CN104531701A

CN104531701A - 用于抑制蛋白激酶3表达的方法

Info

Publication number: CN104531701A
Application number: CN201410643357.1A
Authority: CN
Inventors: 约尔格·考夫曼; 奥利弗·凯尔; 安斯加尔·桑特尔
Original assignee: Silence Therapeutics GmbH
Current assignee: Silence Therapeutics GmbH
Priority date: 2006-07-21
Filing date: 2007-07-20
Publication date: 2015-04-22
Also published as: CN102321626A; KR20090039715A; BRPI0714875A2; CA2658550C; JP2009544281A; US20090304678A1; JP2013172714A; CN102321626B; CN101490253A; WO2008009477A3; MX2009000654A; KR101670085B1; US8232256B2; CA2658550A1; EP2049658A2; RU2553561C2; WO2008009477A2; EP2546337A1; HK1208701A1; AU2007276388A1

Abstract

本发明涉及用于抑制蛋白激酶3表达的方法。本发明涉及包括双链结构的核酸分子及其用途。本发明涉及包括双链结构的核酸分子，其中，所述双链结构包括第一链和第二链，其中，所述第一链包括连续核苷酸的第一段序列，并且所述第一段序列至少部分地与靶核酸互补，和其中，所述第二链包括连续核苷酸的第二段序列，并且所述第二段序列至少部分地与所述第一段序列互补，其中，所述第一段序列包括这样的核酸序列，所述核酸序列至少部分地与SEQ.ID.No.1(NM_013355)所述的核酸序列的核苷酸核心序列或其部分互补。本发明的核酸分子能够用于制备治疗例如血管发生-依赖性疾病的药物。

Description

用于抑制蛋白激酶3表达的方法

本申请是国际申请号PCT/EP2007/006492，国际申请日2007年7月20日，进入中国国家阶段日期为2009年1月16日，中国申请号200780026982.X，发明名称为“用于抑制蛋白激酶3表达的方法”的分案申请。

本发明涉及适合于抑制蛋白激酶3(PKN 3)表达的双链核酸及其应用。

Foulds(Foulds，1958)将瘤发生描述为多级生物学过程，目前已知其通过累积遗传损害而发生。在分子水平上，该多级肿瘤发生过程包括破坏阳性和阴性调节效应子(Weinberg，1989)。Vogelstein及同事(Fearon和Vogelstein，1990)推定人类结肠癌的分子基础涉及许多癌基因、肿瘤抑制基因和修复基因。类似地，已将导致视网膜神经胶质瘤发展的缺陷与另一种肿瘤抑制基因联系起来(Lee等，1987)。在多种其它恶性肿瘤中还识别了其他癌基因和肿瘤阻抑基因。不幸地，仅有少量能够治疗的癌症，且癌症的影响是灾难性的----仅美国每年有超过50万人死亡。

癌症从根本上是遗传疾病，其中对细胞DNA的损伤导致控制细胞增殖的正常机制的破坏。肿瘤阻抑基因维持基因组完整性的两种作用机制是通过细胞停滞，由此容许修复损伤的DNA，或通过程序性细胞死亡去除损伤的DNA(Ellisen和Haber，1998)。程序性细胞死亡，另外称为“程序性细胞死亡(programmed cell death)”，是小心地受到调节的生物化学事件网络，它起到以去除不可逆转地受损细胞为目的的细胞自杀程序作用。程序性细胞死亡能够由许多方法触发，包括结合肿瘤坏死因子，DNA损伤，生长因子的取消、和与Fas受体的抗体交联。尽管已经识别了若干在程序性细胞死亡过程中起作用的基因，但是尚未完全阐明引起程序性细胞死亡的途径。许多研究者试图以这样的目标识别新型程序性细胞死亡-促进基因，所述目标是该基因应该提供选择性地在肿瘤细胞中诱导程序性细胞死亡方法，从而治疗患者体内的癌症。

治疗癌症的备选方法涉及用试剂，诸如Endostatin^TM或抗-VEGF抗体抑制血管发生。在该方法中，目标是防止原发肿瘤的进一步血管化，并且潜在地，将转移性病灶的尺寸限制为在无充分血管生长的条件下能够支持肿瘤细胞的存活。

癌症疾病的特殊组是在肿瘤生长速率、向正常组织中的入侵、对化学疗法或其他常规治疗的抗性和形成遍及全身的转移方面积极的那些癌症疾病。在更积极的癌症情形中，癌症组织更加不同于正常组织，且肿瘤更易于扩散。因此，当前癌症研究中的一个目的是开发这样的试剂，其抑制肿瘤生长和/或减少癌症细胞遍及全身的扩散。

对什么是积极癌症疾病的定义可以从国家癌症研究所主页，即http://www.cancer.gov/Templates/db_alpha.aspx？CdrID＝46053获得。此外，为了描述癌症疾病的积极性，典型地使用分级，所述分级是这样的系统，即根据在显微镜下检查时它们表现出的异常来分类癌症细胞。分级系统的目的是提供关于肿瘤可能的生长速率的信息，及其扩散趋势。用于分级肿瘤的系统随着各种类型的癌症而变化。分级在治疗决定中起作用。

所述分级系统是本领域技术人员所已知的。其中之一是Gleason分数，即基于显微镜下形态分级前列腺癌症组织的系统。Gleason分数在2-10的范围内变化，并指示肿瘤将扩散的可能性。低Gleason分数意味着该癌症组织与正常前列腺组织类似，且该肿瘤具有较低的扩散可能性；高Gleason分数意味着该癌症组织与正常的非常不同，且该肿瘤更可能扩散。

PKN3，也称为蛋白激酶Nβ或PKNβ，是与癌症和肿瘤相关的有价值靶标。如在国际专利申请WO 2004/019973中所述，蛋白激酶Nβ是PI-3激酶/PTEN通路的下游靶标，所述通路与肿瘤发生和转移相关。特别地，后者作用似乎强烈地与抑制基因功能相关，更特别地，与PTEN肿瘤抑制基因功能的丧失相关。如WO 2004/019973中所示，蛋白激酶Nβ在这样的条件下会受到上调作用，在所述条件中PTEN，即PI-3激酶通路的抑制剂，是无活性的。由于蛋白激酶Nβ的上调作用，其中发生所述上调作用的细胞会显示出转移行为和迁移行为的增加。这意味着蛋白激酶Nβ的抑制剂是用于控制细胞转移和迁移行为的合适方法，和用于治疗肿瘤和癌症，更特别地转移的和其细胞显示出转移和/或迁移行为的那种肿瘤和癌症的合适方法。

本领域中现在正需要用于治疗肿瘤疾病的方法。更特别地，需要适合于积极的并表现出入侵行为的那种肿瘤疾病的方法。

还需要适合于影响血管形成，更特别地，在解释肿瘤疾病的病理机制中所涉及的血管形成的方法。这些需要定义了本发明待解决的问题。

通过附加的独立权利要求的主题解决了本发明待解决的问题。可以从从属权利要求获得优选的实施方案。

通过双链核酸分子解决了本发明待解决的问题，

-其中，所述双链结构包括第一链和第二链，

-其中，所述第一链包括连续核苷酸的第一段序列，并且所述第一段序列至少部分地与靶核酸互补，和

-其中，所述第二链包括连续核苷酸的第二段序列，并且所述第二段序列至少部分地与所述第一段序列互补，和

其中，所述靶核酸是编码PKN3的mRNA。

更特别地，在第一方面中，通过包含双链结构的核酸分子解决了本发明待解决的问题，

其中，所述双链结构包括第一链和第二链，

其中，所述第一链包括连续核苷酸的第一段序列，并且所述第一段序列至少部分地与靶核酸互补，和

其中，所述第二链包括连续核苷酸的第二段序列，并且所述第二段序列至少部分地与所述第一段序列互补，

其中，所述第一段序列包括这样的核酸序列，所述核酸序列至少部分地与按照SEQ.ID.No.1(NM_013355)的核酸序列的核苷酸核心序列或其一部分互补，

其中，所述核苷酸核心序列包括来自下列各项的核苷酸序列：

来自SEQ.ID.No.1的核苷酸位置482-500(SEQ.ID.No.2)；

来自SEQ.ID.No.1的核苷酸位置1555-1573(SEQ.ID.No.4)；

来自SEQ.ID.No.1的核苷酸位置1556-1574(SEQ.ID.No.6)；

来自SEQ.ID.No.1的核苷酸位置1559-1577(SEQ.ID.No.8)；

来自SEQ.ID.No.1的核苷酸位置1566-1584(SEQ.ID.No.10)；

来自SEQ.ID.No.1的核苷酸位置2094-2112(SEQ.ID.No.12)；

来自SEQ.ID.No.1的核苷酸位置2102-2120(SEQ.ID.No.14)；

来自SEQ.ID.No.1的核苷酸位置2286-2304(SEQ.ID.No.16)；

来自SEQ.ID.No.1的核苷酸位置2761-2779(SEQ.ID.No.18)；

来自SEQ.ID.No.1的核苷酸位置2763-2781(SEQ.ID.No.20)；

来自SEQ.ID.No.1的核苷酸位置2764-2782(SEQ.ID.No.22)；

来自SEQ.ID.No.1的核苷酸位置2843-2861(SEQ.ID.No.24)；

来自SEQ.ID.No.1的核苷酸位置2844-2862(SEQ.ID.No.26)；或

来自SEQ.ID.No.1的核苷酸位置2846-2864(SEQ.ID.No.28)；

优选地，所述核苷酸核心序列包括来自下列各项的核苷酸序列：

来自SEQ.ID.No.1的核苷酸位置1555-1573(SEQ.ID.No.4)；

来自SEQ.ID.No.1的核苷酸位置1556-1574(SEQ.ID.No.6)；

来自SEQ.ID.No.1的核苷酸位置1559-1577(SEQ.ID.No.8)；

来自SEQ.ID.No.1的核苷酸位置1566-1584(SEQ.ID.No.10)；

来自SEQ.ID.No.1的核苷酸位置2094-2112(SEQ.ID.No.12)；或

来自SEQ.ID.No.1的核苷酸位置2286-2304(SEQ.ID.No.16)；

其中，优选地，所述第一段序列另外至少部分地与所述核苷酸核心序列5’末端前面的区域和/或与所述核苷酸核心序列3’末端后面的区域互补。

在本发明第一方面的实施方案中，所述核酸第一段序列与所述核苷酸核心序列或其一部分互补。

在本发明第一方面的实施方案中，所述核酸第一段序列另外与所述核苷酸核心序列3’末端后面的区域和/或所述核苷酸核心序列5’末端前面的区域互补。

在本发明第一方面的实施方案中，所述核酸第一段序列以18-29个核苷酸，优选地，19-25个核苷酸，和更优选地，19-23个核苷酸，与所述靶核酸互补。

在本发明第一方面的优选实施方案中，所述核酸的核苷酸是连续的核苷酸。

在本发明第一方面的实施方案中，所述核酸第一段序列和/或第二段序列包括18-29个连续的核苷酸，优选地，19-25个连续的核苷酸，和更优选地，19-23个连续的核苷酸。

在本发明第一方面的实施方案中，所述核酸第一链由所述第一段序列组成，和/或所述核酸第二链由所述第二段序列组成。

在第二方面中，通过核酸分子，优选地按照第一方面、包括双链结构的核酸分子，解决了本发明待解决的问题，其中所述双链结构是通过第一链和第二链形成的，其中所述第一链包括连续核苷酸的第一段序列且所述第二链包括连续核苷酸的第二段序列，和其中所述第一段序列至少部分地与所述第二段序列互补，其中

-所述第一段序列由按照SEQ.ID.No.3的核苷酸序列组成，且所述第二段序列由按照SEQ.ID.No.2的核苷酸序列组成；

-所述第一段序列由按照SEQ.ID.No.5的核苷酸序列组成，且所述第二段序列由按照SEQ.ID.No.4的核苷酸序列组成；

-所述第一段序列由按照SEQ.ID.No.7的核苷酸序列组成，且所述第二段序列由按照SEQ.ID.No.6的核苷酸序列组成；

-所述第一段序列由按照SEQ.ID.No.9的核苷酸序列组成，且所述第二段序列由按照SEQ.ID.No.8的核苷酸序列组成；

-所述第一段序列由按照SEQ.ID.No.11的核苷酸序列组成，且所述第二段序列由按照SEQ.ID.No.10的核苷酸序列组成；

-所述第一段序列由按照SEQ.ID.No.13的核苷酸序列组成，且所述第二段序列由按照SEQ.ID.No.12的核苷酸序列组成；

-所述第一段序列由按照SEQ.ID.No.15的核苷酸序列组成，且所述第二段序列由按照SEQ.ID.No.14的核苷酸序列组成；

-所述第一段序列由按照SEQ.ID.No.17的核苷酸序列组成，且所述第二段序列由按照SEQ.ID.No.16的核苷酸序列组成；

-所述第一段序列由按照SEQ.ID.No.19的核苷酸序列组成，且所述第二段序列由按照SEQ.ID.No.18的核苷酸序列组成；

-所述第一段序列由按照SEQ.ID.No.21的核苷酸序列组成，且所述第二段序列由按照SEQ.ID.No.20的核苷酸序列组成；

-所述第一段序列由按照SEQ.ID.No.23的核苷酸序列组成，且所述第二段序列由按照SEQ.ID.No.22的核苷酸序列组成；

-所述第一段序列由按照SEQ.ID.No.25的核苷酸序列组成，且所述第二段序列由按照SEQ.ID.No.24的核苷酸序列组成；

-所述第一段序列由按照SEQ.ID.No.27的核苷酸序列组成，且所述第二段序列由按照SEQ.ID.No.26的核苷酸序列组成；或

-所述第一段序列由按照SEQ.ID.No.29的核苷酸序列组成，且所述第二段序列由按照SEQ.ID.No.28的核苷酸序列组成；

-所述第一段序列由按照SEQ.ID.No.31的核苷酸序列组成，且所述第二段序列由按照SEQ.ID.No.30的核苷酸序列组成；

-所述第一段序列由按照SEQ.ID.No.33的核苷酸序列组成，且所述第二段序列由按照SEQ.ID.No.32的核苷酸序列组成；

-所述第一段序列由按照SEQ.ID.No.35的核苷酸序列组成，且所述第二段序列由按照SEQ.ID.No.34的核苷酸序列组成；

-所述第一段序列由按照SEQ.ID.No.37的核苷酸序列组成，且所述第二段序列由按照SEQ.ID.No.36的核苷酸序列组成；

-所述第一段序列由按照SEQ.ID.No.39的核苷酸序列组成，且所述第二段序列由按照SEQ.ID.No.38的核苷酸序列组成；

优选地，

-所述第一段序列由按照SEQ.ID.No.17的核苷酸序列组成，且所述第二段序列由按照SEQ.ID.No.16的核苷酸序列组成；或

在本发明第一和第二方面的实施方案中，所述核酸分子第一段序列和/或第二段序列包括许多在2’位处具有修饰，并形成规则的，优选地交替位置模式的被修饰核苷酸组，其中，在该序列中，每个被修饰核苷酸组在一端或两端都侧邻侧翼核苷酸的组，其中，形成侧翼核苷酸组的侧翼核苷酸是未修饰的核苷酸或具有与所述被修饰核苷酸的修饰不同的修饰的核苷酸。

在本发明第一和第二方面的实施方案中，所述核酸第一段序列和/或所述核酸第二段序列包括被修饰核苷酸组的模式和/或侧翼核苷酸组的模式。

在本发明第一和第二方面的实施方案中，所述核酸第一段序列和/或所述核酸第二段序列在3’末端包括二核苷酸，其中所述二核苷酸优选地是TT。

在本发明第一和第二方面的优选实施方案中，所述核酸第一段序列和/或所述核酸第二段序列的长度由19-21个核苷酸组成。

在本发明第一和第二方面的实施方案中，所述核酸第一和/或第二段序列在3’末端包括1-5个核苷酸的突出端。

在本发明第一和第二方面的优选实施方案中，所述核酸双链结构的长度是约16-24个核苷酸对，优选地，20-22个核苷酸对。

在本发明第一和第二方面的实施方案中，所述核酸第一链和所述核酸第二链彼此共价连接，优选地，所述第一链的3’末端共价连接于所述第二链的5’末端。

在本发明第一和第二方面的实施方案中，所述核酸分子由两条下列链的每一条组成，且其中其下划线的核苷酸是2’-O-甲基：

优选地，

在第三方面中，通过脂质体制剂解决了本发明待解决的问题，所述脂质体制剂包括按照第一或第二方面所述的核酸。

在第四方面中，通过脂质复合物(lipoplex)解决了本发明待解决的问题，所述脂质复合物包括按照第一或第二方面所述的核酸，和脂质体。

在本发明第四方面的优选实施方案中，所述脂质复合物的脂质体由下列各项组成：

a)约50摩尔％的β-精氨酰基-2，3-二氨基丙酸-N-棕榈基-N-油基-酰胺三盐酸，优选地，(β-(L-精氨酰基)-2，3-L-二氨基丙酸-N-棕榈基-N-油基-酰胺三盐酸)；

b)约48-49摩尔％的1，2-二植烷酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DPhyPE)；和

c)约1-2摩尔％的1，2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-聚乙二醇，优选地，N-(羰基-甲氧基聚乙二醇-2000)-1，2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺钠盐。

在本发明第四方面的更优选实施方案中，所述脂质复合物的ζ-电势是约35-60mV，优选地，约45-50mV。

在本发明第四方面的实施方案中，如通过QELS确定地，所述脂质复合物具有约50-400nm，优选地，约100-140nm，和更优选地，约110nm-130nm的尺寸。

在第五方面中，通过载体，优选地表达载体，解决了本发明待解决的问题，所述载体包括或编码按照第一和第二方面的核酸。

在第六方面中，通过细胞解决了本发明待解决的问题，所述细胞包括按照以上任一方面的核酸或按照以上任一方面的载体。

在第七方面中，通过组合物，优选地，药物组合物解决了本发明待解决的问题，所述组合物包括按照第一或第二方面的核酸、按照第三方面的脂质体制剂、按照第四方面的脂质复合物、按照第五方面的载体和/或按照第六方面的细胞。

在本发明第七方面的优选实施方案中，所述组合物是药物组合物，其任选地进一步包括药用赋形剂。

在本发明第七方面的更优选实施方案中，所述组合物是药物组合物，并且所述药物组合物用于治疗血管发生-依赖性疾病，优选地，由不足、异常或过度血管发生所表征或引起的疾病。

