JP5742900B2 - 糖尿病治療薬 - Google Patents
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Description
このような状況下、本発明者らは、「糖取り込み亢進剤」の作用を引き起こす細胞内の結合蛋白質(以下「作用標的分子」と記す)、さらにはその作用が起こる分子機構(以下「作用メカニズム」と記す)を明らかにすることによって本発明を完成させた。すなわち、本発明は次のような血糖降下作用を有する化合物または糖尿病治療薬、そのような化合物または糖尿病治療薬のスクリーニング方法、そのスクリーニング方法で用いることのできるプローブ化合物などを提供する。
R1は、置換基を1〜3個有してもよい、低級アルキル基、低級アルケニル基、低級アルキニル基または低級アルコキシ基を示し、
−X−及び−Y−は同一または異なってもよく、それぞれ独立して水素原子、−O−、−NR2−、−S−、−SO−、−SO2−、−CH2−、−CR3R4−、−COO−、−CONR2−または−CO−(式中R2は水素原子、置換基を有してもよい低級アルキル基、置換基を有してもよいアシル基、置換基を有してもよいアルコキシカルボニル基、置換基を有してもよいカルバモイル基、または置換基を有してもよいスルホニル基を示し、R3及びR4は同一または異なってもよく、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、アルキル基、メルカプト基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルスルホニル基、アシル基、アシルオキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、ニトロ基、シアノ基、またはトリフルオロメチル基を示す)を示し、
−W−は、置換基を有してもよい炭素数1〜20のアルキル鎖であり、その炭素原子の1〜10個は−O−、−NR5−、−S−、−SO−、−SO2−、または−CO−で置き換えられていてもよく(式中R5は、水素原子、置換基を有してもよい低級アルキル基、置換基を有してもよいアシル基、置換基を有してもよいアルコキシカルボニル基、置換基を有してもよいカルバモイル基、または置換基を有してもよいスルホニル基を示す)、
Qは、水素原子、ビオチン、発蛍光団、発色団、化学発光官能基、酵素、固相、ジアゾ基、またはアジド基を示す。また、式中1つ以上の原子が放射性同位元素であってもよい。但し、
i) 置換基を有してもよい場合の置換基とは、ハロゲン原子、水酸基、アルキル基、メルカプト基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルスルホニル基、アシル基、アシルオキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、ニトロ基、シアノ基、トリフルオロメチル基、アリール基、ヘテロアリール基、ジアゾ基、及びアジド基(好ましくは、ハロゲン原子、水酸基、アミノ基、低級アルキルアミノ基、アリール基、ヘテロアリール基、低級アルキル基及び低級アルコキシ基)からなる群から選ばれ、また、これらの置換基はビオチン標識、発蛍光団標識、発色団標識、化学発光標識、あるいは酵素標識されてもよく、
ii) −X−が水素原子である場合は、−W−、−Y―、または、Qをすべて有さず、
iii) −Y−が水素原子である場合は、Qを有さない。}
(4)一般式(I)で表されるラクタム化合物のうち、Xが水素原子であり、少なくとも一般式(I)内の1つ以上の原子が放射線同位体である上記(1)記載の方法。
(B)被検物質の存在下、当該化合物と当該蛋白質とを接触させる工程、および
(C)当該化合物と当該蛋白質の結合に対する被検物質の阻害活性を測定する工程、
を含む、上記(1)〜(4)のいずれかに記載の方法。
(5a)固相に固定化した当該蛋白質に、被検物質の存在下または非存在下に当該化合物を接触させ、固相に結合した当該化合物の量を測定することによって、当該化合物と当該蛋白質の結合に対する被検物質の阻害活性を測定する、上記(5)に記載の方法。
(5b)固相に固定化した当該化合物に、被検物質の存在下または非存在下に当該蛋白質を接触させ、固相に結合した当該蛋白質の量を測定することによって、当該化合物と当該蛋白質の結合に対する被検物質の阻害活性を測定する、上記(5)に記載の方法。
(5c)被検物質の存在下または非存在下に、当該化合物と当該蛋白質を接触させ、当該蛋白質と当該化合物の結合量を測定することによって、当該化合物と当該蛋白質の結合に対する被検物質の阻害活性を測定する、上記(5)に記載の方法。
(5d)被検物質の存在下で接触させた場合の結合量と、被検物質の非存在下で接触させ
た場合の結合量とを比較することによって、当該化合物と当該蛋白質の結合に対する被検
物質の阻害活性を測定する、上記(5a)〜(5c)のいずれかに記載の方法。
(5e)さらに、3量体GTP結合蛋白質βサブユニットの存在下(あるいは3量体GTP結合蛋白質βサブユニットと結合した状態で)、被検物質のフォスフォイノシタイド3−キナーゼ(特に、サブタイプβ)に対する酵素活性亢進活性を測定する工程を含む、上記(5)に記載の方法。
(5f)さらに、被検物質のAktリン酸化活性を測定する工程を含む、上記(5)または(5e)に記載の方法。
(5g)さらに、被検物質の糖取り込み活性を測定する工程を含む、上記(5)、(5e)または(5f)に記載の方法。
(7)(A)3量体GTP結合蛋白質βサブユニット(当該蛋白質)を固相に固定する工程、
(B)被検物質を当該蛋白質に接触させる工程、および
(C)一般式(I)で示された化合物またはその製薬学的に許容される塩(当該化合物)、酸、塩基または変性剤を含有する溶液を用いて、工程(B)において当該蛋白質に結合した化合物を溶出する工程、
を含む血糖降下作用化合物を同定する方法。
(8)3量体GTP結合蛋白質βサブユニットに結合する血糖降下作用化合物を有効成分とする糖尿病治療薬。
(8a)3量体GTP結合蛋白質βサブユニットに結合する血糖降下作用化合物を哺乳動物に有効量投与することを含む、糖尿病の治療方法。
(8b)3量体GTP結合蛋白質βサブユニットに結合する血糖降下作用化合物の糖尿病治療のための使用。
(8c)3量体GTP結合蛋白質βサブユニットに結合する血糖降下作用化合物の、糖尿病治療薬の製造のための使用。
(9a)3量体GTP結合蛋白質βサブユニットに結合し、フォスフォイノシタイド3−キナーゼの酵素活性を亢進することを主作用とする血糖降下作用化合物を哺乳動物に有効量投与することを含む、糖尿病の治療薬方法。
(9b)3量体GTP結合蛋白質βサブユニットに結合し、フォスフォイノシタイド3−キナーゼの酵素活性を亢進することを主作用とする血糖降下作用化合物の糖尿病治療のための使用。
(9c)3量体GTP結合蛋白質βサブユニットに結合し、フォスフォイノシタイド3−キナーゼの酵素活性を亢進することを主作用とする血糖降下作用化合物の、糖尿病治療薬の製造のための使用。
(10)3量体GTP結合蛋白質βサブユニットに対し、一般式(I)で示された化合物の、当該蛋白質に結合する部位と同一の部位に結合する化合物を有効成分とする糖尿病治療薬。
(10a)3量体GTP結合蛋白質βサブユニットに対し、一般式(I)で示された化合物の、当該蛋白質に結合する部位と同一の部位に結合する化合物を哺乳動物に有効量投与することを含む、糖尿病の治療方法。
(10b)3量体GTP結合蛋白質βサブユニットに対し、一般式(I)で示された化合物の、当該蛋白質に結合する部位と同一の部位に結合する化合物の糖尿病治療のための使用。
(10c)3量体GTP結合蛋白質βサブユニットに対し、一般式(I)で示された化合物の、当該蛋白質に結合する部位と同一の部位に結合する化合物の、糖尿病治療薬の製造のための使用。
(10d)3量体GTP結合蛋白質βサブユニットに対し、一般式(I)で示された化合物と競合的に結合する化合物を有効成分とする糖尿病治療剤。
(12)3量体GTP結合蛋白質βサブユニットとフォスフォイノシタイド3−キナーゼの結合を亢進する化合物を検出することを特徴とする血糖降下作用化合物のスクリーニング方法。
(13)フォスフォイノシタイド3−キナーゼのサブタイプがβであることを特徴とする上記(11)又は(12)に記載のスクリーニング方法。
i) 置換基を有してもよい場合の置換基とは、ハロゲン原子、水酸基、アルキル基、メルカプト基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルスルホニル基、アシル基、アシルオキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、ニトロ基、シアノ基、トリフルオロメチル基、アリール基、ヘテロアリール基、ジアゾ基、及びアジド基からなる群から選ばれ、また、これらの置換基はビオチン標識、発蛍光団標識、発色団標識、化学発光標識、あるいは酵素標識されてもよく、
ii) −X−が水素原子である場合は、−W−、−Y―、または、Qをすべて有さず、
iii) −Y−が水素原子である場合は、Qを有さない。
さらに、一般式(I)中、以下a)からf)のいずれかの条件が満たされる。
a) X-及び-Y-が共に水素原子以外であり、Qがビオチン、発蛍光団、発色団、化学発光官能基、または酵素である;
b) -X-及び-Y-が共に水素原子以外であり、Qがジアゾ基、またはアジド基である;
c) -X-及び-Y-が共に水素原子以外であり、Qが固相である;
d) 1つ以上の原子が放射線同位体である;
e) 少なくとも1つ以上の、ビオチン標識、発蛍光団標識、発色団標識、化学発光標識、あるいは酵素標識された置換基を有する;または
f) 置換基として少なくとも1つ以上のジアゾ基あるいはアジド基を有する。}
(16)置換基を有してもよい場合の置換基がビオチン標識、発蛍光団標識、発色団標識、化学発光標識、あるいは酵素標識されていない、上記(15)記載の化合物またはその製薬学的に許容される塩。
(17)-X-及び-Y-が共に水素原子以外であり、Qがジアゾ基、またはアジド基である、上記(14)に記載の化合物またはその製薬学的に許容される塩。
(18)置換基を有してもよい場合の置換基がビオチン標識、発蛍光団標識、発色団標識、化学発光標識、あるいは酵素標識されていない、上記(17)記載の化合物またはその製薬学的に許容される塩。
(20)一般式(I)内の1つ以上の原子が放射線同位体である、上記(14)に記載の化合物またはその製薬学的に許容される塩。
(21)Xが水素原子である、上記(20)記載の化合物またはその製薬学的に許容される塩。
(22)少なくとも1つ以上の、ビオチン標識、発蛍光団標識、発色団標識、化学発光標識、あるいは酵素標識された置換基を有する、上記(14)に記載の化合物またはその製薬学的に許容される塩。
(23)置換基として少なくとも1つ以上のジアゾ基あるいはアジド基を有する、上記(14)記載の化合物またはその製薬学的に許容される塩。
但し、
i) 置換基を有してもよい場合の置換基とは、ハロゲン原子、水酸基、アルキル基、メルカプト基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルスルホニル基、アシル基、アシルオキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、ニトロ基、シアノ基、トリフルオロメチル基、アリール基、ヘテロアリール基、ジアゾ基、及びアジド基からなる群から選ばれる。}
また、「芳香環」とは、炭素原子で構成される単環または2つの環からなる芳香環を表し、具体的に例えばベンゼン環、ナフタレン環、インデン環、フルオレン環などがあげられ、好ましくはベンゼン環、ナフタレン環などがあげられる。
