PT2049519E - Derivados cíclicos enquanto moduladores da actividade dos receptores das quimiocinas - Google Patents

Description

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Descrição "Derivados cíclicos enquanto moduladores da actividade dos receptores das quimiocinas"

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção diz respeito, de forma geral, a moduladores da actividade do receptor das quimiocinas com uma inesperada combinação de propriedades farmacológicas desejáveis. São também descritas as composições farmacêuticas que os contêm, e os métodos de utilização dos mesmos enquanto agentes para o tratamento e prevenção de doenças inflamatórias, alérgicas, auto-imunes, metabólicas, cancerígenas e/ou cardiovasculares, em especial a diabetes, a doença de Crohn, a aterosclerose e a esclerose múltipla, juntamente com os métodos de preparação de compostos e substâncias intermédias dos mesmos. Também são proporcionados os metabolitos de compostos activos, bem como composições farmacêuticas e uso das mesmas. -2-

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

As quimiocinas são citocinas quimiotácticas, com peso molecular entre os 6 e os 15 kDa, libertadas por uma ampla variedade de células para atrair e activar, entre outros tipos de células, os macrófagos, linfócitos T e B, eosinófilos, basófilos e neutrófilos (revisto em: Charo e Rasonhoff, New Eng. J. Med. 2006, 354, 610-621; Luster, New Eng. J. Med. 1998, 338, 436-445, e Rollins, Blood 1997, 90 909-928). Existem duas classes principais de quimiocinas, CXC e CC, dependendo do facto de as primeiras cisteinas na sequência de aminoácidos serem separadas por um só aminoácido (CXC) ou serem adjacentes (CC) . As quimiocinas CXC, tal como a interleucina-8 (IL-8), a proteína 2 activadora de neutrófilos (NAP-2) e proteína com actividade estimuladora do crescimento de melanomas (MGSA) são quimiotácticas primariamente para neutrófilos e linfócitos T, enquanto que as quimiocinas CC, como RANTES, ΜΙΡ-Ια, MIP-1β, as proteínas quimiotácticas de monócitos (MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4 e MCP-5) e as eotaxinas (-1 e -2) são quimiotácticas para, entre outros tipos de células, macrófagos, linfócitos T, eosinófilos, células dendríticas e basófilos. Existem também as quimiocinas linfotactina-1 -3- linfotactina-2 (ambas quimiocinas C) e fractalcina (uma quimiocina CX3C) que não se inserem em nenhuma das principais subfamilias de quimiocinas.

As quimiocinas liqam-se a receptores específicos na superfície celular que pertencem à família das proteínas com sete domínios transmembranares acopladas à proteína G (revisto em: Horulk, Trends Pharm. Sei. 1994, 15, 159-165), que são desiqnadas de "receptores de quimiocinas". Ao ligar-se aos seus ligandos correspondentes, os receptores de quimiocinas transduzem um sinal intracelular através das proteínas G triméricas associadas, resultando, entre outras respostas, num rápido aumento da concentração de cálcio intracelular, em alterações na forma celular, no aumento da expressão de moléculas de adesão celular, desgranulação e promoção da migração celular. Existem pelo menos dez receptores de quimiocinas humanos que se ligam ou respondem a quimiocinas CC com os seguintes padrões característicos (revistos em Zlotnik e Oshie Immunity 2000, 12, 121): CCR-1 (ou "CKR-1" ou "CC-CKR-1") [ΜΙΡ-Ια, MCP-4, RANTES] (Bem-Barruch et al., Cell 1993, 72, 415-425, e Luster, New Eng. J. Med. 1998, 338, 436-445), CCR-2A e CCR-2B (ou "CKR-2A"/"CKR-2B" ou "CC-CKR-2A"/"CC-CKR-2B") [MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4, MCP-5] (Charo et al., Proc. Natl. Acad. Sei. -4- USA 1994, 91, 2752-2756, e Luster, New Eng. J. Med. 1998, 338, 436-445), CCR-3 (ou "CKR-3" ou "CC-CKR-3") [eotaxina- 1, eotaxina-2, RANTES, MCP-3, MCP-4] (Combadiere et al., J. Biol. Chem. 1995, 270, 16491-16494, e Luster, New Eng. J.

Med. 1998, 338, 436-445), CCR-4 (ou "CKR-4" ou "CC-CKR-4") [TARC, MDC] (Power et al., J. Biol. Chem. 1995, 270, 19495-19500, e Luster, New Eng. J. Med. 1998, 338, 436-445), CCR-5 (ou "CKR-5" ou "CC-CKR-5") [ΜΙΡ-Ια, RANTES, ΜΙΡ-1β] (Sanson et al., Biochemistry 1996, 35, 3362-3367), CCR-6 (ou "CKR-6" ou "CC-CKR-6") [LARC] (Baba et al., J. Biol. Chem. 1997, 272, 14893-14898), CCR-7 (ou "CKR-7" ou "CC- CKR-7") [ELC] (Yoshie et al., J. Leukoc. Biol., 62, 634- 644), CCR-8 (ou "CKR-8" ou "CC-CKR-8") [1-309] (Napolitano

et al., J. Immunol., 1996, 157, 2759-2763), CCR-10 (ou "cur-10" ou "CC-CKR-10") [MCP-1, MCP-3] (Bonini et al., DNA and Cell Biol. 1997, 16, 1249-1256) e CCR-11 [MCP-1, MCP-2 e MCP-4] (Schweickert et al., J. Biol. Chem. 2000, 275, 90550).

Para além dos receptores das quimiocinas dos mamíferos, também foi comprovado que os citomegalovirus, vírus da herpes e o vírus da varíola dos mamíferos expressam, em células infectadas, proteínas com as propriedades de ligação dos receptores das quimiocinas (revisto em: Wells e -5-

Schwartz, Curr. Opin. Biotech. 1997, 8, 741-748) . As quimiocinas CC humanas, tal como RANTES e MCP-3, podem provocar uma rápida mobilização do cálcio através destes receptores codificados por vírus. A expressão do receptor pode ser permissiva de infecções ao permitir a subversão do controlo normal do sistema imunitário e da resposta à infecção. Além disso, os receptores de quimiocinas humanas, como o CXCR4, CCR2, CCR3, CCR5 e CCR8, podem actuar como co-receptores para a infecção de células de mamíferos por parte de micróbios como acontece, por exemplo, no vírus da imunodeficiência humana (VIH).

As quimiocinas e os seus receptores correspondentes foram implicados como sendo importantes mediadores de doenças ou distúrbios inflamatórios, infecciosos e imunoreguladores, incluindo a asma e doenças alérgicas, bem como patologias auto-imunes, como a artrite reumatóide e a esclerose múltipla, e doenças metabólicas como a aterosclerose e a diabetes (revisto em Charo e Rasonhoff, New Eng. J. Med. 2006, 354, 610-621, Z. Gao e W. A. Metz, Chem. Ver. 2003, 103, 3733, P. H. Cárter, Current Opinion in Chemical

Biology 2002, 6, 510, Trivedi et al., Ann. Reports Med.

Chem. 2000, 35, 191, Saunders e Tarby, Drug Disc. Today 1999, 4, 80, Premack e Schall, Nature Medicine 1996, 2, -6- 1174). Por exemplo, a proteína quimiotáctica para monócitos 1 (MCP-1) e o seu Receptor 2 das quimiocinas CC (CCR-2) desempenham um papel crucial na atracção de leucócitos para os locais de inflamação e, subsequentemente, na activação destas células. Quando a quimiocina MCP-1 se liga a CCR-2, induz um rápido aumento na concentração intracelular de cálcio, um aumento na expressão de moléculas de adesão celular e promovem a migração de leucócitos. A demonstração da importância da interacção entre MCP-l/CCR-2 foi demonstrada através de experiências com ratinhos geneticamente modificados. Ratinhos MCP-l_/_ foram incapazes de recrutar monócitos nos locais de inflamação após vários tipos de desafios imunitários (Bao Lu, et al., J. Exp. Med. 1998, 187, 601) . Da mesma forma, ratinhos CCR-2 -/ foram incapazes de recrutar monócitos ou de produzir interferões-γ quando desafiados com vários agentes exógenos; além disso, os leucócitos dos ratinhos sem CCR-2 não migraram em resposta ao MCP-1 (Landin Boring et al., J. Clin. Invest. 1997, 100, 2552) , demonstrando, assim, a especificidade da interacção do MCP-l/CCR-2. Dois outros grupos registaram de forma independente resultados equivalentes com diferentes estirpes de ratinhos CCR-2_/_ (William A. Kuziel et al.,

Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1997, 94, 12053, e Takao -7-

Kurihara et al., J. Exp. Med. 1997, 186, 1757). A viabilidade e a saúde geralmente normal dos animais MCP-l^ e CCR-2~7~ é notável, pois a quebra da interacção entre MCP-l/CCR-2 não induz uma crise fisiológica. Juntos, estes resultados levaram à conclusão de que as moléculas que bloqueiam as acções dos MCP-l/CCR-2 deveriam ser úteis no tratamento de um conjunto de doenças inflamatórias e auto-imunes (revisto em: M. Feria e F. Diaz-González, Exp. Opin. Ther. Patents 2006, 16, 49, e Dawson, W. Miltz e C.

Wiessner, C. Exp. Opin. Ther. Targets 2003, 7, 35) . Esta hipótese foi validada através de vários outros modelos animais de doenças, conforme infra descrito. É amplamente conhecido que a MCP-1 é regulada em pacientes com artrite reumatóide (Alisa Koch et al., J. Clin. Invest. 1992, 90, 772-779). Além disso, vários estudos pré-clínicos demonstraram o potencial valor terapêutico do antagonismo da interacção entre a MCP-1 e o CCR2 no tratamento da artrite reumatóide. Recentemente, foi comprovado que uma vacina de ADN que codifica MCP-1 provocou melhorias da artrite crónica induzida por poliadjuvantes em ratinhos (Sawsan Youssef et al., J. Clin. Invest. 2000, 106, 361).

Da mesma forma, os sintomas de doença poderiam ser controlados através de administração directa de anticorpos -8- para MCP-1 para ratinhos com artrite induzida por colagénio (Hiroomi Ogata et al., J. Pathol. 1997, 182, 106), ou artrite induzida pela parede celular estreptocócica (Ralph C. Schimmer et al., J. Immunol. 1998, 160, 1466). Talvez de forma mais significativa, foi comprovado que um antagonista peptidico de MCP-1, MCP-1(9-76), preveniu o surto de doença e reduziu os sintomas de doença (dependendo do horário da administração) no MRL-1 em cada modelo de ratinho com artrite (Jiang-Hong Gong et al., J. Exp. Med. 1997, 186, 131) . Além disso, foi demonstrado que a administração de moléculas de baixo peso molecular antagonistas de CCR2 reduziu o score clinico em modelos de roedores com artrite (C. M. Brodmerkel et al., J. Immunol. 2005, 175, 5370, e M. Xia et al., Pedido de patente norte-americana 0069123, 2006). A administração de um anticorpo anti-CCR2 apresentou efeitos variados em CIA murina, dependendo do horário de administração (H. Bruhl et al., J. Immunol. 2004, 172, 890) . Estudos recentes com ratinhos CCR2-/- sugerem que a delecção de CCR2 pode exacerbar os modelos de roedores com artrite em circunstâncias experimentais especificas (Μ. P. Quinones et al., J. Clin. Invest. 2004, 113, 856, Μ. P.

Quinones et al., J. Mol. Med. 2006, 84, 503). -9-

Sabe-se hoje que a MCP-1 é regulada nas lesões ateroscleróticas, e foi comprovado que os níveis de MCP-1 em circulação são reduzidos através de tratamento com agentes terapêuticos (Abdolreza Rezaie-Majd et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2002, 22, 1194-1199). Vários estudos cruciais demonstraram que o potencial valor terapêutico do antagonismo da interacção MCP-1/CCR2 no tratamento da aterosclerose. Por exemplo, quando os ratinhos MCP-1-/- foram cruzados com ratinhos deficientes em receptor de LDL, foi observada uma redução em 83% na deposição lípidica aórtica (Long Gu et al., Mol. Cell 1998, 2, 275) . Da mesma forma, quando a MCP-1 foi geneticamente removida dos ratinhos que sobre-expressavam a apolipoproteína B humana, os ratinhos resultantes foram protegidos da formação de lesões ateroscleróticas comparativamente aos ratinhos de controlo MCP-1 +/+ apoB (Jennifa Gosling et al., J. Clin. Invest. 1999, 103, 773). Da mesma forma, quando os ratinhos CCR-2-/- foram cruzados com ratinhos apolipoproteína E -/-, foi registado uma significativa redução na incidência de lesões ateroscleróticas (Landin Boring et al, Nature 1998, 394, 894, T. C. Dawson et al., Atherosclerosis 1999, 143, 205) .

Por fim, quando aos ratinhos com apoliproteína E -/- foi -10- administrado um gene que codifica um antagonista peptídico do CCR2, então a dimensão da lesão é reduzida e a estabilidade das placas é aumentada (W. Ni et al., Circulation 2001, 103, 2096-2101). O transplante de medula óssea de ratinhos CCR2-/- em ratinhos Leiden-ApoE3 inibiu aterogénese precoce (J. Guo et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2003, 23, 447), mas apresentaram efeitos mínimos sobre as lesões mais avançadas (J. Guo et al., Arterioso ler. Thromb. , Vasc. Biol . , 2005, 25, 1014) .

Os pacientes com diabetes mellitus de tipo 2 tipicamente apresentam resistência à insulina como uma das caracteristicas típicas da doença. A resistência à insulina também é associada ao grupo de anomalias conhecida por "síndrome metabólico" ou "síndrome X", que inclui a obesidade, aterosclerose, hipertensão e dislipidemia (revisto em Eckel et al., Lancet 2005, 365, 1415) . É amplamente reconhecido que a inflamação desempenha um papel na exacerbação do processo de doença na diabetes tipo 2 e nas patologias tipo "síndrome X" (revisto em Chen, Pharmacological Research 2006, 53, 469, Neels e Olefsky, J. Clin. Invest. 2006, 116, 33, Danadona e Aljada, Am. J. Cardiol. 2002, 90, 27G-33G, Pickup e Crook, Diabetologia 1998, 41, 1241) . Sabe-se que a MCP-1 desempenha um papel na - 11 - resistência à insulina induzida pela obesidade. Em cultura, os pre-adipócitos humanos expressam de forma constitutiva MCP-1 (Gerhardt, Mol. Cell. Endocrinology 2001, 175, 81). O CCR2 é expresso em adipócitos. A adição de MCP-1 a adipócitos diferenciados in vitro reduz a absorção de glucose estimulada pela insulina e a expressão de vários genes adipogénicos (LpL, adipsina, GLU-4), aP2, receptor 33-adrenérgico e PPARy) (P. Sartipy e D. Loskutoff, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1999, 96, 6902) . Os pacientes com diabetes tipo 2 apresentaram níveis superiores de MCP-1 circulante do que os controlos não diabéticos (S. Nornura et al., Clin. Exp. Immunol. 2000, 121, 437), e a libertação de MCP-1 do tecido adiposo pode ser reduzida através de tratamento com terapêuticas anti-diabéticas, como sendo a metformina ou as tiazolidinedionas (J. M. Bruun et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 2005, 90, 2282). Da mesma forma, a MCP-1 também foi sobre-expressa em modelos murinos experimentais de obesidade, e foi primariamente produzida pelo tecido adiposo (Sartipy e Loskutoff, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 2003, 100, 7265). Em ratinhos obesos, a expressão de MCP-1 precedeu e ocorreu em simultâneo com o aparecimento de resistência à insulina (H. Xu et al., J. Clin. Invest. 2003, 112, 1821). Um outro estudo mostrou que - 12- a expressão de MCP-1 apresenta uma correlação positiva com a massa corporal em tecido adiposo perigonadal de ratinhos (Weisberg et ai., J. Clin. Invest. 2003, 112, 1796). Consistente com estes dados, o desenvolvimento de resistência à insulina em ratinhos db/db foi melhorada através de delecção genética de MCP-1 ou através da expressão induzida por gene de um péptido negativo dominante (H. Kanda et ai., J. Clin. Invest. 2006, 116, 1494). Foi também demonstrada a conversão lógica: a sobre-expressão de MCP-1 em tecido adiposo promoveu a resistência à insulina (N. Kamei et ai., J. Biol. Chem. 2006, 281, 26602). Um resultado contraditório mostrou que a delecção genética de MCP-1 não activou resistência à insulina no ratinho db/db (F. Y. Chow et al., Diabetologia 2007, 50, 471). Consistentes com os dados relativos à MCP-1, estudos directos com CCR2 (receptor da MCP-1) mostraram que este

desempenha um papel na formação da obesidade e da resistência à insulina induzida pela obesidade. A manutenção de uma dieta rica em gorduras aumentou o número de monócitos inflamatórios circulantes CCR2+ em ratinhos do tipo selvagem (C. L. Tsou et al., J. Clin. Invest. 2007, 117, 902) e ratinhos ApoE~/_ (F. Tacke et al., J. Clin.

Invest. 2007, 117, 185). A delecção genética de CCR2 - 13 - reduziu o número de macrófagos activados em tecido adiposo murino (C. N. Lumeng et al., Diabetes 2007, 56, 16), mas não afectou a população de macrófagos M2 adiposos que se acreditava manterem um estado "magro" (C. N. Lumeng et al., J. Clin. Invest. 2007, 117, 175). A delecção genética de CCR2 reduziu a obesidade induzida pela dieta e melhorou a sensibilidade à insulina em modelo de obesidade induzida pela dieta (S. P. Weisberg et al., J. Clin. Invest. 2006, 116, 115, P. Cornelius, RP Gladue, RS Sebastian, patente de invenção WO 2006/013427 A2), 2006), dependendo das condições experimentais (A. Chen et al., Obes. Res. 2005, 13, 1311) . A administração de uma molécula de baixo peso molecular antagonista de CCR2 também melhorou a sensibilidade à insulina neste mesmo modelo (S. P. Weisberg et al., J. Clin. Invest. 2006, 116, 115).

Dois estudos descreveram a importância do papel desempenhado pelo CCR2 na inflamação, remodelação e hipertrofia vascular induzida pela hipertensão (E. Bush et al., Hypertension 2000, 36, 360, M. Ishibashi et al., Circ. Res. 2004, 94, 1203). É amplamente aceite que a MCP-1 é regulada positivamente na esclerose múltipla humana, e foi comprovado que uma terapêutica eficaz com interferão β-l reduz a expressão de - 14- MCP-1 em células mononucleares de sangue periférico, sugerindo que a MCP-1 desempenha um papel na progressão da doença (Carla Iarlori et al., J. Neuroimmunol. 2002, 123, 170-179). Outros estudos demonstraram o potencial valor terapêutico do antagonismo da interacção entre MCP-l/CCR-2 no tratamento da esclerose múltipla; todos estes estudos foram demonstrados através de encefalomielite auto-imune experimental (EAE), o modelo animal convencional de esclerose múltipla. A administração de anticorpos para MCP-1 a animais com EAE reduziu significativamente a reincidência da doença (K. J. Kennedy et al., J. Neuroimmunol. 1998, 92, 98). Além disso, dois estudos mostraram que os ratinhos CCR-2-/- são resistentes à EAE (B. T. Fife et al., J. Exp. Med. 2000, 192, 899, L. Izikson et al., J. Exp. Med. 2000, 192, 1075). Um estudo subsequente prolongou estas observações iniciais examinando os efeitos da delecção do CCR2 em ratinhos de diferentes estirpes (S. Gaupp et al., Am. J. Pathol. 2003, 162, 139). Em especial, a administração de uma molécula de baixo peso molecular antagonista de CCR2 também reduziu a progressão da doença em ratinhos C57BL/6 (C. M. Brodmerkel et al., J.

Immunol. 2005, 175, 5370). -15 - É amplamente reconhecido que a MCP-1 é regulada positivamente em pacientes que desenvolveram síndrome de bronquiolite obliterante após transplante pulmonar (Martine Reynaud-Gaubert et ai., J. of Heart and Lung Transplant, 2002, 21, 721-730, John Belperio et al., J. Clin. Invest. 2001, 108, 547-556) . Num modelo murino de síndrome de bronquiolite obliterante, a administração de um anticorpo para MCP-1 levou à atenuação da obliteração das vias aéreas; da mesma forma, os ratinhos CCR2-/- mostraram-se resistentes à obliteração das vias aéreas neste mesmo modelo (John Belperio et al., J. Clin. Invest. 2001, 108, 547-556). Estes dados sugerem que o antagonismo entre MCP-1 e CCR2 pode ser benéfico no tratamento da rejeição de órgãos após transplante. Além disso, estudos mostraram que a ruptura do eixo MCP-1/CCR2 foi capaz de prolongar a sobrevivência após transplante de ilhéus (Lee et al., J.

Immunol. 2003, 171, 6929, R. Abdi et al., J. Immunol. 2004, 172, 767). Em modelos de ratinhos enxertados, o CCR2 e MCP-1 provaram ser regulados positivamente em enxertos que desenvolveram doença vascular do enxerto (K. Horiguchi et al., J. Heart Lung Transplant 2002, 21, 1090) . Num outro estudo, uma terapia genética anti-MCP-1 atenuou a doença vascular do enxerto (A. Saiura et al., Artherioscler. - 16-

Thromb. Vasc. Biol. 2004, 24, 1886). Um estudo descreveu a inibição da formação neoinitimal nos enxertos de veia experimentais através de bloqueio de MCP-1 (H. Tatewaki et al., J. Vasc. Surg. 2007, 45, 1236) .

Outros estudos demonstraram o potencial valor terapêutico do antagonismo da interacção entre MCP-1 e CCR2 no tratamento da asma. A captura de MCP-1 com um anticorpo neutralizante em ratinhos desafiados com ovalbumina resultou numa significativa redução na hiperresponsividade e inflamação brônquica (Jose-Angel Gonzalo et al., J. Exp. Med. 1998, 188, 157). Provou ser possível reduzir a inflamação alérgica das vias aéreas em ratinhos desafiados com ovo de Schistosoma mansoni através da administração de anticorpos de MCP-1 (Nicholas W. Lukacs et ai., J. Immunol. 1997, 158, 4398) . Consistente com estes dados, os ratinhos MCP-1-/- Apresentaram uma resposta reduzida ao desafio com ovo de Schistosoma mansoni (Bao Lu et al., J. Exp. Med. 1998, 187, 601).

Outros estudos demonstraram o potencial valor terapêutico do antagonismo da interacção entre MCP-1/CCR2 no tratamento de doenças hepáticas. A administração de anticorpos de MCP-1 num modelo murino de glomerulonefrite resultou numa significativa redução da formaçao glomerular crescente e - 17 - deposição de colagénio de tipo I (Clare M. Lloyd et al., J. Exp. Med. 1997, 185, 1371). Além disso, os ratinhos MCP-1-/- com nefrite induzida por soro nefrotóxico apresentaram danos tubulares significativamente menores do que os seus homólogos MCP-1-/- (Gregory H. Tesch et al., J. Clin. Invest. 1999, 103, 73). Vários estudos demonstraram o potencial valor terapêutico do antagonismo da interacção entre MCP-1/CCR2 no tratamento do lúpus eritematoso sistémico. Ratinhos CCR2-/-apresentaram uma longa sobrevivência e doença renal reduzida comparativamente aos seus homólogos WT num modelo murino de lúpus eritematoso sistémico (G. Perez de Lema et al., J. Am. Soc. Neph. 2005, 16, 3592) . Estes dados são consistentes com a actividade modificadora da doença registada em estudos recentes com delecção genética de MCP-1 (S. Shimizu et al., Rheumatology (Oxford) 2004, 43, 1121, Gregory H. Tesch et al., J. Exp. Med. 1999, 190, 1813) ou administração de um antagonista peptídico de CCR2 (H. Hasegawa et al., Arthritis & Rheumatism 2003, 48, 2555) em modelos de roedores com lúpus.

Observou-se um surpreendente aumento em 30 vezes nos linfócitos CCR2+ na lâmina própria dos intestinos delgados de pacientes com doença de Crohn comparativamente ao ileo -18- saudável (S. J. Connor et al., Gut 2004, 53, 1287). Verificou-se também uma expansão do subconjunto de monócitos circulantes CCR2+/CD14+/CD56+ em pacientes com doença de Crohn activa comparativamente aos controlos. Vários estudos com roedores demonstraram o potencial valor terapêutico do antagonismo da interacção entre MCP-1/CCR2 no tratamento da doença de Crohn/colite. Os ratinhos CCR2-/- foram protegidos contra os efeitos da colite induzida por dextrano sulfato de sódio (Pietro G. Andrés et al., J. Immunol. 2000, 164, 6303) . A administração de um antagonista de pequena molécula de CCR2, CCR5 e CXCR3 (afinidades de ligações em murinos = 24, 236 e 369 nM, respectivamente) também protegeu contra a colite induzida por dextrano sulfato de sódio (H. Tokuyama et al., Int. Immunol. 2005, 17, 1023) . Por fim, os ratinhos MCP-1-/- apresentaram lesões do cólon (macroscópicas e histológicas) substancialmente reduzidas, num modelo de colite induzida por hapteno (W. I. Khan et al., Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 2006, 291, GB03).

Dois estudos descrevem a sobre-expressão de MCP-1 nas células epiteliais e na mucosa intestinal de pacientes com doença inflamatória do intestino (H. C. Reinecker et al., -19-

Gastroenterology 1995, 108, 40 e Michael C. Grimm et ai., J. Leukoc. Biol. 1996, 59, 804).

Um estudo descreveu a associação do polimorfismo promotor no gene MCP-1 com esclerodermia (esclerose sistémica) (S. Karrer et al., J. Invest. Dermatol. 2005, 124, 92). Em modelos semelhantes de fibrose tecidular, a inibição do eixo CCR2/MCP- reduziu a fibrose na pele (T. Yamamoto e K. Nishioka, J. Invest. Dermatol. 2003, 121, 510, A. M.

Ferreira et al., J. Invest. Dermatol. 2006, 126, 1900), no pulmão (T. Okuma et al., J. Pathol. 2004, 204, 594, M.

Gharaee-Kermani et al., Cytokine 2003, 24, 266), rim (K. Kitagawa et al., Am. J. Pathol. 2004, 165, 237, T. Wada et al., J. Am. Soc. Nephrol. 2004, 15, 940), coração (S. Hayashidani et al., Circulation 2003, 108, 2134) e fígado (S. Tsuruta et al., Int. J. Mol. Med . 2004, 14, 837) . Um estudo demonstrou o potencial valor terapêutico do antagonismo da interacção entre MCP- 1/CCR2 no tratamento da alveolite. Quando os ratinhos com lesões pulmonares com complexo imune IgA foram tratados por via intravenosa com anticorpos crescidos contra MCP-1 (JE) de ratinho, os sintomas de alveolite foram parcialmente aliviados (Michael L. Jones et al., J. Immunol. 1992, 149, 2147) . -20-

Diversos estudos comprovaram o potencial valor terapêutico do antagonismo da interacção entre MCP-1/CCR2 no tratamento do cancro (revisto em M. J. Craig e R. D. Loberg, Câncer Metastasis Rev. 2006, 25, 611, I. Conti e B. Rollins, Seminars in Câncer Biology 2004, 14, 149, R. Giles e R. D. Loberg, Curr. Câncer Drug Targets 2006, 6, 659). Quando os ratinhos imunodeficientes detentores de células de carcinoma da mama humanas foram tratados com um anticorpo anti-MCP-1, registou-se uma inibição das micrometastases pulmonares e um aumento da taxa de sobrevivência (Rosalba Salcedo et al., Blood 2000, 96, 34-40). Utilizando amostras clinicas humanas de tumores, a expressão de CCR2 foi associada à progressão do cancro da próstata (Y. Lu et al., J. Cell Biochem. 2007, 101, 676). In vitro, comprovou-se que a expressão de MCP-1 por parte das células de cancro da próstata induziu progenitores de medula óssea humana para ressorção óssea (Y. Lu et al., Câncer Res. 2007, 67, 3646). Múltiplos estudos descreveram o potencial valor terapêutico do antagonismo da interacção entre MCP-1/CCR2 no tratamento da restenose. Nos seres humanos, os níveis de MCP-1 estão directamente associados ao risco de restenose (F. Cipollone et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2001, 21, 327) .

Os ratinhos deficientes em CCR2 ou MCP-1 apresentaram uma -21 - redução na área intimai e na taxa íntima/media (comparativamente aos homólogos do tipo selvagem) após lesão arterial (Merce Roque et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2002, 22, 554, A. Schober et al., Circ. Res. 2004, 95, 1125, W. J. Kim et al., Biochem. Blophys. Res.

Conunun. 2003, 310, 936). Nos ratinhos, a transfecção de um inibidor negativo dominante do MCP-1 no músculo esquelético (K. Egashira et al., Circ. Res. 2002, 90, 1167) também reduziu a hiperplasia intimai após lesão arterial. O bloqueio de CCR2 usando um anticorpo neutralizante reduziu a hiperplasia neointimal após stenting em primatas (C. Horvath et al., Circ. Res. 2002, 90, 488).

Dois estudos descrevem a sobre-expressão de MCP-1 em ratinhos com traumatismo craniocerebral induzido (J. S. King et al., J. Neuroimmunol. 1994, 56, 127, e Joan W.

Berman et al., J. Immunol. 1996, 156, 3017) . Além disso, estudos comprovaram que ratinhos CCR2-/- (O. B.

Dimitrijevic et al., Stroke 2007, 38, 1345) e MCP-1-/- (P. M. Hughes et al., J. Cereb. Blood Flow Metab. 2002, 22, 308) são parcialmente protegidos contra isquemia/lesão de reperfusão. É amplamente reconhecido que os monócitos e macrófagos desempenham um papel importante no desenvolvimento da dor -22- neuropática (Liu T., van Rooijen N., Tracey D. J. Pain 2000, 86, 25). Consistente com esta conclusão, foi descrito recentemente o potencial papel do CCR2 no tratamento da dor inflamatória e neuropática. Os ratinhos CCR2-/-apresentaram respostas alteradas à dor inflamatória comparativamente com os seus homólogos WT, incluindo um comportamento de dor reduzido após injecção intraplantar de formalina e alodinia mecânica ligeiramente reduzida após injecção intraplantar de CFA (C. Abbadie et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 2003, 100, 7947) . Além disso, os ratinhos CCR2-/- não apresentaram alodinia mecânica significativa após lesão do nervo ciático. Da mesma forma, uma molécula de baixo peso molecular antagonista de CCR2 reduziu a alodinia para -80% dos niveis pré-lesão após administração oral (C. Abbadie, J. A. Lindia e H. Wang, patente de invenção WO PCT 110376, 2004).

Um outro estudo descreveu o papel crucial do MCP-1 na cardiomiopatia isquémica (N. G. Frangogiannis et al., Circulation 2007, 115, 584) . Outro estudo descreveu a atenuação da insuficiência cardíaca experimental após inibição do MCP-1 (S. Hayashidani et al., Circulation 2003, 108, 2134) . -23-

Outros estudos providenciaram provas de que a MCP-1 é sobre-expressa em vários estados de doença não supra mencionados. Estes estudos apresentam provas correlacionadas de que os antagonistas de MCP-1 poderiam constituir uma terapêutica útil para tais doenças. Outro estudo demonstrou a sobre-expressão de MCP-1 em enxertos cardíacos de roedores, sugerindo um papel do MCP-1 na patogénese da arteriosclerose em transplantes (Mary E. Russel et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1993, 90, 6086). A sobre-expressão de MCP-1 foi registada nas células endoteliais pulmonares de pacientes com fibrose pulmonar idiopática (Harry N. Antoniades et al., Proc. Natl.Acad. Sei. USA 1992, 89, 5371) . Da mesma forma, a sobre-expressão de MCP-1 foi registada na pele de pacientes com psoríase (M. Deleuran et al., J. Dermatol. Sei. 1996, 13, 228, e R. Gillitzer et al., J. Invest. Dermatol. 1993, 101, 127); foram igualmente descritas conclusões idênticas com predominância das células CCR2+ (C. Vestergaard et al., Acta Derm. Venerol. 2004, 84, 353). Finalmente, um estudo recente comprova que o MCP-1 é sobre-expresso nos cérebros e fluido cérebro-espinal de pacientes com demência associada ao HIV-1 (Alfredo Garzino-Demo, patente de invenção WO 99/46991). -24-

Além disso, foi comprovado que o polimorfismo do CCR2 está associado à sarcoidose em pelo menos um subconjunto dos pacientes (P. Spagnolo et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2003, 168, 1162) .

Também deverá referir-se que o CCR-2 foi implicado como co-receptor de algumas estirpes do HIV (B. J. Doranz et al., Cell 1996, 85, 1149) . Determinou-se que o uso de CCR-2 como co-receptor do HIV pode ser correlacionado com a progressão da doença (Ruth I. Connor et al., J. Exp. Med. 1997, 185, G21). Esta descoberta é consistente com a conclusão recente de que a presença de um mutante CCR-2, o CCR2-641, está positivamente correlacionada com o atraso do aparecimento de sintomas do HIV na população humana (Michael W. Smith et al., Science 1997, 277, 959). Embora a MCP-1 tenha sido implicada nestes processos, é possível que os antagonistas de MCP-1 que actuam através da ligação ao CCR-2 possam apresentar efeitos terapêuticos benéficos no atraso da progressão da doença para SIDA em pacientes infectados por HIV.

Deve ter-se em conta que o CCR2 também é o receptor das quimiocinas humanas MCP-2, MCP-3 e MCP-4 (Luster, New Eng. J. Med. 1998, 338, 436-445) . Visto os novos compostos de fórmula (I) descritos antagonizarem o MCP-1 ao ligarem-se -25 - ao receptor do CCR-2, é possível que estes compostos de fórmula (I) sejam também antagonistas eficazes das acções do MCP-2, MCP-3 e MCP-4 mediadas pelo CCR-2. Assim, quando é feita referência ao "antagonismo do MCP-1", deve assumir-se que este é equivalente ao "antagonismo da estimulação de quimiocinas do CCR-2".

