CN102292443A - 使用短干扰核酸(siNA)的RNA干扰介导的上皮钠通道(ENaC)基因表达的抑制 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于研究、诊断和治疗响应ENaC基因表达和/或活性调节和/或调节ENaC基因表达途径的性状、疾病和病状的化合物、组合物和方法。具体而言，本发明涉及能够介导针对ENaC基因表达的RNA干扰(RNAi)或介导针对ENaC基因表达的RNA干扰(RNAi)的双链核酸分子，包括小核酸分子，例如短干扰核酸(siNA)、短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微小RNA(miRNA)、和短发夹RNA(shRNA)分子。

Description

使用短干扰核酸(siNA)的RNA干扰介导的上皮钠通道(ENaC)基因表达的抑制

本申请要求于2009年3月6日提交的美国临时申请号61/158,316、于2008年11月26日提交的美国临时申请号61/118,160、于2008年11月26日提交的美国临时申请号61/118,157、于2008年11月26日提交的美国临时申请号61/118,150、于2008年11月26日提交的美国临时申请号61/118,144的利益。本申请要求所有列出申请的利益，这包括附图在此整体引入本文作为参考。

序列表

依照37CFR§1.52(e)(5)，经由EFS提交的序列表引入本文作为参考。经由EFS提交的序列表文本文件包含于2009年11月18日创建的文件″SequenceListing72WPCT″，其大小为98,183字节。

发明领域

本发明涉及用于研究、诊断和治疗响应上皮钠通道(下文ENaC)调节、基因表达和/或活性的性状、疾病和状况的化合物、组合物和方法，所述上皮钠通道也称为钠通道非神经元1(SCNN1)或阿米洛利敏感钠通道(ASSC)。

本发明还指向涉及性状、疾病和状况的化合物、组合物和方法，所述性状、疾病和状况响应上皮钠通道(ENaC)基因表达途径或其他细胞过程中涉及的基因表达和/或活性的调节，所述基因介导此类性状、疾病和状况的维持或发展。具体而言，本发明涉及能够介导或介导针对上皮钠通道(ENaC)基因表达的RNA干扰(RNAi)的双链核酸分子，包括小核酸分子，例如短干扰核酸(siNA)、短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微小RNA(miRNA)、和短发夹RNA(shRNA)分子，包括此类小核酸分子的混合物和此类小核酸分子的脂质纳米颗粒(nanoparticle)(LNP)制剂。本发明还涉及小核酸分子，例如siNA，siRNA，和可以抑制内源RNA分子功能，例如内源ENaC微小RNA(miRNA)(例如，miRNA抑制剂)或内源ENaC短干扰RNA(siRNA)(例如siRNA抑制剂)，或可以抑制RISC功能(例如，RISC抑制剂)的其他分子，以通过干扰此类内源RNA或与此类内源RNA相关的蛋白质(例如，RISC)的调节功能来调节ENaC基因表达，包括此类小核酸分子的混合物和此类小核酸分子的脂质纳米颗粒(LNP)制剂。此类小核酸分子在例如提供用于治疗响应受试者或生物中的ENaC基因表达调节的性状、疾病和状况的组合物中是有用的，所述性状、疾病和状况例如呼吸性疾病、性状和状况，包括但不限于COPD、哮喘、嗜酸粒细胞性咳嗽、支气管炎、囊性纤维化、肉瘤样病、肺纤维化、鼻炎、窦炎和/或与受试者或生物中的ENaC基因表达或活性相关的其他疾病状态。

发明背景

下文是关于RNAi的相关技术的讨论。该讨论仅为了理解下述本发明而提供。该概述并非下文描述的任何工作是请求保护的本发明的现有技术的承认。

RNA干扰指动物中由短干扰RNA(siRNA)介导的序列特异性转录后基因沉默的过程(Zamore等人，2000，Cell，101，25-33；Fire等人，1998，Nature，391，806；Hamilton等人，1999，Science，286，950-951；Lin等人，1999，Nature，402，128-129；Sharp，1999，Genes& Dev.，13：139-141；和Strauss，1999，Science，286，886)。植物中的相应过程(Heifetz等人，国际PCT公开号WO 99/61631)通常称为转录后基因沉默或RNA沉默，并且在真菌中也称为压抑。转录后基因沉默的过程被认为是用于阻止外来基因表达的进化上保守的细胞防御机制，并且通常由不同的植物区系和门共享(Fire等人，1999，TrendsGenet.，15，358)。使免于外来基因表达的此类保护可能响应双链RNA(dsRNA)的产生而经由细胞应答发展出来，所述双链RNA衍生自病毒感染或转座子元件随机整合到宿主基因组内，所述细胞应答特异性破坏同源单链RNA或病毒基因组RNA。细胞中dsRNA的存在通过仍需充分表征的机制触发RNAi应答。这种机制似乎不同于涉及双链RNA特异性核糖核酸酶的其他已知机制，例如起因于dsRNA介导的蛋白激酶PKR激活和通过核糖核酸酶L导致mRNA的非特异性切割的2′，5′-寡腺苷酸合成酶的干扰素应答(参见例如美国专利号6,107,094；5,898,031；Clemens等人，1997，J.Interferon & Cytokine Res.，17，503-524；Adah等人，2001，Curr.Med.Chem.，8，1189)。

细胞中长dsRNA的存在刺激称为切酶(dicer)的核糖核酸酶III酶的活性(Bass，2000，Cell，101，235；Zamore等人，2000，Cell，101，25-33；Hammond等人，2000，Nature，404，293)。切酶涉及dsRNA加工成称为短干扰RNA(siRNA)的dsRNA短片段(Zamore等人，2000，Cell，101，25-33；Bass，2000，Cell，101，235；Berstein等人，2001，Nature，409，363)。衍生自切酶活性的短干扰RNA一般为长度约21个-约23个核苷酸并且包含约19个碱基对双链体(Zamore等人，2000，Cell，101，25-33；Elbashir等人，2001，GenesDev.，15，188)。切酶已牵涉于来自保守结构的前体RNA的21-和22-核苷酸小时序RNA(stRNA)的切割，所述小时序RNA牵涉于翻译控制(Hutvagner等人，2001，Science，293，834)。RNAi应答还以通常称为RNA诱导性沉默复合物(RISC)的内切核酸酶复合物为特征，所述复合物介导具有与siRNA双链体的反义链互补的序列的单链RNA切割。靶RNA的切割发生于与siRNA双链体的反义链互补的区域中部。(Elbashir等人，2001，Genes Dev.，15，188)。

RNAi已在多种系统中进行研究。Fire等人，1998，Nature，391，806首先在秀丽隐杆线虫(C.elegans)中观察到RNAi。Bahramian和Zarbl，1999，Molecular and Cellular Biology，19，274-283以及Wianny和Goetz，1999，Nature Cell Biol，2，70描述了在哺乳动物系统中由dsRNA介导的RNAi。Hammond等人，2000，Nature，404，293描述了在用dsRNA转染的果蝇(Drosophila)细胞中的RNAi。Elbashir等人，2001，Nature，411，494和Tuschl等人，国际PCT公开号WO 01/75164描述了通过在培养的哺乳动物细胞中引入合成的21-核苷酸RNA的双链体诱导的RNAi，所述哺乳动物细胞包括人胚肾和HeLa细胞。果蝇胚胎溶解产物中的近期工作(Elbashir等人，2001，EMBO J.，20，6877和Tuschl等人，国际PCT公开号WO 01/75164)已揭示了关于siRNA长度、结构、化学组成、和介导有效RNAi活性所必需的序列的某些要求。这些研究已显示21-核苷酸siRNA双链体在包含3′-末端二核苷酸突出端时是最有活性的。此外，用2′-脱氧(2′-H)或2′-O-甲基核苷酸完全置换1条或2条siRNA链取消了RNAi活性，而用2′-脱氧核苷酸(2′-H)置换3′-末端siRNA突出端核苷酸显示是耐受的。siRNA双链体中心处的单个错配序列也显示取消了RNAi活性。此外，这些研究还指出靶RNA中切割位点的位置由siRNA引导序列的5′-末端而不是引导序列的3′-末端限定(Elbashir等人，2001，EMBO J.，20，6877)。其他研究已指出siRNA双链体的靶互补链上的5′-磷酸是siRNA活性所需的，并且ATP用于维持siRNA上的5′-磷酸部分(Nykanen等人，2001，Cell，107，309)。

研究已显示用脱氧核糖核苷酸替换具有2-核苷酸的3′-突出端的21-聚体siRNA双链体的3′末端核苷酸突出端区段对RNAi活性没有不利作用。用脱氧核糖核苷酸替换siRNA每个末端上的最高达4个核苷酸已报道是良好耐受的，而使用脱氧核糖核苷酸的完全置换导致无RNAi活性(Elbashir等人，2001，EMBO J.，20，6877和Tuschl等人，国际PCT公开号WO 01/75164)。此外，Elbashir等人，同上，同样报道使用2’-O-甲基核苷酸的siRNA置换完全取消了RNAi活性。Li等人，国际PCT公开号WO 00/44914和Beach等人，国际PCT公开号WO01/68836预先提出siRNA可以包括对磷酸-糖主链或核苷的修饰，以包括至少一个氮或硫杂原子，然而，无一申请假定此类修饰到何种程度在siRNA分子中将是耐受的，也没有提供此类经修饰的siRNA的任何进一步指导或例子。Kreutzer等人，加拿大专利申请号2,359,180也描述了用于在dsRNA构建体中使用的某些化学修饰，以抵抗双链RNA依赖性蛋白激酶PKR的激活，特别是2′-氨基或2′-O-甲基核苷酸，和包含2′-O或4′-C亚甲桥的核苷酸。然而，Kreutzer等人类似地未能提供关于这些修饰至何种程度在dsRNA分子中将是耐受的例子或指导。

Parrish等人，2000，Molecular Cell，6，1077-1087使用长(＞25nt)siRNA转录物测试了靶向秀丽隐杆线虫中的unc-22基因的某些化学修饰。该作者描述了通过用T7和T3RNA聚合酶掺入硫代硫酸核苷酸类似物将硫代磷酸残基引入这些siRNA转录物内，并且观察到具有2个硫代磷酸酯修饰的碱基的RNA作为RNAi也具有有效性中的相当大减少。此外，Parrish等人报道超过2个残基的硫代磷酸酯修饰使RNA在体外非常不稳定，从而使得干扰活性无法被测定。同前在1081处。该作者还测试了在长siRNA转录物中的核苷酸糖的2′-位置处的某些修饰，并且发现用脱氧核苷酸置换核糖核苷酸产生干扰活性中的相当大减少，特别是在尿苷至胸苷和/或胞苷至脱氧胞苷置换的情况下。同前。此外，该作者测试了某些碱基修饰，包括在siRNA的有义和反义链中，用4-硫尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、和3-(氨基烯丙基)尿嘧啶置换尿嘧啶，和用肌苷置换鸟苷。尽管4-硫尿嘧啶和5-溴尿嘧啶置换似乎是耐受的，Parrish报道肌苷当掺入任一链中时产生干扰活性中的相当大减少。Parrish还报道在反义链中5-碘尿嘧啶和3-(氨基烯丙基)尿嘧啶的掺入同样导致RNAi活性中的相当大减少。

较长dsRNA的使用已得到描述。例如，Beach等人，国际PCT公开号WO 01/68836描述了使用内源衍生的dsRNA用于减弱基因表达的具体方法。Tuschl等人，国际PCT公开号WO 01/75164描述了果蝇体外RNAi系统和特定siRNA分子用于某些功能基因组和某些治疗应用的用途；尽管由于激活干扰素应答的危险，Tuschl，2001，Chem.Biochem.，2，239-245不确定RNAi可以用于治愈遗传疾病或病毒感染。Li等人，国际PCT公开号WO 00/44914描述了特定长度(141bp-488bp)的酶促合成或载体表达的dsRNA用于减弱某些靶基因表达的用途。Zernicka-Goetz等人，国际PCT公开号WO 01/36646描述了使用某一长(550bp-714bp)、酶促合成或载体表达的dsRNA分子用于抑制哺乳动物细胞中的特定基因表达的某些方法。Fire等人，国际PCT公开号WO 99/32619描述了用于将某一长dsRNA分子引入细胞内用于抑制线虫中的基因表达的具体方法。Plaetinck等人，国际PCT公开号WO00/01846描述了关于使用特定长度的dsRNA分子鉴定细胞中负责赋予特定表型的特定基因的某些方法。Mello等人，国际PCT公开号WO01/29058描述了涉及dsRNA介导的RNAi的特定基因的鉴定。Pachuck等人，国际PCT公开号WO 00/63364描述了某一长(至少200个核苷酸)dsRNA构建体。Deschamps Depaillette等人，国际PCT公开号WO99/07409描述了由与某些抗病毒剂组合的特定dsRNA分子组成的具体组合物。Waterhouse等人，国际PCT公开号99/53050和1998，PNAS，95，13959-13964描述了使用某些dsRNA用于减少核酸在植物细胞中的表型表达的某些方法。Driscoll等人，国际PCT公开号WO 01/49844描述了用于促进靶向的生物中的基因沉默的特定DNA表达构建体。

其他人已报道了各种RNAi和基因沉默系统。例如，Parrish等人，2000，Molecular Cell，6，1077-1087描述了靶向秀丽隐杆线虫的unc-22基因的特定化学修饰的dsRNA构建体。Grossniklaus，国际PCT公开号WO 01/38551描述了使用某些dsRNA用于调节植物中的polycomb基因表达的某些方法。Churikov等人，国际PCT公开号WO 01/42443描述了使用某些dsRNA用于修饰生物的遗传特征的某些方法。Cogoni等人，国际PCT公开号WO 01/53475描述了用于分离链孢霉属(Neurospora)沉默基因的某些方法及其用途。Reed等人，国际PCT公开号WO 01/68836描述了用于植物中的基因沉默的某些方法。Honer等人，国际PCT公开号WO 01/70944描述了使用某些dsRNA使用转基因线虫作为帕金森氏病模型的药物筛选的某些方法。Deak等人，国际PCT公开号WO 01/72774描述了可能涉及果蝇中的RNAi的某些果蝇衍生的基因产物。Arndt等人，国际PCT公开号WO 01/92513描述了通过使用增强RNAi的因子用于介导基因抑制的某些方法。Tuschl等人，国际PCT公开号WO 02/44321描述了某些合成的siRNA构建体。Pachuk等人，国际PCT公开号WO 00/63364和Satishchandran等人，国际PCT公开号WO 01/04313描述了使用某一长(超过250bp)、载体表达的dsRNA用于抑制某些多核苷酸序列功能的某些方法和组合物。Echeverri等人，国际PCT公开号WO 02/38805描述了经由RNAi鉴定的某些秀丽隐杆线虫基因。Kreutzer等人，国际PCT公开号WO02/055692、WO 02/055693和EP 1144623B1描述了使用dsRNA用于抑制基因表达的某些方法。Graham等人，国际PCT公开号WO 99/49029和WO 01/70949以及AU 4037501描述了某些载体表达的siRNA分子。Fire等人，US 6,506,559描述了使用介导RNAi的某一长dsRNA(299bp-1033bp)构建体用于抑制体外基因表达的某些方法。Martinez等人，2002，Cell，110，563-574描述了介导HeLa细胞中的RNA干扰的某些单链siRNA构建体，包括某些5′-磷酸化的单链siRNA。Harborth等人，2003，Antisense & Nucleic Acid Drug Development，13，83-105描述了某些化学上和结构上修饰的siRNA分子。Chiu和Rana，2003，RNA，9，1034-1048描述了某些化学上和结构上修饰的siRNA分子。Woolf等人，国际PCT公开号WO 03/064626和WO 03/064625描述了某些化学修饰的dsRNA构建体。Hornung等人，2005，Nature Medicine，11，263-270描述了通过短干扰RNA在浆细胞样树突细胞中经由TLR7的IFN-α的序列特异性有效诱导。Judge等人，2005，NatureBiotechnology，在线公开：2005年3月20日描述了通过合成的siRNA的哺乳动物先天性免疫应答的序列依赖性刺激。Yuki等人，国际PCT公开号WO 05/049821和WO 04/048566描述了用于设计具有最优化活性的短干扰RNA序列和某些短干扰RNA序列的某些方法。Saigo等人，美国专利申请公开号US20040539332描述了设计寡或多核苷酸序列包括短干扰RNA序列用于达到RNA干扰的某些方法。Tei等人，国际PCT公开号WO 03/044188描述了用于抑制靶基因表达的某些方法，所述方法包括用包含DNA和RNA的双链多核苷酸转染细胞、组织或个别生物，所述双链多核苷酸具有与靶基因的至少部分核苷酸序列基本上等同的核苷酸序列。

Mattick，2005，Science，309，1527-1528；Claverie，2005，Science，309，1529-1530；Sethupathy等人，2006，RNA，12，192-197；和Czech，2006 NEJM，354，11：1194-1195；Hutvagner等人，US 20050227256，和Tuschl等人，US 20050182005全都描述了可以经由立体阻断抑制miRNA功能的反义分子并且全部整体引入本文作为参考。

下述美国专利申请公开提供了一般而言的siRNA分子和磷酸二酯酶的基本描述：US-20050287551；US-20050164220；US-20050191627；US-20050118594；US-20050153919；US-20050085486；和US-20030158133；全部整体引入本文作为参考。

发明概述

本发明涉及使用短干扰核酸(siNA)分子通过RNA干扰(RNAi)用于调节上皮钠通道(ENaC)基因表达的化合物、组合物和方法，所述基因例如与炎性和/或呼吸性疾病和状况的发展或维持相关的那些ENaC基因。本发明还涉及使用小核酸分子通过RNA干扰(RNAi)用于调节ENaC基因表达途径和/或活性中涉及的其他基因的表达和活性的化合物、组合物和方法。特别地，本发明的特征在于用于调节ENaC基因表达和/或活性途径中涉及的ENaC基因和/或其他基因表达的小核酸分子，例如短干扰核酸(siNA)、短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微小RNA(miRNA)、和短发夹RNA(shRNA)分子和方法。

本发明还涉及小核酸分子，例如siNA、siRNA和可以抑制内源RNA分子功能，例如内源微小RNA(miRNA)(例如，miRNA抑制剂)或内源短干扰RNA(siRNA)(例如siRNA抑制剂)，或可以抑制RISC功能(例如，RISC抑制剂)的其他分子，以通过干扰此类内源RNA或与此类内源RNA相关的蛋白质(例如，RISC)的调节功能来调节ENaC基因表达。此类分子在本文中统称为RNAi抑制剂。

本发明的siNA或RNAi抑制剂可以是未修饰或化学修饰的。本发明的siNA或RNAi抑制剂可以是化学合成的、由载体表达的或酶促合成的。本发明的特征还在于通过RNA干扰(RNAi)能够调节细胞中的ENaC基因表达或活性的各种化学修饰的合成短干扰核酸(siNA)分子。本发明的特征还在于各种化学修饰的合成短核酸(siNA)分子，其能够通过与miRNA、siRNA或RISC相互作用且因此下调或抑制细胞或生物中的RNA干扰(RNAi)、翻译抑制、或转录沉默来调节细胞中的RNAi活性。化学修饰的siNA和/或RNAi抑制剂的使用通过增加的对于体内核酸酶降解的抗性和/或通过改善的细胞摄取来改善天然siNA分子和/或RNAi抑制剂的各种性质。此外，与早期公开的研究相反，具有多重化学修饰的本发明的siNA分子，包括完全修饰的siRNA具有超过最低限度修饰或未修饰siRNA的保留或改善的RNAi活性。因此，申请人在本文中教导了在天然siRNA活性上保留或改善的化学修饰的siRNA(在本文中一般称为siNA)。本发明的siNA分子提供了用于多种治疗、预防、化妆品、兽医、诊断、靶确认、基因组发现、基因工程和药物基因组学(pharmacogenomic)应用的有用试剂和方法。

上皮钠通道(ENaC，或钠通道非神经元1(SCNN1)或阿米洛利敏感钠通道(ASSC))是膜结合的离子通道，其对于Li⁺、质子且特别是Na⁺是可渗透的。它是‘组成性激活的’通道，即不需要门控刺激且在静息时是开放的。ENaC是由3个不同亚单位组成的异聚体蛋白质-α(SCNN1A)、β(SCNN1B)和γ(SCNN1G)。确切化学计量学直到最近仍不明了，但基于与ASIC通道的同源性，几乎确定是异源三聚体(Jasti，J.等人(2007)Nature 449第316-323页)。每个亚单位由2个跨膜螺旋和胞外环组成。所有多肽的氨基和羧基末端都位于细胞溶质中。此外，存在第四个、所谓的δ-亚单位，其与α-亚单位共享显著同源性，并且可以与β-和γ-亚单位一起形成功能离子通道。

在一个实施方案中，本发明的特征在于一种或多种siNA分子和/或RNAi抑制剂和方法，其独立或组合调节编码上皮钠通道(ENaC)的一种或多种ENaC基因表达，例如编码α(SCNN1A)、β(SCNN1B)或γ(SCNN1G)亚单位序列的基因，包括通过表7中所示的GenBank登记号提及的那些序列。本文提及“ENaC”包括α(SCNN1A)、β(SCNN1B)或γ(SCNN1G)亚单位序列中的任何或所有。在一个优选实施方案中，本发明的特征在于一种或多种siNA分子和/或RNAi抑制剂和方法，其独立或组合地调节编码α(SCNN1A)亚单位的一种或多种ENaC基因的表达。参考示例性编码上皮钠通道(ENaC)基因提供了本发明的各个方面和实施方案的下文描述。本发明还涉及与性状、疾病和状况有关的化合物、组合物和方法，所述性状、疾病和状况响应涉及上皮钠通道(ENaC)基因表达途径或其他细胞过程的基因表达和/或活性调节，所述其他细胞过程介导此类性状、疾病和状况的维持或发展。然而，此类提及仅意欲是示例性的，并且本发明的各种方面和实施方案也涉及表达可替代的ENaC基因的其他基因，例如突变ENaC基因、ENaC基因的同种型、因物种而不同或因受试者而不同的ENaC变体、和ENaC mRNA的可变剪接变体(“剪接变体”)。此类另外基因可以使用对于本文示例性ENaC基因和序列在本文中描述的方法就靶位点进行分析。因此，其他基因的调节和此类调节的作用可以如本文描述的执行。换言之，如本文在下文中定义和在所述实施方案中描述的，术语“ENaC”意欲包含与本文疾病、性状和状况的发展和/或维持相关的基因，例如编码ENaC多肽的基因、ENaC调控多核苷酸(例如ENaC miRNA和siRNA)、突变ENaC基因和ENaC基因的同种型、以及涉及基因表达和/或活性的ENaC途径的其他基因。因此，本文关于术语“ENaC”描述的实施方案中的每一个都可应用于由术语“ENaC”包含的所有蛋白质、肽、多肽和/或多核苷酸分子，如那个术语在本文中定义的。总之，此类基因靶在本文中一般也被称为“靶”序列。

在一个实施方案中，本发明的特征在于包括靶向不同多核苷酸靶的本发明的2种或更多种不同siNA分子和/或RNAi抑制剂(例如siNA、双链体形成siNA、或多功能siNA或其任何组合)的组合物，例如靶向ENaC RNA或DNA的不同区域(例如本文的2种不同靶位点或ENaC靶例如不同同种型的任何组合)或编码和非编码靶。此类siNA分子库可以提供增加的疗效。

在一个实施方案中，本发明的特征在于本发明的2种或更多不同siNA分子的库(例如，siNA、双链体形成siNA、或多功能siNA或其任何组合)，所述siNA分子对不同的多核苷酸靶具有特异性，例如靶ENaC RNA或DNA的不同区域(例如本文的2个不同靶位点或ENaC靶或途径靶例如不同ENaC同种型的任何组合)或编码和非编码靶，其中所述库包含靶向约2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多不同ENaC靶的siNA分子。

在一个实施方案中，本发明的特征在于2种或更多种不同siNA分子和/或RNAi抑制剂的库，所述siNA分子和/或RNAi抑制剂对于ENaC靶具有特异性，例如不同ENaC同种型靶或其任何组合。在一个实施方案中，本发明的特征在于对于ENaC具有特异性的2种或更多种不同siNA分子和/或RNAi抑制剂的库。在一个实施方案中，本发明的特征在于对于ENaC具有特异性的2种或更多种不同siNA分子和/或RNAi抑制剂的库。在一个实施方案中，本发明的特征在于对于ENaC及其同种型具有特异性的2种或更多种不同siNA分子和/或RNAi抑制剂的库。

由于关于ENaC基因跨越不同生物或不同受试者的序列变异性的可能性，选择siNA分子用于广泛治疗应用可能涉及ENaC基因的保守区。在一个实施方案中，本发明涉及靶向ENaC基因的保守区或跨越不同ENaC靶是保守的区域的siNA分子和/或RNAi抑制剂。设计为靶向各种ENaC靶的保守区的siNA分子和/或RNAi抑制剂使得能够有效抑制在不同患者群体中的ENaC靶基因表达。由于ENaC同工型的酶促活性和细胞特异性表达模式中的变异，选择siNA分子用于治疗靶治疗应用可能涉及特异性ENaC同种型。在一个实施方案中，本发明涉及靶向ENaC基因的保守区或跨越不同ENaC靶是保守的区域的siNA分子和/或RNAi抑制剂。在另一个实施方案中，本发明的特征在于下调靶ENaC基因表达或指导ENaC靶RNA切割的双链siNA，而不影响ENaC表达。设计为靶向各种ENaC靶的保守区的siNA分子和/或RNAi抑制剂使得能够有效抑制在不同患者群体中的ENaC同种型表达。

在一个实施方案中，本发明的特征在于双链核酸分子，例如siNA分子，其中一条链包含与ENaC靶核酸分子中的预定核苷酸序列或其部分具有互补性的核苷酸序列。在一个实施方案中，预定核苷酸序列是本文描述的核苷酸ENaC靶序列。在另一个实施方案中，预定核苷酸序列是本领域已知的ENaC靶序列。

在一个实施方案中，本发明的特征在于下调ENaC靶基因表达或指导ENaC靶RNA切割的双链短干扰核酸(siNA)分子，其中所述siNA分子包含约15个-约30个碱基对。

在一个实施方案中，本发明的特征在于指导ENaC靶RNA切割的双链短干扰核酸(siNA)分子，其中所述siNA分子包含约15个-约30个碱基对。

在一个实施方案中，本发明的特征在于经由RNA干扰(RNAi)指导靶ENaC RNA切割的双链短干扰核酸(siNA)分子，其中所述双链siNA分子包含第一条和第二条链，siNA分子的每条链长度为约15个-约30个(例如，约15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个)核苷酸，siNA分子的第一条链包含与靶ENaC RNA具有足够互补性的核苷酸序列以用于siNA分子经由RNA干扰指导靶ENaC RNA的切割，且所述siNA分子的第二条链包含与第一条链互补的核苷酸序列。在一个具体实施方案中，例如，siNA分子的每条链长度为约15个-约30个核苷酸。

在一个实施方案中，本发明的特征在于经由RNA干扰(RNAi)指导靶ENaC RNA切割的双链短干扰核酸(siNA)分子，其中所述双链siNA分子包含第一条和第二条链，siNA分子的每条链长度为约18个-约23个(例如，约18个、19个、20个、21个、22个或23个)核苷酸，siNA分子的第一条链包含与ENaC靶RNA具有足够互补性的核苷酸序列以用于siNA分子经由RNA干扰指导ENaC靶RNA的切割，且所述siNA分子的第二条链包含与第一条链互补的核苷酸序列。

在一个实施方案中，本发明的特征在于经由RNA干扰(RNAi)指导ENaC靶RNA切割的化学合成的双链短干扰核酸(siNA)分子，其中所述siNA分子的每条链长度为约15个-约30个核苷酸；且siNA分子的一条链包含与ENaC靶RNA具有足够互补性的核苷酸序列以用于siNA分子经由RNA干扰指导ENaC靶RNA的切割。

在一个实施方案中，本发明的特征在于经由RNA干扰(RNAi)指导ENaC靶RNA切割的化学合成的双链短干扰核酸(siNA)分子，其中所述siNA分子的每条链长度为约18个-约23个核苷酸；且siNA分子的一条链包含与ENaC靶RNA具有足够互补性的核苷酸序列以用于siNA分子经由RNA干扰指导ENaC靶RNA的切割。

在一个实施方案中，本发明的特征在于下调ENaC靶基因表达或指导ENaC靶RNA切割的siNA分子，例如，其中所述ENaC靶基因或RNA包含蛋白质编码序列。在一个实施方案中，本发明的特征在于下调ENaC靶基因表达或指导ENaC靶RNA切割的siNA分子，例如，其中所述ENaC靶基因或RNA包含非编码序列或涉及ENaC靶基因表达的调节元件(例如，非编码RNA、miRNA、stRNA等)。

在一个实施方案中，本发明的siNA用于抑制ENaC靶基因或ENaC靶基因家族的表达，其中所述ENaC基因或ENaC基因家族序列共享序列同源性。此类同源序列可以如本领域已知的进行鉴定，例如使用序列比对。siNA分子可以被设计为靶向此类同源ENaC序列，例如使用完全互补的序列或通过掺入非规范碱基对，例如错配和/或摆动碱基对，这可以提供另外的ENaC靶序列。在其中错配被鉴定的情况下，非规范碱基对(例如，错配和/或摆动碱基)可以用于产生靶向超过一种ENaC基因序列的siNA分子。在非限制性例子中，非规范碱基对例如UU和CC碱基对用于产生siNA分子，其能够靶向共享序列同源性的不同ENaC多核苷酸靶的序列。照这样，使用本发明的siNA的一个优点是单一siNA可以被设计为包括与核苷酸序列互补的核酸序列，所述核苷酸序列在同源基因之间是保守的。在这种方法中，单一siNA可以用于抑制超过一种基因的表达而不是使用超过一种siNA分子靶向不同基因。

在一个实施方案中，本发明的特征在于具有针对ENaC靶RNA(例如，编码或非编码RNA)的RNAi活性的siNA分子，其中所述siNA分子包含与任何ENaC RNA序列互补的序列，例如具有如本文表7中所示ENaC GenBank登记号的那些序列，所述所有专利都引入本文作为参考。在另一个实施方案中，本发明的特征在于具有针对ENaC靶RNA的RNAi活性的siNA分子，其中所述siNA分子包含与具有变体编码序列的RNA互补的序列，例如与本文描述的或本领域以其他方式已知的疾病、性状、病症和/或状况的维持和/或发展相关的本领域已知的其他突变ENaC基因。如表8中所示或本文其他地方描述的化学修饰可以应用于本发明的任何siNA构建体。在另一个实施方案中，本发明的siNA分子包括这样的核苷酸序列，其可以与ENaC靶基因的核苷酸序列相互作用且从而介导ENaC靶基因表达的沉默，例如，其中siNA通过细胞过程介导ENaC靶基因表达的调节，所述细胞过程介导染色质结构或ENaC靶基因的甲基化模式且阻止ENaC靶基因的转录。

在一个实施方案中，本发明的siNA分子用于下调或抑制起于单元型多态性的ENaC蛋白质的表达，所述单元型多态性与受试者或生物中的性状、疾病或状况相关。ENaC基因、或ENaC蛋白质或RNA水平的分析可以用于鉴定具有此类多态性的受试者或处于发展本文描述的性状、状况或疾病的危险中的那些受试者。这些受试者顺应这样的治疗，例如用本发明的siNA分子和在治疗与靶基因表达相关的疾病中有用的任何其他组合物的治疗。照这样，ENaC蛋白质或RNA水平的分析可以用于确定受试者治疗中的治疗类型和疗程。ENaC蛋白质或RNA水平的监控可以用于预测治疗结果和测定化合物和组合物的效力，所述化合物和组合物调节与性状、病症、状况或疾病相关的某些蛋白质的水平和/或活性。

在本发明的一个实施方案中，siNA分子包含反义链，所述反义链包含与编码ENaC靶蛋白的ENaC核苷酸序列或其部分互补的核苷酸序列。siNA进一步包含有义链，其中所述有义链包含ENaC靶基因的核苷酸序列或其部分。

在另一个实施方案中，siNA分子包含反义区，所述反义区包含与编码ENaC靶蛋白的核苷酸序列或其部分互补的核苷酸序列。siNA进一步包含有义区，其中所述有义区包含ENaC靶基因的核苷酸序列或其部分。

在另一个实施方案中，本发明的特征在于包含核苷酸序列的siNA分子，例如在siNA分子的反义区中与ENaC靶基因的核苷酸序列或序列的部分互补的核苷酸序列。在另一个实施方案中，本发明的特征在于包含区域的siNA分子，例如与包含ENaC靶基因序列的序列或其部分互补的siNA构建体的反义区。

在一个实施方案中，本发明的siNA分子的有义区或有义链与siNA分子的反义区或反义链的那个部分互补，所述部分与ENaC靶多核苷酸序列互补。

在另外一个实施方案中，本发明的特征在于包含序列的siNA分子，例如siNA构建体的反义序列，与包含表7中所示Genbank登记号表示的序列的序列或序列部分互补，所述所有专利都引入本文作为参考。表1b和8以及本文其他地方描述的化学修饰可以应用于本发明的任何siNA构建体。表10中描述的LNP制剂可以应用于本文的任何siNA分子或siNA分子组合。

在本发明的一个实施方案中，siNA分子包含具有约15个-约30个(例如，约15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个)核苷酸的反义链，其中所述反义链与ENaC靶RNA序列或其部分互补，并且其中所述siNA进一步包含具有约15个-约30个(例如，约15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个)核苷酸的有义链，并且其中所述有义链和所述反义链是其中每条链中的至少约15个核苷酸与另一条链互补的不同核苷酸序列。

在一个实施方案中，本发明的siNA分子(例如，双链核酸分子)包含与ENaC的ENaC RNA序列或其部分互补的具有约15个-约30个(例如，约15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个)核苷酸的反义(引导)链。在一个实施方案中，ENaC RNA序列的至少15个核苷酸(例如，15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个核苷酸)与本发明的siNA分子的反义(引导)链互补。

在一个实施方案中，本发明的siNA分子(例如，双链核酸分子)包含具有约15个-约30个(例如，约15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个)核苷酸的有义(过客)链，其包含ENaC RNA的序列或其部分。在一个实施方案中，ENaC RNA序列的至少15个核苷酸(例如，约15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个)核苷酸包含本发明的siNA分子的有义(过客)链。

在本发明的另一个实施方案中，本发明的siNA分子包含具有约15个-约30个(例如，约15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个)核苷酸的反义区，其中所述反义区与ENaC靶DNA序列互补，并且其中所述siNA进一步包含具有约15个-约30个(例如，约15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个)核苷酸的有义区，其中所述有义区和所述反义区包含在其中有义区包含与反义区互补的至少约15个核苷酸的线性分子中。

在一个实施方案中，本发明的siNA分子具有调节由一种或多种ENaC基因编码的ENaC RNA表达的RNAi活性。因为ENaC基因可以彼此共享一定程度的序列同源性，所以通过选择在不同的ENaC靶中共享或可替代地对ENaC靶独特(例如对于任何ENaC同种型独特)的序列，siNA分子可以被设计为靶向一类ENaC基因。因此，在一个实施方案中，siNA分子可以被设计为靶向在几种ENaC基因变体中具有同源性的ENaC多核苷酸序列的保守区，以便用一种siNA分子靶向一类ENaC基因。因此，在一个实施方案中，本发明的siNA分子调节受试者或生物中的一种或多种ENaC同工型的表达。在另一个实施方案中，由于siNA分子介导RNAi活性所需的高度特异性，siNA分子可以被设计为靶向对特定ENaC多核苷酸序列(例如，单个ENaC同工型或ENaC单核苷酸多态性(SNP))独特的序列。

在一个实施方案中，充当RNA干扰基因沉默应答介质的本发明的核酸分子是双链核酸分子。在另一个实施方案中，本发明的siNA分子由包含寡核苷酸之间的约15个-约30个碱基对的双链体核酸分子组成，所述寡核苷酸包含约15个-约30个(例如，约15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个)核苷酸。在另外一个实施方案中，本发明的siNA分子包含具有约1个-约3个(例如，约1个、2个或3个)核苷酸的突出端的双链体核酸分子，例如具有约19个碱基对和3′-末端单核苷酸、二核苷酸、或三核苷酸突出端的约21-核苷酸双链体。在另外一个实施方案中，本发明的siNA分子包含具有平端的双链体核酸分子，其中2个末端是平头的，或可替代地其中末端之一是平头的。

在一个实施方案中，双链核酸(例如，siNA)分子包含核苷酸或非核苷酸突出端。“突出端”意指在双链核酸分子的2条链之间不是碱基配对的核苷酸序列的末端部分(参见例如图6)。在一个实施方案中，本发明的双链核酸分子在双链核酸分子的1条或2条链的3′-末端处可以包含核苷酸或非核苷酸突出端。例如，本发明的双链核酸分子在双链核酸分子的引导链或反义链/区的3′-末端、过客链或有义链/区的3′-末端、或引导链或反义链/区和过客链或有义链/区处可以包含核苷酸或非核苷酸突出端。在另一个实施方案中，本发明的双链核酸(siNA)分子的核苷酸突出端部分包含2′-O-甲基、2′-脱氧、2′-脱氧-2′-氟、2′-脱氧-2′-氟阿拉伯糖基(FANA)、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、2′-O-二氟甲氧基-乙氧基、通用碱基、无环或5-C-甲基核苷酸。在另一个实施方案中，本发明的双链核酸(siNA)分子的非核苷酸突出端部分包含甘油基、脱碱基或反向的脱氧脱碱基非核苷酸。

在一个实施方案中，包含本发明的双链核酸(例如，siNA)分子的突出端部分的核苷酸对应于包含siNA分子的ENaC靶多核苷酸序列的核苷酸。因此，在此类实施方案中，包含本发明的siNA分子的突出端部分的核苷酸包含基于ENaC靶多核苷酸序列的序列，其中包含本发明的siNA分子的引导链或反义链/区的突出端部分的核苷酸可以与ENaC靶多核苷酸序列中的核苷酸互补，且包含本发明的siNA分子的过客链或有义链/区的突出端部分的核苷酸可以包含ENaC靶多核苷酸序列中的核苷酸。此类核苷酸突出端包含可起因于天然dsRNA切酶加工成siRNA的序列。

在一个实施方案中，包含本发明的双链核酸(例如，siNA)分子的突出端部分的核苷酸与ENaC靶多核苷酸序列互补，并且任选如本文所描述的进行化学修饰。照这样，在一个实施方案中，包含本发明的siNA分子的引导链或反义链/区的突出端部分的核苷酸可以与ENaC靶多核苷酸序列中的核苷酸互补，即与siNA分子的引导链或反义链/区中的突出端核苷酸的核苷酸位置互补的ENaC靶多核苷酸序列中的那些核苷酸位置。在另一个实施方案中，包含本发明的siNA分子的过客链或有义链/区的突出端部分的核苷酸可以包含ENaC靶多核苷酸序列中的核苷酸，即对应于siNA分子的过客链或有义链/区中的突出端核苷酸的相同核苷酸位置的ENaC靶多核苷酸序列中的那些核苷酸位置。在一个实施方案中，突出端包含与ENaC靶多核苷酸序列的部分互补的2个核苷酸(例如，3′-GA；3′-GU；3′-GG；3′GC；3′-CA；3′-CU；3′-CG；3′CC；3′-UA；3′-UU；3′-UG；3′UC；3′-AA；3′-AU；3′-AG；3′-AC；3′-TA；3′-TU；3′-TG；3′-TC；3′-AT；3′-UT；3′-GT；3′-CT)突出端。在一个实施方案中，突出端包含不与ENaC靶多核苷酸序列的部分互补的2个核苷酸(例如，3′-GA；3′-GU；3′-GG；3′GC；3′-CA；3′-CU；3′-CG；3′CC；3′-UA；3′-UU；3′-UG；3′UC；3′-AA；3′-AU；3′-AG；3′-AC；3′-TA；3′-TU；3′-TG；3′-TC；3′-AT；3′-UT；3′-GT；3′-CT)突出端。在另一个实施方案中，本发明的siNA分子的突出端核苷酸是2′-O-甲基核苷酸、2′-脱氧-2′-氟阿拉伯糖和/或2′-脱氧-2′-氟核苷酸。在另一个实施方案中，本发明的siNA分子的突出端核苷酸在突出端核苷酸是嘌呤核苷酸的情况下是2′-O-甲基核苷酸，和/或在突出端核苷酸是嘧啶核苷酸的情况下是2′-脱氧-2′-氟核苷酸或2′-脱氧-2′-氟阿拉伯糖核苷酸。在另一个实施方案中，本发明的siNA分子的突出端中的嘌呤核苷酸(存在时)是2′-O-甲基核苷酸。在另一个实施方案中，本发明的siNA分子的突出端中的嘧啶核苷酸(存在时)是2′-脱氧-2′-氟或2′-脱氧-2′-氟阿拉伯糖核苷酸。

在一个实施方案中，包含本发明的双链核酸(例如siNA)分子的突出端部分的核苷酸不与ENaC靶多核苷酸序列互补并且任选如本文所描述的进行化学修饰。在一个实施方案中，突出端包含不与ENaC靶多核苷酸序列的部分互补的3′-UU突出端。在另一个实施方案中，包含本发明的siNA分子的突出端部分的核苷酸是2′-O-甲基核苷酸、2′-脱氧-2′-氟阿拉伯糖和/或2′-脱氧-2′-氟核苷酸。

在一个实施方案中，本发明的双链核酸分子(例如siNA)包含2或3核苷酸突出端，其中突出端中的核苷酸是相同或不同的。在一个实施方案中，本发明的双链核酸分子(例如siNA)包含2或3核苷酸突出端，其中突出端中的核苷酸是相同或不同的，且其中突出端中的一个或多个核苷酸在碱基、糖和/或磷酸主链处进行化学修饰。

在一个实施方案中，本发明的特征在于对ENaC靶核酸分子具有特异性的一个或多个化学修饰的siNA构建体，例如DNA、或编码蛋白质的RNA或与ENaC靶基因表达相关的非编码RNA。在一个实施方案中，本发明的特征在于对核酸分子具有特异性的基于RNA的siNA分子(例如，包含2′-OH核苷酸的siNA)，其包括本文描述的一个或多个化学修饰。此类化学修饰的非限制性例子包括但不限于，硫代磷酸酯核苷酸间键、2′-脱氧核糖核苷酸、2′-O-甲基核糖核苷酸、2′-脱氧-2′-氟核糖核苷酸、4-硫代核糖核苷酸、2′-O-三氟甲基核苷酸、2′-O-乙基-三氟甲氧基核苷酸、2′-O-二氟甲氧基-乙氧基核苷酸(参见例如于2004年11月5日提交的USSN 10/981,966，引入本文作为参考)、“通用碱基”核苷酸、“无环”核苷酸、5-C-甲基核苷酸、2′-脱氧-2′-氟阿拉伯糖(FANA，参见例如Dowler等人，2006，Nucleic Acids Research，34，1669-1675)和末端甘油基和/或反向的脱氧脱碱基残基掺入。当在各种siNA构建体(例如，基于RNA的siNA构建体)中使用时，这些化学修饰显示保持细胞中的RNAi活性，而同时急剧增加这些化合物的血清稳定性。

在一个实施方案中，本发明的siNA分子在siNA分子的内部位置处包含本文描述的化学修饰(例如，2′-O-甲基核糖核苷酸、2′-脱氧-2′-氟核糖核苷酸、4′-硫代核糖核苷酸、2′-O-三氟甲基核苷酸、2′-O-乙基-三氟甲氧基核苷酸、2′-O-二氟甲氧基-乙氧基核苷酸，LNA)。“内部位置”意指siNA双链体的碱基配对位置。

在一个实施方案中，本发明的特征在于对于靶ENaC核酸分子具有特异性的一种或多种化学修饰的siNA构建体，例如ENaC DNA、或编码ENaC蛋白质的ENaC RNA或与靶ENaC基因表达相关的非编码RNA。

在一个实施方案中，本发明的特征在于对于核酸分子具有特异性的基于RNA的siNA分子(例如包含2’-OH核苷酸的siNA)，其包括本文描述的一种或多种化学修饰。此类化学修饰的非限制性例子包括但不限于硫代磷酸酯核苷酸间键、2′-脱氧核糖核苷酸、2’-O-甲基核糖核苷酸、2’-脱氧-2’-氟核糖核苷酸、4’-硫代核糖核苷酸、2’-O-三氟甲基核苷酸、2’-O-乙基-三氟甲氧基核苷酸、2’-O-二氟甲氧基-乙氧基核苷酸(参见例如于2004年11月5日提交的USSN 10/981,966，引入本文作为参考)、“通用碱基”核苷酸、“无环”核苷酸、5-C-甲基核苷酸、和末端甘油基和/或反向脱氧脱碱基残基掺入。当在各种siNA构建体(例如基于RNA的siNA构建体)中使用时，这些化学修饰显示保存在细胞中的RNAi活性，同时急剧增加这些化合物的血清稳定性。此外，与由Parrish等人，同上公开的数据相反，申请人证实多个(超过一个)硫代磷酸酯置换是良好耐受的，并且对于修饰的siNA构建体赋予血清稳定性中的大量增加。

在一个实施方案中，本发明的siNA分子包含经修饰的核苷酸，同时维持介导RNAi的能力。经修饰的核苷酸可以用于改善体外或体内特征，例如稳定性、活性、毒性、免疫应答和/或生物利用率。例如，本发明的siNA分子可以包含作为siNA分子中存在的核苷酸总数目的百分比的经修饰的核苷酸。照这样，本发明的siNA分子一般可以包含约5％-约100％经修饰的核苷酸(例如，约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％经修饰的核苷酸)。例如，在一个实施方案中，本发明的siNA分子中约5％-约100％(例如，约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％经修饰的核苷酸)的核苷酸位置包含核酸糖修饰，例如2′-糖修饰，例如2′-O-甲基核苷酸、2′-脱氧-2′-氟核苷酸、2′-脱氧-2′-氟阿拉伯糖基、2′-O-甲氧基乙基核苷酸、2′-O-三氟甲基核苷酸、2′-O-乙基-三氟甲氧基核苷酸、2′-O-二氟甲氧基-乙氧基核苷酸或2′-脱氧核苷酸。在另一个实施方案中，本发明的siNA分子中约5％-约100％(例如，约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％经修饰的核苷酸)的核苷酸位置包含核酸碱基修饰，例如肌苷、嘌呤、吡啶-4-酮(pyridin-4-one)、吡啶-2-酮、苯基、假尿嘧啶、2，4，6-三甲氧基苯、3-甲基尿嘧啶、二氢尿苷、萘基、氨基苯基、5-烷基胞苷(例如，5-甲基胞苷)、5-烷基尿苷(例如，胸腺嘧啶核苷)、5-卤尿苷(例如，5-溴尿苷)或6-氮杂嘧啶或6-烷基嘧啶(例如6-甲基尿苷)或丙炔修饰。在另一个实施方案中，本发明的siNA分子中约5％-约100％(例如，约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％经修饰的核苷酸)的核苷酸位置包含核酸主链修饰，例如具有本文的式I的主链修饰。在另一个实施方案中，本发明的siNA分子中约5％-约100％(例如，约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％经修饰的核苷酸)的核苷酸位置包含核酸糖、碱基、或主链修饰或其任何组合(例如，核酸糖、碱基、主链或本文的非核苷酸修饰的任何组合)。在一个实施方案中，本发明的siNA分子包含至少约20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％经修饰的核苷酸。给定siNA分子中存在的经修饰的核苷酸的实际百分比将依赖siNA中存在的核苷酸总数目。如果siNA分子是单链的，那么百分比修饰可以基于单链siNA分子中存在的核苷酸总数目。同样地，如果siNA分子是双链的，那么修饰百分比可以基于有义链、反义链、或有义和反义链中存在的核苷酸总数目。

本发明的siNA分子可以包含在siNA分子内的各种位置处经修饰的核苷酸。在一个实施方案中，本发明的双链siNA分子包含在siNA双链体内的内部碱基配对位置处经修饰的核苷酸。例如，内部位置可以包含来自21核苷酸siNA双链体的有义或反义链或区的5′-末端的约3个-约19个核苷酸的位置，所述21核苷酸siNA双链体具有19个碱基对和2核苷酸的3′-突出端。在另一个实施方案中，本发明的双链siNA分子包含在siNA分子的非碱基配对或突出端区域处经修饰的核苷酸。“非碱基配对”意指核苷酸在siNA分子的有义链或有义区和反义链或反义区之间不是碱基配对的。突出端核苷酸可以与相应的ENaC靶多核苷酸序列互补或碱基配对(参见例如图6C)。例如，突出端位置可以包含来自21核苷酸siNA双链体的有义或反义链或区的5′-末端的约20个-约21个核苷酸的位置，所述21核苷酸siNA双链体具有19个碱基对和2核苷酸3′-突出端。在另一个实施方案中，本发明的双链siNA分子包含在siNA分子的末端位置处经修饰的核苷酸。例如，此类末端区域包括siNA分子的有义和/或反义链或区的3′-位置、5′-位置、或3′和5′-位置。在另一个实施方案中，本发明的双链siNA分子包含在碱基配对或内部位置、非碱基配对或突出端区域、和/或末端区域、或其任何组合处经修饰的核苷酸。

本发明的一个方面的特征在于下调ENaC靶基因表达或指导ENaC靶RNA切割的双链短干扰核酸(siNA)分子。在一个实施方案中，双链siNA分子包含一个或多个化学修饰且双链siNA的每条链长度为约21个核苷酸。在一个实施方案中，双链siNA分子不包含任何核糖核苷酸。在另一个实施方案中，双链siNA分子包含一个或多个核糖核苷酸。在一个实施方案中，双链siNA分子的每条链独立地包含约15个-约30个(例如，约15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个)核苷酸，其中每条链包含与另一条链的核苷酸互补的约15个-约30个(例如，约15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个)核苷酸。在一个实施方案中，双链siNA分子的一条链包含与ENaC靶基因的核苷酸序列或其部分互补的核苷酸序列，且双链siNA分子的第二条链包含基本上类似于ENaC靶基因的核苷酸序列或其部分的核苷酸序列。

在另一个实施方案中，本发明的特征在于下调ENaC靶基因表达或指导ENaC靶RNA切割的双链短干扰核酸(siNA)分子，其包含反义区，其中所述反义区包含与ENaC靶基因的核苷酸序列或其部分互补的核苷酸序列，和有义区，其中所述有义区包含基本上类似于ENaC靶基因的核苷酸序列或其部分的核苷酸序列。在一个实施方案中，反义区和有义区独立地包含约15个-约30个(例如，约15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个)核苷酸，其中所述反义区包含与有义区的核苷酸互补的约15个-约30个(例如，约15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个)核苷酸。

在另一个实施方案中，本发明的特征在于下调ENaC靶基因表达或指导ENaC靶RNA切割的双链短干扰核酸(siNA)分子，其包含有义区和反义区，其中所述反义区包含与由ENaC靶基因编码的RNA的核苷酸序列或其部分互补的核苷酸序列，且所述有义区包含与反义区互补的核苷酸序列。

在一个实施方案中，本发明的siNA分子包含平端，即不包括任何突出端核苷酸的末端。例如，包含本文描述的修饰(例如，包含具有式I-VII的核苷酸或包含“Stab 00”-“Stab 36”或“Stab 3F”-“Stab 36F”(表8)或其任何组合(参见表8)的siNA构建体)和/或本文描述的任何长度的siNA分子可以包含平端或无突出端核苷酸的末端。

在一个实施方案中，本发明的任何siNA分子可以包含一个或多个平端，即当平端不具有任何突出端核苷酸时。在一个实施方案中，平端的siNA分子具有等于siNA分子的每条链中存在的核苷酸数目的许多碱基对。在另一个实施方案中，siNA分子包含一个平端，例如其中反义链的5′-末端和有义链的3′-末端不具有任何突出端核苷酸。在另一个例子中，siNA分子包含一个平端，例如其中反义链的3′-末端和有义链的5′-末端不具有任何突出端核苷酸。在另一个例子中，siNA分子包含2个平端，例如其中反义链的3′-末端和有义链的5′-末端以及反义链的5′-末端和有义链的3′-末端不具有任何突出端核苷酸。平端的siNA分子可以包含例如约15个-约30个核苷酸(例如，约15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个核苷酸)。平端的siNA分子中存在的其他核苷酸可以包含例如，错配、凸起、环或摆动碱基对，以调节siNA分子介导RNA干扰的活性。

“平端”意指无突出端核苷酸的双链siNA分子的对称末端或末端。双链siNA分子的2条链在末端处不含突出端核苷酸彼此比对。例如，平端的siNA构建体包含在siNA分子的有义和反义区之间互补的末端核苷酸。

在一个实施方案中，本发明的特征在于下调ENaC靶基因表达或指导ENaC靶RNA切割的双链短干扰核酸(siNA)分子，其中所述siNA分子由2个分开的寡核苷酸片段进行装配，其中一个片段包含有义区且第二个片段包含siNA分子的反义区。有义区可以经由接头分子例如多核苷酸接头或非核苷酸接头与反义区进行连接。

在一个实施方案中，本发明的双链核酸分子(例如siNA)分子包含在维持或增强RNAi活性的位置处的核糖核苷酸。在一个实施方案中，核糖核苷酸存在于siNA分子的有义链或有义区中，其通过允许经由RISC内的酶切割有义链或有义区可以提供RNAi活性(例如，存在于过客链、有义链、或有义区切割位置处的核糖核苷酸，例如19碱基对双链体的过客链的位置9，其通过AGO2酶在RISC中进行切割，参见例如Matranga等人，2005，Cell，123：1-114和Rand等人，2005，Cell，123：621-629)。在另一个实施方案中，siNA分子的引导链或引导区(也称为反义链或反义区)的5′-末端处的一个或多个(例如1个、2个、3个、4个或5个)核苷酸是核糖核苷酸。

在一个实施方案中，本发明的双链核酸分子(例如siNA)分子包含在过客链或过客区(也称为有义链或有义区)内的位置处的一个或多个核糖核苷酸，其允许通过RISC复合物中的酶切割过客链或过客区(例如存在于过客链的位置例如19碱基对双链体的过客链的位置9处的核糖核苷酸例如通过AGO2酶在RISC中进行切割，参见例如Matranga等人，2005，Cell，123：1-114和Rand等人，2005，Cell，123：621-629)。

在一个实施方案中，本发明的siNA分子包含可以相同或不同的至少2个、3个、4个、5个或更多化学修饰。在一个实施方案中，本发明的siNA分子包含至少2个、3个、4个、5个或更多不同的化学修饰。

在一个实施方案中，本发明的siNA分子是双链短干扰核酸(siNA)，其中所述双链核酸分子包含约15个-约30个(例如约15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个)碱基对，且其中所述siNA分子的每条链中的一个或多个(例如，至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个)核苷酸位置包含化学修饰。在另一个实施方案中，siNA包含至少2个、3个、4个、5个或更多不同的化学修饰。

在一个实施方案中，本发明的特征在于下调ENaC靶基因表达或指导ENaC靶RNA切割的双链短干扰核酸(siNA)分子，其中所述siNA分子包含约15个-约30个(例如约15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个)碱基对，且其中所述siNA分子的每条链包含一个或多个化学修饰。在一个实施方案中，双链siNA分子的每条链包含至少2个(例如，2个、3个、4个、5个或更多)不同的化学修饰，例如不同的核苷酸糖、碱基或主链修饰。在另一个实施方案中，双链siNA分子的一条链包含与ENaC靶基因的核苷酸序列或其部分互补的核苷酸序列，且双链siNA分子的第二条链包含基本上类似于ENaC靶基因的核苷酸序列或其部分的核苷酸序列。在另一个实施方案中，双链siNA分子的一条链包含与ENaC靶基因的核苷酸序列或其部分互补的核苷酸序列，且双链siNA分子的第二条链包含基本上类似于ENaC靶基因的核苷酸序列或其部分的核苷酸序列。在另一个实施方案中，siNA分子的每条链包含约15个-约30个(例如约15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个)核苷酸，且每条链包含与另一条链的核苷酸互补的至少约15个-约30个(例如约15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个)核苷酸。ENaC靶基因可以包含例如，在本文中提及或引入本文作为参考的序列。ENaC基因可以包含例如在本文例如表7中通过Genbank登记号提及的序列。

在一个实施方案中，本发明的双链siNA分子的每条链包含不同模式的化学修饰，例如本文的任何“Stab 00”-“Stab 36”或“Stab 3F”-“Stab36F”(表8)修饰模式或其任何组合(参见表8)。具有各种修饰模式的此类siNA分子的有义和反义链的非限制性例子显示于图4和5中。

在一个实施方案中，本发明的siNA分子不包含核糖核苷酸。在另一个实施方案中，本发明的siNA分子包含一个或多个核糖核苷酸(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多核糖核苷酸)。

在一个实施方案中，本发明的siNA分子包含反义区，所述反义区包含与ENaC靶基因的核苷酸序列或其部分互补的核苷酸序列，且siNA进一步包含有义区，所述有义区包含基本上类似于ENaC靶基因的核苷酸序列或其部分的核苷酸序列。在另一个实施方案中，反义区和有义区各自包含约15个-约30个(例如约15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个)核苷酸，且反义区包含与有义区的核苷酸互补的至少约15个-约30个(例如约15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个)核苷酸。在一个实施方案中，双链siNA分子的每条链包含至少2个(例如，2个、3个、4个、5个或更多)不同的化学修饰，例如不同的核苷酸糖、碱基或主链修饰。ENaC靶基因可以包含例如在本文中提及或引入本文作为参考的序列。在另一个实施方案中，siNA是双链核酸分子，其中siNA分子的2条链各自独立地包含约15个-约40个(例如约15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、23个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个或40个)核苷酸，且其中siNA分子的一条链包含与ENaC靶基因的核苷酸序列或其部分互补的至少约15个(例如约15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个或25个或更多)核苷酸。

在一个实施方案中，本发明的siNA分子包含有义区和反义区，其中所述反义区包含与由ENaC靶基因编码的RNA的核苷酸序列或其部分互补的核苷酸序列，且所述有义区包含与反义区互补的核苷酸序列。在一个实施方案中，siNA分子由2个分开的寡核苷酸片段进行装配，其中一个片段包含有义区且第二个片段包含siNA分子的反义区。在另一个实施方案中，有义区可以经由接头分子与反义区进行连接。在另一个实施方案中，有义区经由接头分子例如核苷酸或非核苷酸接头与反义区进行连接。在一个实施方案中，双链siNA分子的每条链包含至少2个(例如，2个、3个、4个、5个或更多)不同的化学修饰，例如不同的核苷酸糖、碱基或主链修饰。ENaC靶基因可以包含例如在本文中提及或引入本文作为参考的序列。

在一个实施方案中，本发明的siNA分子包含一个或多个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或更多)2′-脱氧-2′-氟嘧啶修饰(例如，其中siNA的一个或多个或所有嘧啶(例如，U或C)位置被2′-脱氧-2′-氟核苷酸修饰)。在一个实施方案中，2′-脱氧-2′-氟嘧啶修饰存在于有义链中。在一个实施方案中，2′-脱氧-2′-氟嘧啶修饰存在于反义链中。在一个实施方案中，2′-脱氧-2′-氟嘧啶修饰存在于siNA分子的有义链和反义链中。

在一个实施方案中，本发明的siNA分子包含一个或多个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或更多)2′-O-甲基嘌呤修饰(例如，其中siNA的一个或多个或所有嘌呤(例如，A或G)位置被2′-O-甲基核苷酸修饰)。在一个实施方案中，2′-O-甲基嘌呤修饰存在于有义链中。在一个实施方案中，2′-O-甲基嘌呤修饰存在于反义链中。在一个实施方案中，2′-O-甲基嘌呤修饰存在于siNA分子的有义链和反义链中。

在一个实施方案中，本发明的siNA分子包含一个或多个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或更多)2′-脱氧嘌呤修饰(例如，其中siNA的一个或多个或所有嘌呤(例如，A或G)位置被2′-脱氧核苷酸修饰)。在一个实施方案中，2′-脱氧嘌呤修饰存在于有义链中。在一个实施方案中，2′-脱氧嘌呤修饰存在于反义链中。在一个实施方案中，2′-脱氧嘌呤修饰存在于siNA分子的有义链和反义链中。

在一个实施方案中，本发明的特征在于下调ENaC靶基因表达或指导ENaC靶RNA切割的双链短干扰核酸(siNA)分子，其包含有义区和反义区，其中所述反义区包含与由ENaC靶基因编码的RNA的核苷酸序列或其部分互补的核苷酸序列，且所述有义区包含与反义区互补的核苷酸序列，且其中所述siNA分子具有一个或多个经修饰的嘧啶和/或嘌呤核苷酸。在一个实施方案中，双链siNA分子的每条链包含至少2个(例如，2个、3个、4个、5个或更多)不同的化学修饰，例如不同的核苷酸糖、碱基或主链修饰。在一个实施方案中，有义区中的嘧啶核苷酸是2′-O-甲基嘧啶核苷酸或2′-脱氧-2′-氟嘧啶核苷酸，且有义区中存在的嘌呤核苷酸是2′-脱氧嘌呤核苷酸。在另一个实施方案中，有义区中的嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟嘧啶核苷酸，且有义区中存在的嘌呤核苷酸是2′-脱氧嘌呤核苷酸。在另一个实施方案中，有义区中的嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟嘧啶核苷酸，且有义区中存在的嘌呤核苷酸是2′-脱氧嘌呤核苷酸。在一个实施方案中，反义区中的嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟嘧啶核苷酸，且反义区中存在的嘌呤核苷酸是2′-O-甲基或2′-脱氧嘌呤核苷酸。在上述siNA分子中的任何一种的另一个实施方案中，有义链的非互补区(例如，突出端区域)中存在的任何核苷酸是2′-脱氧核苷酸。

在一个实施方案中，本发明的特征在于下调ENaC靶基因表达或指导ENaC靶RNA切割的双链短干扰核酸(siNA)分子，其中所述siNA分子由2个分开的寡核苷酸片段进行装配，其中一个片段包含有义区且第二个片段包含siNA分子的反义区，且其中包含有义区的片段包括在片段的5′-末端、3′-末端或5′-末端和3′-末端处的末端帽部分。在一个实施方案中，末端帽部分是反向的脱氧脱碱基部分或甘油基部分。在一个实施方案中，siNA分子的2个片段各自独立地包含约15个-约30个(例如约15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个)核苷酸。在另一个实施方案中，siNA分子的2个片段各自独立地包含约15个-约40个(例如约15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、23个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个或40个)核苷酸。在非限制性例子中，siNA分子的2个片段各自包含约21个核苷酸。

在一个实施方案中，本发明的特征在于包含至少一个经修饰的核苷酸的siNA分子，其中所述经修饰的核苷酸是2′-脱氧-2′-氟核苷酸、2′-脱氧-2′-氟阿拉伯糖、2′-O-三氟甲基核苷酸、2′-O-乙基-三氟甲氧基核苷酸、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基核苷酸、或本文和USSN 10/981,966中描述的任何其他经修饰的核苷/核苷酸，所述USSN 10/981,966于2004年11月5日提交，引入本文作为参考。在一个实施方案中，本发明的特征在于包含至少2个(例如，2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多)经修饰的核苷酸的siNA分子，其中所述经修饰的核苷酸选自2′-脱氧-2′-氟核苷酸、2′-脱氧-2′-氟阿拉伯糖、2′-O-三氟甲基核苷酸、2′-O-乙基-三氟甲氧基核苷酸、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基核苷酸、或本文和USSN 10/981,966中描述的任何其他经修饰的核苷/核苷酸，所述USSN 10/981,966于2004年11月5日提交，引入本文作为参考。经修饰的核苷酸/核苷可以是相同或不同的。siNA可以是例如长度约15个-约40个核苷酸。在一个实施方案中，siNA中存在的所有嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟、2′-脱氧-2′-氟阿拉伯糖、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基、4′-硫代嘧啶核苷酸。在一个实施方案中，siNA中经修饰的核苷酸包括至少一个2′-脱氧-2′-氟胞苷或2′-脱氧-2′-氟尿苷核苷酸。在另一个实施方案中，siNA中经修饰的核苷酸包括至少一个2′-脱氧-2′-氟胞苷和至少一个2′-脱氧-2′-氟尿苷核苷酸。在一个实施方案中，siNA中存在的所有尿苷核苷酸是2′-脱氧-2′-氟尿苷核苷酸。在一个实施方案中，siNA中存在的所有胞苷核苷酸是2′-脱氧-2′-氟胞苷核苷酸。在一个实施方案中，siNA中存在的所有腺苷核苷酸是2′-脱氧-2′-氟腺苷核苷酸。在一个实施方案中，siNA中存在的所有鸟苷核苷酸是2′-脱氧-2′-氟鸟苷核苷酸。siNA可以进一步包含至少一个经修饰的核苷酸间键，例如硫代磷酸酯键。在一个实施方案中，2′-脱氧-2′-氟核苷酸存在于siNA中特异性选择的对经由核糖核酸酶的切割敏感的位置处，例如具有嘧啶核苷酸的位置。

在一个实施方案中，本发明的特征在于增加siNA分子针对经由核糖核酸酶的切割的稳定性的方法，所述方法包括将至少一种经修饰的核苷酸引入siNA分子内，其中所述经修饰的核苷酸是2′-脱氧-2′-氟核苷酸。在一个实施方案中，siNA中存在的所有嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟嘧啶核苷酸。在一个实施方案中，siNA中经修饰的核苷酸包括至少一个2′-脱氧-2′-氟胞苷或2′-脱氧-2′-氟尿苷核苷酸。在另一个实施方案中，siNA中经修饰的核苷酸包括至少一个2′-脱氧-2′-氟胞苷和至少一个2′-脱氧-2′-氟尿苷核苷酸。在一个实施方案中，siNA中存在的所有尿苷核苷酸是2′-脱氧-2′-氟尿苷核苷酸。在一个实施方案中，siNA中存在的所有胞苷核苷酸是2′-脱氧-2′-氟胞苷核苷酸。在一个实施方案中，siNA中存在的所有腺苷核苷酸是2′-脱氧-2′-氟腺苷核苷酸。在一个实施方案中，siNA中存在的所有鸟苷核苷酸是2′-脱氧-2′-氟鸟苷核苷酸。siNA可以进一步包含至少一个经修饰的核苷酸间键，例如硫代磷酸酯键。在一个实施方案中，2′-脱氧-2′-氟核苷酸存在于siNA中特异性选择的对经由核糖核酸酶的切割敏感的位置处，例如具有嘧啶核苷酸的位置。

在一个实施方案中，本发明的特征在于增加siNA分子针对经由核糖核酸酶的切割的稳定性的方法，所述方法包括将至少一种经修饰的核苷酸引入siNA分子内，其中所述经修饰的核苷酸是2′-脱氧-2′-氟阿拉伯糖核苷酸。在一个实施方案中，siNA中存在的所有嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟阿拉伯糖嘧啶核苷酸。在一个实施方案中，siNA中经修饰的核苷酸包括至少一个2′-脱氧-2′-氟阿拉伯糖胞苷或2′-脱氧-2′-氟阿拉伯糖尿苷核苷酸。在另一个实施方案中，siNA中经修饰的核苷酸包括至少一个2′-氟胞苷和至少一个2′-脱氧-2′-氟阿拉伯糖尿苷核苷酸。在一个实施方案中，siNA中存在的所有尿苷核苷酸是2′-脱氧-2′-氟阿拉伯糖尿苷核苷酸。在一个实施方案中，siNA中存在的所有胞苷核苷酸是2′-脱氧-2′-氟阿拉伯糖胞苷核苷酸。在一个实施方案中，siNA中存在的所有腺苷核苷酸是2′-脱氧-2′-氟阿拉伯糖腺苷核苷酸。在一个实施方案中，siNA中存在的所有鸟苷核苷酸是2′-脱氧-2′-氟阿拉伯糖鸟苷核苷酸。siNA可以进一步包含至少一个经修饰的核苷酸间键，例如硫代磷酸酯键。在一个实施方案中，2′-脱氧-2′-氟阿拉伯糖核苷酸存在于siNA中特异性选择的对经由核糖核酸酶的切割敏感的位置处，例如具有嘧啶核苷酸的位置。

在一个实施方案中，本发明的特征在于下调ENaC靶基因表达或指导ENaC靶RNA切割的双链短干扰核酸(siNA)分子，其包含有义区和反义区，其中所述反义区包含与由ENaC靶基因编码的RNA的核苷酸序列或其部分互补的核苷酸序列，且所述有义区包含与反义区互补的核苷酸序列，且其中所述反义区中存在的嘌呤核苷酸包含2′-脱氧-嘌呤核苷酸。在一个可替代的实施方案中，反义区中存在的嘌呤核苷酸包含2′-O-甲基嘌呤核苷酸。在上述实施方案的任何一个中，反义区可以包含在反义区的3′末端处的硫代磷酸酯核苷酸间键。可替代地，在上述实施方案的任何一个中，反义区可以包含在反义区的3′末端处的甘油基修饰。在上述siNA分子中的任何一种的另一个实施方案中，有义链的非互补区(例如，突出端区域)中存在的任何核苷酸是2′-脱氧核苷酸。

在一个实施方案中，本发明的siNA分子的反义区包含与内源性转录物的部分互补的序列，所述内源性转录物具有对受试者或生物中的特定疾病或性状相关的等位基因独特的序列，例如包含与疾病或性状特异性等位基因相关的单核苷酸多态性(SNP)的序列。照这样，本发明的siNA分子的反义区可以包含与对特定等位基因独特的序列互补的序列，以提供介导针对疾病、状况或性状相关的等位基因的选择性RNAi中的特异性。

在一个实施方案中，本发明的特征在于下调ENaC靶基因表达或指导ENaC靶RNA切割的双链短干扰核酸(siNA)分子，其中所述siNA分子由2个分开的寡核苷酸片段进行装配，其中一个片段包含有义区且第二个片段包含siNA分子的反义区。在一个实施方案中，双链siNA分子的每条链长度为约21个核苷酸，并且siNA分子的每个片段的约19个核苷酸与siNA分子的另一个片段的互补核苷酸碱基配对，其中siNA分子的每个片段的至少2个3′末端核苷酸与siNA分子的另一个片段的核苷酸不是碱基配对的。在另一个实施方案中，siNA分子是双链核酸分子，其中每条链长度为约19个核苷酸，且其中siNA分子的每个片段的核苷酸与siNA分子的另一个片段的互补核苷酸碱基配对，以形成至少约15个(例如，15个、16个、17个、18个或19个)碱基对，其中所述siNA分子的1个或2个末端是平端。在一个实施方案中，siNA分子的每个片段的2个3′末端核苷酸各自是2′-脱氧-嘧啶核苷酸，例如2′-脱氧-胸苷。在一个实施方案中，siNA分子的每个片段的2个3′末端核苷酸各自是2′-O-甲基嘧啶核苷酸，例如2′-O-甲基尿苷、胞苷或胸苷。在另一个实施方案中，siNA分子的每个片段的所有核苷酸与siNA分子的另一个片段的互补核苷酸碱基配对。在另一个实施方案中，siNA分子是具有有义区和反义区的约19个-约25个碱基对的双链核酸分子，其中所述反义区的约19个核苷酸与由ENaC靶基因编码的RNA的核苷酸序列或其部分碱基配对。在另一个实施方案中，反义区的约21个核苷酸与由ENaC靶基因编码的RNA的核苷酸序列或其部分碱基配对。在上述实施方案的任何一个中，包含所述反义区的片段的5′-末端可以任选包括磷酸基。

