CN101184840A

CN101184840A - 核糖核苷酸还原酶亚基2的抑制剂及其用途

Info

Publication number: CN101184840A
Application number: CNA2006800184085A
Authority: CN
Inventors: M·E·戴维斯; J·D·黑德尔; J·J·鲁西
Original assignee: Calando Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Calando Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2005-03-31
Filing date: 2006-03-31
Publication date: 2008-05-21

Abstract

本申请涉及核糖核苷酸还原酶亚基2(R2)的抑制剂，以及涉及R2抑制剂的方法和组合物。在某些实施方案中，R2抑制剂包括核酸，例如siRNA。

Description

核糖核苷酸还原酶亚基2的抑制剂及其用途

相关申请

本申请要求下列美国临时申请号的权益，其包括2005年3月31日提出的60/667,362、2005年6月30日提出申请的60/695,931，以及2005年12月2日提出申请的60/742,100，这些申请以其整体引用作为参考。

技术背景

核糖核苷酸还原酶(RNR)催化反应，从其相应的5’-核糖核苷二磷酸产生2’-脱氧核糖核苷酸。该反应在产生2’，5’-脱氧核糖核苷三磷酸的途径中是限速步骤，并且是DNA复制所必需的。人RNR由R1和R2两个亚基组成，并且两种蛋白质的表达都是酶活性所需的。R1和R2由分开的染色体上的不同基因编码，并且最重要地，它们的mRNA在细胞周期中被差异性表达。R1蛋白质在整个细胞周期中是稳定的而R2仅在当DNA复制发生时的G1晚期/S早期间被表达(Engstrom等，1985)。

R2的抑制作用已是抗癌和抗病毒治疗的目标。然而，期望新型的R2靶向抑制剂用于治疗细胞增殖性失调如癌症或病原体感染。

发明概述

相应地，本申请提供R2抑制剂，及其可实现靶细胞内R2抑制的相关方法和组合物。特别地，靶细胞包括经历过度增殖的那些细胞如癌或瘤细胞，经历过度生长和/或与某些疾病或情况相关的扩增的细胞(例如，在自体免疫疾病或移植排异中的T细胞)，以及病原体。本申请的R2抑制剂可通过减少R2表达或R2的生物学功能(例如R2的酶活性)来抑制R2。

R2抑制剂可以是核酸、小分子、包含抗体的肽、肽衍生物或拟肽。

某些实施方案涉及R2抑制剂，该抑制剂是核酸。本申请提供分离的核酸，该核酸至少包含在某些条件下(例如生理上的或细胞内的)杂交到R2转录物并在细胞内减少靶基因的表达的部分。靶基因转录物可以是任何剪接前的转录物(即包含内含子)、剪接后的转录物以及剪接变体。在某些实施方案中，靶基因转录物具有在任一SEQ ID NO：1-3中提出的序列。核酸类别的实例包括例如RNAi构建体和酶促核酸构建体。核酸可以是单链或双链的。双链核酸也可包括突出端或非互补的区域，其中一条或另一条链是单链。单链核酸可包括自身互补的区域，意为该化合物以双螺旋结构的区域形成所谓的“发夹”或“茎环”结构。核酸可包括与由靶基因核酸序列的不多于1000、不多于500、不多于250、不多于100或不多于50个核苷酸组成的区域互补的核苷酸序列，该靶基因核酸序列是例如由SEQ IDNO：1-3(图1-2)或任何同源物(如直系同源物和旁系同源物)或其变体指定的任何那些序列。互补区域优选地是至少8个核苷酸，并任选地至少10、15、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。互补区域可落入靶基因转录物的内含子、编码序列或非编码序列之内。通常，核酸具有约8至约500个核苷酸或碱基对的长度，并且任选地长度是约14至约50个核苷酸。核酸可以是DNA、RNA或RNA：DNA杂交体。任一条链可包括DNA和RNA的混合物，以及不易被归类为DNA或RNA的修饰形式。同样地，双链核酸可以是DNA：DNA、DNA：RNA或RNA：RNA，并且任一条链也可包括DNA和RNA的混合物，以及不易被归类为DNA或RNA的修饰形式。核酸可包括任何的多种修饰，包括对骨架(在天然核酸中糖-磷酸部分，包括核苷酸间键合)或碱基部分(天然核酸的嘌呤或嘧啶部分)的一种或多种修饰。核酸优选地具有约15至约30个核苷酸的长度并常含有一种或多种修饰以改善特性如在血清、细胞或核酸可能被施用的部位(例如在口腔性施用核酸时胃和吸入核酸时肺)中的稳定性。在RNAi构建体的情况下，靶标转录物的互补链通常是RNA或其修饰形式。另一条链可以是RNA、DNA或任何其它变体。双链或单链的“发夹”RNAi构建体的双螺旋部分优选地具有18至30个核苷酸的长度并任选地长约21至27个核苷酸。催化性或酶促核酸可以是核糖酶或DNA酶并且也可包含修饰的形式。在生理条件且在无义或有义对照具有很低影响或无影响的浓度下，当与细胞接触时，这里的核酸可抑制靶标R2基因表达约50％、75％、90％或更大。用以测试核酸影响的优选浓度是1、5或10微摩尔。也可测试这里的核酸对细胞表型的影响。在某些癌细胞系的情况下，当施用靶标核酸时可测量到细胞死亡或减少的扩增速率。优选地，在实验上有意义的核酸浓度下细胞扩增将被抑制50％以上。

在某些方面，本申请提供包含任何多种R2抑制剂，例如靶向R2基因的核酸(或靶向性核酸)的药物组合物。药物组合物通常包括药物可接受载体。药物组合物可包含在生理条件下杂交到靶基因转录物并且减少细胞内靶基因的表达的核酸。

在某些方面，本申请提供抑制细胞内R2基因的表达的方法。该方法可包括以有效量的核酸接触细胞，该核酸在生理条件下杂交到靶标R2转录物并且减少细胞内靶基因的表达。可在这样的方法中使用公开的任何靶向R2的核酸。细胞可以是瘤或癌细胞、病原体细胞或正常细胞。在某些实施方案中，正常细胞经历导致患者体内某种疾病或情况的过度增殖。

在某些方面，本申请提供降低受试者体内肿瘤的生长速率的方法，包括施用一定量的足够降低肿瘤生长速率的本文的R2抑制剂。在某些方面，本申请提供治疗癌症患者的方法，包括给患者施用本文的R2抑制剂。R2抑制剂可以是核酸，例如RNAi核酸或酶促核酸，并且可用药物可接受载体制备。任选地，肿瘤包括表达核酸靶标基因的一种或多种癌细胞。相对于来自相似组织的非癌细胞，靶标R2基因可被过度表达。肿瘤也可以是转移瘤。这样的治疗可与至少一种另外的抗癌化疗剂组合，该化疗剂与核酸以附加或协同的方式抑制癌细胞。核酸与另外的抗癌剂可预先制备为组合制剂，或可以独立地制备并以这样的方式(例如，选择时间、剂量)施用以达到组合的效果。

在某些方面，本申请提供核酸在用于治疗例如癌症或病原体感染的药物制备中的用途。

在某些方面，本申请提供治疗癌症患者的方法，包括：(a)在患者体内识别含有表达目的基因的大量癌细胞的肿瘤；以及(b)向患者适当地施用靶向目的基因的核酸。方法可能包括(作为诊断部分)在患者体内识别含有大量癌细胞的肿瘤，所述癌细胞具有靶基因的基因扩增。可用多种途径检测基因扩增，包括，例如，荧光原位杂交(FISH)或代表性寡核苷酸芯片分析(ROMA)。

在某些方面，本申请提供方法和组合物，其用于从被病原体感染的患者或污染的对象中移除或减少病原体。

本申请的另一方面提供包装的药物。这种包装的药物包括：(i)此处公开的药物有效量的抑制剂，所述抑制剂靶向R2基因；以及(ii)施用R2抑制剂的说明书和/或标签，其用于治疗具有表达R2基因的肿瘤患者。

本申请的另一方面提供包装的消毒剂。包装的消毒剂可特异性针对一种或多种感染物质如病原体。这种包装的消毒剂包括：(i)靶向感染物质中的R2基因的有效量的R2抑制剂；以及(ii)施用R2抑制剂的说明书和/或标签，其用于移除或减少感染物质的数量。

附图简述

图1显示人核糖核苷酸还原酶M2(GenBank登记号NM 001034)(SEQ ID NO：1)的cDNA序列。加下划线和加粗的三条11个碱基的序列段相应于由SEQ ID NO：4-6代表的核心靶序列。

图2显示结核分支杆菌H37Rv(Mycobacterium tuberculosis H37Rv)的核糖核苷酸还原酶小亚基的cDNA序列(图2A)(SEQ ID NO：2)和人疱疹病毒4的核糖核苷酸还原酶小亚基的cDNA序列(图2B)(SEQ ID NO：3)。

图3显示在正常人肝脏组织(图3A)和肝细胞癌(HCC)组织(图3B)中R2的免疫组织化学染色。在400×放大倍率下拍摄图象。在HCC肝脏组织中R2表达被可检测性地上调。新鲜切下的人HCC组织在4％多聚甲醛中被固定、包埋入石蜡、并切割成2至5μm切片。在经由分级醇去石蜡和再水化后，对玻片进行微波抗原提取(Antigen Unmasking Solution；VectorLaboratories，Burlingame，CA)并用小鼠的抗人抗RRM2抗体(1∶40稀释，Covance，Philadelphia，PA)和利用小鼠的IgM的第二抗体(用1∶400稀释，Vector Laboratories)标记。使用冷电荷耦合器件照相机(Magnafire；Olympus，Melville，NY)拍摄图象并以TIFF文件输入Adobe Phostoshop(Adobe系统，Mountain View，CA)，以及在Xerox Phaser 860DP打印机上打印。使用标准方法进行苏木精和曙红(H & E)染色。

图4说明靶向R2的siRNA的设计。人R2(hRRM2)mRNA内靶标位点的定位被指定为：A、B和C，其为根据本申请的新型靶标位点；以及X、Y和Z，其为已公开的靶标位点。

图5显示测试siRNA对R2靶标的结合性的凝胶迁移测定。第3、4和5泳道显示使用siRNA分别靶向图4中所述的区域A、B和C的R2的凝胶迁移。使用的siRNA的序列是SEQ ID NO：7和8(靶标位点A)、SEQID NO：9和10(靶标位点B)，以及SEQ ID NO：11和12(靶标位点C)。靶向位点A的siRNA双螺旋显示有力的结合(泳道3)。

图6A和6B显示siRNA的细胞内潜能(图6A)，与它们对靶标的结合亲和力相关(图6B)。图6C显示多种靶向EGFP的siRNA。

图7显示在多种细胞系中由本申请的某些siRNA引起的R2的下调。图7A显示来自用多种所示的siRNA处理的HeLa细胞中hRRM2蛋白质水平的western印迹。图7B显示使用来自多种细胞类型的裂解物的western印迹实验的结果，所述细胞用靶向A、B和C位点的siRNA、对照siRNA和抗hRRM2的反义寡脱氧核苷酸(GTI-2040)转染。

图8显示用于筛选针对R2的siRNA的R2-萤光素酶融合构建体(“pR2Luc质粒”)。用pR2Luc质粒和针对R2的siRNA可共转染细胞。萤光素酶水平的定量与R2表达的下调相关。

图9说明tiling实验的结果。图9A、9B和9C说明分别在靶标位点A、B和C完成的tiling实验的结果。对于每个靶标位点，合成8个或更多的不同的21mer序列，所述序列相邻(+或-)于三个原始识别的靶标位点(tiling)的每一个，并且分别在三个剂量水平(10nM、1nM和0.2nM)进行比较。图9D阐明tiling实验的实验设计。

图10显示在定向诱导基因组局部突变(tiling)实验中使用pR2Luc发现高效siRNA。siRRM2A、siRRM2B、siRRM2C分别是定向于靶标位点A(具有SEQ ID NO：7和8)、靶标位点B(具有SEQ ID NO：9和10)和靶标位点C(具有SEQ ID NO：11和12)的siRNA；siRRM2B+3和siRRM2B+5是对来自靶标位点B定向诱导基因组局部突变的双螺旋，其与原始的位点B siRNA双螺旋相比具有增加的能力；GTI-2040是靶向R2的反义寡脱氧核苷酸；si(GTI-2040)是与GTI-2040反义寡脱氧核苷酸靶向相同位点的siRNA；si(JBC，2004)是以前公开的针对R2的siRNA。

图11显示使用靶标位点B周围的双螺旋(tiling从B+3至B+10)的附加tiling实验的结果。B+5双螺旋总是所测试的最有效的双螺旋而B+9双螺旋显现为第二有效的双螺旋。

图12显示由21mer和27mer RNA对R2-萤光素酶融合蛋白的剂量依赖性下调。

图13显示由R2-萤光素酶融合的siRNA诱导的下调与内源R2的下调相关。在用pR2Luc共转染研究中，siRRM2B+5双螺旋被识别为高度有效。如图所述，在Hep3B细胞中siRRM2B+5双螺旋的单独转染导致在转染后1天、2天和3天产生对内源R2的序列特异性敲除。用20 nM的siRRM2B+5或siCON1(Dharamacon的无靶向对照双螺旋#1)转染细胞。

图14显示针对R2的siRNA诱导脂质转染的细胞的细胞凋亡。用针对R2的siRNA(siRRM2B+5)或无靶向对照siRNA(siCON1)转染培养的人HCC细胞(HepG2)然后在转染后1天、2天或3天分析细胞凋亡。

图15显示针对R2的siRNA增强人HCC细胞的药物诱导的细胞凋亡。用针对R2的siRNA(siRRM2B+5)或无靶向对照siRNA(siCON1)转染培养的人HCC细胞(HepG2)，接着用阿霉素(100nM)处理3天。然后检测细胞凋亡的水平。

图16显示针对R2的siRNA在体内降低R2表达。将编码R2萤光素酶融合基因的质粒(pR2Luc)与针对R2的siRNA(siRRM2B+5)或无靶向对照siRNA(siCON1)共同注入BALB/c小鼠中。融合基因表达后进行全动物生物荧光成象。图16A显示融合基因表达17天以上的汇总图。图16B显示拍摄于注射后2天的代表性的图象。

图17显示针对R2的siRNA(siRRM2B+5)降低培养的人HCC细胞(Hep3B细胞)的生长潜能。人肝细胞癌(HCC)细胞(Hep3B)被稀释铺板培养然后用无靶向对照siRNA(siCON1)或针对R2的siRNA(siRRM2B+5)(5nM)转染。转染后5天，细胞被固定、染色(亚甲基蓝)以及集落记数(约50或更多的细胞)。如图所示，与无靶向对照siRNA(siCON1)相比，针对R2的siRNA(siRRM2B+5)大大地降低Hep3B细胞的集落形成能力。柱状图形代表n＝3重复孔的平均数；误差线代表标准偏差。

图18显示针对R2的siRNA的潜能与降低培养的人HCC细胞(Hep3B细胞)的生长潜能的能力相关。人肝细胞癌(HCC)细胞(Hep3B)被稀释铺板培养并然后用前面显示具有针对R2的可变潜能的五种siRNA(siR2B+3、siR2B+5、siR2B+6、siR2B+7、siR2B+9)(5nM)中的一种转染(参见例如图11)。转染后5天，细胞被固定、染色(亚甲基蓝)以及集落记数(约50或更多细胞)。如图所示，siRNA降低集落形成的能力(本图)与其R2的下调潜能强烈相关(见图11)，如siR2B+3、siR2B+5、siR2B+9>>siR2B+6、siR2B+7。柱状图形代表n＝3重复孔的平均数；误差线代表标准偏差。

图19显示由针对R2的siRNA(siR2B+5)引起的Hep3B细胞生长潜能的降低被5-氟尿嘧啶(5-FU)曝露增强。人肝细胞癌(HCC)细胞(Hep3B)被稀释铺板培养并然后(1)用靶向萤光素酶的siRNA(Luc105-21)或针对R2的siRNA(siR2B+5)(5nM)转染4小时和/或(2)在转染48小时后开始曝露于5-氟尿嘧啶(5-FU)3天。转染后5天，固定细胞、染色(亚甲基蓝)以及集落记数(约50或更多细胞)。如前所见，与非R2靶向对照(这里是Luc105-21)相比，siR2B+5减少了集落数。单独的5-FU(没有siRNA曝露)与未处理的细胞相比减少了集落数，并且在siR2B+5处理后5-FU的曝露更加减少了集落数量。柱状图形代表n＝3重复孔的平均数；误差线代表标准偏差。

图20显示在小鼠皮下Hep3B肿瘤中针对R2的siRNA降低R2蛋白水平。具有皮下人肝细胞癌(Hep3B)肿瘤的小鼠在基于多聚体的传递系统内接受三次连续的每日肿瘤内(IT)注射2.5mg/kg siRNA(或者无靶向对照siRNA(siCON1)，或者针对R2的siRNA(siR2B+5))。第三次注射之后两天，处死小鼠并且将肿瘤固定、石蜡包埋、切片，以及进行免疫组织化学(IHC)分析以评估肿瘤R2蛋白水平。在用含有针对R2的siRNA的制剂处理的三个小鼠中的两个，与用无靶向对照siRNA处理的小鼠相比肿瘤R2蛋白水平急剧地下降。这提示在这些肿瘤中三次连续的每日肿瘤内注射含有siR2B+5的制剂实现R2蛋白的下调。使用以下等级进行评分：+＝低R2蛋白水平，++＝中等R2蛋白水平，+++＝高R2蛋白水平。

图21显示在培养的鼠肝细胞瘤细胞(McA-RH7777)中针对R2的siRNA降低R2蛋白水平。将鼠肝细胞瘤细胞(McA-RH7777)铺板培养然后用针对R2的反义分子(GTI-2040，1nM或20nM)、针对萤光素酶的siRNA(Luc105-21，仅20nM)、针对R2的21mer siRNA(siR2B+5，1nM或20nM)，或针对R2的25/27mer(siR2B+5-27，1nM或20nM)转染。转染后48小时，裂解细胞，用Western印迹分析R2蛋白水平并使用ImageQuant软件定量。定向于R2的全部分子(GTI-2040反义分子、siR2B+5 21mer和25/27mer)显示对R2蛋白水平的剂量依赖性降低，该降低超过阴性对照(Luc105-21，针对萤光素酶的siRNA)的降低。来自siR2B+5 21mer和25/27mer的R2降低是彼此相似的且超过用GTI-2040反义分子所显示的降低。

图22是用于制备向肝细胞传递的模式颗粒方法的示意图。半乳糖-PEG化合物的存在或缺失分别产生含半乳糖或仅PEG化的微珠。

图23通过为传递siRNA而制备的颗粒的动力学光散射(DLS)显示的粒度分布。图23(a)显示模式微珠Gal-50的粒度分布。图23(b)显示制备的siRNA颗粒的粒度分布，该颗粒是用线性的、含环糊精的聚阳离子和含半乳糖的、基于PEG的修饰物经由自组装形成的。

图24显示经由鼠尾静脉注射后20分钟，肝脏对Gal-50、MeO-50、Gal-140和MeO-140颗粒的摄取。

图25显示来自接受尾静脉注射不同大小颗粒的小鼠的肝脏切片。左栏显示在肝脏切片中大量缺少Gal-140微珠(具有140nm的直径)(图25A)。右栏显示在肝脏切片中存在Gal-50微珠(具有50nm的直径)(图25B)。

图26是TEM图象，其显示Gal-140颗粒被定位在库普弗细胞内且未到达肝细胞的内部。

图27是用以产生im-CDP(含咪唑的CDP)的CDP末端基团功能化示意图。

图28说明聚阳离子疏水性对毒性的影响。在所示的AP5中环糊精成分减少细胞毒性。

图29显示im-CDP作为传递载体，其用于在体外传递siRNA到细胞。培养的人尤文肉瘤(TC-71)细胞被曝露于含siEFBP2的制剂(靶向EWS-FLI1融合蛋白的序列)4小时，该制剂用Oligofectamine(OFA)或含环糊精的聚阳离子(im-CDP)制备。转染后48小时，裂解细胞并且使全细胞蛋白质变性、电泳并且转移到PVDF膜，该膜用抗EWS-FLI1或肌动蛋白的抗体检测，并进行western印迹分析定量。通过光密度测定法确定平均条带亮度并计算EWS-FLI1对肌动蛋白亮度的比率。siEFBP2mut是乱序的siEFBP2 siRNA，用作阴性对照。

图30是曝露于CDP/pDNA(栏a、c和d)或im-CDP/pDNA(栏b、e和f) Polyplex的BHK细胞的TEM图象。在(a)和(b)中细胞内囊泡接近细胞膜并且不处于低pH。在(c-f)中，囊泡接近核膜并且处于接近f的pH值。对于(e)和(f)可观察到未包裹的复合体，而在(c)和(d)中未见。

图31显示含环糊精的Polyplex表面修饰(例如，PEG化的或靶向的)，以及具有金刚烷(AD)-PEG缀合物和β-环糊精的内含物复合体形成的示意图。图31A显示含环糊精的Polyplex表面修饰的示意图。图31B显示具有金刚烷(AD)-PEG缀合物和β-环糊精的内含物复合体形成的示意图。配体(L)用于与细胞表面受体的相互作用。修饰的颗粒可以是充分定义的并且对于体外转染以及体内研究的状态稳定。

图32显示在图31中说明的修饰成分的实例。使用葡萄糖修饰物作为靶向半乳糖研究的对照。

图33显示在50mM盐溶液中Polyplex颗粒的稳定性。用AD-PEG5K(PEG5K指5000分子量的PEG)实现完全的稳定性。加入PEG5K(对照)未提供任何稳定性。大小的增加不是源于颗粒的重构而是由于60nm起始颗粒的聚合(由TEM图像证实)。

图34显示在加入质粒DNA(pDNA)前通过组合CDP和AD-PEG5000(AD-PEG5K)形成的颗粒的大小。颗粒稀释于PBS中制备成1mgDNA/mL。用AD-PEG5K实现在具有大于1000倍稀释度的150mM盐溶液中的完全稳定性。

图35显示使用所指的不同Polyplex的萤光素酶基因的传递。(a)含有表面脱唾液酸糖蛋白(ASGP)受体的HepG2细胞，(b)不含表面受体的HeLa细胞。细胞摄取可经由表面受体介导。

图36是在修饰剂中由使用阴离子片段引起的颗粒可调性表面电荷的实例。100％AD-阴离子-PEG代表在该体系中金刚烷(AD)对环糊精(CD)的1∶1摩尔比例。

图37是Polyplex颗粒自组装的示意图。

图38显示1小时后在培养基(A)或100％FBS(B)中多种Polyplex颗粒的浊度试验。未PEG化的Polyplex聚集而所制备的或移除未结合成分后的PEG化的Polyplex未聚集。

图39显示完整制备的颗粒没有激活补体系统。CDPPEGTf指具有电荷比3.18或5.3(+/-)的完整制备的颗粒。

图40显示CDP传递siRNA到培养细胞中。图40A显示在HeLa细胞中无修饰的和CDP制备的FITC标记的siRNA的FACS分析(将100nMsiRNA曝露于HeLa细胞中达2小时)。图40B显示在HeLa细胞中FITC标记的siRNA的CDP传递的共聚焦图象(将100nM siRNA曝露于HeLa细胞中达4小时)。

图41比较来自注射了50μg siRNA的BALB/c小鼠的定量RT-PCR结果，该siRNA在不同的传递剂型中，通过高压尾静脉注射(HPTV，2mL体积注射)或低压尾静脉注射(LPTV，0.2mL体积注射)。

图42显示传递siRNA的转铁蛋白(Tf)靶向颗粒的组装。图42A显示传递系统的成分。图42B显示无靶向颗粒和靶向颗粒的组装。

图43显示经由含转铁蛋白(Tf)的颗粒传递针对萤光素酶的siRNA。

图44显示在接受所指不同处理的NOD/scid小鼠中移植瘤的生长曲线。对每个处理组[n＝8-10]中值积分的肿瘤生物发光信号(光子/秒)相对于注射(均以50μg siRNA)后的时间作图。组：(A)对照D5W，(B)裸siEFBP2，(C)用对照序列(CON#1)完整配制，(D)用siEFBP2完整配制，和(E)不具有配体而用siEFBP2转铁蛋白来配制。

图45显示配制于含Tf的颗粒中的siRNA对肿瘤生长的抑制(左栏)和siRNA对靶标mRNA的序列特异性抑制。图45A显示对已建立的TC-71肿瘤的肿瘤生长的抑制，该肿瘤接受含Tf的颗粒中针对EWS-FLI1的50μg siRNA的三次每日注射(第34、35、36天)。图45B显示两次每日注射后肿瘤的PCR数据，显示EWS-FLI1-mRNA的序列特异性抑制。

发明详述

总述

由于R2表达的调节贯穿整个细胞周期，R2似乎是必需基因(Kittler等，(2004)Nature 432：1036-1040)，并且R2蛋白的结构已被描述(Cerqueria等(2005)Curr.Med.Chem.12：1283)，因此核糖核苷酸还原酶(RNR)的R2亚基是期望的治疗靶标。与RNR的R1亚基以相对恒定的水平在整个细胞周期中过量存在相比，R2合成开始于S早期，并且在细胞内缓慢地积聚直至有丝分裂晚期，此时其被迅速降解。在多种人组织和肿瘤细胞系中已检测到R2的表达(Zhou等(2003)Cancer Research63：6583-6594)。在某些组织中，R2表达在这些组织的正常细胞中低于可检测水平，但是在这些组织的非正常的(例如，瘤或癌的)细胞中变得可检测或增强。例如，在正常肝脏细胞中R2的表达通过western印迹或免疫染色几乎是无法检测的，但是在肝细胞癌中可被检测到(图3)。相应地，R2的抑制可有助于治疗与细胞增殖相关的疾病或状况，包括，例如，癌症、病原体感染等。

通过抑制细胞内R2的生物学活性，如其酶活性可实现R2的抑制。备选地，通过抑制细胞内R2基因的表达可实现R2的抑制。小分子和核酸可用于下调R2活性和/或表达。实例包括肽或肽衍生物的二聚作用抑制剂(例如美国专利号6,030,942或美国专利号4,845,195中所述的五肽Val Val AsnAsp Leu)、催化抑制剂(例如自由基清除剂或铁螯合剂)、反义分子(例如GTI-2040，Lorus Therapeutics，Inc.)、Lin等(2003)J.Bi0l.Chem.279：27030和Duxbury等(2004)Oncogene 28：1539中所述的siRNA分子。然而，新型和改良的R2抑制剂仍然可期望作为新工具以下调R2。核酸R2抑制剂

在某些方面，本申请提供R2基因的核酸抑制剂和例如，通过降低或下调R2基因的表达用以抑制或降低R2基因或蛋白质的活性的方法。“抑制”或“降低”，意指基因表达或编码一种或多种蛋白质或蛋白质亚基的核酸或核酸等同物的水平被降低到低于缺乏本申请核酸物质时观测到的值。

此处所用的术语“核酸”或“核酸物质”指任何基于核酸的化合物，该化合物含有核苷酸并对R2基因具有期望的影响。核酸可以是单链、双链或多链，并可包括修饰的或非修饰的核苷酸或非核苷酸或多种混合物及其组合。本申请的核酸物质的实例包括，但不限制于dsRNA、siRNA和酶促核酸。

在某些实施方案中，本申请提供靶向一种或多种物种(包括真核生物或原核生物)的R2基因或mRNA的核酸抑制剂。在某些实施方案中，可设计核酸抑制剂以使它们特异性地抑制某些物种的R2基因或mRNA序列的表达，但不抑制其它物种的R2基因或mRNA的表达。例如，可设计有助于治疗病原体感染的核酸抑制剂以使它特异性地抑制在病原体中的R2或mRNA表达，而不抑制宿主的R2基因或mRNA的表达。有助于治疗细菌感染的核酸抑制剂可抑制原核的R2基因的表达或mRNA表达而不抑制真核的R2基因或mRNA表达。来自几个物种的R2 cDNA序列的实例显示于图1和2中。

在某些实施方案中，本申请提供靶向R2基因内一个或多个特异性区域的R2基因的核酸抑制剂。人R2基因内示例性的区域包括下面表1中(也参见图1)显示的核心靶标区域。核心靶标序列通常指靶标R2基因或相应mRNA的部分，其通过核酸抑制剂例如dsRNA、siRNA或酶促核酸在序列特异性结合时有效地抑制R2表达。通常，核酸抑制剂可在严紧性条件下杂交到R2蛋白的区域，所述区域包含核心靶标序列、或R2基因或mRNA的部分，所述R2基因或mRNA部分包含在R2基因或mRNA序列内核心靶标区域的一端或两端侧翼的5、10或20个核苷酸，例如，在任一端或两端的核心靶标位点+/-5、+/-10或+/-20个核苷酸。在表1中显示的核心靶标区域是从人R2序列中获得，然而，来自其它物种包括其它真核生物如其它哺乳动物的R2序列内的等同区域也在本文的考虑之内。