Assim, os compostos que modulam a actividade das quimiocinas poderiam demonstrar uma ampla variedade de utilidade no tratamento de doenças inflamatórias, alérgicas, auto-imunes, metabólicas, cancerígenas e/ou cardiovasculares. A publicação de pedido de patente WO 2005021500 (adiante incorporados por referência e atribuídos ao presente requerente) descreve compostos que modulam a actividade do MCP-1, MCP-2, MCP-3 e MCP-4 através do CCR2. A referência também descreve vários processos para preparar estes compostos, incluindo sínteses de múltiplos passos, que incluem a introdução e subsequente remoção dos grupos protectores. É desejável descobrir novos compostos com características farmacológicas optimizadas comparativamente aos moduladores de quimiocinas conhecidos. Por exemplo, é desejável descobrir novos compostos com actividade inibitória do CCR-2 optimizada e selectividade de CCR-2 versus outros -26- receptores acoplados a proteína G (ou seja, receptor 5HT2A). É também desejável descobrir compostos com características vantajosas e optimizadas numa ou mais do que uma das seguintes categorias: (a) propriedades farmacêuticas (ou seja, solubilidade, permeabilidade, aceitabilidade de formulações de libertação controlada); (b) requisitos de dosagem (por exemplo, dosagens mais baixas e/ou dosagem diária única); (c) factores que reduzem as características ao nível dos picos e vales da concentração sanguínea (ou seja, depuração e/ou volume de distribuição); (d) factores que aumentam a concentração do fármaco activo no receptor (ou seja, ligação de proteínas, volume de distribuição); (e) factores que reduzem a desvantagem de interacções clinicas entre fármaco-fármaco (inibição ou indução das enzimas do citocromo P450, tal como a inibição da CYP 2D6, veja-se G. K. Dresser, J. D. Spence, D. G. Bailey, Clin. Pharmacokinet. 2000, 38, 41-57, que é aqui incorporada por referência); -27 - (f) factores que reduzem o potencial de efeitos secundários adversos (por exemplo, selectividade farmacológica para lá dos receptores acoplados à proteína G, reactividade química ou metabólica potencial, limitada penetração no SNC, selectividade de canal iónico). É especialmente desejável descobrir compostos com uma combinação desejável das características farmacológicas supra mencionadas. É também desejável proporcionar processos novos e/ou optimizados para a preparação de tais compostos. Estes processos podem ser caracterizados, sem que tal constitua qualquer tipo de limitação, a) pela fácil adaptação a uma produção a larga escala, como sendo a escala de processamento ou produção; b) pelos passos e/ou técnicas de processamento que permitam melhorias na pureza (incluindo pureza quiral), estabilidade e/ou facilidade de manuseamento de substâncias intermédias e/ou compostos finais; e/ou c) pelo menor número de passos de processamento. -28-

RESUMO DA INVENÇÃO

Assim, são descritos novos moduladores da actividade das quimicinas, ou sais farmaceuticamente aceitáveis ou pró-fármacos dos mesmos, com uma inesperada combinação de caracteristicas farmacológicas desejáveis. A presente descrição proporciona composições farmacêuticas que incluem um veiculo farmaceuticamente aceitável e uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um dos compostos da presente invenção ou sal farmaceuticamente aceitável ou pró-fármaco do mesmo. A presente descrição também proporciona métodos para o tratamento de doenças inflamatórias, alérgicas, auto-imunes, metabólicas, cancerígenas e/ou cardiovasculares, em especial, a diabetes, a esclerose múltipla, a doença de Crohn e/ou a aterosclerose, que inclui a administração, a um hospedeiro que necessite de tal tratamento, de uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um dos compostos da presente invenção, ou sal farmaceuticamente aceitável, ou pró-fármaco do mesmo. A presente descrição proporciona um processo para a preparação de compostos descritos e substâncias intermédias úteis. -29- A presente descrição também proporciona metabolitos de compostos activos, ou sais farmaceuticamente aceitáveis ou pró-fármacos dos mesmos, composições farmacêuticas dos mesmos e métodos de utilização dos metabolitos no tratamento de doenças inflamatórias, alérgicas, auto-imunes, metabólicas, cancerígenas e/ou cardiovasculares, em particular, a diabetes, a esclerose múltipla, a doença de Crohn e/ou a aterosclerose. A presente descrição proporciona a utilização de novos derivados cíclicos para a produção de um medicamento destinado ao tratamento de doenças inflamatórias, alérgicas, auto-imunes, metabólicas, cancerígenas e/ou cardiovasculares.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1 descreve uma estrutura cristalina em raio X de terc-butil (IR,3R,4S)-acetamido-4-((S)-3- (benziloxicarbonilamino)-2-oxopirrolidin-l-il)ciclohexilcarbamato.

DESCRIÇÃO MINUCIOSA -30- A presente invenção diz respeito, de forma geral, a moduladores da actividade do receptor das quimiocinas com uma inesperada combinação de propriedades farmacológicas desejáveis. São também descritas as composições farmacêuticas que os contêm, e os métodos de utilização dos mesmos enquanto agentes para o tratamento e prevenção de doenças inflamatórias, alérgicas, auto-imunes, metabólicas, cancerígenas e/ou cardiovasculares, em especial a diabetes, a doença de Crohn, a aterosclerose e a esclerose múltipla, juntamente com os métodos de preparação de compostos e substâncias intermédias dos mesmos.

Os compostos da presente invenção demonstraram inesperadamente uma desejável combinação de caracteristicas farmacológicas que incluem um grau surpreendentemente elevado de biodisponibilidade oral em combinação com indicações de que os compostos são altamente eficazes e apresentam excelentes critérios de segurança.

Os moduladores de receptores de CCR2 conhecidos, como aqueles descritos na publicação de patente de invenção W02005021500, publicada a 10 de Março de 2005 (patente de invenção norte-americana n.° 7163937, emitida a 16 de Janeiro de 2007, atribuída ao presente requerente) que demonstram um grau adequado de permeabilidade da membrana -31 - (factor crítico para a biodisponibilidade oral), não são suficientemente eficazes, conforme medido através da sua capacidade de ligação ao CCR2, e/ou não apresentam os critérios de segurança adequados conforme indicado pela selectividade do canal iónico medida através de estudos de hERG e Ca do canal iónico.

Por outro lado, conforme ilustrado pelos dados apresentados na secção intitulada "Características farmacológicas comparativas", infra, as moléculas polares da presente invenção demonstram um grau surpreendentemente elevado de permeabilidade membranar e, ainda assim, mantêm uma potente capacidade de ligação ao CCR2 com excelente selectividade do canal iónico.

Assim, a presente invenção proporciona novos moduladores da das quimiocinas com características farmacológicas optimizadas que se espera serem úteis no tratamento de doenças inflamatórias, alérgicas, auto-imunes, metabólicas, cancerígenas e/ou cardiovasculares.

Também são proporcionados metabolitos de compostos activos, composições farmacêuticas e um método de utilização dos mesmos para o tratamento e prevenção de doenças inflamatórias, alérgicas, auto-imunes, metabólicas, cancerígenas e/ou cardiovasculares, em especial, a -32- diabetes, a aterosclerose, a doença de Crohn e a esclerose múltipla, juntamente com os métodos para a preparação de compostos e substâncias intermédias dos mesmos. Os compostos activos são N-((IR,2S,5R)-5-(terc-butilamino)-2-((S) -oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolin-4- ilamino)pirrolidin-l-il)ciclohexil)acetamida (descrito no pedido de patente de invenção pendente, com o número de inscrição 11079) e N-((IR,2S,5R)-5-isopropil(metil)amino)-2- ( (S)-2-ΟΧΟ-3-(6-(trifluorometil)quinazolin-4-ilamino)pirrolidin-l-il)ciclohexil)acetamida (descrito no pedido de patente de invenção pendente, com o número de inscrição 10720). A actividade destes metabolitos é apresentada adiante, na secção intitulada de "Caracteristicas farmacológicas comparativas".

VARIANTES

Numa variante, a descrição diz respeito a um composto seleccionado entre (i) N-((IR,2S,5R)-2-((3S)-3-((6-terc-butilpirimido[5,4— d]pirimidin-4-il)amino)-2-oxo-l-pirrolidinil)-5-(isopropil(metil)amino)ciclohexil)acetamida; -33- Ν- ((IR,2S,5R)-5-(metilamino)-2-((3S)-2-oxo-3-((6-(trifluorometil)-4-quinazolinil)amino)-1-pirrolidinil)ciclohexil)acetamida; N- ((1R,2S,5R)-5-(isopropil(metil)amino)-2-((3S)-2-oxo-3-((C-(trifluorometil)-4-quinazolinil)amino)-1-pirrolidinil)ciclohexil)formamida; N- ((1R,2S,5R)-5-(dimetilamino)-2-((3S)-2-oxo-3-((6 — (trifluorometil)-4-quinazolinil)amino)-1-pirrolidinil)ciclohexil)acetamida; N-((3S)-1-((IS,2R,4R)-2-acetamido-4-(isopropil(metil)amino)ciclohexil)-2-oxo-3-pirrolidinil)-6-terc-buti1-2-piridinacarboxamida; N-((IR,2Sr5R)-5-amino-2-((3S)-2-oxo-3-((6-(trifluorometil)-4-quinazolinil)amino)-1-pirrolidinil)ciclohexil)propanamida; 2-terc-butil-N- {(3S)-1-((IS,2R,4R)-4-(terc-butilamino) 2-(metanosulfonilamino)ciclohexil) -2-oxo-3-pirrolidonil)-4-pirimidinacarboxamida; 2-terc-butil-N- ((3S)-1-((IS,2R,4R)-4-(terc-butilamino) 2-(propionilamino)ciclohexil)-2-oxo-3-pirrolidinil)-4-pirimidinacarboxamida; -34- Ν-((lR,2S,5R)-5-(terc-butilamino)-2-((3 S)-3-((6-terc-butilpirimido[5,4-d]pirimidin-4-il)amino)-2-oxo-l-pirrolidinil)ciclohexil)metanosulfonamida; e N— (((1S,2 S,5R)-5-metoxi-2-((3 S)-2-oxo-3-((6-(trifluorometil)-4-quinazolinil)amino)-1-pirrolidinil)ciclohexil)metil)acetamida; ou JV-((lR,2S,5R)-5- (terc-butilamino) -2 - ( (3S) -3- ( (6-terc-butilpirimido[5,4-d]pirimidin-4-il)amino)-2-oxo-l-pirrolidinil)ciclohexil)metanosulfonamida; N-((1S,2S,5R)-5-metoxi-2-((3 S)-2-oxo-3-((6-(trifluorometil)-4-quinazolinil)amino)-1-pirrolidinil)ciclohexil)metil)acetamida; JV-((lR,2S,5R)-5- (isopropilamino) -2 - ( (3S) -2-oxo-3- ( (6-(trifluorometil)-4-quinazolinil)amino)-1-pirrolidinil)ciclohexil)acetamida; W-((1R,2S,5R)-5-amino-2-((3S)-2-oxo-3-((6-(trifluorometil)-4-quinazolinil)amino)-1-pirrolidinil)ciclohexil)acetamida; N- ((1R,2S,5R)-5-(isopropil(metil)amino)-2-((3S)-3-((1-oxido-6-(trifluorometil)-4-quinazolinil)amino)-2-oxo-l-pirrolidinil)ciclohexil)acetamida; -35- Ν- ((IR,2S,5R)-5-(isopropilamino)-2-((3S)-3-((1-oxido-6-(trifluorometil)-4-quinazolinil)amino)-2-oxo-l-pirrolidinil)ciclohexil)acetamida; e N- ((1R,2S,5R)-5-(terc-butilamino)-2-((3S)-3-((1-oxido-6-(trifluorometil)-4-quinazolinil)amino)-2-oxo-l-pirrolidinil)ciclohexil)acetamida; ou (ii) um sal farmaceuticamente aceitável de (i).

Numa outra variante, a descrição diz respeito a um composto que é N- ( (1.R, 2S, 5R) -3- ( (3S) -3- ( (6-terc-butilpirimido [5, 4-d]pirimidin-4-il)amino)-2-oxo-l-pirrolidinil)-5-(isopropil(metil)amino)ciclohexil)acetamida, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

Numa variante, a descrição diz respeito a um composto que é N-((IR,2S, 5R)-5-(metilamino)-2-((3S)-2-oxo-3-((6-(trifluorometil)-4-quinazolinil)amino)-1- pirrolidinil)ciclohexil)acetamida, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

Numa outra variante, a descrição diz respeito a um composto que é N-((IR,2S,5R)-5-(isopropil(metil)amino)-2-((3S)—2— oxo-3-((6-(trifluorometil)-4-quinazolinil)amino)-1-pirrolidinil)ciclohexil)formamida, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. -36-

Numa outra variante, a descrição diz respeito a um composto que é N— ( (1.R, 2S, 5R) -5- (dimetilamino) -2- ( (3S) -2-oxo—3- ( (6 — (trifluorometil)-4-quinazolinil)amino)-1- pirrolidinil)ciclohexil)acetamida ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

Numa outra variante, a descrição diz respeito a um composto que é N- ( (3S)-1-((15,2R,4R)-2-acetamido-4- (isopropil(metil)amino)ciclohexil)-2-oxo-3-pirrolidinil)-6-terc-butil-2-piridinacarboxamida ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

Numa outra variante, a descrição diz respeito a um composto que é N-((IR,2S,5R)-5-amino-2-((3S)-2-oxo—3-((6— (trifluorometil)-4-quinazolinil)amino)-1- pirrolidinil)ciclohexil)propanamida ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

Numa outra variante, a descrição diz respeito a um composto que é 2-terc-butil-W-((3S)-1-((IS,2R,4R)-4-(terc- butilamino)-2-(metanosulfonilamino)ciclohexil)-2-oxo-3-pirrolidonil)-4-pirimidinacarboxamida ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. 2-oxo-3-pirrolidinil)-4-pirimidinacarboxamida ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. -37-

Numa outra variante, a descrição diz respeito a um composto que é N-((IR,2S,5R)-5-(terc-butilamino)-2-((3S)-3-((6-terc-butilpirimido[5,4-d]pirimidin-4-il)amino)-2-oxo-l-pirrolidinil)ciclohexil)metanosulfonamida ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

Numa outra variante, a descrição diz respeito a um composto que é N—(((IS,2 S,5R)—5—metoxi —2 —((3 S)-2-oxo —3-((6 — (trifluorometil)-4-quinazolinil)amino)-1- pirrolidinil)ciclohexil)metil)acetamida ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

Outra variante diz respeito a uma composição farmacêutica, que inclui um veiculo farmaceuticamente aceitável e um composto dos Exemplos.

Uma outra variante diz respeito a um composto num método para a modulação das quimiocinas ou da actividade do receptor das quimiocinas, que inclui a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto dos Exemplos, a um paciente que dela necessite.

Uma outra variante diz respeito a um composto num método para a modulação da actividade dos receptores de CCR-2, que inclui a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto dos Exemplos, a um paciente que dela necessite. -38-

Uma outra variante diz respeito a um composto num método para a modulação da actividade do MCP-1, MCP-2 , MCP-3 e MCP-4 mediada pelo receptor do CCR2, que inclui a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto dos Exemplos, a um paciente que dela necessite. Uma outra variante diz respeito a um composto num método para a modulação da actividade do MCP, que inclui a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto dos Exemplos, a um paciente que dela necessite. Uma outra variante diz respeito a um composto num método destinado ao tratamento de doenças inflamatórias, alérgicas, auto-imunes, metabólicas, cancerígenas e/ou cardiovasculares, que inclui a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto dos Exemplos, a um paciente que dela necessite.

Uma outra variante diz respeito a um composto num método destinado ao tratamento de distúrbios, que engloba a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto dos Exemplos, a um paciente que dela necessite, sendo os referidos distúrbios seleccionados entre um grupo que inclui a diabetes, obesidade, síndrome metabólico, enfarte, dor neuropática, cardiomiopatia isquémica, psoríase, hipertensão, esclerodermia, osteoartrite, -39- aneurisma, febre, doença cardiovascular, doença de Crohn, insuficiência cardiaca congestiva, doenças auto-imunes, traumatismos cranianos física ou quimicamente induzidos, doença inflamatória do intestino, alveolite, colite, lúpus eritematoso sistémico, nefrite induzida por soro nefrotóxico, glomerulonefrite, asma, esclerose múltipla, aterosclerose, vasculite, placas vulneráveis, artrite reumatóide, restenose, hiperplasia neointimal venosa, hiperplasia neointimal diálise-enxerto, hiperplasia intimai por shunt artério-venoso, transplante de órgão, nefropatia crónica do enxerto e cancro.

Uma outra variante diz respeito a um composto num método destinado ao tratamento de doenças, que engloba a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto dos Exemplos, a um paciente que dela necessite, sendo que as referidas doenças são seleccionadas entre diabetes, obesidade, doença de Crohn, psoríase, fibrose pulmonar idiopática, arteriosclerose pós transplante, traumatismos cranianos física ou quimicamente induzidos, doença inflamatória do intestino, alveolite, colite, lúpus eritematoso sistémico, nefrite induzida por soro nefrotóxico, glomerulonefrite, asma, esclerose múltipla, -40- aterosclerose e artrite reumatóide, restenose, transplante de órgão e cancro.

Uma outra variante diz respeito a um composto num método destinado ao tratamento de doenças, que engloba a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto dos Exemplos, a um paciente que dela necessite, sendo que as referidas doenças são seleccionadas entre diabetes, obesidade, doença de Crohn, lúpus eritematoso sistémico, glomerulonefrite, esclerose múltipla, aterosclerose, restenose e transplante de órgão.

Uma outra variante diz respeito a um composto num método destinado ao tratamento de doenças, que engloba a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto dos Exemplos, a um paciente que dela necessite, sendo que as referidas doenças são seleccionadas entre esclerose múltipla, aterosclerose, doença de Crohn e diabetes.

Uma outra variante diz respeito a um composto num método destinado ao tratamento de doenças, que engloba a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto dos Exemplos, a um paciente que dela necessite, sendo que as referidas doenças são seleccionadas entre restenose, transplante de órgão e cancro. -41 -

Uma outra variante diz respeito a um composto num método destinado ao tratamento da diabetes, que engloba a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto dos Exemplos.

Uma outra variante diz respeito a um composto num método destinado ao tratamento da esclerose múltipla, que engloba a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto dos Exemplos.

Uma outra variante diz respeito a um composto num método destinado ao tratamento da aterosclerose, que engloba a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto dos Exemplos.

Uma outra variante diz respeito a um composto num método destinado ao tratamento da restenose, que engloba a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto dos Exemplos.

Uma outra variante diz respeito a um composto num método destinado ao tratamento do transplante de órgão, que engloba a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto dos Exemplos.

Uma outra variante diz respeito a um composto num método destinado ao tratamento do cancro, que engloba a -42- administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto dos Exemplos.

Uma outra variante diz respeito a um composto num método destinado ao tratamento do cancro, sendo que o cancro é seleccionado entre o cancro da mama, cancro do fígado, cancro da próstata e melanoma.

Uma outra variante diz respeito a um composto num método destinado ao tratamento de doenças inflamatórias, alérgicas, auto-imunes, metabólicas, cancro e/ou cardiovasculares, que sejam pelo menos parcialmente mediadas por CCR-2, que engloba a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto dos Exemplos.

Uma outra variante diz respeito a um composto num método para a modulação da actividade do CCR2 que engloba a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto dos Exemplos.

Uma outra variante diz respeito a um composto num método para a modulação da actividade do MIP-Ιβ e RANTES que é mediada pelo receptor do CCR5, que engloba a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto dos Exemplos. -43-

Uma outra variante diz respeito a um composto num método para a modulação da actividade do CCR2 que engloba a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto dos Exemplos.

Uma outra variante diz respeito a um composto num método para a modulação da actividade do MIP-Ιβ e RANTES que é mediada pelo receptor do CCR5, que engloba a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto dos Exemplos.

Uma outra variante diz respeito a um composto dos Exemplos na preparação de um medicamento destinado ao tratamento da diabetes, obesidade, sindrome metabólico, enfarte, dor neuropática, cardiomiopatia isquémica, psoríase, hipertensão, esclerodermia, osteoartrite, aneurisma, febre, doença cardiovascular, doença de Crohn, insuficiência cardíaca congestiva, doenças auto-imunes, infecção por HIV, demência associada ao HIV, psoríase, fibrose pulmonar idiopática, arteriosclerose pós transplante, traumatismos cranianos física ou quimicamente induzidos, doença inflamatória do intestino, alveolite, colite, lúpus eritematoso sistémico, nefrite induzida por soro nefrotóxico, glomerulonefrite, asma, esclerose múltipla, aterosclerose, vasculite, placas vulneráveis, artrite -44- reumatóide, restenose, hiperplasia neointimal venosa, hiperplasia neointimal diálise-enxerto, hiperplasia intimai por shunt artério-venoso, transplante de órgão, nefropatia crónica do enxerto e cancro.

Uma outra variante diz respeito a um composto dos Exemplos para utilização em terapia.

Uma outra variante diz respeito a um método para a preparação dos compostos dos exemplos. A invenção pode ser incorporada noutras formas especificas sem qualquer afastamento do espirito ou caracteristicas essenciais da mesma. Esta invenção também engloba todas as combinações de aspectos e variantes alternativas da invenção. É subentendido que toda e qualquer variante pode ser aceite em conjunção com qualquer outra variante para descrever variantes adicionais da presente invenção. Além disso, quaisquer elementos de uma variante (incluindo os aspectos preferidos) devem ser entendidos como sendo combinados com todo e qualquer elemento de qualquer variante para descrever variantes adicionais.

DEFINIÇÕES

Os compostos descritos podem apresentar centros assimétricos. Os compostos da presente invenção que contêm -45- um átomo assimetricamente substituído podem ser isolados em formas opticamente activas ou racémicas. É amplamente conhecida na arte o método de preparação de formas opticamente activas, como sendo através da resolução de formas racémicas ou através de síntese a partir de materiais de base opticamente activos. Muitos isómeros geométricos de olefinas, duplas ligações C=N, e outros semelhantes, também podem estar presentes nos compostos descritos, e todos estes isómeros estáveis são contemplados na presente invenção. São descritos os isómeros geométricos Cis e Trans dos compostos da presente invenção e podem ser isolados como mistura de isómeros ou como formas isoméricas separadas. São contempladas todas as formas quirais, diastereoméricas, racémicas e todas as formas isoméricas geométricas de uma estrutura, excepto se especificamente indicada a forma estereoquímica ou isomérica.

Um enantiómero dos compostos descritos pode apresentar uma superior actividade comparativamente aos demais. Assim, todas as estereoquímicas são consideradas como fazendo parte da presente invenção. Sempre que necessário, a separação do material racémico pode ser realizada através de HPLC utilizando uma coluna quiral ou através de uma resolução com agente de resolução tal como o cloreto -46- canfórico, tal como na obra Steven D. Young et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 1995, 2602-2605, e sais de base dos mesmos. Exemplos de sais farmaceuticamente aceites incluem, sem que tal constitua qualquer tipo de limitação, os sais de ácidos minerais ou orgânicos dos resíduos básicos como as aminas, sais alcalinos ou orgânicos de resíduos acídicos como os ácidos carboxílicos, e semelhantes. Os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem os sais não tóxicos convencionais, ou os sais de amónio quaternários do composto formado, por exemplo, a partir de ácidos inorgânicos ou orgânicos não tóxicos. Por exemplo, tais sais não tóxicos convencionais incluem aqueles derivados de ácidos inorgânicos, com o ácido clorídrico, bromídrico, sulfúrico, sulfâmico, fosfórico, nítrico e semelhantes, e os sais preparados a partir de ácidos orgânicos como o ácido acético, propiónico, succínico, glicólico, esteárico, láctico, málico, tartárico, cítrico, ascórbico, pamóico, maleico, hidroximaleico, fenilacético, glutâmico, benzóico, salicílico, sulfanílico, 2-acetoxibenzóico, fumárico, toluenosulfónico, metanosulfónico, etanodissulfónico, oxálico, isetiónico e semelhantes. -47-

Os sais farmaceuticamente aceitáveis da presente invenção podem ser sintetizados a partir do composto parente que contém uma fracção básica ou acidica através dos métodos químicos convencionais. Geralmente, tais sais podem ser preparados através da reacção das formas livres ácidas ou básicas destes compostos com uma quantidade estequiométrica da base ou ácido adequados em água ou num solvente orgânico, ou numa mistura dos dois; geralmente, são preferíveis meios não aquosos como o éter, acetato de etilo, etanol, isopropanol ou acetonitrilo. As listas de sais adequados podem ser consultadas na obra Remington's Pharmaceutical Sciences, 17.a ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1985, p. 1418, cuja descrição se encontra incorporada por referência.

Visto os pró-fármacos serem conhecidos por optimizarem inúmeras qualidades dos fármacos (por exemplo, a solubilidade, biodisponibilidade, produção, etc.), os compostos da presente invenção podem ser produzidos sob a forma de pró-fármaco.

Os termos "composto estável" e "estrutura estável" indicam um composto que é suficientemente robusto para sobreviver ao isolamento a um grau de pureza útil a partir de uma mistura de reacção, e posterior formulação em agente -48- terapêutico eficaz. Pretende-se que a presente invenção englobe compostos estáveis. A expressão "quantidade terapeuticamente eficaz" deve incluir uma quantidade de um composto da presente invenção por si ou uma quantidade da combinação de compostos reivindicada, ou uma quantidade de um composto da presente invenção em combinação com outros ingredientes activos eficazes na inibição do MCP-1 ou no tratamento ou prevenção de doenças.

Conforme utilizados, os termos "tratar" ou "tratamento" abrangem o tratamento de um estado patológico num mamífero, em especial num ser humano, e incluem (a) a prevenção da ocorrência do estado patológico num mamífero, em especial quando esse mamífero apresenta uma predisposição para o estado patológico, mas ainda não lhe foi diagnosticada tal doença; (b) a inibição do estado patológico, ou seja, a detenção do seu desenvolvimento, e/ou (c) o alívio do estado patológico, ou seja, a regressão do estado patológico.

EXEMPLOS

Conforme apropriado, as reacções foram realizadas sob atmosfera de azoto seco (ou árgon). Nas reacções anidras, -49- utilizaram-se solventes Dri-Solv de EM. Nas restantes reacções, foram utilizados solventes reagent grade ou solventes para HPLC. Todos os reagentes comerciais obtidos foram utilizados conforme recebidos.

As medições por LC/MS foram obtidas usando um sistema híbrido tipo quadrupolo Shimadzu HPLC/Waters ZQ. Os dados do pico de interesse são registados por ionização do tipo electrospray em modo positivo. Foram também obtidos espectros de RMN (ressonância magnética nuclear) com instrumentos Bruker ou JEOL 400 MHz e 500 MHz nos solventes indicados. Todos os desvios químicos ("Chemical shift") foram registados em ppm a partir de tetrametilsilano com a ressonância do solvente como padrão interno. Os dados espectrais de 1H-RMN são geralmente registados da seguinte maneira: desvio químico, multiplicidade (s= singleto, br s= singleto largo, d= dupleto, dd= dupleto ou dupletos, t= tripleto, q= quarteto, sep= septeto, m= multipleto, app= aparente), constantes de acoplamento (Hz) e integração.

Os versados na arte reconhecerão as abreviaturas de referência utilizadas. Para agilização da referência, as abreviaturas incluem, sem que tal constitua qualquer tipo de limitações, sat. = saturado, HPLC = cromatografia líquida de alta resolução, AP = área percentual, KF = Karl- -50-

Fischer, RT = temperatura ambiente, mmol = milimoles, HRMS = espectroscopia de massa de alta resolução, TBTU = 0- benzotriazol-2-il-N,N,N'' , Ν' - tetramet ilurónio tetrafluoroboratinho, MTBE = TBME = éter metil-t-butílico, EDAC = cloridratinho de N-(3-dimetilaminopropil)-N'- etilcarbodiimida, EDC = N-(3-dimetilaminopropil)-Ν'- etilcarbodiimida, TEA = trietilamina, DPPA = difenil fosforazida, IPA = álcool isopropílico, TFA = ácido trifluoroacético, DCM = diclorometano, THF = tetrahidrofurano, DMF = N,N-dimetilformamida, BOP = (benzotriazol-l-iloxi)tris(dimetilamino)fosfónio hexafluorofosfato, EtOAc = acetato de etilo, DMSO = dimetilsulfóxido, °C = graus Celsius, eq = equivalente ou equivalentes, g = grama ou gramas, mg = miligrama ou miligramas, mL (ou ml) = mililitro ou mililitros, h = hora ou horas, M = molar, N = normal, min = minuto ou minutos, MHz = megahertz, tlc = cromatografia em camada fina, v/v = razão volume/volume. "α", "β", "R" e "S" são designações estereoquímicas conhecidas dos versados na arte. -51 - EXEMPLO 1 N- ((1Λ,2S,5R)-2-((3S)-3-((6-terc-butilpirimido[5,4-d] pirimidin-4-il)amino)-2-oxo-l-pirrolidinil)-5-(isopropil(metil)amino)ciclohexil)acetamida Ύ

benziloxicarbonilamino-7-oxo-(-aza-biciclo[3.2.1]octano-6-carboxilato (89,6 g, 0,24 mol, veja-se P. H. Cárter et ai., pedido de publicação de patente WO 2005/021500) foi diluído em acetato de etilo (1,5 1) e a solução resultante foi lavada com NaHCCb sat. (2 x 0,45 1) e NaCl sat. (1 x 0,45 1) . A solução foi seca (Na2S04) e depois filtrada directamente para um balão de fundo redondo de 3 tubuladoras de 3 1. A solução foi purgada com injecção directa de azoto antes de ser carregada com Pd/C a 10% (13,65 g) sob atmosfera de azoto. 0 balão foi evacuado e novamente repleto de hidrogénio; este procedimento foi repetido duas vezes mais. Borbulhou-se hidrogénio na solução durante 30 min. e de seguida, agitou-se a reacção -52- sob 1 atm. de H2 durante 18 h. 0 balão foi evacuado, preenchido com azoto e carregado com catalisador fresco (6 g de Pd/C a 10%). Borbulhou-se hidrogénio na solução durante 30 min. e preencheu-se com azoto. A mistura foi filtrada por celite; lavou-se o filtro com acetato de etilo. Diluiu-se o filtrado (—1,6 1 de volume de AtOAc) com acetonitrilo (0,3 1) e carregou-se sequencialmente com L-N-Cbz-metionina (68 g, 0,24 mol) , TBTU (77 g, 0,24 mol) e N,N—diisopropiletilamina (42 ml, 0,24 mol). Agitou-se a reacção à temperatura ambiente durante 4 horas, durante as quais esta passou de uma suspensão para uma solução transparente. Inundou-se a reacção com a adição de NH4C1 sat. (0,75 1) e água (0,15 1); diluiu-se a mistura com EtOAc (0,75 1) . As fases foram misturadas e separadas e a fase orgânica foi lavada com Na2CC>3 sat. (2 x 0, 9 1) e NaCl sat. (1 x 0,75 1) . A solução foi seca (Na2S04) , filtrada e concentrada in vacuo, dando origem a (IR, 2S, 5R)-terc-butil-2-((S)-2-(benziloxicarbonilamino)-4-(metiltio)butanamido)-7-oxo-6-aza-biciclo[3.2.1]octano-6-carboxilato sob a forma de um óleo, que foi levado para o próximo passo sem demais purificação. LC/MS para pico primário: [M-Boc+H]+ = 406, 3; [M+Na]+ = 528,3. -RMN (400 MHz, d4-MeOH) : δ 7,3 6 (m, 5H), 5,11 (s, 2H) , 4,32 (m, 1H) , 4, 0 (m, 1H) , 2,5-2,7 (m, 3H) , -53- 2,25 (m, 1H) , 2,11 (s, 3H) , 2,05 (m, 4H) , 1,9 (m, 1H) , 1,7 (m, 2H) , 1,54 (s, 9H) . Também presentes estão EtOAc [1,26 (t) , 2,03 (s) , 4,12 (q) ] e Ν,Ν,Ν,Ν-tetrametilureia [2,83 (s) ] .

Exemplo 1, Passo 2: Uma amostra de (1.R, 2S, 5R) -terc-butil-2-((S)-2-(benziloxicarbonilamino)-4-(metiltio)butanamido)-7-oxo-6-azabiciclo[3.2.1]octano-6-carboxilato (0,24 mol assumidos; ver procedimento anterior) foi dissolvido em iodometano (1,250 g) e agitou-se durante 48 h à temperatura ambiente. Concentrou-se a reacção in vacuo. Os resíduos foram dissolvidos em diclorometano e concentrados in vacuo. Esta acção foi repetida duas vezes. A lama resultante foi dissolvida em diclorometano (0,4 1) e lançada para uma solução de MTBE (4,0 1) com agitação rápida. Os sólidos amarelos resultantes foram recolhidos através de filtração por sucção e secos sob alto vácuo, dando origem o sal de sulfónio (179 g) . Este material foi levado para o próximo passo sem demais purificação. LC/MS para pico primário: [M-Me2S+H]+ = 458,4; [M]+ = 520,4. 1H-RMN (400 MHz, d4-MeOH) : δ 7, 35 (m, 5H) , 5,09 (s , 2H) , 4,33 (m, 1H) , 4,28 (m, K i—1 3, 98 (m, 1H) , 3,3-3,45 (m, 2H) , 2,97 (s, 3H) , 2, 94 (s, 3H) , 2, 78 (m, 1H) , 2,0-2,3 (m, 4H) , 1,7 (m, 2H) , 1, 52 (s, 9H) . -54-

Também presentes estão MTBE [1,18 (s), 3,2 (s)] e vestígios de Ν,Ν,Ν,Ν-tetrametilureia [2,81 (s) ] .

Exemplo 1, Passo 3: Todo o sal de sulfónio do passo anterior (0,24 mol assumidos) foi dissolvido em DMSO (2,0 1). Agitou-se a solução resultante sob azoto à temperatura ambiente e carregou-se com carbonato de césio (216 g) , pouco a pouco. Agitou-se a suspensão à temperatura ambiente durante 3 h e depois filtrou-se para remover os sólidos. Dividiu-se a solução em porções de -0,22 1 e procedeu-se da seguinte forma: diluiu-se a mistura de reacção (-0,22 1) com acetato de etilo (1,5 1) e lavou-se sucessivamente com água (3 x 0,5 1) e salmoura (1 x 0,3 1) . A fase orgânica foi seca (Na2S04), filtrada e concentrada in vacuo. Obteve-se o desejado (IR,2S, 5R)-terc-butil-2-((S)-3- benziloxicarbonilamino)-2-oxopirrolidin-l-il)-7-oxo-6-azabiciclo[3.2.1]octano-6-carboxilato (90,8 g, 83%) sob a forma de uma espuma microcristalina, livre de impurezas de tetrametilureia. LC/MS para pico primário: [M-Boc+H]+ = 358,4; [M+Na]+ = 480,4. 1H-RMN (400 MHz, d4-MeOH) : δ 7,35 (m, 5H) , 5,12 (s, 2H) , 4,35 (m, 2H) , 4,2 (m, 1H) , 3,6 (m, 1H), 3,3 (m, 1H), 2,64 (m, 1H), 2,28-2,42 (m, 2H), 2,15 (m, 1H) , 1,7-2,0 (m, 5H) , 1,55 (s, 9H) . Se desejado, este material pode ser isolado sob a forma de um sólido através -55- da diluição em MTBE (1 volume), adicionando a heptano (3,3 volumes) e recolhendo o precipitado resultante.