また、「複素環」とは、炭素および窒素、酸素、イオウなどで構成される4〜9員の1〜3つの環からなる複素環を表し、具体的に例えば、ピリジン環、ジヒドロピラン環、ピリダジン環、ピリミジン環、ピラジン環、ピロール環、フラン環、チオフェン環、オキサゾール環、イソオキサゾール環、ピラゾール環、イミダゾール環、チアゾール環、イソチアゾール環、チアジアゾール環、ピロリジン環、ピペリジン環、ピペラジン環、インドール環、イソインドール環、ベンゾフラン環、イソベンゾフラン環、ベンゾチオフェン環、ベンゾピラゾール環、ベンゾイミダゾール環、ベンゾオキサゾール環、ベンゾチアゾール環、プリン環、ピラゾロピリジン環、キノリン環、イソキノリン環、ナフチリジン環、キナゾリン環、ベンゾジアゼピン環、カルバゾール環、ジベンゾフラン環、などがあげられ、好ましくはピリジン環、フラン環、チオフェン環、ベンゾフラン環、ベンゾチオフェン環、インドール環などがあげられ、より好ましくはチオフェン環、ベンゾフラン環、ベンゾチオフェン環、インドール環などがあげられる。
また、「脂肪族環」とは、炭素原子で構成される単環または2つの環からなる脂肪族環を表し、具体的に例えばシクロプロパン環、シクロブタン環、シクロペンタン環、シクロヘキサン環、シクロヘプタン環、シクロオクタン環、デカリン環、ノルボルナン環などがあげられ、好ましくはシクロヘキサン環があげられる。
低級アルコキシ基とは、低級アルキル基を有するアルコキシ基を示す。
アリール基とは、炭素原子で構成される炭素数5〜12の単環または2環よりなる芳香族置換基を示し、具体的に例えばフェニル基、インデニル基、ナフチル基、フルオレニル基などがあげられ、好ましくはフェニル基があげられる。
ハロゲン原子とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子があげられる。
アルケニル基とは、炭素数1〜6の直鎖もしくは分岐鎖もしくは環状のアルケニル基を示し、具体的に例えばビニル基、1-プロペニル基、2-プロペニル基、イソプロペニル基、1-ブテニル基、2-ブテニル基、3-ブテニル基などがあげられる。アルキニル基とは、炭素数1〜6の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基を示し、具体的に例えばエチニル基、1-プロピニル基、2-プロピニル基、1-ブチニル基、2-ブチニル基、3-ブチニル基などがあげられる。
アルキルチオ基とは、炭素数1〜12、好ましくは1〜6の直鎖または分岐鎖状または環状のアルキル基を有するアルキルチオ基を示し、具体的に例えばメチルチオ基、エチルチオ基、n-プロピルチオ基、イソプロピルチオ基、n-ブチルチオ基、イソブチルチオ基、sec-ブチルチオ基、tert-ブチルチオ基、シクロプロピルチオ基、シクロブチルチオ基、シクロペンチルチオ基、シクロブチルチオ基などがあげられる。
アシル基とは、ホルミル基、または炭素数1〜6の直鎖もしくは分岐鎖もしくは環状のアルキル基を有するアシル基、または炭素数1〜6の直鎖もしくは分岐鎖もしくは環状のアルケニル基を有するアシル基、または炭素数1〜6の直鎖もしくは分岐鎖もしくは環状のアルキニル基を有するアシル基、または置換されていてもよいアリール基を有するアシル基であり、具体的に例えばホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、バレリル基、イソバレリル基、ピバロイル基、ヘキサノイル基、アクリロイル基、メタクリロイル基、クロトノイル基、イソクロトノイル基、ベンゾイル基、ナフトイル基などがあげられる。
アシルオキシ基とは、ホルミルオキシ基、または炭素数1〜6の直鎖もしくは分岐鎖もしくは環状のアルキル基を有するアシルオキシ基、または置換されていてもよいアリール基を有するアシルオキシ基を示し、具体的に例えばホルミルオキシ基、アセチルオキシ基、プロピオニルオキシ基、ブチリルオキシ基、イソブチリルオキシ基、バレリルオキシ基、イソバレリルオキシ基、ピバロイルオキシ基、ヘキサノイルオキシ基、アクリロイルオキシ基、メタクリロイルオキシ基、クロトノイルオキシ基、イソクロトノイルオキシ基、ベンゾイルオキシ基、ナフトイルオキシ基などがあげられる。
アルコキシカルボニル基とは、炭素数1〜8の直鎖または分岐鎖または環状のアルキル基を有するアルコキシカルボニル基を示し、具体的に例えばメトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、プロポキシカルボニル基、イソプロポキシカルボニル基、n-ブトキシカルボニル基、イソブトキシカルボニル基、sec-ブトキシカルボニル基、tert-ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基などがあげられる。
カルバモイル基とは、窒素上に炭素数1〜6の直鎖または分岐鎖または環状のアルキル基を有してもよいカルバモイル基であり、具体的に例えばカルバモイル基、N−メチルカルバモイル基、N−エチルカルバモイル基、N,N−ジメチルカルバモイル基、N−ピロリジルカルボニル基、N−ピペリジルカルボニル基、N−モルホリニルカルボニル基などがあげられる。
スルホニル基とは、硫黄原子上に炭素数1〜6の直鎖または分岐鎖または環状のアルキル基を有してもよいスルホニル基であり、具体的に例えばメチルスルホニル基、エチルスルホニル基、プロピルスルホニル基、ブチルスルホニル基、などがあげられる。
また、固相とは、化合物や蛋白質を固定化できる固体、半固体、固溶体であり、具体的には例えば、容器(チューブ、ウェル、プレート)、担体(レジン、ゲル)、シート状、粉末状あるいは棒状の樹脂、ポリマーなどが挙げられるが、化合物や蛋白質を固定化できる器質であればこれらの例には限定されない。
式(I)において、「R1」は、好ましくは、水酸基、アリール基(芳香環基)、ヘテロアリール基(複素環基)、シクロアルキル基、アルコキシ基、ハロゲン原子で置換されている低級アルキル基、低級アルケニル基、低級アルキニル基または低級アルコキシ基などから選択され、より好ましくは、アリールC1-2アルキルまたはヘロアリールC1-2アルキル(例えば、ピリジルメチル、チアゾリルメチル)、ヒドロキシメチル基、メトキシメチル基などから選択される。
式(I)において、好ましい-X-W-Y-は、−O-(CH2)1-2-O-(CH2)1-2-NH−、−O-(CH2)1-2-O-(CH2)1-2-NHCO(CH2)4-6-NH−などである。
なお、式(I)で示される化合物またはその類似化合物の製造方法は、例えば、特許文献1〜4に記載されており、式(I)で示される化合物は、これらの文献の記載および当業者の技術常識に基づいて容易に製造することができる。
「糖取り込み亢進剤」とは、生理的に糖(グルコースおよびそのアナログ等)を細胞内に取り込む細胞、組織に添加することにより、糖取り込み能を上昇させる薬剤、化合物を表し、例えば、具体的には特許文献1〜4に記載の化合物のうち、細胞に対して実質的に糖の取り込み促進活性を示す化合物のことを表し、たとえば一般式(I)(Xが水素原子)で示される化合物を表す。
「作用標的分子」とは、「糖取り込み亢進剤」が直接あるいは間接的に結合する、細胞に発現している蛋白質を表し、特に糖取り込み活性あるいはAktリン酸化のために必要な蛋白質を表す。
「作用メカニズム」とは、「糖取り込み亢進剤」の作用標的分子に対する結合以降に生じる反応、例えば2分子以上の蛋白質間の結合亢進/低下、酵素活性の亢進/低下、蛋白質のリン酸化量の変化等のことを表し、特に糖取り込み活性あるいはAktリン酸化のために必要な変化を表す。
「血糖降下作用化合物」とは、生体に投与した際に血糖値を実質的に降下させる化合物を表し、糖尿病治療薬として使用可能である。
(「糖取り込み亢進剤」の作用指標の検出)
上記の背景に基づき、本発明者らはまず特許文献1〜4(「糖取り込み亢進剤」に関する特許)に記載の一般式(I)(Xが水素原子)の構造を有するいくつかの化合物あるいはその構造をもとに鋭意検討を行い構造展開した化合物を合成し、インスリンの糖取り込み作用時に起きることが知られているAktのリン酸化と(非特許文献2)、糖取り込み活性の強さを測定、比較した。その結果、測定した化合物のAktリン酸化の強さと糖取り込み活性の強さは良い相関を示すことから、「糖取り込み亢進剤」の糖取り込み作用時においても、Aktリン酸化が起きることが示された。
さらに本発明者らは、特許文献1〜4に記載の化合物をもとに、作用標的分子、作用メカニズムを解明するために使用する化合物(以下「プローブ化合物」と記す)の設計を行った。「プローブ化合物」は、特許文献1〜4に記載の「糖取り込み亢進剤」の活性に必要と思われる母核を持ち、リンカー構造を介して、固相(容器、担体など)に固定可能な残基あるいは結合の検出に有用な残基を結合させた化合物、あるいは検出を可能にするためにラジオアイソトープで原子を置換した化合物を設計、合成を行い、種々の有用な化合物を得た。
このようなプローブ化合物は、後述した通り、「糖取り込み亢進剤」の作用標的分子、作用メカニズムを解明するために有用である。さらに、これらのプローブ化合物は新たな「糖取り込み亢進剤」を得るためのスクリーニングに用いることが可能であり、有用である。
本発明者らはさらに、特許文献1〜4に記載の「糖取り込み亢進剤」の作用標的分子を同定するため、さらに研究を行い、上述した「プローブ化合物」を用いて、それらが結合する細胞内の蛋白質の探索を進めた。まず、「プローブ化合物」の一例として、特許文献3に記載の、強い糖取り込み活性を有する化合物1(後述の実施例1の化合物)に対し、トリチウム原子を含むラジオアイソトープ標識体を合成し、「糖取り込み亢進剤」が作用する培養動物細胞の細胞膜に対する結合能を測定した。「糖取り込み亢進剤」の培養動物細胞への作用は、具体的にはヒト肝臓由来のHLF細胞を用い、作用の指標としてAktのリン酸化作用を測定した。化合物1のAktリン酸化作用とラジオアイソトープ標識体の結合活性はほぼ同程度の濃度において飽和的に見られたことから、ラジオアイソトープ標識体が結合した蛋白質は、「糖取り込み亢進剤」の糖取り込み、Aktリン酸化が生じるための作用標的分子の1つであることが非常に強く示唆された。
本発明者らは上記知見をもとに、さらに「糖取り込み亢進剤」の作用メカニズムの解明を行った。その結果、まず、阻害剤を用いた種々の検討によるデータから、「糖取り込み亢進剤」の作用メカニズムにフォスフォイノシタイド3−キナーゼのうちβあるいはδサブタイプが関与する知見を得た。フォスフォイノシタイド3−キナーゼβは3量体GTP結合蛋白質βサブユニットに結合し、その酵素作用が亢進することが報告されていることから(非特許文献4:Maierら、Journal of Biological Chemistry、274、29311、(1999))、本発明者らは、3量体GTP結合蛋白質βサブユニットに結合する「糖取り込み亢進剤」が、3量体GTP結合蛋白質βサブユニットを介してフォスフォイノシタイド3−キナーゼβの活性を亢進する可能性を見出した。
i)「糖取り込み亢進剤」は糖取り込み活性を示すがN-deacetylcolchicineは示さない。
ii)「糖取り込み亢進剤」はAktのリン酸化を示すがN-deacetylcolchicineは示さない。
iii)「糖取り込み亢進剤」とN-deacetylcolchicineの3量体GTP結合蛋白質βサブユニット結合に対する結合は互いに競合しない。
iv)「糖取り込み亢進剤」はフォスフォイノシタイド3−キナーゼβの活性の亢進作用を3量体GTP結合蛋白質βサブユニット存在下で示すのに対し、N-deacetylcolchicineはフォスフォイノシタイド3−キナーゼγの活性の亢進作用を3量体GTP結合蛋白質βサブユニット存在下で示すことが報告されている。(しかしながら、本発明で実施した限りでは、報告されているような亢進作用は見られなかった。)
上記の知見より、本発明者らは、3量体GTP結合蛋白質βサブユニットに結合する「糖取り込み亢進剤」が、3量体GTP結合蛋白質βサブユニットを介したフォスフォイノシタイド3−キナーゼβの活性亢進作用を示すという結論に達した。
〔3〕本発明のプローブ化合物
本発明のプローブ化合物は、上記一般式(I)で示される化合物またはその製薬学的に許容される塩である。一般式(I)で表されるラクタム化合物のうち、−X−及び−Y−が共に水素原子以外であり、Qがビオチン、発蛍光団、発色団、化学発光官能基、または酵素であり、置換基を有してもよい場合の置換基がビオチン標識、発蛍光団標識、発色団標識、化学発光標識、あるいは酵素標識されていない、上記(14)記載のラクタム化合物またはその製薬学的に許容される塩がより好ましい。その中でも、Qはビオチンが好ましい。
