CN111789950A - 调控恐惧记忆巩固的方法和药物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供了A1腺苷受体激动剂用于调控恐惧记忆巩固的方法和药物组合物。本发明还提供了用所述方法或药物组合物预防和/或治疗恐惧记忆及其相关疾病的方法。

Description

调控恐惧记忆巩固的方法和药物组合物

技术领域

本发明涉及疾病治疗和药物领域。具体的，本发明涉及调控哺乳动物的恐惧记忆巩固的方法和药物组合物，以及其用于预防和治疗恐惧记忆和其相关疾病的应用。

背景技术

学习是获得信息和知识的过程，记忆是对所学信息的保存过程。短时程记忆的内容可通过记忆巩固的过程转变为长期乃至永久存储的形式，然而记忆巩固过程不一定需要短时程记忆作为中介。长时程记忆和短时程记忆可能同时平行存在(Mark F.Bear等，Neuroscience:Exploring the Brain，2^nd Edition,2001)。

记忆巩固过程记忆巩固是新记忆在获得后逐渐稳定的过程。在这个过程会发生分子和细胞水平的加工，使细胞内信号级联反应发生，激活转录因子导致基因表达和蛋白质合成，增强海马和其它脑区的突触可塑性(长时程增强，LTP)和突触联系，这个过程也称为突触巩固(synaptic consolidation)(Mednick,S.C.,et al.,Trends Neurosci.2011)。LTP广泛被认为是学习记忆的分子机制。在离体脑片、麻醉以及自由活动的动物上的研究表明LTP可以分为两种时相，非依赖于蛋白质合成的早期LTP和依赖于蛋白质合成晚期LTP。

创伤性记忆会导致不适当的行为反应和严重的生理或心理伤害(Izquierdo,I.,et al.,Physiol.Rev.,2016)。在人类中，创伤性恐惧记忆(traumatic fear memory)会引起多种精神疾病，包括精神分裂症(schizophrenia)、创伤后应激综合征(posttraumaticstress disorder，PTSD)，焦虑症(anxiety disorder)，恐惧症(phobias)和抑郁症(depression)等(Luthi,A.，et al.,Nat.Neurosci.,2014；Garfinkel,S.,N.et al.,J.Neurosci.,.2014)。恐惧和应激相关疾病的估计终生患病率约为29％(Kessler,R.C.,etal.,Arch.Gen.Psychiatry.,2005)。恐惧记忆消除(fear extinction)，也称之为暴露治疗(exposure therapy)是一种降低恐惧的行为学方法。但是暴露治疗是一种依赖于场景线索的学习，不能打断和消除最初产生的恐惧记忆。研究表明，经历暴露治疗的患者再次暴露在与产生创伤时相似或相同的场景中，恐惧记忆会自发恢复(spontaneously recover)或重新产生(renew)(Britton,J.C.,et al.,Depress.Anxiety.,2011；Tovote,P.,et al.,Nat.Rev.Neurosci.,2015)。因此找到一种能特异打断或阻止恐惧记忆形成，或是降低或消除已经形成的恐惧记忆的新策略非常必要。

本领域还需要有效的对恐惧记忆的形成进行控制，并且不产生或较少对其它记忆产生影响的更安全的方法和药物，由此可以进一步用于预防乃至治疗恐惧记忆或其相关疾病例如焦虑症。

发明内容

本发明首次发现海马CA1的星形胶质细胞的激活在调控恐惧记忆的记忆巩固，乃至在降低恐惧记忆和预防和/或治疗恐惧记忆相关疾病如焦虑症中具有重要作用。发明人还进一步发现了星形胶质细胞的激活通过ATP的降解产物腺苷和腺苷A1受体降低恐惧记忆，并发现通过局部注射或腹腔注射腺苷A1受体激动剂均可降低恐惧记忆及其相关疾病例如焦虑症。本发明由此提供了通过给予腺苷A1受体激动剂来调控恐惧记忆的记忆巩固乃至恐惧记忆的形成，从而预防和治疗恐惧记忆或其相关疾病例如焦虑症的方法和药物。

具体的，本发明提供了调控哺乳动物的恐惧记忆的记忆巩固的方法，其包括向所述对象施用腺苷A1受体激动剂，从而抑制事件(如恐惧刺激)后在哺乳动物中的恐惧记忆的形成的步骤。在本发明的其中一个方面，所述方法可以预防或治疗哺乳动物的恐惧记忆或其相关疾病，例如焦虑症。

相应的，本发明提供了腺苷A1受体激动剂在用于制备调控哺乳动物的恐惧记忆的记忆巩固的药物中的用途。其中所述腺苷A1受体激动剂抑制事件(如恐惧刺激)后在哺乳动物中的恐惧记忆的形成。在本发明的其中一个方面，所述药物可用于预防或治疗哺乳动物的恐惧记忆或其相关疾病，例如焦虑症。

本发明还提供了调控哺乳动物的恐惧记忆的记忆巩固的药物组合物，其含有腺苷A1受体激动剂，其可影响事件(如恐惧刺激)在哺乳动物中引起的恐惧记忆的形成。在本发明的其中又一个方面，所述药物组合物可以预防和/或治疗哺乳动物的恐惧记忆或恐惧记忆相关疾病，例如焦虑症。

在本发明的其中一个方面本发明提供了预防和/或治疗对象中的恐惧记忆或其相关疾病的方法，其包括向所述对象施用腺苷A1受体激动剂。

本发明还提供了预防和/或治疗恐惧记忆或其相关疾病的药物组合物，其包含腺苷A1受体激动剂。

需要本文所述的方法和药物(药物组合物)的对象可以是哺乳动物，包括人或者非人灵长类如猴。哺乳动物还可以是其它动物，例如大鼠、小鼠、兔、猪、狗等。所述哺乳动物可以是家养动物，例如猫或者狗。

腺苷受体，即P1型嘌呤受体，广泛表达在胶质和神经元上。腺苷受体是G蛋白偶联受体(G-protein-coupled receptor)，可分为A1，A2和A3亚型，参与多种生理及病理过程。A1受体是大脑中主要的亚型。在中枢神经系统A1受体介导的是抑制性的反应，激活A1受体后会抑制下游腺苷酸环化酶活性，调控兴奋性递质释放，降低神经元兴奋性。在脑缺血保护，学习记忆作用有重要作用。A2A受体在神经系统中主要是介导兴奋性的反应，激活腺苷酸环化酶，提高胞内CAMP水平，激活PKA信号通路。