Exemplo 1, Passo 4: Uma solução agitada de (IR,2S, 5R)-terc-butil-2-((S)-3-benziloxicarbonilamino)-2-oxopirrolidin-l-il)-7-oxo-6-azabiciclo[3.2.1]octano-6-carboxilato (108 g, 0,236 mol) em THF (1 1) foi carregada com hidróxido de litio monohidratado (21,74 g, 0,519 mol). Adicionou-se água (0,3 1) lentamente, de forma que a temperatura não excedeu os 20°C. A reacção foi agitada à temperatura ambiente durante a noite e removeram-se os voláteis in vacuo. Ajustou-se o pH a -4 através da adição de IN de HC1 (450 ml) e NaH2P04. Os precipitados brancos resultantes foram recolhidos por filtração e lavados com água (2 x 1 1) . O sólido foi diluído em diclorometano (1,5 1) e água (~1 1). A camada orgânica foi seca (Na2S04), filtrada e concentrada in vacuo. Os resíduos foram dissolvidos em EtOAc (0,7 1) e a solução resultante foi aquecida em refluxo durante 1 h. Separaram-se os sólidos após arrefecimento à temperatura ambiente, e recolheram-se através de filtração. Estes sólidos foram purificados por recristalização em isopropanol, obtendo-se o desejado ácido (IR,25,5R)-2-((S)-3-(benziloxicarbonilamino)-2-oxopirrolidin-l-il)-5-(terc-butoxicarbonilamino)ciclohexanocarboxílico, sob a forma de -56- um sólido branco (104,5 g, rendimento de 93%). LC/MS para pico primário: [M-tBu+E-l]+ = 420,2; [M-Boc+H]+ = 376,2; [M+H]+ = 476,2 . 1H-RMN (400 MHz, d4- MeOH) : : δ 7,35 (m, 5H) , 5, 11 (s, 2H) , 4,35 (m, 2H) , 3,71 (m , 1H) , 3,45-3,6 (m, 2H) , 2, 99 (m, 1H) , 2,41 (m, 1H) , 2,15 (m , 1H) , 2,0 (m, 2H), 1, 6- 1, 9 (m, 4H) , 1,46 (s, 9H) .

Exemplo 1, Passo 5: Um balão de fundo redondo de 3 1 foi carregado com ácido (1B, 2S,5R)-2-((S)-3- (benziloxicarbonilamino)-2-oxopirrolidin-l-il)-5-{terc-butoxicarbonilamino)ciclohexanocarboxílico (75,5 g, 0,158 mol) , EDC-HC1 (33,5 g, 0,175 mol), 1-hidroxibenzotriazole (23,6 g, 0,175 mol) e diclorometano (1 1) . Agitou-se a reacção à temperatura ambiente durante 2 h, durante as quais esta passou de uma suspensão branca para uma solução transparente. Borbulhou-se amoníaco (gasoso) na solução até o pH ser fortemente básico (papel) e agitou-se a reacção durante 10 min.; repetiu-se esta adição de amoníaco e agitou-se a reacção por mais 10 min. Adicionou-se água. Lavou-se a fase orgânica com NaHC03 sat., NaH2P04 e salmoura antes de se concentrar in vacuo. O resíduo foi fluidificado com acetonitrilo (0,5 1) e depois concentrou-se, obtendo-se (1R,2Sr5R)-2-((S)-3-(benziloxicarbonilamino)-2-oxopirrolidin-l-il)-5-(terc- -57- butoxicarbonilamino)ciclohexanocarboxamida sob a forma de um sólido branco (75,9 g, -100%), que foi utilizado no próximo passo sem demais purificação. LC/MS para pico primário: [M-Boc+H]+ = 375,3; [M+H]+ =475,4; [M-tBu+H]+ = 419, : 3. ^ -RMN (400 MHz, d4- -MeOH): δ 7,35 (m, 5H) , 5, 11 (s 2H) , 4,25 (m, 2H) , 3,70 (m, . 1H) , 3,6 (m, 1H) , 3,45 (m, 1H) 2, 91 (m, 1H) , 2,38 (m, 1H) , • 2,12 (m, 1H) , 1, 9- -2,05 (m, 3H) 1, 65- -1, 9 (m, 4H) , 1 L, 46 (s, 9H) .

Exemplo 1, Passo 6: A reacção foi realizada em três porções iguais e combinada para os procedimentos aquosos. Carregou-se um balão de fundo redondo de 3 tubuladoras de 5 1 com (1R,2S,5R)-2-((S)-3-(benziloxicarbonilamino)-2-oxopirrolidin-l-il)-5-(terc- butoxicarbonilamino)ciclohexanocarboxamida (25,3 g, 53 mmol), acetonitrilo (1,9 1) e 2,6 1 de água/gelo. Agitou-se a mistura e arrefeceu-se a 0°C. Adicionou-se diacetato de iodobenzeno (25,77 g, 80 mmol) e agitou-se a mistura durante 2 h; adicionou-se outro 0,5 eq. de diacetato de iodobenzeno. Agitou-se a reacção durante 9 h (temp. de reacção > 10°C). Carregou-se a mistura com 8 eq. de N,N-diisopropiletilamina e 2 eq. de anidrido acético. Nos trinta minutos seguintes, adicionou-se 4 eq. de N,N-diisopropiletilamina e 2 eq. de anidrido acético a cada dez -58-

minutos, até a reacção prosseguir para a conclusão (HPLC). Removeu-se o acetonitrilo in vacuo; separaram-se alguns sólidos do resíduo e este foi recolhido por filtração. Extraiu-se o resíduo remanescente com diclorometano (3 1, depois 1 1) . Lavou-se a fase orgânica sequencialmente com água, NaHC03 sat. e salmoura. Adicionaram-se os sólidos recolhidos à fase orgânica, juntamente com carbono activado (15 g). Agitou-se a mistura durante 30 minutos a 40°C antes de se filtrar e concentrar in vacuo. Dissolveu-se o resíduo em EtOAc (1 1), e agitou-se a solução resultante a 75°C durante 1 h antes de se deixar arrefecer à temperatura ambiente. Separou-se um sólido e recolheu-se por filtração. Purificou-se este sólido por recristalização: em primeiro lugar, dissolveu-se em 0,5 1 de CH2C12, depois concentrou-se in vacuo, recristalizou-se a partir de 1 1 de EtOAc e repetiu-se esta acção três vezes. Recristalizaram-se os sólidos obtidos das águas-mãe três vezes, usando o mesmo método. Recristalizaram-se duas vezes mais os combinados sólidos a partir de acetonitrilo (0,7 1), obtendo-se 66 g (84%) de terc-butil(IR,2S,5R)-3-acetamido-4-((S)-3- (benziloxicarbonilamino)-2-oxopirrolidin-l-

il)ciclohexilcarbamato (pureza > 99,5% por HPLC). LC/MS para pico primário: [M+H]+ =489,4; [M-tBu+H]+ = 433,3. 1H- -59- -59- RMN (400 MHz, d4-MeOH) : δ 7,3-7,4 (m , 5H) , 5, 11 (s, 2H), 4,35 (m, 1H) , 4,15 (m, 1H) , 4,04 (m, 1H), 3, 8 (m, 1H) , 3,6 (m, 2H) , 2,44 (m, 1H) , 2, 12 (m, 1H) , 1,87- -2, 05 (m, 4H) , 1,87 (s, 3H) , 1,55-1,7 (m, 2H) , 1,46 (s, 9H) . A fidelidade estereoquímica do rearranjo de Hofmann foi confirmado por análise por raio X da estrutura cristalina deste composto, conforme demonstrado na Figura 1.

Exemplo 1, Passo 7: Uma solução agitada de terc-butil (1.R, 3R, 4S) -3-acetamido-4- ( (S) -3-(benziloxicarbonilamino)-2-oxopirrolidin-l- il)ciclohexilcarbamato (66 g, 0,135 mol) em diclorometano (216 ml) foi carregada com ácido trifluoroacético (216 ml). Agitou-se a reacção durante 2 h à temperatura ambiente e concentrou-se in vacuo. Dissolveu-se o resíduo em metanol e concentrou-se a solução resultante in vacuo; repetiu-se uma vez esta acção. Obteve-se benzil (S)-1-( (IS, 2.R, 47?)-2-acetamido-4-aminociclohexil)-2-oxopirrolidin-3-ilcarbamato sob a forma de um óleo e utilizou-se directamente no Passo 8 infra. A LC/MS registou [M+H]+ = 389,4 1H-RMN (400 MHz, d4-MeOH) : δ 7,3-7,4 (m, 5H) , 5,12 (s, 2H) , 4,41 (br, s, 1H) , 4,15 (m, 1H) , 4,00 (t, J= 9,3 Hz, 1H) , 3,81 (t, J =

9,1 Hz, 1H) , 3,65 (q, J 8,4 Hz, 1H) , 3,3-3,4 (m, 1H) , -60- 2,45 (m, 1H) , 1, 95-2, 24 (m, 5H) , 2,00 (s, 3H) , 1,6-1,8 (m, 2H) .

Exemplo 1, Passo 8: Uma solução agitada de benzil(S)-l-((IS, 2R, AR)-2-acetamido-4-aminociclohexil)-2-oxopirrolidin-3-ilcarbamato (-0,135 mol) em metanol (675 ml) foi sequencialmente carregada com acetona (37,8 g, 4 eq.), acetato de sódio (33,2 g, 3 eq.) e cianoborohidreto de sódio (16,9 g, 2 eq.) . Agitou-se a mistura à temperatura ambiente durante 6 h e filtrou-se. Dissolveu-se o filtrado em diclorometano (1 1); lavou-se esta solução com 1 N de NaOH (1 1). Os sólidos recolhidos na filtração foram dissolvidos em lNNaOH (11) a 0°C e extraiu-se com diclorometano (1 1) . Os extractos orgânicos foram combinados e extraídos com HC1 aquoso (200 ml, IN de HC1 + 800 ml de água) . A fase aquosa foi basificada com NaHC03 sat. (500 ml) e depois com 1 N de NaOH (lOOml) até se obter um pH 11. Extraiu-se a fase aquosa com diclorometano (2 1).

Os extractos orgânicos foram combinados, secos (Na2S04) , filtrados e concentrados in vacuo, gerando benzil(S)-l-((IS, 2R, AR)-2-acetamido-4-(isopropilamino)ciclohexil)-2-oxopirrolidin-3-ilcarbamato, sob a forma de um óleo. A LC/MS registou [M+H]+= 431,45. 1H-RMN (400 MHz, d4-MeOH) : δ 7,3-7,4 (m, 5H) , 5,12 (s, 2H) , 4,31 (m, 1H) , 4,24 (t, J = -61 - 9, 4 Hz, 1H) 1-1 \—1 (m, 1H) , 3,61 (t, J 1—1 05 II Hz, 1H) , 3, 52 (q, J = 8, 6 Hz, 1H), 3 , 04 (br, s, 1H) r 2, 96 (sep, J = 6,3, Hz, 1H) , 2, 40 (m, 1H) , 2,15 (m, 1H), 1, 92 (s , 3H) , 1, 7-1, 9 (m, 5H) , 1, 65 (m, 1H) , 1, 12 (app. dd, j = 6,3 , i,i Hz, 6H) . Exemplo i, Passo 9 (ver Passo 9 alternativo, in fra) :

Arrefeceu-se uma solução agitada de benzil(S)-l- ((IS,2R,4R)-2-acetamido-4-(isopropilamino)ciclohexil)-2-oxopirrolidin-3-ilcarbamato (~ 115 mmol) em diclorometano (600 ml) a 0°C e carregou-se sequencialmente com formaldeído (18,6 g, solução com 37% peso), trietilamina (23 ml) e triacetoxiborohidreto de sódio (28,7 g) . Agitou-se a mistura à temperatura ambiente durante 30 minutos e diluiu-se com diclorometano (até 1,2 1). Lavou-se esta solução três vezes com 500 ml de NaHC03 sat. + NaOH (NaHC03 sat., pH 11 com 1 N de NaOH) . Extraiu-se a camada orgânica com HC1 aq. (200 ml, 1 N de HC1 + 600 ml de água). A fase aquosa foi basifiçada com NaHC03 sat. (500 ml) e depois com 1 N de NaOH (100 ml) até se obter pH 11. Extraiu-se a fase aquosa com diclorometano (1,2 1). Os extractos orgânicos foram combinados, secos (Na2S04) , filtrados e concentrados in vácuo, para se obter benzil(S)-1-((15,2R, 4R)-2-acetamido-4-(isopropil(metil)amino)ciclohexil)-2-oxopirrolidin-3-ilcarbamato, sob a forma de um óleo, que -62-

foi utilizado directamente no Passo 10, infra. A LC/MS registou [M+H]+ = 445, 4. 1H-RMN (400 MHz, d4-MeOH) : δ 7,4 (m, 5H) , 5, 12 (s, 2H) , 4,33 (br s, 1H) , 4,25 (t, 9,2 Hz, 1H) , 4, 11 (br s, 1H), 3 ,5-3, 6 (m, 2H), 2,77 s, 2H) , 2,41 (m, 1H) , 2,26 (s, 3H) , E C\1 1-1 C\1 1 o Csi (s, 3H) , 1,7- -1, 9 (m, 5H), 1,10 (app, . dd, J = 17, 6, 6H) .

Exemplo 1, Passo 10: A uma solução de benzil(S)-1-((IS,2R,4R)-2-acetamido-4- (isopropil(metil)amino)ciclohexil)-2-oxopirrolidin-3-ilcarbamato (-0,115 mol) em metanol (600 ml) adicionou-se Pd/C a 10% (6 g de catalisador húmido a 50%) . O balão foi evacuado e repleto de hidrogénio. Agitou-se a mistura sob 1 atm. de H2 durante 2 h e removeu-se o catalisador através de filtração por celite. Concentrou-se o filtrado in vacuo, obtendo-se N-((1R,2S,5R)-2-((S)-3-amino-2-oxopirrolidin-l-il)-5-(isopropil(metil)amino)ciclohexil)acetamida sob a forma de um óleo, que foi transportado para o passo seguinte sem demais purificação. A LC/MS registou [M+H]+ = 311,47. 1H-RMN (400 MHz, d4-MeOH) : δ 4,39 (br s, 1H) , 4,00 (m, 1H) , 3,3-3,5 (m, 4H) , 2,73 (m, 1H) , 2,38 (m, 1H) , 2,25 (s, 3H) , 2, 0-2,2 (m, 3H) , 1,94 (s, 3H) , 1,6-1,75 (m, 4H) , 1,07 (app. dd, J = 21, 6,4 Hz, 6H). -63-

Exemplo 1, Passo 11: A uma solução de N-((lR,2S,5R)-2-((S)~ 3-amino-2-oxopirrolidin-l-il) -5- (isopropil(metil)amino)ciclohexil)acetamida (62 mg, 0,2 mmol) em isopropanol (3 ml) adicionou-se 2-terc-butil-8-cloro-pirimido[5,4-d]pirimidina (49 mg, 1,1 eq., veja-se P. H. Cárter et al., pedido de patente de invenção WO 2005/021500, e trietilamina (40,4 mg, 2 eq.)· Agitou-se a mistura à temperatura ambiente durante 1 h. Removeu-se o solvente sob pressão reduzida. Purificou-se o resíduo com HPLC preparativa para proporcionar o composto do título sob a forma do seu sal de TFA (125 mg, 86,3%). A LC/MS registou [M+H]+ = 497. 1H-RMN (400 MHz, CD3OD) : δ ppm: 9, 31 (1H, s) , 8,67 (1H, s) , 5, 07 (1H, t , J = 9,92 Hz), 4, 14 -4,31 (2H, m) , 3,57-3,89 (4H , m) , 2,78 (3H, s) , 2,58-2 ,67 (1H, m ), 2,38- 2,50 (1H, m) , 1,94-2,29 (6H, m) , 1,92 (3H, s) , 1 ,51 (9H, s), 1,41 (3H, d, J = 6, 61 Hz) , 1,34 (3H, dd, J = 6, 36, 3,81

Hz) . EXEMPLO 2 N— ((li?, 2S, 5R) -5- (isopropilamino) -2- ((3S) -2-oxo-3- ((6-(trifluorometil)-4-quinazolinil)amino)—1— pirrolidinil)ciclohexil)acetamida -64-

Exemplo 2, Passo 1: A uma solução de benzil(S)-l-((IS, 2R, 4R)-2-acetamido-4-(isopropilamino)ciclohexil)-2-oxopirrolidin-3-ilcarbamato (30 mg, 0,07 mmol; veja-se o Exemplo 1, Passo 8) em metanol (3 ml) adicionou-se Pd/C a 10% (30 mg de catalisador húmido a 50%) . O balão foi evacuado e repleto de hidrogénio de um balão de hidrogénio. Agitou-se a mistura à temperatura ambiente durante 1,5 h sob 1 atm. de hidrogénio e de seguida removeu-se o catalisador por filtração. Concentrou-se o filtrado in vacuo. Dissolveu-se o resíduo em isopropanol (3 ml) e carregou-se sequencialmente com 4-cloro-6- (trifluorometil)quinazolina (19,4 mg, 1,2 eq.) e diisopropiletilamina (18 mg, 2 eq.). Agitou-se a mistura à temperatura ambiente durante 1 h. Removeu-se o solvente sob pressão reduzida. Purificou-se o resíduo através de HPLC preparativa de fase reversa, para se obter o composto do título sob a forma do seu sal de TFA (47 mg, 93%) . A LC/MS registou [M+H]+= 493. 1H-RMN (400 MHz, CD3OD) : δ ppm: 8,90 -65- (1H, s) , 8, 81 (1H, s), 8, 25-8 ,29 (1H, m) , 7, 96 (1H, d r J = 8, 65 Hz) , 5 ,44 (1H, t, J = 9, 92 Hz), 4 ,42 (1H, d, J = 2 ,54 Hí 0 , 4,15 -4 ,24 (1H, m) , 3, 90 (1H, t, J ~- = 8,65 Hz) , 3, 70- 3, • 79 (1H, m) , 3,46-3,62 (2H, m) , 2,56- -2, 67 (1H , m) , 2, 33- 2, . 47 (1H, m ) , 1,70-2,23 ( 9H, m) , 1,35 i (6H, d, J = 6, 10 H z) . EXEMPLO 3 N-((IR,2S,5R)-5-(metilamino)-2-((3S)-2-oxo-3-((6-(trifluorometil)-4-quinazolinil)amino)-1-pirrolidinil)ciclohexil)acetamida

H i

Exemplo 3, Passo 1: Uma amostra de terc-butil(IR, 3R, 4S)-3-acetamido-4-((S)-3-benziloxicarbonilamino)-2-oxopirrolidin-1-il)ciclohexilcarbamato (43,2 g, 88 mmol; veja-se o

Exemplo 1, Passo 6) foi dissolvida em diclorometano (200 ml) . Carregou-se a solução com TFA (100 ml) , agitou-se durante 2,5 h e concentrou-se in vacuo. O resíduo foi - 66 - dissolvido em diclorometano (200 ml) e adicionou-se, gota a gota, a solução resultante a uma solução agitada de éter dietilico puro (2,0 1). Recolheu-se o sólido branco com lavagens com éter e depois dissolveu-se em solução salina básica (2,0 M em NaCl e 1,0 M em K2 co3, total de 350 ml). Adicionou-se diclorometano (1,2 D , e misturaram-se vigorosamente as duas fases antes de serem separadas.

Extraiu-se a fase aquosa com diclorometano (3 x 450 ml) . Combinaram-se os extractos orgânicos, secaram-se (MgS04), filtraram-se e concentraram-se in vacuo, para se obter benzil(S)-1-((IS,2R,4R)-2-acetamido-4-aminociclohexil)-2-oxopirrolidin-3-ilcarbamato (34,8 g, quantitativo), sob a forma de um sólido microcristalino, depois de bombear em alto vácuo. A LC/MS registou [M+H]+= 389,5.

Exemplo 3, Passo 2: Uma amostra de benzil(S)-1-((IS,2R,4R)-2-acetamido-4-aminociclohexil)-2-oxopirrolidin-3-ilcarbamato (34,8 g, ca. 90 mmol) dissolveu-se em metanol (400 ml) . Purgou-se o frasco com azoto e carregou-se com trietilamina (15,61 ml, 112 mmol). Agitou-se a reacção à temperatura ambiente durante 14, após as quais a LC/MS da reacção mostrou um consumo completo da amina primária e formação da desejada imina (a LC/MS registou [M+H]+ = 507,4) . Arrefeceu-se a reacção a 0°C e carregou-se com -67- borohidreto de sódio (5,08 g, 134 mmol) em porções, durante 1 minuto. Removeu-se o banho de gelo após 30 min. e agitou-se a solução durante mais 3,5 h. Concentrou-se a reacção in vacuo, para se obter um sólido branco/goma, que se dissolveu em 400 ml de NaHC03 e 1200 ml de EtOAc. Misturaram-se as fases vigorosamente e separaram-se. Lavou-se a fase orgânica 2 x 800 ml de 0,5 N de HC1 (nota: uma terceira fase oleosa encontrava-se no fundo da primeira extracção; tomada juntamente com a fase ácida). Combinou-se as lavagens ácidas, basificaram-se com NaOH sólido a um pH 13, arrefeceram-se à temperatura ambiente e de seguida extrairam-se com EtOAc (1 x 1000 ml; 2 x 600 ml). Combinaram-se os extractos orgânicos, lavaram-se com salmoura (1 x 120 ml) , secaram-se (MgS04) , filtraram-se e concentraram-se in vacuo. Dissolveu-se o resíduo em diclorometano e concentrou-se; repetiu-se este procedimento para se obter benzil(S)-1-((IS,2R,4R)-2-acetamido-4-(4-metoxibenzilamino)ciclohexil)-2-oxopirrolidin-3-ilcarbamato (43, 68 g, 86 mmol, rendimento de 96%), sob a forma de um sólido microcristalino fluido após bombear em alto vácuo. A LC/MS registou [M+H]+ = 509,6.

Exemplo 3, Passo 3: Uma amostra de benzil(S)-1-((IS,2R,4R)-2-acetamido-4-(4-metoxibenzilamino)ciclohexil)-2- -68- oxopirrolidin-3-ilcarbamato (54,45 g, 107 mmol) dissolveu-se em diclorometano (400 ml). Arrefeceu-se a solução resultante a 0°C sob corrente de N2 e de seguida carregou-se sequencialmente com trietilamina (29,8 ml, 214 mmol), formaldeido aquoso (11,96 ml de uma solução a 3%, 161 mmol) e triacetoxiborohidreto de sódio (34,0 g, 161 mmol). Removeu-se o banho de gelo e agitou-se a reacção à temperatura ambiente durante 2 h antes de ser diluído com 750 ml de EtOAc e lavou-se com NaHC03 sat. (2 x 250 ml) . Concentrou-se a fase orgânica in vacuo e o resíduo resultante dissolveu-se em EtOAc (750 ml) . Lavou-se a fase orgânica com ácido [2 x (200 ml de 1 N HC1/300 ml de H20)]. As lavagens acídicas foram combinadas e basificadas com 6 N de NaOH (80 ml) e NaHC03 sat. (70 ml). Extraiu-se a mistura com EtOAc (3 x 500 ml) . Combinaram-se os extractos orgânicos, lavaram-se com salmoura (1 x 100 ml), secaram-se (MgSOí) , filtraram-se e concentraram-se in vacuo. Dissolveu-se o resíduo em cloreto de metileno e concentrou-se; isto foi repetido duas vezes para se obter benzil(S)-l-((IS,2R,4R)-2-acetamido-4-((4- metoxibenzil) (metil)amino)ciclohexil)-2-oxopirrolidin-3-ilcarbamato (54,14 g, 104 mmol, rendimento de 97%) sob a -69- forma de uma espuma microcristalina após bombear em alto vácuo. A LC/MS registou [M+H]+ = 523,6.

Exemplo 3, Passo 4: Uma amostra de benzil(S)-1-((IS,2R,4R)- 2- acetamido-4-((4-metoxibenzil)(metil)amino)ciclohexil)-2-oxopirrolidin-3-ilcarbamato (25,0 g, 47,8 mmol) dissolveu-se em MeOH. O balão foi carregado com dihidroxipaládio (6 g, 8,54 mmol), evacuado e repleto com hidrogénio de um balão de hidrogénio. Agitou-se a mistura à temperatura ambiente e depois filtrou-se (3 x 80 ml de lavagens de isopropanol). Concentrou-se o residuo sob alto vácuo para secagem. Secou-se o residuo azetropicamente com isopropanol (4 x 150 ml) sob pressão reduzida, obtendo-se N-((lR,2S,5R)-2-((S)-3-amino-2-oxopin-olidin-l-il)-5-(metilamino)ciclohexil)acetamida (12,5 g, 46,6 mmol, rendimento de 97%). A LC/MS registou [M+H]+ = 269.

Exemplo 3, Passo 5: A uma solução de N-((IR,2S,5R)-2-((S)- 3- amino-2-oxopin-olidin-l-il)-5- (metilamino)ciclohexil)acetamida (12,5 g, 46,6 mmol) em diclorometano adicionou-se trietilamina (12,98 ml, 93 mmol) e 4-cloro-6-(trifluorometil)quinazolina (10,83 g, 46,6 mmol). Agitou-se a mistura à temperatura ambiente durante a noite e de seguida concentrou-se sob pressão reduzida até secagem. Dissolveu-se o residuo em diclorometano (350 ml) e -70- extraiu-se com uma solução de ácido acético aquoso (1 x 200 ml, 1 x 100 ml; produzida a partir de 300 ml de H20 e 16 ml de ácido acético. Extraiu-se a camada aquosa acidica (pH 4-5) com diclorometano (2 x 300 ml) , basificou-se com Na2C03 até um pH 10-11 e extraiu-se com diclorometano (2 x 350 ml; pH mantido de uma camada aquosa a 10-11, com Na2C03, conforme necessário). Lavou-se a fase orgânica com uma solução saturada de NaCl (1 x 200 ml); a camada de NaCl foi novamente extraída com diclorometano (1 x 100 ml) . Combinaram-se os extractos orgânicos, secaram-se (Na2S04) , filtraram-se e concentraram-se in vácuo, obtendo-se o composto do titulo (19,4 g, 90%). A LC/MS registou [M+H]+ = 465. A HPLC mostra a pureza de 99,4%, sendo a maior impureza singular de 0,5 )%. 1H-RMN (500 MHz, cd3od ) : δ ppm: 8, 77 (1H, s), 8,1 > 6 (1H, s) , 8,02 (1H, dd, J = 8 ,80, 1,37 Hz ) , 7,87 (1H, d, J = 8, 52 Hz), 5, 25 (1H, t, J = 8,52 Hz) , 4, 53 (1H, d, J = 3, 94 H: z) , 4,01 (: 1H, dt, J = 11, 96, 3 ,85, 3, 71 Hz) , 3,46-3, 64 (2H, m) , 32,47 -2,57 (1H, m) , 2,41 (3H, s) , 2 ,22 (1H, dq, J - 12, r 51 , 12,44, 3, 57 ' Hz), r 1, 98 (3H, s) , 1, 95- 1, 98 (1H, m) f 1, 92 -1, 98 (1H, m) , 1,84 -1, 91 (1H, m) , 1, 78 (1H, t, J = 3 ,44 Hz) , 1,71- 1,76 (1H, m) , 1, 62- 1, 69 (1H, m). -71 -

Exemplo 3, Recristalização: Adicionou-se uma amostra do composto do titulo (19,4 g) do Passo 5 a 300 ml de etanol absoluto. A mistura foi trazida a refluxo sob atmosfera de azoto, resultando na total diluição do sólido, e arrefeceu-se lentamente a ~60°C com agitação (formaram-se alguns sólidos antes da concentração). Concentrou-se a mistura lentamente sob pressão reduzida com agitação (banho de óleo mantido a -64 °C) até o peso total do produto e o etanol perfazerem -62 g. Uma quantidade substancial de sólido precipitou-se durante a concentração. Arrefeceu-se a mistura à temperatura ambiente e depois arrefeceu-se em banho de gelo durante 1 h. Filtrou-se a mistura fria e lavou-se o sólido com etanol frio ( — 15 ml) . Secou-se o sólido a 55-60°C durante a noite sob pressão reduzida para se obter a base livre do composto do titulo (17,4 g; recuperação de 90%). A HPLC apresenta uma pureza de 99,9%. EXEMPLO 4 N- ((IR,25,5R)-5-amino-2-((3S)-2-oxo-3-((6-trifluorometil)-4-quinazolinil)amino)-1-pirrolidinil)ciclohexil)acetamida -72- Η ι

Exemplo 4, Passo 1: A uma solução de terc-butil(IR, 3R, 4S) -3-acetamido-4-((S)-3-(benziloxicarbonilamino)-2-oxopirrolidin-1—il)ciclohexilcarbamato (1,7 g, 3,48 mmol; veja-se o Exemplo 1, Passo 6) em metanol (10 ml) adicionou-se Pd/C a 10% (0,6 g de catalisador húmido a 10%). Evacuou-se o balão e preencheu-se com hidrogénio com um balão de hidrogénio. Agitou-se a mistura à temperatura ambiente sob 1 atm. de hidrogénio durante 14 h e removeu-se o catalisador por filtração. Concentrou-se o filtrado in vacuo, para se obter terc-butil(IR,3R,4S)-3-acetamido-4-((S)-3-amino-2-oxopirrolidin-l—il)ciclohexilcarbamato, que foi levado para o passo seguinte sem demais purificação. A LC/MS registou [M+H]+ = 355.

Exemplo 4, Passo 2: A uma solução de terc-butil(IR,3R,45)-3-acetamido-4-((S)-3-amino-2-oxopirrolidin-l— il)ciclohexilcarbamato (~ 3,4 mmol) em isopropanol (10 ml) adicionou-se 4-cloro-6-(trifluorometil)quinazolina (0,97 g, 1,2 eq.) e diisopropiletilamina (0,88 g, 2 eq.). Agitou-se -73- a mistura à temperatura ambiente durante 2,5 h. Removeu-se o solvente sob pressão reduzida. Purificou-se o resíduo com cromatografia com coluna de sílica gel com eluição com MeOH a 1% e a 5% em diclorometano, obtendo-se terc-butil(IR,3R,4S)-3-acetamido-4-((S)-2-oxo-3-(C-(trifluorometil)guinazolinil-4-ilamino)pirrolidin-1— il)ciclohexilcarbamato (2,0 g, -100%). A LC-MS registou [M+H]+ = 551.

Exemplo 4, Passo 3: Carregou-se uma solução agitada de terc-butil(IR,3R,4S)-3-acetamido-4-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)guinazolinil-4-ilamino)pirrolidin-1— il)ciclohexilcarbamato (1,65 g, 3 mmol) em diclorometano (8 ml) com ácido trifluoroacético (4 ml) . Agitou-se a reacção durante 1 h à temperatura ambiente e concentrou-se in vacuo. Dissolveu-se o resíduo numa mistura de 1 ml de etanol e 5 ml de diclorometano. Adicionou-se a solução resultante, gota a gota, a 80 ml de t-butilmetiléter com agitação. Recolheu-se o sólido formado com filtração e secou-se, dando origem ao composto do titulo sob a forma do seu sal de TFA (1,75 g, 86%) . A LC-MS registou [M+H]+ = 451. 1H-RMN (400 MHz, CD3OD) : δ ppm: 8,82 (1H, s) , 8,77 (1H, s), 8,20-8,27 (1H, m), 7,95 (1H, d, J = 8,65 Hz), 5,32 (1H, t, J = 9,92 Hz), 4,36 (1H, d, J = 4,07 Hz), 4,16-4,23 -74- (1Η, m) , 3,87 (1H, t, J = 9,16 Hz), 3, 70-3, 79 (1H, m) , 3,39 (1H, s), 2,54-2, 67 (1H, m) , 2,32-2,45 (1H, m) , 2,08-2,23 (2H, m) , 1, 88-2,04 (6H, m) , 1,73-1,87 (1H, m) . EXEMPLO 5 N- ((1.R, 2S, 5Λ) -5- (isopropil (metil) amino) -2- ((3S) -3- ((1-oxido-6-(trifluorometil)-4-quinazolinil)amino)-2-oxo—1-pirrolidinil)ciclohexil)acetamida

Exemplo 5, Passo 1: Uma amostra de terc-butil(IR, 3R, AS)-3-acetamido-4-((S)-2-oxo-3-((-(trifluorometil)quinazolinil-4-ilamino)pirrolidin-1—il)ciclohexilcarbamato (veja-se o Exemplo 4, Passo 2) foi purificada por HPLC de fase reversa. Dissolveu-se o sal de TFA resultante em EtOAc e lavou-se sucessivamente com IN de NaOH e NaCl sat. Secaram-se os extractos orgânicos (Na2S04) , filtraram-se e concentraram-se in vacuo. Dissolveu-se a base livre resultante (117 mg, 0,21 mmol) em cloreto de metileno (4 -75 - ml) e carregou-se a solução resultante com ácido meta-cloroperóxibenzoico (105 mg de reagente comercial com 77% de pureza). A solução passou para uma cor amarela dentro de 5 min. Agitou-se a reacção durante 3 h antes de ser embebida com a adição de Na2S203 aq. Diluiu-se a mistura com EtOAc e separaram-se as camadas. Lavou-se sucessivamente a fase orgânica com NaHC03 sat. e salmoura antes de se secar (Na2S04) , filtrar e concentrar in vacuo, para se obter 4-((S)-1-(IS,2R,4R)-2-acetamido-4-(terc- butoxicarbonilamino)ciclohexil)-2-oxopirrolidin-3-ilamino)-6-(trifluorometil)quinazolina-l-oxido sob a forma de um sólido amarelo. A LC-MS registou [M+H]+ = 567. A totalidade deste material foi dissolvida em cloreto de metileno (6 ml) e tratada com ácido trifluoroacético (2,5 ml) . Permitiu-se que a solução resultante descansasse durante 3 h antes de ser concentrada in vacuo. Dissolveu-se novamente o residuo em cloreto de metileno (6 ml) e tratinhou-se com ácido trifluoroacético (2,5 ml). Permitiu-se que a solução resultante descansasse durante 0,5 h antes de ser concentrada in vacuo. Purificou-se o residuo por HPLC de fase reversa, obtendo-se o sal de TFA de 4— ( (S) —1 — ((IS,2R,4R)-2-acetamido-4-aminociclohexil)-2-oxopirrolidin-3-ilamino)-6-(trifluorometil)quinazolina-l-oxido sob a -76- forma de pó amarelo (13,6 mg) após liof ilização. A LC-MS registou [M+H]+ = 467,3.