表1 R2的核心靶标序列

描述	序列	SEQ ID NO
描述	序列	SEQ ID NO	RRM2-444核心	5’cgaguaccaug 3’	SEQ ID NO：4
RRM2-632核心	5’gauuuagccaa 3’	SEQ ID NO：5	RRM2-444核心	5’cgaguaccaug 3’	SEQ ID NO：4
RRM2-632核心	5’gauuuagccaa 3’	SEQ ID NO：5	RRM2-928核心	5’aagaaacgagg 3’	SEQ ID NO：6

dsRNA和RNAi构建体

在某些实施方案中，本申请涉及双链RNA(dsRNA)和RNAi构建体。此处使用的术语“dsRNA”指能够RNA干扰(RNAi)的双链RNA分子，包括siRNA(参见例如Bass，2001，Nature，411，428-429；Elbashir等，2001，Nature，411，494.498；和Kreutzer等，PCT公开号WO 00/44895；Zernicka-Goetz等，PCT公开号WO 01/36646；Fire，PCT公开号WO99/32619；Plaetinck等，PCT公开号WO 00/01846；Mello和Fire，PCT公开号WO 01/29058；Deschamps-Depaillette，PCT公开号WO 99/07409；和Li等，PCT公开号WO 00/44914)。另外，RNAi是最初应用于在植物和蠕虫中观察到的现象的术语，其中双链RNA(dsRNA)以特异性和转录后的方式阻碍基因表达。RNAi提供在体外或体内抑制或降低基因表达的有用方法。

此处使用的术语“短干扰RNA”、“siRNA”或“短干扰核酸”，指当由细胞正确加工时，能够介导RNAi或基因沉默能力的任何核酸。例如，siRNA可以是包含自身互补的有义和反义区域的双链多聚核苷酸分子，其中反义区域包括与靶标基因的互补。siRNA可以是具有自身互补的有义和反义区域的单链发夹多聚核苷酸，其中反义区域包括对靶标基因的互补。siRNA可以是环形单链的多聚核苷酸，该多聚核苷酸具有两个或多个环状结构和包含自身互补的有义和反义区域的茎结构，其中反义区域包括对靶标基因的互补，并且其中环形的多聚核苷酸可在体内或体外加工以形成可介导RNAi的活性siRNA。siRNA也可包括具有与靶标基因互补的单链多聚核苷酸，其中单链多聚核苷酸可另外包括末端磷酸基团，如5’-磷酸(参见例如Martinez等，2002，Cell，110，563-574)，或5’，3’-二磷酸。在某些实施方案中，siRNA是结合到靶标核酸并改变靶标核酸活性的非酶促核酸。通过与一种或多种蛋白质或蛋白质复合体，如RNA诱导的沉默复合体(或RISC)间的相互作用可促进siRNA的结合和/或活性。在某些实施方案中，siRNA包含沿着siRNA分子的一条链的单一连续序列与靶标序列互补的序列。

任选地，本申请的siRNA包含核苷酸序列，该核苷酸序列在生理条件下(例如，在细胞环境中)杂交到待抑制基因(“靶标”基因)的mRNA转录物的至少部分的核酸序列。该双链RNA仅需要与具有介导RNAi能力的天然RNA充分相似。因而，本申请具有能耐受由于基因突变、菌株多态性或进化趋异而可以预计的序列变异的优势。靶标序列和siRNA序列间的可耐受的核苷酸错配的数目是在5对碱基中不超过1对，或10对碱基中不超过1对，或20对碱基中不超过1对，或50对碱基中不超过1对。在siRNA双螺旋中心的错配是最关键的并可从根本上阻止靶标RNA的切割。相反，互补到靶标RNA的siRNA链3’末端的核苷酸对靶标识别的特异性无明显贡献。通过本领域所知的序列比对和校正算法(参见Gribskov和Devereux，Sequence Analysis Primer，Stockton Press，1991，以及此处引用的文献)可优化序列同一性，且通过例如使用默认参数在BESTFIT软件程序中执行的Smith-Waterman算法(University of Wisconsin Genetic ComputingGroup)计算核酸序列间的百分比差异。优选siRNA和靶基因部分之间的序列同一性高于90％、95％、96％、97％、98％或99％，或甚至100％。备选地，RNA的双螺旋区域可被功能性地限定为能够在严紧条件下(例如，400mM NaCl，40mM PIPES pH 6.4，1mM EDTA，50℃或70℃杂交12-16小时；接着洗涤)与靶基因转录物的部分杂交的核酸序列。

dsRNA的双链结构可由一条自身互补的RNA链、两条互补RNA链，或DNA链和互补RNA链形成。任选地，可在细胞内或细胞外启动RNA双螺旋形成。以提供每个细胞至少一个拷贝的传递量将RNA导入。双链材料的较高剂量(例如，每细胞至少5、10、100、500或1000个拷贝)可产生更有效的抑制，而较低剂量也可用于特殊的应用。由于靶向抑制相应于RNA双螺旋区域的核酸序列，所以该抑制是序列特异性的。

如这里描述的，目标siRNA包含长约19-30个核苷酸、长约21-27个核苷酸、长约21-25个核苷酸或长约21-23个核苷酸的双螺旋区域。应理解siRNA通过配对到特异性序列来激活核酸酶复合体并将该复合体导向靶基因转录物。结果，在蛋白质复合体中由核酸酶降解靶基因转录物。在某些实施方案中，siRNA分子包含3’羟基基团。在某些实施方案中，例如在dicer酶存在下，siRNA构建体可由加工较长的双链RNA产生。在一个实施方案中，采用果蝇体外系统。在该实施方案中，dsRNA与来自果蝇胚胎的可溶性提取物组合，由此制成组合物。该组合物维持在dsRNA被加工成约21至约27个核苷酸的RNA分子的条件下。利用本领域技术人员所知的许多技术可纯化siRNA分子。例如，可使用凝胶电泳纯化siRNA。备选地，可使用非变性方法如非变性柱层析法纯化siRNA。另外，可使用层析法(例如，大小排阻色谱法)、甘油梯度离心、使用抗体的亲和纯化法纯化siRNA。

由化学合成方法或重组核酸技术可完成目标dsRNA(例如siRNA)的生成。已处理细胞的内源RNA聚合酶可介导体内转录，或克隆的RNA聚合酶可被用于体外转录。此处所用的本申请的dsRNA或siRNA分子无需被限定于仅含有RNA的那些分子，可另外包含化学修饰的核苷酸和非核苷酸。例如，dsRNA可包括对磷酸-糖骨架或核苷酸的修饰，例如以降低对细胞核酸酶的敏感性、改进生物利用率、改进制剂特性和/或改变其它药物代谢动力学性质。例如，可修饰天然RNA的磷酸键使其包含至少一种氮或硫杂原子。在RNA结构中的修饰成分可被修饰以允许特异性的基因抑制而避免对dsRNA的总体应答。同样地，可修饰碱基以阻抑腺苷脱氨酶的活性。可酶促产生或经由部分/总体的有机合成而生成dsRNA，经由体外酶促或有机的合成可导入任何修饰的核糖核苷酸。化学性修饰RNA的方法可适用于修饰dsRNA(参见例如Heidenreich等(1997)Nucleic AcidRes，25：776-780；Wilson等(1994)J MoI Recog 7：89-98；Chen等(1995)Nucleic Acid Res 23：2661-2668；Hirschbein等(1997)Antisense NucleicAcid Drug Dev 7：55-61)。仅用以举例说明，可用硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、二硫代磷酸酯(phosphodithioate)、嵌合的甲基膦酸酯-磷酸二酯、肽核酸、含有寡聚体或糖修饰的5-丙炔基嘧啶(例如，2’取代的核糖核苷、a构型)修饰dsRNA或siRNA的骨架。在某些情况下，本申请的dsRNA缺少含有核苷酸的2’羟基(2’-OH)。在某些实施方案中，siRNA分子包含硫代磷酸酯有义链。在某些实施方案中，siRNA分子包含磷酸二酯反义链。

在一个具体的实施方案中，siRNA分子的至少一条链具有长约1至10个核苷酸、长约1至5个核苷酸、长约1至3个核苷酸，或长约2至4个核苷酸的3’突出端。在某些实施方案中，siRNA可包含具有3’突出端的一条链并且另一条链在3’末端是平末端(例如，没有3’突出端)。在另一个实施方案中，siRNA可能在两条链上都包含3’突出端。突出端的长度对于每条链可以相同或不同。为了进一步增强siRNA的稳定性，3’突出端可被稳定而不降解。在一个实施方案中，通过包含嘌呤的核苷酸如腺嘌呤或鸟嘌呤核苷酸来稳定RNA。备选地，嘧啶核苷酸通过修饰的类似物取代例如尿嘧啶核苷酸3’突出端被2’-胸腺嘧啶取代是允许的并且不影响RNAi的效能。2’羟基的缺失在组织培养基中显著增强突出端的核酸酶抗性并且在体内可能是有益的。

在另一个具体的实施方案中，目标dsRNA也可以是长双链RNA的形式。例如，dsRNA至少是25、50、100、200、300或400个碱基。在某些情况中，dsRNA长度是400～800个碱基。任选地，在细胞内消化dsRNA，例如，以在细胞内产生siRNA序列。然而，在体内长双链RNA的使用不总是可行的，推测由于序列非依赖性的dsRNA应答可能引起有害的影响。在这样的实施方案中，使用降低干扰素或PKR影响的局部传递体系和/或物质是优选的。

在另一个具体的实施方案中，dsRNA或siRNA是发夹结构(或发夹RNA)的形式。发夹RNA可被外源性合成或可通过在体内由RNA聚合酶III启动子转录而形成。制备和使用这种发夹RNA用于在哺乳动物细胞内基因沉默的实例被描述于，例如，Paddison等，Genes Dev，2002，16：948-58；McCaffrey等，Nature，2002，418：38-9；McManus等，RNA5 2002，8：842-50；Yu等，Proc Natl Acad Sci U S A，2002，99：6047-52。优选地，在细胞内或动物体内产生这种发夹RNA以确保对靶基因连续和稳定的抑制。本领域公知可以通过在细胞内加工发夹RNA生成siRNA。

PCT申请WO 01/77350描述示例性的载体用于转基因的双向转录以在真核细胞内产生相同转基因的有义和反义RNA转录物。因此，在某些实施方案中，本申请提供具有下列独特特性的重组载体：它包含病毒复制子，该复制子具有以相反方向排列并且在目标dsRNA的转基因侧翼的两个重叠转录单位，其中这两个重叠转录单位在宿主细胞内从相同的转基因片段中同时产生有义和反义RNA转录物。

在示例性的实施方案中，本申请提供siRNA，其针对如以上表1所示的核心靶标序列，或对应于R2基因或mRNA区的区域，所述R2基因或mRNA对应于在核心靶标序列的一侧或两侧侧翼具有+/-5、+/-10，或+/-20个核苷酸的核心靶标序列。多种示例性siRNA双螺旋的序列被提供于下面表2-8中。

表2 定向于靶标位点A、B和C的siRNA双螺旋。下划线的残基代表3′突出端。

描述	序列	链	SEQ ID NO
描述	序列	链	SEQ ID NO	siRRM2A(或RRM2-444)	5′cccaucgaguaccaugauauc 3′	有义	SEQ ID NO：7
3′agggguagcucaugguacuau 5′	反义	SEQ ID NO：8			5′cccaucgaguaccaugauauc 3′	有义	SEQ ID NO：7
3′agggguagcucaugguacuau 5′	反义	SEQ ID NO：8	siRM2B(或RRM2-632)		5′ggagcgauuuagccaagaagu 3′	有义	SEQ ID NO：9
3′caccucgcuaaaucgguucuu 5′	反义	SEQ ID NO：10			5′ggagcgauuuagccaagaagu 3′	有义	SEQ ID NO：9
3′caccucgcuaaaucgguucuu 5′	反义	SEQ ID NO：10		siRRM2C(或RRM2-928)	5′ggcucaagaaacgaggacuga 3′	有义	SEQ ID NO：11
3′gaccgaguucuuugcuccuga 5′	反义	SEQ ID NO：12			5′ggcucaagaaacgaggacuga 3′	有义	SEQ ID NO：11

与提供于上表2的三种21mer相对应的27mer siRNA也被提供。更具体地，“27R”和“27L”变体可能在下调R2表达中更有效。参见Kim等，“Synthetic dsRNA Dicer substrates enhance RNAi potency andefficacy”Nature Biotechnology 23：222-226(2005)；Rose等，“FunctionfalPolarity is Introduced by Dicer Processing of Short Substrate RNAs”Nucleic Acid Resarch，33(13)：4140-56(2005)。‘R’27mer具有延伸到原始靶标序列右侧(靶标的3’端)的加入的碱基，而‘L’27mer具有延申到原始靶标序列左侧(靶标的5’端)的加入的碱基。27mer siRNA的实例在下表3中显示。

表3 与上表2中显示的21mer siRNA相对应的27mer siRNA。大写字母表示DNA残基，小写字母表示RNA残基，[5′phos]表示5’磷酸，并且下划线的残基表示3’突出端。

描述	序列	链	SEQ IDNO
描述	序列	链	SEQ IDNO	siRRM2A1(或RRM2-444-27R)	5′[5’phos]cccaucgaguaccaugauaucugGC3′	有义	SEQ IDNO：13
3′agggguagcucaugguacuauagaccg 5′	反义	SEQ IDNO：14			5′[5’phos]cccaucgaguaccaugauaucugGC3′	有义	SEQ IDNO：13
3′agggguagcucaugguacuauagaccg 5′	反义	SEQ IDNO：14	siRRM2A2”(或“RRM2-444-27L)		5′aucuuccccaucgaguaccaugauauc 3′	有义	SEQ IDNO：15
3′TAgaagggguagcucaugguacuau[5’phos]5′	反义	SEQ IDNO：16			5′aucuuccccaucgaguaccaugauauc 3′	有义	SEQ IDNO：15
3′TAgaagggguagcucaugguacuau[5’phos]5′	反义	SEQ IDNO：16		siRRM2B1(或RRM2-632-27R)	5′[5’phos]ggagcgauuuagccaagaaguucAG3′	有义	SEQ IDNO：17
3′caccucgcuaaaucgguucuucaaguc 5′	反义	SEQ IDNO：18			5′[5’phos]ggagcgauuuagccaagaaguucAG3′	有义	SEQ IDNO：17
3′caccucgcuaaaucgguucuucaaguc 5′	反义	SEQ IDNO：18	siRRM2B2(或RRM2-632-27L)		5′cuugguggagcgauuuagccaagaagu 3′	有义	SEQ IDNO：19
3′GAaccaccucgcuaaaucgguucuu[5’phos]5′	反义	SEQ IDNO：20			5′cuugguggagcgauuuagccaagaagu 3′	有义	SEQ IDNO：19
3′GAaccaccucgcuaaaucgguucuu[5’phos]5′	反义	SEQ IDNO：20		siRRM2C1(或RRM2-928-27R)	5′[5’phos]ggcucaagaaacgaggacugagaTG3′	有义	SEQ IDNO：21
3′gaccgaguucuuugcuccugacucuac 5′	反义	SEQ IDNO：22			5′[5’phos]ggcucaagaaacgaggacugagaTG3′	有义	SEQ IDNO：21
3′gaccgaguucuuugcuccugacucuac 5′	反义	SEQ IDNO：22	siRRM2C2(或RRM2-928-27L)		5′uauucuggcucaagaaacgaggacuga 3′	有义	SEQ IDNO：23
3′ATaagaccgaguucuuugcuccuga[5’phos]5′	反义	SEQ IDNO：24			5′uauucuggcucaagaaacgaggacuga 3′	有义	SEQ IDNO：23

本申请也提供siRNA，该siRNA靶向本申请的核心靶标序列-20至+20碱基内或本申请的siRNA的-10至+10碱基内。例如，具有靶标位点在三种21mer siRNA每种的-5至+5碱基内的21mer双螺旋被显示或三种核心靶标序列每种的-10至+10碱基被显示于下表4-8中。

表4 定向针对于靶标位点A并且选自siRRM2A siRNA双螺旋的-5至+5碱基的siRNA双螺旋。下划线的残基代表3’突出端。

描述	序列	链	SEQ ID NO
描述	序列	链	SEQ ID NO	siRRM2A-5(或RRM2-439)	5′ucuuccccaucgaguaccaug 3′	有义	SEQ ID NO：25
3′guagaagggguagcucauggu 5′	反义	SEQ ID NO：26			5′ucuuccccaucgaguaccaug 3′	有义	SEQ ID NO：25
3′guagaagggguagcucauggu 5′	反义	SEQ ID NO：26	siRRM2A-4(或RRM2-440)		5′cuuccccaucgaguaccauga3′	有义	SEQ ID NO：27
3′uagaagggguagcucauggua 5′	反义	SEQ ID NO：28			5′cuuccccaucgaguaccauga3′	有义	SEQ ID NO：27
3′uagaagggguagcucauggua 5′	反义	SEQ ID NO：28		siRRM2A-3(或RRM2-441)	5′uuccccaucgaguaccaugau 3′	有义	SEQ ID NO：29
3′agaagggguagcucaugguac 5′	反义	SEQ ID NO：30			5′uuccccaucgaguaccaugau 3′	有义	SEQ ID NO：29
3′agaagggguagcucaugguac 5′	反义	SEQ ID NO：30	siRRM2A-2(或RRM2-442)		5′uccccaucgaguaccaugaua 3′	有义	SEQ ID NO：31
3′gaagggguagcucaugguacu 5′	反义	SEQ ID NO：32			5′uccccaucgaguaccaugaua 3′	有义	SEQ ID NO：31
3′gaagggguagcucaugguacu 5′	反义	SEQ ID NO：32		siRRM2A-1(或RRM2-443)	5′ccccaucgaguaccaugauau 3′	有义	SEQ ID NO：33

描述	序列	链	SEQ ID NO
描述	序列	链	SEQ ID NO		3′aagggguagcucaugguacua 5′	反义	SEQ ID NO：34
siRRM2A+1(或RRM2-445)	5′ccaucgaguaccaugauaucu 3′	有义	SEQ ID NO：35		3′aagggguagcucaugguacua 5′	反义	SEQ ID NO：34
	5′ccaucgaguaccaugauaucu 3′	有义	SEQ ID NO：35	3′gggguagcucaugguacuaua 5′	反义	SEQ ID NO：36
	siRM2A+2(或RRM2-446)	5′caucgaguaccaugauaucug 3′	有义	3′gggguagcucaugguacuaua 5′	反义	SEQ ID NO：36	SEQ ID NO：37
3′ggguagcucaugguacuauag 5′		5′caucgaguaccaugauaucug 3′	有义	反义	SEQ ID NO：38		SEQ ID NO：37
3′ggguagcucaugguacuauag 5′		siRRM2A+3(或RRM2-447)	5′aucgaguaccaugauaucugg 3′	反义	SEQ ID NO：38	有义	SEQ ID NO：39
3′gguagcucaugguacuauaga 5′	反义		5′aucgaguaccaugauaucugg 3′	SEQ ID NO：40		有义	SEQ ID NO：39
3′gguagcucaugguacuauaga 5′	反义		siRRM2A+4(或RRM2-448)	SEQ ID NO：40	5′ucgaguaccaugauaucuggc3′	有义	SEQ ID NO：41
3′guagcucaugguacuauagac 5′	反义	SEQ ID NO：42			5′ucgaguaccaugauaucuggc3′	有义	SEQ ID NO：41
3′guagcucaugguacuauagac 5′	反义	SEQ ID NO：42		siRRM2A+5(或RM2-449)	5′cgaguaccaugauaucuggca 3′	有义	SEQ ID NO：43
3′uagcucaugguacuauagacc 5′	反义	SEQ ID NO：44			5′cgaguaccaugauaucuggca 3′	有义	SEQ ID NO：43

表5 定向针对于靶标位点B并且选自siRRM2B siRNA双螺旋的-5至+5碱基的siRNA双螺旋。下划线的残基代表3’突出端。

描述	序列	链	SEQ ID NO
描述	序列	链	SEQ ID NO	siRRM2B-5(或RRM2-627)	5′uugguggagcgauuuagccaa3′	有义	SEQ ID NO：45
3′ugaaccaccucgcuaaaucgg 5′	反义	SEQ ID NO：46			5′uugguggagcgauuuagccaa3′	有义	SEQ ID NO：45
3′ugaaccaccucgcuaaaucgg 5′	反义	SEQ ID NO：46	siRRM2B-4(或RRM2-628)		5′ugguggagcgauuuagccaag 3′	有义	SEQ ID NO：47
3′gaaccaccucgcuaaaucggu 5′	反义	SEQ ID NO：48			5′ugguggagcgauuuagccaag 3′	有义	SEQ ID NO：47
3′gaaccaccucgcuaaaucggu 5′	反义	SEQ ID NO：48		siRRM2B-3(或RRM2-629)	5′gguggagcgauuuagccaaga 3′	有义	SEQ ID NO：49
3′aaccaccucgcuaaaucgguu 5′	反义	SEQ ID NO：50			5′gguggagcgauuuagccaaga 3′	有义	SEQ ID NO：49
3′aaccaccucgcuaaaucgguu 5′	反义	SEQ ID NO：50	siRRM2B-2(或RRM2-630)		5′guggagcgauuuagccaagaa 3′	有义	SEQ ID NO：51
3′accaccucgcuaaaucgguuc 5′	反义	SEQ ID NO：52			5′guggagcgauuuagccaagaa 3′	有义	SEQ ID NO：51
3′accaccucgcuaaaucgguuc 5′	反义	SEQ ID NO：52		siRRM2B-1(或RRM2-631)	5′uggagcgauuuagccaagaag 3′	有义	SEQ ID NO：53
3′ccaccucgcuaaaucgguucu 5′	反义	SEQ ID NO：54			5′uggagcgauuuagccaagaag 3′	有义	SEQ ID NO：53
3′ccaccucgcuaaaucgguucu 5′	反义	SEQ ID NO：54	siRRM2B+1(或RRM2-633)		5′gagcgauuuagccaagaaguu 3′	有义	SEQ ID NO：55
3′accucgcuaaaucgguucuuc 5′	反义	SEQ ID NO：56			5′gagcgauuuagccaagaaguu 3′	有义	SEQ ID NO：55
3′accucgcuaaaucgguucuuc 5′	反义	SEQ ID NO：56		siRRM2B+2(或RRM2-634)	5′agcgauuuagccaagaaguuc 3′	有义	SEQ ID NO：57

描述	序列	链	SEQ ID NO
描述	序列	链	SEQ ID NO		3′ccucgcuaaaucgguucuuca 5′	反义	SEQ ID NO：58
siRRM2B+3(或RRM2-635)	5′gcgauuuagccaagaaguuca 3′	有义	SEQ ID NO：59		3′ccucgcuaaaucgguucuuca 5′	反义	SEQ ID NO：58
	5′gcgauuuagccaagaaguuca 3′	有义	SEQ ID NO：59	3′cuucgcuaaaucgguucuucaa 5′	反义	SEQ ID NO：60
	siRRM2B+4(或RRM2-636)	5′cgauuuagccaagaaguucag 3′	有义	3′cuucgcuaaaucgguucuucaa 5′	反义	SEQ ID NO：60	SEQ ID NO：61
3′ucgcuaaaucgguucuucaag 5′		5′cgauuuagccaagaaguucag 3′	有义	反义	SEQ ID NO：62		SEQ ID NO：61
3′ucgcuaaaucgguucuucaag 5′		siRRM2B+5(或RRM2-637)(或siR2B+5)(或siRRM2B+521mer)	5′gauuuagccaagaaguucaga 3′	反义	SEQ ID NO：62	有义	SEQ ID NO：63
3′cgcuaaaucgguucuucaagu 5′	反义		5′gauuuagccaagaaguucaga 3′	SEQ ID NO：64		有义	SEQ ID NO：63

表6 定向针对于靶标位点C并且选自siRRM2C siRNA双螺旋的-5至+5碱基的siRNA双螺旋。下划线的残基代表3’突出端。

描述	序列	链	SEQ ID NO
描述	序列	链	SEQ ID NO	siRRM2C-5(或RRM2-923)	5′auucuggcucaagaaacgagg 3′	有义	SEQ ID NO：65
3′uauaagaccgaguucuuugcu 5′	反义	SEQ ID NO：66			5′auucuggcucaagaaacgagg 3′	有义	SEQ ID NO：65
3′uauaagaccgaguucuuugcu 5′	反义	SEQ ID NO：66	siRRM2C-4(或RRM2-924)		5′uucuggcucaagaaacgagga3′	有义	SEQ ID NO：67
3′auaagaccgaguucuuugcuc 5′	反义	SEQ ID NO：			5′uucuggcucaagaaacgagga3′	有义	SEQ ID NO：67

描述	序列	链	SEQ ID NO
描述	序列	链	SEQ ID NO				68
siRRM2C-3(或RRM2-925)	5′ucuggcucaagaaacgaggac 3′	有义	SEQ ID NO：69				68
	5′ucuggcucaagaaacgaggac 3′	有义	SEQ ID NO：69	3′uaagaccgaguucuuugcucc 5′	反义	SEQ ID NO：70
	siRRM2C-2(或RRM2-926)	5′cuggcucaagaaacgaggacu 3′	有义	3′uaagaccgaguucuuugcucc 5′	反义	SEQ ID NO：70	SEQ ID NO：71
3′aagaccgaguucuuugcuccu 5′		5′cuggcucaagaaacgaggacu 3′	有义	反义	SEQ ID NO：72		SEQ ID NO：71
3′aagaccgaguucuuugcuccu 5′		siRRM2C-1(或RRM2-927)	5′uggcucaagaaacgaggacug 3′	反义	SEQ ID NO：72	有义	SEQ ID NO：73
3′agaccgaguucuuugcuccug 5′	反义		5′uggcucaagaaacgaggacug 3′	SEQ ID NO：74		有义	SEQ ID NO：73
3′agaccgaguucuuugcuccug 5′	反义		siRRM2C+1(或RRM2-929)	SEQ ID NO：74	5′gcucaagaaacgaggacugau 3′	有义	SEQ ID NO：75
3′accgaguucuuugcuccugac 5′	反义	SEQ ID NO：76			5′gcucaagaaacgaggacugau 3′	有义	SEQ ID NO：75
3′accgaguucuuugcuccugac 5′	反义	SEQ ID NO：76		siRRM2C+2(或RRM2-930)	5′cucaagaaacgaggacugaug 3′	有义	SEQ ID NO：77
3′ccgaguucuuugcuccugacu 5′	反义	SEQ ID NO：78			5′cucaagaaacgaggacugaug 3′	有义	SEQ ID NO：77
3′ccgaguucuuugcuccugacu 5′	反义	SEQ ID NO：78	siRRM2C+3(或RRM2-931)		5′ucaagaaacgaggacugaugc 3′	有义	SEQ ID NO：79
3′cgaguucuuugcuccugacua 5′	反义	SEQ ID NO：80			5′ucaagaaacgaggacugaugc 3′	有义	SEQ ID NO：79
3′cgaguucuuugcuccugacua 5′	反义	SEQ ID NO：80		siRRM2C+4(或RRM2-932)	5′caagaaacgaggacugaugcc3′	有义	SEQ ID NO：

描述	序列	链	SEQ ID NO
描述	序列	链	SEQ ID NO			81
3′gaguucuuugcuccugacuac 5′	反义	SEQ ID NO：82				81
3′gaguucuuugcuccugacuac 5′	反义	SEQ ID NO：82	siRRM2C+5(或RRM2-933)	5′aagaaacgaggacugaugccu 3′	有义	SEQ ID NO：83
3′aguucuuugcuccugacuacg 5′	反义	SEQ ID NO：84		5′aagaaacgaggacugaugccu 3′	有义	SEQ ID NO：83

这些21mer双螺旋的相应的27mer(“27R”或“27L”)变体也被提供。在下表7中提供实例。

表7 相应于siRRM2B+5 siRNA双螺旋的27mer(或25/27mer)siRNA。下划线的残基代表3’突出端。

描述	序列	链	SEQ IDNO
描述	序列	链	SEQ IDNO	siRRM2B+527mer(或siR2B+5-27)	5’[5’phos]gauuuagccaagaaguucagauuAC3’	有义	SEQ IDNO：85
3’cgcuaaaucgguucuucaagucuaaug 5’	反义	SEQ IDNO：86			5’[5’phos]gauuuagccaagaaguucagauuAC3’	有义	SEQ IDNO：85