腺苷A1受体激动剂包括能够在对腺苷A1受体起活化作用的化合物、复合物或混合物，以及在活化腺苷A1受体的方法(含外科手术方法)中使用的制剂等。所述试剂包括小分子化合物或复合物，或是蛋白、核酸等大分子活性成分，例如与腺苷A1受体结合的天然或人工合成的蛋白，或是影响这些蛋白的表达水平的核酸等。

腺苷A1受体激动剂可对所有腺苷受体(A2A、A2B、A3)具有广泛的作用，或选择性针对A1受体。增加腺苷A1受体兴奋性的试剂包含特异性腺苷A1受体激动剂或非特异性腺苷A1受体激动剂。在本发明说明书中所指的腺苷A1受体激动剂，包括诸如腺苷的非选择性腺苷A1受体激动剂，以及诸如ADAC和2-氯-N6-环戊基腺苷(CCPA)等的选择性腺苷A1受体激动剂。

在本发明的其中一个方面，所述方法和药物组合物中使用的腺苷A1受体激动剂是选择性腺苷A1受体激动剂。例如为N6-环戊基腺苷(CPA)、2-氯-N6-环戊基腺苷(CCPA)、([1S-[la,2b,3b,4a(S*)]]-4-[7-[[1-(3-氯-2-噻吩基)甲基]丙基]氨基]-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基]-N-乙基-2,3-二羟基环戊烷甲酰胺)(AMP579)，N-[R-(2-苯并噻唑基)硫基-2-丙基]-2-氯腺苷(NNC-21-0136)、N-[(1S，反式)-2-羟基环戊基]腺苷(GR79236)、N6-[3-(R)-四氢呋喃]-腺苷(CVT-510，Tecadeonson)、N6-环己基-2-0-甲基腺苷(SDZWAG994)、N6-环戊基-N5'-乙基腺苷-5'-尿酰胺(Selodenoson，赛罗地松)、Capadenoson(BAY68-4986)、(±)-5'-Chloro-5'-deoxy-ENBA、R-苯异丙基腺苷(R(-)N6-(2-phenylisopropyl)adenosine,R-PIA))、Neladenoson dalanate、N6-(2-羟乙基)腺苷(N6-(2-hydroxyethyl)adenosine，HEA)、腺苷同类物(N6-Cyclohexyladenosine，CHA)、WS090501。优选的，在本发明的方法和药物组合物中使用的选择性腺苷A1受体激动剂是N6-环戊基腺苷(CPA)或2-氯-N6-环戊基腺苷(CCPA)。

在本发明的其中另一个方面，所述方法和药物组合物中使用的腺苷A1受体激动剂是非选择性腺苷A1受体激动剂。例如为腺苷或腺苷类似物。优选的，在本发明的方法和药物组合物中使用的非选择性腺苷A1受体激动剂是5’-N-乙基酰胺基腺苷(NECA)、2-氯腺苷(2-CADO)或CI-947。

在本发明中，恐惧记忆特别包括创伤性恐惧记忆(traumatic fear memory)。恐惧记忆相关疾病是指恐惧记忆引起的各种精神疾病，其包括精神分裂症(schizophrenia)、创伤后应激综合征(posttraumatic stress disorder，PTSD)，焦虑症(anxiety disorder)，恐惧症(phobias)和抑郁症(depression)等。

在本发明中，恐惧记忆可以是在不同的脑区介导的恐惧记忆，特别可以指“海马CA1介导的恐惧记忆”。本申请的发明人发现并证明了海马CA1的星形胶质细胞的活性在恐惧记忆及焦虑症形成中具有重要作用：星形胶质细胞激活能持续显著降低恐惧记忆及恐惧引起的焦虑，而不影响新记忆的形成。另外，发明人发现星形胶质细胞激活是通过增加腺苷A1受体参与的通道的活性来达到降低恐惧记忆。

本发明的方法被证明能更有效地作用在恐惧记忆的巩固(consolidation)阶段。当大脑获得外界信息后形成短时记忆(STM)，当短时记忆进入长时程记忆(LTM)后，信息被强化和整合，并存储在特定脑区后变得稳固。这即为记忆的巩固阶段。记忆的再巩固是指在经历类似的诱导下，巩固的记忆被再次激活和修改，原先稳定的记忆变得脆弱易变；再激活的记忆被再次稳固保存的过程。

记忆巩固(memory consolidation)是新记忆在获得后逐渐稳定的过程。在这个过程会发生分子和细胞水平的加工，使细胞内信号级联反应发生，激活转录因子导致基因表达和蛋白质合成，增强海马和其它脑区的突触可塑性(长时程增强，LTP)和突触联系，这个过程也称为突触巩固(synaptic consolidation)，一般发生在记忆获取后6小时内(Mednick,S.C.,et al.,Trends Neurosci.2011)。LTP广泛被认为是学习记忆的分子机制。在离体脑片、麻醉以及自由活动的动物上的研究表明LTP可以分为两种时相，非依赖于蛋白质合成的早期LTP，大概持续2小时，和依赖于蛋白质合成晚期LTP。随着LTP诱导后时间的延长，比如1-2小时后进行药物处理或其它干预，很难影响LTP维持(Fujii.,et al.,BrainResearch.1991；Abraham,W.C.,et al.,Neurobiol.Learn.Mem.2008；)。动物行为学的研究表明当干预发生在学习后相对较短的时间内(比如1小时)就比较容易阻断记忆形成，而如果发生在学习后较长的时间内(比如大于6小时)，就不容易干扰记忆形成(Mednick,S.C.,et al.,Trends Neurosci.2011；Dudai,Y.,Rev.Psychol.2004)。因此一旦LTP或记忆进入蛋白质合成依赖的阶段，记忆由于被巩固而很难被擦除，因此应该在synapticconsolidation发生的前期采取干预措施阻断恐惧记忆形成。