Exemplo 5, Passo 2: Dissolveu-se uma amostra de 4— ( (S)—1 — ((IS,2R,4R)-2-acetamido-4-aminociclohexil)-2-oxopirrolidin-3-ilamino)-6-(trifluorometil)quinazolina-l-oxido (sal de TFA, 13,6 mg) em 2 ml de acetona/metanol (1:1) e carregou-se a solução resultante com cianoborohidreto de sódio (0,3 ml de uma solução de 0,1 M em metanol). A análise por LC/MS após 1,5 h mostrou o consumo do material de base e a conversão em 4-( (S)-1-((IS,2R,4R)-2-acetamido-4- (isopropilamino)ciclohexil)-2-oxopirrolidin-3-ilamino)-6-(trifluorometil)quinazolina-l-oxido. A MS registou [M+H]+ = 509.3. Este material não foi isolado, mas sim adicionalmente purificado: carregou-se a solução com formaldeido aq. a 37% (0,06 ml) e agitou-se durante 30 min, altura em que a análise por LC/MS mostrou a produção do desejado 4-((S)-1-((IS,2R,4R)-2-acetamido-4- (isopropil(metil)amino)ciclohexil)-2-oxopirrolidin-3-ilamino)-6-(trifluorometil)quinazolina-l-oxido. [M+H]+ 523.3. Reduziu-se o volume com corrente de azoto e purificou-se o resíduo resultante por HPLC de fase reversa, obtendo-se o sal de TFA do composto do título, sob a forma -77- de um pó amarelo (1,7 mg) . A LC/MS apresentou [M+H]+ = 523,3.

Preparação alternativa do Exemplo 5

Exemplo 5, Preparação alternativa, Passo 1: Uma amostra de 4-cloro-6-(trifluorometil)quinazolina (3,25 g, 13,97 mmol) foi dissolvida em acetonitrilo (60 ml) sob atmosfera de N2. Carregou-se a solução nebulosa resultante com Cs2C03 (6,83 g, 20,96 mmol) e fenol (1,578 g, 16,77 mmol) e agitou-se à temperatura ambiente. 65 horas depois, filtrou-se a reacção para remoção dos sólidos. Concentrou-se a fase orgânica in vacuo, obtendo-se um sólido cor-de-laranja. Purificou-se o material através de cromatografia por flash automática (80 g de silica gel) usando EtOAc/hexanos (1:3) como eluente, para se obter a desejada 4-fenoxi-6- (trifluorometil)quinazolina sob a forma de um sólido cristalino. A LC/MS apresentou [M+H]+ = 291,1.

Exemplo 5, preparação alternativa, Passo 2: A uma solução de 4-fenoxi-6-(trifluorometil)quinazolina (1,61 g, 5,55 mmol) em CH2C12 anidro (20 ml) adicionou-se ácido 3-clorobenzoperóxido (1,243 g, 5,55 mmol) e agitou-se a mistura à temperatura ambiente durante 5 h. Neste ponto, os -78- sólidos brancos começaram a precipitar. Embebeu-se a reacção com várias gotas de Me2S. À mistura adicionou-se 40 ml de hexano para precipitar o indesejado 2-hidroxi-4-fenoxi-6-(trifluorometil)-quinazolina-l-oxido (0,43 g), que foi recolhida por filtração. Concentrou-se o filtrado para precipitar o desejado 4-fenoxi-6-(trifluorometil)-quinazolina-l-oxido (0,93 g), contaminou-se com subprodutos de ácido benzóico e ca. de 15% de 2-hidroxi-4-fenoxi-6-(trifluorometil)-quinazolina-l-oxido. Este material foi utilizado sem demais purificação. A LC/MS apresentou [M+H]+ = 307,06.

Exemplo 5, preparação alternativa, Passo 3: A uma solução de N-((IR,2S,5R)-2-((S)-3-amino-2-oxopirrolidin-l-il)-5-(isopropil (metil)amino)ciclohexil)acetamida (50 mg, 0,161 mmol; veja-se o Exemplo 1, Passo 10) e 4-fenoxi-6-(trifluorometil)-quinazolina-l-oxido (99 mg, 0,161 mmol) em i-PrOH (2 ml) adicionou-se N,N-diisopropiletilamina (0,056 ml, 0,322 mmol). O recipiente foi selado sob árgon e aquecido no microondas durante lha 120°C. A LC/MS apresentou [M+H]+ = 523,3 como pico máximo do produto. Concentrou-se a mistura e purificou-se através de cromatografia por flash automática (40 g de sílica gel, eluindo com 10% de cNH4OH/MeOH (8:92)) . As fracções que -79- continham o produto desejado unificadas e concentradas in vacuo. Cristalizou-se o resíduo a partir de CH2C12 e hexano. As duas colheitas foram combinadas e secas sob vácuo, obtendo-se o composto do título, 4—( (S)—1 — ( (IS,2R,4R)-2-acetamido-4- (isopropil(metil)amino)ciclohexil)-2-oxopirrolidin-3-ilamino)-6-(trifluorometil)quinazolina-l-oxido (93 mg). A análise por 1H-RMN mostrou que este material continha -0,75 equivalentes molares de CH2CI2. 1H-RMN (400 MHz, d4-MeOH): δ ppm: 8,99 (1H, s) , 8,81 (1H , s) , 8, 62 (d, J = = 8,9 Hz, 1H) , 8,32 (dd, J = 9,0 , 1,5 Hz), 5,28 (t, J = 8,4 Hz, 1H), 4,59 (br s, 1H) , 4,05 (m, 1H), 3 , 55-3 ,65 ( m, 2H), 3,43 (m, 1H) , 2,75 (br s, 1H), 2,55 (m, 1H) , 2,27 (s, 3H) , 2,1-2,3 (m, 3H) , 2,0 (m, 1H) , 1,65-1,7 (m, 3H) , 1,12 (d, J = 6,0 Hz, 3H) , 1,06 (d, J = 6,0 Hz, 3H) . A LC/MS apresentou [M+H]+ = 523,33. EXEMPLO 6 N-((1R,2S,5R)-5-(isopropilamino)-2-((3S)-3-((l-oxido-6-(trifluorometil)-4-quinazolinil)amino)-2-oxo-l-pirrolidinil)ciclohexil)acetamida -80-

Exemplo 6, Passo 1: 0 produto do título é sintetizado como parte da primeira síntese do Exemplo 5 (realizada em dois passos). Se desejado, o composto do título pode ser purificado a partir deste procedimento em vez de feito reagir para formar o Exemplo 5.

Preparação alternativa do Exemplo 6

Exemplo 6, preparação alternativa, Passo 1: A uma solução de benzil(S)-1-((IS,2R,4R)-2-acetamido-4- (isopropilamino)ciclohexil)-2-oxopirrolidin-3-ilcarbamato (0,090 g, 0,209 mmol; veja-se o Exemplo 1, Passo 8) em MeOH (10 ml) adicionou-se -100 mg de Pd/C a 10% (50%, húmido).

Agitou-se a mistura sob H2 (50 psi) durante 14 h. Filtrou-se o catalisador e evaporou-se o solvente para se obter N-((lR,2S,5R)-2-((S)-3-amino-2-oxopirrolidin-l-il) -5-(isopropilamino)ciclohexil)acetamida, sob a forma de um resíduo sólido espumoso (50 mg, 0,169 mmol). Dissolveu-se este material em i-PrOH (2 ml) e carregou-se a solução resultante com 4-fenoxi-6-(trifluorometil)quinazolina-1- -81 - oxido (103 mg, 0,169 itunol; veja-se o Exemplo 5, preparação alternativa, Passo 2) e N,N-diisopropiletilamina (0,059 ml, 0,337 mmol). O recipiente foi selado sob atmosfera de árgon e aquecida no microondas durante lha 120°C. Evaporou-se a reacção, obtendo-se um resíduo oleoso, que foi purificado através de cromatografia por flash automática, dando origem a um sólido amarelo. Este foi recristalizado a partir de CH2Cl2-hexano para se obter o desejado 4—( (S)—1 — ((IS, 2R, 4R)-2-acetamido-4-(isopropilamino)ciclohexil)-2-oxopirrolidin-3-ilamino)-6-(trifluorometil)quinazolina-1-oxido (l.a colheita, 43,5 mg e 2.a colheita, 3,1 mg). A LC/MS apresentou [M+H]+ = 509,32. 1H-RMN (400 MHz, CD3OD): δ 8,99 (s, 1H) , 8,81 (s, 1H) , 8,62 (d, II 0 Hz, i—1 (dd, J = 9, 0 , 1,6 Hz) , 5,28 (t, J = 8,3 Hz, 1H) , 4,56 , 1H), 4 , 02 (brd, 1H) , 3, 63 (m, 2H) , 3,18 (brs, 1H) , 2, 55 (m, 1H), 2,27 (m, 1H) , 2,03 (s, 3H) , 1,97- 7H) , 1,16 (d, J = 5,5 Hz, 3H) , 1,15 (d, J = 5,5 Hz, EXEMPLO 7 N-((IR, 2S,5R)-5-(isopropil(metil)amino-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolin-4-ilamino)pirrolidin-1-11)ciclohexil)formamida -82-

Exemplo 7, Passo 1: Uma solução agitada de ácido (IR,2S,5R)-2-((S)-3-(benziloxicarbonilamino)-2-oxopirrolidin-l-il)-5-(terc- butoxicarbonilamino)ciclohexanocarboxílico (38 g, 0,0799 mol; veja-se o Exemplo 1, Passo 4) em diclorometano (400 ml) foi carregada com ácido trifluoroacético (100 ml) a 0°C. Agitou-se a reacção durante 2 h à temperatura ambiente e concentrou-se in vacuo. Dissolveu-se o resíduo em diclorometano (100 ml) e adicionou-se a solução resultante, gota a gota, a éter dietílico (1500 ml) com agitação. Recolheu-se o sólido através de filtração e lavou-se com éter dietílico (3 x 50 ml) . Secou-se o sólido branco in vacuo para dar origem a ácido (lR,2S,5R)-5-amino-2-((S)-3-(benziloxicarbonilamino)-2-oxopirrolidin-l- il) ciclohexanocarboxílico sob a forma do seu sal de TFA (35,5 g, 86%). O composto foi utilizado no passo seguinte sem demais purificação. A LC/MS apresentou [M+H]+ = 376. -83-

Exemplo 7, Passo 2: Uma solução agitada de ácido (IR,2S,5R)-5-amino-2-((S)-3-(benziloxicarbonilamino)-2-oxopirrolidin-l-il)ciclohexanocarboxílico (sal de TFA, 35,5 g, 0, 0725 mol) em diclorometano (350 ml) foi carregada sequencialmente com N-metilmorfolina (29,3 g, 4,0 eq) e acetona (42,05 g, 10 eq). Agitou-se a mistura à temperatura ambiente durante 10 min. e adicionou-se triacetoxiborohidreto (30,7 g, 2 eq) a 0°C. Agitou-se a mistura à temperatura ambiente durante 14 h, depois adicionaram-se formaldeído (37% peso da solução, 28,4 g, 5 eq) e triacetoxiborohidreto de sódio (18,4 g, 1,2 eq). Agitou-se a mistura à temperatura ambiente durante 2 h. Adicionou-se água (70 ml) e manteve-se a agitação durante 10 minutos. Concentrou-se a mistura sob pressão reduzida para remover os solventes orgânicos. Ajustou-se a mistura resultante a um pH de 7-8 com uma solução de NaHC03 saturado e depois a um pH de ~6 com IN de HC1. Extraiu-se a mistura com diclorometano (5 x 250 ml). Combinaram-se os extractos, secaram-se sob Na2S04 anidro e concentraram-se sob pressão reduzida. Dissolveu-se o resíduo em diclorometano (100 ml) e a solução resultante adicionou-se gota a gota a éter dietílico (1500 ml) com agitação.

Recolheu-se o sólido formado com filtração e lavou-se com -84- éter dietílico (3 x 50 ml) . Secou-se o sólido branco in vacuo para se obter ácido (IR,2S,5R)-2-((S)-3- (benziloxicarbonilamino)-2-oxopirrolidin-l-il)-5-(isopropil(metil)amino)ciclohexanocarboxílico (31 g, 99%). O composto foi utilizado no passo seguinte sem demais purificação. A LC/MS apresentou [M+H]+ = 432.

Exemplo 7, Passo 3: Uma solução agitada de ácido (IR,2S,5R)-2-((S)-3-(benziloxicarbonilamino)-2-oxopirrolidin-l-il)-5- (isopropil(metil)amino)ciclohexanocarboxílico (15,0 g, 0, 0348 mol) em 1,4-dioxano (200 ml) foi carregada com N-metilmorfolina (5,26 g, 1,5 eq) e DPPA (14,3 g, 1,5 eq) a 0°C. Agitou-se a mistura à temperatura ambiente durante 2 h. Carregou-se a mistura com 2-(trimetilsilil)etanol (6,16 g, 1,5 eq) e depois agitou-se durante 2,5 h a 85°C sob a protecção de azoto. Arrefeceu-se a reacção à temperatura ambiente e removeu-se o solvente sob pressão reduzida. 0 resíduo resultante foi dissolvido em acetato de etilo (250 ml) e lavou-se com NaHCCU saturado (3 x 80 ml) e salmoura (3 x 80 ml). Secou-se a solução sob Na2S04 anidro, filtrou-se e concentrou-se in vacuo. Purificou-se o resíduo obtido através de cromatografia com coluna de sílica gel eluindo com 1% e 2,5% de metanol em diclorometano para se obter 2- -85- (trimetilsilil)etil(IR,2S,5R)—2—((S)—3— benziloxicarbonilamino-2-oxopirrolidin-l-il) -5-(isopropil(metil)amino)ciclohexilcarbamato (9,3 g, 49%). A LC/MS apresentou [M+H]+ = 547.

Exemplo 7, Passo 4: Uma solução agitada de 2- (trimetilsilil)etil(1R,2S,5R )-2-((S) — 3 — benziloxicarbonilamino-2-oxopirrolidin-l-il)-5-(isopropil(metil)amino)ciclohexilcarbamato (272 mg, 0,05 mmol) em diclorometano (3 ml) foi carregada com ácido trifluoroacético (2 ml). Agitou-se a reacção durante 2 h à temperatura ambiente e concentrou-se in vacuo. Dissolveu-se o resíduo em diclorometano (50 ml) e lavou-se com NaHC03 (15 ml). Extraiu-se a camada aguosa com diclorometano (4 x 30 ml) . Combinaram-se todas as camadas de diclorometano e secaram-se sob Na2S04 anidro, filtraram-se e concentraram-se in vacuo para dar origem a benzil(S)-1-((IS,2R,4R)-2-amino-4-(isopropil(metil)amino)ciclohexil)-2-oxopirrolidin-3-ilcarbamato (190 mg, 94,5%). A LC/MS apresentou [M+H]+ = 403.

Exemplo 7, Passo 5: A 460 mg (10 mmol) de ácido fórmico, adicionou-se anidrido acético (204 mg, 2 mmol). Agitou-se a mistura à temperatura ambiente durante 2 h. Depois, adicionou-se 1/5 da solução supra a uma mistura de -86- benzil(S)-1-((IS,2R,4R)-2-amino-4- (isopropil(metil)amino)ciclohexil)-2-oxopirrolidin-3-ilcarbamato (60 mg, 0,149 mmol) em diclorometano (3 ml) e trietilamina (62,3 μΐ, 3 eq) a 0°C com agitação. Agitou-se a reacção durante 1 h à temperatura ambiente e adicionou-se 1 ml de água para inundar a reacção. Diluiu-se a mistura com diclorometano (60 ml) e lavou-se com NaHCCú saturado (20 ml) . Secou-se a solução sob Na2SC>4 anidro, filtrou-se e concentrou-se in vacuo para se obter benzil(S)-l- ( (IS,2R,4R)-2-formamido-4- (isopropil(metil)amino)ciclohexil)-2-oxopirrolidin-3-ilcarbamato (50 mg, 78%). A LC/MS apresentou [M+H]+ = 431. Exemplo 7, Passo 6: A uma solução de benzil(S)-l-( (IS,2R,4R)-2-formamido-4- (isopropil(metil)amino)ciclohexil)-2-oxopirrolidin-3-ilcarbamato (50 mg, 0,116 mmol) em metanol (3 ml) adicionou-se Pd/C a 10% (40 mg de catalisador húmido a 50%). Evacuou-se o balão e preencheu-se com hidrogénio com um balão de hidrogénio. Agitou-se a mistura à temperatura ambiente durante lhe removeu-se o catalisador através de filtração. Concentrou-se o filtrado in vacuo para se obter N-((IR,2S,5R)-2-((S)-3-amino-2-oxopirrolidin-l-il)-5-(isopropil (metil)amino)ciclohexil)formamida (35 mg, 100%), -87- que foi levado para o passo seguinte sem demais purificação. A LC/MS apresentou [M+H]+ = 297.

Exemplo 7, Passo 7: A uma solução de N-((IR,2S,5R)-2-( (S)-3-amino-2-oxopirrolidin-l-il)-5- (isopropil(metil)amino)ciclohexil)formamida (34 mg, 0,115 mmol) em isopropanol (3 ml) adicionou-se 4-cloro-6-(trifluorometil)quinazolina (32 mg, 1,2 eq; veja-se P. H. Cárter, pedido de publicação de patente de invenção WO 2005/021500) e trietilamina (29,1 mg, 2,5 eq). Agitou-se a mistura à temperatura ambiente durante a noite. Removeu-se o solvente sob pressão reduzida. Purificou-se o resíduo através de HPLC preparativa para se obter o composto do título sob a forma do seu sal de TFA (76 mg, 91,7%) . A LC/MS apresentou [M+H]+ = 493. ^- RMN (400 MHz, CD3OD): δ ppm: 8 , 73-8, 90 (2H, m) , 8,26 (1H, d, J = 8, 65 Hz) , 8,09 (1H, s ), 7,96 (1H, d, J = 9,16 Hz) ( 5, 35 (1 H, t, J = 9,66 Hz) , 4 , 30 (2H, s), 3,57 -3,92 (4H, m) , 2,77 -2, 83 (3H, m) , 2,56-2,68 (1H, m), 1,91-2,46 (6H, m), 1,29-1,48 (6H, m). -88- EXEMPLO 8 N- ((IR,2S,5R)-(dimetilamino)-2-((3S)-2-oxo-3-((6-(trifluorometil)-4-quinazolinil)amino)-1-pirrolidin)ciclohexil)acetamida

Exemplo 8, Passo 1: Uma solução agitada de terc- butil(IS,3R,4S)-3-acetamido-4-((S) -3-(benziloxicarbonilamino)-2-oxopirrolidin-l- il)ciclohexilcarbamato (66 mg, 0,135 mol; veja-se o Exemplo 1, Passo 6) em diclorometano (216 ml). Agitou-se a reacção durante 2 h à temperatura ambiente e concentrou-se in vacuo. Dissolveu-se o resíduo em metanol e concentrou-se a solução resultante in vacuo; repetiu-se este procedimento uma vez. Obteve-se benzil(S)-1-((IS,2R,AR)-2-acetamido-4-aminociclohexil)-2-oxopirrolidin-3-ilcarbamato sob a forma de um óleo. A LC/MS apresentou [M+H]+ = 389,4. 1H-RMN (400 MHz, d4-MeOH) : δ ppm: 7,3-7,4 (m, 5H) , 5,12 (s, 2H) , 4,41 (br s, 1H) , 4,15 (m, 1H) , 4,00 (t, J = 9,3 Hz, 1H) , 3,81 -89- (t, J = 8,4 Hz, 1H) , 3,3-3,4 (m, 1H) , 2,45 (m, 1H) , 1,95- 2,24 (m, 5H) , 2,00 (s, 3H) , 1,6-1,8 (m, 2H) .

Exemplo 8, Passo 2: A uma solução de benzil(5)-1- ((15, 2R, 4R)-2-acetamido-4-aminociclohexil)-2-oxopirrolidin-3-ilcarbamato, sal de TFA (500 mg, 0,99 mmol) em CH2C12 (20 ml) adicionou-se sequencialmente formaldeido (5 ml, 37% peso da solução), trietilamina (0,35 ml, 2,4 mmol) e triacetoxiborohidreto de sódio (315 mg, 1,5 mmol). 16 horas depois, diluiu-se a solução com CH2C12 e lavou-se com NaHC03 saturado. Recolheu-se a camada orgânica e extraiu-se com uma solução aq. de HC1 (5 ml, IN de HC1 e 20 ml de água) .

Recolheu-se a fase aquosa e basificou-se com uma solução aq. de NaOH (-10 ml IN de NaOH e 20 ml de água) e depois extraiu-se com diclorometano (2 x 50 ml) . Os extractos combinados foram cobinados, secos (Na2S04) , filtrados e concentrados in vacuo para se obter benzil (5)-1-((IS,2R,4R)-2-acetamido-4-(dimetilamino)ciclohexil)-2-oxopirrolidin-3-ilcarbamato sob a forma de um óleo (280 mg, rendimento de 68%). A LC/MS apresentou [M+H]+ = 417. Exemplo 8, Passo 3: A uma mistura de benzil(5)-1- ((15,2R,4R)-2-acetamido-4-(dimetilamino)ciclohexil)-2-oxopirrolidin-3-ilcarbamato (70 mg) e Pd/C a 10% (30 mg de catalisador húmido a 50%) adicionou-se EtOAc (50 ml) e de -90- seguida evacuou-se o balão e preencheu-se com hidrogénio. Agitou-se a mistura sob 1 atm de H2 durante 16 h e removeu-se o catalisador através de filtração por celite. Concentrou-se o filtrado in vacuo para se obter N-((IR,2S,5R)-2-((S)-3-amino-2-oxopirrolidin-l-il)-5-(dimetilamino)ciclohexil)acetamida sob a forma de uma sólido branco (40 mg, rendimento de 85%), que foi levado para o passo seguinte sem demais purificação. A LC/MS apresentou [M+H]+ = 283.

Exemplo 8, Passo 4: A uma solução de N-((IR,2S,5R)-2-((S)-3-amino-2-oxopirrolidin-l-il)-5- (dimetilamino)ciclohexil)acetamida (40 mg, 0,14 mmol) em isopropanol (6 ml) adicionou-se 4-cloro-6- (trifluorometil)quinazolina (39 mg, 0,17 mmol) e trietilamina (0,02 ml, 0,14 mmol). Agitou-se a mistura à temperatura ambiente durante 16 h e concentrou-se in vacuo até se obter um óleo bruto, que foi purificado através de HPLC de fase reversa semi-preparativa (eluição de gradiente, água/metanol/TFA), para se obter o composto do titulo (70 mg, rendimento de 71%) . A LC/MS apresentou [M+H]+ = 479. 1H-RMN (400 MHz, CD3OD) : δ ppm: 8,87 (s, 1H) , 8, 72 (s, 1H) , 8,22 (m, 1H) , 7,87 (m, 1H) , 5,49 (m, 1H) , 4, 23 (m, 1H) , 4,2 (m, 1H) , 4,12 (m, 1H) , 3,75 (m, 1H) , 3,65 -91 - (m, 1H) , 3,38 (m, 1H) , 2,82 (s, 6H) , 2,51 (m, 1H) , 2,15 (m, 1H), 2,14-1,86 (m, 5H), 1,84 (s, 3H). EXEMPLO 9 N- ((3S) -1- ((IS, 2R, 4Λ) -2-acetamido-4- (isopropil(metil)amino)ciclohexil)-2-oxo-3-pirrolidin)-6-terc-butil-2-piridinacarboxamida

Exemplo 9, Passo 1: 6-terc-butilpicolinonitrilo (662 mg, 4,1 mmol; veja-se P. H. Cárter et al.f pedido de publicação de patente de invenção WO 2005/021500) foi dissolvido em ácido acético glacial (6,8 ml) antes da adição de HC1 conc. (1,6 ml) . Agueceu-se esta mistura em banho de óleo (95°C) durante a noite. Depois de arrefecer, concentrou-se a solução. Tranferiu-se o sólido bruto resultante em Et20/hexano 50/50 para um funil de Buchner. Lavou-se o sólido com Et20/hexano 50/50 adicional para se obter ácido -92- 6-terc-butilpicolínico, sal de HC1 (880 mg). A LC/MS apresentou [M+H]+ = 180,0.

Exemplo 9, Passo 2: N-((IR,2S,5R)-2-((S)-3-amino-2- oxopirrolidin-l-il)-5- (isopropil(metil)amino)ciclohexil)acetamida (70 mg, 0,22 mmol; veja-se o Exemplo 1, Passo 10) foi dissolvido em DMF (2 ml) antes da adição de 4-metilmorf olina (0,1 ml, 0,91 mmol) e ácido terc-but ilpicolínico sal HC1 (90 mg, 0,50 mmol). Depois de se arrefecer a 0°C, adicionou-se BOP (175 mg, 0,39 mmol). Aqueceu-se a solução à temperatura ambiente e agitou-se durante a noite. De seguida, filtrou-se a solução e concentrou-se. O resíduo resultante foi purificado através de HPLC de fase reversa (eluição de gradiente, água/metanol/TFA) para se obter o composto do título sob a forma do seu sal de TFA (85, 1 mg) . . A LC/MS apresentou [M+H]+ = = 487,45. 1H-RMN (400 MHz, CD3OD ) : δ ppm: 7,9 (m, 2H) , 7 ', 67 (m, 1H) , 4,47 (m, 1H) , 4, 3 (t, 1H) , 4,24 (m, 1H) , 3, 97- 3, 74 (m, 3H) , 3, 64 (m , 1H) , 2, 82 (s, 3H) , 2,6 (m, 1H) , 2 ,34 (m, 2H) , 2, 25-2, 05 (m, 2H) , 2,01 (s, 3H) , 1,95-1,8 (m, 2H) , 1,45 (s, 9H) , 1,37 (m, 3H) . -93- EXEMPLO 10 N- ((1.R,2S,5R)-5-amino-2-((3S)-2-oxo-3-((6-(trifluorometil)-4-quinazolinil)amino)-1-pirrolidinil)ciclohexil)propanamida

Exemplo 10, Passo 1: A uma solução de (IR,2S,5R)-2-((S)-3-(benziloxicarbonilamino)-2-oxopirrolidin-l-il) -5-(terc-butoxicarbonilamino)ciclohexanocarboxamida (2,0 g, 4,21 mmol; veja-se o Exemplo 1, Passo 5) em MeCN (150 ml) e H20 (250 ml), adicionou-se diacetato de iodobenzeno (1,357 g, 4,21 mmol) . Agitou-se a mistura a 0°C durante 1 h e de seguida deixou-se arrefecer à temperatura ambiente em banho de gelo durante 14 h. Acidificou-se a mistura a um pH 4 com a adição de ácido acético, e depois extraiu-se com éter dietilico (2 x 60 ml) . Concentrou-se a camada aquosa sob pressão reduzida para remoção do acetonitrilo. Extraiu-se a solução residual com cloreto de metileno (2 x 80 ml) depois de se ajustar o pH a 9-10 usando NaHC03. Secou-se a camada -94- de cloreto de metileno (Na2S04> e concentrou-se in vacuo para se obter o desejado terc-butil(IR, 2S, 4S) -3 amino-4-( (S)-3-benziloxicarbonilamino-2-oxopirrolidin-l-il)ciclohexilcarbamato (1,8 g, 4,03 mmol, rendimento de 96%). A LC/MS apresentou [M+H]+ = 447.

Exemplo 10, Passo 2: A uma solução de terc-butil(IR,2S,4S)-3 amino-4-((S)-3-benziloxicarbonilamino-2-oxopirrolidin-l-il) ciclohexilcarbamato (1,8 g, 4,03 mmol) em 3 ml de DMF adicionou-se ácido propiónico (0,285 g, 3,85 mmol), BOP (1,704 g, 3,85 mmol) e trietilamina (0,059 ml, 0,423 mmol). Agitou-se a mistura à temperatura ambiente durante 1,5 h e de seguida lançou-se em água (75 ml). Extraiu-se a mistura resultante com EtOAc (2 x 60 ml) . Combinaram-se as fases orgânicas e lavaram-se com NaHC03 sat. (2 x 40 ml) e salmoura (50 ml) . Depois, secou-se a fase orgânica (MgS04) , filtrou-se e concentrou-se in vacuo. Dispersou-se o resíduo em éter dietílico. Recolheu-se o sólido precipitado através de filtração, lavou-se com éter dietílico (2 x 40 ml) e secou-se in vacuo para se obter terc-butil(IR,3R, 4S)-4-((S)-3-benziloxicarbonilamino)-3-propionamido-2-oxopirrolidin-l-il)ciclohexilcarbamato (1,6 g, 3,18 mmol, rendimento de 79%). A LC/MS apresentou [M+H]+ = 503. -95-

Exemplo 10, Passo 3: A uma solução de terc-butil(IR,3R,4S)-4-((S)-3-benziloxicarbonilamino)-3-propionamido-2-oxopirrolidin-l-il)ciclohexilcarbamato (900 mg, 1,79 mmol) em 10 ml de MeOH adicionou-se hidróxido de paládio em carbono, 20% (340 mg, 2,42 mmol) . Evacuou-se a mistura e preencheu-se com hidrogénio de um balão de hidrogénio. Agitou-se a mistura à temperatura ambiente durante 1,5 h sob 1 atm de H2. A filtração, seguida da concentração sob pressão reduzida, deu origem a terc-butil (IR, 3R, 4S)-4-( (S) - 3- amino-2-oxopirrolidin-l-il)-3- propionamidociclohexilcarbamato (650 mg, 1,764 mmol, rendimento de 99%), que foi utilizado no passo seguinte sem demais purificação. A LC/MS apresentou [M+H]+ = 369.

Exemplo 10, Passo 4: A uma solução de terc-butil(IR,3R,4S)- 4- ((S)-3-amino-2-oxopirrolidin-l-il)-3- propionamidociclohexilcarbamato (650 mg, 1,764 mmol) em 5 ml de isopropanol adicionou-se 4-cloro-6- (trifluorometil)quinazolina (492 mg, 2117 mmol) e trietilamina (0,492 ml, 3,53 mmol). Agitou-se a mistura a 50°C durante 4 h. Removeu-se o solvente sob pressão reduzida e diluiu-se o resíduo com 30 ml de AcOH a 20% em água antes de ser extraído com éter dietílico (2 x 20 ml).

Extraiu-se a camada de éter com uma solução de 20% de AcOH -96- em água (3 x 30 ml) . Combinaram-se as camadas aquosas e basificaram-se com Na2C03 e extraíram-se com cloreto de metileno (3 x 50 ml). Combinaram-se os extractos orgânicos, lavaram-se com salmoura (40 ml) , secaram-se sob Na2S04 anidro e concentraram-se sob pressão reduzida para se obter terc-butil(IR,3R,4S)-4-((S)-2-oxo-3-(6- (trifluorometil)quinazolin-4-ilamino)pirrolidin-l-il)-3-propionamidociclohexilcarbamato. A LC/MS apresentou [M+H]+ = 565. A totalidade deste produto bruto foi dissolvida em 5 ml de cloreto de metileno. Carregou-se a solução resultante com TFA (3 ml), agitou-se à temperatura ambiente durante 30 min, e concentrou-se in vacuo. Preparou-se o resíduo através de HPLC de fase reversa preparativa para se obter o composto do título sob a forma de sal de TFA em solução aquosa de metanol. Concentrou-se esta solução in vacuo para remoção do metanol e basificou-se a solução do resíduo com NaHCCb saturado e extraiu-se com cloreto de metileno (3 x 50 ml) , secou-se (Na2S04) e concentrou-se in vacuo para se obter o composto do titulo sob a sua forma de base livre (550 mg, 1,184 mmol, rendimento de 67%). A LC/MS apresentou [M+H]+ = 465. 1H-RMN (400 MHz, CD30D): δ ppm: 8,77 (1H, s), 8,57 (1H, s), 8,03 (1H, dd, J= 9,16, 2,03 Hz), 7,88 (1H, d, J= 8,65 Hz), 5,24 (1H, t, J= 8,65 Hz), 4,55 (1H, d, J= 3,65 -97-

Hz) , 3,97-4,05 (1H, m) , 3, 52 -3, 67 (2H, m) , 3, 35- i—1 PO (1H m) , 2,47-2,58 (1H, m) , 2,20- 2,34 (3H, m) , 1,62- -2,04 (6H m) , 1,14 (3H, t , J= 7, 63 Hz) . EXEMPLO 11 2-terc-butil-N-((S)-1-((IS,2R,4R)-4-(terc-butilamino)-2-(metilsulfonamido)ciclohexil)-2-oxopirrolidin-3-il)pirimidina-4-carboxamida

H

Exemplo 11, Passo 1: Equipou-se um balão de fundo redondo de 3 tubuladoras aquecido no forno, com uma barra de agitação seca, com um condensador de refluxo seco e dois septos. Depois de se arrefecer sob N2, carregou-se sequencialmente o balão com ácido (IR, 2S,5R)-2-( (S)-3-(benziloxicarbonilamino)-2-oxopirrolidin-l-il)-5- (terc-butoxicarbonilamino)ciclohexanocarboxílico (60 g, 126 mmol; veja-se Exemplo 1, Passo 4), acetonitrilo (800 ml), N-metilmorfolina (27,7 ml, 252 mmol) e difenilfosforil azida -98- (29,9 ml, 139 mmol). Agitou-se a reacção à temperatura ambiente durante 1 h e 40 min, altura em que se adicionou 2-trimetilsililetanol (90 ml, 631 mmol). Preparou.se a reacção para aquecer e atingiu-se o refluxo 30 min depois. Manteve-se em refluxo durante 1 h, altura em que se deixou arrefecer gradualmente até aos 50 °C e depois até aos 15 °C com arrefecimento externo. Inundou-se a reacção com a adição de ácido acético (1,734 ml, 30,3 mmol). Concentrou-se a reacção in vacuo e dissolveu-se em EtOAc (1,2 1) . Lavou-se sequencialmente com água (1 x 0,3 1), NaHC03 sat. (2 x 0,3 1), IN HC1 (1 x 0,3 1) e salmoura (2 x 0,3 1) . Secou-se a fase orgânica (Na2S04), filtrou-se e concentrou-se in vacuo. Surgiu um sólido numa fase muito precoce do processo de concentração. Após a remoção dos voláteis, adicionou-se 800 ml de 10% de EtOAc/hexanos e agitou-se a mistura durante a noite. Recolheu-se o sólido e secou-se para se obter terc-butil(IR,3R,4S)-4-( (S)-3- benziloxicarbonilamino-2-oxopirrolidin-l-il)-3-((2-trimetilsilil)etoxicarbonilamino)ciclohexilcarbamato (60,5 g, 102 mmol, rendimento de 81%). A HPLC mostrou uma pureza de 72%, com 12% de impurezas. Este material foi levado para o passo seguinte sem demais purificação. O filtrado foi -99- posteriormente concentrado para render mais 4,38 g de produto. Rendimento total = 64,9 g (87%).

Exemplo 11, Passo 2: Equipou-se um balão de fundo redondo seco de 500 ml com uma barra de agitação seca e carregou-se sequencialmente com terc-butil(IR,3R,4S)-4-((S)-3- benziloxicarbonilamino-2-oxopirrolidin-l-il) -3-((2-trimetilsilil)etoxicarbonilamino)ciclohexilcarbamato (60,5 g) , CH2CI2 (180 ml) e uma solução de monohidratinho de ácido para-toluenosulfónico (19,48 g, 102 mmol) em CH2C12 (120 ml) e metanol (30 ml). Colocou-se a mistura num evaporador rotativo e removeu-se grande parte do CH2C12 (temp do banho de ca. de 20°C). Quando a mistura começou a espumar, libertou-se o vácuo e aumentou-se a temperatura do banho para 46°C (a temperatura variou entre os 44°C e os 51 °C; foi controlada com a adição de gelo externo) . A mistura foi submetida a rotação a esta temperatura durante exactamente uma hora (foi visível a evolução do gás durante este período de tempo) e depois diluiu-se com EtOAc (1 1) . Lavou-se a fase orgânica com 0,5 N de NH40H (2 x 250 ml) . As lavagens aquosas foram combinadas e postas de parte. Lavou-se a fase orgânica com NH4C1 (1 x 250 ml) e NaCl sat. (1 x 250 ml); estas lavagens aquosas foram postas de parte.