また、一般式(I)で表されるラクタム化合物のうち、Xが水素原子であり、少なくとも一般式(I)内の1つ以上の原子が放射線同位体である上記(14)記載のラクタム化合物またはその製薬学的に許容される塩が特に好ましい。その中でも、R1が置換基を有してもよい低級アルキル基を有し、そのうちの1つ以上の原子が放射性同位体であることが好ましい。
これらの化合物は、例えば、特許文献1〜4に記載の公知の調製方法に従い合成することが可能である。放射性標識は、例えば3H、14C、125I、32P、33P、35S等のラジオアイソトープを分子内に有する化合物を表し、これらラジオアイソトープを含む化合物を原料として用いることで調製することが可能であり、一つの例としてはNaBH4の代わりにNaB3H4を用いて化合物の還元反応を行うことによって調製可能である。また、発蛍光団標識は、例えばフルオロセイン、クマリン、ローダミン、テキサスレッド、Cy3、Cy5、Alaxa化合物等、例えばHandbook of Fluorescent Probes and Research Products, Ninth Edition(Richard P. Haugland著, Molecular Probes社版)に記載の蛍光を有する化合物を、目的の化合物の原料となる化合物のアミノ基、カルボキシル基、水酸基、チオール基等に反応させ結合することにより調製可能である。発色団標識は、例えばニトロベンゼン、ニトロアニリン、アミノピリジン等の置換芳香環、置換複素芳香環を有する残基、あるいはピレン、アクリジン等の高度に共役した芳香環、複素芳香環を有する残基等、好ましくは230nm以上の高波長の極大値におけるモル吸光係数(log10ε)が3.5以上、より好ましくは4.0以上である残基を含む吸光性の高い化合物、あるいは色素化合物を、化学発光標識は、例えばルシフェリン等の酵素存在下で発光反応を示す化合物あるいはルミノールなどの金属イオン存在下で発光反応を示す化合物等、酵素標識は、例えばアルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、βガラクトシダーゼ等の酵素を、上記発蛍光団標識と同様の方法、あるいはクロスリンカー化合物を用いて分子間に架橋を行うことによって調製可能である。
次に、本発明は、(1)上記一般式(I)で示される化合物(当該化合物)及び3量体GTP結合蛋白質βサブユニット(当該蛋白質)を用いて、当該化合物と当該蛋白質の結合に対する被検物質の阻害活性を測定することによって、血糖降下作用化合物をスクリーニングする方法を提供する。
さらに、本発明は、(5)
(A)上記一般式(I)で示される化合物(当該化合物)と3量体GTP結合蛋白質βサブユニット(当該蛋白質)とを接触させる工程、
(B)被検物質の存在下、当該化合物と当該蛋白質とを接触させる工程、および
(C)当該化合物と当該蛋白質の結合に対する被検物質の阻害活性を測定する工程、
を含む血糖降下作用化合物をスクリーニングする方法を提供する。
ここで、「3量体GTP結合蛋白質βサブユニット」とは、単量体でも良く、γサブユニットとの2量体でも良く、またα、γ両サブユニットとの3量体でも実質的にβサブユニットを有していれば良い。3量体GTP結合蛋白質βサブユニットはいかなる生物由来のものでも良く、例えばヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ、ウサギ由来のものなどが挙げられる。また、3量体GTP結合蛋白質βサブユニットは自然界に存在する細胞、組織から抽出したものでも良いが、遺伝子工学的手法を用いて細胞、組織に発現させたものを抽出して用いても良く、さらに未精製のものを用いても良いが、精製したものでも良い。3量体GTP結合蛋白質βサブユニットの精製法は、自然界に存在する3量体GTP結合蛋白質βサブユニットの精製法の一例としては、Sternweisら(非特許文献8:Sternweisら、Journal of Biological Chemistry、259、13806、(1984))の報告した方法等が挙げられる。遺伝子工学的に作成した3量体GTP結合蛋白質βサブユニットの精製法の一例としては、Kozasaら(非特許文献9:Kozasaら、Journal of Biological Chemistry、270、1734、(1995))の報告した方法等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
遺伝子工学的手法を用いて取得した3量体GTP結合蛋白質βサブユニットは、それぞれ報告されているアミノ酸配列のものをそのまま使用することも出来るが、遺伝子変異により適宜アミノ酸配列の変異を行ったものであっても、実質の活性を保っているものであれば使用可能である。さらに、3量体GTP結合蛋白質α、β、γのサブユニットのうちいずれかあるいは複数のサブユニットのアミノ末端、カルボキシ末端あるいはアミノ酸配列の途中部分に、検出あるいは精製を容易にするためのアミノ酸配列、具体例としてヒスチジン残基あるいはその連続配列(poly-His)、c-Myc部分ペプチド(Myc-tag)、hemagglutinin部分ペプチド(HA-tag)、Flag部分ペプチド(Flag-tag)、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)、マルトース結合蛋白質(MBP)等の配列を有するアミノ酸配列を挿入したものでも構わない。
(5a)固相に固定化した当該蛋白質に、被検物質の存在下または不存在下に当該化合物を接触させ、固相に結合した当該化合物の量を測定することによって、当該化合物と当該蛋白質の結合に対する被検物質の阻害活性を測定する、上記(5)に記載の方法。
(5b)固相に固定化した当該化合物に、被検物質の存在下または不存在下に当該蛋白質を接触させ、固相に結合した当該蛋白質の量を測定することによって、当該化合物と当該蛋白質の結合に対する被検物質の阻害活性を測定する、上記(5)に記載の方法。
(5c)被検物質の存在下または不存在下に、当該化合物と当該蛋白質を接触させ、当該蛋白質と当該化合物の結合量を測定することによって、当該化合物と当該蛋白質の結合に対する被検物質の阻害活性を測定する、上記(5)に記載の方法。
なお、上記(5a)〜(5c)の方法では、例えば、被検物質の存在下で接触させた場合の結合量と、被検物質の不存在下で接触させた場合の結合量とを比較することによって、当該化合物と当該蛋白質の結合に対する被検物質の阻害活性を測定することができる。
(A)3量体GTP結合蛋白質βサブユニットを固相に固定する工程、
(B)該3量体GTP結合蛋白質βサブユニットに被検物質を接触させる工程、および
(C)一般式(I)で示された化合物(例えば、実施例1〜実施例10記載の化合物)に結合する化合物、あるいは酸、塩基、変性剤等を加えた溶液を用いて、結合した化合物を溶出する工程を順次行うことによって血糖降下作用化合物をスクリーニングする方法を提供する。
例えば、上記のように合成された化合物ならびに化合物の混合物からなる調製物について、上記(1)〜(7)記載の方法を用いて、活性の高い血糖降下作用化合物を取得することが可能である。すなわち、上記(1)〜(7)記載の方法を用いて、活性の高い血糖降下作用化合物を取得する、あるいは活性の強さの異なる化合物の混合物中からより活性の高い血糖降下作用化合物を取得することが可能であり、この方法を用いて、より有効な血糖降下作用化合物を取得することが可能である。
本発明の概要の項で述べたように、本発明者らは3量体GTP結合蛋白質βサブユニットに結合する化合物が、その結合活性の強さに非常に良く相関して、細胞に対してAktリン酸化作用、糖取り込み作用を引き起こすことを見出した。このように、上記方法を用いて特定することが可能である、3量体GTP結合蛋白質βサブユニットに結合する化合物が糖取り込み亢進作用を示すことは、これまでに知られていない全く新しい知見である。したがって、本発明は、(8)3量体GTP結合蛋白質βサブユニットに結合することを特徴とする血糖降下作用化合物を有効成分とする糖尿病治療薬を提供する。
また、上記したとおり、本発明は、3量体GTP結合蛋白質βサブユニットに結合し、フォスフォイノシタイド3−キナーゼの酵素活性を亢進する化合物を発見したこと、さらにそのような活性を有する化合物がいずれも細胞に対してAktリン酸化、糖取り込み作用を有することを示したものであり、これらの化合物は糖尿病治療薬として利用可能な血糖降下作用物質である。したがって、本発明は、(9)3量体GTP結合蛋白質βサブユニットに結合し、フォスフォイノシタイド3−キナーゼの酵素活性を亢進することを主作用とする血糖降下作用化合物を有効成分とする糖尿病治療薬をも提供する。亢進されるフォスフォイノシタイド3−キナーゼのサブタイプはいずれのものでも良く、また複数のサブタイプに対してでも良いが、好ましくはサブタイプがβであることが良く、より好ましくはβに対して作用を持ち、かつγに対して作用を持たないものが良い。
一方、3量体GTP結合蛋白質βサブユニットに対し、本明細書で「プローブ分子」として用いた一般式(I)で示された化合物に結合する化合物(例えば、実施例1〜実施例10記載の化合物)と同一の結合部位に結合する化合物は、本明細書の実施例に示した事実から、Aktリン酸化、糖取り込み活性を示すことがわかり、このことは本発明における新規な知見である。さらに、GTP結合蛋白質βサブユニットに低分子化合物が結合し何らかの生理反応が起こることによって、Aktリン酸化、糖取り込み活性が生じることはこれまで全く知られていなかった。したがって、本発明は、(10)3量体GTP結合蛋白質βサブユニットに対し、一般式(I)で示された化合物(例えば、化合物1〜7)の、当該蛋白質に結合する部位と同一の部位に結合する化合物を有効成分とする糖尿病治療薬をも提供する。
ここで、当該蛋白質に対して、当該蛋白質に実質的に結合する一般式(I)で示された化合物の結合部位と同一の部位に結合する化合物は、当該蛋白質に対して両者の結合が実質的に競合することを以って定義することができ、例えば本明細書記載の実施例16、実施例22の方法を用いて、簡便に試験することが可能である。
なお、本発明の糖尿病治療薬は、糖尿病治療における全く新たなメカニズム(薬理作用)を知見したことを基礎としている。したがって、本発明の糖尿病治療薬はこの薬理作用を有する化合物を広範に含むものであるが、糖尿病治療作用を有することが知られていた公知化合物(例えば、実施例3、5及び6に記載の化合物)を含むものではない。
また、本発明の糖尿病治療薬は、好ましくは、実施例11に記載の糖取り込み活性の測定方法によって測定された値であって、10μM以下のEC50値を有するものが好ましく、0.1μM以下のEC50値がより好ましく、0.01μM以下のEC50値を有するものが特に好ましい。
さらに、本発明の製剤中における本発明の有効成分の含有量は、製剤の形によって大きく変動し、特に限定されるものではないが、通常は、組成物全量に対して0.01〜100重量%、好ましくは1〜100重量%である。
3量体GTP結合蛋白質βサブユニットとフォスフォイノシタイド3−キナーゼとの協奏作用の測定法は、すでに多くの報告によって一般的に知られており(非特許文献4、非特許文献10:Kerchnerら、Journal of Biological Chemistry、279、44554、(2004))、本発明においては、3量体GTP結合蛋白質βサブユニットに結合し、フォスフォイノシタイド3−キナーゼの酵素活性を亢進する化合物が「糖取り込み亢進剤」としての作用をなし得るという結果を得たことにより、3量体GTP結合蛋白質βサブユニットとフォスフォイノシタイド3−キナーゼの結合を亢進する化合物を特定することによって血糖降下作用化合物のスクリーニングが可能となる。