本发明的方法可用于预防和治疗恐惧记忆或其相关疾病。在特定的导致恐惧记忆的事件发生后的一定时间窗以内给予干预就能显著阻断和降低这个事件带来的恐惧记忆和相关的焦虑，不会复发。本发明的方法因此适合在暴露于恐惧刺激的约6小时内被施用，优选在暴露于恐惧刺激的约2小时内被施用。

在本发明的其中另一个方面，本发明的方法或药物组合物特别适用于紧急预防和治疗恐惧记忆或其相关疾病。本发明的方法或药物组合物可用于紧急处理，例如在经历偶发的意外事件或者是突然的群体性伤害事件后的较短时间内对经历者的预防性处理。在本发明的其中另一个方面，本发明适用于预防人群，特别是恐惧易感人群(例如俗称“胆小”的人群)在经历一般引发恐惧的事件后获得恐惧记忆乃至发展为相关疾病例如焦虑症等。

在本发明的其中一个方面，本发明的治疗恐惧记忆或其相关疾病的方法和药物组合物适合用于在其它治疗恐惧记忆方法和药物不起效的患者中使用。本申请的发明人首次发现并证明了海马，特别是海马CA1的星形胶质细胞在恐惧记忆中具有重要作用，因此提供了通过刺激海马CA1的星形胶质细胞，或是通过给予腺苷A1受体激动剂来治疗(抑制)恐惧记忆或其相关疾病的方法和药物。这是本领域已知的治疗恐惧记忆或其相关疾病的机制和药物未能针对的病理机制和进行治疗的脑部靶组织或其分子水平上的靶目标。

在本发明的一个实施方式中，腺苷A1受体激动剂可经全身施用。腺苷A1受体激动剂可经腹膜内、静脉内、口服、肌肉内或皮下施用以达到该全身效果。最合适的全身递送途径至少部分依赖于所选的腺苷A1受体激动剂的药理学性质。在更优选的实施方式中，腺苷A1受体激动剂的用量为0.05-50mg/kg。

如果需要，腺苷A1受体激动剂可被配制用于局部施用至脑部，特别是海马区上。例如，制备为通过套管局部注射的制剂。局部制剂的优点为可以避免任何可能的药物全身性副作用。

在本发明的其中一个方面，本发明的治疗和预防恐惧记忆及其相关疾病的方法和本发明的治疗和预防恐惧记忆及其相关疾病的药物(药物组合物)中，所述方法、药物或药物组合物为在海马区特别是海马CA1中局部起效，即为施用在海马区特别是海马CA1的方法和药物。对于用于神经组织的药物，特别是脑部神经组织，例如海马来说，将药物的作用限定在目标组织是有益的。用于局部在海马中给药对治疗方法和制备药物都是限制性的技术特征。用于海马区特别是海马CA1的方法或药物需要考虑该方法或药物是否能够在海马区特别是海马CA1发挥药物的有效性，包括药物是否能到达海马区特别是海马CA1，以及在海马区特别是海马CA1中是否能达到起效的浓度等。在本发明中，所述药物或药物组合物为在海马区特别是海马CA1局部给药的剂型。可以通过局部给药的方式来达到将药物作用限定在目标组织，例如通过将药物制成可通过套管植入海马区特别是海马CA1局部给药的剂型。又例如，将药物制成植入组织后缓释的剂型等。另外还可将上述药物制成组织特异性的靶向药物递送系统的形式。例如可以通过将腺苷A1受体激动剂包裹在海马组织靶向性的外泌体中。

本发明提供的药物组合物中的活性成分为腺苷A1受体激动剂。尽管适用于治疗的本发明的药物组合物中的活性成分可以以原料化合物的形式给药，但优选将活性成分，任选地以生理上可接受的盐的形式，与一种或多种佐剂、赋形剂、载体、缓冲剂、稀释剂和/或其它常规的药物辅料一起引入药物组合物。

可以通过任意便利的适合于期望疗法的途径给予本发明的药物组合物。优选的给药途径包括口服给药，特别是以片剂、胶囊、锭剂、散剂和液体形式；和胃肠外给药，特别是皮肤、皮下、肌内和静脉内注射。本发明的药物组合物可以由本领域技术人员通过使用适合于期望制剂的标准方法和常规技术制备。如果需要，则可以使用适合于使活性成分缓释的组合物。

本发明的药物组合物可以是那些适合于口服、直肠、支气管、鼻、肺、局部(包括颊和舌下)、透皮、阴道或肠胃外(包括皮肤、皮下、肌内、腹膜内、静脉内、动脉内、脑内、眼内注射或输注)给药的药物组合物，或那些适合于通过吸入或吹入给药(包括粉末和液体气雾剂给药)或适合于通过缓释系统给药的形式的药物组合物。适合的缓释系统的实例包括含有本发明化合物的固体疏水性聚合物的半渗透基质，该基质可以是成形的制品形式，例如薄膜或微囊。

因此可将本发明的药物组合物中的活性成分与常规的佐剂、载体或稀释剂一起制成药物组合物及其单位剂量的形式。这样的形式包括固体、并尤其是片剂、填充胶囊、散剂和微丸的形式，以及液体、尤其是水溶液或非水溶液、混悬剂、乳剂、酏剂和填充上述形式的胶囊，所有这些形式均用于口服，用于直肠给药的栓剂、以及用于胃肠外的无菌可注射溶液。这样的药物组合物及其单位剂型可包括常规比例的常规成分，含有或不含另外的活性化合物或成分，并且这样的单位剂型可含有与所需每日应用剂量范围相当的任何适合的有效量的活性成分。

为从本发明药物组合物中的活性成分制备药物组合物，药学上可接受的载体可以是固体或者液体。固体形式的制剂包括散剂、片剂、丸剂、胶囊、扁囊剂、栓剂以及可分散的颗粒剂。固体载体可以是一种或多种还能用作稀释剂、矫味剂、增溶剂、润滑剂、悬浮剂、粘合剂、防腐剂、片剂崩解剂或包囊材料的物质。

需要时，可以应用适合提供活性成分缓释的组合物。

药物制剂优选为单位剂型。这类形式中，制剂被细分为含有适量活性组分的单位剂量。单位剂型可以是包装的制剂，该包装含有离散量的制剂，如包装的片剂、胶囊，以及小瓶或安瓿中的粉末。此外，单位剂型可以是胶囊、片剂、扁囊剂或锭剂本身，或者可以是适合数量的任何这些剂型的包装形式。