在本发明第七方面的最优选实施方案中，所述组合物的血管发生是脂肪组织、皮肤、心脏、眼睛、肺、肠、生殖器官、骨骼和关节的血管发生。

在本发明第七方面的实施方案中，疾病选自包括下列各项的组：传染病、自体免疫病症、血管畸形、动脉粥样硬化、移植动脉病、肥胖、银屑病、疣、变应性皮炎、玻璃体持续增生综合征(persistent hyperplastic vitroussyndrome)、糖尿病性视网膜病、早产儿视网膜病、与年龄相关的黄斑疾病、脉络膜新血管形成、原发性肺动脉高血压、哮喘、鼻息肉、炎性肠和牙周疾病、腹水、腹膜粘连、子宫内膜异位、子宫出血、卵巢囊肿、卵巢、卵巢过度刺激(ovarian hyperstimulation)、关节炎、滑膜炎、骨髓炎、骨赘形成。

在本发明第七方面的实施方案中，所述药物组合物用于治疗肿瘤疾病，优选地，癌症疾病，和更优选地，实体肿瘤。

在本发明第七方面的实施方案中，所述药物组合物用于治疗选自包括下列各项的组中的疾病：骨癌、乳腺癌、前列腺癌、消化系统癌症、结肠直肠癌、肝癌、肺癌、肾癌、泌尿生殖器癌、胰腺癌、垂体癌、睾丸癌、眶癌、头颈癌、中枢神经系统癌症和呼吸系统癌症。

在第八方面中，通过按照第一或第二方面的核酸，按照第三方面的脂质体制剂，按照第四方面的脂质复合物，按照第五方面的载体和/或按照第六方面的细胞用于制造药物的用途，解决了本发明待解决的问题。

在本发明第八方面的实施方案中，所述药物用于治疗如关于本发明第七方面所定义的任意疾病。

在本发明第八方面的优选实施方案中，所述药物与一种或数种其他治疗法联合使用。

在本发明第八方面的更优选实施方案中，所述治疗法选自包括下列各项的组：化学疗法、冷冻疗法、高热、抗体疗法、放射疗法和抗血管发生疗法。

在本发明第八方面的最优选实施方案中，所述治疗法是抗体疗法，和更优选地，是利用抗-VEGF抗体(诸如，例如，由基因技术-罗氏(Genentech-Roche)提供和以Avastin名称销售的)或抗-血管生成素抗体的抗体疗法。

在本发明第八方面的实施方案中，所述抗-血管发生疗法使用激酶受体抑制剂，优选地，酪氨酸激酶受体抑制剂，其中所述受体选自包括VEGF受体、PDGF受体、Tie-2、FGFR和EGFR的组。所述类型的抑制剂的实例是靶向VEGF-R和PDGF-R的Sorafenib(拜尔(Bayer))，和靶向EGFR的抗体Erbitux(默克(Merck)/serono)。认为这两种药物都是抗-血管发生药征。

在本发明第八方面的优选实施方案中，所述抑制剂选自包括下列各项的组：siRNA、反义分子、适体、spiegelmer、高亲和性结合肽、肽适体、抗促成素和抗体。

在第八方面的优选实施方案中，所述药物与一种或数种其他治疗法，优选地，抗-肿瘤或抗癌症治疗法组合使用。

在第八方面的更优选实施方案中，所述治疗法选自包括下列各项的组中：化学疗法、冷冻疗法、高热、抗体疗法和放射疗法。

在第八方面的甚至更加优选的实施方案中，所述治疗法是抗血管发生治疗法，且更优选地，利用抗-VEGF抗体或抗-血管生成素抗体的抗体疗法。

在本发明不同方面的进一步优选实施方案中，所述mRNA是人的PKN3的mRNA。在甚至更优选的实施方案中，所述靶核酸是具有按照SEQ.ID.No.1的核酸序列的mRNA。

如将要在本文中更详细概述地，所述核酸分子和分别含有所述核酸分子的药物和制剂特别适合于抑制、或预防或治疗侵入性癌症、积极性癌症和恶性肿瘤。

优选地用于本文时，侵入性癌症是扩散超过其发展的组织层并生长到周围的健康组织中的癌症。也称为渗透性癌症。

优选地用于本文时，积极性癌症是快速生长的癌症。

优选地用于本文时，恶性肿瘤是能够侵袭和破坏周围组织并扩散到身体其他部分的癌性肿瘤。

本领域技术人员承认，与具有SEQ.ID.No.1核苷酸序列的mRNA相比，在不同个体或个体组中，优选地，在种群中的mRNA中可能存在一个或数个单核苷酸改变。与具有SEQ.ID.No.1核酸序列的mRNA相比，所述具有一个或数个单核苷酸改变的mRNA，还应该包括在优选地在本文中使用的术语靶核酸内。在进一步的实施方案中，按照本发明不同方面的核酸分子适合于抑制PKN3以及对其进行编码的mRNA的表达。更优选地，所述表达受到被称为RNA干扰或转录后基因沉默的机制的抑制。因此按照本发明，siRNA分子和RNAi分子分别适合于触发RNA干扰反应，从而优选地导致关于靶分子的mRNA的击倒(knock down)。在这种情况下，这种类型的核酸分子适合于通过降低mRNA水平的表达而降低靶分子的表达。本领域技术人员应该承认，可能存在其他编码PKN3的mRNA，其应该也包括在本申请中。更特别地，基于本文所提供的技术教导，本领域技术人员能够在所述其他mRNA中确定由参考本文中SEQ.ID.No.1而确定的具体核苷酸位置。

还应该承认按照本发明该方面的双链核酸可以具有本文中关于这种类型核酸分子所述的任意设计。此外，应该承认上述机制在优选的实施方案中，关于不同方面和在本文中也称为亚-方面的设计原则，也能够应用于本文所公开的核酸。

RNA干扰指在动物中由短干扰RNA(siRNAs)介导的序列特异性转录后基因沉默过程(Fire等，1998)。植物中的相应过程普遍称为转录后基因沉默或RNA沉默，并且在真菌中也称为抑制(quelling)。认为转录后基因沉默过程是进化-保守的细胞防御机制，其用于阻止一般由不同的群和门共享的外源基因的表达(Fire，1998#263)。该避免外源基因表达的保护可能已经响应双链RNA(dsRNAs)的产生而进化，所述双链RNA(dsRNAs)源自病毒感染或是转座子元件通过细胞应答随机整合到宿主基因组中，其特异性破坏同源单链RNA或病毒基因组RNA。细胞中dsRNA的存在通过尚未得到完全表征的机制触发RNAi的应答。该机制，其还存在于动物细胞中，且具体地还存在于哺乳动物细胞中，似乎与干扰素应答不同，所述干扰素应答由dsRNA-介导的蛋白激酶PKR和2’，5’-寡腺苷酸合酶的活化引起，所述活化导致核糖核酸酶L对mRNA的非-特异性裂解。

siRNA分子或RNAi分子的基本设计，其主要区别于尺寸，基本上是这样的，其使所述核酸分子包括双链结构。该双链结构包括第一链和第二链。更优选地，所述第一链包括连续核苷酸的第一段序列，且所述第二段序列包括连续核苷酸的第二段序列。至少所述第一段序列和所述第二段序列基本上彼此互补。该互补性典型地基于沃森-克里克碱基配对或本领域技术人员已知的其他碱基配对机制，包括但不限于Hoogsteen碱基配对和其他。本领域技术人员应该承认，依赖于该双链结构的长度，不必然需要在碱基互补性方面的完美匹配。然而，在一些实施方案中，所述完美的互补性是优选的。在特别优选的实施方案中，互补性和/或同一性是至少75％、80％、85％、90％或95％。在备选的特别优选实施方案中，互补性和/或同一性是这样的，使互补的和/或相同的核酸分子在下列条件下，与按照本发明的核酸分子的一条链，更优选地，与这两序列之一杂交，所述条件是：能够在下述条件下与靶基因转录物的一部分杂交，所述条件是：400mMNaCl，40mM PIPES pH 6.4，1mM EDTA，50℃或70℃杂交12-16小时，随后清洗。各自的反应条件特别记述在欧洲专利EP 1 230 375中。

错配也是可以容忍的，大多数在这样的条件下，所述条件是双链结构仍然适合触发RNA干扰机制，且优选地该双链结构分别在细胞、组织和生物体中的主要生理条件下，仍然稳定地形成，所述生物体包含或者原则上含有该细胞、组织和器官。更优选地，该双链结构在生理缓冲液中，在37℃稳定。本领域技术人员还应该承认，这种类型的错配能够优选地包含于按照本发明的核酸分子中与核心区域不同的位置处。

优选地用于本文时，术语核酸分子或序列或其部分与靶核酸分子部分地互补，优选地，意指如果RNA干扰(介导)核酸直接或间接地靶向所述靶核酸，则所述靶核酸和所述核酸、其序列或部分之间的互补性，或由于该互补性形成的双链结构，能够触发RNA干扰。应该理解该互补性要求不受限于RNA干扰机制，而受限于任何导致分子诸如由靶核酸编码的多肽活性下调或降低的机制。在一个实施方案中，与另一个核酸分子部分互补的核酸分子包括1、2、3、4或5个基于两个核酸分子碱基配对的错配。更优选地，由此形成的双链核酸分子包括19-25个碱基对。

典型地，所述第一段序列至少部分地与靶核酸互补或至少部分地与靶核酸相同，并且，特别是考虑了所述第一和第二段序列之间关于碱基互补性方面的关系时，所述第二段序列至少部分地与靶核酸相同或至少部分地与靶核酸互补。所述靶核酸优选地是mRNA，尽管其他形式的RNA诸如hnRNAs也适合于本文所公开的核酸分子的目的。优选地用于本文时，所述靶标是PKN3，且更优选地，所述靶核酸是编码PKN3的DNA或RNA，或其一部分，条件是该部分仍然优选地至少具有全长PKN3起激酶作用的特征。

尽管依靠利用长核酸分子，能够观察到RNA干扰，较短的RNAi分子通常是优选的，所述长核酸分子分别包括数打和有时甚至数百个核苷酸和核苷酸对。所述第一段序列和/或第二段序列长度更优选的范围是约18-29个连续的核苷酸，优选地，19-25个连续的核苷酸，且更优选地，19-23个连续的核苷酸。更优选地，所述第一段序列和所述第二段序列二者具有相同的长度。在进一步的实施方案中，双链结构优选地包括16-29，优选地，18-25，更优选地，19-23，和最优选地，19-21个碱基对。

尽管按照本发明，原则上，编码PKN3的mRNA的任意部分能够分别用于设计所述siRNA分子和RNAi分子，本发明人惊讶地发现从具有SEQ.ID.NO.1核苷酸序列的SEQ.ID.NO.1的mRNA的核苷酸位置1555，1556，1559，1566，2094，2286处开始的序列特别适合于由RNA干扰介导分子的处理。

更特别地，本发明人惊讶地发现尽管这些序列和起始点是对PKN3的表达抑制特别优选的靶序列，但是在这些序列的附近存在核苷酸的中心，所述核苷酸的核心在这种情况下是特别有效的。在一个实施方案中，该核心是由以上特指的核苷酸序列的最后约9-11个核苷酸组成的序列。从其开始，该核心能够延伸，以获得具有功能活性的双链核酸分子，其中优选地，具有功能活性意指适合于影响PKN3的表达抑制。为了该目的，基本上与mRNA的相应部分，即核心序列相同的第二段序列因此在5’末端延长一个，优选地数个核苷酸，其中，这样添加的核苷酸与靶核酸中相应位置处存在的核苷酸基本相同。也为了该目的，基本上与靶核酸互补的第一链因此在3’末端延长一个，优选地数个核苷酸，其中，这样添加的核苷酸与靶核酸中相应位置处，即5’末端处存在的核苷酸基本互补。

按照该设计原则，能够将按照本发明的核心序列总结如下：

更优选地，在该表示法中，每个双链分子的上链是有义链，而下链是反义链，两条链均以5’-＞3’的方向表示。甚至更优选地，在有义链中，从第二个核苷酸开始，每隔一个核苷酸在2’位处被优选地修饰为2’-O-Me修饰的核苷酸，且在反义链中，从第一个核苷酸开始，每隔一个核苷酸在2’位处被优选地修饰为2’-O-Me修饰的核苷酸。在优选的实施方案中，能够在任何按照本发明的核酸分子上获得这种类型的修饰或规则的或空间的修饰模式。

在其进一步的实施方案中，所述核心序列与按照本发明的双链核酸分子的第二段序列的核苷酸序列相同，且第一段序列基本与其互补。在另一个优选的实施方案中，按照本发明的双链核酸分子的长度受到本文中关于不同的方面和亚-方面所分别公开的限制。

本领域技术人员应该承认，siRNA分子和RNAi分子的具体设计分别可以按照当前的和未来的设计原则而改变。暂时存在一些设计原则，以下会更加详细地讨论和公开所述原则，并且将其称为按照本发明的核酸分子的亚-方面或第一方面的亚-方面。在本发明的范围内，对于一个具体的亚方面，即核酸的设计所述的所有特征和实施方案也适合于按照本发明核酸的任何其他方面和亚-方面，并因此形成其各自的实施方案。

第一亚-方面涉及按照本发明的核酸，其中，第一段序列包括许多在2’位置处具有修饰的被修饰核苷酸组，其中，在该序列中，每个被修饰核苷酸组在一端或两端都侧邻侧翼核苷酸的组，其中，形成侧翼核苷酸组的侧翼核苷酸是未修饰的核苷酸或具有与所述被修饰核苷酸的修饰不同的修饰的核苷酸。该设计特别记述在国际专利申请WO 2004/015107中。如一些实施方案中所概述地，尽管按照该方面的核酸优选地是核糖核酸，但是，从纯化学的观点出发，2’位置处的修饰导致原来的核苷酸不再是核糖核苷酸。然而，在本发明范围内，应该将所述修饰的核糖核苷酸在本文中作为核糖核苷酸看待和处理，并且将含有所述修饰的核糖核苷酸的分子作为核糖核酸看待和处理。

在按照本发明第一亚-方面的核糖核酸的实施方案中，所述核糖核酸在双链结构的一侧或两侧都是平端的。在更优选的实施方案中，该双链结构包括或由18-25，优选地18-23，和更优选地，19、21或23个碱基对组成，其中所述双链结构优选地是平端的。在甚至更优选的实施方案中，核酸仅由所述第一段序列和所述第二段序列组成。

在按照本发明第一亚-方面的核糖核酸的另一个实施方案中，所述第一段序列和/或所述第二段序列包括许多被修饰的核苷酸组。在进一步优选的实施方案中，所述第一段序列还包括许多侧翼核苷酸组。在优选的实施方案中，许多组意指至少两组。

在按照本发明第一亚-方面的核糖核酸的另一个实施方案中，所述第二段序列包括许多被修饰的核苷酸组。在进一步优选的实施方案中，所述第二段序列还包括许多侧翼核苷酸组。在优选的实施方案中，许多组意指至少两个组。

在进一步优选的实施方案中，所述第一和第二段序列包括许多被修饰的核苷酸组和侧翼核苷酸的组。在更优选的实施方案中，所述许多被修饰的核苷酸组和侧翼核苷酸组在所述第一段序列和/或所述第二段序列上形成一种模式，优选地，规则的和/或重复的模式，其中更优选地，在所述第一和第二段序列上都形成该模式。

在按照本发明第一亚-方面的核糖核酸的优选实施方案中，被修饰的核苷酸组和/或侧翼核苷酸组包括许多核苷酸，其中该数量选自包括1个核苷酸-10个核苷酸的组。关于本文中所指定的任意范围，应该理解每个范围公开了用于定义该范围的各个数字之间的任意单个整数，包括该定义所述范围的两个数字。在该情形中，所述组因此包括一个核苷酸、二个核苷酸、三个核苷酸、四个核苷酸、五个核苷酸、六个核苷酸、七个核苷酸、八个核苷酸、九个核苷酸和十个核苷酸。

在按照本发明第一亚-方面的核糖核酸的另一个实施方案中，所述第一段序列的被修饰核苷酸的模式与所述第二段序列的被修饰核苷酸的模式相同。

在按照本发明第一亚-方面的核糖核酸的优选实施方案中，将所述第一段序列的模式与所述第二段序列的模式进行匹配(align)。

在按照本发明第一亚-方面的核糖核酸的备选实施方案中，所述第一段序列的模式相对于所述第二段序列的模式移动了一个或多个核苷酸。

在按照本发明第一亚-方面的核糖核酸的实施方案中，位于2’位处的修饰选自包括氨基、氟、甲氧基、烷氧基和烷基的组中。

在按照本发明第一亚-方面的核糖核酸的另一个实施方案中，所述双链结构是平端的。

在按照本发明第一亚-方面的核糖核酸的优选实施方案中，所述双链结构在双链结构的两侧都是平端的。

在按照本发明第一亚-方面的核糖核酸的另一个实施方案中，所述双链结构在双链结构的一个侧端是平端的，所述侧端是由所述第一链的5’末端和所述第二链的3’末端定义的。

在按照本发明第一亚-方面的核糖核酸的另一个实施方案中，所述双链结构在双链结构的一个侧端是平端的，所述侧端是由所述第一链的3’末端和所述第二链的5’末端定义的。

在按照本发明第一亚-方面的核糖核酸的另一个实施方案中，所述两条链中的至少一条在5’末端处具有至少一个核苷酸的突出端。

在按照本发明第一亚-方面的核糖核酸的优选实施方案中，所述突出端由至少一个脱氧核糖核苷酸组成。

在按照本发明第一亚-方面的核糖核酸的另一个实施方案中，至少一条所述链在3’末端处具有至少一个核苷酸的突出端。

在第一亚-方面的核糖核酸的实施方案中，所述双链结构的长度是约17-23，和更优选地18或19个碱基或碱基对。

在第一亚-方面的核糖核酸的另一个实施方案中，所述第一链的长度和/或所述第二链的长度彼此独立地选自包括下列范围的组中的一种范围：约15-约23个碱基，17-21个碱基，和18或19个碱基或碱基对，和更优选地，19、21或23个碱基对。

在按照本发明第一亚-方面的核糖核酸的优选实施方案中，所述第一链和所述靶核酸之间的互补性是完美的。

在按照第一亚-方面的核糖核酸的实施方案中，在所述第一链和所述靶核酸之间形成的双链体(duplex)包括至少15个核苷酸，其中在形成所述双链结构的所述第一链和靶核酸之间存在一处错配或两处错配。

在按照第一亚-方面的核糖核酸的实施方案中，所述第一链和所述第二链都包括至少一个被修饰的核苷酸组和至少一个侧翼核苷酸组，其中每个被修饰的核苷酸组包括至少一个核苷酸，且其中每个侧翼核苷酸组包括至少一个核苷酸，其中所述第一链的每个被修饰核苷酸组与所述第二链的侧翼核苷酸组进行比对，其中所述第一链的最末端的5’核苷酸是被修饰核苷酸组中的核苷酸，且所述第二链的最末端的3’核苷酸是侧翼核苷酸组中的核苷酸。

