TWI354552B - Oxydecahydronaphthalene modulators of hm74 - Google Patents

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1354552 九、發明說明： 【先前技術】 本發明之背景 [0001] G蛋白偶聯受體(GPCRs)是涉及細胞信號傳遞的整合 5 性膜蛋白。GpCRs反應各種各樣的細胞外信號，包括神 • 經傳遞質、激素、增味劑和光亮’並能夠傳遞信號而在細 • 胞内引起第二信使反應。許多治療藥物均以GPCRs為目 φ 標’因為這些受體介導各種各樣的生理反應，包括發炎、 血管舒張、心率、支氣管擴張，内分泌和蠕動。 10 [0002] 許多疾病，例如哮喘、慢性阻塞性肺病（COPD)、牛 皮癬以及類風濕性關節炎(RA)，通常被認為具有涉及τ 輔助細胞、單核細胞巨噬細胞和嗜曙紅細胞的發炎性病 因。目鈾所用的皮質類固醇抗炎症療法在治療哮喘方面是 有效的，但也與新陳代謝和内分泌方面的副作用有關。對 15 於通過肺或鼻黏膜吸收的吸入型製劑，情況很可能也是如 Φ 此。目刖尚缺乏令人滿意的治療RA或COPD的口服療法。 • [0003] 人類單核細胞的HM74分子選殖預示HM74將是一 種趨化因子受體（Nomura等’ Int Immun〇1 (1993) 5(寧239-1249)。HM74 ^要表現在骨髓、脾臟、扁桃腺 20 和氣管裏。 [〇〇〇4]人體細胞含有一種相關的但又是獨特的受體 服74八。腦74和HM74A的胺基酸序列約95%是同源 的。但是，HM74A的配體是已知的而髓4的配體則未 知。煙酸或尼克酸是HM74A的配體d et al.，L Bi〇1. 1354552

Chem. 278:9869-9874, 2003)。煙酸是 HM74 的〜種較差的 啟動劑。 [0005] 鼠類基因組含有HM74A基因，但不含JJM74某因。 [0006] 在某些情況之下，HM74和HM74A顯示了认π # & 1 ί共調即作 5 用。本發明申請人採用了 Taqman-PCR並發現，ΗΜ74和 • ΗΜ74Α的表現在中性粒細胞内被TNFa誘導而上調了 5〇 - 倍，在單核細胞内被LPS或TNFa誘導而上調了 1〇至2〇 φ 倍。HM74和HMMA的表現在正常的人類支氣管上皮細 胞内也被Tm細胞因子、IL-4或IL-13誘導而上調了 4 5 10 倍，而已知TH2細胞因子、IL-4或IL-13在哮喘的病因中 是重要的因素。ΗΜ74和ΗΜ74Α的表現在人類主要嗜曙 紅細胞内被IL-5下調。最後，在一種鼠科實驗性哮喘模 型中，肺的ΗΜ74Α表現也被下調。 [〇〇〇7] ΗΜ74和ΗΜ74Α在體内組織中有限的分佈及調節， 15 提示了 ΗΜ74和ΗΜ74Α在發炎過程例如哮喘、c〇PD和 * RA中的作用。 ^ [〇〇〇8] 鑒於GPCRs在疾病中的角色和透過調節GPCRs的活 性來治療疾病的能力，GPCR配體的發現和鐘定可提供用 於治療GPCR活性相關疾病的新型組合物和方法的發 20 展。本發明發現和鑑定涉及HM74的分子，並提供將此發 現用於有關疾病鑑定和治療的組合物和方法。 【發明内容】 本發明之概述 1354552 [〇〇〇9] 本發明係關於可啟動HM74但不啟動HM74A的分 子。 [00010] 在本發明的另一方面，披露了鑑定HM74調節劑的一 些方法。例如，其中一種方法包括以下步驟：提供一種化 5' 學基團’提供表現HM74的細胞以及確定該化學基團是否 * 調節HM74的信號活性，包括這種調節是否是在本發明之 ' 致效劑存在或不存在的情況下發生。在一個相關的方面， φ 該化學基團可包括但不限於，肽類、抗體、致效劑、反致 效劑和拮抗劑。作為一種選擇’一種已知的調節劑可用於 10 競爭性分析以鑑定其他調節劑。 [00011] 稠環二氫吼喃（又稱為氧基十氫萘和氧化萘烷 (oxydecalin))可啟動HM74。這些化合物在表現HM74的 細胞内，例如CHO細胞、293細胞和L1.2細胞内，可引 起選擇性的對劑量敏感的約移動。 15 [00012] 所研究的氧化萘烷類分子具有以下的結構：

R3〇2C’XVv/^\〇/^X_R2 [00013] 其中 X 是 0、NR2 或 S ; [OOOH] Rl是可含有支鏈、雜原子或取代基、或其組合的 Ci-CiS烷基；可含有支鏈、雜原子或取代基、或其組合的 Ci-Cu鏈烯基；可含有支鏈、雜原子或取代基、或其組合 20 1354552 的CrCw炔基；可含有側基、橋基、雜原子或取代基、 或其組合的eve”芳基；或可含有侧基、橋基、雜原子 或取代基、或其組合的c5-c18環烷基；或其組合； [oooi5] R2是一個R!基團；或者，R2可以是一個含有支鏈、 5 雜原子或取代基或其組合的（crc1())烷基（c3_c1G)環烷 基；或者’ X和R2可形成一個環； ' [00016] R3是Η或R丨；以及 φ [00017] γ是羰基、席夫鹼、喔星、縮酮、縮醛、噁唑烷、噻 唑烷或烯醇酯。 10 [00018]所研究的化合物通常是致效劑。因此，所研究的化合 物可作為候選藥物來研究。所研究的化合物還可用於鑑定 調節ΗΜ74的其他分子，例如，用於競爭性分析。 [〇〇〇19]本發明的另一方面包括治療治療組合物，這類組合物 包括核酸、抗體、多肽、致效劑、反致效劑和拮抗劑。此 15 外，本發明之方法還包括通過給需要治療的患者施用這類 _ 治療組合物從而治療疾病和調節ΗΜ74信號活性的方法。 • [00020]通過參考本發明之詳細說明和附圖，本發明之這些方 面和其他方面將變得顯而易見。此外，本文中列出了許多 進一步詳述某些步驟或組合物的參考文獻。每一篇參考文 2〇 獻都作為整體而引述在此，就好像每篇都是單獨地引述在 此一樣。 本發明之詳細說明 [〇〇〇21]本發明係基於可啟動ΗΜ74分子的發現。 1354552 [〇〇〇22]該HM74編竭序列是已知的（N〇mura等，同上文）。 本發明提供了獲取、製備和使用HM74的方法。只要HM74 的已知功能活性不受到有害的影響 ,HM74編碼序歹⑸ 基酸的變化是可接受的。 '序列和胺 _3] ^ =化合物調節HM74活性且是HM74的致效劑，因 此疋療以炎症為特徵的疾病例如哮喘的候選藥物。 _24]此化合物還可用於篩選ΗΜ74的拮抗劑。例如，讓表 現ΗΜ74的細胞接觸一種試驗化合物，然後再接觸本發^ ίο 致效J。然後通過確定試驗化合物是否降低了本發明之 致效劑所誘導的鈣移動程度，就可以查明該試驗化入物對 鈣移動的影響。 σ [_2Ί⑼如致㈣和反致效㈣其他這類分析，也被認 為是屬於本發明的範圍之内。 [〇〇〇26]所研究的氧化萘烷具有以下結構：

X- R2 15 [00027]其中 X 是 〇、NR2 或 S ; [〇〇〇28] Rl是可含有支鏈、雜原子或取代基、或其組合的 Ci_Cls燒基；可含有支鏈雜原子或取代基、或其組合的 Ci-Cis鏈埽基；可含有支鏈、雜原子或取代基、或其組合 的Cl-Ci8炔基；可含有側基、橋基、雜原子或取代基、 1354552 或其組合的C3-C18芳基；或可含有側基、橋基、雜原子 或取代基、或其組合的<：5-(：18環烷基；或其組合； [00029] 尺2是一個Rl基團；或者，可以是一個含有支鍵、 雜原子或取代基或其組合的（CrCw)烷基（C3-C1())環烷 5 基；或者，X和R2可形成一個環； [00030] R3是Η或R】；以及 • [00031] Υ是羰基、席夫臉、喔星、縮酮、縮醛、噁唾烧、噻 ^ °坐烧或烯醇醋。 [00032] 所研究的化合物通常是致效劑。因此，所研究的化合 10 物可作為候選藥物來研究。所研究的化合物還可用於鑑定 調節ΗΜ74的其他分子，例如，用於競爭性分析。 [00033] 術語“燒基”意思是直鏈或支鏈的烴基。其典型的例子 為曱基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、叔丁基、 仲丁基、戊基和己基。該烴可含有一個或一個以上不飽和 15 雙鍵或三鍵，例如稀烴和炔烴。 '[00034] 術語“烷氧基”意思是與氧原子結合的烷基。其例子為 * 甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基和戊氧基。 [00035] “芳基”是芳香烴的環。其例子包括苯基和萘基。 [00036] “雜原子”通常是與分子内典型原子不同的原子。因 20 此，烴内任何非碳或非氫原子均是雜原子。常見的生物上 可接受的雜原子包括氧、硫和氮。 [00037] 術語“雜芳基”指的是其一個或一個以上碳原子被雜 原子取代的芳基。其例子為D比咬基、°米吐基、η比p各基、嘆 吩基、呋喃基、D比喃基、嘧啶基、噠嗪基、吲哚基、喹啉 1354552 基、二氮雜萘基和異噁唑基。 [00038] “支鏈的”意思是在一個或一個以上位點含有一個或 一個以上支鏈的結構。支鏈可以是如上所定義的R基或 側基。 5 [00039] 術語“環烷基”指的是一種環烴。其例子為環丙基、環 ' 丁基、環戊基和環己基。也可能含有長度可變的橋基。 '[00040] “雜環基”是其一個或一個以上碳原子被雜原子取代 | 的環烧基。其例子為B比1^各烧基、狐唆基和0瓜β秦基。 [00041] 術語“雜烷基”是其一個或一個以上碳原子被雜原子 ίο 取代的烧基。ϋ是一種雜炫基。 [00042] 術語“取代的”意思是含有一個或一個以上取代基的 基本有機基團。因此，一個原子或基團可取代分子内另一 個原子或基團。典型的取代基包括鹵素、CrC8烷基、 -CN、烧氧基、經基、硫化物、硫酸根、磺胺、胺和酿胺、 15 醇基、酮基、C6-C18芳基，鹵代CVCu烷基、亞硝酸根或 ' 硝酸根。 ^ [00043] “鹵素”的例子為氯、氟或溴。 [00044] ‘‘鏈烯基”是含有一個或一個以上碳碳雙鍵的烴。該烴 可含有支鏈。 20 [00045] 術語“環”意思是一個、幾個環狀結構中的一個，或幾 個環狀結構，這幾個環狀結構中的兩個或兩個以上的環可 以稠合，其中一個或一個以上的環可以是芳香環，可含有 雜原子，可含有取代基或是其組合。該環可以是雙環或多 環。該環可含有長度不等的橋基。 1354552 [00046] 術語“側基，’意思是與另一結構連接的原子或分子。因 此，側基可以是以上所定義的R基、烷基、芳基’環烷 基等等。 [00047] 術語“橋基，，指的是兩個結構之間的一個連接基。例如 5 可能含有雜原子、取代基、支鏈或其組合的非環烴，如烧 基、鏈烯基等等，可連接兩個環烴’例如芳基或環烷基。 ' 橋基還可位於某環狀結構的内部，連接該環狀結構的至少 Φ 兩個原子。分子内橋基可含有〇、1、2、3、4個或更多的 原子。分子内橋基可以是直鏈的、可含有支鏈或取代基。 10 [00048] 所研究的化合物含有某些官能團’可以衍生為前驅藥 物，用於提高生物可利用性。因此’本發明考慮到所研究 的活性化合物的變體，它們在給藥之後被代謝為生物活性 的形式。這類生物活性藥物前體又被稱為生物上可逆的載 體、潛在的藥物、給藥系統或前驅藥物。（“Bioreversible 15 Carriers in Drug Design” E.B. Roche，ed·，Pergamon，NY, 1987; “Prodrugs as Novel Drug Delivery Systems”，Higuchi φ & Stella, eds.5 American Chemical Society, DC, 1975) [〇〇〇49]藥物的化學改造是針對藥效學的某些特定方面，例如 如何提高必須穿越油脂障礙的極性化合物的利用率，如何 20 穩定通常在體内易降解的化合物等等。 [〇〇〇5〇]製造前驅藥物的其他原因包括生物活性藥物的毒 性、缺乏特異性、不穩定性、在吸收部位即發生代謝、吸 收太快、患者的適應性’例如味道差或注射部位疼痛，醫 生接受程度差或配方問題。 -12.