フォスフォイノシタイド3−キナーゼの活性化によってAktのリン酸化が生じることは広く知れており、本発明の3量体GTP結合蛋白質βサブユニットのフォスフォイノシタイド3−キナーゼに対する酵素活性亢進作用をさらに亢進する化合物が、Aktリン酸化、さらに糖取り込み活性を示すことは想定でき得るが、本発明のような3量体GTP結合蛋白質βサブユニットのフォスフォイノシタイド3−キナーゼに対する酵素活性亢進作用を直接亢進し、さらにAktリン酸化、糖取り込み活性を示すような化合物はこれまでに全く知られておらず、本発明は3量体GTP結合蛋白質βサブユニットのフォスフォイノシタイド3−キナーゼに対する酵素活性亢進作用をさらに亢進する化合物を検出することが、血糖降下作用化合物の効果的なスクリーニングとなりうることを初めて実証したものである。
したがって、本発明は、(11)3量体GTP結合蛋白質βサブユニットのフォスフォイノシタイド3−キナーゼに対する酵素活性亢進作用をさらに亢進する化合物を検出することを特徴とする血糖降下作用化合物のスクリーニング方法を提供する。
実施例25に示したとおり、上記(1)〜(7)の方法で活性が認められた化合物は、フォスフォイノシタイド3−キナーゼと3量体GTP結合蛋白質βサブユニットの結合を亢進することが見出され、3量体GTP結合蛋白質βサブユニットとフォスフォイノシタイド3−キナーゼとの結合を亢進する化合物を検出することによって、血糖降下作用化合物のスクリーニングを行うことが可能である。
フォスフォイノシタイド3−キナーゼと3量体GTP結合蛋白質βサブユニットの結合は、一例として、実施例に示したとおり、両蛋白質の反応後、一方の蛋白質に対する抗体を用いた免疫沈降を行った後、沈降物中に含まれる他方の蛋白質の量を、その蛋白質に対する抗体を用いたウェスタンブロッティング法を用いて測定することが可能である。ただし、上記方法は単なる一例に過ぎず、例えば両蛋白質の抗体を用いたサンドウィッチ法により、測定することが可能である。サンドウィッチ法の具体例としては、酵素免疫固相アッセイ法(Enzyme-linked immuno-sorbent assay:ELISA法)、ラジオイムノアッセイ法等が挙げられ、それぞれの蛋白質をラジオアイソトープ標識、あるいはビオチン標識しておけば、必ずしも抗体を用いなくても両蛋白質の結合を測定することが可能である。具体的には、上記〔4〕で示したように、シンチレーション・プロキシミティ・アッセイ法(Scintilation Proximity Assay: SPA法)、蛍光共鳴エネルギー転移法(Fluorescence Resonance Energy Transfer: FRET法)(TR-FRET法を含む)、AlphaScreen法等の方法が挙げられる。
グリシンエチルエステル塩酸塩(54.68g, 0.392mol)のジクロロメタン溶液(800ml)に、トリエチルアミン(72g, 0.713mmol)を加え0℃に冷却した。3−クロロ−3−オキソブタン酸メチル(48.5g, 0.355mmol)のジクロロメタン溶液(100ml)を30分かけて滴下し、さらに室温で4時間攪拌した。反応終了後、水(1000ml)を加えてジクロロメタン層を分離し、食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を留去した。ここにメタノール(600ml)と活性炭(10g)を加えた。しばらく攪拌し、セライトろ過後、溶媒を除去して、3−エトキシカルボニルメチルアミノ−3−オキソブタン酸メチル(66.9g, 93%)を黄色油状物として得た。
1H-NMR(300MHz, DMSO-d6) δ=1.17(t, J=7.2Hz, 3H), 3.30(s, 2H), 3.60(s,3H), 3.83(d, J=5.7Hz, 2H), 4.07(q, J=7.2Hz, 2H), 8.50(broad t, 1H).
1H-NMR(300MHz, DMSO-d6) δ=3.62(s, 3H), 3.82(s, 2H), 7.50(broad s,1H).
得られた3−メトキシカルボニルピロリジン−2,4−ジオン(39.5g, 0.25mol)に1、4−ジオキサン(2400ml)と水(240ml)を加え、30分間加熱還流した。反応終了後に溶媒を留去し、ピロリジン−2,4−ジオン(テトラミン酸)(24.4g, 100%)を淡黄色固体として得た。
1H-NMR(300MHz, DMSO-d6) ケトン型 δ=2.93(s, 2H),3.77(s, 2H), 8.23(s, 1H)、エノール型 δ=3.74(s, 2H), 4.75(s,1H), 7.07(s, 1H). ケトン型:エノール型=3:2.
1H-NMR(300MHz, DMSO-d6) δ=3.94(s, 2H), 4.56(s, 1H), 4.91(bs, 2H),6.55(dt, J=1.5, 7.5Hz, 1H), 6.72(dd, J=1.5, 7.8Hz, 1H), 6.80(s, 1H), 6.86(dt,J=1.5, 7.5Hz, 1H), 7.02(dd, J=1.5, 7.8Hz, 1H), 8.03(s, 1H); ESI-MS(m/z)190(M+H)+.
ベンゾチオフェン−7−アルデヒド(419mg, 2.58mmol)と工程2で得た4−((2−アミノフェニル)アミノ)−3−ピロリン−2−オン(504mg 2.58mmol)をエタノール(26ml)に溶解した。その溶液に酢酸(30ul, 0.516mmol)を加えて、60℃で18時間攪拌した。溶媒を減圧除去後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(ジクロロメタン:メタノール=91:9)にて精製し、目的物(315mg, 36.7%)を得た。
1H-NMR(300MHz, DMSO-d6) δ=0.76-0.95 (m, 1H), 1.00-1.23(m, 3H),1.41-1.62(m, 3H), 1.85-1.97(m, 1H), 2.00-2.12(m, 1H), 2.80-2.91(m, 1H), 3.80(d,J=16.4Hz, 1H), 3.95(d, J=16.4Hz, 1H), 5.06(s, 1H), 6.44(s, 1H), 6.82(s, 1H),6.96(d, J=7.0Hz, 1H), 7.29(dd, J=7.0, 7.9Hz, 1H), 7.45(d, J=5.3Hz, 1H), 7.72(d, J=5.3Hz, 1H), 7.76 (d, J=7.9Hz, 1H); ESI-MS(m/z) 340(M+H)+.
工程3で得た化合物(315mg, 0.927mmol)と(2E)−3−(ピリジル−2−イル)−アクリル酸(414mg, 2.78mmol)をジメチルホルムアミド(10ml)に溶解した。その溶液に1−エチル−(3−ジエチルアミノプロピル)−カルボジイミド塩酸塩(以後、EDClと記載する。)(524mg, 2.78mmol)を加えて、室温で18時間攪拌した。その間、原料が消失するまで適時試薬を同量追加した。溶媒を減圧除去後、酢酸エチルを加えて、水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧除去後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(ジクロロメタン:メタノール=20:1)にて精製し、目的物(157mg, 36.0%)を得た。
1H-NMR(300MHz, CDCl3) δ=0.564-0.765(m, 1H), 1.02-1.38(m,3H), 1.39-1.58(m, 2H), 1.68-1.98(m, 2H), 2.51-2.74(m, 1H), 2.95-3.13(m, 1H),3.90 (d, J = 15.8Hz, 1H), 3.99 (d, J = 15.8Hz, 1H), 4.37-4.54(m, 2H), 5.30(s,1H), 5.69(s, 1H), 6.52(s, 1H), 7.16-7.23(m, 1H), 7.32-7.51(m, 3H), 7.60-7.75(m,2H), 7.79 (d, J = 7.9Hz, 1H), 7.99 (d, J = 15.2Hz, 1H), 8.54-8.71(m, 1H);ESI-MS(m/z) 471(M+H)+.
工程4で得た化合物(145mg, 0.304mmol)をメタノール(3.0ml)に溶解した。その溶液に、水素化ホウ素ナトリウム(23.0mg,0.608mmol)、ニッケルクロライド6水和物(14.5mg, 0.061mmol)を順次加え、室温で3時間攪拌した。原料が消失するまで、適時試薬を追加した。反応溶液に飽和塩化アンモニウム水溶液を加えて、酢酸エチルで抽出し、飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧濃縮後、実施例1化合物(135mg, 94.0%)を得た。
1H-NMR(300MHz, DMSO-d6) δ=0.35-3.10(m, 13H), 3.81(d, J=16.5Hz, 1H),3.91(d, J=16.5Hz, 1H), 3.90-4.05(m, 1H), 5.90(s, 1H), 6.81(s, 1H), 6.84(s, 1H),7.00-7.90(m, 8H), 8.45-8.50(m, 1H); ESI-MS(m/z) 473(M+H)+.
実施例1の工程3の方法に従い、ベンゾチオフェン−7−アルデヒドの代わりに2−(2−エトキシメチル)−ベンズアルデヒドを用いて合成した。
1H-NMR(300MHz, DMSO-d6) δ=0.83-1.33(m, 7H), 1.44-1.69(m, 2H),1.75-1.97(m, 2H), 2.08-2.23(m, 1H), 2.77-2.92(m, 1H), 3.84(d, J=16.4Hz, 1H),3.69(q, J=7.3Hz, 2H), 3.71(d, J=16.4Hz, 1H), 5.06(s, 1H), 5.32(s, 2H), 6.31(s,1H), 6.68(s, 1H), 6.78-6.91(m, 2H), 6.97-7.21(m, 2H) ; ESI-MS(m/z) 358(M+H)+.
工程1で得た化合物(699mg, 1.96mmol)と(2E)−3−(1,3−チアゾル−2−イル)−アクリル酸(1.22g, 7.83mmol)をジメチルホルムアミド(10ml)に溶解した。その溶液にEDCl(1.50g, 7.83mmol)を加えて、室温で2日半攪拌した。溶媒を減圧除去後、酢酸エチルを加えて水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で順次洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(ジクロロメタン:メタノール=20:1)にて精製し、目的物(512mg, 53%)を得た。
ESI-MS(m/z) 495(M+H)+.
工程2で得た化合物(512mg, 1.04mmol)をメタノール(10ml)に溶解した。その溶液に、ニッケルクロライド6水和物(49.2mg,0.207mmol)と水素化ホウ素ナトリウム(78.5mg, 2.07mmol)を順次加えた。室温で1時間攪拌後、飽和塩化アンモニウム水溶液を加え酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧除去し、目的物(511mg, 99.4%)を得た。
1H-NMR(300MHz, DMSO-d6) δ=0.53-0.76(m, 1H), 0.87-1.33(m, 8H),1.37-1.61(m, 2H), 1.92-2.10(m, 1H), 2.67-2.96(m, 2H), 3.14-3.28(m, 2H),3.48-3.65(m, 2H), 3.76(d, J=16Hz, 1H), 3.84(d, J=16Hz, 1H), 3.95-4.09(m, 1H),5.18-5.32(m, 2H), 5.86(s, 1H), 6.70(s, 1H), 6.75(s, 1H), 6.94(t, J=7.3Hz, 1H),7.00-7.13(m, 2H), 7.23-7.32(m, 1H), 7.54(d, J=3.2Hz, 1H), 7.68(d, J=3.2Hz, 1H);ESI-MS(m/z) 497(M+H)+.