在按照第一亚-方面的核糖核酸的优选实施方案中，每个被修饰的核苷酸组由单核苷酸组成，和/或每个侧翼核苷酸组由单核苷酸组成。

在按照第一亚-方面的核糖核酸的另一个实施方案中，在所述第一链上形成侧翼核苷酸组的核苷酸是未修饰的核苷酸，相对于形成被修饰核苷酸组的核苷酸，其以3’方向排列，且其中在所述第二链上形成被修饰核苷酸组的核苷酸是被修饰的核苷酸，相对于形成侧翼核苷酸组的核苷酸，其以5’方向排列。

在按照第一亚-方面的核糖核酸的另一个实施方案中，所述第一链包括8-12个，优选地9-13个被修饰的核苷酸组，且其中所述第二链包括7-13个，优选地8-10个被修饰的核苷酸组。

在本发明中，以上指定的也分别适用于所述第一和第二链。这对于其中所述链仅由所述序列组成的那些实施方案是特别正确的。

可以将按照该第一亚-方面的核糖核酸分子设计为在所述第一链处具有游离的5’羟基基团，本文中也称为游离的5’OH-基团。游离5’OH-基团意指形成所述第一链的最末端的核苷酸是存在的且因此未被修饰，特别是没有由末端修饰而修饰。典型地，所述第二链的末端5’-羟基基团也分别以未修饰的方式存在。在更优选的实施方案中，所述第一链和第一段序列的3’末端也分别是未修饰的，例如其中存在游离OH-基团，本文中也将其称为游离3’OH-基团，其中5’末端核苷酸的设计是前述任意实施方案之一。优选地，所述游离OH-基团也分别存在于所述第二链和第二段序列的3’末端。在如先前按照本发明所述的核糖核酸分子的其他实施方案中，所述第一链和第一段序列的3’末端，分别地，和/或所述第二链和第二段序列的3’末端，分别地，可以在3’末端具有末端修饰。

当用于本文时，术语游离5’OH-基团和3’OH-基团还分别表示在形成双链结构的多核苷酸，即分别地，所述核酸或链或序列的5末端和3’末端处最末端的核苷酸存在OH-基团。所述OH-基团可以来自核苷酸的糖部分，更优选地，在5’OH-基团的情形中来自5’位和/或在3’OH-基团的情形中来自3’位，或来自附着在各个末端核苷酸的糖部分上的磷酸酯基团。磷酸酯基团原则上可以附着于核苷酸糖部分的任意OH-基团。优选地，在游离5’OH-基团的情形中，该磷酸酯基团附着于糖部分的5’OH-基团，和/或在游离3’OH-基团的情形中，其附着于糖部分的3’OH-基团，仍然提供在本文称为游离5’OH-基团或3’OH-基团的基团。

与第一亚-方面的任意实施方案一起用于本文时，术语末端修饰意指向所述第一和/或第二链最5’或3’核苷酸添加的化学实体。所述末端修饰的实例包括，但不限于，反向的(脱氧)无碱基(abasic)、氨基、氟、氯、溴、CN、CF、甲氧基、咪唑、羧酸酯、thioate、C₁-C₁₀低级烷基、取代的低级烷基、烷芳基或芳烷基、OCF₃、OCN、O-、S-、或N-烷基；O-，S-或N-链烯基；SOCH₃；SO₂CH₃；ONO₂；NO₂，N₃；杂环烷基(heterozycloalkyl)；杂环烷芳基(heterozycloalkaryl)；氨基烷基氨基；聚烷基氨基或取代的甲硅烷基，特别如欧洲专利EP 0 586 520 B1或EP 0 618 925 B1中所述。

用于本文时，烷基或任何包括“烷基”的术语意指包括1-12，优选地1-6和更多个，优选地1-2个C原子的任何碳原子链。

另一种末端修饰是生物素基团。所述生物素基团可以优选地附着于所述第一和/或第二链的最5’或最3’核苷酸，或附着于两末端。在更优选的实施方案中，生物素基团与多肽或蛋白质偶联。所述多肽或蛋白质通过任何其他上述末端修饰附着也属于本发明的范围。该多肽或蛋白质可以为本发明的核酸分子赋予进一步的特征。其中，该多肽或蛋白质可以起到另一种分子的配体的作用。如果所述另一种分子是受体，则该受体的功能和活性可以由结合配体激活。该受体可以显示出内在化活性，内在化活性容许与配体结合的本发明核酸分子的有效转染。关于与本发明核酸分子偶联的配体的实例是VEGF，且相应的受体是VEGF受体。

下表1中显示了具有不同类型末端修饰的本发明RNAi的多种可能的实施方案。

表1：按照本发明的干扰核糖核酸的多种实施方案

如本文中所公开的多种末端修饰优选地位于核糖核酸的核苷酸的核糖部分。更特别地，该末端修饰可以附着于或替代核糖部分的任意OH-基团，包括但不限于2’OH、3’OH和5’OH位，条件是如此修饰的核苷酸是末端核苷酸。反向无碱基(inverted abasic)是核苷酸，即脱氧核糖核苷酸或不具有核碱基(nucleobase)部分的核糖核苷酸。这种类型的化合物特别记述在(Sternberger等，2002)中。

任何上述末端修饰可以关于表1中描述的多种RNAi实施方案使用。与此相关地应该指出，本文中公开的任何RNAi形式或实施方案，RNAi的有义链被失活，优选地通过具有末端修饰，更优选地在5’末端处具有末端修饰而失活，是特别有益的。这是由于与这里所述的核糖核酸的第二链相对应的有义链的失活，它可能反过来干扰细胞中的无关的单链RNA。这样，更特异性地影响细胞的转录组的表达和更具体的其翻译模式。该影响也称作脱靶(off-target)效应。参考表1，作为实施方案7和8进行说明的那些实施方案在上述意义上是特别有益的，因为该修饰导致RNAi(其为所述第二链)的-靶标非特异性部分-失活，这样减少了第二链与在细胞系统或类似系统中的单链RNA的任何非特异性相互作用，在所述系统中，按照本发明的RNAi将分别用于击倒特异性核糖核酸和蛋白质。

在另一个实施方案中，按照第一亚-方面的核酸在核糖核酸的5’末端处具有突出端。更特别地，该突出端原则上可以存在于按照本发明的核糖核酸的第一链和第二链之一或二者上。所述突出端的长度可以是短到1个核苷酸，和长到2-8个核苷酸，优选地，2、4、6或8个核苷酸。5′突出端可以位于本发明所述的核糖核酸的第一链和/或第二链上，也在本发明的范围内。形成突出端的核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或其延长部分。

所述突出端优选地包括至少一个脱氧核糖核苷酸，其中所述一个脱氧核糖核苷酸优选地是最5’-末端的那个。本发明还包括，本发明核糖核酸的各自的反-链(counter-strand)的3’-末端不具有突出端，更优选地，不具有脱氧核糖核苷酸突出端。再者，任何本发明的核糖核酸可以包含关于表1中列出的末端修饰方案和/或本文列出的末端修饰。。

考虑该连续的核苷酸序列，可以在实施方案中获得形成该序列的模式，优选地，规则和/或重复的核苷酸修饰模式，抑制单核苷酸或通过标准磷酸二酯键或，至少部分地，通过硫代磷酸酯键彼此共价连接的核苷酸组显示出这种类型的修饰。如果所述核苷酸或本文中还称为被修饰的核苷酸组的核苷酸组不形成所述序列的5’-末端或3’末端，则核苷酸或核苷酸组紧跟着(follow on)这样的核苷酸的两侧，所述这样的核苷酸不具有前面的核苷酸或核苷酸组的修饰。然而，注意到，这种类型的核苷酸或核苷酸组可以具有不同的修饰。本文中还将这种类型的核苷酸或核苷酸组称为侧翼核苷酸组。分别地，被修饰的核苷酸和被修饰的核苷酸组，和未修饰的或被区别性修饰的核苷酸或未修饰的或区别性修饰的核苷酸组的序列可以重复一次或数次。优选地，该序列重复多于一次。为了清楚的原因，以下更加详细地讨论了该模式，通常参考被修饰的核苷酸组或未修饰的核苷酸组，其中每个所述组实际上可以包括少至单个核苷酸。未修饰的核苷酸用于本文时，意指在形成各自的核苷酸或核苷酸组的核苷酸处不具有任何上述修饰，或具有分别与被修饰的核苷酸和核苷酸组的修饰不同的修饰。

本发明还包括未修饰的核苷酸的修饰，其中这样的未修饰的核苷酸实际上是以与修饰的核苷酸的修饰不同的方式修饰，所述未修饰的核苷酸的修饰可以与形成所述的未修饰的核苷酸的各种核苷酸或各种侧翼核苷酸组的修饰相同或甚至不同。

修饰的和未修饰的核苷酸的模式可以是这样的，即所述链或所述序列的5’-末端核苷酸起始于修饰的核苷酸组，或起始于未修饰的核苷酸组。然而，在备选的实施方案中，还可能通过未修饰的核苷酸组形成5’-末端核苷酸。

这种类型的模式可以在干扰RNA的第一段序列或第二段序列之一或二者上实现。必须注意到，siRNA双链体的靶标-互补链上的5’磷酸酯对于siRNA的功能是必需的，这提示细胞通过游离5’OH(能够对其进行磷酸化)检验siRNA的真实性，并仅容许所述真实的siRNA指导靶RNA的破坏(Nykanen等，2001)。

优选地，所述第一段序列显示出修饰的和未修饰的核苷酸组，即被修饰的核苷酸组和侧翼核苷酸组的模式类型，而所述第二段序列没有显示出这种类型的模式或完全不显示任何模式。在这种情况下，这可能是有用的，因为所述第一段序列实际上对于靶标-特异性降解过程更重要，所述靶标-特异性降解过程解释了RNA的干扰现象，因此，为了特异性的原因，可以对所述第二段序列进行化学修饰，以使其不具有介导RNA干扰的功能。

然而，本发明还包括，所述第一段序列和第二段序列都具有这种类型的模式。优选地，对于所述第一链和所述第二链，该修饰和非-修饰模式相同。

在一个优选实施方案中，形成第二段序列且与第一段序列的核苷酸的修饰组对应的核苷酸组也是被修饰的，而形成第二段序列或第二段序列的未修饰的核苷酸组与形成第一段序列或第一段序列的未修饰的核苷酸的组对应。另外备选的是第一段序列和第一链各自的修饰模式相对于第二段序列和第二链各自的修饰模式存在相位移动。优选地，该移动是这样的，以使第一链的修饰的核苷酸的组与第二链的未修饰的核苷酸的组对应，且反之亦然。本发明还包括，修饰模式的相位移动不是完整的而是重叠的。

在优选的实施方案中，分别位于所述链和序列末端处的第二个核苷酸是未修饰的核苷酸或未修饰核苷酸组的开始。优选地，该未修饰的核苷酸或未修饰的核苷酸组分别位于所述第一和第二链的5’-末端，和甚至更优选地，第一链的5’-末端。在进一步优选的实施方案中，所述未修饰的核苷酸或未修饰的核苷酸组分别位于所述第一链和第一段序列的5’-末端。在优选的实施方案中，该模式由交替的单个修饰的和未修饰的核苷酸组成。

在本发明该方面的进一步优选实施方案中，干扰核糖核酸对象包括两条链，其中2′-O-甲基修饰的核苷酸和未修饰的核苷酸，优选地是非2′-O-甲基修饰的核苷酸，以交替的方式结合在两链上，这意味着每隔一个核苷酸分别是2’-O-甲基修饰的和非-修饰的核苷酸。这意指在所述第一链上，一个2’-O-甲基修饰的核苷酸后面是非-修饰的核苷酸，其又接着是2’-O-甲基修饰的核苷酸，等等。在所述第二链上存在相同的2’-O-甲基修饰和非-修饰序列，其中优选地存在相位移动，这样在所述第一链上的2’-O-甲基修饰的核苷酸与所述第二链上的非-修饰的核苷酸碱基配对，且反之亦然。该特殊安排，即在两条链上的2’-O-甲基修饰的和未修饰的核苷酸的碱基配对，在短干扰核糖核酸，即短碱基配对的双链核糖核酸的情形中是特别优选的，因为尽管本发明人不希望受到该理论的限制，仍然假定了在两个碱基-配对的2’-O-甲基修饰的核苷酸之间存在某种斥力，这会使双链体，优选地，短双链体不稳定。关于该特殊的安排，优选地是如果反义链起始自位于5’末端的2’-O-甲基修饰的核苷酸，其中第二个核苷酸因此是非-修饰的，则第三、第五、第七等核苷酸因此也是2’-O-甲基修饰的，而第二、第四、第六、第八等核苷酸是非-修饰的核苷酸。此外，不希望受到任何理论的限制，似乎在不应该包含任何修饰的反义链的5′末端处的第二个和任选的第四、第六、第八个和/或相似位置是特别重要的，而反义链的最5′末端核苷酸，即第一个5′末端核苷酸可以在任何奇数位存在这样的修饰，例如反义链上第一个、任选的第三、第五和相似位置可以被修饰。在另一个实施方案中，修饰的和非-修饰的核苷酸各自的修饰和非-修饰分别可以是本文中所述的任一种。在更特定的实施方案中，按照本发明的双链核酸分子由19、21或23个连续核苷酸的第一链和19、21或23个连续核苷酸的第二链组成，其中所述第一链和所述第二链基本彼此互补。此外，在所述更特定的实施方案中，该双链结构在两个末端都是平端的。基本与靶核酸，即编码PKN3的mRNA互补的第一链在5’末端起始于这样的核苷酸，即，该核苷酸在2’OH基团处被甲基化，从而形成2’O-Me基团。该第一链的每隔一个核苷酸具有相同的修饰，即在2’OH基团处对其进行甲基化。因此，以该方式修饰所述第一链的第一、第三、第五等，即任何奇数核苷酸位置。所述第一链偶数位置处的核苷酸是非-修饰的核苷酸或修饰的核苷酸，其中该修饰与位于所述第一链奇数核苷酸位置处的核苷酸修饰不同。所述第二链，其也优选地包括19、21或23个核苷酸，在第二、第四、第六等，即任何偶数核苷酸位置处具有被修饰的核苷酸。任何其他核苷酸是非-修饰的核苷酸或修饰的核苷酸，其中该修饰与位于所述第一链偶数核苷酸位置处的核苷酸修饰不同。因此，在以上理解下，所述第二链在5’末端起始于非-修饰核苷酸。在更优选的实施方案中，所述第一和第二链的被修饰核苷酸的修饰是相同的，且所述第一和第二链的非-修饰核苷酸的修饰也相同。在优选的实施方案中，反义链，即所述第一链的5’末端具有OH-基团，其优选地可以在细胞中，优选地，在靶细胞中，被磷酸化，其中本发明的核酸分子应该是活性的或功能性的，或具有磷酸酯基团。优选地，还修饰了有义链，即所述第二链的5’末端，更优选地，如本文所公开地修饰。在实施方案中，3’末端任一或二者都具有末端的磷酸酯。

本发明包括，通过两条单独的链，即所述第一和第二链，形成了双链结构。然而，本发明还包括所述第一链和第二链彼此共价连接。该连接可以发生在分别形成所述第一链和第二链的任意核苷酸之间。然而，优选地，使这两条链之间的连接靠近双链结构的一个或两个末端。该连接可以通过共价的或非-共价的连接形成。共价连接可以通过以化合物将两条链一次或数次和在数个位置分别地连接形成，所述化合物选自包括亚甲基蓝和双官能团的组。所述双官能团优选地选自包括双(2-氯乙基)胺，N-乙酰基-N’-(对-乙醛酰苯甲酰基)胱胺，4-硫尿嘧啶和补骨脂素的组。

在按照本发明任意第一亚-方面的核糖核酸的另一个实施方案中，所述第一链和第二链通过环结构连接。

在按照本发明第一亚-方面的核糖核酸的优选实施方案中，所述环结构包括非-核酸聚合物。

在其优选的实施方案中，所述非-核酸聚合物是聚乙二醇。

在按照本发明任意第一亚-方面的核糖核酸的实施方案中，所述第一链的5’-末端与所述第二链的3’-末端相连接。

在按照本发明任意方面的核糖核酸的另一个实施方案中，所述第一链的3’-末端与所述第二链的5’-末端相连接。

在实施方案中，所述环由核酸组成。用于本文时，认为如Elayadi和Corey(Elayadi等，2001)；(Orum和Wengel，2001)所述的LNA；以及PNA是核酸，且还可以作为形成聚合物的环来使用。基本上，所述第一链的5’-末端可以与所述第二链的3’-末端相连接。作为备选地，所述第一链的3’-末端可以与所述第二链的5’-末端相连接。通常不认为形成所述环结构的核苷酸序列是关键的。然而，形成所述环的核苷酸序列的长度似乎由于空间排列的原因是关键的。因此，四个核苷酸的最短长度似乎适于形成所需要的环结构。原则上，在待杂交的两序列或两条链之间形成铰合部或连接的核苷酸的最大数量是不受限制的。然而，多核苷酸越长，二级和三级结构越容易形成，并且从而影响需要的序列定向。优选地，形成铰合部的核苷酸最多数量是约12个核苷酸。本申请公开的内容包括，任意上述设计可以分别与在本文中公开的和本领域已知的任意其他设计组合，即以能通过环结构或类似结构产生后折叠(back folding)的方式共价地连接两条链。

本发明人惊讶地发现如果该环位于反义链，即按照本发明的核糖核酸的第一链的3’，则这种类型的RNAi的活性比将环置于反义链的5′端更高。因此，分别相对于反义链和有义链，即第一链和第二链的特殊环排列是至关重要的，并且因此与如现有技术中所表达的理解相反，在现有技术中认为方向是无关的。但是，根据这里所述的实验结果，这好像是错误的。现有技术中所表达的理解基于这样的假设，即在加工任何RNAi的过程中产生非环连接的RNAi。但是，如果这是正确的，就不能解释清楚地观察到的具有位于反义链的3′的环的那些结构的增加的活性。迄今为止，在这种小的干扰RNAi的5′→3′方向的优选排列是：第二链-环-第一链。可以将各自的构建体引入到合适的载体系统中。优选地，所述载体包括用于表达RNAi的启动子。优选地，各自的启动子是pol III，且更优选地，所述启动子是如Good等(Good等，1997)中所述的U6、H1、7SK启动子。

