CN102037123A - Epas1抑制剂的组合物和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及内皮PAS结构域蛋白1(EPAS1)的抑制剂以及与EPAS1抑制剂相关的方法和组合物。在某些实施方案中，EPAS1抑制剂包括核酸，例如siRNA。

Description

EPAS1抑制剂的组合物和用途

相关申请的交叉参考

本申请要求2008年4月4日提交的美国临时申请系列案61/123,069的权益。上面参考的申请的所有教导通过引用合并入本文。

背景

转录复合物低氧诱导因子(hypoxia inducible factor，HIF)是氧气动态平衡中的一个关键调节子。低氧诱导参与许多细胞和生理过程的基因的表达，这些过程包括氧气运输和铁代谢、红细胞生成、血管生成、醣酵解和葡萄糖摄取、转录、代谢、pH调节、生长因子信号转导、对应激的应答和细胞粘着。此类基因产物参与增加向含氧量低的组织的氧气运送或激活不需要氧的备选代谢途径(糖酵解)。低氧诱导的途径除了为正常细胞过程所需要外，还可通过允许或帮助血管生成、永生化、遗传不稳定性、组织侵袭和转移来帮助肿瘤生长(Harris，Nat.Rev.Cancer 2：38-47，2002；Maxwell等人，Curr.Opin.Genet.Dev.11：293-299，2001)。

HIF是由α亚基与β亚基复合组成的异二聚体，所述2个亚基都是基本的螺旋-环-螺旋转录因子。HIF的β亚基是一种组成性的核蛋白。HIF的α亚基是特异于氧应答途径的调节亚基，并且可以是3种亚基HIF1α、2α或3α(分别地HIF1α、HIF2α和HIF3α)之一(Maxwell等人，Curr.Opin.Genet.Dev.11：293-299，2001；Safran和Kaelin，J.Clin.Invest.111：779-783，2003)。

在肿瘤建立血液供给之前，低氧条件限制肿瘤生长。HIF1α活性的随后增加导致靶基因例如血管内皮生长因子(VEGF)的表达增加。VEGF的表达是大多数实体瘤中血管化和血管生成的建立所必需的(Iyer等人，Genes Dev.12：149-162，1998)。也在人多形性胶质母细胞瘤(lioblastoma multiforme)(最高级的神经胶质瘤，其中患者平均存活时间短于1年)中观察到HIF1α、VEGF的过表达与肿瘤分级之间的显著关联性。快速增殖的肿瘤生长超过了其血液供给，从而导致大片坏死，并且这些区域表达高水平的HIF1α蛋白和VEGF mRNA，表明了肿瘤对低氧的应答(Zagzag等人，Cancer 88：2606-2618，2000)。

编码HIF2α(也称为内皮PAS结构域蛋白1、EPAS1、MOP2、低氧诱导因子2、HIF相关因子、HRF、HIF1α-样因子、HLF)的基因最初被鉴定为在内皮细胞中表达的转录因子(Ema等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94：4273-4278，1997；Flamme等人，Mech.Dev.63：51-60，1997；Hogenesch等人，J.Biol.Chem.272：8581-8593，1997；Tian等人，Genes Dev.11：72-82，1997)。已通过实验证明了升高的EPAS1活性与血管生成之间的联系，该实现显示HIF活性如何调控VEGF的表达。正常的人肾细胞通常具有低水平的EPAS1，但在将编码EPAS1的载体引入这些细胞后，VEGF mRNA和蛋白质水平显著增加(Xia等人，Cancer 91：1429-1436，2001)。当抑制PAS1时，VEGF表达显著降低，从而证实了EPAS1活性与VEGF表达之间的直接关联(Xia等人，Cancer 91：1429-1436，2001)。HIF活性与VEGF表达之间的关联也在恶性细胞和组织中观察到。在缺乏编码EPAS1的载体的情况下，在肾细胞癌(RCC)细胞系中可容易地检测到EPAS1(Xia等人，Cancer 91：1429-1436，2001)。与正常组织相比较，肾细胞癌组织样品中EPAS1和VEGF mRNA显著增加，表明EPAS1的异常激活可能参与RCC的血管生成(Xia等人，Cancer 91：1429-1436，2001)。

除了RCC外，还已报导EPAS1在其他恶性肿瘤中的表达。EPAS1在人膀胱癌，特别地在具有侵袭性表型的膀胱癌中在mRNA和蛋白质水平上都有表达(Xia等人，Urology 59：774-778，2002)。在头颈部鳞细胞癌(squamous cell head-and-neck cancer(SCHNC))中观察到EPAS1的过表达的另一个实例。高水平的EPAS1与SCHNC的局部侵袭行为以及血管生成的增强相关(Koukourakis等人，Int.J.Radiat.Oncol.Biol.Phys.53：1192-1202，2002)。这些发现也证实了EPAS1的过表达与对化学疗法的抗性之间的关联性。在恶性嗜铬细胞瘤中观察到EPAS1的过表达与癌症之间的另一个关联实例，该细胞瘤与良性相应物相比较而言展示更高水平的EPAS1和诱导的VEGF途径(Favier等人，Am.J.Pathol.161：1235-1246，2002)。EPAS1过表达在非小细胞肺癌(NSCLC)中也是常见事件，并且与多个血管生成因子的上调和癌细胞的血管生成受体过表达相关。NSCLC中EPAS1的过表达指示不良预后(Giatromanolaki等人，Br.J.Cancer 85：881-890，2001)。在人肺腺癌细胞中观察到了EPAS1 mRNA和蛋白质的水平升高，并且此类细胞对低氧的暴露进一步增加了EPAS1表达(Sato等人，Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.26：127-134，2002)。结合起来，这些研究证明升高的EPAS1赋予了侵袭性的肿瘤行为，并且靶向HIF途径可能有助于几种不同类型的癌症的治疗。

此外，低氧应答元件在常氧条件下癌细胞系中VEGF同种型的组成型上调中起着一定作用。胶质母细胞瘤细胞中位于细胞类型特异性增强子元件内的HRE通过增强的EPAS1对HRE的结合来参与VEGF表达的上调(Liang等人，J.Biol.Chem.277：20087-20094，2002)。可结合低氧诱导因子1β但不结合HRE的截短形式EPAS1不能反式激活(transactivate)VEGF启动子(Liang等人，J.Biol.Chem.277：20087-20094，2002)。这进一步证明了癌细胞能够通过增强血管形成和血管生成所需的因子的表达来对抗低氧条件。

由于EPAS1牵涉许多疾病，因此仍然长期需要能够有效地调控EPAS1功能的另外的试剂。鉴于EPAS1表达的上调与许多不同类型的癌症相关，这样的抑制在癌症的治疗中尤其重要。

发明概述

本公开内容提供了调控EPAS1表达的组合物和方法。特别地，用于调控EPAS1表达的RNAi组合物据信对于治疗与EPAS1相关的异常增殖状况是有用的。异常增殖状况的实例有过度增生性病症例如癌症、肿瘤、赘生物(hyperplasias)、肺纤维化、血管生成、银屑病、动脉粥样硬化以及血管中平滑肌细胞的增殖。EPAS1的抑制可能是治疗此类病症的一种特别有用的方法。

因此，本发明提供了EPAS1抑制剂和可在靶细胞中实现EPAS1的抑制的相关方法和组合物。具体地，靶细胞包括处于不期望的增殖中的细胞例如癌细胞或肿瘤细胞、处于与某些疾病或状况相关的过度生长和/或增殖的细胞(例如，自身免疫疾病或移植物排斥中的T细胞)和病原体(例如，细菌和真菌细胞)。本发明的EPAS1抑制剂可通过减弱EPAS1表达或EPAS1的生物学功能(例如EPAS1的酶促活性)来抑制EPAS1。

EPAS1抑制剂可以是核酸、小分子、肽，包括抗体、肽衍生物或拟肽(peptidomimetic)。

某些实施方案涉及核酸类型的EPAS1抑制剂。本发明提供了分离的核酸，其中包含可在某些条件下(例如，生理或细胞内条件)与EPAS1转录物杂交并且减少细胞中靶基因的表达的至少一部分。所述靶基因转录物可以是任何剪接前的转录物(即包含内含子)、剪接后的转录物以及任何剪接变体。在某些实施方案中，靶基因转录物具有SEQ ID NO：1中所示的序列。核酸类别中的实例包括例如RNAi构建体和催化性核酸构建体。核酸可以是单链或双链的。双链核酸还可包含突出或非互补性的区域，在该区域中所述链中的一条或另一条是单链的。单链核酸可包括自身互补的区域，这意味着化合物形成具有双螺旋结构区域的所谓“发夹”或“茎环”结构。核酸可包含与由靶基因核酸序列(例如由SEQ ID NO：1(图1)指示的靶基因核酸序列或其任何同源物(例如直系同源物或旁系同源物)或变体(例如等位基因)中)的不超过1000个、不超过500个、不超过250个、不超过100个或不超过50个核苷酸组成的区域互补的核苷酸序列。所述互补的区域优选为至少8个核苷酸，任选地至少10、15、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。互补的区域可落在靶基因转录物的内含子、编码序列或非编码序列内。一般来说，核酸具有大约8至大约500个核苷酸或碱基对的长度，任选地长度将为大约14至大约50个核苷酸。核酸可以是DNA、RNA或RNA:DNA杂交体。任一条链可包含DNA和RNA的混合物以及不能容易地被分类为DNA或RNA的修饰形式。同样，双链核酸可以是DNA:DNA、DNA:RNA或RNA:RNA，并且任何一条链也可包含DNA和RNA的混合物以及不能容易地被分类为DNA或RNA的修饰形式。核酸可包括多种修饰的任何类型，包括对主链(天然核酸中的糖-磷酸部分，包括核苷酸间连接)或碱基部分(天然核酸的嘌呤或嘧啶部分)的一个或多个修饰。核酸优选可具有大约15至大约30个核苷酸的长度，并且通常将包含一个或多个修饰来改进特征，例如在血清、细胞或核酸可能被递送至的地方(例如在口服递送核酸的情况下是胃，对于吸入的核酸是肺)中的稳定性。在RNAi构建体的情况下，与靶转录物互补的链通常是RNA或其修饰物。另一条链可以是RNA、DNA或任何其他变型。双链或单链“发夹”RNAi构建体的双链体部分优选长度为18至30个核苷酸，任选地大约21至27个核苷酸。催化性或酶促核酸可以是核酶或DNA酶，并且还可包含修饰形式。当在生理条件下并且以无义或有义对照几乎不具有或不具有作用的浓度与细胞接触时，本文中的核酸可抑制靶EPAS1基因的表达大约50％、75％、90％或更多。用于检测核酸效果的优选浓度是1、5、10、20、50、100或1000nM。还可就对细胞表型的影响检测本文中的核酸。在某些癌细胞系的情况下，可在施用靶向核酸后测量细胞死亡或扩增速率的降低。优选地，在核酸的实验上有意义的浓度下细胞扩增被抑制50％以上。

在某些方面，本发明提供了包含各种EPAS1抑制剂例如靶向EPAS1基因的核酸(或靶向核酸)中任何种类的药物组合物。药物组合物通常包含药学上可接受的载体。药物组合物可包含在生理条件下与靶基因转录物杂交并且减少靶基因在细胞中的表达的核酸。

在某些方面，本发明提供了用于抑制EPAS1基因在细胞中的表达的方法。该方法可包括将所述细胞与有效量的核酸接触，所述核酸在生理条件下与靶EPAS1转录物杂交并且减少靶基因在细胞中的表达。任何公开的靶向EPAS1的核酸都可用于这样的方法。所述细胞可以是肿瘤或癌细胞、病原体细胞或正常细胞。在某些实施方案中，正常细胞经历可导致患者中某些疾病或状况的不期望的增殖。

在某些方面，本发明提供了用于降低受试者中肿瘤的生长速率的方法，其包括施用足以降低肿瘤生长速率的量的本文所述EPAS1抑制剂。在某些方面中，本发明提供了用于治疗癌症患者的方法，其包括给患者施用本文中的EPAS1抑制剂。所述EPAS1抑制剂可以是核酸，例如RNAi核酸或催化性核酸，并且可用药学上可接受的载体进行配制。任选地，肿瘤可包含一个或多个表达所述核酸所靶向的基因的癌细胞。靶EPAS1基因相对于来自可比较组织的非癌细胞而言可能是过表达的。肿瘤还可以是转移瘤。可将这样的治疗与至少一种另外的抗癌化疗药物组合，所述化疗药物以与核酸加成性或协同的方式与所述核酸一起抑制癌细胞。可以以组合制剂的形式将核酸和所述另外的抗癌剂配制在一起，或可将其独立地配制，然后以能实现这种组合效应的方式(例如，时间安排、剂量)施用。

在某些方面，本发明提供了核酸在制造用于治疗例如癌症或病原体感染的药剂中的用途。

在某些方面，本发明提供了用于从感染病原体的患者或被病原体污染的物体除去或减少病原体的方法和组合物。

本发明的另一个方面提供了包装的药物。这样的包装的药物包含：(i)治疗有效量的本文中公开的靶向EPAS1基因的抑制剂；和(ii)用于施用所述EPAS1抑制剂以治疗患有表达EPAS1基因的肿瘤的患者的说明书和/或标签。

本发明的另一个方面提供了包装的消毒剂。该包装的消毒剂可特异性地抗一种或多种传染原例如病原体。这样的包装的消毒剂包括：(i)有效量的靶向传染原中的EPAS1基因的EPAS1抑制剂；和(ii)用于施用该EPAS1抑制剂以除去或减少传染原的量的说明书和/或标签。

附图概述

图1显示人EPAS1的cDNA序列(GenBank登录号NM_001430)(SEQ ID NO：1)。以下划线和粗体标示的3个11个碱基的区段相应于由SEQ ID NOs：2-4表示的核心靶序列。

图2描述了初始3个siRNA双链体-siEPAS1A(SEQ ID NOs：5和6)、siEPAS1B(SEQ ID NOs：7和8)和siEPAS1C(SEQ ID NOs：9和10)-在A498(人肾癌)细胞中的抗EPAS1活性的评估。siCON1未显示任何EPAS1下调(相对于未转染的细胞)，而所有3个抗EPAS1的siRNA均表现出EPAS1 mRNA的显著下调。

图3A显示在初始3个位点附近的另外的siRNA双链体在A498细胞中的抗EPAS1活性。在检查的这些双链体当中，siEPAS1A-2、siEPAS1A-1、siEPAS1A、siEPAS1A+3、siEPAS1B-4和siEPAS1C-4显示最强效力的抗EPAS1活性。图3B是tiling实验设计的举例说明。

图4进一步检查了几个抗EPAS1 siRNA双链体(显示最强效力的抗EPAS1活性的抗EPAS1 siRNA双链体；参见图3A)对A498细胞生长的影响。在检测的siRNA双链体当中，siEPAS1A-2和siEPAS1A是A498细胞生长的最重要的抑制剂，如通过实时细胞电子传感(real-time cell electronic sensing)(RT-CES)测量的。

图5显示了siEPAS1A-2(SEQ ID NOs：29和30)有效地降低培养的人肾细胞癌细胞系(A-498，786-O和Caki-1)的细胞EPAS1 mRNA水平。

图6A-6C显示在用siEPAS1A-2处理后细胞增殖速率的下降。如基于VHL状态所预期的，siEPAS1A-2在A498和786-O细胞中但未在Caki-1细胞中实现了显著的抗增殖作用，这表明VHL缺陷的癌细胞是用于降低细胞HIF水平的治疗的良好候选者。

发明概述

本发明的一个方面涉及包含长度为大约15至大约30个核苷酸的含有选自SEQ ID NOs：2-4之序列的第一链和长度为大约15至大约30个核苷酸的第二链的核酸，其中第一链和第二链的至少12个核苷酸彼此互补并且在生理条件下形成双链核酸，以及其中所述双链核酸可通过RNA干扰机制减少内皮PAS结构域蛋白1(EPAS1)在细胞中的表达。

在某些实施方案中，所述核酸是任选地在长度上为大约15至大约30个核苷酸的双链RNA。在其他实施方案中，核酸是发夹RNA，其中所述发夹RNA包含在长度上具有大约4至大约10个核苷酸的环区域。在本文中公开的实施方案的任一个中，所述核酸可包含DNA多核苷酸作为其第一链，以及RNA多核苷酸作为其第二链。在一些实施方案中，上述核酸的第一和/或第二链可包含3′突出区域、5′突出区域或3′和5′突出区域，其中所述突出区域任选地在长度上包含大约1至大约10个核苷酸。

在公开的实施方案的任一个中，所述核酸的第一链可包含选自下述的序列：SEQ ID NOs：5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79和81。类似地，第二链可包含选自下述的序列：SEQ ID NO：6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80和82。

本发明的另一个方面涉及包含在生理条件下与相应于SEQ ID NO：1中核苷酸655-718、2878-2929或4978-5039的EPAS1转录物区域杂交并且减少EPAS1在细胞中的表达的序列的分离核酸。在另外的实施方案中，所述核酸包含与相应于SEQ ID NO：1中核苷酸665-708、2888-2919或4988-5029的EPAS1转录物区域杂交的序列。在特定的实施方案中，所述核酸包含与相应于SEQ ID NO：1中核苷酸670-703、2893-2914或4992-5024的EPAS1转录物区域杂交的序列。在某些实施方案中，所述核酸可以是单链的或双链的。

在公开的实施方案的任一个中，所述核酸可包含与EPAS1的所述区域之一互补的至少10个连续核苷酸。该核酸在长度上可以是大约14至大约50个核苷酸。本文中描述的任一个核酸可以是RNA分子、DNA分子或可包含DNA链和RNA链。

在一些实施方案中，任一公开的核酸可以是包含选自SEQ ID NOs：2-4的序列的RNAi构建体。在某些实施方案中，核酸是包含选自SEQ ID NOs：5-82的序列的RNAi构建体。在其他实施方案中，核酸可以是酶促核酸，例如核酶或DNA酶。

在本发明的某些实施方案中，任一公开的核酸可以是RNAi构建体，例如，dsRNA或发夹RNA。RNAi构建体的双链体部分在长度上可以是大约15至大约30个核苷酸。

在公开的实施方案的任一个中，核酸任选地包含一个或多个经修饰的主链或碱基部分，其中所述经修饰的主链或碱基部分可包含一个或多个下列部分：烷基膦酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯(alkylphosphonothioates)、氨基磷酸酯、磷酸酯、氨甲酸酯、乙酰胺酯(acetamidate)、羧甲酯(carboxylmethyl esters)、碳酸酯和磷酸三酯。被修饰的主链或碱基部分任选地包含至少一个2′-O-烷基化核糖核苷酸。

在某些实施方案中，上述核酸和/或任何上述可应用组合的核酸，当在生理条件下，例如以大约10或大约20nM的浓度与细胞接触时，可抑制细胞中的EPAS1表达50％或更多。

本发明的另一个方面涉及包含任何公开的实施方案的核酸和药学上可接受的载体的药物组合物。

在某些实施方案中，药学上可接受的载体包括阳离子聚合物。所述药学上可接受的载体还可包括环糊精聚合物，例如im-CDP。在某些实施方案中，所述药物组合物可包含颗粒，所述颗粒包含环糊精聚合物和任何所述公开的核酸和/或是被PEG化的。

在其他实施方案中，药物组合物的颗粒还可包含金刚烷。在一些实施方案中，药物组合物包含靶向特定组织或细胞类型的配体，其中所述配体任选地包括转铁蛋白。在某些实施方案中，药物组合物包含纳米颗粒，其中所述纳米颗粒在直径上为大约10至大约100nm，例如直径为大约50至大约70nm，例如直径为大约50nm。