表8提供siRNA的实例，该siRNA靶向本申请的核心靶标序列的-20至+20碱基内或本申请的siRNA的-10至+10碱基内。

表8定向于针对靶标位点B并且选自siRRM2B siRNA双螺旋的+6至+10碱基的siRNA双螺旋。下划线的残基代表3’突出端。

描述	序列	链	SEQ ID NO
描述	序列	链	SEQ ID NO	siRRM2B+6(或RRM2-638)(或siR2B+6)	5′auuuagccaagaaguucagau 3′	有义	SEQ ID NO：87
3′gcuaaaucgguucuucaaguc 5′	反义	SEQ ID NO：88			5′auuuagccaagaaguucagau 3′	有义	SEQ ID NO：87
3′gcuaaaucgguucuucaaguc 5′	反义	SEQ ID NO：88	siRRM2B+7(或RRM2-639)(或siR2B+7)		5′uuuagccaagaaguucagauu 3′	有义	SEQ ID NO：89
3′cuaaaucgguucuucaagucu 5′	反义	SEQ ID NO：90			5′uuuagccaagaaguucagauu 3′	有义	SEQ ID NO：89
3′cuaaaucgguucuucaagucu 5′	反义	SEQ ID NO：90		siRRM2B+8(或RRM2-640)(或siR2B+8)	5′uuagccaagaaguucagauua 3′	有义	SEQ ID NO：91
3′uaaaaaucgguucuucaagucua 5′	反义	SEQ ID NO：92			5′uuagccaagaaguucagauua 3′	有义	SEQ ID NO：91
3′uaaaaaucgguucuucaagucua 5′	反义	SEQ ID NO：92	siRRM2B+9(或RRM2-641)(或siR2B+9)		5′uagccaagaaguucagauuac 3′	有义	SEQ ID NO：93
3′aaaucgguucuucaagucuaa 5′	反义	SEQ ID NO：94			5′uagccaagaaguucagauuac 3′	有义	SEQ ID NO：93
3′aaaucgguucuucaagucuaa 5′	反义	SEQ ID NO：94		siRRM2B+10(或RRM2-642)(或siR2B+10)	5′agccaagaaguucagauuaca 3′	有义	SEQ ID NO：95
3′aaucgguucuucaagucuaau 5′	反义	SEQ ID NO：96			5′agccaagaaguucagauuaca 3′	有义	SEQ ID NO：95

酶促核酸

在某些实施方案中，本申请涉及抑制R2基因或mRNA表达的酶促核酸。示例性的酶促核酸包括靶向以上表1中提供的核心靶标序列之一的那些核酸，或包含核心靶标序列的区域，所述核心靶标序列的一侧或两侧侧翼具有5、10或20个核苷酸。“酶促核酸”，意指在底物结合区域对指定的靶标基因具有互补性，并且也具有特异性切割靶标核酸活性的催化活性的核酸。应理解酶促核酸可以在分子间切割核酸并由此抑制靶标核酸。这些互补区域允许酶促核酸与靶标核酸充分的杂交并因此允许切割。优选百分百互补性(同一性)，但是低至50～75％的互补性在本申请中也是有用的(参见例如Werner和Uhlenbeck，1995，Nucleic Acid Research，23，2092-2096；Hammann等，1999，Antisense and Nucleic Acid Drug Dev.，9，25-31)。可在碱基、糖和/或磷酸基上修饰酶促核酸。这里所述的术语“酶促核酸”可与短语如核糖核酸酶、催化性RNA、酶促RNA、催化性DNA、aptazyme或适配体-结合核糖核酸酶、可调控核糖核酸酶、催化性寡聚核苷酸、核酶(nucleozyme)、脱氧核酶、RNA酶、核糖核酸内切酶、核酸内切酶、“小”核酶、leadzyme、oligozyme或DNA酶互换使用。所有这些术语学描述具有酶催化性活性的核酸。在本申请中描述的特异性酶促核酸在本申请中是非限定的，并且本领域的技术人员知道在本申请的酶促核酸中所重要的是其具有与一个或多个的靶标核酸区域互补的特异性底物结合位点，并且其在底物结合位点内或周围具有核苷酸序列，该核苷酸序列赋予对分子的核酸切割和/或连接活性(Cech等，美国专利号4,987,071；Cech等，1988，260JAMA 3030)。

当前公知几种天然形成的酶促核酸。在生理条件下每种都可催化反式核酸磷酸二酯键的水解(从而可切割其它核酸)。通常，酶促核酸通过首先结合到靶标核酸起作用。这样的结合经由酶促核酸的靶标结合部分发生，使对起切割靶标核酸作用的分子的酶催化部分保持接近。因此，酶促核酸首先识别然后由互补的碱基对结合靶标核酸，且一旦结合到正确位点，就酶催化地起作用以切割靶标核酸。对这种靶标核酸的战略性切割将破坏其指导合成所编码蛋白质的能力。酶促核酸结合并切割它的核酸靶标后，它从该核酸处被释放以寻找另一个靶标并且可重复地结合并且切割新的靶标。

在具体的实施方案中，目标酶促核酸是设计成催化性地切割R2mRNA以防止mRNA翻译的核糖核酸酶(参见，例如，PCT国际公布WO90/11364，公布于1990年10月4日；Sarver等，1990，Science247：1222-1225；美国专利号5,093,246)。尽管在位点特异性的识别序列上切割mRNA的核糖核酸酶可用以破坏特定的mRNA，但优选使用锤头状核酶。锤头状核酶在由侧翼区域指定的位点上切割mRNA，该侧翼区域与靶标mRNA形成互补碱基对。唯一的要求是靶标mRNA具有以下两个碱基的序列：5’-UG-3’。锤头状核酶的构建和产生在本领域是公知的并且更完整地描述于Haseloff和Gerlach，1988，Nature，334：585-591。本申请的核糖核酸酶也包括RNA核糖核酸内切酶(在下文中称为“Cech-型核糖核酸酶”)如天然存在于嗜热四膜虫内的核糖核酸酶(已知为IVS或L-19 IVSRNA)并且其已被广泛描述(参见Zaug等，1984，Science，224：574-578；Zaug和Cech，1986，Science，.231：470-475；Zaug等，1986，Nature，324：429-433；由University Patents Inc公布的国际专利申请号WO 88/04300；Been和Cech，1986，Cell，47：207-216)。

在另一个具体的实施方案中，目标酶促核酸是DNA酶。DNA酶掺入了反义技术和核糖核酸酶技术的一些机械特征。设计DNA酶以使其识别特定的靶标核酸序列如反义寡核苷酸，然而如核糖核酸酶一样它们是催化性的并且特异性切割靶标核酸。简言之，为设计特异性识别并切割靶标核酸的理想的DNA酶，本领域的技术人员必须首先鉴别独特的靶标序列。优选地，独特或充分的序列是约18至22个核苷酸的富含G/C区。高G/C含量帮助确保DNA酶和靶标基因序列间更强的相互作用。当合成DNA酶时，将酶靶向信使的特异性反义识别序列是分开的，因此其包含DNA酶的两臂，并且DNA酶环被置于两个特异性臂之间。制备和施用DNA酶的方法可见于例如美国专利号6,110,462。

在某些实施方案中，本申请的核酸物质长度可以是12至200个核苷酸之间。在一个实施方案中，本申请的示例性的酶促核酸长度是15至50个核苷酸之间，包括，例如，长25至40个核苷酸之间(例如参见Jarvis等，1996，J.Biol.Chem.，271，29107-29112)。在另一个实施方案中，本申请的示例性的反义分子长度是15至75个核苷酸之间，包括，例如，长20至35个核苷酸之间(参见例如Woolf等，1992，PNAS.，89，7305-7309；Milner等，1997，Nature Biotechnology，15，537-541)。在另一个实施方案中，本申请的示例性的siRNA长度是20至30个核苷酸之间，包括，例如，长21至27个核苷酸之间。本领域的技术人员公认所必需的是目标核酸物质的长度和构象对于这里考虑到的活性是充分且合适的。本申请的核酸物质的长度没有限定在规定的一般性限制内。

核酸物质的合成

使用自动化方法长度难以合成长于100个核苷酸的核酸，并且这类分子的治疗费用是令人难以接受的。在本申请中，小的核酸基序(小指核酸基序长度短于约100个核苷酸，优选地长度短于约80个核苷酸，且更优选地长度短于约50个核苷酸(例如酶促核酸和RNAi构建体))被优选地使用于外源传递。这些分子的简单结构增加核酸侵袭RNA结构的靶向区域的能力。

本申请的示例性核酸抑制剂分子包括RNA和DNA分子，可被化学合成。例如，利用本领域所知的方法合成寡核苷酸(例如DNA)，所述方法描述于Caruthers等，1992，Methods in Enzymology 211，3-19，Thompson等，国际PCT公开号WO 99/54459，Wincott等，1995，Nucleic Acids Res.23，2677-2684，Wincott等，1997，Methods MoI.Bio.，74，59，Brennan等.，1998，Biotechnol Bioeng.，61，33-45，以及Brennan，美国专利号6,001,311中。寡核苷酸的合成利用普通核酸保护和偶联基团如5’末端的二甲氧三苯甲基，和3’末端的亚磷酰胺。在非限定的实例中，以对2’-O-甲基化核苷酸的2.5分钟偶联步骤和对2’-脱氧核苷酸的45秒偶联步骤在394 AppliedBiosystems Inc.合成仪上进行小规模的合成。备选地，可在96孔板合成仪，如由Protogene(Palo Alto，CA)生产的具有对循环最小修饰的仪器上进行合成。

任选地，本核酸的部分可被单独合成并于合成后结合在一起，例如通过连接(Moore等，1992，Science 256，9923；Draper等，国际PCT公开号WO 93/23569；Shabarova等，1991，Nucleic Acids Research 19，4247；Bellon等，1997，Nucleosides & Nucleotides，16，951；Bellon等，1997，BioconjugateChem.8，204)。

优选地，通过用核酸酶抗性基团例如2’氨基、’-C-烯丙基、2’-氟、2’-O-甲基、2’-H广泛修饰本文的核酸以增强稳定性(综述参见Usman和Cedergren，1992，TIBS 17，34；Usman等，1994，Nucleic Acids Symp.Ser.31，163)。利用常规方法通过凝胶电泳纯化或通过高压液相色谱法(HPLC，参见Wincott等，supra)纯化核糖核酸酶并重悬于水中。

优化核酸活性

具有修饰(例如碱基、糖和/或磷酸基)的核酸可防止其被血清核糖核酸酶降解并由此增加它们的潜能。本领域中有几个描述糖、碱基和磷酸基修饰的实例可被引入到核酸，能够显著增强其核酸酶稳定性和效能。例如，用核酸酶抗性基团，例如，2’-氨基、2’-C-烯丙基、2’-氟、2’-O-甲基、2’-H，核苷酸碱基修饰成分修饰寡核苷酸以增强稳定性和/或提高生物学活性(综述参见Usman和Cedergren，1992，TIBS.17，34；Usman等，1994，NucleicAcids Symp.Ser.31，163；Burgin等，1996，Biochemistry，35，14090)。本领域已广泛描述核酸的糖修饰(参见Eckstein等，PCT公开号WO 92/07065；Perrault等.Nature，1990，344，565-568；Pieken等.Science，1991，253，314-317；Usman和Cedergren，Trends in Biochem.Sci.，1992，17，334-339；Usman等.PCT公开号WO 93/15187；Sproat，美国专利号5,334,711和Beigelman等，1995，J.Biol.Chem.，270,25702；Beigelman等，PCT公开号WO 97/26270；Beigelman等，美国专利号5,716,824；Usman等，美国专利号5,627,053；Woolf等，PCT公开号WO 98/13526；Thompson等，U.S.S No.60/082,404于1998年4月20日提出申请；Karpeisky等，1998，TetrahedronLett，39，1131；Earnshaw和Gait，1998，Biopolymers(Nucleic AcidsSciences)，48，39-55；Verma和Eckstein，1998，Annu.Rev.Biochem.，67，99-134；和Burlina等，1997，Bioorg.Med.Chem.，5，1999-2010)。可使用类似的修饰成分修饰本申请的核酸。

尽管使用硫代磷酸酯、硫代磷酸酯和/或5’甲基磷酸酯键的寡核苷酸核苷酸间键合的化学修饰可增强稳定性，过多的这些修饰可引起毒性。因此，设计核酸时这些核苷酸间键合的量应被评估并适当地最小化。这些键合浓度的降低将降低毒性从而增加这些分子的效能和具有更高的特异性。

在一个实施方案中，本申请的核酸包括一个或多个G夹子核苷酸。G夹子核苷酸是修饰的胞嘧啶类似物，其中该修饰赋予氢键在双螺旋内互补鸟嘌呤的沃森-克里克和Hoogsteen面的能力，参见例如，Lin和Matteucci，1998，J.Am.Chem.Soc，120，8531-8532。寡核苷酸内的单个G夹子类似取代物在杂交到互补的寡核苷酸时可导致从根本上增强的螺旋热稳定性和错配分辨率。本申请核酸中的这类核苷酸内含物导致对核酸靶标的增强的亲和性和特异性。在另一个实施方案中，本申请的核酸包括一个或多个LNA(锁定核酸)核苷酸如2’，4’-C mythylene二环核苷酸(参见例如Wengel等，PCT公开号WO 00/66604和WO 99/14226)。

在另一个实施方案中，本申请描述了靶向R2基因的核酸的缀合物和/或复合体。这样的缀合物和/或复合体可被用于促进核酸传递到生物系统如细胞中。本申请提供的缀合物和复合体可通过向靶组织或细胞型转运或转移治疗剂、跨越细胞膜、改变药物代谢动力学、和/或调节本发明的核酸定位来提供治疗活性。以下也对这样的缀合物和/或复合体加以描述。

本申请包含新型缀合物和复合体的设计与合成，其用于传递分子跨越细胞膜，所述分子包括但不限于，小分子、脂质、磷脂、核苷、核苷酸、核酸、抗体、毒素、负电荷多聚体和其它多聚体，例如蛋白质、肽、激素、碳水化合物、聚乙二醇、或多胺。通常，所述转运分子被设计成单独地或作为多成分系统的部分使用，具有或不具有可降解的接头。在血清存在或缺乏下，这些化合物被期望促进传递和/或定位本申请的核酸进入来源于不同组织的多种细胞型中(参见Sullenger和Cech，美国专利号5,854,038)。这里所述分子的缀合物可经由可生物降解的接头如可生物降解的核酸接头分子连接到生物活性分子上。

这里使用的术语“可生物降解的核酸接头分子”，指被设计为可生物降解的接头的核酸分子，用所述核酸分子将一个分子连接到另一个分子，例如生物活性分子上。通过使用核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸和化学修饰的核苷酸例如2’-O-甲基、2’-氟、2’氨基、2’-O-氨基、2’-C-烯丙基、2’-O-烯丙基，和其它2’修饰或碱基修饰的核苷酸的多种组合可调节可生物降解的核酸接头分子的稳定性。可生物降解的核酸接头分子可以是二聚物、三聚物、四聚物或更长的核酸，例如长约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸的寡核苷酸，或可包含具有基于磷的键合例如氨基磷酸酯或磷酸二酯键合的一个核苷酸。可生物降解的核酸接头分子也可包括核酸骨架、核酸糖基或核酸碱基修饰。这里使用的术语“可生物降解的”，指在生物系统中的降解，例如酶促降解或化学降解。

外源提供的治疗性核酸物质，如这里所述的分子在细胞中最佳稳定，直至靶标RNA的翻译被抑制足够长时间以降低不期望的蛋白质的水平。这段时间在几小时至几天之间变化，其取决于疾病状态。这些核酸物质应对核酸酶有抵抗力以作为有效的细胞内治疗剂起作用。在此处和本领域的核酸化学合成中的改进已增强其通过引入核苷酸修饰来修饰核酸提高对核酸酶稳定性的能力。

在另一方面，核酸包含5’和/或3’帽子结构。“帽子结构”意指化学修饰，其已被掺入到寡核苷酸的任一末端(参见例如Wincott等，WO 97/26270)。这些末端修饰保护核酸免受核酸外切酶降解，并可有助于传递和/或细胞内的定位。帽子可存在于5’末端(5’帽子)或3’末端(3’帽子)或可存在于两端。在非限定的实例中，5’帽子包括反向的脱碱基残基(部分)、4’，5’-亚甲基核苷酸、1-(β-D-赤呋喃糖基)核苷酸、4’-硫代核苷酸、碳环核苷酸、1，5-己糖醇酐核苷酸、L-核苷酸、α-核苷酸、修饰的碱基核苷酸、二硫代磷酸酯键合、苏型-戊呋喃糖基核苷酸、无环的3’，4’-断裂核苷酸(3’，4’-seconucleotide)、无环的3，4-二羟丁基核苷酸、无环的3，5-二羟戊基核苷酸、3’-3’-反向核苷酸部分、3’-3’-反向脱碱基部分、3’-2’-反向核苷酸部分、 ’-2’-反向脱碱基部分、1，4-丁二醇磷酸盐、3’-氨基磷酸酯、己基磷酸盐、氨己基磷酸盐、3’-磷酸盐、3’-硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、桥联或未桥联的甲基膦酸酯部分(更多详情参见以上Wincott等)。在其它非限定的实例中，3’帽子包括，例如，4’，5’-亚甲基核苷；1-(β-D-赤呋喃糖基)核苷酸、4’硫代核苷酸、碳环核苷酸、5’-氨基-烷基磷酸盐、1，3-二氨基-2-丙基磷酸盐、3-氨基丙基磷酸盐、6-氨基己基磷酸盐、1，2-氨基十二烷基磷酸盐、羟基丙基磷酸盐、1，5-己糖醇酐核苷酸、L-核苷酸、α-核苷酸、修饰的碱基核苷酸、二硫代磷酸酯、苏型戊呋喃糖基核苷酸、无环的3’，4’-断裂核苷酸、3，4-二羟丁基核苷3，5-二羟戊基核苷酸、5’-5’-反向核苷部分、’-5’-反向脱碱基部分、5’-氨基磷酸酯、5’-硫代磷酸酯、1，4-丁二醇磷酸盐、5’-氨基、桥联和/或未桥联5′-氨基磷酸酯、硫代磷酸酯和/或二硫代磷酸酯、桥联或未桥联甲基膦酸酯和5’-巯基部分(更多详情参见Beaucage和Iyer，1993，Tetrahedron 49，1925)。

R2抑制剂的用途

在某些实施方案中，本申请提供抑制一种或多种细胞例如肿瘤或癌细胞或病原体细胞有害增殖的方法。在某些实施方案中，本申请提供抑制或降低肿瘤生长的方法和治疗患癌症个体的方法。这些方法包括对个体患者施用有效量的一种或多种上述的R2抑制剂(例如siRNA)。在某些实施方案中，本申请提供治疗转移性癌症和/或防止转移的方法。在某些实施方案中，本申请提供对传统治疗例如化疗物质有抗性的癌症的治疗方法。某些方法特别针对动物的治疗和预防处理，且更特别地针对人，并且在这样的方法中，将治疗有效量的R2抑制剂施用到动物或人患者。

术语“处理”包括预防和/或治疗处理。术语“预防或治疗”处理是领域公认的并且包括向宿主施用一种或多种对象组合物。如果它在不期望状况(例如宿主动物的疾病或其它不期望的状态)的临床表现前施用，那么处理是预防的(即它保护宿主抵抗发展中的不期望的状况)，反之它如果在不期望状况的表现后施用，处理是治疗的(即它意在减少、改善或稳定现有的不期望状况或其副作用)。

这里描述的肿瘤或癌症包括个体内的肿瘤、肿瘤异种移植物或体外培养的肿瘤，特别地，本申请的核酸物质有助于治疗或预防癌症。本方法可治疗的示例性癌症形式包括，但不限于，前列腺癌、膀胱癌、肺癌(包括小细胞或非小细胞癌)、结肠癌、肾癌、肝癌、乳腺癌、宫颈癌、子宫内膜或其它的子宫癌、卵巢癌、睾丸癌、阴茎的癌症、阴道的癌症、尿道的癌症、胆囊癌、食道癌或胰腺癌。本方法可治疗癌症的另外示例性形式包括，但不限于，骨骼或平滑肌的癌症、胃癌、小肠癌、唾液腺癌、肛门癌、直肠癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、垂体癌和鼻咽癌。可用本发明R2抑制剂治疗的癌症的另外示例性形式包括含有hedgehog表达细胞的癌症。本申请R2抑制剂可治疗的癌症的另外示例性形式包括含有R2表达细胞的癌症。在某些这样的实施方案中，与癌细胞具有相同组织类型的正常的或非癌的细胞在由本领域技术可检测的水平上可不表达R2；例如，与在肝细胞癌细胞中R2的表达相比，正常的肝组织或肝细胞不表达可检测水平的R2。本申请考虑到这里的R2抑制剂可被单独使用，或作为包括其它疗法和/或其它传统或非传统治疗的整体治疗法的部分被施用。

使用此处描述的R2抑制剂核酸可治疗的癌症的另外的实例包括下列各项：白血病，例如但非限于，急性白血病、急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病(例如成髓细胞的、前髓细胞的、骨髓单核细胞的、单核细胞的、和红白血病白血病)以及骨髓异常增殖综合征；慢性白血病，例如但非限于，慢性髓细胞(粒细胞)白血病、慢性淋巴细胞白血病、毛细胞白血病、红细胞增多症；淋巴瘤例如但非限于霍奇金病、非霍奇金病；多发性骨髓瘤例如但非限于郁积型多发性骨髓瘤、无分泌性骨髓瘤、骨硬化性骨髓瘤、浆细胞白血病、孤立浆细胞瘤和髓外浆细胞瘤；瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；未确定显著性的单克隆丙种球蛋白病；良性的单克隆丙种球蛋白病；重链病；骨和连接组织肉瘤例如但非限于骨肉瘤(bone sarcroma)、骨肉瘤(osteosarcoma)、软骨肉瘤、尤因氏肉瘤、恶性巨细胞瘤、骨纤维肉瘤、脊索瘤、骨膜肉瘤、软组织肉瘤、血管瘤(血管肉瘤)、纤维肉瘤、卡波西肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、淋巴管肉瘤、神经鞘瘤、横纹肌肉瘤、滑膜肉瘤；脑瘤例如但非限于神经胶质瘤、星细胞瘤、脑干胶质瘤、室鼓膜瘤、少枝胶质细胞瘤、非神经胶质瘤、听神经瘤、颅咽管瘤、成神经管细胞瘤、脑脊膜瘤、松果体细胞瘤、成松果体细胞瘤、原发性脑恶性淋巴瘤；乳腺癌例如但非限于腺癌、小叶(小细胞)癌、导管内癌、乳腺髓样癌、乳腺黏液癌、管状乳腺癌、乳突状乳腺癌、帕哲病和炎性乳腺癌；肾上腺瘤例如但非限于嗜铬细胞瘤和肾上腺皮质腺癌；甲状腺癌例如但非限于乳头状或滤泡状甲状腺癌、甲状腺髓样癌和甲状腺未分化癌；胰腺癌例如但非限于，胰岛癌、促胃液素瘤、胰高血糖素瘤、VIP肿瘤、生长激素抑制素分泌瘤和良性肿瘤或胰岛细胞瘤；垂体癌例如但非限于库欣氏病、泌乳素瘤、肢端肥大症和多糖尿崩症；眼癌例如但非限于眼膜恶性黑色素瘤如虹膜恶性黑色素瘤、脉络膜恶性黑色素瘤和睫状体恶性黑色素瘤以及视网膜神经胶质瘤；阴道癌例如鳞状细胞癌、腺癌和黑素癌；外阴癌例如鳞状细胞癌、黑素癌、腺癌、基底细胞癌、肉瘤和帕哲病；宫颈癌例如但非限于鳞状细胞癌和腺癌；子宫癌例如但非限于子宫内膜癌和子宫肉瘤；卵巢癌例如但非限于，卵巢上皮性癌、境界瘤、胚组织瘤和间质瘤；食管癌例如但非限于，鳞状细胞癌、腺癌、腺鳞癌、粘表皮癌、腺性鳞状癌、肉瘤、黑素癌、浆细胞瘤、疣状癌和燕麦细胞(小细胞)瘤；胃癌例如但非限于腺癌、真菌样生长(息肉状)、溃疡的、表面传播的、扩散传播的、恶性淋巴瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤和癌肉瘤；结肠癌；直肠癌；肝癌例如但非限于肝细胞癌和肝胚细胞瘤；胆囊癌例如腺癌；胆管癌例如但非限于乳头状、结节状和扩散的；肺癌例如非小细胞肺癌、鳞状细胞癌(表皮癌)、腺癌、大细胞癌和小细胞肺癌；睾丸癌例如但非限于胚瘤、精原细胞瘤、退行发育的、代表性的(典型的)、精母细胞、非精原细胞瘤、胚胎性癌、畸胎瘤、绒毛膜癌(卵黄囊瘤)；前列腺癌例如但非限于，腺癌、平滑肌肉瘤和横纹肌肉瘤、阴茎癌；口腔癌例如但非限于鳞状细胞癌、基底癌；唾液腺癌症例如但非限制于腺癌、粘表皮癌和腺样囊性癌；咽因癌例如但非限于鳞状细胞癌和疣；皮肤癌例如但非限于，基底细胞癌、鳞状细胞癌和黑素瘤、浅表扩散性黑色素瘤、结节性黑色素瘤、恶性雀斑痣样黑素瘤、肢端着色斑性黑素瘤；肾癌例如但非限于肾细胞癌、腺癌、肾上腺样癌、纤维肉瘤、移行细胞癌(肾盂和/或子宫)；肾母细胞瘤；膀胱癌例如但非限于转移细胞癌、鳞状细胞癌、腺癌、癌肉瘤。另外，癌包括粘液肉瘤、骨源性肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、间皮瘤、滑膜瘤、成血管细胞瘤、上皮癌、囊腺癌、支气管癌、汗腺瘤、皮脂腺癌、乳突状癌和乳突状腺癌(这些情况的综述参见Fishman等，1985，Medicine，第2版，J.B.Lippincott Co.，Philadelphia和Murphy等，1997，Informed Decisions：The Complete Book of CancerDiagNOis，Treatment，and Recovery，Viking Penguin，Penguin BooksU.S.A.，Inc.，United States of America)。

在某些实施方案中，本申请提供抑制病原体细胞增殖的方法，例如，在受到病原体细胞感染的患者体内或被病原体细胞污染的物体(例如，化验室或医学设备、厨房操作台或任何受到病原体污染的物体等)内部或表面。病原体的实例包括病毒、细菌、真菌等。多种病原体的广泛基因组信息可获取于公共数据库。这样的基因组信息可被用以设计在多种病原体中靶向R2基因的核酸抑制剂。

根据此处所述的方法可使用的致病病毒的实例包括：逆转录病毒科(例如人免疫缺陷病毒，如HIV-I(也被指为HTLV-III、LAV或HTLV-III/LAV，参见Ratner，L.等，Nature，Vol.313，Pp.227-284(1985)；Wain Hobson，S.等，Cell，Vol.40：Pp.9-17(1985))；HIV-2(参见Guyader等，Nature，Vol.328，pp.662-669(1987)；欧洲专利公开号0 269 520；Chakraborti等，Nature，Vol.328，Pp.543-547(1987)；欧洲专利申请号0655 501)；和其它的分离菌，如HIV-LP(国际公开号WO 94/00562题名“ANovel Human Immunodeficiency Virus”))；小RNA病毒科(例如脊髓灰质炎病毒、肝炎A病毒(Gust，I.D.，等，Intervirology，Vol.20，Pp.1-7(1983)；肠道病毒、人柯萨奇病毒、鼻病毒、人肠道孤病毒)；Calciviridae (例如，引起肠胃炎的毒株)；披膜病毒科(例如，马脑炎病毒、风疹病毒)；黄病毒科(例如，登革热病毒、脑炎病毒、黄热病病毒)；冠状病毒科(例如冠状病毒)；弹状病毒科(例如，疱疹性口炎病毒、狂犬病病毒)；纤丝病毒科(例如埃博拉病毒)；副粘病毒科(例如，副流感病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒)；正粘病毒科(例如，流行性感冒病毒)；布尼亚病毒科(例如，汉坦病毒、bunga病毒、静脉病毒和内罗病毒)；沙粒病毒科(出血热病毒)；呼肠病毒科(例如呼肠孤病毒、环状病毒和轮状病毒)；双核糖核酸病毒科；肝DNA病毒科(肝炎B病毒)；细小病毒科(细小病毒)；乳头多瘤空病毒科(乳突淋瘤病毒、多瘤病毒)；腺病毒科(多数腺病毒)；疱疹病毒科(单纯疱疹病毒(HSV)1和2、水痘带状疱疹病毒、细胞巨化病毒(CMV)、疱疹病毒)；痘病毒科(天花病毒、牛痘病毒、痘病毒)；和虹彩病毒科(例如，非洲猪热病)；和未归类的病毒(例如，海绵状脑病的病因学物质、δ肝炎物质(被认为是肝炎B病毒的有缺陷的卫星细胞)、非A、非B肝炎物质(分类1＝体内传播的；分类2＝肠胃外传播的(既肝炎C)；诺沃克和相关的病毒，以及星状病毒)。