[00051] 一種常見的改造是酯化，它並不限於羧基的衍生化。 製造這類衍生物例如胺、亞胺、含硫取代基以及醯胺的化 學理論是現成的。 [00052] 對於酯類，可以添加各種各樣的取代基，包括不含支 鏈的、環狀的或含有支鏈的烴，可以被取代、可以含有一 個或一個以上的雙鍵或三鍵，可含有環狀結構，烴的主鏈 可含有一個或一個以上雜原子，例如氮、硫或氧等等。 [00053] 當考慮構建該酯的R基時，應該考慮的另一因素是 酶切的容易程度。因此，立體帶電和構象等因素對于生物 可利用性可以是決定性的因素。例如，一個含有支鏈的烧 基可能對酯酶活性位點的可及性造成立體位阻效應，從而 降低水解的速率。這種情況既可以是不大合乎希望的，即 生物可利用性被延遲了；也可以是合乎希望的，即生物可 利用性被延長了。 [00054] 在其他一些情況下，希望提高一種藥物的水溶性。可 達到此目標的取代基之例子包括丁二酸根、硫酸根、半丁 二酸根、磷酸根、胺基酸根、醋酸根、胺等等。 [00055] 胺、二醯亞胺、碳酸根、乙内隨腺等化合物中的氮原 子可以被衍生化。適合於與氮反應的基團一般包括羥曱基 或羥烷基，還包括醯氧烷基以及醯基。 [00056] 羰基也是衍生化的位點。衍生物的例子包括席夫驗、 喔星、縮酮、縮醒·、11 惡峻烧、嗟唾烧和烯醇酉旨。 [00057] 雖然以上所討論的衍生物含有與藥物以共價鍵連接 的取代基，一個取代基也可以其他方式與該藥物連接，例 如，氫鍵、範德華力、靜電力、疏水作用等等。 [00058] 衍生化的另一手段是利用那些通過非酶催化的機制 從前驅藥物上脫除的取代基。其例子包括含有以下化合物 的前驅藥物：（2-氧-1，3-二氧戊環-4-基）甲酯，曼尼希鹼、 惡β坐烧、催化分子内水解的含有驗性側鏈的酯類，以及經 歷分子内親核的環消除反應的酯或醯胺。對於含有苯紛、 醇和胺的藥物，環化機制是適用的。[“Prodrug Design”（前 驅藥物設計）Testa & Mayer in “Encyclopedia of Pharmaceutical Technology”（製藥工藝百科全書），2nd ed. V. 3, Swarbrick & Boylan，eds., Marcel Dekker, 2002] 〇 [00059] 因此’本發明考慮了利用已知的合成方法，用所研究 的化合物來製備任何未來的藥物，以便獲取某些化合物， 它們一旦被輸入體内將發生反應或作用從而產生某種可 調節HM74活性的化合物。 [〇〇〇6〇] 本文中的術語“相當的胺基酸殘基’’意思是當對兩個 或兩個以上的序列進行排列對比分析時，這些胺基酸在蛋 白序列内基本上占據了同樣的位置。本發明的較佳的 HM74多肽具有一個與野生型HM74的胺基酸序列足夠地 相同的胺基酸序列。“野生型”的意思是存在於一限定群體 内最普遍的形式或等位基因，無論是在局部的或較大的範 圍内。本文中所用的術語“足夠地相同”指的是第一個胺基 酸或核苷酸序列與第二個胺基酸或核苷酸序列排列對比 時，含有足夠數量或最少數量的相同或相當的（例如，帶 有類似的側鏈)胺基酸殘基或核苷酸，從而使得第一個胺 基酸或核苷酸序列和第二個胺基酸或核苷酸序列具有共 同的結構域和/或共同的功能活性。例如，含有共同結構 域的胺基酸或核苷酸序列’若與HM74的活性至少具有 96°/。的同源性，即在本文中被定義為足夠地相同。 [°°〇61] 如同本文中互換使用的，“HM74活性”、“HM74的生 物活性，，或“HM74的功能活性”指的是在體内或體外按照 標準技術所4定的由HM74蛋白、多肽或核酸分子施加在 HM74表現細胞上的活性。HM74活性可以是一種直接活 性，例如與另一個蛋白發生的關聯或作用於其上的酶活 性；也可以是一種間接活性，例如，通過該HM74與另一 個蛋白之間的相互作用而介導的細胞信號活性。在一較佳 的具體實施例中，HM74活性至少包括以下一種或幾種活 性：（i)在HM74信號途徑上與蛋白發生相互作用的能 力；（ii)與HM74配體發生相互作用的能力；（iii)當被啟 動時修改寄主細胞的能力；（iv)與本發明的分子結合時即 被啟動的能力；以及(v)與細胞内的目標蛋白發生相互作 用的能力。 [00062] 本發明之一個方面係關於在HM74被啟動時顯示反 應的細胞内表現HM74。如本文中所用，術語“核酸分子” 旨在包括DNA分子（例如cDNA或基因組DNA)和RNA 分子（例如mRNA)，以及使用核苷酸類似物所產生的DNA 或RNA的類似物。此核酸分子可以是單股的或雙股的， 但較佳的是雙股DNA。 [00063] “分離出的核酸分子是指從核酸天然資源的其他核 1354552 酸分子中分離出的一個核酸分子。較佳的是，一個“分離 出的”核酸不含原本天然存在於衍生出該核酸的有機體的 . 基因組DNA内編碼HM74的核酸側翼的核苷酸序列（即位 於核酸5,端和3,端的序列）。該分離出的HM74核酸分子 5 可能含有少於約 5 kb、4 kb、3 kb、2 kb、1 kb、0.5 kb 或 0.1 kb上述的核苷酸序列；在衍生出該核酸的細胞的基因 • 組DNA内’這些核苷酸序列原本天然地存在於該開放讀 φ 框核酸分子的側翼。而且，一個“分離出的，，核酸分子，例 如cDNA分子，當以重組技術的方式產生時，可基本上 1〇 不含其他細胞物質或培養基；或者，當以化學方式合成 時，可基本上不含化學前體或其他化學物質。 [00064] 本發明之核酸分子，例如，編碼HM74的核酸分子可 採用標準的分子生物學技術和序列分離出來（Nomura 等，同上文）。利用全部或部份的HM74序列，HM74核 15 酸分子可採用標準的雜交和選殖技術分離出來（例如，如