治疗有效剂量意指缓解症状或病况的活性成分的量。治疗功效和毒性，例如ED50和LD50，可以通过在细胞培养物或实验动物中的标准药理学程序而测定。治疗性和毒性效果之间的剂量比例是治疗指数，其可以通过LD50/ED50的比例而表达。

给予的剂量当然必须针对所治疗的个体的年龄、体重和病症，以及给药途径、剂型及给药方案，以及期望的结果而小心地调整，且确切的剂量当然应该由医师决定。

实际的剂量取决于所治疗疾病的性质及严重程度、确切的给药方式和给药剂型，且在医师的判断范围之内，可以根据本发明具体情况通过递增剂量而改变，以产生期望的治疗效果。

在本发明的其中一个方面，本发明的方法和药物组合物中，腺苷A1受体激动剂经全身施用。其剂量为约0.01-20mg/kg，优选为约0.05-5mg/kg，更优选为约0.01-1mg/kg。

在本发明的其中另一个方面，本发明的方法和药物组合物中，腺苷A1受体激动剂经局部施用至海马上，特别是施用至海马CA1上。其剂量为约0.001-0.1mg/kg，优选为约0.005-0.05mg/kg，更优选为约0.01mg/kg。

在本发明的其中另一个方面，在本发明提供的腺苷A1受体激动剂在用于制备调控哺乳动物的恐惧记忆的记忆巩固的药物中的用途中，其中所述药物制备为腺苷A1受体激动剂经全身施用的剂型。优选的，所述药物的剂量为约0.01-20mg/kg，更优选为约0.05-5mg/kg，例如为约0.01-1mg/kg。

在本发明的其中另一个方面，在本发明提供的腺苷A1受体激动剂在用于制备调控哺乳动物的恐惧记忆的记忆巩固的药物中的用途中，所述药物制备为所述腺苷A1受体激动剂为局部施用的剂型。例如局部施用至海马上，特别是施用至海马CA1上。优选的，所述药物的剂量为约0.001-0.1mg/kg，更优选为约0.005-0.05mg/kg，例如为约0.01mg/kg。

在本发明的其中另一个方面，在本发明提供的腺苷A1受体激动剂在用于制备调控哺乳动物的恐惧记忆的记忆巩固的药物中的用途中，所述药物为紧急药物组合物。

附图说明

图1.光遗传学激活海马CA1的星形胶质细胞降低恐惧记忆和恐惧相关的焦虑。a,b大鼠海马CA1光纤植入示意图，白色柱子指光纤植入位置，虚线下方指CA1位置。c条件恐惧、光激活范式以及记忆、旷场测试的实验设计和流程。因为实验想探究在记忆巩固阶段光激活星形胶质细胞对恐惧记忆的影响，所以在条件恐惧后立即光激活星形胶质细胞。d在条件恐惧训练中，对照组和光激活组的大鼠有相似freezing水平，表明具有相似的学习能力。e,在场景恐惧记忆测试中，条件恐惧训练后立即光激活星形胶质细胞组大鼠的freezing水平显著降低，表明光激活星形胶质细胞显著降低场景恐惧记忆。f在线索恐惧记忆测试中，光激活星形胶质细胞组大鼠的freezing水平与对照组相似，表明光激活星形胶质细胞不影响线索记忆。g代表性热图显示对照组(没有条件恐惧训练)、条件恐惧训练组、条件恐惧训练后光激活星形胶质细胞组的大鼠在旷场中的运动轨迹。h,柱状图显示，和对照组相比，条件恐惧训练诱发出焦虑表型；条件恐惧训练后光激活星形胶质细胞有效逆转焦虑表型：显著增加在旷场中的运动距离(h)和旷场中央的探索时间(i)。所有数据均表示为平均值±SEM。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。

图2光激活星形胶质细胞对场景恐惧记忆具有长期的降低效应并且不影响新记忆形成。a条件恐惧训练、光激活范式以及记忆测试的实验设计和流程。b在场景恐惧测试中，条件恐惧训练后立即光激活星形胶质细胞组大鼠的freezing水平显著降低，可以持续到光激活后的26天，表明光激活星形胶质细胞持续并显著降低场景恐惧记忆。c在条件恐惧训练中，再次进行条件恐惧训练的光激活组大鼠与首次进行条件恐惧训练的对照组大鼠的freezing水平相似，表明具有相似的学习能力，也提示星形胶质细胞激活不影响新的学习。d在场景恐惧记忆测试中，再次条件恐惧训练的光激活组大鼠与对照组大鼠的freezing水平相似，表明具有相似的恐惧记忆水平，也提示星形胶质细胞激活不影响新记忆形成。

图3.在一定时间窗内光激活星形胶质细胞可显著降低场景恐惧记忆。a,d,g条件恐惧训练、光激活范式以及记忆测试的实验设计和流程。b,e,h在条件恐惧训练中，对照组和光激活组的大鼠有相似freezing水平，表明具有相似的学习能力。c在条件恐惧训练后1小时光激活星形胶质细胞，大鼠freezing水平显著降低，表明恐惧记忆显著降低。f,i在条件恐惧训练后2或3小时光激活星形胶质细胞，大鼠freezing水平和对照组相似，表明对恐惧记忆没有影响。

图4腺苷及腺苷A1受体激活介导场景恐惧记忆降低。a大鼠海马CA1双侧套管植入示意图.b条件恐惧训练、药物注射以及记忆测试的实验设计和流程.c-e在条件恐惧训练中，对照组(溶剂注射)和药物注射组的大鼠有相似的学习能力。f局部双侧注射ATPrS(2mM,9mM,1μl/每侧)和MesADP(5mM,1μl/每侧)组的大鼠和对照组大鼠(注射对应的溶剂)的freezing水平相似，表明ATPrS和MesADP不影响场景恐惧记忆.g局部双侧注射NECA(2mM,1μl/每侧)和CCPA(5mM,1μl/每侧)组的大鼠freezing水平显著降低，表明场景恐惧记忆显著降低.h局部双侧注射CGS 21680(5mM,1μl/每侧)组的大鼠freezing水平和对照组相似，表明CGS 21680不影响场景恐惧记忆。