本发明第一方面的第二亚-方面涉及按照本发明的核酸，其中所述第一段序列和/或第二段序列在3’末端包括二核苷酸，其中所述二核苷酸优选地是TT。在优选的实施方案中，所述第一段序列/或第二段序列的长度由19或21或23个核苷酸组成，且更优选地，双链结构包括18-22个，和更优选地，19-21个碱基对。按照该亚-方面的核酸的设计更加详细地记述在，例如国际专利申请WO 01/75164中。

本发明第一方面的第三亚-方面涉及按照本发明的核酸，其中所述第一和/或第二段序列在3’末端包括1-5个核苷酸的突出端。按照该亚-方面的核酸的设计更加详细地记述在国际专利申请WO 02/44321中。更优选地，所述突出端是核糖核酸。在优选的实施方案中，如本文所定义的每条链和更优选地每个序列具有19-25个核苷酸的长度，其中更优选地，所述链由所述序列组成。在优选的实施方案中，按照本发明的核酸的双链结构包括17-25个碱基对，优选地19-23个碱基对，更优选地19、21或23个碱基对。

本发明第一方面的第四亚-方面涉及按照本发明的核酸，其中所述第一和/或第二段序列在3’末端包括1-5个核苷酸的突出端。按照该亚-方面的核酸的设计记述在WO 02/44321中。

在本发明第一方面的第五亚-方面中，按照本发明的核酸是双链核酸，其为化学合成的双链短干扰核酸(siNA)分子，该分子指导CD31mRNA的裂解，优选地通过RNA干扰进行，其中所述siNA分子的每条链是18-27或19-29个核苷酸的长度，并且所述siNA分子包括至少一个化学修饰的核苷酸非-核苷酸。按照该亚-方面的核酸的设计更加详细地记述在国际专利申请WO 03/070910和英国专利2 397 062中。

在它的一个实施方案中，siNA分子不包括核糖核苷酸。在另一个实施方案中，siNA分子包括一个或多个核苷酸。在另一个实施方案中，化学修饰的核苷酸包括2’-脱氧核苷酸。在另一个实施方案中，化学修饰的核苷酸包括2’-脱氧-2’-氟核苷酸。在另一个实施方案中，化学修饰的核苷酸包括2’-O-甲基核苷酸。在另一个实施方案中，化学修饰的核苷酸包括硫代磷酸酯核苷酸间连接。在进一步的实施方案中，所述非-核苷酸包括无碱基部分，其中优选地，该无碱基部分包括反向脱氧无碱基部分。在另一个实施方案中，非-核苷酸包括甘油基部分。

在进一步的实施方案中，所述第一链和第二链通过连接体分子相连接。优选地，该连接体分子是多核苷酸连接体。备选地，该连接体分子是非-核苷酸连接体。

在按照第五亚-方面的核酸的进一步实施方案中，所述第二链中的嘧啶核苷酸是2’-O-甲基嘧啶核苷酸。

在按照第五亚-方面的核酸的进一步实施方案中，所述第二链中的嘌呤核苷酸是2’-脱氧嘌呤核苷酸。

在按照第五亚-方面的核酸的进一步实施方案中，所述第二链中的嘧啶核苷酸是2’-脱氧-2’-氟嘧啶核苷酸。

在按照第五亚-方面的核酸的进一步实施方案中，所述第二链在5’末端、3’末端或5’末端和3’末端两处包括末端帽部分。

在按照第五亚-方面的核酸的进一步实施方案中，所述第一链中的嘧啶核苷酸是2’-脱氧-2’-氟基嘧啶核苷酸。

在按照第五亚-方面的核酸的进一步实施方案中，所述第一链中的嘌呤核苷酸是2’-O-甲基嘌呤核苷酸。

在按照第五亚-方面的核酸的进一步实施方案中，所述第一链中的嘌呤核苷酸是2’-脱氧嘌呤核苷酸。

在按照第五亚-方面的核酸的进一步实施方案中，所述第一链在第一链的3’末端处包括硫代磷酸酯核苷酸间连接。

在按照第五亚-方面的核酸的进一步实施方案中，所述第一链在第一链的3’末端处包括甘油基修饰。

在按照第五亚-方面的核酸的进一步实施方案中，所述第一和第二链的约19-23个核苷酸是碱基-配对的，且其中优选地，siNA分子每条链的至少两个3’末端核苷酸不与另一条链的核苷酸碱基-配对。优选地，siNA分子每条链的这两个3’末端核苷酸中的每一个均是2’-脱氧-嘧啶。更优选地，所述2’-脱氧-嘧啶是2’-脱氧-胸腺嘧啶核苷。

在按照第五亚-方面的核酸的另一个方面中，所述第一链的5’末端包括磷酸酯基团。

在按照本发明核酸的第五亚-方面的一个具体实施方案中，本发明的siNA分子在维持介导RNAi能力的同时，包括被修饰的核苷酸。所述被修饰的核苷酸能够用于改善体外或体内特征，诸如稳定性、活性和/或生物利用率。例如，本发明的siNA分子能够按照siNA分子中存在的总核苷酸数量的百分比，包含被修饰的核苷酸。这样，本发明的siNA分子通常能够包括约5％-约100％的被修饰核苷酸(例如，5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的被修饰的核苷酸)。给定的siNA分子中存在的被修饰核苷酸的实际百分比应该依赖于siNA中存在的核苷酸总数。如果该siNA分子是单链的，则修饰百分比能够基于单链siNA分子中存在的核苷酸总数。同样地，如果siNA分子是双链的，则修饰百分比可以基于有义链、反义链或有义和反义链二者中存在的核苷酸总数。

在非-限制性实例中，将化学-修饰的核苷酸引入到按照本发明的核酸第五亚-方面的具体核酸分子中，为克服外源性递送的天然RNA分子所固有的体内稳定性和生物利用率的潜在局限性提供有力工具。例如，对于指定的治疗效果，使用化学-修饰的核酸分子可以允许较低剂量的特殊核酸分子，因为化学-修饰的核酸分子在血清中倾向于具有较长的半衰期。此外，某些化学修饰可以通过靶向特定的细胞或组织和/或改善核酸分子的细胞吸收而改善核酸分子的生物利用率。因此，即使与天然核酸分子相比，例如，当与全-RNA核酸分子相比较时，化学-修饰的核酸分子的活性降低了，但是，修饰的核酸分子的总体活性由于改善的分子稳定性和/或递送，可以高于天然分子的活性。与天然未修饰的siNA不同，化学-修饰的siNA还可以在人体中使活化干扰素活性的可能性最小化。

优选地，关于按照本发明的核酸的第五亚-方面，本发明siNA分子的反义链，即第一链能够在所述反义区域的3’-末端处包括硫代磷酸酯核苷酸间连接。该反义链可以在所述反义区域的5’-末端处包括约1-约5个硫代磷酸酯核苷酸间连接。本发明siNA分子的3’-末端核苷酸突出端可以包括在核酸糖、碱基或主链处化学-修饰的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。该3’-末端核苷酸突出端可以包括一个或多个通用碱基核糖核苷酸。该3’-末端核苷酸突出端可以包括一个或多个无环核苷酸。

本领域技术人员应该承认，具体地，本发明的实施方案，其包括由核苷酸构成的环，适合于通过载体使用和表达。优选地，所述载体是表达载体。所述表达载体在任何基因治疗方法中特别有效。因此，所述载体可以用于制备能够优选地用于治疗本文所公开的疾病的药物。然而，本领域技术人员还应该承认，任何按照本发明的核酸的实施方案，其包括任何非-天然存在的修饰，不能立即用于在载体和关于该载体的表达系统诸如细胞、组织、器官和生物体中表达。然而，在本发明中，典型地，在通过载体进行核酸表达后，可以将修饰添加或引入到按照本发明的载体来源的或载体表达的核酸中。特别优选的载体是质粒载体或病毒载体。例如，对于如何在表达载体中使用siRNA分子和RNAi分子的技术教导记述在国际专利申请WO 01/70949中。本领域技术人员应该承认，优选地，所述载体在任何治疗或诊断方法中有效，其中按照本发明的核酸的持续存在分别是理想和有效的，而按照本发明的非-载体核酸和具体地按照本发明化学修饰或化学合成的核酸是特别有效的，其中该分子的短暂存在是理想或有效的。

用于合成本文所述的核酸分子的方法是本领域技术人员已知的。所述方法特别记述在(Caruthers等，1992)，Thompson等，国际PCT公开号WO99/54459，(Wincott等，1995)，(Wincott和Usman，1997)，Brennan等，1998，生物技术和生物工程(Biotechnol Bioeng.)，61，33-45，和Brennan，美国专利号6,001,311中。将全部这些参考文献引入本文作为参考。

在另一个方面，本发明涉及脂质体制剂，其包括且更特别地包含一种或数种按照本发明的核酸分子。优选地，所述脂质体制剂由定义内部体积的脂质组成。所述内部体积优选地包含本发明的核酸分子。更优选地，所述制剂包括脂质体，其中在优选的实施方案中，所述脂质体包括或包含一种或数种阳离子脂质。在最优选的实施方案中，所述脂质体制剂包含一种或数种本发明的核酸分子，这样在脂质体外表面处或其上不能检测到或不存在所述核酸分子。优选地用于本文时，所述脂质体的外表面是与该脂质体周围环境相接触的脂质体表面，特别地跟与由该脂质体包含的脂质相接触的脂质体表面相反。在特别优选的实施方案中，分别通过所述脂质体和脂质体制剂或在所述脂质体和脂质体制剂中包装或包封按照本发明的核酸分子。

本发明进一步的方面涉及脂质复合物，其包括按照本发明的核酸，其中所述脂质复合物由一个和数个核酸分子和一个或数个脂质体组成。在优选的实施方案中，脂质复合物由一个脂质体和数个核酸分子组成。

可以将脂质复合物表征如下。按照本发明的脂质复合物具有约40-55mV的ζ-电势，优选地，约45-50mV的ζ-电势。如通过动态光散射(QELS)，诸如例如通过按照供应商的建议，利用来自贝克曼库尔特(BeckmanCoulter)的N5超细颗粒尺寸分析器所确定地，按照本发明的脂质复合物为大小约80-200nm，优选地，约100-140nm，和更优选地，约110nm-130nm。

作为形成按照本发明的脂质复合物一部分的脂质体优选地是带正电的脂质体，其由下列各项组成：

a)约50摩尔％的β-精氨酰基-2，3-二氨基丙酸-N-棕榈基-N-油基-酰胺三盐酸，优选地，(β-(L-精氨酰基)-2，3-L-二氨基丙酸-N-棕榈基-N-油基-酰胺三盐酸；

优选地，脂质复合物和形成脂质体的脂质组合物包含在载体中。然而，脂质复合物还可以以冻干的形式存在。载体中包含的脂质组合物通常形成分散体。更优选地，如本文中进一步表征地，所述载体是水性介质或水溶液。该脂质组合物典型地在载体中形成脂质体，其中优选地，该脂质体也在内部包含所述载体。

载体中包含的脂质组合物和载体分别优选地具有约50-600mosmole/kg，优选地，约250-350mosmole/kg，和更优选地，约280-320mosmole/kg的摩尔渗透压浓度。

优选地由第一脂质成分和任选地还由第一辅助脂质，优选地与第一脂质成分结合形成的脂质体优选地表现出约20-200nm，优选地，约30-100nm，和更优选地，约40-80nm的颗粒大小。

此外，应该承认该颗粒大小符合某种统计学分布。

按照本发明的脂质组合物的另一种任选的特性是载体的pH优选为约4.0-6.0。然而，其他pH范围诸如4.5-8.0，优选地约5.5-7.5和更优选地约6.0-7.0也属于本发明的范围。

为了认识这些特定的特性，进行了不同的测量。对于调节摩尔渗透压浓度，例如，一种糖或多种糖的组合是特别有效的。在该情况下，本发明的脂质组合物可以包括一种或数种下列糖：蔗糖、海藻糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、麦芽糖、乳酮糖、菊粉和棉子糖，其中，蔗糖、海藻糖、菊粉和棉子糖是特别优选的。在特别优选的实施方案中，主要通过添加糖来调节的摩尔渗透压浓度是约300mosmole/kg，这对应于270mM的蔗糖溶液或280mM的葡萄糖溶液。优选地，载体与被施用了所述脂质组合物的体液等渗。用于本文时，术语摩尔渗透压浓度主要通过添加糖来调节意指至少约80％，优选地至少约90％的摩尔渗透压浓度由所述糖或所述糖的组合提供。

如果本发明的脂质组合物的pH受到调节，则这是通过利用本身为本领域技术人员基本已知的缓冲物质实现的。优选地，使用了碱性物质，其适合于补偿阳离子脂质和更特别地，阳离子头部基团的铵基团的碱性特征。当添加碱性物质诸如分别地，碱性氨基酸和弱碱时，要考虑上述摩尔渗透压浓度。优选地，所述脂质组合物和由所述脂质组合物形成的脂质体的颗粒大小是通过动态光散射，诸如通过按照供应商的建议，利用来自贝克曼库尔特(Beckman Coulter)的N5超细颗粒大小分析器来确定的。

如果脂质组合物包含一个或数个核酸，则该脂质组合物通常形成脂质复合物，即由脂质体和核酸组成的复合物。脂质复合物中总脂质含量在优选地等渗270mM蔗糖或280mM葡萄糖中的更优选浓度是约0,01-100mg/ml，优选地0.01-40mg/ml和更优选地0.01-25mg/ml。应该承认，典型地，可以增高该浓度2-3倍，从而制备合理的储液。本发明还包括，基于此，制备了稀释液，其中典型地将所述稀释液这样制备从而使摩尔渗透压浓度属于以上指定的范围。更优选地，在载体中制备稀释液，所述载体等同于或在功能和更特别地摩尔渗透压浓度方面类似于与脂质组合物联合使用的或其中包含脂质组合物的载体。在本发明脂质组合物的实施方案中，其中，所述脂质组合物还包括核酸，优选地，功能性核酸，诸如但不限于，siRNA，siRNA在脂质组合物中的浓度是约0.2-0.4mg/ml，优选地，0.28mg/ml，且总脂质浓度是约1.5-2.7mg/ml，优选地，2.17mg/ml。应该承认，核酸级分和脂质组分之间的这种质量比是特别优选的，由此获得的电荷比也如此。与本发明脂质组合物的任何其他浓度或稀释度相关，优选地，在该特殊实施方案中分别获得的质量比和电荷比，无论其浓度或稀释度，优选地得到维持。

所述用于例如药物组合物中的浓度可以通过将脂质分散到适量介质，优选地生理用缓冲液或本文所述的任何载体中获得，或者可以通过适当的方法浓缩。所述适当的方法是，例如，超滤法，包括交叉流超滤。过滤膜可以显示1.000-300.000Da分子量截断值(MWCO)或5nm-1μm的孔宽度。特别优选的是约10.000-100.000Da MWCO的孔宽度。本领域技术人员还应该承认，脂质组合物，更特别地，按照本发明的脂质复合物可以以冻干的形式存在。所述冻干形式典型地适合于延长脂质复合物的保存期。特别为了提供适当的摩尔渗透压浓度而添加的糖与其联合用作低温-保护剂。与其联合，还应该承认，上述摩尔渗透压浓度、pH以及脂质复合物浓度的特征指脂质组合物在载体中的溶解、混悬或分散形式，其中所述载体在原则上是本文所述的任何载体，且典型地，是水性载体，诸如水或生理用缓冲液，优选地，等渗缓冲液或等渗溶液。

除这些具体制剂外，还可以将按照本发明的核酸分子配制到本领域中已知的药物组合物中。

因此，按照本发明的核酸分子可以优选地适合于单独地或与其他治疗法结合作为药物和诊断法使用。例如，按照本发明的核酸分子可以包括用于向受试者施用的包括脂质体的递送赋形剂、载体和稀释剂及它们的盐，和/或能够以药用制剂的形式存在。用于递送核酸分子的方法记述在(Agrawal和Akhtar，1995；Akhtar和Juliano，1992)，(Maurer等，1999)；(Hofland和Huang，1995)；和Lee等，2000，ACS讨论会丛书(ACS Symp.Ser.)，752，184-192中，将其全部引入本文作为参考。Beigelman等，美国专利号6,395,713和Sullivan等，PCT WO 94/02595进一步描述了用于递送核酸分子的一般方法。这些方案实质上能够用于递送任何核酸分子。还能够通过本领域技术人员已知的多种方法，其包括，但不仅限于脂质体中的包封，通过离子电渗疗法，或通过引入到其他赋形剂，诸如水凝胶、环糊精(见例如Gonzalez等，1999)、可生物降解的纳米胶囊(nanocapsule)和生物粘性微球体中，或通过蛋白质载体(O’Hare和Normand，国际PCT公开号WO 00/53722)，将核酸分子施用到细胞中。备选地，通过直接注射或通过使用灌输泵，局部递送核酸/赋形剂组合。本发明核酸分子的直接注射，无论皮下、肌内或皮内，可以利用标准针头和注射器方法，或通过无针头的技术诸如(Conry等，1999)和Barry等，国际PCT公开号WO 99/31262中描述的那些来进行。本发明的分子能够用作药物试剂。优选地，药物试剂在受试者中预防、调节疾病状态的发生，或治疗(在某种程度上缓解症状，优选地全部症状)。

因此，本发明还在可接受的载体，诸如稳定剂、缓冲剂等中提供了药物组合物，其包括一种或多种按照本发明的核酸。在有或无稳定剂、缓冲剂等的条件下，能够通过任何标准方法，在受试者中施用(例如RNA、DNA或蛋白质)和引入本发明的多核苷酸或核酸(分子)，从而形成药物组合物。当理想地使用脂质体递送机制时，可以遵从用于形成脂质体的标准方案。还可以以用于口服施用的片剂、胶囊或酏剂，用于直肠施用的栓剂，用于注射施用的无菌溶液、混悬液，和其他本领域中已知的组合物形式，配制并使用本发明的组合物。

进一步提供了按照本发明核酸分子的药用制剂。这些制剂包括上述化合物的盐，例如酸式加成盐，例如盐酸、氢溴酸、乙酸和苯磺酸的盐。

药理学组合物或制剂指处于适合于向细胞或受试者，包括例如人中施用，例如全身施用的形式的组合物或制剂。合适的形式，部分地，依赖于用途以及进入的途径，例如口服、经皮或通过注射。该形式不应该阻止所述组合物或制剂到达靶细胞(即，这样的细胞，为了向该细胞递送，带负电的核酸是理想的)。例如，注射到血流中的药理学组合物应该是可溶的。其他因素是本领域中已知的，且包括考虑因素诸如阻止所述组合物或制剂发挥其作用的毒性和形式。