As lavagens iniciais de NH4OH combinadas foram novamente - 100 - extraídas com EtOAc (1 x 250 ml) e esse extracto orgânico foi lavado com NH4C1 sat. (1 x 60 ml) e NaCl sat. (1 x 60 ml) . Todos os extractos orgânicos foram combinados, secos (Na2S04) , filtrados e concentrados. Purificou-se o resíduo por eluição através de um tampão de Si02 (13 cm de comprimento x 7,5 cm de altura). O primeiro eluente era EtOAc puro (ca. 4 1) . O segundo eluente era 1:9 (10% de NH4OH em MeOH/CH2Cl2 (ca. 5 1)). As fracções que continham o produto desejado foram uniformizados e evaporados, obtendo-se o desejado 2-(trimetilsilil)etil(IR,2S,5R)-5-amino-2-( (S)-3-benziloxicarbonilamino-2-oxopirrolidin-l-il)ciclohexilcarbamato (31,6 g, 64,4 mmol, rendimento de 63%) .

Exemplo 11, Passo 3: A uma solução de 2- (trimetilsilil)etil(IR,2S,5R)-5-amino-2-((S) -3-benziloxicarbonilamino-2-oxopirrolidin-l- il)ciclohexilcarbamato (1,03 g, 2,099 mmol) em metanol (10 ml) adicionou-se 3,5-di-terc-butil-l,2-benzoquinona (0,555 g, 2,52 mmol). Agitou-se esta mistura durante 2 h antes de se adicionar THF (6 ml) e água (2 ml), juntamente com ácido oxálico com pH 4. Concentrou-se esta mistura. Dissolveu-se o resíduo resultante em acetato de etilo e lavou-se com salmoura. Secou-se a camada orgânica (MS04) , filtrou-se e - 101 - concentrou-se. Esta foi purificada através de cromatografia por flash, obtendo-se 2-(trimetilsilil)etil(IR,2S)-2-((S)-3-benziloxicarbonilamino-2-oxopirrolidin-l-il)-5-oxociclohexilcarbamato (0,550 g, 1,123 mmol, rendimento de 53,5%). A LC/MS apresentou [M+H]+ = 491,3.

Exemplo 11, Passo 4: A uma solução de 2- (trimetilsilil)etil(IR,2S)-2-((S)-3-benziloxicarbonilamino-2-oxopirrolidin-l-il)-5-oxociclohexilcarbamato (0,550 g, 1,123 mmol) em cloreto de metileno (0,4 ml) adicionou-se t-butilamina (1180 ml, 11,23 mmol) e isopropóxido de titânio (IV) (6,63 ml, 22,47 mmol). Agitou-se a mistura durante 2 h antes de se adicionar cianoborohidreto de sódio (127 mg, 2,022 mmol) e MeOH (1 ml). 2 h depois, adicionou-se cloreto de metileno (50 ml), seguido de IN NaOH. Filtrou-se a

mistura por celite para remoção dos sais de titânio. Secou-se o filtrado e concentrou-se in vacuo, obtendo-se 2-(trimetilsilil)etil(IR,2S,5R)-2-((S)-3-benziloxicarbonilamino-2-oxopirrolidin-l-il)-5-(terc-butilamino)ciclohexilcarbamato e o seu diastereómero 5S como mistura (510 mg, 0,933 mmol, rendimento de 83%). A LC/MS apresentou [M+H]+ = 547,31.

Exemplo 11, Passo 5: Dissolveu-se o produto do Passo 4 (510 mg, 0, 933 mmol) em CH2C12 (2 ml) e ácido trifluoroacético - 102 - (2,87 ml, 37,3 mmol). 30 min depois, concentrou-se a solução para se obter o sal bis-TFA de benzil(S)-l-((IS, 2R, 4R)-2-amino-4-(terc-butilamino)ciclohexil)-2-oxopirrolidin-3-ilcarbamato sob a forma de mistura com o seu diastereómero 4S (520 mg, 0,825 mmol, rendimento de 88%). A LC/MS apresentou [M+H]+ = 403,25.

Exemplo 11, Passo 6: Dissolveu-se uma porção da amina do Passo 5 (362 mg, 0,57 mmol) em cloreto de metileno (3 ml). Carregou-se a solução resultante sucessivamente com trietilamina (0,125 ml, 0,900 mmol) e cloreto de metanosulfonil (0,070 ml, 0,900 mmol). Agitou-se a mistura durante 2 h à temperatura ambiente e lavou-se com uma solução de NaHC03 sat, secou-se e concentrou-se in vácuo. Dissolveu-se o resíduo em metanol (3 ml) . Carregou-se o recipiente com Pd/C (150 mg, 1,410 mmol) e equipou-se com um balão de hidrogénio. 1 h depois, filtrou-se a solução e concentrou-se in vacuo. Dissolveu-se o resíduo em metanol (3 ml) e carregou-se novamente o recipiente com Pd/C (150 mg, 1410 mmol) e equipou-se com um balão de hidrogénio. 1 h depois, filtrou-se a solução e concentrou-se in vacuo para se obter N-((IR,2S,5R)-2-((S)-3-amino-2-oxopirrolidin-l- como il)-5-(terc-butilamino)ciclohexil)metanosulfonamida -103 - mistura do sei diastereómero 5S (190 mg, 0,548 mmol, rendimento de 75%) . A LC/MS apresentou [M+H]+ = 347,3. Exemplo 11, Passo 7: Dissolveu-se a amina do Passo 7 (190 mg, 0,548 mmol) em cloreto de metileno (3 ml). Adicionou-se 2-terc-butilpirimidina-4-carboxílico (196 mg, 1,09 mmol; veja-se P. H. Cárter et al., pedido de publicação de patente de invenção WO 2005/021500), EDC (210 mg, 1,097 mmol) e N-metilmorfolina (0,247 ml, 2,193 mmol) antes da adição de HOBt (364 mg, 2,7 mmol) . Agitou-se esta mistura durante a noite. Concentrou-se a solução, filtrou-se e purificou-se através de HPLC de fase reversa, obtendo-se o sal de TFA do composto do titulo sob a forma diastereomericamente pura (123 mg, 0,198 mmol, 36%). A LC/MS apresentou [M+H]+ = 509,35. 1H-RMN (400 MHz, CD3OD) : δ ppm: 9,36 (br d, 1H) , 8,97 (d, 1H) , 7,88 (d, 1H) , 4,49 (m, 2H) , 3, 94-3,75 (m, 3H) , 3,64 (m, 1H) , 3,04 (s, 3H) , 2,58 (m, 1H) , 2,33 (m, 2H) , 2,2-1,96 (m, 4H) , 1,88 (m, 1H) , 1,48 (s, 9H), 1,44 (s, 9H). - 104 - EXEMPLO 12 2-terc-butil-N- ((3S) -1- ((IS, 2R, 4.R) -4- (terc-butilamino) -2-(propionilamino)ciclohexil)-2-oxo-3-pirrolidinil)-4-pirimidinacarboxamida

Exemplo 12, Passo 1: Dissolveu-se uma amostra de 2-(trimetilsilil)etil(lR,2S,5R)-2-((S) —3 — benziloxicarbonilamino-2-oxopirrolidin-l-il)-5-(terc-butilamino) ciclohexilcarbamato e o seu diastereómero 5S (68 mg, 0,141 mmol; veja-se o Exemplo 11, Passo 4) em MeOH (3 ml) antes da adição de Pd/C a 10% (100 mg, 0,940 mmol) e um balão de hidrogénio. 1 h depois, filtrou-se a solução e concentrou-se in vacuo. Depois a reacção foi preparada com reagentes frescos. 1 h depois, filtrou-se a solução e concentrou-se para se obter 2- (trimetilsilil)etil(IR,2S,5R)-2-((S)-3-amino-2-oxopirrolidin-l-il)-5-(terc-butilamino)ciclohexilcarbamato como mistura com o seu diastereómero 5S (139,4 mg, 0,338 - 105- mmol, rendimento de 99%) . A LC/MS apresentou [M+H]+ - 413,4.

Exemplo 12, Passo 2: Dissolveu-se o produto do Passo 1 supra (139,4 mg, 0,338 mmol) em CH2C12 (3 ml). Carregou-se sequencialmente a solução com ácido 2-terc-butilpirimidina-4-carboxílico (122 mg, 0,676 mmol), 1-H- benzo[d] [1,2,3]triazol-l-ol (91 mg, 0, 676 mmol) e 4-metilmorfolina (0,149 ml, 1,351 mmol). De seguida, carregou-se a solução com cloridratinho de l—(3— dimetilamino)propil)-3-etil-carbodiimida (130 mg, 0,676 mmol) . Agitou-se esta mistura durante a noite. Concentrou-se a solução, filtrou-se e purificou-se através de HPLC de fase reversa preparativa (Phenomenex 21 X 250 mm, 0% a 100% metanol-água contendo 0,1% de ácido trifluoroacético durante 30 min, 15 ml/min, 220 nM, temperatura ambiente do produto = 29,9 min) para se obter o sal de TFA de 2-(trimetilsilil)etil(IR,2S,5R)-5-(terc-butilamino)-2-((S)-3-(2-terc-butilpirimidina-4-carboxamido)-2-oxopirrolidin-l-il)ciclohexilcarbamato (92 mg, 0,134 mmol, rendimento de 39,5%). A LC/MS apresentou [M+H]+ = 575,5.

Exemplo 12, Passo 3: Dissolveu-se o produto do Passo 2 (92 mg, 0,134 mmol) em CH2C12 (2 ml) antes da adição de ácido 30 min depois, trifluoroacético (3,09 ml, 40,1 mmol). -106 - concentrou-se a solução para se obter o sal de TFA de N-((S)-1-((IS,2R,4R)-2-amino-4-(terc-butilamino)ciclohexil)-2-oxopirrolidin-3-il)-2-terc-butilpirimidina-4-carboxamida (87 mg, 0,132 mmol, rendimento de 99%) . A LC/MS apresentou [M+H]+ = 431,37 .

Exemplo 12, Passo 4: Dissolveu-se o sal de TFA de N-((S)-1-((IS,2R,4R)-2-amino-4-(terc-butilamino)ciclohexil)-2-oxopirrolidin-3-il)-2-terc-butilpirimidina-4-carboxamida (87 mg, 0,132 mmol) em CH2C12 (3 ml) antes da adição de trietilamina (0,092 ml, 0,660 mmol). Arrefeceu-se a solução até aos 0°C e carregou-se com anidrido propiónico (0,051 ml, 0,0396 mmol). 30 min depois, concentrou-se a solução filtrou-se e purificou-se através de HPLC de fase reversa preparativa (Phenomenex 21 X 100 mm, 0% a 100% metanol-água contendo 0,1% de ácido trifluoroacético durante 10 min, 20 ml/min, 220 nM, temperatura ambiente do produto = 8,2 min) para se obter o composto do titulo sob a forma do seu sal de TFA mg. Diluiu-se este material em cloreto de metileno. Lavou-se a solução resultante com Na2CC>3 sat e depois secou-se e concentrou-se in vacuo para se obter o composto do titulo (46 mg, 0,095 mmol, rendimento de 72%). A LC/MS apresentou [M+H]+ = 487,45. 1H-RMN (400 MHz, CD3OD) : δ ppm: 8,84 (d, 1H) , 7,73 (d, 1H) , 4,57 (t, 1H) , 4,29 (m, 1H) , - 107 - 3, 95 (m, 1H) , 3,51 (m, 2H) , 2, 97 (m, 1H) , 2,42 (m, 1H) 2,12 (q, 2H) , 2,06 (m, 1H) , 1, 9 (m, 1H), 1,75-1,55 (m, 5H) 1,36 (s, 9H) , 1,36-1, 02 (m, 12H) EXEMPLO 13 N-((IR,2S,5R)-5-(terc-butilamino)-2-((3S)-3-((6-terc-butilpirimido[5,4-d]pirimidin-4-il)amino)-2-oxo-l-pirrolidinil)ciclohexil)metanosulfonamida

Exemplo 13, Passo 1: Dissolveu-se uma amostra de 2-(trimetilsilil) et il(lR,2S,5R )-2-( (S) — 3 — benziloxicarbonilamino-2-oxopirrolidin-l-il)-5-(terc-butilamino) ciclohexilcarbamato e seu diastereómero 5S (100 mg, 0,183 mmol; veja-se o Exemplo 11, Passo 4) em diclorometano (2 ml) antes da adição de ácido trifluoroacético (2,54 ml, 32,9 mmol). 30 min depois, concentrou-se a solução in vacuo. Dissolveu-se o resíduo em diclorometano (3 ml) antes da adiçao de trietilamina (0,100 - 108 - ml, 0,720 mmol) e cloreto de metanosulfonil (0,018 ml, 0,234 mmol). 2 h depois, este foi lavado com uma solução de NaHC03 sat e secou-se a camada orgânica (Na2S04) , filtrou-se e concentrou-se para se obter benzil(S)-2-((IS,2R,4R)-4-(terc-butilamino)-2-(metilsulfonamido)ciclohexil)-2-oxopirrolidin-3-ilcarbamato sob a forma de uma mistura com o seu diastereómero 4S (66 mg, 0,137 mmol, rendimento de 76%). A LC/MS apresentou [M+H]+ = 481,22.

Exemplo 13, Passo 2: O produto do passo 1 supra (0,066 g, 0,137 mmol) foi dissolvido em MeOH (4 ml) antes da adição de Pd/C a 10% (150 mg, 1,410 mmol) e um balão de hidrogénio. 1 h depois, filtrou-se a solução e concentrou-se in vacuo. A reacção foi novamente preparada com reagentes frescos. 1 h depois, filtrou-se a solução e concentrou-se para se obter N-((IR,2S,5R)-2-((S)-3-amino-2-oxopirrolidin-il)-5-(terc- butilamino)ciclohexil)metanosulfonamida sob a forma de uma mistura com o seu diastereómero 5S (47,5 mg, 0,137 mmol, rendimento de 100%). A LC/MS apresentou [M+H]+ = 347,3. Exemplo 13, Passo 3: Dissolveu-se o produto do Passo 2 (47,5 mg, 0,137 mmol) em 2-propanol (2 ml). Carregou-se sequencialmente a solução resultante com trietilamina (0,057 ml, 0,411 mmol) e 2-terc-butil-8-cloropirimido[5,4- - 109 - d]pirimidina (45,8 mg, 0,206 mmol; veja-se P. H. Cárter, pedido de publicação de patente de invenção WO 2005/021500). Após agitação durante 2 h, concentrou-se a solução. Purificou-se o resíduo através de HPLC de fase reversa preparativa (Phenomenex Luna 5u C18, 21,2 x 100 mm, % de metanol-água contendo 0,1% de ácido trifluoroacético, gradiente durante 12 min, 20 ml/min, 220 nM, tempo de retenção do produto = 8,2 min) para se obter o produto sob a forma de sal de TFA. Este foi dissolvido em diclorometano e lavado com uma solução de 20% de Na2C03. Concentrou-se a camada orgânica para se obter o composto do título (18 mg, 0,034 mmol, rendimento de 24,66%). A LC/MS apresentou [M+H] + _ 533,3. 1H-RMN (400 MHz, CD3OD) : δ PPm: 9,15 (s, 1H) , 8,47 (s, 1H) , 5,16 (m, 1H) , 3,91 (m, 2H) , 3, 83 (m, 1H) , 3,55 (m, 1H) , 3,14 (m, 1H) , 2,91 (s, 3H) , 2,53 (m, 1H) , 2,1 (m, 2H), 1,9 (m, 1H) , 1,77-1,55 (m, 4H) , 1,40 (s, 9H) , 1,07 (s, 9H) . EXEMPLO 14 N-((1Λ,2S,5R)-5-(terc-butilamino)-2-((3S)-3-((l-oxido-6-(trifluorometil)-4-quinazolinil)amino)-2-oxo-l- pirrolidinil)ciclohexil)acetamida - 110 -

Exemplo 14, Passo 1: A uma solução de terc-butil(IR,3R,4S)-3-acetamido-4-((S)-3-(benziloxicarbonilamino)-2-oxopirrolidin-l-il)ciclohexilcarbamato (100 g, 0,205 mol; veja-se o Exemplo 1, Passo 6) em diclorometano (400 ml) adicionou-se TFA (400 ml) a -20°C. Agitou-se a solução de reacção à temperatura ambiente durante 2 horas. Removeu-se o solvente e grande parte do TFA sob pressão reduzida, e diluiu-se o resíduo com diclorometano (2 1) e uma solução aquosa de K2CO3 (2 1) . Ajustou-se o pH a 10 com IN de HC1. Extraiu-se a camada aquosa com diclorometano (3x1 1) . A camada orgânica combinada foi seca sob Na2S04 e concentrou-se para se obter benzil-(S)-1-((IS,2R,4R)-2-acetamido-4-aminociclohexil)-2-oxopirrolidin-3-ilcarbamato sob a forma de um óleo (81 g, rendimento de 100%). Esta amina foi usada directamente no passo seguinte sem demais purificação. Exemplo 14, Passo 2: Agitou-se uma solução de benzil-(S)-1-((IS,2R,4R)-2-acetamido-4-aminociclohexil)-2-oxopirrolidin-3-ilcarbamato (13,3 g, 34 mmol) e 3,5-di-terc- - 111 - butilciclohexa-3,5-dieno-l,2-diona (7,54 g, 34 mmol) em metanol (160 ml) à temperatura ambiente durante 2 h. Concentrou-se a solução e diluiu-se com acetona (132 ml) e água (33 ml) , seguido da adição de Dowex-50WX8-200 (33 g) .

Agitou-se a reacção à temperatura ambiente durante 2 h. Removeu-se o Dowex-50WX8-200 através de filtração e lavou-se com diclorometano (300 ml). Concentrou-se o filtrado sob vácuo para remoção da maioria da acetona. Diluiu-se o resíduo com diclorometano (200 ml) e lavou-se com uma solução aquosa de NaC03 (200 ml) e salmoura (200 ml) . Extraíram-se as camadas aquosas combinadas com diclorometano (2 x 100 ml) . Os extractos orgânicos combinados foram secos sob Na2S04 e foram concentrados. Obteve-se o produto benzil(S)-1-((IS,2R)-2-acetamido-4-oxociclohexil—2-oxopirrolidin-3-ilcarbamato sob a forma de um sólido (12 g, rendimento de 90%) por cristalização em EtOAc (100 ml) e hexano (200 ml) . 1H-RMN (500 MHz, DMSO- d6) : δ ppm : 7,99 (d, J= 9 ,35 Hz, 1H), 7, .44 (d, J= O 00 oo Hz, m i—1 7,28- •7,39 (m, 5H) , 5,03 (s, 2H) , 4,50 (s, 1H) , 4,31 (d, J= 12, 10 Hz, 1H) , 4, 18 (q, J= 8,98 Hz, 1H) , 3, 27 (m, 2H) , 2,82 (dd, J= 15,12, 5,22 Hz , 1H) , 2,52- -2, 65 (m, 1H) , 2,40 (dd, J= 12,92, 4,67 Hz, 1H) , 2,15- -2,31 (m, 2H) , 2,09 - 112 - (d, J= 15,40 Hz, 1H) , 1,90 (m, 1H) , 1,81 (s, 3H) , 1,68 (m, 1H). m/z: 388,46 [M+H].

Exemplo 14, Passo 3: A uma solução de TiCl4 (1M em diclorometano, 36 ml, 36 mmol) em diclorometano (30 ml) a 0°C adicionou-se Ti (OiPr)4 (10,8 ml, 36 mmol). De seguida, agitou-se a mistura à temperatura ambiente durante 10 min. A uma solução de benzil(S)-1-(IS,2R)-2-acetamido-4-oxociclohexil)-2-oxopirrolidin-3-ilcarbamato (23,25 g, 60 mmol) em diclorometano (600 ml) adicionou-se terc-butilamino (30 ml, 300 mmol) à temperatura ambiente, seguido da adição da solução de TiCl4/Ti(OiPr)4 a -50°C. Deixou-se a reacção aquecer lentamente à temperatura ambiente. Concluiu-se a reacção 2 h depois (a reacção foi controlada por HPLC através de "quenching" de uma amostra de HPLC com NaBH4 em metanol) . Arrefeceu-se a solução até 10°C e adicionou-se BH3SMe2 (1M em diclorometano, 66 ml, 66 mmol). Agitou-se a mistura à temperatura ambiente durante 5 h e depois embebeu-se com uma solução aquosa de Na2C03 (300 ml). Filtrou-se o precipitado. Separaram-se as duas camadas e extraiu-se a camada aquosa com diclorometano (600 ml). As camadas de diclorometano combinadas foram extraídas com IN de HC1 duas vezes (150 ml e 15 ml) . (O produto e o indesejado isómero trans encontravam-se ambos na fase - 113 - aquosa). As camadas aquosas acídicas combinadas foram neutralizadas com 12 M de uma solução aquosa de NH4OH (12 ml) a um pH 8 e foram extraídas duas vezes com diclorometano (600 ml, 450 ml). (O produto encontrava-se na fase orgânica, enquanto que o isómero trans se encontrava ainda na camada aquosa). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas 3 vezes com uma solução aquosa de NH4C1 (3 x 200 ml) até não se encontrar qualquer isómero trans na camada orgânica. A camada orgânica foi seca sob Na2S04 e foi concentrada. Purificou-se o resíduo por cristalização em EtOAc/hexano (200 ml / 800 ml) para se obter o desejado benzil (S)-1- ( (15,2R,4R)-2-acetamido-4-(terc-butilamino)ciclohexil)-2-oxopirrolidin-3-ilcarbamato (20,80 g, rendimento de 78%) sob a forma de um sólido branco com uma pureza de 99,5%. 1H-RMN (500 MHz, DMSO-dõ) : δ ppm: 8,76 (s, n \—1 7,27-7,46 (m, 6H) , 5, 03 (m, 2H) , 4,14 (m, 1H) , 4, 07 (q, J= 8,80 Hz, 1H) , 3, 83 (m, 1H) , 3,36 (m, 2H) , 2,91 (s, 1H) , 2,18 (m, 1H) , 2,04 (m, 1H) , 1,78 (s, 3H) , 1,41- 1,74 (m, 7H), 1,04 (s, 9H). m/z: 445,54 [M+H].

Exemplo 14, Passo 4: A uma solução de benzil (5)-1-((15,2R,4R)-2-acetamido-4-(terc-butilamino)ciclohexil)-2-oxopirrolidin-3-ilcarbamato (43,3 g, 98 mmol) em metanol (400 ml), adicionou-se Pd/C húmido a 10% (4,34 g) . Evacuou- - 114 - se a mistura e preencheu-se com hidrogénio de um balão de hidrogénio. Agitou-se a mistura à temperatura ambiente durante 5 h. Filtrou-se a mistura e lavou-se com metanol (500 ml) e concentrou-se sob vácuo até secar. O produto cru obtido foi destilado com IPA (2 x 100 ml) sob pressão reduzida para se obter o produto N-((IR,2S,5R)-2-((S)-3-amino-2-oxopirrolidin-l-il)-5-(terc- butilamino)ciclohexil)acetamida sob a forma de um óleo (30 g, rendimento de 98%) . Esta amina foi utilizada no passo seguinte sem demais purificação.

Exemplo 14, Passo 5: A uma solução de N-((IR,2S,5R)-2-((S)-3-amino-2-oxopirrolidin-l-il)-5-(terc- butilamino)ciclohexil)acetamida (50 mg, 0,161 mmol, preparada conforme supra descrito) e 4-fenoxi-6-(trifluorometil)quinazolina-l-oxido (99 mg, 0,161 mmol; veja-se o Exemplo 5, preparação alternativa, Passo 2) em i-PrOH (2 ml) adicionou-se N,N-diisopropiletilamina (0,056 ml, 0,322 mmol). Selou-se o recipiente sob atmosfera de árgon e aqueceu-se num microondas durante 1 h a 120"C. A LC/MS apresentou [M+H]+ = 523,3 como pico máximo do produto. Repetiu-se a reacção à mesma escala num recipiente separado. Combinaram-se as duas reacções e evaporaram-se, que foi purificado dando origem a um resíduo oleoso, -115- através de cromatografia por flash automática (40 g de sílica gel) com eluição em 8:92 (10% cNH4OH em MeOH) . As fracções contendo o produto desejado foram unificadas e concentradas in vacuo. Cristalizou-se o resíduo a partir de CH2C12 e hexano. As duas colheitas foram combinadas e secas sob vácuo, obtendo-se 4-( (S)-1-((IS,2R,4R)-2-acetamido-4-(terc-butilamino)ciclohexil)-2-oxopirrolidin-3-ilamino)-6-(trifluorometil)quinazolina-l-oxido (101 mg). A análise por 1H-RMN mostrou que este material continha ~0,6 equivalentes molares de CH2C12. A LC/MS apresentou [M+H]+ = 523, 30. 1H- RMN (400 MHz, CD30D) : δ ppm: 9,00 (s, 1H) , 8,80 (s, 1H) , 8,61 (d, J= 9,0 Hz, 1H) , 8,32 (d, J= 9,0, 1,6 Hz, 1H) , 5,28 (t, J= 8,3 Hz, 1H) , 4,57 (brs, 1H) , 4,02 (brd, 1H) , 3,65- 3,51 (m, 2H), 3,24 (brs, 1H), 2,59-2,51 (m, 1H), 2,34-2,20 (m, 1H) , 2,04 (s, 3H) , 2,04 (m, 1H) , 1,89 (brs, 3H) , 1,74 (brs, 2H), 1,20 (s, 9H). EXEMPLO 15 N-( ((IS, 2S, 5R) -5-metoxi-2-((3S) -2-oxo-3- ((6-(trifluorometil)-4-quinazolinil)amino)-1-pirrolidinil)ciclohexil)metil)acetamida - 116 -

Exemplo 15, Passo 1: Dissolveu-se uma amostra de benzil(1R,2S,5R)-7-oxo-6-oxabiciclo[3.2.1]octan-2-ilcarbamato (9 g, 32,7 mmol; veja-se P. H. Cárter et al., pedido de publicação de patente de invenção WO 2005/021500) em THF (50 ml) e água (16,67 ml) à temperatura ambiente antes da adição de borohidreto de sódio (1,237 g, 32,7 mmol). Agitou-se a mistura de reacção durante 22 h. Embebeu-se com uma solução sat de NaHC03. Extraiu-se a mistura de reacção com uma mistura (1:9) de MeOH-CH2Cl2. Lavou-se a camada orgânica combinada com salmoura e secou-se sob MgS04 anidro. Obteve-se o produto desejado, benzil(IS,2R,4R)-4-hidroxi-2- (hidroximetil)ciclohexilcarbamato (8,75 g, 31,3 mmol; rendimento de 96%) sob a forma de um sólido branco espumoso. A LC/MS apresentou [M+H]+ = 280,30.

Exemplo 15, Passo 2: Dissolveu-se uma amostra de benzil(IS,2R,4R)-4-hidroxi-2- (hidroximetil)ciclohexilcarbamato (20,5 g, 73,4 mmol) em piridina anidra (140 ml) à temperatura ambiente antes da adição de cloreto de tritil (20,46 g, 73,4 mmol) numa - 117 - porção. Agitou-se a mistura de reacção durante dois dias. Evaporou-se a piridina e dissolveu-se o resíduo em EtOAc. Lavou-se a solução com água (2 x) seguida de salmoura. Extraiu-se novamente a camada aquosa combinada com EtOAc. Lavou-se esta camada orgânica com salmoura. De seguida, secou-se a camada orgânica combinada sob Na2S04 anidro e evaporou-se para se obter um resíduo oleoso que rendeu um produto cristalino branco do EtOAc e hexano. A água-mãe foi submetida a cromatografia (400 g de sílica gel eluída com 20% de EtAOc/hexano, seguido de 40% e por fim de 70%) . Obteve-se o desejado regioisómero, benzil(IS,2R,4R)-4-hidroxi-2-(tritiloximetil)ciclohexilcarbamato (33,08 g,

63,4 mmol, rendimento de 86%) sob a forma de um sólido branco. A LC/MS apresentou [M-H]~ = 520,2 (AP/C1) . 1H-RMN (400 MHz, CDC1 j ): δ ppm: 7,4 (d, J= 7, 12 Hz, 6H) , 7,19- 7,34 (m, 15H) , 5,25 -5,31 (m, 1H) , 4,98 -5, 0 9 (m, 2H) , 3, 92 (s, 1H) , 3,66 (bs, 1H) , 3,14 -3,24 (m, 1H) , 2,97 (dd, J= 9 ,41, 4,83 Hz, 1H), : I,98-2,08 (m, 1H) , 1 ,91 (d, J= 11, 9 Hz, 2H) , 1,76· -1,84 (m, 1H) , 1,36- -1,49 (m, 2H) , 1,39- -1,43 (m, 1H) , 1,19-1,30 (m, 1H). Obteve-se também uma pequena quantidade do isómero indesejado, benzil(IS,2R,4R)-2-(hidroximetil)-4-(tritiloxi)ciclohexilcarbamato (1,17 g, 2,243 mmol, rendimento de 3,06%). A MS apresentou [M-H]~ = 520,2 - 118 - (AP / Cl) . 1H-RMN (400 MHz, CDC13): δ ppm: 7,48 (d, J= 7,12

Hz, 6H), 7,32-7,40 (m, 5H), 7,21-7,32 (m, 10H), 5,05-5,14 (m, 2H) , 4 , 96 (d, J= 8, 65 Hz r 1H) , 3, 89 (dd r J= 8 ,39, 2,8 Hz, 1H) , 3 ,84 (dd, J-- = 10 ,7, 4 , 58 Hz, 1H) , 3, , 46 (ddd , J= 14,5 , 9 , 92, , 4, 07 H z, 1H) , 3, 07 (ddd, J= 15, 26 , 10 ,43, 4,3 Hz, 1H) , 1 , 66 (dd, J= 14, 24, 3 , 05 Hz) , 1,43 -1 ,51 (m, 1H) , 1,30 -i, 40 (m, 2H) , 1, 14-1 , 23 ( 1H) , , 0,79- -o, r 91 (m, 1H) , 0,72-0,79 (m, 1H) .

Exemplo 15, Passo 3: Dissolveu-se uma amostra de benzil(IS,2R,4R)-4-hidroxi-2- (tritiloximetil)ciclohexilcarbamato (11,5 g, 21,47 mmol) em CH2C12 (100 ml) à temperatura ambiente sob N2 antes da adição de, em sequência, 1,8-bis(dimetilamino)naftaleno (11,50 g, 53,7 mmol), crivos moleculares (4Â em pó, 5 g) e tetrafluoroboratinho de trimetiloxónio (6,35 g, 42,9 mmol, em três porções). Agitou-se a mistura de reacção durante 48 h. Ainda permaneceu algum material de base. Adicionaram-se quantidades adicionais de tetrafluoroboratinho de trimetiloxónio (1,5 g) e crivos moleculares (1 g) e agitou-se a mistura de reacção durante mais 5 h. Diluiu-se com 200 ml de CH2C12 e filtrou-se por celite. Lavou-se o filtrado com 0,5N de HC1 (3 x com 50 ml) seguido de NaCC>3 sat e secou-se sob MgS04 anidro. Depois, evaporou-se asolução e - 119 - secou-se in vácuo, para se obter uma espuma amarela pálida. A espuma amarela foi levada em 100 ml de AcOH:água (7:3) e agitou-se a 60 °C durante 3 h. Concentrou-se a solução cor-de-rosa resultante e basificou-se com IN de NaOH. Extraiu-se a mistura com EtOAc (5 x, 150 ml cada) . Lavou-se a camada orgânica combinada com salmoura, secou-se sob MgSCb anidro e submeteu-se a cromatografia (300 g de sílica gel; eluido com EtOAc:hexano (7:3), seguido de EtOAc). Obteve-se o desejado benzil(IS,2R,4R)-2-(hidroximetil)-4- metoxiciclohexilcarbamato (6,1 g, 20,79 mmol, 97%) sob a forma de um óleo. A LC/MS apresentou [M+H]+ = 294,41. Exemplo 15, Passo 4: Dissolveu-se uma amostra de trif enilf osf ina (7,39 g, 28,2 mmol) em THF (60 ml) a 0°C antes da adição, gota a gota, de dietilazodicarboxilato (4,46 ml, 28,2 mmol). Manteve-se a agitação durante 30 min a 0°C, quando se adicionou lentamente uma solução de benzil (IS,2R,4R)-2-(hidroximetil) -4- metoxiciclohexilcarbamato (4,13 g, 14,08 mmol) em THF (40 ml) à mistura. Agitou-se a mistura de reacção a 0°C durante 30 min, altura em que se adicionou lentamente uma solução de azida de hidrogénio (14,08 ml, 28,2 mmol) (sob a forma de uma solução de 2M em benzeno) . Agitou-se a mistura de reacção a 0°C durante 90 min. Embebeu-se com MeOH e agitou- - 120 - se durante a noite à temperatura ambiente. Concentrou-se a solução amarela avermelhada e submeteu-se a cromatografia. Obteve-se benzi1 (lS,2S,4R)-2-(azidometil) -4- metoxiciclohexilcarbamato (4,19 g, 13,16 mmol, rendimento de 93%) sob a forma de um óleo viscoso. A LC/MS apresentou [M+H]+ = 319,5.

Exemplo 15, Passo 5: Dissolveu-se uma amostra de benzil(IS,2S,4R)-2-(azidometil)-4-metoxiciclohexilcarbamato (4,7 g, 14,76 mmol) em THF à temperatura ambiente antes da adição de água (0,293 ml, 16,24 mmol) e trifenilfosfina (4,26 g, 16,24 mmol). Agitou-se a reacção a 60°C durante 4 h. Arrefeceu-se e tratinhou-se com uma solução aquosa saturada de Na2C03 (3,13 g, 29,5 mmol) seguida de di-t-butildicarbonato (3,77 ml, 16,24 mmol). Agitou-se a mistura de reacção durante a noite à temperatura ambiente. Dividiu-se entre EtOAc e água. Lavou-se a camada orgânica com salmoura e secou-se sob MgS04 anidro. Concentrou-se a solução e submeteu-se a cromatografia (500 ml de sílica gel eluído com 30% de EtOAc/hexano). Obteve-se o desejado terc-butil((IS,2S,5R)-2-benziloxicarbonilamino-5-metoxihexil)metilcarbamato sob a forma de um óleo viscoso. A LC/MS apresentou [M-Boc+H]+ = 293,25. - 121 -

Exemplo 15, Passo 6: Dissolveu-se uma amostra do produto do Passo 5 em MeOH (100 ml) . Adicionou-se paládio em carbono (0,185 g, 1,743 mmol) à solução e agitou-se a mistura de reacção sob hidrogénio a 50 psi durante 2 h. Filtrou-se a mistura de reacção através de celite com EtOAc. Concentrou-se a solução resultante in vácuo, obtendo-se terc-butil(IS,2S,5R)-2-amino-5-metoxiciclohexil)metilcarbamato sob a forma de um óleo transparente que foi utilizado sem demais purificação. Assumiu-se um rendimento quantitativo. A LC/MS apresentou [M+H]+ = 259,41.