在一个实施方案中，本发明的特征在于抑制ENaC靶RNA序列表达的双链短干扰核酸(siNA)分子，其中所述siNA分子不包含任何核糖核苷酸，且其中所述双链siNA分子的每条链为约15个-约30个核苷酸。在一个实施方案中，siNA分子长度为21个核苷酸。包含非核糖核苷酸的siNA构建体的例子是有义/反义化学的任何组合的表8中所示的稳定化学的组合，例如Stab 7/8、Stab 7/11、Stab 8/8、Stab 18/8、Stab 18/11、Stab 12/13、Stab 7/13、Stab 18/13、Stab 7/19、Stab 8/19、Stab 18/19、Stab 7/20、Stab 8/20、Stab 18/20、Stab 7/32、Stab 8/32或Stab 18/32(例如，具有Stab 7、8、11、12、13、14、15、17、18、19、20或32有义或反义链或其任何组合的任何siNA)。在本文中，数字Stab化学可以包括如表8中所示化学的2′-氟和2′-OCF3形式。例如，“Stab7/8”指Stab 7/8和Stab 7F/8F等。在一个实施方案中，本发明的特征在于经由RNA干扰指导ENaC靶RNA切割的化学合成的双链RNA分子，其中所述RNA分子的每条链长度为约15个-约30个核苷酸；RNA分子的一条链包含与ENaC靶RNA具有足够互补性的核苷酸序列以用于RNA分子经由RNA干扰指导ENaC靶RNA切割；且其中所述RNA分子的至少一条链任选包含本文描述的一个或多个化学修饰的核苷酸，例如但不限于，脱氧核苷酸、2′-O-甲基核苷酸、2′-脱氧-2′-氟核苷酸、2′-脱氧-2′-氟阿拉伯糖、2′-O-甲氧基乙基核苷酸、4′-硫代核苷酸、2′-O-三氟甲基核苷酸、2′-O-乙基-三氟甲氧基核苷酸、2′-O-二氟甲氧基-乙氧基核苷酸等或其任何组合。化学修饰的核苷酸可以是相同或不同的。

在一个实施方案中，本发明的ENaC靶RNA包括编码ENaC蛋白质的序列。

在一个实施方案中，本发明的ENaC靶RNA包括非编码RNA序列(例如miRNA、snRNA、siRNA等)，参见例如Mattick，2005，Science，309，1527-1528；Claverie，2005，Science，309，1529-1530；Sethupathy等人，2006，RNA，12，192-197；和Czech，2006 NEJM，354，11：1194-1195。

在一个实施方案中，本发明的特征在于包含本发明的siNA分子的药物。

在一个实施方案中，本发明的特征在于包含本发明的siNA分子的活性成分。

在一个实施方案中，本发明的特征在于双链短干扰核酸(siNA)分子抑制、下调或减少ENaC靶基因表达的用途，其中所述siNA分子包含其可以是相同或不同的一个或多个化学修饰，且双链siNA的每条链的长度独立地为约15个-约30个或更多(例如约15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个或更多)核苷酸。在一个实施方案中，本发明的siNA分子是包含一个或多个化学修饰的双链核酸分子，其中所述siNA分子的2个片段各自独立地包含约15个-约40个(例如约15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、23个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个或40个)核苷酸，且其中一条链包含与由ENaC靶编码RNA的核苷酸序列或其部分互补的至少15个核苷酸。在一个非限制性的例子中，siNA分子的2个片段各自包含约21个核苷酸。在另一个实施方案中，siNA分子是包含一个或多个化学修饰的双链核酸分子，其中每条链长度为约21个核苷酸，且其中siNA分子的每个片段的约19个核苷酸与siNA分子的另一个片段的互补核苷酸碱基配对，其中siNA分子的每个片段的至少2个3′末端核苷酸与siNA分子的另一个片段的核苷酸不是碱基配对的。在另一个实施方案中，siNA分子是包含一个或多个化学修饰的双链核酸分子，其中每条链长度为约19个核苷酸，且其中siNA分子的每个片段的核苷酸与siNA分子的另一个片段的互补核苷酸碱基配对，以形成至少约15个(例如，15个、16个、17个、18个或19个)碱基对，其中所述siNA分子的1个或2个末端是平端。在一个实施方案中，siNA分子的每个片段的2个3′末端核苷酸各自是2′-脱氧-嘧啶核苷酸，例如2′-脱氧-胸苷。在一个实施方案中，siNA分子的每个片段的2个3′末端核苷酸各自是2′-O-甲基嘧啶核苷酸，例如2′-O-甲基尿苷、胞苷或胸苷。在另一个实施方案中，siNA分子的每个片段的所有核苷酸与siNA分子的另一个片段的互补核苷酸碱基配对。在另一个实施方案中，siNA分子是具有有义区和反义区且包含一个或多个化学修饰的约19个-约25个碱基对的双链核酸分子，其中所述反义区的约19个核苷酸与由ENaC靶基因编码的RNA的核苷酸序列或其部分碱基配对。在另一个实施方案中，反义区的约21个核苷酸与由ENaC靶基因编码的RNA的核苷酸序列或其部分碱基配对。在上述实施方案的任何一个中，包含所述反义区的片段的5′-末端可以任选包括磷酸基。

在一个实施方案中，本发明的特征在于抑制、下调或减少ENaC靶基因表达的双链短干扰核酸(siNA)分子的用途，其中所述双链siNA分子的一条链是反义链，所述反义链包含与ENaC靶RNA的核苷酸序列或其部分互补的核苷酸序列，另一条链是有义链，所述有义链包含与反义链的核苷酸序列互补的核苷酸序列。在一个实施方案中，每条链具有至少2个(例如，2个、3个、4个、5个或更多)化学修饰，所述化学修饰可以是相同或不同的，例如核苷酸、糖、碱基或主链修饰。在一个实施方案中，双链siNA分子中存在的大多数嘧啶核苷酸包含糖修饰。在一个实施方案中，双链siNA分子中存在的大多数嘌呤核苷酸包含糖修饰。

在一个实施方案中，本发明的特征在于抑制、下调或减少ENaC靶基因表达的双链短干扰核酸(siNA)分子，其中所述双链siNA分子的一条链是反义链，所述反义链包含与ENaC靶RNA的核苷酸序列或其部分互补的核苷酸序列，其中另一条链是有义链，所述有义链包含与反义链的核苷酸序列互补的核苷酸序列。在一个实施方案中，每条链具有至少2个(例如，2个、3个、4个、5个或更多)化学修饰，所述化学修饰可以是相同或不同的，例如核苷酸、糖、碱基或主链修饰。在一个实施方案中，双链siNA分子中存在的大多数嘧啶核苷酸包含糖修饰。在一个实施方案中，双链siNA分子中存在的大多数嘌呤核苷酸包含糖修饰。

在一个实施方案中，本发明的特征在于在于抑制、下调或减少ENaC靶基因表达的双链短干扰核酸(siNA)分子，其中所述双链siNA分子的一条链是反义链，所述反义链包含与编码蛋白质的ENaC靶RNA的核苷酸序列或其部分互补的核苷酸序列，另一条链是有义链，所述有义链包含与反义链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，且其中双链siNA分子中存在的大多数嘧啶核苷酸包含糖修饰。在一个实施方案中，siNA分子的每条链包含约15个-约30个或更多(例如约15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个或更多)核苷酸，其中每条链包含与另一条链的核苷酸互补的至少约15个核苷酸。在一个实施方案中，siNA分子由2个寡核苷酸片段进行装配，其中一个片段包含siNA分子的反义链的核苷酸序列，且第二个片段包含siNA分子的有义区的核苷酸序列。在一个实施方案中，有义链经由接头分子例如多核苷酸接头或非核苷酸接头与反义链进行连接。在进一步的实施方案中，有义链中存在的嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟嘧啶核苷酸，且有义区中存在的嘌呤核苷酸是2′-脱氧-嘌呤核苷酸。在另一个实施方案中，有义链中存在的嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟嘧啶核苷酸，且有义区中存在的嘌呤核苷酸是2′-O-甲基嘌呤核苷酸。在另外一个实施方案中，反义链中存在的嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟嘧啶核苷酸，且反义链中存在的任何嘌呤核苷酸是2′-脱氧-嘌呤核苷酸。在另一个实施方案中，反义链包含一个或多个2′-脱氧-2′-氟嘧啶核苷酸和一个或多个2′-O-甲基嘌呤核苷酸。在另一个实施方案中，反义链中存在的嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟嘧啶核苷酸，且反义链中存在的任何嘌呤核苷酸是2′-O-甲基嘌呤核苷酸。在进一步的实施方案中，有义链包含3′-末端和5′-末端，其中末端帽部分(例如，反向的脱氧脱碱基部分或反向的脱氧核苷酸部分例如反向的胸苷)存在于有义链的5′-末端、3′-末端、或5′和3′末端处。在另一个实施方案中，反义链在反义链的3′末端处包含硫代磷酸酯核苷酸间键。在另一个实施方案中，反义链包含在3′末端处的甘油基修饰。在另一个实施方案中，反义链的5′-末端任选包含磷酸基。

在抑制ENaC靶基因表达的双链短干扰核酸(siNA)分子的上述实施方案的任何一个中，其中所述双链siNA分子中存在的大多数嘧啶核苷酸包含糖修饰，siNA分子的2条链各自可以包含约15个-约30个或更多(例如约15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个或更多)核苷酸。在一个实施方案中，siNA分子的每条链的约15个-约30个或更多(例如约15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个或更多)核苷酸与siNA分子的另一条链的互补核苷酸碱基配对。在另一个实施方案中，siNA分子的每条链的约15个-约30个或更多(例如约15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个或更多)核苷酸与siNA分子的另一条链的互补核苷酸碱基配对，其中siNA分子的每条链的至少2个3′末端核苷酸与siNA分子的另一条链的核苷酸不是碱基配对的。在另一个实施方案中，siNA分子的每个片段的2个3′末端核苷酸各自是2′-脱氧-嘧啶，例如2′-脱氧-胸苷。在一个实施方案中，siNA分子的每条链与siNA分子的另一条链的互补核苷酸碱基配对。在一个实施方案中，反义链的15个-约30个(例如约15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个)核苷酸与ENaC靶RNA的核苷酸序列或其部分碱基配对。在一个实施方案中，反义链的18个-约25个(例如约18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个或25个)核苷酸与ENaC靶RNA的核苷酸序列或其部分碱基配对。

在一个实施方案中，本发明的特征在于抑制ENaC靶基因表达的双链短干扰核酸(siNA)分子，其中所述双链siNA分子的一条链是反义链，所述反义链包含与ENaC靶RNA的核苷酸序列或其部分互补的核苷酸序列，另一条链是有义链，所述有义链包含与反义链的核苷酸序列互补的核苷酸序列。在一个实施方案中，每条链具有至少2个(例如，2个、3个、4个、5个或更多)不同的化学修饰，例如核苷酸糖、碱基或主链修饰。在一个实施方案中，双链siNA分子中存在的大多数嘧啶核苷酸包含糖修饰。在一个实施方案中，双链siNA分子中存在的大多数嘌呤核苷酸包含糖修饰。在一个实施方案中，反义链的5′-末端任选包括磷酸基。

在一个实施方案中，本发明的特征在于抑制ENaC靶基因表达的双链短干扰核酸(siNA)分子，其中所述双链siNA分子的一条链是反义链，所述反义链包含与ENaC靶RNA的核苷酸序列或其部分互补的核苷酸序列，另一条链是有义链，所述有义链包含与反义链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，且其中双链siNA分子中存在的大多数嘧啶核苷酸包含糖修饰，且其中反义链的核苷酸序列或其部分与ENaC靶RNA的非翻译区的核苷酸序列或其部分互补。

在一个实施方案中，本发明的特征在于抑制ENaC靶基因表达的双链短干扰核酸(siNA)分子，其中所述双链siNA分子的一条链是反义链，所述反义链包含与ENaC靶RNA的核苷酸序列或其部分互补的核苷酸序列，其中另一条链是有义链，所述有义链包含与反义链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，其中双链siNA分子中存在的大多数嘧啶核苷酸包含糖修饰，且其中反义链的核苷酸序列与ENaC靶RNA的核苷酸序列或存在于ENaC靶RNA中的其部分互补。

在一个实施方案中，本发明的特征在于在药学上可接受的载体或稀释剂中包含本发明的siNA分子的组合物。在另一个实施方案中，本发明的特征在于在药学上可接受的载体或稀释剂中的本发明的2种或更多不同的siNA分子(例如靶向ENaC靶RNA的不同区域的siNA分子或靶向ENaC途径RNA的siNA分子)。

在非限制性例子中，将化学修饰的核苷酸引入核酸分子内提供了克服外源递送的天然RNA分子固有的体内稳定性和生物利用率的潜在局限性中的有力工具。例如，化学修饰的核酸分子的使用可以使得对于给定疗效较低剂量的特定核酸分子成为可能，因为化学修饰的核酸分子在血清中倾向于具有较长的半衰期。此外，通过ENaC靶向特定细胞或组织和/或改善核酸分子的细胞摄取，某些化学修饰可以改善核酸分子的生物利用率。因此，即使与天然核酸分子相比较，例如，当与全RNA核酸分子相比较时，化学修饰的核酸分子的活性减少，由于分子改善的稳定性和/或递送，经修饰的核酸分子的总体活性也可以大于天然分子的那种。与天然未修饰的siNA不同，化学修饰的siNA也可以使在人中激活干扰素活性或免疫刺激的可能性降到最低。这些性质因此对天然siRNA或最低限度修饰的siRNA在各种体外和体内背景中介导RNAi的能力，包括研究和治疗应用中的用途加以改进。申请人在本文中描述了与相应的未修饰或最低限度修饰的siNA分子相比较，具有改善的RNAi活性的化学修饰的siNA分子。本文公开的化学修饰的siNA基序提供了维持基本上类似于未修饰的或最低限度修饰的活性siNA的RNAi活性(参见例如Elbashir等人，2001，EMBO J.，20：6877-6888)，同时提供适合于在治疗应用中使用的核酸酶抗性和药物代谢动力学(pharmacoketic)性质的能力。

在本文描述的siNA分子的任何一个实施方案中，本发明的siNA分子的反义区可以包含在所述反义区3′-末端处的硫代磷酸酯核苷酸间键。在本文描述的siNA分子的任何一个实施方案中，反义区可以包含在所述反义区的5′-末端处的约1个-约5个硫代磷酸酯核苷酸间键。在本文描述的siNA分子的任何一个实施方案中，本发明的siNA分子的3′-末端核苷酸突出端可以包含在核酸糖、碱基或主链处进行化学修饰的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。在本文描述的siNA分子的任何一个实施方案中，3′-末端核苷酸突出端可以包含一个或多个通用碱基核糖核苷酸。在本文描述的siNA分子的任何一个实施方案中，3′-末端核苷酸突出端可以包含一个或多个无环核苷酸。

本发明的一个实施方案提供了以允许核酸分子表达的方式包含核酸序列的表达载体，所述核酸序列编码本发明的至少一种siNA分子。本发明的另一个实施方案提供了包含此类表达载体的哺乳动物细胞。哺乳动物细胞可以是人细胞。表达载体的siNA分子可以包含有义区和反义区。反义区可以包含与编码ENaC靶的RNA或DNA序列互补的序列，且有义区可以包含与反义区互补的序列。siNA分子可以包含具有互补的有义和反义区的2条不同的链。siNA分子可以包含具有互补的有义和反义区的单链。

在一个实施方案中，本发明的特征在于能够在细胞或重构的体外系统内介导RNA干扰(RNAi)的化学修饰的短干扰核酸(siNA)分子，其中所述化学修饰包含一个或多个(例如，约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多)核苷酸，所述核苷酸包含具有式I的主链修饰的核苷酸间键：

其中每个R1和R2独立地是任何核苷酸、非核苷酸、或多核苷酸，其可以是天然存在的或化学修饰的，并且其可以包括在siNA分子的结构中或充当与siNA分子附着的点，每个X和Y独立地是O、S、N、烷基或取代烷基，每个Z和W独立地是O、S、N、烷基、取代烷基、O-烷基、S-烷基、烷芳基、芳烷基或乙酰基，且其中W、X、Y和Z任选地不全是O。在另一个实施方案中，本发明的主链修饰包含膦酰乙酸酯和/或硫代膦酰乙酸酯核苷酸间键(参见例如Sheehan等人，2003，Nucleic Acids Research，31，4109-4118)。

具有式I，例如其中任何Z、W、X和/或Y独立地包含硫原子的化学修饰的核苷酸间键，可以存在于siNA双链体的1条或2条寡核苷酸链中，例如有义链、反义链或2条链中。本发明的siNA分子可以包含在有义链、反义链或2条链的3′-末端、5′-末端、或3′和5′-末端处具有式I的一个或多个(例如，约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多)化学修饰的核苷酸间键。例如，本发明的示例性siNA分子可以包含在有义链、反义链或2条链的5′-末端处具有式I的约1个-约5个或更多(例如，约1个、2个、3个、4个、5个或更多)化学修饰的核苷酸间键。在另一个非限制性例子中，本发明的示例性siNA分子可以包含在有义链、反义链或2条链中含有具有式I的化学修饰的核苷酸间键的一个或多个(例如，约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多)嘧啶核苷酸。在另外一个非限制性例子中，本发明的示例性siNA分子可以包含在有义链、反义链或2条链中含有具有式I的化学修饰的核苷酸间键的一个或多个(例如，约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多)嘌呤核苷酸。在另一个实施方案中，具有式I的一个或多个核苷酸间键的本发明的siNA分子也包含具有式I-VII中任何一个的化学修饰的核苷酸或非核苷酸。

在一个实施方案中，本发明的特征在于能够在细胞或重构的体外系统内介导RNA干扰(RNAi)的化学修饰的短干扰核酸(siNA)分子，其中所述化学修饰包含一个或多个(例如，约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多)具有式II的核苷酸或非核苷酸：

其中R3、R4、R5、R6、R7、R8、R10、R11和R12各自独立地是H、OH、烷基、取代烷基、烷芳基或芳烷基、F、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、OCH3、OCN、O-烷基、S-烷基、N-烷基、O-链烯基、S-链烯基、N-链烯基、SO-烷基、烷基-OSH、烷基-OH、O-烷基-OH、O-烷基-SH、S-烷基-OH、S-烷基-SH、烷基-S-烷基、烷基-O-烷基、ONO2、NO2、N3、NH2、氨烷基、氨基酸、氨酰基、ONH2、O-氨烷基、O-氨基酸、O-氨酰基、杂环烷基、杂环烷芳基、氨烷基氨基、多烷基氨基(polyalklylamino)、取代的甲硅烷基，或具有式I、II、III、IV、V、VI和/或VII中的任何一个的基团，其中任何一个可以包括在siNA分子的结构中或充当与siNA分子附着的点；R9是O、S、CH2、S＝O、CHF或CF2，且B是核苷(nucleosidic)碱基例如腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶、胸腺嘧啶、2-氨基腺苷、5-甲基胞嘧啶、2，6-二氨基嘌呤、或与靶RNA互补或非互补的任何其他非天然存在的碱基，或非核苷碱基例如苯基、萘基、3-硝基吡咯、5-硝基吲哚、水粉蕈素、羟基吡啶、吡啶酮、或可以与靶RNA互补或非互补的任何其他非天然存在的通用碱基。在一个实施方案中，R3和/或R7包含缀合物部分和接头(例如，如本文所描述或本领域其他方面已知的核苷酸或非核苷酸接头)。缀合物部分的非限制性例子包括关于细胞受体的配体，例如衍生自天然存在的蛋白质配体的肽；蛋白质定位序列，包括细胞ZIP编码序列；抗体；核酸适体；维生素和其他辅因子，例如叶酸和N-乙酰半乳糖胺；聚合物，例如聚乙二醇(PEG)；磷脂；胆固醇；类固醇，和聚胺，例如PEI、精胺或亚精胺。在一个实施方案中，本发明的具有式II的核苷酸是2′-脱氧-2′-氟核苷酸。在一个实施方案中，本发明的具有式II的核苷酸是2′-O-甲基核苷酸。在一个实施方案中，本发明的具有式II的核苷酸是2′-脱氧核苷酸。

式II的化学修饰的核苷酸或非核苷酸可以存在于siNA双链体的1条或2条寡核苷酸链中，例如有义链、反义链或2条链中。本发明的siNA分子可以包含在有义链、反义链或2条链的3′-末端、5′-末端、或3′和5′-末端处的式II的一个或多个化学修饰的核苷酸或非核苷酸。例如，本发明的示例性siNA分子可以包含在有义链、反义链或2条链的5′-末端处的式II的约1个-约5个或更多(例如，约1个、2个、3个、4个、5个或更多)化学修饰的核苷酸或非核苷酸。在另一个非限制性例子中，本发明的示例性siNA分子可以包含在有义链、反义链或2条链的3′-末端处的式II的约1个-约5个或更多(例如，约1个、2个、3个、4个、5个或更多)化学修饰的核苷酸或非核苷酸。

在一个实施方案中，本发明的特征在于能够在细胞或重构的体外系统内介导RNA干扰(RNAi)的化学修饰的短干扰核酸(siNA)分子，其中所述化学修饰包含一个或多个(例如，约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多)具有式III的核苷酸或非核苷酸：

其中R3、R4、R5、R6、R7、R8、R10、R11和R12各自独立地是H、OH、烷基、取代烷基、烷芳基或芳烷基、F、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、OCH3、OCN、O-烷基、S-烷基、N-烷基、O-链烯基、S-链烯基、N-链烯基、SO-烷基、烷基-OSH、烷基-OH、O-烷基-OH、O-烷基-SH、S-烷基-OH、S-烷基-SH、烷基-S-烷基、烷基-O-烷基、ONO2、NO2、N3、NH2、氨烷基、氨基酸、氨酰基、ONH2、O-氨烷基、O-氨基酸、O-氨酰基、杂环烷基、杂环烷芳基、氨烷基氨基、多烷基氨基、取代的甲硅烷基，或具有式I、II、III、IV、V、VI和/或VII中的任何一个的基团，其中任何一个可以包括在siNA分子的结构中或充当与siNA分子附着的点；R9是O、S、CH2、S＝O、CHF或CF2，且B是核苷碱基例如腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶、胸腺嘧啶、2-氨基腺苷、5-甲基胞嘧啶、2，6-二氨基嘌呤、或可以利用的与靶RNA互补或非互补的任何其他非天然存在的碱基，或非核苷碱基例如苯基、萘基、3-硝基吡咯、5-硝基吲哚、水粉蕈素、羟基吡啶、吡啶酮、或可以与靶RNA互补或非互补的任何其他非天然存在的通用碱基。在一个实施方案中，R3和/或R7包含缀合物部分和接头(例如，如本文所描述或本领域其他方面已知的核苷酸或非核苷酸接头)。缀合物部分的非限制性例子包括关于细胞受体的配体，例如衍生自天然存在的蛋白质配体的肽；蛋白质定位序列，包括细胞ZIP编码序列；抗体；核酸适体；维生素和其他辅因子，例如叶酸和N-乙酰半乳糖胺；聚合物，例如聚乙二醇(PEG)；磷脂；胆固醇；类固醇，和聚胺，例如PEI、精胺或亚精胺。

式III的化学修饰的核苷酸或非核苷酸可以存在于siNA双链体的1条或2条寡核苷酸链中，例如有义链、反义链或2条链中。本发明的siNA分子可以包含在有义链、反义链或2条链的3′-末端、5′-末端、或3′和5′-末端处的式III的一个或多个化学修饰的核苷酸或非核苷酸。例如，本发明的示例性siNA分子可以包含在有义链、反义链或2条链的5′-末端处的式III的约1个-约5个或更多(例如，约1个、2个、3个、4个、5个或更多)化学修饰的核苷酸或非核苷酸。在另一个非限制性例子中，本发明的示例性siNA分子可以包含在有义链、反义链或2条链的3′-末端处的式III的约1个-约5个或更多(例如，约1个、2个、3个、4个、5个或更多)化学修饰的核苷酸或非核苷酸。

在另一个实施方案中，本发明的siNA分子包含具有式II或III的核苷酸，其中具有式II或III的核苷酸是反向构型。例如，具有式II或III的核苷酸以3′-3′、3′-2′、2′-3′或5′-5′的构型例如在1条或2条siNA链的3′-末端、5′-末端、或3′和5′-末端处与siNA构建体进行连接。

在一个实施方案中，本发明的特征在于能够在细胞或重构的体外系统内介导RNA干扰(RNAi)的化学修饰的短干扰核酸(siNA)分子，其中所述化学修饰包含具有式IV的5′-末端磷酸基：

其中每个X和Y独立地是O、S、N、烷基、取代烷基或烷基卤；其中每个Z和W独立地是O、S、N、烷基、取代烷基、O-烷基、S-烷基、烷芳基、芳烷基、烷基卤或乙酰基；且其中W、X、Y和Z任选地不全是O且Y充当与siNA分子附着的点。

在一个实施方案中，本发明的特征在于在ENaC靶互补链上带有具有式IV的5′-末端磷酸基的siNA分子，例如与ENaC靶RNA互补的链，其中所述siNA分子包含全RNA siNA分子。在另一个实施方案中，本发明的特征在于在PD非移植角膜和同基因(Lewis-Lewis)E4靶互补链上带有具有式IV的5′-末端磷酸基的siNA分子，其中所述siNA分子还包含在1条或2条链的3′-末端上具有约1个-约4个(例如，约1个、2个、3个或4个)脱氧核糖核苷酸的约1个-约3个(例如，约1个、2个或3个)核苷酸3′-末端核苷酸突出端。在另一个实施方案中，具有式IV的5′-末端磷酸基存在于本发明的siNA分子的ENaC靶互补链上，例如带有具有式I-VII中任何一个的化学修饰的siNA分子。

在一个实施方案中，本发明的特征在于能够在细胞或重构的体外系统内介导RNA干扰(RNAi)的化学修饰的短干扰核酸(siNA)分子，其中所述化学修饰包含一个或多个硫代磷酸酯核苷酸间键。例如，在非限制性例子中，本发明的特征在于在1条siNA链中具有约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或更多硫代磷酸酯核苷酸间键的化学修饰的短干扰核酸(siNA)。在另外一个实施方案中，本发明的特征在于在2条siNA链中独立地具有约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或更多硫代磷酸酯核苷酸间键的化学修饰的短干扰核酸(siNA)。硫代磷酸酯核苷酸间键可以存在于siNA双链体的1条或2条寡核苷酸链中，例如有义链、反义链或2条链中。本发明的siNA分子可以包含在有义链、反义链或2条链的3′-末端、5′-末端、或3′-和5′-末端处的一个或多个硫代磷酸酯核苷酸间键。例如，本发明的示例性siNA分子可以包含在有义链、反义链或2条链的5′-末端处约1个-约5个或更多(例如，约1个、2个、3个、4个、5个或更多)连续的硫代磷酸酯核苷酸间键。在另一个非限制性例子中，本发明的示例性siNA分子可以包含在有义链、反义链或2条链中的一个或多个(例如，约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多)嘧啶硫代磷酸酯核苷酸间键。在另外一个非限制性例子中，本发明的示例性siNA分子可以包含在有义链、反义链或2条链中的一个或多个(例如，约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多)嘌呤硫代磷酸酯核苷酸间键。

双链siNA分子的每条链可以具有一个或多个化学修饰，从而使得每条链包含不同模式的化学修饰。本文提供了可以产生不同修饰模式的修饰方案的几个非限制性例子。

在一个实施方案中，本发明的特征在于siNA分子，其中有义链包含一个或多个，例如，约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多硫代磷酸酯核苷酸间键，和/或一个或多个(例如，约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多)2′-脱氧、2′-O-甲基、2′-脱氧-2′-氟、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、2′-O-二氟甲氧基-乙氧基和/或约一个或多个(例如，约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多)通用碱基修饰的核苷酸，和任选地在有义链的3′-末端、5′-末端、或3′-和5′-末端处的末端帽分子；且其中反义链包含约1个-约10个或更多，具体地约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多硫代磷酸酯核苷酸间键，和/或一个或多个(例如，约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多)2′-脱氧、2′-O-甲基、2′-脱氧-2′-氟、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、2′-O-二氟甲氧基-乙氧基、4′-硫代和/或一个或多个(例如，约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多)通用碱基修饰的核苷酸，和任选地在反义链的3′-末端、5′-末端、或3′-和5′-末端处的末端帽分子。在另一个实施方案中，有义和/或反义siNA链的一个或多个，例如约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多嘧啶核苷酸由2′-脱氧、2′-O-甲基、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、2′-O-二氟甲氧基-乙氧基、4′-硫代和/或2′-脱氧-2′-氟核苷酸进行化学修饰，包括或不包括存在于相同或不同链中的一个或多个，例如约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多硫代磷酸酯核苷酸间键和/或3′-末端、5′-末端、或3′-和5′-末端处的末端帽分子。

在另一个实施方案中，本发明的特征在于siNA分子，其中有义链包含约1个-约5个，具体地约1个、2个、3个、4个或5个硫代磷酸酯核苷酸间键，和/或一个或多个(例如，约1个、2个、3个、4个、5个或更多)2′-脱氧、2′-O-甲基、2′-脱氧-2′-氟、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、2′-O-二氟甲氧基-乙氧基、4′-硫代和/或一个或多个(例如，约1个、2个、3个、4个、5个或更多)通用碱基修饰的核苷酸，和任选地在有义链的3′-末端、5′-末端、或3′-和5′-末端处的末端帽分子；且其中反义链包含约1个-约5个或更多，具体地约1个、2个、3个、4个、5个或更多硫代磷酸酯核苷酸间键，和/或一个或多个(例如，约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多)2′-脱氧、2′-O-甲基、2′-脱氧-2′-氟、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、2′-O-二氟甲氧基-乙氧基、4′-硫代和/或一个或多个(例如，约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多)通用碱基修饰的核苷酸，和任选地在反义链的3′-末端、5′-末端、或3′-和5′-末端处的末端帽分子。在另一个实施方案中，有义和/或反义siNA链的一个或多个，例如约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多嘧啶核苷酸由2′-脱氧、2′-O-甲基、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、2′-O-二氟甲氧基-乙氧基、4′-硫代和/或2′-脱氧-2′-氟核苷酸进行化学修饰，包括或不包括存在于相同或不同链中的约1个-约5个或更多，例如约1个、2个、3个、4个、5个或更多硫代磷酸酯核苷酸间键和/或3′-末端、5′-末端、或3′-和5′-末端处的末端帽分子。

在一个实施方案中，本发明的特征在于siNA分子，其中反义链包含一个或多个，例如，约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多硫代磷酸酯核苷酸间键，和/或约一个或多个(例如，约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多)2′-脱氧、2′-O-甲基、2′-脱氧-2′-氟、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、2′-O-二氟甲氧基-乙氧基、4′-硫代和/或一个或多个(例如，约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多)通用碱基修饰的核苷酸，和任选地在有义链的3′-末端、5′-末端、或3′-和5′-末端处的末端帽分子；且其中反义链包含约1个-约10个或更多，具体地约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多硫代磷酸酯核苷酸间键，和/或一个或多个(例如，约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多)2′-脱氧、2′-O-甲基、2′-脱氧-2′-氟、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、2′-O-二氟甲氧基-乙氧基、4′-硫代和/或一个或多个(例如，约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多)通用碱基修饰的核苷酸，和任选地在反义链的3′-末端、5′-末端、或3′-和5′-末端处的末端帽分子。在另一个实施方案中，有义和/或反义siNA链的一个或多个，例如约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多嘧啶核苷酸由2′-脱氧、2′-O-甲基、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、2′-O-二氟甲氧基-乙氧基、4′-硫代和/或2′-脱氧-2′-氟核苷酸进行化学修饰，包括或不包括存在于相同或不同链中的一个或多个，例如约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多硫代磷酸酯核苷酸间键和/或3′-末端、5′-末端、或3′-和5′-末端处的末端帽分子。

在另一个实施方案中，本发明的特征在于siNA分子，其中反义链包含约1个-约5个或更多，具体地约1个、2个、3个、4个、5个或更多硫代磷酸酯核苷酸间键，和/或一个或多个(例如，约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多)2′-脱氧、2′-O-甲基、2′-脱氧-2′-氟、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、2′-O-二氟甲氧基-乙氧基、4′-硫代和/或一个或多个(例如，约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多)通用碱基修饰的核苷酸，和任选地在有义链的3′-末端、5′-末端、或3′-和5′-末端处的末端帽分子；且其中反义链包含约1个-约5个或更多，具体地约1个、2个、3个、4个、5个或更多硫代磷酸酯核苷酸间键，和/或一个或多个(例如，约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多)2′-脱氧、2′-O-甲基、2′-脱氧-2′-氟、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、2′-O-二氟甲氧基-乙氧基、4′-硫代和/或一个或多个(例如，约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多)通用碱基修饰的核苷酸，和任选地在反义链的3′-末端、5′-末端、或3′-和5′-末端处的末端帽分子。在另一个实施方案中，有义和/或反义siNA链的一个或多个，例如约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多嘧啶核苷酸由2′-脱氧、2′-O-甲基、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、2′-O-二氟甲氧基-乙氧基、4′-硫代和/或2′-脱氧-2′-氟核苷酸进行化学修饰，包括或不包括存在于相同或不同链中的约1个-约5个，例如约1个、2个、3个、4个、5个或更多硫代磷酸酯核苷酸间键和/或3′-末端、5′-末端、或3′-和5′-末端处的末端帽分子。

在一个实施方案中，本发明的特征在于在siNA分子的每条链中具有约1个-约5个或更多(具体地约1个、2个、3个、4个、5个或更多)硫代磷酸酯核苷酸间键的化学修饰的短干扰核酸(siNA)分子。

在另一个实施方案中，本发明的特征在于包含2′-5′核苷酸间键的siNA分子。一个或多个2′-5′核苷酸间键可以在1条或2条siNA序列链的3′-末端、5′-末端、或3′-和5′-末端处。此外，一个或多个2′-5′核苷酸间键可以存在于1条或2条siNA序列链的各种其他位置处，例如，包括siNA分子的1条或2条链中的嘧啶核苷酸的每个核苷酸间键的约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多可以包括2′-5′核苷酸间键，或包括siNA分子的1条或2条链中的嘌呤核苷酸的每个核苷酸间键的约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多可以包括2′-5′核苷酸间键。

在另一个实施方案中，本发明的化学修饰的siNA分子包含具有2条链的双链体，其中的1条或2条链可以是化学修饰的，其中每条链的长度单独地是约15个-约30个(例如，约15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个)核苷酸，其中所述双链体具有约15个-约30个(例如，约15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个)碱基对，且其中所述化学修饰包含具有式I-VII中任何一个的结构。例如，本发明的示例性化学修饰的siNA分子包含具有2条链的双链体，其中的1条或2条链可以是由具有式I-VII中任何一个或其任何组合的化学修饰进行化学修饰，其中每条链由约21个核苷酸组成，各自具有2-核苷酸3′-末端核苷酸突出端，且其中所述双链体具有约19个碱基对。在另一个实施方案中，本发明的siNA分子包含单链发夹结构，其中所述siNA长度为约36个-约70个(例如，约36个、40个、45个、50个、55个、60个、65个或70个)核苷酸，具有约15个-约30个(例如，约15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个)碱基对，且其中所述siNA可以包括包含具有式I-VII中任何一个或其任何组合的结构的化学修饰。例如，本发明的示例性化学修饰的siNA分子包含具有约42个-约50个(例如，约42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个或50个)核苷酸的线性寡核苷酸，其由具有式I-VII中任何一个或其任何组合的化学修饰进行化学修饰，其中所述线性寡核苷酸形成具有约19个-约21个(例如，19个、20个或21个)碱基对和2-核苷酸3′-末端核苷酸突出端的发夹结构。在另一个实施方案中，本发明的线性发夹siNA分子包含茎环基序，其中所述siNA分子的环部分是生物可降解的。例如，本发明的线性发夹siNA分子被这样设计，从而使得siNA分子的环部分在体内降解可以产生具有3′-末端突出端的双链siNA分子，例如包含约2个核苷酸的3′-末端核苷酸突出端。

在另一个实施方案中，本发明的siNA分子包含发夹结构，其中所述siNA长度为约25个-约50个(例如，约25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个或50个)核苷酸，具有约3个-约25个(例如，约3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个或25个)碱基对，且其中所述siNA可以包括一个或多个化学修饰，所述化学修饰包含具有式I-VII中任何一个或其任何组合的结构。例如，本发明的示例性化学修饰的siNA分子包含具有约25个-约35个(例如，约25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个或35个)核苷酸的线性寡核苷酸，其由具有式I-VII中任何一个或其任何组合的一个或多个化学修饰进行化学修饰，其中所述线性寡核苷酸形成具有约3个-约25个(例如，3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个或25个)碱基对和可以如本文所描述的进行化学修饰的5′-末端磷酸基(例如具有式IV的5′-末端磷酸基)的发夹结构。在另一个实施方案中，本发明的线性发夹siNA分子包含茎环基序，其中所述siNA分子的环部分是生物可降解的。在一个实施方案中，本发明的线性发夹siNA分子包含含有非核苷酸接头的环部分。

在另一个实施方案中，本发明的siNA分子包含不对称的发夹结构，其中所述siNA分子长度为约25个-约50个(例如，约25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个或50个)核苷酸，具有约3个-约25个(例如，约3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个或25个)碱基对，且其中所述siNA可以包括一个或多个化学修饰，所述化学修饰包含具有式I-VII中任何一个或其任何组合的结构。例如，本发明的示例性化学修饰的siNA分子包含具有约25个-约35个(例如，约25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个或35个)核苷酸的线性寡核苷酸，其由具有式I-VII中任何一个或其任何组合的一个或多个化学修饰进行化学修饰，其中所述线性寡核苷酸形成具有约3个-约25个(例如，约3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个或25个)碱基对和可以如本文所描述的进行化学修饰的5′-末端磷酸基(例如具有式IV的5′-末端磷酸基)的不对称的发夹结构。在一个实施方案中，本发明的不对称的发夹siNA分子包含茎环基序，其中所述siNA分子的环部分是生物可降解的。在另一个实施方案中，本发明的不对称的发夹siNA分子包含含有非核苷酸接头的环部分。

在另一个实施方案中，本发明的siNA分子包含具有分开的多核苷酸链的不对称的双链结构，所述多核苷酸链包含有义和反义区，其中所述反义区长度为约15个-约30个(例如，约15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个)核苷酸，其中所述有义区长度为约3个-约25个(例如，约3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个或25个)核苷酸，其中所述有义区和反义区具有至少3个互补核苷酸，且其中所述siNA可以包括一个或多个化学修饰，所述化学修饰包含具有式I-VII中任何一个或其任何组合的结构。例如，本发明的示例性化学修饰的siNA分子包含具有分开的多核苷酸链的不对称的双链结构，所述多核苷酸链包含有义和反义区，其中所述反义区长度为约18个-约23个(例如，约18个、19个、20个、21个、22个或23个)核苷酸，且其中所述有义区长度为约3个-约15个(例如，约3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或15个)核苷酸，其中所述有义区反义区具有至少3个互补核苷酸，且其中所述siNA可以包括一个或多个化学修饰，所述化学修饰包含具有式I-VII中任何一个或其任何组合的结构。在另一个实施方案中，不对称的双链siNA分子还可以具有可如本文所描述的进行化学修饰的5′-末端磷酸基(例如具有式IV的5′-末端磷酸基)。

在另一个实施方案中，本发明的siNA分子包含环状核酸分子，其中所述siNA长度为约38个-约70个(例如，约38个、40个、45个、50个、55个、60个、65个或70个)核苷酸，具有约15个-约30个(例如，约15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个)碱基对，且其中所述siNA可以包括化学修饰，所述化学修饰包含具有式I-VII中任何一个或其任何组合的结构。例如，本发明的示例性化学修饰的siNA分子包含具有约42个-约50个(例如，约42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个或50个)核苷酸的环状寡核苷酸，其由具有式I-VII中任何一个或其任何组合的化学修饰进行化学修饰，其中所述环状寡核苷酸形成具有约19个碱基对和2个环的哑铃形结构。

在另一个实施方案中，本发明的环状siNA分子包含2个环基序，其中所述siNA分子的1个或2个环部分是生物可降解的。例如，本发明的环状siNA分子被这样设计，从而使得siNA分子的环部分在体内降解可以产生具有3′-末端突出端的双链siNA分子，例如包含约2个核苷酸的3′-末端核苷酸突出端。

在一个实施方案中，本发明的siNA分子包含至少一个(例如，约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多)脱碱基部分，例如具有式V的化合物：

其中R3、R4、R5、R6、R7、R8、R10、R11、R12和R13各自独立地是H、OH、烷基、取代烷基、烷芳基或芳烷基、F、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、OCH3、OCN、O-烷基、S-烷基、N-烷基、O-链烯基、S-链烯基、N-链烯基、SO-烷基、烷基-OSH、烷基-OH、O-烷基-OH、O-烷基-SH、S-烷基-OH、S-烷基-SH、烷基-S-烷基、烷基-O-烷基、ONO2、NO2、N3、NH2、氨烷基、氨基酸、氨酰基、ONH2、O-氨烷基、O-氨基酸、O-氨酰基、杂环烷基、杂环烷芳基、氨烷基氨基、多烷基氨基、取代的甲硅烷基，或具有式I、II、III、IV、V、VI和/或VII中的任何一个的基团，其中任何一个可以包括在siNA分子的结构中或充当与siNA分子附着的点；R9是O、S、CH2、S＝O、CHF或CF2。在一个实施方案中，R3和/或R7包含缀合物部分和接头(例如，如本文所描述或本领域其他方面已知的核苷酸或非核苷酸接头)。缀合物部分的非限制性例子包括关于细胞受体的配体，例如衍生自天然存在的蛋白质配体的肽；蛋白质定位序列，包括细胞ZIP编码序列；抗体；核酸适体；维生素和其他辅因子，例如叶酸和N-乙酰半乳糖胺；聚合物，例如聚乙二醇(PEG)；磷脂；胆固醇；类固醇，和聚胺，例如PEI、精胺或亚精胺。

在一个实施方案中，本发明的siNA分子包含至少一个(例如，约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多)反向的脱碱基部分，例如具有式VI的化合物：

其中R3、R4、R5、R6、R7、R8、R10、R11、R12和R 13各自独立地是H、OH、烷基、取代烷基、烷芳基或芳烷基、F、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、OCH3、OCN、O-烷基、S-烷基、N-烷基、O-链烯基、S-链烯基、N-链烯基、SO-烷基、烷基-OSH、烷基-OH、O-烷基-OH、O-烷基-SH、S-烷基-OH、S-烷基-SH、烷基-S-烷基、烷基-O-烷基、ONO2、NO2、N3、NH2、氨烷基、氨基酸、氨酰基、ONH2、O-氨烷基、O-氨基酸、O-氨酰基、杂环烷基、杂环烷芳基、氨烷基氨基、多烷基氨基、取代的甲硅烷基，或具有式I、II、III、IV、V、VI和/或VII中的任何一个的基团，其中任何一个可以包括在siNA分子的结构中或充当与siNA分子附着的点；R9是O、S、CH2、S＝O、CHF或CF2，且R2、R3、R8或R13充当与本发明的siNA分子附着的点。在一个实施方案中，R3和/或R7包含缀合物部分和接头(例如，如本文所描述或本领域其他方面已知的核苷酸或非核苷酸接头)。缀合物部分的非限制性例子包括关于细胞受体的配体，例如衍生自天然存在的蛋白质配体的肽；蛋白质定位序列，包括细胞ZIP编码序列；抗体；核酸适体；维生素和其他辅因子，例如叶酸和N-乙酰半乳糖胺；聚合物，例如聚乙二醇(PEG)；磷脂；胆固醇；类固醇，和聚胺，例如PEI、精胺或亚精胺。

在另一个实施方案中，本发明的siNA分子包含至少一个(例如，约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多)取代的聚烷基部分，例如具有式VII的化合物：

其中每个n独立地是1-12的整数，R1、R2和R3各自独立地是H、OH、烷基、取代烷基、烷芳基或芳烷基、F、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、OCH3、OCN、O-烷基、S-烷基、N-烷基、O-链烯基、S-链烯基、N-链烯基、SO-烷基、烷基-OSH、烷基-OH、O-烷基-OH、O-烷基-SH、S-烷基-OH、S-烷基-SH、烷基-S-烷基、烷基-O-烷基、ONO2、NO2、N3、NH2、氨烷基、氨基酸、氨酰基、ONH2、O-氨烷基、O-氨基酸、O-氨酰基、杂环烷基、杂环烷芳基、氨烷基氨基、多烷基氨基、取代的甲硅烷基，或具有式I、II、III、IV、V、VI和/或VII中的任何一个的基团，其中任何一个可以包括在siNA分子的结构中或充当与siNA分子附着的点。在一个实施方案中，R3和/或R1包含缀合物部分和接头(例如，如本文所描述或本领域其他方面已知的核苷酸或非核苷酸接头)。缀合物部分的非限制性例子包括关于细胞受体的配体，例如衍生自天然存在的蛋白质配体的肽；蛋白质定位序列，包括细胞ZIP编码序列；抗体；核酸适体；维生素和其他辅因子，例如叶酸和N-乙酰半乳糖胺；聚合物，例如聚乙二醇(PEG)；磷脂；胆固醇；类固醇，和聚胺，例如PEI、精胺或亚精胺。

“ZIP编码”序列意指涉及细胞拓扑(topogenic)信号传导介导的转运的任何肽或蛋白质序列(参见例如Ray等人，2004，Science，306(1501)：1505)。

双链siNA分子内的每个核苷酸可以独立地具有包含式I-VIII中任何一个的结构的化学修饰。因此，在一个实施方案中，本发明的siNA分子的一个或多个核苷酸位置包含具有式I-VII中任何一个的结构的化学修饰或本文的任何其他修饰。在一个实施方案中，本发明的siNA分子的每个核苷酸位置包含具有式I-VII中任何一个的结构的化学修饰或本文的任何其他修饰。

在一个实施方案中，本发明的双链siNA分子的1条或2条链的一个或多个核苷酸位置包含具有式I-VII中任何一个的结构的化学修饰或本文的任何其他修饰。在一个实施方案中，本发明的双链siNA分子的1条或2条链的每个核苷酸位置包含具有式I-VII中任何一个的结构的化学修饰或本文的任何其他修饰。

在另一个实施方案中，本发明的特征在于具有式VII的化合物，其中R1和R2是羟基(OH)，n＝1，且R3包含O且是与本发明的双链siNA分子的1条或2条链的3′-末端、5′-末端、或3′和5′-末端或者与本发明的单链siNA分子附着的点。这种修饰在本文中称为“甘油基”(例如，图7中的修饰6)。

在另一个实施方案中，本发明的化学修饰的核苷或非核苷(例如，具有式V、VI或VII中任何一个的部分)在本发明的siNA分子的3′-末端、5′-末端、或3′和5′-末端处。例如，化学修饰的核苷或非核苷(例如，具有式V、VI或VII的部分)可以存在于siNA分子的反义链、有义链、或反义和有义链的3′-末端、5′-末端、或3′和5′-末端处。在一个实施方案中，化学修饰的核苷或非核苷(例如，具有式V、VI或VII的部分)可以存在于本发明的双链siNA分子的有义链的5′-末端和3′-末端以及反义链的3′-末端处。在一个实施方案中，化学修饰的核苷或非核苷(例如，具有式V、VI或VII的部分)可以存在于本发明双链siNA分子的有义链的5′-末端和3′-末端以及反义链的3′-末端的末端位置处。在一个实施方案中，化学修饰的核苷或非核苷(例如，具有式V、VI或VII的部分)可以存在于本发明双链siNA分子的有义链的5′-末端和3′-末端以及反义链的3′-末端的2个末端位置处。在一个实施方案中，化学修饰的核苷或非核苷(例如，具有式V、VI或VII的部分)可以存在于本发明双链siNA分子的有义链的5′-末端和3′-末端以及反义链的3′-末端的倒数第二位置处。此外，具有式VII的部分可以存在于如本文所描述的发夹siNA分子的3′-末端或5′-末端处。

在另一个实施方案中，本发明的siNA分子包含具有式V或VI的脱碱基残基，其中具有式VI或VI的所述脱碱基残基以3′-3′、3′-2′、2′-3′或5′-5′的构型例如在1条或2条siNA链的3′-末端、5′-末端、或3′和5′-末端处与siNA构建体进行连接。

在一个实施方案中，本发明的siNA分子包含例如在siNA分子的5′-末端、3′-末端、5′和3′-末端、或其任何组合处的一个或多个(例如，约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多)锁定核酸(LNA)核苷酸。

在一个实施方案中，本发明的siNA分子包含例如在siNA分子的5′-末端、3′-末端、5′和3′-末端、或其任何组合处的一个或多个(例如，约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多)4′-硫代核苷酸。

在另一个实施方案中，本发明的siNA分子包含例如在siNA分子的5′-末端、3′-末端、5′和3′-末端、或其任何组合处的一个或多个(例如，约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多)无环核苷酸。

在一个实施方案中，本发明的化学修饰的短干扰核酸(siNA)分子包含有义链或有义区，其具有一个或多个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个或更多)2′-O-烷基(例如，2′-O-甲基)、2′-脱氧-2′-氟、2′-脱氧、FANA、或脱碱基化学修饰或其任何组合。

在一个实施方案中，本发明的化学修饰的短干扰核酸(siNA)分子包含反义链或反义区，其具有一个或多个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个或更多)2′-O-烷基(例如，2′-O-甲基)、2′-脱氧-2′-氟、2′-脱氧、FANA、或脱碱基化学修饰或其任何组合。

本发明的化学修饰的短干扰核酸(siNA)分子包含有义链或有义区和反义链或反义区，其各自具有一个或多个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个或更多)2′-O-烷基(例如，2′-O-甲基)、2′-脱氧-2′-氟、2′-脱氧、FANA、或脱碱基化学修饰或其任何组合。

在一个实施方案中，本发明的特征在于包含有义区的本发明的化学修饰的短干扰核酸(siNA)分子，其中所述有义区中存在的任何(例如，一个或多个或所有)嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟嘧啶核苷酸(例如，其中所有嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟嘧啶核苷酸，或可替代地多个(即超过一个)嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟嘧啶核苷酸)。

在一个实施方案中，本发明的特征在于包含有义区的本发明的化学修饰的短干扰核酸(siNA)分子，其中所述有义区中存在的任何(例如，一个或多个或所有)嘧啶核苷酸是FANA嘧啶核苷酸(例如，其中所有嘧啶核苷酸是FANA嘧啶核苷酸，或可替代地多个(即超过一个)嘧啶核苷酸是FANA嘧啶核苷酸)。

在一个实施方案中，本发明的特征在于包含反义区的本发明的化学修饰的短干扰核酸(siNA)分子，其中所述反义区中存在的任何(例如，一个或多个或所有)嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟嘧啶核苷酸(例如，其中所有嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟嘧啶核苷酸，或可替代地多个(即超过一个)嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟嘧啶核苷酸)。

在一个实施方案中，本发明的特征在于包含有义区和反义区的本发明的化学修饰的短干扰核酸(siNA)分子，其中所述有义区和反义区中存在的任何(例如，一个或多个或所有)嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟嘧啶核苷酸(例如，其中所有嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟嘧啶核苷酸，或可替代地多个(即超过一个)嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟嘧啶核苷酸)。

在一个实施方案中，本发明的特征在于包含有义区的本发明的化学修饰的短干扰核酸(siNA)分子，其中所述有义区中存在的任何(例如，一个或多个或所有)嘌呤核苷酸是2′-脱氧嘌呤核苷酸(例如，其中所有嘌呤核苷酸是2′-脱氧嘌呤核苷酸，或可替代地多个(即超过一个)嘌呤核苷酸是2′-脱氧嘌呤核苷酸)。

在一个实施方案中，本发明的特征在于包含反义区的本发明的化学修饰的短干扰核酸(siNA)分子，其中所述反义区中存在的任何(例如，一个或多个或所有)嘌呤核苷酸是2′-O-甲基嘌呤核苷酸(例如，其中所有嘌呤核苷酸是2′-O-甲基嘌呤核苷酸，或可替代地多个(即超过一个)嘧啶核苷酸是2′-O-甲基嘌呤核苷酸)。

在一个实施方案中，本发明的特征在于包含有义区的本发明的化学修饰的短干扰核酸(siNA)分子，其中所述有义区中存在的任何(例如，一个或多个或所有)嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟嘧啶核苷酸(例如，其中所有嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟嘧啶核苷酸，或可替代地多个(即超过一个)嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟嘧啶核苷酸)，且所述有义区中存在的任何(例如，一个或多个或所有)嘌呤核苷酸是2′-脱氧嘌呤核苷酸(例如，其中所有嘌呤核苷酸是2′-脱氧嘌呤核苷酸，或可替代地多个(即超过一个)嘌呤核苷酸是2′-脱氧嘌呤核苷酸)。

在一个实施方案中，本发明的特征在于包含有义区的本发明的化学修饰的短干扰核酸(siNA)分子，其中所述有义区中存在的任何(例如，一个或多个或所有)嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘧啶核苷酸(例如，其中所有嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘧啶核苷酸，或可替代地多个(即超过一个)嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘧啶核苷酸)，且其中所述有义区中存在的任何(例如，一个或多个或所有)嘌呤核苷酸是2′-脱氧嘌呤核苷酸(例如，其中所有嘌呤核苷酸是2′-脱氧嘌呤核苷酸，或可替代地多个(即超过一个)嘌呤核苷酸是2′-脱氧嘌呤核苷酸)，其中包含存在于所述有义区中的3′-末端核苷酸突出端的任何核苷酸是2′-脱氧核苷酸。

在一个实施方案中，本发明的特征在于包含有义区的本发明的化学修饰的短干扰核酸(siNA)分子，其中所述有义区中存在的任何(例如，一个或多个或所有)嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘧啶核苷酸(例如，其中所有嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘧啶核苷酸，或可替代地多个(即超过一个)嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘧啶核苷酸)，且其中所述有义区中存在的任何(例如，一个或多个或所有)嘌呤核苷酸是2′-O-甲基嘌呤核苷酸(例如，其中所有嘌呤核苷酸是2′-O-甲基、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘌呤核苷酸，或可替代地多个(即超过一个)嘌呤核苷酸是2′-O-甲基、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘌呤核苷酸)。

在一个实施方案中，本发明的特征在于包含有义区的本发明的化学修饰的短干扰核酸(siNA)分子，其中所述有义区中存在的任何(例如，一个或多个或所有)嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘧啶核苷酸(例如，其中所有嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘧啶核苷酸，或可替代地多个(即超过一个)嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘧啶核苷酸)，且其中所述有义区中存在的任何(例如，一个或多个或所有)嘌呤核苷酸是2′-O-甲基、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘌呤核苷酸(例如，其中所有嘌呤核苷酸是2′-O-甲基、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘌呤核苷酸，或可替代地多个(即超过一个)嘌呤核苷酸是2′-O-甲基、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘌呤核苷酸)，且其中包含存在于所述有义区中的3′-末端核苷酸突出端的任何核苷酸是2′-脱氧核苷酸。

在一个实施方案中，本发明的特征在于包含反义区的本发明的化学修饰的短干扰核酸(siNA)分子，其中所述反义区中存在的任何(例如，一个或多个或所有)嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘧啶核苷酸(例如，其中所有嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘧啶核苷酸，或可替代地多个(即超过一个)嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘧啶核苷酸)，且其中所述反义区中存在的任何(例如，一个或多个或所有)嘌呤核苷酸是2′-O-甲基、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘌呤核苷酸(例如，其中所有嘌呤核苷酸是2′-O-甲基、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘌呤核苷酸，或可替代地多个(即超过一个)嘌呤核苷酸是2′-O-甲基、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘌呤核苷酸)。

在一个实施方案中，本发明的特征在于包含反义区的本发明的化学修饰的短干扰核酸(siNA)分子，其中所述反义区中存在的任何(例如，一个或多个或所有)嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘧啶核苷酸(例如，其中所有嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘧啶核苷酸，或可替代地多个(即超过一个)嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘧啶核苷酸)，其中所述反义区中存在的任何(例如，一个或多个或所有)嘌呤核苷酸是2′-O-甲基、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘌呤核苷酸(例如，其中所有嘌呤核苷酸是2′-O-甲基、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘌呤核苷酸，或可替代地多个(即超过一个)嘌呤核苷酸是2′-O-甲基、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘌呤核苷酸)，且其中包含存在于所述反义区中的3′-末端核苷酸突出端的任何核苷酸是2′-脱氧核苷酸。

在一个实施方案中，本发明的特征在于包含反义区的本发明的化学修饰的短干扰核酸(siNA)分子，其中所述反义区中存在的任何(例如，一个或多个或所有)嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘧啶核苷酸(例如，其中所有嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘧啶核苷酸，或可替代地多个(即超过一个)嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘧啶核苷酸)，且其中所述反义区中存在的任何(例如，一个或多个或所有)嘌呤核苷酸是2′-脱氧嘌呤核苷酸(例如，其中所有嘌呤核苷酸是2′-脱氧嘌呤核苷酸，或可替代地多个(即超过一个)嘌呤核苷酸是2′-脱氧嘌呤核苷酸)。

在一个实施方案中，本发明的特征在于包含反义区的本发明的化学修饰的短干扰核酸(siNA)分子，其中所述反义区中存在的任何(例如，一个或多个或所有)嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘧啶核苷酸(例如，其中所有嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘧啶核苷酸，或可替代地多个(即超过一个)嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘧啶核苷酸)，且其中所述反义区中存在的任何(例如，一个或多个或所有)嘌呤核苷酸是2′-O-甲基、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘌呤核苷酸(例如，其中所有嘌呤核苷酸是2′-O-甲基、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘌呤核苷酸，或可替代地多个(即超过一个)嘌呤核苷酸是2′-O-甲基、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘌呤核苷酸)。

在一个实施方案中，本发明的特征在于能够在细胞或重构的体外系统内介导RNA干扰(RNAi)的化学修饰的短干扰核酸(siNA)分子，其包含有义区，其中所述有义区中存在的一个或多个嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘧啶核苷酸(例如，其中所有嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘧啶核苷酸，或可替代地多个(即超过一个)嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘧啶核苷酸)，且所述有义区中存在的一个或多个嘌呤核苷酸是2′-脱氧嘌呤核苷酸(例如，其中所有嘌呤核苷酸是2′-脱氧嘌呤核苷酸，或可替代地多个(即超过一个)嘌呤核苷酸是2′-脱氧嘌呤核苷酸)，和反义区，其中所述反义区中存在的一个或多个嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘧啶核苷酸(例如，其中所有嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘧啶核苷酸，或可替代地多个(即超过一个)嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘧啶核苷酸)，且所述反义区中存在的一个或多个嘌呤核苷酸是2′-O-甲基、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘌呤核苷酸(例如，其中所有嘌呤核苷酸是2′-O-甲基、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘌呤核苷酸，或可替代地多个(即超过一个)嘌呤核苷酸是2′-O-甲基、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘌呤核苷酸)。有义区和/或反义区可以具有末端帽修饰，例如本文描述或图7中显示的任何修饰，其任选存在于有义和/或反义序列的3′-末端、5′-末端、或3′和5′-末端处。有义和/或反义区可以任选进一步包含具有约1个-约4个(例如，约1个、2个、3个或4个)2′-脱氧核苷酸的3′-末端核苷酸突出端。突出端核苷酸可以进一步包含一个或多个(例如，约1个、2个、3个、4个或更多)硫代磷酸酯、膦酰乙酸酯和/或硫代膦酰乙酸酯核苷酸间键。这些化学修饰的siNA的非限制性例子显示于本文的图4和5以及表1b和8中。在这些描述的实施方案的任何一个中，有义区中存在的嘌呤核苷酸可替代地是2′-O-甲基、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘌呤核苷酸(例如，其中所有嘌呤核苷酸是2′-O-甲基、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘌呤核苷酸，或可替代地多个嘌呤核苷酸是2′-O-甲基、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘌呤核苷酸)，且反义区中存在的一个或多个嘌呤核苷酸是2′-O-甲基、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘌呤核苷酸(例如，其中所有嘌呤核苷酸是2′-O-甲基、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘌呤核苷酸，或可替代地多个(即超过一个)嘌呤核苷酸是2′-O-甲基、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘌呤核苷酸)。同样地，在这些实施方案的任何一个中，有义区中存在的一个或多个嘌呤核苷酸可替代地是嘌呤核糖核苷酸(例如，其中所有嘌呤核苷酸是嘌呤核糖核苷酸，或可替代地多个(即超过一个)嘌呤核苷酸是嘌呤核糖核苷酸)，且反义区中存在的任何嘌呤核苷酸是2′-O-甲基、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘌呤核苷酸(例如，其中所有嘌呤核苷酸是2′-O-甲基、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘌呤核苷酸，或可替代地多个(即超过一个)嘌呤核苷酸是2′-O-甲基、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘌呤核苷酸)。此外，在这些实施方案的任何一个中，有义区中存在和/或反义区中存在的一个或多个嘌呤核苷酸可替代地选自2′-脱氧核苷酸、锁定核酸(LNA)核苷酸、2′-甲氧基乙基核苷酸、4′-硫代核苷酸、2′-O-三氟甲基核苷酸、2′-O-乙基-三氟甲氧基核苷酸、2′-O-二氟甲氧基-乙氧基核苷酸、和2′-O-甲基核苷酸(例如，其中所有嘌呤核苷酸选自2′-脱氧核苷酸、锁定核酸(LNA)核苷酸、2′-甲氧基乙基核苷酸、4′-硫代核苷酸、2′-O-三氟甲基核苷酸、2′-O-乙基-三氟甲氧基核苷酸、2′-O-二氟甲氧基-乙氧基核苷酸、和2′-O-甲基核苷酸，或可替代地多个(即超过一个)嘌呤核苷酸选自2′-脱氧核苷酸、锁定核酸(LNA)核苷酸、2′-甲氧基乙基核苷酸、4′-硫代核苷酸、2′-O-三氟甲基核苷酸、2′-O-乙基-三氟甲氧基核苷酸、2′-O-二氟甲氧基-乙氧基核苷酸、和2′-O-甲基核苷酸)。

在另一个实施方案中，本发明的siNA分子中，优选地在本发明的siNA分子的反义链中，但也任选在有义和/或反义和有义链中存在的任何经修饰的核苷酸，包含具有与天然存在的核糖核苷酸类似的性质或特征的经修饰的核苷酸。例如，本发明的特征在于包括具有Northern构型(例如，Northern假旋转环(pseudorotation cycle)，参见例如Saenger，Principles of Nucleic Acid Structure，Springer-Verlag编辑，1984)的经修饰的核苷酸的siNA分子，所述Northern构型也称为“核糖样(ribo-like)”或“A型螺旋”构型。当它们具有C3’-内向型糖褶皱构象(C3’-内sugar pucker conformation)时，具有Northern构象的此类核苷酸一般被视为“核糖样”。照这样，本发明的siNA分子中，优选地在本发明的siNA分子的反义链中，但也任选在有义和/或反义和有义链中存在的化学修饰的核苷酸，对核酸酶降解有抗性同时维持介导RNAi的能力。具有northern构型的核苷酸的非限制性例子包括锁定核酸(LNA)核苷酸(例如，2′-O-，4′-C-亚甲基-(D-呋喃核糖基)核苷酸)；2′-甲氧基乙氧基(MOE)核苷酸；2′-甲基-硫代-乙基，2′-脱氧-2′-氟核苷酸，2′-脱氧-2′-氯核苷酸，2′-叠氮核苷酸，2′-O-三氟甲基核苷酸，2′-O-乙基-三氟甲氧基核苷酸，2′-O-二氟甲氧基-乙氧基核苷酸，4′-硫代核苷酸、和2′-O-甲基核苷酸。

在一个实施方案中，本发明的双链siNA分子的有义链包含末端帽部分，(参见例如图7)例如在有义链的3′-末端、5′-末端、或3′和5′-末端处的反向脱氧脱碱基部分。

在一个实施方案中，本发明的特征在于能够在细胞或重构的体外系统内介导RNA干扰(RNAi)的化学修饰的短干扰核酸分子(siNA)，其中所述化学修饰包含与化学修饰的siNA分子共价附着的缀合物。由本发明预期的缀合物的非限制性例子包括在Vargeese等人，USSN10/427,160中描述的缀合物和配体，所述USSN 10/427,160于2003年4月30日提交，包括附图整体引入本文作为参考。在另一个实施方案中，缀合物经由生物可降解的接头与化学修饰的siNA分子共价附着。在一个实施方案中，缀合物分子在化学修饰的siNA分子的有义链、反义链、或2条链的3′-末端处进行附着。在另一个实施方案中，缀合物分子在化学修饰的siNA分子的有义链、反义链、或2条链的5′-末端处进行附着。在另外一个实施方案中，缀合物分子在化学修饰的siNA分子的有义链、反义链、或2条链的3′-末端和5′-末端或其任何组合处进行附着。在一个实施方案中，本发明的缀合物分子包含促进化学修饰的siNA分子递送到生物系统例如细胞内的分子。在另一个实施方案中，与化学修饰的siNA分子附着的缀合物分子是关于细胞受体的配体，例如衍生自天然存在的蛋白质配体的肽；蛋白质定位序列，包括细胞ZIP编码序列；抗体；核酸适体；维生素和其他辅因子，例如叶酸和N-乙酰半乳糖胺；聚合物，例如聚乙二醇(PEG)；磷脂；胆固醇；类固醇，和聚胺，例如PEI、精胺或亚精胺。由本发明预期的可以与化学修饰的siNA分子附着的具体缀合物分子的例子在Vargeese等人，美国系列号10/201,394中得到描述，所述美国系列号10/201,394于2002年7月22日提交，引入本文作为参考。本发明的siNA分子使用的缀合物类型和缀合程度可以就改善的药物代谢动力学概况、生物利用率和/或siNA构建体的稳定性同时维持siNA介导RNAi活性的能力进行评估。照这样，本领域技术人员可以筛选用各种缀合物进行修饰的siNA构建体，以确定siNA缀合物复合物是否具有改善的性质同时维持介导RNAi的能力，例如在如本领域一般已知的动物模型中。

在一个实施方案中，本发明的特征在于本发明的短干扰核酸(siNA)分子，其中所述siNA进一步包含使siNA的有义区与siNA的反义区连接的核苷酸、非核苷酸、或混合的核苷酸/非核苷酸接头。在一个实施方案中，核苷酸、非核苷酸、或混合的核苷酸/非核苷酸接头用于例如使缀合物部分与siNA附着。在一个实施方案中，本发明的核苷酸接头可以是长度≥2个核苷酸的接头，例如长度约3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个核苷酸。在另一个实施方案中，核苷酸接头可以是核酸适体。如本文所使用的，“适体”或“核酸适体”意指与ENaC靶分子特异性结合的核酸分子，其中所述核酸分子具有包含在其天然背景中由ENaC靶分子识别的序列的序列。可替代地，适体可以是与ENaC靶分子结合的核酸分子，其中所述ENaC靶分子不与核酸天然结合。ENaC靶分子可以是任何目的分子(例如ENaC或其任何同种型)。例如，适体可以用于与蛋白质的配体结合结构域结合，从而阻止天然存在的配体与蛋白质的相互作用。这是非限制性例子，并且本领域技术人员将认识到使用本领域一般已知的技术可以容易地产生其他实施方案。(参见，例如，Gold等人，1995，Annu.Rev.Biochem.，64，763；Brody和Gold，2000，J.Biotechnol.，74，5；Sun，2000，Curr.Opin.Mol.Ther.，2，100；Kusser，2000，J.Biotechnol.，74，27；Hermann和Patel，2000，Science，287，820；和Jayasena，1999，ClinicalChemistry，45，1628.)