在另外的实施方案中，所述药学上可接受的载体包括含有咪唑-修饰的环糊精的阳离子聚合物和含有金刚烷-PEG-配体的靶向部分，其中所述聚合物和靶向部分形成封装所述核酸的纳米颗粒。纳米颗粒的直径为大约50至大约120nm，例如大约50至大约100nm，例如大约50至大约70nm，或甚至大约50nm。例如，药物组合物的靶向配体可包括半乳糖和/或转铁蛋白。

在另外的方面，本发明涉及任何所述公开的核酸在制造用于治疗与不希望的细胞增殖相关的疾病或状况的药剂中的用途。所述细胞可以是癌细胞、肿瘤细胞或病原性细胞(pathogenic cell)。在某些实施方案中，所述细胞可以是其不期望的增殖导致所述疾病或状况的正常细胞。

本发明的其他方面涉及用于治疗癌症患者的方法，其包括给患者施用治疗有效量的任何上述核酸。在某些实施方案中，所述方法还可包括施用至少一种另外的抗癌化疗药物，例如氟尿嘧啶(5FU)，所述抗癌化疗药物例如以加成或协同的方式与该核酸一起抑制癌细胞的增殖。在一些实施方案中，癌细胞与来自可比较组织的非癌细胞相比较而言表达更高水平的EPAS1。

在特定的实施方案中，本发明涉及治疗癌症患者的方法，其包括给患者施用治疗有效量的双链核酸(所述双链核酸通过RNAi机制降低EPAS1的表达)和一种或多种诱导EPAS1表达的抗癌剂。

在上文或其他地方描述的任何方法中，可用药学上可接受的载体配制所述核酸。在某些实施方案中，可用靶向癌细胞例如肾透明细胞癌的配体配制所述核酸，例如其中所述配体任选地包括转铁蛋白和/或半乳糖)。可将核酸配制为聚合物纳米颗粒的组分，其中所述纳米颗粒在直径上可为大约10至大约120nm，例如大约50至大约120nm，例如大约50至大约100nm或甚至大约50nm。

在本文中公开的任一方法中，可全身性施用治疗有效量的所述核酸。

本文中描述的方法还可包括在施用所述核酸之前测定患者中von Hippel-Landau(VHL)蛋白的水平。例如，可通过测量与健康受试者相比较而言患者中VHL的RNA或蛋白质水平的降低来测定所述活性。在其他实施方案中，可通过遗传筛查鉴定VHL基因中的一个或多个突变来测定所述活性，其中所述一个或多个突变包括引起截短的突变或可引起等位基因丢失的突变。此外，所述一个或多个突变可包含无义突变、移码突变、启动子突变、增强子突变、剪接位点突变、无效突变或多聚腺苷酸尾突变。

发明详述

概述

EPAS1的激活导致HI F靶基因，特别是编码VEGF、TGF-α、Met、基质细胞衍生因子(SDF)-1和趋化因子受体CXCR4等的基因的上调(Soccio等人，Jour.Biol.Chem.280：19410-19418，2005；Kim和Kaelin，J.Clin.Onocology 22：4991-5004，2004)。因此，其是一种期望的癌症治疗靶。特别地，EPAS1的上调与肾细胞癌密切相关，并且部分地归因于其与von Hippel-Lindau肿瘤抑制基因(VHL)的关联。VHL的失活与各种VHL相关异常，特别地肾透明细胞癌(RCC)的发生有关联。VHL基因产物pVHL是识别HIF的α亚基和将其靶向多遍在蛋白化作用(polyubiquitination)和蛋白酶体降解的复合体的部分。因此，VHL-缺陷型癌细胞具有增加水平的HIF，从而使得它们是用于降低细胞HIF水平的治疗的良好候选者。

EPAS1的抑制可通过抑制细胞中EPAS1的生物学活性例如其酶促活性来实现。备选地，EPAS1的抑制可通过抑制细胞中EPAS1基因的表达来实现。小分子和核酸可供用于下调EPAS1活性和/或表达。一些实例包括反义分子(例如，美国专利7,217,572)和短发夹RNA(如Kondo等人1(3)：439-444，2003和Zimmer等人2：89-95，2004中描述的)。然而，仍然期望拥有新型和改进的EPAS1抑制剂作为下调EPAS1的新型工具。

核酸EPAS1抑制剂

在某些方面，本发明提供了EPAS1基因的核酸抑制剂和用于例如通过减少或下调EPAS1基因的表达来抑制或降低EPAS1基因或蛋白的活性的方法。“抑制”或“降低”意指该基因的表达或编码一种或多种蛋白质或蛋白质亚基的核酸或等价核酸的水平被降低至低于在本发明的核酸试剂不存在时观察到的水平。

如本文中所使用的，术语“核酸”或“核酸试剂”是指含有核苷酸并且具有期望的对EPAS1基因的效果的任何基于核酸的化合物。核酸可以是单链、双链或多链的，并且可包含经修饰或未修饰的核苷酸或非核苷酸或各种混合物和其组合。本发明的核酸试剂的实例包括但不限于dsRNA、siRNA和酶促核酸。

在某些实施方案中，本发明提供了被靶向一个或多个物种(包括真核生物或原核生物)的EPAS1基因或mRNA的核酸抑制剂。在某些实施方案中，可将所述核酸抑制剂设计成能够特异性抑制来自某些物种的EPAS1基因或mRNA序列的表达但不抑制来自其他物种的EPAS1基因或mRNA的表达。例如，可用于治疗病原体感染的核酸抑制剂可设计成能够特异性抑制病原体中EPAS1基因或mRNA的表达但不抑制宿主的EPAS1基因或mRNA的表达。

在某些实施方案中，本发明提供了被靶向到EPAS1基因内的一个或多个特定区域的EPAS1基因核酸抑制剂。人EPAS1基因内的示例性区域包括下文表1(也参见图1)中显示的核心靶区域。核心靶序列通常是指在被抑制剂核酸例如dsRNA、siRNA或酶促核酸序列特异性结合后有效地抑制EPAS1表达的靶EPAS1基因或相应mRNA的部分。一般地，核酸抑制剂可在严格条件下与包含核心靶序列的EPAS1蛋白区域，或包含侧翼连接EPAS1基因或mRNA序列内核心靶序列的一个或两个末端的5、10或20个核苷酸的EPASE基因或mRNA部分(例如核心靶位点+/-5、+/-10或+/-20个核苷酸(在任一端或两端上))杂交。表1中显示的核心靶序列是从人EPAS1序列获得的；然而，来自其他物种包括真核生物例如其他哺乳动物的EPAS1序列中的等同区域也包括在本文中。

表1.EPAS1的核心靶序列(HIF2α)的实例

描述	有义序列	SEQ ID NO
			EPAS1-0677核心	5’acacacaagcu  3’	SEQ ID NO：2
EPAS1-2894核心	5’gccacccagua 3’	SEQ ID NO：3
			EPAS1-4999核心	5’ugucaacguaa 3’	SEQ ID NO：4

dsRNA和RNAi构建体

在某些实施方案中，本发明涉及双链RNA(dsRNA)和RNAi构建体。术语“dsRNA”，如本文中所使用的，是指能够进行RNA干扰(RNAi)的双链RNA分子，包括siRNA(参见例如，Bass，Nature 411：428-429，2001；Elbashir等人，Nature 411：494-498，2001；Kreutzer等人，PCT公开案WO 00/44895；Zernicka-Goetz等人，PCT公开案WO 01/36646；Fire，PCT公开案WO 99/32619；Plaetinck等人，PCT公开案WO 00/01846；Mello和Fire，PCT公开案WO 01/29058；Deschamps-Depaillette，PCT公开案WO 99/07409；和Li等人，PCT公开案WO 00/44914)。此外，RNAi是最初用于在植物和蠕虫中观察到的其中双链RNA(dsRNA)以特异性的翻译后方式阻断基因表达的现象。RNAi提供了体外或体内抑制或减少基因表达的有用方法。

术语“短干扰RNA”、“siRNA”或“短干扰核酸”，如本文中所使用的，是指当通过细胞适当地加工时能够介导RNAi或基因沉默的任何核酸。例如，siRNA可以是包含自身互补的有义和反义区域的双链多核苷酸分子，其中反义区域包含对靶基因的互补性。siRNA可以是具有自身互补的有义和反义区的单链发夹多核苷酸，其中反义区包含对靶基因的互补性。siRNA可以是具有两个或更多个环结构和包含自身互补的有义和反义区的茎的环状单链多核苷酸，其中反义区包含对靶基因的互补性，以及其中环状多核苷酸可经体内或体外加工，从而产生能够介导RNAi的活性siRNA。siRNA还可包含具有对于靶基因的互补性的单链多核苷酸，其中单链多核苷酸还可包含末端磷酸基团，例5’-磷酸(参见例如Martinez等人，Cell 110：563-574，2002)或5’，3’-二磷酸。在某些实施方案中，siRNA是结合靶核酸并且改变靶核酸的活性的非酶促核酸。可通过与一种或多种蛋白质或蛋白质复合体例如RNA诱导的沉默复合体(或RISC)相互作用来促进siRNA的结合和/或活性。在某些实施方案中，siRNA包含沿着siRNA分子的一条链的单个连续序列与靶序列互补的序列。

任选地，本发明的siRNA包含在生理条件下(例如，在细胞环境中)与待抑制基因(“靶”基因)的mRNA转录物的至少部分的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。双链RNA只需要与天然RNA足够相似以使其具有介导RNAi的能力。因此，本发明具有能够耐受由于基因突变、品系多态性或进化趋异而可能预期的序列变异的有利方面。靶序列与siRNA序列之间的可耐受的核苷酸错配的数目在5个碱基对中不超过1个，或10个碱基对中1个，或20个碱基对中1个，或50个碱基对中1个。siRNA双链体的中心中的错配是最重要的，其可能基本上消除靶RNA的切割。相反地，与靶RNA互补的siRNA链的3’末端上的核苷酸对靶识别的特异性没有显著的作用。可通过本领域内已知的序列比较和比对算法(参见Gribskov和Devereux，Sequence Analysis Primer，Stockton Press，1991，并且通过引用合并入本文)最优化序列同一性并且使用例如BESTFIT软件程序中执行的Smith-Waterman算法(例如，University of Wisconsin Genetic Computing Group)，利用缺省参数计算核苷酸序列之间的百分比差异。优选siRNA与靶基因的部分之间有大于90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性或甚至100％的序列同一性。可选择地，可将RNA的双链体区域在功能上定义为能够在严格条件(例如，在400mM NaCl，40mM PIPES pH 6.4，1mM EDTA中于50℃或70℃下杂交12-16小时；然后清洗)下与靶基因转录物的部分杂交的核苷酸序列。

dsRNA的双链结构可由单个自身互补的RNA链、两条互补RNA链或DNA链与互补的RNA链形成。任选地，可在细胞内或细胞外启动RNA双链体的形成。可以以允许每细胞递送至少一个拷贝的量引入RNA。双链材料的更高剂量(例如，每细胞至少5、10、100、500或1000个拷贝)可产生更有效的抑制，然而更低的剂量对于特定应用也是有用的。抑制是序列特异性的，因为相应于RNA的双链体区域的核苷酸序列被靶向抑制。

如本文中所描述的，受试者siRNA包含在长度上为大约19-30个核苷酸，在长度上为大约21-27个核苷酸，在长度上为大约21-25个核苷酸或在长度上为大约21-23个核苷酸的双链体区域。siRNA被认为可募集核酸复合体并且通过与特异性序列配对而将复合物导向靶基因转录物。结果，靶基因被蛋白质复合体中的核酸酶降解。在某些实施方案中，siRNA分子包含3’羟基。在某些实施方案中，可以例如通过例如在酶dicer存在的情况下加工更长的双链RNA来原位产生siRNA构建体。在一个实施方案中，使用果蝇体外系统。在该实施方案中，将dsRNA与来源于果蝇胚胎的可溶性提取物混合，从而产生组合。在其中dsRNA被加工成大约21至大约27个核苷酸的RNA分子的条件下维持该组合。可使用对于本领域技术人员来说是已知的许多技术来纯化siRNA分子。例如，可使用凝胶电脉纯化siRNA。可选择地，可使用非变性方法，例如非变性柱层析来纯化siRNA。此外，可使用层析(例如，大小排阻层析)、甘油梯度离心、使用抗体的亲和纯化来纯化siRNA。

可利用化学合成方法或利用重组核酸技术来产生目的dsRNA(例如siRNA)。被处理细胞的内源RNA聚合酶可介导体内转录，或克隆的RNA聚合酶可用于体外转录。如本文中所使用的，本发明的dsRNA或siRNA分子不必限于只包含RNA的那些分子，而是还包括化学修饰的核苷酸和非核苷酸。例如，dsRNA可包含对磷酸-糖主链或核苷的修饰，例如以减少对细胞核酸酶的敏感性，提高生物利用度，改进制剂特征和/或改变其他药物代谢动力学性质。举例来说，可修饰天然RNA的磷酸二酯连接以包含氮或硫杂原子中的至少一种。可定制RNA结构中的修饰以允许特异性基因抑制同时避免对dsRNA的一般反应。同样，可修饰碱基以阻断腺苷脱氨酶的活性。可通过酶促或通过部分/完全有机合成来产生dsRNA，可通过体外酶促或有机合成来引入任何修饰的核糖核苷酸。化学修饰RNA分子的方法可经改动以适用于修饰dsRNA(参见，例如，Heidenreich等人，Nucleic Acids Res.25：776-780，1997；Wilson等人，J Mol.Recog.7：89-98，1994；Chen等人，Nucleic Acids Res.23：2661-2668，1995；Hirschbein等人，Antisense Nucleic Acid Drug Dev.7：55-61，1997)。仅举例来说，可使用硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、二硫代磷酸酯、嵌合甲基膦酸酯-磷酸二酯、肽核酸、含有5-炔丙基-嘧啶的寡聚物或糖修饰(例如，2’-取代核糖核苷，a-构型)来修饰dsRNA或siRNA的主链。在某些情况下，本发明的dsRNA缺乏含2′-羟基(2′-OH)的核苷酸。在某些实施方案中，siRNA分子包含硫代磷酸酯有义链。在某些实施方案中，siRNA分子包含磷酸二酯反义链。

在一个特定的实施方案，siRNA分子的至少一条链具有在长度上为大约1至大约10个核苷酸、在长度上为大约1至5个核苷酸、在长度上为大约1至3个核苷酸或在长度上为大约2至4个核苷酸的3′突出。在某些实施方案中，siRNA可包含一条具有3′突出的链并且另一条链在3’末端被平端化(例如不具有3’突出)。在另一个实施方案中，siRNA可在两条链上都包含3’突出。突出的长度对于每一条链而言可以是相同的或不同的。为了进一步增强siRNA的稳定性，可稳定3′突出以抗降解。在一个实施方案中，通过包含嘌呤核苷酸例如腺苷酸或鸟苷酸来稳定RNA。可选择地，被修饰的类似物对嘧啶核苷酸的置换，例如，2′-脱氧胸苷(deoxythyinidine)对尿苷酸3′突出的置换可被耐受并且不影响RNAi的效率。2′羟基的不存在显著增加了突出在组织培养基中的核酸酶抗性并且在体内是有益的。

在另一个特定的实施方案中，目的dsRNA还可以以长双链RNA的形式存在。例如，dsRNA是至少25、50、100、200、300或400个碱基。在一些情况下，dsRNA在长度上为400-800个碱基。任选地，dsRNA在细胞内被降解，例如以在细胞中产生siRNA序列。然而，推测因可能由不依赖于序列的dsRNA反应所引起的有害作用，在体内使用长双链并非总是可行。在此类实施方案中，使用局部递送系统和/或减小干扰素或PKR的作用的试剂是优选的。

在另外的特定实施方案中，dsRNA或siRNA以发夹结构(或发夹RNA)的形式存在。可外源性地合成或可通过在体内从RNA聚合酶III启动子转录来合成发夹RNA。制备和使用此类发夹RNA以便在哺乳动物细胞中进行基因沉默的实例描述于，例如，Paddison等人，Genes Dev.16：948-58，2002；McCaffrey等人，Nature 418：38-9，2002；McManus等人，RNA 8：842-50，2002；Yu等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99：6047-6052，2002。优选地，在细胞或动物中对此类发夹RNA进行工程改造以确保对靶基因的持续且稳定的抑制。在本领域内已知可通过在细胞中加工发夹RNA来产生siRNA。

PCT申请WO 01/77350描述了用于转基因的双向转录以在真核细胞中产生相同转基因的有义和反义RNA转录物的示例性载体。因此，在某些实施方案中，本发明提供了具有下列独特特征的重组载体：其包含具有以相对方向排列的两个重叠转录单位并且侧翼连接目的dsRNA的转基因的病毒复制子，其中所述两个重叠转录单位在宿主细胞中从该相同转基因片段产生有义和反义RNA转录物。

在一些示例性实施方案中，本发明提供了针对上文表1中显示的核心靶序列或相应于EPAS1基因或mRNA的区域(所述区域相应于核心靶序列以及±5、±10或±20个在一侧或两侧侧翼连接该核心靶序列的核苷酸)的区域的siRNA。下文表2-6中提供了许多示例性siRNA双链体的序列。

表2.针对靶位点A、B和C的siRNA双链体的实例。以下划线标示的残基代表3’突出。

还提供了上述3个21聚体的相应的27聚体siRNA。更特别地，“27R”和“27L”变体在下调EPAS1的表达中可能更有效。参见Kim等人，Nature Biotechnology 23：222-226，2005；Rose等人，Nucleic Acids Research 33(13)：4140-56，Jul.26，2005)。‘R’27聚体具有延伸至原始靶序列的右侧(相对于靶而言为3’侧)的添加的碱基，而‘L’27聚体具有延伸至原始靶序列的左侧(相对于靶而言为5’侧)的添加的碱基。所述27聚体siRNA的实例示于下面的表3中。

表3.相应于示于上文表2中的21聚体siRNA的27聚体siRNA。大写字母表示DNA残基，小写字母表示RNA残基，[5’phos]表示5’磷酸。

本发明还提供了靶向核心靶序列的-20至+20碱基内或本发明的siRNA的-10至+10碱基内的siRNA。例如，靶位点在所述3个21聚体siRNA中每一个的-5至+5碱基内的21聚体双链体或在所述3个核心靶序列中每一个的-10至+10碱基内的双链体示于下文的表4至6中。

表4.针对靶位点A并且覆盖siEPAS1A siRNA双链体的-5碱基至+5碱基的siRNA双链体。下划线标示的残基代表3’突出。

表5.针对靶位点B并且覆盖siEPAS1B siRNA双链体的-5至+5碱基的siRNA双链体。下划线标示的残基代表3’突出。

描述	序列	链	SEQ ID NO
				siEPAS1B-5	5′acagugcuacgccacccagua 3′	有义	SEQ ID NO：43

表6.针对靶位点C并且覆盖siEPAS1C siRNA双链体的-5至+5碱基的siRNA双链体。下划线标示的残基代表3’突出。

酶促核酸

在某些实施方案中，本发明涉及抑制EPAS1基因或mRNA表达的酶促核酸。示例性酶促核酸包括靶向上文表1中提供的核心靶序列之一或包含核心靶序列和5、10或20个侧翼连接该核心靶序列的一侧或两侧的核苷酸的区域的那些酶促核酸。“酶促核酸”，其是指在底物结合区中具有对指定靶基因的互补性并且还具有特异性切割靶核酸的酶促活性的核酸。应理解酶促核酸能够分子间切割核酸，从而使靶核酸失活。这些互补区允许酶促核酸与靶核酸充分杂交，从而允许切割。百分之百的互补性(同一性)是优选的，但低至50-75％的互补性也可用于该应用(参见例如Werner和Uhlenbeck，Nucleic Acids Research 23：2092-2096，1995；Hammann等人，Antisense and Nucleic Acid Drug Dev.9：25-31，1999)。可在碱基、糖和/或磷酸基团上修饰酶促核酸。如本文中所描述的，术语“酶促核酸”可与短语例如核酶、催化性RNA、酶促RNA、催化性DNA、aptazyme或适体结合核酶、可调节的核酶、催化性寡核苷酸、核酶(nucleozyme)、DNA酶、RNA酶、内切核糖核酸酶、内切核酸酶、小酶(minizyme)、leadzyme、oligozyme或DNA酶互换使用。所有这些术语描述了具有酶促活性的核酸。本文中描述的特定酶促核酸在应用中不受限制，本领域技术人员将认识到在本发明的酶促核酸中重要的是其具有与一个或多个靶核酸区域互补的特异性底物结合部位以及其在该底物结合部分内或其周围具有赋予对该分子的核酸切割和/或连接活性的核苷酸序列(Cech等人，美国专利4,987,071；Cech等人，JAMA 260：3030，1988)。