Exemplo 15, Passo 7: Dissolveu-se uma amostra de terc-butil(IS,2S,5R)-2-amino-5-metoxiciclohexil)metilcarbamato (2,53 g, 9,79 mmol) em CH2C12 (50 ml) à temperatura ambiente. Carregou-se sequencialmente a solução com 1-hidroxibenzotriazole (1,45 g, 10,77 mmol), N-carbobenziloxi-L-metionina (4,16 g, 14,69 mmol) e cloridratinho de 1-(3-dimetil-aminopropil)-3- etilcarbodiimida (2,440 g, 12,73 mmol). Agitou-se a mistura de reacção durante a noite. Diluiu-se com EtOAc e lavou-se com Na2C03 saturado, seguido de salmoura. Secou-se a solução (MgS04) , filtrou-se e concentrou-se in vácuo, obtendo-se terc-butil((IS,2S,5R)-2-( (S)-2- benziloxicarbonilamino-4-(metiltio)butanamido)-5- - 122- metoxiciclohexil)metilcarbamato sob a forma de um sólido viscoso sem cor. A LC/MS apresentou [M+H]+ = 524 ,31. Exemplo 15, Passo 8: Dissolveu- se uma amostra do produto do Passo 7 em iodometano (30 ml) e agitou-se à temperatura ambiente durante dois dias. Evaporou-se a mistura de reacção e secou-se in vacuo. Dissolveu-se 0 resíduo em CH2CI2 e evaporou-se. Repetiu-se este processo quatro vezes mais. Secou-se o resíduo resultante in vacuo, obtendo-se um sólido amarelo espumoso que foi tomado em DMF (20 ml) e tratado com Cs2C03 (6,36 g, 19,52 mmol). Agitou-se a mistura de reacção à temperatura ambiente durante a noite. Diluiu-se com EtOAc e lavou-se com água (2 x). Extraiu-se a camada aquosa combinada com EtOAc (2 x). De seguida, lavou-se a camada orgânica combinada com salmoura e secou-se sob MgS04 anidro. Depois, a solução foi concentrada e submetida a cromatografia, obtendo-se terc-butil((IS,2S,5R)-2-((S)-3-benziloxicarbonilamino-2-oxopirrolidin-l-il) -5-metoxiciclohexil)metilcarbamato sob a forma de um sólido branco espumoso. A LC/MS apresentou [M+H]+ = 476,4.

Exemplo 15, Passo 9: Dissolveu-se uma amostra de terc-butil((IS,2S,5R)-2-((S)-3-benziloxicarbonilamino-2-oxopirrolidin-l-il)-5-metoxiciclohexil)metilcarbamato (0,75 g, 1,577 mmol) em CH2C12 (15 ml) à temperatura ambiente. - 123 -

Carregou-se a solução com ácido trifluoroacético (1,215 ml, 15,77 mmol) e agitou-se durante 6 h. De seguida evaporou-se e secou- se in vacuo. Dissolveu-se o resíduo em EtOAc e lavou-se com Na2C03 saturado, seguido de salmoura. Depois, secou-se a camada orgânica sob Na2S04, concentrou-se e secou-se in vacuo, obtendo-se uma espuma amarela pálida.

Dissolveu-se este material em CH2C19 (10 ml) à temperatura ambiente. Carregou-se sequencialmente a solução com trietilamina (0,659 ml, 4,73 mmol), dimetilaminopiridina (0,019 g, 0,158 mmol) e anidrido acético (0,164 ml, 1,734 mmol) . Agitou-se a mistura de reacção durante 90 min e depois embebeu-se com NaHC03 saturado. Depois extraiu-se a mistura de reacção com CH2C12 (3 x) . Combinaram-se as camadas orgânicas, secaram-se sob MS04 anidro, concentraram-se e submeteram-se a cromatografia. Obteve-se o produto desejado, benzil(S)-1-(IS,2S,4R)-2- (acetamidometil)-4-metoxiciclohexil)-2-oxopirrolidin-3-ilcarbamato, sob a forma de um sólido branco. A LC/MS apresentou [M+H]+ = 418,4.

Exemplo 15, Passo 10: Agitou-se uma amostra de benzil (S)—1 — (IS,2S,4R)-2-(acetamidometil)-4-metoxiciclohexil)-2-oxopirrolidin-3-ilcarbamato (614 mg, 1,471 mmol) e Pd/C (62,6 mg, 0,294 mmol) em MeOH (30 ml) à temperatura - 124- ambiente sob atmosfera de hidrogénio a 50 psi durante 2 h. Filtrou-se a suspensão por celite com EtOAc, concentrou-se e secou-se in vacuo para se obter N- ( ( (IS,2S,5R)-2-((S)-3-amino-2-oxopirrolidin-l-il)-5- metoxiciclohexil)metil)acetamida (410 mg, 1,447 mmol, 98% de rendimento) sob a forma de um sólido branco. A LC/MS apresentou [M+H]+ = 284,24.

Exemplo 15, Passo 11: Dissolveu-se uma amostra de N-(((IS, 2S, 5R)-2-((S)-3-amino-2-oxopirrolidin-l-il)-5-metoxiciclohexil)metil)acetamida (220 mg, 0,776 mmol) em 2-propanol (10 ml) à temperatura ambiente. A esta solução adicionou-se trietilamina (0,433 ml, 3,11 mmol), seguida de 4-cloro-6-(trifluorometil)quinazolina (235 mg, 1,009 mmol). Agitou-se a mistura de reacção durante a noite. Concentrou-se e submeteu-se a cromatografia (120 g de sílica gel eluindo com 5% seguido de 10% de MeOH em CH2C12) , obtendo-se o composto do titulo (300 mg, 0,626 mmol, rendimento de 81%) sob a forma de um sólido branco. A LC/MS apresentou [M+H] + = 480,4. ΧΗ- RMN (400 MHz , CDCI3) : δ ppm : 8, 6 (s, 1H) 8, 51 (S , 1H), 7, 92 (br s, 1H), 7,87-7, 82 (m, 2H) , 6,28 (b: s, 1H), 5, 00 (dd, J= 16,02, 8,65 Hz, 1H) , 4,36- -4,35 (m 1H) , 3, 72-3,68 (m, 1H) i, 3,63- 3,56 (m, 1H) , 3, 37- -3, 23 (m 2H) , 3, 31 (s, 3H) , 3,: 18-3,13 (m, 1H) , 2, 69- 2, 66 (m, 1H) - 125 - 2,12-2,07 (m, 1H) , 2, 06-1, 89 (m, 4H) , 1,96 (s, 3H) , 1,74- 1,67 (m, 1H), 1,57-1,51 (m, 1H) , 1,30-1,28 (m, 1H) .

COMPARAÇÃO DAS CARACTERÍSTICAS FARMACOLÓGICAS São adiante apresentados ensaios e dados que comparam as caracteristicas farmacológicas dos compostos da presente invenção com aquelas dos compostos da patente de invenção WO 2005/021500 (correspondendo à patente de invenção norte-americana n.° 7163937, atribuída ao presente requerente).

Ligação de células mononucleares de sangue periférico humano ("Ligação a CCR2")

Veja-se também: Yoshimura et al., J. Immunol., 1990, 145, 292. 0 ensaio de ligação a CCR2 humano foi estabelecido com células mononucleares de sangue periférico humano (hPBMCs) usando MCP-1 125l-humano como ligando "tracer". hPBMCs foram isoladas de leukopak humano (Biological Specialty Inc.) usando um protocolo padronizado com Ficoll-Hypaque (Mediatech Cellgro). As hPBMCs isoladas foram lavadas e diluídas a lxl07/ml em tampão de ligação (RPMI-1640. 0,1% BSA, 20 mm Hepes, pH 7.4). 121-MCP-1 (NEN/Perk Elmer) foi - 126- diluído a 0,45 nM em tampão de ligação. Diluiu-se o composto em tampão de ligação em 3 vezes as concentrações finais usadas no ensaio de ligação. Realizou-se o ensaio de ligação usando uma placa para filtração de 96 poços (Millipore) . A ligação total do 1251-MCP-1 foi avaliada da seguinte maneira: a cada reacção de um volume total de 150 μΐ adicionou-se células 5xl05, 0,15 nM de 1251-MCP-1 e composto, de forma que a concentração final variou entre 0 e entre 100 nM. A placa foi incubada à temperatura ambiente durante 30 minutos, seguida de três lavagnes com RPMI-1640, 0,1% de BSA, 0,4 M de NaCl, 20 mm de Hepes, pH 7,4 usando uma filtração por colector a vácuo (Millipore). Após a lavagem, secou-se a placa ao ar durante 60 minutos à temperatura ambiente. A este processo seguiu-se a adição de 25 μΐ de Microscint 20 em cada poço. A placa foi selada e contada no Trilux durante 1 minuto. A ligação não-específica foi determinada na presença de 300 nM MCP-1 frio (Pepro Tech Inc.) . Foi calculado o 1251-MCP-1 especifico sob a forma de diferença entre a ligação total e a ligação não-específica. Todas as condições foram testadas em duplicado. O IC50 é definido como a concentração do composto em competição necessário para reduzir a ligação específica em 50%. - 127-

Fluxo de hERG

Foram cultivadas (37°C, 5% C02) células HEK293 que expressavam de forma estável canais de hERG em meio DMEM ("Dulbecco's Modified Eagle’s Media"), suplementado com soro fetal de bovino Sigma a 10%, aminoácidos não-essenciais, 2 mM de L-glutamina e 500 pg/ml de G418, na incubadora. Foi utilizado um tampão de dissociação celular para extrair as células dos balões, que foram posteriormente colocadas em placas com 384 poços (placas pretas/transparentes da Corning revestidas com poli-D-lisina numa densidade de 2 x 104 células por poço (20 μΐ) em meio de soro a 10%, e foram incubadas durante 15-24 horas a 37 °C numa incubadora com 5% de C02, até se obter uma monocamada de células confluente.

Preparou-se um stock de 2 mm de corante BTC-AM (Molecular Probes, Eugene, OR) em 100% de DMSO e adicionou-se ácido plurónico (1:1) a 10% (p/v) em DMSO no dia do ensaio. Posteriormente, diluiu-se o corante em tampão EP externo de hERG (140 mm de NaCl, 4,0 mm de KC1, 1,8 mm de CaCl2, 1,0 mm de MgCl2, 10 mm de HEPES com pH 7.3 e 10 mm de glucose; todos os componentes tampão foram obtidos através da Sigma - 128 -

Chemical). Esta mistura de corante BTC (30 μΐ) foi adicionada às células e produziram uma concentração final de 2,5 μπι. As células foram incubadas a 21 °C durante 45 minutos.

Os compostos do teste foram diluídos em 10 mm de DMSO em 60 μΐ. Estes compostos foram diluídos em série numa razão de 1:2 em DMSO em colunas 1-10 e 11-20 de uma placa com 384 poços. Foram geradas placas prontas para o ensaio marcando 2,5 μΐ da placa diluída em série em DMSO, que foi preparada no Velocity 11 BioCel. As placas aquosas foram criadas através da adição de 48 μΐ de tampão EP e depois foram diluídas 30-45 minutos antes da leitura do ensaio no FLIPR. Depois da carga de corante, os compostos aquosos diluídos foram adicionados às células das três placas replicadas (10 μΐ) , rendendo um intervalo de concentração de dez pontos de 80 μιτι a 0,156 nM. A concentração final de DMSO no ensaio é de 1%. Foram preparadas placas aquosas prontas para o ensaio e foram diluídas num manuseador de líquidos Cybio.

As células carregadas com corante foram lidas no FLIPR384 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) , que excita o corante usando a linha de 488 nm de laser de árgon. A emissão foi filtrada usando um filtro passa-banda de 540 ± 30 nm. Os canais de hERG sao estimulados a abrir pela adiçao de 20 -129 - μΐ/poço de tampão EP contendo 66 mm de K2SO4 e 1,3 mm de T12S04 (Sigma/Aldrich). Para cada placa, foram recolhidos dados a cada segundo por um período de 12 segundos, altura em que se adicionou tampão de estímulo contendo Tl+. Continuou a recolha de dados a cada segundo durante 48 segundos, e depois continuou a cada três segundos durante mais 2 minutos. 0 intervalo dinâmico do ensaio foi determinado a partir de poços em branco e totais. Os poços totais (colunas 21 e 22) definem a activação máxima de hERG da placa (sem qualquer composto de teste presente) e os poços em branco (colunas 23 e 24) definem 100% de inibição hERG. Os poços em branco contêm 400 nM do inibidor padrão hERG dofetilide (Flicker et al., 1998) ou E-4031. Os pontos de dados brutos em cada poço da amostra foram corrigidos quanto à variação célula/sinal, background de controlo negativo (em branco) e foram normalizados relativamente aos controlos positivos (totais) usando o software FLIPR on-line. Posteriormente foram definidas as curvas de resposta de concentração do composto em teste do fluxo de dados de hERG Tl+ usando Excel Fit (ID Business Solutions Limited, Surrey, RU) com uma equação logística única, Y= A + ( (B-A)/1 + ( (C/X)Λϋ)) ) , em que A= inibição máxima. Os dados foram analisados -130 - através da definição das amplitudes máximas de alteração na fluorescência do fluxo de Tl+ de uma determinada condição do composto em teste. As potências (valores IC50) dos compostos foram calculadas a partir da média dos poços triplicados.

Canal de sódio, ensaio de ligação ponto 2

Veja-se também: W. A. Catterall et al., J. Biol. Chem. 1981, 256, 8922. 0 tampão de ligação padrão continha 50 mm de HEPES, 50 mm de Tris-HCl pH 7.4, 130 mm de cloreto de colina, 5,4 mm de KC1, 0,8 mm de MgCl2, 5,5 mm de glucose, 40 pg/ml de LqT. As reacções de ligação foram iniciadas através da adição de sinaptossomas (preparados a partir de cérebro de ratinho Wistar) à mistura de reacção contendo 5 nM de [3H]-batracotoxina num tampão de ligação padrão e o composto a ser testado na concentração desejável. As amostras foram depois misturadas e incubadas a 37°C durante 60 minutos. As reacções foram detidas através da adição de tampão de lavagem gelado contendo 50 mm de HEPES, 50 mm de Tris-HCl pH 7.4, 1,8 mm de CaCl2, 0,8 mm de MgCl2 e 1 mg/ml de albumina sérica bovina. Os sinaptossomas foram imediatamente recolhidos em filtros de fibra de vidro e -131 - lavados 3 vezes com tampões de lavagem. Contou-se a radioactividade de [3H]-batracotoxina remanescente nos filtros usando espectrómetros de cintilação líquida.

Ensaio de permeabilidade de membrana artificial paralela (PAMPA) 0 ensaio de permeabilidade de membrana artificial paralela (PAMPA) é constituído por uma combinação especialmente formulada de lípidos com base em lecitina, designada por lípido do tracto gastrointestinal (GIT). 0 lípido do GIT assemelha-se bastante à composição e performance da membrana in vivo, conforme medido pelos compostos padrão conhecidos por serem passivamente absorvidos nos seres humanos. 0 ensaio PAMPA é amplamente utilizado para determinar o coeficiente de permeabilidade (Pc), que pode estar associado à permeabilidade passiva in vivo do composto. 0 coeficiente de permeabilidade (Pc) de um determinado composto é examinado num cenário dependente do pH com pH apical e basolateral de 7,4. Todas as experiências são realizadas em determinações triplicadas. - 132-

Os compostos (stocks de 10 mm em 100% de DMSO) foram diluídos em 1:100 em tampão com pH 7,4 (plON CAT # 110151), providenciando uma solução de ensaio de 100 pm em 1% de DMSO. O composto diluído em tampão de dador foi transferido para uma placa Whatman Unifilter e filtrado antes da colocação de 200 μΐ no poço do dador da placa de ensaio (plON CAT # 110163) . O ensaio PAMPA foi formado pipetando 4 μΐ de uma solução lipídica (plON CAT # 110169) numa placa de filtro (VWR CAT # 13503) . De seguida, a membrana foi coberta com 200 μΐ do tampão do poço do aceitador a um pH 7.4 (plON CAT # 110139) . A placa do ensaio PAMPA (lado do dador e lado do aceitador) foi combinada e deixou-se incubar à temperatura ambiente durante4 horas. A placa foi depois desmontada e preencheram-se (150 μΐ/placa) placas de espectrofotómetro (VWR CAT # 655801) . As placas de dador, aceitador, referência e em branco foram lidas no leitor de placas SpectraMax UV. Os dados foram capturados através do software plON, que analisa os espectros e gera valores Pc.

Quimiotaxia de CCR2 O ensaio de quimiotaxia do CCR2 humano foi realizado com a linha celular monocítica humana, THP-1. As células THP-1 -133 - foram em primeiro lugar marcadas com corante fluorescente Calceína-AM em RPMI-1640 sem vermelho de fenol e sem BSA (pH 7.4) a 37°C durante 30 minutos com agitação leve a cada 15 minutos. As células marcadas foram depois lavadas e novamente suspensas a 1 x 105/ml em tampão de quimiotaxia (RPMI-1640 sem vermelho de fenol, 0,1% de BSA, pH 7,4). O composto de teste foi diluído em tampão de quimiotaxia de forma que a concentração final do ensaio variou entre 0,1 nM e entre 1 pm. Diluiu-se o ligando MCP-1 (PeproTech Inc.) a 20 nM em tampão de quimiotaxia. Para realizar o ensaio, misturou-se um volume idêntico do composto do teste com um volume idêntico de células THP-1 marcadas (Mistura 1) , e misturou-se um volume idêntico do composto do teste com um volume idêntico de ligando MCP-1 diluído (Mistura 2). Ambas as misturas foram incubadas de forma independente a 37°C durante 10 minutos, seguido de agitação leve. A quimiotaxia induzida por MCP-1 foi, então, medida numa placa de quimiotaxia (Becton Dickinson) colocando 50 μΐ da Mistura 1 na câmara superior e 225 μΐ da Mistura 2 na câmara inferior. A placa foi coberta com uma tampa e incubou-se a 37°C durante 30 minutos. 30 minutos depois, leu-se a placa num Cytofluor. Todas as condições foram testadas em duplicado. Na determinação do sinal e ruído, colocaram-se - 134 - 50 μΐ de células marcadas com THP-1 (5 x 104/poço) na câmara superior e 225 μΐ de ligando MCP-1 na câmara inferior (concentração final de 10 nM). A inibição obtida através das concentrações medidas do composto do teste foi calculada sob a forma de percentagem do composto-controlo MCP-1 livre. O IC50 é definido como a concentração do composto do teste necessária para se obter 50% de inibição da quimiotaxia celular.

"Patch clamp" de hERG

Utilizou-se um "patch clamp" de configuração "whole cell" para medir directamente as correntes de hERG em células HEK-293 que expressavam de forma estável a subunidade α do canal de potássio clonado de hERG. O composto foi testado num tampão aquoso com pH 7.4 à temperatura ambiente. Aplicaram-se pulsos repetitivos de teste (0,05 Hz) com um potencial de -80 mV a +20 mV durante 2 segundos e foram determinadas correntes de saída depois dos pulsos do teste passando a voltagem para -65 mV. Os efeitos do composto foram calculados através da medição da inibição do pico da corrente de saída. - 135 - "Patch clamp" dos canais de sódio

Utilizou-se um "patch clamp" de configuração "whole cell" para medir directamente as correntes no sentido interno de sódio em células HEK-293 que expressavam o canal de sódio cardíaco humano, SCN5A. 0 composto foi testado num tampão aquoso sem proteínas. Para a determinação da inibição do estado estacionário ("steady State"), as correntes de sódio foram estimuladas a cada 5 segundos usando o seguinte protocolo de voltagem: as células foram mantidas a um potencial de -90 mV e passaram para -20 mV durante 60 ms. Foram calculados os efeitos através da medição do pico de corrente durante o pulso do teste de -20 mV. A dependência da taxa por parte da inibição foi avaliada através da estimulação a frequências de 1 Hz e 4 Hz.

Farmacocinética da unidose em ratinhos

Foram utilizados ratinhos Sprague-Dawley machos (250-300 g) nos estudos de farmacocinética. Os ratinhos permaneceram em jejum durante a noite antes da dosagem PO e receberam alimento 4 h após a dose. Foram recolhidas amostras de sangue (—0,3 ml) da veia jugular em tubos contendo K2EDT A -136 - e de seguida centrifugaram-se a 4°C (1500-2000 xg) para obtenção de plasma. No estudo da biodisponibilidade oral, 2 grupos de animais (N= 2-3 por grupo) receberam o composto do teste sob a forma de infusão intravenosa (IV) (ao longo de 10 min) através da veia jugular ou sob a forma de sonda oral. Foram obtidas amostras de sangue em série 0,17 (apenas na IV), 0,25, 0,5, 0,75, 1, 2, 4, 6, 8 e 24 h depois da dose. As amostras de plasma, obtidas através da centrifugação a 4°C (1500-2000 xg) foram armazenadas a -20°C até se proceder à análise por LC/MS/MS.

Farmacocinética da unidose em macacos A farmacocinética dos vários compostos de teste foi avaliada em macacos Cynomolgus macho num design "crossover". Os macacos permaneceram em jejum durante a noite antes da dosagem PO e receberam alimento 4 h após a dose. Um grupo de animais (3 a 5 kg) recebeu o composto sob a forma de infusão IV (ao longo de 10 min) através da veia femoral e sob a forma de sonda oral, com uma fase de lavagem de 1 semana entre tratamentos. Foram obtidas amostras de sangue em série (—0,3 ml) da artéria femoral 0,17 (apenas na IV), 0,25, 0,5, 0,75, 1, 2, 4, 6, 8 e 24 h - 137- depois da dose e centrifugaram-se a 4°C (1500-200 xg) para obtenção de plasma. As amostras de plasma foram armazenadas a -20°C até se proceder à análise por LC/MS/MS.

Análise de dados dos ensaios farmacocinéticos

Foram obtidos os parâmetros farmacocinéticos através da análise não-compartimental da concentração de plasma vs dados temporais (software KINETICA™, Versão 4.2, InnaPhase Corporation, Filadélfia, PA) . Foram registados o pico de concentração (Cmáx) e o tempo para Cmáx directamente a partir das observações experimentais. A área sob a curva desde o tempo zero até ao tempo da última amostragem (AUC(O-T)) foi calculada usando uma combinação de somas lineares e trapezoidais. A "clearance" total do plasma (CLTp), volume de distribuição "steady State" (Vss), eliminação aparente da meia-vida (Tl/2) e o tempo médio de residência (MRT) foram estimados após administração IV. O cálculo da Tl/2 foi realizado utilizando um mínimo de 3 pontos temporais com concentrações quantificáveis. A biodisponibilidade oral absoluta (F) foi estimada sob a forma de taxa de valores AUC normalizados por dose após as doses orais e IV. - 138 -

Ligação THP-1 0 ensaio de ligação de CCR2 humano foi também estabelecido com a linha celular leucémica monocitica humana THP-1, que expressa CCR2 endógeno, usando MCP-1 125l-humano como ligando "tracer". Os ensaios de ligação de competição de radioligandos foram utilizados na avaliação da afinidade de ligação dos compostos do teste ao receptor de CCR2. Nos estudos de competição de radioligandos, adicionou-se 100 μΐ contendo células 2 ,5 x 105 THP-1/poço (em tampão de ensaio contendo 5 0 mm de HEPES, pH 7.4, 5 mm de MgCl2, 1 mm de CaCl2 e 0,5% de BSA) a placas de ensaio de 96 poços contendo o composto do teste numa diluição em série de 3 vezes, com as concentrações finais a variar entre os 5 pm e entre os 100 pM. Subsequentemente, adicionou-se 50 μΐ de radioligando 1251-NICP-1 numa concentração final de 0,2 nM em tampão de ensaio à reacção. Após um período de 90 minutos de incubação à temperatura ambiente, a reacção de ligação foi terminada colhendo com placas de filtro GF/B (Perkin Elmer Cat. N.° 6005177) seguido de lavagem com tampão de lavagem gelado (50 mm de HEPES, pH 7.4, 0,1% de BSA, 0,5 M de NaCl) para remoção do ligando não ligado. -139 -

Depois da lavagem, secou-se a placa durante 45 minutos a 60 °C seguido da adição de 40 μΐ de liquido de cintilação MicroScint 20, selou-se e analisou-se com o leitor Packard TopCount. Determinou-se a ligação não-especifica na presença de 10 pm (excesso molar de 5000 vezes) de um antagonista de pequena molécula CCR2 interno (Exemplo 2k, patente de invenção WO2005021500; IC50 do CCR2 = 2 nM) . Calculou-se a ligação especifica do MCP-1-1 sob a forma de diferença entre a ligação total e a ligação não-especif ica. Os dados da competição foram apresentados sob a forma de percentagem da inibição da ligação especifica de radioligandos na ausência do composto do teste (percentagem do sinal total). Depois de corrigir a ligação não-especif ica, foram determinados os valores IC50. O IC50 é definido como a concentração do composto do teste necessária para reduzir a ligaçao específica do MCP-1-1 em 50% e foi calculado usando a equação logística de quatro parâmetros para se adaptar aos dados normalizados.

Os dados de cada composto conforme medidos nos ensaios supra descritos são apresentados infra. - 140 - QUADRO 1. Dados comparativos in vitro.

Composto IC50 ligação CCR2 IC50 (nM) FLUXO HERG (nM) Ligação canal Na+ (% inibição) Permeabilidade PAMPA (nm/seg) Exemplo 12as W02005021500 0,27 (1) 2, 8 Não Não disponível disponível Exemplo 12aj 0,43 + W02005021500 0,06 0, 77 Não Não disponível (2) disponível Exemplo 2k, 0,88 ± 97%, 10 000 529 ± 157 (9) W02005021500 0, 60 (23) 51,000 nM Exemplo 12bd 1,15 ± W0200502150 0,07 (2) >80 000 54% 10 000 392 nM Exemplo 8a, 1,83 ± 3% 10000 nM 94 ± 58 (10) W02005021500 0,80 (12) >80 000 33% 30000 nM Exemplo 8e, W02005021500 220 ± 0,03 >80 000 -6%, 10000 2 ± 2 (2) (2) nM Exemplo 9c, W02005021500 0,96 ± >80 000 48%, 10000 nM 145171 (8) - 141 -

0,26 (19) 75%, 30000 nM Exemplo 1, presente 3,34±0,32 >80 000 12%, 10000 nM 187 invenção (3) 6%, 30 000 nM Exemplo 3, presente 4,741.58 >80 000 17%, 10000 nM 235 + 68 (5) invenção (3) 42%, 30000 nM Exemplo 7, presente 1,7210,54 >80 000 22%,10000 nM 326+221 (2) invenção (7) 44%,30000 nM Exemplo 8, presente 3,58+0,78 >80 000 14%,10000 nM 557 invenção (3) 19%,30000 nM Exemplo 9, presente 1,69+0,67 >80 000 13%,10000 nM 266 invenção (3) 48%,30000 nM Exemplo 10, 48%,10000 nM presente 5,18+1,98 >80 000 18%,10000 nM 228 invenção (6) 45%,30000 nM Exemplo 11, 1,91+0,52 14%,10000 nM presente (3) >80 000 34%,30000 nM 350 invenção Exemplo 12, presente 44911,35 >80 000 18%,10000 nM 239 invenção (3) 36%,30000 nM - 142-

Exemplo 13, presente invenção 4,01±1,31 (3) >80 000 5%,10000 nM 21%,30000 nM 54±63 (2) Exemplo 15, presente 3,34±0,71 >80 000 -5%,10000 nM 186 invenção (4) 5%,30000 nM QUADRO 2. Dados comparativos adicionais In vitro.

Composto IC50 quimiotaxia CCR2 (nM) hERG patch clamp (% inibição) Patch clamp canal Na+ (% inibição) Exemplo 2k, 52%, 10000 nM W020050215 0,27±0,16 83%,10000 M 90%, 30000 nM (12) Exemplo 8a, 2,63±1,24 22%, 10000 nM W020050215 (4) 4% 10000 49%, 30000 nM Exemplo 9c, 19%, 10000 nM W02005021500 0,21 4%,10000 nM 39%, 30000 nM Exemplo 1, 3,85± 0,36 presente (2) 8%,10000 nM 13% 30000 nM invenção 17%,30000 nM Exemplo 3, presente 2,20± 1,59 6%,10000 nM 3% 30000 nM 24%,30000 nM invenção (5) - 143-

Exemplo, presente invenção 7, 2,85 12%,10000 nM 29%,30000 nM 10% 30000 nM Exemplo 8, presente invenção 4,0 9± 1,21 (4) 18%,10000 nM 37%,30000 nM 11% 30000 nM Exemplo 9, presente invenção 0, 35 26%,10000 nM 41%,30000 nM 6% 30000 nM Exemplo 10, presente invenção 1,6± 0,42 (4) 33%,10000 nM 35%,30000 nM Exemplo 11, presente invenção 0, 92 15%,30000 nM Não disponível Exemplo 12, presente invenção 0, 88 6%,10000 nM 7%,30000 nM Não disponível Exemplo 13, presente invenção 0, 49 10%,30000 nM Não disponível Exemplo 15, presente invenção 0, 9± 0,67 (6) 29%,30000 nM 47%,30000 nM Não disponível - 144- QUADRO 2b. Dados comparativos da farmacocinética in vivo no ratinho.

Composto Dose iv/PO (mg/kg) Cl (ml/min/kg) F% AUC oral (nM*h) Exemplo 2k, W020050215 25/25 40 68 9294 Exemplo 8a, W02005021500 6/72 42 1,4 690 Exemplo 9c, W020050215 4/43 54 14 1855 Exemplo 1, Presente invenção Não disponível Não disponível Não disponível Não disponível Exemplo 3, Presente invenção 2/10 31 88 10068 Exemplo 7, Presente invenção Não disponível Não disponível Não disponível Não disponível Exemplo 8, Presente invenção 8,6 (PO) Não disponível Não disponível 7281 Exemplo 9, Presente invenção Não disponível Não disponível Não disponível Não disponível - 145 -

Exemplo 10, Presente invenção 1,6/9,3 45 57 4227 Exemplo 11, Presente invenção 2/10 56 52 3043 Exemplo 12, Presente invenção 2/10 59 91 5228 Exemplo 13, Presente invenção 2/10 26 88 10522 Exemplo 15, Presente invenção 2,7/11 23 93 16221 QUADRO 2c. Dados comparativos da farmacocinética in vivo no macaco

Composto Dose IV/PO (mg/kg) Cl (ml/min/kg) F% AUC oral (nM*h) Exemplo 2k, W02005021500 1/1,4 25 46 862 Exemplo 8a, W02005021500 1/11 14 9,4 1896 Exemplo 9c, W02005021500 1/10 12 26 6763 Exemplo 1, Não Não Não Não - 146-

Presente invenção disponível disponível disponível disponível Exemplo 3, Presente invenção 1/11 15 91 2051 Exemplo 7, Presente invenção Não disponível Não disponível Não disponível Não disponível Exemplo 8, Presente invenção 0,8 (PO) Não disponível Não disponível 558 Exemplo 9, Presente invenção Não disponível Não disponível Não disponível Não disponível Exemplo 10, Presente invenção 1/1 21 67 1085 Exemplo 11, Presente invenção Não disponível Não disponível Não disponível Não disponível Exemplo 12, Presente invenção 1 (PO) Não disponível Não disponível 413 Exemplo 13, - 147-

Composto IC50 ligação PBMC (nM) IC50 ligação THP-1 (nM) Exemplo 2, presente invenção 15,0 ± 7,3 (6) 27 (1) Exemplo 4, presente invenção 3,46 ± 1,10 (5) 4,22 ± 1,22 (4) Exemplo 5, presente invenção 27,5 ± 1,4 (2) 21,3 (1) Exemplo 6, presente invenção Não disponível 139,1 (1) Exemplo 14, presente invenção 14,9 ± 5,2 (2) 19,9 (1)

UTILIDADE

Os compostos representativos dos exemplos são apresentados como moduladores da actividade dos receptores das quimiocinas usando ensaios conhecidos pelos versados na arte. Nesta secção, descrevem-se tais ensaios e apresenta- - 148- se a literatura de referência. São descritos mais ensaios na secção entitulada "Comparação das caracteristicas farmacológicas", supra. Ao exibirem actividades nestes ensaios de antagonismo do MCP-1, é expectável que os compostos dos exemplos sejam úteis no tratamento de doenças humanas associadas às quimiocinas e aos seus respectivos receptores. A definição de actividade nestes ensaios consiste no facto de um composto demonstrar um IC50 de 30 μΜ ou inferior em concentração quando medido por um determinado ensaio.

Antagonismo da ligação de MCP-1 às PBMC humanas (Yoshimura et al., J. Immunol. 1990, 145, 292)

Pelo menos um dos compostos descritos nos exemplos apresenta actividade no antagonismo da ligação de MCP-1 às PBMC humanas (células mononucleares do sangue periférico humano).

Placas de filtro Millipore (# MABVN 1250) são tratadas com 100 μΐ de tampão de ligação (0,5% de albumina sérica bovina, 20 mm de tampão HEPES e 5 mm de cloreto de magnésio em meio RPMI 1640) durante 30 minutos à temperatura - 149- ambiente. Para se medir a ligação, combinou-se 50 μΐ de tampão de ligação, com ou sem um composto de concentração conhecida, com 50 μΐ de MCP-1 humano marcado com 125-l (para se obter um radioligando com uma concentração final de 150 pM) e 50 μΐ de tampão de ligação contendo células 5 x 105. As células utilizadas em tais ensaios de ligação podem incluir células mononucleares de sangue periférico humano isoladas por centrifugação de gradiente de Ficoll-Hypaque, monócitos humanos (Weiner et al., J. Immunol. Methods, 1980, 36, 89) ou a linha celular THP-1 que expressa o receptor endógeno. A mistura de composto, células e radioligando é incubada à temperatura ambiente durante trinta minutos. As placas são colocadas num colector a vácuo, aplica-se vácuo e as placas são lavadas três vezes com tampão de ligação contendo 0,5 M de NaCl. Remove-se a saia de plástico da placa, deixa-se secar a placa ao ar, retiram-se os poços e contam-se. É calculada a percentagem de inibição da ligação usando o total de contagens obtidas na ausência de qualquer composto competitivo e determina-se a ligação "background" através da adição de 100 nM de MCP-1 no lugar do composto do teste.