所谓“全身施用”优选地意指在血流中体内全身吸收或累积药物，随后遍及全身分布。引起全身吸收的施用途径包括，但不限于：静脉内、皮下、腹膜内、吸入、口服、肺内和肌内。这些施用途径中的每一种都使本发明的siNA分子暴露于易受影响的患病组织。已显示出药物进入循环的速率是分子量或尺寸的函数。使用脂质体或其他药物载体，包括按照本发明的核酸，能够潜在地将药物局部化，例如，在某些组织类型中，诸如肿瘤组织中。能够促进药物与细胞如淋巴细胞和巨噬细胞的表面结合的脂质体制剂也是有效的。该方法能够通过利用异常细胞，诸如形成肿瘤组织的细胞的巨噬细胞和淋巴细胞免疫识别的特异性，提供药物向靶细胞增强的递送。

“药用制剂”，优选地意指这样的组合物或制剂，其容许按照本发明的核酸分子在最适合于它们理想活性的物理位置中的有效分布。适用于具有按照本发明核酸分子的制剂的这样的试剂的非限制性实例包括：P-糖蛋白抑制剂(诸如普卢兰尼克(Pluronic)P85)，其能够增强药物进入CNS(Jolliet-Riant和Tillement，1999)；可生物降解的聚合物，诸如用于在脑内植入后持续释放递送的聚(DL-丙交酯-共-乙交酯)微球体(Emerich等，1999)(Alkermes公司，剑桥，MA)；和负载的纳米颗粒，诸如由聚丁基氰基丙烯酸酯构成的那些，其能够递送药物穿过血脑屏障并能够改变神经元的吸收机制(神经心理药理学安定生物精神病学的发展(ProgNeuropsychopharmacol Biol Psychiatry)，23，941-949，1999)。关于本发明核酸分子递送策略的其他非-限制性实例包括(Boado等，1998)；Tyler等，1999，FEBS通信(FEBS Lett.)，421，280-284；pardridge等，1995，美国PNAS，92,5592-5596；Boado，1995，药物递送进展综述(Adv.Drug Delivery Rev.)，15，73-107；Aldrian-Herrada等，1998，核酸研究(Nucleic Acids Res.)，26，4910-4916；和Tyler等，1999，PNAS美国，96,7053-7058中所述的材料。

按照本发明，还提供了包括表面-修饰的脂质体的组合物的用途，所述脂质体包含聚(乙二醇)脂质(PEG-修饰的、或长久-循环脂质体或潜在的(stealth)脂质体)。这些制剂提供用于增加药物在靶组织中积累的方法。该药物载体种类通过单核吞噬系统(MPS或RES)抵抗调理作用和消除，从而允许更长久的血液循环时间和对包封的药物增强的组织暴露(Lasic等，化学综述(Chem.Rev.)1995，95，2601-2627；Ishiwata等，化学和药理学报告(Chem.Pharm.Bull.)1995，43，1005-1011)。已经显示出该脂质体选择性地在肿瘤中积累，推测是通过新血管形成的靶组织中的外渗和捕获实现的(Lasic等，科学(Science)1995，267，1275-1276；Oku等，1995，Biochim.Biophys.Acta，1238，86-90)。特别与已知在MPS组织中积累的常规阳离子脂质体相比(Liu等，生物学和化学杂志(J.Biol.Chem.)1995，42，24864-24780；Choi等，国际PCT公开号WO 96/10391；Ansell等，国际PCT公开号WO 96/10390；Holland等，国际PCT公开号WO96/10392)，长-循环脂质体增强DNA和RNA的药物动力学和药效学。与阳离子脂质体相比，长-循环脂质体可能还在较大程度上保护药物免受核酸酶的降解，这基于它们避免在代谢积极的MPS组织，诸如肝和脾中积累的能力。

而且，提供了为储存施用而制备的组合物，其包括在药用载体或稀释剂中的药物有效量的需要的化合物。用于治疗用途的可用载体或稀释剂在制药领域是众所周知的，并且记述在，例如，雷明顿制药科学(Remington’sPharmaceutical Sciences)，马克出版公司(Mack Publishing Co.)(A.R.Gennaro版本1985)，据此引入本文作为参考。例如，能够提供防腐剂、稳定剂、染料和调味剂。这些包括苯甲酸钠、山梨酸和对羟基苯甲酸的酯。另外，能够使用抗氧化剂和悬浮剂。

药物有效剂量是预防、抑制发生，或治疗(在某种程度上缓解症状，优选地全部症状)疾病状态所需要的剂量。药物有效剂量依赖于疾病的类型、使用的组合物、施用的途径、被治疗的哺乳动物类型、考虑的特定哺乳动物的身体特征、同时进行的药物治疗和医药领域中技术人员应该意识到的其他因素。通常，根据带负电荷的聚合物的潜能，施用0.1mg/kg-100mg/kg体重/天的活性成分的量。

可以口服地、局部地、肠胃外地、通过吸入或喷雾、或直肠地，以剂型制剂的形式，施用按照本发明的核酸分子及其制剂，所述剂型制剂包含常规非-毒性药用载体、辅剂和/或赋形剂。用于本文时，术语肠胃外的包括经皮的、皮下的、血管内的(例如，静脉内的)、肌内的或鞘内注射或灌输技术等。另外，提供了药物制剂，其包括本发明的核酸分子和药用载体。一种或多种按照本发明的核酸分子能够与一种或多种非-毒性药用载体和/或稀释剂和/或辅剂，和如果需要，其他活性成分联合存在。含有按照本发明的核酸分子的药物组合物能够处于适合于口服使用的形式，例如，作为片剂、药片、锭剂、水性或油性混悬液、可分散的粉末或颗粒、乳剂、硬或软胶囊、或糖浆或酏剂形式。

可以按照药物组合物制备领域中已知的任何方法，制备意欲用于口服使用的组合物和具体地药物组合物，并且该组合物可以包含一种或多种所述甜味剂、调味剂、着色剂或防腐剂，从而提供在制药上美观且可口的制剂。片剂包含活性成分，其与非-毒性药用赋形剂混合，所述药用赋形剂适合于片剂的制备。这些赋形剂可以是，例如，惰性的稀释剂；诸如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；粒化和崩解剂，例如，玉米淀粉或海藻酸；粘合剂，例如淀粉、明胶或阿拉伯胶，和润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。片剂可以是未包被的，或者可以通过已知技术对它们进行包被。在一些情形中，所述包衣能够通过已知技术制备，从而延迟在胃肠道中的崩解和吸收，并由此在较长的时期内提供持续作用。例如，能够使用时间延迟物质，诸如甘油基单硬脂酸酯或甘油基二硬脂酸酯。

用于口服使用的制剂还能够以硬明胶胶囊的形式存在，其中活性成分与惰性的固体稀释剂，例如，碳酸钙、磷酸钙或白陶土相混合，或者以软明胶胶囊的形式存在，其中活性成分与水或油介质，例如花生油、液体石蜡或橄榄油相混合。

水性混悬液含有活性物质，其与适合于制备水性混悬液的赋形剂混合。所述赋形剂是悬浮剂，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、氢丙基甲基纤维素、藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍树胶和阿拉伯树胶；分散或润湿剂可以是天然-存在的磷脂，例如磷脂酰胆碱，或氧化烯与脂肪酸的缩合产物，例如聚氧乙烯硬脂酸酯，或环氧乙烷与长链脂肪醇的缩合产物，例如十七碳乙烯氧基辛醇，或环氧乙烷与源自脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物，诸如聚氧乙烯山梨醇一油酸酯，或环氧乙烷与具有源自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物，例如聚乙烯脱水山梨糖醇一油酸酯。水性混悬液还可以包含一种或多种防腐剂，例如乙基，或正丙基对羟基苯甲酸酯，一种或多种着色剂，一种或多种调味剂和一种或多种甜味剂，诸如蔗糖或糖精。

油性混悬液可以通过将活性成分混悬于植物油，例如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油，或矿物油诸如液体石蜡中而配制。油性混悬液可以包含增稠剂，例如蜂蜡、硬石蜡或鲸蜡醇。可以添加甜味剂和调味剂，从而提供适口的口服制剂。能够通过添加抗氧化剂诸如抗坏血酸来保存这些组合物。

适合于通过添加水而制成水性混悬液的可分散粉末和颗粒提供与分散或润湿剂、悬浮剂和一种或多种防腐剂相混合的活性成分。合适的分散或润湿剂或悬浮剂由上面已经提及的那些为例。还可以存在另外的赋形剂，例如甜味剂、调味剂和着色剂。

本发明的药物组合物还可以处于水包油的乳剂形式。油相可以是植物油或矿物油或其混合物。合适的乳化剂可以是天然-存在的树胶，例如阿拉伯树胶或黄蓍树胶，天然-存在的磷脂，例如大豆、磷脂酰胆碱和源自脂肪酸和己糖醇、酐的酯或偏酯，例如脱水山梨糖醇一油酸酯，和所述偏酯与环氧乙烷的缩合产物，例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇一油酸酯。这些乳剂还可以包含甜味剂和调味剂。

糖浆和酏剂可以用甜味剂，例如甘油、丙二醇、山梨醇、葡萄糖或蔗糖配制。该制剂还可以包含缓和剂、防腐剂、调味剂和着色剂。药物组合物可以处于无菌可注射水性或油质混悬液的形式。按照本领域已知的技术，利用上文提及的那些合适的分散或润湿剂和悬浮剂，能够配制该混悬液。无菌可注射制剂还可以是处于非-毒性母体可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或混悬液，例如，如在1，3-丁二醇中的溶液。可以使用的可用赋形剂和溶剂中特别是水、Ringer溶液和等渗氯化钠溶液。另外，无菌不挥发的油类常规用作溶剂或悬浮介质。为了该目的，可以使用任何温和的不挥发的油类，包括合成的单甘油酯或甘油二酯。另外，脂肪酸诸如油酸在制备注射剂中存在用途。

还可以以栓剂的形式施用本发明的核酸分子，例如，用于药物的直肠施用。可以通过混合药物和合适的无刺激性赋形剂来制备这些组合物，所述赋形剂在常温下是固态的，但在直肠温度下是液态的，并因此会在直肠中融化，从而释放药物。这样的物质包括可可脂和聚乙二醇。

可以肠胃外施用处于无菌介质中的本发明的核酸分子。根据所使用的赋形剂和浓度，能够将药物混悬或溶解在赋形剂中。有利地，辅剂诸如局部麻醉剂、防腐剂和缓冲剂可以溶解在赋形剂中。

本领域中技术人员通过常规试验能够分别确定药物和药物组合物的剂量水平。

应该理解，关于任何具体受试者的特异性剂量水平依赖于多种因素，包括所使用的具体化合物的活性、年龄、体重、一般健康状态、性别、饮食、施用时间、施用途径和排泄率、药物联合和经历治疗的具体疾病的严重性。

为了将按照本发明的药物施用到非人动物，诸如狗、猫、马、牛、猪、山羊、绵羊、小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠中，还可以优选地将所述组合物添加到动物饲料或饮用水中。可以方便地配制动物饲料和饮用水组合物，以使动物随着它的饮食获得治疗合适量的该组合物。该组合物还能够方便地作为用于添加到饲料或饮用水中的预混合物存在。

本发明的核酸分子还可以与其他治疗化合物联合施用于受试者，从而增加总体治疗效果。使用多种化合物治疗适应症能够增加有益效果，同时降低副作用的出现。

在实施方案中，所述核酸分子在它们不同的实施方案、形式和制剂中，能够分别与其他治疗法诸如化学疗法、冷冻疗法、高热、抗体疗法、放射疗法和抗-血管发生疗法一起使用。特别优选的治疗法是抗-血管发生疗法。与抗-血管发生疗法联合，特别优选的靶标是VEGF受体和PDGF受体。典型地，通过利用针对与血管发生相关的靶标，诸如VEGF受体和PDGF受体的抑制剂，实施抗-血管发生疗法。除小分子外，还能够产生或提供或使用其他类型的化合物，其起到针对所述靶标的抑制剂作用。因此可以使用下列类型的化合物：特别如WO 00/44895或WO 01/75164中所述的siRNA；特别如US 5,849,902，US 5,989,912中所述的或称为基因区组的反义分子；特别如EP 0 533 838 B1中所述的适体；特别如WO 98/08856中所述的spiegelmer；能够从包括10²-10¹⁸个肽的随机序列肽库中识别出的高亲和性结合肽，所述10²-10¹⁸个肽以一种类似于适体的方式在它们的氨基酸序列上相区别，并且因此有时也被称为肽适体；特别如DE 197 42 706中所述的抗促成素；和特别如“抗体：实验室手册”(“Antibodies：ALaboratory Manual”)，冷泉港实验室(Cold Spring Harbor Laboratory)(Harlow，E.和Lane D.版本)中所述的抗体。

在一个实施方案中，提供了适合于将按照本发明的核酸分子施用于特定细胞类型的组合物，其中该组合物分别典型地引入一种或数种下列成分和分子。例如，脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPr)(Wu和Wu，1987，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)262，4429-4432)对肝细胞是独特的，且结合分支的半乳糖-末端的糖蛋白，诸如脱唾液酸血清类黏蛋白(ASOR)。在另一个实例中，在许多癌细胞中过表达叶酸受体。所述糖蛋白、合成的复合糖或叶酸与受体的结合以这样的亲和性发生，所述亲和性强烈依赖于寡糖链的分支程度，例如，三触角(tria-tennary)结构以比二触角(biatenarry)或单触角(monoatennary)链更高的亲和性结合(Baenziger和Fiete，1980，细胞(Cell)，22，611-620；Connolly等，1982，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，257，939-945)。Lee和Lee，1987.复合糖杂志(Glycoconjugate J.)，4，317-328，通过使用N-乙酰-D-半乳糖胺作为糖部分，获得了该高特异性，所述N-乙酰-D-半乳糖胺与半乳糖相比，具有针对受体的更高的亲和性。为了结合和吸收甘露糖基-末端的糖蛋白或复合糖，还描述了“聚集效应”(Ponpipom等，1981，医学和化学杂志(J.Med.Chem.)，24，1388-1395)。使用基于半乳糖、半乳糖胺或叶酸的缀合物运送外源化合物穿过细胞膜能够提供靶定的递送方法，从而例如，治疗肝病、肝癌或其他癌症。使用生物缀合物也能够提供治疗所需的治疗化合物的必需剂量中的减少。此外，能够通过使用本发明的核酸生物缀合物来调节治疗的生物利用率、药效学和药物动力学参数。所述生物缀合物的非限制性实例记述在Vargeese等，2001年8月13日提交的USSN 10/201,394；和Matulic-Adamic等，2002年3月6日提交的USSN 60/362,016中。

在它们的不同实施方案中，按照本发明的核酸分子，包含所述核酸分子的载体、细胞、药物、组合物和具体地药物组合物，按照本发明的包含所述核酸分子的组织和动物，分别可以用在为了治疗以及在诊断和研究领域中。

由于下列疾病中涉及PKN3在不同组织和血管内皮中的分布，按照本发明的核酸分子可以用于治疗和/或预防所述疾病，优选地，特征为涉及，优选地在病理或患病组织、细胞，优选地PTEN-阴性肿瘤细胞中的疾病。

因此，如本文所公开的核酸分子和包含它的药物和药物组合物可以用于促-和抗-血管生成的治疗，包括由不足量、异常或过量的血管发生所表征或引起的疾病。所述疾病包括传染病、自体免疫病症、血管畸形、动脉粥样硬化、移植动脉病、肥胖、银屑病、疣、变应性皮炎、玻璃体持续增生综合征、糖尿病性视网膜病、早产儿视网膜病、与年龄相关的黄斑疾病、脉络膜新血管形成、原发性肺动脉高血压、哮喘、鼻息肉、炎性肠和牙周疾病、腹水、腹膜粘连、子宫内膜异位、子宫出血、卵巢囊肿、卵巢的、卵巢过度刺激、关节炎、滑膜炎、骨髓炎、骨赘形成和中风、溃疡、动脉粥样硬化和类风湿性关节炎。

其他疾病是包括或特征为肿瘤组织的那些。优选地用于本文时，术语肿瘤组织指由生物体、该生物体的组织或细胞产生的组织，该组织是不应该产生的，且被认为是病态的，即在不患所述这种疾病的受试者中不存在。而且，优选地用于本文时，肿瘤疾病是由于肿瘤组织的存在而直接或间接形成的任意疾病，其中优选地，所述肿瘤组织由一种/该组织的异常调节或不受控制的，优选地自主生长而形成。术语肿瘤疾病优选地还包括良性和恶性肿瘤疾病。更优选地，肿瘤疾病选自包括下列任意癌症的组，例如骨癌、乳腺癌、前列腺癌、消化系统癌症、结肠直肠癌、肝癌、肺癌、肾癌、泌尿生殖器癌、胰腺癌、垂体癌、睾丸癌、眶癌、头颈癌、中枢神经系统癌症、呼吸癌症。