目前已知几种天然发生的酶促核酸。各酶促核酸可在生理条件下以反式方式(从而可切割其他核酸)催化核酸磷酸二酯键的水解。通常，酶促核酸通过首先与靶核酸结合来发挥作用。这样的结合通过酶促核酸的靶结合部分(该部分紧邻所述分子内用于切割靶核酸的酶促部分)来发生。因此，酶促核酸首先识别，然后通过互补碱基配对结合靶核酸，然后一旦结合至正确位点，即发挥酶促作用来切割靶核酸。这样的靶核酸的策略性切割将破坏其指导编码的蛋白质合成的能力。在酶促核酸已结合并且切割其核酸靶后，其从该核酸释放以寻找另一个靶并且可重复结合和切割新靶。

在一个特定的实施方案中，所述酶促核酸是设计来催化性切割EPAS1 mRNA以阻止其翻译的核酶(参见，例如，1990年10月4日公开的PCT国际公开案WO90/11364；Sarver等人，Science 247：1222-1225，1990；和美国专利5,093,246)。虽然在位点特异性识别序列上切割mRNA的核酶可用于破坏特定mRNA，但锤头核酶的使用是优选的。锤头核酶在由与靶mRNA形成互补碱基对的侧翼区域指定的位置上切割mRNA。唯一的要求是靶mRNA具有下列2碱基的序列：5′-UG-3′。锤头核酶的结构和产生在本领域内是熟知的并且更全面地描述于Haseloff和Gerlach，1988，Nature，334：585-591。本发明的核酶还包括RNA内切核糖核酸酶(在下文中称为“Cech型核酶”)，例如在嗜热四膜虫中天然发生的并且已得到广泛描述的(参见，例如，Zaug，等人，Science 224：574-578，1984；Zaug和Cech，Science 231：470-475，1986；Zaug，等人，Nature，324：429-433，1986；由大学专利有限公司(University Patents Inc.)公开的国际专利申请案WO88/04300；Been和Cech，Cell 47：207-216，1986)的RNA内切核糖核酸酶(称为IVS或L-19 IVS RNA)。

在另一个特定的实施方案中，所述酶促核酸是DNA酶。DNA酶整合了反义和核酶技术的一些机械特征。DNA酶被设计成能够识别特定的靶核酸序列，很象反义寡核苷酸，然而更象核酶一样，它们催化性并且特异性切割靶核酸。简而言之，为了设计特异性识别和切割靶核酸的理想DNA酶，本领域技术人员必须首先鉴定独特的靶序列。优选地，所述独特或实质性的序列是富含G/C的大约18至22个核苷酸。高G/C含量帮助确保DNA酶与靶基因序列之间更强的相互作用。当合成所述DNA酶时，将酶靶向信使的特定反义识别序列分开，从而其包含该DNA酶的两个臂，并且DNA酶的环被置于这两个特定臂之间。制备和施用DNA酶的方法可见于例如美国专利6,110,462。

在某些实施方案中，本发明的核酸试剂在长度上为12至200个核苷酸。在一个实施方案中，本发明的示例性酶促核酸在长度上为15至50个核苷酸，包括例如在长度上为25至40个核苷酸(例如参见Jarvis等人，J.Biol.Chem.271：29107-29112，1996)。在另一个实施方案中，本发明的示例性反义分子在长度上为15至75个核苷酸，包括例如在长度上为20至35个核苷酸(参见例如Woolf等人，PNAS 89：7305-7309，1992；Milner等人，Nature Biotechnology 15：537-541，1997)。在另一个实施方案中，本发明的示例性siRNA在长度上为20至30个核苷酸，包括例如在长度上为21至27个核苷酸。本领域技术人员将认识到所需要的是所述核酸试剂的长度和构象足以并且适合于本文中涉及的其活性。本发明的核酸试剂的长度不限制在所述的一般限度内。

核酸试剂的合成

使用自动化方法难以合成长度大于100个核苷酸的核酸，并且此类分子的治疗成本是令人望而却步的。对于本发明，优选将小核酸基序(小是指核酸基序的长度短于大约100个核苷酸，优选长度短于大约80个核苷酸，和更优选长度短于50个核苷酸(例如，酶促核酸和RNAi构建体))用于外源递送。此类分子的简单结构增加了核酸侵入RNA结构的靶向区域的能力。

可化学合成本发明的示例性核酸抑制剂分子，包括RNA和DNA分子。举例来说，使用如Caruthers等人，Methods in Enzymology 211：3-19，1992；Thompson等人，国际PCT公开案WO 99/54459，Wincott等人，Nucleic Acids Res.23：2677-2684，1995；Wincott等人，Methods Mol.Bio.74：59，1997；Brennan等人，Biotechnol Bioeng.61：33-45，1998；和Brennan，美国专利6,001,311中描述的本领域内已知的方案来合成寡核苷酸(例如，DNA)。寡核苷酸的合成利用常用的核酸保护和偶联基团，例如在5′末端的二甲氧三苯甲基和在3′末端的亚磷酰胺。在一个非限定性实例中，在394 Applied Biosystems，Inc.合成仪上，使用2.5分钟的偶联步骤(对于2′-O-甲基化核苷酸)和45秒的偶联步骤(对于2′-脱氧核苷酸)进行小规模合成。可选择地，可在96孔板合成仪例如由Protogene(Palo Alto，CA)生产的仪器(对循环进行了极小的改进)上进行合成。

任选地，可分开合成本核酸的部分，合成后将它们连在一起，例如通过连接(Moore等人，Science 256：9923，1992；Draper等人，国际PCR公开案WO 93/23569；Shabarova等人，Nucleic Acids Research 19：4247，1991；Bellon等人，Nucleosides & Nucleotides 16：951，1997；Bellon等人，Bioconjugate Chem.8：204，1997)来进行。

优选地，通过使用抗核酸酶的基团例如2′-氨基、2′-C-烯丙基、2′-氟、2′-O-甲基、2′-H的修饰来广泛地修饰本文中的核酸以增强稳定性(关于综述参见Usman和Cedergren，TIBS 17：34，1992；Usman等人，Nucleic Acids Symp.Ser.31：163，1994)。使用一般方法通过凝胶电泳或利用高压液相色谱(HPLC；参见Wincott等人，同上)来纯化核酶，然后将其重悬浮于水中。

最优化核酸的活性和设计

具有修饰(例如，碱基、糖和/或磷酸)的核酸可阻止血清核糖核酸酶对它们的降解，从而增加它们的效力。本领域内存在几个描述可被引入核酸而显著增强它们的核酶稳定性和效力的糖、碱基和磷酸修饰的实例。例如，通过使用抗核酸酶的基团例如，2′-氨基、2′-C-烯丙基、2′-氟、2′-O-甲基、2′-H的修饰、核苷酸碱基修饰来修饰寡核苷酸以增强稳定性和/或生物学活性(关于综述参见Usman和Cedergren，TIBS 17：34，1992；Usman等人，Nucleic Acids Symp.Ser.31：163，1994；Burgin等人，Biochemistry 35：14090，1996)。核酸的糖修饰已在本领域内进行了广泛地描述(参见Eckstein等人，PCT公开案WO 92/07065；Perrault等人，Nature 344：565-568，1990；Pieken等人，Science 253：314-317，1991；Usman和Cedergren，Trends in Biochem.Sci.17：334-339，1992；Usman等人PCT公开案WO 93/15187；Sproat，美国专利5,334,711和Beigelman等人，J.Biol.Chem.，270：25702，1995；Beigelman等人，PCT公开案WO 97/26270；Beigelman等人，美国专利5,716,824；Usman等人，美国专利5,627,053；Woolf等人，PCT公开案WO 98/13526；1998年4月20日提交的Thompson等人，U.S.S.No.60/082,404；Karpeisky等人，Tetrahedron Lett.，39：1131，1998；Earnshaw和Gait，Biopolymers(Nucleic acid Sciences)48：39-55，1998；Verma和Eckstein，Annn.Rev.Biochem.67：99-134，1998；和Burlina等人，Bioorg.Med.Chem.5：1999-2010，1997)。类似的修饰可用于修饰本发明的核酸。

虽然使用硫代磷酸酯、硫代磷酸酯和/或5′-甲基膦酸酯连接化学性修饰寡核苷酸的核苷酸间连接提高了稳定性，然而过多的此类修饰可引起毒性。因此，应当估计此类核苷酸间连接的量并且当设计核酸时适当地使之减少至最少。此类连接的浓度的降低能减弱毒性，从而导致此类分子的功效增加和特异性更高。

在一个实施方案中，本发明的核酸包括一个或多个G-clamp核苷酸。G-clamp核苷酸是被修饰的胞嘧啶类似物，其中修饰赋予在双链体内的互补鸟嘌呤的Watson-Crick和Hoogsteen面都形成氢键的能力(参见例如，Lin和Matteucci，J.Am.Chem.Soc.120：8531-8532，1998)。寡核苷酸内的单个G-clamp类似物置换可导致当与互补寡核苷酸杂交时有显著增强的螺旋热稳定性和错配鉴别。本发明的核酸中包含此类核苷酸导致对核酸靶的亲和力和特异性增强。在另一个实施方案中，本发明的核酸包含一个或多个LNA(被锁核酸)核苷酸例如亚甲基二环核苷酸(2′，4′-C mythylene bicyclo nucleotide)(参见例如Wengel等人，PCT公开案WO 00/66604和WO 99/14226)。

在另一个实施方案中，本发明表征了靶向EPAS1基因的核酸的缀合物和/或复合物。此类缀合物和/或复合物可用于帮助核酸至生物系统例如细胞内的递送。由本发明提供的缀合物和复合物可通过将治疗剂转运或转移至靶组织或细胞类型，穿过细胞膜，改变药代动力学和/或调控本发明的核酸的定位来提供治疗活性。这样的缀合物和/或复合物也在下文中进行了描述。

本发明包括用于递送分子穿过细胞膜的新型缀合物和复合物的设计和合成，所述分子包括但不限于小分子、脂质、磷脂、核苷、核苷酸、核酸、抗体、毒素、带负电荷的聚合物和其他聚合物，例如蛋白质、肽、激素、碳水化合物、聚乙二醇或多胺。一般地，所述转运体被设计成单独使用或作为多组分系统(具有或不具有可降解的连接体)的部分来使用。此类化合物预期将在血清存在或不存在的情况下促进本发明的核酸向源于不同组织的许多细胞类型中的递送和/或定位(参见Sullenger和Cech，美国专利5,854,038)。可通过生物可降解的连接体例如生物可降解的核酸连接体分子将本文中描述的分子的缀合物连接至生物活性分子。

术语“生物可降解核酸连接体分子”，如本文中使用的，是指被设计为将一个分子连接至另一个分子例如生物学活性分子的生物可降解连接体的核酸分子。生物可降解核酸连接体分子的稳定性可通过使用核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸和化学修饰的核苷酸(例如2′-O-甲基、2′-氟、2′-氨基、2′-O-氨基、2′-C-烯丙基、2′-O-烯丙基和其他2′-修饰的或碱基修饰的核苷酸)的不同组合来进行调控。生物可降解核酸连接体分子可以是二聚体、三聚体、四聚体或更长的核酸，例如长度大约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸的寡核苷酸，或可包含具有基于磷的连接例如氨基磷酸酯或磷酸二酯连接的单个核苷酸。生物可降解核酸连接体分子还可包含核酸主链、核酸糖或核酸碱基修饰。术语“生物可降解的”如本文中所使用的，是指生物系统中的降解，例如酶促降解或化学降解。

外源递送的治疗性核酸试剂，例如本文中描述的分子，最佳地在细胞中稳定直至靶RNA的翻译被抑制的时间足够长而能够降低该不期望的蛋白质的水平。取决于疾病的状态，这段时间从数小时至数天不等。为了用作有效的细胞内治疗剂，此类核酸试剂应当抗核酸酶。本文中和本领域内核酸化学合成的改进已扩展了通过引入核苷酸修饰来修饰核酸以增强上述它们的核酸酶稳定性的能力。

在另一个方面，所述核酸包含5′-和/或3′-帽结构。“帽结构”是指已被整合在寡核苷酸的任一末端上的化学修饰(参见例如Wincott等人，WO 97/26270)。此类末端修饰保护核酸免受外切核酸酶降解，并且可帮助递送和/或细胞内的定位。该帽可存在于5′-末端(5′-帽)上或3′-末端(3′-帽)上或可存在于两个末端上。在一些非限定性实例中，5′-帽包括倒转的非碱基(inverted abasic)残基(部分)、4′，5′-亚甲基核苷酸；1-(β-D-赤藓呋喃糖基)核苷酸、4′-硫代核苷酸、碳环核苷酸；1，5-脱水己糖醇(anhydrohexitol)核苷酸、L-核苷酸、α-核苷酸、修饰的碱基核苷酸、二硫代磷酸酯连接、苏式戊呋喃糖基核苷酸、无环3′，4′-开环核苷酸、无环3，4-二羟基丁基核苷酸、无环3，5-二羟基戊基核苷酸，3′-3′-反向核苷酸部分；3′-3′-倒转无碱基部分、3′-2′-倒转核苷酸部分、3′-2′-倒转无碱基部分、1，4-丁二醇磷酸酯、3′-氨基磷酸酯；己基磷酸酯；氨基己基磷酸酯；3′-磷酸酯；3′-硫代磷酸酯；二硫代磷酸酯或者桥连或非桥连甲基膦酸酯部分(关于更详细内容，参见Wincott等人，同上)。在其他一些非限定实例中，3′-帽包括例如4′，5′-亚甲基核苷酸；1-(β-D-赤藓呋喃糖基)核苷酸；4′-硫代核苷酸、碳环核苷酸；5′-氨基-烷基磷酸酯；1，3-二氨基-2-丙基磷酸酯、3-氨基丙基磷酸酯；6-氨基己基磷酸酯；1，2-氨基十二烷基磷酸酯；羟丙基磷酸酯；1，5-脱水己糖醇核苷酸；L-核苷酸；α-核苷酸；被修饰的碱基核苷酸；二硫代磷酸酯；苏-戊呋喃糖基核苷酸；无环3′，4′-开环核苷酸；3，4-二羟基丁基核苷酸；3，5-二羟基戊基核苷酸、5′-5′-反向核苷酸部分；5′-5′-反向无碱基部分；5′-氨基磷酸酯；5′-硫代磷酸酯；1，4-丁二醇磷酸酯；5′-氨基；桥连和/或非桥连5′-氨基磷酸酯、硫代磷酸酯和/或二硫代磷酸酯、桥连或非桥联的甲基膦酸酯和5′-巯基部分(关于更详细内容，参见Beaucage和Iyer，Tetrahedron 49：1925，1993)。

siRNA设计

RNA干扰，或RNAi，是最初在植物(其中其被称为转录后基因沉默或PTGS)、线虫和果蝇(综述于Bernstein等人，2001；Carmell等人，2002)中描述的基因沉默机制。在目前的模型中，RNAi途径被双链RNA(dsRNA)“触发器(trigger)”(其之后被细胞酶Dicer加工成称为小干扰RNA(siRNA)的短的21至23个核苷酸的dsRNA)激活。siRNA被整合入RNA诱导的沉默复合体(RISC)，在所述复合体中siRNA的反义链充当引导物，将同源mRNA靶向siRNA/靶双链体(从siRNA引导链的5′末端开始大约10个碱基)内的核酸内切酶切割。在哺乳动物细胞中，长于30个核苷酸的dsRNA触发非特异性干扰素途径而不是RNAi。然而，Tuschl和其同事证明(Elbashir等人，2001a；Harborth等人，2001；Caplen等人，2002)外源引入哺乳动物细胞的更短的siRNA绕过了Dicer步骤并且直接激活同源mRNA降解，而不起始干扰素反应。随后，许多实验室证明体内表达抗人病毒和细胞靶的siRNA和相关短发夹RNA(shRNA)的可行性。RNAi的进展正迅速扩展并且对于治疗应用而言已取得相当大的进步(Zamore，2001；Kitabwalla和Ruprecht，2002；Martinez等人，2002；Couzin，2003；Scherr等人，2003；Wilson等人，2003；Hannon和Rossi，2004)。

合成siRNA是选择用于外源性的短期应用的方法。目前，未修饰的siRNA介导通常在转染后2至3天达到峰值的RNAi作用。合成siRNA的最常用设计模拟Dicer对触发器dsRNA的切割产生的内源siRNA(Elbashir等人，2001a)，其中有义和反义链为21至23个核苷酸长。除了在两个3′末端上的核苷酸突出外，双链体的退火部分完全互补。对于合成siRNA，3′二核苷酸突出可来源于靶序列，如在它们的天然对应物中一样。虽然从21至23聚体构建的siRNA足以满足大多数目的，但可使用多至29个核苷酸的寡聚物机而不起始干扰素作用。我们已观察到通过Dicer的作用在细胞中从更长的双链RNA产生的siRNA可以比外源提供的21聚体强100多倍的效力(Kim等人，2005)。由Siolas等人(2005)提供的指南手稿显示了相似的结论，虽然这些研究者使用合成的发夹作为Dicer底物。此处提及的研究将利用这些重要发现来产生用于动物研究的有效的siRNA。接下来将论述能够准确预测将从Dicer底物双链体RNA产生的siRNA的新设计规则(Kim等人，2005)。？

siRNA反义链与靶之间的错配，取决于它们的数目和位置，倾向于将活性降低至不同程度。虽然控制siRNA/靶错配和RNAi活性之间的关系的规则还不完全清楚，但可作一些归纳总结，它们适用于siRNA和简单shRNA。核酸内切酶的切割位置附近的突变频繁地但非总是减弱RNAi作用。此外，反义链的第一半部分(5′末端)中的突变也是非常有害的(Randall和Rice，2001；Holen等人，2002；Amarzguioui等人，2003)。因为核酸内切酶性切割是从反义siRNA链的5′末端开始‘测量的’，因此引导链的5′末端中的突变有可能使得反义/mRNA靶双链体在激活的RISC复合物中失去稳定，从而抑制切割。结合起来，这些结果表明，当设计RNAi构建体以靶向特定同种型时，可能期望这样选择靶同种型中的靶位点以使其相应的siRNA与未靶向的同种型之间的错配落在双链体的5′末端。如果这是不可能的，如当难以接近靶以进行切割时(综述于Scherer和Rossi，2003b)，则检测交叉反应性是很重要的。