图5海马CA1脑区局部双侧注射NECA,CCPA不影响动物自发运动。a药物注射和旷场测试的实验流程图。b,d脑区局部双侧注射NECA(2mM,1μl/每侧),CCPA(5mM,1μl/每侧)不影响动物在旷场中的运动距离。c,e脑区局部双侧注射NECA,CCPA不影响动物在旷场中央的探索时间。

图6腹腔注射腺苷A1受体激动剂显著降低恐惧记忆和焦虑。a条件恐惧训练、药物注射以及记忆测试的实验设计和流程图。在条件恐惧后立即注射药物，并分别在第2天和第3天进行场景恐惧记忆测试。b-e在场景恐惧测试中，对照组(溶剂注射)和药物注射组的大鼠有相似的freezing水平，表明动物学习能力相似。f腹腔注射低剂量CCPA(0.03mg/kg)组大鼠与对照组大鼠的freezing水平相似，表明对恐惧记忆没有影响。g-i腹腔注射高剂量的CCPA(0.1/0.3/1mg/kg)组大鼠的freezing水平显著降低，表明恐惧记忆显著降低.j,m代表性热图显示对照组(没有条件恐惧训练)、条件恐惧训练组的大鼠在注射溶剂或药物后3小时和24小时在旷场中的动轨迹。k-o和对照组相比，经过条件恐惧训练的大鼠在旷场中的运动距离和旷场中央的探索时间显著降低，诱发出焦虑表型，条件恐惧训练后腹腔注射腺苷A1受体激动剂CCPA(0.1mg/kg)有效逆转焦虑表型：显著增加在旷场中的运动距离和旷场中央的探索时间。

图7腹腔注射低剂量CCPA不影响动物的自发运动。a代表性热图显示注射不同剂量CCPA(0.1/0.3/1mg/kg)后大鼠在旷场中的运动轨迹。b-e低剂量CCPA(0.1mg/kg)不影响动物的自发运动，高剂量(0.3/1mg/kg)显著降低动物的运动距离，但是分别在注射后5小时或24小时后恢复到正常水平。

具体实施方式

下面将结合实施例进一步说明本发明的实质内容和有益效果，该实施例仅用于说明本发明而非对本发明的限制。

实施例1材料和方法

实验方法和材料

动物材料

雄性GFAP-ChR2-EYFP SD大鼠(8-12周龄)，野生型SD大鼠(8-12周龄)。GFAP-ChR2-EYFP大鼠是中国科学院神经科学研究所制作的。大鼠4-5只/笼，能够自由摄取水和食物，在12小时的明暗周期(7点-19点有光)环境下饲养。手术后的大鼠单笼饲养。所有的动物实验经过浙江大学动物保护和使用委员会的批准。

立体定位手术埋置光纤套管

大鼠腹腔注射戊巴比妥钠(1％,wt/vol)麻醉后固定在立体定位仪上。手术过程中用加热垫控制体温，使体温保持稳定。用眼科剪剪开头皮。用颅骨钻在目标位点钻孔。在海马CA1脑区双侧(前后距离bregma：3.75mm(AP),左右旁开±2.46mm(ML),颅骨表面垂直往下-2.63mm(DV))埋置光纤套管(core diameter 200μm,NA 0.37,Newdoon,China)。光纤套管通过光纤跳线与激光器连接(Newdoon,China)。每次实验前用光功率计(LP1,sanwa,Japan)测量光纤尖端的输出功率。

立体定位手术埋置给药套管

对于药理实验，两个给药套管(RWD Life Science,China)分别埋置在双侧海马CA1(前后距离bregma：3.75mm(AP),左右旁开±2.46mm(ML),颅骨表面往下-2.63mm(DV))。光纤和给药套管用牙科水泥固定在颅骨表面。待牙科水泥完全凝固后，在套管中插入与套管等长的内芯，并拧紧螺帽以防止内芯脱落。手术后动物恢复7天开始行为学测试。实验结束后，组织学鉴定光纤和套管的位置。排除光纤和套管位置不正确的动物。

条件恐惧实验

条件恐惧实验是在一个25×25×25cm的恐惧箱(Panlab Harvard Apparatus,Spain)内完成。条件恐惧实验共包含3个阶段：条件恐惧训练(fear conditioning)，海马依赖的场景恐惧测试(hippocampus-dependent contextual fear test)(Kim,J.J et al.,Science 256,675-677,1992)和非海马依赖的线索恐惧测试(hippocampus-independentcued fear test)(Phillips,R.G.et al.,Behav.Neurosci.106,274-285,1992)。啮齿类动物在恐惧时会表现出特有的不动反应。如果动物不动时间超过2秒，就定义为僵立(freezing)。在实验开始前3天，将动物放在实验环境中，并每天进行一次handling处理。实验第一天，条件恐惧箱用70％酒精擦拭，箱子含有不锈钢地板格栅可用于传送电击。把大鼠轻轻放入箱内适应2分钟并记录这期间的基本freezing水平。接着给予一个30秒的声音刺激(2kHz,85dB)，当声音持续到第29秒时给予大鼠2秒的足部电击(0.6mA)，声音和电击同时结束。一共给予3次声音-电击配对训练，每次间隔60秒。在最后一次电击结束后大鼠在训练箱内停留90秒，然后放回鼠笼。条件恐惧训练一共持续7分钟，整个过程是在相对黑暗的箱内完成。条件恐惧训练结束24小时后，进行场景恐惧记忆测试，将大鼠放在同一个训练箱内5分钟，检测其freezing时间。随后2小时，进行线索恐惧记忆测试。线索恐惧测试是在一个较明亮的，环境和气味不同于训练箱的箱内进行，用1％的乙酸擦拭。将大鼠放入适应1分钟后，给予3次30秒的声音刺激(2kHz,85dB)，每次声音刺激间隔30秒，记录声音刺激诱发的freezing水平。整个记录过程是用商业软件自动记录(FREEZING,Panlab HarvardApparatus,Spain)。恐惧的水平用僵立时间的百分比表示。在场景恐惧记忆测试中，freezing水平的计算是在5分钟的场景测试中freezing时间所占的百分比。在线索恐惧记忆测试中，freezing水平的计算是3次声音刺激下freezing时间所占的百分比。