在另外一个实施方案中，本发明的非核苷酸接头包含脱碱基核苷酸、聚醚、聚胺、聚酰胺、肽、碳水化合物、脂质、聚烃、或其他聚合化合物(例如聚乙二醇，例如具有2个-100个乙二醇单位的那些)。具体例子包括由下述参考文献描述的那些：Seela和Kaiser，NucleicAcids Res.1990，18：6353和Nucleic Acids Res.1987，15：3113；Cload和Schepartz，J.Am.Chem.Soc.1991，113：6324；Richardson和Schepartz，J.Am.Chem.Soc.1991，113：5109；Ma等人，Nucleic Acids Res.1993，21：2585和Biochemistry 1993，32：1751；Durand等人，Nucleic AcidsRes.1990，18：6353；McCurdy等人，Nucleosides & Nucleotides 1991，10：287；Jschke等人，Tetrahedron Lett.1993，34：301；Ono等人，Biochemistry 1991，30：9914；Arnold等人，国际公开号WO 89/02439；Usman等人，国际公开号WO 95/06731；Dudycz等人，国际公开号WO 95/11910以及Ferentz和Verdine，J.Am.Chem.Soc.1991，113：4000，全部引入本文作为参考。“非核苷酸”进一步意指任何基团或化合物，其可以掺入核酸链内代替一个或多个核苷酸单位，包括糖和/或磷酸置换，并且允许其余碱基显示其酶促活性。基团或化合物可以是脱碱基的，因为它不包含通常公认的核苷酸碱基，例如腺苷、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶，例如在糖的C1位置处。

在一个实施方案中，本发明的特征在于能够在细胞或重构的体外系统内介导RNA干扰(RNAi)的短干扰核酸(siNA)分子，其中由2个分开的寡核苷酸装配的siNA分子的1条或2条链不包含任何核糖核苷酸。例如，siNA分子可以由单个寡核苷酸装配，其中所述siNA的有义和反义区包含分开的寡核苷酸，其不具有寡核苷酸中存在的任何核糖核苷酸(例如，具有2′-OH基团的核苷酸)。在另一个例子中，siNA分子可以由单个寡核苷酸装配，其中siNA的有义和反义区通过如本文所描述的核苷酸或非核苷酸接头进行连接或环化，其中所述寡核苷酸不具有寡核苷酸中存在的任何核糖核苷酸(例如，具有2′-OH基团的核苷酸)。申请人已惊讶地发现siNA分子内核糖核苷酸(例如，具有2′-羟基的核苷酸)的存在并非支持RNAi活性所需或必需的。照这样，在一个实施方案中，siNA内的所有位置可以包括化学修饰的核苷酸和/或非核苷酸，例如具有式I、II、III、IV、V、VI或VII或其任何组合的核苷酸和或非核苷酸，其程度至siNA分子支持细胞中的RNAi活性的能力被维持。

在一个实施方案中，本发明的化学修饰的短干扰核酸(siNA)分子包含具有2个或更多(例如，2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个或更多)2′-O-烷基(例如，2′-O-甲基)修饰或其任何组合的有义链或有义区。在另一个实施方案中，2′-O-烷基修饰在siNA的有义链或有义区中的交替位置处，例如位置1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21等，或位置2、4、6、8、10、12、14、16、18、20等。

在一个实施方案中，本发明的化学修饰的短干扰核酸(siNA)分子包含具有2个或更多(例如，2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个或更多)2′-O-烷基(例如，2′-O-甲基)修饰或其任何组合的反义链或反义区。在另一个实施方案中，2′-O-烷基修饰在siNA的反义链或反义区中的交替位置处，例如位置1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21等，或位置2、4、6、8、10、12、14、16、18、20等。

在一个实施方案中，本发明的化学修饰的短干扰核酸(siNA)分子包含有义链或有义区和反义链或反义区，其各自具有2个或更多(例如，2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个或更多)2′-O-烷基(例如，2′-O-甲基)、2′-脱氧-2′-氟、2′-脱氧、或脱碱基化学修饰或其任何组合。在另一个实施方案中，2′-O-烷基修饰在siNA的有义链或有义区中的交替位置处，例如位置1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21等，或位置2、4、6、8、10、12、14、16、18、20等。在另一个实施方案中，2′-O-烷基修饰在siNA的反义链或反义区中的交替位置处，例如位置1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21等，或位置2、4、6、8、10、12、14、16、18、20等。

在一个实施方案中，本发明的siNA分子包含在siNA分子的1条或多条链或一个或多个区域内的交替位置处的化学修饰的核苷酸或非核苷酸(例如，具有式I-VII中的任何一个，例如2′-脱氧、2′-脱氧-2′-氟、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、2′-O-二氟甲氧基-乙氧基或2′-O-甲基核苷酸)。例如，此类化学修饰可以在基于RNA的siNA分子每隔一个的位置处引入，起始于来自siNA的3′-末端或5′-末端的第一个或第二个核苷酸。在非限制性例子中，在其中siNA的每条链长度为21个核苷酸的本发明的双链siNA分子的特征在于其中每条链的位置1、3、5、7、9、11、13、15、17、19和21是化学修饰的(例如，由具有式I-VII中的任何一个的化合物，例如2′-脱氧、2′-脱氧-2′-氟、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、2′-O-二氟甲氧基-乙氧基或2′-O-甲基核苷酸)。在另一个非限制性例子中，在其中siNA的每条链长度为21个核苷酸的本发明的双链siNA分子的特征在于其中每条链的位置2、4、6、8、10、12、14、16、18和20是化学修饰的(例如，由具有式I-VII中的任何一个的化合物，例如2′-脱氧、2′-脱氧-2′-氟、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、2′-O-二氟甲氧基-乙氧基或2′-O-甲基核苷酸)。在一个实施方案中，双链siNA分子的一条链包含在位置2、4、6、8、10、12、14、16、18和20处的化学修饰，和在位置1、3、5、7、9、11、13、15、17、19和21处的化学修饰。此类siNA分子可以进一步包含如本文所描述的末端帽部分和/或主链修饰。

在一个实施方案中，本发明的siNA分子包含下述特征：如果嘌呤核苷酸存在于siNA分子的反义链或反义区(也称为引导序列或引导链)的5′-末端处(例如，来自5′-末端的末端核苷酸位置1、2、3、4、5或6中的任何一个处)，那么此类嘌呤核苷酸是核糖核苷酸。在另一个实施方案中，嘌呤核糖核苷酸当存在时与siNA分子的有义链或有义区(也称为过客链)的核苷酸碱基配对。此类嘌呤核糖核苷酸可以存在于另外包含经修饰的核苷酸的siNA稳定化基序中。

在一个实施方案中，本发明的siNA分子包含下述特征：如果嘧啶核苷酸存在于siNA分子的反义链或反义区(也称为引导序列或引导链)的5′-末端处(例如，来自5′-末端的末端核苷酸位置1、2、3、4、5或6中的任何一个处)，那么此类嘧啶核苷酸是核糖核苷酸。在另一个实施方案中，嘧啶核糖核苷酸当存在时与siNA分子的有义链或有义区(也称为过客链)的核苷酸碱基配对。此类嘧啶核糖核苷酸可以存在于另外包含经修饰的核苷酸的siNA稳定化基序中。

在一个实施方案中，本发明的siNA分子包含下述特征：如果嘧啶核苷酸存在于siNA分子的反义链或反义区(也称为引导序列或引导链)的5′-末端处(例如，来自5′-末端的末端核苷酸位置1、2、3、4、5或6中的任何一个处)，那么此类嘧啶核苷酸是经修饰的核苷酸。在另一个实施方案中，经修饰的嘧啶核糖核苷酸当存在时与siNA分子的有义链或有义区(也称为过客链)的核苷酸碱基配对。经修饰的嘧啶核苷酸的非限制性例子包括具有式I-VII中的任何一个的那些，例如2′-脱氧、2′-脱氧-2′-氟、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、2′-O-二氟甲氧基-乙氧基或2′-O-甲基核苷酸。

在一个实施方案中，本发明的特征在于具有结构SI的双链核酸(siNA)分子：

B——————N_X3——————(N)_X2B-3′

B(N)_X1——————N_X4——————[N]_X5-5′

                   SI

其中每个N独立地是可以是未修饰或化学修饰的核苷酸；每个B是可以存在或不存在的末端帽部分；(N)代表可以是未修饰或化学修饰的非碱基配对或突出端核苷酸；[N]代表其中存在时的任何嘌呤核苷酸是核糖核苷酸的核苷酸位置；X1和X2独立地是约0-约4的整数；X3是约9-约30的整数；X4是约11-约30的整数，前提是X4和X5的和为17-36；X5是约1-约6的整数；NX3与NX4和NX5互补，且

(a)反义链(下部链)中存在的任何嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟核苷酸；除[N]核苷酸位置中的嘌呤核苷酸外的反义链(下部链)中存在的任何嘌呤核苷酸独立地是2′-O-甲基核苷酸、2′-脱氧核糖核苷酸、或2′-脱氧核糖核苷酸和2′-O-甲基核苷酸的组合；

(b)有义链(上部链)中存在的任何嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟核苷酸；有义链(上部链)中存在的任何嘌呤核苷酸独立地是2′-脱氧核糖核苷酸、2′-O-甲基核苷酸、或2′-脱氧核糖核苷酸和2′-O-甲基核苷酸的组合；和

(c)任何(N)核苷酸任选是2′-O-甲基、2′-脱氧-2′-氟或脱氧核糖核苷酸。

在一个实施方案中，本发明的特征在于具有结构SII的双链核酸(siNA)分子：

B——————N_X3——————(N)_X2B-3′

B(N)_X1——————N_X4——————[N]_X5-5′

                  SII

其中每个N独立地是可以是未修饰或化学修饰的核苷酸；每个B是可以存在或不存在的末端帽部分；(N)代表可以是未修饰或化学修饰的非碱基配对或突出端核苷酸；[N]代表其中存在时的任何嘌呤核苷酸是核糖核苷酸的核苷酸位置；X1和X2独立地是约0-约4的整数；X3是约9-约30的整数；X4是约11-约30的整数，前提是X4和X5的和为17-36；X5是约1-约6的整数；NX3与NX4和NX5互补，且

(a)反义链(下部链)中存在的任何嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟核苷酸；除[N]核苷酸位置中的嘌呤核苷酸外的反义链(下部链)中存在的任何嘌呤核苷酸是2′-O-甲基核苷酸；

(b)有义链(上部链)中存在的任何嘧啶核苷酸是核糖核苷酸；有义链(上部链)中存在的任何嘌呤核苷酸是核糖核苷酸；和

(c)任何(N)核苷酸任选是2′-O-甲基、2′-脱氧-2′-氟或脱氧核糖核苷酸。

在一个实施方案中，本发明的特征在于具有结构SIII的双链核酸(siNA)分子：

B——————N_X3——————(N)_X2B-3′

B(N)_X1——————N_X4——————[N]_X5-5′

                  SIII

其中每个N独立地是可以是未修饰或化学修饰的核苷酸；每个B是可以存在或不存在的末端帽部分；(N)代表可以是未修饰或化学修饰的非碱基配对或突出端核苷酸；[N]代表其中存在时的任何嘌呤核苷酸是核糖核苷酸的核苷酸位置；X1和X2独立地是约0-约4的整数；X3是约9-约30的整数；X4是约11-约30的整数，前提是X4和X5的和为17-36；X5是约1-约6的整数；NX3与NX4和NX5互补，且

(a)反义链(下部链)中存在的任何嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟核苷酸；除[N]核苷酸位置中的嘌呤核苷酸外的反义链(下部链)中存在的任何嘌呤核苷酸是2′-O-甲基核苷酸；

(b)有义链(上部链)中存在的任何嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟核苷酸；有义链(上部链)中存在的任何嘌呤核苷酸是核糖核苷酸；和

(c)任何(N)核苷酸任选是2′-O-甲基、2′-脱氧-2′-氟或脱氧核糖核苷酸。

在一个实施方案中，本发明的特征在于具有结构SIV的双链核酸(siNA)分子：

B——————N_X3——————(N)_X2B-3′

B(N)_X1——————N_X4——————[N]_X5-5′

                  SIV

其中每个N独立地是可以是未修饰或化学修饰的核苷酸；每个B是可以存在或不存在的末端帽部分；(N)代表可以是未修饰或化学修饰的非碱基配对或突出端核苷酸；[N]代表其中存在时的任何嘌呤核苷酸是核糖核苷酸的核苷酸位置；X1和X2独立地是约0-约4的整数；X3是约9-约30的整数；X4是约11-约30的整数，前提是X4和X5的和为17-36；X5是约1-约6的整数；NX3与NX4和NX5互补，且

(a)反义链(下部链)中存在的任何嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟核苷酸；除[N]核苷酸位置中的嘌呤核苷酸外的反义链(下部链)中存在的任何嘌呤核苷酸是2′-O-甲基核苷酸；

(b)有义链(上部链)中存在的任何嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟核苷酸；有义链(上部链)中存在的任何嘌呤核苷酸是脱氧核糖核苷酸；和

(c)任何(N)核苷酸任选是2′-O-甲基、2′-脱氧-2′-氟或脱氧核糖核苷酸。

在一个实施方案中，本发明的特征在于具有结构SV的双链核酸(siNA)分子：

B——————N_X3——————(N)_X2B-3′

B(N)_X1——————N_X4——————[N]_X5-5′

                  SV

其中每个N独立地是可以是未修饰或化学修饰的核苷酸；每个B是可以存在或不存在的末端帽部分；(N)代表可以是未修饰或化学修饰的非碱基配对或突出端核苷酸；[N]代表其中存在时的任何嘌呤核苷酸是核糖核苷酸的核苷酸位置；X1和X2独立地是约0-约4的整数；X3是约9-约30的整数；X4是约11-约30的整数，前提是X4和X5的和为17-36；X5是约1-约6的整数；NX3与NX4和NX5互补，且

(a)反义链(下部链)中存在的任何嘧啶核苷酸是具有核糖样构型(例如，Northern或A型螺旋构型)的核苷酸；除[N]核苷酸位置中的嘌呤核苷酸外的反义链(下部链)中存在的任何嘌呤核苷酸是2′-O-甲基核苷酸；

(b)有义链(上部链)中存在的任何嘧啶核苷酸是具有核糖样构型(例如，Northern或A型螺旋构型)的核苷酸；有义链(上部链)中存在的任何嘌呤核苷酸是2′-O-甲基核苷酸；和

(c)任何(N)核苷酸任选是2′-O-甲基、2′-脱氧-2′-氟或脱氧核糖核苷酸。

在一个实施方案中，本发明的特征在于具有结构SVI的双链核酸(siNA)分子：

B——————N_X3——————(N)_X2B-3′

B(N)_X1——————N_X4——————[N]_X5-5′

                  SVI

其中每个N独立地是可以是未修饰或化学修饰的核苷酸；每个B是可以存在或不存在的末端帽部分；(N)代表可以是未修饰或化学修饰的非碱基配对或突出端核苷酸；[N]代表包含使得反义链(下部链)的5′-末端比有义链(上部链)的5′-末端更不热稳定的序列的核苷酸位置；X1和X2独立地是约0-约4的整数；X3是约9-约30的整数；X4是约11-约30的整数，前提是X4和X5的和为17-36；X5是约1-约6的整数；NX3与NX4和NX5互补，且

(a)反义链(下部链)中存在的任何嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟核苷酸；除[N]核苷酸位置中的嘌呤核苷酸外的反义链(下部链)中存在的任何嘌呤核苷酸独立地是2′-O-甲基核苷酸、2′-脱氧核糖核苷酸、或2′-脱氧核糖核苷酸和2′-O-甲基核苷酸的组合；

(b)有义链(上部链)中存在的任何嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟核苷酸；有义链(上部链)中存在的任何嘌呤核苷酸独立地是2′-脱氧核糖核苷酸、2′-O-甲基核苷酸、或2′-脱氧核糖核苷酸和2′-O-甲基核苷酸的组合；和

(c)任何(N)核苷酸任选是2′-O-甲基、2′-脱氧-2′-氟或脱氧核糖核苷酸。

在一个实施方案中，本发明的特征在于具有结构SVII的双链核酸(siNA)分子：

B——————N_X3——————(N)_X2B-3′

B(N)_X1——————N_X4——————-5′

                 SVII

其中每个N独立地是可以是未修饰或化学修饰的核苷酸；每个B是可以存在或不存在的末端帽部分；(N)代表非碱基配对或突出端核苷酸；X1和X2独立地是约0-约4的整数；X3是约9-约30的整数；X4是约11-约30的整数，NX3与NX4互补，且任何(N)核苷酸是2′-O-甲基和/或2′-脱氧-2′-氟核苷酸。

在一个实施方案中，本发明的特征在于具有结构SVIII的双链核酸(siNA)分子：

B——————N_X7—[N]_X6—N_X3——————(N)_X2B-3′

B(N)_X1——————N_X4——————[N]_X5-5′

                 SVIII

其中每个N独立地是可以是未修饰或化学修饰的核苷酸；每个B是可以存在或不存在的末端帽部分；(N)代表可以是未修饰或化学修饰的非碱基配对或突出端核苷酸；[N]代表包含使得反义链(下部链)的5′-末端比有义链(上部链)的5′-末端更不热稳定的序列的核苷酸位置；[N]代表是核糖核苷酸的核苷酸位置；X1和X2独立地是约0-约4的整数；X3是约9-约15的整数；X4是约11-约30的整数，前提是X4和X5的和为17-36；X5是约1-约6的整数；X6是约1-约4的整数；X7是约9-约15的整数；NX7、NX6和NX3与NX4和NX5互补，且

(a)反义链(下部链)中存在的任何嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟核苷酸；除[N]核苷酸位置中的嘌呤核苷酸外的反义链(下部链)中存在的任何嘌呤核苷酸独立地是2′-O-甲基核苷酸、2′-脱氧核糖核苷酸、或2′-脱氧核糖核苷酸和2′-O-甲基核苷酸的组合；

(b)有义链(上部链)中存在的任何嘧啶核苷酸除[N]核苷酸外是2′-脱氧-2′-氟核苷酸；有义链(上部链)中存在的任何嘌呤核苷酸除[N]核苷酸外独立地是2′-脱氧核糖核苷酸、2′-O-甲基核苷酸、或2′-脱氧核糖核苷酸和2′-O-甲基核苷酸的组合；和

(c)任何(N)核苷酸任选是2′-O-甲基、2′-脱氧-2′-氟或脱氧核糖核苷酸。

在一个实施方案中，本发明的特征在于具有结构SIX的双链核酸(siNA)分子：

B——————N_X3——————(N)_X2B-3′

B(N)_X1——————N_X4——————[N]_X5-5′

                  SIX

其中每个N独立地是可以是未修饰或化学修饰的核苷酸；每个B是可以存在或不存在的末端帽部分；(N)代表可以是未修饰或化学修饰的非碱基配对或突出端核苷酸；[N]代表是核糖核苷酸的核苷酸位置；X1和X2独立地是约0-约4的整数；X3是约9-约30的整数；X4是约11-约30的整数，前提是X4和X5的和为17-36；X5是约1-约6的整数；NX3与NX4和NX5互补，且

(a)反义链(下部链)中存在的任何嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟核苷酸；除[N]核苷酸位置中的嘌呤核苷酸外的反义链(下部链)中存在的任何嘌呤核苷酸独立地是2′-O-甲基核苷酸、2′-脱氧核糖核苷酸、或2′-脱氧核糖核苷酸和2′-O-甲基核苷酸的组合；

(b)有义链(上部链)中存在的任何嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟核苷酸；有义链(上部链)中存在的任何嘌呤核苷酸独立地是2′-脱氧核糖核苷酸、2′-O-甲基核苷酸、或2′-脱氧核糖核苷酸和2′-O-甲基核苷酸的组合；和

(c)任何(N)核苷酸任选是2′-O-甲基、2′-脱氧-2′-氟或脱氧核糖核苷酸。

在一个实施方案中，本发明的特征在于具有结构SX的双链核酸(siNA)分子：

B——————N_X3——————(N)_X2B-3′

B(N)_X1——————N_X4——————[N]_X5-5′

                  SX

其中每个N独立地是可以是未修饰或化学修饰的核苷酸；每个B是可以存在或不存在的末端帽部分；(N)代表可以是未修饰或化学修饰的非碱基配对或突出端核苷酸；[N]代表是核糖核苷酸的核苷酸位置；X1和X2独立地是约0-约4的整数；X3是约9-约30的整数；X4是约11-约30的整数，前提是X4和X5的和为17-36；X5是约1-约6的整数；NX3与NX4和NX5互补，且

(a)反义链(下部链)中存在的任何嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟核苷酸；除[N]核苷酸位置中的嘌呤核苷酸外的反义链(下部链)中存在的任何嘌呤核苷酸是2′-O-甲基核苷酸；

(b)有义链(上部链)中存在的任何嘧啶核苷酸是核糖核苷酸；有义链(上部链)中存在的任何嘌呤核苷酸是核糖核苷酸；和

(c)任何(N)核苷酸任选是2′-O-甲基、2′-脱氧-2′-氟或脱氧核糖核苷酸。

在一个实施方案中，本发明的特征在于具有结构SXI的双链核酸(siNA)分子：

B——————N_X3——————(N)_X2B-3′

B(N)_X1——————N_X4——————[N]_X5-5′

                  SXI

其中每个N独立地是可以是未修饰或化学修饰的核苷酸；每个B是可以存在或不存在的末端帽部分；(N)代表可以是未修饰或化学修饰的非碱基配对或突出端核苷酸；[N]代表是核糖核苷酸的核苷酸位置；X1和X2独立地是约0-约4的整数；X3是约9-约30的整数；X4是约11-约30的整数，前提是X4和X5的和为17-36；X5是约1-约6的整数；NX3与NX4和NX5互补，且

(a)反义链(下部链)中存在的任何嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟核苷酸；除[N]核苷酸位置中的嘌呤核苷酸外的反义链(下部链)中存在的任何嘌呤核苷酸是2′-O-甲基核苷酸；

(b)有义链(上部链)中存在的任何嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟核苷酸；有义链(上部链)中存在的任何嘌呤核苷酸是核糖核苷酸；和

(c)任何(N)核苷酸任选是2′-O-甲基、2′-脱氧-2′-氟或脱氧核糖核苷酸。

在一个实施方案中，本发明的特征在于具有结构SXII的双链核酸(siNA)分子：

B——————N_X3——————(N)_X2B-3′

B(N)_X1——————N_X4——————[N]_X5-5′

                  SXII

其中每个N独立地是可以是未修饰或化学修饰的核苷酸；每个B是可以存在或不存在的末端帽部分；(N)代表可以是未修饰或化学修饰的非碱基配对或突出端核苷酸；[N]代表是核糖核苷酸的核苷酸位置；X1和X2独立地是约0-约4的整数；X3是约9-约30的整数；X4是约11-约30的整数，前提是X4和X5的和为17-36；X5是约1-约6的整数；NX3与NX4和NX5互补，且

(a)反义链(下部链)中存在的任何嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟核苷酸；除[N]核苷酸位置中的嘌呤核苷酸外的反义链(下部链)中存在的任何嘌呤核苷酸是2′-O-甲基核苷酸；

(b)有义链(上部链)中存在的任何嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟核苷酸；有义链(上部链)中存在的任何嘌呤核苷酸是脱氧糖核苷酸；和

(c)任何(N)核苷酸任选是2′-O-甲基、2′-脱氧-2′-氟或脱氧核糖核苷酸。

在一个实施方案中，本发明的特征在于具有结构SXIII的双链核酸(siNA)分子：

B——————N_X3——————(N)_X2B-3′

B(N)_X1——————N_X4——————[N]_X5-5′

                 SXIII

其中每个N独立地是可以是未修饰或化学修饰的核苷酸；每个B是可以存在或不存在的末端帽部分；(N)代表可以是未修饰或化学修饰的非碱基配对或突出端核苷酸；[N]代表是核糖核苷酸的核苷酸位置；X1和X2独立地是约0-约4的整数；X3是约9-约30的整数；X4是约11-约30的整数，前提是X4和X5的和为17-36；X5是约1-约6的整数；NX3与NX4和NX5互补，且

(a)反义链(下部链)中存在的任何嘧啶核苷酸是具有核糖样构型(例如，Northern或A型螺旋构型)的核苷酸；除[N]核苷酸位置中的嘌呤核苷酸外的反义链(下部链)中存在的任何嘌呤核苷酸是2′-O-甲基核苷酸；

(b)有义链(上部链)中存在的任何嘧啶核苷酸是具有核糖样构型(例如，Northern或A型螺旋构型)的核苷酸；有义链(上部链)中存在的任何嘌呤核苷酸是2′-O-甲基核苷酸；和

(c)任何(N)核苷酸任选是2′-O-甲基、2′-脱氧-2′-氟或脱氧核糖核苷酸。

在一个实施方案中，本发明的特征在于具有结构SXIV的双链核酸(siNA)分子：

B————N_X7—[N]_X6—N_X3————(N)_X2B-3′

B(N)_X1——————N_X4——————[N]_X5-5′

                  SXIV

其中每个N独立地是可以是未修饰或化学修饰的核苷酸；每个B是可以存在或不存在的末端帽部分；(N)代表可以是未修饰或化学修饰的非碱基配对或突出端核苷酸；[N]代表是核糖核苷酸的核苷酸位置；[N]代表是核糖核苷酸的核苷酸位置；X1和X2独立地是约0-约4的整数；X3是约9-约15的整数；X4是约11-约30的整数，前提是X4和X5的和为17-36；X5是约1-约6的整数；X6是约1-约4的整数；X7是约9-约15的整数；NX7、NX6和NX3与NX4和NX5互补，且

(a)反义链(下部链)中存在的任何嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟核苷酸；除[N]核苷酸位置中的嘌呤核苷酸外的反义链(下部链)中存在的任何嘌呤核苷酸独立地是2′-O-甲基核苷酸、2′-脱氧核糖核苷酸、或2′-脱氧核糖核苷酸和2′-O-甲基核苷酸的组合；

(b)有义链(上部链)中存在的任何嘧啶核苷酸除[N]核苷酸外是2′-脱氧-2′-氟核苷酸；有义链(上部链)中存在的任何嘌呤核苷酸除[N]核苷酸外独立地是2′-脱氧核糖核苷酸、2′-O-甲基核苷酸、或2′-脱氧核糖核苷酸和2′-O-甲基核苷酸的组合；和

(c)任何(N)核苷酸任选是2′-O-甲基、2′-脱氧-2′-氟或脱氧核糖核苷酸。

在一个实施方案中，具有结构SI、SII、SIII、SIV、SV、SVI、SVII、SVIII、SIX、SX、SXI、SXII、SXIII或SXIV中的任何一个的双链核酸(siNA)分子包含在核酸分子的反义链或反义区的5′-末端处的末端磷酸基。

在一个实施方案中，具有结构SI、SII、SIII、SIV、SV、SVI、SVII、SVIII、SIX、SX、SXI、SXII、SXIII或SXIV中的任何一个的双链核酸(siNA)分子包含X5＝1、2或3；X1和X2各自＝1或2；X3＝12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，和X4＝15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。

在一个实施方案中，具有结构SI、SII、SIII、SIV、SV、SVI、SVII、SVIII、SIX、SX、SXI、SXII、SXIII或SXIV中的任何一个的双链核酸(siNA)分子包含X5＝1；X1和X2各自＝2；X3＝19，和X4＝18。

在一个实施方案中，具有结构SI、SII、SIII、SIV、SV、SVI、SVII、SVIII、SIX、SX、SXI、SXII、SXIII或SXIV中的任何一个的双链核酸(siNA)分子包含X5＝2；X1和X2各自＝2；X3＝19，和X4＝17。

在一个实施方案中，具有结构SI、SII、SIII、SIV、SV、SVI、SVII、SVIII、SIX、SX、SXI、SXII、SXIII或SXIV中的任何一个的双链核酸(siNA)分子包含X5＝3；X1和X2各自＝2；X3＝19，和X4＝16。

在一个实施方案中，具有结构SI、SII、SIII、SIV、SV、SVI、SVII、SVIII、SIX、SX、SXI、SXII、SXIII或SXIV中的任何一个的双链核酸(siNA)分子包含在有义链或有义区的3′和5′-末端处的B。

在一个实施方案中，具有结构SI、SII、SIII、SIV、SV、SVI、SVII、SVIII、SIX、SX、SXI、SXII、SXIII或SXIV中的任何一个的双链核酸(siNA)分子包含在反义链或反义区的3′-末端处的B。

在一个实施方案中，具有结构SI、SII、SIII、SIV、SV、SVI、SVII、SVIII、SIX、SX、SXI、SXII、SXIII或SXIV中的任何一个的双链核酸(siNA)分子包含在有义链或有义区的3′和5′-末端处的B以及在反义链或反义区的3′-末端处的B。

在一个实施方案中，具有结构SI、SII、SIII、SIV、SV、SVI、SVII、SVIII、SIX、SX、SXI、SXII、SXIII或SXIV中的任何一个的双链核酸(siNA)分子进一步包含在核酸分子的有义链、反义链、或有义链和反义链的3′末端上的第一个末端(N)处的一个或多个硫代磷酸酯核苷酸间键。例如，双链核酸(siNA)分子可以包含具有含硫代磷酸酯核苷酸间键的突出端核苷酸位置的X1和/或X2＝2，例如(NsN)其中“s”指示硫代磷酸酯。

在一个实施方案中，具有结构SI、SII、SIII、SIV、SV、SVI、SVII、SVIII、SIX、SX、SXI、SXII、SXIII或SXIV中的任何一个的双链核酸(siNA)分子包含是2′-O-甲基核苷酸的(N)核苷酸。

在一个实施方案中，具有结构SI、SII、SIII、SIV、SV、SVI、SVII、SVIII、SIX、SX、SXI、SXII、SXIII或SXIV中的任何一个的双链核酸(siNA)分子包含是2′-脱氧核苷酸的(N)核苷酸。

在一个实施方案中，具有结构SI、SII、SIII、SIV、SV、SVI、SVII、SVIII、SIX、SX、SXI、SXII、SXIII或SXIV中的任何一个的双链核酸(siNA)分子包含是2’-脱氧-2’-氟核苷酸的(N)核苷酸。

在一个实施方案中，具有结构SI、SII、SIII、SIV、SV、SVI、SVII、SVIII、SIX、SX、SXII、SXIII或SXIV中的任何一个的双链核酸(siNA)分子包含在反义链(下部链)中的(N)核苷酸，其与ENaC靶多核苷酸序列中的核苷酸互补，所述ENaC靶多核苷酸序列中的核苷酸与反义(下部)链的N和[N]核苷酸具有互补性。

在一个实施方案中，具有结构SI、SII、SIII、SIV、SV、SVI、SVII、SVIII、SIX、SX、SXII、SXIII或SXIV中的任何一个的双链核酸(siNA)分子包含在有义链(上部链)中的(N)核苷酸，其包含ENaC靶多核苷酸序列的约15个-约30个核苷酸的邻接核苷酸序列。在一个实施方案中，具有结构SI、SII、SIII、SIV、SV、SVI、SVII、SVIII、SIX、SX、SXII、SXIII或SXIV中的任何一个的双链核酸(siNA)分子包含在有义链(上部链)中的(N)核苷酸，其包含对应与反义(下部)链具有互补性的ENaC靶多核苷酸序列的核苷酸序列，从而使得有义链的邻接(N)和N核苷酸序列包含ENaC靶核酸序列的核苷酸序列。

在一个实施方案中，具有结构SVIII或SXIV中的任何一个的双链核酸(siNA)分子包含仅在双链核酸分子的有义(上部)链的5′-末端处的B。

在一个实施方案中，具有结构SI、SII、SIII、SIV、SV、SVI、SVII、SVIII、SIX、SX、SXI、SXII、SXIII或SXIV中的任何一个的双链核酸(siNA)进一步包含在反义(下部)链的5′-末端处非配对的末端核苷酸。非配对的核苷酸不与有义(上部)链互补。在一个实施方案中，非配对的末端核苷酸与ENaC靶多核苷酸序列互补，所述ENaC靶多核苷酸序列与反义(下部)链的N和[N]核苷酸具有互补性。在另一个实施方案中，非配对的末端核苷酸不与ENaC靶多核苷酸序列互补，所述靶多核苷酸序列与反义(下部)链的N和[N]核苷酸具有互补性。

在一个实施方案中，具有结构SVIII或SXIV中的任何一个的双链核酸(siNA)分子包含X6＝1和X3＝10。

在一个实施方案中，具有结构SVIII或SXIV中的任何一个的双链核酸(siNA)分子包含X6＝2和X3＝9。

在一个实施方案中，本发明的特征在于包含配制为下述制剂中的任何的siNA分子或双链核酸分子或RNAi抑制剂的组合物，例如LNP-051；LNP-053；LNP-054；LNP-069；LNP-073；LNP-077；LNP-080；LNP-082；LNP-083；LNP-060；LNP-061；LNP-086；LNP-097；LNP-098；LNP-099；LNP-100；LNP-101；LNP-102；LNP-103；或LNP-104(参见表10)。

在一个方面，本发明包括具有彼此互补的第一条链和第二条链的双链核酸(siNA)分子，其中至少一条链包括：

5’-UGUGCAACCAGAACAAAUC-3’(SEQ ID NO：10)；

5’-GAUUUGUUCUGGUUGCACA-3’(SEQ ID NO：107)；

5’-UUAUGGAUGAUGGUGGCUU-3’(SEQ ID NO：13)；

5’-AAGCCACCAUCAUCCAUAA-3’(SEQ ID NO：124)；

5’-GUGUGGCUGUGCCUACAUC-3’(SEQ ID NO：16)；

5’-GAUGUAGGCACAGCCACAC-3’(SEQ ID NO：125)

5’-GCUGUGCCUACAUCUUCUA-3’(SEQ ID NO：21)；或

5’-UAGAAGAUGUAGGCACAGC-3’(SEQ ID NO：126)；和

其中一个或多个核苷酸是任选化学修饰的。在这个方面的一个实施方案中，双链核酸(siNA)分子包括全部未修饰的核苷酸。在一个实施方案中，双链核酸(siNA)分子包括全部化学修饰的核苷酸。

在另一个方面，本发明包括包含结构SIX′的双链核酸(siNA)分子，其具有有义链和反义链：

B——————N_X3——————(N)_X2B-3′

B(N)_X1——————N_X4——————[N]_X5-5′

                 SIX′

其中

上部链是双链核酸分子的有义链，并且下部链是双链核酸分子的反义链，并且所述有义链包括与反义链互补的序列；

所述反义链包括与SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：13、SEQ IDNO：16或SEQ ID NO：21互补的序列；

每个N独立地是未修饰或化学修饰的核苷酸；

每个B是存在或不存在的末端帽部分；

(N)代表突出端核苷酸，其各自独立地是未修饰的或2’-O-甲基核苷酸、2’-脱氧-2’-氟核苷酸或2′-脱氧核糖核苷酸；

[N]代表其为核糖核苷酸的核苷酸；

X1和X2独立地是0-4的整数；

X3是9-30的整数；

X4是11-30的整数，条件是X4和X5的总和是17-36；

X5是1-6的整数；并且其中

(a)N_X4位置中的每个嘧啶核苷酸独立地是2’-脱氧-2’-氟核苷酸或2’-O-甲基核苷酸；

N_X4位置中的每个嘌呤核苷酸独立地是2’-O-甲基核苷酸或2’-脱氧核糖核苷酸；和

(b)N_X3位置中的每个嘧啶核苷酸是2’-脱氧-2’-氟核苷酸；

N_X3位置中的每个嘌呤核苷酸独立地是2’-脱氧核糖核苷酸或2’-O-甲基核苷酸。

在一个实施方案中，每个B是如图27中所示的反向脱碱基帽部分。

在另一个方面，本发明还包括双链核酸(siNA)分子，其中siNA是：

5’-BuGuGcAAccAGAAcAAAucTTB-3’(有义)(SEQ ID NO：51)

     |||||||||||||||||||

3’-UUAcAcGuuGGucuuGuuUAG-5’(反义)(SEQ ID NO：52)

其中：

每个B是反向脱碱基帽部分；

c是2’-脱氧-2’-氟胞苷；

u是2’-脱氧-2’-氟尿苷；

A是2’-脱氧腺苷；

G是2’脱氧鸟苷；

T是胸苷；

A是腺苷；

G是鸟苷；

U是尿苷

A是2’-O-甲基-腺苷；

G是2’-O-甲基-鸟苷；

U是2’-O-甲基-尿苷；和

核苷酸间键合是化学修饰或未修饰的。

在这个方面的一个实施方案中，核苷酸间键合是未修饰的。

在另一个方面，本发明还包括双链核酸(siNA)分子，其中siNA是：

5′-BuuAuGGAuGAuGGuGGcuuTTB-3′(有义)(SEQ ID NO：57)

     |||||||||||||||||||

3′-UUAAuAccuAcuAccAccGAA-5′(反义)(SEQ ID NO：58)

其中：

每个B是反向脱碱基帽；

c是2’-脱氧-2’-氟胞苷；

u是2’-脱氧-2’-氟尿苷；

A是2’-脱氧腺苷；

G是2’脱氧鸟苷；

T是胸苷；

A是腺苷；

G是鸟苷；

A是2’-O-甲基-腺苷；

U是2’-O-甲基-尿苷；和

核苷酸间键合是化学修饰或未修饰的。

在这个方面的一个实施方案中，核苷酸间键合是未修饰的。

在另一个方面，本发明还包括双链核酸(siNA)分子，其中siNA是：

5′BGuGuGGcuGuGccuAcAucTTB 3′(有义)(SEQ ID NO：63)

    |||||||||||||||||||

3′UUcAcAccGAcAcGGAuGUAG 5′(反义)(SEQ ID NO：64)

其中：

每个B是反向脱碱基帽部分；

c是2’-脱氧-2’-氟胞苷；

u是2’-脱氧-2’-氟尿苷；

A是2’-脱氧腺苷；

G是2’脱氧鸟苷；

T是胸苷；

A是腺苷；

G是鸟苷；

U是尿苷；

A是2’-O-甲基-腺苷；

G是2’-O-甲基-鸟苷；

U是2’-O-甲基-尿苷；和

核苷酸间键合是化学修饰或未修饰的。

在这个方面的一个实施方案中，核苷酸间键合是未修饰的。

在另一个方面，本发明还包括双链核酸(siNA)分子，其中siNA是：

5′-BGcuGuGccuAcAucuucuATTB-3′(有义)(SEQ ID NO：73)

     |||||||||||||||||||

3′UUcGAcAcGGAuGuAGAAGAU-5′(反义)(SEQ ID NO：74)

其中：

每个B是反向脱碱基帽部分；

c是2’-脱氧-2’-氟胞苷；

u是2’-脱氧-2’-氟尿苷；

A是2’-脱氧腺苷；

G是2’脱氧鸟苷；

T是胸苷；

A是腺苷；

G是鸟苷；

U是尿苷；

A是2’-O-甲基-腺苷；

G是2’-O-甲基-鸟苷；

U是2’-O-甲基-尿苷；和

核苷酸间键合是化学修饰或未修饰的。

在这个方面的一个实施方案中，核苷酸间键合是未修饰的。

在另一个方面，本发明包括包含结构SX′的双链核酸(siNA)分子，其具有有义链和反义链：

B——————N_X3——————(N)_X2B-3′

B(N)_X1——————N_X4——————[N]_X5-5′

                  SX′

其中

上部链是双链核酸分子的有义链，并且下部链是双链核酸分子的反义链；所述反义链包括与SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：13、SEQ IDNO：16或SEQ ID NO：21具有互补性的序列，并且所述有义链包括与反义链具有互补性的序列；

每个N独立地是未修饰或化学修饰的核苷酸；

每个B是存在或不存在的末端帽部分；

(N)代表突出端核苷酸，其各自独立地是未修饰的或2’-O-甲基核苷酸、2’-脱氧-2’-氟核苷酸或2′-脱氧核糖核苷酸；

[N]代表其为核糖核苷酸的核苷酸；

X1和X2独立地是0-4的整数；

X3是9-30的整数；

X4是11-30的整数，条件是X4和X5的总和是17-36；

X5是1-6的整数；并且其中

(a)N_X4位置中的每个嘧啶核苷酸独立地是2’-脱氧-2’-氟核苷酸或2’-O-甲基核苷酸；

N_X4位置中的每个嘌呤核苷酸是2’-O-甲基核苷酸；

(b)N_X3位置中的每个嘧啶核苷酸是核糖核苷酸；

N_X3位置中的每个嘌呤核苷酸是核糖核苷酸。

在另一个方面，本发明包括包含结构SXI′的双链核酸(siNA)分子，其具有有义链和反义链：

B——————N_X3——————(N)_X2B-3′

B(N)_X1——————N_X4——————[N]_X5-5′

                  SXI′

其中

上部链是双链核酸分子的有义链，并且下部链是双链核酸分子的反义链；所述反义链包括与SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：13、SEQ IDNO：16或SEQ ID NO：21互补的序列，并且所述有义链包括与反义链互补的序列；

每个N独立地是未修饰或化学修饰的核苷酸；

每个B是存在或不存在的末端帽部分；

(N)代表突出端核苷酸，其各自独立地是未修饰的或2’-O-甲基核苷酸、2’-脱氧-2’-氟核苷酸或2′-脱氧核糖核苷酸；

[N]代表其为核糖核苷酸的核苷酸；

X1和X2独立地是0-4的整数；

X3是9-30的整数；

X4是11-30的整数，条件是X4和X5的总和是17-36；

X5是1-6的整数；并且其中

(a)N_X4位置中的每个嘧啶核苷酸独立地是2’-脱氧-2’-氟核苷酸或2’-O-甲基核苷酸；

N_X4位置中的每个嘌呤核苷酸是2’-O-甲基核苷酸；

(b)N_X3位置中的每个嘧啶核苷酸是2’-脱氧-2’-氟核苷酸；

N_X3位置中的每个嘌呤核苷酸是核糖核苷酸。

在另一个方面，本发明包括包含结构SXII′的双链核酸(siNA)分子，其具有有义链和反义链：

B——————N_X3——————(N)_X2B-3′

B(N)_X1——————N_X4——————[N]_X5-5′

                 SXII′

其中

上部链是双链核酸分子的有义链，并且下部链是双链核酸分子的反义链；所述反义链包括与SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：13、SEQ IDNO：16或SEQ ID NO：21互补的序列，并且所述有义链包括与反义链互补的序列；

每个N独立地是未修饰或化学修饰的核苷酸；

每个B是存在或不存在的末端帽部分；

(N)代表突出端核苷酸，其各自独立地是未修饰的或2’-O-甲基核苷酸、2’-脱氧-2’-氟核苷酸或2′-脱氧核糖核苷酸；

[N]代表其为核糖核苷酸的核苷酸；

X1和X2独立地是0-4的整数；

X3是9-30的整数；

X4是11-30的整数，条件是X4和X5的总和是17-36；

X5是1-6的整数；并且其中

(a)N_X4位置中的每个嘧啶核苷酸独立地是2’-脱氧-2’-氟核苷酸或2’-O-甲基核苷酸；

N_X4位置中的每个嘌呤核苷酸是2’-O-甲基核苷酸；

(b)N_X3位置中的每个嘧啶核苷酸是2’-脱氧-2’-氟核苷酸；

N_X3位置中的每个嘌呤核苷酸是2’-脱氧核苷酸。

在另一个方面，本发明包括包含结构SXIII′的双链核酸(siNA)分子，其具有有义链和反义链：

B——————N_X3——————(N)_X2B-3′

B(N)_X1——————N_X4——————[N]_X5-5′

                 SXIII′

其中

上部链是双链核酸分子的有义链，并且下部链是双链核酸分子的反义链；所述反义链包括与SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：13、SEQ IDNO：16或SEQ ID NO：21互补的序列，并且所述有义链包括与反义链互补的序列；

每个N独立地是未修饰或化学修饰的核苷酸；

每个B是存在或不存在的末端帽部分；

(N)代表突出端核苷酸，其各自独立地是未修饰的或2’-O-甲基核苷酸、2’-脱氧-2’-氟核苷酸或2′-脱氧核糖核苷酸；

[N]代表其为核糖核苷酸的核苷酸；

X1和X2独立地是0-4的整数；

X3是9-30的整数；

X4是11-30的整数，条件是X4和X5的总和是17-36；

X5是1-6的整数；并且其中

(a)N_X4位置中的每个嘧啶核苷酸是具有核糖样、Northern或A形螺旋构型的核苷酸；

N_X4位置中的每个嘌呤核苷酸是2’-O-甲基核苷酸；

(b)N_X3位置中的每个嘧啶核苷酸是具有核糖样、Northern或A形螺旋构型的核苷酸；

N_X3位置中的每个嘌呤核苷酸是2’-O-甲基核苷酸。

在前述方面的一个实施方案中，双链核酸(siNA)分子包括结构SIX′，其中X5是3。在一个实施方案中，双链核酸(siNA)分子包括结构SIX′，其中X1是2并且X2是2。在一个实施方案中，双链核酸(siNA)分子包括结构SIX′，其中X5是3，X1是2并且X2是2。在一个实施方案中，双链核酸(siNA)分子包括结构SIX′，其中X5是3，X1是2，X2是2，X3是19并且X4是16。在前述方面的一个实施方案中，包括但不限于结构SIX′、SX′、SXI′、SXII′和SXIII′的双链核酸(siNA)分子，X5＝1、2或3；每个X1和X2＝1或2；X3＝12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，并且X4＝15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。

在前述方面的一个实施方案中，B存在于有义链的3′和5′末端上以及任选地在反义链的3′末端上。在一个实施方案中，B仅存在于有义链的3′和5′末端上。

本发明还包括如上文其他地方描述的双链核酸(siNA)分子，其中第一条链和第二条链彼此互补，并且其中至少一条链在其整个长度上与SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：21具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性，并且其中任何核苷酸是未修饰或化学修饰的。在一个实施方案中，第一条链和第二条链彼此互补，并且至少一条链在其整个长度上与SEQ ID NO：10、SEQID NO：13、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：21的互补体具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性，并且其中任何核苷酸是未修饰或化学修饰的。在一个实施方案中，第一条链和第二条链彼此互补，并且至少一条链在其整个长度上与SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：21具有至少95％同一性，或与SEQ IDNO：10、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：21的互补体具有至少95％同一性，并且其中核苷酸各自是未修饰或化学修饰的。在一个实施方案中，第一条链和第二条链彼此具有90％互补性，其中至少一条链与SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：21或其互补体具有至少95％同一性。

本发明还包括如上文其他地方描述的双链核酸(siNA)分子，其中第一条链和第二条链彼此互补，并且其中在高严格条件下，至少一条链可与SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：16或SEQ IDNO：21或其互补体的多核苷酸序列杂交，并且其中任何核苷酸是未修饰或化学修饰的。在一个实施方案中，第一条链和第二条链彼此具有90％互补性，并且在高严格条件下，至少一条链可与SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：21或其互补体的多核苷酸序列杂交，并且其中任何核苷酸是未修饰或化学修饰的。

对于核苷酸酸序列，术语“同一性”指示当最佳比对且伴随合适插入或缺失比较时，2个核酸序列之间的同一性程度。换言之，2个序列之间的同一性百分比是由序列共享的等同位置数目函数(即，％同一性＝等同位置#/位置总#乘以100)，考虑缺口数目和每个缺口的长度，所述缺口需要引入用于2个序列的最佳比对。2个序列之间的序列比较和同一性百分比测定使用数学算法完成，如下文非限制性例子中所述。

2个核苷酸序列之间的同一性百分比使用Accelrys GCG软件包(University of Wisconsin)中的GAP程序进行测定，使用NWSgapdna.CMP矩阵和40、50、60、70或80的缺口权和1、2、3、4、5或6的长度权。2个核苷酸序列之间的同一性百分比还可以使用E.Meyers和W.Miller的算法(Comput.Appl.Biosci.，4：11-17(1988))进行测定，所述算法已掺入ALIGN程序(版本2.0)内，使用PAM 120权重残基表、缺口长度罚分12和缺口罚分4。

杂交技术是熟练专业人员众所周知的(参见例如，Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989))。优选严格杂交条件包括在包括下述的溶液中在4℃过夜孵育：50％甲酰胺、5xSSC(150mM NaCl、15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH 7.6)、5xDenhardt′s溶液、10％硫酸葡聚糖和20微克/ml变性剪切鲑精DNA；随后为在0.1x SSC中在约65℃洗涤滤器。

本发明的另一个方面包括药物组合物，其包括在药学上可接受的载体或稀释剂中的本发明的双链核酸(siNA)分子。

本发明的另一个方面包括治疗患有状况的人受试者的方法，所述状况通过ENaC的作用或通过ENaC作用的丧失介导，所述方法包括给所述受试者施用有效量的本发明的双链核酸(siNA)分子。在这个方面的一个实施方案中，状况是呼吸性疾病或由呼吸性疾病引起。可根据本发明的这个方面治疗的呼吸性疾病包括COPD、哮喘、囊性纤维化、嗜酸粒细胞性咳嗽、支气管炎、肉瘤样病、肺纤维化、鼻炎、窦炎(特别是COPD、囊性纤维化和哮喘)。

在一个方面，本发明包括根据本发明的双链核酸用于用作药剂的用途。在一个实施方案中，药物用于在治疗通过ENaC的作用或通过ENaC作用的丧失介导的状况中使用。在一个实施方案中，药物用于治疗呼吸性疾病的用途。在一个实施方案中，药物用于治疗选自下述的呼吸性疾病的用途：COPD、哮喘、囊性纤维化、嗜酸粒细胞性咳嗽、支气管炎、肉瘤样病、肺纤维化、鼻炎、窦炎。在一个特定实施方案中，用途是用于治疗选自COPD、囊性纤维化和哮喘的呼吸性疾病。

在另一个方面，本发明包括根据本发明的双链核酸用于在药物制备中使用的用途。在一个实施方案中，药物用于在治疗通过ENaC的作用或通过ENaC作用的丧失介导的状况中使用。在一个实施方案中，药物用于治疗呼吸性疾病的用途。在一个实施方案中，药物用于治疗选自下述的呼吸性疾病的用途：COPD、哮喘、囊性纤维化、嗜酸粒细胞性咳嗽、支气管炎、肉瘤样病、肺纤维化、鼻炎、窦炎。在一个特定实施方案中，用途是用于治疗选自COPD、囊性纤维化和哮喘的呼吸性疾病。

应当理解在前述实施方案中，特别是在段落[000197]至[000214]中所述的那些实施方案，术语“短干扰核酸”(siNA)指能够介导RNA干扰的核酸分子。

在一个实施方案中，本发明的特征在于包括第一种双链核酸和第二种双链核酸分子的组合物，其各自具有彼此互补的第一条链和第二条链，其中所述第一种双链核酸分子的第二条链包括与第一种ENaC靶序列互补的序列，并且所述第二种双链核酸分子的第二条链包括与第二种ENaC靶序列互补的序列。在一个实施方案中，组合物进一步包括阳离子脂质、中性脂质和聚乙二醇-缀合物。在一个实施方案中，组合物进一步包括阳离子脂质、中性脂质、聚乙二醇-缀合物和胆固醇。在一个实施方案中，组合物进一步包括聚乙二醇-缀合物、胆固醇和表面活性剂。在一个实施方案中，阳离子脂质选自CLinDMA、pCLinDMA、eCLinDMA、DMOBA和DMLBA。在一个实施方案中，中性脂质选自DSPC、DOBA和胆固醇。在一个实施方案中，聚乙二醇-缀合物选自PEG-二肉豆蔻酰甘油和PEG-胆固醇。在一个实施方案中，PEG是2KPEG。在一个实施方案中，表面活性剂选自棕榈醇、十八烷醇、油醇和亚油醇(linoleyl alcohol)。在一个实施方案中，在一个实施方案中，阳离子脂质是CLinDMA，中性脂质是DSPC，聚乙二醇缀合物是2KPEG-DMG，所述胆固醇是胆固醇，并且所述表面活性剂是亚油醇。在一个实施方案中，CLinDMA、DSPC、2KPEG-DMG、胆固醇和亚油醇分别以43∶38∶10∶2∶7的摩尔比值存在。

在本文的任何一个实施方案中，本发明的siNA分子经由RNA干扰或RNA干扰的抑制调节一种或多种ENaC靶的表达。在一个实施方案中，RNA干扰是RISC介导的ENaC靶的切割(例如，siRNA介导的RNA干扰)。在一个实施方案中，RNA干扰是ENaC靶的翻译抑制(例如，miRNA介导的RNA干扰)。在一个实施方案中，RNA干扰是ENaC靶的转录抑制(例如，siRNA介导的转录沉默)。在一个实施方案中，RNA干扰在细胞质中发生。在一个实施方案中，RNA干扰在核中发生。

在本文的任何一个实施方案中，本发明的siNA分子经由内源ENaCRNA例如内源ENaC mRNA、ENaC siRNA、ENaC miRNA的抑制，或可替代地通过RISC的抑制调节一种或多种ENaC靶的表达。

在一个实施方案中，本发明的特征在于通过miRNA抑制、siRNA抑制、或RISC抑制调节一种或多种ENaC基因靶的表达的一种或多种RNAi抑制剂。

在一个实施方案中，本发明的RNAi抑制剂是如本文所描述的siNA分子，其具有与一种或多种靶miRNA或siRNA分子互补的一条或多条链。

在一个实施方案中，本发明的RNAi抑制剂是与靶miRNA或siRNA分子或其部分互补的反义分子。本发明的反义RNAi抑制剂可以具有长度为约10个-约40个核苷酸的长度(例如长度为10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个或40个核苷酸)。本发明的反义RNAi抑制剂可以包含如本文所描述的一个或多个经修饰的核苷酸或非核苷酸(参见例如具有本文的式I-VII中任何一个或其任何组合的分子)。在一个实施方案中，本发明的反义RNAi抑制剂可以包含一个或多个或所有2′-O-甲基核苷酸。在一个实施方案中，本发明的反义RNAi抑制剂可以包含一个或多个或所有2′-脱氧-2′-氟核苷酸。在一个实施方案中，本发明的反义RNAi抑制剂可以包含一个或多个或所有2′-O-甲氧基-乙基(也称为2′-甲氧基乙氧基或MOE)核苷酸。在一个实施方案中，本发明的反义RNAi抑制剂可以包含一个或多个或所有硫代磷酸酯核苷酸间键。在一个实施方案中，本发明的反义RNAi抑制剂可以包含在反义RNAi抑制剂的3′-末端、5′-末端、或5′和3′末端处的末端帽部分。

在一个实施方案中，本发明的RNAi抑制剂是对于RISC具有结合亲和力的核酸适体，例如可调节的适体(参见例如An等人，2006，RNA，12：710-716)。本发明的适体RNAi抑制剂可以具有长度为约10个-约50个核苷酸的长度(例如长度为10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个或50个核苷酸)。本发明的适体RNAi抑制剂可以包含如本文所描述的一个或多个经修饰的核苷酸或非核苷酸(参见例如具有本文的式I-VII中任何一个或其任何组合的分子)。在一个实施方案中，本发明的适体RNAi抑制剂可以包含一个或多个或所有2′-O-甲基核苷酸。在一个实施方案中，本发明的适体RNAi抑制剂可以包含一个或多个或所有2′-脱氧-2′-氟核苷酸。在一个实施方案中，本发明的适体RNAi抑制剂可以包含一个或多个或所有2′-O-甲氧基-乙基(也称为2′-甲氧基乙氧基或MOE)核苷酸。在一个实施方案中，本发明的适体RNAi抑制剂可以包含一个或多个或所有硫代磷酸酯核苷酸间键。在一个实施方案中，本发明的适体RNAi抑制剂可以包含在适体RNAi抑制剂的3′-末端、5′-末端、或5′和3′末端处的末端帽部分。

在一个实施方案中，本发明的特征在于用于调节细胞内的ENaC靶基因表达的方法，其包括：(a)合成本发明的siNA分子，其可以是化学修饰或未修饰的，其中所述siNA链之一包含与ENaC靶基因的RNA互补的序列；和(b)在适合于调节(例如，抑制)细胞中的ENaC靶基因表达的条件下，将siNA分子引入细胞内。

在一个实施方案中，本发明的特征在于用于调节细胞内的ENaC靶基因表达的方法，其包括：(a)合成本发明的siNA分子，其可以是化学修饰或未修饰的，其中所述siNA链之一包含与ENaC靶基因的RNA互补的序列，且其中所述siNA的有义链序列包含与ENaC靶RNA的序列相同或基本上相似的序列；和(b)在适合于调节(例如，抑制)细胞中的ENaC靶基因表达的条件下，将siNA分子引入细胞内。

在另一个实施方案中，本发明的特征在于用于调节细胞内的超过一种ENaC靶基因表达的方法，其包括：(a)合成本发明的siNA分子，其可以是化学修饰或未修饰的，其中所述siNA链之一包含与ENaC靶基因的RNA互补的序列；和(b)在适合于调节(例如，抑制)细胞中的ENaC靶基因表达的条件下，将siNA分子引入细胞内。

在另一个实施方案中，本发明的特征在于用于调节细胞内的2种或更多ENaC靶基因表达的方法，其包括：(a)合成本发明的一种或多种siNA分子，其可以是化学修饰或未修饰的，其中所述siNA链包含与ENaC靶基因的RNA互补的序列，且其中所述siNA的有义链序列包含与ENaC靶RNA的序列相同或基本上相似的序列；和(b)在适合于调节(例如，抑制)细胞中的ENaC靶基因表达的条件下，将siNA分子引入细胞内。

在另一个实施方案中，本发明的特征在于用于调节细胞内的超过一种ENaC靶基因表达的方法，其包括：(a)合成本发明的siNA分子，其可以是化学修饰或未修饰的，其中所述siNA链包含与ENaC靶基因的RNA互补的序列，且其中所述siNA的有义链序列包含与ENaC靶RNA的序列相同或基本上相似的序列；和(b)在适合于调节(例如，抑制)细胞中的ENaC靶基因表达的条件下，将siNA分子引入细胞内。

在另一个实施方案中，本发明的特征在于用于调节细胞内的ENaC靶基因表达的方法，其包括：(a)合成本发明的siNA分子，其可以是化学修饰或未修饰的，其中所述siNA链之一包含与ENaC靶基因的RNA互补的序列，其中所述siNA的有义链序列包含与ENaC靶RNA的序列相同或基本上相似的序列；和(b)在适合于调节(例如，抑制)细胞中的ENaC靶基因表达的条件下，将siNA分子引入细胞内。

在一个实施方案中，本发明的siNA分子用作先体外后体内应用中的试剂。例如，为了疗效将siNA试剂引入移植到受试者内的组织或细胞内。细胞和/或组织可以得自随后接受外植体的生物或受试者，或可以得自移植前的另一种生物或受试者。siNA分子可以用于调节细胞或组织中的一种或多种基因的表达，从而使得细胞或组织获得所需表型或当体内移植时能够执行功能。在一个实施方案中，从患者中提取某些靶细胞。在适合于经由这些细胞摄取ENaC siNA的条件下(例如，使用递送试剂例如阳离子脂质、脂质体等，或使用技术例如电穿孔以促进siNA递送到细胞内)，使这些提取的细胞与靶向细胞内的特定核苷酸序列的siNA接触。随后将细胞再引回到相同患者或其他患者内。

在一个实施方案中，本发明的特征在于调节组织外植体中的ENaC靶基因表达的方法，其包括：(a)合成本发明的siNA分子，其可以是化学修饰的，其中所述siNA链之一包含与ENaC靶基因的RNA互补的序列；和(b)在适合于调节(例如，抑制)组织外植体中的ENaC靶基因表达的条件下，将siNA分子引入得自特定生物的组织外植体的细胞内。在另一个实施方案中，该方法进一步包括在适合于调节(例如，抑制)那种生物中的ENaC靶基因表达的条件下，将组织外植体引回到组织从中获得的生物内或另一个生物内。

在一个实施方案中，本发明的特征在于调节组织外植体中的ENaC靶基因表达的方法，其包括：(a)合成本发明的siNA分子，其可以是化学修饰的，其中所述siNA链之一包含与ENaC靶基因的RNA互补的序列，且其中所述siNA的有义链序列包含与ENaC靶RNA的序列相同或基本上相似的序列；和(b)在适合于调节(例如，抑制)组织外植体中的ENaC靶基因表达的条件下，将siNA分子引入得自特定生物的组织外植体的细胞内。在另一个实施方案中，该方法进一步包括在适合于调节(例如，抑制)那种生物中的ENaC靶基因表达的条件下，将组织外植体引回到组织从中获得的生物内或另一个生物内。

在另一个实施方案中，本发明的特征在于调节组织外植体中的超过一种ENaC靶基因表达的方法，其包括：(a)合成本发明的siNA分子，其可以是化学修饰的，其中所述siNA链之一包含与ENaC靶基因的RNA互补的序列；和(b)在适合于调节(例如，抑制)组织外植体中的ENaC靶基因表达的条件下，将siNA分子引入得自特定生物的组织外植体的细胞内。在另一个实施方案中，该方法进一步包括在适合于调节(例如，抑制)那种生物中的ENaC靶基因表达的条件下，将组织外植体引回到组织从中获得的生物或另一个生物内。

在一个实施方案中，本发明的特征在于调节受试者或生物中的ENaC靶基因表达的方法，其包括：(a)合成本发明的siNA分子，其可以是化学修饰的，其中所述siNA链之一包含与ENaC靶基因的RNA互补的序列；和(b)在适合于调节(例如，抑制)受试者或生物中的ENaC靶基因表达的条件下，将siNA分子引入受试者或生物内。ENaC靶蛋白或RNA的水平可以使用本领域众所周知的各种方法进行测定。

在另一个实施方案中，本发明的特征在于调节受试者或生物中的超过一种ENaC靶基因表达的方法，其包括：(a)合成本发明的siNA分子，其可以是化学修饰的，其中所述siNA链之一包含与ENaC靶基因的RNA互补的序列；和(b)在适合于调节(例如，抑制)受试者或生物中的ENaC靶基因表达的条件下，将siNA分子引入受试者或生物内。ENaC靶蛋白或RNA的水平可以如本领域已知的进行测定。

在一个实施方案中，本发明的特征在于用于调节细胞(例如，肺或肺上皮细胞)内的ENaC靶基因表达的方法，其包括：(a)合成本发明的siNA分子，其可以是化学修饰的，其中所述siNA包含与ENaC靶基因的RNA具有互补性的单链序列；和(b)在适合于调节(例如，抑制)细胞中的ENaC靶基因表达的条件下，将siNA分子引入细胞内。

在另一个实施方案中，本发明的特征在于用于调节细胞(例如，肺或肺上皮细胞)内的超过一种ENaC靶基因表达的方法，其包括：(a)合成本发明的siNA分子，其可以是化学修饰的，其中所述siNA包含与ENaC靶基因的RNA具有互补性的单链序列；和(b)在适合于调节(例如，抑制)细胞中的ENaC靶基因表达的条件下，使细胞在体外或体内与siNA分子接触。

在一个实施方案中，本发明的特征在于调节组织外植体((例如，肺或如可以从一个生物移植给另一个或移植回器官、组织或细胞从中获得的相同生物的任何其他器官、组织或细胞)中的ENaC靶基因表达的方法，其包括：(a)合成本发明的siNA分子，其可以是化学修饰的，其中所述siNA包含与ENaC靶基因的RNA具有互补性的单链序列；和(b)在适合于调节(例如，抑制)组织外植体中的ENaC靶基因表达的条件下，使得自特定受试者或生物的组织外植体的细胞与siNA分子接触。在另一个实施方案中，该方法进一步包括在适合于调节(例如，抑制)那种受试者或生物中的ENaC靶基因表达的条件下，将组织外植体引回到组织从中获得的受试者或生物内或另一个受试者或生物内。

在另一个实施方案中，本发明的特征在于调节组织外植体(例如，肺或如可以从一个生物移植给另一个或移植回器官、组织或细胞从中获得的相同生物的任何其他器官、组织或细胞)中的超过一种ENaC靶基因表达的方法，其包括：(a)合成本发明的siNA分子，其可以是化学修饰的，其中所述siNA包含与ENaC靶基因的RNA具有互补性的单链序列；和(b)在适合于调节(例如，抑制)组织外植体中的ENaC靶基因表达的条件下，将siNA分子引入得自特定受试者或生物的组织外植体的细胞内。在另一个实施方案中，该方法进一步包括在适合于调节(例如，抑制)那种受试者或生物中的ENaC靶基因表达的条件下，将组织外植体引回到组织从中获得的受试者或生物内或另一个受试者或生物内。

在一个实施方案中，本发明的特征在于调节受试者或生物中的ENaC靶基因表达的方法，其包括：(a)合成本发明的siNA分子，其可以是化学修饰的，其中所述siNA包含与ENaC靶基因的RNA具有互补性的单链序列；和(b)在适合于调节(例如，抑制)受试者或生物中的ENaC靶基因表达的条件下，将siNA分子引入受试者或生物内。

在另一个实施方案中，本发明的特征在于调节受试者或生物中的超过一种ENaC靶基因表达的方法，其包括：(a)合成本发明的siNA分子，其可以是化学修饰的，其中所述siNA包含与ENaC靶基因的RNA具有互补性的单链序列；和(b)在适合于调节(例如，抑制)受试者或生物中的ENaC靶基因表达的条件下，将siNA分子引入受试者或生物内。

在一个实施方案中，本发明的特征在于调节受试者或生物中的ENaC靶基因表达的方法，其包括在适合于调节(例如，抑制)受试者或生物中的ENaC靶基因表达的条件下，使受试者或生物与本发明的siNA分子接触。

在一个实施方案中，本发明的特征在于用于治疗或预防与受试者或生物中的基因表达或活性相关的疾病、病症、性状或状况的方法，其包括在适合于调节受试者或生物中的ENaC靶基因表达的条件下，使受试者或生物与本发明的siNA分子接触。基因表达的减少和因此各自蛋白质/RNA水平中的减少在某种程度上减轻了疾病、病症、性状或状况的症状。

在一个实施方案中，本发明的特征在于用于治疗或预防受试者或生物中的一种或多种呼吸性疾病、性状或状况的方法，其包括在适合于调节受试者或生物中的ENaC靶基因表达的条件下，使受试者或生物与本发明的siNA分子接触，由此可以达到一种或多种呼吸性疾病、一种或多种性状或一种或多种状况的治疗或预防。在一个实施方案中，本发明的特征在于例如经由肺递送经由给相关组织或细胞例如肺细胞和组织的局部施用，使受试者或生物与本发明的siNA分子接触。在一个实施方案中，本发明的特征在于经由给相关组织或细胞的全身施用(例如经由siNA的静脉内或皮下施用)，使受试者或生物与本发明的siNA分子接触，所述相关组织或细胞例如涉及受试者或生物中的呼吸性疾病、性状或状况的维持或发展的组织或细胞。本发明的siNA分子可以如本文描述或本领域其他方面已知的进行配制或缀合，以靶向受试者或生物中的合适组织或细胞。siNA分子可以与如本领域已知的其他治疗处理和模式组合，用于治疗或预防受试者或生物中的呼吸性疾病、性状或状况。

在一个实施方案中，本发明的特征在于用于治疗或预防与受试者或生物的COPD、哮喘、囊性纤维化、嗜酸粒细胞性咳嗽、支气管炎、肉瘤样病、肺纤维化、鼻炎和/或窦炎的方法，其包括在适合于调节受试者或生物中的ENaC靶基因表达的条件下，使受试者或生物与本发明的siNA分子接触，从而可以达到COPD、哮喘、囊性纤维化、嗜酸粒细胞性咳嗽、支气管炎、肉瘤样病、肺纤维化、鼻炎和/或窦炎的治疗或预防。在一个实施方案中，本发明的特征在于经由给相关组织或细胞的局部施用，使受试者或生物与本发明的siNA分子接触，所述相关组织或细胞例如涉及COPD、哮喘、囊性纤维化、嗜酸粒细胞性咳嗽、支气管炎、急性和慢性肺同种异体移植物排斥、肉瘤样病、肺纤维化、鼻炎和/或窦炎的肺或气道细胞和组织。在一个实施方案中，本发明的特征在于经由给相关组织或细胞的全身施用(例如经由siNA的静脉内或皮下施用)，使受试者或生物与本发明的siNA分子接触，所述相关组织或细胞例如涉及受试者或生物中的COPD、哮喘、囊性纤维化、嗜酸粒细胞性咳嗽、支气管炎、急性和慢性肺同种异体移植物排斥、肉瘤样病、肺纤维化、鼻炎和/或窦炎的维持或发展的组织或细胞。本发明的siNA分子可以如本文描述或本领域其他方面已知的配制或缀合，以靶向受试者或生物中的合适组织或细胞。siNA分子可以与如本领域已知的其他治疗处理和模式组合，用于治疗或预防受试者或生物中的COPD、哮喘、囊性纤维化、嗜酸粒细胞性咳嗽、支气管炎、肉瘤样病、肺纤维化、鼻炎和/或窦炎。

在一个实施方案中，本发明的特征在于用于治疗或预防与受试者或生物中的一种或多种呼吸性疾病、性状或状况的方法，其包括在适合于调节(例如抑制)受试者或生物中的ENaC靶基因表达抑制剂的表达的条件下，使受试者或生物与本发明的siNA分子接触。在一个实施方案中，ENaC基因表达的抑制剂是miRNA。

在一个实施方案中，本发明的特征在于用于治疗或预防与受试者或生物中的一种或多种炎性疾病、性状或状况的方法，其包括在适合于调节受试者或生物中的ENaC靶基因表达的条件下，使受试者或生物与本发明的siNA分子接触，由此可以达到一种或多种炎性疾病、一种或多种性状或一种或多种状况的治疗或预防。在一个实施方案中，本发明的特征在于例如经由肺递送经由给相关组织或细胞例如肺细胞和组织的局部施用，使受试者或生物与本发明的siNA分子接触。在一个实施方案中，本发明的特征在于经由给相关组织或细胞的全身施用(例如经由siNA的静脉内或皮下施用)使受试者或生物与本发明的siNA分子接触，所述组织或细胞例如涉及受试者或生物中的炎性疾病、性状或状况的维持或发展的组织或细胞。本发明的siNA分子可以如本文描述的或本领域其他方面已知的进行配制或缀合，以靶向受试者或生物中的合适组织或细胞。siNA分子可以与本领域已知的其他治疗性处理和方式组合，用于治疗或预防受试者或生物中的炎性疾病、性状或状况。

在一个实施方案中，本发明的特征在于用于治疗或预防与受试者或生物中的一种或多种炎性疾病、性状或状况的方法，其包括在适合于调节(例如抑制)受试者或生物中的ENaC靶基因表达抑制剂的表达的条件下，使受试者或生物与本发明的siNA分子接触。在一个实施方案中，ENaC基因表达的抑制剂是miRNA。

在一个实施方案中，本发明的siNA分子或双链核酸分子如下述中所述配制为组合物：于2005年7月29日提交的美国临时专利申请号60/678,531和相关美国临时专利申请号60/703,946，和于2005年11月15日提交的美国临时专利申请号60/737,024(Vargeese等人)。

在用于治疗或预防受试者中的上皮钠通道(ENaC)相关疾病、性状或状况的上述方法中的任何中，治疗与如本领域一般公认的β-2激动剂组合物的施用组合，所述β-2激动剂组合物包括例如沙丁胺醇或硫酸舒喘灵。

在用于治疗或预防受试者中的上皮钠通道(ENaC)相关疾病、性状、表型或状况的上述方法中的任何中，治疗与如本领域一般公认的PDE4抑制剂组合物(例如西地那非、莫他匹酮、咯利普兰和扎普司特、扎达维林和托拉芬群)的施用组合。

在一个实施方案中，本发明的siNA分子或双链核酸分子配制为下述专利中描述的组合物：美国临时专利申请号60/678,531和于2005年7月29日提交的相关的美国临时专利申请号60/703,946，于2005年11月15日提交的美国临时专利申请号60/737,024，以及于2006年2月14日提交的USSN 11/353,630和于2006年10月24日提交的USSN 11/586,102(Vargeese等人)。

在用于调节细胞、受试者或生物中的一种或多种靶表达或用于治疗或预防细胞、受试者或生物中的疾病、性状、状况或表型的本文方法中的任何中，本发明的siNA分子经由RNA干扰调节一种或多种ENaC靶的表达。在一个实施方案中，RNA干扰是RISC介导的ENaC靶切割(例如siRNA介导的RNA干扰)。在一个实施方案中，RNA干扰是ENaC靶的翻译抑制(例如miRNA介导的RNA干扰)。在一个实施方案中，RNA干扰是ENaC靶的转录抑制(例如siRNA介导的转录沉默)。在一个实施方案中，RNA干扰在细胞质中发生。在一个实施方案中，RNA干扰在核中发生。

在本发明的任何一种治疗方法中，siNA可以作为疗程给受试者施用，例如以各种时间间隔施用，例如在疗程期间每天一次，在疗程期间每2天一次，在疗程期间每3天一次，在疗程期间每4天一次，在疗程期间每5天一次，在疗程期间每6天一次，在疗程期间每周一次，在疗程期间每隔一周一次，在疗程期间每月一次等。在一个实施方案中，疗程是每1、2、3、4、5、6、7、8、9或10周1次。在一个实施方案中，疗程为约1-约52周或更长(例如，无限期)。在一个实施方案中，疗程为约1-约48个月或更长(例如，无限期)。

在一个实施方案中，疗程涉及初始疗程，例如对于固定时间间隔(例如1x、2x、3x、4x、5x、6x、7x、8x、9x、10x或更多)每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多周1次，随后为维持疗程，例如对于另外的固定时间间隔(例如1x、2x、3x、4x、5x、6x、7x、8x、9x、10x或更多)每4、6、8、10、15、20、25、30、35、40或更多周1次。

在本发明的任何一种治疗方法中，siNA可以如本文所描述的或本领域其他方面已知的全身性地给受试者施用，单独作为单一疗法或与本文描述的或本领域已知的另外疗法组合。全身施用可以包括例如，如本领域一般已知的肺(吸入、喷雾法等)静脉内、皮下、肌内、导管插入、鼻咽、经皮和/或经口/胃肠施用。

在一个实施方案中，在本发明的任何一种治疗或预防方法中，siNA可以如本文描述的或本领域其他方面已知的局部地施用于受试者或施用于局部组织，单独作为单一疗法或与本领域已知的另外疗法组合。局部施用可以包括例如，如本领域一般已知的吸入、喷雾法、导管插入、植入、直接注射、皮肤/经皮应用、支架、滴耳剂/滴眼剂、或门静脉施用于相关组织，或任何其他局部施用技术、方法或操作。

根据本发明的化合物和药物制剂可以与一种或多种其他治疗剂组合使用或包括一种或多种其他治疗剂，所述治疗剂例如选自抗炎剂、抗胆碱能剂(特别是M₁/M₂/M₃受体拮抗剂)、β₂-肾上腺素受体激动剂、抗感染剂例如抗生素、抗病毒剂或抗组织胺药。在一个进一步的方面，本发明因此提供了这样的组合，其包括式(I)的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或生理学功能衍生物，连同一种或多种其他治疗活性剂，例如选自抗炎剂例如皮质类固醇或NSAID、抗胆碱能剂、β₂-肾上腺素受体激动剂、抗感染剂例如抗生素、抗病毒剂或抗组织胺药。本发明的一个实施方案包含这样的组合，其包括式(I)的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或生理学功能衍生物，连同β₂-肾上腺素受体激动剂、和/或抗胆碱能剂、和/或PDE-4抑制剂、和/或抗组织胺药。