虽然由21至23聚体构成的siRNA足以满足大多数目的，但可使用多至29个核苷酸的寡聚物机而不起始干扰素作用。我们已观察到通过Dicer的作用在细胞中从更长的双链RNA产生的siRNA可以比外源提供的21聚体的效力强高达100倍(Kim等人，2005)。由Siolas等人(2005)提供的指南手稿描述了相似的结论，虽然这些研究者使用合成的发夹作为Dicer底物。这些提及的研究将利用这些重要发现来产生有效力的siRNA用于动物研究。下面将讨论能够准确预测可以从Dicer底物双链体RNA产生的siRNA的新设计规则。

果蝇胚胎裂解物中的实验表明在合成siRNA链上需要游离的5′-OH或5′-磷酸(Elbashir等人，2001b；Nykanen等人，2001)。在HeLa提取物(Schwarz等人，2002)或完整细胞(Chiu和Rana，2002)中观察到相似的结果。一条或另一条siRNA链上的不对称5′氨基修饰显示反义链的5′氨基修饰消除了RNAi，然而仅有义链的相同修饰不抑制RNAi效果。同样地，除非用磷酸酶预处理，否则转染入细胞、后来再分离的非磷酸化合成siRNA不能被激酶在体外磷酸化(Chiu和Rana，2002)。结合起来，这表明了体内非常需要反义链上的5′磷酸。这与该核苷酸的修饰干扰反义链能够在激活的RISC复合体中用作核酸内切酶裂解性切割的引导物这一假说是一致的。在另一方面，封闭3′末端的修饰在大多数情况下对双链体siRNA，对任一链几乎没有影响(Amarzguioui等人，2003)。

siRNA双链体上主链修饰的研究已显示多至每条siRNA链6个分布在5′至3′末端之间的2′-O-甲氧基或者在3′末端上2个2′-O-烯丙基修饰不会不利地影响RNAi(Amarzguioui等人，2003)。增加修饰的数目超过该点或5′末端的烯丙基修饰削弱了RNAi(Amarzguioui等人，2003；Holen等人，2003)。相反地，2个以上的硫代磷酸酯修饰是有细胞毒性的，同时未促进效力的显著增加(Amarzguioui等人，2003)。只有当将siRNA直接注射入动物时才可实现siRNA上主链修饰的有利方面，因为主链修饰延长了此类分子的半衰期(Layzer等人，2004；Soutschek等人，2004)。此处，我们可利用由环糊精纳米颗粒载体提供的保护免受血清核酸酶降解的有利方面，从而我们的RNA将不用进行主链修饰，以使它们可在体内被有效切割。

序列的定义

RNAi可由使用阳离子脂质或其他载体递送至细胞的合成siRNA触发，或通过21聚体反义和有义链或可被加工成siRNA的短发夹RNA的基因表达来触发(综述于Scherer和Rossi，2003a)。siRNA介导的敲低(knockdown)成功的一个重要决定因素是靶位点可接近性与来自siRNA的适当链的选择的组合。我们和其他研究人员已开发了鉴定靶位点与siRNA双链体的适当组合的算法(Heale等人，2005)。我们的算法考虑了靶位点的二级结构预测和siRNA的双链体末端稳定性。后者在选择进入RISC的反义链中非常重要(Khvorova等人，2003；Schwarz等人，2003；Tomari等人，2004)。也已发现长至足以被RNA酶III家族成员Dicer切割的dsRNA可以比21聚体siRNA更强效高达100倍(Kim等人，2005；Siolas等人，2005)。因此，我们的用于鉴定靶位点和siRNA的优选方法是用我们的算法(Heale等人，2005)挑选序列基序，鉴定潜在的靶序列和21聚体siRNA并且就相对效力检测几个21聚体。

将用于确定最佳靶位点的新型计算机算法用于鉴定人内皮PAS结构域蛋白1(EPAS1)基因内的3个潜在靶位点。合成针对这3个靶序列的siRNA，并且如Davis等人在US 2006/0263435A1(以其全文通过引用合并入本文)所述在细胞提取物预筛选测定中对其进行检测。

之前已证明细胞提取物结合测定可高度预测细胞内效力(参见，例如，美国专利7,427,605，以其全文通过引用合并入本文)。简而言之，用³²P在它们的5’端标记合成的21聚体，并且将其在室温下于HEK 293细胞质提取物中进行温育。siRNA可被结合在包含RISC组分argonaute 2(Ago2)的复合体中。结合效力与细胞内效力强相关，如美国专利7,427,605的图6中所显示的。一旦鉴定了最强的21聚体，则将该序列整合入作为Dicer底物的27个碱基双链体内。已建立了用于Dicer切割的形式，从而从27聚体只产生选择的21聚体(参见下面)。因此，对使用所选择的27聚体的唯一限制是递送。用于体内Dicer切割的优选底物具有下列一般特征：

5’NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNdNdN 3’

3’NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN  N N5’

通过使用体外切割和切割产物的质谱分析，已确定Dicer识别2个碱基的3引发突出，并且从有义链的5′末端切割21个碱基，和从2碱基突出切割21个碱基，从而只产生1个21聚体。通过在有义链的3′末端包含2个脱氧核糖核苷酸(dN)，Dicer不能从该双链体的右手侧进入，从而确保只产生目的21聚体。美国专利7,427,605的图6和实施例1提供了其中将一系列仅有单个碱基差异的21聚体与提取物一起温育的提取物结合测定的代表性结果。siRNA的结合亲和力明确地与靶的敲低相关。已对20多个不同的siRNA重复了该测定，并且相关性依然。

如Heale等人，2005中所述利用算法运算人EPAS1 mRNA序列。就与其他人序列的潜在互补性分析前几个预测的siRNA和靶，观察在反义链的5′末端上延伸的匹配。以10nM的浓度检测与其他靶不共有延伸的5′同源性的序列。在随后的体内实验中可使用在A498细胞中展示EPAS1mRNA水平和/或抗增殖作用的最显著降低的dsRNA。

EPAS1抑制剂的用途

在某些实施方案中，本发明提供了抑制一种或多种细胞例如肿瘤或癌细胞或病原体细胞的不期望增殖的方法。在某些实施方案中，本发明提供了抑制或减少肿瘤生长的方法和治疗患有癌症的个体的方法。这些方法包括给个体患者施用有效量的一种或多种上述EPAS1抑制剂(例如，siRNA)。在某些实施方案中，本发明提供了用于治疗转移癌和/或预防转移的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于治疗抗常规疗法例如化疗药物的癌症的方法。某些方法特别地针对动物、更特别是人的治疗性和预防性治疗，并且在此类方法中，给该动物或人患者施用治疗有效量的EPAS1抑制剂。

术语“治疗”包括预防性和/或治疗性治疗。术语“预防性或治疗性”治疗是本领域内公认的并且包括给宿主施用一种或多种目标组合物。如果在不期望的状况(例如宿主动物的疾病或其他不期望的状态)的临床表现之前施用，那么治疗是预防性(即，其保护宿主以防止发展不期望的状况)，而如在不期望的状况表现之后施用，则治疗是治疗性的，(即其旨在减小、改善或稳定现有的不期望状况或其副作用)。

如本文中所使用的，“预防”病症或状况的治疗剂是指这样的化合物，其在统计样品中相对于未被治疗的对照样品而言减少被治疗的样品中病症或者状况的发生或者相对于未被治疗的对照样品而言延迟病症或状况的一个或多个症状的发作或降低其严重度。

如本文中描述的，肿瘤或癌症包括个体内部的肿瘤、肿瘤异种移植物或体外培养的肿瘤。特别地，本发明的核酸试剂可用于治疗或预防癌症。可通过所述方法治疗的癌症的示例性形式包括但不限于，前列腺癌、膀胱癌、肺癌(包括小细胞或非小细胞癌)、结肠癌、肾癌、肝癌、乳腺癌、宫颈癌、子宫内膜或其他子宫癌、卵巢癌、睾丸癌、阴茎癌、阴道癌、尿道癌、胆囊癌、食管癌或胰腺癌。可通过所述方法治疗的癌症的另外的示例性形式包括但不限于骨骼肌或平滑肌的癌症、胃癌、小肠癌、唾腺癌、肛门癌、直肠癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、脑下垂体癌和鼻咽癌。可使用本发明的EPAS1抑制剂治疗的癌症的另外的示例性形式包括含有表达hedgehog的细胞的癌症。可用本发明的EPAS1抑制剂治疗的癌症的另外的示例性形式包括包含表达EPAS1的细胞的癌症。在某些此类实施方案中，与癌症细胞属于相同组织类型的正常或非癌细胞可能不以可被本领域内的技术检测到的水平表达EPAS1；例如，正常肾组织或肾细胞不表达可检测水平的EPAS1，与肾癌细胞中EPAS1的表达相反。本发明预期可单独地使用本文中的EPAS1抑制剂，或可将其作为整体治疗方案(包括其他治疗剂和/或其他常规或非常规疗法)的部分而施用。

可使用本文中描述的EPAS1抑制剂核酸治疗的癌症的另外的实例包括下列疾病：白血病，例如但不限于急性白血病、急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病例如成髓细胞白血病(myeloblastic leukemias)、前髓细胞性白血病、粒单核细胞白血病、单核细胞性白血病(monocytic leukemias)以及红白血病白血病(erythroleukemia leukemias)和骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome)；慢性白血病，例如但不限于慢性髓细胞(粒细胞)白血病、慢性淋巴细胞白血病、多毛细胞白血病；真性红细胞增多症；淋巴瘤例如但不限于何杰金氏病、非何杰金氏病；多发性骨髓瘤例如但不限于冒烟型多发性骨髓瘤(smoldering multiple myeloma)、非分泌性骨髓瘤、骨硬化性骨髓瘤、浆细胞白血病、孤立性浆细胞瘤和髓外浆细胞瘤；华氏巨球卵白血症(WHO称为淋巴浆细胞样淋巴瘤)(s macroglobulinemia)；未确定重要性的单克隆免疫球蛋白病；良性单克隆丙种球蛋白病；重链病；骨和结缔组织肉瘤(bone and connective tissue sarcomas)例如但不限于骨肿瘤(bone sarcoma)、骨肉瘤、软骨肉瘤、尤文氏肉瘤、恶性巨细胞瘤、骨的纤维肉瘤、脊索瘤、骨膜肉瘤、软组织肉瘤、血管肉瘤(血管肉瘤)、纤维肉瘤、卡波西肉瘤(Kaposi’s sarcoma)、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、淋巴管肉瘤、神经鞘瘤、横纹肌肉瘤、滑膜肉瘤；脑瘤例如但不限于神经胶质瘤、星形细胞瘤、脑干胶质瘤、室管膜瘤、少突胶质细胞瘤、nonglial tumor、听神经瘤、颅咽管瘤、髓母细胞瘤、脑膜瘤、松果体细胞瘤、松果体母细胞瘤、脑原发性淋巴瘤；乳腺癌包括但不限于腺癌、小叶细胞癌(lobular(small cell)carcinoma)、导管内癌、乳腺髓样癌(medullary brest cancer)、乳腺粘液癌(mucinous brest cancer)、乳腺小管癌(tubular brest cancer)、乳腺乳头状癌(papillary brest cancer)、帕哲氏病(Paget’s disease)炎性乳腺癌；肾上腺癌例如但不限于嗜铬细胞瘤和肾上腺皮质癌；甲状腺癌例如但不限于甲状腺乳头状癌或甲状腺滤泡状癌(papillary or follicular thyroid cancer)、甲状腺髓样癌和甲状腺未分化癌(anaplastic thyroid cancer)；胰腺癌例如但不限于，胰岛瘤、胃泌素瘤、胰高血糖素瘤、胰腺瘤、分泌生长抑素的肿瘤和类癌或胰岛细胞瘤；垂体癌例如但不了如限于库欣综合征(Cushing’s disease)、垂体催乳素瘤(prolactin-secreting tumor)、肢端肥大症和和尿崩症；眼癌(eye cancers)例如但不限于眼黑色素瘤(ocular melanoma)例如虹膜黑色素瘤(iris melanoma)、脉络膜黑素瘤和睫状体黑色素瘤(cilliary body melanoma)和视网膜母细胞瘤；阴道癌例如鳞状细胞癌、腺癌和黑素瘤；外阴癌例如鳞状细胞癌、黑素瘤、腺癌、基底细胞癌、肉瘤和帕哲氏病(Paget’s disease)；宫颈癌例如但不限于，鳞状细胞癌，和腺癌；子宫癌例如但不限于子宫内膜癌和子宫肉瘤；卵巢癌例如但不限于，卵巢上皮癌、交界瘤、生殖细胞瘤和间质瘤；食管癌例如但不限于，鳞癌、腺癌、腺样囊性癌(adenoid cyctic carcinoma)、粘液表皮样癌、腺鳞癌、肉瘤、黑素瘤、浆细胞瘤、疣状癌和食管小细胞癌(oat cell(small cell)carcinoma)；胃癌例如但不限于，腺癌、真菌样生长(fungating)(息肉样)、溃疡、浅表扩散、弥散性扩散(diffusely spreading)、恶性淋巴瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤和癌肉瘤；结肠癌；直肠癌；肝癌例如但不限于肝细胞癌和肝母细胞瘤；胆囊癌例如腺癌；胆管癌(cholangiocarcinomas)例如但不限于pappillary、结节(nodular)和扩散(diffuse)；肺癌例如非小细胞肺癌、鳞状细胞癌(表皮样癌(epidermoid carcinoma))、腺癌、大细胞癌和小细胞肺癌；睾丸癌例如但不限于生殖细胞瘤、精原细胞瘤、未分化(anaplastic)、经典(classic)(典型的(typical))、精母细胞型(spermatocytic)、非精原细胞瘤、胚胎性癌、畸胎癌(teratomacarcinoma)、绒毛膜癌(卵黄囊瘤)、前列腺癌例如但不限于，腺癌、平滑肌肉瘤和横纹肌肉瘤；penal cancers；口腔癌例如但不限于鳞状细胞癌；基底型癌(basal cancers)；唾腺癌例如但不限于腺癌、粘液表皮样癌和涎腺腺样囊性癌；咽癌(pharynx cancers)例如但不限于鳞状细胞癌和疣状(verrucous)；皮肤癌例如但不限于，基底细胞癌、鳞状细胞癌和黑素瘤、浅表扩散性黑素瘤、结节性黑素瘤、恶性雀斑样痣黑素瘤、肢端雀斑样痣性黑素瘤；肾癌例如但不限于肾透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma)、乳头状肾细胞癌、肾嫌色细胞癌(chromophobe renal cell carcinoma)、肾嗜酸细胞瘤、腺癌、肾上腺样瘤、纤维肉瘤、移行细胞癌(肾盂和/或子宫)；肾母细胞瘤；膀胱癌例如但不限于移行细胞癌、鳞状细胞癌、腺癌、癌肉瘤。此外，癌症包括黏液肉瘤、骨肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、间皮瘤、滑膜瘤、血管母细胞瘤、上皮癌、囊腺癌、原发性支气管癌(bronchogenic carcinoma)、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌和乳头状腺癌(关于此类病症的综述，参见Fishman等人，1985，Medicine，第2版，J.B.Lippincott Co.，Philadelphia and Murphy等人，1997，Informed Decisions：The Complete Book of Cancer Diagnosis，Treatment，and Recovery，Viking Penguin，Penguin Books U.S.A.，Inc.，United States of America)。

在某些实施方案中，本发明提供了抑制正常细胞(例如，非癌细胞和/或非病原性细胞)的不期望增殖的方法。例如，正常细胞可以是毛发生长所需要的细胞，不期望的毛发生长可用本文中描述的方法来治疗；细胞的不期望的增殖可在正常毛发生长中，在毛发病、多毛症、妇女多毛症(hirsutism)或毛囊炎(包括毛囊炎性脱发、网状红瘢性毛囊炎(folliculitis ulerythematosa reticulata)、瘢痕疙瘩性毛囊炎(keloid folliculitis)和假毛囊炎)中发生。在一个另外的实例中，正常细胞可以是参与不期望的免疫反应例如自身免疫反应、移植排斥等的免疫细胞。在一个示例性实施方案，正常细胞可以是正常T细胞，T细胞的过度活性或增殖是造成许多疾病或状况的原因，所述疾病或状况包括：糖尿病、关节炎(包括类风湿性关节炎、幼年型类风湿性关节炎、骨关节炎，和银屑病关节炎)、多发性硬化症、脑脊髓炎、重症肌无力、系统性红斑狼疮、自身免疫性甲状腺炎、皮炎(包括异位性皮炎和湿疹性皮炎)、银屑病、干燥综合症、克罗恩病、口疮性溃疡、虹膜炎、结膜炎、角膜结膜炎、I型糖尿病、炎症性肠病、溃疡性结肠炎、哮喘、过敏性哮喘、皮肤型红斑狼疮、硬皮病、阴道炎、直肠炎、药疹、麻风病逆行反应(leprosy reversal reactions)、麻风结节性红斑、自身免疫性葡萄膜炎、变态反应性脑脊髓炎、急性坏死出血性脑病(acute necrotizing hemorrhagic encephalopathy)、特发性双耳进行性感音神经性听觉丧失(idiopathic bilateral progressive sensorineural hearing loss)、再生障碍性贫血、单纯红细胞性贫血、特发性血小板减少症、多软骨炎、韦格纳肉芽肿(Wegener′s granulomatosis)、慢性活动型肝炎、史帝芬-琼森氏征候群(Stevens-Johnson syndrome)、特发性脂肪泻、扁平苔藓、格雷夫斯病、结节病、原发性胆汁性肝硬化、后葡萄膜炎、间质性肺纤维化(interstitial lung fibrosis)、移植物抗宿主病、移植的病例(包括使用同种异体或异种组织的移植)例如骨髓移植、肝移植或者任何器官或组织的移植、变态反应例如特应性变态反应和T-细胞肿瘤例如白血病和/或淋巴瘤。

在本文方法的某些实施方案中，可一起(同时)或在不同的时间(相继地)施用EPAS1的一种或多种核酸抑制剂。例如，可按照本文中描述的方法使用两种或更多种dsRNA、siRNA或酶促核酸或其组合。

在某些实施方案中，可单独使用本发明的目标抑制剂核酸。可选择地，可将目标抑制剂核酸与其他常规抗癌剂、抗原病体药物或针对不期望细胞增殖的治疗或预防的其他治疗途径组合来施用。例如，此类方法可用于预防性癌症预防、术后癌症复发和转移的预防以及作为其他常规癌症疗法的辅助。本发明认识到常规癌症疗法(例如化学疗法、放射疗法、光疗法、免疫疗法和手术)的功效可通过使用目标核酸试剂来增强。当使用含有EPAS1抑制剂和另一种治疗剂的联合治疗时，此类治疗剂可分开或结合施用。在某些实施方案中，联合治疗可包括EPAS1抑制剂核酸和另一种治疗剂，它们配制在一起或作为分开的制剂施用。

已显示众多常规化合物具有抗肿瘤活性。此类化合物在化学疗法中已被用作药剂来缩小实体瘤，预防转移和进一步生长，或减少白血病或骨髓恶性肿瘤中恶性细胞的数目。虽然化学疗法在治疗各种类型的恶性肿瘤中是有效的，但许多抗肿瘤化合物可诱导不期望的副作用。已显示当组合两种或更多种不同治疗法时，治疗法可协同作用并且有可能降低各治疗法的剂量，从而减少由各化合物在更高剂量下产生的有害副作用。在其他情况下，难以治疗的恶性肿瘤有可能对两种或更多种不同治疗法的联合治疗产生响应。