Antagonismo do influxo de cálcio induzido por MCP-1 - 150 - (Sullivan et al., Methods Mol. Biol. 1999, 114, 125-133)

Pelo menos um dos compostos descritos nos exemplos apresenta actividade no antagonismo do influxo de cálcio induzido por MCP-1 no ensaio infra descrito. A mobilização de cálcio é medida usando o corante fluorescente indicador de Ca2+, Fluo-3. As células são incubadas a 8 x 105 células/ml em tampão fosfato salino contendo 0,1% de albumina sérica bovina, 20 mm de tampão HEPES, 5 mm de glucose, 1% de soro fetal bovino, 4 μπι de Fluo-3 AM e 2,5 mm de probenecid durante 60 minutos a 37"C. As células utilizadas em tais ensaios de cálcio podem incluir monócitos humanos isolados conforme descrito por Weiner et al., J. Immunol. Methods, 1990, 36, 89-97 ou linhas celulares que expressem o receptor endógeno de CCR2, tal como a THP-1 e MonoMac-6. As células são depois lavadas três vezes em tampão fosfato salino contendo 0,1% de albumina sérica bovina, 20 mm de HEPES, 5 mm de glucose e 2,5 mm de probenecid. As células são novamente suspensas em tampão fosfato salino contendo 0,5% de albumina sérica bovina, 20 mm de HEPES e 2,5 mm de probenecid numa concentração final de 2-4 x 106 células/ml. As células são - 151 - colocadas em microplacas de 96 poços com paredes pretas (100 μΐ/poço) e as placas são centrifugadas a 200 x g durante 5 minutos. São adicionadas aos poços várias concentrações do composto (50 μΐ/poço) e 5 minutos depois, adiciona-se 50 μΐ/poço de MCP-1 para se obter uma concentração final de 10 nM. É detectada a mobilização de cálcio através do recurso a um leitor de placas de imagiologia fluorescente. A monocamada celular é excitada com um laser de árgon (488 nM) e é medida a fluorescência associada às células durante 3 minutos (a cada segundo durante os primeiros 90 segundos e a cada 10 segundos nos 90 segundos seguintes). São gerados dados sob a forma de unidades de fluorescência arbitrária e é determinada a alteração na fluorescência de cada poço como o diferencial máximo-minimo. É calculada a inibição dependente do composto relativamente à resposta do MCP-1.

Antagonismo da quimiotaxia das PBMC humanas induzida por MCP-1 (Bacon et al., Brit. J. Pharmacol. 1988, 95, 966) - 152 -

Pelo menos um dos compostos descritos nos exemplos apresenta actividade no antagonismo da quimiotaxia das PBMC humanas induzida por MCP-1 no ensaio infra descrito.

Uma câmara de quimiotaxia Neuroprobe MBA96 de 96 poços, uma placa de 96 poços Polyfiltronics MPC e filtros Neuroprobe PFD5 de policarbonato sem polivinilpirrolidona de 8 micrones são aquecidos numa incubadora a 37"C. Células mononucleareas de sangue periférico humano (PBMCs) (Boyum et al., Scand. J. Clin. Lab. Invest. Suppl. 1968, 97, 31) recentemente isoladas através do método de separação de densidade Ficoll, são suspensas em DMEM a 1 x 107c/ml e aquecidas a 37°C. As diluições dos compostos do testesão realizadas numa concentração até 2x superior àquela necessária no DMEM. A suspensão das PBMC e a solução de 60 nM de MCP-1 são misturadas 1:1 em tubos de polipropileno com DMEM pré-aquecido com ou sem a diluição dos compostos do teste. Estas misturas são aquecidas num aquecedor a 37°C. Para dar inicio ao ensaio, adicionou-se o MACP-1 e a mistura do composto nos poços da placa Polyfiltronics MPC de 96 poços que havia sido colocada na parte inferior da câmara de quimiotaxia Neuroprobe. O volume aproximado é de 400 μΐ em cada poço e deverá existir um menisco positivo depois da distribuição. O filtro de 8 micrones é suavemente -153 - colocado no cimo da placa de 96 poços, é fixada uma junta ao fundo da câmara superior e é montada a câmara. 200 μΐ do volume da suspensão celular/mistura de composto são adicionados aos poços adequados da câmara superior. Esta é coberta com selante de placas, e a unidade montada é colocada numa incubadora a 37°C durante 45 minutos. Depois da incubação, o selante da placa é removido e toda a suspensão celular remanescente é aspirada. A câmara é desmontada e o filtro é suavemente removido. Mantendo o filtro num ângulo de 90°, as células por migrar são lavadas usando uma corrente suave de tampão fosfato salino e o cimo do filtro é limpo com a ponta de uma espétula de borracha. Repete-se esta lavagem duas vezes mais. O filtro é seco ao ar e totalmente imerso em coloração de Wright Geimsa durante 45 minutos. O filtro é depois lavado, embebendo em água destilada durante 7 minutos, seguido de uma lavagem adicional de 15 segundos com água destilada fresca. 0 filtro é novamente seco ao ar. São quantificadas as células migradas no filtro através de microscopia visual.

Os receptores das quimiocinas dos mamíferos proporcionam um alvo para interferirem com ou promoverem a função celular imune num mamífero, tal como os seres humanos. Os compostos que inibem ou promovem a função do promotor das quimiocinas -154- são particularmente úteis na modulação da função celular imune com fins terapêuticos. Assim, a presente invenção diz respeito a compostos que são úteis na prevenção e/ou tratamento de uma série de doenças inflamatórias, infecciosas e imunoreguladoras, incluindo a asma e doenças alérgicas, infecção por micróbios patogénicos (que, por definição, incluem os virus), bem como patologias auto-imunes, como a artrite reumatóide e a arterosclerose.

Por exemplo, um composto instantâneo que iniba uma ou mais funções de um receptor das quimiocinas de um mamífero (por exemplo, um receptor das quimiocinas humanas) pode ser administrado para inibir (ou seja, reduzir ou prevenir) a inflamação ou doença infecciosa. Como resultado, é inibido um ou mais processos inflamatórios, como a emigração, adesão, quimiotaxia e exocitose de leucócitos (por exemplo, de enzimas, histamina) ou a libertação de mediadores inflamatórios.

Da mesma forma, um composto que promova uma ou mais funções dos receptores das quimiocinas dos mamíferos (por exemplo, uma quimiocina humana) administrado para estimular (induzir ou optimizar) uma resposta imune ou inflamatória, tal como a emigração, adesão, quimiotaxia e exocitose de leucócitos (por exemplo, de enzimas, histamina) ou a libertação de -155 - mediadores inflamatórios, resultando na benéfica estimulação dos processos inflamatórios. Por exemplo, os eosinófilos podem ser recrutados para combater as infecções parasitárias. Além disso, o tratamento das doenças inflamatórias, alérgicas e auto-imunes supra mencionadas também pode ser contemplado num composto que promova uma ou mais funções do receptores das quimiocinas dos mamíferos se se contemplar a libertação de composto suficiente para provocar a perda de expressão do receptor nas células através da indução da internalização do receptor das quimiocinas, ou a libertação de composto de forma a resultar na má orientação da migração celular.

Para além dos primatas, como os humanos, também podem ser tratados vários outros mamíferos de acordo com o método da presente invenção. Por exemplo, podem ser tratados mamíferos incluindo, sem que tal constitua qualquer tipo de limitação, vacas, ovelhas, cabras, cavalos, cães, gatos, porquinhos-da-india, ratinhos ou outras espécies de bovinos, ovinos, equídeos, caninos, felinos, roedores ou murinos. No entanto, o método também pode ser praticado noutras espécies, como as espécies aviarias. 0 indivíduo tratado mediante o método supra é um mamífero, de ambos os sexos, no qual é desejada a modulação da actividade do -156 - receptor das quimiocinas. 0 termo "modulação", conforme utilizado, engloba o antagonismo, agonismo, antagonismo parcial e/ou agonismo parcial. ENSAIOS FUNCIONAIS E DE LIGAÇÃO DO CCR5

Derivação celular e cultura celular

Foi desenvolvida uma "pool" de células HT1080 que expressam de forma estável o receptor 5 endógeno das quimiocinas CC (CCR5) usando os métodos descritos por Harrington, Sherf e Rundlett (vejam-se as patentes de invenção norte-americanas US 6361972 e 6410266) . Os clones com maior expressão foram isolados utilizando a citometria de fluxo repetitiva, seguida de "sub-cloning". Estas células foram depois cultivadas em pratinhos de 6 poços (3 x 105 células/poço) e foram transfectadas com um vector de ADN contendo Gqi5 da proteína G quimérica marcada com HA (Molecular Devices; foram usadas 5 microgramas de vector de ADN linearizado em 15 microlitros de Ex-Gen da Fermentes na transfecção). Dois dias depois da transfecção, os poços foram combinados e depositados em placas P100. Sete dias depois da deposição, as colónias foram recolhidas, expandidas e analisadas - 157 - quanto ao conteúdo de Gqi5 através de Western blot. Foi seleccionado um clone (designado de 3559.1.6) com alta expressão de Gqi5 (da transfecção) e de CCR5 (endógeno) e utilizou-se nas experiências infra descritas. As células HT1080 (clone 3559.1.6) foram cultivadas com alfa-MEM suplementado com 10% de soro fetal bovino dializado, 2% de penicilina/estreptomicina/glutamina e 500 microgramas/ml de higromicina B (concentração final) a 37 °C com 5% de CO2 em atmosfera humidificada.

Preparado de membrana

Grânulos celulares ("cell pellet") contendo 1 x 108 células HT1080 (clone 3559.1.6) foram novamente suspensos em 5 ml de tampão Membrane Prep Buffer gelado (50 mm de HEPES, 5 mm de MgCl2, 1 mm de CaCl2) e homogenizou-se a alta velocidade em homogenizador Polytron durante 20 seg em gelo. O material homogeneizado foi diluído com 25 ml de tampão Membrane Prep Buffer e centrifugado durante 12 min (48000 x g a 4°C) . O pellet celular foi novamente suspenso em 5 ml em tampão Membrane Prep Buffer antes de ser novamente homogeneizado conforme anteriormente descrito. O material - 158 - homogeneizado foi diluído com 5 ml de tampão Membrane Prep Buffer e analisado quanto à concentração da proteína CCR5.

Ensaio de ligação 0 material homogeneizado recém preparado a partir do Preparado de Membrana supra descrito foi diluído em tampão de ligação (50 mm de HEPES, 5 mm de MgCl2, 1 mm de CaCl2, 0, 1% de BSA; foi também adicionado um comprimido inibidor da protease antes do ensaio) para se obter a concentração final de proteína de 10 microgramas/poço (placas de 96 poços brancas da Corning Inc.). Este preparado de membrana foi misturado com contas WGA-SPA (Amerhsam; previamente embebidas em tampão de ligação) para se obter uma concentração de 200 microgramas/poço. A mistura de membrana/contas SPA (100 microlitros/poço) foi depois adicionada a uma placa previamente marcada com 2 microlitros de DMSO contendo várias concentrações dos artigos do teste (DMSO puro para o controlo negativo, várias concentrações de exemplos desta invenção para os artigos do teste, 500 nM de beta MIP-1 como controlo positivo) . O ensaio de ligação foi iniciado através da adição de 50 microlitros de beta [ 125-1 ]-MIP-1 (Perkin -159 -

Elmer, o material foi diluído em tampão de ligação de form que a adição de 50 microlitros/poço resultava numa concentração final de 0,1 nM de beta [ 125-1 ]-MIP-1) . A placa foi selada e permitiu-se que permanecesse à temperatura ambiente durante 4-6 h antes de ser contada num contador Packard TopCount. Foi calculada a percentagem ligada para o artigo do teste, usando controlos negativos e positivos para definir a janela de cada experiência.

Ensaio funcional com base no leitor de placas com imagiologia fluorométrica (FLIPR) Células HT1080 (clone 3559.1.6) foram dispostas em picas a 10 000 células/poço (30 microlitros) em placas de 384 poços (PDL Biocoat de fundo preto/transparente, Beckton Dickinson) e carregou-se com 30 microlitros/poço de corante fluorescente Fluoro-4 AM (preparado através da diluição com 10 ml de tampão de Hanks) . As células foram incubadas a 37 °C com 5% de C02 durante 30 min antes de serem lavadas três vezes e suspensas em tampão de ensaio (20 mm de HEPES, 1,2 mm de CaCl2, 5 mm de MgCl2, 2,5 mm de probenecid, 0,5% de BSA, 1 x de tampão de Hanks) . O artigo do teste foi diluído em série em DMSO e de seguida diluído com tampão de - 160 - ensaio (1:10) antes de ser adicionado às células (10 microlitros/poço). Usando o FLIPR, as placas foram lidas (10-70 seg) para indução de fluxo (ou seja, actividade agonista). As células foram então adicionalmente carregadas com Solução agonista (30 microlitros/poço; preparou-se através da diluição de 30 microlitros de 100 microMolar de MIP-1 beta em 100 ml de tampão de ensaio; este protocolo obtém uma concentração final de 5 nM de MIP-1 beta no ensaio ) e as placas foram lidas usando o FLIPR por um minuto . A actividade antagonista do artigo do teste foi determinada em relação a 0,4% de DMSO/tampão de controlo negativo.

Pelo menos um composto da descrição é um inibidor de ambas as proteínas CCR2 e CCR5 e pode ser utilizado para tratar doenças associadas às quimiocinas. Estes compostos da presente invenção são considerados antagonistas duais.

As doenças ou condições da espécie humana ou outras espécies que podem ser tratadas com inibidores da função do receptor das quimiocinas incluem, sem que tal constitua qualquer tipo de limitação, as doenças ou condições inflamatórias ou alérgicas, incluindo doenças respiratórias alérgicas como a asma, rinite alérgica, doenças da hipersensibilidade pulmonar, pneumonite de -161 - hipersensibilidade, celulite eosinofílica (por exemplo, síndrome de Well), pneumonias eosinofílicas (por exemplo, síndrome de Loeffler, pneumonia eosinofílica crónica), fasceíte eosinofílica (por exemplo, síndrome de Shulman), hipersensibilidade retardada, doenças pulmonares intersticiais (ILD) (por exemplo, fibrose pulmonar idiopática ou ILD's associadas à artrite reumatóide, lúpus sistémico eritematoso, espondilite anquilosante, esclerose sistémica, síndrome de Sjõgren, polimiosite ou dermatomiosite), anafilaxia sistémica ou reacções de hipersensibilidade, alergias a fármacos (por exemplo, à penicilina, cefalosporinas), síndrome eosinofilia-mialgia provocado pela ingestão de triptofano contaminado, alergias às picadas de insecto, doenças auto-imunes como a artrite reumatóide, artrite psoriática, esclerose múltipla, lúpus sistémico eritematoso, miastenia grave, diabetes juvenil, glomerulonefrite, tiroidite auto-imune, doença de Behcet, rejeição de enxertos (por exemplo, no transplante de órgãos), incluindo a rejeição de aloenxerto ou doença enxerto contra hospedeiro, doenças inflamatórias dos intestinos, como a doença de Crohn e a colite ulcerosa, espondiloartropatias, esclerodermia, psoríase (incluindo a psoríase mediada por células T) e dermatoses inflamatórias -162 - como a dermatite, eczema, dermatite atópica, dermatite alérgica de contacto, urticária, vasculite (por exemplo, vasculite necrotizante, cutânea e de hipersensibilidade) , miosite eosinofilica, fasceite eosinofilica, cancros com infiltração leucocitária da pele e dos órgãos. Podem ser tratadas outras doenças ou condições nas guais deverão ser inibidas as respostas inflamatórias indesejáveis, incluindo, sem gue tal constitua gualquer tipo de limitação, as lesões por reperfusão, aterosclerose, algumas doenças hematológicas, toxicidade induzida por citocinas (por exemplo, choque séptico, choque endotóxico), polimiosite, dermatomiosite. Doenças ou condições infecciosas da espécie humana ou de outras espécies que podem ser tratadas com inibidores da função do receptor das quimiocinas incluem, sem que tal constitua qualquer tipo de limitação, o HIV.

As doenças ou condições da espécie humana ou de outras espécies que podem ser tratadas com promotores da função do receptor das quimiocinas incluem, sem que tal constitua qualquer tipo de limitação, a imunossupressão, tal como aquela verificada em indivíduos com síndromes de imunodeficiência como a SIDA ou outras infecções virais, indivíduos submetidos a radioterapia, quimioterapia, -163 - terapia para doenças auto-imunes ou terapia de fármacos (por exemplo, terapia com corticosteróides), que provocam imunossupressão, imunossupressão devida a deficiência congénita na função do receptor ou outras causas, e doenças infecciosas como as doenças parasitárias incluindo, sem que tal constitua qualquer tipo de limitação, as infecções helmínticas, tais como as infecções por nemátodes (lombrigas), (Tricuriase, Enterobiase, Ascariase, anquilostoma, Estrongiloidiase, Triquinose, filariase), tremátodes (esquistossomas) (Esquistossomíase, Clonorquiase), cestodes (ténias) (Equinococose, Taeniasis saginata, Cisticercose), vermes intestinais, enxaquecas por larvas viscerais (por exemplo, Toxocara), gastroenterite eosinofilica (por exemplo, Anisaki sp., Phocanema sp.) » enxaquecas por larvas cutâneas (Ancylostona braziliense, Ancylostoma caninum). Os compostos da presente invenção são, assim, úteis na prevenção e tratamento de uma ampla gama de distúrbios e doenças inflamatórias, infecciosas e imunoreguladoras.

Além disso, o tratamento das doenças inflamatórias, alérgicas e auto-imunes supra mencionadas também pode ser contemplado por promotores da função do receptor das quimiocinas se contemplar a libertação de composto - 164- suficiente para provocar a perda de expressão do receptor nas células através da indução da internalização do receptor das quimiocinas, ou a libertação de composto de forma a resultar na má orientação da migração celular.

Num outro aspecto, a presente invenção pode ser utilizada para availiar os putativos agonistas ou antagonistas específicos de um receptor acoplado a uma proteína G. A presente invenção diz respeito ao uso destes compostos na preparação e exceução de ensaios de selecção dos compostos que modulam a actividade dos receptores das quimiocinas. Além disso, os compostos da presente invenção são úteis no estabelecimento ou determinação do local de ligação de outros compostos aos receptores das quimiocinas, por exemplo, através de inibição competitiva ou como referência num ensaio para comparar as sua actividade conhecida com a de um composto com actividade desconhecida. Aquando do desenvolvimento de novos ensaios ou protocolos, os compostos de acordo com a presente invenção poderiam ser usados para testar a sua eficácia. Mais especificamente, podem ser proporcionados tais compostos sob a forma de um kit comercial, por exemplo, para utilização na investigação farmacêutica envolvendo as doenças supra mencionadas. Os compostos da presente invenção também são úteis na -165 - avaliaçãod so putativos moduladores específicos dos receptores das quimiocinas. Além disso, poderemos utilizar os compostos da presente invenção para examinar a especificidade dos receptores acoplados à proteína G que se acredita não serem receptores das quimiocinas, para servirem de exemplo de compostos que não ligam, ou como variantes estruturais de compostos activos nestes receptores que podem ajudar a definir locais específicos de interacção.

Os compostos descritos são úteis no tratamento ou prevenção de doenças seleccionadas entre a artrite reumatóide, osteoartrite, choque séptico, aterosclerose, aneurisma, febre, efeitos cardiovasculares, choque hemodinâmico, síndrome de sépsis, lesão de reperfusão pós-isquémica, malária, doença de Crohn, doenças inflamatórias dos intestinos, infecção micobacteriana, meningite, psoríase, insuficiência cardíaca congestiva, doenças fibróticas, cachexia, rejeição de transplante, doenças auto-imunes, doenças inflamatórias da pele, esclerose múltipla, lesões por radiação, lesão alveolar difusa, VIH, demência associada ao VIH, diabetes mellitus não-insulino dependente, asma, rinite alérgica, dermatite atópica, fibrose pulmonar idiopática, penfigóide bolhoso, infecçoes - 166 - helmínticas parasitárias, colite alérgica, eczema, conjuntivite, transplante, eosinofilia familiar, celulite eosinofilica, pneumonias eosinofilicas, fasceite eosinofilicas, gastroenterite eosinofilica, eosinofilia induzida por fármacos, fibrose cística, síndrome de Churg-Strauss, linfoma, doença de Hodgkin, carcinoma colónico, síndrome de Felty, sarcoidose, uveíte, doença de Alzheimer, glomerulonefrite e lúpus eritematoso sistémico, carcinoma das células escamosas esofágicas, dor neuropática de obesidade.

Num outro aspecto, os compostos são úteis no tratamento ou prevenção de doenças seleccionadas entre a artrite reumatóide, osteoartrite, aterosclerose, aneurisma, febre, efeitos cardiovasculares, doença de Crohn, doenças inflamatórias dos intestinos, psoríase, insuficiência cardíaca congestiva, esclerose múltipla, doenças auto-imunes, doenças inflamatórias da pele.

Num outro aspecto, os compostos são úteis no tratamento ou prevenção de doenças seleccionadas entre a artrite reumatóide, osteoartrite, aterosclerose, doença de Crohn, doenças inflamatórias dos intestinos e esclerose múltipla. - 167 -

Num outro aspecto, os exemplos descritos podem ser úteis no tratamento de uma série de cancros, incluindo, sem que tal constitua qualquer tipo de limitação, os seguintes: carcinoma, incluindo o da bexiga (incluindo cancro metastático e acelerado da bexiga), mama, cólon (incluindo o cancro colorectal), rim, fígado, pulmão (incluindo cancro do pulmão de pequenas e de não-pequenas células e adenocarcinoma pulmonar), ovário, próstata, testículos, tracto genitourinário, sistema linfático, recto, laringe, pâncreas (incluindo o carcinoma pancreático exócrino), esófago, estômago, vesícula biliar, colo do útero, tiróide e pele (incluindo o carcinoma das células escamosas); tumores hematopoiéticos de linhagem linfóide incluindo a leucemia, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfoblástica aguda, linfoma das células B, linfomas de Hodgkin, linfoma não-Hodgkin, linfoma de tricoleucitos, linfoma histiocítico e linfoma de Burketts; tumores hematopoiéticos de linhagem mielóide incluindo as leucemias mielogenas crónicas, síndrome mielodisplásico, leucemia mielóide e leucemia promielocítica; -168 - tumores do sistema nervoso central e periférico incluindo astrocitoma, neuroblastoma, glioma e schwanomas; tumores de origem mesenquimal incluindo o fibrosarcoma, rabdomiossarcoma e osteosarcoma; e outros tumores incluindo melanoma, xeroderma pigmentoso, ceratinhoactantoma, seminoma, cancro folicular da tiróide e teratinhocarcinoma.

Num outro aspecto, são descritos métodos de tratamento do cancro, em que o cancro é seleccionado entre o cancro da mama, cancro da próstata e melanoma. Além disso, os compostos descritos podem ser úteis no tratamento do cancro do ovário e do mielona múltiplo. A presente invenção proporciona métodos para o tratamento de uma série de doenças proliferativas não-cancerosas. A terapia combinada para prevenir ou tratar a infkamação, distúrbios e doenças infecciosas e imunoregulatórias, incluindo a asma e as doenças alérgicas, bem como as patologias auto-imunes como a artrite reumatóide e a aterosclerose, e aquelas patologias supra mencionadas é ilustrada pela combinação dos compostos da presente invenção e outros compostos conhecidos por possuírem essa - 169 - mesma utilidade. Por exemplo, no tratamento ou prevenção da inflamação, os presentes compostos podem ser usados em conjunto com um agente anti-inflamatório ou analgésico tal como um agonista opiáceo, um inibidor da lipoxigenase, um inibidor da ciclooxigenase-2, um inibidor da interleucina, tal como um inibidor da interleucina-1, um inibidor do factor nexrótico tumoral, um antagonista do NMDA, um inibidor ou óxido nítrico ou um inibidor da síntese do óxido nítrico, um agente anti-inflamatório não-esteróide, um inibidor da fosfodiesterase, um agente anti-inflamatório supressor das citocinas, por exemplo com um composto como o acetaminofeno, aspirina, codeína, fentanil, ibuprofeno, indometacin, cetorolac, morfina, naproxeno, fenacetina, piroxicam, um analgésico esteróide, sufetanil, sundilac, interferão alfa e semelhantes. Da mesma forma, os presentes compostos podem ser administrados com um analgésico, com um potenciador como a cafeína, com um antagonista H2, simeticone, hidróxido de alumínio ou magnésio, um descongestionante como a fenilfrina, fenilpropanolamina, pseudofedrina, oximetazolina, efinefrina, nafazolina, xilometazolina, propilhexedrina ou levodesoxiefedrina, e anti-tússicos como a codeína, hidrocodona, caramifen, carbetapentano ou dextrometorfano, um diurético e um anti- - 170 - histamínico sedante ou não-sedante. Da mesma forma, os compostos descritos podem ser usados em combinação com outros fármacos utilizados no tratamento/prevenção/supressão ou melhoria das doenças ou condições nas quais é útil o composto da presente invenção. Tais fármacos podem ser administrados por uma via e numa quantidade vulgarmente utilizadas, em simultâneo ou sequencialmente com um composto da presente invenção. Quando um composto é utilizado em simultâneo com outro ou outros fármacos, pode ser utilizada uma composição farmacêutica que contenha tais outros fármacos para além do composto da presente invenção. Assim, as composições farmacêuticas incluem aquelas que também contêm um ou mais outros ingredientes activos, para além de um composto da descrição da presente invenção.

Exemplos de outros ingredientes activos que podem ser combinados com um composto da presente invenção, administrados separadamente ou nas mesmas composições farmacêuticas, incluem, sem que tal constitua qualquer tipo de limitação, (a) antagonistas da integrina como aquelas das selectinas, ICAM's e VLA-4, (b) esteróides como a beclometasona, metilprednisolona, betametasona, prednisona, dexametasona e hidrocortisona, (c) imunossupressores como a - 171 - ciclosporina, tacrolimus, rapamicina e outros imunossupressores do tipo FK-506, (d) anti-histaminicos (antagonistas da histamina Hl) , como a bromofeniramina, clorofeniramina, dexclorofeniramina, tripolidina, clemastina, difenidramina, difenilpiralina, tripelenamina, hidroxizina, metdilazina, prometazina, trimeprazina, azatadina, pirilamina, cetirizina, ciproheptadina, antazolina, fenilamina astemizole, terfenadina, loratadina, fexofenadina, descarboetoxiloratadina e semelhantes, (e) anti-asmáticos não-esteróides como os antagonistas b2 (terbutalina, metaproterenol, fenoterol, isoetarina, albuteral, bitolterol e pirbuterol), teofilina, cromolina de sódio, atropina, brometo de ipratrópio, antagonistas dos leucotrienos (zafirlucaste, montelucaste, pranlucaste, iralucaste, pobilucaste, SKB-102,203), inibidores da biosintese dos leucotrienos (zileuton, BAY- 1005), (f) agentes anti-inflamatórios não-esteróides (NSAID's) como os derivados do ácido propiónico (alminoprofeno, benxaprofeno, ácido buclóxico, carprofeno, fenbufeno, fenoprofeno, fluprofeno, flurbiprofeno, ibuprofeno, indoprofeno, cetoprofeno, miroprofeno, naproxeno, oxaprozina, pirprofeno, pranoprofeno, suprofeno, ácido tiaprofénico e tioxaprofeno), derivados do ácido - 172- acético (indometacina, acemetacina, alclofenac, clidanac, diclofenac, fenclofenac, ácido fenclózico, fentaziac, furofenac, ibufenac, isoxepac, oxpinac, sundilac, tiopinac, tolmetin, zidometacina e zomepirac), derivados do ácido fenâmico (ácido flufenâmico, ácido meclofenâmico, ácido mefenâmico, ácido niflúmico e ácido tolfenâmico), derivados do ácido bifenilcarboxilico (diflunisal e flufenisal), oxicams (isoxicam, piroxicam, sudoxicam e tenoxicam), salicilatos (ácido acetilsalicilico, sulfasalazina) e as pirazolonas (apazona, benzpiperilon, feprazona, mofebutazona, oxifenbutazona, fenilbutazona) , (g) inibidores da ciclooxigenase-2 (COX-2), (h) inibidores da fosfodiesterase do tipo 4 (PDE-IV), (i) outros antagonistas dos receptores das quimiocinas, (j) agentes redutores do colesterol como os inibidores da HMG-COA reductase (lovastatina, sinvastatina e pravastatina, fluvastatina, atorvastatina e outras estatinas), sequestrantes (colestiramina e colestipol), ácido nicotónico, derivados do ácido fenofibrico (gemfibrozil, clofibratinho, fenofibratinho e benzafibratinho) e probucol, (k) agentes anti-diabéticos como a insulina, sulfonilureias, biguanidas (metformina), inibidores da α-glucosidade (acarbose) e glitazonas (troglitazona e piolglitazona), (1) preparados - 173- de interferões (interferão alfa—2a, interferão alfa—2B, interferão alfa-N3, interferão beta-la, interferão beta-lb, interferão gama-lb), (m) compostos antivirais como a efavirenz, nevirapina, indinavir, ganciclovir, lamivudina, famciclovir e zalcitabina, (o) outros compostos como o ácido 5-aminosalicílico e pró-fármacos do mesmo, anti-metabolitos como a azatioprina e 6-mercaptopurina, e agentes quimioterapêuticos citotóxicos do cancro. A proporção do peso do composto da presente invenção em relação ao segundo ingrediente activo pode variar e dependerá das doses eficazes de cada ingrediente. Geralmente, é utilizada a dose eficaz de cada um deles. Assim, por exemplo, quando um composto é combinado com um NSAID, a razão do peso do composto da presente invenção em relação ao NSAID irá variar de entre cerca de 1000:1 e entre cerca de 1:1000, ou em alternativa, entre cerca de 200:1 e entre cerca de 1:200. As combinações de um composto da presente invenção e outros ingredientes activos também estarão entre os intervalos supra mencionados, mas em cada caso deverá ser utilizada a dose eficaz de cada ingrediente activo.

No tratamento do cancro, é muitas vezes vantajosa uma combinação de agentes quimioterápicos e/ou outros - 174- tratamentos (por exemplo, radioterapia). 0 segundo (ou terceiro) agente pode ter o mesmo ou um mecanismo de acção diferente daquele do agente terapêutico. Pode, em especial, ser útil utilizar combinações citotóxicas de fármacos em que os dois ou três fármacos administrados actuam de forma diferente ou num ciclo celular de diferentes fases, e/ou em que os dois ou mais fármacos apresentam toxicidades ou efeitos secundários sobrepostos, e/ou em que os fármacos a combinar apresentam uma eficácia demonstrada no tratamento do estado patológico manifestado pelo paciente.

Assim, os compostos descritos (ou outras fórmulas descritas) podem ser administradas em combinação com outros agentes e tratamento anti-cancro e citotóxicos úteis no tratamento do cancro ou outras doenças proliferativas. A presente invenção inclui também o uso dos compostos (ou outras fórmulas descritas) na preparação de medicamentos destinados ao tratamento do cancro, e/ou engloba o embalamento dos compostos juntamente com instruções de que os compostos podem ser usados em combinação com outros agentes e tratamentos anti-cancro ou citotóxicos destinados ao tratamento do cancro. A presente invenção engloba ainda combinações dos compostos de um ou mais agentes adicionais sob a forma de kit, por exemplo, em que são embalados em - 175 - conjunto ou colocados em embalagens separadas para venda como kit, ou em que são embalados para serem formulados em conjunto. 0 segundo (ou mais) agentes anti-cancro pode ser seleccionado entre qualquer um ou mais dos seguintes: agentes alquilantes (incluindo mostardas de azoto, alquilsulfonatos, nitrosoureias, derivados de etilenimina e triazenos), anti-angiogénicos (incluindo inibidores das metaloproteinases da matriz), antimetabolitos (incluindo inibidores da adenosina deaminase, antagonistas do ácido fólico, análogos da purina e análogos da pirimidina) antibióticos ou anticorpos (incluindo anticorpos monoclonais, anticorpos CTLA-4, antraciclinas), inibidores da aromatase; modificadores da resposta do ciclo celular, enzimas, inibidores da farnesil-transferase; agentes hormonais e anti-hormonais e esteróides (incluindo análogos sintéticos, glucoesteróides, estrogénios/anti-estrogénios [por exemplo, SERM's], androgénios/anti-androgénios, progestinas, agonistas do receptor da progesterona e agonistas e antagonistas da - 176- hormona libertadora da hormona luteinizante [LHRH]), moduladores do sistema factor de crescimento insulínico (IGF)/receptor do factor de crescimento insulínico (IGFR) (incluindo inibidores do IGFRl), inibidores do sinal da integrina, inibidores da cinase (incluindo inibidores da multi-cinase e/ou inibidores da Src ou Src/abl-cinase, inibidores das cinases dependentes da ciclina [CDK], anticorpos panHer, Her-1 e Her-2, inibidores do VEGF, incluindo anticorpos anti-VEGF, inibidores do EGFR, inibidores da proteína activada por mitogénios [MAP], inibidores do MEK, inibidores da Aurora-cinase, inibidores do PDGF e outros inibidores da tirosina cinase ou inibidores da serina/treonina cinase; agentes disruptores dos microtúbulos, tais como ecteinascidinas ou seus análogos e derivados, agentes estabilizadores dos microtúbulos como os taxanos, e as epotilonas de ocorrência natural e seus análogos sintéticos e semi-sintéticos; agentes de ligação e destabilização dos microtúbulos (incluindo alcaloides vinca), e inibidores da topoisomerase, inibidores da prenil- transferase complexos de coordenação de platina - 177 - inibidores da transdução de sinal e outros agentes usados como agentes anti-cancro e citotóxicos, como os modificadores da resposta biológica, factores de crescimento e moduladores imunes.

Além disso, os compostos da presente invenção podem ser formulados ou co-administrados com outros agentes terapêuticos seleccionados devido à sua particular utilidade na abordagem dos efeitos secundários associados às condições supra referidas. Por exemplo, os compostos da invenção podem ser formulados com agentes para prevenir náuseas, hipersensibilidade e irritação gástrica como os antieméticos e anti-histaminicos Hi e H2.

Os agentes terapêuticos supra mencinados, quando utilizados em combinação com os compostos da presente invenção, podem ser utilizados, por exemplo, nas quantidades indicadas no Physician's Desk Reference (PDR) ou conforme determinado pelos versados na arte.

Os compostos são administrados a um mamífero numa quantidade terapeuticamente eficaz. 0 termo "terapeuticamente eficaz" significa uma quantidade de um composto da presente descrição que, quando administrado a um mamífero por si só ou em combinação com um agente - 178 - terapêutico adicional, é eficaz na prevenção ou melhoria das condições da doença ou na progressão da doença.