得た。
1H-NMR(300MHz, DMSO-d6) δ=0.53-0.75(m, 1H), 0.90-1.21(m, 3H),1.39-1.58(m, 2H), 1.91-2.06(m, 1H), 2.42-2.60(m, 1H), 2.69-2.86(m, 1H),2.87-3.00(m, 1H), 3.14-3.27(m,2H), 3.76(d, J=16Hz, 1H), 3.83(d, J=16Hz, 1H),3.91-4.08(m, 2H), 5.82(s, 1H), 6.65(s, 1H), 6.70(s, 1H), 6.74(dd, J=7.3, 7.6Hz,1H), 6.83(d, J=7.3Hz, 1H), 6.94(d, J=7.6Hz, 1H), 7.11(dd, J=7.3, 7.6Hz, 1H),7.54(d, J=3.5Hz, 1H), 7.67(d, J=3.5Hz, 1H), 9.72(s, 1H); ESI-MS(m/z) 440(M+H)+.
ビス−(2−ブロモエチル)エーテル(2.04ml, 16.2mmol)とカリウムスクシンイミド(1.50g, 8.10mmol)をジメチルホルムアミドに溶解した。その溶液を80℃に加熱し、19時間攪拌した。溶媒を減圧除去し、酢酸エチルを加えた。有機層を水, 飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン:酢酸エチル=5:1)にて精製し、ブロモ体(1.64g, 68.0%)を得た。
ESI-MS(m/z) 299(M+H)+.
ESI-MS(m/z) 656(M+H)+.
工程5で得た化合物(205mg, 0.313mmol)とヒドラジン1水和物(150μl, 3.13mmol)をエタノールに溶解した。その溶液を70℃で1時間20分攪拌した。析出した白色固体をろ過し除去することで、実施例2化合物(113mg, 68.7%)を得た。
1H-NMR(300MHz, DMSO-d6) δ=0.52-0.73(m, 1H), 0.88-1.19(m, 4H),1.37-1.56(m, 3H), 1.90-2.05(m, 1H), 2.56-2.67(m, 4H), 2.68-2.93(m, 2H),3.10-3.30(m, 5H), 3.59-3.73(m, 2H), 3.76(d, J=16Hz, 1H), 3.84(d, J=16Hz, 1H),3.92-4.06(m, 1H), 4.06-4.22(m, 2H), 5.84(s, 1H), 6.68(s, 1H), 6.73(s, 1H), 6.87-6.95(m,1H), 6.98-7.07(m, 2H), 7.23-7.34(m, 1H), 7.54(d, J=3.2Hz, 1H), 7.67(d, J=3.2Hz,1H); ESI-MS(m/z) 526(M+H)+.
1H-NMR(300MHz, DMSO-d6) δ=0.55-3.05(m, 9H), 3.74(d, J=16.5Hz, 1H),3.82(d, J=16.5Hz, 1H), 3.90-4.05(m, 1H), 3.83(s, 3H), 4.05-4.20(m, 1H), 6.01(s,1H), 6.73(s, 1H), 6.73(s, 1H), 6.86-7.10(m, 4H), 7.50(d, J=15.3Hz, 1H), 7.76(d,J=15.6Hz, 1H), 7.84(d, J=3.0Hz, 1H), 7.94(d, J=3.0Hz, 1H); ESI-MS(m/z) 449(M-H)-.
工程1で得た化合物(38.3mg, 0.085mmol)をエタノール(5.0ml)に溶解した。その溶液に10%パラジウム炭素(50%含水, 15mg)を加え、水素雰囲気下で2日間攪拌した。反応溶液をセライトろ過後、溶媒を減圧濃縮することで、実施例4化合物(33mg, 87%)を得た。
1H-NMR(300MHz, DMSO-d6) δ=0.50-3.40(m, 9H), 3.73(s, 3H),3.70-3.85(m, 2H), 3.90-4.05(m, 1H), 5.81(s, 1H), 6.67(s, 1H), 6.71(s, 1H),6.86-7.31(m, 4H), 7.53(d, J=3.3Hz, 1H), 7.67(d, J=3.3Hz, 1H); ESI-MS(m/z)453(M+H)+, 451(M-H)-.
実施例1化合物の方法に従い、ベンゾチオフェン−7−アルデヒドの代わりにベンゾチオフェン−3−アルデヒドを用いることで、実施例3化合物を合成した。
1H-NMR(300MHz, DMSO-d6) δ=0.408-0.646(m, 1H), 0.750-0.918(m, 1H),0.918-1.17(m, 2H), 1.28-2.03(m, 3H), 2.35-2.46(m, 1H), 2.65-2.81(m, 1H),2.81-2.96(m, 1H), 2.96-3.20(m, 2H), 3.80(d, J = 16.4Hz, 1H), 3.87(d, J =16.4Hz, 1H), 3.93-4.07(m, 1H), 5.97(s, 1H), 6.74(s, 1H), 6.82(s, 1H),7.16-7.25(m, 1H), 7.26-7.35(m, 2H), 7.35-7.49(m, 2H), 7.69(dd, J = 7.0, 7.0Hz,1H), 7.90(d, J=6.5Hz, 1H), 7.99(d, J=6.5Hz, 1H), 8.52(s, 1H); ESI-MS(m/z)473(M+H)+.
実施例化合物1の工程3の方法に従い、ベンゾチオフェン−7−アルデヒドの代わりにベンゾフラン−7−アルデヒドを用いることで合成した。
1H-NMR(300MHz, DMSO-d6) δ=0.75-1.20(m, 4H), 1.35-1.55 (m, 2H),1.75-1.90 (m, 1H), 2.10-2.25 (m, 2H), 2.75-2.90 (m, 1H), 3.72 (d, J=16.8Hz,1H), 3.84 (d, J=16.8Hz, 1H), 5.30 (s, 1H), 6.36 (s, 1H), 6.72 (s, 1H), 6.80 (d,J=7.5Hz, 1H), 6.93 (d, J=2.1Hz, 1H), 7.09 (t, J=7.5Hz, 1H), 7.48 (d, J=7.5Hz,1H), 7.98 (d, J=2.1Hz, 1H); ESI-MS(m/z) 324(M+H)+.
工程1で得た化合物(75mg, 0.232mmol)をジメチルホルムアミド(6ml)に溶解し、シクロプロパンカルボン酸(370ml, 4.65mmol)およびEDCl(712mg, 3.71mmol)を加え、室温で3日間撹拌した。反応溶液を減圧濃縮し、酢酸エチルを加え、飽和炭酸水素ナトリウム、飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧濃縮して得た残渣を逆相HPLCで精製することにより、実施例5化合物(61mg, 67%)を得た。
1H-NMR(300MHz, DMSO-d6) δ=0.45-1.14(m, 8H), 1.30-1.48(m, 2H),1.88-2.02(m, 1H), 2.22-2.52(m, 2H), 2.83-2.96(m, 2H), 3.83(d, J=16.8Hz, 1H),3.86(d, J=16.8Hz, 1H), 3.95-4.08(m, 1H), 6.61(s, 1H), 6.73(s, 1H), 6.99(d,J=2.1Hz, 1H), 6.99(d, J=7.5Hz, 1H), 7.22(t, J=7.5Hz, 1H), 7.62(d, J=7.5Hz, 1H),8.03(d, J=2.1Hz, 1H); ESI
-MS(m/z) 392(M+H)+.
実施例1の工程3の方法に従い、ベンゾチオフェン−7−アルデヒドの代わりにベンズアルデヒドを用いることで合成した。
1H-NMR(300MHz, DMSO-d6) δ=0.50-3.40(m, 10H), 3.69(d, J=16.0Hz, 1H),3.84(d, J=16.0Hz, 1H), 4.79(s, 1H), 6.32(s, 1H), 6.75(s, 1H), 7.10-7.30(m, 5H);284(M-H)+.
工程1化合物(200mg, 0.707mmol)をジクロロメタン(50ml)に溶解し、アセトキシ酢酸(500mg, 4.24mmol)、トリエチルアミン(209μl, 1.41mmol)及びEDCl(543mg, 2.83mmol)を加え、室温で4時間撹拌した。反応溶液に0.1N塩酸を加え、酢酸エチルで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧除去後、残渣をメタノール(10ml)に溶解し、炭酸カリウム(488mg, 3.54mmol)を加えて、室温で30分攪拌した。不溶物をセライトろ過にて除き、水を加え、酢酸エチルで抽出し、有機層を飽和食塩水にて洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧除去後、残渣にジエチルエーテル/ジクロロメタン(容積比8/1)の溶液を加え、析出してきた結晶をろ過し、実施例6化合物(185mg, 77%)を得た。
1H-NMR(300MHz, DMSO-d6) δ=0.50-2.79(m, 9H), 3.75-4.05(m, 4H),4.42(m, 1H), 4.72(m, 1H), 5.54(s, 1H), 6.74(s, 1H), 6.80(s, 1H), 7.22-7.37(m,5H); ESI-MS(m/z) 342(M+H)+
1H-NMR(300MHz, DMSO-d6) δ=0.49-0.70(m, 1H), 0.81-1.19(m, 4H),1.35-1.57(m, 3H), 1.89-2.06(m, 1H), 2.54-2.64(m, 4H), 2.69-2.90(m, 2H),3.00-3.49(m, 5H), 3.67-3.74(m, 2H), 3.78(d, J=16.8Hz, 1H), 3.85(d, J=16.8Hz,1H), 3.92-4.06(m, 1H), 4.06-4.21(m ,2H), 5.87(s, 1H), 6.68(s, 1H), 6.72(m, 1H),6.90(dd, J=7.6, 7.6Hz, 1H), 6.98-7.05(m, 2H), 7.16-7.23(m, 1H), 7.25(s, 1H),7.27(s, 1H), 7.68(ddd, J=1.8, 7.6, 7.6Hz, 1H), 8.45-8.52(m, 1H); ESI-MS(m/z)520(M+H)+.
実施例2化合物(20mg, 0.0381mmol)とビオチン(37.2mg,0.152mmol)をジメチルホルムアミド(1.0ml)に溶解した。その溶液にEDCl(29.1mg, 0.152mmol)を加えて、室温で21時間攪拌した。反応溶液に酢酸エチルを加えて、炭酸水素ナトリウム水溶液、brineで洗浄し、無水硫酸ナトリウムで攪拌した。溶媒を減圧除去後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(ジクロロメタン:メタノール=95:5)にて精製し、実施例8化合物(11.1mg, 39.5%)を得た。
1H-NMR(300MHz, DMSO-d6) δ=0.51-0.76(m, 1H), 0.79-1.18(m, 4H),1.21-1.40(m, 4H), 1.42-1.80(m, 10H), 1.90-2.16(m, 2H), 2.57-2.69(m, 2H),2.69-2.95(m, 3H), 2.98-3.15(m, 2H), 3.62-3.71(m, 2H), 3.79(d, J=16.4Hz, 1H),3.86(d, J=16.4Hz, 1H), 3.95-4.06(m, 1H), 4.06-4.24(m, 3H), 4.24-4.43(m, 1H),5.86(s, 1H), 6.36(s, 1H), 6.42(s, 1H), 6.72(s, 1H), 6.77(s, 1H), 6.88-6.97(m,1H), 6.99-7.09(m, 2H), 7.23-7.38(m, 1H), 7.47-7.60(m, 1H), 7.64-7.74(m, 1H);ESI-MS(m/z) 738.