某些化疗治疗剂可引起不期望的EPAS1的上调，从而诱导以下一种或多种蛋白质的表达：细胞周期蛋白G2、c-Met、CXCR4、IGF2、IGF-BP1、IGF-BP2、IGF-BP3、EGF、WAF-1、TGF-α、TGF-β3、ADM、EPO、IGF2、EG-VEGF、VEGF、NOS2、LEP、LRP1、HK1、HK2、AMF/GP1、ENO1、GLUT1、GAPDH、LDHA、血小板衍生生长因子B、PFKBF3、PKFL、MIC1、NIP3、NIX、RTP801和/或某些基质金属硫蛋白。通过其对血管生成的诱导和其对无氧代谢的激活而促进细胞存活，据信EPAS1的激活可能抵消了此类药物的其他抗癌活性。因此，可将EPAS1抑制剂与某些化疗药物组合使用以获得更大的功效。

可用于与EPAS1抑制剂一起用于所述联合治疗的药剂包括(仅举例说明)：氨鲁米特、安吖啶、阿那曲唑、天冬酰胺酶、bcg、比卡鲁胺、博来霉素、布舍瑞林、白消安、喜树碱、卡培他滨、卡铂、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、氯膦酸、秋水仙碱、环磷酰胺、环丙孕酮、阿糖胞苷、达卡巴嗪、放线菌素D、柔红霉素、己二烯雌酚、己烯雌酚、多烯紫衫醇、多柔比星、表柔比星、雌二醇、雌莫司汀、依托泊苷、依西美坦、非格司亭、氟达拉滨、氟氢可的松、氟尿嘧啶、氟甲睾酮、氟他胺、吉西他滨、染料木黄酮(genistein)、戈舍瑞林、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、伊马替尼、干扰素、伊立替康(irinotecan)、伊立替康(ironotecan)、来曲唑、亚叶酸、亮丙瑞林、左旋咪唑、洛莫司汀、氮芥、甲羟孕酮、甲地孕酮、美法仑、巯嘌呤、美司钠、甲氨碟呤、丝裂霉素、米托坦、米托蒽醌、尼鲁米特、诺考达唑、奥曲肽、奥沙利铂、紫杉醇、帕米膦酸、喷司他丁、普卡霉素、卟菲尔钠(porfimer)、甲基苄肼、雷替曲塞、利妥昔单抗、链佐星(streptozocin)、舒拉明、他莫昔芬、替莫唑胺、替尼泊甙、睾酮、硫鸟嘌呤、噻替派、二氯二茂钛、拓扑替康、曲妥珠单抗、维A酸、长春碱、长春新碱、长春地辛和长春瑞滨。

此类抗癌剂可根据它们的作用机制分类为例如下列类型：抗代谢产物/抗癌药剂，例如嘧啶类似物(5-氟尿嘧啶、氟尿苷、卡培他滨、吉西他滨和阿糖胞苷)和嘌呤类似物、叶酸拮抗剂和相关抑制剂(巯嘌呤、硫鸟嘌呤、喷司他丁和2-氯脱氧腺苷(克拉屈滨))；抗增殖/抗有丝分裂药包括天然产物例如长春花生物碱类(长春碱、长春新碱和长春瑞滨)，微管破坏剂例如例如紫杉烷(紫杉醇、多烯紫衫醇)、长春新碱、长春碱、诺考达唑、埃博霉素和诺维本、鬼臼乙叉甙(epidipodophyllotoxins)(替尼泊苷)，DNA损伤剂(放线菌素、安吖啶、蒽环类药、博来霉素、白消安、喜树碱、卡铂、苯丁酸氮芥、顺铂、环磷酰胺(cyclophosphamide)、环磷酰胺(cytoxan)、放线菌素D、柔红霉素、多烯紫衫醇、多柔比星、表柔比星、hexamethylmelamineoxaliplatin、异环磷酰胺、美法仑、merchlorethamine、丝裂霉素、米托蒽醌、亚硝基脲、紫杉醇、普卡霉素、甲基苄肼、替尼泊苷、三亚乙基硫代磷酰胺和依托泊苷(VP16))；抗生素例如更生霉素(dactinomycin)(放线菌素D)、柔红霉素、多柔比星(阿霉素)、伊达比星、蒽环类药、米托蒽醌、博莱霉素、普卡霉素(光神霉素(mithramycin))和丝裂霉素；酶(系统性代谢L天冬酰胺和剥夺不具有合成它们自己的天冬酰胺的能力的细胞)；抗血小板剂；抗增殖/抗有丝分裂烷化剂例如氮芥类(氮芥、环磷酰胺和类似物、美法仑、苯丁酸氮芥)、乙烯亚胺类和甲基三聚氰胺(methylmelamines)(六甲蜜胺和塞替派)、烷基磺酸盐-白消安、亚硝基脲类(卡莫司汀(BCNU)和类似物链佐星)、三氮烯类-氮烯唑胺(DTIC)；抗增殖/抗有丝分裂抗代谢药物例如叶酸类似物(甲氨蝶呤)；铂配位复合物(platinum coordination complexes)(顺铂、卡铂)、甲基苄肼、羟基脲、米托坦、氨鲁米特；激素类、激素类似物(雌激素、他莫昔芬、戈舍瑞林、比卡鲁胺、尼鲁米特)和芳香化酶抑制剂(来曲唑、阿那曲唑)；抗凝剂(anticoagulants)(肝素、人造肝素盐和凝血酶(thrombin)的其他抑制剂)；纤维蛋白溶解药(例如组织型纤维蛋白溶酶原激活剂、链激酶和尿激酶)、阿司匹林、COX-2抑制剂(inhibitors)、双嘧达莫、噻氯匹定、氯吡格雷、阿昔单抗；抗迁移剂(antimigratory agent)；抗分泌因子(蛋白转运抑制剂(breveldin))；免疫抑制剂(环孢菌素、他克莫司(FK-506)、西罗莫司(雷帕霉素)、硫唑嘌呤、霉酚酸酯)；抗血管生成化合物(TNP-470、染料木黄酮)和生长因子抑制剂(血管内皮生长因子(VEGF)抑制剂、成纤维细胞生长因子(FGF)抑制剂、表皮生长因子(EGF)抑制剂)；血管紧张素受体抑制剂；一氧化氮供体；反义寡核苷酸；抗体(曲妥珠单抗)；细胞周期抑制剂和分化诱导剂(维A酸)；mTOR抑制剂、拓扑异构酶抑制剂(多柔比星(阿霉素)、安吖啶、喜树碱、柔红霉素、放线菌素D、去羟栀子甙(eniposide)、表柔比星、依托泊苷、伊达比星、伊立替康(CPT-11)和米托蒽醌、拓扑替康、伊立替康)、皮质激素(可的松、地塞米松、氢化可的松、甲基强的松龙(methylpednisolone)、泼尼松(prednisone)和泼尼松龙(prenisolone))；生长因子信号传导激酶抑制剂；线粒体功能障碍诱导剂和天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(caspase)激活剂；染色质破坏剂(chromatin disruptor)。

此类抗癌药可单独地与EPAS1抑制剂一起使用，或与另外的抗癌药组合使用。在现有技术中已开发了许多联合治疗，包括但不限于上面所列的联合治疗。除了常规抗癌药外，本方法的药剂还可以是抑制有助于不期望的细胞增殖(为常规化学疗法的靶)的细胞成分表达的化合物和反义RNA、RNAi或其他多核苷酸。此类靶是(仅举例说明)生长因子、生长因子受体、细胞周期调控蛋白、转录因子或信号转导激酶。

本发明的方法可能因允许常规抗癌药在更低的剂量上产生更大的作用而优于现有联合治疗。在本发明的优选实施方案中，当与EPAS1抑制剂(例如核酸构建体)组合使用时，抗癌药或抗癌药组合的有效剂量(ED₅₀)至多是单独的抗癌药(即与在无EPAS1抑制剂的情况下相同药剂相比)的ED₅₀的五分之一。相反地，当与EPAS1抑制剂(例如，核酸构建体)组合使用时，此类抗癌药或此类抗癌药组合的治疗指数(TI)是所述抗癌药方案单独使用(即与在无EPAS1抑制剂的情况下相同药剂相比)的TI的至少5倍。

在某些实施方案中，可将本文中描述的EPAS1抑制剂核酸与其他治疗剂一起施用，所述其他治疗剂包括例如抗炎剂、免疫抑制剂和/或抗感染剂(例如抗生素抗病毒和/或抗真菌化合物等)。一些示例性抗炎药包括例如甾体(steroidal)(例如，皮质醇、醛固酮、泼尼松、甲基强的松、曲安西龙(triamcinolone)、地塞米松、去氧皮质酮和氟皮质醇)和非甾体抗炎药(例如布洛芬、萘普生和吡罗昔康)。一些示例性免疫抑制药包括例如泼尼松、硫唑嘌呤(依木兰)、环孢菌素(山地明、新山地明)、雷帕霉素、抗胸腺细胞球蛋白、达克珠单抗、OKT3和ALG、霉酚酸酯(Cellcept)和他克莫司(Prograf、FK506)。示例性抗生素包括，例如，磺胺药物(例如，磺胺)，叶酸类似物(例如，甲氧苄啶)、β内酰胺(例如，青霉素、头孢菌素类)、氨基糖苷类(例如，链霉素、卡那霉素、新霉素、庆大霉素)、四环素类(例如，金霉素、土霉素和强力霉素)、大环内酯类(例如，红霉素、阿奇霉素和克拉霉素)、林可酰胺类(例如，克林霉素)、链阳菌素类(例如，奎奴普丁和达福普汀)、氟喹诺酮类(例如，环丙沙星、左氧氟沙星和莫西沙星)、多肽类(例如，多粘菌素类)、利福平、莫匹罗星、环丝氨酸、氨基环醇(例如，壮观霉素)、糖肽类(例如，万古霉素)和噁唑烷酮类(例如，利奈唑胺)。一些示例性抗病毒剂包括例如阿糖腺苷、阿昔洛韦、丙氧鸟苷、缬更昔洛韦，核苷类似物逆转录酶抑制剂抑制剂(例如，ZAT、ddI、ddC、D4T、3TC)，非核苷类逆转录酶抑制剂(例如，奈韦拉平、地拉韦啶)，蛋白酶抑制剂(例如，沙奎那韦、利托那韦、茚地那韦、奈非那韦)、利巴韦林、金刚烷胺、金刚乙胺、瑞乐沙(relenza)、达菲、普来可那立和干扰素类。示例性抗真菌药包括，例如，多烯类抗真菌药(polyene antifungals)(例如，两性霉素和制霉菌素)、咪唑类抗真菌药(酮康唑和咪康唑)、三唑类抗真菌药物(例如，氟康唑和伊曲康唑)、氟胞嘧啶、灰黄霉素和特比萘芬。

在其他方面，还可将本文中描述的EPAS1抑制剂核酸与抑制HIF1α的其他试剂例如由Khodadoust和Sharma(US 2006/0135443A1)描述的化合物组合施用。还可将此类化合物与本文中描述的EPAS1抑制剂一起或进一步与上述抗癌药组合来使用。

在其他实施方案中，本公开内容提供了抑制血管生成的方法和治疗血管生成相关疾病的方法。如本文中描述的，血管生成相关疾病包括但不限于：依赖于血管生成的癌症，包括例如实体瘤、血液传播肿瘤(blood born tumor)例如白血病和肿瘤转移；良性肿瘤，例如血管瘤、听神经瘤、神经纤维瘤、沙眼和化脓性肉芽肿；炎性疾病例如免疫和非免疫性炎症；慢性关节风湿和银屑病；眼血管生成疾病(ocular angiogenic disease)，例如，糖尿病性视网膜病、早产儿视网膜病变、黄斑变性、角膜移植片排斥、新生血管性青光眼、晶体后纤维膜增生症、虹膜红变(rubeosis)；奥韦综合征；心肌血管新生；新生血管形成斑(plaque neovascularization)；毛细血管扩张；血友病性关节炎(hemophiliac joints)；血管纤维瘤；和创伤性肉芽形成(wound granulation)和伤口愈合；毛细血管扩张(telangiectasia)、银屑病、硬皮病、化脓性肉芽肿、冠状动脉侧枝(cororany collaterals)、缺血性四肢血管生成(ischemic limb angiogenesis)、角膜疾病、虹膜红变(rubeosis)、关节炎、关节炎、骨折、血管生成(vasculogenesis)、造血作用。

应理解，本公开内容的方法和组合物还用于治疗任何不依赖于血管生成的癌症(肿瘤)。如本文中所使用的，术语“不依赖于血管生成的癌症”是指其中在肿瘤组织中几乎不存在或不存在新生血管形成的癌症(肿瘤)。

在此类方法的某些实施方案中，可一起(同时)或在不同的时间(相继地)施用一种或多种核酸治疗剂。此外，可将核酸治疗剂与另一种类型的用于治疗癌症或用于抑制血管生成的化合物一起施用。

取决于联合治疗的性质，可在继续本发明的核酸治疗剂的施用的同时和/或之后施用其他疗法。可以以单次剂量或以多个剂量进行核酸治疗剂的施用。在一些情况下，在常规治疗之前至少数天开始核酸治疗剂的施用，然而在其他情况下，在即将施用常规疗法之前或在施用常规疗法的同时开始施用。

施用的方法和组合物

在某些实施方案中，本发明提供包含本文中描述的一种或多种EPAS1抑制剂的组合物。在某些实施方案中，所述组合物是适合在患者中治疗性使用的药物。在某些实施方案中，所述组合物是适合于动物或人中美容使用的化妆品。在一些备选实施方案中，所述组合物是非药用的和非美容用途的。一般地，化妆品与药物之间的差异是后者需要机构批准(例如由食品和药物管理局批准)以用于人或动物。

用于递送EPAS1抑制剂、尤其是核酸的方法可基于本领域内已知的方法(参见，例如，Akhtar等人，Trends Cell Bio.，2：139，1992；和Delivery Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics，ed.Akhtar，1995；Sullivan等人，PCT公开案WO 94/02595)。可利用、改动或改进此类方案以递送实际上任何核酸。可通过本领域技术人员已知的许多方法将核酸递送至细胞，包括但不限于脂质体中的封装、通过离子透入法或通过掺入其他载体(例如水凝胶、环糊精、生物可降解纳米囊和生物粘附微球)。可选择地，通过直接注射或通过使用输注泵来局部递送核酸/载体组合。递送的其他途径包括但不限于口服(片剂或丸剂形式)和/或硬膜内递送(Gold，Neuroscience，76：1153-1158，1997)。其他途径包括使用各种转运体和载体系统，例如通过使用缀合物和生物可降解聚合物。在某些实施方案中，可组合目标EPAS1抑制剂和媒介物(vehicle)并且在施用之前以终剂量配制。在备选实施方案中，分开配制目标EPAS1抑制剂和媒介物以便可在施用时组合它们。例如，可将目标EPAS1抑制剂和媒介物贮存在递送试剂盒或包装的分开的隔室(compartments)中，并且在施用至期望的部位时或通过期望的途径施用时，混合目标EPAS1抑制剂和媒介物以进行递送。这些分开的隔室可以是试剂盒中分开的小瓶、药剂递送笔形注射器中分开的药筒(参见美国专利5,542,760)、注射器中的分开的插管或隔室等。

在某些实施方案中，目标EPAS1抑制剂以包含聚合物微粒或纳米颗粒作为递送媒介物的超分子复合物的形式提供。如本文中所使用的，术语“微粒”或“纳米颗粒”包括微球或纳米球(均一的球体)、微胶囊或纳米胶囊(具有核心和聚合物的外层)和形状不规则的颗粒。

本发明涉及聚合物的应用，所述聚合物优选在期望EPAS1抑制剂释放的时期内或之后相对较早的时间内(通常在一年，更常见地数月，甚至更常见地数天至数周的范围内)是生物可降解的。生物降解可以指微粒的崩解，即形成微粒/纳米颗粒的聚合物和/或聚合物本身的解离。这可因颗粒在其中施用的载体的pH向释放部位的pH的变化(如在二酮哌嗪的情况下)、水解(如在聚(羟酸)的情况下)、通过离子例如钙扩散出微粒(如在由聚合物例如藻酸盐的离子键合形成的微粒或纳米颗粒的情况下)和通过酶促作用(如在许多多糖和蛋白质的情况下)而发生。在一些情况下，线性释放可能是最有用的，虽然在其他情况下脉冲释放或“集团释放(bulk release)”可以提供更有效的结果。

代表性的合成材料有：二酮哌嗪，聚(羟酸)例如聚(乳酸)，聚(乙醇酸)和其共聚物，聚酐、聚酯例如聚原酸酯、聚酰胺、聚碳酸酯、聚烯类(polyalkylenes)例如聚乙烯、聚丙烯、聚乙二醇、聚(环氧乙烷)、聚对苯二甲酸乙二酯(poly(ethylene terephthalate))、聚乙烯化合物例如聚乙烯醇、聚乙烯醚、聚乙烯酯、聚卤代烯烃、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙乙烯酸酯和聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚硅氧烷、丙烯酸和甲基丙烯酸的聚合物包括聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸丁酯)、聚(甲基丙烯酸异丁酯)、聚(甲基丙烯酸己酯)、聚(甲基丙烯酸异癸酯)、聚(甲基丙烯酸月桂酯)、聚(聚甲基丙烯酸苯酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸异丙酯)、聚(丙烯酸异丁酯)、聚(丙烯酸十八酯)、聚氨基甲酸酯和其共聚物、纤维素包括烷基纤维素、羟烷基纤维素、纤维素醚、纤维素酯、硝基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丁基甲基纤维素、醋酸纤维素、丙酸纤维素、醋酸丁酸纤维素、苯二甲酸醋酸纤维素、羧乙基纤维素、三醋酸纤维素和纤维素硫酸钠盐、聚(丁酸)、聚(戊酸)和聚(丙交酯-共-己内酯)。

天然聚合物包括藻酸(盐/酯)和其他多糖(包括葡聚糖和纤维素)、胶原、白蛋白和其他亲水性蛋白质、玉米醇溶蛋白和其他醇溶蛋白和疏水性蛋白质、其共聚物和混合物。如本文中所使用的，其化学衍生物是指化学基团例如烷基、烯基的置换、添加、羟化、氧化以及由本领域技术人员常规进行的其他修饰。

生物粘附聚合物(Bioadhesive polymer)包括由H.S.Sawhney，C.P.Pathak和J.A.Hubell in Macromolecules 26：581-587，1993描述的生物可蚀解的水凝胶、聚透明质酸(polyhyaluronic acid)、酪蛋白、明胶、明胶蛋白、聚酐、聚丙烯酸、海藻酸、壳聚糖和聚丙烯酸酯。

对于关于药物递送策略的综述，参见Ho等人，Curr.Opin.Mol.Ther.1：336-343，1999和Jain，Drug Delivery Systems：Technologies and Commercial Opportunities，Decision Resources，1998以及Groothuis等人，J.Neuro Virol.3：387-400，1997。在Sullivan等人，同上，Draper等人，PCT WO93/23569，Beigelman等人，PCT申请案WO99/05094，和Klimuk等人，PCT申请案WO99/04819中提供了核酸递送和施用的更详细描述。

短语“胃肠外施用”和“经胃肠外施用”如本文中所使用的，是指除了肠和局部施用外的施用模式，通常通过注射来施用，其包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、硬膜内、囊内、眶内、心内、真皮内(intradermal)、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下(subcapsular)、蛛网膜下、脊内、胸骨内注射和输注以及肝内动脉施用(包括肝内注射和肝内输注)。

短语“全身性施用”、“全身地施用”、“外周施用(peripheral administration)”和“外周地施用”，如本文中所使用的，是指除了直接进入中枢神经系统外的使其进入患者的系统，从而经历代谢等过程的化合物、药物或其他材料的施用，例如，皮下施用。