Sambrook et al., eds., “Molecular Cloning: A Laboratory φ

Manual，” 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press， Cold Spring Harbor，NY，1989 —文中所述）。 [00065] 本發明之核酸分子可按照標準的PCR放大技術、利 20 用cDNA、mRNA或基因組DNA作為範本和適當的低聚 核苷酸引子而加以放大。如此放大的核酸可被選殖進適當 的載體並用DNA序列分析法鑑定。此外，與HM74核普 酸序列對應的低聚核苷酸可通過標準的合成技術製備，例 如，使用自動化DNA合成儀。 [00066]1354552 而且，本發明的核酸分子可以只包括核酸序歹彳中李 HM74的那些部份，例如，編碼細胞外結構域和/或細'' 螞 結構域的片段，當配體與其結合時它將產生一種可檢跑内 細胞内變化。較佳的是，那種可檢測的細胞内變化 7的 HM74在一個正常的寄主細胞被啟動時所觀察到 X ^ /· 那種 變化 [00067] 一個編碼“ΗΜ74的生物活性部份”的核酸片段可&、。 以下步驟來製備：分離ΗΜ74中可編碼具有ΗΜ74生過 性的多肽的那一部份，表現ΗΜ74蛋白的被編碼部份 如’通過體外重組表現）以及評估ΗΜ74被編碼部^的^ 性。 4 [00068] 15 本發明還進一步包括這樣的一些核酸分子：它們由於 基因密碼的簡併性而不同於所彼露的ΗΜ74的核皆酸序 列’從而編碼與先前所彼露的ΗΜ74蛋白基本上相回 ΗΜ74蛋白。 的 φ [〇〇〇69]熟悉本技術者將會理解，導致HM74胺基酸序列變化 的DNA序列多態現象，可存在於一個群體(例如人群)^。 由於天然的等位基因變異，這種HM74編碼序列的基因夕 態現象可存在於一個群體的某些成員中。等位基因是= 20 特疋基因位點出現的—組基因中的―個基因。如本^ 所使用的，術語“基因，，和“重组基因”指的是包含 樞的核酸分子，較佳的是哺乳動芯 θ蛋白。如本文中所使用的，術語“等位基因變異 的疋出現在ΗΜ74位點或該核普酸序列編碼的多肽的核 ⑧ -17- 1354552 苦酸序列。等位基因也可通過對許多$同個體中的有關基 因進行測序而加以鑑定。通過使用雜交探針來鑑定許多不 同個體的同一基因位點，就很容易達到這一目的。作為天 然專位基因查異的結果且不改變ΗΜ74功能活性的這類 核苷酸的任何變異和所有變異，以及所引起的ΗΜ74胺基 酸的多態現象或突變’均包括在本發明之範圍之内。 [〇〇〇7〇] 某些源自其他物種的ΗΜ74蛋白（ΗΜ74同源物），其 核苷酸序列不同於人的ΗΜ74核苷酸序列，但基本上具有 同樣的活性。可編碼這類ΗΜ74蛋白的核酸分子，也包括 在本發明的範圍之内。對應于天然等位基因變體和本發明 之ΗΜ74 cDNA同源物的核酸分子，可根據其與本文所 披露的人的HM74核酸的同源性，利用人的cDNA或其 一部份作為雜交探針’並按照標準的雜交技術在嚴格的雜 交條件下予以分離。 15 [00071] 如本文中所使用的，術語“在嚴格條件下雜交，，旨在描 述這樣一些雜交和洗條條件，在這些條件下核苷酸序列通 常保持雜交的狀態。這樣的嚴格條件是熟悉本技術者所熟 知的，而且可在文獻中查到，例如，Current Protocol^ in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 2〇 6.3.1 -6.3.6。嚴格雜交條件的一個較佳的非限制性例子 是，於約45°C在6x氯化鈉/檸檬酸鈉（SSC)中進行雜交， 隨後於50-65 °C在0.2x SSC，0.1% SDS中洗滌一遍或多 遍。較佳的是，本發明的一個在嚴格條件下雜交為HM74 序列或其互補序列的分離出的核酸分子，對應于一個天然 • 18 - 1354552 產生的核酸分子。如本文中所使用的，“天然產生的，，核酸 分子指的是包含一天然產生的核苷酸序列（例如，編碼一 天然蛋白）的RNA或DNA分子。 [〇〇〇72] 除了可能存在於該群體中的HM74序列的天然產生 的等位基因變體，熟悉本技術者將會進一步理解，突變可 將變化導入核苷酸序列，從而導致編碼後HM74中胺基酸 • 序列的變化，但基本上不改變HM74蛋白的生物活性。因 φ 此，可以進行核苷酸的取代使得在“非實質性”胺基酸殘基 上發生胺基酸的取代。一個“非實質性，，胺基酸殘基是這樣 10 一種殘基，它可從野生型的HM74序列演變而來，但其生 物活性基本上未改變。例如，各種物種HM74中未保留或 只保留一半的胺基酸殘基’對於活性可能是非實質性的， 因此很可能成為改變的目標。換言之，保留在各種物種 HM74蛋白中的胺基酸殘基，對於活性可能是實質性的， 15 因此不大可能成為改變的目標。 個胺基酸序列，與已知的HM74胺基酸序列相比， 96%、97%、98%、99%或 100%相同。 [00073] 相應地’本發明之另一方面係關於可編碼HM74蛋白 的核酸分子，其中對於活性是非實質性的胺基酸殘基中包 含了某些變化。這樣的HM74蛋白不同於已知的胺基酸序 列但保留了生物活性。在一具體實施例中，被分離出 酸分子包括一個可編碼蛋白的核皆酸序列，它所包括^ @ 至少 添加或刪除一個 蛋白的分離的核 [00074] 在已知HM74的核苷酸序列上取代、 或多個核苷酸，可產生一個可編碼HM74 20 1354552 酸分子，並使該被編碼蛋白内一個或多個胺基酸被取代、 添加或刪除。該HM74蛋白含有一不同於已知HM74的序 ♦ 歹 lj 〇 [00075] 可以通過標準的技術引入各種突變，例如針對位點的 5 犬變和pcr介導的突變。較佳的是，使保守的胺基酸取 代在一個或多個預期是非實質性的胺基酸殘基上。“保守 的胺基酸取代’’指的是該胺基酸殘基被一個具有相似側鏈 φ 的胺基酸殘基取代。具有相似側鏈的胺基酸殘基家族在本 技術領域内已有所定義。那些家族包括具有鹼性側鏈的胺 10 基酸(例如賴胺酸、精胺酸和組胺酸），酸性側鏈（例如天冬 胺酸和谷胺酸）’不帶電的極性側鏈(例如甘胺酸、天冬醯 月女、被酿胺、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸和半胱胺酸），非 極性側鏈(例如，丙胺酸、纈胺酸、亮胺酸、異亮胺酸、 脯胺酸、苯基丙胺酸、蛋胺酸和色胺酸），卜分支側鏈(例 15 如，蘇胺酸、纈胺酸和異亮胺酸）以及芳香族側鏈(例如， 酪胺酸、苯基丙胺酸、色胺酸和組胺酸）。因此，HM74 内-個預期是非實質性的胺基酸殘基，最好是被另一個屬 於同-側鏈家族的胺基酸殘基取代。作為一種替換方式， 也可以沿著HM74編碼序列的全部或部分隨機地引入突 20 冑’例如通過飽和突變的方式，而且可以筛選所生成的突 變體的HM74生物活性，以鐘定保留活性的突變體。在突 變之後’被編碼的蛋白可以重組地表現，蛋白的活性可以 被測定。 [00076] T*以用於產生所研究的核酸的經改良的核苦酸例子 5 二龙5-氟尿嘧啶、5_溴尿嘧啶、5_氯尿嘧啶、5碘尿嘧啶、 5^^'黃料、4-乙酿胞射、5-(致經甲基)尿錢' 胺基甲基-2_硫代尿芽、5•羧甲胺基甲基尿射、二 、P_D•半乳糖Q挪、N6·異戊烯基腺嗓呤、1- 4 = Η基崎、2,2·二甲基烏^、2_甲基腺 Ν6-眙過土烏嘌呤、3·甲基胞核嘧啶、5_甲基胞嘧啶、 10 基胺票呤、5_甲胺基甲基尿較、5_甲氧 幾甲尿喷咬、㈣—甘絲Q㈣、5_曱氧基 A腺二2治°疋二5_甲氧基尿哺咬、2_硫代甲基-n6_異戊烯 =妨:ίΐ ?尿嘧咬-5_髮乙酸、wybutoxosine、假尿嘧咬、 :、2_硫代胞錢、5_甲基_2_硫代尿射、2_硫代尿 °疋、-硫代尿嘴咬、5_甲基尿喷。定、尿射_5_經乙酸甲 =、5-甲基_2_硫代尿錢、M3•胺基_3善 啶以及2,6·二胺基嘌呤等。 円土）尔在 15 ，^影響ΗΜ74功能的—種方式是影響圓*的表現。 20 γ可以操縱轉錄的水平以將HM74 mRNA的含量控 在較低或較南的水平，從而使細胞表面腿％的表現呈 現，低或較高的水平。實現這種操縱的一種方式是利用可 調節的促進子。該促進子可通過例如同源重組的方式導入 HM74編碼序列附近基因組内的適當位點。 [00078]相應地’本發明之另一個方面係關於抗hm74的抗 體。本文中所使用的術語“抗體，，指的是免疫球蛋白分子和 免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有特異結合抗原例 如HM74的抗原結合位點的分子。特異結合的分子 -21· 1354552 是指那些結合HM74但基本上不結合樣品（例如天然含有 HM74的生物樣品）中其他分子的分子。免疫球蛋白分子 的免疫活性部分的例子包括F⑽和F(abi)2片段，該兩種片 段可以通過用酶例如胃蛋白酶來處理抗體而產生。本發明 5 15 20 提!1了可結合HM74的多株和單株抗體。本文所使用的術 邊早株抗體”或“單株抗體組合”指的是一群抗體分子，它 =含有-類能夠與特定的刪74抗原決定基發生免疫 ，二的：體基因型或抗原結合位點的選殖體。因此，單株 -的結合親合力㈣HM74蛋自抗原蚊基顯示單 [_79] #本技術領域内所知 抗原的抗體_，包 備出各種其他結合 性化抗體等。 又、瓜&體抗體，重組抗體、人 [00080] 本發明之另— y 部分）的核_^^面係關於含有可編碼勘4(或其一 種類型的載體是“質粒，，，指的是其他 所使用的，‘“载體，，的車是表現載體。如本文中 核酸的核醆分一扣的疋此夠運载與它相連接的另一 DNA片畏可r、 炫观災的戟體是“質米 載體是病去的圓形錢DNA環。另-類型的 毒的基因叙内。某m他的咖諸可以連接到該病 (例如，具有％菌、夠在寄主細胞内部自發地複製 載體）。其他源的細㈣體和哺乳動物附加型 引入寄主、===_物非附加型_在被 主基因叙1被=胞的基因組内，因此與寄 皮錢。而且，某些载體，表現載體， ⑧ -22- 1354552 ;曰导興辦地連接的基@的表現。—般而今，用於 Ϊ組ΤΑ =的表現载體經常是以質體(載體):形式存 在二但疋’本發明還意在包括其他形式的表現載體，例如 起專效侧的病毒键(例如，複製缺陷逆轉錄酶病毒、 腺病毒和腺相關病毒）。

10 15

[〇_ 綱之重組表現载體包括本發明之核酸，它以適合 核酸在寄主細胞内表現的形式的存在。這意味著，重組表 現載體包括以用於表現的寄主細胞為基礎所選擇的一個 或多個調控序列’該調控序列與欲表現的核酸可操作地連 接。在重組表現载體内，所謂“可操作地連接，，旨在表示所 考慮的核苷酸序列以便於該核苷酸序列表現(例如，在一 體内轉錄/轉譯系統内或當載體被引入寄主細胞時在一寄 主細胞内表現）的方式與調控序列連接。術語“調控序列” 意在包括啟動子、促進子以及其他表現控制元素（例如， 多聚腺苷酸化信號）。有些文獻中敘述了這類調控序列， 例如 Goeddel，Gene Expression Technology: Methods in Enzymology Vol. 185，Academic Press，San Diego, CA (1990)。調控序列包括在許多種寄主細胞内指導核苷酸序 列組成性表現的調控序列（例如，組織特異性的調控序 20 列）。熟悉本技術者應理解表現載體的設計可取決於諸如 欲轉化的寄主細胞的選擇、所希望的蛋白表現水平等因 素。本發明之表現載體可導入寄主細胞，從而生產如本文 所述的由核酸編碼的蛋白或肽（例如，HM74、突變體形式 的HM74、融合蛋白等）。 -23· ⑧ 1354552 [00082] 本發明之重組表現載體可設計用於HM74在原核或 真核細胞内的表現，例如，大腸桿菌、昆蟲細胞(使用桿 . 狀病毒表現載體）、酵母細胞或哺乳動物細胞之類的細菌 細胞。上文提到的Goeddel —文對於適合的寄主細胞作了 5 進一步討論。作為一種替換方式，重組表現載體也可以在 體外轉錄和轉譯，例如使用T7啟動子調控序列和T7聚 . 合酶。 ^ [00083] 在另一具體實施例中，HM74表現載體是酵母表現載 體。在釀酒酵母（S. cerevisiae)内表現的載體例子包括 ίο pYepSecl (Baldari et al., EMBO J. (1987) 6:229-234)'pMFa (Kurjan et al., Cell (1982) 30:933-943) ' pJRY88 (Schultz et al., Gene (1987) 54:113-123) ' pYES2 (Invitrogen