実施例2化合物(20mg, 0.0381mmol)とN−tert−ブチルオキシカルボニル−6−アミノカプロン酸(17.6mg,0.0761mmol)をジメチルホルムアミド(1.0ml)に溶解した。その溶液にEDCl(14.6mg, 0.0761mmol)を加えて、室温で17時間攪拌した。反応溶液に酢酸エチルを加えて炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄して、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧除去後、残渣をトリフルオロ酢酸(0.3ml)とジクロロメタン(0.1ml)に溶解して、室温で30分攪拌した。反応溶液に炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて、ジクロロメタンで抽出した。有機層を飽和食塩水にて洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧除去後、実施例9化合物(19.8mg, 81.5% for 2steps)を得た。
1H-NMR(300MHz, DMSO-d6) δ=0.49-0.72(m, 1H), 0.89-1.14(m, 3H),1.14-1.38(m, 4H), 1.40-1.69(m, 4H), 1.93-2.09(m, 2H), 2.14-2.25(m, 1H),2.71-2.94(m, 2H), 3.01-3.29(m, 4H), 3.57-3.75(m, 2H), 3.77(d, J=16.4Hz, 1H),3.85(d, J=16.4Hz, 1H), 3.92-4.19(m, 3H), 5.85(s, 1H), 6.70(s, 1H), 6.76(s, 1H),6.87-6.93(m, 1H), 6.97-7.09(m, 2H), 7.23-7.35(m, 1H), 7.38(d, J=3.2Hz, 1H),7.67(d, J=3.2Hz, 1H), 7.74-7.84(m, 1H); ESI-MS(m/z) 639.
実施例7化合物(25.3mg, 0.0488mmol)とビオチン(35mg, 0.146mmol)をジメチルホルムアミド(2.0ml)に溶解した。その溶液にEDCl(28.1mg, 0.146mmol)を加えて、室温で16時間攪拌した。反応溶液に酢酸エチルを加えて、水、飽和食塩水で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧除去後、実施例10化合物(37.1mg, 99%)を得た。
1H-NMR(300MHz, DMSO-d6) δ=0.51-0.69(m, 1H), 0.79-1.15(m, 4H),1.21-1.70(m, 4H), 1.42-1.80(m, 10H), 1.90-2.23(m, 2H), 2.53-2.63(m, 2H),2.76-2.87(m, 3H), 2.92-3.00(m, 2H), 3.53-3.77(m, 2H), 3.78(d, J=16.7Hz, 1H),3.85(d, J=16.7Hz, 1H), 3.95-4.06(m, 1H), 4.07-4.17(m, 2H), 4.26-4.34(m, 2H),5.87(s, 1H), 6.36(s, 1H), 6.38(m, 1H), 6.68(s, 1H), 6.74(m, 1H), 6.85-6.95(m,1H), 6.99-7.05(m, 2H), 7.14-7.22(m, 1H), 7.23-7.33(m, 2H), 7.63-7.72(m, 1H),7.75-7.83(m, 1H), 8.53-8.51(m, 1H); ESI-MS(m/z) 747.
雄性Wistarラットを断頭放血後に開腹し、傍精巣脂肪組織を摘出した。これをBSA(ウシ血清アルブミン)を含むKRH(Krebs-Linger Hepes: 130mM NaCl、4.7mM KCl、1.2mM KH2PO4、1.2mM MgSO4、1mM CaCl2、25mM HEPES)中で細断し、コラゲナーゼ(タイプI)を加えて約40分間消化処理を行い、単離された脂肪細胞を得た。バッファー交換によりコラゲナーゼを除去後、2%BSA/KRH溶液を加えて再浮遊させ、脂肪細胞けん濁液を得た。
約20時間絶食したC57BL/KsJ-db/dbJclマウスに対して、物性、安定性の良い化合物5、化合物6、について経口投与し、投与直前と投与後30、60、120、180分に尾静脈より採血を行い、血糖値を測定した。投与媒体として0.5%メチルセルロースまたは50%ポリエチレングリコールを用いた。
ヒト肝臓由来HLF細胞を用い、被検化合物によるAktリン酸化作用の測定を下記の通り行った。HLF細胞を2x104細胞/wellとなるように、10%ウシ胎児血清(FCS)を含むダルベッコMEM培地を用いて96穴プレートに播種し、約5時間、37℃、5%CO2存在下で培養し、十分に付着させた後、培地を吸引除去し、血清を含まず0.1%BSAを含むダルベッコMEM培地で、同様に終夜培養した。培地を吸引除去した後、被検化合物を含む0.1%BSAを含むダルベッコMEM培地を添加し、37℃、5%CO2存在下で15分間の被検化合物処理を行った後、96穴プレートを氷上に置き、培地を吸引除去した後、氷温のリシスバッファー(1mM PMSFを含む)を加え、-80℃で凍結した。リシスバッファーはリン酸化Akt測定キット(Cell Signaling Technologies社、製品番号7160、PathScanR Phospho-Akt1 (Ser473)Sandwich ELISA Kit)に添付のものを、添付文書に従って作成したものを使用した。上記凍結した96穴プレートを室温に戻して抽出液(lysate)を融解した後、上記リン酸化Akt測定キットを用い、添付文書に従ってリン酸化Akt量を測定した。各被検物質によるAktリン酸化の度合いを図1に示した。
ヒト肝臓由来HLF細胞の細胞膜の調製は下記の通り行った。まず、直径15cmの細胞培養用ディッシュに10%FCSを含むダルベッコMEM培地でほぼコンフルエントに培養したHLF細胞、30枚分を、HMEEバッファー(20mMHEPES-KOH、1mM EDTA、1mM EGTA、2mM MgCl2)存在下でセルスクレーパーを用いて細胞をかき取り、約30mlの細胞けん濁液を得た。本けん濁液をテフロン(登録商標)ホモジナイザーを用いてホモジナイズを行い(氷温、1000 rpm、15 stroke)、低速の遠心(1500rpm、5分)後の上清を再度高速で遠心(12000rpm、30分)を行い、沈殿を1mlのHMEEバッファーにけん濁し、細胞膜溶液とした。プロテインアッセイ(BioRad社)を用いた、BSAを標品とした蛋白質定量の結果、上記細胞膜溶液中の蛋白質濃度は3.5mg/mlであった。
(1)HLF細胞膜からの結合蛋白質の抽出
上記実施例14で見られた3H標識化合物1の結合蛋白質(以下結合蛋白質)の可溶化を下記のように行った。上記実施例14に示したとおり作成したHLF細胞膜(3.5mg/ml)のHMEEバッファー溶液100μlに、400μlの0.25%および0.125%のDigitoninを含むRBAバッファーを加え、終濃度をそれぞれ0.2%、0.1%とし、混合した後、室温で1時間静置した。遠心(15000rpm、30分)によって得た上清を、各抽出液とし、下記のPD10(GEヘルスケア社、製品番号17-0851-01)を用いたゲルろ過によって含まれる蛋白質に対する3H標識化合物1の特異的な結合を測定する方法(以下PD10法)を用い、抽出液中の結合蛋白質量を測定した。
上記実施例2および7〜10記載の「プローブ分子」として合成した化合物が、化合物1と同じ結合蛋白質に結合するかを確かめるため、上記実施例14に示した方法を用い、HLF細胞膜への3H標識化合物1結合に対する各化合物の阻害活性を測定した。同時に実施例11に示した糖取り込み作用および実施例13に示したAktリン酸化活性が比較的強かった化合物3を同時に評価した。その結果、図4に示したように、いずれの化合物もある程度の3H標識化合物1の細胞膜に対する結合を阻害し、結合蛋白質に対する結合能を有することが分かった。
HLF細胞膜からの結合蛋白質の抽出は、下記の通り行った。実施例14と同様の方法で作成したHLF細胞膜(3.7mg/ml)1.2mlに、0.25% Digitoninを含むRBAバッファー4.8mlを加え、軽く攪拌した後室温で1時間静置した。遠心(15000rpm、30分)により不溶物を除いた上清(6ml)を、RBAバッファー24mlで希釈し、HLF細胞膜抽出液とした。
実験
上記実施例15に示した化合物2を固定化したアフィニティーカラムに加え、実施例15(2)で化合物2と同等の、結合蛋白質に対する結合活性を有する化合物7を同様に固定化したアフィニティーカラムを作成し、実施例15と同様のアフィニティーカラム操作を行った。
なお上記において、化合物3、化合物4を適当な被検物質に替えてアフィニティーカラムからのGβの溶出を検出することにより、プローブ化合物(化合物2、化合物7を固定化したアフィニティーカラム)とGβとの結合阻害活性を測定し、血糖降下作用物質のスクリーニングを行うことが可能である。
配列番号1、2の合成DNAをプライマーとし、ヒトGβ1の全蛋白コード領域を含むcDNAクローンをテンプレートとして定法によりPCR反応を行った。得られた1056bpのDNAを制限酵素HindIII、XhoIで消化し、GFXキット(アマシャムバイオサイエンス社)を用いて精製した。ベクターpcDNA3.1Hyg(+)(インビトロジェン社)のHindIII、XhoI部位にクローニングした後、本プラスミドを有する大腸菌JM109株のシングルコロニー培養液よりプラスミドを調製してDNAシーケンシングを行い、配列番号3で示した塩基配列(配列番号4はアミノ酸配列を示す)を確認し、pcDNA3.1Hyg(+)-GNB1を作成した。さらに本大腸菌培養液からQIAprepplasmid purification kit(QIAGEN)を用いてプラスミドDNAを調製し、動物細胞トランスフェクション用に供した。また、配列番号5、6の合成DNAをプライマーとし、ヒトGγ2の全蛋白コード領域を含むcDNAクローンをテンプレートとして定法によりPCR反応を行った。得られた255bpのDNAを制限酵素EcoRI、XhoIで消化し、GFXキット(アマシャムバイオサイエンス社)を用いて精製した。ベクターpcDNA3.1(+)(インビトロジェン社)のEcoRI、XhoI部位にクローニングした後、配列番号7で示した塩基配列(配列番号8はアミノ酸配列を示す)を確認し、pcDNA3.1(+)-GNG2を作成した。さらに形質転換した大腸菌JM109株の培養液からプラスミドDNAを調製し、動物細胞トランスフェクション用に供した。
上記実施例17に記載したとおり調製した発現プラスミドを用い、HEK293T細胞を用いた蛋白質の発現を行った。HEK293T細胞を、直径10cmの細胞培養用ディッシュに培養し、Lipofectamine 2000(インビトロジェン社、製品番号11618-019)を用い、添付のマニュアルに従った方法を用いて、Gβ1とGγ2を同時にトランスフェクションし、発現細胞(Gβ1γ2)を回収した。コントロールとして、発現ベクターの代わりに遺伝子を未挿入のベクターを同様にトランスフェクションした細胞(Mock)を作成、回収した。回収した細胞は、PBSを用いた洗浄後、リシスバッファー(75mM Tris-HCl、12.5mM MgCl2、2mM EDTA、pH7.4、プロテアーゼインヒビターカクテル(Rosch Diagnostics社、11-697-498-001)、0.3% CHAPS)1mlにけん濁し、超音波破砕を行い、遠心(15000rpm、20分)を行うことによって上清を抽出液として得た。プロテインアッセイ(BioRad社)を用いた、BSAを標品とした蛋白質定量を行うことで、Gβ1γ2、Mockそれぞれの抽出液の蛋白質濃度が同等であることを確かめた。