原则上分别可以利用按照本发明药物组合物和药物，其包括所述脂质组合物和脂质复合物，治疗的其他特定疾病可以来自下列列表：急性成淋巴细胞白血病(成人)，急性成淋巴细胞白血病(儿童)，急性骨髓白血病(成人)，急性骨髓白血病(儿童)，肾上腺皮质癌，肾上腺皮质癌(儿童)，AIDS-相关的癌症，AIDS-相关的淋巴瘤，肛门癌，星形细胞瘤(儿童)，小脑星形细胞瘤(儿童)，大脑星形细胞瘤，肝外胆管癌，膀胱癌，膀胱癌(儿童)，骨癌，骨肉瘤/恶性纤维性组织细胞瘤，脑干神经胶质瘤(儿童)，脑瘤(成人)，脑瘤，脑干神经胶质瘤(儿童)，脑瘤，小脑星形细胞瘤(儿童)，脑瘤，大脑星形细胞瘤/恶性神经胶质瘤(儿童)，脑瘤，室鼓膜细胞瘤(儿童)，脑瘤，成神经管细胞瘤(儿童)，脑瘤，脑幕上初级神经外胚层瘤(儿童)，脑瘤，视觉通路和下丘脑神经胶质瘤(儿童)，脑瘤(儿童)，乳腺癌，乳腺癌(儿童)，雄性乳腺癌，支气管腺瘤/类癌瘤(儿童)，伯基特淋巴瘤，类癌瘤(儿童)，胃肠的类癌瘤，未知的原发癌，原发性中枢神经系统淋巴瘤，小脑星形细胞瘤(儿童)，大脑星形细胞瘤/恶性神经胶质瘤(儿童)，宫颈癌，慢性淋巴细胞白血病，慢性骨髓性白血病，慢性骨髓增生病症，结肠癌，结肠直肠癌(儿童)，皮肤T-细胞淋巴瘤，子宫内膜癌，室鼓膜细胞瘤(儿童)，食道癌，食道癌(儿童)，尤因肿瘤家族，颅外生殖细胞瘤(儿童)，性腺外生殖细胞瘤，肝外胆管癌，眼癌，眼内黑素瘤，眼癌，成视网膜细胞瘤，胆囊癌，胃(胃)癌，胃(胃)癌(儿童)，胃肠类癌瘤，颅外生殖细胞瘤(儿童)，性腺外生殖细胞瘤，卵巢生殖细胞瘤，妊娠绒毛膜上皮瘤，神经胶质瘤(成人)，脑干神经胶质瘤(儿童)，神经胶质瘤，(儿童)大脑星形细胞瘤，神经胶质瘤，(儿童)视觉通路和下丘脑神经胶质瘤，毛细胞白血病，头颈癌，肝细胞(肝)癌(成人)(原发性)，肝细胞(肝)癌(儿童)(原发性)，霍奇金淋巴瘤(成人)，霍奇金淋巴瘤(儿童)，下咽癌，下丘脑和视觉通路神经胶质瘤(儿童)，眼内黑素瘤，岛细胞癌(内分泌胰腺)，卡波西肉瘤，肾(肾细胞)癌，肾癌(儿童)，喉癌，喉癌(儿童)，急性淋巴细胞白血病(成人)，急性淋巴细胞白血病(儿童)，急性骨髓白血病(成人)，急性骨髓白血病(儿童)，白血病，慢性淋巴细胞白血病，慢性骨髓性白血病，毛细胞白血病，唇和口腔癌，肝癌(成人)(原发性)，肝癌(儿童)(原发性)，肺癌，非-小细胞肺癌，小细胞淋巴瘤，AIDS-相关的淋巴瘤，伯基特淋巴瘤，皮肤T-细胞淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤(成人)，霍奇金淋巴瘤(儿童)，非-霍奇金淋巴瘤(成人)，非-霍奇金淋巴瘤(儿童)，原发性中枢神经系统淋巴瘤，瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症，骨/骨肉瘤的恶性纤维性组织细胞瘤，成神经管细胞瘤(儿童)，黑素瘤，眼内(眼)黑素瘤，默克尔细胞癌，恶性间皮瘤(成人)，间皮瘤(儿童)，具有隐匿性原发灶的转移鳞状颈部癌(Metastaticsquamous Neck Cancer with Occult Primary)，多发性内分泌腺瘤形成综合征(儿童)，多发性骨髓瘤/血浆细胞瘤，蕈样霉菌病，骨髓发育不良综合征，骨髓发育不良/骨髓增生疾病，慢性骨髓性白血病，急性骨髓白血病(成人)，急性骨髓白血病(儿童)，多发性骨髓瘤，慢性骨髓增生病症，鼻腔和鼻窦癌，鼻咽癌，鼻咽癌(儿童)，成神经细胞瘤，非-霍奇金淋巴瘤(成人)，非-霍奇金淋巴瘤(儿童)，非-小细胞肺癌，口癌(儿童)，口腔癌，唇和口咽癌，骨的骨肉瘤/恶性纤维性组织细胞瘤，卵巢癌(儿童)，卵巢上皮癌，卵巢生殖细胞瘤，卵巢低恶性潜力瘤，胰腺癌，胰腺癌(儿童)，岛细胞胰腺癌，鼻窦和鼻腔癌，甲状旁腺癌，阴茎癌，嗜铬细胞瘤，成松果体细胞瘤和脑幕上的初级神经外胚层瘤(儿童)，垂体瘤，血浆细胞瘤/多发性骨髓瘤，胸膜肺母细胞瘤，妊娠和乳腺癌，妊娠和霍奇金淋巴瘤，妊娠和非-霍奇金淋巴瘤，原发性中枢神经系统淋巴瘤，前列腺癌，直肠癌，肾细胞(肾)癌，肾细胞(肾)癌(儿童)，肾盂和输尿管过渡细胞癌，成视网膜细胞瘤，横纹肌肉瘤(儿童)，唾液腺癌，唾液腺癌(儿童)，尤因肉瘤，卡波西肉瘤，软组织肉瘤(成人)，软组织肉瘤(儿童)，子宫肉瘤，赛塞利综合征，皮肤癌(非-黑素瘤)，皮肤癌(儿童)，皮肤癌(黑素瘤)，默克尔细胞皮肤癌，小细胞肺癌，小肠癌，软组织肉瘤(成人)，软组织肉瘤(儿童)，鳞状细胞癌，具有隐匿性原发灶的转移鳞状颈部癌，转移性胃(胃)癌，胃(胃)癌(儿童)，脑幕上初级神经外胚层瘤(儿童)，皮肤T-细胞淋巴瘤，睾丸癌，胸腺瘤(儿童)，胸腺瘤和胸腺癌，甲状腺癌，甲状腺癌(儿童)，肾盂和输尿管过渡细胞癌，妊娠绒毛膜上皮瘤，输尿管和肾盂过渡细胞癌，尿道癌，子宫内膜子宫癌，子宫肉瘤，阴道癌，视觉通路和下丘脑神经胶质瘤(儿童)，外阴癌，瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症，维尔姆斯瘤。

除了在血管发生中，更特别地，在抑制负责肿瘤血管发生和肿瘤迁移的内皮细胞游动性中，更特别地，在前列腺癌的情形中涉及PKN3以外(参考Leenders等，2004，EMBO J.23(16)：3303-3313)，PKN3是PI3-激酶通路的一部分。

PI 3-激酶通路的特征在于随着生长因子诱导而产生的PI 3-激酶活性和平行信号传导通路。生长因子刺激细胞导致它们在细胞膜上的关连受体的活化，这随之联合并活化细胞内信号传导分子，诸如PI 3-激酶。PI 3-激酶(由调节性p85和催化性p110亚基组成)的活化导致通过磷酸化作用活化Akt，从而支持细胞响应，诸如增殖，存活或进一步向下游迁移。因此PTEN是这样的肿瘤抑制基因，它参与磷脂酰肌醇(PI)3-激酶通路，并且它在调节细胞生长和转移中的作用曾经得到了广泛的研究(关于综述参见，Stein，R.C.和Waterfield，M.D.(2000).PI3-激酶抑制：药物开发的目标？(PI 3-kinase inhibition：a target for drug development？)今日分子医学(Mol Med Today)6，347-357；Vazquez，F.和Sellers，W.R.(2000).PTEN肿瘤抑制基因蛋白质：磷酸肌醇3-激酶信号传导的拮抗剂(The PTEN tumorsuppressor protein：an antagonist of phosphoinositide 3-kinase signaling).生物化学和生物物理集(Biochim Biophys Acta)1470，M21-35；Roymans，D.和Slegers，H.(2001).肿瘤发展中的磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphatidylinositiol 3-kinases in tumor progression).欧洲生物化学杂志(Eur J Biochem)268，487-498)。肿瘤抑制基因PTEM通过逆转PI 3-激酶-催化的反应而起到PI 3-激酶的阴性调节子功能，并由此确保通路的活化以瞬间和受控的方式发生。PI3-激酶信号传导的长期超活化作用由PTEN功能性去活化作用引起。PI 3-激酶活化能够通过添加小分子抑制剂LY294002而被阻断。在平行通路中起作用的信号转导激酶MEK的活性和下游响应能够例如受到小分子抑制剂PD98059的抑制。

PI 3-激酶通路通过缺失PTEN功能所引起的长期活化作用是肿瘤发生和转移的主要贡献者，这说明该肿瘤抑制基因代表关于受控细胞增殖的重要关卡。PTEN敲除细胞显示出与这样的细胞相似的特征，在所述细胞中，通过PI 3-激酶的活化形式长期诱导PI 3-激酶通路。(Di Cristofano，A.，Pesce，B.，Cordon-Cardo，C.和Pandolfi，P.P.(1998).PTEN是胚胎发育和肿瘤抑制的基础(PTEN is essential for embryonic development and tumoursuppression).自然遗传学(Nat Genet)19，348-355.Klippel，A.，Escobedo，M.A.，Wachowicz，M.S.，Apell，G.，Brown，T.W.，Giedlin，M.A.，Kavanaugh，W.M.和Williams，L.T.(1998).磷脂酰肌醇3-激酶的活化足以引起细胞周期进入并促进特征为致癌转化的细胞变化(Activation ofphosphatidylinositiol 3-kinase is sufficient for cell cycle entry and promotescellular changes characteristic of oncogenic transformation).分子细胞生物学(Mol Cell Biol)18，5699-5711.Kobayashi，M.，Nagata，S.，Iwasaki，T.，Yanagihara，K.，Saitoh，I.，Karouji，Y.，Ihara，S.和Fukui，Y.(1999).由磷脂酰肌醇3-激酶引起的腺癌去分化(Dedifferentiation of adenocarcinomas byactivation of phosphatidylinositiol 3-kinase).美国国家科学院学报(ProcNatl Acad Sci USA)96，4874-4879)。

PTEN参与若干通路，所述通路也称为PTEN相关通路，诸如PI3K/PTEN通路、Akt通路、EGF-相关自分泌环和mTOR通路。实际上，PI 3-激酶通路是任何直接或间接地涉及PI 3-激酶的通路。PI 3-激酶可以在所述通路中起抑制剂或活化剂的作用，或者它可以同样地受到该通路的其他元件的调节。

存在着充足的描述涉及PI 3-激酶通路的疾病和病症的现有技术。因此在本文中教导了可以由本发明方法及其设计、筛选或制造的药物和诊断剂处理的任何这些病症和疾病。由于举例说明而非限制的原因，是指下述：子宫内膜癌、结肠直肠癌、神经胶质瘤、子宫内膜癌、腺癌、子宫内膜增生、Cowden综合征、遗传性非-息肉病结肠直肠癌、Li-Fraumene综合征、乳腺-卵巢癌、前列腺癌(Ali，I.U.，国家癌症研究所杂志(Journal of theNational Cancer Institute)，卷92，11期，2000年6月7日，第861-863页)、Bannayan-Zonana综合征、LDD(Lhermitte-Duklos综合征)(Macleod，K.，见上)错构瘤-巨头疾病包括Cow病(CD)和Bannayan-Ruvalcaba-Rily综合征(BRR)、粘膜与皮肤病灶(例如，外毛根鞘瘤)、巨头、智力迟钝、胃与肠错构瘤、脂肪瘤、甲状腺瘤、乳腺纤维囊性疾病、小脑发育异常神经节细胞瘤和乳腺和甲状腺恶性肿瘤(Vazquez，F.，Sellers，W.R.，见上)。

鉴于此，PKN3是PI 3-激酶通路中有价值的下游药物靶标，所述PI 3-激酶通路能够受到这样的药物的处理，所述药物具有比其他作用于PKN3上游靶标的药物更少的副作用。由于具有对效应子分子的这个特殊部分，即蛋白质PKN3和参与该通路中的更下游分子的控制，在该信号传导级联中仅有非常有限数量的平行分支或更上游的靶标可能引起不希望的作用。因此，与细胞周期、DNA修复、程序性细胞死亡、葡萄糖运输、翻译相关的其他PI-3激酶/PTEN通路活性不受影响。而且，不诱导胰岛素信号传导，这意味着实际上避免了在连同使用LY294002中观察到的糖尿病响应或其他副作用。LY294002(2-(4-吗啉基)8-苯基色酮)是由Lilly研究实验室(Indianapolis)作为PI-3K抑制剂所开发的若干色酮衍生物小分子抑制剂之一(Vlahos等1994，JBC 269，5241-5248)。其靶向它们的PI-3K分子催化亚基，p110，并通过与催化中心中结合的ADP竞争而起作用。然而，LY294002不能区分被暗示具有不同的细胞功能的不同p110同种型(α、β、γ、δ)。

PKN3也在被瑞帕霉素处理的mTOR的更下游。mTOR(瑞帕霉素的哺乳动物靶标)，也称为Raft或FRAP，在PI 3-激酶下游起作用，从而调节诸如依赖于pp70 S6激酶进入细胞周期的过程。mTOR起生长因子和营养适用性传感器作用，从而通过活化pp70 S6激酶和起始因子4E来控制翻译。mTOR功能受到细菌大环内酯瑞帕霉素的抑制，所述细菌大环内酯瑞帕霉素阻断T细胞和某些肿瘤细胞的生长(Kuruvilla和Schreiber 1999，化学和生物学(Chemistry & Biology)6，R129-R136)。

如例如Yu等所述，瑞帕霉素及其衍生物是目前临床使用的合适药物的事实证明了药物靶标如果是更有效的，并具有较少的副作用，则它对特殊分子机制更具特异性(Yu，K.等(2001)内分泌-相关癌症(Endrocrine-RelatCanc)8，249)。

PKN3是蛋白激酶C家族的成员，认为全部蛋白激酶C家族是蛋白质-丝氨酸/苏氨酸激酶。典型地，这种类型的蛋白激酶包括一个调节性和一个催化性亚基，并利用钙离子和磷脂作为辅因子。二酰基甘油起到这种蛋白激酶家族活化剂的作用。蛋白激酶C家族的成员参与若干与激素或神经递质相连接的信号传导通路。这些蛋白激酶通过磷酸化作用调节它们靶蛋白的活性。本领域中已知蛋白激酶C的非生理延续活性导致转化的细胞表型，该表型可能引起癌症的产生。

数据库中存在作为mRNA的PKN3完整序列，例如以编号gi 7019488或NM_013355。利用该遗传密码，可以从该mRNA中推断出该特殊氨基酸序列。而且，数据库中存在编号为gi 7019489或NP_037487.1的PKN3氨基酸序列。

特别在小家鼠(M.musculus)，褐家鼠(R norvegicus)，拟南芥(A.thaliana)，秀丽隐杆线虫(C.elegans)，黑腹果蝇(D.melanogaster)和酿酒酵母(S.cerevisiae)中可以发现人PKN3的同系物。针对先前提及的不同种类，该比对区域的百分比特异性和长度分别是67％和279个氨基酸，51％和866个氨基酸，38％和305个氨基酸，36％和861个氨基酸，63％和296个氨基酸和44％和362个氨基酸。本领域技术人员应该承认任何这些或其他同系物应该原则上适合于实践本发明，除非利用该同系物生成的药物仍然可以与人蛋白激酶Nβ或任何其他所指的蛋白激酶Nβ相互作用。

人氨基酸序列还可以获自ProtEST，编号pir：JC7083，其中各自的蛋白激酶Nβ称为JC7083蛋白激酶。来自人蛋白激酶Nβ的基因位于人9号染色体上。关于蛋白激酶Nβ的cDNA来源通常是许多癌症和不同胎儿或胚胎组织，更特别地，特别是胃、腺癌、脑、乳腺、伯基特、淋巴瘤、宫颈、软骨肉瘤、结肠、胎儿眼睛、胎儿晶状体、胎儿眼睛前段、胎儿视神经、胎儿视网膜、胎儿视网膜凹、胎斑性胎儿脉络膜、纤维性卵泡膜细胞瘤(fibrotheoma)、生殖系、nead颈、心脏、肾、大细胞癌、平滑肌肉瘤转移软骨肉瘤、卵巢、甲状旁腺、视网膜神经胶质瘤、横纹肌肉瘤、小细胞癌、扁平细胞癌、睾丸、和子宫。由这个列表，显然地，除了如本文中公开的任何其他疾病和如本文中公开的患病状态外，本文中也称为药物的药物，还可以用于治疗和/或预防任何这些疾病或任何涉及所述特异性细胞、组织或器官的疾病。这些疾病和患病状态也应该包含在术语“如本文中所述的疾病”中。

能够由按照本发明的核苷酸分子和含有所述核苷酸分子的药物治疗和/或预防的如本文中所述的疾病以及如本文中所述的患病状态还包括肿瘤发生和转移。这具体应用于如本文中所述的那些疾病和如本文中所述的那些患病状态，其中所述疾病或患病状态中涉及的细胞是PTEN阴性的，这意味着肿瘤抑制基因PTEN没有活性，或具有降低的活性水平。所述疾病还包括通常涉及PI 3-激酶通路的那些疾病。除具体的转移瘤外，糖尿病分别属于这种类型的疾病和患病状态。因此，细胞，具体地如本文中所述的疾病或患病状态中涉及的和PTEN阴性的那些，易受由这样的药物治疗的影响，所述药物的作用模式是诸如降低或消除各自涉及的细胞中的PKN3活性。因此，利用所述药物能够方便地治疗这样的患者，所述患者的肿瘤特征为优选超活化的PI 3-激酶通路，包括但不仅限于通过增殖或突变编码PI 3-激酶通路成分(p110，Akt)的基因，或是PTEN阴性的，或具有PTEN阴性细胞，特别是如果这些在如本文中所述的疾病或如本文中所述的患病状态中有所涉及。所述活性降低可以源自转录水平或翻译水平，即PKN3酶活性的降低。在不希望受限于任何理论的条件下，后一方面，即修饰PKN3的活性还由PKN3的特征引起，即PKN3的酶活性也可以被上调和下调，更优选地，被下调。

另一组可以利用所述药物方便治疗的患者是患有癌症的那些，所述癌症具有关于缺失PTEN功能的高发生频率，特别是在晚期肿瘤中(Cantley和Neel，1999)。PTEN的缺失与各自肿瘤细胞增高的积极性和侵入行为相关联。

应该承认，本文中所述的可以使用按照本发明的药物组合物治疗和预防的不同疾病也是能够用本文所述的药物预防和/或治疗的那些疾病，且反之亦然。

用于本文时，术语疾病的治疗还应该包括预防该疾病。

其他特性、实施方案和优点可以来自下列附图。

图1是说明PKN3参与PI 3-通路的示意图。

图2显示在人细胞系(HeLa，HUVEC)和小鼠细胞系(EOMA)中利用PKN3特异性siRNA进行的击倒试验的蛋白质印迹分析结果。

图3显示利用配制为脂质复合物的不同浓度PKN3特异性siRNA分子进行的击倒试验结果，以确定HeLa和HUVEC细胞中siRNA的IC50。

图4显示利用PKN3特异性siRNA分子和作为对照的PKN3特异性反义分子的击倒试验的蛋白质印迹分析结果，其中在不同时间点评估所述分子在抑制力方面的功效。

图5显示击倒试验的蛋白质印迹分析结果，其中使用了不同浓度的PKN3特异性siRNA脂质复合物，其在3’末端表现或不表现出磷酸酯基团。

图6显示利用不同PKN3特异性siRNA分子(图6A)的击倒试验的蛋白质印迹分析结果和说明细胞外基质上失去对HUVEC生长的PKN3功能的显微照片(图6B)。

图7说明了在s.c.PC-3异种移植肿瘤小鼠模型中，用于测试PKN3特异性siRNA分子体内功效的实验设计(图7A)和该分子对肿瘤体积(图7B)和体重(图7C)的影响。