为了探究星形胶质激活对恐惧记忆的影响，大鼠在条件恐惧训练后立即或间隔1小时，2小时，3小时分别给予光遗传学蓝光刺激15分钟(473nm,10Hz,光纤尖端光强为1-3mW，30s光开,30s光关)。

为了探究药物注射对恐惧记忆的影响，大鼠在条件恐惧训练后立即海马脑区或腹腔注射药物及对应的对照溶剂。

焦虑样行为测试

旷场测试：旷场测试是检测啮齿类动物焦虑样行为和自发活动的经典方法(Cai,Y.Q et al.,J.Neurosci.38,2018)。动物因对新空旷的环境恐惧，在中央区域活动较少，主要在周边区域活动，但由于好奇心，动物又会自发产生去中央区域探索的特性。和正常动物相比，有焦虑样行为的动物在旷场中央的探索时间较少。大鼠旷场长×宽×高是100×100×40(cm)，内壁黑色。旷场中心50cm×50cm的区域被定义为旷场的中央区域，其余区域被定义为外周区域。实验开始时把大鼠放在旷场一角，允许大鼠自由探索5分钟并用上方摄像头记录。大鼠在旷场中的行为活动用一个自动的行为学追踪软件分析(ANY-maze,StoeltingCo.,USA)。每只动物测试完后，用纸巾和75％酒精擦拭旷场装置，再对下一只动物进行测试，这样做是避免残留气味影响下一只动物的行为。大鼠在旷场中5分钟内的运动距离(total distance)被定义为总运动距离，在中央区域的探索时间被定义为中央区域时间。

药物注射

实验中用的药物ATP-γ-S,NECA,CCPA,CPT,SCH58261和ARL67156三钠盐购自于Sigma-Aldrich公司。MesADP和CGS 21680购自于Tocris公司。NECA,CCPA,CPT,SCH58261,CGS 21680用DMSO溶解成储存液，实验时用无菌生理盐水稀释成最终浓度。ATP-γ-S,MesADP和ARL67156用无菌生理盐水溶解成储存液，实验时用无菌生理盐水稀释成最终浓度。脑区药物注射是通过先前已经埋置好的套管注射。实验时把注射内管插入引导套管，内管比套管长2毫米，每侧核团注射1微升药物。对照组注射等量的溶剂。对于腹腔注射，动物注射不同剂量的CCPA和对应的溶剂。

统计分析

所有的数据统计是用GraphPad Prism(Version 6.01)完成。数据分析采用单因素变异数分析、双因素变异数分析，事后用Bonferroni或Newman-Keuls检验，以及双尾非配对t检验。实验动物随机分组。数据以平均值±标准误表示。P<0.05设为有统计学意义。

实施例2激活海马CA1的星形胶质细胞降低恐惧记忆和恐惧相关的焦虑

对GFAP-ChR2-EYFP和WT大鼠根据实施例1描述的方法进行立体定位手术埋置光纤套管，进行恐惧刺激训练后，观察不同处理对大鼠的恐惧记忆和恐惧相关的焦虑的影响。

实验方法和结果如图1所示。

其中，图1a和图1b为大鼠海马CA1光纤植入示意图，其中白色柱子指光纤植入位置，虚线下方指CA1位置。图1c为对大鼠进行条件恐惧、光激活范式以及记忆、旷场测试的实验设计和流程。根据实施例1描述的方法，对大鼠分别进行条件恐惧训练，海马依赖的场景恐惧测试和非海马依赖的线索恐惧测试。因为实验探究在记忆巩固阶段光激活星形胶质细胞对恐惧记忆的影响，因此在条件恐惧后立即或间隔1小时，2小时，3小时光激活星形胶质细胞。

图1d-图1i为实验结果。其中图1d显示，在条件恐惧训练中，对照组和光激活组的大鼠有相似的学习能力。图1e显示，在场景恐惧记忆测试中，条件恐惧训练后立即光激活星形胶质细胞组大鼠的freezing水平显著降低，表明光激活星形胶质细胞显著降低场景恐惧记忆。图1f显示，在线索恐惧记忆测试中，光激活星形胶质细胞组大鼠的freezing水平与对照组相似，表明光激活星形胶质细胞不影响线索记忆。图1g为代表性热图，显示对照组(没有条件恐惧训练)、条件恐惧训练组、条件恐惧训练后光激活星形胶质细胞组的大鼠在旷场中的运动轨迹。图1h的柱状图显示，和对照组相比，条件恐惧训练诱发出焦虑表型；条件恐惧训练后光激活星形胶质细胞有效逆转焦虑表型：显著增加在旷场中的运动距离(h)和旷场中央的探索时间(i)。

所有数据均表示为平均值±SEM。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。

实施例3光激活星形胶质细胞对场景恐惧记忆具有长期的降低效应并且不影响新记忆形成

根据实施例1描述的方法对GFAP-ChR2-EYFP和WT大鼠进行立体定位手术埋置光纤套管，进行恐惧刺激训练后，观察不同处理对大鼠的场景恐惧记忆的影响。

图2a为对大鼠进行条件恐惧、光激活范式以及记忆、旷场测试的实验设计和流程。根据实施例1描述的方法，对大鼠分别进行条件恐惧训练和再训练，海马依赖的场景恐惧测试。

图2b显示，在场景恐惧测试中，条件恐惧训练后立即光激活星形胶质细胞组大鼠的freezing水平显著降低，可以持续到光激活后的26天，表明光激活星形胶质细胞持续并显著降低场景恐惧记忆。图2c显示，在条件恐惧训练中，再次进行条件恐惧训练的光激活组大鼠与首次进行条件恐惧训练的对照组大鼠的freezing水平相似，表明具有相似的学习能力，也提示星形胶质细胞激活不影响新的学习。图2d显示，在场景恐惧记忆测试中，再次条件恐惧训练的光激活组大鼠与对照组大鼠的freezing水平相似，表明具有相似的恐惧记忆水平，也提示星形胶质细胞激活不影响新记忆形成。