(1)6xHis-Gαi1の発現系の構築
配列番号9、10の合成DNAをプライマーとし、ヒト3量体GTP結合蛋白質αi1サブユニット(Gαi1)の全蛋白コード領域を含むcDNAクローンをテンプレートとして定法によりPCR反応を行った。得られた1116bpのDNAを、ベクターpCR4Blunt-TOPO(インビトロジェン社、製品番号K2875)にサブクローニングした後、配列番号11で示した塩基配列(配列番号12はアミノ酸配列を示す)を確認し、さらに制限酵素BamHI、XhoIで切断し、Bac-to-Bacバキュロウイルス蛋白発現システム(インビトロジェン社、製品番号10359-016)のベクターpFastBac1の同制限酵素部位に挿入し、pFB1-6xHis-GNAI1を作成した。さらに添付マニュアルに従い、形質転換した大腸菌DH10Bac株の培養液からバクミドDNAを調製した。このバクミドDNAを昆虫細胞Sf-21株にリポフェクション法により遺伝子導入を行い、アミノ末端にHisタグ配列を付加した6xHis-Gαi1蛋白を発現する組換えウイルスを取得した。ウイルスは更にSf-21細胞に感染させることにより組換え蛋白を必要な量を確保しうるウイルス力価まで増加させた。目的の組換え蛋白の発現はウイルス感染細胞ライゼートについて特異的抗体を用いたウェスタンブロット法により確認した。
配列番号13、14の合成DNAをプライマーとし、ヒトGβ1の全蛋白コード領域を含むcDNAクローンをテンプレートとして定法によりPCR反応を行った。得られた1051bpのDNAを、ベクターpCR4Blunt-TOPO(インビトロジェン社、製品番号K2875)にサブクローニングした後、配列番号15で示した塩基配列(配列番号16はアミノ酸配列を示す)を確認し、さらに制限酵素EcoRI、XhoIで切断し、Bac-to-Bacバキュロウイルス蛋白発現システム(インビトロジェン社、製品番号10359-016)のベクターpFastBac1の同制限酵素部位に挿入し、pFB1-GNB1を作成した。さらに添付マニュアルに従い、形質転換した大腸菌DH10Bac株の培養液からバクミドDNAを調製した。このバクミドDNAを昆虫細胞Sf-21株にリポフェクション法により遺伝子導入を行い、Gβ1蛋白を発現する組換えウイルスを取得した。マニュアルに従いウイルスは更にSf-21細胞に感染させることにより組換え蛋白を必要な量を確保しうるウイルス力価まで増加させた。目的の組換え蛋白の発現はウイルス感染細胞抽出液について特異的抗体を用いたウェスタンブロット法により確認した。
配列番号17、18の合成DNAをプライマーとし、ヒトGβ2の全蛋白コード領域を含むcDNAクローンをテンプレートとして定法によりPCR反応を行った。得られた1048bpのDNAを、ベクターpCR4Blunt-TOPO(インビトロジェン社、製品番号K2875)にサブクローニングした後、配列番号19で示した塩基配列(配列番号20はアミノ酸配列を示す)を確認し、さらに制限酵素EcoRI、XhoIで切断し、Bac-to-Bacバキュロウイルス蛋白発現システム(インビトロジェン社、製品番号10359-016)のベクターpFastBac1の同制限酵素部位に挿入し、pFB1-GNB2を作成した。さらに添付マニュアルに従い、形質転換した大腸菌DH10Bac株の培養液からバクミドDNAを調製した。このバクミドDNAを昆虫細胞Sf-21株にリポフェクション法により遺伝子導入を行い、Gβ2蛋白を発現する組換えウイルスを取得した。マニュアルに従いウイルスは更にSf-21細胞に感染させることにより組換え蛋白を必要な量を確保しうるウイルス力価まで増加させた。目的の組換え蛋白の発現はウイルス感染細胞抽出液について特異的抗体を用いたウェスタンブロット法により確認した。
配列番号21、22の合成DNAをプライマーとし、正常ヒト皮膚線維芽細胞のcDNAライブラリーをテンプレートとして定法によりPCR反応を行った。得られた1078bpのDNAを、ベクターpCR4Blunt-TOPO(インビトロジェン社、製品番号K2875)にサブクローニングした後、配列番号23で示した塩基配列(配列番号24はアミノ酸配列を示す)を確認し、さらに制限酵素EcoRI、XhoIで切断し、Bac-to-Bacバキュロウイルス蛋白発現システム(インビトロジェン社、製品番号10359-016)のベクターpFastBac1の同制限酵素部位に挿入し、pFB1-GNB3を作成した。さらに添付マニュアルに従い、形質転換した大腸菌DH10Bac株の培養液からバクミドDNAを調製した。このバクミドDNAを昆虫細胞Sf-21株にリポフェクション法により遺伝子導入を行い、Gβ3蛋白を発現する組換えウイルスを取得した。マニュアルに従いウイルスは更にSf-21細胞に感染させることにより組換え蛋白を必要な量を確保しうるウイルス力価まで増加させた。目的の組換え蛋白の発現はウイルス感染細胞抽出液について特異的抗体を用いたウェスタンブロット法により確認した。
配列番号25、26の合成DNAをプライマーとし、ヒト肝癌由来HLF細胞のcDNAライブラリーをテンプレートとして定法によりPCR反応を行った。得られた1055bpのDNAを、ベクターpCR4Blunt-TOPO(インビトロジェン社、製品番号K2875)にサブクローニングした後、配列番号27で示した塩基配列(配列番号28はアミノ酸配列を示す)を確認し、さらに制限酵素EcoRI、XhoIで切断し、Bac-to-Bacバキュロウイルス蛋白発現システム(インビトロジェン社、製品番号10359-016)のベクターpFastBac1の同制限酵素部位に挿入し、pFB1-GNB4を作成した。さらに添付マニュアルに従い、形質転換した大腸菌DH10Bac株の培養液からバクミドDNAを調製した。このバクミドDNAを昆虫細胞Sf-21株にリポフェクション法により遺伝子導入を行い、Gβ4蛋白を発現する組換えウイルスを取得した。マニュアルに従いウイルスは更にSf-21細胞に感染させることにより組換え蛋白を必要な量を確保しうるウイルス力価まで増加させた。目的の組換え蛋白の発現はウイルス感染細胞抽出液について特異的抗体を用いたウェスタンブロット法により確認した。
配列番号29、30の合成DNAをプライマーとし、ヒト肝癌由来HLF細胞のcDNAライブラリーをテンプレートとして定法によりPCR反応を行った。得られた1093bpのDNAを、ベクターpCR4Blunt-TOPO(インビトロジェン社、製品番号K2875)にサブクローニングした後、配列番号31で示した塩基配列(配列番号32はアミノ酸配列を示す)を確認し、さらに制限酵素EcoRI、XhoIで切断し、Bac-to-Bacバキュロウイルス蛋白発現システム(インビトロジェン社、製品番号10359-016)のベクターpFastBac1の同制限酵素部位に挿入し、pFB1-GNB5を作成した。さらに添付マニュアルに従い、形質転換した大腸菌DH10Bac株の培養液からバクミドDNAを調製した。このバクミドDNAをカイコ細胞Sf-21株にリポフェクション法により遺伝子導入を行い、Gβ5蛋白を発現する組換えウイルスを取得した。マニュアルに従いウイルスは更にSf-21細胞に感染させることにより組換え蛋白を必要な量を確保しうるウイルス力価まで増加させた。目的の組換え蛋白の発現はウイルス感染細胞抽出液について特異的抗体を用いたウェスタンブロット法により確認した。
配列番号33、34の合成DNAをプライマーとし、ヒト3量体GTP結合蛋白質γ2サブユニット(Gγ2)の全蛋白コード領域を含むcDNAクローンをテンプレートとして定法によりPCR反応を行った。得られた290bpのDNAを、ベクターpCR4Blunt-TOPO(インビトロジェン社、製品番号K2875)にサブクローニングした後、配列番号35で示した塩基配列(配列番号36はアミノ酸配列を示す)を確認し、さらに制限酵素EcoRI、XhoIで切断し、Bac-to-Bacバキュロウイルス蛋白発現システム(インビトロジェン社、製品番号10359-016)のベクターpFastBac1の同制限酵素部位に挿入し、pFB1-Myc-GNG2を作成した。さらに添付マニュアルに従い、形質転換した大腸菌DH10Bac株の培養液からバクミドDNAを調製した。このバクミドDNAをカイコ細胞Sf-21株にリポフェクション法により遺伝子導入を行い、アミノ末端Mycタグ配列付加Myc-Gγ2蛋白を発現する組換えウイルスを取得した。マニュアルに従いウイルスは更にSf-21細胞に感染させることにより組換え蛋白を必要な量を確保しうるウイルス力価まで増加させた。目的の組換え蛋白の発現はウイルス感染細胞ライゼートについてMycタグ配列特異的抗体を用いたウェスタンブロット法により確認した。
昆虫細胞Sf21株を用いた蛋白質の発現、生産は、Bac-to-Bacバキュロウイルス蛋白発現システム(インビトロジェン社、製品番号10359-016)添付のマニュアル(Instruction Manual)記載の方法に従って行った。具体的には、プラークアッセイを用いてタイターを確認した3次、あるいは4次ウイルス溶液を用い、Gβ、Myc-Gγ2および6xHis-Gαi1遺伝子を含むバキュロウイルスを、それぞれMOI=2.5となるように、250ml容の三角フラスコを用い、108細胞/100mlのSF900IISFM培地(Invitrogen社、製品番号10902-096)中で、65時間、28℃で振とう培養を行った。Gβに関しては、Gβ1、Gβ2、Gβ3、Gβ4、Gβ5の各サブタイプそれぞれについて培養を実施した。培養後、遠心(1000rpm、5分)により細胞を回収し、Insect Cell PBS(7.3mM NaH2PO4(pH6.2)、58mM KCl、47mM NaCl、5mM CaCl2)10mlで洗浄した後、さらに遠心(3000rpm、5分)によって細胞を回収し凍結保存した。
上記実施例19(8)記載の通り調製したGβ1とMyc-Gγ2およびGαi1-Hisを発現した凍結昆虫細胞Sf21、107細胞を、融解後、1% Triton X-100を含むRBAバッファー(75mM Tris-HCl、12.5mM MgCl2、2mM EDTA、pH7.4)1.3mlでけん濁、超音波処理によって蛋白質の抽出を行い、遠心(15000rpm、15分、4℃)によって得た上清をGβ1γ2-Myc 抽出液(1.3ml)とした。
上記実施例19(8)で取得したGβ1、Gβ2、Gβ3、Gβ4、Gβ5の各サブタイプを発現した凍結昆虫細胞Sf21、108細胞を、融解、3mlのLysis Bufferを用いてけん濁後、1% Triton X-100を含むRBAバッファー(75mM Tris-HCl、12.5mM MgCl2、2mM EDTA、pH7.4)2mlでけん濁、4℃、1時間攪拌して、蛋白質の抽出を行い、遠心(100000G、20分、4℃)によって得た上清をGβγ2-Myc抽出液とした。
各サブタイプGβγ2-Myc発現昆虫細胞lysateを用いた、実施例11および13で活性の見られた化合物(化合物1、化合物3、化合物5、化合物6)、およびN-deacetylcolchicineのGβ結合作用の評価を、実施例21に記載の方法に準じて、3H標識化合物1の結合アッセイに対する阻害活性を測定することによって行った。
上記実施例19(8)記載の通り調製したGβ1とMyc-Gγ2およびGαi1-Hisを発現した凍結昆虫細胞Sf21、2.5x108細胞を、融解後、4mlのLysis Buffer(50mM HEPES (pH8.0)、3mM MgCl2、10mM 2-メルカプトエタノール、10μM GDP、プロテアーゼインヒビターカクテル(Rosch Diagnostics社、11-697-498-001)、1mM EDTA、100mM NaCl)を用いて細胞をけん濁した後、100000g、20分の遠心を行い、ペレットを得た。さらにこのペレットを2mlのExtraction Buffer(50mM HEPES (pH8.0)、3mM MgCl2、10mM 2-メルカプトエタノール、10μM GDP、プロテアーゼインヒビターカクテル、50mM NaCl、1%コール酸ナトリウム)を用いてけん濁、さらに4℃、1時間の攪拌を行った後、さらに100000G、20分の遠心を行い、その上清を抽出液(2ml)として得た。抽出液(2ml)にBuffer A(50mMHEPES (pH8.0)、3mM MgCl2、10mM 2-メルカプトエタノール、10μM GDP、プロテアーゼインヒビターカクテル、100mM NaCl、0.5% Lubrol)16mlを加えた溶液を作成した。