Corporation, San Diego, CA)，以及 pPicZ (Invitrogen Corp·，

San Diego, CA)。 15 [00084] 作為一種替換方式，可使用桿狀病毒表現載體使得 HM74可表現在昆蟲細胞晨。可表現在經培養的昆蟲細胞 ® (例如Sf9細胞）蛋白裏的桿狀病毒載體包括pAc系列 (Smith etal·，Mol. Cell. Biol. (1983) 3:2156-2165)和 pVL 系列（Lucklow et al.，Virology (1989) 170:31-39)。 20 [00085] 在另一個具體實施例中，使用了哺乳動物表現載體使 得本發明之核酸被表現在哺乳動物細胞裏。哺乳動物表現 載體的例子包括 pCDM8 (Seed，Nature (1987) 329:840)和 pMT2PC (Kaufman et al.，EMBO J. (1987) 6:187-195)。當 用於哺乳動物細胞裏時’表現載體的控制功能經常是由病 ⑧ -24- 1354552 毒調$元件提供的。例如，常用的啟動子是從多瘤病毒、 腺病毒2、細胞巨化病毒和猿病毒4〇衍生而來的。關于 . 其他原核細胞和真核細胞的適當表現系統，參閱上文提及 的Sambn>〇k等人的論文第Μ章和第17章。 5 [〇0 0 8 6 ]對於哺乳動物細胞的穩定轉染，取決於所使用的表現 載體和轉染技術，已知只有一小部分細胞可以將外來的 DN A整合進基因組。為了鏗別和選擇那些整合子，通常 φ 將編碼可選擇標記（例如對抗生素的抵抗）的基因與所研 究的基因一起導入寄主細胞。較佳的可選擇標記包括那些 10 對某些藥物例如G418、潮黴素和甲氨蝶呤等具有抗藥性 的可選擇標記。編碼一可選擇標記的核酸可導入寄主細胞 内那個與編碼HM74的載體相同的載體，或可導入一不同 的載體。用所導入核酸穩定地轉染的細胞可通過藥物選擇 來鑑定（例如，整合了可選擇標記基因的細胞將生存’而 15 其他的細胞則死亡）。 [〇〇〇87] 所研究的可結合和啟動HM74的化合物是稠環二氫 °比喃類化合物，包括氧化萘烷類化合物。氧化萘烷是氧化 十氫化萘的另一名稱。這類二氫吡喃具有如下結構通式： [〇 〇 〇8 8 ] 所研究的二氫吡喃和氧化萘烷可按照以下文獻所介 2〇 紹的方法製備：美國第6,399,653號專利、WO 97/48691 專利以及 von Roedern，Mol. Div. (1998) 3:253-256。 [00089] 所研究的氧化萘烷類分子具有以下的結構： 1354552

• [00090] 其中 X 是 O、NR2 或 S ; .[00091] Ri是可含有支鏈、雜原子或取代基、或其組合的 CrC18烷基；可含有支鏈、雜原子或取代基、或其組合的 # (^-(：18鏈烯基；可含有支鏈、雜原子或取代基、或其組合 的Ci-C^炔基；可含有側基、橋基、雜原子或取代基、 或其組合的C3-C18芳基；或可含有側基、橋基、雜原子 或取代基、或其組合的〇5-(：18環烷基；或其組合； [00092] R_2是一個Rl基團；或者，可以是一個含有支鍵、 10 雜原子或取代基或其組合的（CrCio)烷基（C3-C1{))環烷 基；或者，X和R2可形成一個環； -[00093] R3 是 Η 或 Ri ;以及 鲁[00094] Y是叛基、席夫驗、喔星、縮酮、縮醒·、°惡°坐烧、嗟 β坐炫或烯醇醋。 15 [00095] 所研究的化合物通常是致效劑。因此，所研究的化合 物可作為候選藥物來研究。所研究的化合物還可用於鑑定 調節ΗΜ74的其他分子，例如，用於競爭性分析。 [00096] 較佳的化合物是其分子中當R2是曱基、乙基或環己 基時，R!不是正烷基或CrC4含支鏈的烷基；或當R2是 20 CrC4的醇或可能含有一乙醯取代基的CVCU含支鏈的烷 ⑧ 1354552 基時，I不是正(CrQ)烷基、（(να)含支鏈的烷基或硫 代苯基。 • [00097]術語“烷基，，意思是直鏈或支鏈的烴基。其典型的例子 為甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、叔丁基、 5 仲丁基二戊基和己基。該烴可含有一個或一個以上不飽和 雙鍵或三鍵，例如烯烴和炔烴。 .[⑽γ術語“烷氧基，’意思是與氧原子結合的烷基。其例子為 春 甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基和戊氧基。 [00099] “芳基”是芳香烴的環。其例子包括苯基和萘基。 10 [000100] “雜原子，，通常是與分子内典型原子不同的原子。因 此，烴内任何非碳或非氫原子均是雜原子。常見的生物上 可接受的雜原子包括氧、硫和氮。 [000101]術语“雜芳基”指的是其一個或一個以上破原子被雜 原子取代的芳基。其例子為吡啶基、咪唑基、„比咯基、嘍 15 吩基、呋喃基、吡喃基、嘧啶基、噠嗪基、吲哚基、喹淋 ^ 基、二氮雜萘基和異噁唑基。 [〇_〇2]術語“環烷基”指的是一種環烴。其例子為環丙基、環 丁基、環戍基和環己基。 [0001031 “雜環基”是其一個或一個以上碳原子被雜原子取代 的環烧基。其例子為°比洛燒基、η瓜咬基和瓜嗓基。 t〇〇〇1〇4i術語“雜烷基”是其一個或一個以上碳原子被雜原子 取代的烷基。醚是一種雜烷基。 [〇〇〇1〇5]術語“取代的”意思是含有一個或一個以上取代基的 基本有機基團。因此，一個原子或基團可取代分子内另一 1354552 個原子或基團。典型的取代基包括鹵素、烷基、 -CN、烷氧基、羥基、硫化物、硫酸根、磺胺、胺和醯胺、 • 醇基、酮基、c6-c18芳基，鹵代crc18烷基、亞硝酸根或 硝酸根。 5 [000106] “鹵素’’的例子為氣、氟或溴。 [000107] “鏈烯基”是含有一個或一個以上碳碳雙鍵的烴。該烴 ' 可含有支鏈。 ^ [000108] 術語“環”意思是一個、幾個環狀結構中的一個。這幾 個環狀結構中的兩個或兩個以上的環可以稠合，其中一個 10 或一個以上的環可以是芳香環，可含有雜原子，可含有取 代基或是其組合。該環可以是雙環或多環。該環可含有長 度不等的橋基。 [000109] 所研究的化合物可結合和啟動HM74，但不結合 HM74A。 15 [000110] 所研究的氧化萘烷可按照美國第6,399,653號專利所 述的已知技術合成。 ® [000111] 本發明之氧化萘炫類化合物HM74調節劑，可被納入 各種適合於給藥方式的醫藥組合物。這類醫藥組合物通常 含有該活性成分和一種藥學上可接受的載體。如本文中所 20 使用的，術語“藥學上可接受的載體”旨在包括適合於給藥 方式的任何和所有的溶劑、分散介質、包衣，抗菌劑和抗 真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。將這樣的介質和試劑用 於醫藥活性物質的做法是本技術領域内眾所周知的。除了 那些常規的介質或試劑與活性化合物不相容的情況，這類 1354552 介質和試劑在組合物内的使用是經過深思熟慮的。輔助的 活性化合物也可被納入該組合物内。 .[000112] 本發明之醫藥組合物是按照預定的給藥途徑而配製 的。給藥途徑的例子包括非腸道途徑，例如靜脈注射、皮 5 内、皮下、口腔（例如吸入）、透皮（局部），粘膜和直腸給 藥。用於非腸道途徑、皮内或皮下給藥的溶液或懸浮液可 ' 包括以下組分：無菌稀釋劑，例如注射用水、鹽水溶液、 非揮發性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶劑； 抗菌劑，例如苯甲醇或對羥基苯曱酸曱酯；抗氧劑，例如 10 抗壞血酸或亞硫酸氫納；螯合劑，例如EDTA ;緩衝劑， 例如醋酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽；以及滲透壓調節劑，例 如氯化鈉或葡萄糖。酸度（pH)可用酸或鹼來調節，例如 HC1或NaOH。注射製劑可密封於安瓿瓶、一次性注射器 或玻璃或塑膠製成的多劑量小瓶。 15 [000113] 適合於注射用的醫藥組合物包括用於即時製備無菌 注射液或分散劑的無菌水溶液（若為水溶性）或分散劑以 ® 及無菌粉末。對於靜脈給藥方式，適合的載體包括生理鹽 水，抑菌水，Cremophor EL® (BASF; Parsippany，NJ)或磷 酸鹽緩衝鹽水(PBS)。在所有情況下，該組合物必須無菌 20 而且應具有一定的流動性以便於注射。它在製造和儲存條 件下必須是穩定的，必須加以處理以抵抗微生物例如細菌 和真菌的污染。載體可以是含有水、乙醇、多羥基化物（例 如丙三醇、丙二醇、液體聚乙二醇等）及其適當混合物的 溶劑或分散介質。為了維持適當的流動性，可使用包衣， 13^4552