在某些实施方案中，用药学上可接受的载体配制本发明的目标核酸(例如，RNAi构建体和酶促核酸)。可单独施用或作为药物制剂(组合物)的成分施用此类治疗剂。这些药剂可配制成以任何方便的方式(用于人或兽医药剂的)施用的形成。湿润剂、乳化剂和润滑剂例如月桂基硫酸钠和硬脂酸镁以及着色剂、释放剂、包衣剂、甜味剂、调味剂和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂也可存在于组合物中。

目标核酸的制剂包括适合于全身性、局域、口服、经鼻、局部、胃肠外、直肠和/或阴道内施用的那些形式。制剂可方便地以单位药物剂型提供并且可通过药学领域内熟知的任何方法来制备。可与载体材料组合以产生单个剂型的活性成分的量将视待治疗的宿主、施用的具体模式而变化。可与载体材料组合以产生单个剂型的活性成分的量通常为产生治疗效果的化合物的那个量。

在某些实施方案中，制备此类制剂或组合物的方法包括将另一种类型的治疗剂或抗感染剂与载体以及任选地一种或多种助剂(accessory ingredient)组合。一般地，可使用液体载体或微粒固体载体或两者来制备制剂，然后，需要时，使产品成型。

用于口服施用的制剂可以以胶囊、扁囊剂、丸剂、片剂、锭剂(使用调味基质，通常是蔗糖和阿拉伯胶或黄芪胶)、粉剂、颗粒剂的形式或作为水性或非水性液体中的溶液或悬浮液，或作为水包油或油包水液体乳剂或作为酏剂或糖浆剂，或作为软锭剂(使用惰性基质，例如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶)和/或作为漱口剂(mouth wash)等形式存在，其各自包含预先确定量的目标核酸治疗剂作为活性成分。

在用于口服施用的固体剂型(胶囊剂、片剂、丸剂、锭剂、粉剂、颗粒剂等)中，可将本发明的一种或多种核酸治疗剂与一种或多种药学上可接受的载体例如柠檬酸钠或磷酸二钙和/或任何下列物质混合：(1)填充剂或增充剂，例如淀粉，乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和/或硅酸；(2)粘合剂例如羧甲基纤维素、藻酸盐/酯、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和/或阿拉伯胶；(3)保湿剂，例如甘油；(4)崩解剂，例如琼脂-琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠；(5)溶液阻滞剂，例如石蜡；(6)吸收促进剂，例如季铵化合物；(7)湿润剂例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(8)吸收剂，例如高岭土和膨润土粘土；(9)润滑剂，例如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠和其混合物；和(10)着色剂。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，药物组合物还可包含缓冲剂。通过使用这样的赋形剂如乳糖或奶糖(milk sugar)以及高分子量聚乙二醇等，相似类型的固体组合物还可用作软填充和硬填充明胶胶囊中的填充剂。

用于口服施用的液体剂型包括药学上可接受的乳剂、微乳剂、溶液、悬浮液、糖浆剂和酏剂。除了活性成分外，液体剂型还可包含本领域内常用的惰性稀释剂，例如水或其他溶剂、增溶剂和乳化剂例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁二醇、油(特别地，棉籽油、落花生油、玉米油、胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢呋喃醇、聚乙二醇和脱水山梨糖醇的脂肪酸酯以及其混合物。除了惰性稀释剂外，口服组合物还可包括佐剂例如湿润剂、乳化及悬浮剂、甜味剂、调味剂、着色剂、芳香剂和防腐剂。

除了活性化合物外，悬液中还可包含悬浮剂例如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨糖醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝(aluminum metahydroxide)、膨润土、琼脂-琼脂和黄芪胶以及其混合物。

可将本发明的方法和组合物局部施用至皮肤或粘膜例如子宫颈和阴道上的粘膜。这为定向递送至定位在皮肤或粘膜的不期望的细胞增殖提供了最大的机会，同时诱导副作用的可能性最低。局部制剂还可包含已知可有效作为皮肤或角质层穿透促进剂的众多种试剂中的一种或多种试剂。此类穿透促进剂的实例是2-吡咯烷酮、N-甲基-2-吡咯烷酮、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、丙二醇、甲醇或异丙醇，二甲基亚砜以及月桂氮酮(azone)。还可包含另外的试剂来制备美容上可接受的制剂。此类试剂的实例是脂肪、石蜡、油、染料、芳香剂、防腐剂、稳定剂和表面活性剂。还可包含角质溶解剂，例如本领域内已知的角质溶解剂。实例是水杨酸和硫磺。

用于局部或经皮肤施用的剂型包括粉剂、喷雾剂、软膏、糊剂、乳膏剂、洗剂、凝胶、溶液、贴剂(patche)和吸入剂。可在无菌条件下将目标核酸与药学上可接受的载体以及与可能需要的任何防腐剂、缓冲剂或喷射剂混合。除了目标核酸分子外，软膏、糊剂、乳膏剂和凝胶中还可包含赋形剂例如动物和植物脂肪、油、蜡、石蜡、淀粉、黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨润土、硅酸、滑石和氧化锌或其混合物。

除了目标核酸治疗剂外，粉剂和喷雾剂中还可包含赋形剂例如乳糖、滑石、硅酸、氢氧化铝、硅酸钙和聚酰胺粉剂或此类物质的混合物。喷雾剂可额外地包含常用喷射剂例如氯氟烃(chlorofluorohydrocarbon)和挥发性的未取代烃类例如丁烷和丙烷。

还提供了适合于吸入的制剂，此类制剂可用于经肺递送，其可被定位至肺系统或全身。用于经肺递送的药用装置的实例包括计量吸入器(metered dose inhaler，MDI)和干粉吸入器(dry powder inhaler，DPI)。可适合于通过吸入递送目标EPAS1抑制剂和/或活性剂的示例性递送系统描述于例如美国专利5,756,353；5,858,784；和PCT申请WO98/31346；WO98/10796；WO00/27359；WO01/54664；WO02/060412中。可用于递送EPAS1抑制剂和/或活性剂的其他气雾剂描述于美国专利6,294,153；6,344,194；6,071,497，美国专利申请公开案2004/0063654，和PCT申请WO02/066078；WO02/053190；WO01/60420；WO00/66206中。

加压计量吸入器(pMDI)是世界上最常用的吸入器。当打开阀门(通常通过向下压喷射剂罐)，让液体喷射剂喷出罐时，气雾剂产生。通常，药物或治疗剂包含在悬浮于液体喷射剂的小颗粒(通常直径为数微米)中，但在一些制剂中，可将药物或治疗剂溶解在喷射剂中。当气雾剂离开装置时，喷射剂快速蒸发，产生被吸入的小药物或治疗剂颗粒。通常用于此类pMDI中的喷射剂包括但不限于氢氟烷(hydro fluoroalkane，HFA)。对于pMDI，还可使用例如表面活性剂来配制药物或治疗剂。其他溶剂或赋形剂也可与pMDI一起使用，例如乙醇、抗坏血酸、偏亚硫酸钠、甘油、三氯叔丁醇和盐酸十六烷基吡啶。此类pMDI还可包括另外加上去的装置，例如隔离物(spacer)、容纳室和其他改进。

第三种类型的吸入器在干粉吸入器(DPI)。在DPI中，气雾剂通常是粉剂，其包含在装置内直至吸入。以粉剂形式将治疗剂或药物制造为小粉剂颗粒(直径通常为数百万分之一米或微米)。在许多DPI中，将药物或治疗剂与直径通常为50-100微米的大得多的糖颗粒(例如，乳糖一水合物)混合。除了可以更容易地填充小的单个粉剂剂量外，对乳糖/药物聚结物的增加的气动力促进了药物颗粒在吸入时的输送。当吸入时，借助于湍流和/或机械装置例如在颗粒聚结物撞击于其上的屏或旋转表面(spinning surface)，粉剂被粉碎成其组成颗粒，从而将小的单个药物粉末颗粒释放至空气中以被吸入肺。糖颗粒通常倾向于遗留在装置内和/或口腔-咽喉中。

本发明的一个方面提供了含有EPAS1抑制剂的气雾剂组合物。气雾剂组合物可以是包含雾化EPAS1抑制剂的组合物或在适合于雾化的制剂中包含EPAS1抑制剂的组合物。可与另外的活性剂组合来配制EPAS1抑制剂，并且该组合制剂适合于雾化。可选择地，可分开配制EPAS1抑制剂和另外的活性剂，以便在雾化发生后或在施用至受试者后它们组合在一起。

适合于胃肠外施用的药物组合物可包含与一种或多种药学上可接受的无菌等渗水性或非水性溶液、分散体、悬浮液或乳液或无菌粉剂(其可在即将使用之前被重建成无菌可注射液或分散体，其可包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、使得制剂与想要的受者的血液等渗的溶质或悬浮剂或增稠剂)组合的一种或多种核酸试剂。可用于本发明药物组合物的合适的水性和非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(例如甘油，丙二醇，聚乙二醇等)及其适当的混合物、植物油例如橄榄油和可注射有机酯例如油酸乙酯。可以例如通过使用包衣材料例如卵磷脂，在分散相的情况下通过维持所需颗粒大小以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。

此类组合物还可包含佐剂，例如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。可通过包含各种抗菌剂和抗真菌剂例如对羟苯甲酸、三氯叔丁醇、苯酚山梨酸等来确保预防微生物的作用。在组合物中包含等渗剂例如糖、氯化钠等也可能比较合乎需要。此外，可通过包含延迟吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶来产生可注射药物形式的延长的吸收。

可通过在生物可降解聚合物例如聚乳酸-聚乙醇酸中形成一种或多种核酸试剂的微胶囊基质(microencapsule matrice)来制备可注射贮库形式(depot form)。取决于药物对聚合物的比率以及使用的具体聚合物的性质，可控制药物释放的速率。其他生物可降解聚合物的实例包括聚(原酸酯)和聚(酐)。贮库可注射制剂还可通过将药物捕获在可与身体组织相容的脂质体或微乳剂中来制备。

用于阴道内或直肠施用的制剂可以以栓剂的形式提供，所述栓剂可通过将一种或多种本发明的化合物与一种或多种合适的非刺激性赋形剂或载体(包括例如，可可脂、聚乙二醇、栓剂蜡或水杨酸酯)混合来制备，并且其在室温下是固体，但在体温下是液体，因此，其将在直肠或阴道腔中熔化，从而释放活性化合物。

在某些实施方案中，用药学上可接受的试剂(其允许核酸有效地分布在最适合于它们的期望活性的物理位置中)配制本发明的核酸。此类药学可接受的试剂的非限定性实例包括：PEG、磷脂、硫代磷酸酯、P糖蛋白抑制剂(例如Pluronic P85)(其可增进药物进入各种组织)、用于在移植后持续释放递送的生物可降解聚合物例如聚(DL-丙交酯-共-乙交酯)微球体(Emerich，DF等人，Cell Transplant，8：47-58，1999)和载药纳米颗粒(loaded nanoparticle)，例如用聚氰基丙烯酸丁酯制造的载药纳米颗粒，其可将药物递送穿过血脑屏障和可改变神经元摄取机制(Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry 23：941-949，1999)。

在其他一些实施方案中，本发明的某些核酸可在细胞内从真核启动子表达(例如，Izant和Weintraub，Science 229：345，1985；McGarry和Lindquist，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：399，1986；Scanlon等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：10591-5，1991；Kashani-Sabet等人，Antisense Res.Dev.2：3-15，1992；Dropulic等人，J.Virol.66：1432-41，1992；Weerasinghe等人，J.Virol.65：5531-4，1991；Ojwang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10802-6，1992；Chen等人，Nucleic Acids Res.20：4581-9，1992；Sarver等人，Science 247：1222-1225，1990；Thompson等人，Nucleic Acids Res.23：2259，1995；Good等人，Gene Therapy，4：45，1997)。本领域技术人员认识到可在真核细胞中从适当的DNA/RNA载体表达任何核酸。此类核酸的活性可通过利用酶促核酸将它们从初级转录物释放下来来增强(Draper等人，PCT WO 93/23569，和Sullivan等人，PCT WO 94/02595；Ohkawa等人，Nucleic Acids Symp.Ser.27：15-6，1992；Taira等人，Nucleic Acids Res.19：5125-30，1991；Ventura等人，Nucleic Acids Res.21：3249-55，1993；Chowrira等人，J.Biol.Chem.269：25856，1994；所有这些参考文献以其全文通过引用合并入本文)。特异于CNS的基因治疗方法由Blesch等人，Drug News Perspect.13：269-280，2000；Peterson等人，Cent.Nerv.Syst.Dis.485-508，2000；Peel and Klein，J.Neurosci.Methods 98，95-104，2000；Hagihara等人，Gene Ther.7：759-763，2000；and Herrlinger等人，Methods Mol.Med.35：287-312，2000人描述。AAV介导的核酸至神经系统细胞的递送进一步由Kaplitt等人，美国专利6,180,613描述。

在本发明的另一个方面，本发明的RNA分子优选从插入DNA或RNA载体的转录单位表达(参见例如Couture等人，TIG 12：510，1996)。重组载体优选是DNA质粒或病毒载体。可基于但不限于腺伴随病毒、逆转录病毒、腺病毒、或α病毒构建表达核酶的病毒载体。优选地，如上所述递送能够表达核酸的重组载体，并且将其保持在靶细胞中。可选择地，可使用提供核酸的瞬时表达的病毒载体。必要时，可以重复施用此类载体。一旦表达后，所述核酸结合靶mRNA。可以例如通过静脉内或肌内施用全身性地，通过施用至从患者外植而来的靶细胞、然后再引入患者，或通过可允许导入期望的靶细胞的任何其他方法来递送表达核酸的载体(关于综述，参见Couture等人，TIG 12：510，1996)。

在一个方面，本发明涉及包含编码至少一个本发明核酸的核酸序列的表达载体。以允许本发明的核酸表达的方式可操作地连接核酸序列。例如，本发明表征了表达载体，其包含：a)转录起始区(例如，真核生物pol I、II或III起始区)；b)转录终止区(例如，真核生物pol I、II或III终止区)；c)编码本发明的至少一种核酸催化剂的核酸；其中以允许所述核酸表达和/或递送的方式将所述序列可操作地连接至所述起始区和所述终止区。载体可任选地包括在编码本发明核酸催化剂的序列的5′侧或3′侧可操作地连接蛋白质的开放阅读框架(ORF)；和/或内含子(间插序列)。

在包括双链核酸的某些实施方案中，可分开地表达两条链，然后在细胞中杂交。此类分开的表达可通过分开的表达构建体或通过单个表达构建体来进行。可选择地，可一起表达两条链，例如可一起表达发夹RNA的两条链。

无论选择的施用途径是什么，如下所述或通过其他常规方法把可以以合适水合形式使用的本发明的EPAS1抑制剂和/或本发明的药物组合物配制成药学上可接受的剂型。

本发明的药物组合物中活性成分的实际剂量水平可变化，以便获得有效地实现对于具体患者、组合物和施用模式的期望治疗反应而对患者无毒的活性成分的量。

选择的剂量水平将取于许多因素，包括使用的本发明具体EPAS1抑制剂的活性、施用途径、施用的时间、使用的具体化合物的排泄速率、治疗的持续时间、与使用的具体EPAS1抑制剂组合使用的其他药物、化合物和/或材料、待治疗的患者的年龄、性别、体重、状况、总体健康和先前的医疗史以及医学领域内熟知的其他因素。

医生或兽医可容易地确定和开出需要的药物组合物的有效量。例如，医生或兽医可在低于达到期望治疗效果所需水平的水平上开始用于药物组合物的本发明EPAS1抑制剂的剂量，然后逐渐地增加剂量直至达到期望的效果。

一般说来，本发明的EPAS1抑制剂的合适的日剂量是为有效地产生治疗效果的最低剂量的化合物量。这样的有效剂量通常取决于上述因素。一般地，用于患者的静脉内、脑室内和皮下剂量在每天每千克体重大约0.0001至大约100mg的范围内。

必要时，活性化合物的有效日剂量可通过在1天中以适当的间隔分开地施用2、3、4、5、6或更多个亚剂量(任选地为单位剂型形式)来施用。

本发明的药物制剂还包括兽医组合物，例如适合于兽医用途(例如用于治疗家畜或家养动物例如狗)的EPAS1抑制剂的药物制剂。接受该治疗的患者是有此需要的任何动物，包括灵长类动物，特别地人和其他非人哺乳动物例如马科动物、牛、猪和绵羊；以及一般地家禽和宠物。

EPAS1抑制剂还可被配制用于非药物用途，例如用作从任何病原体污染的物体除去病原体的消毒剂，或用作化妆品以除去不想要的毛发生长。可类似地如本文中描述的某些药物组合物(例如，洗剂、软膏剂、膜、贴剂等)一样配制化妆品组合物。

还可将其他分子、分子结构或化合物的混合物例如脂质体、聚合物、受体靶向分子、口服、直肠、局部或其他制剂与本发明的EPAS1抑制剂例如RNAi构建体混合，用它们封装、缀合EPAS1抑制剂或以其它方式将EPAS1抑制剂与它们结合，以帮助摄取、分配和/或吸收。可在还包含穿透促进剂、载体化合物和/或转染剂的制剂中提供目标RNAi构建体。

教导此类摄取、分配和/或吸收辅助制剂(所述辅助制剂可适合于RNAi构建体特别地siRNA分子的递送)的制备的代表性美国专利包括但不限于U.S.5,108,921；5,354,844；5,416,016；5,459,127；5,521,291；51543,158；5,547,932；5,583,020；5,591,721；4,426,330；4,534,899；5,013,556；5,108,921；5,213,804；5,227,170；5,264,221；5,356,633；5,395,619；5,416,016；5,417,978；5,462,854；5,469,854；5,512,295；5,527,528；5,534,259；5,543,152；5,556,948；5,580,575和5,595,756。

本发明的RNAi构建体还包括任何药学上可接受的盐、酯或此类酯的盐，或在当给动物包括人施用时能够提供(直接或间接地)其生物学活性代谢物或残余物的任何其他化合物。因此，例如，本公开内容也涉及RNAi构建体和siRNA的药学上可接受的盐、此类RNAi构建体的药学可接受的盐及其他生物等价物。

使用金属或胺，例如碱金属和碱土金属或有机胺形成药学上可接受的碱加成盐。用作阳离子的金属的实例是钠、钾、镁、钙等。合适的胺的实例是N，N’-二苄基乙烯二胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、二环己胺、乙二胺、N-甲基葡糖胺和普鲁卡因(参见，例如，Berge等人，″Pharmaceutical Salts，″J.of Pharma Sci.66：1-19，1977)。所述酸性化合物的碱加成盐可通过将游离酸形式与足够量的期望的碱接触以以常规方式产生盐来制备。游离酸形式可通过将盐形式与酸接触，然后以常规方式分离游离酸来再生。游离酸形式与它们各自的盐形式在某些物理性质例如极性溶剂中的溶解度上有些不同，但在其他方面就本发明的目而言盐与它们各自的游离酸等价。如本文中所使用的，“药物加成盐”包括本发明组合物的一个成分的酸形式的药学上可接受盐。此类盐包括胺的有机或无机酸盐。优选酸盐是盐酸盐、醋酸盐、水杨酸盐、硝酸盐和磷酸盐。其他合适的药学上可接受的盐对于本领域技术人员来说是熟知的并且包括多种无机和有机酸的碱性盐。

对于siRNA，药学上可接受的盐的实例包括但不限于：(a)使用阳离子例如钠、钾、铵、镁、钙，多胺例如精胺和亚精胺等形成的盐；(b)使用无机酸例如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸等形成的酸加成盐；(c)使用有机酸乙酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、葡糖酸、柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸、苯甲酸、单宁酸、棕榈酸、海藻酸、聚谷氨酸、萘磺酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、萘二磺酸、多聚半乳糖醛酸等形成的盐；和(d)从元素阴离子例如氯，溴和碘形成的盐。