传染性细菌的实例包括：幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)、伯氏包柔氏螺旋体菌(Borrelia burgdorferi)、嗜肺性军团病菌(Legionellapneumophilia)、某种分支杆菌(Mycobacterium sps.)(例如M.tuberculosis、M.avium、M.intracellular、M.kansaii、M.gordonae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitides)、单核细胞增多性李司忒氏菌(Listeriamonocytogenes)、恶性酿脓链球菌(A组链球菌属)(Streptococcuspyogenes)(Group A Streptococcus)、无乳链球菌(B组链球菌属)(Streptococcus agalactiae)(Group B Streptococcus)、链球菌(viridans组)(Streptococcus)(viridans group)、粪链球菌(Streptococcus faecalis)、波比斯链球菌(Streptococcus bovis)、链球菌(厌氧种)(Streptococcus)(anaerobicsps.)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、一种致病性弯曲杆菌(Campylobacter sp.)、一种肠球菌(Enterococcus sp.)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、炭疽杆菌(Bacillus anthracis)、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)、一种棒状杆菌(Corynebacterium sp.)、红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)、产气荚膜梭状芽胞杆菌(Clostridium perfringers)、破伤风梭状芽胞杆菌(Clostridium tetani)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、佛里德兰德氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)、多杀巴斯德氏菌(Pasturella multocida)、一种拟杆菌(Bacteroides sp.)、核粒梭形杆菌(Fusobacterium nucleatum)、念珠状链杆菌(Streptobacillusmoniliformis)、苍白密螺旋体(Treponema pallidium)、细弱密螺旋体(Treponema pertenue)、钩端螺旋体(Leptospira)和衣氏放线菌(Actinomycesisraelii)。

传染性真菌的实例包括：新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、夹膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、沙眼衣原体(Chlamydiatrachomatis)、白色念珠菌(Candida albicans)。其它传染性有机体(即原生生物)包括：镰状疟原虫(Plasmodium falciparum)和鼠弓形体(Toxoplasmagondii)。

多种微生物的基因组信息(包括核酸序列、氨基酸序列、蛋白质表达信息，和/或蛋白质结构信息)可查阅于由基因组研究所(TIGR)(www.tigr.org)和/或国立生物技术信息中心(NCBI)(www.ncbi.nlm.nih.gov)维护的数据库。可获得基因组信息的细菌的实例包括，例如，根癌土壤杆菌菌株C58(Agrobacterium tumefaciens str.C58)(Cereon)(NC_03062 & NC_003063)、根癌土壤杆菌菌株C58(Agrobacterium tumefaciens str.C58)(U.Washington)(NC_003304 & NC_003305)、超嗜热菌(Aquifexaeolicus)(NC_000918)、耐盐芽孢杆菌(Bacillus halodurans)(NC 002570)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)(NC_000964)、伯氏包柔氏螺旋体(Borreliaburgdorferi)(NC_001318)、马尔他布鲁氏杆菌(Brucella melitensis)(NC_003317 & NC_003318)、某种巴克纳氏菌(Buchnera sp.APS)(NC_002528)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)(NC_002163)、新月柄杆菌CB15(Caulobacter crescentus--CB 15)(NC_002696)、鼠衣原体(Chlamydia muridarum)(NC_02620)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)(NC_000117)、肺炎披衣菌AR39(Chlamydophila pneumoniae AR39)(NC_002179)、肺炎披衣菌CWL029(Chlamydophilapneumoniae CWL029)(NC_000922)、肺炎披衣菌J138(Chlamydophila pneumoniaeJ138)(NC_002491)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)(NC_003030)、产气荚膜梭状芽胞杆菌(Clostridium perfringens)((NC_003366)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)(NC_003450)、耐辐射球菌(Deinococcusradiodurans)(NC_001263 & NC_001264)、大肠杆菌K12(Escberichia coliK12)(NC_000913)、大肠杆菌O157：H7(Escherichia coliO157：H7)(NC_002695)、大肠杆菌O157：H7 EDL933(Escherichoa coliO157：H7 EDL933)(NC_002655)、具核梭杆菌具核亚种ATCC 25586(Fusobacterium nucleatum subsp.nucleatum ATCC 25586)(NC_003454)、嗜血流感杆菌(Haemophilus influenzae Rd)(NC_00907)、幽门螺旋杆菌26695(Helicobacter pylori 26695)(NC_000915)、幽门螺旋杆菌J99(Helicobacter pylori J99)(NC_00921)、乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcuslactis subsp.lactis)(NC_002662)、无害李斯特氏菌(Listeria innocua)(NC_003212)、单核细胞增多性李司特氏菌EGD-e(Listeria monocytogenesEGD-e)(NC_003210)、百脉根瘤菌(Mesorhizobium loti)(NC_002678)、麻风分支杆菌(Mycobacterium leprae)(NC_002677)、结核分支杆菌CDC1551(Mycobacterium tuberculosis CDC1551)(NC_002755)、结核分支杆菌H37Rv(Mycobacterium tuberculosisH37Rv)(NC_000962)、生殖器支原体(Mycoplasma genitalium)(NC_000908)、肺炎支原体(Mycoplasmapneumoniae)(NC_000912)、肺支原体(Mycoplasma pulmonis)(NC_002771)、脑膜炎奈瑟氏菌MC58(Neisseria meningitidis MC58)(NC_003112)、脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)(NC_003116)、某种念珠藻(NOtoc sp.)(NC_003272)、出血败血性巴斯德氏菌(Pasteurellamultocida)(NC_002663)、绿脓杆菌(Pseudomonas aerugiNOa)(NC_002516)、茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)(NC_003295 &NC_003296)、康氏立克次氏体(Rickettsia conorii)(NC_003103)、普氏立克次氏体(Rickettsia prowazekii)(NC_000963)、肠沙门氏菌亚种(Salmonellaenterica subsp.enterica serovar Typhi)(NC_003198)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)(NC_002305)、鼠伤寒沙门氏菌LT2(Salmonellatyphimurium LT2)(NC_003197)、苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobiummeliloti)(NC_003047)、金黄色酿脓葡萄球菌亚种(Staphylococcus aureussubsp.aureus MW2)(NC_003923)、金黄色酿脓葡萄球菌亚种(Staphylococcus aureu subsp.aureus Mu50)(NC_002758)、金黄色酿脓葡萄球菌亚种(Staphylococcus aureus subsp.aureus N315)(NC_002745)、肺炎链球菌R6(Streptococcus pneumoniaeR6)(NC_003098)、肺炎链球菌TIGR4(Streptococcus pneumoniaeTIGR4)(NC_003028)、酿脓链球菌Ml GAS(Streptococcus pyogenes Ml GAS)(NC_002737)、酿脓链球菌MGAS8232(Streptococcus pyogenes MGAS8232)(NC_003485)、天蓝色链霉菌A3(2)(Streptomyces coelicolor)A3(2)(NC_003888)、某种蓝细菌PCC 6803(Synechocystis sp.PCC 6803)(NC_000911)、腾冲嗜热菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)(NC_003869)、热海栖热袍菌(Thermotoga maritima)(NC_000853)、苍白密螺旋体(Treponema pallidum)(NC_000919)、尿素分解尿素原体(Ureaplasma urealyticum)(NC_002162)、霍乱孤菌(Vibrio cholerae)(NC_002505 & NC_002506)、茄科细菌性斑点病原菌(Xanthomonas axonopodisp pv.citri str.306)(NC_003919)、野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris pv.campestris str. ATCC 33913)(NC_003902)、苛养木杆菌9a5c(Xylella fastidiosa 9a5c)(NC_002488)和鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)(NC 003143)。

可从TIGR和/或NCBI中获得基因组信息的古细菌的实例包括，例如，嗜热古菌(Aeropyrum pernix)(NC_000854)、嗜高温酸根还原细菌(Archaeoglobus fulgidus)(NC_000917)、某种嗜盐菌(Halobacterium sp.NRC-1)(NC_002607)、加氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)(NC_000909)、Methannopyras kandleriAV19(NC_003551)、Methanoarcinaacetivorans str.C2A(NC_003552)、Methanoarcina mazei Goel(NC_003901)、热自养甲烷热杆菌(Methanothermobacter thermautotrophicus)(NC_000916)、嗜气菌(Pyrobaculum aerophilum)(NC_003364)、古细菌(Pyrococcus abyssi)(NC_000868)、Pyrococcus furiosus DSM 3638(NC_003413)、极端嗜热古菌(Pyrococcuts horikoshii)(NC_000961)、Sulflobus solfataricus(NC_002754)、Sulflobus tokodaii(NC_003106)、嗜酸热原体(Thermoplasma acidophilum)(NC 002578)和火山热原体(Thermoplasma volcanium)(NC_002689)。

可从TIGR和/或NCBI中获得基因组信息的真核生物的实例包括，例如，冈比亚按蚊(Anopheles Gambia)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)、果蝇(Drosophila melanogaster)、家兔脑胞内原虫(Encephalitozoon cuniculi)、Guillardia theta nucleomorph、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)。

可从TIGR和/或NCBI中获得超过900种病毒物种的基因组信息包括例如，关于丁型肝炎病毒、逆转录病毒、卫星病毒、dsDNA病毒、dsRNA病毒、ssDNA病毒、ssRNA负链病毒、ssRNA正链病毒、未分类的噬菌体和其它未分类的病毒的信息。

在某些实施方案中，本申请提供抑制正常细胞(例如，非癌和/或非病原细胞)过度增殖的方法。例如，正常细胞可以是毛发生长所需的细胞，这里描述的方法可处理过度的毛发生长；细胞的过度增殖可发生在正常的毛发生长中、在毛发病、毛过多症、多毛症或包括脱发性毛囊炎、网状红斑萎缩性毛囊炎、项部疤痕疙瘩性毛囊炎和假毛囊炎的毛囊炎中。在另一个实例中，正常细胞可以是涉及不期望的免疫应答的免疫细胞，例如自体免疫应答、移植排异等。在示例性的实施方案中，正常细胞可以是正常T细胞，并且T细胞过度的活性或增殖引发多种疾病或情况，包括：糖尿病、关节炎(包括风湿性关节炎、幼年型类风湿性关节炎、骨关节炎和牛皮癣关节炎)、多发性硬化、脑脊髓炎、重症肌无力、全身性红斑狼疮、自体免疫甲状腺炎、皮炎(包括过敏性皮炎和湿疹皮炎)、牛皮癣、斯耶格伦氏综合征、克罗恩氏病、口疮性溃疡、虹膜炎、结膜炎、角膜结膜炎、类型I糖尿病、肠炎疾病、溃疡性结肠炎、哮喘、过敏性哮喘、皮肤性红斑狼疮、硬皮病、阴道炎、直肠炎、药物性皮疹、逆性癫病、麻风结节性红斑、自体免疫葡萄膜炎、过敏性脑脊髓炎、急性坏死出血脑病、先天性两侧进行性听力丧失、再生障碍性贫血症、纯红细胞贫血症、先天性血小板减少症、多软骨炎、韦格纳氏肉芽肿病、慢性活动性肝炎、斯-约综合征、先天口炎性腹泻、扁平苔癣、格雷夫斯氏病、肉状瘤病、原发性胆硬化、后葡萄膜炎、肺间质纤维化、移植物抗宿主病、移植的案例(包括使用同种异基因的移植或异种的移植)如骨髓移植、肝移植或任何器官或组织的移植、敏感症如遗传性过敏症和T细胞肿瘤如白血病和/或淋巴瘤。

在此处方法的某些实施方案中，可共同(同时地)或在不同的时间(相继地)施用一种或多种R2的核酸抑制剂。例如，依照此处描述的方法可使用两种或多种dsRNA、siRNA或酶促核酸，或其组合。

在某些实施方案中，可单独使用本申请的目标抑制剂核酸。备选地，可将本抑制剂核酸与其它传统的抗癌、抗病原体或针对过度细胞增殖的治疗或预防的其它治疗途径组合施用。例如，可使用这样的方法用于癌症的预防、癌症复发和术后转移的预防，以及作为其它传统癌症治疗的辅药。本申请认为经由使用本核酸物质可增强传统癌症治疗(例如，化疗、放射性治疗、光疗、免疫疗法和手术)的效力。当使用包含R2抑制剂核酸和另一种治疗剂的组合治疗时，可单独地或结合地施用这样的治疗剂，在某些实施方案中，组合治疗可涉及R2抑制剂核酸和另一种治疗剂，其为配制在一起的或作为分开的剂型施用。

广泛大量的常规化合物已显示出具有抗肿瘤活性。这些化合物在化疗中已被作为药用物质以缩小实体瘤、防止转移和进一步的生长，或减少在白血病或骨髓恶性肿瘤中恶性细胞的数量。尽管化疗在治疗多种类型的恶性肿瘤中已有成效，但许多抗肿瘤化合物会诱导不良的副作用。已显示当两种或多种不同治疗组合时，治疗可协同进行并允许减少每种治疗的剂量，由此减少每种化合物在较高剂量时引起的有害副作用，在其它实例中，难以治愈的恶性肿瘤可应答两种或多种不同治疗的组合治疗。

可用于组合性治疗特别是抗肿瘤治疗的药物化合物，包括(仅用以说明)：氨鲁米特、安吖啶、阿纳托司唑、天冬酰胺酶、beg、比卡鲁胺、博来霉素、乙基酰胺、白消安、喜树碱、卡培他滨、顺羧酸铂、卡氯芥、苯丁酸氮芥、顺-二氯二氨络铂、2-氯脱氧腺苷、氯磷酸盐、秋水仙碱、环磷酰胺、去乙酰环丙氯地孕酮、阿糖胞苷、达卡巴嗪、更生霉素、道诺霉素、双烯雌酚、二乙基已烯雌酚、多西他奇、阿霉素、表柔比星、雌二醇、雌莫司汀、依托泊苷、依西美坦、非格司亭、氟达拉滨、氟氢可的松、氟尿嘧啶、氟羚甲基睾丸素、氟他胺、吉西他滨、染料木黄酮、戈舍瑞林、羟基脲、去甲氧正定霉素、异环磷酰胺、伊马替尼、干扰素、依立替康、伊立替康、来曲唑、甲酰四氢叶酸、亮丙瑞林、左咪唑、罗莫司丁、二氯甲基二乙胺、甲孕酮、甲地孕酮、苯丙氨酸氮芥、巯基嘌呤、巯乙磺酸钠、甲氨蝶呤、丝裂霉素、邻氯苯对氯苯二氯乙烷、米托蒽醌、安得乐、噻氨酯哒唑、奥曲肽、奥沙利铂、紫杉醇、氨羟二磷酸二钠、喷司他丁、光辉霉素、卟菲尔钠、甲基苄肼、雷替曲塞、利妥昔单抗、链佐星、苏拉明、三苯氧胺、替莫唑胺、替尼泊苷、睾丸激素、硫鸟嘌呤、噻替派、二氯环戊二烯钛、托泊替康、曲妥单抗、维甲酸、长春碱、长春新碱、长春地辛和长春瑞滨。

这些化疗抗肿瘤的化合物依据它们的作用机制可被分类为，例如以下的组：抗代谢物/抗癌物质，如嘧啶类似物(5-氟尿嘧啶、氟脱氧尿苷、卡培他滨、吉西他汀(gemcitabine)和阿糖胞苷)和嘌呤类似物，叶酸拮抗剂和相关的抑制剂(巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、喷司他丁和2-氯脱氧腺苷(cladribinee))；包括天然产物的抗增殖/抗有丝分裂剂，如常春藤生物碱(长春碱、长春新碱和长春瑞滨)；微管干扰剂，如紫杉烷(紫杉醇、紫杉萜)、长春花新碱、长春碱、噻氨酯哒唑、埃坡西龙和诺维本、epidipodophyllotoxins(依托泊苷、替尼泊苷)；DNA破坏剂(放射菌素、安吖啶、蒽环类抗生素、博来霉素、白消安、喜树碱、顺羧酸铂、苯丁酸氮芥、顺氯氨铂、环磷酰胺、环磷酰胺、更生霉素、道诺霉素、阿霉素、表柔比星、hexamethylmelamineoxaliplatin、磷酰胺、苯丙氨酸氮芥、merchlorehtamine、丝裂霉素、米托蒽醌、亚硝基脲、光神霉素、甲苄肼、紫杉酚、泰索帝、替尼泊苷、三亚乙基硫代磷酰胺和依托泊苷(VP 16))；抗生素，如更生霉素(放射菌素D)、道诺霉素、阿霉素(阿霉素)、去甲氧正定霉素、氨茴环霉素、米托蒽醌、博来霉素、光神霉素(光神霉素)和丝裂霉素；酶(左旋天冬酰胺，其全身性代谢天冬酰胺酸并除去不具有合成自己的天冬酰胺酸能力的细胞)；抗血小板物质；抗增殖/抗有丝分裂的烷化剂如氮芥(二氯甲基二乙胺、环磷酰胺和类似物、苯丙氨酸氮芥、苯丁酸氮芥)、乙烯亚胺和甲基三聚氰胺(六甲基三聚氰胺和噻替派)、烷基磺酸酯白消安、亚硝基脲(亚硝基脲氮芥(BCNU)和类似物、链脲霉素)，trazenes-dacarbazinine(DTIC)；抗增殖/抗有丝分裂的抗代谢物如叶酸类似物(甲氨蝶呤)；铂协同复合体(顺铂、卡铂)、甲基苄肼、羟基脲、米托坦、氨鲁米特；激素、激素类似物(雌激素、三苯氧胺、戈舍瑞林、比卡鲁胺、安得乐)和芳香酶抑制剂(来曲唑、阿纳托司唑)；抗凝剂(肝素、合成的肝素盐和其它凝血酶抑制剂)；纤溶剂(如组织纤溶酶原激活物、链激酶和尿激酶)、阿斯匹林、双嘧达莫、噻氯匹啶、氯吡格雷、阿昔单抗；抗迁移剂；抗分泌剂(breveldin)；免疫抑制剂(环孢菌素、他克莫司(FK-506)、西罗莫司(雷怕霉素)、咪唑硫嘌呤、麦考酚酸吗乙酯)；抗血管生成化合物(TNP-470，染料木黄酮)和生长因子抑制剂(血管内皮生长因子(VEGF)抑制剂、成纤维细胞生长因子(FGF)抑制剂)；血管紧张素受体阻断剂；氧化氮供体；反义寡核苷酸；抗体(曲妥单抗)；细胞周期抑制剂和分化诱导剂(维甲酸)；mTOR抑制剂、拓扑异构酶抑制剂(阿霉素(阿霉素)、安吖啶、喜树碱、道诺霉素、更生霉素、依尼泊苷、表柔比星、依托泊苷、去甲氧正定霉素和米托蒽醌、托泊替康、依立替康)、皮质类固醇(可的松、地塞米松、氢化可的松、甲基泼尼松、泼尼松和prenisolone)；生长因子信号转导激酶抑制剂；线粒体功能异常诱导剂和胱天蛋白酶激活剂；以及染色质破坏剂。

在某些实施方案中，可将这里所述R2抑制剂核酸与其它治疗剂包括例如抗炎剂、免疫抑制剂，和/或抗感染剂(例如抗生素、抗病毒，和/或抗真菌化合物等)组合施用。

示例性的抗炎药物包括，例如，类固醇(例如，氢化可的松、皮质醛酮、泼尼松、甲基泼尼松、去炎松、地塞米松、脱氧可体松和氟皮质醇)和非类固醇抗炎药物(例如，异丁苯丙酸、甲氧萘丙酸和吡罗昔康)。示例性的免疫抑制药物包括例如，泼尼松、硫唑嘌呤(Imuran)、环孢菌素(Sandimmune，NeoraD、雷帕霉素、抗胸腺细胞血球素、daclizumab、OKT3和ALG、麦考酚酸莫酯(Cellcept)和他克莫司(Prograf，FK506)。示例性的抗生素包括例如，磺胺类药物(例如磺胺)、叶酸类似物(例如甲氧苄氨嘧啶)、β内酰胺(例如青霉素、头孢霉菌素)、氨基糖甙类(例如链霉素、卡那霉素、新霉素、庆大霉素)、四环素(例如氯四环素、氧四环素和强力霉素)、大环内酯物(例如红霉素、阿齐红霉素和甲基红霉素)、林可酰胺类抗生素(例如氯林可霉素)、链阳性菌素类(例如奎奴普丁和达福普汀)、氟喹诺酮类(例如环丙沙星、左氧氟沙星和莫西沙星)、多肽(例如多粘菌素)、利福平、莫匹罗星、环丝氨酸、氨基环醇(例如奇放线菌素)、糖肽(例如万古霉素)，和唑烷酮类(例如利奈唑胺)。示例性的抗病毒剂包括例如，阿糖腺苷、阿昔洛韦、更昔洛韦、缬更昔洛韦、核苷类似物反转录酶抑制剂(例如ZAT、ddl、ddC、D4T、3TC)、非核苷反转录酶抑制剂(例如奈韦拉平、地拉夫定)、蛋白酶抑制剂(例如沙奎那韦、利托那韦、印地那韦、那非那韦)、三氮唑核苷、三环癸胺、金刚乙胺、神经氨酸苷酶抑制剂、达菲、普来可那立和干扰素。示例性的抗真菌药物包括例如，抗真菌多烯(例如两性霉素和制霉菌素)、抗真菌咪唑(酮康唑和咪康唑)、抗真菌三唑(例如氟康唑和依他康唑)、氟胞嘧啶、灰黄霉素和特比萘芬。

依据组合治疗的性质，当正在和/或在其后施用其它治疗时，可持续施用本申请的核酸治疗剂。核酸治疗剂的施用可以单剂或多剂进行。在某些实例中，在常规治疗至少几天前开始施用核酸治疗剂，而在其它情况中，施用开始于即将施用或正在施用常规治疗时。

施用方法和组合物

在某些实施方案中，申请提供包含这里描述的一种或多种R2抑制剂的组合物。在某些实施方案中，组合物是药物，适合于患者体内的治疗用途，在某些实施方案中，组合物是化妆品，适合于动物或人的化妆用途。在备选的实施方案中，组合物是非药用和非化妆用的。通常，化妆品和药物之间的差别是后者要求管理许可(例如，通过食品和药品管理部门)以用于人或动物。

传递R2抑制剂特别是核酸的方法可基于本领域所知的那些方法(参见例如Akhtar等，1992，Trends Cell Bio.，2，139；和Delivery Strategies forAntisense Oligonucleotide Therapeutics，ed.Akhtar，1995；Sullivan等，PCT公开号WO 94/02595)。这些方案可被使用、修改或改良用于近乎所有核酸的传递。通过本领域技术人员所知的多种方法可向细胞施用核酸，该方法包括但不限于包装于脂质体、通过离子电渗疗法或通过掺入其它载体如水凝胶、环糊精、可生物降解的纳米胶囊以及生物黏着微球。备选地，通过直接注射或灌注泵局部传递核酸/载体组合。其它传递路线包括，但不限于，口腔(片剂或丸剂形式)和/或鞘内传递(Gold，1997，Neuroscience，76，1153-1158)。其它方法包括多种运输和载体系统，例如经由缀合物和可生物降解的多聚体的使用，在某些实施方案中，在施用前以最终剂量形式组合并制备目标R2抑制剂和载体。在备选的实施方案中，分开制备目标R2抑制剂和载体使在施用时将其组合。例如，目标R2抑制剂和载体可被贮存在传递试剂盒或包装的分开的区室，并在向期望的位点或通过可期望的途径施用时，混合目标R2抑制剂和载体用于传递。分开的区室可以是试剂盒中的单独小瓶、药物传递笔中单独的墨盒(参见美国专利号5,542,760)、注射器中单独的套管或区室等。

在某些实施方案中，提供目标R2抑制剂作为超分子复合体，该复合体包括作为传递载体的聚合的微粒或纳米颗粒。这里使用的术语“微粒”或“纳米颗粒”包括微球或纳米球(均一球体)、微囊体或纳米胶囊(具有聚合体的核心和外层)，以及不规则形状的颗粒。

本申请考虑使用的多聚体优选可在一定时间内生物降解，在该时间段或其后相对不久可期望R2抑制剂被释放，所述时间通常在一年范围内，更典型的几个月，甚至典型为几天至几周。生物降解可指微粒的分裂(即，形成微粒/纳米颗粒的聚合体的解离)，和/或聚合物自身的分解。这可能作为载体的pH改变的结果而发生，在载体中的颗粒被施用于释放位点的pH(如在环缩二氨酸的情况下)，水解作用(如在聚(羟基酸)的情况下)，通过微粒外的离子如钙的扩散(如在经由聚合物如藻酸盐的离子键形成的微粒或纳米颗粒的情况下)，以及通过酶促作用(如在许多多糖和蛋白质的情况下)。在某些情况下线性释放可能是最有用的，尽管在其它情况脉冲释放或“大批量释放”可能提供更有效的结果。

代表性的合成原料是：环缩二氨酸、聚(羟基酸)如聚(乳酸)、聚(羟基乙酸)及其共聚物、聚酐、聚酯如聚原酸酯、聚酰胺、聚碳酸酯、聚亚烷基如聚乙烯、聚丙烯、聚(乙二醇)、聚(环氧乙烷)、聚(乙烯对苯二酸酯)、聚乙烯化合物如聚乙烯醇、聚乙烯醚、聚乙烯酯、聚乙烯卤化物、聚乙烯吡咯烷酮、多乙酸乙烯酯和聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚硅醚、丙烯酸和甲基丙烯酸的多聚体包括聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸丁酯)、聚(甲基丙烯酸异丁酯)、聚(甲基丙烯酸己酯)、聚(异癸基异丁烯酸酯)、聚(甲基丙烯酸十二烷酯)、聚(甲基丙烯酸苯酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸异丙酯)、聚(丙烯酸异丁酯)、聚(丙烯酸十八烷酯)、聚亚安酯和其共聚物，纤维素包括烷基纤维素、羟烷基纤维素、纤维素醚、纤维素酯、硝基纤维素、甲基纤维素、乙基纤雏素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丁基甲基纤维素、醋酸纤维素、丙酸纤维素、乙酸丁酸纤维素、乙酸酞酸纤维素、羧乙基纤维素、三醋酸纤维素以及硫酸钠盐纤维素、聚(丁酸)、聚(戊酸)和聚(丙交酯-己内酯)。

天然多聚体包括藻酸盐和其它多聚糖，其中多聚糖包括葡聚糖和纤维素、胶原、清蛋白和其它亲水性蛋白质、玉米醇溶蛋白和其它谷醇溶蛋白以及疏水性蛋白质，共聚物及其混合物。如此处使用的，其化学衍生物指化学基团的取代、增加，例如烷基化、烯化、羟基化、氧化和由本领域的技术人员进行的其它常规修饰。

生物黏着多聚体包括由H.S.Sawhney，C.P.Pathak和J.A.Hubell inMacromolecules，1993，26，581-587描述的生物可蚀性水凝胶、聚透明质酸、酪蛋白、白明胶、明胶蛋白、聚酐、聚丙烯酸、藻酸盐、壳聚糖和聚丙烯酸酯。

对药物递送策略的全面综述，参见Ho等，1999，Curr.Opin.MoI.Ther.，1，336-343和Jain，Drug Delivery Systems：Technologies and CommercialOpportunities，Decision Resources，1998以及Groothuis等，1997，J.NeuroVirol，3，387-400。核酸传递和施用的更详细的描述提供于Sullivan等，supra，Draper等，PCT WO 93/23569，Beigelmaii等，PCT公开号WO 99/05094，和Klimuk等，PCT公开号WO 99/04819。

这里使用的短语“肠胃外的施用”和“肠胃外地施用”意为不同于肠和局部的施用的施用模式，通常通过注射并且包括(非限制)，静脉内、肌肉内、动脉内、椎管内、囊内、眼框内、心脏内、皮内、腹腔内、气管内、皮下、角质层下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、胸骨内的注射和输液，以及肝内动脉施用(包括肝内注射和肝内输液)。

这里使用的短语“全身性的施用”、“全身性地施用”、“外周的施用”和“外周性地施用”意为施用化合物、药物或其它物质不同于直接进入中枢神经系统，而使其进入患者系统并从而经历代谢作用和其它相似过程，例如皮下施用。

在某些实施方案中，用药物可接受载体制备本申请的目标核酸(例如RNAi构建体和酶促核酸)。这样的治疗剂可单独地施用或作为药物制剂(组合物)的成分施用。可制备本制剂以任何便利的途径施用作人或兽的医药用途。湿润剂、乳化剂和润滑剂，如十二烷基硫酸钠和硬脂酸镁，以及着色剂、脱模剂、涂层剂、甜味剂、调味料和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂也可存在于组合物中。

目标核酸的制剂包括用于全身、非全身、口、鼻、局部、肠胃外、直肠，和/或阴道内的施用的那些制剂。制剂可以单位剂量形式便利地提供并且可通过制药领域众所周知的任何方法制备。可与载体材料组合以产生单剂形式的活性成分的量将依据正在治疗的宿主、施用的特定模式而改变。可与载体材料组合以产生单剂形式的活性成分的量通常是产生治疗效果的化合物的量。

在某些实施方案中，制备这些制剂或组合物的方法包括组合另外类型的治疗剂或抗感染剂和载体，以及任选地一种或多种附加成分。通常，可以流体载体或精细可分的固体载体或两者制备制剂，然后如果需要，定形成产品。