本发明的一个实施方案包含包括一种或两种其他治疗剂的组合。对于本领域技术人员明确的是，当合适时，一种或多种其他治疗成分可以以盐的形式使用，例如作为碱金属或胺盐或作为酸加成盐、或药物前体，或作为酯例如低级烷基酯，或作为溶剂化物例如水合物，以最佳化治疗成分的活性和/或稳定性和/或物理特征，例如溶解性。还明确的是，当合适时，治疗成分可以以光学上纯的形式使用。

在一个实施方案中，本发明包含包括本发明的化合物连同β2-肾上腺素受体激动剂的组合。β2-肾上腺素受体激动剂的非限制性例子包括沙美特罗(这可以是外消旋物或单一对映体例如R-对映体)、舒喘灵(这可以是外消旋物或单一对映体例如R-对映体)、福莫特罗(这可以是外消旋物或单一非对映体例如R，R-非对映体)、沙甲胺醇、非诺特罗、卡莫特罗、依坦特罗、那明特罗、克仑特罗、吡布特罗、flerbuterol、瑞普特罗、班布特罗、茚达特罗、特步他林及其盐，例如沙美特罗的昔萘酸盐(1-羟基-2-萘羧酸盐)、舒喘灵的硫酸盐或游离碱、或福莫特罗的延胡索酸盐。在一个实施方案中，β2-肾上腺素受体激动剂是长效β2-肾上腺素受体激动剂，例如提供约12小时或更久的有效支气管扩张的化合物。

其他β2-肾上腺素受体激动剂包括下述中所述的那些：WO02/066422、WO 02/070490、WO 02/076933、WO 03/024439、WO03/072539、WO 03/091204、WO 04/016578、WO 2004/022547、WO2004/037807、WO 2004/037773、WO 2004/037768、WO2004/039762、WO 2004/039766、WO01/42193和WO03/042160。

β2-肾上腺素受体激动剂的进一步例子包括3-(4-{[6-({(2R)-2-羟基-2-[4-羟基-3-(羟甲基)苯基]乙基}氨基)己基]氧基}丁基)苯磺酰胺；3-(3-{[7-({(2R)-2-羟基-2-[4-羟基-3-羟甲基)苯基]乙基}-氨基)庚基]氧基}丙基)苯磺酰胺；4-{(1R)-2-[(6-{2-[(2，6-二氯苄基)氧基]乙氧基}己基)氨基]-1-羟基乙基}-2-(羟甲基)苯酚；4-{(1R)-2-[(6-{4-[3-(环戊基磺酰基)苯基]丁氧基}己基)氨基]-1-羟基乙基}-2-(羟甲基)苯酚；N-[2-羟基1-5-[(1R)-1-羟基-2-[[2-4-[[(2R)-2-羟基-2苯基乙基]氨基]苯基]乙基]氨基]乙基]苯基]甲酰胺；N-2{2-[4-(3-苯基-4-甲氧基苯基)氨基苯基]乙基}-2-羟基-2-(8-羟基-2(1H)-喹啉酮-5-基)乙胺；和5-[(R)-2-(2-{4-[4-(2-氨基-2-甲基-丙氧基)-苯基氨基]-苯基}-乙基氨基)-1-羟基-乙基]-8-羟基-1H-喹啉-2-酮。

在一个实施方案中，β2-肾上腺素受体激动剂可以以由药学上可接受的酸形成的盐的形式，所述药学上可接受的酸选自硫酸、盐酸、延胡索酸、羟萘甲酸(例如1-或3-羟基-2-萘甲酸)、肉桂酸、取代肉桂酸、三苯基乙酸、氨基磺酸、对氨基磺酸、萘基丙烯酸、苯甲酸、4-甲氧基苯甲酸、2-或4-羟基苯甲酸、4-氯苯甲酸和4-苯基苯甲酸。合适的抗炎剂包括皮质类固醇。可以与本发明的化合物组合使用的皮质类固醇的例子是那些经口和吸入皮质类固醇及其具有抗炎活性的药物前体。非限制性例子包括甲基泼尼松龙、泼尼松龙、地塞米松、丙酸氟替卡松、6α，9α-二氟-11β-羟基-16α-甲基-17α-[(4-甲基-1，3-噻唑-5-羰基)氧基]-3-氧代-雄甾-1，4-二烯-17β-硫代羟酸S-氟甲酯、6α，9α-二氟-17α-[(2-呋喃甲酰)氧基]-11β-羟基-16α-甲基-3-氧代-雄甾-1，4-二烯-17β-硫代羟酸S-氟甲酯(氟替卡松糠酸盐)、6α，9α-二氟-11β-羟基-16α-甲基-3-氧代-17α-丙酰氧基-雄甾-1，4-二烯-17β-硫代羟酸S-(2-氧代-四氢-呋喃-3S-基)酯、6α，9α-二氟-11β-羟基-16α-甲基-3-氧代-17α-(2，2，3，3-四甲基环丙基羰基)氧基-雄甾-1，4-二烯-17β-硫代羟酸S-氰基甲酯和6α，9α-二氟-11β-羟基-16α-甲基-17α-(1-甲基环丙基羰基)氧基-3-氧代-雄甾-1，4-二烯-17β-硫代羟酸S-氟甲酯、倍氯米松酯(例如17-丙酸酯或17，21-二丙酸酯)、布地奈德、氟尼缩松、莫米松酯(例如莫米松糠酸酯)、曲安奈德、罗氟奈德、环索奈德(16α，17-[[(R)-环己基亚甲基]二(氧基)]-11β，21-二羟基-孕甾-1，4-二烯-3，20-二酮)、布替可特丙酸酯、RPR-106541和ST-126。在一个实施方案中，皮质类固醇包括氟替卡松丙酸酯、6α，9α-二氟-11β-羟基-16α-甲基-17α-[(4-甲基-1，3-噻唑-5-羰基)氧基]-3-氧代-雄甾-1，4-二烯-17β-硫代羟酸S-氟甲酯、6α，9α-二氟-17α-[(2-呋喃甲酰)氧基]-11β-羟基-16α-甲基-3-氧代-雄甾-1，4-二烯-17β-硫代羟酸S-氟甲酯、6α，9α-二氟-11β-羟基-16α-甲基-3-氧代-17α-(2，2，3，3-四甲基环丙基羰基)氧基-雄甾-1，4-二烯-17β-硫代羟酸S-氰基甲酯和6α，9α-二氟-11β-羟基-16α-甲基-17α-(1-甲基环丙基羰基)氧基-3-氧代-雄甾-1，4-二烯-17β-硫代羟酸S-氟甲酯。在一个实施方案中，皮质类固醇是6α，9α-二氟-17α-[(2-呋喃甲酰)氧基]-11β-羟基-16α-甲基-3-氧代-雄甾-1，4-二烯-17β-硫代羟酸S-氟甲酯。皮质类固醇的非限制性例子可以包括在下述公开专利申请和专利中所述的那些：WO02/088167、WO02/100879、WO02/12265、WO02/12266、WO05/005451、WO05/005452、WO06/072599和WO06/072600。

在一个实施方案中，可以具有对反式阻抑超过反式激活的选择性并且可以在组合疗法中有用的具有糖皮质激素激动的非类固醇化合物包括下述公开专利申请和专利中涵盖的那些：WO03/082827、WO98/54159、WO04/005229、WO04/009017、WO04/018429、WO03/104195、WO03/082787、WO03/082280、WO03/059899、WO03/101932、WO02/02565、WO01/16128、WO00/66590、WO03/086294、WO04/026248、WO03/061651、WO03/08277、WO06/000401、WO06/000398和WO06/015870。

可以具有对反式阻抑超过反式激活的选择性并且可以在组合疗法中有用的具有糖皮质激素激动的非类固醇化合物包括下述专利中涵盖的那些：WO03/082827、WO98/54159、WO04/005229、WO04/009017、WO04/018429、WO03/104195、WO03/082787、WO03/082280、WO03/059899、WO03/101932、WO02/02565、WO01/16128、WO00/66590、WO03/086294、WO04/026248、WO03/061651和WO03/08277。

抗炎剂的非限制性例子包括非类固醇抗炎药(NSAID’s)。

NSAID’s的非限制性例子包括色甘酸钠、奈多罗米钠、磷酸二酯酶(PDE)抑制剂(例如茶碱、PDE4抑制剂或混合PDE3/PDE4抑制剂)、白三烯拮抗剂、白三烯合成抑制剂(例如孟鲁司特)、iNOS抑制剂、类胰蛋白酶和弹性蛋白酶抑制剂、β-2整联蛋白拮抗剂和腺苷受体激动剂或拮抗剂(例如腺苷2a激动剂)、细胞因子拮抗剂(例如趋化因子拮抗剂例如CCR3拮抗剂)或细胞因子合成抑制剂、或5-脂氧合酶抑制剂。在一个实施方案中，本发明包含用于经口施用的iNOS(诱导型一氧化氮合酶)抑制剂。iNOS抑制剂的例子包括下述公开国际专利和专利申请中公开的那些：WO93/13055、WO98/30537、WO02/50021、WO95/34534和WO99/62875。CCR3抑制剂的例子包括WO02/26722中公开的那些。

在一个实施方案中，本发明提供了式(I)的化合物与磷酸二酯酶4(PDE4)抑制剂组合的用途，例如在适合于吸入的制剂的情况下。在本发明的这个方面有用的PDE4-特异性抑制剂可以是已知抑制PDE4酶或发现充当PDE4抑制剂，并且仅是PDE4抑制剂的任何化合物，不是抑制PDE家族的其他成员例如PDE3和PDE5的化合物，以及PDE4。

化合物包括顺式-4-氰基-4-(3-环戊氧基-4-甲氧基苯基)环己-1-羧酸、2-甲酯基-4-氰基-4-(3-环丙基甲氧基-4-二氟甲氧基苯基)环己-1-酮和顺式-[4-氰基-4-(3-环丙基甲氧基-4-二氟甲氧基苯基)环己-1-醇]。此外，顺式-4-氰基-4-[3-(环戊氧基)-4-甲氧基苯基]环己-1-羧酸(也称为西洛司特)及其盐、酯、药物前体或物理形式，这在1996年9月03日授权的美国专利5,552,438中描述；这个专利及其公开的化合物全部引入本文作为参考。

其他化合物包括来自Elbion的AWD-12-281(Hofgen，N.等人15thEFMC Int Symp Med Chem(Sept 6-10，Edinburgh)1998，Abst P.98；CAS参考号247584020-9)；命名NCS-613(INSERM)的9-苄基腺嘌呤衍生物；来自Chiroscience和Schering-Plough的D-4418；鉴定为CI-1018(PD-168787)且归于Pfizer的苯并二氮卓PDE4抑制剂；由Kyowa Hakko在WO99/16766中公开的苯并间二氧杂环戊烯衍生物；来自Kyowa Hakko的K-34；来自Napp的V-11294A(Landells，L.J.等人Eur Resp J[Annu Cong Eur Resp Soc(Sept 19-23，Geneva)1998]1998，12(Suppl.28)：Abst P2393)；来自Byk-Gulden的罗氟司特(CAS参考号162401-32-3)和酞嗪酮(pthalazinone)(WO99/47505，其公开内容在此引入作为参考)；普马芬群，(-)-p-[(4aR^*，10bS^*)-9-乙氧基-1，2，3，4，4a，10b-六氢-8-甲氧基-2-甲基苯并[c][1，6]萘啶-6-基]-N，N-二异丙基苯甲酰胺，其是已由Byk-Gulden现在的Altana制备且公开的混合PDE3/PDE4抑制剂；由Almirall-Prodesfarma开发的阿罗茶碱；来自Vernalis的VM554/UM565；或T-440(Tanabe Seiyaku；Fuji，K.等人JPharmacol Exp Ther，1998，284(1)：162)和T2585。进一步的化合物在公开的国际专利申请WO04/024728(Glaxo Group Ltd)、WO04/056823(Glaxo Group Ltd)和WO04/103998(Glaxo Group Ltd)中公开。

抗胆碱能剂的例子是充当针对毒蕈碱受体的拮抗剂的那些化合物，特别是其为M 1或M3受体的拮抗剂、M1/M3或M2/M3的双重拮抗剂、受体或M1/M2/M3受体的泛拮抗剂的那些化合物。用于经由吸入施用的示例性化合物包括异丙托铵(例如作为溴化物，CAS 22254-24-6，在名称爱全乐下销售)、氧托品(例如作为溴化物，CAS 30286-75-0)和噻托溴铵(例如作为溴化物，CAS 136310-93-5，在名称Spiriva下销售)。还有利的是瑞伐托酯(例如作为氢溴化物，CAS 262586-79-8)和WO01/04118中公开的LAS-34273。用于经口施用的示例性化合物包括哌仑西平(CAS 28797-61-7)、达非那新(CAS 133099-04-4或CAS133099-07-7用于在名称替尼达普下销售的氢溴化物)、奥昔布宁(CAS5633-20-5，在名称Ditropan下销售)、特罗地林(CAS 15793-40-5)、托特罗定(CAS 124937-51-5或CAS 124937-52-6用于在名称Detrol下销售的酒石酸盐)、奥替溴铵(例如作为溴化物，CAS 26095-59-0，在斯巴敏名称下销售)、曲司氯铵(CAS 10405-02-4)和索利那辛(CAS242478-37-1或CAS 242478-38-2用于也称为YM-905且在名称Vesicare下销售的琥珀酸盐)。

其他抗胆碱能剂包括式(XXI)的化合物，其公开于美国专利申请60/487981中：

其中与托品烷环附着的烷基链的优选方向是内；

R³¹和R³²独立地选自具有优选1-6个碳原子的直链或支链低级烷基基团、具有5-6个碳原子的环烷基基团、具有6-10个碳原子的环烷基-烷基、2-噻吩基、2-吡啶基、苯基、由具有不超过4个碳原子的烷基基团取代的苯基、和由具有不超过4个碳原子的烷氧基基团取代的苯基；

X^-代表与N原子的正电荷相关的阳离子。X^-可以是但不限于氯化物、溴化物、碘化物、硫酸盐、苯磺酸盐和甲苯磺酸盐，包括例如：(3-内)-3-(2，2-二-2-噻吩基乙烯基)-8，8-二甲基-8-氮

双环[3.2.1]辛烷溴化物；(3-内)-3-(2，2-二苯基乙烯基)-8，8-二甲基-8-氮

双环[3.2.1]辛烷溴化物；(3-内)-3-(2，2-二苯基乙烯基)-8，8-二甲基-8-氮

双环[3.2.1]辛烷4-甲基苯磺酸盐；(3-内)-8，8-二甲基-3-[2-苯基-2-(2-噻吩基)乙烯基]-8-氮

双环[3.2.1]辛烷溴化物；和/或(3-内)-8，8-二甲基-3-[2-苯基-2-(2-吡啶基)乙烯基]-8-氮

双环[3.2.1]辛烷溴化物。

进一步的抗胆碱能剂包括式(XXII)或(XXIII)的化合物，其公开于美国专利申请60/511009中：

其中：指示的H原子在外位置中；R⁴¹代表与N原子的正电荷相关的阳离子。R⁴¹可以是但不限于氯化物、溴化物、碘化物、硫酸盐、苯磺酸盐和甲苯磺酸盐；R⁴²和R⁴³独立地选自直链或支链低级烷基基团(具有优选1-6个碳原子)、环烷基基团(具有5-6个碳原子)、环烷基-烷基(具有6-10个碳原子)、杂环烷基(具有5-6个碳原子)和N或O作为杂原子、杂环烷基-烷基(具有6-10个碳原子)和N或O作为杂原子、芳基、任选取代的芳基、杂芳基和任选取代的杂芳基；R⁴⁴选自(C₁-C₆)烷基、(C₃-C₁₂)环烷基、(C₃-C₇)杂环烷基、(C₁-C₆)烷基(C₃-C₁₂)环烷基、(C₁-C₆)烷基(C₃-C₇)杂环烷基、芳基、杂芳基、(C₁-C₆)烷基-芳基、(C₁-C₆)烷基-杂芳基、-OR⁴⁵、-CH₂OR⁴⁵、-CH₂OH、-CN、-CF₃、-CH₂O(CO)R⁴⁶、-CO₂R⁴⁷、-CH₂NH₂、-CH₂N(R⁴⁷)SO₂R⁴⁵、-SO₂N(R⁴⁷)(R⁴⁸)、-CON(R⁴⁷)(R⁴⁸)、-CH₂N(R⁴⁸)CO(R⁴⁶)、-CH₂N(R⁴⁸)SO₂(R⁴⁶)、-CH₂N(R⁴⁸)CO₂(R⁴⁵)、-CH₂N(R⁴⁸)CONH(R⁴⁷)；R⁴⁵选自(C₁-C₆)烷基、(C₁-C₆)烷基(C₃-C₁₂)环烷基、(C₁-C₆)烷基(C₃-C₇)杂环烷基、(C₁-C₆)烷基-芳基、(C₁-C₆)烷基-杂芳基；R⁴⁶选自(C₁-C₆)烷基、(C₃-C₁₂)环烷基、(C₃-C₇)杂环烷基、(C₁-C₆)烷基(C₃-C₁₂)环烷基、(C₁-C₆)烷基(C₃-C₇)杂环烷基、芳基、杂芳基、(C₁-C₆)烷基-芳基、(C₁-C₆)烷基-杂芳基；R⁴⁷和R⁴⁸独立地选自H、(C₁-C₆)烷基、(C₃-C₁₂)环烷基、(C₃-C₇)杂环烷基、(C₁-C₆)烷基(C₃-C₁₂)环烷基、(C₁-C₆)烷基(C₃-C₇)杂环烷基、(C₁-C₆)烷基-芳基和(C₁-C₆)烷基-杂芳基，包括例如：(内)-3-(2-甲氧基-2，2-二-噻吩-2-基-乙基)-8，8-二甲基-8-氮

-双环[3.2.1]辛烷碘化物；3-((内)-8-甲基-8-氮杂-双环[3.2.1]辛-3-基)-2，2-二苯基-丙腈；(内)-8-甲基-3-(2，2，2-三苯基-乙基)-8-氮杂-双环[3.2.1]辛烷；

3-((内)-8-甲基-8-氮杂-双环[3.2.1]辛-3-基)-2，2-二苯基-丙酰胺；

3-((内)-8-甲基-8-氮杂-双环[3.2.1]辛-3-基)-2，2-二苯基-丙酸；

(内)-3-(2-氰基-2，2-二苯基-乙基)-8，8-二甲基-8-氮

-双环[3.2.1]辛烷碘化物；

(内)-3-(2-氰基-2，2-二苯基-乙基)-8，8-二甲基-8-氮

-双环[3.2.1]辛烷溴化物；

3-((内)-8-甲基-8-氮杂-双环[3.2.1]辛-3-基)-2，2-二苯基-丙-1-醇；

N-苄基-3-((内)-8-甲基-8-氮杂-双环[3.2.1]辛-3-基)-2，2-二苯基-丙酰胺；

(内)-3-(2-氨基甲酰基-2，2-二苯基-乙基)-8，8-二甲基-8-氮

-双环[3.2.1]辛烷碘化物；

1-苄基-3-[3-((内)-8-甲基-8-氮杂-双环[3.2.1]辛-3-基)-2，2-二苯基-丙基]-脲；

1-乙基-3-[3-((内)-8-甲基-8-氮杂-双环[3.2.1]辛-3-基)-2，2-二苯基-丙基]-脲；

N-[3-((内)-8-甲基-8-氮杂-双环[3.2.1]辛-3-基)-2，2-二苯基-丙基]-乙酰胺；

N-[3-((内)-8-甲基-8-氮杂-双环[3.2.1]辛-3-基)-2，2-二苯基-丙基]-苯甲酰胺；

3-((内)-8-甲基-8-氮杂-双环[3.2.1]辛-3-基)-2，2-二-噻吩-2-基-丙腈；

(内)-3-(2-氰基-2，2-二-噻吩-2-基-乙基)-8，8-二甲基-8-氮

-双环[3.2.1]辛烷碘化物；N-[3-((内)-8-甲基-8-氮杂-双环[3.2.1]辛-3-基)-2，2-二苯基-丙基]-苯磺酰胺；[3-((内)-8-甲基-8-氮杂-双环[3.2.1]辛-3-基)-2，2-二苯基-丙基]-脲；N-[3-((内)-8-甲基-8-氮杂-双环[3.2.1]辛-3-基)-2，2-二苯基-丙基]-甲基磺酰胺；和/或(内)-3-{2，2-二苯基-3-[(1-苯基-甲酰氧基)-氨基]-丙基}-8，8-二甲基-8-氮

-双环[3.2.1]辛烷溴化物。

进一步的化合物包括(内)-3-(2-甲氧基-2，2-二-噻吩-2-基-乙基)-8，8-二甲基-8-氮-双环[3.2.1]辛烷碘化物；(内)-3-(2-氰基-2，2-二苯基-乙基)-8，8-二甲基-8-氮

-双环[3.2.1]辛烷碘化物；(内)-3-(2-氰基-2，2-二苯基-乙基)-8，8-二甲基-8-氮

-双环[3.2.1]辛烷溴化物；(内)-3-(2-氨基甲酰基-2，2-二苯基-乙基)-8，8-二甲基-8-氮-双环[3.2.1]辛烷碘化物；(内)-3-(2-氰基-2，2-二-噻吩-2-基-乙基)-8，8-二甲基-8-氮

-双环[3.2.1]辛烷碘化物；和/或(内)-3-{2，2-二苯基-3-[(1-苯基-甲酰氧基)-氨基]-丙基}-8，8-二甲基-8-氮-双环[3.2.1]辛烷溴化物。

在一个实施方案中，本发明提供了包括式(I)的化合物或其药学上可接受的盐连同H1拮抗剂的组合。H1拮抗剂的例子包括但不限于氨来呫诺(amelexanox)、阿司咪唑、阿扎他定、氮卓斯汀、阿伐斯汀、溴苯那敏、西替利嗪、左西替利嗪、乙氟利嗪、氟苯那敏、氯马斯汀、赛克力嗪、卡瑞斯汀、赛庚啶、卡比沙明、去羧乙氧基氯雷他定、多西拉敏、二甲茚定、依巴斯汀、依匹斯汀、乙氟利嗪、非索非那定、羟嗪、酮替芬、氯雷他定、左卡巴斯汀、咪唑斯汀、美喹他嗪、米安色林、诺柏斯汀、美克洛嗪、去甲阿司咪唑、奥洛他定、哌香豆司特、吡拉明、异丙嗪、特非那定、曲吡那敏、替美斯汀、三甲泼拉嗪和曲普利啶，特别是西替利嗪、左西替利嗪、乙氟利嗪和非索非那定。在一个进一步的实施方案中，本发明提供了包括式(I)的化合物或其药学上可接受的盐连同H3拮抗剂(和/或反激动剂)的组合。H3拮抗剂的例子包括例如WO2004/035556和WO2006/045416中公开的那些化合物。可以与本发明的化合物组合使用的其他组胺受体拮抗剂包括H4受体的拮抗剂(和/或反激动剂)，例如Jablonowski等人，J.Med.Chem.46：3957-3960(2003)中公开的化合物。

在一个进一步的方面，本发明因此提供了包括式(I)的化合物和/或其药学上可接受的盐、溶剂化物或生理学功能衍生物连同PDE4抑制剂的组合。

在一个进一步的方面，本发明因此提供了包括式(I)的化合物和/或其药学上可接受的盐、溶剂化物或生理学功能衍生物连同β2-肾上腺素受体激动剂的组合。

在一个进一步的方面，本发明因此提供了包括式(I)的化合物和/或其药学上可接受的盐、溶剂化物或生理学功能衍生物连同皮质类固醇的组合。

在一个进一步的方面，本发明因此提供了包括式(I)的化合物和/或其药学上可接受的盐、溶剂化物或生理学功能衍生物连同抗胆碱能剂的组合。

在一个进一步的方面，本发明因此提供了包括式(I)的化合物和/或其药学上可接受的盐、溶剂化物或生理学功能衍生物连同抗组胺药的组合。

在一个进一步的方面，本发明因此提供了包括式(I)的化合物和/或其药学上可接受的盐、溶剂化物或生理学功能衍生物连同PDE4抑制剂和β2-肾上腺素受体激动剂的组合。

在一个进一步的方面，本发明因此提供了包括式(I)的化合物和/或其药学上可接受的盐、溶剂化物或生理学功能衍生物连同抗胆碱能剂和PDE4抑制剂的组合。

上文提及的组合可以方便地呈现用于以药物制剂的形式使用，并且因此包括如上定义的组合连同药学上可接受的稀释剂或载体的药物制剂代表本发明的一个进一步方面。

此类组合的个别化合物可以在分开或组合药物制剂中顺次或同时施用。在一个实施方案中，个别化合物将在组合药物制剂中同时施用。已知治疗剂的合适剂量将容易地由本领域技术人员理解。

在一个进一步的方面，本发明因此提供了药物组合物，其包括本发明的化合物连同另一种治疗活性剂的组合。

在一个进一步的方面，本发明因此提供了药物组合物，其包括本发明的化合物连同PDE4抑制剂的组合。

在一个进一步的方面，本发明因此提供了药物组合物，其包括本发明的化合物连同β2-肾上腺素受体激动剂的组合。

在一个进一步的方面，本发明因此提供了药物组合物，其包括本发明的化合物连同皮质类固醇的组合。

在一个进一步的方面，本发明因此提供了药物组合物，其包括本发明的化合物连同抗胆碱能剂的组合。

在一个进一步的方面，本发明因此提供了药物组合物，其包括本发明的化合物连同抗组胺药的组合。

本发明的组合物(例如siNA和/或其LNP制剂)可以配制用于以任何合适方式施用，并且本发明因此在其范围内还包括药物组合物，其包括本发明的组合物(例如siNA和/或其LNP制剂)连同需要时与一种或多种药学上可接受的稀释剂或载体混合。

在一个实施方案中，本发明的药物组合物(例如siNA和/或其LNP制剂)通过这样的过程制备，所述过程包括使成分混合到合适制剂内。本发明的施用方法的非限制性例子包括经口、经颊、舌下、肠胃外、局部直肠施用或其他局部施用。在一个实施方案中，本发明的组合物可以通过吹入和吸入施用。用于局部施用的各种类型制剂的非限制性例子包括软膏、洗剂、乳膏剂、凝胶剂、泡沫剂、用于通过经皮贴剂递送的制剂、粉末、喷雾剂、气溶胶、用于在吸入器或吹入器中使用的胶囊或药液筒或滴剂(例如眼或鼻滴剂)、用于喷雾化的溶液/悬浮液、栓剂、子宫托、保留灌肠剂和可咀嚼或可吮吸片剂或丸剂(例如用于治疗口疮性溃疡)或脂质体或微胶囊制剂。

在一个实施方案中，本发明的组合物(例如siNA和/或其LNP制剂和药物组合物)局部施用于鼻例如用于治疗鼻炎，包括通过增压泵施用于鼻的增压气溶胶制剂和水性制剂。非增压且适合于局部施用于鼻腔的制剂是特别有利的。合适的制剂包含水作为稀释剂或载体用于这个目的。在一个实施方案中，用于将本发明的组合物施用于肺或鼻的水性制剂可以与常规赋形剂例如缓冲试剂、张度修饰剂等一起提供。在另一个实施方案中，水性制剂还可以通过喷雾化施用于鼻。

本发明的组合物(例如siNA和/或其LNP制剂和药物组合物)可以配制为液态制剂用于从液体分配器中递送，例如具有分配喷嘴或分配孔口的液体分配器，在使用者施加的力应用于液体分配器的注入机制后，通过所述分配喷嘴或分配孔口分配测定剂量的液体制剂。在一个实施方案中，本发明的液体分配器使用液体制剂的多个测定剂量的储库，剂量可在连续泵启动后分配。在一个实施方案中，本发明的分配喷嘴或孔口可以配置用于插入使用者的鼻孔内，用于包括本发明组合物的液体制剂的喷雾分配到鼻腔内。上述类型的液体分配器在WO05/044354中描述且举例说明，其完整内容在此引入本文作为参考。分配器具有外壳，其容纳具有固定在用于包含液体制剂的容器上的压气泵的液体排放装置。在一个实施方案中，外壳具有至少一个手指可操作侧杆，其可就外壳而言在内部移动，以使容器在外壳中向上用凸轮带动(cam)，以引起泵压缩且注入测定剂量的制剂通过外壳的鼻喷嘴离开泵柄。在另一个实施方案中，液体分配器是在WO05/044354的图30-40中举例说明的一般类型。

软膏、乳膏剂和凝胶剂可以例如用水或油基质配制，伴随合适增稠剂和/或胶凝剂和/或溶剂的添加。此类基质的非限制性例子因此可以例如包括水和/或油例如液体石蜡或植物油例如花生油或蓖麻油、或溶剂例如聚乙二醇。增稠剂和胶凝剂可以根据基质的性质使用。此类试剂的非限制性例子包括软石蜡、硬脂酸铝、鲸蜡硬脂醇、聚乙二醇、羊毛脂、蜂蜡、羧聚乙烯和纤维素衍生物、和/或单硬脂酸甘油酯和/或非离子型乳化剂。

在一个实施方案中，洗剂可以用水或油基质配制，并且一般而言还将包含一种或多种乳化剂、稳定剂、分散剂、悬浮剂或增稠剂。

在一个实施方案中，用于外敷的粉末可以借助于任何合适的粉末基质例如滑石、乳糖或淀粉形成。滴剂可以用水或非水基质配制，还包括一种或多种分散剂、增溶剂、悬浮剂或防腐剂。

喷雾组合物可以例如配制为水溶液或悬浮液，或配制为由增压包例如计量吸入器递送的气溶胶，使用合适的液化推进剂。在一个实施方案中，适合于吸入的本发明的气溶胶组合物可以是悬浮液或溶液，并且一般包含式(I)的化合物和合适的推进剂，例如碳氟化合物或含氢含氯氟烃或其混合物，特别是氢氟烷，特别是1，1，1，2-四氟乙烷、1，1，1，2，3，3，3-六氟正丙烷或其混合物。气溶胶组合物可以任选包含本领域众所周知的另外配制赋形剂，例如表面活性剂。非限制性例子包括油酸、卵磷脂或寡聚乳酸或衍生物例如WO94/21229和WO98/34596中所述的那些、和共溶剂例如乙醇。在一个实施方案中，本发明的药物气溶胶制剂包括本发明的化合物和碳氟化合物或含烃含氯氟烃或其混合物作为推进剂，任选与表面活性剂和/或共溶剂组合。

本发明的组合物的制剂可以包括药物气溶胶，其中推进剂选自1，1，1，2-四氟乙烷、1，1，1，2，3，3，3-六氟正丙烷及其混合物。

本发明的制剂可以通过加入合适缓冲剂进行缓冲。

可以配制用于在例如胶质的吸入器或吹入器中使用的包括本发明组合物的胶囊和药液筒，其包含用于吸入本发明的化合物和合适粉末基质例如乳糖或淀粉的粉末混合物。在一个实施方案中，每个胶囊或药液筒一般可以包含20μg-10mg式(I)的化合物。在另一个实施方案中，本发明的化合物可以不含赋形剂例如乳糖呈现。

根据本发明的局部组合物中式(I)的活性化合物的比例取决于待制备的制剂的精确类型，但一般将在按重量计0.001-10％的范围内。在一个实施方案中，使用的大多数类型制剂的比例将在0.005-1％，例如0.01-0.5％的范围内。在另一个实施方案中，本发明的组合物包括用于吸入或吹入的粉末，其中使用的比例通常将在0.1-5％的范围内。

包括本发明的组合物的气溶胶制剂优选这样安排，使得气溶胶的每个测定剂量或“小块(puff)”包含20μg-10mg。在一个实施方案中，气溶胶制剂是20μg-2000μg。在另一个实施方案中，气溶胶制剂是20μg-500μg式(I)的化合物。施用可以是每天一次或每天数次，例如2、3、4或8次，每次给出例如1、2或3个剂量。在一个实施方案中，用包括本发明组合物的气溶胶的日总剂量将在100μg-10mg的范围内。在另一个实施方案中，用包括本发明组合物的气溶胶的日总剂量将在200μg-2000μg的范围内。通过吸入器或吹入器中的胶囊和药液筒递送的日总剂量和测定剂量将一般是由气溶胶制剂递送的那种的加倍。

在悬浮液气溶胶制剂的情况下，颗粒(例如微粒化)药物的粒子大小应是这样的，以便允许在气溶胶制剂施用后基本上所有药物吸入到肺内。在一个实施方案中，颗粒的粒子大小将小于100微米。在另一个实施方案中，颗粒的粒子大小将小于20微米。粒子大小的范围可以在1-10微米的范围内。在一个实施方案中，颗粒范围可以是1-5微米。在另一个实施方案中，颗粒范围可以是2-3微米。

本发明的制剂可以通过本发明的药物和化合物分散或溶解在合适容器中的选择调节剂中进行制备。在一个实施方案中，分散或溶解借助于超声处理或高剪切混合器。该过程希望地在控制湿度条件下执行。

根据本发明的气溶胶制剂的化学和物理稳定性和药物可接受性可以通过本领域技术人员众所周知的技术进行测定。在一个实施方案中，组分的化学稳定性可以通过例如在产品的延长贮存后的HPLC测定进行测定。物理稳定性数据可以从其他常规分析技术获得。在一个实施方案中，物理稳定性数据可以通过下述获得：漏渗测试、阀门递送测定(平均注射重量/启动)、剂量再现性测定(活性成分/启动)和喷雾分布分析。

根据本发明的悬浮液气溶胶制剂的稳定性可以通过常规技术进行测量。在一个实施方案中，悬浮液气溶胶的稳定性可以这样进行测量：使用背光散射仪器测定絮凝大小分布，或通过串联撞击或通过“双撞击器(twin impinger)”分析过程测量粒子大小分布。

如本文使用的，提及“双撞击器”测定意指如British Pharmacopaeia1988，第A204-207页，附录XVII C中定义的“测定使用仪器A在增压吸入中发出剂量的沉积”。此类技术使得能够计算气溶胶制剂的“可吸收部分”。在一个实施方案中，用于计算“可吸收部分”的方法参考“细小颗粒部分”，这是每次启动在下层撞击室中收集的活性成分量，表示为每次启动递送的活性成分总量，使用上文描述的双撞击器方法。

术语“定量吸入器”或MDI意指包括罐、覆盖罐的安全盖和位于盖中的制剂计量阀门的单元。MDI系统包括合适的开缝装置。本发明的合适开槽装置包括例如阀门传动装置和圆筒状或圆锥样通道，通过其药物可以从填满的滤毒罐经由计量阀门递送至患者的鼻或口例如口状物传动装置。

本发明的MDI滤毒罐一般包括能够经得住所使用推进剂的蒸气压力的容器，例如塑料或塑料包被的玻璃瓶或优选金属罐，例如铝或其合金，其可以任选是阳极氧化的、漆包被和/或塑料包被的(例如引入本文作为参考的WO96/32099，其中部分或全部内表面由任选与一种或多种非氟碳聚合物组合的一种或多种氟碳聚合物包被)，所述容器由计量阀门关闭。在一个实施方案中，盖可以经由超声波焊接、螺旋接头或卷边在罐上固定。本文教导的MDI可以通过本领域方法进行制备(例如参见Byron上文和WO96/32099)。在一个实施方案中，本发明的滤毒罐配备盖组件，其中药物剂量阀门位于盖中，并且所述盖原位卷曲。

在本发明的一个实施方案中，罐的金属内表面由最优选与非氟聚合物掺和的氟聚合物包被。在本发明的另一个实施方案中，罐的金属内表面由聚四氟乙烯(PTFE)和聚苯醚砜(PES)的聚合物掺和物包被。在本发明的一个进一步实施方案中，罐的整个金属内表面由聚四氟乙烯(PTFE)和聚苯醚砜(PES)的聚合物掺和物包被。

计量阀门设计为每次启动递送测定量的制剂，且掺入垫圈以防止推进剂通过阀门渗漏。垫圈可以包括任何合适的弹性体材料，例如低密度聚乙烯、氯化丁基、溴化丁基、EPDM、黑色和白色丁二烯-丙烯腈橡胶、丁基橡胶和氯丁橡胶。合适的阀门是从气溶胶工业中众所周知的制造商中商购可得的，所述制造商例如Valois，法国(例如DF10、DF30、DF60)，Bespak plc，UK(例如BK300、BK357)和3M-NeotechnicLtd，UK(例如SpraymiserTM)。

在各种实施方案中，MDI也可以与其他结构结合使用，所述其他结构例如但不限于用于贮存且包含MDI的外包装包裹，包括美国专利号6,119,853；6,179,118；6,315,112；6,352,152；6,390,291；和6,679,374中所述的那些，以及剂量计数单元例如但不限于美国专利号6,360,739和6,431,168中所述的那些。

药物气溶胶制备领域技术人员众所周知的常规大量制备方法和机器可以用于制备大规模批次用于填满滤毒罐的商业生产。因此，例如在用于制备悬浮液气溶胶制剂的一种大量制备方法中，计量阀门在铝罐上卷曲，以形成空滤毒罐。将颗粒药物加入装料容器中，并且液化推进剂连同任选的赋形剂通过装料容器压力填充到制备容器内。药物悬浮液在再循环至灌装机前混合，并且随后药物悬浮液的等分试样通过计量阀门填充到滤毒罐内。在用于制备溶液气溶胶制剂的一种示例大量制备方法中，计量阀门在铝罐上卷曲，以形成空滤毒罐。液体推进剂连同任选的赋形剂和溶解的药物通过装料容器压力填充到制备容器内。

在另一个实施方案中，在足够冷以确保制剂不汽化的条件下，将液化制剂的等分试样加入打开的滤毒罐，并且随后计量阀门在滤毒罐上卷曲(crimp)。

一般地，在制备用于药物用途的批次中，每个填满的滤毒罐进行重量检查，用批号编码并且包装到托盘内用于在释放测试前贮存。

局部制剂可以通过每天一次或多次应用施用于受累区域；在皮肤区域上可以有利地使用封闭敷料。连续或延长递送可以通过粘着储库系统达到。

对于内部施用，根据本发明的化合物(例如siNA和/或其LNP制剂)可以例如以常规方式配制用于经口、鼻、肠胃外或直肠施用。在一个实施方案中，用于经口施用的制剂包括糖浆剂、酏剂、粉末、颗粒剂、片剂和胶囊，合适时其一般包含常规赋形剂例如结合剂、填充剂、润滑剂、崩解剂、湿润剂、悬浮剂、润滑剂、防腐剂、缓冲盐、调味剂、着色剂和/或甜味剂。剂量单位形式如下所述可以是优选的。

本发明的化合物一般而言可以通过内部施用给予，在其中指出全身性糖皮质激素受体激动剂疗法的情况下。

缓慢释放或肠包衣制剂可以是有利的，特别是对于炎性肠病症的治疗。

在某些实施方案中，本发明的化合物(例如siNA和/或其LNP制剂)将配制用于经口施用。在其他实施方案中，本发明的化合物将配制用于吸入施用。

在另一个实施方案中，本发明的特征在于调节受试者或生物中的超过一种ENaC靶基因表达的方法，其包括在适合于调节(例如，抑制)受试者或生物中的ENaC靶基因表达的条件下，使受试者或生物与本发明的一种或多种siNA分子接触。

本发明的siNA分子可以被设计为经由多种核酸分子的RNAi靶向下调或抑制靶基因表达。在一个实施方案中，本发明的siNA分子用于靶向对应于靶基因的各种DNA，例如经由异染色质基因沉默或转录抑制。在一个实施方案中，本发明的siNA分子用于靶向对应于靶基因的各种RNA，例如经由RNA靶切割或翻译抑制。此类RNA的非限制性例子包括信使RNA(mRNA)、非编码RNA(ncRNA)或调节元件(参见例如Mattick，2005，Science，309，1527-1528和Claverie，2005，Science，309，1529-1530)，其包括miRNA和其他小RNA、一种或多种靶基因的可变RNA同种型、一种或多种靶基因的转录后修饰的RNA、一种或多种靶基因的前mRNA、和/或RNA模板。如果可变剪接产生通过使用合适的外显子加以区分的转录物家族，那么本发明可以用于抑制通过合适的外显子的基因表达，以特异性抑制或区分基因家族成员的功能。例如，包含可变剪接的跨膜结构域的蛋白质可以以膜结合和分泌形式进行表达。使用本发明靶向包含跨膜结构域的外显子可以用于确定与蛋白质的分泌形式成对比的膜结合的药物靶向的功能结果。涉及靶向这些RNA分子的本发明应用的非限制性例子包括治疗药物应用、化妆品应用、兽医应用、药物发现应用、分子诊断和基因功能应用、和基因作图，例如用本发明的siNA分子使用单核苷酸多态性作图。此类应用可以使用已知的基因序列或来自可从表达序列标签(EST)获得的部分序列来实现。

在另一个实施方案中，本发明的siNA分子用于靶向对应于一个或多个基因家族例如ENaC家族基因(例如所有已知ENaC同种型、或ENaC同种型的选择分组)的保守序列。照这样，靶向多重ENaC靶的siNA分子可以提供增加的疗效。此外，通过避免其他ENaC同种型，可以避免毒性。

在一个实施方案中，siNA分子可以用于在多种应用中表征基因功能的途径。例如，本发明可以用于抑制途径中的一种或多种靶基因的活性，以在基因功能分析、mRNA功能分析或翻译分析中确定未表征的一种或多种基因的功能。本发明可以用于确定通向药物开发的涉及各种疾病和状况的潜在靶基因途径。本发明可以用于了解涉及例如呼吸性、炎性和/或自身免疫疾病、病症和状况的基因表达的途径。

在一个实施方案中，本发明的一种或多种siNA分子和/或方法用于下调编码通过Genbank登记提及的RNA的一种或多种基因的表达，例如编码本文通过Genbank登记号，例如本文(例如在表7中)显示的Genbank登记号提及的一种或多种RNA序列的靶基因。

在一个实施方案中，本发明的特征在于这样的方法，其包括：(a)产生具有预定复杂性的siNA构建体文库；和(b)在适合于测定靶RNA序列内的RNAi靶位点的条件下，测定上文(a)的siNA构建体。在一个实施方案中，(a)的siNA分子具有固定长度的链，例如长度为约23个核苷酸。在另一个实施方案中，(a)的siNA分子具有不同长度，例如具有长度为约15个-约30个(例如，约15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个)核苷酸的链。在一个实施方案中，该测定可以包含如本文所描述的重构的体外siNA测定。在另一个实施方案中，该测定可以包括在其中表达靶RNA的细胞培养系统。在另一个实施方案中，就可检测的切割水平分析靶RNA的片段，例如通过凝胶电泳、RNA印迹分析或RNA酶保护测定，以确定靶RNA序列内最合适的一个或多个靶位点。靶RNA序列可以如本领域已知的获得，例如对于体外系统通过克隆和/或转录，和在体内系统中通过细胞表达。

在一个实施方案中，本发明的特征在于这样的方法，其包括：(a)产生具有预定复杂性例如4N的siNA构建体的随机文库，其中N代表在每条siNA构建体链中碱基配对的核苷酸的数目(例如，对于具有含19个碱基对的21核苷酸有义和反义链的siNA构建体，复杂性将是4¹⁹)；和(b)在适合于测定靶RNA序列内的RNAi靶位点的条件下，测定上文(a)的siNA构建体。在另一个实施方案中，(a)的siNA分子具有固定长度的链，例如长度为约23个核苷酸。在另外一个实施方案中，(a)的siNA分子具有不同长度，例如具有长度为约15个-约30个(例如，约15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个)核苷酸的链。在一个实施方案中，该测定可以包含重构的体外siNA测定。在另一个实施方案中，该测定可以包括在其中表达靶RNA的细胞培养系统。在另一个实施方案中，就可检测的切割水平分析靶RNA的片段，例如通过凝胶电泳、RNA印迹分析或RNA酶保护测定，以确定靶靶RNA序列内最合适的一个或多个靶位点。靶靶RNA序列可以如本领域已知的获得，例如对于体外系统通过克隆和/或转录，和在体内系统中通过细胞表达。

在另一个实施方案中，本发明的特征在于这样的方法，其包括：(a)分析由靶基因编码的RNA靶的序列；(b)合成与(a)的RNA的一个或多个区域具有序列互补性的一个或多个siNA分子组；和(c)在适合于测定靶RNA序列内的RNAi靶的条件下，测定(b)的siNA分子。在一个实施方案中，(b)的siNA分子具有固定长度的链，例如长度为约23个核苷酸。在另一个实施方案中，(b)的siNA分子具有不同长度，例如具有长度为约15个-约30个(例如，约15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个)核苷酸的链。在一个实施方案中，该测定可以包含如本文所描述的重构的体外siNA测定。在另一个实施方案中，该测定可以包括在其中表达靶RNA的细胞培养系统。就可检测的切割水平分析靶RNA的片段，例如通过凝胶电泳、RNA印迹分析或RNA酶保护测定，以确定靶RNA序列内最合适的一个或多个靶位点。靶RNA序列可以如本领域已知的获得，例如对于体外系统通过克隆和/或转录，和在体内系统中通过表达。

“靶位点”意指靶RNA内对于由siNA构建体介导的切割“被靶向”的序列，所述siNA构建体在其反义区内包含与靶序列互补的序列。

“可检测的切割水平”意指靶RNA的切割(和切割产物RNA的形成)至足以区分超过由靶RNA随机降解产生的RNA背景的切割产物的程度。对于大多数检测方法，来自1-5％靶RNA的切割产物的产生足以检测超过背景。

在一个实施方案中，本发明的特征在于包含在药学上可接受的载体或稀释剂中的本发明siNA分子的组合物，所述本发明siNA分子可以是化学修饰的。在另一个实施方案中，本发明的特征在于包含在药学上可接受的载体或稀释剂中的本发明siNA分子的药物组合物，所述本发明siNA分子可以是化学修饰的，靶向一种或多种基因。在另一个实施方案中，本发明的特征在于用于诊断受试者中的疾病、性状或状况的方法，其包括在适合于诊断受试者中的疾病、性状或状况的条件下，给受试者施用本发明的组合物。在另一个实施方案中，本发明的特征在于用于治疗或预防受试者中的疾病、性状或状况，例如呼吸性、炎性和/或自身免疫病症的方法，其包括在适合于治疗或预防受试者中的疾病、性状或状况的条件下，给受试者施用单独或与一种或多种其他治疗化合物结合的本发明的组合物。

在另一个实施方案中，本发明的特征在于用于确认靶基因靶的方法，其包括：(a)合成本发明的siNA分子，其可以是化学修饰的，其中所述siNA链之一包括与靶基因的RNA互补的序列；(b)在适合于调节细胞、组织、受试者或生物中的靶基因表达的条件下，将siNA分子引入细胞、组织、受试者或生物内；和(c)通过测定细胞、组织、受试者或生物中的任何表型改变来确定基因的功能。

在另一个实施方案中，本发明的特征在于用于确认靶的方法，其包括：(a)合成本发明的siNA分子，其可以是化学修饰的，其中所述siNA链之一包括与靶基因的RNA互补的序列；(b)在适合于调节生物系统中的靶基因表达的条件下，将siNA分子引入生物系统内；和(c)通过测定生物系统中的任何表型改变来确定基因的功能。

“生物系统”意指来自生物源的纯化或未纯化形式的材料，所述生物源包括但不限于人或动物，其中所述系统包括对RNAi活性所需的组分。术语“生物系统”包括例如，细胞、组织、受试者或生物、或其提取物。术语生物系统还包括可以在体外背景中使用的重构的RNAi系统。

“表型改变”意指响应与本发明的核酸分子接触或用本发明的核酸分子(例如，siNA)治疗发生的关于细胞的任何可检测改变。此类可检测的改变包括但不限于，如可以通过本领域已知的方法测定的形状、大小、增殖、运动性、蛋白质表达或RNA表达中的改变或者其他物理或化学变化。可检测的改变还可以包括报道基因/分子的表达，例如绿色荧光蛋白(GFP)或用于鉴定表达的蛋白质的各种标记或可以被测定的任何其他细胞组分。

在一个实施方案中，本发明的特征在于包含本发明的siNA分子的试剂盒，所述本发明的siNA分子可以是化学修饰的，所述试剂盒可以用于调节生物系统包括例如细胞、组织、受试者或生物中的靶基因表达。在另一个实施方案中，本发明的特征在于包含本发明的超过一种siNA分子的试剂盒，所述本发明的siNA分子可以是化学修饰的，所述试剂盒可以用于调节生物系统包括例如细胞、组织、受试者或生物中的超过一种靶基因的表达。

在一个实施方案中，本发明的特征在于包含本发明的一种或多种siNA分子的细胞，所述本发明的siNA分子可以是化学修饰的。在另一个实施方案中，包含本发明的siNA分子的细胞是哺乳动物细胞。在另外一个实施方案中，包含本发明的siNA分子的细胞是人细胞。

在一个实施方案中，可以是化学修饰的本发明的siNA分子的合成包括：(a)合成siNA分子的2条互补链；(b)在适合于获得双链siNA分子的条件下，使2条互补链一起退火。在另一个实施方案中，siNA分子的2条互补链的合成是通过固相寡核苷酸合成。在另外一个实施方案中，siNA分子的2条互补链的合成是通过固相串联寡核苷酸合成。

在一个实施方案中，本发明的特征在于用于合成siNA双链体分子的方法，其包括：(a)合成siNA分子的第一条寡核苷酸序列链，其中所述第一条寡核苷酸序列链包含可切割的接头分子，其可以用作支架用于合成siNA的第二条寡核苷酸序列链；(b)在第一条寡核苷酸序列链的支架上合成siNA的第二条寡核苷酸序列链，其中所述第二条寡核苷酸序列链进一步包含可以用于纯化siNA双链体的化学部分；(c)在适合于2条siNA寡核苷酸链杂交且形成稳定的双链体的条件下，切割(a)的接头分子；和(d)利用第二条寡核苷酸序列链的化学部分纯化siNA双链体。在一个实施方案中，上文(c)中的接头分子的切割在寡核苷酸的脱保护期间发生，例如在使用烷基胺碱例如甲胺的水解条件下。在一个实施方案中，合成方法包括在固体支持体例如可控孔度玻璃(CPG)或聚苯乙烯上的固相合成，其中(a)的第一种序列在可切割接头例如琥珀酰接头上使用固体支持体作为支架来合成。用作支架用于合成第二条链的(a)中的可切割接头可以包含与固体支持体衍生的接头相似的反应性，从而使得固体支持体衍生的接头和(a)的可切割接头的切割伴随发生。在另一个实施方案中，可以用于分离附着的寡核苷酸序列的(b)的化学部分包含三苯甲基，例如二甲氧三苯甲基，其可以在如本文所描述的三苯甲基依赖性(trityl-on)合成策略中使用。在另外一个实施方案中，化学部分例如二甲氧三苯甲基在纯化期间例如使用酸性条件去除。

在进一步的实施方案中，用于siNA合成的方法是溶液相合成或混合相合成，其中siNA双链体的2条链使用与第一种序列附着的可切割接头串联合成，所述可切割接头充当支架用于合成第二种序列。在适合于分开的siNA序列链杂交的条件下切割接头导致双链siNA分子的形成。

在另一个实施方案中，本发明的特征在于用于合成siNA双链体分子的方法，其包括：(a)合成siNA分子的一条寡核苷酸序列链，其中所述序列包含可切割的接头分子，其可以用作支架用于合成另一条寡核苷酸序列；(b)在(a)的支架上合成与第一条序列链具有互补性的第二条寡核苷酸序列，其中所述第二条序列包含双链siNA分子的另一条链，且其中所述第二条序列进一步包含可以用于分离附着的寡核苷酸序列的化学部分；(c)在适合于分离包含由可切割接头连接的2条siNA寡核苷酸链的全长序列的条件下，和在适合于2条siNA寡核苷酸链杂交且形成稳定的双链体的条件下，利用第二条寡核苷酸序列链的化学部分纯化(b)的产物。在一个实施方案中，上文(c)中的接头分子的切割在寡核苷酸的脱保护期间发生，例如在水解条件下。在另一个实施方案中，上文(c)中的接头分子的切割在寡核苷酸的脱保护后发生。在另一个实施方案中，合成方法包括在固体支持体例如可控孔度玻璃(CPG)或聚苯乙烯上的固相合成，其中(a)的第一种序列在可切割接头例如琥珀酰接头上使用固体支持体作为支架来合成。用作支架用于合成第二条链的(a)中的可切割接头可以包含与固体支持体衍生的接头相似的反应性或不同的反应性，从而使得固体支持体衍生的接头和(a)的可切割接头的切割伴随或顺次发生。在一个实施方案中，可以用于分离附着的寡核苷酸序列的(b)的化学部分包含三苯甲基，例如二甲氧三苯甲基。

在另一个实施方案中，本发明的特征在于用于在单一合成法中制备双链siNA分子的方法，其包括：(a)合成具有第一种和第二种序列的寡核苷酸，其中第一种序列与第二种序列互补，且第一种寡核苷酸序列经由可切割接头与第二种序列连接，且其中末端5′-保护基团例如5′-O-二甲氧三苯甲基(5′-O-DMT)保持在具有第二种序列的寡核苷酸上；(b)使寡核苷酸脱保护，由此脱保护导致使2种寡核苷酸序列连接的接头的切割；和(c)在适合于分离双链siNA分子的条件下，例如使用如本文所描述的三苯甲基依赖性合成策略，纯化(b)的产物。

在另一个实施方案中，本发明的siNA分子的合成方法包括Scaringe等人，美国专利号5,889,136；6,008,400；和6,111,086的教导，所述专利整体引入本文作为参考。

在一个实施方案中，本发明的特征在于介导针对ENaC靶多核苷酸的RNAi的siNA构建体，其中所述siNA构建体包含增加siNA构建体的核酸酶抗性的一种或多种化学修饰，例如具有式I-VII中任何一个或其任何组合的一种或多种化学修饰。

在另一个实施方案中，本发明的特征在于用于产生具有增加的核酸酶抗性的siNA分子的方法，其包括(a)将具有I-VII中任何一个或其任何组合的核苷酸引入siNA分子内，和(b)在适合于分离具有增加的核酸酶抗性的siNA分子的条件下，测定步骤(a)的siNA分子。

在另一个实施方案中，本发明的特征在于用于产生具有改善的毒理学概况(例如，具有减弱的或无免疫刺激性质)的siNA分子的方法，其包括(a)将具有I-VII(例如，表8中提及的siNA基序)中任何一个或其任何组合的核苷酸引入siNA分子内，和(b)在适合于分离具有改善的毒理学概况的siNA分子的条件下，测定步骤(a)的siNA分子。

在另一个实施方案中，本发明的特征在于用于产生具有改善的毒理学概况(例如，具有减弱的或无免疫刺激性质)的siNA制剂的方法，其包括(a)产生包含本发明的siNA分子和如本文所描述的或本领域其他方面已知的递送媒介物或递送颗粒的siNA制剂，和(b)在适合于分离具有改善的毒理学概况的siNA制剂的条件下，测定步骤(a)的siNA制剂。

在另一个实施方案中，本发明的特征在于用于产生在细胞、受试者或生物中不刺激干扰素应答(例如，无干扰素应答或减弱的干扰素应答)的siNA分子的方法，其包括(a)将具有I-VII(例如，表8中提及的siNA基序)中任何一个或其任何组合的核苷酸引入siNA分子内，和(b)在适合于分离不刺激干扰素应答的siNA分子的条件下，测定步骤(a)的siNA分子。

在另一个实施方案中，本发明的特征在于用于产生在细胞、受试者或生物中不刺激干扰素应答(例如，无干扰素应答或减弱的干扰素应答)的siNA制剂的方法，其包括(a)产生包含本发明的siNA分子和如本文所描述的或本领域其他方面已知的递送媒介物或递送颗粒的siNA制剂，和(b)在适合于分离不刺激干扰素应答的siNA制剂的条件下，测定步骤(a)的siNA制剂。在一个实施方案中，干扰素包括干扰素α。

在另一个实施方案中，本发明的特征在于用于产生在细胞、受试者或生物中不刺激炎症或促炎细胞因子应答(例如，无细胞因子应答或减弱的细胞因子应答)的siNA分子的方法，其包括(a)将具有I-VII(例如，表8中提及的siNA基序)中任何一个或其任何组合的核苷酸引入siNA分子内，和(b)在适合于分离不刺激细胞因子应答的siNA分子的条件下，测定步骤(a)的siNA分子。在一个实施方案中，细胞因子包含白细胞介素例如白细胞介素-6(IL-6)和/或肿瘤坏死α(TNF-α)。

在另一个实施方案中，本发明的特征在于用于产生在细胞、受试者或生物中不刺激炎症或促炎细胞因子应答(例如，无细胞因子应答或减弱的细胞因子应答)的siNA制剂的方法，其包括(a)产生包含本发明的siNA分子和如本文所描述的或本领域其他方面已知的递送媒介物或递送颗粒的siNA制剂，和(b)在适合于分离不刺激细胞因子应答的siNA制剂的条件下，测定步骤(a)的siNA制剂。在一个实施方案中，细胞因子包含白细胞介素例如白细胞介素-6(IL-6)和/或肿瘤坏死α(TNF-α)。

在另一个实施方案中，本发明的特征在于用于产生在细胞、受试者或生物中不刺激Toll样受体(TLR)应答(例如，无TLR应答或减弱的TLR应答)的siNA分子的方法，其包括(a)将具有I-VII(例如，表8中提及的siNA基序)中任何一个或其任何组合的核苷酸引入siNA分子内，和(b)在适合于分离不刺激TLR应答的siNA分子的条件下，测定步骤(a)的siNA分子。在一个实施方案中，TLR包含TLR3、TLR7、TLR8和/或TLR9。

在另一个实施方案中，本发明的特征在于用于产生在细胞、受试者或生物中不刺激Toll样受体(TLR)应答(例如，无TLR应答或减弱的TLR应答)的siNA制剂的方法，其包括(a)产生包含本发明的siNA分子和如本文所描述的或如本领域其他方面已知的递送媒介物或递送颗粒的siNA制剂，和(b)在适合于分离不刺激TLR应答的siNA制剂的条件下，测定步骤(a)的siNA制剂。在一个实施方案中，TLR包含TLR3、TLR7、TLR8和/或TLR9。

在一个实施方案中，本发明的特征在于经由RNA干扰(RNAi)指导靶RNA切割的化学合成的双链短干扰核酸(siNA)分子，其中：(a)所述siNA分子的每条链长度为约18个-约38个核苷酸；(b)所述siNA分子的一条链包含与所述靶RNA具有足够互补性的核苷酸序列，用于siNA分子经由RNA干扰指导靶RNA切割；和(c)其中所述siNA分子内的核苷酸位置进行化学修饰，以将siNA分子的免疫刺激性质减少至低于相应的未修饰的siNA分子那种的水平。与未修饰或最低限度修饰的siNA相比较，此类siNA分子被说成具有改善的毒理学概况。

“改善的毒理学概况”意指与未修饰或未配制的siNA、或具有较少的修饰或在给予改善的毒理学方面较不有效的修饰的siNA分子相比较，化学修饰或配制的siNA构建体在细胞、受试者或生物中显示出减少的毒性。此类siNA分子也被视为具有“改善的RNAi活性”。在非限制性例子中，与未修饰或未配制的siNA、或具有较少的修饰或在给予改善的毒理学方面较不有效的修饰的siNA分子相比较，具有改善的毒理学概况的siNA分子和制剂与细胞、受试者或生物中减少的免疫刺激性质相关，例如减少的、降低的或减弱的免疫刺激应答。此类改善的毒理学概况的特征在于取消的或减少的免疫刺激，例如减少或取消干扰素(例如干扰素α)、炎性细胞因子(例如白细胞介素例如IL-6和/或TNF-α)和/或toll样受体(例如，TLR3、TLR7、TLR8和/或TLR9)的诱导。在一个实施方案中，具有改善的毒理学概况的siNA分子或制剂不包含核糖核苷酸。在一个实施方案中，具有改善的毒理学概况的siNA分子或制剂包含少于5个核糖核苷酸(例如，1个、2个、3个或4个核糖核苷酸)。在一个实施方案中，具有改善的毒理学概况的siNA分子或制剂包含Stab 7、Stab 8、Stab 11、Stab 12、Stab 13、Stab 16、Stab 17、Stab 18、Stab 19、Stab 20、Stab 23、Stab 24、Stab 25、Stab 26、Stab 27、Stab 28、Stab 29、Stab 30、Stab 31、Stab 32、Stab 33、Stab 34、Stab 35、Stab 36或其任何组合(参见表8)。在本文中，数字化的Stab化学物包括表8中所示化学物的2′-氟和2′-OCF3形式。例如，“Stab 7/8”指Stab 7/8和Stab 7F/8F等。在一个实施方案中，具有改善的毒理学概况的siNA分子或制剂包含本发明的siNA分子和如美国专利申请公开号20030077829中所述的制剂，所述专利包括附图整体引入本文作为参考。

在一个实施方案中，与给定siNA分子相关的免疫刺激应答的水平可以如本文所描述的或如本领域其他方面已知的进行测量，例如通过在测定中测定PKR/干扰素应答、增殖、B细胞激活和/或细胞因子生产水平，以定量特定siNA分子的免疫刺激应答(参见，例如，Leifer等人，2003，J Immunother.26，313-9；和美国专利号5,968,909，整体引入作为参考)。在一个实施方案中，与未修饰或最低限度修饰的siNA分子相比较，减少的免疫刺激应答为约10％-约100％，例如10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％减少的免疫刺激应答。在一个实施方案中，与siNA分子相关的免疫刺激应答可以通过化学修饰的程度进行调节。例如，可以选择在siNA分子中具有约10％-约100％，例如约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％或至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％修饰的核苷酸位置的siNA分子，以具有如本文所描述的相应程度的免疫刺激性质。

在一个实施方案中，就最优化的RNAi活性选择减少的免疫刺激应答的程度。例如，对治疗病毒感染保留某一程度的免疫刺激可以是优选的，其中对于最大的抗病毒活性，免疫刺激中小于100％的减少可以是优选的(例如，免疫刺激中约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的减少)，而关于具有最小免疫刺激性质的siNA分子抑制内源基因靶的表达可以是优选的，以防止非特异性毒性或脱靶(off-target)效应(例如免疫刺激中约90％-约100％的减少)。

在一个实施方案中，本发明的特征在于经由RNA干扰(RNAi)指导靶RNA切割的化学合成的双链siNA分子，其中(a)所述siNA分子的每条链长度为约18个-约38个核苷酸；(b)所述siNA分子的一条链包含与所述靶RNA具有足够互补性的核苷酸序列，用于siNA分子经由RNA干扰指导靶RNA切割；和(c)其中所述siNA分子的一个或多个核苷酸进行化学修饰，以将siNA分子的免疫刺激性质减少至低于相应的未修饰的siNA分子那种的水平。在一个实施方案中，每条链包含与另一条链的核苷酸互补的至少约18个核苷酸。

在另一个实施方案中，包含经修饰的核苷酸以减少siNA分子的免疫刺激性质的siNA分子包含反义区，所述反义区具有与靶基因的核苷酸序列或其部分互补的核苷酸序列，且进一步包含有义区，其中所述有义区包含与所述靶基因的核苷酸序列或其部分基本上类似的核苷酸序列。在其的一个实施方案中，反义区和有义区包含约18个-约38个核苷酸，其中所述反义区包含与有义区的核苷酸互补的至少约18个核苷酸。在其的一个实施方案中，有义区中的嘧啶核苷酸是2′-O-甲基嘧啶核苷酸。在其的另一个实施方案中，有义区中的嘌呤核苷酸是2′-脱氧嘌呤核苷酸。在其的另外一个实施方案中，有义区中存在的嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟嘧啶核苷酸。在其的另一个实施方案中，所述反义区中的嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟嘧啶核苷酸。在其的另外一个实施方案中，所述反义区中的嘌呤核苷酸是2′-O-甲基嘌呤核苷酸。在其的另外一个实施方案中，所述反义区中存在的嘌呤核苷酸包含2′-脱氧嘌呤核苷酸。在另一个实施方案中，反义区包含在所述反义区的3′末端处的硫代磷酸酯核苷酸间键。在另一个实施方案中，反义区包含在所述反义区的3′末端处的甘油基修饰。

在其他实施方案中，包含经修饰的核苷酸以减少siNA分子的免疫刺激性质的siNA分子可以包含本文描述的siNA分子的任何结构特征。在其他实施方案中，包含经修饰的核苷酸以减少siNA分子的免疫刺激性质的siNA分子可以包含本文描述的siNA分子的任何化学修饰。

在一个实施方案中，本发明的特征在于用于产生化学合成的双链siNA分子的方法，所述双链siNA分子具有化学修饰的核苷酸以减少siNA分子的免疫刺激性质，其包括(a)在siNA分子中引入一个或多个经修饰的核苷酸，和(b)在这样的条件下测定步骤(a)的siNA分子，与具有未修饰的核苷酸的相应siNA分子相比较，所述条件适合于分离具有减少的免疫刺激性质的siNA分子。siNA分子的每条链长度为约18个-约38个核苷酸。siNA分子的一条链包含与靶RNA具有足够互补性的核苷酸序列，用于siNA分子经由RNA干扰指导靶RNA切割。在一个实施方案中，减少的免疫刺激性质包含响应于引入细胞、组织或生物中的siNA，炎性或促炎细胞因子例如白细胞介素(IL-6)或肿瘤坏死α(TNF-α)取消的或减少的诱导。在另一个实施方案中，减少的免疫刺激性质包含响应于引入细胞、组织或生物中的siNA，Toll样受体(TLRs)例如TLR3、TLR7、TLR8或TLR9取消的或减少的诱导。在另一个实施方案中，减少的免疫刺激性质包含响应于引入细胞、组织或生物中的siNA，干扰素例如干扰素α取消的或减少的诱导。

在一个实施方案中，本发明的特征在于介导针对靶多核苷酸的RNAi的siNA构建体，其中所述siNA构建体包含本文描述的一个或多个化学修饰，其调节siNA构建体的有义和反义链之间的结合亲和力。

在另一个实施方案中，本发明的特征在于用于产生在siNA分子的有义和反义链之间具有增加的结合亲和力的siNA分子的方法，其包括(a)将具有式I-VII中任何一个或其任何组合的核苷酸引入siNA分子内，和(b)在适合于分离在siNA分子的有义和反义链之间具有增加的结合亲和力的siNA分子的条件下，测定步骤(a)的siNA分子。

在一个实施方案中，本发明的特征在于介导针对靶多核苷酸的RNAi的siNA构建体，其中所述siNA构建体包含本文描述的一个或多个化学修饰，其调节siNA构建体的反义链和细胞内的互补靶RNA序列之间的结合亲和力。

在一个实施方案中，本发明的特征在于介导针对靶多核苷酸的RNAi的siNA构建体，其中所述siNA构建体包含本文描述的一个或多个化学修饰，其调节siNA构建体的反义链和细胞内的互补靶DNA序列之间的结合亲和力。

在另一个实施方案中，本发明的特征在于用于产生在siNA分子的反义链和互补靶RNA序列之间具有增加的结合亲和力的siNA分子的方法，其包括(a)将具有式I-VII中任何一个或其任何组合的核苷酸引入siNA分子内，和(b)在适合于分离在siNA分子的反义链和互补靶RNA序列之间具有增加的结合亲和力的siNA分子的条件下，测定步骤(a)的siNA分子。

在另一个实施方案中，本发明的特征在于用于产生在siNA分子的反义链和互补靶DNA序列之间具有增加的结合亲和力的siNA分子的方法，其包括(a)将具有式I-VII中任何一个或其任何组合的核苷酸引入siNA分子内，和(b)在适合于分离在siNA分子的反义链和互补靶DNA序列之间具有增加的结合亲和力的siNA分子的条件下，测定步骤(a)的siNA分子。

在一个实施方案中，本发明的特征在于介导针对靶多核苷酸的RNAi的siNA构建体，其中所述siNA构建体包含本文描述的一个或多个化学修饰，其调节能够产生另外的内源siNA分子的细胞聚合酶的聚合酶活性，所述内源siNA分子与化学修饰的siNA构建体具有序列同源性。

在另一个实施方案中，本发明的特征在于用于产生能够介导细胞聚合酶增加的聚合酶活性的siNA分子的方法，所述细胞聚合酶能够产生与化学修饰的siNA分子具有序列同源性的另外的内源siNA分子，所述方法包括(a)将具有式I-VII中任何一个或其任何组合的核苷酸引入siNA分子内，和(b)在适合于分离能够介导细胞聚合酶增加的聚合酶活性的siNA分子的条件下，测定步骤(a)的siNA分子，所述细胞聚合酶能够产生与化学修饰的siNA分子具有序列同源性的另外的内源siNA分子。

在一个实施方案中，本发明的特征在于介导针对细胞中靶多核苷酸的RNAi的化学修饰的siNA构建体，其中所述化学修饰不以降低经由此类siNA构建体介导的RNAi的功效的方式显著影响siNA与靶RNA分子、DNA分子和/或蛋白质或对于RNAi所必需的其他因子的相互作用。

在另一个实施方案中，本发明的特征在于用于产生具有针对多核苷酸靶改善的RNAi特异性的siNA分子的方法，其包括(a)将具有式I-VII中任何一个或其任何组合的核苷酸引入siNA分子内，和(b)在适合于分离具有改善的RNAi特异性的siNA分子的条件下，测定步骤(a)的siNA分子。在一个实施方案中，改善的特异性包含与未修饰的siNA分子相比较具有减少的脱靶效应。例如，在本发明的siNA分子的有义链或区的3′-末端、5′-末端、或3′和5′-末端处引入末端帽部分可以指导siNA具有改善的特异性，其通过阻止有义链或有义区充当用于针对相应靶的RNAi活性的模板实现，所述相应靶与有义链或有义区具有互补性。

在另一个实施方案中，本发明的特征在于用于产生具有针对靶多核苷酸改善的RNAi活性的siNA分子的方法，其包括(a)将具有式I-VII中任何一个或其任何组合的核苷酸引入siNA分子内，和(b)在适合于分离具有改善的RNAi活性的siNA分子的条件下，测定步骤(a)的siNA分子。

在另外一个实施方案中，本发明的特征在于用于产生具有针对靶RNA改善的RNAi活性的siNA分子的方法，其包括(a)将具有式I-VII中任何一个或其任何组合的核苷酸引入siNA分子内，和(b)在适合于分离具有针对靶RNA改善的RNAi活性的siNA分子的条件下，测定步骤(a)的siNA分子。

在另外一个实施方案中，本发明的特征在于用于产生具有针对靶DNA改善的RNAi活性的siNA分子的方法，其包括(a)将具有式I-VII中任何一个或其任何组合的核苷酸引入siNA分子内，和(b)在适合于分离具有针对靶DNA改善的RNAi活性的siNA分子的条件下，测定步骤(a)的siNA分子。

在一个实施方案中，本发明的特征在于介导针对靶多核苷酸的RNAi的siNA构建体，其中所述siNA构建体包含本文描述的一个或多个化学修饰，其调节siNA构建体例如siNA的胆固醇缀合物的细胞摄取。