实施例4在一定时间窗内光激活星形胶质细胞可显著降低场景恐惧记忆

对GFAP-ChR2-EYFP和WT大鼠根据实施例1描述的方法进行立体定位手术埋置光纤套管，进行恐惧刺激训练后，观察在不同时间对大鼠进行处理对大鼠的场景恐惧记忆的影响。

图3a,d,g分别为条件恐惧训练后1小时、2小时和3小时进行光激活范式以及记忆测试的实验设计和流程。图3b,e,h的结果显示，在条件恐惧训练中，对照组和光激活组的大鼠有相似freezing水平，表明具有相似的学习能力。图3c显示在条件恐惧训练后1小时光激活星形胶质细胞，大鼠freezing水平显著降低，表明恐惧记忆显著降低。图3f和图3i显示，在条件恐惧训练后2或3小时光激活星形胶质细胞，大鼠freezing水平和对照组相似，表明对恐惧记忆没有影响。这些结果提示，在创伤性事件发生后记忆巩固早期阶段激活星形胶质细胞均可显著降低恐惧记忆。

实施例5腺苷及腺苷A1受体激活介导场景恐惧记忆降低

根据实施例1描述的方法对GFAP-ChR2-EYFP和WT大鼠大鼠进行手术埋置给药套管，进行恐惧刺激训练后，观察通过在海马CA1通过套管给药不同的腺苷A1受体激动剂对大鼠进行处理对大鼠的场景恐惧记忆的影响。

测试的ATP受体激动剂包括ATP的非水解类似物ATPrS，P2Y受体的激动剂MesADP，腺苷的非水解类似物NECA，腺苷A1受体激动剂CCPA和腺苷A2A受体激动剂CGS 21680。

图4a为大鼠海马CA1双侧套管植入示意图.图4b为对大鼠进行条件恐惧训练、药物注射以及记忆测试的实验设计和流程图。

图4c-e的结果显示，在条件恐惧训练中，对照组(溶剂注射)和药物注射组的大鼠有相似的学习能力。

图4f显示局部双侧注射ATPrS(2mM,9mM,1μl/每侧)和MesADP(5mM,1μl/每侧)组的大鼠和对照组大鼠(注射对应的溶剂)的freezing水平相似，表明ATPrS和MesADP不影响场景恐惧记忆.

图4g显示局部双侧注射腺苷的非水解类似物NECA(2mM,1μl/每侧)和腺苷A1受体激动剂CCPA(5mM,1μl/每侧)组的大鼠freezing水平显著降低，表明场景恐惧记忆显著降低。

图4h显示局部双侧注射腺苷A2a受体激动剂CGS 21680(5mM,1μl/每侧)组的大鼠freezing水平和对照组相似，表明CGS 21680不影响场景恐惧记忆。

实施例6海马CA1脑区局部双侧注射NECA,CCPA不影响动物自发运动

根据实施例1描述的方法对GFAP-ChR2-EYFP和WT大鼠进行手术埋置给药套管，观察通过在海马CA1通过套管给药不同的腺苷A1受体激动剂对大鼠进行处理对大鼠自发活动的影响。

图5a为对大鼠进行药物注射以及旷场测试的实验流程图。

图5b,d显示，在大鼠脑区局部双侧注射NECA(2mM,1μl/每侧),CCPA(5mM,1μl/每侧)不影响动物在旷场中的运动距离。图5c,e在脑区局部双侧注射NECA,CCPA不影响动物在旷场中央的探索时间。

实施例7腹腔注射腺苷A1受体激动剂显著降低恐惧记忆和焦虑

对GFAP-ChR2-EYFP和WT大鼠大鼠进行恐惧刺激训练后，观察通过腹腔给药腺苷A1受体激动剂对大鼠进行处理对大鼠的记忆的影响。

图6a为对大鼠进行条件恐惧训练、药物注射以及记忆测试的实验设计和流程图。实验探究在记忆巩固阶段注射腺苷A1受体激动剂CCPA对恐惧记忆的影响，在条件恐惧后立即注射药物，并分别在第2天和第3天进行场景恐惧记忆测试。

图6b-e显示，在场景恐惧测试中，对照组(溶剂注射)和药物注射组的大鼠有相似的freezing水平，表明动物学习能力相似。

图6f显示，腹腔注射低剂量CCPA(0.03mg/kg)组大鼠与对照组大鼠的freezing水平相似，表明对恐惧记忆没有影响。

图6g-i腹腔注射高剂量的CCPA(0.1/0.3/1mg/kg)组大鼠的freezing水平显著降低，表明恐惧记忆显著降低。

图6j,m为代表性热图显示对照组(没有条件恐惧训练)、条件恐惧训练组的大鼠在注射溶剂或药物后3小时和24小时在旷场中的运动轨迹。图6k-o显示，和对照组相比，经过条件恐惧训练的大鼠在旷场中的运动距离和旷场中央的探索时间显著降低，诱发出焦虑表型，条件恐惧训练后腹腔注射腺苷A1受体激动剂CCPA(0.1mg/kg)有效逆转焦虑表型：显著增加在旷场中的运动距离和旷场中央的探索时间。

实施例8腹腔注射低剂量CCPA不影响动物的自发运动

观察腹腔给药腺苷A1受体激动剂对大鼠的影响。

图7a为代表性热图。显示注射不同剂量CCPA(0.1/0.3/1mg/kg)后大鼠在旷场中的运动轨迹。

图7b-e显示，低剂量CCPA(0.1mg/kg)不影响动物的自发运动，高剂量(0.3/1mg/kg)显著降低动物的运动距离，但是分别在注射后5小时或24小时后恢复到正常水平。

结论

本发明首次发现海马CA1的星形胶质细胞激活能持续显著降低恐惧记忆，而不影响新记忆的形成。发明人还进一步发现了星形胶质细胞的激活通过ATP的降解产物腺苷和腺苷A1受体降低恐惧记忆，并发现通过局部注射或全身施用腺苷A1受体激动剂例如腺苷或其类似物均可降低恐惧记忆的记忆巩固及焦虑。本发明由此提供了通过全身或局部给予腺苷A1受体激动剂来调控哺乳动物的恐惧记忆的记忆巩固，以及预防和治疗恐惧记忆或其相关疾病例如焦虑症的方法和药物。