用于口腔施用的制剂可以是胶囊、扁囊剂、药丸、药片、锭剂(使用调味的基质，通常是蔗糖和阿拉伯树胶或黄芪胶)、散剂、颗粒的形式，或在水溶性或非水溶性流体中作为溶液或悬浮液，或作为水包油或油包水流体乳剂，或作为甘香洒剂或糖浆，或作为片剂(使用惰性基质，如白明胶和甘油，或蔗糖和阿拉伯树胶)和/或作为漱口水等，每种都包含预定量的目标核酸治疗剂作为活性成分。

在以固体剂量形式(胶囊、药片、药丸、糖衣丸、散剂、颗粒等)用于口腔施用时，可将本申请的一种或多种核酸治疗剂与一种或多种药物可接受的载体混合，例如柠檬酸钠或磷酸二钙，和/或任何下列各项：(1)填充剂或增量剂，如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和/或硅酸；(2)粘合剂，例如，羧甲基纤维素、藻酸盐、白明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、和/或阿拉伯树胶；(3)保湿剂，例如甘油；(4)崩解剂，例如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、褐藻酸、某些硅酸盐、和碳酸钠；(5)溶液阻滞剂，例如石蜡；(6)吸收加速剂，例如季铵化合物；(7)湿润剂，例如，鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(8)吸收剂，例如，高岭土和斑脱土粘土；(9)润滑剂，如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠、及其混合物；以及(10)着色剂。在胶囊、药片和药丸的实例中，药物组合物也可包含缓冲剂。在软填和硬填的白明胶胶囊中也可用相似类型的固体组合物作为填充剂，使用这样的赋形剂如乳糖或牛奶糖，以及高分子量聚乙二醇等。

用于口腔施用的流体剂量形式包括药物可接受的乳剂、微乳剂、溶液、悬浮液、糖浆和甘香洒剂。除活性成分外，流体剂量形式可包含本领域普遍使用的惰性稀释剂如水或其它溶剂、助溶剂和乳化剂如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁二醇、油类(特别是，棉籽、落花生、玉米、胚芽、橄榄、海狸香和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和山梨聚糖的脂肪酸酯，及其混合物。除隋性稀释剂外，口腔的组合物也可包括佐剂如湿润剂、乳化和悬浮制剂、甜味剂、调味剂、着色剂、芳香剂和防腐剂。

除活性化合物外，悬浮液可包含悬浮剂如乙氧基异十八醇、聚氧乙烯山梨糖醇、山梨聚糖酯、微晶纤维素、氢氧化铝、斑脱土、琼脂和黄芪胶，及其混合物。

本申请的方法和组合物可被局部施用到皮肤或黏膜如宫颈和阴道上的那些黏膜。这为直接传递到定位于皮肤或黏膜的过度细胞增殖提供最好时机，具有诱导副作用的最小可能性。局部制剂可另外包括一种或多种已知有效作为皮肤或角质层穿透增强剂的广泛多样的物质。这些的实例是2-吡咯烷酮、N-甲基-2-吡咯烷酮、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、丙二醇、甲醇或异丙醇、二甲基亚砜和氮酮。可另外包括附加剂以制备化妆用可接受的制剂。这些的实例是油脂、蜡、油、染料、香料、防腐剂、稳定剂和表面活性剂。也可包括如本领域所知的那些角质层分离剂。实例是水杨酸和硫磺。

用于局部或跨真皮施用的剂量形式包括散剂、喷雾、油膏、膏剂、乳剂、洗剂、凝胶、溶液、贴剂和吸入剂。在无菌条件下，目标核酸可与药物可接受载体，以及任何防腐剂、缓冲液或可能需要的推进剂混合。除目标核酸分子外，油膏、膏剂、乳剂和凝胶可包含赋形剂如动物和植物脂肪、油、蜡、石蜡、淀粉、黄芪胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅氧烷、斑脱土、硅酸、滑石和氧化锌，或其混合物。

除目标核酸治疗剂外，散剂和喷雾可包含赋形剂如乳糖、滑石、硅酸、氢氧化铝、硅酸钙和聚酰胺散剂，或这些物质的混合物。喷雾可另外包含惯用推进物，如氯氟烃和挥发性未取代烃如丁烷和丙烷。

也提供适于吸入的制剂，并且这样的制剂可被用于肺部传递，其可被定位于肺部系统或全身系统。用于肺部传递的药物装置的实例包括剂量计量吸入器(MDI)和干型散剂吸入器(DPI)。通过适于传递目标R2抑制剂和/或活性制剂而吸入的示例性的传递系统被描述于例如美国专利号5,756,353、5,858,784以及PCT申请WO 98/31346、WO 98/10796、WO 00/27359、WO 01/54664、WO 02/060412。可用于传递R2抑制剂和/或活性物质的其它气雾制剂被描述于美国专利号6,294,153、6,344,194、6,071,497，美国专利申请公开号2004/0063654，以及PCT申请WO 02/066078、WO 02/053 190、WO 01/60420、WO 00/66206。

加压的计量剂量吸入器(pMDI)是全世界最普遍使用的吸入器。当阀打开(常通过推进筒向下挤压)时产生气雾剂，允许流体推进物喷射出筒。通常，药物或治疗剂被包含在悬浮于流体推进物的小颗粒(通常直径几微米)中，但在某些制剂中药物或治疗剂可被溶解于推进物中。气雾剂离开装置的同时推进物快速蒸发，产生供吸入的小型药物或治疗颗粒。在这种pMDI中通常用的推进物包括但不限于氢氟代链烷(HFA)。也可以利用pMDI将表面活性剂用于例如制备药物或治疗剂。利用pMDI也可使用其它溶剂或赋形剂，如乙醇、抗坏血酸、焦亚硫酸钠、甘油、氯丁醇和界面活性剂(cetylpyridium chloride)。这种pMDI可另外包括附加装置例如间隔的装置、贮藏室和其它修饰成分。

第三种类型的吸入器是干型散剂吸入器(DPI)。在DPI中，气雾剂通常是装置中内含的散剂直至其被吸入。以散剂形式将治疗剂或药物制备成小型散剂颗粒(一般直径几微米)。在许多DPI中，将药物或治疗剂与更大的糖颗粒混合(例如，乳糖一水合物)，其直径一般为50-100微米。乳糖/药物结块上增加的空气动力除了使小型个别散剂剂量更易填充之外，还改善吸入量以上的药物颗粒的夹带。一旦吸入，散剂在湍流和/或机械装置例如颗粒团聚体碰撞的筛子或旋转表面的帮助下破碎成它的组成颗粒，释放小型的、单独的药物散剂颗粒到空气中从而被吸入肺中。糖颗粒通常会留在装置和/或在口-咽喉中。

本申请一方面提供包含R2抑制剂的气雾剂组合物。气雾剂组合物可以是包含成雾状散开的R2抑制剂的组合物或在适合于成雾状散开的制剂中包含R2抑制剂的组合物。R2抑制剂可与附加的活性剂组合制备，并且该组合制剂适于成雾状散开。备选地，R2抑制剂和附加的活性剂可被单独制备，以使它们在成雾状散开发生后或被施用到受试者后被组合。

适于肠胃外施用的药物组合物可包含一种或多种核酸物质，所述核酸物质与一种或多种药物可接受的无菌等渗水溶性或非水溶性溶液、分散液、悬浮液或乳状液，或无菌散剂(在使用前可被复原成无菌可注射的溶液或分散液)组合，其可包含抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂、溶质(其使制剂与预期接受者的血液或悬浮剂或增厚剂等渗)。可在本申请的药物组合物中使用的合适的水溶性和非水溶性载体的实例包括水、乙醇、多羟基化合物(如丙三醇、丙二醇、聚乙二醇等)，及其合适的混合物，植物油如橄榄油、可注射的有机酯如油酸乙酯。例如，通过涂层原料如卵磷脂的使用，通过在分散液的实例中维持必需的颗粒大小，以及通过表面活性剂的使用可维持适当的流动性。

这些组合物也可包含佐剂如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。通过包含多种抗细菌和抗真菌物质，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚山梨酸等，可防止微生物作用。也可期望将包括等渗剂如糖、氯化钠等纳入组合物。另外，由包含延缓吸收的物质如单硬脂酸铝和白明胶可引起可注射药物形式的延长的吸收。

通过以可生物降解的多聚体如聚丙交酯-聚乙交酯形成一种或多种核酸物质的微胶囊基质来制备可注射的储库型制剂。依据药物对聚合体的比率和使用的特定聚合体的性质，可控制药物释放的比率。其它可生物降解的聚合体的实例包括聚(原酸酯)和聚(酐)。通过将药物诱导入与身体组织兼容的脂质体或微乳剂中也可制备可注射的储库型制剂。

用于阴道内或直肠施用的制剂可以栓剂存在，其可通过混合本申请的一种或多种化合物与一种或多种合适的无刺激的赋形剂或载体(包括例如可可油、聚乙二醇、栓剂蜡或水杨酸盐)来制备，其在室温下是固体，但在体温下是流体，并且因此将融化于直肠或阴道腔并释放活性化合物。

在某些实施方案中，以药物可接受物质制备本申请的核酸，该物质使核酸在最适于其期望活性的生理位置中有效分布。这种药物可接受物质的非限制性实例包括：PEG、磷脂、硫代磷酸酯、可促进药物进入各种组织的P-糖蛋白抑制剂(如Pluronic P85)、可生物降解的多聚体如聚(DL-丙交酯-乙交酯共聚物)微球用于移植后持续的释放传递(Emerich，DF等，1999，Cell Transplant，8，47-58)，以及如那些由聚氰基丙烯酸正丁酯制成的负载的纳米颗粒，其可跨越血脑屏障传递药物并改变神经的摄取机制(ProgNeuropsychopharmacol Biol Psychiatry，23，941-949，1999)。

在其它实施方案中，在细胞内可从真核启动子表达本申请的某些核酸(例如，Izant和Weintraub，1985，Science，229，345；McGarry和Lindquist，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 83，399；Scanlon等，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88,10591-5；Kashani-Sabet等，1992，Antisense Res.Dev.，2，3-15；Dropulic等，1992，J.Virol.，66，1432-41；Weerasinghe等，1991，J.Virol，65，5531-4；Ojwang等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89,10802-6；Chen等，1992，Nucleic Acids Res.，20，4581-9；Sarver等，1990Science，247，1222-1225；Thompson等，1995，Nucleic Acids Res.，23，2259；Good等，1997，Gene Therapy，4，45)。本领域的技术人员了解在真核细胞内从适当的DNA/RNA载体上可表达任何核酸。这种核酸的活性可经由酶促核酸作用通过从初级转录物的释放被放大(Draper等，PCT WO 93/23569，Sullivan等，PCT WO 94/02595；Ohlcawa等，1992，核酸Symp.Ser.，27，15-6；Taira等，1991，核酸Res.，19，5125-30；Ventura等，1993，核酸Res.，21，3249-55；Chowrira等，1994，J.Biol.Chem.，269，25856；因此所有这些参考此处以其整体引用作为参考)。对CNS特异的基因治疗方法被描述于Blesch等，2000，Drug News Perspect，13，269-280；Peterson等，2000，Cent.Nerv.Syst.Dis.，485-508；Peel和Klein，2000，J.Neurosci.Methods，98，95-104；Hagihara等，2000，Gene Ther.，7，759-763；以及Herrlinger等，2000，Methods MoI.Med.，35，287-312。AAV介导对神经系统的细胞的核酸传递被另外描述于Kaplitt等，美国专利号6,180,613。

在本申请另一方面，优选从插入到DNA或RNA载体的转录单位中表达本申请的RNA分子(参见例如Couture等，1996，TIG.，12，510)。重组载体优选地是DNA质粒或病毒载体。构建核酶表达病毒载体可基于但不限于腺相关病毒、逆转录酶病毒、腺病毒或阿尔法病毒。优选地，如上所述地传递能够表达核酸的重组载体，并且在靶细胞中持续。备选地，病毒载体可被用于提供瞬时的核酸表达。可按照需要重复施用这些载体。一旦被表达，核酸结合到靶标mRNA。核酸表达载体的传递可以是全身性的，如通过静脉内的或肌肉内的施用，通过向从患者中外植的靶细胞施用接着重导入患者中，或通过允许导入到期望的靶细胞的任何其它手段(综述参见Couture等，1996，TIG.，12，510)。

一方面，本申请考虑到包含编码至少一种本申请核酸的核酸序列的表达载体。该核酸序列以允许本申请核酸表达的方式被有效地连接。例如，本申请公开的表达载体包括：a)转录起始区(例如真核pol I、II或III起始区)；b)转录终止区(例如真核pol I、II或III终止区)；c)编码至少一种本申请的核酸催化剂的核酸序列；并且其中所述序列以允许所述核酸表达和/或传递的方式被有效地连接到所述起始区和所述终止区。载体可任选地包括蛋白质的开放阅读框(ORF)，该开放阅读框可操作地连接在编码本申请的核酸催化剂的序列的5’端或3’端上。

在某些包括双链核酸的实施方案中，两条链可分开表达然后在细胞中杂交。这样的分开表达可通过分开的表达构建体或通过单个表达构建体。备选地，两条链可一起表达，例如，发夹RNA的两条链可一起表达。

不考虑选择的施用路线，本申请的R2抑制剂(其可以适当的水合形式使用)和/或本申请的药物组合物，如下面描述的或通过其它常规方法被制备成药物可接受的剂量形式。

在本发明的药物组合物中可改变活性成分的实际剂量水平以获得一定量的活性成分，其对于特定患者、组合物和施用模式可有效获得期望的治疗应答，而对患者无毒害。

选择的剂量水平将取决于多种因素，包括使用的本申请的特定R2抑制剂、或其酯、盐或氨化物的活性、施用的途径、施用的时间、正在使用的特定化合物的排出速率、治疗的持续时间、与使用的特定R2抑制剂组合使用的其它药物、化合物和/或材料、正在治疗的患者的年龄、性别、体重、生理状况、一般健康状况和前期病史，以及医药领域众所周知的类似因素。

医师或兽医可容易地确定和对所需有效量的药物组合物开处方。例如，医师或兽医可以低于为达到期望药物效果而要求的水平开出在药物组合物中使用的本申请R2抑制剂的剂量，并逐渐增加剂量直至达到期望的效果。

通常，本申请R2抑制剂的合适的每日剂量应该是有效产生治疗效果的最低剂量的化合物量。这种有效剂量通常取决于上述因素。通常，用于患者的静脉内、脑室内和皮下的剂量应在每天约0.0001至约100mg/kg体重量范围内。

如果需要，可以在全天以合适间隔施用活性化合物的有效每日剂量为分别施用2、3、4、5、6或更多的亚剂量，任选地，以单位剂量形式。

本申请的药物制剂也包括兽用的组合物，例如适用于兽用的R2抑制剂的药物制备，例如用于牲畜或家畜如狗的治疗。接受该治疗的患者是任何需要的动物，通常包括灵长类特别是人，和其它非人的哺乳动物如马、牛、猪和绵羊；以及家禽和宠物。

也可制备R2抑制剂用于非药物用途，例如，作为消毒剂用以从任何病原体污染的物体上移除病原体，或用作化妆品以移除不期望的毛发生长。可像这里描述的某些药物组合物一样相似地制备化妆品组合物(例如，洗液、油膏、薄膜、贴剂等)。

R2抑制剂如本申请的RNAi构建体也可被混合、装入胶囊、缀合或另外的连接于其它分子、分子结构或化合物的混合物，例如，脂质体、多聚体、靶标分子受体、帮助摄取、分配和/或吸收的口、直肠、局部或其它制剂。在制剂中可提供目标RNAi构建体，也可包含渗透增强剂、载体化合物和/或转染剂。

代表性的美国专利教导可适用于传递RNAi构建体，特别是siRNA分子的这类摄入、分配和/或吸收辅助制剂的制备，包括，但不限于U.S.5,108,921、5,354,844、5,416,016、5,459,127、5,521,291、51543,158、5,547,932、5,583,020、5,591,721、4,426,330、4,534,899、5,013,556、5,108,921、5,213,804、5,227,170、5,264,221、5,356,633、5,395,619、5,416,016、5,417,978、5,462,854、5,469,854、5,512,295、5,527,528、5,534,259、5,543,152、5,556,948、5,580,575和5,595,756。

本申请的RNAi构建体也包含任何药物可接受的盐、酯或这类酯的盐、或任何其它化合物，其在对动物包括人的施用上可提供(直接地或间接地)生物学活性代谢物或其残留物。相应地，例如，本公开也涉及RNAi构建体和药物可接受的siRNA的盐、药物可接受的这类siRNA构建体的盐，以及其它生物等效物。

用金属或胺如碱性和碱土金属或有机胺来形成药物可接受的碱加成盐。作为阳离子使用的金属的实例是钠、钾、镁、钙等。合适的胺的实例N，NI-二苄乙二胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、二环己基胺、1，2-乙二胺、N-甲基葡糖胺，以及普鲁卡因(参见例如Berge等，″PharmaceuticalSalts，″J of Pharma ScL，1977，66，1-19)。以传统方式以游离酸的形式与足够量的期望的碱接触以生成盐来制备所述的酸性化合物的碱加成盐。可以通过将盐形式与酸接触再生游离酸形式并且以传统方式分解出游离酸。在某些自然特性如在极性溶剂中的溶解性上，游离酸形式稍微不同于它们各自的盐形式，但是在其它方面，对于本发明的目的，该盐等效于它们各自的游离酸。这里使用的“药物加成盐”包括本发明组合物的成分之一的酸式药物可接受盐。这些盐包括胺的有机或无机酸式盐。优选的酸式盐是氢氯化物、醋酸盐、水杨酸盐、硝酸盐和磷酸盐。其它合适的药物可接受盐是本领域技术人员众所周知的并且包括多种无机或有机酸的碱性盐。

对于siRNA，药物可接受盐的实例包括，但不限于，(a)以阳离子如钠、钾、铵、镁、钙聚胺如精胺和亚精胺等形成的盐；(b)以无机酸例如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸等形成的酸加成盐；(c)以有机酸例如醋酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、顺丁烯二酸、反丁烯二酸、葡萄糖酸、柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸、苯甲酸、丹宁酸、棕榈酸、褐藻酸、多聚谷氨酸、萘磺酸、甲基磺酸、对-甲苯磺酸、萘磺酸、多聚半乳糖醛酸等形成的盐；以及(d)从基本阴离子如氯、溴和碘中形成的盐。

示例性的组合物包括与传递系统如脂质体系统混合的RNAi构建体，并且任选地包括可接受的赋形剂。在某些实施方案中，制备组合物用作局部施用于例如疱疹病毒感染。

在某些实施方案中，使用多聚载体传递目标核酸。多聚载体可形成载有一种或多种目标核酸的微颗粒，在某些实施方案中，特别是在期望全身性的施用中，纳米颗粒可具有直径约10nm、20nm、30nm、40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、120nm、150nm、200nm或更大的尺寸大小。在某些实施方案中，纳米颗粒可具有直径约10-120nm、10-100nm、50-120nm、50-100nm、10-70nm、50-70nm或约50nm的尺寸大小。在某些实施方案中，纳米颗粒包含环糊精。在特定的实施方案中，纳米颗粒包含环糊精共聚物，例如，描述于美国专利6,509,323和美国专利申请公开号2002/0151523中的线性环糊精共聚物以及描述于美国专利申请公开号2004/0077595和2004/0109888中的基于环糊精的多聚体。在特定的实施方案中，环糊精是被修饰的，例如，具有功能化的末端基团，如这里描述的im-CDP，例如，在图27和42中所示。在某些实施方案中，使用描述于美国专利申请公开号2003/0008818，2003/0017972和2004/0063654中的那些内含物复合体来传递核酸。在某些实施方案中，传递系统或载体可另外包括一种或多种修饰剂或修饰成分，例如，可改变微颗粒表面化学性质的修饰剂。修饰剂可以是阴离子成分。如下面所述的修饰剂可以是靶向某些组织或细胞型的配体。修饰剂可以是聚乙二醇(PEG)分子例如PEG5000分子。

在某些实施方案中，R2抑制剂或其组合物可与一种或多种配体有效的结合以固定到特定细胞表面蛋白或粘合到靶细胞的基质上，由此促进复合物向靶细胞的汇集，并且在某些情况，增强细胞对RNAi构建体的吸收。仅用以说明，适用于将本发明的超分子复合体和脂质体靶向特定细胞型的配体的实例在下表中列出。

表9用于靶向传递到多种细胞型的合适配体

配体	受体	细胞类型
配体	受体	细胞类型	叶酸	叶酸受体	上皮癌，骨髓干细胞
水溶性维生素	维生素受体	多种细胞	叶酸	叶酸受体	上皮癌，骨髓干细胞
水溶性维生素	维生素受体	多种细胞	磷酸吡哆醛	CD4	CD4+淋巴细胞
脱脂载脂蛋白	LDL	肝细胞，血管内皮细胞	磷酸吡哆醛	CD4	CD4+淋巴细胞
脱脂载脂蛋白	LDL	肝细胞，血管内皮细胞	胰岛素	胰岛素受体
转铁蛋白	转铁蛋白受体	内皮细胞	胰岛素	胰岛素受体
转铁蛋白	转铁蛋白受体	内皮细胞	半乳糖	脱唾液酸糖蛋白受体	肝细胞
唾液酰-Lewis_X	E，P选择蛋白	活化的内皮细胞	半乳糖	脱唾液酸糖蛋白受体	肝细胞
唾液酰-Lewis_X	E，P选择蛋白	活化的内皮细胞	Mac-1	L选择蛋白	嗜中性粒细胞，白细胞
VEGF	Flk-1，2	肿瘤上皮细胞	Mac-1	L选择蛋白	嗜中性粒细胞，白细胞
VEGF	Flk-1，2	肿瘤上皮细胞	碱性FGF	FGF受体	肿瘤上皮细胞
EGF	EGF受体	上皮细胞	碱性FGF	FGF受体	肿瘤上皮细胞
EGF	EGF受体	上皮细胞	VCAM-1	a₄b₁整合蛋白	血管内皮细胞
ICAM-1	a_Lb₂整合蛋白	血管内皮细胞	VCAM-1	a₄b₁整合蛋白	血管内皮细胞
ICAM-1	a_Lb₂整合蛋白	血管内皮细胞	PECAM-1/CD31	a_vb₃整合蛋白	血管内皮细胞，活化的血小板
	a_vb₁整合蛋白a_vb₅整合蛋白	动脉粥样斑块中的内皮细胞和平滑肌细胞	PECAM-1/CD31	a_vb₃整合蛋白	血管内皮细胞，活化的血小板
	a_vb₁整合蛋白a_vb₅整合蛋白	动脉粥样斑块中的内皮细胞和平滑肌细胞	RGD	a_vb₃整合蛋白	肿瘤内皮细胞，血管平滑肌细胞
HIV GP 120/41GP120	CD4	CD4+淋巴细胞	RGD	a_vb₃整合蛋白	肿瘤内皮细胞，血管平滑肌细胞

在某些实施方案中，R2抑制剂或其药物组合物可与一种或多种包含半乳糖的靶向配体结合。包含半乳糖的示例性配体包括，例如，乳糖和类似分子。肝脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)是在肝细胞表面上表达的C型凝集素。ASGPR结合带有末端β-D-半乳糖(Gal)或N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)的糖蛋白。对ASGPR的配体的亲和力取决于多天线残基的类型(Gal对比GalNAc)、数量(四天线>三天线>>双天线>>单天线)和排列。ASGPR的各种多肽亚基(人是四聚物)可结合单一的末端Gal或GalNAc。

其它实施方案

在某些实施方案中，本申请提供适用于肝特异性传递治疗剂如这里所述抑制剂核酸的传递载体。肝特异性传递载体包括(1)主要成分，其包含图27中显示的咪唑修饰的含有环化糊精的多聚体，和(2)修饰成分，其包含图32中显示的金刚烷-PEG-半乳糖分子。当与一种或多种治疗剂混合在一起时，修饰成分和主要成分形成内含物复合体或Polyplex，其将治疗剂封装在多聚体中以形成微粒组合物(见图31)。在某些实施方案中，配制传递载体以提供具有平均直径约30-100nm、约40-70nm、约50-70nm、约50-60nm、或约50nm的微粒组合物。

在多种实施方案中，可使用肝特异性传递载体向肝脏传递任何类型的治疗剂，例如，用于治疗肝特异性疾病或紊乱，或用于治疗涉及或影响肝脏的疾病或紊乱。

本发明的肝治疗剂可以是小分子、肽或肽类似物，例如，拟肽和核酸。本发明的核酸肝治疗剂可以是反义RNA、RNAi构建体(例如siRNA)或核糖核酸酶。核酸性肝治疗剂也可以是基因治疗构建体，例如传递要在肝细胞中表达的基因的表达构建体。

本发明的肝治疗剂对肝脏疾病或情况例如人肝脏疾病或情况是有效的。由细胞(例如肝脏中的肝细胞或病原体)的不必要的增殖可导致肝脏疾病或情况。本发明的方法和组合物可对任何肝脏疾病或情况有用或有效，包括但不限于肝癌(例如肝细胞癌或其它癌症的肝转移，例如胰腺癌)、肝炎A、肝炎B、肝炎C、肝炎D、肝炎E、肝炎G、自体免疫肝炎、肝硬化、阿拉日耶综合征、酒精肝疾病、α-1-抗胰蛋白酶缺乏、巴-希综合征、胆道闭锁、Byler病、卡罗利病、克-纳综合征、迪-约综合征、脂肪肝、半乳糖血症、吉尔伯综合征、糖原累积病I、血管瘤、血色素沉着症、肝脏疾病中的瘙瘁(Itching in Liver disease)、肝移植、迟发性皮肤卟啉症、原发性胆硬化、原卟啉症、红细胞肝性、罗特尔综合征、硬化胆管炎和威尔逊病。因此，本发明的药物组合物可对于一种或多种肝脏疾病或情况(如这里所述的那些)有效。

在某些实施方案中，本发明的肝治疗剂靶向肝细胞特异性基因，例如通过调节(抑制或促进)肝细胞特异性基因的表达。肝细胞特异性基因通常包括在肝细胞中具有比在其它细胞(例如库普弗细胞)或组织中更高表达水平的任何基因。

在某些实施方案中，肝治疗剂靶向在患有肝脏疾病或情况的患者的肝细胞中失调的基因。基因可以是肝细胞特异性基因。备选地，基因不是肝细胞特异性基因，例如与其它细胞和组织相比，在肝细胞中具有相似或更低表达水平的基因，并且与正常肝脏中的肝细胞相比，在患有肝脏疾病或情况的患者的肝细胞中该基因的表达和/或活性被改变。例如，核糖核苷酸还原酶亚基II(R2)在肝细胞癌中是失调的，即R2在经进行通过细胞周期的肝细胞癌细胞中表达，但在通常休眠的正常肝细胞中不表达。靶向R2的肝治疗剂可以是特异性地降低或抑制R2表达的核酸物质，并且这种核酸物质可以是反义分子、RNAi构建体(例如siRNA构建体)或核糖核酸酶。

肝治疗剂也可靶向肝特异性分子或基因组区，如肝癌特异性转录调节元件(TRE)，优选CRG-L2调节序列，描述于美国专利申请公开号20050124068。肝治疗剂也可靶向与一种或多种肝脏疾病或情况相关的核酸(基因或基因组区)，例如描述于美国专利申请公开号20040241657中的那些核酸。

肝治疗剂可抑制或促进肝脏生长，例如，通过抑制或促进肝细胞增殖。这类物质可用于肝脏保护，其实例描述于美国专利申请公开号20040170613。

本发明另一方面提供治疗患有肝脏疾病或情况的患者的方法。该方法通常包括向患者全身性地施用治疗有效量的本发明的药物组合物。经由多种传递路线可实现全身性施用，例如静脉注射或腹膜内注射、跨皮肤传递、肺部传递或经口摄取。

本发明的方法和组合物针对于任何肝脏疾病或情况可能是有用或有效的，所述肝脏疾病或情况包括但不限于，肝癌(例如肝细胞癌或其它癌症的肝转移，例如胰腺癌)、肝炎A、肝炎B、肝炎C、肝炎D、肝炎E、肝炎G、自体免疫肝炎、肝硬化、阿拉日耶综合征、酒精肝疾病、α-1-抗胰蛋白酶缺乏、巴-希综合征、胆道闭锁、Byler疾病、卡罗利病、克-纳综合征、迪-约综合征、脂肪肝、半乳糖血症、吉尔伯综合征、糖原累积病I、血管瘤、血色素沉着症、肝脏疾病中的瘙痒、肝移植、迟发性皮肤卟啉症、原发性胆硬化、原卟啉症、红细胞肝性、罗特尔综合征、硬化胆管炎和成尔逊病。

本发明的方法和组合物可用于传递肝治疗剂，包括目前可获得的或在发展中(例如在临床试验中)的药物。本发明考虑到多种肝治疗剂，包括但不限于，小分子物质、肽或肽类似物(包括拟肽)、核酸物质(例如包括siRNA构建体、反义分子、酶促核酸、或其它基因治疗构建体的RNAi构建体)或疫苗。