在另一个实施方案中，本发明的特征在于用于产生具有改善的细胞摄取的针对靶多核苷酸的siNA分子的方法，其包括(a)将具有式I-VII中任何一个或其任何组合的核苷酸引入siNA分子内，和(b)在适合于分离具有改善的细胞摄取的siNA分子的条件下，测定步骤(a)的siNA分子。

在一个实施方案中，本发明的特征在于介导针对靶多核苷酸的RNAi的siNA构建体，其中所述siNA构建体包含本文描述的一个或多个化学修饰，其增加siNA构建体的生物利用率，例如通过附着改善siNA构建体的药物代谢动力学的聚合缀合物例如聚乙二醇或等价缀合物，或通过附着在体内靶向特定组织类型或细胞类型的缀合物。此类缀合物的非限制性例子在引入本文作为参考的Vargeese等人，美国系列号10/201,394中得到描述。

在一个实施方案中，本发明的特征在于用于产生具有改善的生物利用率的本发明siNA分子的方法，其包括(a)将缀合物引入siNA分子的结构内，和(b)在适合于分离具有改善的生物利用率的siNA分子的条件下，测定步骤(a)的siNA分子。此类缀合物可以包括关于细胞受体的配体，例如衍生自天然存在的蛋白质配体的肽；蛋白质定位序列，包括细胞ZIP编码序列；抗体；核酸适体；维生素和其他辅因子，例如叶酸和N-乙酰半乳糖胺；聚合物，例如聚乙二醇(PEG)；磷脂；胆固醇；胆固醇衍生物，聚胺，例如精胺或亚精胺；等。

在一个实施方案中，本发明的特征在于双链短干扰核酸(siNA)分子，其包括与靶RNA序列或其部分互补的第一种核苷酸序列，和与所述第一种序列具有互补性的第二种序列，其中所述第二种序列以不能再充当引导序列用于有效介导RNA干扰和/或由促进RNAi的细胞蛋白质识别的方式进行化学修饰。在一个实施方案中，siNA的第一种核苷酸序列如本文所描述的进行化学修饰。在一个实施方案中，siNA的第一种核苷酸序列未修饰(例如，是全RNA)。

在一个实施方案中，本发明的特征在于双链短干扰核酸(siNA)分子，其包括与靶RNA序列或其部分互补的第一种核苷酸序列，和与所述第一种序列具有互补性的第二种序列，其中所述第二种序列以阻止其进入RNAi途径作为引导序列或作为与靶核酸(例如，RNA)序列互补的序列的方式进行设计或修饰。在一个实施方案中，siNA的第一种核苷酸序列如本文所描述的进行化学修饰。在一个实施方案中，siNA的第一种核苷酸序列未修饰(例如，是全RNA)。此类设计或修饰预期增强siNA的活性和/或改善本发明的siNA分子的特异性。这些修饰还预期使任何脱靶效应和/或相关毒性降到最低。

在一个实施方案中，本发明的特征在于双链短干扰核酸(siNA)分子，其包括与靶RNA序列或其部分互补的第一种核苷酸序列，和与所述第一种序列具有互补性的第二种序列，其中所述第二种序列不能充当引导序列用于介导RNA干扰。在一个实施方案中，siNA的第一种核苷酸序列如本文所描述的进行化学修饰。在一个实施方案中，siNA的第一种核苷酸序列未修饰(例如，是全RNA)。

在一个实施方案中，本发明的特征在于双链短干扰核酸(siNA)分子，其包括与靶RNA序列或其部分互补的第一种核苷酸序列，和与所述第一种序列具有互补性的第二种序列，其中所述第二种序列没有末端5′-羟基(5′-OH)或5′-磷酸基。

在一个实施方案中，本发明的特征在于双链短干扰核酸(siNA)分子，其包括与靶RNA序列或其部分互补的第一种核苷酸序列，和与所述第一种序列具有互补性的第二种序列，其中所述第二种序列包含在所述第二种序列的5′-末端处的末端帽部分。在一个实施方案中，末端帽部分包含反向脱碱基、反向脱氧脱碱基、反向核苷酸部分、图7中显示的基团、烷基或环烷基、杂环、或阻止其中第二种序列充当引导序列或关于RNAi的模板的RNAi活性的任何其他基团。

在一个实施方案中，本发明的特征在于双链短干扰核酸(siNA)分子，其包括与靶RNA序列或其部分互补的第一种核苷酸序列，和与所述第一种序列具有互补性的第二种序列，其中所述第二种序列包含在所述第二种序列的5′-末端和3′-末端处的末端帽部分。在一个实施方案中，每个末端帽部分个别地包含反向脱碱基、反向脱氧脱碱基、反向核苷酸部分、图7中显示的基团、烷基或环烷基、杂环、或阻止其中第二种序列充当引导序列或关于RNAi的模板的RNAi活性的任何其他基团。

在一个实施方案中，本发明的特征在于用于产生具有关于下调或抑制靶核酸(例如DNA或RNA，例如基因或其相应的RNA)的表达改善的特异性的本发明siNA分子的方法，所述方法包括(a)将一个或多个化学修饰引入siNA分子的结构内，和(b)在适合于分离具有改善的特异性的siNA分子的条件下，测定步骤(a)的siNA分子。在另一个实施方案中，用于改善特异性的化学修饰包含在siNA分子的5′-末端、3′-末端、或5′和3′-末端处的末端帽修饰。末端帽修饰可以包含例如，图7中显示的结构(例如反向脱氧脱碱基部分)，或使得siNA分子的部分(例如有义链)不能介导针对脱靶核酸序列的RNA干扰的化学修饰。在非限制性例子中，siNA分子被这样设计，从而使得只有siNA分子的反义序列可以充当引导序列用于RISC介导的相应靶RNA序列的降解。这可以通过经由向有义链中引入化学修饰使得siNA的有义序列无活性来完成，所述化学修饰阻碍有义链被识别为经由RNAi机器的引导序列。在一个实施方案中，此类化学修饰包含在siNA的有义链的5′-末端处的任何化学基团，或用于使得有义链作为用于介导RNA干扰的引导序列无活性的任何其他基团。这些修饰例如可以导致其中有义链的5′-末端不再具有游离的5′-羟基(5′-OH)或游离的5′-磷酸基(例如，磷酸、二磷酸、三磷酸、环磷酸等)的分子。此类siNA构建体的非限制性例子在本文中得到描述，例如“Stab 9/10”、“Stab 7/8”、“Stab 7/19”、“Stab17/22”、“Stab 23/24”、“Stab 24/25”和“Stab 24/26”(例如，具有Stab 7、9、17、23或24有义链的任何siNA)化学物及其变体(参见表8)，其中siNA的有义链的5′-末端和3′-末端不包含羟基或磷酸基。在本文中，数字化的Stab化学物包括表8中所示化学物的2′-氟和2′-OCF3形式。例如，“Stab 7/8”指Stab 7/8和Stab 7F/8F等。

在一个实施方案中，本发明的特征在于用于产生具有关于下调或抑制ENaC靶核酸(例如DNA或RNA，例如ENaC基因或其相应编码和/或非编码RNA)的表达改善的特异性的本发明siNA分子的方法，所述方法包括将一个或多个化学修饰引入siNA分子的结构内，所述化学修饰阻止siNA分子的链或部分充当关于RNAi活性的模板或引导序列。在一个实施方案中，siNA分子的无活性链或有义区是siNA分子的有义链或有义区，即siNA的链或区与靶核酸序列没有互补性。在一个实施方案中，此类化学修饰包含在siNA的有义链或区的5′-末端处不包含5′-羟基(5′-OH)或5′-磷酸基的任何化学基团，或用于使得有义链或有义区作为用于介导RNA干扰的引导序列无活性的任何其他基团。此类siNA构建体的非限制性例子在本文中得到描述，例如“Stab 9/10”、“Stab7/8”、“Stab 7/19”、“Stab 17/22”、“Stab 23/24”、“Stab 24/25”和“Stab 24/26”(例如，具有Stab 7、9、17、23或24有义链的任何siNA)化学物及其变体(参见表8)，其中siNA的有义链的5′-末端和3′-末端不包含羟基或磷酸基。在本文中，数字化的Stab化学物包括表8中所示化学物的2′-氟和2′-OCF3形式。例如，“Stab 7/8”指Stab 7/8和Stab 7F/8F等。

在一个实施方案中，本发明的特征在于用于筛选在介导针对靶核酸序列的RNA干扰中有活性的siNA分子的方法，其包括(a)产生多个未修饰的siNA分子，(b)在适合于分离在介导针对靶核酸序列的RNA干扰中有活性的siNA分子的条件下，筛选步骤(a)的siNA分子，和(c)将化学修饰(例如，如本文所描述的或如本领域其他方面已知的化学修饰)引入(b)的活性siNA分子内。在一个实施方案中，该方法进一步包括在适合于分离在介导针对靶核酸序列的RNA干扰中有活性的化学修饰的siNA分子的条件下，再次筛选步骤(c)的化学修饰的siNA分子。

在一个实施方案中，本发明的特征在于用于筛选在介导针对靶核酸序列的RNA干扰中有活性的化学修饰的siNA分子的方法，其包括(a)产生多个化学修饰的siNA分子(例如，如本文所描述的或如本领域其他方面已知的siNA分子)，和(b)在适合于分离在介导针对靶核酸序列的RNA干扰中有活性的化学修饰的siNA分子的条件下，筛选步骤(a)的siNA分子。

术语“配体”指任何化合物或分子，例如药物、肽、激素或神经递质，其能够与另一种化合物例如受体直接或间接地相互作用。与配体相互作用的受体可以存在于细胞表面上，或可替代地可以是细胞内和/或细胞间受体。配体与受体的相互作用可以导致生化反应，或可以仅仅是物理相互作用或结合。

在另一个实施方案中，本发明的特征在于用于产生具有改善的生物利用率的本发明siNA分子的方法，其包括(a)将赋形剂制剂引入siNA分子，和(b)在适合于分离具有改善的生物利用率的siNA分子的条件下，测定步骤(a)的siNA分子。此类赋形剂包括聚合物例如环糊精、脂质、阳离子脂质、聚胺、磷脂、纳米颗粒、受体、配体等。

在另一个实施方案中，本发明的特征在于用于产生具有改善的生物利用率的本发明siNA分子的方法，其包括(a)将具有式I-VII中任何一个或其任何组合的核苷酸引入siNA分子内，和(b)在适合于分离具有改善的生物利用率的siNA分子的条件下，测定步骤(a)的siNA分子。

在另一个实施方案中，聚乙二醇(PEG)可以与本发明的siNA化合物共价附着。附着的PEG可以是任何分子量，优选约100-约50,000道尔顿(Da)。

本发明可以单独或作为试剂盒的组分使用，所述试剂盒具有执行在体外或体内将RNA引入测试样品和/或受试者所必需的至少一种试剂。例如，试剂盒的优选组分包括本发明的siNA分子和如本文所描述的促进siNA引入目的细胞内的媒介物(例如，使用脂质和本领域已知的其他转染方法，参见例如Beigelman等人，US 6,395,713)。该试剂盒可以例如在确定基因功能和/或活性，或在药物最优化中，和在药物发现中用于靶确认(参见例如Usman等人，USSN 60/402,996)。此类试剂盒还可以包括说明书以允许试剂盒用户实践本发明。

如本文所使用的，术语“短干扰核酸”、“siNA”、“短干扰RNA”、“siRNA”、“短干扰核酸分子”、“短干扰寡核苷酸分子”或“化学修饰的短干扰核酸分子”指能够通过介导RNA干扰“RNAi”或基因沉默以序列特异性方式抑制或下调基因表达或病毒复制的任何核酸分子。这些术语可以指单个核酸分子、多个此类核酸分子、或此类核酸分子库。siNA可以是包含自互补的有义和反义区的双链核酸分子，其中所述反义区包含与靶核酸分子中的核苷酸序列或其部分互补的核苷酸序列，且有义区具有对应于靶核酸序列或其部分的核苷酸序列。siNA可以由2个分开的寡核苷酸装配，其中一条链是有义链而另一条是反义链，其中所述反义和有义链是自互补的(即，每条链包含与另一条链中的核苷酸序列互补的核苷酸序列；例如其中反义链和有义链形成双链体或双链结构，例如其中双链区为约15个-约30个，例如约15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个碱基对；反义链包含与靶核酸分子中的核苷酸序列或其部分互补的核苷酸序列，且有义链包含对应于靶核酸序列或其部分的核苷酸序列(例如，siNA分子的约15个-约25个或更多核苷酸与靶核酸或其部分互补)。可替代地，siNA由单个寡核苷酸装配，其中所述siNA的自互补的有义和反义区通过一种或多种基于核酸或非基于核酸的接头进行连接。siNA可以是具有双链体、不对称的双链体、发夹或不对称的发夹二级结构、具有自互补的有义和反义区的多核苷酸，其中所述反义区包含与分开的靶核酸分子中的核苷酸序列或其部分互补的核苷酸序列，且有义区具有对应于靶核酸序列或其部分的核苷酸序列。siNA可以是具有2个或更多环结构和包含自互补的有义和反义区的茎的环状单链多核苷酸，其中所述反义区包含与靶核酸分子中的核苷酸序列或其部分互补的核苷酸序列，且有义区具有对应于靶核酸序列或其部分的核苷酸序列，且其中环状多核苷酸可以在体内或体外进行加工以产生能够介导RNAi的活性siNA分子。siNA还可以包含具有与靶核酸分子中的核苷酸序列或其部分互补的核苷酸序列的单链多核苷酸(例如，其中此类siNA分子不需要在siNA分子内存在对应于靶核酸序列或其部分的核苷酸序列)，其中所述单链多核苷酸可以进一步包含末端磷酸基，例如5′-磷酸(参见例如Martinez等人，2002，Cell.，110，563-574和Schwarz等人，2002，Molecular Cell，10，537-568)或5’，3’-二磷酸。在某些实施方案中，本发明的siNA分子包含分开的有义和反义序列或区，其中所述有义和反义区通过如本领域已知的核苷酸或非核苷酸接头分子进行共价连接，或可替代地通过离子相互作用、氢键合、范德瓦尔斯(van der waals)相互作用、疏水作用和/或堆积相互作用进行非共价连接。在某些实施方案中，本发明的siNA分子包含与靶基因的核苷酸序列互补的核苷酸序列。在另一个实施方案中，本发明的siNA分子以引起靶基因表达抑制的方式与靶基因的核苷酸序列相互作用。如本文所使用的，siNA分子无需限于仅包含RNA的那些分子，而是进一步包含化学修饰的核苷酸和非核苷酸。在某些实施方案中，本发明的短干扰核酸分子缺乏含2′-羟基(2′-OH)的核苷酸。申请人在某些实施方案中描述了不需要存在具有2′-羟基的核苷酸用于介导RNAi的短干扰核酸，并且照这样，本发明的短干扰核酸分子任选地不包括任何核糖核苷酸(例如，具有2′-OH基团的核苷酸)。然而，在siNA分子内不需要存在核糖核苷酸以支持RNAi的此类siNA分子可以具有一种或多种附着的接头或其他附着或结合的基团、部分、或包含一个或多个具有2′-OH基团的核苷酸的链。任选地，siNA分子可以在约5、10、20、30、40或50％的核苷酸位置处包含核糖核苷酸。本发明的经修饰的短干扰核酸分子还可以称为短干扰经修饰的寡核苷酸“siMON”。如本文所使用的，术语siNA意欲等价于用于描述能够介导序列特异性RNAi的核酸分子的其他术语，例如短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微小RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)、短干扰寡核苷酸、短干扰核酸、短干扰经修饰的寡核苷酸、化学修饰的siRNA、转录后基因沉默RNA(ptgsRNA)等。本发明的siNA分子的非限制性例子显示于本文的图4-6、以及表1a和1b中。此类siNA分子不同于本领域已知的介导基因表达抑制的其他核酸技术，例如核酶、反义、三链体形成、适体、2，5-A嵌合体或诱饵寡核苷酸。

“RNA干扰”或“RNAi”意指如本领域一般已知的且由短干扰核酸分子介导的抑制或下调细胞中的基因表达的生物过程，参见例如Zamore和Haley，2005，Science，309，1519-1524；Vaughn和Martienssen，2005，Science，309，1525-1526；Zamore等人，2000，Cell，101，25-33；Bass，2001，Nature，411，428-429；Elbashir等人，2001，Nature，411，494-498；和Kreutzer等人，国际PCT公开号WO00/44895；Zernicka-Goetz等人，国际PCT公开号WO 01/36646；Fire，国际PCT公开号WO 99/32619；Plaetinck等人，国际PCT公开号WO00/01846；Mello和Fire，国际PCT公开号WO 01/29058；Deschamps-Depaillette，国际PCT公开号WO 99/07409；和Li等人，国际PCT公开号WO 00/44914；Allshire，2002，Science，297，1818-1819；Volpe等人，2002，Science，297，1833-1837；Jenuwein，2002，Science，297，2215-2218；和Hall等人，2002，Science，297，2232-2237；Hutvagner和Zamore，2002，Science，297，2056-60；McManus等人，2002，RNA，8，842-850；Reinhart等人，2002，Gene & Dev.，16，1616-1626；和Reinhart和Bartel，2002，Science，297，1831)。此外，如本文所使用的，术语RNAi意欲等价于用于描述序列特异性RNA干扰的其他术语，例如转录后基因沉默、翻译抑制、转录抑制或表观遗传学(epigenetics)。例如，本发明的siNA分子可以用于在转录后水平或转录前水平上表观遗传地沉默基因。在非限制性例子中，基因表达经由本发明的siNA分子的表观遗传调节可以起因于siNA介导的染色质结构的修饰或甲基化模式以改变基因表达(参见，例如，Verdel等人，2004，Science，303，672-676；Pal-Bhadra等人，2004，Science，303，669-672；Allshire，2002，Science，297，1818-1819；Volpe等人，2002，Science，297，1833-1837；Jenuwein，2002，Science，297，2215-2218；和Hall等人，2002，Science，297，2232-2237)。在另一个非限制性例子中，基因表达经由本发明的siNA分子的调节可以起因于siNA经由RISC介导的RNA(编码或非编码RNA)切割，或可替代地，如本领域已知的翻译抑制。在另一个实施方案中，基因表达经由本发明的siNA分子的调节可以起因于转录抑制(参见例如Janowski等人，2005，Nature Chemical Biology，1，216-222)。

在一个实施方案中，本发明的siNA分子是双链体形成寡核苷酸“DFO”，(参见例如图11-12以及于2003年12月3日提交的Vaish等人，USSN 10/727,780和于2004年5月24日提交的国际PCT申请号US04/16390)。

在一个实施方案中，本发明的siNA分子是多功能siNA(参见例如图13-25以及于2004年2月10日提交的Jadhav等人，USSN60/543,480和于2004年5月24日提交的国际PCT申请号US04/16390)。在一个实施方案中，本发明的多功能siNA可以包括靶向例如ENaCRNA的2个或更多个区域的序列(参见例如表1a和1b中的靶序列)。在一个实施方案中，本发明的多功能siNA可以包括靶向选自表1a和1b中的ENaC靶序列的任何ENaC靶或其任何同种型或其任何组合的序列。

如本文所使用的，“不对称发夹”意指包含反义区、可以包含核苷酸或非核苷酸的环部分、和有义区的线性siNA分子，所述有义区包含比反义区更少的核苷酸，其程度至有义区具有足够的互补核苷酸以与反义区碱基配对且形成具有环的双链体。例如，本发明的不对称的发夹siNA分子可以包含具有足够的长度以在细胞或体外系统中介导RNAi的反义区(例如约15个-约30个，或约15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个核苷酸)和包含约4个-约12个(例如，约4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个或12个)核苷酸的环区域、和具有与反义区互补的约3个-约25个(例如，约3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个或25个)核苷酸的有义区。不对称的发夹siNA分子还可以包含5′-末端磷酸基，其可以是化学修饰的。不对称的发夹siNA分子的环部分可以包含如本文所描述的核苷酸、非核苷酸、接头分子或缀合分子。

如本文所使用的，“不对称的双链体”意指具有2条分开的链的siNA分子，所述链包含有义区和反义区，其中所述有义区包含比反义区更少的核苷酸，其程度至有义区具有足够的互补核苷酸以与反义区碱基配对且形成双链体。例如，本发明的不对称的双链体siNA分子可以包含具有足够的长度以在细胞或体外系统中介导RNAi的反义区(例如约15个-约30个，或约15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个核苷酸)、和具有与反义区互补的约3个-约25个(例如，约3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个或25个)核苷酸的有义区。

“RNAi抑制剂”意指可以在细胞或生物中下调、减少或抑制RNA干扰功能或活性的任何分子。RNAi抑制剂可以下调、减少或抑制RNAi(例如RNAi介导的靶多核苷酸的切割、翻译抑制或转录沉默)，其通过与RNAi途径的任何组分相互作用或干扰RNAi途径的任何组分的功能实现，所述组分包括蛋白质组分例如RISC、或核酸组分例如miRNA或siRNA。RNAi抑制剂可以是siNA分子，反义分子，适体，或者与RISC、miRNA、或siRNA或细胞或生物中的RNAi途径的任何其他组分相互作用、或干扰RISC、miRNA、或siRNA或细胞或生物中的RNAi途径的任何其他组分的功能的小分子。通过抑制RNAi(例如RNAi介导的靶多核苷酸的切割、翻译抑制或转录沉默)，本发明的RNAi抑制剂可以用于调节(例如上调或下调)靶基因的表达。在一个实施方案中，本发明的RNA抑制剂经由翻译抑制、转录沉默、或RISC介导的多核苷酸(例如，mRNA)的切割，通过干扰(例如减少或阻止)基因表达的内源性下调或抑制用于上调基因表达。通过干扰基因表达的内源阻抑、沉默或抑制机制，本发明的RNAi抑制剂因而可以用于上调基因表达以治疗起因于功能丧失的疾病、性状或状况。在一个实施方案中，术语“RNAi抑制剂”用于代替本文的各种实施方案中的术语“siNA”，例如具有增加基因表达的作用用于治疗功能丧失疾病、性状和/或状况。

如本文所使用的，“适体”或“核酸适体”意指与靶分子特异性结合的多核苷酸，其中核酸分子具有与由靶分子在其天然背景中识别的序列不同的序列。可替代地，适体可以是与靶分子结合的核酸分子，其中靶分子不与核酸天然结合。靶分子可以是任何目的分子。例如，适体可以用于与蛋白质的配体结合结构域结合，从而阻止天然存在的配体与蛋白质的相互作用。这是非限制性例子，并且本领域技术人员将认识到使用本领域一般已知的技术可以容易地产生其他实施方案，参见例如Gold等人，1995，Annu.Rev.Biochem.，64，763；Brody和Gold，2000，J.Biotechnol.，74，5；Sun，2000，Curr.Opin.Mol.Ther.，2，100；Kusser，2000，J.Biotechnol.，74，27；Hermann和Patel，2000，Science，287，820；和Jayasena，1999，Clinical Chemistry，45，1628。本发明的适体分子可以如本领域一般已知的或如本文描述的进行化学修饰。

如本文所使用的，术语“反义核酸”指这样的核酸分子，其通过RNA-RNA或RNA-DNA或RNA-PNA(蛋白质核酸；Egholm等人，1993Nature 365，566)相互作用与靶RNA结合，并且通过空间相互作用或通过RNA酶H介导的靶识别改变靶RNA的活性(关于综述，参见Stein和Cheng，1993 Science 261，1004和Woolf等人，美国专利号5,849,902)。一般地，反义分子沿着反义分子的单个邻接序列与靶序列互补。然而，在某些实施方案中，反义分子可以与底物结合，从而使得底物分子形成环，和/或反义分子可以结合，从而使得反义分子形成环。因此，反义分子可以与2个(或甚至更多)非邻接的底物序列互补，或反义分子的2个(或甚至更多)非邻接的序列部分可以与靶序列或2者互补。关于目前的反义策略的综述，参见Schmajuk等人，1999，J.Biol.Chem.，274，21783-21789，Delihas等人，1997，Nature，15，751-753，Stein等人，1997，Antisense N.A.Drug Dev.，7，151，Crooke，2000，Methods Enzymol.，313，3-45；Crooke，1998，Biotech.Genet.Eng.Rev.，15，121-157，Crooke，1997，Ad.Pharmacol.，40，1-49。此外，由2’-MOE和如本领域已知的其他修饰进行修饰的反义DNA或反义可以通过DNA-RNA相互作用用于靶向RNA，从而激活RNA酶H，所述RNA酶H消化双链体中的靶RNA。反义寡核苷酸可以包含一个或多个RNA酶H激活区，其能够激活靶RNA的RNA酶H切割。反义DNA可以经由使用单链DNA表达载体或其等价物进行化学合成或表达。本发明的反义分子可以如本领域一般已知的或如本文描述的进行化学修饰。

“调节”意指基因表达、或编码一种或多种蛋白质或蛋白质亚基的RNA分子或等价RNA分子的水平、或一种或多种蛋白质或蛋白质亚基的活性得到上调或下调，从而使得表达、水平或活性大于或小于在不存在调节剂的情况下观察到的那种。例如，术语“调节”可以意指“抑制”，但措辞“调节”的用途不限于这个定义。

“抑制”、“下调”或“减少”意指基因表达、或编码一种或多种蛋白质或蛋白质亚基的RNA分子或等价RNA分子的水平、或一种或多种蛋白质或蛋白质亚基的活性减少低于在不存在本发明的核酸分子(例如，siNA)的情况下观察到的那种。在一个实施方案中，由siNA分子的抑制、下调或减少低于在无活性或减弱的分子的存在下观察到的那种水平。在另一个实施方案中，由siNA分子的抑制、下调或减少低于在例如具有杂乱序列或具有错配的siNA分子的存在下观察到的那种水平。在另一个实施方案中，由本发明的核酸分子抑制、下调或减少基因表达在核酸分子的存在下大于在不存在其的情况下。在一个实施方案中，基因表达的抑制、下调或减少与转录后沉默，例如RNAi介导的靶核酸分子(例如RNA)切割或翻译抑制相关。在一个实施方案中，基因表达的抑制、下调或减少与转录前沉默相关，例如通过DNA甲基化模式和DNA染色质结构中的改变。

“上调”或“促进”意指基因表达、或编码一种或多种蛋白质或蛋白质亚基的RNA分子或等价RNA分子的水平、或一种或多种蛋白质或蛋白质亚基的活性增加高于在不存在本发明的核酸分子(例如，siNA)的情况下观察到的那种。在一个实施方案中，由siNA分子上调或促进基因表达高于在无活性或减弱的分子的存在下观察到的那种水平。在另一个实施方案中，由siNA分子上调或促进基因表达高于在例如具有杂乱序列或具有错配的siNA分子的存在下观察到的那种水平。在另一个实施方案中，由本发明的核酸分子上调或促进基因表达在核酸分子的存在下大于在不存在其的情况下。在一个实施方案中，基因表达的上调或促进与RNA介导的基因沉默抑制相关，例如RNAi介导的编码或非编码RNA靶的切割或沉默，其下调、抑制或沉默待上调的目的基因的表达。基因表达的下调可以例如由编码RNA或其编码的蛋白质进行诱导，例如通过负反馈或拮抗作用。基因表达的下调可以例如由对目的基因具有调节控制的非编码RNA进行诱导，例如经由翻译抑制、染色质结构、甲基化、RISC介导的RNA切割或翻译抑制通过沉默基因表达。照这样，下调、抑制或沉默目的基因的靶的抑制或下调可以用于上调或促进目的基因朝向治疗用途表达。

在一个实施方案中，本发明的RNAi抑制剂通过抑制RNAi或基因沉默用于上调基因表达。例如，本发明的RNAi抑制剂通过上调基因表达可以用于治疗功能丧失疾病和状况，例如在其中特定基因的一个等位基因具有导致由突变等位基因编码的蛋白质功能丧失的突变(例如，移码、错义或无义突变)的单倍性不足情况下。在此类情况下，RNAi抑制剂可以用于上调由野生型或功能等位基因编码的蛋白质表达，从而通过补偿突变体或无效等位基因校正单倍性不足。在另一个实施方案中，本发明的siNA分子用于下调功能等位基因的毒性获得的表达，而本发明的RNAi抑制剂伴随地用于上调野生型或功能等位基因的表达，例如在本文或本领域其他方面已知的疾病、性状或状况治疗中(参见例如Rhodes等人，2004，PNAS USA，101：11147-11152和Meisler等人2005，The Journal of Clinical Investigation，115：2010-2017)。

“基因”、或“靶基因”或“靶DNA”意指编码RNA的核酸，例如核酸序列，包括但不限于编码多肽的结构基因。基因或靶基因还可以编码功能RNA(fRNA)或非编码RNA(ncRNA)，例如小时序RNA(stRNA)、微小RNA(miRNA)、小核RNA(snRNA)、短干扰RNA(siRNA)、核仁小RNA(snRNA)、核糖体RNA(rRNA)、转移RNA(tRNA)及其前体RNA。此类非编码RNA可以充当在调节涉及功能或调节性细胞过程的fRNA或ncRNA活性中siNA介导的RNA干扰的靶核酸分子。导致疾病的异常fRNA或ncRNA活性因此可以通过本发明的siNA分子进行调节。靶向fRNA和ncRNA的siNA分子也可以用于操作或改变受试者、生物或细胞的基因型或表型，其通过干预细胞过程例如遗传印记、转录、翻译或核酸加工(例如，转氨基作用、甲基化等)实现。靶基因可以是衍生自细胞、内源基因、转基因或外源基因的基因，所述外源基因例如在感染其后存在于细胞中的病原体例如病毒的基因。包含靶基因的细胞可以衍生自或包含在任何生物中，例如植物、动物、原生动物、病毒、细菌或真菌。植物的非限制性例子包括单子叶植物、双子叶植物或裸子植物。动物的非限制性例子包括脊椎动物或无脊椎动物。真菌的非限制性例子包括霉菌或酵母。关于综述，参见例如Snyder和Gerstein，2003，Science，300，258-260。

“非规范碱基对”意指任何非沃森克里克碱基对，例如错配和/或摆动碱基对，包括翻转错配(flipped mismatches)、单氢键错配、反式类型错配、三碱基相互作用和四碱基相互作用。此类非规范碱基对的非限制性例子包括但不限于：AC反Hoogsteen、AC摆动、AU反Hoogsteen、GU摆动、AA N7氨基、CC 2-羰基-氨基(H1)-N3-氨基(H2)、GA剪切、UC 4-羰基-氨基、UU亚氨基-羰基、AC反摆动、AU Hoogsteen、AU反沃森克里克、CG反沃森克里克、CG N3-氨基-氨基N3、AA N1-氨基对称、AA N7-氨基对称、GA N7-N1氨基-羰基、GA+羰基-氨基N7-N 1、GG N1-羰基对称、GG N3-氨基对称、CC羰基-氨基对称、CC N3-氨基对称、UU 2-羰基-亚氨基对称、UU 4-羰基-亚氨基对称、AA氨基-N3、AA N1-氨基、AC氨基2-羰基、AC N3-氨基、AC N7-氨基、AU氨基-4-羰基、AU N1-亚氨基、AU N3-亚氨基、AU N7-亚氨基、CC羰基-氨基、GA氨基-N1、GA氨基-N7、GA羰基-氨基、GA N3-氨基、GC氨基-N3、GC羰基-氨基、GC N3-氨基、GC N7-氨基、GG氨基-N7、GG羰基-亚氨基、GG N7-氨基、GU氨基-2-羰基、GU羰基-亚氨基、GU亚氨基-2-羰基、GU N7-亚氨基、psiU亚氨基-2-羰基、UC 4-羰基-氨基、UC亚氨基-羰基、UU亚氨基-4-羰基、AC C2-H-N3、GA羰基-C2-H、UU亚氨基-4-羰基2羰基-C5-H、AC氨基(A)N3(C)-羰基、GC亚氨基氨基-羰基、Gpsi亚氨基-2-羰基氨基-2-羰基和GU亚氨基氨基-2-羰基碱基对。

如本文使用的，“ENaC”意指任何上皮钠通道或ENaC蛋白质、肽或多肽，例如编码α(SCNN1A)、β(SCNN1B)或γ(SCNN1G)亚单位序列的基因，包括通过表7中所示的GenBank登记号提及的那些序列。本文提及“ENaC”包括α(SCNN1A)、β(SCNN1B)或γ(SCNN1G)亚单位序列中的任何或所有。在一个优选实施方案中，本发明的特征在于一种或多种siNA分子和/或RNAi抑制剂和方法，其独立或组合地调节编码α(SCNN1A)亚单位的一种或多种ENaC基因的表达。术语ENaC还指编码任何ENaC蛋白质、肽或多肽的核酸，例如编码α(SCNN1A)、β(SCNN1B)或γ(SCNN1G)亚单位序列的核酸，包括通过表7中所示的GenBank登记号提及的那些序列。术语“ENaC”还意欲包括其他ENaC编码序列，例如衍生自各种受试者或生物的ENaC序列，包括其他ENaC同工型、突变ENaC基因、ENaC基因的同种型、ENaC基因多态性和ENaC剪接变体。

如本文使用的，“靶”意指例如由表7中所示的GenBank登记号编码的任何ENaC蛋白质、肽或多肽的核酸。术语“靶”还指编码任何靶蛋白、肽或多肽的核酸序列或靶多核苷酸序列，例如由具有表7中显示的Genbank登记号的序列编码的蛋白质、肽或多肽。目的靶可以包括靶多核苷酸序列，例如靶DNA或靶RNA。术语“靶”还意欲包括其他序列，例如相异同工型、突变靶基因、靶多核苷酸的同种型、靶多态和非编码(例如，ncRNA、miRNA、stRNA、sRNA)或如本文所描述的其他调节多核苷酸序列。因此，在本发明的各种实施方案中，与靶RNA具有互补性的本发明的双链核酸分子(例如siNA)可以用于抑制或下调miRNA或其他ncRNA活性。在一个实施方案中，miRNA或ncRNA活性的抑制可以用于下调或抑制依赖于miRNA或ncRNA活性的基因表达(例如，本文描述的或本领域其他方面已知的基因靶)。在另一个实施方案中，通过与miRNA或ncRNA具有互补性的本发明的双链核酸分子(例如siNA)抑制miRNA或ncRNA活性可以用于上调或促进靶基因表达(例如，本文描述的或本领域其他方面已知的基因靶)，其中此类基因的表达通过miRNA或ncRNA得到下调、抑制或沉默。基因表达的此类上调可以用于治疗如本领域一般已知的与功能丧失或单倍性不足相关的疾病和状况。

“途径靶”意指涉及基因表达或活性途径的任何靶。例如，任何给定靶都可以具有相关途径靶，其可以包括生物途径中的上游、下游或修饰基因。这些途径靶基因可以在本文的疾病、状况和性状治疗中提供附加或协同作用。

在一个实施方案中，靶是任何靶RNA或其部分。

在一个实施方案中，靶是任何ENaC RNA或其部分。

在一个实施方案中，靶是任何ENaC DNA或其部分。

在一个实施方案中，靶是任何ENaC mRNA或其部分。

在一个实施方案中，靶是任何ENaC miRNA或其部分。

在一个实施方案中，靶是任何ENaC siRNA或其部分。

在一个实施方案中，靶是ENaC靶或其部分。

在一个实施方案中，靶是本文所述和/或表7中所示的任何ENaC(例如一个或多个)靶序列。在一个实施方案中，靶是表1a或1b中所示的任何(例如一个或多个)靶序列或其部分。在另一个实施方案中，靶是对应于表1a或1b中所示的任何(例如一个或多个)靶序列或其互补体或ENaC靶或其部分的siRNA、miRNA或stRNA。

在一个实施方案中，靶是表7中所示的任何ENaC(例如一个或多个)靶序列。在一个实施方案中，靶是表1a或1b中所示的任何(例如一个或多个)靶序列(例如SEQ ID NO：1、2、3和/或4)或其部分。在另一个实施方案中，靶是对应于表1a或1b中所示的任何(例如一个或多个)靶(例如SEQ ID NO：1、2、3和/或4)或其互补体或其部分的siRNA、miRNA或stRNA。在另一个实施方案中，靶是对应于本文或表7中所示的序列对应任何(例如一个或多个)序列的任何siRNA、miRNA或stRNA。

“同源序列”意指由一个或多个多核苷酸序列例如基因、基因转录物和/或非编码多核苷酸共享的核苷酸序列。例如，同源序列可以是由编码相关但不同的蛋白质的2个或更多基因共享的核苷酸序列，例如基因家族的不同成员，不同的蛋白质表位、不同的蛋白质同工型或完全趋异的基因，例如细胞因子及其相应受体。同源序列可以是由2种或更多非编码多核苷酸共享的核苷酸序列，例如非编码DNA或RNA、调节序列、内含子、和转录控制或调节位点。同源序列还可以包括由超过一种多核苷酸序列共享的保守序列区。同源性无需是完全同源性(例如，100％)，因为部分同源的序列也由本发明预期(例如，99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％、80％等)。

“保守序列区”意指多核苷酸中的一个或多个区域的核苷酸序列在世代之间或从一个生物系统、受试者或生物到另一个生物系统、受试者或生物没有明显变化。多核苷酸可以包括编码或非编码DNA和RNA。

“有义区”意指与siNA分子的反义区具有互补性的siNA分子的核苷酸序列。此外，siNA分子的有义区可以包含与靶核酸序列具有同源性的核酸序列。在一个实施方案中，siNA分子的有义区称为有义链或过客链。

“反义区”意指与靶核酸序列具有互补性的siNA分子的核苷酸序列。此外，siNA分子的反义区可以任选包含与siNA分子的有义区具有互补性的核酸序列。在一个实施方案中，siNA分子的反义区称为反义链或引导链。

“靶核酸”或“靶多核苷酸”意指其表达或活性待调节的任何核酸序列(例如，任何ENaC序列)。靶核酸可以是DNA或RNA。在一个实施方案中，本发明的靶核酸是靶RNA或DNA。

“互补性”意指核酸可以通过传统沃森-克里克或如本文所描述的其他非传统类型与另一种核酸序列形成一个或多个氢键。在一个实施方案中，本发明的双链核酸分子例如siNA分子，其中每条链长度为15个-30个核苷酸，包含双链核酸分子的2条链之间约10％-约100％(例如，约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％)的互补性。在另一个实施方案中，本发明的双链核酸分子例如siNA分子，其中一条链是有义链且另一条链是反义链，其中每条链长度为15个-30个核苷酸，包含在双链核酸分子的反义链中的核苷酸序列及其相应的靶核酸分子例如靶RNA或靶mRNA或病毒RNA的核苷酸序列之间至少约10％-约100％(例如，至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％)的互补性。在一个实施方案中，本发明的双链核酸分子例如siNA分子，其中一条链包含称为有义区的核苷酸序列且另一条链包含称为反义区的核苷酸序列，其中每条链长度为15个-30个核苷酸，包含在双链核酸分子的有义区和反义区之间约10％-约100％(例如，约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％)的互补性。提及本发明的核酸分子，关于核酸分子与其互补序列的结合自由能足以允许核酸的相关功能得以进行，例如RNAi活性。关于核酸分子的结合自由能的测定是本领域众所周知的(参见，例如，Turner等人，1987，CSH Symp.Quant.Biol.LIIpp.123-133；Frier等人，1986，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 83：9373-9377；Turner等人，1987，J.Am.Chem.Soc.109：3783-3785)。百分比互补性指示可以与第二种核酸序列形成氢键(例如，沃森-克里克碱基配对)的核酸分子中的邻接残基百分比(例如与具有10个核苷酸的第二种核酸序列碱基配对的第一种寡核苷酸中总共10个核苷酸中的5个、6个、7个、8个、9个或10个核苷酸分别代表50％、60％、70％、80％、90％和100％的互补性)。在一个实施方案中，本发明的siNA分子在siNA分子的有义链或有义区和反义链或反义区之间具有完全互补性。在一个实施方案中，本发明的siNA分子与相应的靶核酸分子完全互补。“完全互补”意指核酸序列的所有邻接残基将与第二种核酸序列中相同数目的邻接残基氢键合。在一个实施方案中，本发明的siNA分子包含与一种或多种靶核酸分子或其部分互补的约15个-约30个或更多(例如，约15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个或更多)核苷酸。在一个实施方案中，本发明的siNA分子在siNA分子的有义链或有义区和反义链或反义区之间或在siNA分子的反义链或反义区和相应的靶核酸分子之间具有部分互补性(即，小于100％的互补性)。例如，部分互补性可以包括在siNA结构内的各种错配或非碱基配对的核苷酸(例如，1个、2个、3个、4个、5个或更多错配或非碱基配对的核苷酸)，其可以导致在siNA分子的有义链或有义区和反义链或反义区之间或在siNA分子的反义链或反义区和相应的靶核酸分子之间产生的凸起、环或突出端。

在一个实施方案中，本发明的双链核酸分子例如siNA分子在核酸分子的有义链或有义区和反义链或反义区之间具有完全互补性。在一个实施方案中，本发明的双链核酸分子例如siNA分子与相应的靶核酸分子完全互补。

在一个实施方案中，本发明的双链核酸分子例如siNA分子在双链核酸分子的有义链或有义区和反义链或反义区之间或在核酸分子的反义链或反义区和相应的靶核酸分子之间具有部分互补性(即，小于100％的互补性)。例如，部分互补性可以包括在双链核酸分子内的各种错配或非碱基配对的核苷酸(例如，1个、2个、3个、4个、5个或更多错配或非碱基配对的核苷酸，例如核苷酸凸起)，其在结构上可以导致在双链核酸分子的有义链或有义区和反义链或反义区之间或在双链核酸分子的反义链或反义区和相应的靶核酸分子之间产生的凸起、环或突出端。在一些实施方案中，部分互补性可以指位于双链核酸分子的3′-或5′-末端上的非碱基配对的核苷酸(例如1、2、3、4、5或6个或更多个非碱基配对的核苷酸)。在此类实施方案中，双链核酸分子的其余部分在链和/或靶序列之间可以是完全互补的。

在一个实施方案中，本发明的双链核酸分子是微小RNA(miRNA)。“微小RNA”或“miRNA”意指通过mRNA切割、翻译阻抑/抑制或异染色质沉默调节靶信使RNA的表达的小双链RNA(参见例如Ambros，2004，Nature，431，350-355；Bartel，2004，Cell，116，281-297；Cullen，2004，Virus Research.，102，3-9；He等人，2004，Nat.Rev.Genet.，5，522-531；Ying等人，2004，Gene，342，25-28；和Sethupathy等人，2006，RNA，12：192-197)。在一个实施方案中，本发明的微小RNA在miRNA分子的有义链或有义区和反义链或反义区之间或在miRNA的反义链或反义区和相应的靶核酸分子之间具有部分互补性(即，小于100％的互补性)。例如，部分互补性可以包括在双链核酸分子内的各种错配或非碱基配对的核苷酸(例如，1个、2个、3个、4个、5个或更多错配或非碱基配对的核苷酸，例如核苷酸凸起)，其在结构上可以导致在miRNA的有义链或有义区和反义链或反义区之间或在miRNA的反义链或反义区和相应的靶核酸分子之间产生的凸起、环或突出端。

在一个实施方案中，下调或减少靶基因表达的本发明的siNA分子可以如本文描述或如本领域其他方面已知用于治疗或预防受试者或生物中的呼吸性疾病、病症、性状或状况。

在本发明的一个实施方案中，本发明的siNA分子的每个序列长度独立地为约15个-约30个核苷酸，在具体实施方案中长度为约15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个核苷酸。在另一个实施方案中，本发明的siNA双链体独立地包含约15个-约30个碱基对(例如，约15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个)。在另一个实施方案中，本发明的siNA分子的一条或多条链独立地包含与靶核酸分子互补的约15个-约30个核苷酸(例如，约15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个)。在另外一个实施方案中，包含发夹或环状结构的本发明的siNA分子长度为约35个-约55个(例如，约35个、40个、45个、50个或55个)核苷酸、或长度为约38个-约44个(例如，约38个、39个、40个、41个、42个、43个或44个)核苷酸且包含约15个-约25个(例如，约15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个或25个)碱基对。本发明的示例性siNA分子显示于表II和III和/或图4-5中。

如本文所使用的，“细胞”以其通常的生物学含义使用，并且不指完整多细胞生物，例如具体地不指人。细胞可以存在于生物内，例如鸟类、植物和哺乳动物，例如人、牛、羊、猿、猴、猪、狗和猫。细胞可以是原核的(例如，细菌细胞)或真核的(例如，哺乳动物或植物细胞)。细胞可以具有体细胞或种系起源、全能或多能、分裂或非分裂。细胞还可以衍生自或可以包含配子或胚胎、干细胞、或完全分化的细胞。

本发明的siNA分子可以直接添加，或可以与阳离子脂质复合，包装在脂质体内，或以其他方式递送给靶细胞或组织。核酸或核酸复合物可以先体外后体内、或在体内通过局部递送给肺局部地施用于相关组织，包括或不包括其掺入生物聚合物中。在具体实施方案中，本发明的核酸分子包含表1a和1b和/或图4-5中显示的序列。此类核酸分子的例子基本上由这些表和图中限定的序列组成。此外，表8中描述的化学修饰的构建体和表10中显示的脂质纳米颗粒(LNP)制剂可以应用于本发明的任何siNA序列或siNA序列组。

在另一个方面，本发明提供了包含本发明的一种或多种siNA分子的哺乳动物细胞。一种或多种siNA分子可以独立地被靶向本发明的靶多核苷酸内的相同或不同位点。

“RNA”意指包含至少一种核糖核苷酸残基的分子。“核糖核苷酸”意指在β-D-呋喃核糖部分的2′位置处具有羟基的核苷酸。该术语包括双链RNA、单链RNA、分离的RNA例如部分纯化的RNA、基本上纯的RNA、合成RNA、重组产生的RNA、以及通过一个或多个核苷酸的添加、缺失、置换和/或改变不同于天然存在的RNA的改变的RNA。此类改变可以包括添加非核苷酸材料，例如向siNA的一个或多个末端或内部，例如在RNA的一个或多个核苷酸处。本发明的RNA分子中的核苷酸还可以包含非标准核苷酸，例如非天然存在的核苷酸或化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸。这些改变的RNA可以称为类似物或天然存在的RNA的类似物。

“受试者”意指其是外植细胞的供体或受体或细胞自身的生物。“受试者”还指本发明的核酸分子可以施用于其的生物。受试者可以是哺乳动物或哺乳动物细胞，包括人或人细胞。在一个实施方案中，受试者是婴儿(例如，小于1个月大，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月大的受试者)。在一个实施方案中，受试者是初学走路的孩子(例如，1、2、3、4、5或6岁大)。在一个实施方案中，受试者是老人(例如，超过约65岁年龄的任何人)。

如本文所使用的，“化学修饰”意指与天然siRNA或RNA的核苷酸不同的核苷酸的化学结构的任何修饰。术语“化学修饰”包含天然siRNA或RNA核苷和核苷酸由经修饰的核苷和经修饰的核苷酸如本文所描述的或如本领域其他方面已知的添加、置换或修饰。此类化学修饰的非限制性例子包括但不限于，具有本文的式I、II、III、IV、V、VI或VII中的任何一个的组合物，硫代磷酸酯核苷酸间键，2′-脱氧核糖核苷酸，2′-O-甲基核糖核苷酸，2′-脱氧-2′-氟核糖核苷酸，4′-硫代核糖核苷酸，2′-O-三氟甲基核苷酸，2′-O-乙基-三氟甲氧基核苷酸，2′-O-二氟甲氧基-乙氧基核苷酸(参见例如于2004年11月5日提交的USSN 10/981,966，引入本文作为参考)，FANA，“通用碱基”核苷酸，“无环”核苷酸，5-C-甲基核苷酸，末端甘油基和/或反向脱氧脱碱基残基掺入，或具有本文的式I-VII中任何一个的修饰。在一个实施方案中，本发明的核酸分子(例如，dsRNA、siNA等)是被化学修饰部分修饰的(例如，约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％修饰的)。在另一个实施方案中，本发明的核酸分子(例如，dsRNA、siNA等)是被化学修饰完全修饰的(例如，约100％修饰的)。

如本文所使用的，术语“硫代磷酸酯”指具有式I的核苷酸间键，其中Z和/或W包含硫原子。因此，术语硫代磷酸酯指硫代磷酸酯和二硫代磷酸酯核苷酸间键。

如本文所使用的，术语“膦酰乙酸酯”指具有式I的核苷酸间键，其中Z和/或W包含乙酰基或保护的乙酰基。

如本文所使用的，术语“硫代膦酰乙酸酯”指具有式I的核苷酸间键，其中Z包含乙酰基或保护的乙酰基且W包含硫原子，或可替代地W包含乙酰基或保护的乙酰基且Z包含硫原子。

如本文所使用的，术语“通用碱基”指与每个天然DNA/RNA碱基形成碱基对的核苷酸碱基类似物，而在它们之间只有很少的区别。通用碱基的非限制性例子包括C-苯基、C-萘基和其他芳族衍生物、肌苷、吡咯氨甲酰和硝基吡咯衍生物例如如本领域已知的3-硝基吡咯、4-硝基吲哚、5-硝基吲哚和6-硝基吲哚(参见例如Loakes，2001，Nucleic AcidsResearch，29，2437-2447)。

如本文所使用的，术语“无环核苷酸”指具有无环核糖的任何核苷酸，例如其中核糖碳(C1、C2、C3、C4或C5)中任何一个独立地或组合地在核苷酸中不存在。

本发明的核酸分子独立地、或与其他药物组合或结合可以用于预防或治疗受试者或生物中本文描述的或本领域其他方面已知的疾病、病症、状况和性状。

在一个实施方案中，本发明的siNA分子可以在适合于治疗的条件下独立地或与一种或多种药物组合施用于受试者，或可以施用于对于本领域技术人员显而易见的其他合适的细胞。

在进一步的实施方案中，siNA分子可以与其他已知治疗组合用于预防或治疗受试者或生物中的呼吸性疾病、病症或状况。例如，所描述的分子可以与一种或多种已知化合物、治疗或操作组合用于预防或治疗如本领域已知的受试者或生物中疾病、病症、状况和性状，例如PDE抑制剂包括8-甲氧基甲基-IBMX(PDE4B 1抑制剂、咯利普兰(PDE4B抑制剂)和登布茶碱(PDE4B抑制剂)。

在一个实施方案中，本发明的特征在于以允许siNA分子表达的方式包含编码本发明的至少一种siNA分子的核酸序列的表达载体。例如，载体可以包含编码siNA分子的2条链的一种或多种序列，所述siNA分子包含双链体。载体还可以包含编码单个核酸分子的一种或多种序列，所述单个核酸分子是自互补的且因此形成siNA分子。此类表达载体的非限制性例子在Paul等人，2002，Nature Biotechnology，19，505；Miyagishi和Taira，2002，Nature Biotechnology，19，497；Lee等人，2002，Nature Biotechnology，19，500；和Novina等人，2002，NatureMedicine，预先在线公开doi：10.1038/nm725中得到描述。

在另一个实施方案中，本发明的特征在于包括本发明的表达载体的哺乳动物细胞，例如人细胞。

在另外一个实施方案中，本发明的表达载体包含关于与RNA分子具有互补性的siNA分子的序列，所述RNA分子通过Genbank登记号，例如本文表7中所示的Genbank登记号提及。

在一个实施方案中，本发明的表达载体包含编码2种或更多siNA分子的核酸序列，所述siNA分子可以是相同或不同的。

在本发明的另一个方面，与靶RNA分子相互作用且下调编码靶RNA分子(例如在本文中通过Genbank登记号提及的靶RNA分子)的基因的siNA分子由插入到DNA或RNA载体内的转录单位表达。重组载体可以是DNA质粒或病毒载体。表达siNA的病毒载体可以基于但不限于下述进行构建：腺伴随病毒、逆转录病毒、腺病毒或甲病毒。能够表达siNA分子的重组载体可以如本文所描述的进行递送，且在靶细胞中持续。可替代地，可以使用提供siNA分子的瞬时表达的病毒载体。必要时此类载体可以重复施用。一旦被表达，siNA分子就经由RNA干扰(RNAi)结合且下调基因功能或表达。siNA表达载体的递送可以是全身性的，例如通过静脉内或肌内施用，通过施用于来自受试者外植(ex-planted)的靶细胞随后重新引入受试者内，或通过将允许引入所需靶细胞内的任何其他方式。

“载体”意指用于递送所需核酸的任何基于核酸和/或病毒的技术。

本发明的其他特征和优点从其优选实施方案的下列描述和从权利要求是显而易见的。

附图简述

图1显示了用于合成siNA分子的方案的非限制性例子。互补的siNA序列链，链1和链2串联合成，且通过可切割键例如核苷酸琥珀酸酯或脱碱基琥珀酸酯进行连接，所述可切割键可以与用于在固体支持体上的固相合成的可切割接头相同或不同。合成可以是固相或液相，在显示的实例中，合成是固相合成。合成这样进行从而使得保护基团例如二甲氧三苯甲基在串联寡核苷酸的末端核苷酸上保持完整。寡核苷酸切割和脱保护后，2条siNA链自发地杂交以形成siNA双链体，其允许通过利用末端保护基团的性质纯化双链体，例如通过应用其中仅分离具有末端保护基团的双链体/寡核苷酸的三苯甲基依赖纯化法。

图2显示了通过本发明方法合成的纯化siNA双链体的MALDI-TOF质谱。显示的2个峰对应于分开的siNA序列链的预测质量。这个结果证实由串联合成产生的siNA双链体可以作为单个实体使用简单的三甲苯基依赖纯化法进行纯化。

图3显示了涉及RNAi的靶RNA降解的非限制性被提议的机制代表。通过依赖于RNA的RNA聚合酶(RdRP)由外来单链RNA产生的双链RNA(dsRNA)激活切酶(DICER)，所述切酶依次产生siNA双链体，所述外来单链RNA例如病毒、转座子或其他外源RNA。可替代地，合成或表达的siNA可以通过合适的方法直接引入细胞内。形成识别靶RNA的活性siNA复合物，从而导致通过RISC内切核酸酶复合物降解靶RNA或导致通过依赖于RNA的RNA聚合酶(RdRP)合成另外的RNA，其可以激活切酶且导致另外的siNA分子，从而扩大RNAi应答。

图4A-F显示了本发明的化学修饰的siNA构建体的非限制性例子。在该图中，N代表任何核苷酸(腺苷、鸟苷、胞嘧啶、尿苷或任选地胸苷，例如胸苷可以在由圆括号指定的突出端区域(N N)中被取代。显示了关于siNA构建体的有义和反义链的各种修饰。(N N)核苷酸位置可以如本文所描述的进行化学修饰(例如，2′-O-甲基，2′-脱氧-2′-氟等)且可以衍生自或不衍生自相应的靶核酸序列(参见例如图6C)。此外，图4中显示的序列可以任选包括在来自有义链的5′-末端的第9位，或通过从引导链的5′-末端计数11个核苷酸位置基于引导链的5′-末端的第11位处的核糖核苷酸(参见图6C)。

图4A：有义链包含21个核苷酸，其中2个末端3′-核苷酸任选是碱基配对的且其中存在的所有核苷酸都是核糖核苷酸，除了(N N)核苷酸，其可以包含核糖核苷酸、脱氧核苷酸、通用碱基、或本文描述的其他化学修饰。反义链包含21个核苷酸，任选具有3′-末端甘油基部分，其中2个末端3′-核苷酸任选与靶RNA序列互补，且其中存在的所有核苷酸都是核糖核苷酸，除了(N N)核苷酸，其可以包含核糖核苷酸、脱氧核苷酸、通用碱基、或本文描述的其他化学修饰。显示为“s”的经修饰的核苷酸间键例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或如本文所描述的其他经修饰的核苷酸间键，任选使反义链中的(N N)核苷酸连接。

图4B：有义链包含21个核苷酸，其中2个末端3′-核苷酸任选是碱基配对的且其中可能存在的所有嘧啶核苷酸都是2′脱氧-2′-氟经修饰的核苷酸，且可能存在的所有嘌呤核苷酸都是2′-O-甲基经修饰的核苷酸，除了(N N)核苷酸，其可以包含核糖核苷酸、脱氧核苷酸、通用碱基、或本文描述的其他化学修饰。反义链包含21个核苷酸，任选具有3′-末端甘油基部分且其中2个末端3′-核苷酸任选与靶RNA序列互补，且其中可能存在的所有嘧啶核苷酸都是2′脱氧-2′-氟经修饰的核苷酸，且可能存在的所有嘌呤核苷酸都是2′-O-甲基经修饰的核苷酸，除了(N N)核苷酸，其可以包含核糖核苷酸、脱氧核苷酸、通用碱基、或本文描述的其他化学修饰。显示为“s”的经修饰的核苷酸间键例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或如本文所描述的其他经修饰的核苷酸间键，任选使有义和反义链中的(N N)核苷酸连接。

图4C：有义链包含具有5′和3′-末端帽部分的21个核苷酸，其中2个末端3′-核苷酸任选是碱基配对的且其中可能存在的所有嘧啶核苷酸都是2′-O-甲基或2′脱氧-2′-氟经修饰的核苷酸，除了(N N)核苷酸，其可以包含核糖核苷酸、脱氧核苷酸、通用碱基、或本文描述的其他化学修饰。反义链包含21个核苷酸，任选具有3′-末端甘油基部分且其中2个末端3′-核苷酸任选与靶RNA序列互补，且其中可能存在的所有嘧啶核苷酸都是2′脱氧-2′-氟经修饰的核苷酸，除了(N N)核苷酸，其可以包含核糖核苷酸、脱氧核苷酸、通用碱基、或本文描述的其他化学修饰。显示为“s”的经修饰的核苷酸间键例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或如本文所描述的其他经修饰的核苷酸间键，任选使反义链中的(N N)核苷酸连接。

图4D：有义链包含具有5′和3′-末端帽部分的21个核苷酸，其中2个末端3′-核苷酸任选是碱基配对的且其中可能存在的所有嘧啶核苷酸都是2′-脱氧-2′-氟经修饰的核苷酸，除了(N N)核苷酸，其可以包含核糖核苷酸、脱氧核苷酸、通用碱基、或本文描述的其他化学修饰，且其中可能存在的所有嘌呤核苷酸都是2′-脱氧核苷酸。反义链包含21个核苷酸，任选具有3′-末端甘油基部分且其中2个末端3′-核苷酸任选与靶RNA序列互补，且其中可能存在的所有嘧啶核苷酸都是2′-脱氧-2′-氟经修饰的核苷酸且其中可能存在的所有嘌呤核苷酸都是2′-O-甲基经修饰的核苷酸，除了(N N)核苷酸，其可以包含核糖核苷酸、脱氧核苷酸、通用碱基、或本文描述的其他化学修饰。显示为“s”的经修饰的核苷酸间键例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或如本文所描述的其他经修饰的核苷酸间键，任选使反义链中的(N N)核苷酸连接。

图4E：有义链包含具有5′和3′-末端帽部分的21个核苷酸，其中2个末端3′-核苷酸任选是碱基配对的且其中可能存在的所有嘧啶核苷酸都是2’-脱氧-2′-氟经修饰的核苷酸，除了(N N)核苷酸，其可以包含核糖核苷酸、脱氧核苷酸、通用碱基、或本文描述的其他化学修饰。反义链包含21个核苷酸，任选具有3′-末端甘油基部分且其中2个末端3′-核苷酸任选与靶RNA序列互补，且其中可能存在的所有嘧啶核苷酸都是2’-脱氧-2′-氟经修饰的核苷酸且其中可能存在的所有嘌呤核苷酸都是2′-O-甲基经修饰的核苷酸，除了(N N)核苷酸，其可以包含核糖核苷酸、脱氧核苷酸、通用碱基、或本文描述的其他化学修饰。显示为“s”的经修饰的核苷酸间键例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或如本文所描述的其他经修饰的核苷酸间键，任选使反义链中的(N N)核苷酸连接。

图4F：有义链包含具有5′和3′-末端帽部分的21个核苷酸，其中2个末端3′-核苷酸任选是碱基配对的且其中可能存在的所有嘧啶核苷酸都是2’-脱氧-2′-氟经修饰的核苷酸，除了(N N)核苷酸，其可以包含核糖核苷酸、脱氧核苷酸、通用碱基、或本文描述的其他化学修饰，且其中可能存在的所有嘌呤核苷酸都是2′-脱氧核苷酸。反义链包含21个核苷酸，任选具有3′-末端甘油基部分且其中2个末端3′-核苷酸任选与靶RNA序列互补，且具有1个3′-末端硫代磷酸酯核苷酸间键，且其中可能存在的所有嘧啶核苷酸都是2’-脱氧-2′-氟经修饰的核苷酸且其中可能存在的所有嘌呤核苷酸都是2′-脱氧核苷酸，除了(N N)核苷酸，其可以包含核糖核苷酸、脱氧核苷酸、通用碱基、或本文描述的其他化学修饰。显示为“s”的经修饰的核苷酸间键例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或如本文所描述的其他经修饰的核苷酸间键，任选使反义链中的(NN)核苷酸连接。构建体A-F的反义链包含与本发明的任何靶核酸序列互补的序列。此外，当对于图4A-F中显示的任何构建体在反义链的3′-末端处存在甘油基部分(L)时，经修饰的核苷酸间键是任选的。

图5A-F显示了本发明的具体化学修饰的siNA序列的非限制性例子。A-F将图4A-F中描述的化学修饰应用于示例性ENaC siNA序列。此类化学修饰可以应用于任何ENaC序列。此外，图5中显示的序列可以任选包括在来自有义链的5′-末端的第9位，或通过从引导链的5′-末端计数11个核苷酸位置基于引导链的5′-末端的第11位处的核糖核苷酸(参见图6C)。此外，图5中显示的序列可以任选包括在反义链的5′-末端处最高达约4个位置的末端核糖核苷酸(例如，在反义链的5′-末端处的约1个、2个、3个或4个末端核糖核苷酸)。

图6A-C显示了本发明的不同siNA构建体的非限制性例子。

图6A中显示的例子(构建体1、2和3)具有19个代表性碱基对；然而，本发明的不同实施方案包括本文描述的任何数目的碱基对。括弧区域代表核苷酸突出端，例如，包含长度为约1个、2个、3个或4个核苷酸，优选约2个核苷酸。构建体1和2可以独立地用于RNAi活性。构建体2可以包含多核苷酸或非核苷酸接头，其可以任选被设计为生物可降解的接头。在一个实施方案中，构建体2中显示的环结构可以包含生物可降解的接头，其导致在体内和/或体外形成构建体1。在另一个例子中，构建体3可以用于在相同原理下产生构建体2，其中接头用于在体内和/或体外产生活性siNA构建体2，其可以任选利用另一种生物可降解的接头以在体内和/或体外产生活性siNA构建体1。照这样，siNA构建体的稳定性和/或活性可以基于用于在体内或体外和/或体外使用的siNA构建体的设计进行调节。

图6B中显示的例子代表本发明的双链核酸分子的不同变化，例如微小RNA，其可以包括起因于部分互补性的突出端、凸起、环和茎-环。具有凸起、环和茎-环的此类基序一般是miRNA的特征。凸起、环和茎-环可以起因于任何程度的部分互补性，例如在本发明的双链核酸分子的1条或2条链中约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多核苷酸的错配或凸起。

图6C中显示的例子代表本发明的模型双链核酸分子，其包含具有2个21核苷酸序列、具有二核苷酸3′-突出端的19个碱基对双链体。顶部链(1)代表有义链(过客链)，中间链(2)代表反义链(引导链)，和下部链(3)代表靶多核苷酸序列。二核苷酸突出端(NN)可以包含衍生自靶多核苷酸的序列。例如，引导链中的3′-(NN)序列可以与靶多核苷酸的5′-[NN]序列互补。此外，过客链的5′-(NN)序列可以包含与靶多核苷酸序列的5′-[NN]序列相同的序列。在其他实施方案中，突出端(NN)不衍生自靶多核苷酸序列，例如其中引导链中的3′-(NN)序列与靶多核苷酸的5′-[NN]序列不互补，且过客链的5′-(NN)序列可以包含与靶多核苷酸序列的5′-[NN]序列不同的序列。在另外的实施方案中，任何(NN)核苷酸是化学修饰的，例如如2′-O-甲基、2′-脱氧-2′-氟和/或本文的其他修饰。此外，过客链可以包含过客链的核糖核苷酸位置N。对于显示的代表性19碱基对21聚体双链体，位置N可以是在来自过客链的3′末端中的9个核苷酸。然而，在具有不同长度的双链体中，位置N基于引导链的5′-末端进行确定，其通过从引导链的5′-末端计数11个核苷酸位置且挑选过客链中相应的碱基配对核苷酸实现。通过Ago2的切割在如箭标指出的位置10和11之间发生。在另外的实施方案中，在基于引导链的5′-末端的位置10和11处存在2个核糖核苷酸，NN，其通过从引导链的5′-末端计数10和11个核苷酸位置且挑选过客链中相应的碱基配对核苷酸实现。

图7显示了不同稳定化学物(1-10)的非限制性例子，所述稳定化学物可以例如用于稳定本发明的siNA序列的3′-末端，包括(1)[3-3′]-反向脱氧核糖；(2)脱氧核糖核苷酸；(3)[5′-3′]-3′-脱氧核糖核苷酸；(4)[5′-3′]-核糖核苷酸；(5)[5′-3′]-3′-O-甲基核糖核苷酸；(6)3′-甘油基；(7)[3′-5′]-3′-脱氧核糖核苷酸；(8)[3′-3′]-脱氧核糖核苷酸；(9)[5′-2′]-脱氧核糖核苷酸；和(10)[5-3′]-二脱氧核糖核苷酸。除了该图中指出的经修饰的和未修饰的主链化学外，这些化学物可以与如本文所描述的不同主链修饰例如具有式I的主链修饰组合。此外，显示的末端修饰5′显示的2′-脱氧核苷酸可以是本文描述的另一种经修饰的或未修饰的核苷酸或非核苷酸，例如具有式I-VII中任何一个或其任何组合的修饰。

图8显示了用于鉴定本发明化学修饰的siNA构建体的策略的非限制性例子，所述siNA构建体是核酸酶抗性的同时保留介导RNAi活性的能力。基于教导的设计参数将化学修饰引入siNA构建体内(例如，引入2′-修饰、碱基修饰、主链修饰、末端帽修饰等)。经修饰的构建体在合适的系统中进行测试(例如，关于核酸酶抗性的人血清，显示，或关于PK/递送参数的动物模型)。平行地，siNA构建体就RNAi活性例如在细胞培养系统例如萤光素酶报道分子测定)中进行测试。随后鉴定具有特定特征同时维持RNAi活性的引导siNA构建体，且其可以再一次进行进一步修饰和测定。相同方法可以用于鉴定具有改善的药物代谢动力学概况、递送和RNAi活性的siNA-缀合物分子。

图9显示了本发明的磷酸化siNA分子的非限制性例子，包括线性和双链体构建体及其不对称的衍生物。

图10显示了本发明的化学修饰的末端磷酸基的非限制性例子。

图11A显示了利用在靶核酸序列中鉴定的回文和/或重复核酸序列用于设计自互补的DFO构建体的方法的非限制性例子。(i)在核酸靶序列中鉴定回文或重复序列。(ii)设计与靶核酸序列和回文序列互补的序列。(iii)给互补序列的3′-末端附加互补序列的非回文/重复部分的反向重复序列，以产生包含与核酸靶互补的序列的自互补DFO分子。(iv)DFO分子可以自我装配以形成双链寡核苷酸。图11B显示了双链体形成寡核苷酸序列的非限制性代表性例子。图11C显示了代表性双链体形成寡核苷酸序列的自我装配示意图的非限制性例子。图11D显示了代表性双链体形成寡核苷酸序列的自我装配示意图，随后为与靶核酸序列的相互作用导致基因表达的调节的非限制性例子。

图12显示了利用掺入DFO构建体内的回文和/或重复核酸序列设计自互补DFO构建体的非限制性例子，所述DFO构建体具有与任何目的靶核酸序列互补的序列。这些回文/重复序列的掺入允许设计形成双链体的DFO构建体，其中每条链能够例如通过RNAi介导靶基因表达的调节。首先，鉴定靶序列。随后产生互补序列，其中将核苷酸或非核苷酸修饰(显示为X或Y)引入互补序列内，产生人工回文(在该图中显示为XYXYXY)。给互补序列的3′-末端附加非回文/重复互补序列的反向重复，以产生包含与核酸靶互补的序列的自互补DFO。DFO可以自我装配以形成双链寡核苷酸。

图13显示了包含2种分开的多核苷酸序列的本发明多功能siNA分子的非限制性例子，所述多核苷酸序列各自能够介导RNAi指导的不同靶核酸序列的切割。图13A显示了多功能siNA分子的非限制性例子，其具有与第一种靶核酸序列互补的第一个区域(互补区域1)和与第二种靶核酸序列互补的第二个区域(互补区域2)，其中所述第一个和第二个互补区域位于多功能siNA中的每种多核苷酸序列的3′-末端处。多功能siNA构建体的每种多核苷酸序列的虚线部分具有关于siNA双链体的相应部分的互补性，但不具有对于靶核酸序列的互补性。图13B显示了多功能siNA分子的非限制性例子，其具有与第一种靶核酸序列互补的第一个区域(互补区域1)和与第二种靶核酸序列互补的第二个区域(互补区域2)，其中所述第一个和第二个互补区域位于多功能siNA中的每种多核苷酸序列的5′-末端处。多功能siNA构建体的每种多核苷酸序列的虚线部分具有关于siNA双链体的相应部分的互补性，但不具有对于靶核酸序列的互补性。

图14显示了包含单一多核苷酸序列的本发明多功能siNA分子的非限制性例子，所述单一多核苷酸序列包含各自能够介导RNAi指导的不同靶核酸序列的切割的不同区域。图14A显示了多功能siNA分子的非限制性例子，其具有与第一种靶核酸序列互补的第一个区域(互补区域1)和与第二种靶核酸序列互补的第二个区域(互补区域2)，其中所述第二个互补区域位于多功能siNA中的多核苷酸序列的3′-末端处。多功能siNA构建体的每种多核苷酸序列的虚线部分具有关于siNA双链体的相应部分的互补性，但不具有对于靶核酸序列的互补性。图14B显示多功能siNA分子的非限制性例子，其具有与第一种靶核酸序列互补的第一个区域(互补区域1)和与第二种靶核酸序列互补的第二个区域(互补区域2)，其中所述第一个互补区域位于多功能siNA中的多核苷酸序列的5′-末端处。多功能siNA构建体的每种多核苷酸序列的虚线部分具有关于siNA双链体的相应部分的互补性，但不具有对于靶核酸序列的互补性。在一个实施方案中，这些多功能siNA构建体在体内或体外进行加工，以产生如图13中所示的多功能siNA构建体。