示例性组合物包含与递送系统例如脂质体系统混合的RNAi构建体，其中任选地包括可接受的赋形剂。在某些实施方案中，配制组合物以用于局部施用。

在某些实施方案中，使用聚合物媒介物递送目标核酸。聚合物媒介物可与一种或多种目标核酸形成微粒。在某些实施方案中，特别地在期望全身性施用的情况下，纳米颗粒可具有在直径上为大约10nm、20nm、30nm、40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、120nm、150nm、200nm或更大的尺寸。在某些实施方案中，纳米颗粒可具有在直径上为大约10-120nm、10-100nm、50-120nm、50-100nm、10-70nm、50-70nm或大约50nm的尺寸。在某些实施方案中，纳米颗粒包含环糊精。在一些具体实施方案，纳米颗粒包含环糊精共聚物，例如线性化的环糊精共聚物(如美国专利6,509,323和美国专利申请公开案2002/0151523中描述的)和基于环糊精的聚合物(如美国专利申请公开案2004/0077595，2004/0109888和2004/0087024中描述的)。在一些具体实施方案中，修饰环糊精，例如使之具有功能化末端基团，例如含有咪唑的CDP。在某些实施方案中，使用包合物(inclusion complexe)例如美国专利7,018,609和7,166,302和美国专利申请公开案2004/0063654中描述的包合物递送核酸。在某些实施方案中，递送系统或媒介物还可包含一种或多种改性剂或修饰组分(modifiying component)，例如可改变微粒的表面化学的改性剂。改性剂可以是阴离子成分。改性剂可以是靶向某些组织或细胞类型的配体，如下面所描述的。改性剂可以是聚乙二醇(PEG)分子，例如PEG5000分子。

在某些实施方案中，EPAS1抑制剂或其药物组合物可与一种或多种有效地结合靶细胞上的特殊细胞表面蛋白或基质的配体结合，从而促进复合物至靶细胞的摄入(sequestration)，并且在一些情况下，增强细胞对RNAi构建体的摄取。仅以举例说明，适用于将本发明的超分子复合体和脂质体靶向特定细胞类型的配体的实例列于下表中。

表7.用于向多种细胞类型进行靶向递送的合适配体

配体	受体	细胞类型
			叶酸	叶酸受体	上皮癌，骨髓干细胞
水溶性维生素	维生素受体	各种细胞

在某些实施方案中，EPAS1抑制剂或其药物组合物可与一种或多种包括半乳糖或转铁蛋白的靶向配体结合。兆蛋白，一种能够结合转铁蛋白的表面受体，在肾透明细胞癌(RCC)上过表达(Schuetz等人，J Mol Diagn.7：206-18，2005)。还已显示转铁蛋白受体在低氧条件期间过表达(Tacchini等人，J.Biol.Chem.274：24142-6，1999；Lok和Ponka，J Biol.Chem.274：24147-52，1999)。透明细胞RCC也高度上调转铁蛋白受体，从而使转铁蛋白成为治疗肾的病症，特别地肾癌的一个理想的靶向配体。包括半乳糖的示例性配体包括例如乳糖和相似的分子。肝去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)是在肝细胞表达上表达的C型凝集素。ASGPR结合具有末端β-D-半乳糖(Gal)或N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)的糖蛋白。配体对ASGPR的亲和力取决于多头(multiantennary)残基的类型(Gal对GalNAc)、数目(四头(antennary)＞三头(triantennary)＞二头(biantennary)＞一头(monantennary))和排列。ASGPR(人为四聚体)的各多肽亚基可结合单末端Gal或GalNAc。

其他实施方案

肾癌

肾细胞癌(RCC)，肾癌的最常见形式，每10,000个人中影响大约3个人。该日益增加的发病率在美国每年导致大约38,000个新病例。尽管近年来批准了3个新药用于RCC，但反应主要是部分的并且只有有限的持续时间(Costa和Drabkin，Oncologist Dec；12(12)：1404-15，2007)。此处，我们提出了用于治疗肾癌的新型治疗剂。通过非病毒递送的短干扰RNA(siRNA)抑制EPAS1提供了肾癌的有效疗法。单独地抑制EPAS1和/或与低剂量的化疗药物组合来抑制EPAS1提供了用于肾癌的治疗作用机制，其具有预期的优于现有疗法的安全特征。

75％的RCC病例为透明细胞癌，并且大部分由von Hippel-Lindau(VHL)基因的功能障碍驱动。导致RCC的VHL功能丧失和其他非VHL途径共有低氧应答异常激活的特征，例如血管内皮生长因子(VEGF)的上调和由此引起的新血管生成。VHL基因产物pVHL是识别转录因子低氧诱导因子(HIF)的α亚基并且将其靶向多遍在蛋白化作用和蛋白酶体降解的复合物的部分。因此，VHL缺陷型癌细胞具有增加的HIF水平，从而使得它们成为用于降低细胞HIF水平的治疗的良好候选者。确实已显示通过靶向EPAS1的shRNA的逆转录病毒介导递送抑制EPAS1(3个人HIFα蛋白中的1个)足以抑制pVHL-缺陷型肿瘤在动物中的生长(Kondo等人，PLOS Biology 1(3)：439-444，2003)。

von Hippel-Lindau(VHL)肿瘤抑制基因产物的作用牵涉正常和患病细胞中的低氧基因调控。患有VHL疾病的个体对肾囊肿、肾透明细胞癌、嗜铬细胞瘤、中枢神经系统的血管母细胞瘤、视网膜的血管瘤、胰腺的胰岛细胞瘤和内淋巴囊肿瘤易感(Pugh和Ratcliffe，Semin.Cancer.Biol.2003，13：83-89，2003)。VHL基因产物通过作为参与低氧诱导型因子α亚基降解的E3-遍在蛋白连接酶复合物的识别组分来参与遍在蛋白介导的蛋白酶解(Cockman等人，J.Biol.Chem.275：25733-25741，2000；Ohh等人，Nat.Cell Biol.2：423-427，2000)。在正常细胞中，VHL/HIF复合物形成并且靶向HIFα亚基发生破坏(Maxwell等人，Nature 399：271-275，1999)。有人提出这是通过EPAS1的氧依赖性结构域的羟化和随后被VHL基因产物识别而发生的，因为同源的氧依赖性结构域的识别正是VHL蛋白籍以识别HIF1α的机制(Maxwell等人，Nature 399：271-275，1999)。EPAS1事实上在体外被酶脯氨酰4-羟化酶羟化(Hirsila等人，J.Biol.Chem.2003)。

肾癌的EPAS1抑制

EPAS1 mRNA主要在高度血管化的成体组织例如肺、心脏和肝中和在胚胎和成年小鼠的胎盘和内皮细胞中表达(Hogenesch等人，J.Biol.Chem.272：8581-8593，1997)。正常人组织与癌症的比较揭示：EPAS1蛋白在正常组织中不能被检测到，但在恶性组织中可容易地显现(Talks等人，Am.J.Pathol.157：411-421，2000)。在EPAS1基因缺陷型小鼠胚胎中观察到的异常证明了EPAS1的表达在发育中是必需的，所述异常包括观察到的儿茶酚胺动态平衡的破坏和抗心力衰竭的保护作用的缺乏(Tian等人，Genes Dev.12：3320-3324，1998)。

EPAS1表达和HIF的转录活性受到细胞氧气浓度精确地调控。虽然氧气水平的变化不影响HIF1-β蛋白的水平，但α亚基的丰度在将细胞暴露于低氧后显著增加，这主要归因于α亚基蛋白的稳定化作用(Safran和Kaelin，J.Clin.Invest.111：779-783，2003).EPAS1mRNA和蛋白以低水平在组织培养细胞中表达，但通过暴露于1％氧气(低氧状态)，蛋白质表达被显著诱导(Wiesener等人，Blood 92：2260-2268，1998)。低氧诱导型因子2α/低氧诱导型因子1β异二聚体蛋白结合低氧应答元件，所述应答元件包含核心识别序列5′-TACGTG-3′，其被发现存在于低氧调控的基因的顺式调控区内(Ema等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94：4273-4278，1997；Hogenesch等人，J.Biol.Chem.272：8581-8593，1997)。该异二聚体对HRE的结合诱导了基因表达。当返回常氧条件时，EPAS1蛋白被快速降解(Wiesener等人，Blood 92：2260-2268，1998)。

丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)途径对于EPAS1激活是至关重要的。直接磷酸化MAPK的双特异性蛋白激酶的抑制在低氧期间阻止了EPAS1的反式激活(Conrad 1999；Conrad，2001)。然而，抑制剂不阻止EPAS1磷酸化，因此，虽然MAPK途径可调控EPAS1的活性，但其并不直接磷酸化该蛋白质(Conrad等人，Comp.Biochem.Physiol.B.Biochem.Mol.Biol.128：187-204，2001；Conrad等人，J.Biol.Chem.274：33709-33713，1999)。Src家族激酶途径也参与EPAS1的调控。Src家族激酶的特异性抑制剂消除了人肺腺癌细胞中低氧诱导的EPAS1 mRNA的表达(Sato等人，Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.26：127-134，2002)。

氧动态平衡的维持除了在生理发育中需要外，也是肿瘤生长所必需的。因为血液通过肿瘤建立的异常血管的循环不良，所以肿瘤细胞经历低氧。虽然低氧对癌细胞是有毒的，但因遗传和适应性变化的结果使它们耐受低氧环境，因此它们仍然存活。一个这样的适应是称为血管内皮生长因子(VEGF)的血管原性生长因子(angiogenic growth factor)的表达增加。VEGF是由癌细胞以及正常细胞响应于低氧而分泌的至关重要的血管生成因子(Harris，Nat.Rev.Cancer 2：38-47，2002；Maxwell等人，Curr.Opin.Genet.Dev.11：293-299，2001).

血管母细胞瘤(Hemangioblastoma)，VHL基因突变的最常见的表现，展示VEGF mRNA在它们的相关基质细胞中过表达。VEGF mRNA的过表达与EPAS1 mRNA的升高的表达高度相关。该发现表明VHL基因功能的丧失与VEGF基因的转录激活之间的关系，这可能是通过VEGF依赖性血管生长中的EPAS1活性所介导的(Flamme等人，Am.J.Pathol.153：25-29，1998)。

VHL基因产物的肿瘤抑制活性可通过体内激活人肾癌细胞中的HIF靶基因来消除。VHL基因产物突变体丧失了将HIF靶向遍在蛋白介导的破坏的能力，表明HI F的下调与VHL肿瘤抑制功能是密切相关的(Kondo等人，Cancer Cell 1：237-246，2002)。与人肾细胞癌相反，结节性硬化症复合物-2(Tsc-2)基因而非VHL基因的产物是啮齿类动物肾细胞癌的主要靶(Liu等人，Cancer Res.63：2675-2680，2003)。缺乏Tsc-2功能的大鼠RCC细胞展示EPAS1蛋白的稳定化作用和VEGF的上调，并且被高度血管化(Liu等人，Cancer Res.63：2675-2680，2003)。

升高的EPAS1活性与血管生成之间的关联也已通过显示HIF的活性如何调控VEGF的表达的实验得到证明。正常人肾细胞通常具有低水平的EPAS1，但当向此类细胞中引入编码EPAS1的载体后，VEGF mRNA和蛋白质水平显著增加(Xia等人，Cancer 91：1429-1436，2001)。当EPAS1受到抑制时，VEGF表达显著减少，从而证明了EPAS1活性与VEGF表达之间的直接关联(Xia等人，Cancer 91：1429-1436，2001)。类似地，当用编码EPAS1的病毒转导人脐静脉细胞时，观察到VEGF mRNA的剂量依赖性增加(Maemura等人，J.Biol.Chem.274：31565-31570，1999)。缺乏反式激活结构域的突变EPAS1的表达在低氧期间抑制了VEGF mRNA的诱导，这一发现进一步表明EPAS1是VEGF表达的重要调节剂的发现(Maemura等人，J.Biol.Chem.274：31565-31570，1999)。

在恶性细胞和组织中也观察到HIF活性与VEGF表达之间的关联性。在编码EPAS1的载体不存在的情况下可在肾细胞癌(RCC)细胞系中容易地检测到EPAS1(Xia等人，Cancer 91：1429-1436，2001)。与正常组织相比较，肾细胞癌组织样品中EPAS1和VEGF mRNA的显著增加表明EPAS1的异常激活可能参与RCC的血管生成(Xia等人，Cancer 91：1429-1436，2001)。

结合起来，这些研究证明了升高的EPAS1可赋予侵袭性肿瘤行为，并且靶向HIF途径可能有助于治疗几种不同类型的癌症。特别地，这些研究和此处未报导的其他研究显示EPAS1是肾癌的极好的靶。可使用靶向肾细胞的颗粒递送本文中描述的组合物，所述颗粒将抗EPAS1的siRNA递送至患病肾组织以抑制EPAS1的表达来治疗肾细胞癌。在某些实施方案中，递送技术RONDEL^TM可用作合适的媒介物用于肾特异性递送本文中描述的抑制剂核酸。RONDEL^TM技术包括使用形成其两部分siRNA递送系统的基础的含环糊精聚合物。第一组分是线性的含有环糊精的聚阳离子，其在与小干扰RNA混合时将结合siRNA的阴离子“主链”。该聚合物和siRNA自组装成直径小于100nm的纳米颗粒，所述颗粒完全保护siRNA免受血清中的核酸酶降解。siRNA递送系统已被设计用于不同的递送途径，包括静脉内注射。当递送至靶细胞时，靶向配体结合细胞表面上的膜受体，然后含有RNA的纳米颗粒通过胞吞作用被摄入细胞，然后从递送媒介物释放。

本发明的肾治疗剂可以是小分子、肽或肽类似物例如拟肽和核酸。本发明的核酸肾治疗剂可以是反义RNA、RNAi构建体(例如siRNA)或核酶。核酸肾治疗剂还可以是基因治疗构建体，例如将递送将在肾细胞中表达的基因的表达构建体。

本发明的肾治疗剂可有效地抗例如由细胞的不期望增殖引起的肾病或状况。本发明的方法和组合物可用于或有效地抗任何肾病或状况，包括但不限于肾癌(例如肾透明细胞癌、乳头状肾细胞癌、肾嫌色细胞癌(chromophobe renal cell carcinoma)和嗜酸细胞腺瘤)、急性肾脏功能衰竭、慢性肾脏功能衰竭、肾小球肾炎、糖尿病肾病等。因此，本发明的药物组合物可有效地抗一种或多种肾病或状况，例如本文中描述的疾病或状况。

在某些实施方案中，肾治疗剂靶向在患有肾病或状况的患者的肾细胞中失调的基因。该基因可以是特异于肾细胞的。可选择地，该基因并不是肾特异性基因，例如与其他细胞和组织相比较而言在肾细胞中具有相似或更低表达水平的基因，并且与来自正常肾的肾细胞相比较，该基因的表达和/或活性在患有肾病或状况的患者的肾细胞中被改变。例如，EPAS1在肾细胞癌中失调。即，EPAS1可在具有异常von Hippel-Lindau(VHL)蛋白活性的肾细胞癌细胞中过表达，但在正常肾细胞中以不可检测的水平表达。靶向EPAS1的肾治疗剂可以是特异性减少或抑制EPAS1的表达的核酸试剂，并且此类核酸药剂可以是反义分子、RNAi构建体(例如，siRNA构建体)或核酶。

本发明的另一方面提供了治疗患有肾病或状况的患者的方法。该方法通常包括给患者全身性施用治疗有效量的本发明的药物组合物。全身性施用可通过各种递送途径，例如静脉内或腹膜内注射、透皮递送、经肺递送或经口摄取来实现。

在某些方面，本发明提供了用于治疗癌症患者的方法，其包括：(a)在患者中鉴定具有众多表达EPAS1(或以高于预先确定的域值的水平表达EPAS1)的癌细胞的肿瘤；和(b)给患者，适当时为受试者施用靶向EPAS1的目标核酸。方法可包括鉴定患者中具有众多含有EPAS1基因扩增的癌细胞的肿瘤作为诊断部分。基因扩增可以以许多种方法来检测，包括例如荧光原位杂交(FISH)或代表性寡核苷酸微阵列分析(ROMA)。

在某些实施方案中，本发明提供了用于通过作为本文中描述的递送媒介物的部分施用EPAS1抑制剂来治疗患有肾病例如透明细胞RCC的患者的方法。在其他实施方案中，该治疗方法包括在治疗之前表征患者以确定他们的VHL状态。即，可将具有适当的VHL状态的患者选择作为用于本方法的期望的候选者。适当的VHL状态可通过许多本领域公认的方法来确定。例如，Hui等人(U.S.6,013,436)公开了用于诊断VHL中的突变(其可以是例如插入或缺失突变)的试剂盒和方法。此外，Boman(US2007/031881A1)教导了用于检测VHL的细胞水平以区分对于野生型等位基因为纯合的细胞与对于野生型等位基因为杂合的细胞的免疫测定。此外，Henderson(US 2004/166491A1)教导了诊断VHL基因中的单核苷酸多态性(SNP)的方法。当位于编码区中时，SNP的存在会导致无功能的或具有减弱功能的蛋白质的产生。更频繁地，SNP发生在非编码区中。如果SNP发生在调控区中，其可能影响VHL蛋白的表达。例如，SNP在启动子区域中的存在可引起蛋白质表达减少。因此，本发明的方法可包括在患者中鉴定具有VHL的缺陷型变体的肿瘤(作为诊断部分)。

本发明涉及多种肾治疗剂，包括但不限于小分子试剂、肽或肽类似物(包括拟肽)、核酸试剂(例如RNAi构建体，包括siRNA构建体、反义分子、酶促核酸或其他基因治疗构建体)、疫苗或目前可获得的或处于开发中(例如在临床试验中)的药剂。可按照由Davis等人(US2006/0263435A1)描述的方法递送此类肾治疗剂。

实施例

通过参考下列实施例将更容易地理解现正进行一般性描述的本公开内容，所述实施例仅用于举例说明本公开内容的某些方面和实施方案，并且无意限定本公开内容。

实施例1：使用siRNA进行EPAS1表达的下调

我们现设计许多特异于EPAS1序列的siRNA，并且就它们在体外和体内下调EPAS1表达的能力对其进行检测。这些特异性siRNA的序列在本文中以SEQ ID NOs：5-82提供(上面表2至6中显示的)。

如图2中所示的，针对EPAS1的siRNA能够在A498(人肾癌)细胞中下调EPAS1的表达。3个抗EPAS1的siRNA双链体(表2中显示为SEQ ID NOs：5-10的siEPAS1A、siEPAS1B和siEPAS1C)中的每一个均在A498细胞中实现了EPAS1蛋白质水平的降低。相反地，siCON1(在下面表8中显示为SEQ ID NOs：83和84的非靶向对照siRNA)未显示明显的下调。

为了进行图2中显示的实验，从美国典型培养物保藏中心获得A498细胞。将细胞在转染之前24小时涂板在6孔组织培养板(250,000个细胞/孔)中。为了进行转染，按照制造商的推荐使用Lipofectamine^TMRNAiMAX(Invitrogen)和下列每一种核酸在无血清培养基(OptiMEM，Invitrogen)中制备复合物：：