图8说明了在s.c.PC-3异种移植肿瘤小鼠模型中，用于测试PKN3特异性siRNA分子体内功效的实验设计(图8A)和以体重或肿瘤体积的百分比表示的不同剂量的所述siRNA分子的效果(图8B)，和利用以体重或肿瘤体积百分比表示的所述分子的不同治疗时间表的效果(图8C)。

图9说明前列腺内PC-3异种移植肿瘤小鼠模型中，用于测试PKN3特异性siRNA分子体内功效的实验设计(图9A)，所述分子对前列腺肿瘤体积和淋巴结转移瘤的影响(图9B)和所述分子对肺组织中PKN-3和Tie2mRNA减少的影响(图9C)。

图10说明前列腺内PC-3异种移植肿瘤小鼠模型中，用于测试利用全身性施用的特异性siRNA分子的不同治疗方案的体内功效的实验设计(图10A)，和所述不同治疗方案对前列腺肿瘤体积(图10B)和对淋巴结转移瘤体积(图10C)的影响。

图11用于测试全身性施用的不同剂量PKN3特异性siRNA分子的体内功效的实验设计(图11A)，和所述不同剂量对前列腺肿瘤体积(图11B)和淋巴结转移瘤体积(图11C)的影响。

图12A显示形成脂质复合物的化合物。

图12B显示按照本发明的脂质复合物与脂质体相比较的结构示意性图解。

图13显示利用具有19个碱基对或23个碱基对的PKN3特异性siRNA分子的击倒试验的蛋白质印迹分析结果。

图14显示利用不同PKN3特异性siRNA分子的击倒试验的蛋白质印迹分析结果。

图15显示在三个不同细胞系中，利用具有19个碱基对或23个碱基对的siRNA分子的击倒试验的蛋白质印迹分析结果，其中以不同浓度使用所述siRNA分子。

图16显示在同位前列腺癌小鼠模型中，用于测试PKN3特异性siRNA分子体内功效的实验设计(图16A)和所述具有19个碱基对或23个碱基对的PKN3特异性siRNA分子对前列腺肿瘤体积(图16B)、淋巴结转移瘤体积(图16C)和淋巴结转移瘤扩散(图16D)减少的影响。

图17显示在同位前列腺癌小鼠模型中，用于测试不同剂量的包括23个碱基对的PKN3特异性siRNA分子的体内功效的实验设计(图17A)和所述不同剂量对前列腺肿瘤体积(图17B)、淋巴结转移瘤体积(图17C)和淋巴结转移瘤扩散(图17D)减少的影响。

实施例1：材料和方法

体外转染和免疫印迹；抗体

利用上述阳离子脂质体，用siRNA转染细胞系。简要地，细胞播种后约12小时，向细胞中加入不同量的siRNA-脂质复合物溶液，所述siRNA-脂质复合物溶液是被稀释在含有10％血清的培养基中的，以获得在1-50nM siRNA范围内的转染浓度。转染后(48小时)，如上所述地溶解细胞，并对其进行免疫印迹(Klippel等，1998)。利用DC蛋白质测定(BioRad)确定蛋白质浓度，并且等量加载，以进行利用下列抗体的免疫印迹分析：兔抗-PTEN(Ab-2，Neomarkers)、Akt-1、兔抗-PKN3(Leenders等，2004)。

细胞系

按照ATCC建议培养PC-2、HeLa、HUVEC(人脐静脉内皮细胞)、和EOMA细胞系。

肿瘤异种移植

在该研究中使用雄性Hsd：NMRI-nu/nu小鼠(8周龄)。为了对定植肿瘤异种移植物进行肿瘤治疗试验，皮下植入总量5.0x10⁶个肿瘤细胞/100μl PBS。利用测径器确定，并按照公式体积＝(长x宽²)/2计算肿瘤体积。对于肿瘤治疗试验，通过低压、小体积尾静脉注射，静脉内(i.v.)施用siRNA-脂质复合物溶液。在同位肿瘤模型中，在全身麻醉条件下，将2.0x10⁶个PC-3细胞/30μl PBS注射到前列腺的左背外侧叶中(Stephenson等，1992)。手术后50天时杀死动物，并如上所述地确定肿瘤(前列腺)体积和区域性转移瘤(尾部、腰部和肾淋巴结转移瘤)。

对于静脉内治疗，通过经由单次尾静脉注射200μl溶液，静脉内施用siRNA脂质复合物，执行siRNA-脂质复合物，所述注射以1.88mg/kg siRNA和14.5mg/kg脂质作为最终剂量或关于不同剂量的不同时间表(如所示)。

统计学分析

将数据表达为平均值±s.e.m。通过Mann-Whitney U检验确定差别的统计学显著性。认为P值＜0.05是统计学显著的。

Matrigel测定

为了测定细胞在Matrigel基质上的生长，用siRNA转染HUVEC 48小时。胰蛋白酶化后，将细胞一式两份地接种到经250μl Matrigel底膜基质预-包被的24-孔板(110,000个细胞/孔)上，并在重新涂布后20小时，利用安装在Axiovert S100显微镜上的Axiocam相机，以×1.25或×2.5放大倍数，获得显微照片。

实施例2：PKN3 siRNA分子

按照本发明的分子，其在本文中也称为siRNA分子(AtuRNAi，见表1a和1b.)并用在本研究中，如在(Czauderna等，2003)中描述，并由BioSpring(Frankfurt a.M.，德国)合成。

所述分子的双链体由各自有义和反义链形成，其各自以5’-＞3’的方向显示在表1a和1b中。因此，通过组合各自的有义和反义链而形成双链分子，例如形成具有双链结构分子的PKN3-hm-1s和PKN3-hm-1as，其在具体实施例中也称为PKN3(1)。所述分子是平端的，然而，形成双链分子的每条链具有与3’-末端，更具体地与末端3’OH末端相连的磷酸酯。通过交换两条链上的2’-O-甲基糖修饰来化学稳定所述分子，其中未修饰的核苷酸面对对面链上修饰的核苷酸，正如也从表1a获得地。这些双链分子是按照本发明核酸分子的特别优选实施方案。

表1a：

在具有2’-O-甲基修饰的核苷酸下划线；由该划线部分证明了每隔一个核苷酸具有这种类型的修饰，其中所述修饰起始自反义链上的第一个核苷酸，和有义链上的第二个核苷酸(处于这样的附加条件下，即从左向右，以5’-3’描述有义链和反义链)。

S链代表有义链，其在本文中也称为第二链；且as链代表反义链，其在本文中也称为第一链，其中所述第一链包括第一连续核苷酸序列，且所述第一段序列至少部分地与靶核酸互补，其中所述靶核酸，用于本文时，优选地是待降解或destilized的核酸。

这些分子在本文中也称为PKN3特异性siRNA，并在两种人细胞系，即HeLa、HUVEC，和一种小鼠细胞系(EOMA)中对其进行了筛选。如实施例1中所述，转染了20nM siRNA，并在转染后48小时，由全细胞溶解物进行免疫印迹。将结果显示在图2中。如可以获自图2地，特别优选的是核酸分子KN3(2)、PKN3(3)、PKN3(4)、PKN3(5)、PKN3(6)、PKN3(8)。

甚至更优选的分子是PKN3(3)，将其用于进一步的研究中。

基于PKN3(3)，设计了其他siRNA分子，将其显示在下表1b中，并将由PKN3-hm-3A23v1和PKN3-hm-3B23v1分子，即单链组成的分子注释为PKN3-23-v1，将由PKN3-hm-3A23v2和PKN3-hm-3B23v2分子，即单链组成的分子注释为PKN3-23-v2，将由PKN3-hm-3A23v3和PKN3-hm-3B23v3分子，即单链组成的分子注释为PKN3-23-v3，将由PKN3-hm-3A23v4和PKN3-hm-3B23v4分子，即单链组成的分子注释为PKN3-23-v4，并将由PKN3-hm-3A23v5和PKN3-hm-3B23v5分子，即单链组成的分子注释为PKN3-23-v5。

表示和设计这些siRNA分子的方式与对表1a中包含的siRNA分子所描述的相同。如可以获自表1b，起始自PKN3(3)，在表1b中称为PKN3-hm-3A19/PKN3-hm-3B19，在有义链3’末端和反义链5’末端加入总数4个核苷酸(PKN3-23-v1)，在有义链5’末端加入总数4个核苷酸并在反义链3’末端加入总数4个核苷酸(PKN3-23-v2)，在有义链5’末端加入1个核苷酸和3’末端加入3个核苷酸并在反义链5’末端加入3个核苷酸和在3’末端加入1个核苷酸(PKN3-23-v3)，在有义链5’末端加入2个核苷酸和3’末端加入2个核苷酸并在反义链5’末端加入2个核苷酸和在3’末端加入2个核苷酸(PKN3-23-v4)，和在有义链5’末端加入3个核苷酸和3’末端加入1个核苷酸并在反义链5’末端加入1个核苷酸和在3’末端加入3个核苷酸(PKN3-23-v5)。在表1b中以斜体显示新加入的核苷酸。

表1b

检测表1b的siRNA分子的击倒功效，并与具有19个核苷酸长度的PKN3特异性siRNA之一，更具体地与PKN3(3)相比较。为了该目的，将HeLa B细胞涂布在6个孔中(40k)，16小时后用20nM转染，并在转染后48小时进行细胞溶解以获得细胞提取物。如果没有明确指出是相反的，则连同这些siRNA分子使用的技术和程序是本文中在实施例部分和更明确地在实施例1中所述的那些。

图13中描述了用抗-PKN3抗体和抗-PTEN抗体探测的细胞溶解物的蛋白质印迹，后者起加载对照的作用。如可以获自图13地，PKN3-23-v1是特别有效的，在功效方面，其次是PKN3-23-v4、PKN3-23-v5、PKN3-23-v2和PKN3-23-v3。使用包含作为有义链Luc-siRNA-2B(cguacgcggaauacuucga，SEQ.ID.No 56)和作为反义链Luc-siRNA-2A(ucgaaguauuccgcguacg，SEQ.ID.No 57)的萤光素酶特异性siRNA分子作为对照(KO)。

筛选了其他潜在的siRNA分子，将其描述在表2中，其中表达和修饰的方式与对上表1a和1b中所示的siRNA分子所述的相同。

表2

在如上所述的HUVEC细胞中的初步筛选中筛选出表2中所述的这些siRNA分子。将细胞涂布在6个孔中(40k)，16小时后用20nM siRNA和1μg/ml AtuFECT01转染，并在转染后72小时进行细胞溶解以获得蛋白提取物。图14中描述了用抗-PKN3和抗-PTEN探测的细胞溶解物的蛋白质印迹，后者起加载对照的作用，其中ut代表未处理的；Luci代表如上定义的蛋白萤光素酶siRNA；且co3是

PKN3-23-v1

PKN3-hm-3A23v1 as uuguccaggaaguccucaagucu

PKN3-hm-3B23v1 s agacuugaggacuuccuggacaa

如果没有明确指出是相反的，则连同这些siRNA分子使用的技术和程序是本文中在实施例部分和更明确地在实施例1中所述的那些。

实施例3：PKN3特异性siRNA分子的脂质复合物制剂

基本如Santel所述地制备脂质复合物制剂(Santel等2006)。

通过在300mM无菌无RNA酶蔗糖溶液中再水合脂质膜，以摩尔比50/49/1，混合阳离子脂质AtuFECT01(β-L-精氨酰基-2，3-L-二氨基丙酸-N-棕榈基-N-油基-酰胺三盐酸，Atugen AG)、中性磷脂1，2-二植烷酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DPhyPE)(Avanti极性脂质公司(Avanti Polar Lipids Inc.)，Alabaster，AL)和PEG化的脂质N-(羰基-甲氧基聚乙二醇-2000)-1，2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸-乙醇胺钠盐(DSPE-PEG)(Lipoid GmbH，路德维希港(Ludwigshafen)，德国)，从而获得总脂质浓度4.34mg/ml。如果没有明确指出是相反的，则典型地，对30g小鼠的单次静脉内注射以标准剂量1.88mg/kg siRNA和14.5mg/kg脂质进行。而且，如果没有明确指出是相反的，则PKN3特异性siRNA分子是实施例2中定义的PKN3(3)分子。图12A中描述了形成按照本发明脂质复合物的不同化合物，包括PKN3(3)，由此应该理解特异性siRNA分子原则上可以是本文中公开的任何siRNA分子，优选地，如表1a和1b中所示的任何siRNA分子。

图12B显示siRNA脂质复合物，即在siRNA分子与上述脂质，即阳离子脂质、也称为辅助子脂质的DphyPE、和PG-脂质即DSPE-PEG之间或由其形成的复合物。PKN3-特异性siRNA的粗体核苷酸表示单独核苷酸的2’-O-甲基修饰。

实施例4：确定IC50

在HeLa和HUVEC细胞中转染后，确定由PKN3(3)分子和实施例3中指定的脂质一起形成的脂质复合物，也称为siRNA-PKN3(3)-脂质复合物的IC50。转染后48小时制备蛋白质细胞溶解物，并用PKN3和PTEN-特异性抗体进行免疫印迹。

脂质复合的(以脂质复合物配制的)siRNA分子(“siRNA-PKN3(3)”)的浓度是1，5，10和20nM，

结果描述在图3中。

由图3，可以获得在HeLa细胞中，浓度为5nM的siRNA-PKN3(3)已经适合于在蛋白质水平上显著抑制PKN3。这同样适用于HUVEC细胞，由此需要稍微更高的浓度以达到与HeLa细胞中非常相同的抑制程度。使用PTEN作为加载对照。

另外，在细胞系HUVEC和EOMA中，分别对由如本文中表1b中所述的PKN3分子形成的脂质复合物，更具体地PKN3-23-v1，与作为19muer的PKN3(3)相比较，进行剂量滴定。如以上实施例中所述地，将细胞涂布在6个孔中(40k)，16小时后用指定浓度的siRNA进行转染，并在转染后48小时溶解以获得蛋白提取物。图15中描述了由抗-PKN3抗体和抗-PTEN抗体探测的溶解物的蛋白质印迹，后者起加载对照的作用。

如可以从图15中获得地，PKN3-23-v1 siRNA在功效上与PKN3(3)的那个相似。通过细胞培养转染试验和随后的半定量免疫印迹评估19mer和23mer分子的IC50，并对三种不同的细胞系显示出相似的功效(IC50～5nM)。值得指出的是EOMA是小鼠来源的内皮细胞系，其指示关于小鼠和人的活性。

实施例5：PKN3特异性siRNA分子的瞬时作用

为了显示PKN3特异性siRNA分子，即siRNA-PKN-3(3)和PKN3特异性反义分子(GB对照)抑制作用的瞬时特征(Leenders等，2004)，将这些分子转染到HeLa细胞中。在48小时、96小时、144小时和192小时制备蛋白质溶解物。在每种情形中，如实施例3中所述地，使细胞暴露于含有PKN3(3)分子的siRNA脂质复合物24小时，并在所述24小时后除去所述siRNA脂质复合物。

结果描述在图4中。

从图4可知，直到96小时，仍能够观察到siRNA PKN3(3)在蛋白质水平上对PKN3的作用，由此144小时后，特定siRNA分子的功效似乎降低，且192小时后基本不再能观察到抑制作用。与GB对照相比，按照本发明的siRNA分子因而显示出比反义分子持续时间更长的活性，所述反义分子的抑制在96小时后已经显著减小。

实施例6：与按照本发明的siRNA分子的3’末端相连的磷酸酯基团的影响

在该实施例中，研究了位于形成按照本发明的双链结构或分子的有义链和反义链的3’-末端的3’-磷酸酯修饰的影响，其中使用PKN3(3)作为抑制介导核酸分子，且配制所述核酸分子，从而形成如实施例3中所述制备的各自脂质复合物。在HeLa细胞中测试由此获得的脂质复合物，由此分别转染不同量的所述siRNA分子和脂质复合物，转染后48小时制备蛋白质溶解物。如本文中所述地分析免疫印迹，并将结果显示在图5中。

如从图5中可知地，磷酸酯修饰实际上对siRNA分子和含有所述siRNA分子的脂质复合物的功效没有影响。

实施例7：PKN3对细胞外基质上HUVEC生长的功能丢失

为了进一步显示随着利用按照本发明的分子抑制PKN3，还存在一些生理学和形态学上的改变，使用了细胞外基质生长测定(Leenders等，2004)。

更特别地，用4种不同的siRNA-PKN3脂质复合物转染HUVEC，所述脂质复合物各自分别含有PKN3(1)、PKN3(3)、PKN3(4)和PKN3(5)作为siRNA分子，并用siRNA Luc-脂质复合物(20nM)作为对照。在转染开始的48小时内，细胞保持生长直至汇合。48小时后，胰蛋白酶消化细胞，以等细胞数量(110.000个细胞)重新涂布，并将其涂布在24个含有matigel的孔中。

获得各自的显微镜照片，从而监测重新涂布后20小时HUVEC细胞生长中的变化。结果描述在图6中。

如所预期地，在有效的siRNA PKN3脂质复合物，优选地PKN3(3)脂质复合物和PKN3(5)脂质复合物的情形中，观察到生长的显著抑制。

实施例8：抑制皮下s.c.PC-3异种移植肿瘤生长

通过皮下注射PC-3细胞生成PC-3异种移植肿瘤模型。随后，用实施例3中所述的脂质复合物处理由此产生的肿瘤。所述脂质复合物中包含的siRNA分子是PKN3(3)。图7A中描述了基本试验设计。构建了总共3个不同的处理组，其中每组由6只小鼠组成。第一组仅接受蔗糖，第二组接受含有针对萤光素酶的siRNA的脂质复合物(siRNALuc-脂质复合物)，且第三组接受含有特异于PKN3的siRNA的脂质复合物(siRNA PKN3-脂质复合物)。

肿瘤细胞接种后，从第25到35天施用不同试剂。每日进行8次静脉内注射。siRNA脂质复合物的剂量是1.88mg/kg siRNA和14.5mg/kg总脂质(Santel等，2006a；Santel等，2006b)。

平行地，与PKN3(3)相比较，评估了PKN3-23-v1 siRNA分子。图16A中描述了各自的基本试验设计，其中在肿瘤细胞接种后，从第29到47天施用不同试剂，即蔗糖、PKN3(3)和PKN3-23-v1，其中施药是每隔一天进行10x静脉内注射(在包括12只小鼠的组中)。siRNA脂质复合物的剂量是2，8mg/kg siRNA和21，7mg/kg总脂质(Santel等，2006a，Santel等，2006b)。