阿拉日耶综合征，或AGS，是儿童期慢性肝脏疾病的主要形式之一，具有严重的发病率和10至20％的死亡率。已报道由Jagged-1基因(JAG1)中的突变导致AGS。参见例如Alagille等，J.Pediat.86：63-71，1975；Anad等，J.Med.Genet.27：729-737，1990；Kamath等，J.Med.Genet.40：891-895，2003。因此，肝治疗剂可以是AGS治疗剂(或针对AGS的有效药物)，并且AGS治疗剂可包括靶向突变的JAG1基因的基因治疗构建体。

滥用酒精是遍及全世界发病率和死亡率的主要原因。醇影响身体的许多器官系统，但可能最显著影响的是中枢神经系统和肝脏。几乎所有摄取的醇都在肝脏中被代谢并且过量的醇摄入可导致急性和慢性的肝脏疾病。在美国由滥用酒精引起的肝硬化是十大致死原因之一。滥用酒精通常导致三种病理学上截然不同的肝脏疾病。在临床实践中，任一或所有这三种情况可于同一时间，在同一患者中共同发生。这三种情况是：(1)脂肪肝(脂肪变性)：滥用酒精可导致肝细胞(肝脏中的主要细胞类型)内脂肪的积聚。相似的情况也可见于并非酒精滥用者的肥胖人群。如果患者停止饮酒则脂肪肝是可逆的，然而，脂肪肝可导致脂肪肝炎。脂肪肝炎是伴随炎症的脂肪肝并且这种情况可导致肝瘢痕和肝硬化。(2)肝炎：醇可导致急性和慢性的肝炎。患有酒精性肝炎的患者通常是近期异常大量消耗酒精的长期酒徒。其它表现也是可能的。酒精性肝炎可从轻度肝炎(仅在化验测试中具有疾病的指示)到严重肝功能障碍并伴有并发症如黄疸(胆红素滞留引起的黄色肤色)、肝脑病(肝脏衰竭引起的神经学上的功能障碍)、腹水(腹腔中流体积蓄)、出血性食管曲张(食道中静脉曲张)、非正常血液凝块和昏迷。从组织学上，酒精性肝炎特征性表现为肝细胞的气囊扩张变性、嗜中性粒细胞和间或马洛里小体(细胞中间体丝状蛋白的异常聚焦)炎症。(3)在解剖学上硬化的特征在于在伴有纤维化的肝脏中分布广泛的结节。纤维化和结节形成引起正常肝脏结构的变形，干扰血液流经肝脏。硬化也可导致肝脏不能执行其生化功能。在美国，滥用酒精是肝硬化的主要原因。在解剖学上，酒精性肝硬化几乎总是微小的结节(即再生的肝脏结节是小型的)。

由任何慢性肝病也可引起硬化，如慢性肝炎B、C和D、慢性自体免疫肝炎、遗传性代谢疾病(例如血色素沉着症、威尔逊病)、慢性胆管疾病、慢性充血性心脏衰竭、寄生虫感染(例如血吸虫病)、非酒精性脂肪肝炎(可由脂肪肝引起的肝炎)，或长期曝露于毒素或药物。

硬化治疗通常由潜在病因决定。醇摄取的终止将阻止酒精性硬化的进程并且因此在慢性酒精滥用者中的及早诊断是重要的。同样地，肝毒性药物的中断或环境毒素的移除将阻止发展。代谢疾病的治疗如血色素沉着症中铁过载或威尔逊病中铜过载的治疗也是有效的治疗。慢性病毒性肝炎B和C可应答干扰素的治疗并且自体免疫肝炎可用泼尼松和硫唑嘌呤(巯唑嘌呤)改善。药物如熊去氧胆酸(Actigall)可减缓原发性胆硬化和可能致硬化的胆管炎的进程。肝脏移植对于末期硬化的治疗是高度有效的。

胆汁郁积，或进行性家族性肝内胆汁郁积1或PFIC1和良性的周期性肝内胆汁郁积(BRIC)是由ATP8B1基因突变引起的。进行性家族性肝内胆汁郁积的二级形式(PFIC2)是由肝特异性ATP-表达盒(ABC)转运蛋白(BSEP)的突变引起的。PFIC3是由3-β-羟基-δ-5-C27-类固醇氧化还原酶(HSD3B7)的突变引起的。参见例如Ghent等，J.Pediat.93：127-132，1978；Trauner等，New Eng.J.Med.339：1217-1227，1998；Whitington等，J.Pediat.Gastroent.Nutr.18：134-141，1994。

肝癌可以是任一下列非限制性实例：肝脏的转移瘤、胆管癌或肝细胞癌。

转移瘤是从器官或起源扩散的肿瘤。由于它的血液供给，肝脏是某些癌症扩散的常见位点。扩散到肝脏的某些最常见的癌症起源于结肠、胰腺、肺脏和乳腺。淋巴瘤和白血病也可侵入肝脏。胆管癌是起源于肝脏中的胆管细胞的癌症。胆管癌也可发生在肝脏外的胆管中。

肝细胞癌是起源于肝细胞即肝中的主要细胞型的癌症。全世界而言，肝细胞癌是癌症死亡的两大主要原因之一。它在亚洲和非洲的部分地区特别流行。约80％患肝细胞癌的人群有肝硬化。肝炎B病毒和肝炎C病毒的慢性感染也增加了发展肝细胞癌的危险。黄曲霉毒素，其由污染坚果(最普通的花生)、谷物和豆类的霉菌产生，也涉及作为引起肝细胞癌的主要危险因素。尽管几乎不存在于美国，在世界其它地区黄曲霉毒素是普遍的并且经常污染食物。

迪-约综合征是由微管(肝细胞的顶部)中多特异性有机阴离子转运蛋白(CMOAT)的突变引起的，其也被定义多药物抗性相关蛋白2(MRP2)并且在胆的有机阴离子转运中起重要作用。Wada等，Hum.Molec.Genet.7：203-207，1998。

遗传性的高胆红素血症(Wolkoff等，in The Metabolic Basis ofInherited Disease.New York：McGraw-Hill(pub.)(5th ed.)1983.Pp.1385-1420)包括(1)主要产生非结合型高胆红素血症的那些：吉尔伯或Arias综合征、克-纳综合征类型I和克-纳综合征类型II；和(2)主要产生结合型高胆红素血症的那些：迪-约综合征、罗特尔综合征和肝内的胆汁郁积的几种形式。详细的研究显示吉尔伯综合征患者具有降低的胆红素葡糖醛酸基转移酶的活性。Bosma等，New Eng.J.Med.333：1171-1175，1995。但是已显示吉尔伯综合征是由UDP-葡糖醛酸基转移酶基因(UGT1 A1)中的突变引起。在相同基因中的突变引起克-纳综合征类型I和克-纳综合征类型II。因此，靶向UGT1A1的肝治疗剂可以有效的针对这些遗传性的高胆红素血症。

脂肪肝病症也被称为脂肪变性，并且具有肝脏炎症的脂肪肝或被称为脂肪肝炎。脂肪变性和脂肪肝炎可由醇和其它药物引起并且有时也可发生在糖尿病患者中。不由醇引起的脂肪肝炎有时被指作非酒精性脂肪肝炎或“NASH”。

典型的半乳糖血症是由半乳糖-1-磷酸盐尿苷酰转移酶基因(GALT)中的突变引起的。

糖原累积病是由葡萄糖-6-磷酸酶中的缺陷引起的。该紊乱涉及肝脏和肾脏，并且低血糖症是主要的问题。该紊乱也涉及肝细胞腺瘤。Bianchi，EurJ Pediatr.1993；152 Suppll：S63-70。

有两种类型的肝脏血管瘤：海绵状血管瘤和血管内皮瘤。血管内皮瘤通常仅见于儿童。海绵状血管瘤是最普遍的成人良性肝脏肿瘤，尽管它发生于所有年龄的个体并且遍及全世界。

典型的血色素沉着症(HFE)，常染色体隐性疾病，多数常由染色体6p21.3上名为HFE基因的突变引起。它也被发现由编码血幼素(HJV)的基因突变引起，该基因对应1q21。幼年型血色素沉着症或血色素沉着症类型2(HFE2)也是常染色体隐性的。一种形式，称为HFE2A，是由HJV基因突变引起。第二种形式，称为HFE2B，是由编码hepcidin抗菌肽(HAMP)的基因突变引起，该基因对应19q13。血色素沉着症类型3(HFE3)，常染色体隐性疾病，是由编码转铁蛋白受体(TFR2)的基因突变引起，该基因对应7q22。血色素沉着症类型4(HFE4)，常染色体显性疾病，是由SLC40A1基因突变引起，该基因编码铁转运蛋白并且对应2q32。血色素沉着症的临床特征包括肝硬化、糖尿病、皮肤的色素沉着过多和心脏衰竭。原发性肝细胞癌(HCC)、并发性硬化在受影响的纯和体中造成约三分之一的死亡率。因为如果确诊，血色素沉着症是相对容易治疗的疾病，这是可预防的癌症形式。

术语肝炎A(HA)或A型病毒肝炎已取代所有以前的名称：传染性肝炎、流行性肝炎、流行性黄疸、卡他性黄疸、传染性黄疸、Botkins疾病和MS-1肝炎。通过在疾病的急性期或早期康复期收集的血清中检查到IgM类抗HAV来诊断肝炎A。以微小核糖核酸病毒科家族的肠道病毒种群归类肝炎A病毒(HAV)。HAV具有由小(直径27nm)蛋白质衣壳包裹的单个RNA分子并具有CsCl中1.33g/ml的浮力密度。

肝炎B通常是由微小核糖核酸病毒科家族中通常为双链的DNA病毒即肝炎B病毒(HBV)引起的。HBV引起人体中的肝炎并且该家族中的相关病毒在鸭子、晏鼠和美洲旱獭中引发肝炎。HBV基因组有四个基因：pol、env、pre-core和X，分别编码病毒DNA聚合酶、被膜蛋白、pre-core蛋白(其被加工成病毒衣壳)和蛋白X。蛋白X的功能不清楚但是可能涉及宿主细胞基因的激活和癌症的形成。

α-干扰素是在美国认可的用于治疗慢性肝炎B的第一种药物。干扰素治疗被推荐用于患有“复制性疾病”的个体(HBeAg阳性)。用干扰素α治疗16周后，约40％的这类个体将丧失血清HBeAg。HBeAg的丧失与提高的预后相关。由丢失HBeAg评估的少数治疗的患者(少于10％)甚至可被治愈。针对慢性肝炎B的其它治疗选择包括核苷类似物。在1998年12月，美国食品和药物管理部门(FDA)认可的拉米夫定(lamivudine)，也已知作为3TC并且也对HIV有效，用于慢性肝炎B的治疗(HBeAg阳性的患者)。针对慢性肝炎B以100mg/天口服拉米夫定。在比较研究中，拉米夫定在诱导血清HBeAg的丧失上与干扰素α是等效的。也显示它可改善治疗一年的患者中肝脏活组织切片检查的结果。在2002年9月，FDA认可的阿德福韦酯(adevofir dipivoxil)，另一种核苷类似物也对HIV有效，用于肝炎B的治疗。用于慢性肝炎B的剂量是10mg/天。目前，在临床试验中正在研究其它核苷类似物。干扰素α和核苷类似物的组合，两种核苷类似物一起(例如拉米夫定和阿德福韦)也都在研究中。为了组合治疗，其它核苷类似物如泛昔洛韦(famciclovir)、洛达普令(lobucavir)和阿德福韦也已被研究用于组合治疗慢性肝炎B。Yao和Gishi，Current GastroenterologyReports 1999，1：20-26。

全世界大约170,000,000人口以及在美国4,000,000人口受到肝炎C病毒(HCV)的感染。病毒起初通过血液和血液产品传播。受到HCV急性感染的约85％的个体变成慢性感染。因此，HCV是慢性(持续时间长于六个月)肝炎的主要原因。一旦慢性感染，无治疗时病毒几乎绝对不会被清除。在罕见实例中，HCV感染引起临床上急性的疾病甚至肝脏衰竭，然而，大多数急性感染的实例是临床上不可检测的。HCV在黄病毒科家族中是正链的、单链RNA病毒。基因组大约10,000个核苷酸并且编码约3,000个氨基酸的单个聚蛋白。该聚蛋白由宿主细胞和病毒蛋白酶加工成病毒复制所需的三个主要的结构蛋白和若干非结构蛋白。具有少量不同基因组序列的几种不同基因型的HCV已被确定与应答干扰素α治疗中的差异相关。目前对肝炎C的全部治疗方案是基于干扰素α的多种制剂的使用，其通过肌肉内或皮下的注射施用。干扰素α-2a(Roferon-A、Hoffmann-La Roche)、干扰素α-2b(Intron-A、Schering-Plough)和干扰素alfacon-1(Infergen、Intermune)都是在美国被许可作为单一物质用于患有慢性肝炎C的成人的治疗。Peginterferonα，有时称为聚乙二醇化的干扰素，也已被用于慢性肝炎C的治疗。在肝炎C的患者中已被研究的两种Peginterferonα制剂：Peginterferon α-2b(Peg-Intron、Schering-Plough)和Peginterferon α-2a(Pegasys、Hoffmann-La Roche)。单独使用Peginterferon α-2a，大约30％至40％的患者获得持续应答治疗24至48周。Zeuzem等，New EnglandJournal of Medicine.2000；343：1666-1172；Heathcote等.New EnglandJournal of Medicine.2000；343：673-1680。在慢性肝炎C的治疗中，向干扰素α中添加病毒唑优于单独的干扰素α。病毒唑是具有针对广谱病毒的活性的合成核苷。FDA也认可干扰素α-2b附加病毒唑用于治疗使用以前的干扰素α治疗后复发的患有慢性肝炎C的个体。另外，在以前没有用干扰素治疗的慢性肝炎C的患者治疗中，干扰素α-2b附加病毒唑的组合在获得持续的应答上比单独干扰素α-2b更有效，并且这一现象已于1998年12月获得FDA认可。FDA也已认可Peginterferonα附加病毒唑的组合用于慢性肝炎C的治疗。

Peginterferonα与命名为VX-497(Vertex Pharmaceutical)的化合物的临床试验也在进行中。VX-497具有一些与病毒唑相似的特征并抑制胞内酶如所知的可起到一定作用的肌苷一磷酸脱氢酶。新一代治疗肝炎C的药物或治疗剂包括为抑制肝炎C病毒功能而特别设计的那些产品。这种药物的靶标是肝炎C病毒RNA基因组。核糖核酸酶(Hepatazyme，Pharmaceutical)被设计成在病毒生存所必需的区域中切割肝炎C病毒RNA基因组。在试管中已确定它在切割肝炎C病毒RNA中的功效并且该药品目前正处于早期临床试验。ISIS-14803(Isis Pharmaceutical)是互补到肝炎C病毒RNA的保守序列的反义抑制剂。该分子结合到病毒RNA并抑制复制所需的蛋白质的表达。ISIS-14803目前正处于早期临床试验。已知的小分子如VP-50406(ViroPharma)也被证明在实验室中抑制肝炎C病毒RNA并且正处于早期临床开发中。蛋白质合成所必需的肝炎C病毒RNA独特结构的抑制剂，已知的如核糖体内部进入位点或IRES，也在实验室研究中。

肝炎D病毒(也称为δ病毒)是小型环状RNA病毒。肝炎D病毒是复制缺陷型的并因此在缺乏另外的病毒时不能繁殖。在人中，肝炎D病毒感染仅发生在肝炎B感染存在下。干扰素α被用于治疗患有慢性肝炎B和肝炎D感染的患者。

肝炎E病毒(HEV)具有大约8kb的单链多聚腺苷的RNA基因组。基于它的物化特性推测是类杯状病毒。由HEV引起的疾病称为肝炎E，或肠内传播的非A非B肝炎(ET-NANBH)。其它名称包括粪-口非A非B肝炎和类A非A非B肝炎。

肝炎G病毒(HGV)是HCV相关的黄病毒。

目前有几种用于肝脏疾病中瘙瘁的治疗药物。这些药物包括消胆胺、抗生素利福平、麻醉拮抗药纳洛酮和naltrexone，以及5-羟色胺类型3受体拮抗药。将药物加巴喷丁用于治疗肝脏疾病引起的瘙瘁处于临床试验中(IRB Protocol#9618)。

迟发性皮肤卟啉症是常染色体的显性疾病，其特征在于光敏性皮炎并伴有尿中大量尿卟啉的排出。缩小的肝脏和红细胞尿卟啉原脱羧酶活性已被报道于家族性迟发性皮肤卟啉症(Kushner等，1976 Clin.Invest.58：1089-1097；Lehr和Doss，1981，Dtsch.Med.Wschr.106：241-245)和偶发的迟发性皮肤卟啉症的实例中(Elder等，1978，New Eng.J.Med.299：274-278；Felsher等，1978，New Eng.J.Med.299：1095-1098)。

原发性胆硬化(PBC)是具有肝内小胆管的炎性破坏特征的疾病。PBC最终导致肝脏硬化。PBC的起因未知，但由于自体抗体的存在，其通常被认为是自体免疫疾病。其它病因，如传染性物质，尚未被完全排除在外。PBC患者被推荐服用维生素和钙以帮助预防该疾病的常见并发症骨质疏松症(骨质的流失)。秋水仙碱在抑制肝纤维化中起重要作用并且提高化验值而非病征或症状。已在PBC患者中研究多种免疫抑制剂。皮质类固醇或许并不有效并且可能恶化PBC患者中普遍存在的骨质疏松症。已在几个研究中检验硫唑嘌呤(Imuran)、甲氨蝶呤和环孢菌素A。熊去氧胆酸(Actigall或Urso)，一种胆酸，已显示改善PBC患者中的化验和临床参数并且一项研究结果提示其可减缓疾病的发展进程。在PBC导致的末期肝脏疾病患者中，原位肝移植是高度有效的。

红细胞肝性原卟啉症或EPP是具有不完全外显率的常染色体显性遗传。使用单倍型分离分析，Gouya等(2002)确认内含子的单核苷酸多态性(SNP)，IVS3-48T-C(177000.0015)，其调节正常位点上游63 bp的组成型异常受体剪接位点的使用。通过无义介导的衰减机制(NMD)降解异常剪接的mRNA，导致mRNA稳定态水平的降低和EPP表型表达所需的附加FECH酶缺乏。

原发性硬化型胆管炎(PSC)是慢性肝脏疾病，其特征在于发炎、破坏和导致肝脏硬化的肝内和肝外胆管的纤维化。PSC常并发反复的细菌性胆管炎(细菌引起的胆管感染)发作。PSC患者也有增加的患胆管癌(胆道癌)的风险。在PBC导致的晚期肝病患者的治疗中，原位肝移植是高度有效的。

威尔逊病是常染色体隐性疾病，其特征在于肝细胞内铜的显著增加以及并发的肝脏和神经异常。在威尔逊病中，基底神经节和肝脏经历改变，分别表现为神经病学表现和硬化病征。铜代谢中的紊乱以某种方式涉及该机制。Beam，In：Stanbury等：The Metabolic Basis of Inherited Disease.New York：McGraw-Hill(pub.)(第三版)1972.Pp.1033-1050。

肝移植可被推荐用于其它治疗方法无法治疗的某些肝脏疾病或情况。这类肝脏疾病或情况的实例包括：肝炎B、肝炎C、尿素循环缺陷、家族性血胆脂醇过多、醇诱导的硬化、糖原累积病、自体免疫肝炎、原发性尿草酸盐过多类型I、隐原性硬化、克-纳综合征类型I、先天性肝纤维症、Neimann-Pick疾病、原发性胆硬化、家族性淀粉样变、胆道闭锁、肝细胞癌、原发性硬化性胆管炎、肝胚细胞瘤、阿拉日耶综合征、血管内皮瘤、家族性胆汁郁积、非类癌神经内分泌癌(Non-Carciniod neuro-endocrine)、药物诱导的肝脏衰竭、肝肿瘤、急性/爆发性肝脏衰竭、巴-希综合征、α-1-抗胰岛素缺乏、威尔逊病、血色素沉着症、酪氨酸血症、原卟啉症或囊性纤维症。

实施例

现在对本公开进行大体描述，通过参考以下实施例使本公开更易于理解，其仅被包括用于解释本公开的某些方面和实施方案，而非限制本公开。

实施例1：siRNA设计和测试

RNA干扰，或RNAi，是最初描述于植物(其中已知作为转录后基因沉默，或PTGS)、秀丽隐杆线虫和果蝇(综述于Bernstein等，2001；Carmell等，2002)中的基因沉默机制。在通用模式中，由双链RNA(dsRNA)“触发物”激活RNAi途径，然后该触发物由细胞酶Dicer加工成被称为小干扰RNA(siRNA)的短的、21-23个核苷的dsRNA。siRNA被掺入到RNA诱导的沉默复合体(RISC)中，其中siRNA反义链作为靶向同源mRNA的引导链用于在siRNA/靶标双螺旋中约从siRNA引导链的5’末端10个碱基的内核分离。在哺乳动物细胞中，长于30个核苷酸的dsRNA触发非特异性的干扰素途径而不是RNAi。然而，Tuschl及其同行证明(Elbashir等，2001a；Harborth等，2001；Caplen等，2002)外源性导入哺乳动物细胞的更短的siRNA避开Dicer作用步骤并直接激活同源mRNA降解，没有启动干扰素应答。随后，许多实验室证明在体内表达针对人病毒和细胞靶标的siRNA和相关的短发夹RNA(shRNA)的可行性。RNAi方面的进展迅速并且已在治疗应用上获得相当大的进步(zamore，2001；Kitabwalla和Ruprecht，2002；Martinez等，2002；Couzin，2003；Scherr等，2003；Wilson等，2003；Harmon和Rossi，2004)。

合成siRNA是外源、短期应用可选择的方法。目前，未修饰的siRNA介导的RNAi效果通常在转染后2-3天达到最高点。合成siRNA最常见的设计模拟由Dicer切割触发物dsRNA产生的外源性siRNA(Elbashir等，2001a)，其中有义和反义链长21-23个核苷酸。除了两个3’末端的两个核苷的突出端之外，双螺旋的退火部分完全互补。对于合成的siRNA，3’二核苷酸突出端可来源于靶标序列，如在它们天然的副本中。尽管构建的从21-23-mer的siRNA足够用于多数用途，可使用多达29个核苷酸的寡聚体而不启动干扰素应答。我们已观测到在细胞中通过Dicer的作用从更长的双链RNA产生的siRNA可以达到比外源性提供的21mer的siRNA高100倍的效能(Kim等，2005)。Siolas等(2005)同事手稿显示相似的结论，尽管这些研究人员使用合成发夹作为Dicer底物。这里提议的研究将利用这些重要的发现物以产生有效的siRNA用于动物研究中。接下来将讨论能够准确预测从Dicer底物双螺旋RNA中产生的siRNA的新的设计规则。

siRNA反义链和靶标间的错配趋于不同程度的降低活性，其取决于它们的数目和定位。尽管操纵siRNA/靶标错配和RNAi活性之间关系的规则尚未被完全解决，可进行一些很可能应用于siRNA和简单shRNA的归纳。内切核苷酸的切割位点附近的突变经常但不总是降低RNAi效果。同样，在反义链前半部分(5’末端)的突变是非常有害的(Randall和Rice，2001；Holen等，2002；Amarzguioui等，2003)。因为内切核苷酸的切割是从反义siRNA链的5’末端开始“测量的”，很可能在激活的RISC复合体中引导链5’末端的突变使反义/mRNA靶标双螺旋不稳定，抑制切割。总之，这些结果指示，当设计RNAi构建体以靶向特异性同工型时，可建议选择在靶标同工型中的靶标位点，以使在其相应siRNA和非靶标同工型间的错配落入双螺旋的5’末端之中。如果这不可能，如当靶标难以接近切割时(综述于Scherer和Rossi，2003b)，测试交叉反应是重要的。

尽管构建的从21-23-mer的siRNA足够用于多数用途，可使用多达29个核苷酸的低聚体而不启动干扰素应答。我们已观测到在细胞中通过Dicer的作用从更长的双链RNA产生的siRNA可以达到比外源性提供的21mer的siRNA高100倍的效能(Kim等，2005)。Siolas等(2005)同事手稿具有相似的结论，尽管这些研究人员使用合成发夹作为Dicer底物。计划研究利用这些重要的发现以产生用于动物研究的有效的siRNA。将讨论新的设计规则以提供从Dicer底物双螺旋RNA中产生的siRNA的准确预测。

果蝇胚胎裂解物的实验说明在合成的siRNA链上需要游离的5’-羟基或5’-磷酸基(Elbashir等，2001b；Nykanen等，2001)。于HeLa提取物(Schwarz等，2002)或完整细胞(Chiu和Rana，2002)中观测到相似的结果。任一siRNA链的不对称的5’氨基修饰表明反义链的5’氨基修饰彻底破坏RNAi而仅有义链的相同修饰没有抑制RNAi效果。同样，转染到细胞中并随后重新分离的未磷酸化的合成siRNA除非用磷酸酶预处理不能在体外被激酶作用(Chiu和Rana，2002)。总之，这些结果表明在体内强烈需要反义链上的5’磷酸基。这符合该核苷酸修饰干扰反义链在激活的RISC复合体中作为内切核苷酸切割的引导链能力的假设。另一方面，在多数情况下，在任一链上阻碍3’末端的修饰对双螺旋siRNA影响很小(Amarzguiouiet al.，2003)。

对siRNA双螺旋骨架修饰的研究已显示每条siRNA链的分布在5’和3’端之间的多达六个2′-O-甲基，或3’端的两个′-O-烯丙基修饰对RNAi没有不利的影响(Amarzguioui等，2003)。超出该点的修饰或5’端的烯丙基修饰的增加的数目减弱RNAi(Amarzguioui等，2003；Holen等，2003)。相反地多于两个硫代硫酸酯的修饰对细胞有害，而不能促进效能的显著增加(Amarzguioui等，2003)。siRNA骨架修饰的优势可能仅在将siRNA直接注射到动物中时被实现，因为骨架修饰延长这些分子的半衰期(Layzer等，2004；Soutschek等，2004)。这里，我们利用环糊精纳米颗粒载体提供的保护不受血清核酸酶作用，因此我们的RNA并非骨架修饰的从而它们在体内可以有效地被Dicer切割。

序列的定义

RNAi既可通过使用阳离子脂质体或其它载体传递到细胞的合成的siRNA，也可经由基因表达21mer的有义和反义链或被加工成siRNA的短发夹RNA而触发(综述于Scherer和Rossi，2003a)。siRNA介导的成功敲除的重要决定因素是可到达的靶标位点的组合以及对siRNA合适链的选择。我们和其他人已开发了用以识别靶标位点和siRNA双螺旋的适当组合的算法(Heale等，2005)。我们的算法考虑到靶标位点二级结构预测和siRNA的双螺旋末端稳定性。后者在选择反义链进入RISC中是重要的(Khvorova等，2003；Schwarz等，2003；Tomari等，2004)。也已发现可被RNAse III家族成员Dicer切割的足够长的dsRNA可以达到比21mer的siRNA高100倍的效能(Kim等，2005；Siolas等，2005)。因此，我们鉴定靶标位点和siRNA的优选的方法是用我们的算法挑选出序列基序(Heale等，2005)，鉴定可能的靶标序列和21mer的siRNA并且测试几种21mersiRNA的相对功效。

确定最佳靶标位点的新型计算算法被用于识别在人R2(hRRM2)基因内的三种可能的靶标位点(参见图4)(Heale等，Nucl.Acids Res.33：e30(2005))。合成定向于这三种靶标序列的siRNA并在如下所述的细胞提取物预筛测定中检测。在细胞提取物结合测定中定向于这三种靶标位点的siRNA的结果在图5中显示。

为预筛21mer，我们已观测到细胞提取物结合测定对细胞内功效具有高度预见性(Kim，Amarzguoi和Rossi，准备的手稿)。简言之，将合成的21mer在5’端标记³²p并且于室温下在HEK 293细胞质提取物中孵育。siRNA可被结合进包含RISC成分argonaute 2(Ago2)的复合体中。结合效力与细胞内效能有力相关(图6A-6C)。一旦我们鉴定出最有效的21mer，该序列被整合到27个碱基的双螺旋中，该双螺旋是Dicer的底物(图6A-6C)。我们已建立了Dicer作用的形式以使只有选择的21mer从27mer中产生(参见如下)。因而，对于使用选择的27mer体的唯一限制在于传递。针对体内Dicer作用我们优选的底物具有以下普遍特征：

5’NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNdN3’

3’NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN N N5’

利用体外Dicer作用和Dicer作用产物的质谱分析，我们确定Dicer识别两个碱基的3’突出端，并从有义链5’端切割21个碱基，并且从两个碱基的突出端切割21个碱基，形成仅一个21mer。通过在有义链3’端包括两个脱氧核糖核苷酸(dN)，Dicer不从该双螺旋的右手侧进入，从而确保只产生目的21mer。图6A-6C也提供提取物结合测定的代表性结果，其中将一系列的单个碱基差异的21mer与提取物一同孵育。siRNA的结合亲和力与靶标的敲除恰好相关。我们已对超过20种的不同siRNA重复该测定，且该相关性保持不变。