上記(1)で取得した精製Gβ1γ2-Mycを用い、Gβ1γ2-Myc存在下における各サブタイプ(α、β、γ、δ)PI3-kinaseの活性に対する、N-deacetylcolchicineおよび化合物1の作用の検討を、報告されているMaierら(非特許文献4)、Kerchnerら(非特許文献10)の方法を参考に行った。各サブタイプのPI3-kinaseは、α(PI3Kinase (p110α/p85α), active、Upstate社、製品番号14-602)、β(PI3 Kinase(p110β/p85α), active、Upstate社、製品番号14-603)、γ(PI3KγHis-GST(Phosphoinositide 3-kinase p110γHis/p101GST)human, Recombinant, Sf9 insect cell、JENA Bioscience社、製品番号PR-347S)、δ(PI3 Kinase (p110δ/p85α), active、Upstate社、製品番号14-604)をそれぞれ用いた。また、下記の反応において、バッファーとしてPI3Kバッファー(40mM HEPES-Na (pH7.4)、120mM NaCl、1mM EGTA、1mMジチオスレイトール、1mMβグリセロ燐酸、10mM MgCl2、0.1% BSA)を用いた。
上記(2)の結果に基づき、化合物1によるPI3-kinaseβの活性化がGβ(Gβ1γ2-Myc)依存的なものであるかどうか、さらに化合物1以外のGβ結合物質でも同様の活性化が見られるかを確かめるため、さらに下記の検討を行った。
なお上記において、化合物1、化合物6を適当な被検物質に替えて酵素活性亢進作用を検出することにより、血糖降下作用物質のスクリーニングを行うことが可能である。
1.5ml容マイクロチューブにPI3Kバッファー(40mM HEPES-Na (pH7.4)、120mM NaCl、1mM EGTA、1mMジチオスレイトール、1mMβグリセロ燐酸、10mM MgCl2、0.1% BSA)中(300μl)に、実施例20(1)で取得したGβ1γ2-Myc,200ng、PI3-kinaseβ(PI3 Kinase (p110β/p85α), active、Upstate社、製品番号14-603)160ng、被検物質を加え、室温で30分間静置した。これに抗cMyc抗体(9E10、200μg/ml、SantaCruz社、製品番号sc-40)溶液(10μl)を加え、さらに室温で2時間静置した。この溶液に、同バッファーで洗浄した抗マウスIgGアガロースビーズ(American Qualex社、製品番号61060)25μlを加え、室温で1時間攪拌混合した後、遠心(10000rpm、1分)により上清を除き、さらに0.5mlの同バッファーで3回、ビーズの洗浄を行った。ビーズはSDSを含むバッファーで煮沸溶出し、SDSポリアクリルアミド電気泳動後、抗p110β抗体(SantaCruz社、製品番号sc-602)および抗Gβ抗体(SantaCruz社、製品番号sc-261)を用いたウェスタンブロット法により、ビーズに吸着したp110β量、およびGβ量を測定した。
なお上記において、化合物1、化合物6を適当な被検物質に替えてGβとp110β(PI3-kinaseβ)の結合亢進作用を検出することにより、血糖降下作用物質のスクリーニングを行うことが可能である。
ヒト肝臓由来HLF細胞の化合物6によるAktリン酸化活性に対する、siRNA法を用いたGβの発現抑制の効果の評価を下記の通り行った。
HLF細胞を3.75x104/wellとなるように、10%FCSを含むダルベッコMEM培地を用いて、24well dish(IWAKI、製品番号3820-024)に播種し、37℃、5%CO2存在下で6時間培養し、細胞を十分に付着させた後、「ネガティブコントロールsiRNA」(Sense:UUCUCCGAACGUGUCACGU
dTdT(配列番号:37)、Antisense:ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT(配列番号:38)、キアゲン社、製品番号1027310)、または、Gβ1 siRNA(Sense:GAUCAUUGUUGCACACAAAdTdT(配列番号:39)、Antisense:UUUGUGUGCAACAAUGAUCdTdG(配列番号:40)、キアゲン社、製品番号SI00428841)およびGβ2 siRNA(Sense:GCCAUGAAUCCGACAUCAAdTdT(配列番号:41)、Antisense:UUGAUGUCGGAUUCAUGGCdCdG(配列番号:42)、キアゲン社、製品番号SI00428848)およびGβ4 siRNA(Sense:CCUUAUAUUUGCAGGUGAAdTdT(配列番号:43)、Antisense:UUCACCUGCAAAUAUAAGGdTdA(配列番号:44)、キアゲン社、製品番号SI00130746)を等量ずつ含む「Gβ siRNA」用い、Dharmafect2(Dharmacon社、製品番号T-2002-02)を用いてそれぞれ100nMの濃度でsiRNAの細胞内導入を行い、37℃、5%CO2存在下で48時間培養した。siRNA導入48時間後に10%FCSを含むダルベッコMEM培地0.5mlに置換し、さらに37℃、5%CO2存在下で20時間培養した後、0.1%BSAを含むダルベッコMEM培地0.5mlに置換し、37℃、5%CO2存在下で4時間培養した後、化合物6および0.1%BSAを含むダルベッコMEM培地0.5mlに置換し、37℃、5%CO2存在下で20分間の処理を行った。その後、0.5ml PBSを用いて洗浄し、リシスバッファー(Cell Signaling Technologies社、製品番号9803、1mM PMSFを含む)100μlにけん濁し、超音波破砕した後、遠心(14000rpm、10分間)を行うことによって上清を抽出液として得た。プロテインアッセイ(BioRad社、製品番号500-0006)を用い、BSAを標品とした蛋白質定量を行い、それぞれの抽出液の蛋白質濃度が同等になるように調整した。SDSポリアクリルアミド電気泳動後、抗リン酸化Akt抗体(Cell Signaling Technologies社、製品番号9271)、および抗Gβ1抗体(SantaCruz社、製品番号sc-379)および抗Gβ2抗体(SantaCruz社、製品番号sc-380)および抗Gβ4抗体(SantaCruz社、製品番号sc-382)を用いたウェスタンブロット法により、リン酸化Akt量およびGβ1量およびGβ2量およびGβ4量を測定した。図16に示したように、「ネガティブコントロールsiRNA」を導入した場合、化合物6濃度依存的にリン酸化Akt量が上昇するのに対し、「GβsiRNA」を導入し、Gβの発現が抑制された場合では、化合物6のいずれの濃度においてもリン酸化Akt は検出されなかった。以上より、化合物6によるAktリン酸化はGβを介していることが明らかとなった。
(1)G蛋白質βγ(Gβ1γ2-His)の調製
昆虫細胞を用いたGβ1の発現系の構築は実施例19(2)に示した通りに行った。昆虫細胞を用いた6xHis-Gγ2の発現系の構築は以下のように行った。
配列番号45及び46の合成DNAをプライマーとし、ヒトGγ2の全蛋白コード領域を含むcDNAクローンをテンプレートとして定法によりPCR反応を行った。得られた0.3kbpのDNAを、ベクターpCR4Blunt-TOPO(インビトロジェン社、Cat No.K2875)にサブクローニングした後、配列番号47で示した塩基配列(配列番号48はアミノ酸配列を示す)を確認し、さらに制限酵素EcoRI、XhoIで切断し、Bac-to-Bacバキュロウイルス発現システム(インビトロジェン社、Cat No.10359-016)のベクターpFastBac1の同制限酵素部位に挿入し、pFB1-6xHis-GNG2を作成した。さらに添付マニュアルに従い、形質転換した大腸菌DH10Bac株の培養液からバクミドDNAを調製した。このバクミドDNAをカイコ細胞Sf-21株にリポフェクション法により遺伝子導入を行い、6xHis-Gγ2蛋白を発現する組換えウイルスを取得した。マニュアルに従いウイルスは更にSf-21細胞に感染させることにより組換え蛋白を必要な量を確保しうるウイルス力価まで増加させた。目的の組換え蛋白の発現はウイルス感染細胞ライゼートについて6xHisタグ配列特異的抗体を用いたウェスタンブロット法により確認した。
実施例24記載(2)の方法に従ってリピッドミセル溶液を作成し、上記(1)で調製したGβ1γ2-Hisを13.3μg/mlの濃度になるように加え、氷上で10分間静置した。本溶液30μlに、化合物1および6を含む溶液5μl、PI3-kinaseβ(5μg/ml)5μlを順次加え、33P-γ-ATPを含む40μMATP溶液10μlを加え、室温で2時間反応を行った。反応後80μlの1N HClを加えて反応を停止し、300μlのクロロホルム:メタノール(1:1)で脂質の抽出を行い、80μlの1N HClで2回洗浄した後、有機層を10mlの液体シンチレーター(Hionic Fluor)を加えて液体シンチレーションカウンターで33Pを測定した。
すなわち、本方法をスクリーニング系として用い、血糖降下作用物質のスクリーニングが可能であることが明らかとなった。
Claims (6)
- 一般式(I)で示される化合物またはその製薬学的に許容される塩。
i) 置換基を有してもよい場合の置換基とは、ハロゲン原子、水酸基、アルキル基、メルカプト基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルスルホニル基、アシル基、アシルオキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、ニトロ基、シアノ基、トリフルオロメチル基、アリール基、ヘテロアリール基、ジアゾ基、及びアジド基からなる群から選ばれ、また、これらの置換基はビオチン標識、発蛍光団標識、発色団標識、化学発光標識、あるいは酵素標識されてもよく、
ii) −X−が水素原子である場合は、−W−、−Y―、または、Qをすべて有さず、
iii) −Y−が水素原子である場合は、Qを有さない。
さらに、一般式(I)中、以下a)からc)のいずれかの条件が満たされる。
a) X-及び-Y-が共に水素原子以外であり、Qがビオチン、発蛍光団、発色団、化学発光官能基、または酵素である;
b) X-及び-Y-が共に水素原子以外であり、Qがジアゾ基、またはアジド基である;
c) X-及び-Y-が共に水素原子以外であり、Qが固相である。} - X-及び-Y-が共に水素原子以外であり、Qがビオチン、発蛍光団、発色団、化学発光官能基、または酵素である、請求項1に記載の化合物またはその製薬学的に許容される塩。
- 置換基を有してもよい場合の置換基がビオチン標識、発蛍光団標識、発色団標識、化学発光標識、あるいは酵素標識されていない、請求項2記載の化合物またはその製薬学的に許容される塩。
- -X-及び-Y-が共に水素原子以外であり、Qがジアゾ基、またはアジド基である、請求項1に記載の化合物またはその製薬学的に許容される塩。
- 置換基を有してもよい場合の置換基がビオチン標識、発蛍光団標識、発色団標識、化学発光標識、あるいは酵素標識されていない、請求項4記載の化合物またはその製薬学的に許容される塩。
- -X-及び-Y-が共に水素原子以外であり、Qが固相である、請求項1記載の化合物またはその製薬学的に許容される塩。
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