I 劑的情況下，則可通過維持所需的 生物的作用 以及使用表面活化劑。為了預防微 5 10 15 20 如，對辦其二可使用各種各樣的抗菌劑和抗真菌劑，例 工土本曱酸酯、氣丁醇、笨酚 及氣化納。可tt；甘露醇和山梨糖醇之類的多元醇，以 内加入包合物的延遲吸收，可藉由在組合物 和明膠。相收的試劑而達到，例如加人單硬酯酸銘 _1根=^躲㈣製備是將所需劑量的該活性化合 各的.容兩丨述一種成分或幾種成份一起，置入一種適 二=1:進刪滅菌。通常，分散劑的製備是 分散介質^ 種無菌載體，後者含有-種基本的 射液的备-/斤需的上述其他成份。對於用於製備無菌注 此’、囷粉末，較佳的製備方法是真空乾燥法和冷束乾 士"匕顿先前、經滅菌過滤的溶液產生能性成分的粉 ，再加入任何其他所需的成份。 [000115] 口服殷 # , 的載體—樂且合物一般含有一種惰性稀釋劑或可食用 了口服i匕們可被密封在明膠膠囊内或被壓製成片劑。為 :、冷療給藥的目的，該活性化合物可與賦形劑一起成 茸锸以1劑、錠劑或膠囊的形式使用。口服組合物也可用 用，|態載體製備成糖漿或液體製劑而作為漱口液使 液態載體中的化合物是經口腔途徑施用，成者 淳人口後吐出，或者咽下。 ’ ⑧ -30- 1354552 :的Si广合劑和/或佐劑材料可作為醫藥組合 = 。片劑、丸劑、膠囊、錢劑等可含有以 似的化合物:枯合劑，例如微晶質纖 5 10 15 =:二:膠;賦形劑，例如澱粉或乳糖;崩散劑， ! 二1rgel (羥乙酸澱粉鈉)或玉米澱粉；潤滑 々· 9馱鎂或Ster0tes;助滑劑，例如膠體二氧化

石，β例如蔗糖或糖精；或調味劑，例如薄荷Κ 楊酸甲喊橙味調味劑。 J

[000117]對=吸 ' 給藥方式，該化合物可從含有適當揮發劑 (例如一氧化碳之類的氣體）的加壓容器、分配器或喷霧器 以氣霧劑喷霧的形式給藥。 [〇〇〇118]系統性，藥也可通過枯臈或透皮給藥的方式。對于枯 f或透皮給® ’在配方巾使用了克服渗透障礙的滲透劑。 這樣的f透劑在本技術賴岐料周知的，.，用於 枯膜、.，'市的气透劑包括洗務劑、膽汁鹽，以及梭键抱酸衍 i t使用鼻腔噴霧或栓劑來完成。對於 ，如，領域内眾所周知的，可將活性化合物 配入軟肩、樂膏、凝膠或油膏。 [000119] 該化合物也可製成；κ十， 劑基料，如可可脂和其他 式（例如使用常規的检 用於直腸灌腸。、甘私），或製成灌腸劑的形式 [〇〇〇12〇]在一具體實施例中’哕年以儿人 人 物過快地從體内排出的載體m物與某種防止該化^ 的齡㈣植入體内和微膠囊給藥系統。可以使用生物 20 1354552 降解、生物相容性聚合物，例如乙烯—醋酸乙烯酯共聚 物、聚酸酐、聚甘醇酸、膠原、聚原酸酯以及聚乳酸。 [000121]製備這類藥劑的方法對於熟悉本技術者將是顯而易 見的。各種材料也可以通過商業途徑從Alza Corporation 5 和Nova Pharmaceuticals, Inc.等公司購得。脂質體懸浮液 (其含有與單株抗體一起靶向作用於被感染細胞的脂質體) • 也可用作為藥學上可接受的載體。這些載體可按照為熟悉 0 本技術者已知的方法製備，例如，按照美國第4,522,811 號專利所述的方法製備。 10 [000122]為了給藥方便和劑量一致，以單位劑量的形式配製口 服或非腸道給藥的組合物是特別有利的。本文中所謂的單 位劑量形式指的是適合作為治療患者的單位用量且形體 上獨立的單位’每個單位含有根據所需的藥物載體而算出 的預定量活性化合物，以產生所希望的治療效果。取決於 15 疾病的類型和嚴重性’給患者輸入約1 pg/kg至15 mg/kg (例如0.1至20 mg/kg)的活性成份是一種可供選擇的初始 劑量，無論是一次或多次地分別給藥，還是連續地注入。 典型的曰劑量範圍可從約1 1〇〇mg/kg4以上， 取決於以上提到的各種因素。對於幾天或更長時間的重複 性給藥，根據具體情況，應維持治療直至出現所希望的抑 制疾病症狀的效果。但是，其他劑量的療程也可能會有 效。治療的進展情況可以容易地通過常規的技術和分析予 以監測。WO 94/04188專利坡露了一示範性劑量的療程。 本發明之單位劑篁的規格受制於且直接依賴於該活性化 -32- 1354552 % 合物的獨特性質和所欲達到的具體治療效果，以及用 療患者的這種活性化合物在配製技術方面的 = 训該醫藥組合物可密封在容器、包裝袋或分配J性。 附上使用說明。 命鬥’並 5 [000124]所研究的HM74調節劑可用於各種篩選分析和仏 方法（例如治療和預防）。所研究的HM74調節劑可用二^ ：€其他㈣HM74活性絲㈣藥物或化合物，也可用: 讀其特徵為炎症的疾病^所研究的調㈣ _ 服74例產生輸不足繼、輪生的H= 1〇 蛋白類型與野生型HM74蛋白相比活性下降或異常而引 起的各種情況。本發明還涉及通過本文所述的筛選試 鑑疋的新穎HM74調節劑及其在治療方面的應用。 [〇〇〇125]本發明提供了一種鑑定調節劑的方法（本文中又稱為 ‘‘篩選分析”）。該調節劑也就是與HM74蛋白結人=對 15 舰74的表現或HM74的活性具有·或抑制作用二候選 化合物或試劑，或試驗化合物或試劑（例如肽、擬肽、、小 攀 分子化合物、抗體或其他藥物）。 [〇〇〇126]在一具體實施例中，本發明提供了篩選那些可社八 HM74或調節HM74活性的候選化合物或試驗化:物^ 2〇 析方法。因此，該篩選分析可用於鑑定其他可調節hm74 的利尿磺胺類（furosemide-like)和氧化萘烷類化合物。這 類調節劑還可用於競爭性分析以敎其他調^ HM74拮抗劑。 1354552 [000127]在一具體實施例中，分析是以細胞為基礎而進行的。 在該分析中，使一個在細胞表面表現膜結合形式ΉΜ74 的細胞與一試驗化合物接觸，然後測定該試驗化合物啟動 ΗΜ74的能力。該細胞可以是酵母細胞或源自哺乳動物的 細胞。可通過以下方式來測試該試驗化合物啟動ΗΜ74 活性的能力：例如，使該試驗化合物與某種放射性同位素 或S#彳*記偶聯，這種偶聯使得可通過檢測與ΗΜ74形成的 複合體中或ΗΜ74所在位置上標記化合物的方式，來測定 該试驗化合物與ΗΜ74的結合。例如，可以用ns〗、35g、 C或Η直接地或間接地標記試驗化合物，該放射性同 位素可通過射電輻射直接計數或通過閃爍計數而測出。或 者，該試驗化合物可用例如辣根過氧化物酶、鹼式磷酸酶 或螢光素酶等標上酶標記’該酶標記可通過測定某種適宜 ^物向產物的轉換來檢測。在一較佳的具體實施例中，該 分析包括使一個在細胞表面表現膜結合形式ΗΜ74的細 胞與一種將ΗΜ74與試驗化合物結合的已知化合物接 觸’然後確定該試驗化合物在與ΗΜ?4相互作用時盥該已 知化合物競爭的能力。 〃 [〇〇_]八在另-實施例中，分析也是以細胞為基礎而進行的。 该分析包括使—個在細胞表面表賴結合形式ΗΜ74的 =胞試驗化合物接觸，錢測定該試驗化合物調節 =α=，Μ74的能力。例如’可通過測定該試 調或抑制腦4的能力來確定該試驗化合物 Ρ ，舌性的能力。當啟動的ΗΜ74與信號通路相關 •34· 的胞内或胞膜靶分子相互作用時，這一點可能就很清楚 了。如本文中所使用的，“靶分子”是指實際上與HM74結 合或相互作用的分子，例如一細胞表面表現HM74的分 子、另一細胞表面的分子、一胞外環境中的分子、一與細 胞膜的内表面有關聯的分子或細胞質分子。HM74靶分子 可以是某種非HM74分子。在一個實施例中，HM74靶分 子是某種信號轉導通路的組成部分，它促進胞外信號（例 如由於某種化合物與HM74的結合而產生的信號）經過細 胞膜轉導進入該細胞。又如，靶分子也可以是具有催化活 性的另一個細胞間蛋白或促進下游信號分子與HM74結 合的蛋白。 [000129] 測定HM74與HM74靶分子結合或與HM74靶分子 相互作用的能力，可以通過上述的一種測定直接結合的方 法來實現。在一較佳的實施例中，測定HM74與HM74 靶分子結合或與HM74靶分子相互作用的能力，可以通過 測定這些靶分子的活性來實現。例如，靶分子的活性可以 通過以下方式來測定：檢測該靶分子對細胞第二信使（例 如，胞内Ca2+、甘油二酯、IP3等）的誘導，檢測該靶分子 在適當底物上的催化活性/酶活性，檢測報導基因（例如與 編碼可檢測標志例如螢光素酶的核酸可操作地連接的 HM74反應調節元件）的誘導，或檢測細胞的反應例如細 胞分化或細胞增殖。 [000130] 在另一具體實施例中，本發明的分析是一種無細胞分 析，包括使HM74與一種試驗化合物接觸，並確定該試驗 1354552 化合物與HM74結合的能力。如上所述，該試驗化合物與 HM74之間的結合可直接地或間接地確定。在一較佳的具 體實施例中’該分析包括使HM74與本發明的一種已知化 θ物和试驗化合物同時接觸，並確定該試驗化合物影響上 5 述已知化合物的ΗΜ74活性的能力。確定該試驗化合物與 ΗΜ74相互作用的能力，包括確定該試驗化合物與上述已 知化合物相比優先與ΗΜ74結合的能力。 [000131]在另-具體實施例中’該分析是一種無細胞分析，包 括使ΗΜ74與-種試驗化合物接觸，並確驗化合物 10 調節（例如啟動或抑制)圓4之活性的能力。確定該試驗 化合物調節ΗΜ74利生的能力，可利用上述的一種確定直 接結合的方法，通過確定被啟動的ΗΜ74與ΗΜ74靶分子 結合的能力而實現。在一供選擇的具體實施例中，確定該 試驗化合物調節ΗΜ74活性的能力，可通過確定ημ74 15 進一步調節匪74乾分子的能力來實現。例如，可按如上 赢 所述的方法㈣定_分子在-適當底物上的催化/酶活 • 性。 [00剩在另一具體實施例中，該無細胞分析包括使_ 與-種可使ΗΜ74與-種試驗化合物結合的已知化合物 20 接觸，以及測定該試驗化合物與ΗΜ74相互作用的能力， 其中，確定該試驗化合物與_相互作用的能力也包括 確定該匪74與腦74乾分子優先結合或優先調節ΗΜ74 靶分子活性的能力。 $體可被非配體分子啟動，這些非配體分子未必抑制