我们的算法贯穿使用人和小鼠R2序列(Heale等，2005)。通过观察在反义链5’端扩展的配对，对预测的最好的五个siRNA和靶标分析与其它鼠的序列可能的互补性。在提取物结合测定中测试与其它靶标不具有扩展的5’同源性的序列，并且选择使用最好的结合物。将该21mer序列以及来源于靶标mRNA的延伸的序列掺入上面显示的27/29mer形式中。在细胞培养物中于5nM至5pM的浓度范围滴定测定dsRNA。将具有最低IC₅₀值的dsRNA用于后来的体内实验。因为甚至在序列预筛下脱靶也是潜在问题，所以使用ELISA测定和鼠微列阵分析常规地测试α和β干扰素的活化(Kim等，2005)。

材料和方法

图6A：RNAi测定。为了共转染测定，转染前一天将HEK293细胞以60％的融合度接种到24孔平板。每一RNA等份试样在含有报告载体的50μL的Opti-MEM(Invitrogen，Carlsbad，CA)中稀释并与含有1.5μLLipofectamine 2000(Invitrogen，Carlsbad，CA)的50μL Opti-MEM混合。在室温下孵育混合物15分钟并加入到500μL终体积培养基的细胞中。为规范转染效率，每一试验包括靶标和/或双螺旋RNA与红色荧光蛋白(RFP)报告质粒的共转染。只有转染效率的变化低于10％(由RFP表达评定)的实验被评估。转染后24小时测定EGFP表达水平。由荧光光谱测定法确定EGFP表达。

图6B：凝胶迁移分析。收获在10cm平板中的融合的HEK293细胞并用PBS洗涤。将细胞沉淀重悬于0.5μL的缓冲液D(20mM HEPES，pH7.9、0.2mM EDTA、0.5mM DTT、50mM KCl、10％甘油、0.2mM PMSF)并超声15秒。5分钟微量离心后收集上清液。对于每个测定，将10μL提取液与10fmol的标记的siRNA孵育30分钟。将样品与天然的上样染料混合并在低温室内于200V在5％聚丙烯酰胺凝胶(29∶1)上分离2小时，在(b)中泳道A-E中使用的序列(c)。

实施例2：使用siRNA下调R2表达

我们现已设计和测试了许多对R2序列特异的siRNA在体外和体内下调R2表达的能力。这里以SEQ ID NO：7-96提供特异性siRNA的序列(在上面表2-8中显示)。

如图7所示，针对R2的siRNA可在多种培养的细胞系中下调R2表达。在三种检测的细胞系的每一种中，针对R2的三种siRNA双螺旋的每一种(在表2中显示为SEQ ID NO：7-12的siRRM2-A、siRRM2-B和siRRM2-C)都可实现R2蛋白水平的降低。相反，GTI-2040反义脱氧核苷显示最小下调。

为进行图7中显示的实验，HeLa(人宫颈癌)、HepG2(肝细胞癌)和CCD-1074Sk(人成纤维细胞)细胞获自美国模式培养和保藏所(AmericanType Culture Collection)。转染前24小时将细胞在六孔组织培养平板(每孔250,000细胞)上铺板。为了转染，根据制造商推荐使用Oligofectamine(Invitrogen)和下列核酸的每一种在无血清培养基(OptiMEM，Invitrogen)中制备复合体：

“si对照”或“siCON1”：无靶向对照siRNA#1(Dharmacon)，在下面表10中显示为SEQ ID NO：97和98；

“SiRRM2-A”：针对hRRM2“A”位点的siRNA，在上面表2中显示为SEQ ID NO：7和8；

“SiRRM2-B”：针对hRRM2“B”位点的siRNA，在上面表2中显示为SEQ ID NO：9和10；

“SiRRM2-C”：针对hRRM2“C”位点的siRNA，在上面表2中显示为SEQ ID NO：11和12；以及

“GTI-2040”：针对hRRM2的反义寡脱氧核苷酸(Lee等，CancerResearch 63：2802-2811(2003))，在下面表10中显示为SEQ ID NO：99。

表10在此处描述的实施例中使用的对照核酸的序列。下划线的残基代表3’突出端。

描述	序列	链	SEQ ID NO
描述	序列	链	SEQ ID NO	si对照(或siCON1)	5′uagcgacuaaacacaucaauu 3′	有义	SEQ ID NO：97
3′uuuaucgcugauuuguguaguu 5′	反义	SEQ ID NO：98			5′uagcgacuaaacacaucaauu 3′	有义	SEQ ID NO：97
3′uuuaucgcugauuuguguaguu 5′	反义	SEQ ID NO：98	GTI-2040		5′cuugguggagcgauuuagcc 3′		SEQ ID NO：99

核酸复合体以50nM最终核浓度曝露于细胞4小时，其后通过抽吸移去复合体并用完全培养基补充。转染两天(48小时)后，裂解细胞并且使用1∶250稀释度的山羊多克隆抗R2的第一抗体(sc-10846，Santa Cruz)和1∶5000稀释度的HRP缀合的驴抗山羊IgG第二抗体(Santa Cruz)通过western印迹测定R2蛋白水平。印迹使用ECL检测试剂盒(GE/AmershamBiosciences)显影并使用ImageQuant TL软件(GE/Amersham Biosciences)定量。

实施例3：用于鉴定每个靶标位点上的R2 siRNA的Tiling实验

如图10中所示的位点，使用tiling实验以鉴定具有增加的效能的针对R2的siRNA。针对R2的三种siRNA双螺旋的每一种(在上面表2中显示为SEQ ID NO：7-12的siRRM2-A、siRRM2-B和siRRM2-C)可实现R2萤光素酶融合蛋白质水平的降低。siRRM2B+3和siRRM2B+5双螺旋显示对这三种原始双螺旋的每一种较强的下调，siRRM2B+5提供最有效的下调。相反地，GTI-2040反义脱氧核苷酸和具有相同靶标的siRNA(“si(GTI-2040)”)未展示出任何下调。最后，显示以前公开的针对RRM2的siRNA(“si(JBC，2004)”)实现的下调用于对照。

为进行图10中显示的实验，HepG2(肝细胞癌)细胞获自美国模式培养和保藏所。转染前24小时将细胞在24孔组织培养平板(每孔50,000细胞)上铺板。为了转染，根据制造商推荐使用Lipofectin(Invitrogen)、pR2Luc质粒(1μg/孔)和下列核酸的每一种在无血清培养基(OptiMEM，Invitrogen)中制备复合体：

“siRRM2A”：针对hRRM2的“A”位点的siRNA，在上面表2中显示为SEQ ID NO：7和8；

“siRRM2B”：针对hRRM2的“B”位点的siRNA，在上面表2中显示为SEQ ID NO：9和10；

“siRRM2C”：针对hRRM2的“C”位点的siRNA，在上面表2中显示为SEQ ID NO：11和12；

“siRRM2B+3”：hRRM2原始“B”位点下游3个核苷酸的siRNA，在上面表5中显示为SEQ ID NO：59和60；

“siRRM2B+5”：hRRM2原始“B”位点下游5个核苷酸的siRNA，在上面表5中显示为SEQ ID NO：63和64；

“GTI-2040”：针对hRRM2的反义寡脱氧核苷酸，在上面表10中显示为SEQ ID NO：99；

“si(GTI-2040)”：具有与针对hRRM2的反义寡脱氧核苷酸相同的靶标位点的siRNA双螺旋(在下面表11中显示为SEQ ID NO：100和101)；和

“si(JBC，2004)”：针对以前公布的hRRM2(J.Biol.Chem.279(26)：27030-27038，2004)的siRNA双螺旋(在下面表11中显示为SEQ IDNO：102和103)。

表11.在此处描述的实施例中使用的si(GTI-2040)和si(JBC，2004)的序列。下划线的残基代表3’突出端。

描述	序列	链	SEQ ID NO
描述	序列	链	SEQ ID NO	si(GTI-2040)	5’cuugguggagcgauuuagccaa 3’	有义	SEQ ID NO：100
3′uugaaccaccucgcuaaaucgg 5′	反义	SEQ ID NO：101			5’cuugguggagcgauuuagccaa 3’	有义	SEQ ID NO：100
3′uugaaccaccucgcuaaaucgg 5′	反义	SEQ ID NO：101	si(JBC 2004)		5′gaggcuaccuauggugaacgu 3′	有义	SEQ ID NO：102
3′uucuccgauggauaccacuug 5′	反义	SEQ ID NO：103			5′gaggcuaccuauggugaacgu 3′	有义	SEQ ID NO：102

这些核酸复合体以10nM最终核浓度曝露于细胞4小时，其后通过抽吸移去复合体并用完全培养基补充。转染两天(48小时)后，裂解细胞并且根据制造商的说明书使用萤光素酶试验(萤光素酶试验系统，Promega)测定R2萤光素酶融合蛋白的水平。

实施例4：额外的Tiling实验用于鉴定在靶标位点B上的R2 siRNA

图11显示额外的tiling实验的结果，进行该实验以鉴定具有增加的效能的针对R2的siRNA。与图10中显示的结果相似，siRRM2B+5提供最有效的下调。siRRM2B+9和siRRM2B+3双螺旋也提供有力的下调，但没有siRRM2B+5有效。

为进行图11中显示的实验，HepG2(肝细胞癌)细胞获自美国模式培养和保藏所。转染前24小时将细胞在24孔组织培养平板(每孔50,000细胞)上铺板培养。为了转染，根据制造商推荐使用Lipofectin(Invitrogen)、pR2Luc质粒(1μg/孔)和下列核酸的每一种在无血清培养基(OptiMEM，Invitrogen)中制备复合体：

“siGL3”：Dharmacon出售的靶向萤光素酶的siRNA(“萤光素酶GL3双螺旋”)；

“siRRM2B+4”：hRRM2原始“B”位点下游4个核苷酸的siRNA，在上面表5中显示为SEQ ID NO：61和62；

“siRRM2B+6”：hRRM2原始“B”位点下游6个核苷酸的siRNA，在上面表8中显示为SEQ ID NO：87和88；

“siRRM2B+7”：hRRM2原始“B”位点下游7个核苷酸的siRNA，在上面表8中显示为SEQ ID NO：89和90；

“siRRM2B+8”：hRRM2原始“B”位点下游8个核苷酸的siRNA，在上面表8中显示为SEQ ID NO：91和92；

“siRRM2B+9”：hRRM2原始“B”位点下游9个核苷酸的siRNA，在上面表8中显示为SEQ ID NO：93和94；和

“siRRM2B+10”：hRRM2原始“B”位点下游10个核苷酸的siRNA，在上面表8中显示为SEQ ID NO：95和96。

将这些复合体以10nM、1nM或0.2nM的最终siRNA浓度曝露于细胞4小时，其后通过抽吸移除复合体并用完全培养基补充。转染两天(48小时)后，裂解细胞并且根据制造商的说明书使用萤光素酶试验(萤光素酶试验系统，Promega)测定R2萤光素酶融合蛋白的水平。

实施例5：21mer和27mersiRNA活性的测定

如图12所示，用B+5靶标位点的RNA双螺旋(21mer或27mer)进行剂量依赖的共转染研究以鉴定具有增强潜能的定向于R2的siRNA。21mer和27mer的siRRM2B+5都对脂质体共转染的R2Luc提供有效下调。在检测的最高浓度下(10nM和1nM)，21mer显示比27mer稍高的效能，而在检测的最低浓度下(0.2nM)27mer显示稍高的效能。

为进行图12中显示的实验，HepG2(肝细胞癌)细胞获自美国模式培养和保藏所。转染前24小时将细胞在24孔组织培养平板(每孔50,000细胞)上铺板培养。为了转染，根据制造商推荐使用Lipofectin(Invitrogen)、pR2Luc质粒(1μg/孔)和下列核酸的每一种在无血清培养基(OptiMEM，Invitrogen)中制备复合体：

“siRRM2B+5 21mer”：hRRM2原始“B”位点下游5个核苷酸的siRNA，在上面表5中显示为SEQ ID NO：63和64；

以及“siRRM2B+5 27mer”：27mer RNA双螺旋，其具有与siRRM2B+5相同的靶标位点并且期望具有与siRRM2B+5 21mer同样的Dicer切割产物(在上面表7中显示为SEQ ID NO：85和86)。

这些复合体以10nM、1nM或0.2nM最终siRNA浓度曝露于细胞4小时，其后通过抽吸移除复合体并用完全培养基补充。转染两天(48小时)后，裂解细胞并且根据制造商的说明书使用萤光素酶试验(萤光素酶试验系统，Promega)测定R2萤光素酶融合蛋白的水平。

实施例6：使用siRNA下调外源性R2表达

如图13所示，siRNA诱导的R2萤光素酶融合蛋白的下调与敲除内源性R2表达相关。在所有四个检测的时间点上，siRRM2B+5诱导在无靶向对照(siCON1)siRNA中未见的内源性R2蛋白的强烈下调。这证实首次于“tiling实验”中用R2萤光素酶融合蛋白检测的siRRM2B+5双螺旋确实是在肝细胞癌细胞中内源性R2的有效下调物。

为进行图13中显示的实验，Hep3B(肝细胞癌)细胞获自美国模式培养和保藏所。转染前细胞在6孔组织培养平板(每孔250,000细胞)上铺板培养24小时。为了转染，根据制造商推荐使用Oligofectamine(Invitrogen)和下列核酸的每一种在无血清培养基(OptiMEM，Invitrogen)中制备复合体：

“si对照”：无靶向对照siRNA#1(Dharmacon)(在上面表10中显示为SEQ ID NO：97和98)；和

“siRRM2B+5”：hRRM2原始“B”位点下游5个核苷酸的siRNA(在上面表5中显示为SEQ ID NO：63和64)。

将这些复合体以50nM的最终siRNA浓度曝露于细胞4小时，其后通过抽吸移除复合体并用完全培养基补充。在转染一天(24小时)、两天(48小时)、三天(72小时)或3.25天(78小时)后，裂解细胞并通过western印迹检测R2蛋白的水平。western印迹利用以1∶250稀释的山羊多克隆抗R2第一抗体(sc-10846，Santa Cruz)和以1∶5000稀释的HRP缀合的驴抗山羊IgG第二抗体(Santa Cruz)。使用ECL检测试剂盒(GE/AmershamBiosciences)显影western印迹。随后对膜进行剥离(REstore StrippingBuffer，Pirece)并进行GAPDH印迹作为加样对照。使用ImageQuant TL软件(GE/Amersham Biosciences)进行western印迹的定量。

实施例7：针对R2的siRNA诱导HepG2细胞中的细胞凋亡

如图14所示，针对R2的siRNA诱导HepG2细胞中的细胞凋亡。在所有三个测试的时间点上，但最显著地在转染3天后，用siRRM2B+5转染的HepG2细胞展现出比用siCON1转染的那些细胞更高程度的荧光(指示更高程度的细胞凋亡)。

为进行图14中所示实验，HepG2(肝细胞癌)细胞获自美国模式培养和保藏所。转染前24小时将细胞在6孔组织培养平板(每孔250,000细胞)上铺板培养。为了转染，根据制造商推荐使用Oligofectamine(Invitrogen)和下列核酸的每一种在无血清培养基(OptiMEM，Invitrogen)中制备复合体：

将这些复合体以50nM的最终siRNA浓度曝露于细胞4小时，其后通过抽吸移除复合体并用完全培养基补充。在转染一天(24小时)、两天(48小时)或三天(72小时)后，使用Vybrant Apoptosis Assay#2(Invitrogen)和流式细胞技术分析细胞的细胞凋亡。在曝露于AlexaFluor488标记的Annexin V后，记录作为总体平均荧光的数据。

实施例8：针对R2的siRNA增进HCC细胞的药物诱导的细胞凋亡

如图15所示，针对R2的siRNA增进药物诱导的HCC细胞的细胞凋亡。在曝露于阿霉素之前用siRRM2B+5脂质体转染的HepG2细胞比没有获得siRNA的或用无靶向性对照(siCON1)siRNA脂质体转染的那些细胞显示出显著更高程度的细胞凋亡。

为进行图15中所示实验，HepG2(肝细胞癌)细胞获自美国模式培养和保藏所(American Type Culture Collection)。转染前24小时将细胞在6孔组织培养平板(每孔250,000细胞)上铺板培养。为了转染，根据制造商推荐使用Oligofectamine(Invitrogen)和下列核酸的每一种在无血清培养基(OptiMEM，Invitrogen)中制备复合体：

“si对照”：无靶向对照siRNA#1(Dharmacon)(在上面表10中显示为SEQ ID NO：97和98)；以及

将这些复合体以50nM的最终siRNA浓度曝露于细胞4小时，其后通过抽吸将其移除并且用阿霉素(100nM)孵育细胞(经lipoplex处理以及以前未处理的细胞)3天。使用Vybrant Apoptosis Assay#2(Invitrogen)和流式细胞技术分析细胞的细胞凋亡。在曝露于AlexaFluor488标记的AnnexinV后，记录作为总体平均荧光的数据。

实施例9：针对R2的siRNA降低体内R2萤光素酶融合蛋白的表达

如图16所示，针对R2的siRNA在体内降低R2萤光素酶融合蛋白的表达。在所有时间点上，与单独接受pR2Luc质粒或具有siCON1双螺旋的质粒的小鼠相比，接受siRRM2B+5双螺旋(在上面表5中显示为SEQ IDNO：63和64)的小鼠显示出急剧降低的发光。

为进行图16中显示的实验，雌性BALB/c小鼠(约6周龄，Jackson Labs，n＝5的组)接受单一高压(10％v/w)尾静脉注射，所注射为单独的pR2Luc质粒(0.25mg/kg)或其与针对R2(siRRM2B+5)、萤光素酶(Luc105-21)或无靶向对照(siCON1)的siRNA(1.25mg/kg)的组合。在注射后的多个时间点上(2、6、11或17天)，将小鼠麻醉(异氟醚气体)，注射D-萤光素(Xenogen，腹膜内PBS中150mg/kg)，并且在10分钟后成像以确定整体动物的生物荧光(使用IVIS 100成像系统，Xenogen)。以在每一时间点上仅接受pR2Luc质粒的小鼠的平均值百分率作为整体动物生物荧光提供条形图中的数据。另外，显示注射两天(t＝2天)后拍摄的小鼠的代表性成像(图16)。

实施例10：针对R2的siRNA降低培养的HCC细胞的生长潜能

如图17所示，最优化的针对R2的siRNA(siR2B+5)降低培养的人HCC细胞(Hep3B细胞)的生长潜能。与用无靶向对照siRNA(siCON1)的相似处理相比，用最优化的针对R2的siRNA(siR2B+5)脂质体转染Hep3B细胞大大降低集落形成潜能。这指示在这些细胞中下调R2(完全由用抗R2的siRNA的脂质体转染产生)降低它们的生长潜能。

为进行图17中显示的实验，Hep3B(肝细胞癌)细胞获自美国模式培养和保藏所。转染前24小时将细胞在6孔组织培养平板(每孔1000个细胞)上铺板培养。为了转染，根据制造商推荐使用Oligofectamine(Invitrogen)和下列核酸的每一种在无血清培养基(OptiMEM，Invitrogen)中制备复合体：

“siR2B+5”：针对hRRM2的最优化的siRNA(在上面表5中显示为SEQID NO：63和64)；以及

“siCON1”：无靶向对照siRNA#1(Dharmacon)(在上面表10中显示为SEQ ID NO：97和98)。

将这些复合体以5nM的最终siRNA浓度曝露于细胞4小时，其后通过抽吸移除复合体并用完全培养基补充。转染五天(120小时)后，细胞用乙醇固定(10min)并用亚甲基蓝(在水中)着色。人工记数集落(具有约50或更多的细胞)。一式三份的孔(n＝3)用于每一处理；柱状图代表平均数并且误差线代表标准偏差(图17)。

实施例11：siRNA的效能与降低生长潜能的能力相关

如图18所示，针对R2的siRNA的效能与siRNA降低培养的人HCC细胞生长潜能的能力相关。与使用已显示缺乏下调R2效力的两种siRNA(siR2B+6和siR2B+7)的任一的相似处理相比，使用已显示有效下调R2的三种siRNA(siR2B+3、siR2B+5和siR2B+9)的任一脂质体转染Hep3B细胞大大降低集落形成潜能。就图17中的结果而言，该结果表明在Hep3B细胞中下调R2(完全由用抗R2 siRNA的脂质体转染产生)降低它们的生长潜能。

为进行图18中所示实验，Hep3B(人肝细胞癌)细胞获自美国模式培养和保藏所。转染前24小时将细胞在6孔组织培养平板(每孔500细胞)上铺板培养。为了转染，根据制造商推荐使用Oligofectamine(Invitrogen)和下列核酸的每一种在无血清培养基(OptiMEM，Invitrogen)中制备复合体：

“siRRM2B+3”：针对hRRM2相对有效的siRNA(在上面表5中显示为SEQ ID NO：59和60)；

“siRRM2B+5”：针对hRRM2相对有效的siRNA(在上面表5中显示为SEQ ID NO：63和64)；

“siRRM2B+6”：针对hRRM2相对低效的siRNA(在上面表8中显示为SEQ ID NO：87和88)；

“siRRM2B+7”：针对hRRM2相对低效的siRNA(在上面表8中显示为SEQ ID NO：89和90)；和

“siRRM2B+9”：针对hRRM2相对有效的siRNA(在上面表5中显示为SEQ ID NO：93和94)。

将这些复合体以5nM的最终siRNA浓度曝露于细胞4小时，其后通过抽吸移除复合体并用完全培养基补充。转染五天(120小时)后，细胞用乙醇固定(10min)并用亚甲基蓝(在水中)着色。人工记数集落(具有约50或更多的细胞)。一式三份的孔(n＝3)用于每一处理；柱状图代表平均数且误差线代表标准偏差(图18)。为了比较，在图11中显示共转染研究(用以评估针对R2的这些siRNA双螺旋的相对效能)的结果。

实施例12：5-FU增强由R2 siRNA降低的生长潜能

如图19所示，由针对R2的siRNA(siR2B+5)对Hep3B细胞生长潜能的降低由于5-氟尿嘧啶(5-FU)曝露而增强。如上所讨论(参见图17)，与用阴性对照siRNA(这里，该siRNA是Luc105-21，其靶向萤火虫萤光素酶)的相似处理相比，用最优化的针对R2的siRNA(siR2B+5)脂质体转染Hep3B细胞大大降低集落形成潜能。另外，将细胞曝露于化疗的5-氟尿嘧啶(5μM达72小时)降低了相对于未处理细胞的集落数目并增强了siR2B+5的抗增殖效果。

为进行图19中所示实验，Hep3B(肝细胞癌)细胞获自美国模式培养和保藏所。转染前24小时将细胞在6孔组织培养平板(每孔500细胞)上铺板培养。为了转染，根据制造商推荐使用Oligofectamine(Invitrogen)和下列核酸的每一种在无血清培养基(OptiMEM，Invitrogen)中制备复合体：

“siR2B+5”：针对hRRM2有效的siRNA(在上面表5中显示为SEQ IDNO：63和64)；以及

“Luc105-21”：针对萤火虫萤光素酶的siRNA(在此使用作为阴性对照；在下面表12中显示为SEQ ID NO：104和105)。

表12在此处描述的实施例中使用的Luc105-21的序列。大写字母表示DNA残基，小写字母表示RNA残基，并且下划线的残基代表3’突出端。

描述	序列	链	SEQ ID NO
描述	序列	链	SEQ ID NO	Luc105-21	5’gguuccuggaacaauugcuTT 3’	有义	SEQ ID NO：104
3’TTccaaggaccuuguuaacga 5’	反义	SEQ ID NO：105			5’gguuccuggaacaauugcuTT 3’	有义	SEQ ID NO：104

以5nM的最终核浓度将细胞曝露于这些复合体4小时，其后通过抽吸移除复合体并用完全培养基补充。对于5-FU处理的样品，在转染48小时后用5μM的5-氟尿嘧啶(5-FU)补充生长培养基并且另外孵育细胞三天。转染五天(120小时)后，细胞用乙醇固定(10min)并用亚甲基蓝(在水中)着色。人工记数集落(具有约50或更多的细胞)。一式三份的孔(n＝3)被用于每一处理；柱状图代表平均数且误差线代表标准偏差(图19)。

实施例13：针对R2的siRNA降低小鼠肿瘤中R2蛋白水平

如图20所示，针对R2的siRNA降低在小鼠皮下Hep3B肿瘤内R2蛋白水平。与用无靶向对照siRNA(siCON1)处理的小鼠中的那些值相比，在用含有抗R2 siRNA(siR2B+5)的制剂处理的小鼠中，三分之二的小鼠肿瘤R2蛋白水平急剧降低。这表明在这些肿瘤中每日连续三次肿瘤内注射含有siR2B+5的制剂实现下调R2蛋白。

为进行图20中显示的实验，Hep3B(人肝细胞癌)细胞被皮下注射入HRLN雌裸小鼠nu/nu。当肿瘤达到平均重量200-300mg时，在具有金刚烷-聚(乙二醇)-转铁蛋白(AD-PEG-Tf)靶向配体的含环糊精的聚阳离子(CDP)传递系统内，用连续三次每日肿瘤内(IT)注射最优化的针对R2的siRNA(siR2B+5)(在表5中显示为SEQ ID NO：63和64)或无靶向对照siRNA(siCON1)(在表10中显示为SEQ ID NO：97和98)处理小鼠(每次注射2.5mg/kg siRNA)。第三次注射的两天后，对小鼠实施安乐死，获取肿瘤、福尔马林固定、石蜡包埋、切片，并且经由免疫组织化学(IHC)检测人R2蛋白表达。将切片用于评价相关的R2蛋白表达(+：低、++：中等、+++：高)。

实施例14：针对R2的siRNA降低大鼠肝细胞瘤细胞中蛋白质水平

如图21所示，针对R2的siRNA降低培养的大鼠肝细胞瘤细胞(McA-Rh7777)中蛋白质水平。所有靶向于R2的分子(GTI-2040反义、siR2B+5 21mer和siR2B+5-27 25/27mer)显示剂量依赖性的降低R2蛋白水平，该降低高于阴性对照(Luc105-21，针对萤光素酶的siRNA)的降低。因siR2B+5 21mer和siR2B+5-27 25/27mer的R2降低是彼此相当的并且高于用GTI-2040反义分子所显示的降低。最后，该数据指示最初针对hRRM2形成的这两个双螺旋也能够实现下调R2蛋白的大鼠直系同源物(rRRM2)。

为进行图21中所示实验，McA-RH7777(大鼠肝细胞瘤)细胞获自美国模式培养和保藏所。转染前24小时将细胞在6孔组织培养平板(每孔250,000细胞)上铺板培养。为了转染，根据制造商推荐使用Oligofectamine(Invitrogen)和下列核酸的每一种在无血清培养基(OptiMEM，Invitrogen)中制备复合体：

“Luc105-21”：针对萤火虫萤光素酶的最优化的siRNA(阴性对照)；

“GTI-2040”：针对hRRM2的反义寡核苷酸；

“siR2B+5”：针对hRRM2的最优化的siRNA(21mer)；

“siR2B+5-27”：针对hRRM2的最优化的Dicer底物RNA(25/27mer)；

这些复合体以1nM或20nM的最终核酸浓度曝露于细胞4小时，其后通过抽吸移除复合体并用完全培养基补充。转染两天(48小时)后，裂解细胞并利用作为第一抗体的1∶250稀释的山羊多克隆抗R2抗体(sc-10846，Santa Cruz)和作为第二抗体的1∶10000稀释的HRP缀合的驴抗山羊IgG抗体(Santa Cruz)通过western印迹测定R2蛋白的水平。使用ECL检测试剂盒(GE/Amersham Biosciences)显影印迹。使用ImageQuant TL软件(GE/Amersham Biosciences)进行western印迹的定量。

实施例15：siRNA的传递系统

我们已基于短的、含环糊精的聚阳离子(CDP)建立了非病毒的核酸传递系统。本载体是首例完全由自我组装形成的基于多聚体的核酸传递系统，并且是目前可获得的最可调节的载体(Davis等，2004)。本传递系统在体外和体内表现出非常低的毒性(在体外：Gonzalez等，1999；Hwang等，2001；Pun和Davis，2002；Reineke和Davis，2003a，b；在体内：Bellocq等，2003b；Davis等，2004；Pun等，2004)，并可以用于对动物全身性施用寡核苷酸(Pun等，2004)、siRNA(Hu-Lieskovan等，2005)和质粒(Bellocq等，2003b)。利用小鼠和兔子的最初研究已显示该传递系统没有引起免疫应答，并且它具有在动物体内改变传递核酸的生物分布的能力(Pun等，2004；Hu-Lieskovan等，2005)。传递系统由具有大约50nm的可调性直径和表面电荷的自我组装颗粒构成。完全通过自我组装方法制备这些纳米颗粒以提供可再生的和可升级的传递载体。设计纳米颗粒以维持组装直至它们“感应”细胞内环境的低pH，其后它们改变自己以协助细胞内的运输。纳米颗粒可容纳靶向配体用于结合到细胞表面受体并且它们的用途已提供用于动物中靶向传递(Bellocq等，2003b；Pun等，2004；Hu-Lieskovan等，2005)。因此，我们可以：(i)创造定义明确的具有可调特性的核酸传递系统，所述可调特性能够用定量方法进行表征，和(ii)在啮齿动物模型中提供有效的传递和功能。