图15显示了包含2种分开的多核苷酸序列的本发明多功能siNA分子的非限制性例子，所述多核苷酸序列各自能够介导RNAi指导的不同靶核酸序列的切割，且其中所述多功能siNA构建体进一步包含自互补的、回文或重复区域，从而使得较短的双功能siNA构建体成为可能，所述双功能siNA构建体可以介导针对不同靶核酸序列的RNA干扰。图15A显示了多功能siNA分子的非限制性例子，其具有与第一种靶核酸序列互补的第一个区域(互补区域1)和与第二种靶核酸序列互补的第二个区域(互补区域2)，其中所述第一个和第二个互补区域位于多功能siNA中的每种多核苷酸序列的3′-末端处，且其中所述第一个和第二个互补区域进一步包含自互补的、回文或重复区域。多功能siNA构建体的每种多核苷酸序列的虚线部分具有关于siNA双链体的相应部分的互补性，但不具有对于靶核酸序列的互补性。图15B显示了多功能siNA分子的非限制性例子，其具有与第一种靶核酸序列互补的第一个区域(互补区域1)和与第二种靶核酸序列互补的第二个区域(互补区域2)，其中所述第一个和第二个互补区域位于多功能siNA中的每种多核苷酸序列的5′-末端处，且其中所述第一个和第二个互补区域进一步包含自互补的、回文或重复区域。多功能siNA构建体的每种多核苷酸序列的虚线部分具有关于siNA双链体的相应部分的互补性，但不具有对于靶核酸序列的互补性。

图16显示了包含单一多核苷酸序列的本发明多功能siNA分子的非限制性例子，所述单一多核苷酸序列包含各自能够介导RNAi指导的不同靶核酸序列的切割的不同区域，且其中所述多功能siNA构建体进一步包含自互补的、回文或重复区域，从而使得较短的双功能siNA构建体成为可能，所述双功能siNA构建体可以介导针对不同靶核酸序列的RNA干扰。图16A显示了多功能siNA分子的非限制性例子，其具有与第一种靶核酸序列互补的第一个区域(互补区域1)和与第二种靶核酸序列互补的第二个区域(互补区域2)，其中所述第二个互补区域位于多功能siNA中的多核苷酸序列的3′-末端处，且其中所述第一个和第二个互补区域进一步包含自互补的、回文或重复区域。多功能siNA构建体的每种多核苷酸序列的虚线部分具有关于siNA双链体的相应部分的互补性，但不具有对于靶核酸序列的互补性。图16B显示了多功能siNA分子的非限制性例子，其具有与第一种靶核酸序列互补的第一个区域(互补区域1)和与第二种靶核酸序列互补的第二个区域(互补区域2)，其中所述第一个互补区域位于多功能siNA中的多核苷酸序列的5′-末端处，且其中所述第一个和第二个互补区域进一步包含自互补的、回文或重复区域。多功能siNA构建体的每种多核苷酸序列的虚线部分具有关于siNA双链体的相应部分的互补性，但不具有对于靶核酸序列的互补性。在一个实施方案中，这些多功能siNA构建体在体内或体外进行加工，以产生如图15中所示的多功能siNA构建体。

图17显示了本发明的多功能siNA分子如何能够靶向2种分开的靶核酸分子的非限制性例子，例如编码不同蛋白质(例如，本文的任何ENaC靶)的分开的RNA分子，例如细胞因子及其相应受体、不同的病毒品系、病毒和涉及病毒感染或复制的细胞蛋白质、或涉及共同或分歧生物途径的不同蛋白质，所述生物途径牵涉于疾病进展的维持。多功能siNA构建体的每条链包含与分开的靶核酸分子具有互补性的区域。多功能siNA分子这样设计，从而使得可以由RISC复合物利用siNA的每条链，以起始RNA干扰介导的其相应靶的切割。这些设计参数可以包括siNA构建体的每个末端的去稳定作用(参见例如Schwarz等人，2003，Cell，115，199-208)。此类去稳定作用可以例如通过使用如本领域已知的鸟苷-胞苷碱基对、交替碱基对(例如，摆动)、或在末端核苷酸位置处使化学修饰的核苷酸去稳定来完成。

图18显示了本发明的多功能siNA分子如何能够靶向相同靶核酸分子内的2种分开的靶核酸序列的非限制性例子，例如RNA的交替编码区、RNA的编码和非编码区、或RNA的可变同种型区域。多功能siNA构建体的每条链包含与靶核酸分子的分开区域具有互补性的区域。多功能siNA分子这样设计，从而使得可以由RISC复合物利用siNA的每条链，以起始RNA干扰介导的其相应靶区域的切割。这些设计参数可以包括siNA构建体的每个末端的去稳定作用(参见例如Schwarz等人，2003，Cell，115，199-208)。此类去稳定作用可以例如通过使用如本领域已知的鸟苷-胞苷碱基对、交替碱基对(例如，摆动)、或在末端核苷酸位置处使化学修饰的核苷酸去稳定来完成。

图19(A-H)显示了本发明的栓系多功能siNA构建体的非限制性例子。在显示的例子中，接头(例如，核苷酸或非核苷酸接头)使2个siNA区域(例如，2个有义、2个反义、或可替代地有义和反义区连接在一起。对应于第一种靶序列和第二种靶序列的分开的有义(或有义和反义)序列与多功能siNA中其对应的有义和/或反义序列杂交。此外，各种缀合物、配体、适体、聚合物或报道分子可以与接头区域附着，用于选择性或改善的递送和/或药物代谢动力学性质。

图20显示了各种基于树状聚体的多功能siNA设计的非限制性例子。

图21显示了各种超分子的多功能siNA设计的非限制性例子。

图22显示了使用30核苷酸前体siNA构建体的切酶激活的多功能siNA设计的非限制性例子。30碱基对双链体经由切酶从任一末端切割成22和8碱基对产物(8b.p.片段未显示)。为了易于呈现，由切酶产生的突出端未显示-但可以被补偿。显示了3个靶向序列。重叠的所需序列同一性由灰色框指出。要求亲本30b.p.siNA的N’s的2’-OH位置的位点以使切酶切割成为可能，如果这在稳定化学物中进行测试的话。应当指出30聚体双链体经由切酶RNA酶III的加工不产生精确的22+8切割，而是产生一系列紧密相关的产物(其中22+8是主要位点)。因此，经由切酶的加工将产生一系列活性siNA。

图23显示了使用40核苷酸前体siNA构建体的切酶激活的多功能siNA设计的非限制性例子。40碱基对双链体经由切酶从任一末端切割成20碱基对产物。为了易于呈现，由切酶产生的突出端未显示-但可以被补偿。显示了4个靶向序列。具有同源性的靶序列由框包围。这种设计形式可以延伸至较大的RNA。如果化学稳定的siNA由切酶结合，那么策略上定位的核糖核苷酸键可以使设计者切割产物成为可能，其允许更广泛的多功能设计谱。例如不限于约22-核苷酸的切酶标准的切割产物可以允许多功能siNA构建体具有例如约3个-约15个核苷酸的靶序列同一性重叠。

图24显示了本发明的另外多功能siNA构建体设计的非限制性例子。在一个例子中，缀合物、配体、适体、标记或其他部分与多功能siNA的区域附着，以使得改善的递送或药物代谢动力学概况分析成为可能。

图25显示了本发明的另外多功能siNA构建体设计的非限制性例子。在一个例子中，缀合物、配体、适体、标记或其他部分与多功能siNA的区域附着，以使得改善的递送或药物代谢动力学概况分析成为可能。

图26显示了胆固醇连接的亚磷酰胺的非限制性例子，其可以用于合成本发明的胆固醇缀合的siNA分子。显示了具有与siNA分子的有义链5′-末端连接的胆固醇部分的例子。

图27描述了与核酸链连接的5′和3′反向脱碱基帽部分的一个实施方案。

图28显示了与其为免疫刺激激动剂的对照瑞喹莫德(R848)比较，在用siRNA处理后在TLR7-U2OS细胞中的相对IL8mRNA表达(n＝4，伴随6次重复/时间点)。

图29显示了与其为免疫刺激激动剂的对照ssRNA40比较，在用siRNA处理后在TLR8-U2OS细胞中的相对IL8mRNA表达(n＝4，伴随6次重复/时间点)。

图30显示了以100、50、20和10nM浓度对于靶位点(SEQ ID NO 51和52)和1181(SEQ ID NO：57和58)用修饰的ENaC siRNA转染重组HEK细胞后，在FLIPR(荧光成像板阅读器)测定中的钠转运的抑制。

发明详述

本发明的核酸分子的作用机制

以下的讨论讨论了由短干扰RNA介导的RNA干扰被提议的机制，如目前已知的并且不意欲是限制性的且不是现有技术的承认。申请人在本文中证实化学修饰的短干扰核酸如siRNA分子一样具有类似或改善的介导RNAi的能力，且预期具有改善的体内稳定性和活性；因此，这个讨论不意欲仅限于siRNA且可以整体应用于siNA。“改善的介导RNAi的能力”或“改善的RNAi活性”意欲包括在体外和/或体内测量的RNAi活性，其中RNAi活性是siNA介导RNAi的能力和本发明siNA的稳定性的反映。在本发明中，与包含多个核糖核苷酸的全RNA siRNA或siNA相比较，这些活性的产物可以在体外和/或体内得到增加。在一些情况下，siNA分子的活性或稳定性可以是减少的(即，小于10倍)，但siNA分子的总体活性在体外和/或体内得到增强。

RNA干扰指动物中由短干扰RNA(siRNA)介导的序列特异性转录后基因沉默的过程(Fire等人，1998，Nature，391，806)。植物中的相应过程通常称为转录后基因沉默或RNA沉默，并且在真菌中也称为压抑。转录后基因沉默的过程被认为是用于阻止外来基因表达的进化上保守的细胞防御机制，所述细胞防御机制通常由不同的群落(flora)和门(phyla)共享(Fire等人，1999，Trends Genet.，15，358)。使免于外来基因表达的此类保护可能响应双链RNA(dsRNA)的产生而经由细胞应答发展出来，所述双链RNA衍生自病毒感染或转座子元件随机整合到宿主基因组内，所述细胞应答特异性破坏同源单链RNA或病毒基因组RNA。细胞中dsRNA的存在通过仍需充分表征的机制触发RNAi应答。这种机制似乎不同于起因于dsRNA介导的蛋白激酶PKR激活和通过核糖核酸酶L导致mRNA的非特异性切割的2′，5′-寡腺苷酸合成酶的干扰素应答。

细胞中长dsRNA的存在刺激称为切酶的核糖核酸酶III酶的活性。切酶涉及dsRNA加工成称为短干扰RNA(siRNA)的dsRNA短片段(Berstein等人，2001，Nature，409，363)。衍生自切酶活性的短干扰RNA一般为长度约21个-约23个核苷酸并且包含约19碱基对双链体。切酶也已牵涉于来自保守结构的前体RNA的21-和22-核苷酸小时序RNA(stRNA)的切割，所述小时序RNA牵涉于翻译控制(Hutvagner等人，2001，Science，293，834)。RNAi应答还以通常称为RNA诱导的沉默复合物(RISC)的包含siRNA的内切核酸酶复合物为特征，所述复合物介导具有与siRNA同源的序列的单链RNA切割。靶RNA的切割在与siRNA双链体的引导序列互补的区域中间发生(Elbashir等人，2001，Genes Dev.，15，188)。此外，RNA干扰还可以涉及小RNA(例如，微小RNA或miRNA)介导的基因沉默，推测是通过调节染色质结构且从而阻止靶基因序列转录的细胞机制(参见例如Allshire，2002，Science，297，1818-1819；Volpe等人，2002，Science，297，1833-1837；Jenuwein，2002，Science，297，2215-2218；和Hall等人，2002，Science，297，2232-2237)。照这样，本发明的siNA分子可以用于经由与RNA转录物相互作用或可替代地通过与特定基因序列相互作用来介导基因沉默，其中此类相互作用导致在转录水平或转录后水平上的基因沉默。

RNAi已在多种系统中进行研究。Fire等人，1998，Nature，391，806首先在秀丽隐杆线虫中观察到RNAi。Wianny和Goetz，1999，NatureCell Biol.，2，70描述了在小鼠胚胎中由dsRNA介导的RNAi。Hammond等人，2000，Nature，404，293描述了在用dsRNA转染的果蝇细胞中的RNAi。Elbashir等人，2001，Nature，411，494描述了在培养的哺乳动物细胞中通过引入合成的21-核苷酸RNA的双链体诱导的RNAi，所述哺乳动物细胞包括人胚肾和HeLa细胞。果蝇胚胎溶解产物中的近期工作已揭示了关于siRNA长度、结构、化学组成、和介导有效RNAi活性所必需的序列的某些要求。这些研究已显示21核苷酸siRNA双链体在包含2个2-核苷酸3′-末端核苷酸突出端时是最有活性的。此外，用2′-脱氧或2′-O-甲基核苷酸置换1条或2条siRNA链取消了RNAi活性，而用脱氧核苷酸置换3′-末端siRNA核苷酸显示是耐受的。siRNA双链体中心处的错配序列也显示取消了RNAi活性。此外，这些研究还指出靶RNA中切割位点的位置由siRNA引导序列的5′-末端而不是3′-末端限定(Elbashir等人，2001，EMBO J.，20，6877)。其他研究已指出siRNA双链体的靶互补链上的5′-磷酸是siRNA活性所需的，并且ATP用于维持siRNA上的5′-磷酸部分(Nykanen等人，2001，Cell，107，309)；然而，缺乏5′-磷酸的siRNA分子当外源引入时是有活性的，从而暗示siRNA构建体的5′-磷酸化可以在体内发生。

本发明的双链体形成寡核苷酸(DFO)

在一个实施方案中，本发明的特征在于包含双链体形成寡核苷酸(DFO)的siNA分子，所述DFO可以自我装配成双链寡核苷酸。本发明的双链体形成寡核苷酸可以化学合成或由转录单位和/或载体表达。本发明的DFO分子提供用于多种治疗、诊断、农业、兽医、靶确认、基因组发现、基因工程和药物基因组学应用的有用试剂和方法。

申请人在本文中证实某些寡核苷酸是基因表达的序列特异性调节的有效介质，所述寡核苷酸为了方便起见且非限制性地在本文中称为双链体形成寡核苷酸或DFO分子。本发明的寡核苷酸与本领域已知的其他核酸序列(例如，siRNA、miRNA、stRNA、shRNA、反义寡核苷酸等)的不同之处在于它们代表被设计为自我装配成双链寡核苷酸的一类线性多核苷酸序列，其中双链寡核苷酸中的每条链包含与ENaC靶核酸分子互补的核苷酸序列。本发明的核酸分子因此可以自我装配成功能双链体，其中双链体的每条链包含相同的多核苷酸序列且每条链包含与靶核酸分子互补的核苷酸序列。

一般地，双链寡核苷酸通过2种不同的寡核苷酸序列装配形成，其中一条链的寡核苷酸序列与第二条链的寡核苷酸序列互补；此类双链寡核苷酸由2种分开的寡核苷酸装配，或由在其自身上折叠以形成双链结构的单个分子装配，所述单个分子在本领域中通常称为发夹茎环结构(例如，shRNA或短发夹RNA)。本领域已知的这些双链寡核苷酸都具有共同特征，因为双链体的每条链具有不同的核苷酸序列。

不同于本领域已知的双链核酸分子，申请人已开发了由单链或线性寡核苷酸开始形成双链核酸分子的新的、潜在地节省成本和简化的方法。根据本发明形成的双链寡核苷酸的2条链具有相同的核苷酸序列并且彼此不共价连接。此类双链寡核苷酸分子可以通过本领域已知的方法和试剂容易地进行合成后连接，并且在本发明的范围内。在一个实施方案中，形成双链寡核苷酸的本发明的单链寡核苷酸(双链体形成寡核苷酸)包含第一个区域和第二个区域，其中所述第二个区域包括其是第一个区域中的核苷酸序列或其部分的反向重复的核苷酸序列，从而使得单链寡核苷酸自我装配以形成双链体寡核苷酸，其中双链体的一条链的核苷酸序列与第二条链的核苷酸序列相同。此类双链体形成寡核苷酸的非限制性例子在图11和12中举例说明。这些双链体形成寡核苷酸(DFOs)可以任选包括某些回文或重复序列，其中此类回文或重复序列存在于DFO的第一个区域和第二个区域之间。

在一个实施方案中，本发明的特征在于双链体形成寡核苷酸(DFO)分子，其中所述DFO包含双链体形成自互补核酸序列，其具有与ENaC靶核酸序列互补的核苷酸序列。DFO分子可以包含单个自互补序列或起因于此类自互补序列装配的双链体。

在一个实施方案中，本发明的双链体形成寡核苷酸(DFO)包含第一个区域和第二个区域，其中所述第二个区域包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含第一个区域的核苷酸序列的反向重复，从而使得DFO分子可以装配成双链寡核苷酸。此类双链寡核苷酸可以充当短干扰核酸(siNA)以调节基因表达。由本发明的DFO分子形成的双链寡核苷酸双链体的每条链可以包含与ENaC靶核酸分子(例如，ENaC靶RNA)中的相同核苷酸序列互补的核苷酸序列区域。

在一个实施方案中，本发明的特征在于可以装配成双链寡核苷酸的单链DFO。申请人已惊讶地发现具有自互补性的核苷酸区域的单链寡核苷酸可以容易地装配成双链体寡核苷酸构建体。此类DFOs可以装配成可以以序列特异性方式抑制基因表达的双链体。本发明的DFO分子包含具有核苷酸序列的第一个区域，所述核苷酸序列与第二个区域的核苷酸序列互补，且其中所述第一个区域的序列与ENaC靶核酸(例如，RNA)互补。DFO可以形成双链寡核苷酸，其中双链寡核苷酸的每条链的部分包含与ENaC靶核酸序列互补的序列。

在一个实施方案中，本发明的特征在于双链寡核苷酸，其中所述双链寡核苷酸的2条链彼此不共价连接，且其中双链寡核苷酸的每条链包含与ENaC靶核酸分子中的相同核苷酸序列或其部分(例如，ENaCRNA靶)互补的核苷酸序列。在另一个实施方案中，双链寡核苷酸的2条链共享至少约15个，优选至少约16个、17个、18个、19个、20个或21个核苷酸的相同核苷酸序列。

在一个实施方案中，本发明的DFO分子包含具有式DFO-I的结构：

5′-p-X Z X′-3′

其中Z包含任选具有一个或多个经修饰的核苷酸(例如具有经修饰的碱基例如2-氨基嘌呤、2-氨基-1，6-二氢嘌呤或通用碱基的核苷酸)的回文或重复核酸序列，例如长度为偶数数目的约2个-约24个核苷酸(例如，约2个、4个、6个、8个、10个、12个、14个、16个、18个、20个或22个或24个核苷酸)，X代表例如长度约1个-约21个核苷酸(例如，约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或21个核苷酸)的核酸序列，X′包含例如长度约1个-约21个核苷酸(例如，约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或21个核苷酸)的、具有对于序列X或其部分的核苷酸序列互补性的核酸序列，p包含可以存在或不存在的末端磷酸基，且其中序列X和Z独立或共同包含这样的核苷酸序列，其与ENaC靶核酸序列或其部分互补且具有足够的长度以与ENaC靶核酸序列或其部分(例如，ENaC RNA靶)相互作用(例如，碱基配对)。例如，X独立地可以包含长度为约12个-约21个或更多(例如，约12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个或更多)核苷酸的序列，其与ENaC靶RNA中的核苷酸序列或其部分互补。在另一个非限制性例子中，当X存在时，与ENaC靶RNA或其部分(例如，ENaC RNA靶)互补的X和Z的核苷酸序列一起的长度为约12个-约21个或更多核苷酸(例如，约12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个或更多)。在另外一个非限制性例子中，当X不存在时，与ENaC靶RNA或其部分互补的Z的核苷酸序列长度为约12个-约24个或更多核苷酸(例如，约12个、14个、16个、18个、20个、22个、24个或更多)。在一个实施方案中，X、Z和X′独立地是寡核苷酸，其中X和/或Z包含足够长度的核苷酸序列，以与靶中的核苷酸序列或其部分(例如，ENaC RNA靶)相互作用(例如，碱基配对)。在一个实施方案中，寡核苷酸X和X′的长度相同。在另一个实施方案中，寡核苷酸X和X′的长度不同。在另一个实施方案中，寡核苷酸X和Z，或Z和X’，或X、Z和X’的长度相同或不同。

当序列在本说明书中被描述为具有“足够的”长度以与另一种序列相互作用(即，碱基配对)时，它意指长度是这样的，从而使得2种序列之间形成的键(例如，氢键)数目足以使得2种序列在目的条件下能够形成双链体。此类条件可以是体外的(例如，对于诊断或测定目的)或体内的(例如，对于治疗目的)。测定此类长度是简单和常规的事情。

在一个实施方案中，本发明的特征在于具有式DFO-I(a)的双链寡核苷酸构建体：

5′-p-X Z X′-3′

3′-X′Z X-p-5′

其中Z包含回文或重复核酸序列或者具有一个或多个经修饰的核苷酸(例如具有经修饰的碱基例如2-氨基嘌呤、2-氨基-1，6-二氢嘌呤或通用碱基的核苷酸)的回文或重复样核酸序列，例如长度为偶数数目的约2个-约24个核苷酸(例如，约2个、4个、6个、8个、10个、12个、14个、16个、18个、20个、22个或24个核苷酸)，X代表例如长度约1个-约21个核苷酸(例如，约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或21个核苷酸)的核酸序列，X′包含例如长度约1个-约21个核苷酸(例如，约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或21个核苷酸)的、具有对于序列X或其部分的核苷酸序列互补性的核酸序列，p包含可以存在或不存在的末端磷酸基，且其中X和Z各自独立地包含这样的核苷酸序列，其与ENaC靶核酸序列或其部分(例如，ENaC RNA靶)互补且具有足够的长度以与ENaC靶核酸序列或其部分(例如，ENaC RNA靶)相互作用。例如，序列X独立地可以包含长度为约12个-约21个或更多(例如，约12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个或更多)核苷酸的序列，其与靶核苷酸序列或其部分(例如，ENaC RNA靶)互补。在另一个非限制性例子中，与靶序列或其部分互补的X和Z的核苷酸序列一起(当X存在时)的长度为约12个-约21个或更多核苷酸(例如，约12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个或更多)。在另外一个非限制性例子中，当X不存在时，与靶序列或其部分互补的Z的核苷酸序列长度为约12个-约24个或更多核苷酸(例如，约12个、14个、16个、18个、20个、22个、24个或更多)。在一个实施方案中，X、Z和X′独立地是寡核苷酸，其中X和/或Z包含足够长度的核苷酸序列，以与靶序列中的核苷酸序列或其部分(例如，ENaC RNA靶)相互作用(例如，碱基配对)。在一个实施方案中，寡核苷酸X和X′的长度相同。在另一个实施方案中，寡核苷酸X和X′的长度不同。在另一个实施方案中，寡核苷酸X和Z，或Z和X’，或X、Z和X’的长度相同或不同。在一个实施方案中，式I(a)的双链寡核苷酸构建体包括一个或多个，具体地1个、2个、3个或4个错配，其程度至此类错配不显著地减少双链寡核苷酸抑制ENaC靶基因表达的能力。

在一个实施方案中，本发明的DFO分子包含具有式DFO-II的结构：

5′-p-X X′-3′

其中X和X′各自独立地是长度约12个核苷酸-约21个核苷酸的寡核苷酸，其中X包含例如长度约12个-约21个核苷酸(例如，约12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或21个核苷酸)的核酸序列，X′包含例如长度约12个-约21个核苷酸(例如，约12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或21个核苷酸)的、具有对于序列X或其部分的核苷酸序列互补性的核酸序列，p包含可以存在或不存在的末端磷酸基，且其中X包含这样的核苷酸序列，其与靶核酸序列(例如，ENaC靶RNA)或其部分互补且具有足够的长度以与靶核酸序列或其部分相互作用(例如，碱基配对)。在一个实施方案中，寡核苷酸X和X′的长度相同。在另一个实施方案中，寡核苷酸X和X′的长度不同。在一个实施方案中，寡核苷酸X和X’的长度足以形成相对稳定的双链寡核苷酸。

在一个实施方案中，本发明的特征在于具有式DFO-II(a)的双链寡核苷酸构建体：

5′-p-X X′-3′

3′-X′X-p-5′

其中X和X′各自独立地是长度约12个核苷酸-约21个核苷酸的寡核苷酸，其中X包含例如长度约12个-约21个核苷酸(例如，约12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或21个核苷酸)的核酸序列，X′包含例如长度约12个-约21个核苷酸(例如，约12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或21个核苷酸)的、具有对于序列X或其部分的核苷酸序列互补性的核酸序列，p包含可以存在或不存在的末端磷酸基，且其中X包含这样的核苷酸序列，其与靶核酸序列或其部分(例如，ENaC RNA靶)互补且具有足够的长度以与靶核酸序列(例如，ENaC靶RNA)或其部分相互作用(例如，碱基配对)。在一个实施方案中，寡核苷酸X和X′的长度相同。在另一个实施方案中，寡核苷酸X和X′的长度不同。在一个实施方案中，寡核苷酸X和X’的长度足以形成相对稳定的双链寡核苷酸。在一个实施方案中，式II(a)的双链寡核苷酸构建体包括一个或多个，具体地1个、2个、3个或4个错配，其程度至此类错配不显著地减少双链寡核苷酸抑制ENaC靶基因表达的能力。

在一个实施方案中，本发明的特征在于具有式DFO-I(b)的DFO分子：

5′-p-Z-3′

其中Z包含任选包括一个或多个非标准的或经修饰的核苷酸(例如具有经修饰的碱基例如2-氨基嘌呤或通用碱基的核苷酸)的回文或重复核酸序列，所述非标准的或经修饰的核苷酸可以促进与其他核苷酸的碱基配对。Z可以具有例如足以与靶核酸(例如，ENaC靶RNA)分子的核苷酸序列相互作用(例如，碱基配对)的长度，优选长度至少12个核苷酸，具体地约12个-约24个核苷酸(例如，约12个、14个、16个、18个、20个、22个或24个核苷酸)。p表示可以存在或不存在的末端磷酸基。

在一个实施方案中，具有式DFO-I、DFO-I(a)、DFO-I(b)、DFO-II(a)或DFO-II中任何一个的DFO分子可以包含化学修饰，其如本文所描述，但不限于例如具有式I-VII中任何一个的核苷酸、如表8中描述的稳定化学物、或如本文的各种实施方案中描述的经修饰的核苷酸和非核苷酸的任何其他组合。

在一个实施方案中，具有式DFO-I、DFO-I(a)和DFO-I(b)的DFO构建体的Z中的回文或重复序列或经修饰的核苷酸(例如，具有经修饰的碱基例如2-氨基嘌呤或通用碱基的核苷酸)包含化学修饰的核苷酸，其能够与ENaC靶核酸序列的部分相互作用(例如，可以形成沃森克里克碱基对或非沃森克里克碱基对的经修饰的碱基类似物)。

在一个实施方案中，本发明的DFO分子，例如具有式DFO-I或DFO-II的DFO包含约15个-约40个核苷酸(例如，约15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个或40个核苷酸)。在一个实施方案中，本发明的DFO分子包含一种或多种化学修饰。在一个非限制性例子中，将化学修饰的核苷酸和/或非核苷酸引入本发明的核酸分子内提供了克服外源递送的未修饰的RNA分子固有的体内稳定性和生物利用率的潜在局限性中的有力工具。例如，化学修饰的核酸分子的使用可以使对于给定疗效较低剂量的特定核酸分子成为可能，因为化学修饰的核酸分子在血清中或在细胞或组织中倾向于具有较长的半衰期。此外，通过不仅增强半衰期而且促进核酸分子靶向特定器官、细胞或组织和/或改善核酸分子的细胞摄取，某些化学修饰可以改善核酸分子的生物利用率和/或效力。因此，即使与天然/未修饰的核酸分子相比较，例如，当与未修饰的RNA分子相比较时，化学修饰的核酸分子的活性在体外减少，但由于分子改善的稳定性、效力、效应持续时间、生物利用率和/或递送，经修饰的核酸分子的总体活性也可以大于天然或未修饰的核酸分子。

本发明的多功能或多靶向siNA分子

在一个实施方案中，本发明的特征在于包含多功能短干扰核酸(多功能siNA)分子的siNA分子，其调节生物系统例如细胞、组织或生物中的一种或多种基因的表达。本发明的多功能短干扰核酸(多功能siNA)分子可以靶向靶核酸序列的超过一个区域，或可以靶向超过一种不同的靶核酸分子(例如，ENaC RNA靶)的序列。本发明的多功能siNA分子可以化学合成或由转录单位和/或载体表达。本发明的多功能siNA分子提供用于多种人应用、治疗、诊断、农业、兽医、靶确认、基因组发现、基因工程和药物基因组学应用的有用试剂和方法。

申请人在本文中证实某些寡核苷酸是基因表达的序列特异性调节的有效介质，所述寡核苷酸为了方便起见且非限制性地在本文中称为多功能短干扰核酸或多功能siNA分子。本发明的多功能siNA分子与本领域已知的其他核酸序列(例如，siRNA、miRNA、stRNA、shRNA、反义寡核苷酸等)的不同之处在于它们代表这样设计的一类多核苷酸分子，从而使得多功能siNA构建体中的每条链包含与一种或多种靶核酸分子中的不同核酸序列互补的核苷酸序列。本发明的单个多功能siNA分子(一般是双链分子)因此可以靶向超过一种(例如，2种、3种、4种、5种或更多)不同的靶核酸靶分子。本发明的核酸分子也可以靶向相同靶核酸序列的超过一个(例如，2个、3个、4个、5个或更多)区域。照这样，本发明的多功能siNA分子在下调或抑制一种或多种靶核酸分子的表达中是有用的。例如，本发明的多功能siNA分子可以靶向(例如与之具有互补性)选自ENaC、ENaC同种型或其任何的核酸分子。通过用一种多功能siNA构建体减少或抑制超过一种靶核酸分子的表达，本发明的多功能siNA分子代表一类有效的治疗剂，其可以提供疾病(例如呼吸性)相关途径内的多重靶的同时抑制。此类同时抑制可以提供协同治疗处理策略，而无需分开的临床前和临床开发努力或复杂的管理机构批准过程。

靶向靶核酸分子(例如，ENaC靶RNA或DNA)的超过一个区域的多功能siNA分子的用途预期提供基因表达的有效抑制。例如，本发明的单个多功能siNA构建体可以靶向靶核酸分子(例如，ENaC RNA或DNA)的保守和可变区，从而允许下调或抑制例如不同靶ENaC同工型或变体以最佳化疗效和使毒性降到最低，或允许靶向ENaC靶核酸分子的编码和非编码区。

一般地，双链寡核苷酸由2种不同的寡核苷酸装配形成，其中一条链的寡核苷酸序列与第二条链的寡核苷酸序列互补；此类双链寡核苷酸一般由2种分开的寡核苷酸(例如，siRNA)装配。可替代地，双链体可以由在其自身上折叠的单个分子(例如，shRNA或短发夹RNA)形成。这些双链寡核苷酸是本领域已知介导RNA干扰的且全部具有共同特征，其中只有1个核苷酸序列区域(引导序列或反义序列)与靶核酸序列具有互补性，且另一条链(有义序列)包含与靶核酸序列同源的核苷酸序列。一般地，反义序列保留在活性RISC复合物中，且通过反义序列与靶序列的互补碱基配对将RISC引导至靶核苷酸序列，用于介导序列特异性RNA干扰。本领域已知在一些细胞培养系统中，某些类型的未修饰的siRNA可以显示出“脱靶”效应。假设这种脱靶效应涉及在RISC复合物中siRNA的有义序列而不是反义序列的参与(参见例如Schwarz等人，2003，Cell，115，199-208)。在这种情况下，有义序列被认为将RISC复合物指导至不同于预期靶序列的序列(脱靶序列)，从而导致脱靶序列的抑制。在这些双链核酸分子中，每条链与不同的靶核酸序列互补。然而，受这些dsRNA影响的脱靶是完全无法预测的且是非特异性的。

不同于本领域已知的双链核酸分子，申请人已开发了使用单个多功能siNA构建体下调或抑制超过一种靶核酸序列的表达的新的、潜在地节省成本和简化的方法。本发明的多功能siNA分子被设计为双链或部分双链的，从而使得多功能siNA的每条链或区域的部分与选择的靶核酸序列互补。照这样，本发明的多功能siNA分子不限于彼此互补的靶向序列，而是任何2种不同的靶核酸序列。本发明的多功能siNA分子被这样设计，从而使得与给定靶核酸序列互补的多功能siNA分子的每条链或区域具有合适的长度(例如，长度为约16个-约28个核苷酸，优选长度为约18个-约28个核苷酸)用于介导针对靶核酸序列的RNA干扰。靶核酸序列和多功能siNA的链或区域之间的互补性必须是足够的(至少约8个碱基对)以用于经由RNA干扰切割靶核酸序列。本发明的多功能siNA预期使对于某些siRNA序列例如Schwarz等人，同上中描述的那些可见的脱靶效应降到最低。

已报道长度29个碱基对-36个碱基对的dsRNA(Tuschl等人，国际PCT公开号WO 02/44321)不介导RNAi。这些dsRNA无活性的一个原因可能是缺乏周转或与靶RNA序列相互作用的链的解离，从而使得RISC复合物不能与靶RNA的多个拷贝有效相互作用，从而导致RNAi过程的效力和功效显著下降。申请人已惊讶地发现本发明的多功能siNA可以克服这个障碍且能够增强RNAi过程的功效和效力。照这样，在本发明的某些实施方案中，长度约29个-约36个碱基对的多功能siNA可以这样设计，从而使得多功能siNA分子的每条链的部分包含长度足以有效介导RNAi(例如，约15个-约23个碱基对)的与靶核酸互补的核苷酸序列区域和与靶核酸不互补的核苷酸序列区域。通过在多功能siNA的每条链中具有互补和非互补部分，多功能siNA可以介导针对靶核酸序列的RNA干扰，而不被抑制周转或解离(例如，当每条链的长度太长而不能介导针对分别的靶核酸序列的RNAi时)。此外，具有内部重叠区的本发明多功能siNA分子的设计允许多功能siNA分子具有有利的(减少的)大小用于介导RNA干扰，和具有非常适合于用作治疗剂的大小(例如，其中每条链独立地长度为约18个-约28个核苷酸)。非限制性例子在图13-25和表1b中举例说明。

在一个实施方案中，本发明的多功能siNA分子包含第一个区域和第二个区域，其中多功能siNA的所述第一个区域包含与第一种靶核酸分子的核酸序列互补的核苷酸序列，且多功能siNA的所述第二个区域包含与第二种靶核酸分子的核酸序列互补的核苷酸序列。在一个实施方案中，本发明的多功能siNA分子包含第一个区域和第二个区域，其中多功能siNA的所述第一个区域包含与靶核酸分子的第一个区域的核酸序列互补的核苷酸序列，且多功能siNA的所述第二个区域包含与靶核酸分子的第二个区域的核酸序列互补的核苷酸序列。在另一个实施方案中，多功能siNA的第一个区域和第二个区域可以包含共享某一程度的互补性(例如，约1个-约10个互补核苷酸)的分开的核酸序列。在某些实施方案中，包含分开的核酸序列的多功能siNA构建体可以通过本领域已知的方法和试剂容易地进行合成后连接，并且此类连接的构建体在本发明的范围内。可替代地，多功能siNA的第一个区域和第二个区域可以包含具有某一程度的自互补性的单一核酸序列，例如在发夹或茎环结构中。此类双链和发夹多功能短干扰核酸的非限制性例子分别在图13和14举例说明。这些多功能短干扰核酸(多功能siNA)可以任选包括某些重叠核苷酸序列，其中此类重叠核苷酸序列存在于多功能siNA的第一个区域和第二个区域之间(参见例如图15和16)。在一个实施方案中，第一种靶核酸分子和第二种核酸靶分子是一种或多种ENaC靶序列，例如任何ENaC核酸序列或ENaC同种型核酸序列。

在一个实施方案中，本发明的特征在于多功能短干扰核酸(多功能siNA)分子，其中多功能siNA的每条链独立地包含与不同的靶核酸序列互补的核酸序列的第一个区域和与靶序列不互补的核苷酸序列的第二个区域。每条链的靶核酸序列在相同靶核酸分子或不同靶核酸分子中。在一个实施方案中，一种或多种核酸靶分子是一种或多种ENaC靶序列，例如任何ENaC或ENaC同种型核酸序列。

在另一个实施方案中，多功能siNA包含2条链，其中：(a)第一条链包含与靶核酸序列具有序列互补性的区域(互补区域1)，和与靶核苷酸序列没有序列互补性的区域(非互补区域1)；(b)多功能siNA的第二条链包含与靶核酸序列具有序列互补性的区域(互补区域2)，所述靶核酸序列不同于与第一条链核苷酸序列互补的靶核苷酸序列，和与互补区域2的靶核苷酸序列没有序列互补性的区域(非互补区域2)；(c)第一条链的互补区域1包含与第二条链的非互补区域2中的核苷酸序列互补的核苷酸序列，且第二条链的互补区域2包含与与第一条链的非互补区域1中的核苷酸序列互补的核苷酸序列。互补区域1和互补区域2的靶核酸序列在相同靶核酸分子或不同靶核酸分子中。在一个实施方案中，一种或多种核酸靶分子是一种或多种ENaC靶序列，例如任何ENaC或ENaC同种型核酸序列。

在另一个实施方案中，多功能siNA包含2条链，其中：(a)第一条链包含与衍生自基因(例如，第一种ENaC基因)的靶核酸序列具有序列互补性的区域(互补区域1)，和与互补区域1的靶核苷酸序列没有序列互补性的区域(非互补区域1)；(b)多功能siNA的第二条链包含与衍生自基因(例如，第二种ENaC基因)的靶核酸序列具有序列互补性的区域(互补区域2)，所述基因不同于与互补区域1的基因，和与互补区域2的靶核苷酸序列没有序列互补性的区域(非互补区域2)；(c)第一条链的互补区域1包含与第二条链的非互补区域2中的核苷酸序列互补的核苷酸序列，且第二条链的互补区域2包含与与第一条链的非互补区域1中的核苷酸序列互补的核苷酸序列。在一个实施方案中，核酸靶序列包括一种或多种ENaC靶序列，例如任何ENaC或ENaC同种型核酸序列。

在另一个实施方案中，多功能siNA包含2条链，其中：(a)第一条链包含与衍生自第一种基因(例如，ENaC基因)的靶核酸序列具有序列互补性的区域(互补区域1)，和与互补区域1的靶核苷酸序列没有序列互补性的区域(非互补区域1)；(b)多功能siNA的第二条链包含与第二种靶核酸序列具有序列互补性的区域(互补区域2)，所述第二种靶核酸序列不同于互补区域1的第一种靶核酸序列，然而，前提是关于互补区域1的靶核酸序列和关于互补区域2的靶核酸序列都衍生自相同基因，和与互补区域2的靶核苷酸序列没有序列互补性的区域(非互补区域2)；(c)第一条链的互补区域1包含与第二条链的非互补区域2中的核苷酸序列互补的核苷酸序列，且第二条链的互补区域2包含与与第一条链的非互补区域1中的核苷酸序列互补的核苷酸序列。在一个实施方案中，核酸靶序列包括一种或多种ENaC靶序列，例如任何ENaC或ENaC同种型核酸序列。

在一个实施方案中，本发明的特征在于多功能短干扰核酸(多功能siNA)分子，其中所述多功能siNA包含2种互补核酸序列，其中第一种序列包含与第一种靶核酸分子内的核苷酸序列具有核苷酸序列互补性的第一个区域，且其中第二种序列包含与相同靶核酸分子内的不同核苷酸序列具有核苷酸序列互补性的第一个区域。优选地，第一种序列的第一个区域也与第二种序列的第二个区域的核苷酸序列互补，且第二种序列的第一个区域与第一种序列的第二个区域的核苷酸序列互补。在一个实施方案中，核酸靶序列包括一种或多种ENaC靶序列，例如任何ENaC或ENaC同种型核酸序列。

在一个实施方案中，本发明的特征在于多功能短干扰核酸(多功能siNA)分子，其中所述多功能siNA包含2种互补核酸序列，其中第一种序列包含与第一种靶核酸分子内的核苷酸序列具有核苷酸序列互补性的第一个区域，且其中第二种序列包含与第二种靶核酸分子内的不同核苷酸序列具有核苷酸序列互补性的第一个区域。优选地，第一种序列的第一个区域也与第二种序列的第二个区域的核苷酸序列互补，且其中第二种序列的第一个区域与第一种序列的第二个区域的核苷酸序列互补。在一个实施方案中，核酸靶序列包括一种或多种ENaC靶序列，例如任何ENaC或ENaC同种型核酸序列。

在一个实施方案中，本发明的特征在于包含第一个区域和第二个区域的多功能siNA分子，其中所述第一个区域包含与第一种靶核酸分子内的核酸序列互补的具有约18个-约28个核苷酸的核酸序列，且所述第二个区域包含与第二种靶核酸分子内的不同核酸序列互补的具有约18个-约28个核苷酸的核苷酸序列。在一个实施方案中，第一种核酸靶分子和第二种靶核酸分子选自任何ENaC靶序列，例如任何ENaC或ENaC同种型核酸序列。

在一个实施方案中，本发明的特征在于包含第一个区域和第二个区域的多功能siNA分子，其中所述第一个区域包含与靶核酸分子内的核酸序列互补的具有约18个-约28个核苷酸的核酸序列，且所述第二个区域包含与相同靶核酸分子内的不同核酸序列互补的具有约18个-约28个核苷酸的核苷酸序列。在一个实施方案中，核酸靶分子选自任何ENaC靶序列，例如任何ENaC或任何ENaC同种型核酸序列。

在一个实施方案中，本发明的特征在于双链多功能短干扰核酸(多功能siNA)分子，其中多功能siNA的一条链包含具有与第一种靶核酸序列互补的核苷酸序列的第一个区域，且第二条链包含具有与第二种靶核酸序列互补的核苷酸序列的第一个区域。第一种和第二种靶核酸序列可以存在于分开的靶核酸分子中，或可以是相同靶核酸分子内的不同区域。照这样，本发明的多功能siNA分子可以用于靶向不同基因、相同基因的同种型、一种或多种基因转录物的突变和保守区、或相同或不同基因或基因转录物的编码和非编码序列的表达。在一个实施方案中，第一种核酸靶序列和第二种靶核酸序列选自任何ENaC靶序列，例如任何ENaC或ENaC同种型核酸序列。

在一个实施方案中，本发明的靶核酸分子编码单一蛋白质。在另一个实施方案中，靶核酸分子编码超过一种蛋白质(例如，1种、2种、3种、4种、5种或更多蛋白质)。照这样，本发明的多功能siNA构建体可以用于下调或抑制几种蛋白质(例如任何ENaC、任何ENaC同种型蛋白质或其组合)的表达。例如，在一条链中包含与衍生自ENaC靶(例如任何ENaC或ENaC同种型)的第一种靶核酸序列具有核苷酸序列互补性的区域，和第二条链包含与第二种ENaC靶(例如任何ENaC或ENaC同种型)具有核苷酸序列互补性的区域的多功能siNA分子可以通过靶向多种ENaC基因用于下调、抑制或关闭特定生物途径。

在一个实施方案中，本发明利用不同ENaC同工型例如任何ENaC或其同种型中存在的保守核苷酸序列。通过设计多功能siNA，其方式为其中一条链包括与各种ENaC家族成员中保守的靶核酸序列互补的序列，和另一条链任选包括与ENaC途径靶核酸序列互补的序列，可以使用单个多功能siNA有选择地和有效地调节或抑制ENaC疾病相关生物途径。

在一个实施方案中，本发明的多功能短干扰核酸(多功能siNA)包含第一个区域和第二个区域，其中所述第一个区域包含与第一种ENaC靶的第一种ENaC RNA互补的核苷酸序列，和所述第二个区域包含与第二种ENaC靶的第二种ENaC RNA互补的核苷酸序列。在一个实施方案中，第一个和第二个区域可以包括与在相同ENaC同工型内的不同ENaC靶位点的共享或保守或在ENaC同工型的不同种类中共享的RNA序列互补的核苷酸序列。

在一个实施方案中，本发明的双链多功能siNA分子包含具有式MF-I的结构：

5′-p-X Z X′-3′

3′-Y′Z Y-p-5′

其中5’-p-XZX’-3’和5’-p-YZY’-3’各自独立地是长度约20个核苷酸-约300个核苷酸的寡核苷酸，优选约20个-约200个核苷酸，约20个-约100个核苷酸，约20个-约40个核苷酸，约20个-约40个核苷酸，约24个-约38个核苷酸，或约26个-约38个核苷酸；XZ包含与第一种ENaC靶核酸序列互补的核酸序列；YZ是包含与第二种ENaC靶核酸序列互补的核酸序列的寡核苷酸；Z包含自互补的长度约1个-约24个核苷酸(例如，约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个或24个核苷酸)的核苷酸序列；X包含与区域Y’中存在的核苷酸序列互补的长度约1个-约100个核苷酸的核苷酸序列，优选约1个-约21个核苷酸(例如，约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或21个核苷酸)；Y包含与区域X’中存在的核苷酸序列互补的长度约1个-约100个核苷酸的核苷酸序列，优选约1个-约21个核苷酸(例如，约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或21个核苷酸)；每个p包含独立地存在或不存在的末端磷酸基；XZ和YZ各自独立地具有足以分别与第一种和第二种靶核酸序列或其部分稳定地相互作用(即，碱基配对)的长度。例如，每种序列X和Y可以独立地包含长度为约12个-约21个或更多核苷酸(例如，约12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个或更多)的序列，其与不同靶核酸分子例如靶RNA或其部分中的靶核苷酸序列互补。在另一个非限制性例子中，与第一种ENaC靶核酸序列或其部分互补的X和Z的核苷酸序列一起的长度为约12个-约21个或更多核苷酸(例如，约12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个或更多)。在另一个非限制性例子中，与第二种ENaC靶核酸序列或其部分互补的Y和Z的核苷酸序列一起的长度为约12个-约21个或更多核苷酸(例如，约12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个或更多)。在一个实施方案中，第一种ENaC靶核酸序列和第二种ENaC靶核酸序列存在于相同靶核酸分子(例如，ENaC靶RNA或ENaC途径RNA)中。在另一个实施方案中，第一种ENaC靶核酸序列和第二种ENaC靶核酸序列存在于不同靶核酸分子(例如，ENaC靶RNA和ENaC途径RNA)中。在一个实施方案中，Z包含回文或重复序列。在一个实施方案中，寡核苷酸X和X’的长度相同。在另一个实施方案中，寡核苷酸X和X’的长度不同。在一个实施方案中，寡核苷酸Y和Y’的长度相同。在另一个实施方案中，寡核苷酸Y和Y’的长度不同。在一个实施方案中，MF-I的双链寡核苷酸构建体包括一个或多个，具体地1个、2个、3个或4个错配，其程度至此类错配不显著地减少双链寡核苷酸抑制靶基因表达的能力。

在一个实施方案中，本发明的多功能siNA分子包含具有式MF-II的结构：

5′-p-X X′-3′

3′-Y′Y-p-5′

其中5’-p-XX’-3’和5’-p-YY’-3’各自独立地是长度约20个核苷酸-约300个核苷酸的寡核苷酸，优选约20个-约200个核苷酸，约20个-约100个核苷酸，约20个-约40个核苷酸，约20个-约40个核苷酸，约24个-约38个核苷酸，或约26个-约38个核苷酸；X包含与第一种靶核酸序列互补的核酸序列；Y是包含与第二种靶核酸序列互补的核酸序列的寡核苷酸；X包含与区域Y′中存在的核苷酸序列互补的长度约1个-约100个核苷酸的核苷酸序列，优选约1个-约21个核苷酸(例如，约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或21个核苷酸)；Y包含与区域X′中存在的核苷酸序列互补的长度约1个-约100个核苷酸的核苷酸序列，优选约1个-约21个核苷酸(例如，约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或21个核苷酸)；每个p包含独立地存在或不存在的末端磷酸基；X和Y各自独立地具有足以分别与第一种和第二种靶核酸序列或其部分稳定地相互作用(即，碱基配对)的长度。例如，每种序列X和Y可以独立地包含长度为约12个-约21个或更多核苷酸(例如，约12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个或更多)的序列，其与不同靶核酸分子例如ENaC靶RNA或其部分中的靶核苷酸序列互补。在一个实施方案中，第一种ENaC靶核酸序列和第二种ENaC靶核酸序列存在于相同靶核酸分子(例如，ENaC靶RNA或ENaC途径靶RNA)中。在另一个实施方案中，第一种ENaC靶核酸序列和第二种ENaC靶核酸序列存在于不同靶核酸分子(例如，ENaC靶RNA和ENaC途径靶RNA)中。在一个实施方案中，Z包含回文或重复序列。在一个实施方案中，寡核苷酸X和X′的长度相同。在另一个实施方案中，寡核苷酸X和X′的长度不同。在一个实施方案中，寡核苷酸Y和Y′的长度相同。在另一个实施方案中，寡核苷酸Y和Y′的长度不同。在一个实施方案中，式I(a)的双链寡核苷酸构建体包括一个或多个，具体地1个、2个、3个或4个错配，其程度至此类错配不显著地减少双链寡核苷酸抑制靶基因表达的能力。

在一个实施方案中，本发明的多功能siNA分子包含具有式MF-III的结构：

X    X′

Y′-W-Y

其中X、X’、Y和Y’各自独立地是长度约15个核苷酸-约50个核苷酸的寡核苷酸，优选约18个-约40个核苷酸，或约19个-约23个核苷酸；X包含与区域Y′中存在的核苷酸序列互补的核苷酸序列；X′包含与区域Y中存在的核苷酸序列互补的核苷酸序列；X和X′各自独立地具有足以分别与第一种和第二种ENaC靶核酸序列或其部分稳定地相互作用(即，碱基配对)的长度；W代表使序列Y′和Y连接的核苷酸或非核苷酸接头；且多功能siNA经由RNA干扰指导第一种和第二种ENaC靶序列的切割。在一个实施方案中，第一种ENaC靶核酸序列和第二种ENaC靶核酸序列存在于相同靶核酸分子(例如，ENaC靶RNA或ENaC途径靶RNA)中。在另一个实施方案中，第一种ENaC靶核酸序列和第二种ENaC靶核酸序列存在于不同靶核酸分子或其部分(例如，ENaC靶RNA和ENaC途径靶RNA)中。在一个实施方案中，区域W使序列Y′的3′-末端与序列Y的3′-末端连接。在一个实施方案中，区域W使序列Y′的3′-末端与序列Y的5′-末端连接。在一个实施方案中，区域W使序列Y′的5′-末端与序列Y的5′-末端连接。在一个实施方案中，区域W使序列Y′的5′-末端与序列Y的3′-末端连接。在一个实施方案中，末端磷酸基存在于序列X的5′-末端处。在一个实施方案中，末端磷酸基存在于序列X′的5′-末端处。在一个实施方案中，末端磷酸基存在于序列Y的5′-末端处。在一个实施方案中，末端磷酸基存在于序列Y′的5′-末端处。在一个实施方案中，W经由生物可降解的接头使序列Y和Y′连接。在一个实施方案中，W进一步包含缀合物、标记、适体、配体、脂质或聚合物。

在一个实施方案中，本发明的多功能siNA分子包含具有式MF-IV的结构：

X    X′

Y′-W-Y

其中X、X’、Y和Y’各自独立地是长度约15个核苷酸-约50个核苷酸的寡核苷酸，优选约18个-约40个核苷酸，或约19个-约23个核苷酸；X包含与区域Y′中存在的核苷酸序列互补的核苷酸序列；X′包含与区域Y中存在的核苷酸序列互补的核苷酸序列；Y和Y′各自独立地具有足以分别与第一种和第二种ENaC靶核酸序列或其部分稳定地相互作用(即，碱基配对)的长度；W代表使序列Y′和Y连接的核苷酸或非核苷酸接头；且多功能siNA经由RNA干扰指导第一种和第二种ENaC靶序列的切割。在一个实施方案中，第一种ENaC靶核酸序列和第二种ENaC靶核酸序列存在于相同靶核酸分子(例如，ENaC靶RNA或ENaC途径靶RNA)中。在另一个实施方案中，第一种ENaC靶核酸序列和第二种ENaC靶核酸序列存在于不同靶核酸分子或其部分(例如，ENaC靶RNA和ENaC途径靶RNA)中。在一个实施方案中，区域W使序列Y′的3′-末端与序列Y的3′-末端连接。在一个实施方案中，区域W使序列Y′的3′-末端与序列Y的5′-末端连接。在一个实施方案中，区域W使序列Y′的5′-末端与序列Y的5′-末端连接。在一个实施方案中，区域W使序列Y′的5′-末端与序列Y的3′-末端连接。在一个实施方案中，末端磷酸基存在于序列X的5′-末端处。在一个实施方案中，末端磷酸基存在于序列X′的5′-末端处。在一个实施方案中，末端磷酸基存在于序列Y的5′-末端处。在一个实施方案中，末端磷酸基存在于序列Y′的5′-末端处。在一个实施方案中，W经由生物可降解的接头使序列Y和Y′连接。在一个实施方案中，W进一步包含缀合物、标记、适体、配体、脂质或聚合物。

在一个实施方案中，本发明的多功能siNA分子包含具有式MF-V的结构：

X    X′

Y′-W-Y

其中X、X’、Y和Y’各自独立地是长度约15个核苷酸-约50个核苷酸的寡核苷酸，优选约18个-约40个核苷酸，或约19个-约23个核苷酸；X包含与区域Y′中存在的核苷酸序列互补的核苷酸序列；X′包含与区域Y中存在的核苷酸序列互补的核苷酸序列；X、X’、Y或Y’各自独立地具有足以分别与第一种、第二种、第三种或第四种ENaC靶核酸序列或其部分稳定地相互作用(即，碱基配对)的长度；W代表使序列Y′和Y连接的核苷酸或非核苷酸接头；且多功能siNA经由RNA干扰指导第一种、第二种、第三种和/或第四种靶序列的切割。在一个实施方案中，第一种、第二种、第三种和第四种ENaC靶核酸序列全都存在于相同靶核酸分子(例如，ENaC靶RNA或ENaC途径靶RNA)中。在另一个实施方案中，第一种、第二种、第三种和第四种ENaC靶核酸序列独立地存在于不同靶核酸分子或其部分(例如，ENaC靶RNA和ENaC途径靶RNA)中。在一个实施方案中，区域W使序列Y′的3′-末端与序列Y的3′-末端连接。在一个实施方案中，区域W使序列Y′的3′-末端与序列Y的5′-末端连接。在一个实施方案中，区域W使序列Y′的5′-末端与序列Y的5′-末端连接。在一个实施方案中，区域W使序列Y′的5′-末端与序列Y的3′-末端连接。在一个实施方案中，末端磷酸基存在于序列X的5′-末端处。在一个实施方案中，末端磷酸基存在于序列X′的5′-末端处。在一个实施方案中，末端磷酸基存在于序列Y的5′-末端处。在一个实施方案中，末端磷酸基存在于序列Y′的5′-末端处。在一个实施方案中，W经由生物可降解的接头使序列Y和Y′连接。在一个实施方案中，W进一步包含缀合物、标记、适体、配体、脂质或聚合物。

在一个实施方案中，本发明的多功能siNA分子(例如，具有式MF-I-MF-V中的任何一个)的区域X和Y与相同靶核酸分子的部分的不同靶核酸序列互补。在一个实施方案中，此类靶核酸序列位于RNA转录物的编码区内的不同位置处。在一个实施方案中，此类靶核酸序列包含相同RNA转录物的编码和非编码区。在一个实施方案中，此类靶核酸序列包含可变剪接转录物或此类可变剪接转录物的前体的区域。

在一个实施方案中，具有式MF-I-MF-V中的任何一个的多功能siNA分子可以包含化学修饰，其如本文所描述但不限于，例如具有本文描述的式I-VII中任何一个的核苷酸、如表8中描述的稳定化学物、或如本文的各种实施方案中描述的经修饰的核苷酸和非核苷酸的任何其他组合。

在一个实施方案中，具有式MF-I或MF-II的多功能siNA构建体的Z中的回文或重复序列或经修饰的核苷酸(例如，具有经修饰的碱基例如2-氨基嘌呤或通用碱基的核苷酸)包含化学修饰的核苷酸，其能够与靶核酸序列的部分相互作用(例如，可以形成沃森克里克碱基对或非沃森克里克碱基对的经修饰的碱基类似物)。

在一个实施方案中，本发明的多功能siNA分子，例如具有式MF-I-MF-V的多功能siNA的每条链独立地包含约15个-约40个核苷酸(例如，约15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个或40个核苷酸)。在一个实施方案中，本发明的多功能siNA分子包含一种或多种化学修饰。在非限制性例子中，将化学修饰的核苷酸和/或非核苷酸引入本发明的核酸分子内提供了克服外源递送的未修饰的RNA分子固有的体内稳定性和生物利用率的潜在局限性中的有力工具。例如，化学修饰的核酸分子的使用可以使对于给定疗效较低剂量的特定核酸分子成为可能，因为化学修饰的核酸分子在血清中或在细胞或组织中倾向于具有较长的半衰期。此外，通过不仅增强半衰期而且促进核酸分子靶向特定器官、细胞或组织和/或改善核酸分子的细胞摄取，某些化学修饰可以改善核酸分子的生物利用率和/或效力。因此，即使与天然/未修饰的核酸分子相比较，例如，当与未修饰的RNA分子相比较时，化学修饰的核酸分子的活性在体外减少，但由于分子改善的稳定性、效力、效应持续时间、生物利用率和/或递送，经修饰的核酸分子的总体活性也可以大于天然或未修饰的核酸分子。

在另一个实施方案中，本发明的特征在于多功能siNA，其中所述多功能siNA由2种分开的双链siNA装配，其中每条有义链的一个末端与另一种siNA分子的有义链的末端栓系，从而使得2条反义siNA链与其相应的有义链退火，所述有义链在一个末端处彼此栓系(参见图19)。系链(tether)或接头可以是如本领域一般已知或如本文所描述的基于核苷酸的接头或非基于核苷酸的接头。

在一个实施方案中，本发明的特征在于多功能siNA，其中所述多功能siNA由2种分开的双链siNA装配，其中siNA的一条有义链的5′-末端与另一种siNA分子的有义链的5′-末端栓系，从而使得2条反义siNA链的5′-末端与其相应的有义链退火，所述有义链在一个末端处彼此栓系，彼此背向(在相反方向上)(参见图19(A))。系链或接头可以是如本领域一般已知或如本文所描述的基于核苷酸的接头或非基于核苷酸的接头。

在一个实施方案中，本发明的特征在于多功能siNA，其中所述多功能siNA由2种分开的双链siNA装配，其中siNA的一条有义链的3′-末端与另一种siNA分子的有义链的3′-末端栓系，从而使得2条反义siNA链的5′-末端与其相应的有义链退火，所述有义链在一个末端处彼此栓系，彼此面对(参见图19(B))。系链或接头可以是如本领域一般已知或如本文所描述的基于核苷酸的接头或非基于核苷酸的接头。

在一个实施方案中，本发明的特征在于多功能siNA，其中所述多功能siNA由2种分开的双链siNA装配，其中siNA的一条有义链的5′-末端与另一种siNA分子的有义链的3′-末端栓系，从而使得一条反义siNA链的5′-末端与其相应的有义链退火，所述有义链在一个末端处彼此栓系，面对另一条反义链的3′-末端(参见图19(C-D))。系链或接头可以是如本领域一般已知或如本文所描述的基于核苷酸的接头或非基于核苷酸的接头。

在一个实施方案中，本发明的特征在于多功能siNA，其中所述多功能siNA由2种分开的双链siNA装配，其中siNA的一条反义链的5′-末端与另一种siNA分子的反义链的3′-末端栓系，从而使得一条有义siNA链的5′-末端与其相应的反义链退火，所述反义链在一个末端处彼此栓系，面对另一条有义链的3′-末端(参见图19(G-H))。在一个实施方案中，第一条反义链的5′-末端和第二条反义链的3′-末端之间的键以这样的方式设计，以便容易地切割(例如，生物可降解的接头)，从而使得多功能siNA的每条反义链的5′末端具有适合于介导基于RNA干扰的靶RNA切割的游离5′-末端。系链或接头可以是如本领域一般已知或如本文所描述的基于核苷酸的接头或非基于核苷酸的接头。

在一个实施方案中，本发明的特征在于多功能siNA，其中所述多功能siNA由2种分开的双链siNA装配，其中siNA的一条反义链的5′-末端与另一种siNA分子的反义链的5′-末端栓系，从而使得一条有义siNA链的3′-末端与其相应的反义链退火，所述反义链在一个末端处彼此栓系，面对另一条有义链的3′-末端(参见图19(E))。在一个实施方案中，第一条反义链的5′-末端和第二条反义链的5′-末端之间的键以这样的方式设计，以便容易地切割(例如，生物可降解的接头)，从而使得多功能siNA的每条反义链的5′末端具有适合于介导基于RNA干扰的靶RNA切割的游离5′-末端。系链或接头可以是如本领域一般已知或如本文所描述的基于核苷酸的接头或非基于核苷酸的接头。

在一个实施方案中，本发明的特征在于多功能siNA，其中所述多功能siNA由2种分开的双链siNA装配，其中siNA的一条反义链的3′-末端与另一种siNA分子的反义链的3′-末端栓系，从而使得一条有义siNA链的5′-末端与其相应的反义链退火，所述反义链在一个末端处彼此栓系，面对另一条有义链的3′-末端(参见图19(F))。在一个实施方案中，第一条反义链的5′-末端和第二条反义链的5′-末端之间的键以这样的方式设计，以便容易地切割(例如，生物可降解的接头)，从而使得多功能siNA的每条反义链的5′末端具有适合于介导基于RNA干扰的靶RNA切割的游离5′-末端。系链或接头可以是如本领域一般已知或如本文所描述的基于核苷酸的接头或非基于核苷酸的接头。

在上述实施方案中的任何一个中，第一种靶核酸序列或第二种靶核酸序列可以独立地包含ENaC和/或ENaC同种型。在上述实施方案中的任何一个中，第一种靶核酸序列或第二种靶核酸序列可以独立地包含ENaC或ENaC RNA同种型。在一个实施方案中，第一种ENaC靶核酸序列是ENaC靶RNA或其部分，并且第二种ENaC靶核酸序列是ENaC途径靶RNA或DNA。在一个实施方案中，第一种ENaC靶核酸序列是靶RNA、DNA或其部分，并且第二种ENaC靶核酸序列是另一种RNA、DNA或其部分。

在一个实施方案中，在本文实施方案中的任何一个中，第一种靶序列是ENaC靶序列或其部分，并且第二种靶序列是ENaC靶序列或其部分。在一个实施方案中，在本文实施方案中的任何一个中，第一种靶序列是ENaC(例如任何ENaC或ENaC同种型)靶序列或其部分，并且第二种靶序列是ENaC(例如任何ENaC或ENaC同种型)靶序列或其部分。

核酸分子的合成

长度超过100个核苷酸的核酸合成使用自动化方法是困难的，且此类分子的治疗成本是价格高得惊人的。在本发明中，小核酸基序(“小”指核酸基序长度只不过100个核苷酸，优选长度只不过80个核苷酸，和最优选长度只不过50个核苷酸；例如串联合成的个别siNA寡核苷酸序列或siNA序列)优选用于外源递送。这些分子的简单结构增加了核酸侵入蛋白质和/或RNA结构的靶区的能力。本发明的示例性分子是化学合成的，且其他类似地可以是合成的。

寡核苷酸(例如，某些经修饰的寡核苷酸或缺乏核糖核苷酸的寡核苷酸的部分)使用本领域已知的规程合成，例如如下述参考文献中所述：Caruthers等人，1992，Methods in Enzymology 211，3-19，Thompson等人，国际PCT公开号WO 99/54459，Wincott等人，1995，Nucleic AcidsRes.23，2677-2684，Wincott等人，1997，Methods Mol.Bio.，74，59，Brennan等人，1998，Biotechnol Bioeng.，61，33-45，和Brennan，美国专利号6,001,311。所有这些参考文献都引入本文作为参考。寡核苷酸的合成利用常见的核酸保护和偶联基团，例如在5′-末端处的二甲氧三苯甲基，和在3′-末端处的亚磷酰胺。在非限制性例子中，小规模的合成在394 Applied Biosystems，Inc.合成仪上进行，其使用0.2μmol规模规程，对于2′-O-甲基化核苷酸使用2.5分钟的偶联步骤和对于2′-脱氧核苷酸或2′-脱氧-2′-氟核苷酸使用45秒的偶联步骤。表9概述了在合成循环中使用的试剂的量和接触时间。可替代地，以0.2μmol规模的合成可以在96孔板合成仪上进行，例如由Protogene(Palo Alto，CA)生产的仪器，其伴随对循环最低限度的修改。相对于聚合物结合的5′-羟基，在2′-O-甲基残基的每个偶联循环中可以使用33倍过量的(0.11M的60μL＝6.6μmol)2′-O-甲基亚磷酰胺和105倍过量的S-乙基四唑(0.25M的60μL＝15μmol)。相对于聚合物结合的5′-羟基，在脱氧残基的每个偶联循环中可以使用22倍过量(0.11M的40μL＝4.4μmol)脱氧亚磷酰胺和70倍过量的S-乙基四唑(0.25M的40μL＝10μmol)。通过三苯甲基级分的比色定量测定的，在394 AppliedBiosystems，Inc.合成仪上的平均偶联得率一般为97.5-99％。关于394Applied Biosystems，Inc.合成仪的其他寡核苷酸合成试剂包括下述：脱三苯甲基作用溶液是溶于二氯甲烷的3％TCA(ABI)；加帽用溶于THF的16％N-甲基咪唑(ABI)和溶于THF的10％乙酸酐/10％2，6-二甲基吡啶(ABI)来进行；且氧化溶液是溶于THF的16.9mM I₂，49mM吡啶，9％水(PerSeptive Biosystems，Inc.)。Burdick & Jackson SynthesisGrade乙腈直接从试剂瓶中使用。S-乙基四唑溶液(溶于乙腈的0.25M)由从American International Chemical，Inc.获得的固体制成。可替代地，对于硫代磷酸酯键的引入，使用Beaucage试剂(3H-1，2-苯并二硫醇-3-酮1，1-二氧化物，溶于乙腈的0.05M)。

基于DNA的寡核苷酸的脱保护如下进行：将聚合物结合的三苯甲基依赖寡核糖核苷酸转移至4mL玻璃螺旋盖小瓶，且于65℃悬浮于40％含水甲胺(1mL)中10分钟。冷却至-20℃后，从聚合物支持体中取出上清液。将支持体用1.0mL EtOH∶MeCN∶H2O/3∶1∶1洗涤3次，涡旋且随后将上清液加入第一次的上清液中。使包含寡核糖核苷酸的组合的上清液干燥成白色粉末。在一个实施方案中，本发明的核酸分子根据下述专利中描述的方法进行合成、脱保护和分析：US6,995,259、US 6,686,463、US 6,673,918、US 6,649,751、US 6,989,442和USSN 10/190,359，所述所有专利整体引入本文作为参考。

对于包括本发明的某些siNA分子的RNA使用的合成方法遵循如下述参考文献中描述的程序：Usman等人，1987，J.Am.Chem.Soc.，109，7845；Scaringe等人，1990，Nucleic Acids Res.，18，5433；和Wincott等人，1995，Nucleic Acids Res.23，2677-2684 Wincott等人，1997，Methods Mol.Bio.，74，59，且利用常见的核酸保护和偶联基团，例如在5′-末端处的二甲氧三苯甲基，和在3′-末端处的亚磷酰胺。在非限制性例子中，小规模的合成在394 Applied Biosystems，Inc.合成仪上进行，其使用0.2μmol规模规程，对于烷基甲硅烷基保护的核苷酸使用7.5分钟的偶联步骤和对于2′-O-甲基化核苷酸使用2.5分钟的偶联步骤。表9概述了在合成循环中使用的试剂的量和接触时间。可替代地，以0.2μmol规模的合成可以在96孔板合成仪上进行，例如由Protogene(Palo Alto，CA)生产的仪器，伴随对循环最低限度的修改。相对于聚合物结合的5′-羟基，在2′-O-甲基残基的每个偶联循环中可以使用33倍过量的(0.11M的60μL＝6.6μmol)2′-O-甲基亚磷酰胺和75倍过量的S-乙基四唑(0.25M的60μL＝15μmol)。相对于聚合物结合的5′-羟基，在核糖(ribo)残基的每个偶联循环中可以使用66倍过量(0.11M的120μL＝13.2μmol)烷基甲硅烷基(核糖)保护的亚磷酰胺和150倍过量的S-乙基四唑(0.25M的120μL＝30μmol)。通过三苯甲基级分的比色定量测定的，在394Applied Biosystems，Inc.合成仪上的平均偶联得率一般为97.5-99％。关于394 Applied Biosystems，Inc.合成仪的其他寡核苷酸合成试剂包括下述：脱三苯甲基作用溶液是溶于二氯甲烷的3％TCA(ABI)；加帽用溶于THF的16％N-甲基咪唑(ABI)和溶于THF的10％乙酸酐/10％2，6-二甲基吡啶(ABI)来进行；氧化溶液是溶于THF的16.9mM I₂，49mM吡啶，9％水(PerSeptiveBiosystems，Inc.)。Burdick & Jackson Synthesis Grade乙腈直接从试剂瓶中使用。S-乙基四唑溶液(溶于乙腈的0.25M)由从AmericanInternational Chemical，Inc.获得的固体制成。可替代地，对于硫代磷酸酯键的引入，使用Beaucage试剂(3H-1，2-苯并二硫醇-3-酮1，1-二氧化物，溶于乙腈的0.05M)。

RNA的脱保护使用双罐或单罐规程进行。对于双罐规程，将聚合物结合的三苯甲基依赖寡核糖核苷酸转移至4mL玻璃螺旋盖小瓶，且于65℃悬浮于40％含水甲胺(1mL)中10分钟。冷却至-20℃后，从聚合物支持体中取出上清液。将支持体用1.0mL EtOH∶MeCN∶H2O/3∶1∶1洗涤3次，涡旋且随后将上清液加入第一次的上清液中。使包含寡核糖核苷酸的组合的上清液干燥成白色粉末。将碱基脱保护的寡核糖核苷酸重悬浮于无水TEA/HF/NMP溶液(300μL的1.5mL N-甲基吡咯烷酮、750μL TEA和1mL TEA·3HF溶液以提供1.4M HF浓度)中且加热至65℃。1.5小时后，寡聚体用1.5M NH₄HCO₃猝灭。在一个实施方案中，本发明的核酸分子根据下述专利中描述的方法进行合成、脱保护和分析：US 6,995,259、US 6,686,463、US 6,673,918、US6,649,751、US 6,989,442和USSN 10/190,359，所述所有专利整体引入本文作为参考。

可替代地，对于单罐规程，将聚合物结合的三苯甲基依赖寡核糖核苷酸转移至4mL玻璃螺旋盖小瓶，且于65℃悬浮于33％乙醇甲胺/DMSO：1/1(0.8mL)溶液中15分钟。将小瓶置于室温，加入TEA·3HF(0.1mL)且使小瓶于65℃加热15分钟。使样品于-20℃冷却且随后用1.5M NH₄HCO₃猝灭。

对于三苯甲基依赖寡聚体的纯化，将猝灭的NH₄HCO₃溶液装载到包含C-18的药液筒上，所述药液筒用乙腈随后为50mM TEAA预先洗涤。用水将装载的药液筒洗涤后，RNA用0.5％TFA脱三苯甲基13分钟。药液筒随后再次用水洗涤，用1M NaCl进行盐交换且再次用水洗涤。寡核苷酸随后用30％乙腈进行洗脱。

平均逐步偶联得率一般为＞98％(Wincott等人，1995 Nucleic AcidsRes.23，2677-2684)。本领域技术人员将认识到合成的规模可以调整至大于或小于上述例子，包括但不限于96孔形式。