-36 - 1354552 配體的結合但可引起受體的結構變化，從而導致可引起活 化的G蛋白的結合’或受體的聚集、二聚化或誤合。 [000134]本發明的無細胞分析既適用於可溶形式的腦74,也 適用於膜結合形式的HM74。京尤包括膜結合形式HM74的 5 無細胞分析而言，使用某種增溶劑也許是可取的，可使膜 結合形式的HM74保持在溶液中。這類增溶劑的例子包括 ' 非離子型洗滌劑，例如正辛基葡萄糖苷、正十二烷基葡萄 鲁糖苷、正十二烷基麥芽糖苷、辛醯基_N_甲基葡萄糖醯胺、 癸醯基-N-甲基葡萄糖醯胺、Triton X · 1〇〇、Triton X _ ίο U4、Thesit®、異十三烷基聚乙二醇醚、3-[(3·膽醯胺基 丙基）二曱胺基]-2-經基-ΐ_丙橫酸鹽（〇1^八1>;5〇)或Ν_十二 烧基-Ν，Ν-二甲基-3-胺基小丙續酸鹽。 [〇〇°1351在另一具體實施例中，當ΗΜ74被表現在寄主細胞上 時，匕承叉了某種變化而處于一種恒定的啟動狀態。改變 15 ΗΜ74可以使受體無需與配體結合即具有活性。使受體啟 動的一種方式是改變ΗΜ74，使之在未與配體結合的情況 下即與G蛋白相互作用。這種改變類似於該受體在與配 體結合時發生的構象變化，使得受體能夠結合胞内G蛋 白。WO 00/22129專利提供了這樣的一種方法。 20 [000136] W0 00/22129專利介紹了位於TM6和IC3區域的產 生組成性活性的特疋胺基酸。將該特定胺基酸導入HM74 的各種方法疋本技術領域中已知的，例如定點突變、次選 殖等方法。然後，被改變的HM74分子被表現在寄主細胞 内’即形成具有組成性活性的HM74。 -37· ⑧ [000137] 被啟動的細胞於是暴露於疑為HM74致效劑、拮抗 劑、反致效劑之類的分子，即可改變HM74活性的分子。 在用藥物開發過程中已知的方法治療與HM74代謝改變 相關的疾病過程中，這些改變G蛋白活性的分子則是靶 分子。 [000138] 在本發明上述分析方法的許多具體實施例中，可能需 要固定HM74或靶分子以促進其中任一種或兩種蛋白的 複合形式與非複合形式之間的分離，並便於實現分析的自 動化。試驗化合物與HM74的結合，或在候選化合物存在 或不存在的h況下HM74與乾分子之間的相互作用，可在 任何適合于容納該反應物的容器内實現。這類容器的例子 包括微孔板、試管和微離心管。在一具體實施例中，可以 提供一種融合蛋白，它增加了 一個結構域使得上述任一種 或兩種蛋白均可與一基質結合。例如，谷胱甘肽_s_轉移 酶/HM74融合蛋白、或谷胱甘肽_s_轉移酶/靶分子融合蛋 白可被吸附在谷胱甘肽瓊脂糖珠上（Sigma Chemical，St Louis，MO)、或谷胱甘肽衍生的微孔板上。然後，該複合 體再與試驗化合物結合，或與該試驗化合物以及未被吸附 的靶分子蛋白或HM74蛋白中任一種蛋白結合，該混合物 在有利於複合體形成的條件（例如在生理鹽和pH值的條 件）下培養。培養完畢後，洗滌瓊脂糖珠或微孔板培養孔， 以除去任何未結合的組分，並按照如上所述的方法直接或 間接地測量複合體的形成。或者，可將該複合體從基質上 解離下來，並使用標準技術測定HM74結合或活性的水 1354552 平。 t〇〇〇139]其他將蛋白固定在基質上的技術也可用於本發明之 • 篩選分析中。例如，可利用生物素和鏈黴親合素蛋白的結 合使HM74固定，或使靶分子固定。生物素化的HM74 5 或乾为子可以用本技術領域内眾所周知的技術（例如生物 素化試劑盒，Pierce Chemicals，Rockford，IL)，從生物素 . _NHS (N—羥基琥珀醯亞胺）來製備。並固定在覆有鏈黴親 _ ΰ素蛋白的96孔培養板内（Pierce Chemicals)。或者，可 與HM74或靶分子反應但不幹擾HM74蛋白與靶分子結合 10 的抗體可在該培養板的培養孔内衍生，未結合的乾分子或 HM74被抗體結合而滞留在孔内。檢測這類複合體的方 法，除了上述用於被谷胱甘肽轉移酶(GST)固定的複合 體的方法以外，還包括使用易與HM74或靶分子反應的抗 體所進行的複合體免疫檢測法，以及依賴於檢測HM74 15 或靶分子相關酶活性的酶聯分析。 [ooomo]在另一具體實施例中，HM74表現的調節劑通過以下 _ 方法得到了鑑定：使細胞與一候選化合物接觸，並測定 HM74 mRNA或蛋白在細胞中的表現。在該候選化合物存 在和不存在這兩種情況下，對HM74 mRNA或蛋白的表 ° 現水平進行了比較。然後，在上述比較的基礎上，該候選 化合物即可被鑑定為HM74表現的調節劑。例如，如果該 候選化合物存在時HM74 mRNA或蛋白的表現水平高於 (統計上顯著地高於）該候選化合物不存在時的表現水 平’則該候選化合物即可被鑑定為HM74 mRNA或蛋白 1354552 表現的刺激劑或致效劑。或者，如果該候選化合物存在時 HM74 mRNA或蛋白的表現水平低於(統計學上顯著地低 於）該候選化合物不存在時的表現水平，則該候選化合物 即被鑑定為HM74 mRNA或蛋白表現的的抑制劑或拮抗 劑。如果在配體或致效劑存在時，或在組成性ΉΜ74内， ΗΜ74的活性下降到基線以下，則該候選化合物即可被鑑 定為反致效劑。ΗΜ74 mRNA或蛋白在細胞内的表現水 平，可通過本文所述的檢測HM74 mRNA或蛋白的方法 而確定。 15 [〇〇額]可以製備大量的純腹74,也可確定可能的功能區域 的構象物理特徵’以用於合理的藥物設計。例如，該分子 的IC3區域和EC結構域都是特別值得注意的區域。一旦 識別了某—區域的形狀和離子結構，就可以設計與這些區 用的候選藥物，然後在完整的細胞、動物和患者 體行磁：產生這種結構資訊的方法包括Χ·射線晶 核磁共振、分子建模等等。該Μ結構還可導致 ϊ針對類似構象部位的識別，對於這些部位存在 物，也位起作用的已知藥物。這些藥物或其衍生 物也许可與ΗΜ74-起應用。 [⑽㈣2]本發明還涉 及其治療用途。 $選分析所鑑定的新穎試劑 [000143] 對於與沾圭 為具有風除（或易串、症見或活性異常相關的疾病，本發明 提供了預防和治療m員或已經患有該疾病的患者 、法。這類疾病包括但不限於炎症性 20 疾病，例如，哮喘、慢性阻塞性肺病和類風濕性關節炎等β [000144] 本發明的一個方面提供了一種方法，通過給患者施用 調節ΗΜ74的表現或調節至少一種ΗΜ74活性的製劑，預 防與ΗΜ74的表現或活性異常相關的疾病或症狀。對於因 ΗΜ74的表現或活性異常所引起或所促成的疾病，可以通 過本文所述的診斷或預診斷分析方法中的一種或數種的 組合來鑒別具有風險的人員。可在以ΗΜ74異常為特徵的 症狀呈現之前即施用預防性製劑，從而可預防疾病或失 調，或者延緩其進程。取決於ΗΜ74異常的類型，可用 ΗΜ74致效劑或ΗΜ74拮抗劑對患者進行治療。根據本文 所述的篩選分析，可以確定合適的製劑。 [000145] 本發明的另一個方面涉及一些出於治療目的而調節 ΗΜ74的表現或活性的方法。本發明的調節方法涉及讓細 胞接觸可調節與細胞連接的ΗΜ74之一種或多種活性的 试劑。調卽ΗΜ74活性的試劑可以是本文所述的試劑，例 如利尿磺胺或氧化萘烷、核酸或者蛋白質、ΗΜ74蛋白的 天然存在的同源配體、狀、ΗΜ74多狀模擬物或其他小分 子。在一具體實施例中’該試劑能刺激ΗΜ74的一種或多 種生物學活性。在另一具體實施例中，該試劑能抑制 ΗΜ74蛋白的一種或多種生物學活性。這種抑制性試劑的 例子包括抗ΗΜ74抗體。這些調節方法可以在體外實現 (例如將細胞與該試劑一起培養），也可以在體内實現(例如 給患者輸入該試劑）。如此，本發明提供了一些治療方法， 用於對患有以ΗΜ74的異常表現或異常活性為特徵之疾 j失調的患者進行治療。在1體實_中該方法涉 使用可前（例如上職下調_74的表現或活性的試 f例如通過本文所述㈣選分析方法而鑑定的試劑）或 各種试劑的組合。 _14匕在麗4被異常下調的情況下和/或在活性的 “很可能產生有益效果的情況下，刺激Η·的活性是 可取的。反之’在HM74被異常上調情況下和/或在hm74 活性的降低很可能產生有益效果的情 4 的活性是可取的。 10 剛:=發明將通過以下實例得到進—步說明，但它們不應 ”疋限制性的。本申請書自始至終引用的所有文 t ”書均係作為參考文獻引述在 此。 15【實施方式】 _ f例1—表現腹74的哺乳動物細胞的製備 •，圓]、編碼麵74的。麗被選殖入—個表現載體並轉染 入哺乳動物細胞，例如CHO細胞或293細胞。 [000149]為了製備過表現HM74的哺乳動物細胞，將哺乳動物 20 細胞接種於6孔35 mm組織培養板中（每孔3 χ 1〇5個哺乳 動物細胞（美國典型培養物保藏中心（ATCC)目錄號： CRL-1573)，每孔加2 ml含10%胎牛血清（Gibco/BRL公 司，目錄號：1600-044)的DMEM培養基(Gibco/BRL公司， 目錄號：11765-054)。 • 42· ⑧ 1354552 [000150] 然後，將細胞置於37°C的C〇2培養箱中培育，直至 細胞鋪滿50-80%。將所選殖的HM74cDNA核酸序列插入 pcDNA 3.1選殖載體中（Invitrogen公司，目錄號： V790-20)。用100 μΐ無血清F12 Ham培養基稀釋2 5 DNA。另取 25 μΐ Lipofectamine 脂質體試劑（Life