肝癌

肝癌可以具有许多形式。肝细胞的癌症即肝细胞癌，显著不同于存在于肝脏的其它组织类型如直肠、乳腺、肺等的转移瘤。原发性肝癌是世界范围内第六大高发性癌症(Gerolami等，2003)。这里提出的研究使用肝细胞癌并因此涉及肝细胞的癌症。来自美国癌症协会(American Cancer Society)2004年的统计数据显示1992-1999年间肝癌的五年相对存活率，与其它限定的组织：乳腺(97.0％)、结肠和直肠(90.1％)、前列腺(100.0％)和胰腺(16.6％)相比，限定在肝脏中的肝癌存活率是16.3％。因此，肝癌和胰腺癌是目前人中最致命的、局部限定的癌症，并且这些事实显示对于这些癌症需要更有效的新型治疗。这里我们提出新的治疗剂用于治疗肝癌。即，我们提出通过非病毒传递的短干扰RNA(siRNA)抑制核糖核苷酸还原酶(RNR)亚基2(R2)将提供针对肝癌的新型有效的治疗。单独地和与低剂量化疗剂组合地抑制R2将提供作用于肝癌的新型治疗机制，其比目前治疗具有预期更高的安全性。

针对肝癌的核糖核苷酸还原酶亚基2的抑制

核糖核苷酸还原酶(RNR)催化从其相应的5’-核糖核苷二磷酸产生2’-脱氧核糖核苷酸的反应。该反应在产生2’-脱氧核糖核苷5’-三磷酸的途径中是限速步骤，并且是DNA复制所必需的。人RNR由R1和R2两个亚基组成，并且两种蛋白质的表达是酶活性所必需的。R1和R2由分开的染色体上不同基因编码，并且最重要地，它们的mRNA在整个细胞周期中表达不同。R1蛋白质在整个细胞周期中是稳定的，而R2仅在DNA复制发生的G1晚期/S早期期间表达(Engstrom等，1985)。

RNR是抗癌疗法的目的靶标。文献证据表明眼癌肿瘤抑制物以一种控制整个细胞周期进程的机制来抑制RI和R2(Angus等，2002)。通过与许多激活的癌基因相互作用，R2蛋白也可对确定肿瘤细胞的恶性潜能具有影响。例如，Fan及合作者已指出当R2过表达时用v-fms、v-src、A-raf、c-myc及其它转化的细胞的锚定依赖性生长被显著增强(Fan等，1998)。R2的过表达已显示作为引起吉西他汀抗性的因素(Liu等，2004)。最近，Lin等(2004)报道通过siRNA抑制R2使HCT-116细胞对于DNA损害剂和RNR抑制剂敏感化。这些和其它的问题使R2抑制成为抗癌治疗的有用目标(Yen，2003)。

Yen及合作者(Chen等，2000)和Lee等(2003)已指出针对R2的反义分子可在体外和体内显著降低人癌细胞的生长。Lee及合作者已表明GTI-2040，即已显示在体外以200nM抑制R2产生的20mer硫代磷酸寡核苷酸(PS-ODN)(Orr和Dorr，2004)，在裸鼠中显著抑制人结肠、胰腺、肝脏、肺、乳腺、肾、卵巢、大脑、前列腺等的皮下肿瘤(Lee等，2003)。这些研究者也证明在癌细胞系中R2蛋白水平被提高，并且这些结果与在肿瘤和肿瘤细胞系中显示出增加的RNR水平的早期研究相一致(Jensen等，1994)。正在由Lorus治疗的研究者检验使用R2抑制作为人抗癌策略的概念(Lee等，2003)，其目前正以GTI-2040进行II期临床试验(Orr和Dorr，2004)。I期结果(对27名晚期癌症患者施用3周连续的静脉输注接着1周休息的疗程)为II期试验提供的推荐剂量为185mg/m²/d(5mg/kg/d)(Orr和Dorr，2004)。II期试验使用GTI-2040与卡培他滨组合治疗肾细胞癌症。试验的原始数据显示在21名可评估的患者中一些人的疾病稳定性和某些肿瘤应答(Orr和Dorr，2004)。RNA干扰(RNAi)已显示出比反义分子更加有效的对基因表达的序列特异性抑制，并且正迅速成为超越反义、核糖核酸酶或DNA酶技术的调控基因表达的选择方法。最近，Whang及合作者已使用：(i)针对R2的siRNA以增强胰腺癌对于吉西他汀的化学敏感性(Duxbury等，2004a)，和(ii)逆转录病毒表达的针对R2的siRNA以减少胰腺癌细胞的侵入并降低吉西他汀抗性(Duxbury等，2004b)。

这些研究以及其它这里未报道的研究显示R2是针对肝癌的优秀靶标。对于肝癌肿瘤特别重要的是癌细胞由于肿瘤生长将通过细胞周期，而正常肝细胞将休眠。因此，向正常肝细胞的脱靶传递不太可能产生严重副作用。这里，为了抑制R2的表达，我们将制备向肝细胞传递针对R2的siRNA的肝细胞靶向颗粒以为肝细胞癌症提供新的和有效的治疗。50～100nm大小对于有效、全身性传递治疗的重要性

10nm的长度尺寸适合于必须具有足够循环时间以确保肿瘤内的显著积聚和运输的物质。直径小于10nm的物质将很快(几分钟内)经由肾脏从循环系统中被清除(Jorgensen和Moller 1979)。小分子治疗主要以这种方式被排出。一旦物质直径超过10nm，它们就不能经由肾脏生理性排出。因此，10nm是需要长期(以小时数计)循环时间的物质尺寸的下限。对于循环的尺寸上限是毛细管的直径。然而，这种尺寸对于有效渗透肿瘤而言太大。多数实体瘤具有在正常组织中未观测到的特征。一些这类特征是：(i)广泛的血管生成和因此增高的血管密度(Matre等，1999)，(ii)广泛的血管渗透性，(iii)缺陷型血管结构以及(iv)从胞间隙的淋巴清除受损(Fang等，2003)。所谓的“增强的渗透性和滞留”(EPR)效果(其为肿瘤特征(i-iv)的结果)是众所周知的并且允许生物的和合成的大分子进入循环并积聚于肿瘤中(Fang等，2003；Tanaka等，2004)。传统的、低分子量药物通常具有几分钟的血浆半衰期。EPR效果需要几小时以发生显著积聚。因此，对于经由肾脏不能清除的实体(10nm尺寸以上)由于EPR作用在肿瘤中的摄取被加强。直径100nm以内的实体可离开循环系统并进入肿瘤。这种尺寸的物质很少具有从循环系统可到达的其它定位点除了一种其它组织即肝脏(内皮穿透大约是100-150nm)。一旦离开循环系统并进入肿瘤块后，该物质需要在肿瘤内具有一定流动性。我们通过实验(下面显示的)发现直径大约50nm的物质提供良好折衷的尺寸。即，如果该物质是10nm那么它们不能运载大量的治疗剂而尺寸在100nm以上则限制组织中的流动性。对于肝细胞癌，该尺寸也非常适合于向肿瘤细胞传递，因为颗粒也必须跨越肝脏穿透(大约150nm；Guyton，1981)并连接ASGPR(尺寸在70nm以下；Rensen等，2001)。

Davis及合作者已研究尺寸和靶向配体对从全身性注射到达肝细胞的细胞内位点的影响。使用荧光标记的单分散性多聚体微珠，通过显示于示意图22中的方法合成四种颗粒类型。微珠的特点列于表13中，并且于图23中提供典型的粒度分布连同制备的siRNA颗粒(详见于后面的章节)以说明本微珠是治疗颗粒的良好模型。

表13.用于摄取实验的微珠

微珠名称	平均直径(nm)	z-电位(mV)	半乳糖表面密度(pmol/cm²)
微珠名称	平均直径(nm)	z-电位(mV)	半乳糖表面密度(pmol/cm²)	Gal-50	51.5	-2.7	25.4
MeO-50	53.5	-2.7	0	Gal-50	51.5	-2.7	25.4
MeO-50	53.5	-2.7	0	Gal-140	138.1	-2.6	30.6
MeO-140	138.7	-3.2	0	Gal-140	138.1	-2.6	30.6

当通过尾静脉注射向小鼠施加相同数目的微珠时，在图24中提供肝脏中收集剂量的百分比。注意那些缺少半乳糖的颗粒未积聚成显著量。肝脏切片(图25)显示Gal-140颗粒未真正到达肝细胞(图25A)但是作为个别颗粒被库普弗细胞摄取(图26)，并且该结果显示颗粒不聚集于血液、组织中和细胞内。另一方面，在整个样本中，Gal-50颗粒定位于肝细胞内(图25B)。用蓝色染料显现核，而以绿色显现微珠。

这些数据指示大约50nm尺寸的颗粒可具有显著的贯穿组织并进入细胞的运动。尽管这些研究涉及靶向肝细胞，我们已在肿瘤中观测到相似的行为。已显示50nm大小的运载荧光标记的DNA酶的转铁蛋白靶向的颗粒经由小鼠中尾静脉注射定位于肿瘤细胞内，而缺乏转铁蛋白靶向配体的50nm颗粒经由EPR作用定位于肿瘤但不进入肿瘤细胞(Pun等，2004)。因此，这两项研究显示经由全身性施用，直径大约50nm的颗粒尺寸适合于有效获得在肝细胞和肿瘤中的细胞内定位。

自组装的核酸传递系统的设计和功能

我们的非病毒传递系统(Gonzalez等，1999；Hwang等，2001；Pun和Davis，2002；Reineke和Davis，2003a，b)涉及两种成分。第一种成分是含环糊精的聚阳离子(参见图27)。通过制备在电荷空间、电荷中心类型和疏水性(通过改变多聚体骨架的疏水性)上改变的多种聚阳离子，显示体外毒性与聚阳离子疏水性相关(参见图28)。含CD的聚阳离子与大小从短的单链寡核苷酸到大的质粒(我们已使用的高达10kbp)的核酸相互作用，经由静电相互作用(多聚体上的正电荷，核酸上的负电荷)与核酸自组装以形成在混合物中含有100％核酸的大约50-100nm的Polyplex，并且完全保护核酸免于核酸酶降解(Hwang等，2001；Pun和Davis，2002)。TEM图象表明Polyplex具有球形形态(Hwang等，2001)。FE-SEM和TEM steropairs确定颗粒具有球形形态并且cryo-TEM图象显示这些颗粒是密集的。聚阳离子给予低毒性(对于单独的聚阳离子：在体外IC₅₀高于1mM并且在小鼠中能很好地耐受100mg/kg以上的量(Hwang等，2001)；对于充分制备的颗粒：在小鼠中CDP量可以是500mg/kg以上而没有急性毒性(Pun等，2004))。很明显环糊精对于提供低毒性起重要作用。

图30中提供的数据说明体外质粒DNA(pDNA)的传递。在pH值7以下提供缓冲作用的其它聚阳离子以某种方式协助增强基因表达(Zuber等，2001；Putnam等，2001)。为使CDP具有这种类型的缓冲能力并且适合于体内研究，如图27中所示，咪唑(pKa～6.2)基团被缀合到CDP末端。

含咪唑的CDP的确缓冲了内吞囊泡的pH(用其它pH敏感性荧光探针在肝脏细胞中的最新测定最后显示pH被缓冲-数据未显示)。内体的缓冲作用引起渗透膨胀最终可导致囊泡破裂以提供释放核酸。另外，在CDP上咪唑的质子化作用引发多聚体释放核酸。图31显示的TEM说明这一点。

上面描述的具有CDP或im-CDP的Polyplex遇到与其它Polyplex相同的问题，即它们是在生理条件下聚集的带正电荷的胶态颗粒。通过PEG化作用(PEG：聚乙二醇)提供Polyplex的盐和血清稳定性的尝试已产生混合的结果。PEG化作用可预防pDNA结合和浓缩(Garrett等，2000)或改变Polyplex形态(Nguyen等，2000)。然而，确实存在聚阳离子的PEG化作用后pDNA浓缩的成功实例(Kwok等，1999)。Davis及合作者设计含有环糊精的PEG化Polyplex的新方法。图31解释该方法学(Pun和Davis，2002)。

修饰成分(实例显示于图32)含有末端金刚烷(AD)用于与表面环糊精、带电片段、PEG片段和靶向配体形成内含物复合体。Pun和Davis已指出修饰物修饰了颗粒的表面并且这样做使人们能够制备这样的颗粒：(i)在生理盐条件下稳定(图33和34)(Pun和Davis(2002))，(ii)可靶向细胞表面受体(图35)以及(iii)具有规定的表面电荷(图36)和靶向配体的数目(Pun和Davis(2002)。

目前，通过在加入到核酸之前混合聚阳离子和修饰成分可获得稳定的颗粒的制剂。在这三种成分混合在一起后整个系统几秒内自发地自组装成均一大小的颗粒(在颗粒中是100％的核酸)(参见图37)，并且可以用高达10mg pDNA/mL的pDNA浓度制备该制剂。

在模式生物流体中已测试基因传递颗粒的物化行为。如上所示，颗粒在150mM NaCl中是稳定的。另外，我们使用浊度测定测试在血液和血液成分存在下的稳定性。即，如果发生聚集，聚集的实体能散射更多的可被定量测量的光。图38说明该测定并显示尽管未PEG化的Polyplex在培养基(a)，或100％活性胎牛血清(FBS)(b)中聚集，PEG化的颗粒不聚集。

阳离子脂质体和多聚体已显示激活补体系统(Plank等，1996)。与Plank等(1996)报道的数据相一致，图39表明聚阳离子如PEI和CDP事实上显示补体激活作用。然而，在用于动物中的浓度下甚至当游离成分没有被移除时，完全制备的颗粒(Tf-PEG-AD、AD-PEG、CDP和pDNA)却没有激活补体(Tf-PEG-AD，含转铁蛋白(Tf)的PEG-AD其中Tf用于靶向肿瘤(Pun等2004))。

核酸在小鼠中的全身性传递

靶向肝脏的半乳糖与siRNA

裸siRNA没有被培养的细胞摄取，而CDP配制的材料(50nm颗粒直径，图23b)基本上进入所有细胞中(图40)。另一方面，裸siRNA在血清中不稳定而CDP制剂提供保护以抵抗核酸酶降解(我们已显示保护高达72小时)。因此，CDP/siRNA制剂在血清中稳定并传递siRNA进入细胞。

在小鼠中靶向肝细胞的研究中，我们使用Song等(2003)的siRNA序列下调FAS基因。Song等(2003)指出流体注射(～1mL溶液快速注射入尾静脉)降低FAS mRNA水平。流体注射方法向肝细胞传递核酸(Liu等，1999；Zhang等，1999；Yant等，2000)包括siRNA(McCaffrey等，2002；Lewis等，2002；Song等，2003)是众所周知的。使用BALB/c小鼠和50μg siRNA的注射，通过定量RT-PCR获得图41中显示的数据。如Song等(2003)报道的，流体注射方法(标记的HPTV)降低FAS mRNA水平而标准的、低容量的(200μL)注射裸siRNA没有降低。然而，含半乳糖的、im-CDP配制的颗粒给予与用HPTV方法观测到相似的FAS mRNA降低量(使用标准低容量的(200 μL)注射)。

靶向肿瘤的转铁蛋白与siRNA

为促进向癌细胞传递核酸，将转铁蛋白(Tf)掺入我们的传递系统作为靶向配体(Bellocq等，2003a)。转铁蛋白受体(TfR)以远远高于正常细胞的水平存在于恶性细胞的表面。

在NOD/scid小鼠中通过尾静脉注射TC-71细胞产生弥漫性肿瘤模型，该TC-71细胞用慢病毒转导使其能够整合萤光素酶基因(TC71-LUC)。TC-71细胞是含有称为EWS-FLI1融合基因的尤文肉瘤细胞并且在其表面具有TfR。融合基因的蛋白质产物已知参与细胞增殖。

首先，已确定使用普通的尾静脉注射可向肿瘤传递功能性siRNA。图43显示使用含有Tf的颗粒可以从针对萤光素酶的siRNA的传递中获得萤光素酶信号的大量降低(用裸siRNA没有观测到)。接着，我们确定在已形成的肿瘤中(图45)或在肿瘤的形成期间(图44)传递针对EWS-FLI1的siRNA(体外结果显示于图29中)可影响肿瘤生长(除在大脑中以外完全抑制肿瘤生长；含有Tf的颗粒不能跨越血-脑屏障(Pun等，2004))。这些数据清楚地确定在动物中使用靶向配体的传递载体确实保持完整。最后，来自血液化学分析的结果和主要器官的病理学显示siRNA被安全传递而没有引起免疫应答(血清IL-12和干扰素α没有改变)或造成对主要器官的损伤。

如图43中所示(顶栏)，从用制备的siRNA每周两次的处理四周的NOD/scid小鼠中获得生物荧光图象。从注射TC71-LUC细胞后立即开始，用含有靶向EWS-FLI1的siRNA(siEFBP2)或无靶向对照序列(siCON1)的制剂每周两次的处理小鼠四周。每周两次的监测这些小鼠的生物荧光。

图42说明靶向萤光素酶的siRNA(siGL3)如何被制备和靶向。传递系统的成分包括：含环糊精的聚阳离子(CDP)，其浓缩siRNA并且保护它免于核酸酶降解；金刚烷-聚(乙二醇)(AD-PEG)缀合物，其经由内含物复合制剂在生理性流体中稳定颗粒；AD-PEG-转铁蛋白(AD-PEG-Tf)缀合物，其向颗粒提供靶向配体，通过过表达细胞表面转铁蛋白受体(TfR)的细胞来促进它们的吸收。无靶向和靶向颗粒的组装：对于无靶向的颗粒，CDP和AD-PEG被组合并加入siRNA以产生稳定但无靶向的Polyplex。对于靶向的颗粒，将CDP、AD-PEG和AD-PEG-Tf组合并加入siRNA中以产生稳定、靶向性的颗粒。在加入siRNA之前，以1∶1 AD∶/β-CD(摩尔比)的比例将CDP与AD-PEG₅₀₀₀缀合物混合。靶向的Polyplex也以1∶1000AD-PEG-Tf∶AD-PEG(重量比)的比例含有转铁蛋白修饰的AD-PEG(AD-PEG-Tf)。然后以3/1(+/-)的电荷比例(来自于CDP的正电荷对比于来自于siRNA骨架的负电荷)将该混合物加入到相等体积的siRNA中。将水中相等体积的10％(重量体积比)葡萄糖加入到形成的Polyplex中以制备含5％(重量体积比)葡萄糖(D5W)的适于注射的最终Polyplex制剂。

在注射TC71-LUC细胞后通过连续两天低压尾静脉(LPTV)注射施用配制的siRNA(黑色箭头)。使用积分的生物荧光流量(光子/秒)相对细胞注射后的时间作图。在43天观测到的萤光素酶表达降低到预处理(40天)值的约8％(图43)。在注射后2-3天，用靶向、配制的含siGL3的Polyplex处理的小鼠肿瘤显示强的萤光素酶信号减少(高于90％)。

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本领域的技术人员仅使用常规实验将能够认识到或能够确定这里所述的本发明具体实施方案的许多等同方案。这类等同方案将被包含于下列权利要求中。

所有上面引用的参考和出版物因此以其整体引入作为参考。

Claims

1.核酸，其包括：

(i)长度为15至30个核苷酸的第一链，其包含选自由SEQ ID NO：4-6组成的组的序列，和

(ii)长度为15至30个核苷酸的第二链，

其中第一链和第二链的至少12个核苷酸是彼此互补的，并且在生理条件下形成双链核酸，并且其中该双链核酸可通过RNA干扰机制降低细胞中核糖核苷酸还原酶亚基2(R2)的表达。

2.权利要求1的核酸，其中该核酸是双链RNA。

3.权利要求1的核酸，其中该核酸是发夹RNA。

4.权利要求3的核酸，其中该发夹RNA的环区域的长度为4至10个核苷酸。

5.权利要求1的核酸，其中该RNA的双链部分的长度为约15至约30个核苷酸。

6.权利要求1的核酸，其中第一链是DNA多聚核苷酸并且第二链是RNA多聚核苷酸。

7.权利要求1的核酸，其中第一和/或第二链还包含3’突出端区域、5’突出端区域、或3’和5’突出端区域。

8.权利要求7的核酸，其中该突出端区域的长度为1至10个核苷酸。

9.权利要求1的核酸，其中该核酸包含一种或多种修饰的骨架或碱基部分。

10.权利要求9的核酸，其中修饰的骨架或碱基部分是下面的一种或多种：烷基膦酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代磷酸酯(alkylphosphonothioate)、氨基磷酸酯、磷酸酯、氨基甲酸酯、acetamidate、羧甲基酯、碳酸盐和磷酸三酯。

11.权利要求9的核酸，其中该核酸包含至少一个2’-O-烷基化的核糖核苷酸。

12.权利要求1的核酸，其中第一链包含的序列选自SEQ ID NO：7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93和95组成的组。

13.权利要求1的核酸，其中第二链包含的序列选自SEQ ID NO：8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94和96组成的组。

14.权利要求1的核酸，其中当在生理条件下以10纳摩尔的浓度与细胞接触时，该核酸以50％或更多的抑制细胞中R2表达。

15.分离的核酸，其包含的序列在生理条件下与相应于SEQ ID NO：1的核苷酸422-485、616-667或907-968的R2转录物的区域杂交并且减少细胞中R2的表达。

16.权利要求15的分离的核酸，其中该核酸包含的序列与相应于SEQID NO：1的核苷酸432-475、626-657或917-958的R2转录物的区域杂交。

17.权利要求15的分离的核酸，其中该核酸包含的序列与相应于SEQID NO：1的核苷酸437-470、631-652或921-953的R2转录物的区域杂交。

18.权利要求15的核酸，其中该核酸包含与所述的R2区域之一互补的至少10个连续的核苷酸。

19.权利要求15的核酸，其中该核酸的长度为约14至约50个核苷酸。

20.权利要求15的核酸，其中该核酸是单链的。

21.权利要求15的核酸，其中该核酸是双链的。

22.权利要求15的核酸，其中该核酸是DNA分子，任选地包含一种或多种修饰的骨架或碱基部分。

23.权利要求15的核酸，其中该核酸是RNA分子，任选地包含一种或多种修饰的骨架或碱基部分。

24.权利要求15的核酸，其中该核酸包含DNA链和RNA链，并且任选地包含一种或多种修饰的骨架或碱基部分。

25.权利要求15的核酸，其中该核酸是RNAi构建体。

26.权利要求25的核酸，其中RNAi构建体是dsRNA，任选地包含一种或多种修饰的骨架或碱基部分。

27.权利要求25的核酸，其中RNAi构建体是发夹RNA，任选地包含一种或多种修饰的骨架或碱基部分。

28.权利要求25的核酸，其中RNAi构建体的双螺旋部分长度是从约15至约30个核苷酸。

29.权利要求25的核酸，其中RNAi构建体包含选自SEQ ID NO：4-6组成的组的序列，任选地包含一种或多种修饰的骨架或碱基部分。

30.权利要求25的核酸，其中RNAi构建体包含选自SEQ ID NO：7-96组成的组的序列，任选地包含一种或多种修饰的骨架或碱基部分。

31.权利要求25的核酸，其中RNAi构建体包含一种或多种修饰的骨架或碱基部分。

32.权利要求31的核酸，其中RNAi构建体包含至少一种核苷酸间的键合，所述键合选自烷基膦酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、磷酸酯、氨基甲酸酯、acetamidate、羧甲基酯、碳酸盐和磷酸三酯组成的组。

33.权利要求31的核酸，其中修饰的RNAi构建体包含至少一个2’-O-烷基化的核糖核苷酸。

34.权利要求15的核酸，其中该核酸是酶促核酸。

35.权利要求34的核酸，其中该酶促核酸是核糖核酸酶。

36.权利要求34的核酸，其中酶促核酸是DNA酶。

37.权利要求15的核酸，其中当在生理条件下以10纳摩尔的浓度与细胞接触时，该核酸以50％或更多的抑制细胞中R2表达。

38.包含权利要求1或15的核酸和药物可接受的载体的药物组合物。

39.权利要求38的药物组合物，其中药物可接受的载体包括阳离子多聚体。

40.权利要求38的药物组合物，其中药物可接受的载体包括环糊精多聚体。

41.权利要求40的药物组合物，其中环糊精结构是如图27中所示的im-CDP。

42.权利要求38的药物组合物，其包含的颗粒包括环糊精多聚体和权利要求1或15的核酸并且是被PEG化的。

43.权利要求42的药物组合物，其中该颗粒还包含金刚烷。

44.权利要求38的药物组合物，还包含靶向特定组织或细胞型的配体。

45.权利要求44的药物组合物，其中该配体包含半乳糖。

46.权利要求38的药物组合物，包含纳米颗粒，其中该纳米颗粒直径是从10至100nm。

47.权利要求46的药物组合物，其中纳米颗粒直径是从约50至70nm。

48.权利要求47的药物组合物，其中纳米颗粒直径是约50nm。

49.权利要求38的药物组合物，其中药物可接受载体包含：

咪唑修饰的含环糊精的阳离子多聚体，和

包含金刚烷-PEG-配体的靶向部分，

其中该聚合体和靶向部分形成包裹核酸的纳米颗粒。

50.权利要求49的药物组合物，其中纳米颗粒具有约50至120nm的直径。

51.权利要求50的药物组合物，其中纳米颗粒具有约50至100nm的直径。

52.权利要求51的药物组合物，其中纳米颗粒具有约50至70nm的直径。

53.权利要求49的药物组合物，其中纳米颗粒具有约50nm的直径。

54.权利要求49的药物组合物，其中靶向配体包含半乳糖。

55.权利要求49的药物组合物，其中靶向配体包含转铁蛋白。

56.权利要求1或15的核酸在用于治疗与细胞不必要增殖相关的疾病或情况的药物制备中的用途。

57.权利要求56的用途，其中该细胞是癌细胞或肿瘤细胞。

58.权利要求56的用途，其中细胞是病原体细胞。

59.权利要求56的用途，其中细胞是正常细胞，其不必要的增殖导致疾病或情况。

60.用于治疗癌症患者的方法，包括向患者施用治疗有效量的权利要求1或15的双链核酸。

61.权利要求60的方法，其中用该核酸和药物可接受的载体配制。

62.权利要求60的方法，其中用该核酸和靶向癌细胞的配体配制。

63.权利要求62的方法，其中配体是转铁蛋白。

64.权利要求62的方法，其中癌细胞是肝细胞并且配体包含半乳糖。

65.权利要求60的方法，其中核酸被制备为多聚体纳米颗粒的组分。

66.权利要求65的方法，其中纳米颗粒直径是从10至120nm。

67.权利要求65的方法，其中纳米颗粒直径是从50至120nm。

68.权利要求67的方法，其中纳米颗粒直径是从50至100nm。

69.权利要求65的方法，其中纳米颗粒直径是50nm。

70.权利要求60的方法，其中施用的途径是全身性的。

71.权利要求60的方法，其中施用的途径是肝内动脉施用。

72.权利要求71的方法，其中该癌症是肝癌。

73.权利要求60的方法，其中癌细胞与来自可比较组织的非癌细胞相比表达更高水平的R2。

74.权利要求60的方法，还包括至少一种额外的抗癌化疗剂，该化疗剂与核酸以附加或协同的方式抑制癌细胞。

75.权利要求74的方法，其中化疗剂是氟尿嘧啶(5FU)。

76.肝特异性传递的药物组合物，其包含：

肝治疗剂，和

传递载体，该传递载体包含(i)咪唑修饰的含环糊精的阳离子多聚体，和(ii)含金刚烷-PEG-配体的靶向部分，其中该多聚体和靶向部分形成包裹核酸的纳米颗粒。

77.权利要求76的药物组合物，其中纳米颗粒直径是从10至100nm。

78.权利要求77的药物组合物，其中纳米颗粒直径是约50至70nm。

79.权利要求77的药物组合物，其中纳米颗粒直径是约50nm。

80.权利要求76的药物组合物，其中肝治疗剂是小分子、多肽或核酸。

81.权利要求80的药物组合物，其中肝治疗剂是权利要求1或15的核酸。

82.治疗肝脏的疾病或紊乱的方法，其包括应受试者需要向其施用组合物，所述组合物包括：

肝治疗剂，和

传递载体，该传递载体包含(i)咪唑修饰的含环糊精的阳离子多聚体，和(ii)含金刚烷-PEG-配体的靶向部分，其中聚合体和靶向部分形成包裹核酸的纳米颗粒。

83.权利要求82的方法，其中肝脏的疾病或紊乱是肝细胞癌。

84.权利要求82的方法，其中施用的途径是肝内动脉施用。