上面是对本发明进行的说明，不能将其看成是对本发明进行的限制。除非另外指出，本发明的实践将使用有机化学、聚合物化学、生物技术等的常规技术，显然除在上述说明和实施例中所特别描述之外，还可以别的方式实现本发明。其它在本发明范围内的方面与改进将对本发明所属领域的技术人员显而易见。根据本发明的教导，许多改变和变化是可行的，因此其在本发明的范围之内。

如无特别表示，本文中出现的温度的单位“度”是指摄氏度，即℃。

Claims (11)

1.一种调控哺乳动物的恐惧记忆的记忆巩固的方法，所述方法包括对哺乳动物施用腺苷A1受体激动剂，从而抑制事件在哺乳动物中引起的恐惧记忆的形成的步骤，优选的，其中所述方法用于预防和/或治疗恐惧记忆或恐惧记忆相关疾病例如焦虑症。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述腺苷A1受体激动剂为选择性A1腺苷受体激动剂，例如为N6-环戊基腺苷(CPA)、2-氯-N6-环戊基腺苷(CCPA)、([1S-[la,2b,3b,4a(S*)]]-4-[7-[[1-(3-氯-2-噻吩基)甲基]丙基]氨基]-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基]-N-乙基-2,3-二羟基环戊烷甲酰胺)(AMP579)，N-[R-(2-苯并噻唑基)硫基-2-丙基]-2-氯腺苷(NNC-21-0136)、N-[(1S，反式)-2-羟基环戊基]腺苷(GR79236)、N6-[3-(R)-四氢呋喃]-腺苷(CVT-510，Tecadeonson)、N6-环己基-2-0-甲基腺苷(SDZWAG 994)、N6-环戊基-N5'-乙基腺苷-5'-尿酰胺(Selodenoson，赛罗地松)、Capadenoson(BAY 68-4986)、(±)-5'-Chloro-5'-deoxy-ENBA、R-苯异丙基腺苷(R(-)N6-(2-phenylisopropyl)adenosine,R-PIA))、Neladenoson dalanate、N6-(2-羟乙基)腺苷(N6-(2-hydroxyethyl)adenosine，HEA)、腺苷同类物(N6-Cyclohexyladenosine，CHA)、WS090501，

例如，其中所述选择性腺苷A1受体激动剂为CCPA或CPA。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述腺苷A1受体激动剂为非选择性腺苷A1受体激动剂，例如为腺苷或腺苷类似物，

例如，其中所述非选择性腺苷A1受体激动剂为5’-N-乙基酰胺基腺苷(NECA)、2-氯腺苷(2-CADO)或CI-947。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述腺苷A1受体激动剂经全身施用，优选的，其剂量为约0.01-20mg/kg，优选为约0.05-5mg/kg，更优选为约0.01-1mg/kg。

5.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述腺苷A1受体激动剂经局部施用至海马上，特别是施用至海马CA1上，

优选的，其剂量为约0.001-0.1mg/kg，优选为约0.005-0.05mg/kg，更优选为约0.01mg/kg。

6.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述腺苷A1受体激动剂在哺乳动物暴露于恐惧刺激后施用，优选的，所述腺苷A1受体激动剂在暴露于恐惧刺激后的约6小时内被施用，例如在暴露于恐惧刺激后的约2小时内被施用。

7.腺苷A1受体激动剂在用于制备调控哺乳动物的恐惧记忆的记忆巩固的药物中的用途，其中所述腺苷A1受体激动剂抑制事件在哺乳动物中引起的恐惧记忆的形成，优选的，所述为紧急药物组合物，

其中，所述腺苷A1受体激动剂如权利要求1-6中任一项所定义。

8.调控哺乳动物的恐惧记忆的记忆巩固的药物组合物，其包含腺苷A1受体激动剂，优选的，其为用于预防和/或治疗恐惧记忆或恐惧记忆相关疾病的药物组合物。

9.根据权利要求8所述的药物组合物，其中所述腺苷A1受体激动剂为

(1)选择性A1腺苷受体激动剂，例如为N6-环戊基腺苷(CPA)、2-氯-N6-环戊基腺苷(CCPA)、([1S-[la,2b,3b,4a(S*)]]-4-[7-[[1-(3-氯-2-噻吩基)甲基]丙基]氨基]-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基]-N-乙基-2,3-二羟基环戊烷甲酰胺)(AMP579)，N-[R-(2-苯并噻唑基)硫基-2-丙基]-2-氯腺苷(NNC-21-0136)、N-[(1S，反式)-2-羟基环戊基]腺苷(GR79236)、N6-[3-(R)-四氢呋喃]-腺苷(CVT-510，Tecadeonson)、N6-环己基-2-0-甲基腺苷(SDZWAG 994)、N6-环戊基-N5'-乙基腺苷-5'-尿酰胺(Selodenoson，赛罗地松)、Capadenoson(BAY 68-4986)、(±)-5'-Chloro-5'-deoxy-ENBA、R-苯异丙基腺苷(R(-)N6-(2-phenylisopropyl)adenosine,R-PIA))、Neladenoson dalanate、N6-(2-羟乙基)腺苷(N6-(2-hydroxyethyl)adenosine，HEA)、腺苷同类物(N6-Cyclohexyladenosine，CHA)、WS090501，

(2)非选择性腺苷A1受体激动剂，例如为腺苷或腺苷类似物。

10.根据权利要求8或权利要求9所述的药物组合物，其为全身施用的剂型，优选的，其剂量为约0.01-20mg/kg，优选为约0.05-5mg/kg，更优选为约0.01-1mg/kg，

或

其为局部施用的剂型，例如为局部施用至海马的剂型，例如为局部施用至海马CA1的剂型，

优选的，其剂量为约0.001-0.1mg/kg，优选为约0.005-0.05mg/kg，更优选为约0.01mg/kg。

11.根据权利要求8或权利要求9所述的药物组合物，其为紧急药物组合物，

例如，其为在哺乳动物暴露于恐惧刺激后的约6小时内被施用的药物组合物，例如在暴露于恐惧刺激后的约2小时内被施用的药物组合物。

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