Technologies 公司，目錄號：18324-020)，用 1〇〇 μΐ 無也 清F12 Ham培養基稀釋。然後將DNA溶液和 Lipofectamine溶液緩缓混合，於室溫下培養45分鐘，以 •形成DNA-脂質複合體。 ίο [000151] 將細胞用2 ml無血清F12 Ham培養基洗滌一次。對 於每一份轉染反應（每塊6孔板上共6份轉染反應），分別 將0.8 ml無血清F12 Ham培養基加入含有DNA—脂質複 合體的溶液（總體積0.2毫升）中，並緩緩混勻。然後將所 產生的混合物（以下稱為“轉染混合物”)覆蓋(0.8 ml + 0.2 15 ml)在洗蘇過的細胞上。不加抗菌藥物。再將細胞與脂質 ' —DNA複合體一起置於C02培養箱中於37°C共同培養 籲 丨6小時以發生轉染反應。 [000152] 培養結束後，保留該轉染混合物，並在細胞上覆蓋 lml含10%胎牛血清的F12 Ham培養基。轉染18小時後， 20 吸出覆蓋在細胞上的培養基。然後用pH 2-4的 PBS(Gibco/BRL公司，目錄號：10010-023)洗滌細胞，棄 去PBS再加入含5%血清的F12 Ham培養基(“選擇培養 基”）。轉染後72小時後，用含有400 pg/ml抗菌劑 ⑧ 1354552

Genetecin(Life Technologies 公司’目錄號·· 11811)的選擇 培養基將細胞液稀釋10倍。 實例2 —致效劑分析 [000153] 為了篩選人的HM74致效劑’可將HM74以人工方 5 式偶聯在一個Gq結構上。Gq結構的啟動可刺激Ca2+從 • 細胞内部肌質網囊泡的釋放。Ca2+被釋放進細胞質後，可 用Ca2+螯合染料檢測。用螢光成像板讀數器（Fluorometric Imaging Plate Reader )或 FLIPR® 裝置（Molecular Devices ® 公司）監測所產生的任何螢光變化。致效劑的活性通過螢 10 光強度的增加得到反映。 [000154] 表現HM74的CHO-K1細胞預先被設計為可表現某種 無傾向性的Gq蛋白（Gotl6)。為了製備這種細胞，購買了 Gal6-偶聯的 CHO 細胞（Molecular Devices 公司的 LIVEWARE™細胞’目錄號：RD-HGA16)，並遵循實例1 15 的方案，使得HM74表現在這些細胞中。 • [000155] 將細胞置於含10%胎牛血清、1〇〇 iu/ml青黴素 • (Gibco/BRL 公司’目錄號：15140-148)、100 pg/ml 鏈黴 素（目錄號：15140-148，Gibco/BRL 公司）、400 pg/ml geneticin(G418)(Gibco/BRL 公司，目錄號：ι〇ι31·〇35)和 20 200 pg/ml zeocin (Invitrogen 公司，目錄號：R250-05)的 F12 Ham 培養基（Gibco/BRL 公司，目錄號：Π765-054) 内，並於37°C和5% C〇2的條件下維持在對數生長階段。 在進行分析前一天，使用一96/384孔多點加樣器 (Labsystems公司，832型）將CH0_K1細胞按照12 5〇〇細 1354552 胞/孔接種於每孔體積為50 μΐ的384孔透明底分析板上

(Greiner/Marsh公司，目錄號：Ν58102)。將細胞置於370C 含5%C〇2的加濕培養箱中培養(F〇rma Scientific公司3110 型水夾套C02培養箱）。

5 [oooi56]製備以下儲備液：1M Hepes儲備液（pH 7.5)(Gibco/BRL 公司，目錄號：15630_080);用 iNNa〇H - 配製的25〇 mM羧苯磺胺儲備液(Sigma公司，目錄號： P8761);以及用 DMSO(Sigma 公司 D2650)配製的 1 mM Fluo 4-AM染料儲備液(Molecular Probes公司，目錄號： 10 F1 4202)。反應缓衝液用1〇〇〇 ml的Hank’s平衡鹽溶液 (Fisher/Mediatech 公司，目錄號：MT21023)、20 ml 的 1 M Hepes儲備液以及1〇 mi的250 mM羧苯磺胺儲備液配 製。加樣緩衝液配製：將1.6 ml的1 mM Fluo 4-AM染料 儲備液與0.32 ml的普魯蘭尼克酸（piuronic 15 acid)(Molecular Probes 公司，目錄號：P6866)混合，然後 與400 ml上述反應緩衝液以及4 ml胎牛血清混合。 ® [000157]在進行分析前1小時，用96/384孔多點加樣器吸取 新製備的加樣緩衝液，按每孔50 μΐ加入384孔板中。將 細胞置於37°C加濕培養箱中培養以達到最佳染色效果。 20 在即將開始分析之前，用384孔EMBLA細胞洗滌器 (Skatron公司，型號：12386)於每孔加90 μΐ反應緩衝液 洗滌細胞2次。洗滌時吸頭至少離底10 mm，每孔保留 45 μΐ緩衝液。 [000158]將 FLIPR®II 儀器（Molecular Devices 公司）上 CCD 攝 _45- ⑧ 1354552 像機(Princeton Instrum她公司）的光圈刻度調到2〇，曝 =時間調到0.4秒。該攝像機是用於監測細胞板著色的精 確度。 在生理鹽緩衝液中以每孔含量約為1〇_的濃度條 5 彳下，檢驗可能含有氧化萘賴化合物的化合物庫。在加 =化合物之前10秒測量螢光的變化。加入化合物之後， • 帛〜分鐘每秒測量-次螢光’然後，每6秒鐘曝光-次， φ t折實驗總的時間為3分鐘。第10次掃描之後，按5 μ1 :份加入100 μΜ化合物儲備液’使細胞上最終的化合物 10 濃度為10 。記錄最初80次掃插的螢光變化最大值， 作為致效劑活性的標準，並與以1〇 μΜ ATp (Sigma公司 A9〇62)誘導的螢光變化最大值進行比較。 [〇〇〇16〇]經發現，很多氧化萘烷化合物均可啟動HM74。 15 實例3—拮抗劑分析 '[000161]為了篩選人的HM74致效劑，可將HM74以人工方 鲁 式偶聯在一個Gq結構上。與實例2 —樣，可用FLIPR® 儀器監測螢光的變化。拮抗劑的活性通過螢光強度的減小 得到反映。 20 [000162] 如同實例2所述，表現HM74的CHO-K1細胞預先被 設計為可表現某種無傾向性的Gq蛋白（Gal6)。將細胞置 於含10%胎牛血清、100 lU/ml青黴素(Gibco/BRL公司， 目錄號：15140-148)、100 pg/ml鏈黴素（目錄號： 15140-148 ， Gibco/BRL 公司）、400 pg/ml ⑧ 1354552 geneticin(G418)(Gibco/BRL 公司，目錄號：10131-035)和 200 pg/ml zeocin (Invitrogen 公司’目錄號：R250-05)的 F12 Ham 培養基(Gibco/BRL 公司，目錄號：11765 —054) 内，並於37°C和5% C02的條件下維持在對數生長階段。 _5 在進行分析前一天，使用一 96/384孔多點加樣器將 ' CHO-K1細胞按照12,500細胞/孔接種於每孔體積為50 μΐ 的384孔黑色透明底分析板上(Greiner/Marsh公司，目錄 號：N58102)。將細胞置於37°C含5%C02的加濕培養箱 •中培養 ίο [〇〇〇163] 製備以下儲備液：iM Hepes儲備液（PH 7.5)(Gibco/BRL 公司，目錄號：15630-080);用 IN NaOH 配製的250 mM缓苯石夤胺儲備液(Sigma公司，目錄號： P8761);用 DMSO(Sigma 公司 D2650)配製的 1 mM Fluo 4-AM染料儲備液(Molecular Probes公司，目錄號：Π 15 4202);以及配體或拮抗劑的儲備液。反應緩衝液用1000 ml的Hank's平衡鹽溶液(Fisher/Mediatech公司，目錄 ⑩ 號：MT21〇23)、20 ml的1 M Hepes儲備液以及10 ml的 250 mM羧苯磺胺儲備液以及1 mMCaCl2配製配製。加樣 緩衝液配製：將80 μΐ的1 mM Fhio 4-AM染料儲備液與 20 16 μΐ 普魯蘭尼克酸(pluronic acid)(Molecular Probes 公 司’目錄號：P6866)混合，然後與20ml上述反應緩衝液 以及0.2 ml胎牛血清混合。 [0001643在進行分析前30分鐘，用96/384孔多點加樣器吸取 新製備的加樣緩衝液，按每孔30 μ1加入384孔板中。將 •47- 1354552 細胞置於37°C加濕培養箱中培養以達到最佳染色效果。 在即將開始分析之前，用384孔EMBLA細胞洗滌器於每 • 孔加μΐ反應緩衝液洗滌細胞3次。洗滌時吸頭至少 離底40 mm，每孔保留45 μΐ緩衝液。 ,5 [_165]用 Platemate 384 孔板移液器（Matrix 公司）吸取 5 μ1 的100 μΜ拮抗劑化合物儲備液加入細胞液中。在培養過 程中，該化合物濃度約為10 μΜ。將細胞置於FLIPR®n 魯 中’第一分鐘每秒測量一次培養板的螢光，然後，每6 秒鐘曝光一次’分析實驗總的時間為3分鐘。在第10次 1〇 掃描之後，加入拮抗劑或配體（10 μΜ)。每次加樣之後， 384孔板加樣頭用20 μΐ的〇.〇1〇/0 DMSO水溶液洗滌1〇 次。 [000166] 在用候選拮抗劑檢驗之前，可以使Μ74細胞接觸某 種已鑑定的致效劑，也可以不接觸。 15 實例4一受體結合分析 籲[000167]為了製備包含ΗΜ74的細胞膜片段，在含有1 mM EDTA的磷酸鹽緩衝鹽水（10 ml)中培養後收集表現HM74 的CHO細胞系。在重新懸浮於5 ml緩衝液A(50 mM 20 Tris-HCl (pH 7.8)(Sigma 公司 T6791)、5 mM MgCl2 (Sigma 公司 M8266)以及 1 mM EGTA(Sigma 公司 0396))之前， 用含有1 mM EDTA(10 ml)的填酸鹽缓衝鹽水再洗滌細胞 3次。 ⑤ • 48 - 1354552 1〇00168]然後’用組織勻漿器（Polytron 公司，Kinemetica，ΡΤ 10/35型）將細胞打碎1分鐘。將所產生的勻漿用s〇rvall