“siCONTROL”或“siCON1”：非靶向阴性对照siRNA；

“siEPAS1A”：上文表2中显示为SEQ ID NOs：5和6的横跨hEPAS1“A”靶位点的siRNA；

“siEPAS1B”：上文表2中显示为SEQ ID NOs：7和8的横跨hEPAS1“B”靶位点的siRNA；

“siEPAS1C”：如上文表2中显示为SEQ ID NOs：9和10的横跨hEPAS1“C”靶位点的siRNA。

将核酸复合物以10nM的终核酸浓度暴露于细胞，进行4小时，之后通过抽吸除去复合物，换入完全培养基。转染后2天(48小时)，利用Trizol从所有细胞分离总RNA，然后逆转录成cDNA。通过qRT-PCR测定相对EPAS1 mRNA水平(相对于未转染的A498细胞)；针对持家基因(GAPDH)对数据进行标准化。

表8.本文所述实施例中使用的对照核酸的序列。下划线标示的残基代表3’突出。

实施例2：用于鉴定各靶位点上的EPAS1 siRNA的Tiling实验

如图3A中显示的，使用tiling实验鉴定针对EPAS1的具有增加效力的siRNA。为进行图3中显示的实验，从美国典型培养物保藏中心获得A498(人肾癌)细胞。在转染之前24小时将细胞涂板至6孔组织培养板(250,000个细胞/孔)。为了进行转染，按照制造商的推荐使用Lipofectamine^TM RNAiMAX(Invitrogen)和下列每一种核酸在无血清培养基(OptiMEM，Invitrogen)中制备复合物：

“siEPAS1A”：如上文表2和4中显示为SEQ ID NOs：5、6和23-42的横跨hEPAS1“A”位点的siRNA双链体：

siEPAS1A-5：上文表4中显示为SEQ ID NOs：23和24的位于hEPAS1原始“A”位点上游5个核苷酸的siRNA；

siEPAS1A-4：上文表4中显示为SEQ ID NOs：25和26的位于hEPAS1原始“A”位点上游4个核苷酸的siRNA；

siEPAS1A-3：上文表4中显示为SEQ ID NOs：27和28的位于hEPAS1原始“A”位点上游3个核苷酸的siRNA；

siEPAS1A-2：上文表4中显示为SEQ ID NOs：29和30的位于hEPAS1原始“A”位点上游2个核苷酸的siRNA；；

siEPAS1A-1：上文表4中显示为SEQ ID NOs：31和32的位于hEPAS1原始“A”位点上游1个核苷酸的siRNA；

siEPAS1A：上文表2中显示为SEQ ID NOs：5和6的以hEPAS1原始“A”位点为中心的siRNA；

siEPAS1A+1：上文表4中显示为SEQ ID NOs：33和34的位于hEPAS1原始“A”位点下游1个核苷酸的siRNA；

siEPAS1A+2：上文表4中显示为SEQ ID NO s：35和36的位于hEPAS1原始“A”位点下游2个核苷酸的siRNA；

siEPAS1A+3：上文表4中显示为SEQ ID NOs：37和38的位于hEPAS1原始“A”位点下游3个核苷酸的siRNA；

siEPAS1A+4：上文表4中显示为SEQ ID NOs：39和40的位于hEPAS1原始“A”位点下游4个核苷酸的siRNA；

siEPAS1A+5：上文表4中显示为SEQ ID NOs：41和42的位于hEPAS1原始“A”位点下游5个核苷酸的siRNA；

“siEPAS1B”：上文表2和5中显示为SEQ ID NOs：7、8和43-62的横跨hEPAS1“B”位点的siRNA双链体：

siEPAS1B-5：上文表5中显示为SEQ ID NOs：43和44的位于hEPAS1原始“B”位点上游5个核苷酸的siRNA；

siEPAS1B-4：上文表5中显示为SEQ ID NOs：45和46的位于hEPAS1原始“B”位点上游4个核苷酸的siRNA；

siEPAS1B-3：上文表5中显示为SEQ ID NOs：47和48的位于hEPAS1原始“B”位点上游3个核苷酸的siRNA；

siEPAS1B-2：上文表5中显示为SEQ ID NOs：49和50的位于hEPAS1原始“B”位点上游2个核苷酸的siRNA；

siEPAS1B-1：上文表5中显示为SEQ ID NOs：51和52的位于hEPAS1原始“B”位点上游1个核苷酸的siRNA；

siEPAS1B：上文表2中显示为SEQ ID NOs：7和8的以hEPAS1原始“B”位点为中心的siRNA；

siEPAS1B+1：上文表5中显示为SEQ ID NOs：53和54的位于hEPAS1原始“B”位点的下游1个核苷酸的siRNA；

siEPAS1B+2：上文表5中显示为SEQ ID NOs：55和56的位于hEPAS1原始“B”位点下游2个核苷酸的siRNA；

siEPAS1B+3：上文表5中显示为SEQ ID NO s：57和58的位于hEPAS1原始“B”位点下游3个核苷酸的siRNA；

siEPAS1B+4：上文表5中显示为SEQ ID NOs：59和60的位于hEPAS1原始“B”位点下游4个核苷酸的；

siEPAS1B+5：上文表5中显示为SEQ ID NOs：61和62的位于hEPAS1原始“B”位点下游5个核苷酸的siRNA；

“siEPAS1C”：上文表2和6中显示为SEQ ID NOs：9、10和63-82的横跨hEPAS1“C”位点的siRNA双链体：

siEPAS1C-5：上文表6中显示为SEQ ID NOs：63和64的位于hEPAS1原始“C”位点上游5个核苷酸的siRNA；

siEPAS1C-4：上文表6中显示为SEQ ID NOs：65和66的位于hEPAS1原始“C”位点上游4个核苷酸的siRNA；

siEPAS1C-3：上文表6中显示为SEQ ID NOs：67和68的位于hEPAS1原始“C”位点上游3个核苷酸的siRNA；

siEPAS1C-2：上文表6中显示为SEQ ID NOs：69和70的位于hEPAS1原始“C”位点上游2个核苷酸的siRNA；

siEPAS1C-1：上文表6中显示为SEQ ID NOs：71和72的位于hEPAS1原始“C”位点上游1个核苷酸的siRNA；

siEPAS1C：上文表2中显示为SEQ ID NOs：9和10的以hEPAS1原始“C”位点为中心的siRNA；

siEPAS1C+1：上文表6中显示为SEQ ID NOs：73和74的位于hEPAS1原始“C”位点下游1个核苷酸的siRNA；

siEPAS1C+2：上文表6中显示为SEQ ID NOs：75和76的位于hEPAS1原始“C”位点下游2个核苷酸的siRNA；

siEPAS1C+3：上文表6中显示为SEQ ID NOs：77和78的位于hEPAS1原始“C”位点下游3个核苷酸的siRNA；

siEPAS1C+4：上文表6中显示为SEQ ID NOs：79和80的位于hEPAS1原始“C”位点下游4个核苷酸的siRNA；

siEPAS1C+5：上文表6中显示为SEQ ID NOs：81和82的位于hEPAS1原始“C”位点下游5个核苷酸的siRNA。

关于tiling实验的实验设计的举例说明参见图3B。

将此类复合物以10nM的终核酸浓度暴露于细胞，进行4小时，之后通过抽吸除去，然后换入完全培养基。转染后2天(48小时)，利用Trizol从所有细胞分离总RNA，然后逆转录成cDNA。通过qRT-PCR测定相对EPAS1 mRNA水平(相对于未转染的A498细胞)；针对GAPDH对数据进行标准化。

在此处检查的双链体中，下列6个双链体显示最有效力的抗EPAS1活性：siEPAS1A-2、siEPAS1A-1、siEPAS1A、siEPAS1A+3、siEPAS1B-4和siEPAS1C-4。下面进一步检查这些双链体。

实施例3：抗EPAS1的siRNA降低了培养的A498细胞的生长潜能

如图4中显示的，就它们降低培养的人A498细胞的生长潜能的能力检查siEPAS1A-2、siEPAS1A-1、siEPAS1A、siEPAS1A+3、siEPAS1B-4和siEPAS1C-4 siRNA双链体。将siCON1用作非靶向对照。siEPAS1A-2和siEPAS1A对A498细胞生长引发最显著的抑制(RT-CES)。

为了进行图4中显示的实验，从美国典型培养物保藏中心获得A498(人肾癌)细胞。在转染之前24小时将细胞涂板至6孔组织培养板(250,000个细胞/孔)。为了进行转染，按照制造商的推荐使用Lipofectamine^TM RNAiMAX(Invitrogen)和核酸在无血清培养基(OptiMEM，Invitrogen)中制备复合物。

实施例4：siEPAS1A-2降低细胞EPS1 mRNA水平

在用siEPAS1A-2(序列对SEQ ID NO：29和30)转染细胞后，通过qRT-PCR检查培养的人肾细胞癌(A-498、786-O和Caki-1)细胞中EPAS1 mRNA的水平。在所有3个细胞系中均看到非常强的EPAS1 mRNA水平的序列特异性降低。(参见图5；误差棒代表3个重复测量的标准差)。

使用可商购获得的转染试剂(Lipofectamine^TM RNAiMAX；Invitrogen)，以20nM的siRNA浓度和4小时的暴露时间利用siEPAS1A-2或非靶向对照siRNA双链体(siCONTROL)转染各细胞系。转染后48小时，分离并且逆转录细胞RNA，测量未转染的、用siEPAS1A-2转染的或用非靶向对照siRNA(siCONTROL)转染的A498、Caki-1和786-O细胞中的EPAS1 mRNA水平(针对GAPDH标准化)。

实施例5：siEPAS1A-2降低细胞增殖速率

为了成为有效的抗癌药，siEPAS1A-2应当不仅降低细胞EPAS1水平而且还应当实现细胞生长的抑制。预计在von Hippel-Lindau无效型(VHL^-/-)的那些细胞中将观察到EPAS1敲低的抗增殖效应。786-O和A-498人RCC细胞缺乏野生型pVHL，而Caki-1细胞是VHL^+/+。

为了检查siEPAS1A-2对细胞增殖速率的影响，以各自10nM(A498和Caki-1)或20nM(786-O)的浓度用siEPAS1A-2或非靶向对照siRNA(siCONTROL)转染这3个人RCC细胞系中的每一个，进行4小时，使用实时细胞电子传感(RT-CES)测定系统测量它们随后的增殖速率。在转染后定期(每60分钟一次)监控细胞密度，进行数天，并且将其定量为“细胞指数”。这3个不同细胞系作为转染后时间之函数的细胞指数的曲线示于图6A-6C(误差棒代表4个重复孔的标准差)中。如基于VHL状态所预期的，siEPAS1A-2在A498和786-O细胞中实现了显著的抗增殖作用，但在Caki-1中却没有，这表明在VHL中有缺陷的癌细胞是用于降低细胞HIF水平的治疗的良好候选者。

本领域技术人员将认识到或通过只使用常规实验能够确定本文中描述的本发明的特定实施方案的许多等价物。此类等价物也意图包括在下列权利要求中。

所有引述的参考文献和公开案出版物均以其全文通过引用合并入本文。

Claims (75)

1.一种核酸，其包含：

(i)包含选自SEQ ID NOs：2-4的序列的在长度上为大约15至大约30个核苷酸的第一链，和

(ii)在长度上为大约5至大约30个核苷酸的第二链，

其中第一链与第二链的至少12个核苷酸彼此互补并且在生理条件下形成双链核酸，以及其中所述双链核酸可通过RNA干扰机制降低内皮PAS结构域蛋白1(EPAS1)在细胞中的表达。

2.权利要求1的核酸，其中所述核酸是双链RNA。

3.权利要求2的核酸，其中所述双链部分任选地在长度上为大约15至大约30个核苷酸。

4.权利要求1的核酸，其中所述核酸是发夹RNA。

5.权利要求4的核酸，其中所述发夹RNA包含具有在长度上为大约4至大约10个核苷酸的环区域。

6.前述权利要求中任一项的核酸，其中所述第一链是DNA多核苷酸，并且所述第二链是RNA多核苷酸。

7.权利要求6的核酸，其中所述第一和/或第二链还包含3′突出区域、5′突出区域或3′和5′突出区域。

8.权利要求7的核酸，其中所述突出区域在长度上为大约1至大约10个核苷酸。

9.前述权利要求中任一项的核酸，其中所述第一链包含选自SEQ ID NOs：5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79和81的序列。

10.权利要求1至9中任一项的核酸，其中所述第二链包含选自SEQID NO：6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80和82的序列。

11.一种分离的核酸，其中包含在生理条件下与EPAS1转录物中对应于SEQ ID NO：1内核苷酸655-718、2878-2929或4978-5039的区域发生杂交并且降低EPAS1在细胞中的表达的序列。

12.权利要求11的分离的核酸，其中所述核酸包含与EPAS1转录物中对应于SEQ ID NO：1内核苷酸66-708、2888-2919或4988-5029的区域发生杂交的序列。

13.权利要求11的核酸，其中所述核酸包含与EPAS1转录物中对应于SEQ ID NO：1内核苷酸670-703，2893-2914或4992-5024的区域发生杂交的序列。

14.权利要求11至13中任一项的核酸，其中所述核酸是单链的。

15.权利要求11至13中任一项的核酸，其中所述核酸是双链的。

16.权利要求11至15中任一项的核酸，其中所述核酸包含与EPAS1的所述区域中的一个互补的至少10个连续核苷酸。

17.权利要求11至16中任一项的核酸，其中所述核酸在长度上为大约14至大约50个核苷酸。

18.权利要求11至17中任一项的核酸，其中所述核酸是RNA分子。

19.权利要求11至17中任一项的核酸，其中所述核酸是DNA分子。

20.权利要求11至17中任一项的核酸，其中所述核酸包含DNA链和RNA链。

21.权利要求11至20中任一项的核酸，其中所述核酸是包含选自SEQ ID NOs：2-4的序列的RNAi构建体。

22.权利要求11至20中任一项的核酸，其中所述核酸是包含选自SEQ ID NOs：5-82的序列的RNAi构建体。

23.权利要求11至22中任一项的核酸，其中所述核酸是酶促核酸。

24.权利要求23的核酸，其中所述酶促核酸是核酶。

25.权利要求23的核酸，其中所述酶促核酸是DNA酶。

26.前述权利要求中任一项的核酸，其中所述核酸是RNAi构建体。

27.权利要求26的核酸，其中所述RNAi构建体是dsRNA。

28.权利要求27的核酸，其中所述RNAi构建体是发夹RNA。

29.权利要求27的核酸，其中所述RNAi构建体的双链体部分在长度上为大约15至大约30个核苷酸。

30.前述权利要求中任一项的核酸，其中所述核酸任选地包含一个或多个经修饰的主链或碱基部分。

31.权利要求30的核酸，其中所述经修饰的主链或碱基部分包含下列中的一个或多个：烷基膦酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、磷酸酯、氨甲酸酯、乙酰胺酯、羧甲酯、碳酸酯和磷酸三酯。

32.权利要求30任一项的核酸，其中所述经修饰的主链或碱基部分包含至少一个2′-O-烷基化核糖核苷酸。

33.前述权利要求中任一项的核酸，其中，当在生理条件下以10nM的浓度与细胞接触时，所述核酸抑制该细胞中的EPAS1表达50％或更多。

34.包含前述权利要求中任一项的核酸和药学上可接受的载体的药物组合物。

35.权利要求34的药物组合物，其中所述药学上可接受的载体包括阳离子聚合物。

36.权利要求34的药物组合物，其中所述药学上可接受的载体包括环糊精聚合物。

37.权利要求36的药物组合物，其中所述环糊精结构是im-CDP。

38.权利要求34的药物组合物，其中所述药物组合物包含颗粒，所述颗粒包含环糊精聚合物和权利要求1至33中任一项的核酸并且是PEG化的。

39.权利要求38的药物组合物，其中所述颗粒还包含金刚烷。

40.权利要求34的药物组合物，其还包含靶向特定组织或细胞类型的配体。

41.权利要求40的药物组合物，其中所述配体包括转铁蛋白。

42.权利要求34的药物组合物，其包含纳米颗粒，其中所述纳米颗粒的直径为大约10至大约100nm.

43.权利要求42的药物组合物，其中所述纳米颗粒的直径为大约50至大约70nm.

44.权利要求43的药物组合物，其中所述纳米颗粒的直径任选地为大约50nm。

45.权利要求34的药物组合物，其中所述药学上可接受的载体包含：

含有咪唑修饰的环糊精的阳离子聚合物，和

包含金刚烷-PEG-配体的靶向部分，

其中所述聚合物和靶向部分形成封装核酸的纳米颗粒。

46.权利要求45的药物组合物，其中所述纳米颗粒具有大约50至大约120nm的直径。

47.权利要求46的药物组合物，其中所述纳米颗粒具有大约50至大约100nm的直径。

48.权利要求47的药物组合物，其中所述纳米颗粒具有大约50至大约70nm的直径。

49.权利要求45的药物组合物，其中所述纳米颗粒具有大约50nm的直径。

50.权利要求45的药物组合物，其中所述靶向配体包含半乳糖。

51.权利要求45的药物组合物，其中所述靶向配体包含转铁蛋白。

52.权利要求1至33中任一项的核酸用于制造药剂的用途，所述药剂用于治疗与不期望的细胞增殖相关的疾病或状况。

53.权利要求52的用途，其中所述细胞是癌细胞或肿瘤细胞。

54.权利要求52的用途，其中所述细胞是病原体细胞。

55.权利要求52的用途，其中所述细胞是正常细胞，其不期望的增殖导致所述疾病或状况。

56.用于治疗癌症患者的方法，其包括给该患者施用治疗有效量的权利要求1至33中任一项的核酸。

57.权利要求56的方法，其还包括施用至少一种另外的抗癌化疗药物，所述化疗药物以加成或协同方式与所述核酸一起抑制癌细胞的增殖。

58.权利要求57的方法，其中所述化疗药物任选地是氟尿嘧啶(5FU)。

59.权利要求56的方法，其中所述癌细胞与来自可比较组织的非癌细胞相比较而言表达更高水平的EPAS1。

60.治疗癌症患者的方法，其包括给所述患者施用治疗有效量的双链核酸和一种或多种诱导EPAS1表达的抗癌药，所述双链核酸通过RNAi机制降低EPAS1的表达。

61.权利要求56至60中任一项的方法，其中使用药学上可接受的载体配制所述核酸。

62.权利要求56至60中任一项的方法，其中使用靶向癌细胞的配体配制所述核酸。

63.权利要求62的方法，其中所述癌细胞是肾透明细胞癌，并且所述配体包括转铁蛋白。

64.权利要求62的方法，其中所述配体是半乳糖。

65.权利要求56至60中任一项的方法，其中将所述核酸配制为聚合物纳米颗粒的成分。

66.权利要求65的方法，其中所述纳米颗粒的直径为大约10至大约120nm。

67.权利要求66的方法，其中所述纳米颗粒的直径为大约50至大约120nm。

68.权利要求67的方法，其中所述纳米颗粒的直径为大约50至大约100nm。

69.权利要求65的方法，其中所述纳米颗粒的直径为大约50nm。

70.权利要求56至69中任一项的方法，其中全身性施用治疗有效量的所述核酸。

71.权利要求56至70中任一项的方法，其还包括在施用该核酸之前测定患者中von Hippel-Landau(VHL)蛋白活性的水平。

72.权利要求71的方法，其中通过测量与健康受试者相比较而言患者中VHL的RNA或蛋白质水平的下降来测定所述活性。

73.权利要求71的方法，其中利用遗传筛查鉴定VHL基因中的一个或多个突变来测定所述活性。

74.权利要求73的方法，其中所述一个或多个突变包括引起截短的突变或引起等位基因丢失的突变。

75.权利要求73的方法，其中所述一个或多个突变包括无义突变、移码突变、启动子突变、增强子突变、剪接位点突变、无效突变和多聚腺苷酸尾突变。

Images