与PKN3(3)相比，在图7B和图7C中针对PKN3(3)和在图16B-16D中针对PKN3-23-v1 siRNA分子，描述了所述处理方案的结果。

如从图7B可知地，与如所示(标准剂量1.88mg/kg/天siRNA；14.5mg/kg/天脂质；箭头)处理的siRNALuc-脂质复合物(三角形)或等压蔗糖(实心圆)相比，构建的PC-3异种移植物的生长显著受到siRNAPKN3脂质复合物(菱形)的抑制。在如图7B中所示的处理过程中监测体重变化。各个数据代表每日肿瘤体积的平均值s.e.m。随着施用不同的脂质复合物，仅能观察到体重的微量减小，这证实了，如果有影响的话，脂质复合物的脂质成分对动物健康仅有最小的影响。

如从图16B、16C和16D中可知地，测试的两种siRNA分子，即PKN3(3)，即“19mer”，和PKN3-23-v1，即“23mer”，在该前列腺肿瘤模型中显示出相同的功效，将其表达为前列腺肿瘤体积的减小(图16B)，淋巴结转移瘤体积的减小(图16C)和淋巴结转移扩散(图16D)。

实施例9：抑制皮下PC-3异种移植肿瘤生长：不同脂质复合物剂量的影响

进行了下述试验，从而研究不同脂质复合物剂量对抑制皮下PC-3异种移植肿瘤生长的影响。更具体地，使用了siRNAPKN3(3)脂质复合物。如实施例3中所述地制备脂质复合物。由图8A可知该试验设计。处理组由6只小鼠组成，其中一组动物接受蔗糖作为阴性对照，而其他组接受siRNA PKN3-脂质复合物，更明确地，siRNA PKN3(3)脂质复合物。在皮下肿瘤细胞接种后，从第22-38天，每日对动物施用11次静脉内注射，并评估存活直到第67天。

siRNA脂质复合物制剂的配方如下：1.88mg/kg siRNA+14.5mg/kgatuFect01/1％PEG；

不同的脂质复合物剂量如下：

-每日0.94mg/kg siRNA，第22-32天，

-每日1.88mg/kg siRNA，第22-32天

-1.88mg/kg siRNA，每日二次50％剂量，第22-28天，

-每隔一日1.88mg/kg，第22-38天

结果描述在图8B中。从图8B可知，每日1.88mg/kg的剂量导致肿瘤体积的显著减小，由此体重仅微小改变，并且同样对所述脂质复合物制剂没有观察到负作用。

实施例10：抑制皮下PC-3异种移植肿瘤生长：不同处理方案的影响

与实施例8相联系，描述了试验设计。

结果描述在图8C中。更具体地，从图8C可知，该实施例中研究的处理时间表的效果在影响肿瘤体积方面没有不同。然而，由每日两次、每日和每隔一日组成的处理时间表显示出相同的肿瘤生长抑制，这说明每隔一日用PKN3-siRNA脂质复合物处理足以维持治疗功效。另外，每日两次处理导致体重的显著减小，这暗示了不具有附加治疗益处的极限剂量(Santel等，2006a)。

实施例11：在同位异种移植肿瘤模型中，用siRNA PKN3(3)脂质复合物全身性处理小鼠

在同位异种移植肿瘤模型中进行该试验，从而研究用siRNAPKN3脂质复合物和更明确地siRNA PKN3(3)脂质复合物全身性处理小鼠对肿瘤生长的影响，(试验详细信息见(Santel等，2006a))。

图9A中描述了用于在同位PC-3前列腺肿瘤和淋巴结转移瘤模型中分析siRNAPKN3脂质复合物处理的功效的试验设计。定义了总共4个处理组，每组由9只小鼠组成，即接受蔗糖、siRNA Luc-脂质复合物、siRNAPKN3-脂质复合物和siRNA Tie2-脂质复合物的组。在前列腺内肿瘤细胞接种后，从第35-49天，每隔一日，8次静脉内注射由1.88mg/kg siRNA和14.5mg/kg atuFect01/1％PEG组成的siRNA脂质复合物剂量。在第35天，进行了预-处理对照。

由该试验，与用蔗糖或萤光素酶特异性siRNA分子(siRNALuc)处理的组相比，在用指定的siRNA脂质复合物处理后的小鼠中观察到前列腺PC-3肿瘤和淋巴结转移瘤体积的减小，将其更明确地描述在图9B中(前列腺肿瘤的体积尺寸和淋巴结转移瘤的体积)。

在左侧显示了开始处理前的肿瘤转移瘤体积(第35天，对照)。由星号表示统计学显著性。如从所述图中可知地，PKN3特异性siRNA分子，更明确地含有所述PKN3特异性siRNA分子的脂质复合物，在减小前列腺肿瘤体积和淋巴结转移瘤体积方面高度有效。

为了证明由静脉内施用PKN3-siRNA脂质复合物引起的体内RNA干扰，分析了肺组织中mRNA击倒。更明确地，在图9C中描述了由定量TaqMan反转录-聚合酶链式反应揭示的来自经相应siRNA脂质复合物处理的小鼠的肺组织中PKN-3和Tie2 mRNA水平的降低。显示了针对CD34mRNA标准化的肺中Tie2或PKN3 mRNA相对平均量，从而证明体内脂质复合物介导体内干扰。平行检测了对照TIE-2受体特异性siRNA脂质复合物，也证明了当与阴性萤光素酶特异性siRNA-脂质复合物相比较时，靶特异性mRNA的减少(图9，右图)，但没有揭示出对肿瘤生长或形成淋巴结转移瘤的显著抑制。这些数据证明了利用PKN3-siRNA-脂质复合物的靶基因(gebne)特异性治疗效果。

实施例12：在同位异种移植肿瘤模型中，用siRNA-PKN3(3)-脂质复合物全身性处理小鼠：处理时间表的影响

在同位异种移植肿瘤模型中进行该试验，从而测试与用siRNA-PKN3-脂质复合物和更明确地siRNA-PKN3(3)-脂质复合物全身性处理小鼠相关的不同处理时间表。

在图10A中描述了试验设置。存在两个处理组，其中每组由9只接受蔗糖或siRNAPKN3脂质复合物施药的小鼠组成。在前列腺内肿瘤细胞接种后，从第35-53天，每隔一日或每隔两日进行10/7x静脉内注射。使用了两种不同的siRNA脂质复合物剂量，如下：1.88/2.8mg/kg siRNA14.5/21.7mg/kg atuFect01/1％PEG，即具有14.5/21.7mg/kg总脂质。

将结果描述为前列腺肿瘤的体积(图10B)和淋巴结转移瘤体积(图10C)。观察到针对两种参数肿瘤体积和LN转移瘤形成的抑制，然而，当与每隔两日的处理相比较时，对每隔一日的处理没有观察到显著的功效增加。然而，随着更高的每日剂量(2.8mg/kg siRNA)，观察到对转移瘤形成的更显著抑制。这些数据显示siRNA介导的抑制不受限于每日静脉内施药，且每隔一日的处理能够获得治疗效果。

实施例13：在同位异种移植肿瘤模型中，用siRNA-PKN3(3)-脂质复合物全身性处理小鼠：不同剂量的影响

在同位异种移植肿瘤模型中进行该试验，从而测试与用所述脂质复合物和更明确地siRNA-PKN3(3)脂质复合物(图11)和siRNA-PKN3-23-v1tu17)全身性处理小鼠相关的不同剂量。

在图11A中描述了试验设置。存在3个处理组，其中每组由10只接受蔗糖、siRNA PKN3脂质复合物或仅脂质复合物施药的小鼠组成。在前列腺内肿瘤细胞接种后，从第28-46天，每隔一日进行10x静脉内注射。siRNA脂质复合物剂量如下：0.7/1.4/2.8mg/kg siRNA；5.4/10.9/21.7mg/kg总脂质(在所述脂质复合物中，全部三种一起：atuFect01/辅助子脂质/1％PEG)。每隔一日通过静脉内注射施用三种剂量方案。

将结果描述为前列腺肿瘤的体积(图11B)和淋巴结转移瘤体积(图11C)。在这两种情形中，对每日剂量2，8mg或1，4mg siRNA/kg均观察到显著的抑制，这证明了这些siRNA分子的治疗窗口。

同样，在包括PKN3-23-v1而非PKN3(3)作为siRNA种类的siRNAPKN3脂质复合物的情形中，存在三个不同的处理组，其中每组由7-8只接受蔗糖、siRNA PKN3脂质复合物或单独的脂质复合物施用的小鼠组成。在前列腺内肿瘤细胞接种后，从第7-63天，每隔三日进行15x静脉内注射。siRNA脂质复合物剂量分别如下：1，4mg/kg siRNA(10，9mg总脂质/kg)/和0，7mg/kg siRNA(5，4mg总脂质/kg)。

将结果描述为前列腺肿瘤的体积(图17B)和淋巴结转移瘤体积(图17C)。在这两种情形中，对剂量1，4mg/kg和0，7mg/kg siRNA均分别观察到显著的抑制，这证明了这些siRNA分子剂量的治疗窗口。

另外，记录了细胞攻击后的小鼠体重，并描述在图17D中。由该图可知，在所述处理方案下，小鼠体重没有减少，这证明没有关于作为动物健康的通用指征的体重的总毒性作用。

参考文献

在此本文参考了现有技术的不同文献，将所述文献，即如下阅读的完整参考文献资料的全部引入本文作为参考。

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说明书、权利要求、序列表和/或附图中公开的本发明特征是可以分别地和组合地用于以其不同形式实现本发明的材料。

Claims

1.包括双链结构的核酸分子，

其中，所述双链结构包括第一链和第二链，

其中，所述第一段序列包括这样的核酸序列，所述核酸序列至少部分地与SEQ.ID.No.1(NM_013355)所述的核酸序列的核苷酸核心序列或其部分互补，

来自SEQ.ID.No.1的核苷酸位置482-500(SEQ.ID.No.2)；

来自SEQ.ID.No.1的核苷酸位置1555-1573(SEQ.ID.No.4)；

来自SEQ.ID.No.1的核苷酸位置1556-1574(SEQ.ID.No.6)；

来自SEQ.ID.No.1的核苷酸位置1559-1577(SEQ.ID.No.8)；

来自SEQ.ID.No.1的核苷酸位置1566-1584(SEQ.ID.No.10)；

来自SEQ.ID.No.1的核苷酸位置2094-2112(SEQ.ID.No.12)；

来自SEQ.ID.No.1的核苷酸位置2102-2120(SEQ.ID.No.14)；

来自SEQ.ID.No.1的核苷酸位置2286-2304(SEQ.ID.No.16)；

来自SEQ.ID.No.1的核苷酸位置2761-2779(SEQ.ID.No.18)；

来自SEQ.ID.No.1的核苷酸位置2763-2781(SEQ.ID.No.20)；

来自SEQ.ID.No.1的核苷酸位置2764-2782(SEQ.ID.No.22)；

来自SEQ.ID.No.1的核苷酸位置2843-2861(SEQ.ID.No.24)；

来自SEQ.ID.No.1的核苷酸位置2844-2862(SEQ.ID.No.26)；或

来自SEQ.ID.No.1的核苷酸位置2846-2864(SEQ.ID.No.28)；

来自SEQ.ID.No.1的核苷酸位置1555-1573(SEQ.ID.No.4)；

来自SEQ.ID.No.1的核苷酸位置1556-1574(SEQ.ID.No.6)；

来自SEQ.ID.No.1的核苷酸位置1559-1577(SEQ.ID.No.8)；

来自SEQ.ID.No.1的核苷酸位置1566-1584(SEQ.ID.No.10)；

来自SEQ.ID.No.1的核苷酸位置2094-2112(SEQ.ID.No.12)；或

来自SEQ.ID.No.1的核苷酸位置2286-2304(SEQ.ID.No.16)；

2.按照权利要求1的核酸，其中所述第一段序列与所述核苷酸核心序列或其部分互补。

3.按照权利要求1-2中任一项的核酸，其中所述第一段序列另外与所述核苷酸核心序列3’末端后面的区域和/或所述核苷酸核心序列5’末端前面的区域互补。

4.按照权利要求1-3中任一项的核酸，其中所述第一段序列以18-29个核苷酸，优选地，19-25个核苷酸，和更优选地，19-23个核苷酸，与所述靶核酸互补。

5.按照权利要求4的核酸，其中所述核苷酸是连续的核苷酸。

6.按照权利要求1的核酸，其中所述第一段序列和/或所述第二段序列包括18-29个连续的核苷酸，优选地，19-25个连续的核苷酸，和更优选地，19-23个连续的核苷酸。

7.按照权利要求1-6中任一项的核酸，其中所述第一链由所述第一段序列组成，和/或所述第二链由所述第二段序列组成。

8.包括双链结构的核酸分子，优选地按照权利要求1-7中任一项的核酸分子，其中所述双链结构是通过第一链和第二链形成的，其中所述第一链包括连续核苷酸的第一段序列，且所述第二链包括连续核苷酸的第二段序列，和其中所述第一段序列至少部分地与所述第二段序列互补，其中

优选地，

9.按照权利要求1-8中任一项的核酸分子，其中所述第一段序列和/或第二段序列包括多个在2’位处具有修饰、并形成规则的优选地交替位置模式的被修饰的核苷酸组，其中，优选地在该段序列中，每个被修饰的核苷酸组在一端或两端都侧邻侧翼核苷酸的组，其中，形成侧翼核苷酸组的侧翼核苷酸是未修饰的核苷酸或具有与所述被修饰核苷酸的修饰不同的修饰的核苷酸。

10.按照权利要求1-9中任一项的核酸，其中所述第一段序列和/或所述第二段序列包括被修饰的核苷酸组的模式和/或侧翼核苷酸组的模式。

11.按照权利要求1-10，优选地权利要求1-8中任一项的核酸，其中所述第一段序列和/或所述第二段序列在3’末端包括二核苷酸，其中所述二核苷酸优选地是TT。

12.按照权利要求11的核酸，其中所述第一段序列和/或所述第二段序列的长度由19-21个核苷酸组成。

13.按照权利要求1-10，优选地权利要求1-8中任一项的核酸，其中所述第一段和/或第二段序列在3’末端包括1-5个核苷酸的突出端。

14.按照权利要求13的核酸，其中所述双链结构的长度是约16-24个核苷酸对，优选地，20-22个核苷酸对。

15.按照权利要求1-14中任一项的核酸，其中所述第一链和所述第二链彼此共价连接，优选地，所述第一链的3’末端共价连接于所述第二链的5’末端。

16.按照权利要求1-15中任一项的核酸，其中所述分子由下列两条链的每一条组成，且其中带下划线的核苷酸是2’-O-甲基：

17.包括按照权利要求1-16中任一项的核酸的脂质体制剂。

18.包括按照权利要求1-16中任一项的核酸和脂质体的脂质复合物。

19.按照权利要求18的脂质复合物，其中所述脂质体由下列各项组成：

20.按照权利要求19的脂质复合物，其中所述脂质复合物的ζ-电势是约3540-6055mV，优选地，约45-50mV。

21.按照权利要求19或20的脂质复合物，其中如通过QELS确定，所述脂质复合物具有约50-400nm，优选地，约100-140nm，和更优选地，约110-130nm的尺寸。

22.载体，优选地，表达载体，其包括或编码按照权利要求1-16中任一项的核酸。

23.包括按照以上权利要求中任一项的核酸或按照以上权利要求中任一项的载体的细胞。

24.组合物，优选地，药物组合物，其包括按照权利要求1-16中任一项的核酸，按照权利要求17的脂质体制剂，按照权利要求18-21中任一项的脂质复合物，按照权利要求22的载体和/或按照权利要求23的细胞。

25.按照权利要求24的组合物，其中所述组合物是药物组合物，其任选地进一步包括药用赋形剂。

26.按照权利要求25的组合物，其中所述组合物是药物组合物，并且所述药物组合物用于治疗血管发生-依赖性疾病，优选地，由不足、异常或过度血管发生所表征或引起的疾病。

27.按照权利要求26的药物组合物，其中所述血管发生是脂肪组织、皮肤、心脏、眼睛、肺、肠、生殖器官、骨和关节的血管发生。

28.按照权利要求26或27的药物组合物，其中所述疾病选自包括下列各项的组：传染病、自体免疫病症、血管畸形、动脉粥样硬化、移植动脉病、肥胖、银屑病、疣、变应性皮炎、玻璃体持续增生综合征、糖尿病性视网膜病、早产儿视网膜病、与年龄相关的黄斑疾病、脉络膜新血管形成、原发性肺动脉高血压、哮喘、鼻息肉、炎性肠和牙周疾病、腹水、腹膜粘连、子宫内膜异位、子宫出血、卵巢囊肿、卵巢、卵巢过度刺激、关节炎、滑膜炎、骨髓炎、骨赘形成。

29.按照权利要求25-28中任一项，优选地权利要求25的药物组合物，所述药物组合物用于治疗肿瘤疾病，优选地癌症疾病和更优选地实体肿瘤。

30.按照权利要求25-29中任一项，优选地权利要求29的药物组合物，所述药物组合物用于治疗选自包括下列各项的组中的疾病：骨癌、乳腺癌、前列腺癌、消化系统癌症、结肠直肠癌、肝癌、肺癌、肾癌、泌尿生殖器癌、胰腺癌、垂体癌、睾丸癌、眶癌、头颈癌、中枢神经系统癌症和呼吸系统癌症。

31.按照权利要求1-16中任一项的核酸、按照权利要求17的脂质体制剂、按照权利要求18-21中任一项的脂质复合物、按照权利要求22的载体和/或按照权利要求23的细胞用于制造药物的用途。

32.按照权利要求31的用途，其中所述药物用于治疗如权利要求26-30中任一项所定义的任意疾病。

33.按照权利要求32的用途，其中所述药物与一种或数种其他治疗法组合使用。

34.按照权利要求33的用途，其中所述治疗法选自包括下列各项的组：化学疗法、冷冻疗法、高热、抗体疗法、放射疗法和抗-血管发生疗法。

35.按照权利要求34的用途，其中所述治疗法是抗体疗法，且更优选地，利用抗-VEGF抗体或抗-血管生成素(anti-angiopoetin)抗体的抗体疗法。

36.按照权利要求34的用途，其中所述抗-血管发生疗法使用激酶受体抑制剂，优选地，酪氨酸激酶受体抑制剂，其中所述受体选自包括VEGF受体、PDGF受体、Tie-2、FGFR和EGFR的组。

37.按照权利要求36的用途，其中所述抑制剂选自包括下列各项的组：siRNA、反义分子、适体、spiegelmer、高亲和性结合肽、肽适体、抗促成素和抗体。