可替代地，本发明的核酸分子可以分开合成且在合成后连接在一起，例如通过连接(Moore等人，1992，Science 256，9923；Draper等人，国际PCT公开号WO 93/23569；Shabarova等人，1991，NucleicAcids Research 19，4247；Bellon等人，1997，Nucleosides & Nucleotides，16，951；Bellon等人，1997，Bioconjugate Chem.8，204)，或通过在合成和/或脱保护后杂交。

本发明的siNA分子可以经由如本文实施例1中描述的串联合成方法进行合成，其中2条siNA链被合成为由可切割接头分开的单个邻接寡核苷酸片段或链，其随后进行切割以提供分开的siNA片段或链，所述siNA片段或链杂交且允许siNA双链体的纯化。接头可以是多核苷酸接头或非核苷酸接头。如本文所描述的siNA的串联合成可以容易地适应多孔/多板合成平台，例如96孔或类似地更大的多孔平台。如本文所描述的siNA的串联合成还可以容易地适应使用分批反应器、合成柱等的大规模合成平台。

siNA分子还可以由2种不同的核酸链或片段装配，其中一个片段包括有义区且第二个片段包括RNA分子的反义区。

本发明的核酸分子可以通过用核酸酶抗性基团修饰进行广泛修饰以增强稳定性，所述核酸酶抗性基团例如2′-氨基、2′-C-烯丙基、2′-氟、2′-O-甲基、2′-H(关于综述参见Usman和Cedergren，1992，TIBS17，34；Usman等人，1994，Nucleic Acids Symp.Ser.31，163)。siNA构建体可以通过凝胶电泳使用一般方法进行纯化，或可以通过高压液相层析(HPLC；参见Wincott等人，同上，其在此整体引入本文作为参考)进行纯化且重悬浮于水中。

在本发明的另一个方面，本发明的siNA分子由插入到DNA或RNA载体内的转录单位表达。重组载体可以是DNA质粒或病毒载体。表达siNA的病毒载体可以基于但不限于下述进行构建：腺伴随病毒、逆转录病毒、腺病毒或甲病毒。能够表达siNA分子的重组载体可以如本文所描述的递送，且在靶细胞中持续。可替代地，可以使用提供siNA分子的瞬时表达的病毒载体。

本发明的核酸分子的活性优化

化学合成具有修饰(碱基、糖和/或磷酸)的核酸分子可以防止其经由血清核糖核酸酶的降解，这可以增加其效力(参见例如，Eckstein等人，国际公开号WO 92/07065；Perrault等人，1990 Nature 344，565；Pieken等人，1991，Science 253，314；Usman和Cedergren，1992，Trendsin Biochem.Sci.17，334；Usman等人，国际公开号WO 93/15187；和Rossi等人，国际公开号WO 91/03162；Sproat，美国专利号5,334,711；Gold等人，美国专利号6,300,074；和Burgin等人，同上；所述所有专利引入本文作为参考)。所有上述参考文献描述了可以对本文描述的核酸分子的碱基、磷酸和/或糖部分进行的各种化学修饰。描述了增强其在细胞中的功效的修饰，和从核酸分子中去除碱基以缩短寡核苷酸合成时间且减少化学需求。

在本领域中存在描述糖、碱基和磷酸修饰的几个例子，所述修饰可以引入核酸分子内，显著增强其核酸酶稳定性和功效。例如，通过用核酸酶抗性基团修饰对寡核苷酸进行修饰以增强稳定性和/或增强生物活性，所述核酸酶抗性基团例如2′-氨基、2′-C-烯丙基、2′-氟、2′-O-甲基、2′-O-烯丙基、2′-H、核苷酸碱基修饰(关于综述参见Usman和Cedergren，1992，TIBS.17，34；Usman等人，1994，Nucleic Acids Symp.Ser.31，163；Burgin等人，1996，Biochemistry，35，14090)。核酸分子的糖修饰在本领域中已得到广泛描述(参见Eckstein等人，国际公开PCT号WO 92/07065；Perrault等人，Nature，1990，344，565-568；Pieken等人，Science，1991，253，314-317；Usman和Cedergren，Trendsin Biochem.Sci.，1992，17，334-339；Usman等人，国际公开PCT号WO 93/15187；Sproat，美国专利号5,334,711和Beigelman等人，1995，J.Biol.Chem.，270，25702；Beigelman等人，国际PCT公开号WO97/26270；Beigelman等人，美国专利号5,716,824；Usman等人，美国专利号5,627,053；Woolf等人，国际PCT公开号WO 98/13526；Thompson等人，于1998年4月20日提交的USSN 60/082,404；Karpeisky等人，1998，Tetrahedron Lett.，39，1131；Earnshaw和Gait，1998，Biopolymers(Nucleic Acid Sciences)，48，39-55；Verma和Eckstein，1998，Annu.Rev.Biochem.，67，99-134；和Burlina等人，1997，Bioorg.Med.Chem.，5，1999-2010；所述所有参考文献在此整体引入本文作为参考)。此类出版物描述了确定糖、碱基和/或磷酸修饰等掺入核酸分子内而不调节催化的位置的一般方法和策略，并且引入本文作为参考。考虑到此类教导，类似修饰可以如本文所描述的用于修饰本发明的siNA核酸分子，只要siNA在细胞中促进RNAi的能力未被显著抑制。

在一个实施方案中，本发明的核酸分子如US 20050020521中所述的进行化学修饰，所述专利整体引入本文作为参考。

尽管用硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯和/或5′-甲基膦酸酯键化学修饰寡核苷酸核苷酸间键改善稳定性，但过度修饰可以引起某些毒性或减少的活性。因此，当设计核酸分子时，这些核苷酸间键的量应降到最低。这些键浓度中的减少应降低毒性，从而导致这些分子增加的功效和更高的特异性。

提供了具有维持或增强活性的化学修饰的短干扰核酸(siNA)分子。此类核酸一般也比未修饰的核酸对核酸酶更有抵抗力。因此，体外和/或体内活性不应显著降低。在其中调节是目的的情况下，外源递送的治疗核酸分子应最优地在细胞内是稳定的，直至靶RNA的翻译已足够长久地调节，以减少不希望有的蛋白质的水平。取决于疾病状态，这个时间段从小时到天不等。RNA和DNA化学合成中的改善(Wincott等人，1995，Nucleic Acids Res.23，2677；Caruthers等人，1992，Methodsin Enzymology 211，3-19(引入本文作为参考))已通过引入核苷酸修饰以增强其核酸酶稳定性扩大修饰核酸分子的能力，如上文描述的。

在一个实施方案中，本发明的核酸分子包括一个或多个(例如，约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多)G-封条(clamp)核苷酸。G-封条核苷酸是经修饰的胞嘧啶类似物，其中所述修饰给予与双链体内的互补鸟嘌呤的沃森-克里克和Hoogsteen面氢键合的能力，参见例如Lin和Matteucci，1998，J.Am.Chem.Soc.，120，8531-8532。当与互补寡核苷酸杂交时，寡核苷酸内的单个G-封条类似物置换可以导致基本上增强的螺旋热稳定性和错配区分。在本发明的核酸分子中包括此类核苷酸导致对核酸靶、互补序列或模板链增强的亲和力和特异性。在另一个实施方案中，本发明的核酸分子包括一个或多个(例如，约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多)LNA“锁定核酸”核苷酸，例如2′，4′-C亚甲基二环核苷酸(参见例如Wengel等人，国际PCT公开号WO00/66604和WO 99/14226)。

在另一个实施方案中，本发明的特征在于本发明的siNA分子的缀合物和/或复合物。此类缀合物和/或复合物可以用于促进siNA分子递送到生物系统例如细胞内。由本发明提供的缀合物和复合物可以给予治疗活性，其通过将治疗化合物转移经过细胞膜，改变药物代谢动力学和/或调节本发明的核酸分子的定位实现。本发明包含用于使分子递送经过细胞膜的新缀合物和复合物的设计和合成，所述分子包括但不限于，小分子、脂质、胆固醇、磷脂、核苷、核苷酸、核酸、抗体、毒素、负电荷聚合物和其他聚合物，例如蛋白质、肽、激素、碳水化合物、聚乙二醇或聚胺。一般而言，描述的转运蛋白被设计为单独或作为多组分系统的部分使用，包括或不包括可降解接头。这些化合物预期改善本发明的核酸分子在血清的存在或不存在下在源于不同组织的许多细胞类型内的递送和/或定位(参见Sullenger和Cech，美国专利号5,854,038)。本文描述的分子的缀合物可以经由接头与生物活性分子附着，所述接头是生物可降解的，例如生物可降解的核酸接头分子。

如本文所使用的，术语“生物可降解的接头”指核酸或非核酸接头分子，其被设计为生物可降解的接头，以使一种分子与另一种分子例如生物活性分子与本发明的siNA分子或本发明的siNA分子的有义与反义链连接。生物可降解的接头被这样设计，使得它的稳定性可以就特定目的进行调节，例如递送给特定组织或细胞类型。基于核酸的生物可降解的接头分子的稳定性可以通过使用各种化学进行调节，例如核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸和化学修饰的核苷酸的组合，所述化学修饰的核苷酸例如2′-O-甲基、2′-氟、2′-氨基、2′-O-氨基、2′-C-烯丙基、2′-O-烯丙基、和其他2′-修饰的或碱基修饰的核苷酸。生物可降解的核酸接头分子可以是二聚物、三聚物、四聚物或更长的核酸分子，例如长度为约2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个核苷酸的寡核苷酸，或可以包含具有基于磷的键例如氨基磷酸酯或磷酸二酯键的单个核苷酸。生物可降解的核酸接头分子还可以包含核酸主链、核酸糖、或核酸碱基修饰。

如本文所使用的，术语“生物可降解的”指生物系统中的降解，例如酶促降解或化学降解。

如本文所使用的，术语“生物活性分子”指能够在系统中引发或修饰生物应答的化合物或分子。由本发明预期的单独或与其他分子组合的生物活性siNA分子的非限制性例子包括治疗活性分子，例如抗体、胆固醇、激素、抗病毒剂、肽、蛋白质、化疗剂、小分子、维生素、辅因子、核苷、核苷酸、寡核苷酸、酶促核酸、反义核酸、三链体形成寡核苷酸、2，5-A嵌合体、siNA、dsRNA、同种异型酶、适体、诱饵及其类似物。本发明的生物活性分子还包括能够调节其他生物活性分子的药物代谢动力学和/或药物动力学的分子，所述其他生物活性分子例如脂质和聚合物，例如聚胺、聚酰胺、聚乙二醇和其他聚醚。

如本文所使用的，术语“磷脂”指包含至少一个磷基团的疏水性分子。例如，磷脂可以包含含磷基团和饱和或不饱和的烷基，任选由OH、COOH、氧、胺、或取代或未取代的芳基取代。

外源递送的治疗核酸分子(例如siNA分子)最优地在细胞内是稳定的，直至RNA的逆转录已足够长久地调节，以减少RNA转录物的水平。核酸分子对核酸酶是有抵抗力的以充当有效的细胞内治疗剂。本发明和本领域中描述的核酸分子的化学合成中的改善已通过如上文描述的引入核苷酸修饰以增强其核酸酶稳定性扩大修饰核酸分子的能力。

在另外一个实施方案中，提供了具有化学修饰的siNA分子，所述化学修饰维持或增强涉及RNAi的蛋白质的酶促活性。此类核酸一般也比未修饰的核酸对核酸酶更有抵抗力。因此，体外和/或体内活性不应显著降低。

本发明的基于核酸的分子的使用通过提供组合疗法的可能性(例如，靶向不同基因的多重siNA分子；与已知小分子调节剂偶联的核酸分子；或使用分子组合的间歇疗法，所述分子组合包括不同基序和/或其他化学或生物分子)将导致更佳的治疗。用siNA分子治疗受试者还可以包括不同类型的核酸分子的组合，例如酶促核酸分子(核酶)、同种异型酶、反义、2，5-A寡腺苷酸、诱饵和适体。

在另一个方面，本发明的siNA分子包含一个或多个5′和/或3′-帽结构，例如仅在有义siNA链、反义siNA链或2条siNA链上。

“帽结构”意指化学修饰，其已在寡核苷酸的任一末端处掺入(参见例如引入本文作为参考的Adamic等人，美国专利号5,998,203)。这些末端修饰保护核酸分子不受外切核酸酶降解，且可以帮助在细胞内的递送和/或定位。帽可以存在于5′-末端处(5′-帽)或3′-末端处(3′-帽)，或可以存在于2个末端上。在非限制性例子中，5′-帽包括但不限于，甘油基，反向脱氧脱碱基残基(部分)；4′，5′-亚甲基核苷酸；1-(β-D-呋喃型赤藓糖基)核苷酸，4′-硫代核苷酸；碳环核苷酸；1，5-失水己糖醇核苷酸；L-核苷酸；α-核苷酸；经修饰的碱基核苷酸；二硫代磷酸酯键；苏糖型-呋喃型戊糖基核苷酸；无环3′，4′-断裂核苷酸；无环3，4-二羟丁基核苷酸；无环3，5-二羟戊基核苷酸；3′-3′-反向核苷酸部分；3′-3′-反向脱碱基部分；3′-2′-反向核苷酸部分；3′-2′-反向脱碱基部分；1，4-丁二醇磷酸酯；3′-氨基磷酸酯；己基磷酸酯；氨己基磷酸酯；3′-磷酸酯；3′-硫代磷酸酯；二硫代磷酸酯；或桥连或非桥连甲基膦酸酯部分。帽部分的非限制性例子显示于图7中。

3′-帽的非限制性例子包括但不限于，甘油基，反向脱氧脱碱基残基(部分)；4′，5′-亚甲基核苷酸；1-(β-D-呋喃型赤藓糖基)核苷酸，4′-硫代核苷酸；碳环核苷酸；5′-氨基-烷基磷酸酯；1，3-二氨基-2-丙基磷酸酯；3-氨丙基磷酸酯；6-氨己基磷酸酯；1，2-氨基十二烷基磷酸酯；羟丙基磷酸酯；1，5-失水己糖醇核苷酸；L-核苷酸；α-核苷酸；经修饰的碱基核苷酸；二硫代磷酸酯；苏糖型-呋喃型戊糖基核苷酸；无环3′，4′-断裂核苷酸；3，4-二羟丁基核苷酸；3，5-二羟戊基核苷酸；5′-5′-反向核苷酸部分；5′-5′-反向脱碱基部分；5′-氨基磷酸酯；5′-硫代磷酸酯；1，4-丁二醇磷酸酯；5′-氨基；桥连或非桥连5′-氨基磷酸酯，硫代磷酸酯和/或二硫代磷酸酯，桥连或非桥连甲基膦酸酯和5′-巯基部分(关于更多细节参见Beaucage和Iyer，1993，Tetrahedron 49，1925；引入本文作为参考)。

术语“非核苷酸”意指任何基团或化合物，其可以掺入核酸链内代替一个或多个核苷酸单位，包括糖和/或磷酸置换，且允许剩余碱基显示出其酶促活性。基团或化合物是脱碱基的，因为它不包含通常公认的核苷酸碱基，例如腺苷、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶，且因此在1′-位置处缺乏碱基。

“烷基”指饱和脂族烃，包括直链、支链和环状烷基。优选地，烷基具有1个-12个碳。更优选地，它是1个-7个碳的低级烷基，更优选地1个-4个碳。烷基可以是取代或未取代的。当取代时，取代基团优选是羟基、氰基、烷氧基、＝O、＝S、NO₂或N(CH₃)₂、氨基或SH。该术语还包括链烯基，其是包含至少一个碳-碳双键的不饱和烃基团，包括直链、支链和环状基团。优选地，链烯基具有1个-12个碳。更优选地，它是1个-7个碳的低级链烯基，更优选地1个-4个碳。链烯基可以是取代或未取代的。当取代时，取代基团优选是羟基、氰基、烷氧基、＝O、＝S、NO₂、卤素、N(CH₃)₂、氨基或SH。术语“烷基”还包括炔基，其是包含至少一个碳-碳三键的不饱和烃基团，包括直链、支链和环状基团。优选地，炔基具有1个-12个碳。更优选地，它是1个-7个碳的低级炔基，更优选地1个-4个碳。炔基可以是取代或未取代的。当取代时，取代基团优选是羟基、氰基、烷氧基、＝O、＝S、NO₂或N(CH₃)₂、氨基或SH。

此类烷基还可以包括芳基、烷芳基、碳环芳基、杂环芳基、酰胺和酯基团。“芳基”指芳族基团，其具有含共轭π电子系统的至少一个环且包括碳环芳基、杂环芳基和联芳基，所有这些可以是任选取代的。芳基的优选取代基是卤素、三卤甲基、羟基、SH、OH、氰基、烷氧基、烷基、链烯基、炔基和氨基。“烷芳基”指与芳基(如上所述)共价连接的烷基(如上所述)。碳环芳基是其中芳族环上的环原子都是碳原子的基团。碳原子是任选取代的。杂环芳基是在芳族环中具有1个-3个杂原子作为环原子和剩余环原子是碳原子的基团。合适的杂原子包括氧、硫和氮，且包括呋喃基、噻吩基、吡啶基、吡咯基、N-低级烷基吡咯并、嘧啶基、吡嗪基、咪唑基等，全部任选取代。“酰胺”指-C(O)-NH-R，其中R是烷基、芳基、烷芳基或氢。“酯”指-C(O)-OR′，其中R是烷基、芳基、烷芳基或氢。

如本文所使用的，“核苷酸”如本领域公认的包括天然碱基(标准)和本领域众所周知的经修饰的碱基。此类碱基一般位于核苷酸糖部分的1’位置处。核苷酸一般包含碱基、糖和磷酸基。核苷酸可以是未修饰的或在糖、磷酸和/或碱基部分处修饰的(也可互换地称为核苷酸类似物，经修饰的核苷酸，非天然核苷酸，非标准核苷酸等；参见例如，Usman和McSwiggen，同上；Eckstein等人，国际PCT公开号WO92/07065；Usman等人，国际PCT公开号WO 93/15187；Uhlman &Peyman，同上，所有在此引入本文作为参考)。如由Limbach等人，1994，Nucleic Acids Res.22，2183概括的，存在本领域已知的经修饰的核酸碱基的几个例子。可以引入核酸分子内的碱基修饰的一些非限制性例子包括肌苷、嘌呤、吡啶-4-酮、吡啶-2-酮、苯基、假尿嘧啶、2，4，6-三甲氧基苯、3-甲基尿嘧啶、二氢尿苷、萘基、氨基苯基、5-烷基胞苷(例如，5-甲基胞苷)、5-烷基尿苷(例如，胸腺嘧啶核苷)、5-卤尿苷(例如，5-溴尿苷)或6-氮杂嘧啶或6-烷基嘧啶(例如，6-甲基尿苷)、丙炔等(Burgin等人，1996，Biochemistry，35，14090；Uhlman & Peyman，同上)。“经修饰的碱基”在这个方面意指在1′位置处除腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶外的核苷酸碱基或其类似物。

在一个实施方案中，本发明的特征在于具有磷酸主链修饰的经修饰的siNA分子，所述磷酸主链修饰包含一种或多种硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、磷酸三酯、吗啉代、酰胺化氨基甲酸酯、羧甲基、乙酰胺化(acetamidate)、聚酰胺、磺酸酯、氨磺酰、氨基磺酸酯、甲缩醛(formacetal)、硫甲缩醛和/或烷基甲硅烷基、取代。关于寡核苷酸主链修饰的综述，参见Hunziker和Leumann，1995，NucleicAcid Analogues：Synthesis and Properties，in Modern Synthetic Methods，VCH，331-417，和Mesmaeker等人，1994，Novel Backbone Replacementsfor Oligonucleotides，in Carbohydrate Modifications in AntisenseResearch，ACS，24-39。

“脱碱基”意指在糖部分的1′位置处缺乏核碱基(nucleobase)或具有氢原子(H)或其他非核碱基化学基团代替核碱基的糖部分，参见例如Adamic等人，美国专利号5,998,203。在一个实施方案中，本发明的脱碱基部分是核糖、脱氧核糖或双脱氧核糖。

“未修饰的核苷”意指与β-D-呋喃型核糖的1′碳连接的下述碱基之一：腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶。

“经修饰的核苷”意指在未修饰的核苷酸碱基、糖和/或磷酸的化学结构中包含修饰的任何核苷酸碱基。经修饰的核苷酸的非限制性例子由式I-VII和/或本文描述的其他修饰显示。

与如关于本发明描述的2′-经修饰的核苷酸结合，“氨基”意指2′-NH₂或2′-O-NH₂，其可以是修饰的或未修饰的。此类经修饰的基团在例如Eckstein等人，美国专利号5,672,695和Matulic-Adamic等人，美国专利号6,248,878中得到描述，所述2个专利整体引入作为参考。

可以对核酸siNA结构进行各种修饰以增强这些分子的效用。此类修饰将增强保存期限、体外半衰期、稳定性和易于将此类寡核苷酸引入靶位点，例如以增强细胞膜的渗透，并且给予识别靶细胞且与靶细胞结合的能力。

核酸分子的施用

本发明的siNA分子可以适合单独或与其他疗法组合用于治疗、预防、抑制、或减少呼吸性、炎性、自身免疫疾病、性状、状况和表型，和/或涉及细胞或组织中的ENaC靶或ENaC途径靶水平或将响应细胞或组织中的ENaC靶或ENaC途径靶水平的任何其他性状、疾病、状况或表型。在一个实施方案中，本发明的siNA分子及其制剂或组合物如本文描述和如本领域一般已知的施用于肺。在一个实施方案中，本发明的siNA分子及其制剂或组合物如本文描述和如本领域一般已知的施用于细胞、受试者或生物。

在一个实施方案中，本发明的siNA组合物可以包含对于给受试者施用的递送媒介物包括脂质体，载体和稀释剂及其盐，和/或可以存在于药学上可接受的制剂中。用于递送核酸分子的方法在下述参考文献中得到描述：Akhtar等人，1992，Trends Cell Bio.，2，139；DeliveryStrategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics，编辑Akhtar，1995，Maurer等人，1999，Mol.Membr.Biol.，16，129-140；Hofland和Huang，1999，Handb.Exp.Pharmacol.，137，165-192；和Lee等人，2000，ACS Symp.Ser.，752，184-192，所有这些参考文献引入本文作为参考。Beigelman等人，美国专利号6,395,713和Sullivan等人，PCT WO94/02595进一步描述了用于递送核酸分子的一般方法。这些规程可以用于递送事实上任何核酸分子。核酸分子可以通过本领域技术人员已知的多种方法施用于细胞，包括但不限于，被囊化在脂质体中，通过离子电渗疗法，或通过掺入其他媒介物内，所述其他媒介物例如生物可降解聚合物、水凝胶、环糊精(参见例如Gonzalez等人，1999，Bioconjugate Chem.，10，1068-1074；Wang等人，国际PCR公开号WO 03/47518和WO 03/46185)、乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)和PLCA小球体(参见例如美国专利6,447,796和美国专利申请公开号US2002130430)、生物可降解纳米胶囊(nanocapsule)、和生物粘附小球体，或通过蛋白质载体(O′Hare和Normand，国际PCT公开号WO00/53722)。在另一个实施方案中，本发明的核酸分子还可以用聚乙烯亚胺及其衍生物配制或与聚乙烯亚胺及其衍生物复合，例如聚乙烯亚胺-聚乙二醇-N-乙酰半乳糖胺(PEI-PEG-GAL)或聚乙烯亚胺-聚乙二醇-三-N-乙酰半乳糖胺(PEI-PEG-triGAL)衍生物。在一个实施方案中，本发明的核酸分子如美国专利申请公开号20030077829中所述进行配制，所述专利申请整体引入本文作为参考。

在一个实施方案中，本发明的siNA分子配制为下述专利中所述的组合物：美国临时专利申请号60/678,531以及于2005年7月29日提交的相关美国临时专利申请号60/703,946，于2005年11月15日提交的美国临时专利申请号60/737,024，于2006年2月14日提交的USSN11/353,630和于2006年10月24日提交的USSN 11/586,102(Vargeese等人)，所有这些专利都整体引入本文作为参考。此类siNA制剂一般称为“脂质核酸颗粒”(LNP)。在一个实施方案中，本发明的siNA分子用本文表10中描述的一种或多种LNP组合物进行配制(参见USSN11/353,630同上)。

在一个实施方案中，本发明的siNA分子及其制剂或组合物如US2006/0062758；US 2006/0014289；和US 2004/0077540中所述施用于肺组织和细胞。

在一个实施方案中，本发明的siNA分子与膜破裂试剂例如美国专利申请公开号20010007666中描述的那些复合，所述专利包括附图整体引入本文作为参考。在另一个实施方案中，一种或多种膜破裂试剂和siNA分子还与阳离子脂质或辅助脂质分子例如美国专利号6,235,310中描述的那些脂质复合，所述专利包括附图整体引入本文作为参考。

在一个实施方案中，本发明的siNA分子与如下述专利中描述的递送系统复合：美国专利申请公开号2003077829以及国际PCT公开号WO 00/03683和WO 02/087541，所有专利包括附图整体引入本文作为参考。

在一个实施方案中，本发明的siNA分子与如下述专利中一般描述的递送系统复合：美国专利申请公开号US-20050287551；US-20050164220；US-20050191627；US-20050118594；US-20050153919；US-20050085486；和US-20030158133；，所有专利包括附图整体引入本文作为参考。

在一个实施方案中，本发明的核酸分子经由去端肽胶原(atelocollagen)复合或缀合施用于骨骼组织(例如，骨、软骨、腱、韧带)或骨转移性肿瘤(参见例如Takeshita等人，2005，PNAS，102，12177-12182)。因此，在一个实施方案中，本发明的特征在于作为与去端肽胶原复合的组合物的一种或多种dsiNA分子。在另一个实施方案中，本发明的特征在于经由如本文所描述的或本领域其他方面已知的接头与去端肽胶原缀合的一种或多种siNA分子。

在一个实施方案中，本发明的核酸分子及其制剂(例如，本发明的双链核酸分子的LNP制剂)经由肺递送施用，例如通过经由吸入设备或喷雾器施用的气溶胶或喷雾干燥制剂的吸入，从而提供核酸分子快速的局部摄取进入相关肺组织内。包含微粉化核酸组合物的可吸收干燥颗粒的固体微粒组合物可以通过下述制备：将干燥或冻干的核酸组合物研磨，且随后使微粉化组合物通过例如400目筛以破碎或分出大附聚物。包含本发明的核酸组合物的固体微粒组合物可以任选包含分散剂，所述分散剂用于促进气溶胶以及其他治疗化合物的形成。合适的分散剂是乳糖，其可以与核酸化合物以任何合适的比值例如按重量计的1∶1比值掺合。

包含本发明的核酸组合物(siNA和/或其LNP制剂)的液体或非液体颗粒的气溶胶可以通过任何合适的方法产生，例如用包括喷雾器的装置(参见例如引入本文作为参考的US 4,501,729)。在一个实施方案中，本发明的喷雾器装置在用于有意识、自主呼吸的受试者和用于所有年龄的控制换气(ventilated)受试者的应用中使用。本发明的喷雾器装置可以用于对于肺的靶向局部和全身性药物递送。在一个实施方案中，包括喷雾器的装置用于将本发明的组合物(例如siNA和/或其LNP制剂)局部递送至肺或肺组织。在一个实施方案中，包括喷雾器的装置用于全身地递送本发明的组合物(例如siNA和/或其LNP制剂)。可以使用包括本发明的喷雾器的装置治疗或管理的疾病和状况的非限制性例子包括哮喘、支气管炎、COPD、囊性纤维化、肺气肿、呼吸道合胞病毒、流感病毒及其他呼吸道或肺部疾病和感染。本发明的喷雾器装置可以用于递送各个种类的药物及其组合；包括例如但不限于siNA组合物和/或其LNP制剂、抗组胺药、抗感染剂、抗病毒剂、抗菌剂、血液改性剂、心血管药物、解充血药、诊断学、免疫抑制剂、肥大细胞稳定剂、抗炎剂、呼吸试剂、皮肤和粘膜试剂和其他种类。在一个实施方案中，本发明的喷雾器装置用于有效递送蛋白质、肽、寡核苷酸、质粒和小分子(即，白细胞介素、DNA酶、反义RNA、链球菌属(streptococcus)B多肽和HIV整合酶)。在另一个实施方案中，本发明的喷雾器装置用于递送至少一种活性剂的呼吸分散体，包括乳状液、微乳液或亚微米和纳米微粒悬浮液。参见例如美国专利号7128,897和7,090,830B2，两者引入本文作为参考。

包含本发明的组合物(例如siNA和/或其LNP制剂)的液体或非液体气溶胶的递送可以使用任何合适的装置来完成，所述装置例如超声或空气喷射喷雾器。在一个实施方案中，包括喷雾器的装置依赖于振荡信号以驱动压电陶瓷振荡器用于产生高能超声波，这机械地搅拌本发明的组合物(例如siNA和/或其LNP制剂)，生成药物气溶胶云雾。(参见例如引入本文作为参考的美国专利号7,129,619B2和7,131,439B2)。在另一个实施方案中，包括喷雾器的装置依赖于压缩空气与本发明的组合物(例如siNA和/或其LNP制剂)的空气喷射混合，以形成在气溶胶云雾中的小滴。

喷雾器装置可以用于连续或定期地施用包括本发明的组合物(例如siNA和/或其LNP制剂)的气溶胶，并且可以手动、自动或依照患者的呼吸调控。(参见美国专利号3,812,854，WO 92/11050)。在一个实施方案中，包括喷雾器的装置可以经由微通道挤出室或循环增压快速灌注方式定期地施用本发明的组合物(例如siNA和/或其LNP制剂)。在另一个实施方案中，包括喷雾器的装置可以用于连续地施用包括本发明的组合物(例如siNA和/或其LNP制剂)的悬浮液气溶胶。

本发明的喷雾器装置可以使用包括本发明的组合物(例如siNA和/或其LNP制剂)的载体，一般为水或稀释水或非水溶液。在一个实施方案中，包括喷雾器的装置使用醇溶液，优选通过添加例如包括本发明的组合物(例如siNA和/或其LNP制剂)的氯化钠或其他合适的盐制成与体液等渗。在另一个实施方案中，本发明的喷雾器装置使用包括本发明的组合物(例如siNA和/或其LNP制剂)的非水含氟化合物载体。包括喷雾器的装置可以以约0.001％-90％w/w载体制剂的量递送本发明的组合物。在一个实施方案中，包括喷雾器的装置使用在液体载体中包括本发明的组合物(例如siNA和/或其LNP制剂)的合适制剂，其以高达40％w/w优选小于20％w/w制剂的量。在另一个实施方案中，包括喷雾器的装置使用稳定的非液体微粒、亚微米、纳米颗粒悬浮液，包括少至0.001％高达90％w/w本发明的组合物(例如siNA和/或其LNP制剂)，相对于非液体微粒、亚微米和/或纳米颗粒重量(美国专利号6,946,117B1)。

气溶胶制剂可以包括任选的添加剂，包括防腐剂，如果制剂未制成无菌的。非限制性例子包括羟苯甲酯、抗氧化剂、调味剂、挥发性油、缓冲剂和乳化剂及其他制剂表面活性剂。在一个实施方案中，碳氟化合物或全氟化碳载体用于减少降解且提供本发明的组合物(例如siNA和/或其LNP制剂)更安全的生物相容性非液体微粒悬浮液。在另一个实施方案中，包括喷雾器的装置递送包括含氟化合物的本发明的组合物(例如siNA和/或其LNP制剂)，所述含氟化合物是抑菌的，从而减少在相容装置中的微生物生长可能性。

包含活性组合物和表面活性剂的固体颗粒的气溶胶可以类似地用任何固体微粒气溶胶发生器来生产。在一个实施方案中，用于给受试者施用固体微粒试剂的气溶胶发生器产生可吸收的颗粒，如上文说明的，且生成包含组合物的预定测定剂量的气溶胶体积。在另一个实施方案中，气溶胶包括微粒组合，其包括本发明的至少一种组合物(例如siNA和/或其LNP制剂)与预定体积的悬浮介质或表面活性剂，以提供呼吸掺和物。

在一个实施方案中，本发明的固体微粒气溶胶发生器是吹入器。用于通过吹入法施用的合适制剂包括精细捣碎的粉末，其可以借助于吹入器进行递送。在吹入器中，粉末例如有效执行本文描述的治疗的其计量剂量包含在一般由明胶或塑料制成的胶囊或药液筒中，其穿入或原位打开并且经由在吸入后通过设备吸取的空气或借助于手工操作的泵递送粉末。吹入器中使用的粉末单独由活性成分组成，或由包含活性成分、合适的粉末稀释剂例如乳糖和任选的表面活性剂的粉末掺合物组成。活性成分一般构成0.1-100w/w制剂。第二种类型的举例说明性气溶胶发生器包含计量剂量吸入器。计量剂量吸入器是增压气溶胶分配器，一般包含活性成分在液化推进剂的悬浮液或溶液制剂。在使用期间，这些设备通过适合于递送计量容积的阀排出制剂，以产生包含活性成分的细颗粒喷雾。合适的推进剂包括某些含氯氟烃，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷及其混合物。制剂可以另外包含一种或多种助溶剂例如乙醇，乳化剂和其他制剂表面活性剂例如油酸或失水山梨醇三油酸酯，抗氧化剂和合适的调味剂。用于肺递送的其他方法在例如美国专利申请号20040037780以及美国专利号6,592,904；6,582,728；6,565,885中得到描述，所有专利引入本文作为参考。

在一个实施方案中，本文提供的用于在肺递送中使用的siNA和LNP组合物和制剂进一步包含一种或多种表面活性剂。用于增强本发明的组合物摄取的合适表面活性剂或表面活性剂组分包括合成和天然以及完整和截短形式的表面活性蛋白A，表面活性蛋白B，表面活性蛋白C，表面活性蛋白D和表面活性蛋白E，二饱和磷脂酰胆碱(除二棕榈酰外)，二棕榈酰磷脂酰胆碱，磷脂酰胆碱，磷脂酰甘油，磷脂酰肌醇，磷脂酰乙醇胺，磷脂酰丝氨酸；磷脂酸，泛醌，溶血磷脂酰乙醇胺，溶血磷脂酰胆碱，棕榈酰-溶血磷脂酰胆碱，脱氢表雄酮，多萜醇，sulfatidic acid，甘油-3-磷酸，二羟丙酮磷酸，甘油，甘油-3-磷酸胆碱，二羟丙酮，棕榈酸盐，胞苷二磷酸(CDP)二酰甘油，CDP胆碱，胆碱，磷酸胆碱；以及天然和人造片层体，其是关于表面活性剂组分的天然载体媒介物，ω-3脂肪酸，聚烯酸(polyenic acid)，多烯酸，卵磷脂，棕榈酸，氧化乙烯或丙烯的非离子嵌段共聚物，聚氧丙烯、单体和聚合的，聚氧乙烯、单体和聚合的，具有葡聚糖和/或烷酰基侧链的聚乙烯胺，Brij 35，Triton X-100和合成表面活性剂ALEC，Exosurf，Survan和Atovaquone，除了别的以外。这些表面活性剂可以在制剂中作为单个表面活性剂或多组分表面活性剂的部分使用，或作为与本文的药物组合物的核酸组分的5′和/或3′末端共价结合的附加物使用。

本发明的组合物可以作为包括可吸收大小的颗粒的制剂施用到呼吸系统内，例如大小足够小的颗粒以在吸入后经过鼻、口和喉以及通过肺的支气管和肺泡。一般而言，可吸收颗粒大小为约0.5-10微米。包括在气溶胶中的不可吸收大小的颗粒倾向于沉积在喉中且被吞咽，并且气溶胶中不可吸收颗粒的量因此降到最低。对于鼻施用，10-500um的粒度是优选的，以确保保留在鼻腔中。

在一个实施方案中，本发明的siNA分子及其制剂或组合物如本领域一般已知的施用于肝(参见例如Wen等人，2004，World JGastroenterol.，10，244-9；Murao等人，2002，Pharm Res.，19，1808-14；Liu等人，2003，gene Ther.，10，180-7；Hong等人，2003，J PharmPharmacol.，54，51-8；Herrmann等人，2004，Arch Virol.，149，1611-7；和Matsuno等人，2003，gene Ther.，10，1559-66)。

在一个实施方案中，本发明的特征在于将本发明的核酸分子递送给造血细胞，包括单核细胞和淋巴细胞的方法的用途。这些方法由Hartmann等人，1998，J.Phamacol.Exp.Ther.，285(2)，920-928；Kronenwett等人，1998，Blood，91(3)，852-862；Filion和Phillips，1997，Biochim.Biophys.Acta.，1329(2)，345-356；Ma和Wei，1996，Leuk.Res.，20(11/12)，925-930；和Bongartz等人，1994，Nucleic AcidsResearch，22(22)，4681-8详细描述。如上所述的此类方法包括使用游离寡核苷酸、阳离子脂质制剂、包括pH敏感性脂质体和免疫脂质体的脂质体制剂、以及包括与融合肽缀合的寡核苷酸的生物缀合物，用于由寡核苷酸转染造血细胞。

在一个实施方案中，本发明的siNA分子及其制剂或组合物如本领域一般已知的直接或地方性地(例如，局部地)施用于真皮或滤泡(参见例如Brand，2001，Curr.Opin.Mol.Ther.，3，244-8；Regnier等人，1998，J.Drug Target，5，275-89；Kanikkannan，2002，BioDrugs，16，339-47；Wraight等人，2001，Pharmacol.Ther.，90，89-104；和Preat和Dujardin，2001，STP PharmaSciences，11，57-68)。在一个实施方案中，本发明的siNA分子及其制剂或组合物直接或地方性地施用，其中使用包含醇(例如，乙醇或异丙醇)、水且任选包括另外试剂例如肉豆蔻酸异丙酯和卡波姆980的含水醇凝胶制剂。

在一个实施方案中，本发明的siNA分子离子电渗地例如施用于特定器官或区室(例如，眼、眼后、心脏、肝、肾、膀胱、前列腺、肿瘤、CNS等)。离子电渗疗法递送的非限制性例子在例如WO 03/043689和WO 03/030989中得到描述，所述专利整体引入本文作为参考。

在一个实施方案中，本发明的siNA化合物和组合物约每1-50周(例如，约每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50周)全身或局部地进行施用，单独或与本文的其他化合物和/或疗法组合。在一个实施方案中，本发明的siNA化合物和组合物约每1-50周(例如，约每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50周)全身地(例如，经由静脉内、皮下、肌内、输注、泵、植入等)进行施用，单独或与本文描述的和/或本领域其他方面已知的其他化合物和/或疗法组合。

在一个实施方案中，本发明的递送系统包括例如，含水和非水凝胶、乳膏、多重乳剂、微乳、脂质体、软膏、水性和非水溶液、洗剂、气溶胶、烃基质和粉末，并且可以包含赋形剂例如增溶剂、渗透增强剂(例如，脂肪酸、脂肪酸酯、脂肪醇和氨基酸)、和亲水聚合物(例如，聚卡波非和聚乙烯吡咯烷酮)。在一个实施方案中，药学上可接受的载体是脂质体或经皮增强剂。可以在本发明中使用的脂质体例子包括下述：(1)CellFectin，阳离子脂质N，NI，NII，NIII-四甲基-N，NI，NII，NIII-四棕榈基-精胺和二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)的1∶1.5(M/M)脂质体制剂(GIBCO BRL)；(2)Cytofectin GSV，阳离子脂质和DOPE的2∶1(M/M)脂质体制剂(Glen Research)；(3)DOTAP(N-[1-(2，3-二油酰氧)-N，N，N-三甲基-甲基硫酸铵)(Boehringer Manheim)；和(4)Lipofectamine，聚阳离子脂质DOSPA和中性脂质DOPE的3∶1(M/M)脂质体制剂(GIBCO BRL)。

在一个实施方案中，本发明的递送系统包括贴剂、片剂、栓剂、阴道栓、凝胶和乳膏，并且可以包含赋形剂例如增溶剂和增强剂(例如，丙二醇、胆汁盐和氨基酸)、和其他媒介物(例如，聚乙二醇、脂肪酸酯和衍生物、以及亲水聚合物例如羟丙基甲基纤维素和透明质酸)。

在一个实施方案中，本发明的siNA分子用聚乙烯亚胺(例如，线性或分支PEI)和/或聚乙烯亚胺衍生物配制，或与聚乙烯亚胺(例如，线性或分支PEI)和/或聚乙烯亚胺衍生物复合，所述聚乙烯亚胺衍生物包括例如接枝PEIs例如半乳糖PEI、胆固醇PEI、抗体衍生的PEI及其聚乙二醇PEI(PEG-PEI)衍生物(参见例如Ogris等人，2001，AAPA PharmSci，3，1-11；Furgeson等人，2003，Bioconjugate Chem.，14，840-847；Kunath等人，2002，Phramaceutical Research，19，810-817；Choi等人，2001，Bull.Korean Chem.Soc.，22，46-52；Bettinger等人，1999，Bioconjugate Chem.，10，558-561；Peterson等人，2002，Bioconjugate Chem.，13，845-854；Erbacher等人，1999，Journal of GeneMedicine Preprint，1，1-18；Godbey等人，1999.，PNAS USA，96，5177-5181；Godbey等人，1999，Journal of Controlled Release，60，149-160；Diebold等人，1999，Journal of Biological Chemistry，274，19087-19094；Thomas和Klibanov，2002，PNAS USA，99，14640-14645；和Sagara，US 6,586,524，引入本文作为参考)。

在一个实施方案中，本发明的siNA分子包含生物缀合物，例如如Vargeese等人，于2003年4月30日提交的USSN 10/427,160；US6,528,631；US 6,335,434；US 6,235,886；US 6,153,737；US 5,214,136；US 5,138,045中描述的核酸缀合物，所述所有专利引入本文作为参考。

因此，本发明的特征在于在可接受的载体例如稳定剂、缓冲剂等中包含本发明的一种或多种核酸的药物组合物。本发明的多核苷酸可以通过任何标准方法施用(例如，RNA、DNA或蛋白质)且引入受试者中，包括或不包括稳定剂、缓冲剂等，以形成药物组合物。当需要使用脂质体递送机制时，可以遵从用于脂质体配制的标准规程。本发明的组合物还可以如本领域已知的配制且用作乳膏、凝胶、喷雾剂、油及其他合适的组合物，用于局部、皮肤、或经皮施用。

本发明还包括所述化合物的药学上可接受的制剂。这些制剂包括上述化合物的盐，例如酸加成盐，例如盐酸、氢溴酸、乙酸和苯磺酸的盐。

药理学组合物或制剂指以适合于施用，例如全身或局部施用到细胞或受试者内的形式的组合物或制剂，所述受试者包括例如人。合适的形式部分依赖使用或进入途径，例如经口、经皮或通过注射。此类形式不应阻止组合物或制剂达到靶细胞(即，需要给其递送带负电荷核酸的细胞)。例如，注射到血流内的药理学组合物应当是可溶的。其他因素是本领域已知的，且包括考虑，如阻止组合物或制剂发挥其作用的毒性和形式。

在一个实施方案中，本发明的siNA分子通过全身施用在药学上可接受的组合物或制剂中施用于受试者。“全身施用”意指药物在血流中的体内全身性吸收或积累随后分布遍及整个身体。导致全身性吸收的施用途径包括但不限于：静脉内、皮下、门静脉、腹膜内、吸入、经口、肺内和肌内。这些施用途径中的每一种使本发明的siNA分子暴露于可到达的患病组织(例如肺)。药物进入循环内的速率已显示是分子量或大小的函数。包含本发明的化合物的脂质体或其他药物载体的使用可以潜在地使药物局部化于例如某些组织类型，例如网状内皮系统(RES)的组织。可以促进药物与细胞例如淋巴细胞和巨噬细胞表面结合的脂质体制剂也是有用的。这种方法通过利用异常细胞的巨噬细胞和淋巴细胞免疫识别的特异性可以提供药物对靶细胞的增强递送。

“药学上可接受的制剂”或“药学上可接受的组合物”意指允许本发明的核酸分子在最适合于其所需活性的物理位置中有效分布的组合物或制剂。适合于与本发明的核酸分子一起配制的试剂的非限制性例子包括：P-糖蛋白抑制剂(例如Pluronic P85)；生物可降解聚合物，例如用于持续释放递送的DL-丙交酯-乙交酯共聚物小球体(Emerich，DF等人，1999，Cell Transplant，8，47-58)；和装载的纳米颗粒，例如由聚氰基丙烯酸丁酯制成的那些。关于本发明的核酸分子的递送策略的其他非限制性例子包括在下述参考文献中描述的材料：Boado等人，1998，J.Pharm.Sci.，87，1308-1315；Tyler等人，1999，FEBS Lett.，421，280-284；Pardridge等人，1995，PNAS USA.，92，5592-5596；Boado，1995，Adv.Drug Delivery Rev.，15，73-107；Aldrian-Herrada等人，1998，Nucleic Acids Res.，26，4910-4916；和Tyler等人，1999，PNAS USA.，96，7053-7058。

本发明的特征还在于包含表面修饰的脂质体的组合物的用途，所述表面修饰的脂质体包含聚乙二醇脂质(PEG修饰的，或长循环脂质体或隐形脂质体)和本发明的核酸分子。这些制剂提供用于增加药物(例如，siNA)在靶组织中积累的方法。这类药物载体经得住经由单核吞噬细胞系统(MPS或RES)的调理作用和消除，从而使胶囊化的药物更长的血液循环时间和增强的组织暴露成为可能(Lasic等人，Chem.Rev.1995，95，2601-2627；Ishiwata等人，Chem.Pharm.Bull.1995，43，1005-1011)。此类脂质体已显示在肿瘤中选择性积累，推测是通过在新血管形成的靶组织中的外渗和捕获(Lasic等人，Science 1995，267，1275-1276；Oku等人，1995，Biochim.Biophys.Acta，1238，86-90)。长循环脂质体增强DNA和RNA的药物代谢动力学和药物动力学，特别是与已知在MPS组织中积累的常规阳离子脂质体相比较(Liu等人，J.Biol.Chem.1995，42，24864-24870；Choi等人，国际PCT公开号WO 96/10391；Ansell等人，国际PCT公开号WO 96/10390；Holland等人，国际PCT公开号WO 96/10392)。基于其避免在代谢攻击性MPS组织例如肝和脾中积累的能力，长循环脂质体也可能保护药物不受核酸酶降解至与阳离子脂质体相比较更大的程度。

在一个实施方案中，本发明的脂质体制剂包含用下述专利中描述的化合物和组合物配制，或与下述专利中描述的化合物和组合物复合的本发明的双链核酸分子(例如，siNA)：US 6,858,224；6,534,484；6,287,591；6,835,395；6,586,410；6,858,225；6,815,432；US 6,586,001；6,120,798；US 6,977,223；US 6,998,115；5,981,501；5,976,567；5,705,385；US 2006/0019912；US 2006/0019258；US 2006/0008909；US2005/0255153；US 2005/0079212；US 2005/0008689；US 2003/0077829，US 2005/0064595，US 2005/0175682，US 2005/0118253；US2004/0071654；US 2005/0244504；US 2005/0265961和US2003/0077829，所述所有专利都整体引入本文作为参考。

本发明还包括制备用于贮存或施用的组合物，其包括在药学上可接受的载体或稀释剂中药学有效量的所需化合物。用于治疗用途的可接受的载体或稀释剂是药学领域中众所周知的，并且例如在引入本文作为参考的Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.(A.R.Gennaro编辑1985)中得到描述。例如可以提供防腐剂、稳定剂、染料和调味剂。这些包括苯甲酸钠、山梨酸和对羟基苯甲酸酯。此外，可以使用抗氧化剂和悬浮剂。

药学有效剂量是预防、抑制发生、或治疗(使症状减轻至某一程度，优选所有症状)疾病状态所需的那种剂量。药学有效剂量取决于疾病类型、使用的组合物、施用途径、待治疗的哺乳动物类型、正在考虑的具体哺乳动物的身体特征、并存的药疗法、以及医学领域技术人员将认识到的其他因素。一般地，取决于带负电荷聚合物的效力，施用0.1mg/kg-100mg/kg体重/天的活性成分量。

本发明的核酸分子及其制剂可以在包含常规无毒的药学上可接受的载体、佐剂和/或媒介物的剂量单位制剂中经口、地方性、肠胃外、经由吸入或喷雾、或经直肠施用。如本文所使用的，术语肠胃外包括经皮、皮下、血管内(例如，静脉内)、肌内、或鞘内注射或输注技术等。此外，提供了包含本发明的核酸分子和药学上可接受的载体的药物制剂。本发明的一种或多种核酸分子可以与一种或多种无毒的药学上可接受的载体和/或稀释剂和/或佐剂，以及需要时其他活性成分结合存在。包含本发明的核酸分子的药物组合物可以是适合于经口使用的形式，例如作为片剂、锭剂、糖锭、水性或油性悬浮液、可分散的粉末或颗粒、乳剂、硬或软胶囊、或糖浆或酏剂。

预期用于经口使用的组合物可以根据本领域已知的用于制备药物组合物的任何方法进行制备，并且此类组合物可以包含一种或多种此类甜味剂、调味剂、着色剂或防腐剂以便提供药学上精致和可口的制剂。片剂包含与无毒的药学上可接受的赋形剂混合的化学成分，所述赋形剂适合于制备片剂。这些赋形剂可以是例如惰性稀释剂；例如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；粒化和崩解剂，例如玉米淀粉、或藻酸；粘合剂，例如淀粉、明胶或阿拉伯胶；和润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。片剂可以是无包被的，或它们可以通过已知技术进行包被。在某些情况下此类包被可以通过已知技术进行制备，以延迟在胃肠道中的崩解和吸收且因此提供经过较长时间段的持续作用。例如，可以使用时间延迟材料例如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。

用于经口使用的制剂也可以呈现为其中活性成分与惰性固体稀释剂例如碳酸钙、磷酸钙或高岭土混合的硬明胶胶囊，或呈现为其中活性成分与水或油介质例如花生油、液体石蜡或橄榄油混合的软明胶胶囊。

水性悬浮液包含与适合于制备水性悬浮液的赋形剂混合的活性材料。此类赋形剂是悬浮剂，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍树胶和阿拉伯树胶；分散或湿润剂可以是天然存在的磷脂例如卵磷脂，或烯化氧与脂肪酸的缩合产物例如聚氧乙烯硬脂酸酯，或环氧乙烷与长链脂族醇的缩合产物例如十七乙烯氧基鲸蜡醇(heptadecaethyleneoxycetanol)，或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物例如聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯，或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物例如聚乙烯山梨糖醇酐单油酸酯。水性悬浮液还可以包含一种或多种防腐剂例如对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸正丙酯，一种或多种着色剂，一种或多种调味剂，和一种或多种甜味剂例如蔗糖或糖精。

油性悬浮液可以通过使活性成分悬浮于植物油或矿物油例如液体石蜡中来制备，所述植物油例如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油。油性悬浮液可以包含增稠剂例如蜂蜡、硬石蜡或鲸蜡醇。可以添加甜味剂和调味剂以提供可口的经口制剂。这些组合物可以通过添加抗氧化剂例如抗坏血酸进行防腐。

适合于通过添加水制备水性悬浮液的可分散的粉末和颗粒提供与分散或湿润剂、悬浮剂和一种或多种防腐剂混合的活性成分。合适的分散或湿润剂或悬浮剂由上文已提及的那些例示。还可以存在另外的赋形剂例如甜味剂、调味剂和着色剂。

本发明的药物组合物也可以是水包油乳剂的形式。油相可以是植物油或矿物油或这些的混合物。合适的乳化剂可以是天然存在的树胶例如阿拉伯树胶或黄蓍树胶，天然存在的磷脂例如大豆、卵磷脂，以及衍生自脂肪酸和己糖醇、酐的酯或偏酯，例如山梨糖醇酐单油酸酯，和所述偏酯与环氧乙烷的缩合产物例如聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯。乳剂还可以包含甜味剂和调味剂。

糖浆和酏剂可以用甜味剂例如甘油、丙二醇、山梨糖醇、葡萄糖或蔗糖进行配制。此类制剂还可以包含缓和剂、防腐剂以及调味剂和着色剂。药物组合物可以是无菌可注射的水性或含油悬浮液的形式。这种悬浮液可以根据已知技术进行配制，其中使用上文已提及的那些合适的分散或湿润剂和悬浮剂。无菌可注射的制剂也可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，例如作为溶于1，3-丁二醇的溶液。在可以使用的可接受的媒介物和溶剂中有水、林格液和等渗氯化钠溶液。此外，无菌的、固定油照惯例用作溶剂或悬浮介质。为了这个目的，可以使用任何温和的固定油包括合成的甘油单酯或甘油二酯。此外，脂肪酸例如油酸在可注射物的制备中找到用途。

本发明的核酸分子也可以以栓剂的形式施用，例如用于药物的直肠施用。这些组合物可以通过将药物与合适的非刺激性赋形剂混合进行制备，所述赋形剂在常温下是固体的但在直肠温度下是液体的，并且因此在直肠中将熔化以释放药物。此类材料包括可可脂和聚乙二醇。

本发明的核酸分子可以在无菌介质中肠胃外施用。取决于使用的媒介物和浓度，药物可以悬浮于或溶解于媒介物中。有利地，佐剂例如局部麻醉药、防腐剂和缓冲剂可以溶解于媒介物中。

约0.1mg-约140mg/千克体重/天的级别的剂量水平在上述状况的治疗中是有用的(约0.5mg-约7g/受试者/天)。可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量依赖于治疗的宿主和具体施用方式而变。剂量单位形式一般包含约1mg-约500mg活性成分。

应当理解对于任何特定受试者的具体剂量水平取决于多种因素，包括使用的具体化合物的活性、年龄、体重、一般健康、性别、饮食、施用时间、施用途径、和排泄率、药物组合和经历治疗的特定疾病的严重度。

对于给非人动物的施用，组合物也可以加入动物饲料或饮用水中。配制动物饲料和饮用水组合物可以是方便的，以便动物连同其饮食接受治疗合适量的组合物。将组合物呈现为预混合料用于加入饲料或饮用水中也可以是方便的。

本发明的核酸分子也可以与其他治疗化合物组合施用于受试者以增加总体疗效。使用多重化合物以治疗适应症可以增加有利效应，同时减少副作用的存在。

在一个实施方案中，本发明包含适合于给特定细胞类型施用本发明的核酸分子的组合物。例如，脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPr)(Wu和Wu，1987，J.Biol.Chem.262，4429-4432)是肝细胞特有的并且结合分支半乳糖-末端糖蛋白，例如脱唾液酸血清类粘蛋白(ASOR)。在另一个例子中，叶酸受体在许多癌症细胞中超表达。此类糖蛋白、合成复合糖、或叶酸与受体的结合以强烈依赖寡糖链的分支程度的亲和力发生，例如，三触角(triatennary)结构以比二触角(biatenarry)或单触角(monoatennary)链更大的亲和力结合(Baenziger和Fiete，1980，Cell，22，611-620；Connolly等人，1982，J.Biol.Chem.，257，939-945)。Lee和Lee，1987，Glycoconjugate J.，4，317-328，通过使用N-乙酰-D-半乳糖胺作为碳水化合物部分获得这种高特异性，与半乳糖相比较所述N-乙酰-D-半乳糖胺具有对受体更高的亲和力。这种“成簇效应”也已对于甘露糖-末端糖蛋白或复合糖的结合和摄取进行描述(Ponpipom等人，1981，J.Med.Chem.，24，1388-1395)。使用基于半乳糖、半乳糖胺或叶酸的缀合物转运外源化合物跨越细胞膜可以提供例如治疗肝病、肝癌或其他癌症的靶向递送方法。生物缀合物的使用还提供对于治疗所需的治疗化合物的所需剂量中的减少。此外，治疗生物利用率、药物动力学和药物代谢动力学参数可以通过使用本发明的核酸生物缀合物进行调节。此类生物缀合物的非限制性例子在2001年8月13日提交的Vargeese等人，USSN 10/201,394；和2002年3月6日提交的Matulic-Adamic等人，USSN 60/362,016中得到描述。

可替代地，本发明的某些siNA分子可以在细胞内从真核启动子表达(例如，Izant和Weintraub，1985，Science，229，345；McGarry和Lindquist，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 83，399；Scanlon等人，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88，10591-5；Kashani-Sabet等人，1992，Antisense Res.Dev.，2，3-15；Dropulic等人，1992，J.Virol.，66，1432-41；Weerasinghe等人，1991，J.Virol.，65，5531-4；Ojwang等人，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89，10802-6；Chen等人，1992，Nucleic Acids Res.，20，4581-9；Sarver等人，1990 Science，247，1222-1225；Thompson等人，1995，Nucleic Acids Res.，23，2259；Good等人，1997，Gene Therapy，4，45)。本领域技术人员认识到任何核酸都可以在真核细胞中从合适的DNA/RNA载体表达。此类核酸的活性可以通过其经由酶促核酸从初级转录物中释放得到增大(Draper等人，PCT WO 93/23569，和Sullivan等人，PCT WO 94/02595；Ohkawa等人，1992，Nucleic Acids Symp.Ser.，27，15-6；Taira等人，1991，Nucleic Acids Res.，19，5125-30；Ventura等人，1993，Nucleic Acids Res.，21，3249-55；Chowrira等人，1994，J.Biol.Chem.，269，25856)。

在本发明的另一个方面，本发明的RNA分子可以由插入到DNA或RNA载体内的转录单位(参见例如Couture等人，1996，TIG.，12，510)表达。重组载体可以是DNA质粒或病毒载体。表达siNA的病毒载体可以基于但不限于下述进行构建：腺伴随病毒、逆转录病毒、腺病毒或甲病毒。在另一个实施方案中，基于pol III的构建体用于表达本发明的核酸分子(参见例如Thompson，美国专利号5,902,880和6,146,886)。能够表达siNA分子的重组载体可以如本文所描述的递送，且在靶细胞中持续。可替代地，可以使用提供核酸分子的瞬时表达的病毒载体。必要时此类载体可以重复施用。一旦被表达，siNA分子就与靶mRNA相互作用且产生RNAi应答。siNA分子表达载体的递送可以是全身性的，例如通过静脉内或肌内施用，通过施用于从受试者外植的靶细胞随后重新引入受试者内，或通过将允许引入所需靶细胞内的任何其他方式(关于综述参见Couture等人，1996，TIG.，12，510)。

在一个方面，本发明的特征在于包含编码本发明的至少一种siNA分子的核酸序列的表达载体。表达载体可以编码siNA双链体的一条或两条链，或自我杂交成siNA双链体的单条自互补链。编码本发明的siNA分子的核酸序列可以以允许siNA分子表达的方式可操作地连接(参见例如Paul等人，2002，Nature Biotechnology，19，505；Miyagishi和Taira，2002，Nature Biotechnology，19，497；Lee等人，2002，NatureBiotechnology，19，500；和Novina等人，2002，Nature Medicine，预先在线公开doi：10.1038/nm725)。

在另一个方面，本发明的特征在于包含下述的表达载体：a)转录起始区(例如，真核polI、II或III起始区)；b)转录终止区(例如，真核pol I、II或III终止区)；和c)编码本发明的至少一种siNA分子的核酸序列，其中所述序列以允许siNA分子表达和/或递送的方式与所述起始区和所述终止区可操作地连接。载体可以任选包括关于在编码本发明siNA的序列的5′侧或3′-侧上可操作地连接的蛋白质的可读框(ORF)；和/或内含子(间插序列)。

siNA分子序列的转录可以由用于真核RNA聚合酶I(pol I)、RNA聚合酶II(pol II)、或RNA聚合酶III(pol III)的启动子驱动。来自pol II或pol III启动子的转录物在所有细胞中以高水平表达；给定pol II启动子在给定细胞类型中的水平取决于附近存在的基因调节序列(增强子、沉默基因等)的性质。原核RNA聚合酶启动子也可以使用，只要原核RNA聚合酶在合适的细胞中表达(Elroy-Stein和Moss，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.U S A，87，6743-7；Gao和Huang 1993，NucleicAcids Res.，21，2867-72；Lieber等人，1993，Methods Enzymol.，217，47-66；Zhou等人，1990，Mol.Cell.Biol.，10，4529-37)。几个研究者已证实由此类启动子表达的核酸分子可以在哺乳动物细胞中起作用(例如，Kashani-Sabet等人，1992，Antisense Res.Dev.，2，3-15；Ojwang等人，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.U S A，89，10802-6；Chen等人，1992，Nucleic Acids Res.，20，4581-9；Yu等人，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.U S A，90，6340-4；L′Huillier等人，1992，EMBO J.，11，4411-8；Lisziewicz等人，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A，90，8000-4；Thompson等人，1995，Nucleic Acids Res.，23，2259；Sullenger和Cech，1993，Science，262，1566)。更具体而言，转录单位例如衍生自编码U6小核(snRNA)、转移RNA(tRNA)和腺病毒VA RNA的基因的那些在细胞中产生高浓度的所需RNA分子例如siNA方面是有用的(Thompson等人，同上；Couture和Stinchcomb，1996，同上；Noonberg等人，1994，Nucleic Acid Res.，22，2830；Noonberg等人，美国专利号5,624,803；Good等人，1997，Gene Ther.，4，45；Beigelman等人，国际PCT公开号WO 96/18736。上述siNA转录单位可以掺入多种载体内用于引入哺乳动物细胞内，包括但不限于，质粒DNA载体、病毒DNA载体(例如，腺病毒或腺伴随病毒载体)、或病毒RNA载体(例如逆转录病毒或甲病毒载体)(关于综述参见Couture和Stinchcomb，1996，同上)。

在另一个方面，本发明的特征在于以允许那种siNA分子表达的方式包含编码本发明的至少一种siNA分子的核酸序列的表达载体。在一个实施方案中，表达载体包含：a)转录起始区；b)转录终止区；和c)编码siNA分子的至少一条链的核酸序列，其中所述序列以允许siNA分子表达和/或递送的方式与起始区和终止区可操作地连接。

在另一个实施方案中，表达载体包含：a)转录起始区；b)转录终止区；c)可读框；和d)编码siNA分子的至少一条链的核酸序列，其中所述序列与可读框的3′-末端可操作地连接，且其中所述序列以允许siNA分子表达和/或递送的方式与起始区、可读框和终止区可操作地连接。在另外一个实施方案中，表达载体包含：a)转录起始区；b)转录终止区；c)内含子；和d)编码至少一种siNA分子的核酸序列，其中所述序列以允许核酸分子表达和/或递送的方式与起始区、内含子和终止区可操作地连接。

在另一个实施方案中，表达载体包含：a)转录起始区；b)转录终止区；c)内含子；d)可读框；和e)编码siNA分子的至少一条链的核酸序列，其中所述序列与可读框的3′-末端可操作地连接，且其中所述序列以允许siNA分子表达和/或递送的方式与起始区、内含子、可读框和终止区可操作地连接。

ENaC生物学和生物化学

上皮钠通道(ENaC，或钠通道非神经元1(SCNN1)或阿米洛利敏感钠通道(ASSC))是膜结合的离子通道，其对于Li⁺、质子且特别是Na⁺是可渗透的。它是‘组成性激活的’通道，即不需要门控刺激且在静止时是开放的。ENaC是由3个不同亚单位组成的异聚体蛋白质-α(SCNN1A)、β(SCNN1B)和γ(SCNN1G)。确切化学计量学直到最近仍不明了，但基于与ASIC通道的同源性，几乎确定是异源三聚体(Jasti等人同上)。每个亚单位由2个跨膜螺旋和胞外环组成。所有多肽的氨基和羧基末端都位于细胞溶质中。此外，存在第四个、所谓的δ-亚单位，其与α-亚单位共享显著同源性，并且可以与β-和γ-亚单位一起形成功能离子通道。例如δ2、β、γ-四聚体在胰腺、睾丸和卵巢中出现，尽管其功能仍是未知的。

ENaC位于特别是肾、肺和结肠中的极化上皮细胞的顶膜中。它涉及经上皮Na⁺-离子转运，这连同Na⁺/K⁺-ATP酶一起完成。它通过Na⁺-离子的再吸收在血液、上皮和上皮外液体的Na⁺-和K⁺-离子稳态中起主要作用。

气道衬有以两层约10微米深的液体膜。在纤毛周围是水样纤周溶胶。在这之上是诱陷吸入颗粒的粘液毡。粘液层自身诱陷吸入的病原体/颗粒，允许其经由进行的粘膜纤毛消除而去除，无需触发潜在有害的炎症应答。纤周溶胶的低粘度允许纤毛击打且推进粘液毡沿着气道到口。在大气道中，粘液占优势地来自粘液腺，但也来自表面上皮中的杯状细胞。水通过腺体分泌加入气道表面，这通过经由浆液细胞的活跃Cl^-分泌驱动。水通过经由ENaC跨越表面上皮的Na⁺转运去除。在气道疾病中，平衡从水分泌变成粘液分泌(Widdicombe，J.H.(2002)J.Anat.201第313-318页)。因此，ENaC代表跨越气道上皮的钠吸收的限速步骤，并且因此控制来自气道上皮表面的水吸收。COPD(Melton，L.(2002)Lancet 359第1924页；Hogg，J.C.等人(2004)N.Engl.J.Med.350第2645-2653页；deMarco，R.等人(2007)Am.J.Respir.Crit.Care Med.175第32-39页)和囊性纤维化的特征在于气道的相对脱水，引起粘液粘连。结果是粘液淤滞。粘连粘液阻塞气道，并且可以变成第一次间歇发作的病源地，并且随后为慢性气道感染/疾病恶化。

COPD中的粘液脱水可能是多因素的。必须指出相对脱水可以表现为较少的气道表面液体或腔中存在的材料固体％中的增加。虽然COPD的关键特征杯状细胞增生(Hogg等人同上)和所产生的粘蛋白分泌过多本身可以增加气道表面液体的固体含量％，引起COPD中的相对脱水，但离子和水转运中的缺陷起作用也是可能地(Boucher，R.C.(2004)Proc.Am.Thorac.Soc .1第66-70页)。可能粘液脱水是COPD中的问题的最令人注目数据是Hogg的那些(Hogg等人同上)，这描述了对于气道表面的粘液粘附和小气道中的粘液阻塞。在这个研究中，在手术切除的肺组织中评估在具有COPD的患者中气道阻塞的进行性病理学效应。COPD的进展与壁中的组织体积中的增加(P＜0.001)和小气道的腔中炎性粘液渗出物的积累(P＜0.001)强相关。

关于囊性纤维化，Knowles等人(Knowles，M等人(1981)N.Engl.J.Med.305第1489-1495页)测量在具有囊性纤维化的患者和对照患者中跨越呼吸粘液的经上皮电势差。囊性纤维化气道中的经上皮电势差明显大于对照中。这是由于过量ENaC介导的Na⁺转运，因为用阿米洛利的腔表面溢出在囊性纤维化中诱导比对照中在经上皮电势差中的更大减少。这些基本观察改变了囊性纤维化的呼吸病理学的潜在原因的观点，从仅仅是由于缺乏Cl^-离子分泌的缺陷到与过量Na⁺吸收相关的那种。

响应阿米洛利在电势差中的更大减少指示来自呼吸上皮表面的过量盐吸收和因此液体吸收。这得到各种体外和体内研究的强烈支持(Boucher，R.C(2007)Annu.Rev.Med.58第157-170页；Boucher，R.C.(2007)Trends Mol.Med.13第231-240页；Boucher，R.C.(2007)J.Int.Med.261第5-16页；Donaldson，S.H.和Boucher，R.C.(2007)Chest 132第1631-1636页)。气道表面脱水的结果是粘液淤滞。粘连粘液阻塞气道，并且可以变成第一次间歇发作的病源地，并且随后为慢性气道感染/疾病恶化。解决这个缺陷的治疗策略的开发是减缓、延迟或潜在地预防这些肺疾病的合乎逻辑和有希望的方法。

实施例：

下述是显示本发明的核酸的选择、分离、合成和活性的非限制性例子。

实施例1：针对ENaCα有活性的siNA的设计、合成和鉴定

ENaCαsiNA合成

设计、合成一系列64条siNA链且就针对ENaC的功效评估。关于ENaC siNA设计的主要标准是(i)跨越所有人、小鼠和大鼠同工型的ENaC的保守，和(ii)如通过有专利权的算法测定的高功效得分。还检查了siNA对ENaC蛋白质生产和RNA水平的作用。设计、合成且就针对ENaC的功效评估的siNA序列在表1a(靶序列)和表1b(修饰序列)中描述。

表1a：ENaCα靶序列，注明靶位点。

实施例2：siNA构建体的串联合成

本发明的示例性siNA分子使用可切割接头例如基于琥珀酰的接头串联合成。如本文所描述的串联合成随后为以高得率提供RNAi分子的单步纯化过程。这种方法高度顺应siNA合成支持高通量RNAi筛选，并且可以容易地适应多柱或多孔合成平台。

其中5′-末端二甲氧三苯甲基(5′-O-DMT)保持完整(三苯甲基依赖合成)的siNA寡核苷酸(oligo)及其互补体串联合成完成后，寡核苷酸如上所述进行脱保护。脱保护后，允许siNA序列链自发地杂交。这种杂交产生其中一条链已保留5′-O-DMT基团而互补链包含末端5′-羟基的双链体。新形成的双链体在常规固相提取纯化(三苯甲基依赖(Trityl-On)纯化)期间表现为单个分子，即使只有1个分子具有二甲氧三苯甲基。因为链形成稳定的双链体，所以这种二甲氧三苯甲基(或等价基团，例如其他三苯甲基或其他疏水性部分)是纯化寡核苷酸对所全部需要的，例如通过使用C18药液筒。

使用标准亚磷酰胺合成化学法(chemistry)直至引入串联接头的点，例如反向脱氧脱碱基琥珀酸酯或琥珀酸甘油酯接头(参见图1)或等价可切割接头。可以使用的接头偶联条件的非限制性例子包括阻碍碱基例如二异丙基乙胺(DIPA)和/或DMAP，在活化剂例如六氟磷酸溴三吡咯烷

(PyBrOP)的存在下。接头偶联后，使用标准合成化学以完成第二种序列的合成，使末端5′-O-DMT保持完整。合成后，所得到的寡核苷酸根据本文描述的程序进行脱保护，且用合适的缓冲液例如用50mM NaOAc或1.5M NH₄H₂CO₃猝灭。

siNA双链体的纯化可以使用固相提取容易地完成，例如使用用1柱体积(CV)的乙腈、2CV H2O和2CV 50mM NaOAc调节的WatersC18 SepPak 1g药液筒。装载样品且随后用1CV H2O或50mM NaOAc洗涤。失败序列用1CV 14％ACN(水性具有50mM NaOAc和50mMNaCl)洗脱。随后例如使用1CV H2O洗涤柱，随后为柱上脱三苯甲基作用，例如通过使1CV 1％含水三氟乙酸(TFA)经过柱，随后向柱中添加第二次CV 1％含水TFA且允许静置约10分钟。去除剩余TFA溶液且用H2O随后为1CV 1M NaCl和另外的H2O洗涤柱。随后例如使用1CV 20％含水CAN洗脱siNA双链体产物。

图2提供了纯化的siNA构建体的MALDI-TOF质谱分析法分析的例子，其中每个峰对应于siNA双链体的个别siNA链的计算质量。当通过毛细管凝胶电泳(CGE)进行分析时，相同纯化的siNA提供了3个峰，1个峰推测对应于双链体siNA，且2个峰推测对应于分开的siNA序列链。相同siNA构建体的离子交换HPLC分析只显示了单个峰。与由分开合成的寡核苷酸序列链产生的siNA构建体相比较，使用下述萤光素酶报道分子测定测试纯化的siNA构建体证实相同的RNAi活性。