DOSAGEM E FORMULAÇÃO

Os compostos da presente descrição podem ser administrados em formas de dosagem oral, como comprimidos, cápsulas (sendo que cada uma inclui formulações de libertação prolongada ou controlada), píluas, pós, grânulos, elixires, tinturas, suspensões, xaropes e emulsões. Também podem ser administrados por via intravenosa (bolus ou infusão), intraperitoneal, subcutânea ou intramuscular, sendo que todas elas utilizam formas de dosagem bem conhecidas dos versados nas artes farmacêuticas. Podem ser administrados por si só, mas geralmente serão administrados com um veiculo farmacêutico seleccionado com base na via de administração escolhida e na prática farmacêutica de referência. 0 regime de dosagem dos compostos da presente invenção dependerá, claro, de vários factores, como as caracteristicas farmacodinâmicas do agente em particular e do seu modo e via de administração, da espécia, idade, sexo, saúde, condição médica e peso do receptor, da - 179 - natureza e extensão dos sintomas, do tipo de tratamento simultâneo, da frequência do tratamento, da via de administração, da função renal e hepática do paciente e do efeito desejado. Um médico ou veterinário poderá determinar e prescrever a quantidade eficaz do fármaco necessária para prevenir, combater ou deter a progressão da doença.

Como forma de guia geral, a dosagem oral diária de cada ingrediente activo, quando usado para os fins indicados, irá situar-se no intervalo entre cerca de 0,001 e entre 1000 mg/kg de peso corpo, ou entre cerca de 0, 01 a 100 mg/kg de peso corporal por dia, ou em alternativa, entre cerca de 1,0 e entre 20 mg/kg/dia. Por via intravenosa, as doses irão variar entre cerca de 1 e entre cerca de 10 mg/kg/minuto durante uma infusão a uma velocidade constante. Os compostos da presente invenção podem ser administrados numa dose única diária, ou a dosagem total diária pode ser administrada em doses divididas em duas, três ou quatro doses diárias. Numa variante, a dosagem oral diária do ingrediente activo é de entre 3 e entre 600 mg administradas numa dose única diária ou em doses divididas administradas duas vezes por dia. Em alternativa, o ingrediente activo pode ser administrado em doses de 10-20 mg administradas duas vezes por dia ou de 40 a 100 mg - 180 - administradas uma vez por dia. Em alternativa, o ingrediente activo pode ser administrado em doses de 3, 10, 30, 100, 300 e 600 mg administradas uma ou duas vezes por dia.

Os compostos da presente invenção podem ser administrados por via intranasal através de um uso tópico de veículos intranasais adequados, ou por via transdérmicas, usando pensos transdérmicos. Quando administrados sob a forma de um sistema de libertação transdérmica, a administração irá, obviamente, ser contínua e não intermitente ao longo do regime de dosagem.

Os compostos são tipicamente administrados em mistura com diluentes, excipientes ou veículos farmacêuticos adequados (colectivamente designados como veículos farmacêuticos) adequadamente seleccionados no que respeita à forma de administração pretendida, ou seja, comprimidos orais, cápsulas, elixires, xaropes e semelhantes, e de acordo com as práticas farmacêuticas convencionais.

Por exemplo, para administração oral sob a forma de um comprimido ou cápsula, o componente activo pode ser combinado com um veículo oral inerte, não tóxico e farmaceuticamente aceitável, tal como a lactose, amido, sacarose, glucose, metilcelulose, estearatinho de magnésio, -181 - fosfato dicálcio, sulfato de cálcio, manitol, sorbitol e semelhantes; para a administração oral sob a forma de líquido, os componentes orais do fármaco podem ser combinados com qualquer veículo oral inerte, não tóxico e farmaceuticamente aceitável, tal como o etanol, glicerol, água e semelhantes. Além disso, quando desejado ou necessário, também podem ser incorporados na mistura aglutinantes, lubrificantes, agentes desintegrantes e agentes corantes. Aglutinantes adequados incluem o amido, gelatina, açúcares naturais como a glucose ou beta-lactose, adoçantes de milho, gomas naturais e sintéticas como a acácia, tragacanto ou alginato de sódio, carboximetilcelulose, polietilenoglicol, ceras e semelhantes. Os lubrificantes usados nestas formas de dosagem incluem o oleato de sódio, estearatinho de sódio, estearatinho de magnésio, benzoato de sódio, acetato de sódio, cloreto de sódio e semelhantes. Desintegrantes incluem, sem que tal constitua qualquer tipo de limitação, o amido, metilcelulose, ágar, bentonite, goma xantana e semelhante.

Os compostos da presente invenção também podem ser administrados sob a forma de sistemas de libertação lipossomais, tal como as vesículas unilamelares pequenas, - 182 - vesículas unilamelares grandes e vesículas multilamelares. Os lipossomas podem ser formados a partir de uma variedade de fosfolípidos, como o colesterol, estearilamina ou fosfatidilcolinas.

Os compostos da presente invenção também podem ser acoplados com polímeros solúveis como veículos de fármacos detectáveis. Tais polímeros podem incluir a polivinilpirrolidona, copolímero de pirano, polihidroxipropilmetacrilamida-fenol, polihidroxietilaspartamidofenol ou polietilencóxido-polilisina substituída por resíduos de palmitoil. Além disso, os compostos da presente invenção podem ser acoplados a uma classe de polímeros biodegradáveis úteis na obtenção da libertação controlada de um fármaco, por exemplo, ácido poliláctico, ácido poliglicólico, copolímeros de ácido poliláctico e poliglicólico, poli(épsilon-caprolactona), ácido polihidróxi-butírico, poliortoésteres, polidihidropiranos, policianoacilatos e blocos de copolimeros cruzados ou anfipáticos de hidrogéis. As formas de dosagem (composições farmacêuticas) adequadas para administração podem conter entre cerca de 1 miligrama e entre cerca de 100 miligramas de ingrediente activo por unidade de dosagem. Nestas composições farmacêuticas, o -183 - ingrediente activo irá geralmente estar presente numa quantidade entre cerca de 0,5-95% por peso, com base no peso total da composição.

As cápsulas de gelatina podem conter o ingrediente activo e veículos em pó, como a lactose, o amido, os derivados da celulose, o estearatinho de magnésio, o ácido esteárico, e semelhantes. Podem ser usados diluentes semelhantes para produzir os comprimidos por compressão. Os comprimidos e as cápsulas podem ser produzidos sob a forma de produtos de libertação controlada para proporcionar a libertação contínua de medicação ao longo de um determinado período de horas. Os comprimidos por compressão podem ser revestidos por açúcar ou película para evitar quaisquer sabores desagradáveis e para proteger o comprimido da atmosfera, ou podem ser entericamente revestidos para uma desintegração selectiva no tracto gastrointestinal.

As formas de dosagem líquidas para administração oral podem conter corantes ou aromas para aumentar a aceitação do paciente.

No geral, a água, um óleo adequado, a dextrose aquosa (glicose) e soluções de açúcar associadas e glicóis como o propilenoglicol e polietilenoglicóis são veículos adequados para as soluções parentéricas. As soluções para - 184 - administração parentérica podem conter um sal hidrossolúvel do ingrediente activo, agentes estabilizantes adequados e, se necessário, substâncias tampão. Os agentes antioxidantes como o bissulfito de sódio, sulfito de sódio ou ácido ascórbico, sozinhos ou combinados, são agentes estabilizantes adequados. Também são usados o ácido cítrico e seus sais e EDTA de sódio. Alé' disso, as soluções parentéricas podem conter conservantes, como o cloreto de benzalcónio, metil- ou propilparabenos e clorobutanol. Veículos farmaceuticamente aceitáveis são descritos na obra Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing

Company, um texto de referência nesta área.

Formas de dosagem farmacêutica úteis representativas para administração dos compostos da presente invenção podem ser ilustradas da seguinte forma: Cápsulas

Pode ser preparado um grande número de unidades de cápsulas através do preenchimento de cápsulas de gelatina dura de duas partes convencionais com 100 miligramas do ingrediente activo em pó, 150 miligramas de lactose, 50 miligramas de celulose e 6 miligramas de estearatinho de magnésio. -185- Cápsulas de gelatina mole

Pode ser preparada uma mistura do ingrediente activo num óleo digerível como o óleo de soja, óleo de semente de algodoeiro ou azeite e injectada através de uma bomba de deslocamento positivo na gelatina para formar cápsulas de gelatina contendo 100 miligramas do ingrediente activo. As cápsulas deverão ser lavadas e secas.

Comprimidos

Os comprimidos podem ser preparados através dos procedimentos convencionais de forma que ; a. unidade de dosagem seja 100 miligramas de ingrediente activo, 0,2 miligramas de dióxido de silício coloidal, 5 miligramas de estearatinho de magnésio, 275 miligramas de celulose microcristalina, 11 miligramas de amido e 98,8 miligramas de lactose. Os revestimentos adequados podem ser aplicados de forma a aumentar a palatabilidade ou absorção retardada.

Injectável -186 -

Uma composição parentérica adequada para administração por injecção pode ser preparada agitando 1,5% por peso de ingrediente activo em 10% por volume de propilenoglicol e água. A solução deverá ser tornada isotónica com cloreto de sódio e esterilizada.

Suspensão

Uma suspensão aquosa pode ser prepaada para administração oral de forma que cada 5 ml contenham 100 mg de ingrediente activo finamente dividido, 200 mg de carboximetilcelulose sódica, 5 mg de benzoato de sódio, 1,0 g de solução de sorbitol, U.S.P. e 0,025 ml de vanilina.

Nos casos em que os compostos da presente invenção são combinados com outros agentes anticoagulantes, por exemplo, uma dosagem diária pode ser de cerca de 0,1 a 100 miligramas do composto de Fórmula I e cerca de 1 a 7,5 miligramas do segundo anticoagulante, por quilograma de peso corporal do paciente. Para a forma de dosagem de comprimidos, os compostos da presente invenção podem estar geralmente presentes numa quantidade de cerca de 5 a 10 miligramas por unidade de dosagem, e o segundo - 187 - anticoagulante numa quantidade de cerca de 1 e 5 miligramas por unidade de dosagem.

Nos casos em que são administrados dois ou mais dos segundos agentes terapêuticos com o composto dos exemplos, geralmente a quantidade de cada componente numa dosagem diária tipica e numa forma de dosagem tipica pode ser reduzida em relação à dosagem comum do agente quando administrado por si só, tendo em vista o efeito aditivo ou sinérgico dos agentes terapêuticos quando administrados em combinação.

Em especial quando proporcionada sob a forma de unidade de dosagem única, existe uma potencial interacção química entre os ingredientes activos combinados. Por este motivo, quando o composto dos exemplos e um segundo agente terapêutico são combinados numa unidade de dosagem única, estes são formulados de forma que, embora os ingredientes activos sejam combinados numa unidade de dosagem única, o contacto físico entre os ingredientes activos é minimizado (ou seja, reduzido). Por exemplo, um ingrediente activo pode ser revestido entericamente. Ao revestir entericamente um dos ingredientes activos, é possível não só minimizar o contacto entre os ingredientes activos combinados mas também é possível controlar a libertação de um desses - 188 - componentes no tracto gastrointestinal de forma que um destes componentes não é libertado no estômago mas sim libertado nos intestinos. Um dos ingredientes activos também pode ser revestido com um material que resulta numa libertação controlada ao longo do tracto gastrointestinal e também serve para minimizar o contacto físico entre os ingredientes activos combinados. Além disso, o componente de libertação prolongada pode ser adicionalmente revestido entericamente de forma que a libertação deste componente ocorra apenas no intestino. Ainda assim, uma outra abordagem envolve a formulação de um produto combinado no qual um componente é revestido com um polímero de libertação controlada e/ou entérica e o outro componente também é revestido com um polímero, tal como um grau de baixa viscosidade de hidroxipropilmetilcelulose (HPMC) ou outros materiais conhecidos na arte, para separar os componentes activos. 0 revestimento do polímero serva para formar uma barreira adicional à interacção com o outro componente.

Estas e outras formas de minimizar o contacto entre os componentes dos produtos combinados da presente invenção, sejam eles administrados numa forma de dosagem única ou administrados em formas separadas mas ao mesmo tempo e pela - 189 - mesma via, serão óbvios aos conhecedores da arte através da leitura da presente descrição.

Adicionalmente, alguns dos compostos descritos podem ser úteis como metabolitos de outros compostos. Assim, numa variante, os compostos podem ser úteis como um composto substancialmente puro, que pode também ser posteriormente incorporado numa composição farmacêutica, ou podem ser úteis como metabolito que é gerado após administração do pró-fármaco desse composto. Numa variante, um composto pode ser útil como metabolito sendo útil no tratamento das doenças supra descritas. 0 termo "substancialmente puro", conforme utilizado, inclui um composto com uma pureza superior a cerca de 90% do peso, incluindo cerca de 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 e 100% .

Como exemplo, um composto descrito pode ser substancialmente puro, tendo uma pureza superior a cerca de 90% (por peso), em que a percentagem remanescente inferior a 10% de material inclui outro metabolito do composto, um pró-fármaco do composto e/ou impurezas de reacção e/ou procesamento advindos da sua preparaçao. - 190 -

REFERENCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO A presente listagem de referências citadas pela requerente é apresentada meramente por razões de conveniência para o leitor. Não faz parte da patente de invenção europeia. Embora se tenha tomado todo o cuidado durante a compilação das referências, não é possível excluir a existência de erros ou omissões, pelos quais o IEP não assume nenhuma responsabilidade.

Patentes de invenção citadas na descrição • US 0069123 A, M. Xia [0006] • US 2006 A [0010] • WO 200613427 A2, P. Cornelius, RP Gladue, RS Sebastian [0008] • WO 110376 A, C. Abbadie, J. A. Lindia e H. Wang [0022] • WO 2004 A [0022] • WO 9946991 A, Alfredo Garzino-Demo [0024] • WO 2005021500 A [0028] [0041] [0095] [0105] [0135] [0142] [0156] [0165] [0173] [0184] [0201] [0202] • US 7163937 B [0041] [0184] • WO 20050215 [0202] • US 6361972B [0214] • US 6410266 B [0214]

Literatura não relacionada com patentes, citada na descrição • Charo; Rasonhoff. New Eng. J. Med., 2006, vol. 354, 610- 621 [0002][0005] - 191 - • Luster. New Eng. J. Med., 1998, vol.338, 436-445 [0002] [0003] [0027] • Rollins. Blood, 1997, vol.90, 909-928 [0002] • Horuc. Trends Pharm. Sei., 1994, vol. 15, 159-165 [0003] • Zlotnik; Oshie. Imunnity, 2000, vol.12, 121 [0003] • Ben Barruch et al. Cell, 1993, vol.72, 415-425 [0003] • Luster. New, Eng. J. Med. 1998, vol.338, 436-445 [0003] • Charro et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1994, vol.91, 2752-2756 [0003] • Combadiere et al. J. Biol. Chem., 1995, vol.270, 16491- 16494 [0003] • Power et al. J. Biol. Chem., 1995, vol.270, 19495-19500 [0003] • Sanson et al. J. Biochemistry, 1996, vol.35, 3362-3367 [0003] • Baba et al. J. Biol. Chem., 1997, vol.272, 14893-14898 [0003] • Yoshie et al. J. Leukoc. Biol., 1997, vol.62, 634-644 [0003] • Napolitano et al. J. Immunol., 1996, vol.157, 2759-2763 [0003] • Bonini et al. DNA and Cell Biol., 1997, vol.16, 1249-1256 [0003] • Schwelckert et al. J. Biol. Chem., 2000, vol.275, 90550 [0003] • Wells; Schwartz. Curr. Opin. Biotech., 1997, vol.8, 741- 748 [0004] • Z. Gao; W. A. Metz. Chem. Rev., 2003, vol.103, 3733 [0005] • P. H. Cárter. Current Opinion in Chemical Biology, 2002, vol. 6, 510 [0005] - 192 - • Trivedi et al. Ann. Reports Med. Chem., 2000, vol. 35, 191 [0005] • Saunders; Tarby. Drug Disc. Today, 1999, vol. 4, 80 [0005] • Premack; Schall. Nature Medicine, 1996, vol.2, 1174 [0005] • Bao Lu et al. J. Exp. Med., 19 98, vol. 187, 601 [0005][0012] • Landin Boring et al. J. Clin. Invest., 1997, vol. 100, 2552 [0005] • William A. Kuziel et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1997, vol.94, 12053 [0003] • Takao Kurihara et al. J. Exp. Med., 1997, vol.186, 1757 [0005] • M. Feria; F. Diaz-González. Exp. Opin. Ther. Patents, 2006, vol.16, 49 [0005] • J. Dawson; W. Militz; C. Wiessner. C. Exp. Opin. Ther.

Targets, 2003, vol. 7, 35 [0005] • Alisa Koch et al. J. Clin. Invest., 1992, vol. 90, 772- 779 [0006] • Sawsan Youssef et al. J. Clin. Invest., 2000, vol.10 6, 361 [0006] • Hiroomi Ogata et al. J. Pathol., 1997, vol.182, 106 [0006] • Ralph C. Schimmer et al. J. Immunol., 1998, vol.160, 1466 [0006] • Jiang-Hong Gong et al. J. Exp. Med., 1997, vol. 186, 131 [0006] • C. M. Brodmerkel et al. J. Immunol., 2005, vol. 175, 5370 [0006] [0010] • H. Bruhl et al. J. Immunol., 2004, vol.172, 890 [0006] -193 - • M.P. Quinones et al. J. Clin. Invest., 2004, vol.113, 856 [0006] • M.P. Quinones. J. Mol. Med., 2006, vol.84, 503 [0006] • Abdolreza Rezaie-Majd et al. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 2002, vol.22, 1194-1199 [0005] • Long Gu et al. Mol. Cell, 1998, vol. 2, 275 [0007] • Jennifa Gosling et al. J. Clin. Invest., 1999, vol.103, 773 [0007] • Landin Boring et al. Nature, 1998, vol.394, 894 [0007] • T.C. Dawson et al. Atherosclerosis, 1999, vol.143, 205 [0007] • W. Ni et al. Circulation, 2001, vol.103, 2096-2101 [0007] • J. Guo et al. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 2003, vol. 23, 447 [0007] • J. Guo et al. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 2005, vol. 25, 1014 [0007] • Eckel et al. Lancet, 2005, vol.365, 1415 [0008] • Chen. Pharmacological Research, 2006, vol.53, 469 [0008] • Neels ; Olefsky. J. Clin. Invest., 2006, vol.116, 33 [0008] • Danadona ; Aljada. Am. J. Cardiol., 2002, vol. 90, 27G- 33G [0008] • Pickup; Crook. Diabetologia, 1998, vol. 41, 1241 [0008] • Gerhardt. Mol. Cell. Endocrinology, 2001, vol.175, 81 [0008] • P. Sartipy; D. Loskutoff. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1999, vol.96, 6902 [0008] • S. Nomura et al. Clin. Exp. Immunol., 2000, vol. 121, 437 [0008] • J. M. Bruun et al. J. Clin. Endocrinol. Metab., 2005, vol. 90, 2282 [0008] - 194- • Sartipy ; Loskutoff. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 2003, vol.100, 7265 [0008] • H. Xu et al. J. Clin. Invest., 2003, vol.112, 1821 [0008] • Weisberg et al. J. Clin. Invest., 2003, vol.112, 1796 [0008] • H. Kanda et al. J. Clin. Invest., 2006, vol. 116, 1494 [0008] • N. Kamei et al. J. Biol. Chem, 2006, vol. 281, 26602 [0008] • F. Y. Chow et al. Diabetologia, 2007, vol. 50, 471 [0008] • C.L. Tsou et al. J. Clin. Invest., 2007, vol. 117, 902 [0008] • F. Tacke et al. J. Clin. Invest., 2007, vol.117, 185 [0008] • C. N. Lumeng et al. Diabetes, 2007, vol.56, 16 [0008] • C. N. Lumeng et al. J. Clin. Invest., 2007, vol.117, 175 [0008] • S. P. Weisberg et al. J. Clin. Invest., 2006, vol.116, 115 [0008] • A. Chen et al. Obes. Res., 2005, vol. 13, 1311 [0008] • E. Bush et al. Hypertension, 2000, vol. 36, 360 [0009] • M. Ishibashi et al. Circ. Res., 2004, vol. 94, 1203 [0009] • Carla Iarlori et al. J. Neuroimmunol., 2002, vol.123, 170-179 [0010] • J. Kennedy et al. J. Neuroimmunol., 1998, vol.92, 98 [0008] • C. N. Lumeng et al. J. Clin. Invest., 2007, vol.117, 175 [0010] • B. T. Fife et al. J. Exp. Med., 2000, vol.192, 899 [0010] • L. Izikson et al. J. Exp. Med., 2000, vol. 192, 1075 [0010] - 195 - • S. Gaupp et al. Am. J. Pathol., 2 003, vol. 162, 13 9 [0010] • Martine Reynaud-Gaubert et al. J. of Heart and Lung Transplant, 2002, vol. 21, 721-730 [0011] • John Belpiro et al. J. Clin. Invest., 2001, vol. 108, 547-556 [0011] • I. Lee et al. J. Immunol., 2003, vol.171, 6929 [0011] • R. Abdi et al. J. Immunol., 2004, vol.172, 767 [0011] • K. Horiguchi et al. J. Heart Lung Transplant, 2002, vol.21, 1090 [0011] • A. Saiura et al. Artherioscl. Thromb. Vascl Biol., 2004, vol.24, 1886 [0011] • H. Tatewaki et al. J. Vasc. Surg., 2007, vol. 45, 1236 [0011] • Jose-Angel Gonzalo et al. J. Exp. Med., 1998, vol. 188, 157 [0012] • Nicolas W. Lukacs et al. J. Immunol., 1997, vol. 185, 1371 [0013] • Claire M. Lloyd et al. J. Exp. Med., 1997, vol. 1371 [0011] • Gregory H. Tesch et al. J. Clin. Invest., 1999, vol. 103, 73 [0013] • G. Perez de Lema et al. J. Am. Soc. Neph., 2005, vol. 16, 3592 [0014] • S. Shimizu et al. Rheumatology (Oxford), 2004, vol. 43, 1121 [0014] • Gregory H. Tesch et al. J. Exp. Med., 1999, vol. 190, 1813 [0014] • H. Hasegawa et al. Arthritis & Rheumatism, 2003, vol. 48, 2555 [0014] - 196 - • S. J. Connor et al. Gut, 2004, vol. 53, 1287 [0015] • Pietro G. Andrés et al. J. Immunol., 2000, vol. 164, 6303 [0015] • H. Tokuyama et al. Int. Immunol., 2005, vol. 17, 1023 [0015] • W. I. Khan et al. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol., 2006, vol. 291, G803 [0015] • H. C. Reinecker et al. Gastroenterology, 1995, vol. 108, 40 [0016] • Michael C. Griítim et al. J. Leukoc. Biol., 1996, vol. 59, 804 [0016] • S. Karrer et al. J. Invest. Dermatol., 2005, vol. 124, 92 [0017] • T. Yamamoto; K. Nishioka. J, Invest. Dermatol., 2003, vol. 121, 510 [0017] • A.M. Ferreira et al. J. Invest. Dermatol., 2006, vol. 126, 1900 [0017] • T. Okuma et al. J. Pathol., 2004, vol. 204, 594 [0017] • M. Gharaee-Kermani et al. Cytokine, 2003, vol. 24, 266 [0017] • K. Kitagawa et al. Am. J. Pathol., 2004, vol. 165, 237 [0017] • T. Wada et al. J. Am. Soc. Nephrol., 2004, vol. 15, 940 [0017] • S. Hayashidani et al. Circulation, 2003, vol. 108, 2134 [0017] [0023] • S. Tsuruta et al. Int. J. Mol. Med., 2004, vol. 14, 837 [0017] • Michael L. Jones et al. J. Immunol., 1992, vol. 149, 2147 [0018] • M. J. Craig ; R. D. Loberg. Câncer Metastasis Rev., 2006, - 197- vol. 25, 611 [0019] • I. Conti ; B. Rollins. Seminars in Câncer Biology, 2004, vol. 14, 149 [0017] • R. Giles ; R. D. Loberg. Curr. Câncer Drug Targets, 2006, vol. 6, 659 [0019] • Rosalba Salcedo et al. Blood, 2000, vol. 96, 34-40 [0019] • Y. Lu et al. J. Cell Biochem, 2007, vol. 101, 676 [0019] • Y. Lu et al. Prostate, 2006, vol. 66, 1311 [0019] • Y. Lu et al. Câncer Res., 2007, vol. 67, 3646 [0019] • S. Tsuruta et al. Int. J. Mol. Med., 2004, vol. 14, 837 [0017] • F. Cipollone et al. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 2001, vol. 21, 327 [0020] • Merce Roque et al. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 2002, vol. 22, 554 [0020] • A. Schober et al. Circ. Res., 2004, vol. 95, 1125 [0020] • W. J. Kim et al. Biochem Biophys. Res. Commun., 2 0 03, vol. 310, 936 [0020] • K. Egashira et al. Circ. Res., 2002, vol. 90, 1167 [0020] • C. Horvath et al. Circ. Res., 2002, vol. 90, 488 [0020] • J. S. King et al. J. Neuroimmunol., 1994, vol. 56, 127 [0021] • Joan W. Berman et al. J. Immunol., 1996, vol. 156, 3017 [0021] • O. B. Dimitrijevic et al. Stroke, 2007, vol. 38, 1345 [0021] • P. M. Hughes et al. J. Cereb. Blood Flow Metab., 2002, vol. 22, 308 [0021] • Liu T.; van Rooijen N.; Tracey D. J. Pain, 2000, vol. 86, 25 [0022] • C. Abbadie et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 2003, vol. - 198 - 100, 7947 [0022] • N. G. Frangogiannis et al. Circulation, 2007, vol. 115, 584 [0023] • Mary E. Russell et al. 2 003, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, vol. 90, 6086 [0024] • Harry N. Antoniades et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1992, vol. 89, 5371 [0024] • M. Deleuran et al. J. Dermatol. Sei., 1996, vol. 13, 228 [0024] • R. Gillitzer et al. J. Invest. Dermatol., 1993, vol. 101, 127 [0024] • C. Vestergaard et al. Acta Derm. Venerol., 2004, vol. 84, 353 [0024] • P. Spagnolo et al. Am. J. Respir. Crit. Care Med., 2003, vol. 168, 1162 [0025] • B. J. Doranz et al. Cell, 1996, vol. 85, 1149 [0026] • Ruth I. Connor et al. J. Exp. Med., 1997, vol. 185, G21 [0026] • Michael W. Smith et al. Science, 1997, vol. 277, 959 [0026] • G. K. Dresser ; J. D. Spence ; D. G. Balley. Clin.

Pharmacokinet., 2000, vol. 38, 41-57 [0029] • Steven D. Young et al. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 1995, 2602-2605 [0084] • Remington's Pharmaceutical Sciences. Mack Publishing Company, 1985, 1418 [0085] • Yoshimura et al. J. Immunol., 1990, vol. 145, 292 [0185] • W. A. Catterall et al. J. Biol. Chem., 1981, vol. 256, 8922 [0191] • Weiner et al. J. Immunol. Methods, 1980, vol. 36, 89 [0205] - 199 - • Weiner et al. J. Immunol. Methods, 1990, vol. 36, 89-97 [0207] • Boyum et al. Scand. J. Clin. Lab. Invest., 1968, vol. 97 31 [0209]

Lisboa, 11/08/2010

Claims (14)

1. - 1 - Reivindicações 1. Composto seleccionado entre: (i) N-((1R, 2S,5R)-2-((3S)-3-((6-terc-butilpirimido[5,4- d] pirimidin-4-il)amino)-2-oxo-l-pirrolidinil)-5-(isopropil(metil)amino)ciclohexil)acetamida; N- ((IR,2S,5R)-5-(metilamino)-2-((3S)-2-oxo-3-((6-(trifluorometil)-4-quinazolinil)amino)-1-pirrolidinil)ciclohexil)acetamida; N- ((IR,2S,5R)-5-(isopropil(metil)amino)-2-((3S)-2-oxo-3-((6-(trifluorometil)-4-quinazolinil)amino) -1-pirrolidinil)ciclohexil)formamida; N- ((IR,2S,5R)-5-(dimetilamino)-2-((3S)-2-oxo-3-((6-(trifluorometil)-4-quinazolinil)amino)-1-pirrolidinil)ciclohexil)acetamida; N- {(3S-1-((IS,2R,4R)-2-acetamido-4-(isopropil(metil)amino)ciclohexil)-2-oxo-3-pirrolidinil)-6-terc-buti1-2-piridinacarboxamida; N- ((1R,2S,5R)-5-amino-2-((35)-2-oxo-3-((6-(trifluorometil)-4-quinazolinil)amino)-1-pirrolidinil)ciclohexil)propanamida; -2- 2-terc-butil-JV- ( (35) -1- ( (15, 25, 45) -4 (terc-butilamino) -2-(metanosulfonilamino)ciclohexil)-2-oxo-3-pirrolidinil)-4-pirimidinacarboxamida; 2-terc-butil-JV- ( (35) -1- ( (15, 25, 45) -4 (terc-butilamino) -2-(propionilamino)ciclohexil)-2-oxo-3-pirrolidinil)-4-pirimidinacarboxamida; N- ((15,25,55)-5-(terc-butilamino)-2-((35)-3-((6-terc-butilpirimido[5,4-d]pirimidin-4-il)amino)-2-oxo-l-pirrolidinil)ciclohexil)metanosulfonamida; N- ( ( (15, 2 5, 55) -5-metoxi-2- ( (35) -2-oxo-3- ( (6-(trifluorometil)-4-quinazolinil)amino)-1-pirrolidinil)ciclohexil)metil)acetamida; N- ((15,25,55)-5-(isopropilamino)-2-((35)-2-oxo-3-((6-(trifluorometil)-4-quinazolinil)amino)-1-pirrolidinil)ciclohexil)acetamida; N- ((15,2 5,45)-5-amino-2-((35)-2-oxo-3-((6-(trifluorometil)-4-quinazolinil)amino)-1-pirrolidinil)ciclohexil)acetamida; N- ((15,25,55)-5-(isopropil(metil)amino)-2-((35)-3-((1-oxido-6-(trifluorometil)-4-quinazolinil)amino)-2-oxo-l-pirrolidinil)ciclohexil)acetamida; -3- Ν- ((15,25,55)-5-(isopropilamino)-2-((35)-3-((l-oxido-6-(trifluorometil)-4-quinazolinil)amino)-2-oxo-l-pirrolidinil)ciclohexil)acetamida; e N-((15,25,55)-5-{terc-butilamino)-2-((35)-3-((1-oxido-6-(trifluorometil)-4-quinazolinil)amino)-2-oxo-l-pirrolidinil)ciclohexil)acetamida; ou (ii) um sal farmaceuticamente aceitável de (i).
2. 2. Composto da reivindicação 1, que é JV-( (15, 25, 55)-2- ((35)-3-((6-terc-butilpirimido[5,4-d]pirimidin-4-il)amino)-2-oxo-l-pirrolidinil)-5- (isopropil(metil)amino)ciclohexil)acetamida, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
3. 3. Composto da reivindicação l, que é N-((15,25,55)-5- (metilamino)-2-((35)-2-oxo-3-((6-(trifluorometil)-4-quinazolinil)amino-l-pirrolidinil)ciclohexil)acetamida, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
4. 4. Composto da reivindicação 1, que é N-((15,25,55)-5- (isopropil(metil)amino-2-((35)-2-oxo-3-((6- (trifluorometil)-4-quinazolinil)amino-1- -4- pirrolidinil)ciclohexil)formamida, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
5. 5. Composto da reivindicação 1, que é N-((IR, 2S,5R)-5- (dimetilamino)-2-((35)-2-oxo-3-((6-(trifluorometil)-4-quinazolinil)amino-l-pirrolidinil)ciclohexil)acetamida, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
6. 6. Composto da reivindicação 1, que é IV-((3S)-1-((15,2R,4R)-2-acetamido-4-(isopropil(metil)amino)-ciclohexil)-2-oxo-3-pirrolidinil)-6-terc-butil-2-piridinacarboxamida, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
7. 7. Composto da reivindicação 1, que é N-((IR,25,5R)-5- amino-2-((35)-2-oxo-3-((6-(trifluorometil) -4-quinazolinil)amino)-1-pirrolidinil)-ciclohexil)propanamida, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
8. 8. Composto da reivindicação 1, que é 2-terc-butil-IV- ( (35) -1-((15,2R,4R)-4-(terc-butilamino)-2- (metanosulfonilamino)ciclohexil)-2-oxo-3-pirrolidinil)-4- -5- pirimidinocarboxamida, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
9. 9. Composto da reivindicação 1, que é 2-terc-butil-N- ((3S)-1-((15,2R,4R)-4-(terc-butilamino)-2- (propionilamino)ciclohexil)-2-oxo-3-pirrolidinil)-4-pirimidinocarboxamida, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
10. 10. Composto da reivindicação 1, que é N- ((IR,25,5R)-5- (terc-butilamino)-2-((35)-3-((6-terc-butilpirimido[5,4- d] pirimidin-4-il)amino)-2-oxo-l- pirrolidinil)ciclohexil)metanosulfonamida, N-(((15, 25,5R)-5-metoxi-2-((35)-2-oxo-3-((6-(trifluorometil)-4-quinazolinil)amino)-1- pirrolidinil)ciclohexil)metil)acetamida ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
11. 11. Composição farmacêutica que inclui um composto de qualquer uma das reivindicações 1 a 10 e um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável. -6-
12. 12. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10 para utilização em terapêutica.
13. 13. Composto de acordo com a reivindicação 12 para utilização no tratamento de uma doença seleccionada entre a diabetes, obesidade, síndrome metabólico, acidente vascular cerebral, dor neuropática, cardiomiopatia isquémica, psoríase, hipertensão, esclerodermia, osteoartrite, aneurisma, febre, doença cardiovascular, doença de Crohn, insuficiência cardíaca congestiva, doenças auto-imunes, infecção por HIV, demências associadas ao HIV, psoríase, fibrose pulmonar idiopática, arterioesclerose de transplante, traumatismos cranianos física ou quimicamente induzidos, doença inflamatória do intestino, alveolite, colite, lúpus eritematoso sistémico, nefrite induzida por soro nefrotóxico, glomerulonefrite, asma, esclerose múltipla, aterosclerose, vasculite, placas vulneráveis, artrite reumatóide, restenose, hiperplasia da neointíma venosa, hiperplasia da neointíma de diálise-enxerto, hiperplasia da intima por shunt artério-venoso, transplante de órgão, nefropatia crónica do enxerto e cancro. -7-
14. 14. Composto de acordo com a reivindicação 12 para utilização no tratamento de uma doença seleccionada entre a diabetes, obesidade, doença de Crohn, lúpus sistémico eritematoso, glomerulonefrite, esclerose múltipla, aterosclerose, restenose e transplante de órgãos, preferivelmente esclerose múltipla, aterosclerose, doença de Crohn e diabetes. Lisboa, 11/08/2010 - 1/ 1 - FIG. 1