Instruments公司的rC3B冷凍離心機以49,000 X g於40C 離心2〇分鐘。將所產生的沉澱物重新懸浮於25 ml緩衝 •5 液A中，並重複離心步驟3次。最後一次離心之後，將 該沉澱物再次重新懸浮於5 ml緩衝液A中，分成若干等 份儲存於-70°C。 [000169]用細胞膜片段並以帶放射性標記的所研究的致效劑 # 作為示蹤劑進行受體結合分析。分析在96孔板(Beckman 10 儀器公司）中進行。該結合反應物為18 pg的CHO細胞製 劑，在放射性致效劑（〇·〇1 nM - 25 nM)存在的條件下，在 最終體積為0.2 ml的含有0.1%牛血清白蛋白（sigma公 司，目錄號：34287)的緩衝液A中進行反應（參閱im et al.， J. Biol. Chem. (2000) 275(19):14281-14286)。在室溫下培 15 養該反應物1小時。通過用一多通道收集器（Brandel)上的

Whatman GF/C過濾器進行過濾而終止反應。該多通道收 • 集器預先用0.3%聚乙烯亞胺（Sigma公司，目錄號：P3143) 和0.1%牛血清白蛋白（BSA)處理1小時。將混合物加入 過濾器並培養1小時。過濾器用1 ml pH值為7.6的冰冷 20 50 mM Tris-HC 1溶液洗滌6次。對應於根據放射性而測定 的每個示蹤劑濃度，特異性結合的計算，是以全部結合與 非特異性結合（背景）之間的差異為基礎的。取8至16個 濃度數據點，以確定在致效劑與受體之間的平衡狀態下實 現的致效劑與受體的結合(平衡結合參數）。在一競爭性分 冬 ⑧‘ 析試驗中，將一試驗性化合物加入該混合物，在與受體的 結合方面與放射性致效劑競爭（競爭結合值）。繪製抑制曲 線以確定對於結合的抑制達50%而所需的濃度(IC50)。 實例5 _小分子致效劑 [000170] 如上所述，使一系列氧化萘烷類分子接觸表現HM74 的細胞。對靶分子進行標記以確定是否發生與HM74的結 合。通過測定細胞洗滌後的標記程度來探測這種結合。還 通過二維凝膠電泳法分離HM74以及測定與該蛋白相關 的標記程度來確定這種結合。在對這種結合進行評估之 後，或獨立於這種評估，確定了候選致效劑啟動HM74 的能力。FLIPR分析被用於評價當靶分子與HM74結合時 胞内的妈移動。如此鑑定了引起I弓移動的氧化萘烧分子。 [000171] 本發明現已說明完畢，技術人員將會知道，可以對本 文所介紹的發明内容做出各種各樣的改變和改進，而不背 離此處所介紹的本發明的精神和範圍。 [000172] 本申請書中所引用的所有文獻均以其整體而引述在 此。 •50 ⑧

Claims (1)

1354552 ^ 專利申請案第94丨04732號

ROC Patent Appln. No. 94104732 修正無釗線之申請專利範团中文本一附件(二） Amended Claims in Chinese — EnclYIH (民國100年6月30曰送呈） * (Submitted on June 30,201 ϊ) 十、申請專利範圍： 1. 一種在需要治療的患者體内調節ΗΜ74信號活性或信 . 號傳遞的醫藥組成物，其包含具有以下分子結構的化合 物：

10 15 X— r2 其中X是Ο、NR2或S ; R,是可含有支鏈、雜原子或取代基、或其組合的CrC18 烷基；可含有支鏈、雜原子或取代基、或其組合的 (^-(：18鏈烯基；可含有支鏈、雜原子或取代基、或 其組合的炔基；可含有側基、橋基、雜原子 或取代基、或其組合的C3-C18芳基；或可含有側 基、橋基、雜原子或取代基、或其組合的C5-CI8 環烷基；或其組合； R2 是一個Ri基團，可以是一個含有支鏈、雜原子或 取代基或其組合的（CrC1())烷基(C3-C1{))環烷基；或 者，X和R2可形成一個環； R3 是Η或R!;以及 Υ 是羰基、席夫驗、喔星（oxine)、縮酮、縮酿、11 惡嗤 烧、σ塞吐烧或烯醇g旨。 -51 - 1354552 2. —種具有以下分子結構的化合物之用途：

其中X是Ο、NR2或S ; 是可含有支鏈、雜原子或取代基、或其組合的crc18 烷基；可含有支鏈、雜原子或取代基、或其組合的 (^-(:18鏈烯基；可含有支鏈、雜原子或取代基、或 其組合的crc18炔基；可含有侧基、橋基、雜原子 或取代基、或其組合的c3-c18芳基；或可含有側 基、橋基、雜原子或取代基、或其組合的C5-C! 8 環烷基；或其組合； 是一個Ri基團，可以是一個含有支鏈、雜原子或 取代基或其組合的（Ci-Cio)燒基(C3-C10)環烧基；或 者，X和R2可形成一個環； 是Η或Ri ;以及 是幾基、席夫驗、喔星（oxine)、縮_、縮搭、σ惡唾 烷、噻唑烷或烯醇酯， 其用於製造在需要治療的患者體内調節ΗΜ74信號活 性或信號傳遞之藥物。 3. —種鑑定ΗΜ74致效劑的方法，其包括用表現ΗΜ74的 20 細胞接觸潛在的致效劑，並測定在上述潛在的致效劑存 Ri 10 15 R2 R3 Y -52- 1354552 況下，相對於上述潛在的致效劑不存在的情況， 疋否HM74的信號活性有所捭加， 具有以下結構： ㈣增加’其㈣潛在的致效劑 其中X是0、NR2或S ; 1 :、雜原子或取代基、或其組合的CrCi8 3 3有支鏈、雜原子或取代基、或其組合的 鏈烯基；可含有支鏈、雜原子或取代基、或 …组&的cvc,8炔基；可含有側基、橋基、雜原子 或取代基、或其組合的c3_Ci8芳基；或可含有側 t、橋基、雜原子或取代基、或其組合的c5-c18 環烧基；或其組合； R2疋個R]基圑，可以是一個含有支鍵、雜原子或 取代基或其組合的说基(CVC1Q)環烧基；或 者，X和R2可形成一個環； I是Η或& ;以及 Υ是幾基、席夫驗、喔星、、_、祕ϋ炫、嗔 唑烷或烯醇酯。 :種鑑定ΗΜ74反致效劑的方法，其包括用表現麗4 的細胞接觸潛在的反致效劑，並測定在上述潛在的反致 •53· 1354552 效劑存在的情況下，相對於上述潛在的反致效劑不存在 的情況，是否HM74的信號活性有所下降，以及在一種 致效劑存在的情況下是否有所下降，其中該潛在的反致 效劑具有以下結構：

X- R2

其中X是Ο、NR2或S ; 10

15 R]是可含有支鍵、雜原子或取代基、或其組合的C1-C18 烷基；可含有支鏈、雜原子或取代基、或其組合的 (^-(:18鏈烯基；可含有支鏈、雜原子或取代基、或 其組合的CrC18炔基；可含有側基、橋基、雜原子 或取代基、或其組合的C3-C18芳基；或可含有側 基、橋基、雜原子或取代基、或其組合的C5-C18 環烷基；或其組合； R2 是一個R!基團，可以是一個含有支鏈、雜原子或 取代基或其組合的（C!-Ci〇)烧基(〇3-〇1〇)极烧基，或 者，X和R2可形成一個環； R_3 是Η或R!;以及 Υ 是羰基、席夫鹼、喔星、縮酮、縮醛、噁唑烷、噻 峻院或稀醇酯。 5. 一種鑑定ΗΜ74拮抗劑的方法，其包括用表現ΗΜ74的 -54- 20 1354552 細胞接觸潛在的拮抗劑，並測定在上述潛在的拮抗劑存 在的情況下，相對於一潛在致效劑存在的情況，是否 HM74的信號活性有所下降，其中該潛在的拮抗劑具有 以下結構：

X- R2

其中X是ο、nr2或s ; 10

15 Ri是可含有支鏈、雜原子或取代基、或其組合的CrC!8 烷基；可含有支鏈、雜原子或取代基、或其組合的 <^-(：18鏈烯基；可含有支鏈、雜原子或取代基、或 其組合的crc18炔基；可含有側基、橋基、雜原子 或取代基、或其組合的c3-c18芳基；或可含有側 基、橋基、雜原子或取代基、或其組合的c5-c18 環烷基；或其組合； R_2 是一個Ri基團，可以是一個含有支鍵、雜原子或 取代基或其組合的（Ci-Cw)烷基(C3-C1())環烷基；或 者，X和112可形成一個環； R3 是Η或R1 ;以及 Υ 是羰基、席夫鹼、喔星、縮酮、縮醛、噁唑烷、噻 σ坐烧或稀醇酉旨。 6. —種調節炎症反應的醫藥組成物，其包含炎症調節劑量 -55- 20 1354552 之具有以下結構式的化合物：

R2 其中X是Ο、NR2或s ;

R!是可含有支鏈、雜原子或取代基、或其組合的Ci_Ci8 烧基；可含有支鏈、雜料或取代基、或其組合的 CrCu鏈烯基；可含有支鏈、雜原子或取代基、或 其組合的CrC〗8块基；可含有侧基、橋基、雜原子 或取代基、或其組合的C3_Cis芳基；或可含有側 基、橋基、雜原子或取代基、或其組合的c5_ 10 環烷基；或其組合； 8 I是一個R!基團，可以是一個含有支鏈、雜原子或 取代基或其組合的（CVCm)烷基(C3_CiQ)環烷基；或 者，X和R2可形成一個環； I 是Η或心；以及 15 Υ是羰基、席夫鹼、喔星、縮酮、縮醛、噁唑烷、嘍 唑烷或烯醇酯。 —種具有下式的化合物之用途： -56· 1354552

, 其申x是〇、nr2或s ; & =含有支鏈、雜原子絲代基、或其組合的cvcls f基，可含有支鏈、雜原子或取代基、或其組合的 • C「C18鏈稀基，·可含有支鏈、雜原子或取代基、或 其組合的CVC18块基；可含有側基、橋基、雜原子 或取代基、或其組合的c3_Ci8芳基；或可含有側 基、橋基、雜原子或取代基、或其組合的C5_C18 環烷基；或其組合； 10 R2是一個Ri基團，可以是一個含有支鏈、雜原子或 取代基或其組合的（CrC1Q)烷基(c3_c一環烷基；或 ， 者’ X和R2可形成一個環； , R3是Η或R];以及 Υ 疋务·基、席夫驗、喔星、縮_、縮路、β惡嗤烧、0塞 15 ^ 唑烷或烯醇酯， 其係用於製造供調節炎症反應的藥物。 -57-