实施例3：siNA的化学合成和纯化

可以设计siNA分子以与RNA信使中的各个位点相互作用，例如本文描述的RNA序列内的靶序列。一种或多种siNA分子的一条链的序列与上文描述的靶位点序列互补。siNA分子可以使用本文描述的方法进行化学合成。用作对照序列的无活性siNA分子可以通过下述合成：使siNA分子的序列混乱，从而使得它与靶序列不互补。一般地，siNA构建体可以通过使用如本文所描述的固相寡核苷酸合成法进行合成(参见例如Usman等人，美国专利号5,804,683；5,831,071；5,998,203；6,117,657；6,353,098；6,362,323；6,437,117；6,469,158；Scaringe等人，美国专利号6,111,086；6,008,400；6,111,086，全部整体引入本文作为参考)。

在非限制性例子中，RNA寡核苷酸以逐步方式使用如本领域已知的亚磷酰胺化学法来合成。标准亚磷酰胺化学法涉及包含下述中的任何一种的核苷的使用：5′-O-二甲氧三苯甲基、2′-O-叔丁基二甲基甲硅烷基、3′-O-2-氰乙基N，N-二异丙基亚磷酰胺基团和环外胺保护基团(例如N6-苯甲酰腺苷、N4乙酰基胞苷、和N2-异丁酰鸟苷)。可替代地，2′-O-甲硅烷基醚可以与酸不稳定的2′-O-原酸酯保护基团结合在如由Scaringe同上描述的RNA合成中使用。不同的2′化学物可以需要不同的保护基团，例如2′-脱氧-2′-氨基核苷可以利用如Usman等人，美国专利5,631,360中描述的N-邻苯二甲酰保护，所述专利整体引入本文作为参考。

在固相合成期间，向固体支持体结合的寡核苷酸中顺次加入(3′-至5′-方向)每种核苷酸。在链的3′-末端处的第一个核苷使用各种接头与固体支持体(例如，可控孔度玻璃或聚苯乙烯)共价附着。使核苷酸前体、核糖核苷亚磷酰胺和活化剂组合，从而导致第二个核苷亚磷酰胺偶联在第一个核苷的5′-末端上。随后洗涤支持体且用加帽试剂例如乙酸酐给任何未反应的5′-羟基加帽，以产生无活性的5′-乙酰基部分。随后使三价的磷键氧化成更稳定的磷酸键。在核苷酸的加入循环结束时，在合适的条件下(例如用于基于三苯甲基的基团的酸性条件和用于基于甲硅烷基的基团的氟化物)切割5′-O-保护基团。对于每个后续核苷酸重复该循环。

可以使用合成条件的修改以最优化偶联效率，取决于待合成的siNA的具体化学组成，例如通过使用不同的偶联时间、不同的试剂/亚磷酰胺浓度、不同的接触时间、不同的固体支持体和固体支持体接头化学物。siNA的脱保护和纯化可以如下述参考文献中一般描述的进行：Usman等人，US 5,831,071、US 6,353,098、US 6,437,117，和Bellon等人，US 6,054,576、US 6,162,909、US 6,303,773，或Scaringe同上，所述参考文献整体引入本文作为参考。此外，可以修改脱保护条件以提供siNA构建体最佳的可能得率和纯度。例如，申请人已观察到包含2′-脱氧-2′-氟核苷酸的寡核苷酸可以在不合适的脱保护条件下降解。此类寡核苷酸使用含水甲胺于约35℃30分钟进行脱保护。如果包含2′-脱氧-2′-氟的寡核苷酸还包含核糖核苷酸，那么用含水甲胺于约35℃30分钟脱保护后，添加TEA-HF且使反应于约65℃维持另外15分钟。siNA脱保护的单链通过阴离子交换进行纯化，以达到高纯度同时维持高得率。为了形成siNA双链体分子，使单链在盐水溶液中以等摩尔比值组合以形成双链体。在冻干之前通过切向过滤使双链体siNA浓缩且脱盐。

下文是显示各种合成的siNA的表。

表1b：合成的ENaCαsiNA链

其中：

A、C、G和U＝核糖A、C、G或U

c和u＝2′-脱氧-2′-氟C或U

A、U和G＝2′-O-甲基(2′-OMe)A、U或G

A和G＝脱氧A或G

B＝反向脱碱基的

T＝胸苷。

siNA组合物的制备

在非限制性例子中，对于每种siNA组合物，使用固相合成分开合成siNA的2条单个的、互补链，随后通过离子交换层析分开进行纯化。使互补链退火以形成双链(双链体)。随后使双链体超滤且冻干以形成固体siNA组合物(例如，药物组合物)。制备过程的非限制性例子显示于表12的流程图中。

固相合成

使用亚磷酰胺化学法在自动化固相合成仪，例如AmershamPharmacia AKTA Oligopilot(例如，Oligopilot或Oligopilot 100plus)上合成单链寡核苷酸。将可调节的合成柱装满由第一个核苷残基衍生的固体支持体。通过酸不稳定的5′-O-二甲氧三苯甲基的脱三苯甲基作用以释放5′-羟基来起始合成。将溶于乙腈的亚磷酰胺和合适的活化剂同时递送给合成柱，从而导致亚磷酰胺(amidite)与5′-羟基的偶联。随后用乙腈洗涤柱。将碘泵过柱以使亚磷酸三酯键P(III)氧化成其磷酸三酯P(V)类似物。在2，6-二甲基吡啶和N-甲基咪唑的存在下，未反应的5′-羟基使用试剂例如乙酸酐进行加帽。对于下一个亚磷酰胺掺入，延伸循环由脱三苯甲基作用步骤重新开始。重复这个过程直至所需序列已合成。通过去除末端二甲氧三苯甲基终止合成。

切割和脱保护

合成结束时，将固体支持体和结合的寡核苷酸转移至过滤漏斗，在真空下干燥，且转移至反应容器。添加水基且使混合物加热，以实现琥珀酰键的切割，氰乙基磷酸保护基团的去除和环外胺保护的脱保护。

对不包含核糖核苷酸的单链执行下述过程：用水基处理固体支持体后，在真空下过滤混合物以使固体支持体和脱保护的粗合成材料分开。随后用水漂洗固体支持体，将其与滤液组合。所得到的碱性溶液用酸中和以提供粗制单链的溶液。

对包含核糖核苷酸的单链执行下述过程：用水基处理固体支持体后，在真空下过滤混合物以使固体支持体和脱保护的粗合成材料分开。随后用二甲基亚砜(DMSO)漂洗固体支持体，将其与滤液组合。使混合物冷却，添加氟化物试剂例如三氢氟酸三乙胺，并使溶液加热。用合适的缓冲液猝灭反应以提供粗制单链的溶液。

阴离子交换纯化

每种粗制单链的溶液使用层析纯化进行纯化。使用合适的缓冲液梯度洗脱产物。将级分收集在封闭卫生处理的容器中，通过HPLC分析，且使合适的级分组合以提供产物库，所述产物库就纯度(HPLC)、同一性(HPLC)和浓度(UV A260)进行分析。

退火

基于产物库的分析，将等摩尔量的(使用理论消光系数计算的)有义和反义寡核苷酸链转移至反应容器。将溶液混合且通过层析法就双链体的纯度进行分析。如果分析指出任一链的过量，那么滴定另外的非过量链直至双链体形成完成。当分析指出已达到靶产物纯度时，将材料转移至切向流过滤(TFF)系统用于浓缩和脱盐。

超滤

退火的产物溶液使用包含合适的分子量截止膜的TFF系统进行浓缩。浓缩后，产物溶液经由渗滤使用WFI质量的水进行脱盐，直至滤液的传导性是水的那种。

冻干

将浓缩的溶液转移至在柜式冷冻干燥机中的卫生处理的盘。随后将产物冷冻干燥成粉末。从冷冻干燥机中取出盘且转移至等级100的层气流(Laminar Air Flow)(LAF)通风橱用于包装。

药品的包装

包含冷冻干燥产物的冷冻干燥机盘在等级100的LAF通风橱中打开。将产物转移至合适大小的卫生处理的容器中，随后将所述卫生处理的容器密封且加上标签。

药品容器封闭系统

在具有卫生处理的盖的卫生处理的Nalgene容器中批量包装冻干的药品。使用的瓶大小取决于在其内放置材料的量。填充后，用聚乙烯带在封闭处将每个瓶另外密封。

分析法和说明

原材料和过程中(In-Process)方法

在引入药品制备过程内前就同一性测试原材料。关键的原材料，掺入药品分子内的那些，使用适当的纯度测试或测定测试另外进行测试。在制备方法中的关键控制点上测试过程中的样品，以监控且确保最终药品的质量。

药品分析法和说明

合并关于寡核苷酸的分析法和验收标准的控制在批量siNA组合物的临床测试前确立。下述测试法和验收标准反映了这些控制的例子。

分析法概括

同一性(ID)测试

ID寡核苷酸主峰：药品的同一性使用层析法确立。用于这种测定的数据通过HPLC测试法之一产生(参见纯度测试)。比较药品样品和标准注射剂的峰保留时间。药品同一性由主峰保留时间的有利比较支持。

分子量：药品的同一性使用分光镜法确立。通过与含水乙酸铵一起沉淀制备药品样品用于分析。药品的分子量通过质谱分析法进行测定。将测试控制在来自理论分子量的原子质量单位的设定数目内。

解链温度：这种方法通过测量双链药品的解链温度(Tm)支持药品的同一性。使溶液中的样品加热同时监控溶液的紫外(UV)吸光度。Tm标记为随着由于双链体解离成单链吸光度增加的吸光度曲线的拐点。

测定测试

寡核苷酸含量：这种测定确定药品中的寡核苷酸总含量。寡核苷酸吸收UV光，在260nm处具有局部极大值。存在的寡核苷酸种类由双链siRNA产物和来自制备过程的其他较少的相关寡核苷酸物质包括残留单链组成。将药品样品精确地称重，溶解，且测定体积地在水中稀释。使用UV分光光度计在石英池中测量吸光度。使用工作标准的用实验测定的摩尔吸光系数计算寡核苷酸总测定值，且以微克钠寡核苷酸/毫克固体药品报告。

纯度测试：纯度将使用一种或多种层析法进行测量。取决于存在的药品的核酸类似物的分离和数目，可以使用正交分离法以监控API的纯度。分离可以通过下述方法达到：

SAX-HPLC：寡核苷酸磷酸二酯和使用缓冲的盐梯度的强阴离子交换HPLC柱之间的离子交换相互作用以进行分离。

RP-HPLC：寡核苷酸和使用含水缓冲液对有机溶剂梯度的疏水反相HPLC柱之间的分配相互作用以进行分离。

毛细管凝胶电泳(CGE)：在凝胶填充的毛细管内在缓冲溶液中通过分子筛的电泳分离。当应用电场时发生分离，从而随着它们通过凝胶基质迁移引起阴离子寡核苷酸按照分子大小分离。在所有分离法中，峰一般按寡核苷酸长度的顺序洗脱且通过UV在260nm处进行检测。

其他测试

物理外观：视觉检查药品样品。这种测试确定材料具有冻干固体的特征，鉴定固体的颜色，且确定是否存在任何可见的污染物。

细菌内毒素测试：细菌内毒素测试通过鲎变形细胞溶解物(LAL)测定使用动态比浊法在96孔板中进行。关于药品的内毒素限度将适当地设定，以便当与赋形剂组合时，在施用的药物产品中不超过关于内毒素的每日容许限度。

需氧生物负荷：需氧生物负荷通过合同实验室(contract laboratory)使用基于USP第<61>章的方法进行。

乙腈含量：残留乙腈分析通过合同实验室使用气相层析(GC)进行。乙腈是上游合成步骤中使用的主要有机溶剂，尽管在合成中使用几种其他有机试剂。后续纯化过程步骤一般去除药品中的溶剂。取决于过程发展工作的结果，可以监控其他溶剂。溶剂将限制在ICH限度内。

含水量：含水量通过容量Karl Fischer(KF)滴定法使用固体蒸发器单位(烤箱)确定。水一般作为组合物按重量计的几个百分比存在于核酸药品中，且因此将得到监控。

pH：将监控重构药品的pH以确保用于人注射的适合性。

离子含量：关于钠、氯化物和磷酸盐的测试将通过合同实验室使用标准原子吸收作用和离子层析法进行。将进行离子的一般监控，以确保掺入药品的药物产品的重量摩尔渗透压浓度将在可接受的生理学范围内。

金属含量：关于有关材料的测试通过合同实验室使用标准分析法-电感偶合等离子体(ICP)光谱学进行。

实施例4：RNAi体外测定法以评估siNA活性

在无细胞系统中重演RNAi的体外测定用于评估靶向RNA靶的siNA构建体。该测定包含由Tuschl等人，1999，Genes and Development，13，3191-3197和Zamore等人，2000，Cell，101，25-33描述的适合对靶RNA使用的系统。衍生自合胞胚层的果蝇提取物用于在体外重构RNAi活性。靶RNA经由体外转录使用T7RNA聚合酶由合适的靶表达质粒产生，或经由如本文所描述的化学合成产生。有义和反义siNA链(例如各20uM)通过在缓冲液(例如100mM乙酸钾，30mMHEPES-KOH，pH 7.4，2mM乙酸镁)中于90℃孵育1分钟随后为于37℃1小时进行退火，随后在裂解缓冲液(例如100mM乙酸钾，pH 7.4的30mM HEPES-KOH，2mM乙酸镁)中进行稀释。可以通过在琼脂糖凝胶上在TBE缓冲液中凝胶电泳且用溴化乙锭染色监控退火。果蝇裂解物使用来自酵母糖蜜琼脂上收集的Oregon R蝇0-2小时龄的胚胎进行制备，所述胚胎被去绒毛膜(dechorionated)且裂解。将裂解物离心且分离上清液。该测定包含反应混合物，所述反应化合物包含50％裂解物[体积/体积]、RNA(10-50pM终浓度)、和包含siNA(10nM终浓度)的10％[体积/体积]裂解缓冲液。反应混合物还包含10mM磷酸肌酸、10ug/ml肌酸磷酸激酶、100um GTP、100uM UTP、100uMCTP、500uM ATP、5mM DTT、0.1U/uL RNA酶抑制剂(RNasin)(Promega)和100uM的每种氨基酸。将乙酸钾的终浓度调整至100mM。反应在冰上预组装且在加入RNA前于25℃预孵育10分钟，随后于25℃孵育另外60分钟。反应用4体积的1.25x Passive Lysis Buffer(Promega)猝灭。靶RNA切割通过RT-PCR分析或本领域已知的其他方法进行测定，且与其中siNA从反应中省略的对照反应比较。

可替代地，关于该测定的内部标记的靶RNA通过在[α-³²P]CTP的存在下的体外转录制备，通过旋转层析经过G50Sephadex柱，且无需进一步纯化用作靶RNA。任选地，靶RNA是使用T4多核苷酸激酶进行5′-³²P末端标记的。测定如上所述进行，并且通过RNAi产生的靶RNA和特异性RNA切割产物在凝胶的放射自显影图上显现。切割百分比通过PHOSPHOR IMAGER

(放射自显影术)定量条带来测定，所述条带代表完整对照RNA或来自无siNA的对照反应的RNA和通过测定产生的切割产物。

在一个实施方案中，这种测定用于确定靶RNA靶中用于siNA介导的RNAi切割的靶位点，其中就RNAi介导的靶RNA靶的切割筛选多个siNA构建体，例如通过分析经由标记的靶RNA的电泳的测定反应，或通过RNA印迹，以及通过本领域众所周知的其他方法。

实施例5：用于评估ENaC基因表达的下调的动物模型

在体外鉴定活性siNA构建体后，气道ENaC功能的啮齿类动物模型可以用于评估靶向ENaC的siNA在减少离子转运中的有效性。合适模型是由Coote，K.J.等人(2008)Br.J.Pharmacol.(2008年9月22日在线投稿第1-9页；doi：10.1038/bjp.2008.363)描述的豚鼠模型。这个模型使用气管电势差以测量在豚鼠中的气道上皮离子转运。

实施例6：RNAi介导的ENaC基因表达的抑制

可以就在例如A549人肺癌细胞中减少ENaC RNA表达的功效测试siNA构建体(表1b)。A549(人；ATCC目录#CCL-185)细胞在37℃在5％CO₂的存在下培养，并且在具有2mM L-谷氨酰胺的Ham′s F12K培养基中生长，所述培养基调整至包含1.5g/L碳酸氢钠，并且补充有以10％终浓度的胎牛血清和100U/mL青霉素。A549细胞在转染前约24小时以7,500细胞/孔，100μl/孔在96孔板中铺平板。在24小时后，如下制备包含siNA和Lipofectamine 2000(Invitrogen)的复合物：制备包含以14μg/ml终浓度的Lipofectamine 2000在OPTI-MEM中的Lipofectamine2000溶液。平行地，在OPTI-MEM中以150nM终浓度制备siNA溶液。在2种溶液于20℃孵育20分钟后，对于每种siNA一起加入相等体积的siNA溶液和Lipofectamine 2000溶液。所得到的溶液具有以75nM终浓度的siNA和以7μg/ml终浓度的Lipofectamine 2000。这种溶液在20℃孵育20分钟。在孵育后，将50μl溶液加入每个孔中(三份重复)。每个孔中的siNA终浓度是25nM，并且每个孔中的Lipofectamine 2000终浓度是2.33μg/ml。使板孵育48小时，在收获前无培养基更换。剂量应答曲线以相似方式测定，其中每个浓度三份重复地完成，并且在每次转染中维持恒定量的Lipofectamine 2000。

使用Invitek Invisorb RNA Cell HTS 96Kit/C(目录#70619000)用略微修改的方案从96孔板中提取RNA。用于从每块板中分离RNA的方案细节如下描述：

1)具有倾角(rake)抽吸培养基

2)加入150ul/孔裂解缓冲液

3)在板振荡器上放置1分钟

4)将DNA结合板置于0.5ml收集板之上

5)将190ul上下吸取2次，并且加入DNA结合板中

6)覆盖板

7)使板以4000RPM离心4分钟

8)弃去DNA结合板

9)将RNA结合板置于2ml收集板之上

10)将150ul/孔结合缓冲液R加入0.5ml收集板中

11)将0.5ml收集板的内容物移至RNA结合板

12)使孵育1分钟

13)使板以4000RPM离心4分钟

14)将600ul/孔洗涤缓冲液R1加入RNA结合板中

15)使板以4000RPM离心4分钟

16)倾倒来自2ml收集板的洗涤缓冲液

17)将400ul/孔洗涤缓冲液R2加入RNA结合板中

18)使板以4000RPM离心4分钟

19)将400ul/孔洗涤缓冲液R2加入RNA结合板中

20)使板以4000RPM离心10分钟

21)倾倒来自2ml收集板的洗涤缓冲液

22)使板以4000RPM离心3分钟

23)弃去2ml收集板，并且将RNA结合板置于微量滴定板之上

24)将100ul/孔洗脱缓冲液加入RNA结合板中

25)孵育2分钟

26)密封板

27)使板以4000RPM离心3分钟

28)弃去RNA结合板

29)覆盖微量滴定板用于在-80冰箱中贮存。

6孔板转染方案

在转染当天，将约150,000细胞种植在6孔板中在2ml生长培养基中。在约3小时后，使用Lipofectamine 2000试剂(2.5μl/孔)，用siNA以12.5、25、50或100nM终浓度转染细胞。如下制备siNA-Lipofectamine2000(以25nM C_f)的复合物：(a)1μM siNA母液在250μl Opti-MEMReduced Serum Medium中稀释(所产生的siNA浓度是250nM)；(b)通过以1∶100比值稀释在Opti-MEM中的原液制备Lipofectamine 2000试剂的工作溶液，它随后混合且在室温孵育5分钟；(c)使250μl稀释siNA与相等体积的Lipofectamine 2000工作溶液混合(所产生的siNA浓度是125nM)；和(d)将500μl混合物加入孔中(所产生的siNA浓度是25nM)。细胞随后在37℃孵育48小时。

定量RT-PCR(Taqman)

一系列探针和引物用于检测在小鼠、大鼠和人细胞系中的ENaCα和GAPDH基因的各种miRNA转录物。根据制造商的说明书，在ABI7500仪器上执行测定。在每次实验内，基线设置在扩增曲线的指数期，并且基于基线与扩增曲线的交叉点，由仪器指定Ct值。这个Ct值随后基于标准曲线指定QTY值。本文各个实验中的标准曲线使用从用于实验转染的相同细胞系中提取的1ng-300ng RNA。

ENaCα蛋白质印迹

用于蛋白质印迹实验的蛋白质来源来自在6孔板中的A549细胞转染。将细胞种植(～150,000/孔)在2mL完全培养基(Ham′s F12，Cellgro目录#10-080-CV+10％FBS)中。细胞在种植后转染3-4小时，使用Lipofectamine 2000用siNA以25nM的终浓度(三份重复)。允许siNA孵育48小时。根据制造商的说明书，使用“PARIS”Protein and RNAIsolation System(Ambion，目录#1921)制备蛋白质样品。使用BradfordDye Reagent(Bio-Rad，目录#500-0205)测量在细胞溶解产物中的总蛋白质量。

通过在含5％2-巯基乙醇的2X Laemmli缓冲液中1∶1稀释蛋白质样品，并且在95℃孵育5分钟，在4-12％NuPAGE预制凝胶(Invitrogen目录#NPO0322BOX)上运行蛋白质印迹测定。每个泳道装载有20μg蛋白质(除根据制造商的推荐方案加入的标记泳道外)。凝胶在100V运行约2小时，或直至20kD标准标记到达凝胶底部。在通过电泳分辨后，将蛋白质转移至PVDF膜(在100V 1小时)。使用在PBS中的酪蛋白(1％)，使膜封闭(在室温60分钟；在板振荡器上)。初级兔多克隆抗体(Abcam#ab3464)在1％酪蛋白/PBS中1∶500稀释，并且与膜一起在4℃在摇杆(rocker)上孵育。使印迹洗涤3次共5分钟，每次用0.1％Twen/PBS溶液。使印迹与次级抗体溶液(山羊抗兔抗体，JactsonImmunoresearch目录#111-035-144)以1∶25,000稀度在室温在摇杆上孵育30分钟。在这个孵育后，使印迹快速冲洗3次共5分钟，每次用0.1％Tween/PBS溶液。根据制造商的说明书，使印迹与ECL+试剂(Amersham#RPN2133)一起孵育1-2分钟。随后使印迹成像。

如上所述的蛋白质印迹测定用于证实本发明的siNA分子减少ENaCα的蛋白质水平。

RACE分析

使用96孔板，用25nM活性或25nM对照siNA处理A549细胞。为了获得足够的RNA(5μg)，一块96孔板用于每次处理(96次重复)。在24小时转染后，使用标准Trizol(Invitrogen)分离来分离总RNA，使用2ml Trizol/96孔板。分离的RNA用于RACE方案。

通过将在7μl H₂O中的5μg总RNA加入冷冻干燥的GeneRacerOligo中，并且在65C孵育5分钟，使GeneRacer Oligo与总RNA连接。将混合物置于冰上2分钟，短暂离心，随后向其中加入1μl 10x连接酶缓冲液、1μl 10mM ATP、1μl RNAse Out(40U/μl)和1μl T4 RNA连接酶(5U/μl)。使混合物轻轻混合，并且随后在37℃孵育1小时。在1小时孵育后，加入90μl DEPC H₂O和100μl苯酚∶氯仿。使混合物以高速(on high)涡旋30秒，并且随后以高速离心5分钟。将水层转移至新的eppendorf管。向这个层中加入2μl糖原、10μl 3M乙酸钠，并且随后混合。随后加入220μl乙醇。使混合物倒转数次以混合，随后置于干冰上10分钟。它以高速在4℃离心20分钟。抽吸上清液，随后用70％乙醇洗涤。它以高速离心5分钟，并且去除上清液。允许团块干燥2-3分钟。使团块悬浮于10μl DEPC H₂O中。

向10μl连接RNA中加入1μl 10μM RT-Primer(ENaCα引物1)、1μl 10mM dNTP mix和1μl DEPC H₂O，随后使混合物在65C孵育5分钟，随后置于冰上2分钟，并且短暂离心。向这个中加入4μl 5x第一链缓冲液、1μl 0.1M DTT、1μl RNAe Out(40U/μl)和1μl Superscript IIIRT(200U/μl)。使混合物轻轻混合，随后在50℃孵育45分钟，随后为65℃7分钟。RT反应通过在70℃孵育15分钟灭活，并且随后置于冰上。使混合物短暂离心。随后向这个中加入1μl RNA酶H(2U)，随后轻轻混合，并且随后在37℃孵育20分钟。随后将这个混合物贮存于-20℃或立即用于PCR。

使用1μl上文的RT反应作为模板，使用5’GeneRacer引物and 3’Gene Specific引物(ENaC α引物1)将标准PCR扩增执行34个循环。通过使用60℃退火温度增加特异性。使用1μl上文的PCR反应作为模板，使用GeneRacer Nested 5’引物和Nested 3’Gene Specific引物(ENaCα引物2)，执行巢式PCR反应34个循环。通过使用60C退火温度增加特异性。在天然6％PAGE上分析样品。使用由GeneRacer试剂盒提供的SNAP柱，切下预期大小的条带，并且从凝胶中洗脱。使用由GeneRacer试剂盒提供的TOPO TA Cloning试剂盒，克隆洗脱的凝胶条带。包含菌落的LB-Amp琼脂板进行PCR筛选且测序。

表2：在RACE方法中使用的引物序列

计算

使用GraphPad Prizm软件由数据计算所有IC₅₀值，特别是用于简单配体结合的S形、变量斜度曲线。此外，除非另有说明，否则siNA的功效和效力(例如击倒％)的所有计算相对于非靶向对照siNA完成。如果报道的话，那么使用斯氏t检验计算P值，包括Welch校正用于不等方差。

在mRNA击倒％的所有计算中，相对于用非靶向对照(NTC)处理的样品中的目的基因表达的标准化水平进行计算，除非另有说明。将目的基因表达水平除以每种样品中的GAPDH或36B4(取决于物种)表达水平。每个实验中关于每个条件的3次重复求平均值，并且计算那些样品的标准差。下式随后用于计算目的基因的击倒％：

(1)-(标准化的活性siNA处理的表达水平)/(标准化的NTC siNA处理的表达水平)*100％。

使标准化数据作图，并且测定与其分别的反向对照siNA比较，通过活性siNA的靶mRNA减少百分比。

结果：

如前所述设计且合成ENaCαsiNA。在3种细胞系中筛选siNA。人A549细胞、小鼠NIH 3T3和大鼠H-4-II-E细胞。在所有3个物种中来自ENaCαsiNA筛选的数据显示于表3a、3b、4a、4b、5a和5b中，并且关于一些siNA分子的数据概括呈现于表6中。每次筛选在24小时时执行。使用这个时间点的决定基于在那个时间点时可见的mRNA击倒程度。

表3a.在人A549细胞中的ENaCαsiNA筛选。在转染细胞中的ENaCα表达、GAPDH的表达水平、对于GAPDH水平标准化的ENaCα表达水平、和相对于在转染细胞中的非靶向对照siNA(NTC)的ENaCαmRNA减少％。对于每个值，n＝3，并且在转染后24小时收获细胞。相对于在转染细胞中的非靶向对照siNA(NTC)的ENaCαmRNA减少％。UNT是未处理对照，并且LF2K是单独的Lipofectamine 2K。

表3b.在人A549细胞中的ENaCαsiNA筛选。在转染细胞中的ENaCα表达、GAPDH的表达水平、对于GAPDH水平标准化的ENaCα表达水平、和相对于在转染细胞中的非靶向对照siNA(NTC)的ENaCαmRNA减少％。对于每个值，n＝3，并且在转染后24小时收获细胞。相对于在转染细胞中的非靶向对照siNA(NTC)的ENaCαmRNA减少％。UNT是未处理对照，并且LF2K是单独的Lipofectamine 2K。

表4a.在小鼠NIH 3T3细胞中的ENaCαsiNA筛选。mSCNN1A的表达、m36B4和mSCNN1A的表达水平对于m36B4水平标准化，和相对于非靶向对照siNA的mSCNN1A mRNA减少％。对于每个点，n＝3，并且在转染后24小时收获细胞。

处理	平均ENaCα表达	平均36B4表达	平均值	标准差	减少％	％sd
							UNT	2.31	17.14	0.15	0.04	35.6％	18.1％
LF2K	3.42	17.25	0.20	0.01	16.7％	3.9％
							位点310	3.19	16.02	0.20	0.04	16.6％	16.4％
位点311	3.83	16.80	0.23	0.02	4.6％	10.0％
							位点334	3.57	16.98	0.21	0.03	12.3％	11.9％
位点337	3.42	14.44	0.24	0.02	0.8％	7.2％
							位点338	3.24	12.29	0.26	0.02	-9.5％	8.7％
位点339	5.05	14.61	0.35	0.01	-44.9％	2.7％
							位点340	3.35	14.93	0.23	0.01	5.4％	5.0％
位点341	3.17	13.56	0.23	0.04	3.9％	17.0％
							位点781	3.50	16.49	0.22	0.06	9.8％	25.5％
位点782	0.85	16.72	0.05	0.04	78.2％	14.9％
							位点1100	3.43	14.25	0.24	0.04	-1.5％	18.4％
位点1121	3.39	11.45	0.27	0.04	-14.5％	17.2％
							位点1181	0.54	15.48	0.04	0.04	84.4％	16.2％
位点1351	2.56	11.91	0.22	0.01	9.6％	4.8％
							位点1382	2.94	13.77	0.21	0.02	10.7％	6.8％
位点1383	0.91	14.23	0.04	0.04	82.4％	15.6％
							MAPK14 1033	3.04	15.69	0.20	0.03	17.2％	14.1％
MAPK14对照2	3.20	13.51	0.24	0.03	0.0％	14.0％

表4b.在小鼠NIH 3T3细胞中的ENaCαsiNA筛选。mSCNN1A的表达、m36B4和mSCNN1A的表达水平对于m36B4水平标准化，和相对于非靶向对照siNA的mSCNN1A mRNA减少％。对于每个点，n＝3，并且在转染后24小时收获细胞。

表5a：在大鼠H-4-II-E中的ENaCαsiNA筛选。显示了对于rGAPDH水平标准化的rSCNN1A的表达、rGAPDH和rSCNN1A的表达水平，和相对于非靶向对照siNA(NTC)的r ENaCαmRNA减少％。对于每个点，n＝3，并且在转染后24小时收获细胞。

表5b：在大鼠H-4-II-E中的ENaCαsiNA筛选。显示了对于rGAPDH水平标准化的rSCNN1A的表达、rGAPDH和rSCNN1A的表达水平，和相对于非靶向对照siNA(NTC)的r ENaCαmRNA减少％。对于每个点，n＝3，并且在转染后24小时收获细胞。

表6在人、大鼠和小鼠细胞系中关于一些siNA的ENaC mRNA击倒功效(％KD)和效力(IC₅₀)概括。

RACE实验证实与表6中的位点对应的siNA构建体显示RISC介导的靶RNA切割。因此，验证RNA击倒是RNAi活性的直接结果。

实施例7：在人支气管上皮细胞中的最大限度ENaC mRNA击倒和ENaC siNA效力。

细胞培养制备

得自Lonza的人支气管上皮细胞(NHBE细胞)(目录号CC-2540)在5％CO2的存在下在37℃生长，并且在BEBM基本培养基(Lonza，目录号CC-3171)中在Biocoat胶原1包被烧瓶(Becton Dickinson)上培养。

人U2OS-TLR7和人U2OS-TLR8细胞在5％CO2的存在下在37℃生长，并且在达尔贝科改良伊格尔氏培养基(DMEM)、1％非必需氨基酸中培养，所述培养基补充有以10％的胎牛血清以及100ug/ml链霉素和100u/ml青霉素。通过添加300ug/ml庆大霉素维持TLR7和TLR8的稳定表达。

重组HEK293细胞系(表达ENaCβ和γ)SCNN1B(P618AY620L)+SCNN1G(P624stop)#24在CO2的存在下在37℃生长，并且在M1培养基M1+0.5mg/ml遗传霉素和0.2mg/ml潮霉素中培养。

转染

在NHBE中的mRNA击倒和EC50：细胞在胶原1包被的板中铺平板，并且在合适培养基中培养。细胞在铺平板后在5％CO2的存在下在37℃培养24小时。siNA在OptiMEM 1中稀释至1uM，并且递送脂质GSK212357A稀释至25ug/ml。对于siNA制剂，使相等体积的稀释siNA和递送脂质组合，并且在室温孵育20分钟。细胞同时进行胰蛋白酶处理，并且以150,000细胞/ml重悬浮于无抗生素BEBM培养基中。96孔板的每个孔加入20ul配制的siNA和80ul BEBM培养基(6次重复/数据点/siNA浓度)，以便给出siRNA的9点剂量范围(100nM、30nM、10nM、3nM、1nM、0.3nM、0.1nM、0.03nM、0.01nM)。与GSK212357A-siNA复合物的孵育时间是48小时，伴随在24小时时的一次培养基更换。

TLR3介导的免疫刺激：NHBE细胞如上所述进行处理用于测量胞内体TLR3介导的免疫刺激，包括聚I:C作为关于OAS1 mRNA上调的阳性对照。对于膜结合的TLR3介导的免疫刺激的测量，NHBE细胞以1200细胞/96孔培养，并且在不存在递送媒介物的情况下以(100nM、30nM、10nM、3nM、1nM、0.3nM、0.1nM、0.03nM、0.01nM)施用在PBS中的siRNA。

TLR7和TLR8介导的免疫刺激：在转染前24小时，表达TLR7和TLR8的U2OS骨肉瘤细胞以2x10⁴细胞/孔的浓度种植在96孔板形式中。使用DharmaFECT1脂质转染试剂用siRNA转染细胞，分别使用瑞喹莫德(R848)和LyoVec-复合的、富含GU的寡核苷酸ssRNA40作为对照(100μl/孔)。在6小时后用含抗生素DMEM替换处理培养基。在转染后24小时收获细胞。R848和ssRNA40是在刺激后2种受体的表征激动剂；转化的骨肉瘤细胞显示以剂量应答方式增加的IL8表达。确定4-10μg/ml的激动剂浓度范围，因为它引起用于测定的IL8mRNA表达的最佳水平。在用2种激动剂R848和ssRNA40处理后，在缺乏TLR的天然U2OS细胞系中未观察到显著的IL8表达。

DharmaFECT1用作递送试剂用于siRNA，因为它组合低免疫刺激作用与高递送效率。

在超表达ENaCα的细胞中经由FLIPR对ENaC的功能作用：反向转染方法用于转染HEK重组细胞系。5ul siRNA(在Optimem中稀释至合适浓度)与在Optimem中稀释的5ul Gemini脂质转染试剂在384孔非包被FLIPR板中混合。使板在室温孵育20分钟，以允许复合物形成。收获细胞，向下旋转，稀释至3x10⁵/ml，并且以40ul/孔(12K/孔)在包含转染复合物的384孔板形式中铺平板。使板孵育过夜20小时。细胞随后用表达ENaCα的BacMam病毒(表达SCNN1A的BacMam病毒，GRITS 29703，滴度0.356x10⁸/ml)转导。加入30ul病毒(1.7％)20K/孔，MOI是约1。使细胞孵育24小时。在FLIPR测定当天，抽吸培养基，留下10ul体积。装载20ul染料/孔(FMP2 Blue染料，R8181，MDS。对于每壶(pot)，在测定前使133ml Tyrodes缓冲液稀释以制备1X母液)。使板在室温孵育0.5小时，并且在FLIPR读数前在线加入10ul化合物(FLIPR设置：方案Na MP.fcf，伴随暴露长度0.4秒和滤波器#2)。化合物板：1ul体积，行1、2和3是最终16、4和0uM阿米洛利(1/200稀释度)(IC80、IC50和对照)。加入的FMP2染料/猝灭剂测量在FLIPR测定中的Na+，加入的抑制剂阿米洛利以IC80(16uM)或IC50(4uM)。

RNA分离96孔板：根据制造商的说明书，使用Automated SV96Total RNA Isolation System(Promega)，从96孔板形式中的细胞中分离总RNA。Biomek 2000 Laboratory Automation Workstation(BeckmanCoulter)用于将转染细胞溶解产物应用于硅胶膜。无RNA酶DNA酶I随后直接应用于硅胶模，以消化污染性基因组DNA。通过简单洗涤步骤，使结合的总RNA进一步纯化掉污染性盐、蛋白质和细胞杂质。最后，通过加入无核酸酶水从膜中洗脱总RNA。

RNA分离384孔板：根据制造商的说明书，使用Oiagen TurboCapture RNA制备试剂盒提取mRNA。

定量RT-PCR(TaqMan)：一系列探针和引物用于检测在人细胞系中的ENaCα、OAS1、IL8和GAPDH(作为对照/标准化)的miRNA转录物。根据制造商的说明书，在ABI 7900HT仪器上执行测定。使用的引物探针组GAPDH正向5’-CAAGGTCATCCATGACAACTTTG-3(SEQID NO：128)，’反向5’-GGGCCATCCACAGTCTTCT-3’(SEQ ID NO：129)，探针5’d FAM-ACCACAGTCCATGCCATCACTGCCA-TAMRA3’(SEQ ID NO：130)，ENaCα正向5’-ACATCCCAGGAATGGGTCTTC-3’(SEQ ID NO：131)，反向5’-ACTTTGGCCACTCCATTTCTCT-3’(SEQ ID NO：132)，探针5’dFAM-TGCTATCGCGACAGAACAATTACACCGTC-TAMRA 3’(SEQID NO：133)，OAS1正向5’-ACCTAACCCCCAAATCTATGTCAA-3’(SEQ ID NO：134)，反向5’-TGGAGAACTCGCCCTCTTTC-3’(SEQID NO：135)，探针5’dFAM-CTCATCGAGGAGTGCACCGACCTG-TAMRA 3’(SEQ ID NO：136)，IL8正向5’-CTGGCCGTGGCTCTCTTG-3’(SEQ ID NO：137)，反向5’-CCTTGGCAAAACTGCACCTT-3’(SEQ ID NO：138)，探针5’d FAM-CAGCCTTCCTGATTTCTGCAGTCTGTG-TAMRA 3’(SEQID NO：139)。

结论：

TaqMan：将临界阈值(Ct)转换为对应于在384孔板的每个孔中分析的特定基因的拷贝数。对于给定处理在每块板中制备6个等同孔。此处，计算平均基因拷贝数和标准差。变异系数(CV)百分比(％C.V.＝[标准差/平均值]*100)的测定允许省略其值为离群值的孔(从而使得％C.V.＜25)。通过用其在那个特定样品中的GAPDH配对物除那种基因的平均拷贝数测定基因的相对丰度(aka相对表达)。

数据的统计分析

EC50值使用sigma图由数据进行计算。siNA的功效和效力的所有计算相对于非靶向对照siNA完成。

击倒百分比在4种化学修饰的siNA(靶位点1181(SEQ ID NOs：57和58)、靶位点782(SEQ ID NOs：51和52)、靶位点1383(SEQ IDNOs：63和64)和靶位点1388(SEQ ID NOs 73和74)之间进行比较。数据使用ANOVA检验进行分析，并且随后使用False Discovery Rate校正(FDR)校正p值用于多重比较。还产生95％置信区间曲线图，以图解显示引导线(leads)在哪里显著不同于彼此。

结果

针对靶位点782(SEQ ID NOs：51和52)、1181(SEQ ID NOs：57和58)、1383(SEQ ID NOs：63和64)和1388(SEQ ID NOs 73和74))的高度有效和有力的siNA已用于证实在人正常支气管上皮细胞(NHBE)中ENaCαmRNA的最大限度以及剂量依赖性击倒(KD)。

表14：在转染后24小时靶向人ENaCα的siNA的功效(％KD)和效力(EC₅₀)。

另外，评估了以最大限度剂量100nM的4种siNA免疫刺激TLR3介导的OAS1(免疫刺激生物标记)mRNA水平中的增加％。执行9点剂量应答0.01-100nM siNA。

当NHBE细胞用已由递送媒介物(Gemini表面活性剂GSC170 Dab-WO03/82809中的实施例37)配制的siNA转染时，通过记录OAS1mRNA水平中的增加％，测量胞内体TLR3介导的免疫刺激(相对于Gemini递送媒介物对照，OAS1 mRNA水平中的增加％)。TLR3激动剂聚I:C用作关于OAS1 mRNA诱导的阳性对照。

当siNA由DharmaFect1(Gibco BRL)配制且递送至U2OS细胞时，所述U2OS细胞已改造为稳定表达TLR7或TLR8，通过IL8mRNA水平中的增加测量TLR7或TLR8介导的免疫刺激。细胞用TLR7或TLR8激动剂瑞喹莫德(R848)和ssRNA40/LyoVec分别处理，以充当关于IL8mRNA诱导的阳性对照。IL8mRNA水平用作TLR7或TLR8介导的免疫刺激的生物标记。

上文描述的免疫刺激测试的结果显示于图28和29以及表15中。

表15：siNA的TLR3、TLR7和TLR8免疫刺激活性概括。

还测试了ENaC siNA抑制ENaC的功能活性的能力。图30显示了用针对靶位点782和1181的ENaC siNA转染重组HEK细胞，所述ENaC siNA特别是分别对应于SEQ ID NOs：51和52以及SEQ ID NOs：57和58的siNA。

用2种ENaC-αsiNA都观察到剂量依赖性应答抑制。在siNA的最高浓度时观察到高达90％的应答抑制。FLIPR测定中的抑制程度与ENaC mRNA击倒水平关联。在siNA的最高浓度时观察到高达85％的ENaC-αmRNA击倒。结果在表16中概括。在FLIPR测定中，与未转染细胞比较，用对照(UC-3)siNA(Ctrl)转染导致10-30％的本底抑制。

表16：FLIPR测定应答抑制和ENaC mRNA击倒的概括(n＝6，来自3次独立实验的平均数据)。

实施例8：适应症

ENaC研究中现有的大量知识指出需要用于研究、诊断和治疗用途的测定ENaC活性的方法和可以调节ENaC表达的化合物。如本文所描述的，本发明的核酸分子可以在测定中用于诊断与ENaC水平有关的疾病状态。此外，核酸分子可以用于治疗与ENaC水平有关的疾病状态。可以与ENaC表达调节相关的特定疾病状态包括但不限于呼吸性、炎性和自身免疫疾病、性状、状况和表型。此类适应症的非限制性例子在下文讨论。

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是在其中炎症的持续上调被认为起作用的炎性气道和肺泡疾病的一个例子。COPD中的炎症的特征在于嗜中性粒细胞、CD8阳性淋巴细胞和巨噬细胞增加浸润到气道内。嗜中性粒细胞和巨噬细胞在COPD中的气道炎症的发病机理中起重要作用，因为其释放许多介质包括弹性蛋白酶、金属蛋白酶和氧自由基的能力，所述介质促进组织炎症和损害。已暗示在具有COPD的患者气道中的炎性细胞积累通过促炎细胞因子和趋化因子的增加释放驱动，所述促炎细胞因子和趋化因子将炎症细胞吸引到气道内，激活其并且维持其存在。存在的细胞还释放酶(如金属蛋白酶)和氧自由基，这对组织具有负面作用且使疾病持续。广泛多样的促炎细胞因子和趋化因子已显示在具有COPD的患者的肺内是增加的。在它们中，重要作用由肿瘤坏死因子α(TNF-α)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素8(IL-8)发挥，这在具有COPD的患者的气道中是增加的。

其中炎症看起来起作用的呼吸性疾病的其他例子包括：哮喘、囊性纤维化、嗜酸粒细胞性咳嗽、支气管炎、急性和慢性肺同种异体移植物排斥、肉瘤样病、肺纤维化、鼻炎、支气管扩张和窦炎。哮喘通过气道炎症、可逆阻塞和气道高反应性定义。在这种疾病中，涉及的炎症细胞占优势地是嗜酸性粒细胞、T淋巴细胞和肥大细胞，尽管嗜中性粒细胞和巨噬细胞也可以是重要的。广泛多样的细胞因子和趋化因子已显示在气道中是增加的，并且通过促进炎症、阻塞和气道高反应性在这种疾病的病理生理学中起作用。

嗜酸粒细胞性咳嗽的特征在于久咳和在不存在气道阻塞或高反应性的情况下，在患者的气道内存在炎症细胞，主要是嗜酸性粒细胞。几种细胞因子和趋化因子在这种疾病中是增加的，尽管它们主要是嗜酸性粒细胞导向的。嗜酸性粒细胞在气道内被召募且激活，并且潜在地释放酶和氧自由基，这在炎症和咳嗽的持续中起作用。

急性支气管炎是在下气道例如通过污染、粉尘、气体或化学制品的感染或激惹事件过程中发生的急性疾病。慢性支气管炎通过在大多数时候咳嗽的存在和痰产生定义，对于一年至少3个月，共2年。在急性或慢性支气管炎过程中在气道内还可以发现炎症细胞，主要是嗜中性粒细胞，伴随广泛多样的趋化因子和细胞因子。这些介质被认为在这些疾病过程中出现的炎症、症状和粘液产生中起作用。

肉瘤样病是其中慢性非干酪性肉芽肿在组织内出现的不明原因疾病。肺是最通常受累的器官。肺支气管肺泡灌洗显示主要是淋巴细胞、巨噬细胞以及有时的嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞中的增加。这些细胞还通过细胞因子和趋化因子被召募且激活，并且被认为涉及疾病的发病机理。

肺纤维化是特征在于进行性和慢性纤维化(瘢痕化)的肺组织疾病，这将导致慢性呼吸功能不全。存在不同类型和原因的肺纤维化，但特征都在于炎症细胞流入和持续、成纤维细胞的激活和增殖伴随肺组织中的胶原沉积。这些事件看起来涉及细胞因子和趋化因子在肺组织内的释放。

急性鼻炎是在鼻或气道例如通过污染、粉尘、气体或化学制品的感染或激惹事件过程中发生的急性疾病。慢性鼻炎通过持久慢性流鼻水、鼻充血、喷嚏和瘙痒(pruritis)的存在定义。在急性或慢性鼻炎过程中在上气道内还可以发现炎症细胞，伴随广泛多样的趋化因子和细胞因子。这些介质被认为在这些疾病过程中出现的炎症、症状和粘液产生中起作用。

急性窦炎是窦的急性疾病，通常为传染病，特征在于鼻充血、流鼻涕、脓痰、头痛或窦痛，连同或不连同发热。慢性窦炎通过急性窦炎症状持续超过6个月定义。在急性或慢性窦炎过程中在上气道和窦内还可以发现炎症细胞，伴随广泛多样的趋化因子和细胞因子。这些介质被认为在这些疾病过程中出现的炎症、症状和痰产生中起作用。

支气管扩张是特征在于发炎厚壁且膨胀的气道的呼吸性疾病。来自这种疾病的损害是起于许多原因的炎症和感染的恶性循环最后结果，所述许多原因例如囊性纤维化、非囊性纤维化原因、感染后损害等。症状可以包括久咳、痰产生和不适，因为气道变得由细菌慢性感染。

如上所述，这些炎性呼吸性疾病的特征都在于召募且激活不同炎症细胞的介质的存在，所述炎症细胞释放酶或氧自由基，引起症状、炎症持续，并且当慢性时，正常组织的损坏或破坏。

实施例9：靶RNA表达的多功能siNA抑制

多功能siNA设计

一旦已鉴定关于多功能siNA构建体的靶位点，就设计具有长度例如约18个-约28个核苷酸的互补区的siNA的每条链，所述互补区与不同靶核酸序列互补。设计具有约4个-约22个核苷酸的邻近侧翼区的每个互补区，所述侧翼区与靶序列不互补，但包含与另一种序列的互补区的互补性(参见例如图13)。可以同样地设计发夹构建体(参见例如图14)。在不同靶核酸序列之间共享的互补、回文或重复序列的鉴定可以用于缩短多功能siNA构建体的总体长度(参见例如图15和16)。

在非限制性例子中，呈现了另外3类另外的多功能siNA设计，其允许单个siNA分子沉默多个靶。第一种方法利用接头以直接方式连接siNA(或多功能siNA)。这可以允许连接最有效的siNA，而不产生有可能触发干扰素应答的长的、连续RNA段。第二种方法是重叠的或连接的多功能设计的树状聚体延伸；或可替代地siNA以超分子形式的组织。第三种方法使用长度超过30个碱基对的螺旋。这些siNA经由切酶加工将揭示新的、活性5′反义末端。因此，长siNA可以靶向由原始5′末端限定的位点和由新末端限定的那些，所述新末端由切酶加工产生。当与常规多功能siNA(其中有义和反义链各自限定1个靶)组合时，该方法可以用于例如靶向4个或更多位点。

I.栓系的双功能siNA

基本想法是设计其中2条反义siNA链与单条有义链退火的多功能siNA的新方法。有义链寡核苷酸包含接头(例如，如本文所描述的非核苷酸接头)和与反义siNA链退火的2个片段(参见图19)。接头还可以任选包含基于核苷酸的接头。关于这种方法的几个潜在优点和变化包括但不限于：

1.2个反义siNA是独立的。因此，靶位点的选择不受关于2个位点之间的序列保守的需求的约束。可以组合任何2个高活性siNA以形成多功能siNA。

2.当与具有同源性的靶位点组合使用时，靶向存在于2种基因(例如，不同同种型)中的序列的siNA，该设计可以用于靶向超过2个位点。单个多功能siNA可以例如用于靶向2种不同靶RNA的RNA。

3.使用有义和反义链以靶向基因的多功能siNA也可以掺入栓系的多功能设计内。这使得展现用单个复合物靶向6个或更多位点的可能性。

4.可能使超过2个反义链siNA与单个栓系的有义链退火。

5.该设计避免了长的连续dsRNA段。因此，不太可能起始干扰素应答。

6.接头(或与其附着的修饰，例如本文描述的缀合物)可以改善复合物的药物代谢动力学性质或改善其掺入脂质体内。对接头引入的修饰不应影响siNA活性至如果它们与siNA直接附着而具有的相同程度(参见例如图24和25)。

7.有义链可以延长超过退火的反义链，以提供用于附着缀合物的另外位点。

8.复合物的极性可以这样转变，从而使得2个反义3′末端邻近接头，且5′末端远离接头或其组合。

树状聚体和超分子siNA

在树状聚体siNA方法中，siNA的合成通过首先合成树状聚体模板起始，随后为附着各种功能siNA。各种构建体在图20中描述。可以附着的功能siNA的数目仅受使用的树状聚体的尺寸限制。

关于多功能siNA的超分子方法

超分子形式简化了树状聚体合成的挑战。在这种形式中，siNA链通过标准RNA化学合成，随后为各种互补链的退火。个别链合成在5′-末端处包含1个siNA的反义有义序列，随后为核酸或合成接头，例如六乙二醇(hexaethyleneglyol)，其依次随后为以5′至3′方向的另一个siNA的有义链。因此，siNA链的合成可以以标准3′至5′方向进行。三功能和四功能siNA的代表性例子在图21中描述。基于相似原则，可以设计更高功能性的siNA构建体，只要达到各种链的有效退火。

切酶允许的多功能siNA

使用多重靶的生物信息学分析，可以鉴定长度约2个-约14个核苷酸的不同靶序列之间共享的相同序列段。这些相同区域可以设计成延长的siNA螺旋(例如，＞30个碱基对)，从而使得经由切酶的加工揭示次级功能5′-反义位点(参见例如图22)。例如，当siNA反义链(例如，具有3′-TT突出端的双链体中的21核苷酸链)的前17个核苷酸与靶RNA互补时，在25nM时观察到强沉默。以相同形式由仅16核苷酸的互补性观察到80％的沉默。

将这种性质掺入约30个-40个或更多碱基对的siNA设计内导致另外的多功能siNA构建体。图22中的例子举例说明了30碱基对双链体在经由切酶-RNA酶III加工后如何能够靶向3个不同序列；这些序列可以在相同的mRNA或分开的RNA上，例如病毒和宿主因子信使，或沿着给定途径(例如，炎症级联)的多重点。此外，40碱基对双链体可以组合串联双功能设计，以提供靶向4个靶序列的单个双链体。更加广泛的方法可以包括使用同源序列以使得对于1个多功能双链体能够沉默5或6个靶。图22中的例子举例说明了如何能够达到这点。30碱基对双链体经由切酶从任一末端切割成22和8碱基对产物(8b.p.片段未显示)。为了易于呈现，由切酶产生的突出端未显示-但可以被补偿。显示了3个靶向序列。重叠的所需序列同一性由灰色框指出。要求亲本30b.p.siNA的N’s的2’-OH位置的位点以使切酶切割成为可能，如果这在稳定化学物中进行测试的话。应当指出30聚体双链体经由切酶RNA酶III的加工不产生精确的22+8切割，而是产生一系列紧密相关的产物(其中22+8是主要位点)。因此，经由切酶的加工将产生一系列活性siNA。另一个非限制性例子显示于图23中。40碱基对双链体经由切酶从任一末端切割成20碱基对产物。为了易于呈现，由切酶产生的突出端未显示-但可以被补偿。以4种颜色-蓝色、浅蓝色以及红色和橙色显示了4个靶向序列。重叠的所需序列同一性由灰色框指出。这种设计形式可以延伸至较大的RNA。如果化学稳定的siNA由切酶结合，那么策略上定位的核糖核苷酸键可以使设计者切割产物成为可能，其允许更广泛的多功能设计谱。例如不限于约22-核苷酸的切酶标准的切割产物可以允许多功能siNA构建体具有例如约3个-约15个核苷酸的靶序列同一性重叠。

实施例10：诊断用途

本发明的siNA分子可以在多种诊断应用中使用，例如在多种应用中的分子靶(例如，RNA)的鉴定中，例如在临床、工业、环境、农业和/或研究背景中。siNA分子的此类诊断用途涉及利用重构的RNAi系统，例如使用细胞裂解物或部分纯化的细胞裂解物。本发明的siNA分子可以用作诊断工具，以检查在患病细胞内的遗传漂变和突变，或检测内源或外源例如病毒RNA在细胞中的存在。siNA活性和靶RNA的结构之间的紧密关联允许检测分子的任何区域中的突变，所述突变改变靶RNA的碱基配对和三维结构。通过使用在本发明中描述的多重siNA分子，人们可以对核苷酸变化作图，这对于体外以及细胞和组织中的RNA结构和功能是重要的。用siNA分子切割靶RNA可以用于抑制基因表达，且限定特定基因产物在疾病或感染进展中的作用。以这种方式，其他遗传靶可以定义为疾病的重要介质。通过提供组合疗法(例如，靶向不同基因的多重siNA分子、与已知小分子抑制剂偶联的siNA分子、或使用siNA分子和/或其他化学或生物分子组合的间歇疗法)的可能性，这些实验将导致疾病进展的更佳治疗。本发明的siNA分子的其他体外用途是本领域众所周知的，且包括与疾病、感染或相关状况相关的mRNA存在的检测。此类RNA通过测定在用siNA治疗后切割产物的存在进行检测，其中使用标准方法例如荧光共振发射转移(FRET)。

在具体例子中，对于测定使用仅切割野生型或突变型靶RNA的siNA分子。第一种siNA分子(即，仅切割野生型靶RNA的那些)用于鉴定样品中存在的野生型RNA，且第二种siNA分子(即，仅切割突变型靶RNA的那些)用于鉴定样品中的突变型RNA。作为反应对照，野生型和突变RNA的合成底物由2种siNA分子进行切割，以证实在反应和不存在“非靶向的”RNA种类切割的情况下的相对siNA有效性。来自合成底物的切割产物也用于产生大小标记，用于分析样品群体中的野生型和突变RNA。因此，每次分析需要2种siNA分子、2种底物和1种未知样品，其组合成6种反应。使用RNA酶保护测定确定切割产物的存在，从而使得每种RNA的全长和切割片段可以在聚丙烯酰胺凝胶的1个泳道中进行分析。并非绝对需要定量结果，以了解突变RNA的表达和靶细胞中所需表型改变的推定危险。其蛋白质产物牵涉表型(即，疾病相关或感染相关的)发展的mRNA的表达足以确定危险。如果对于2种转录物使用可比较比活性的探针，那么RNA水平的定性比较是足够的且减少初次诊断的成本。较高的突变型与野生型比值与较高的危险相关，无论RNA水平进行定性还是定量比较。

本说明书中提及的所有专利和出版物是本发明所属领域技术人员的技术水平的指示。本公开内容中引用的所有参考文献引入作为参考，其程度如同每个参考文献已个别地整体引入作为参考一样。

技术人员应当理解本发明非常适合于执行目标且获得提及的目标和优点，以及其中固有的那些。作为优选实施方案的目前代表的本文描述的方法和组合物是示例性的且不意欲作为对本发明范围的限制。其中的改变和其他用途对于本领域技术人员将是显而易见的，其包含在本发明的精神内，且由权利要求的范围限定。

在不背离本发明的范围和精神的情况下，可对本文公开的本发明进行各种替换和修饰，这对于本领域技术人员将是显而易见的。因此，此类另外的实施方案在本发明和随后权利要求的范围内。本发明教导本领域技术人员测试本文描述的化学修饰的各种组合和/或替换，以产生具有用于介导RNAi活性的改善活性的核酸构建体。此类改善的活性可以包含改善的稳定性、改善的生物利用率、和/或介导RNAi的细胞应答的改善的活化。因此，本文描述的具体实施方案不是限制性的，并且本领域技术人员应当理解无需过度实验即可测试本文描述的修饰的具体组合，以鉴定具有改善的RNAi活性的siNA分子。

本文举例说明性描述的本发明可以在不存在本文未具体公开的任何一种或多种元素、一种或多种限制的情况下适当地进行实践。因此，例如，在本文的每种情况下，术语“包含”、“基本上由……组成”和“由……组成”中的任何一个可以用另2个术语中的任一替换。已使用的术语和表达用作描述性而非限制性的术语，并且在此类术语和表达的使用中不意欲排除所显示和所描述的特征的任何等价物或其部分，但应认识到在本发明要求保护的范围内的各种修饰是可能的。因此，应当理解尽管本发明已通过优选实施方案具体公开，但本领域技术人员可以采用本文公开概念的任选特征、修饰和变化，并且此类修饰和变化视为在如由说明书和附加权利要求限定的本发明范围内。

此外，当本发明的特征或方面按照马库什(Markush)组或可替代方案的其他分组进行描述时，本领域技术人员将认识到本发明因此也按照马库什组或其他组的任何个别成员或成员亚组进行描述。

实施例11：纳米颗粒封装的siNA/载体制剂的制备

一般的LNP制剂

siNA纳米颗粒溶液通过将siNA和/或载体分子以0.9mg/mL的浓度溶解于25mM柠檬酸盐缓冲液(pH 4.0)中进行制备。脂质溶液通过将阳离子脂质(例如CLinDMA或DOBMA，参见表10中关于制剂的结构和比值)、DSPC、胆固醇和PEG-DMG(表10中所示的比值)的混合物以约15mg/mL的浓度溶解于无水乙醇中进行制备。氮与磷酸盐比值是接近3∶1。

相等体积的siNA/载体和脂质溶液用2个FPLC泵以相同流速递送至混合T形连接器。背压阀用于调整至所需粒度大小。所得到的乳状混合物收集在无菌玻璃瓶中。随后用相等体积的柠檬酸盐缓冲液缓慢稀释这种混合物，并且通过离子交换膜过滤，以去除混合物中的任何游离siNA/载体。针对柠檬酸盐缓冲液(pH 4.0)的超滤用于去除乙醇(来自ALCO筛选的测试条)，且针对PBS(pH 7.4)超滤以更换缓冲液。最终LNP通过浓缩至所需体积获得，并且通过0.2μm滤器无菌过滤。所获得的LNP就粒度大小、ζ电势、含醇量、总脂肪含量、装入胶囊的核酸和总核酸浓度而言进行表征。

LNP制备过程

在一个非限制性例子中，LNP-086siNA/载体制剂如下批量制备。关于过程的工艺流程图显示于表13中，这可以适合于siNA/载体混合物(显示了2种siNA/载体双链体)或单一siNA/载体双链体。过程由下述组成：(1)制备脂质溶液；(b)制备siNA/载体溶液；(3)混合/粒子形成；(4)孵育；(5)稀释；(6)超滤和浓缩。

1.脂质溶液的制备

概述：向配备冷凝器的3颈圆底烧瓶中加入CLinDMA、DSPC、胆固醇、PEG-DMG和亚油醇的混合物。随后加入乙醇。在氩下用搅拌棒搅拌悬浮液，并且使用由过程控制器控制的加热罩在30℃加热。在悬浮液变得澄清后，允许溶液冷却至室温。

用于配制8L LNP批次的详细程序

1.使3颈2L圆底烧瓶、冷凝器、量筒和2个10L圆锥形玻璃容器去热原。

2.使脂质加温至室温。称圆底烧瓶重量的皮重。使用移液管助器(pipette aid)用移液管将CLinDMA(50.44g)转移到3颈圆底烧瓶内。

3.用称量纸将DSPC(43.32g)、胆固醇(5.32g)和PEG-DMG(6.96g)顺次称重到圆底烧瓶内。

4.在分开的玻璃小瓶(去热原的)中称重亚油醇(2.64g)。首先称小瓶的皮重，并且随后用移液管将化合物转移到小瓶内。

5.获得连同液体在内的圆底烧瓶总重量，扣除皮重。误差通常小于±1.0％。

6.将液态溶液所需的八分之一乙醇(1L)转移到圆底烧瓶内。

7.使置于加热罩中的圆底烧瓶与J-CHEM过程控制器连接。用搅拌棒和在顶上的冷凝器在氩下搅拌液体悬浮液。通过具有密封适配器的圆底烧瓶的一个颈将热电偶探头放到悬浮液内。

8.使悬浮液在30℃加热直至它变得澄清。允许溶液冷却至室温，并且转移至圆锥形玻璃容器并且用盖密封。

2.siNA/载体溶液的制备

概述：siNA/载体溶液可以包括单一siNA双链体和或载体，或可以可替代地包括2种或更多种siNA双链体和/或载体的混合物。在单一siNA/载体双链体的情况下，使siNA/载体溶解于25mM柠檬酸盐缓冲液(pH 4.0，100mM NaCl)中，以获得0.9mg/mL的终浓度。在2种siNA/载体分子混合物的情况下，通过使每种siNA/载体分子溶解于25mM柠檬酸盐缓冲液(pH 4.0，100mM NaCl)的50％预期总体积中制备siNA/载体溶液，以获得0.9mg/mL的终浓度。对于另一种siNA/载体分子重复这个程序。使2种0.9mg/mLsiNA/载体溶液混合，以获得以包含2种siNA分子总体积的0.9mg/mL溶液。

用于配制8L含siNA混合物LNP批次的详细程序

1.称重水校正因子(约1.2)3.6g倍的siNA-1粉末到无菌容器例如Corning贮存瓶内。

2.将siNA转移至去热原的5L玻璃容器。用柠檬酸盐缓冲液(25mM，pH 4.0和100mM NaCl)将称重容器冲洗3x，将冲洗液置于5L容器中，用柠檬酸盐缓冲液QS至4L。

3.用UV分光计测定siNA溶液的浓度。一般地，从溶液中获得20μL，稀释50倍至1000μL，并且在用柠檬酸盐缓冲液成为空白后，记录在A260nm的UV读数。制备平行样品且测量。如果关于2个样品的读数是一致的，那么获得平均值且基于siNA的消光系数计算浓度。如果终浓度超出0.90±0.01mg/mL的范围，那么通过加入更多siNA/载体粉末或加入更多柠檬酸盐缓冲液调整浓度。

4.对于siNA-2重复。

5.在10l去热原的10L玻璃容器中，转移4L每种0.9mg/mL siNA溶液

无菌过滤

该过程描述了使脂质/乙醇溶液无菌过滤的操作。目的是提供用于装入胶囊过程的无菌原材料。过滤过程以80mL规模用20cm²膜面积运行。流速是280mL/分钟。这个过程可通过增加管道直径和过滤面积依比例决定。

1.材料

a.高压灭菌的Nalgene 50硅胶管PN 8060-0040

b.Master Flex蠕动泵    型号7520-40

i.Master flex泵压头    型号7518-00

c.Pall Acropak 200.8/0.2μm无菌滤器。PN 12203

d.去热原的10L玻璃容器

e.用于玻璃容器的高压灭菌盖。

2.程序

a.将管道置于泵压头内。将泵设为50％总泵速度，并且用刻度量筒测量流动1分钟

b.调整泵设置且测量流动至280mL/分钟。

c.设置具有由夹子安全附着的滤器的管道。

d.设置泵且将管道置于泵压头内。

e.将管道的进料末端置于待过滤的材料内。

f.将具有进料钟(bell)的滤器滤液侧置于去热原的玻璃容器内。

g.通过滤器注入材料直至所有材料被过滤。

AKTA泵设置

1.材料

a.AKTA P900泵

b.特氟隆管2mm IDx3mm OD 2个各x20.5cm Upchurch PN1677

c.特氟隆管1mm IDx3mm OD  6.5cm Upchurch PN 1675

d.Peek Tee 1mm ID 1个各Upchurch PN P-714

e.1/4-28F至10-32M 2个各Upchurch PN P-652

f.ETFE套圈用于3.0mm OD管道6个各Upchurch PN P-343x

g.Flangless螺母6个各Upchurch PN P-345x

h.ETFE帽用于1/4-28平底配件1个各Upchurch PN P-755

i.氩压缩气体

j.调节器0-60psi

k.特氟隆管

l.Peek Y配件

m.去热原的玻璃器具圆锥形底.2/泵

n.高压灭菌盖。

o.压力盖

2.泵设置

a.打开泵

b.允许泵执行自我检验

c.确保没有与管道附着的帽或压力调节器(这将引起泵超压。)

d.按压“OK”以使泵同步

e.顺时针方向转动旋钮咔嗒4次至“设置”-按压“OK”

f.顺时针方向转动旋钮咔嗒5次至“设置梯度模式”-按压“OK”

g.顺时针方向转动旋钮咔嗒1次至“D”-按压“OK”

h.按压“Esc”两次

3.泵消毒

a.将1000mL 1N NaOH置于1L玻璃容器内

b.使泵与压力盖附着

c.将1000mL 70％乙醇置于1L玻璃容器内

d.使泵与压力盖附着。

e.将2000mL玻璃容器置于泵出口下。

f.顺时针方向转动旋钮咔嗒1次至“设置流速”-按压“OK”

g.顺时针方向转动旋钮以使流速增至40mL/分钟；逆时针方向以降低；当设定所需流速时，按压“OK”。

h.将时间设为40分钟。

i.接通以10psi的氩气。

j.逆时针方向转动旋钮咔嗒2次至“运行”-按压“OK”，并且启动定时器。

k.逆时针方向转动旋钮咔嗒1次至“结束保持暂停”

l.当定时器发出声音时，按压在泵上的“OK”

m.切断气体

n.使泵贮存在消毒溶液中直至准备使用(过夜？)

4.泵流动检查

a.将200mL乙醇置于去热原的500mL玻璃瓶内。

b.使泵与压力盖附着。

c.将200mL无菌柠檬酸盐缓冲液置于500mL去热原的玻璃瓶内。

d.使泵与压力盖附着。

e.将100mL刻度量筒置于泵出口下。

f.顺时针方向转动旋钮咔嗒1次至“设置流速”-按压“OK”

g.顺时针方向转动旋钮以使流速增至40mL/分钟；逆时针方向以降低；当设定所需流速时，按压“OK”。

h.将时间设为1分钟。

i.接通以10psi的氩气。

j.逆时针方向转动旋钮咔嗒2次至“运行”-按压“OK”，并且启动定时器。

k.逆时针方向转动旋钮咔嗒1次至“结束保持暂停”

l.当定时器发出声音时，按压在泵上的“OK”

m.切断气体

n.确认递送了40mL乙醇/柠檬酸盐溶液。

3.粒子形成-混合步骤

o.使无菌盖/乙醇溶液与AKTA泵附着。

p.使无菌siNA/载体或siNA/载体混合物/柠檬酸盐缓冲溶液与AKTA泵附着。

q.使去热原的接受容器(2x批次大小)与盖附着

r.将时间设为计算的混合时间。

s.接通氩气并且维持压力在5-10psi之间。

t.逆时针方向转动旋钮咔嗒2次至“运行”-按压“OK”，并且启动定时器。

u.逆时针方向转动旋钮咔嗒1次至“结束保持暂停”

v.当定时器发出声音时，按压在泵上的“OK”

w.切断气体

4.孵育

在混合后使溶液保持用于22±2小时孵育。孵育在室温(20-25℃)并且加工中溶液避光。

5.稀释

用相等体积的柠檬酸盐缓冲液稀释脂质siNA溶液。用双头蠕动泵稀释溶液，设置具有相等长度的管道和T形连接。流速是360mL/分钟。

1.材料

h.高压灭菌的Nalgene 50硅胶管PN 8060-0040

i.Tee 1/4‘ID

j.Master Flex蠕动泵    型号7520-40

i.Master flex泵压头    型号7518-00

ii.Master flex泵压头   型号7518-00

k.去热原的2x20L玻璃容器

l.用于玻璃容器的高压灭菌盖。

2.程序

a.使2个相等长度的管道与T形连接器附着。管道应是长度约1米。使约50cm的第三段管道与T形连接器的出口末端附着。

b.将管道仪器置于双泵头内。

c.将管道仪器的一个进料末端置于乙醇溶液内。将另一个进料末端置于相等体积的柠檬酸盐缓冲液内。

d.将泵速度控制设为50％。将时间设为1分钟。

e.将管道仪器的出口末端置于500mL刻度量筒内。

f.打开泵且启动定时器。

g.当定时器发出声音时，停止泵且测定递送体积。

h.将泵流速调整至360mL/分钟。

i.当流速设定时，排干管道。

j.将管道仪器的一个进料末端置于脂质/siNA溶液内。将另一个进料末端置于相等体积的柠檬酸盐缓冲液(16L)内。

k.将管道仪器的出口末端置于第一个2x20L去热原的玻璃容器内。

l.将定时器设为90分钟，并且启动泵。视觉上监控稀释过程，以确定流速是相等的。

m.当接受容器在16升时，换成下一个容器，并且收集16L。

n.当所有材料已转移时，停止泵。

6.超滤和浓缩

概述：超滤过程是定时过程，并且必须小心地监控流速。膜面积已基于批次体积进行测定。这是2步过程；第一步是浓缩步骤，获得从32升到3600mL和浓度约2mg/mL的稀释材料。浓缩步骤是4小时±15分钟。第二个步骤是渗滤步骤，将乙醇柠檬酸盐缓冲液更换为磷酸盐缓冲盐水。渗滤步骤是3小时，并且再次必须小心地监控流速。在这个步骤过程中，通过顶空GC监控乙醇浓度。在3小时(20渗滤体积)后，采取第二次浓缩，以使溶液浓缩至约6mg/mL或1.2升的体积。将这个材料收集到去热原的玻璃容器内。系统用400mL PBS以高流速冲洗，并且关闭渗透物线路。收集这种材料并且加入第一个收集中。在这个点时的预期浓度是4.5mg/mL。测定浓度和体积。

1.材料

x.Quatroflow泵

y.具有高压灭菌的5L储库的Flexstand系统。

z.超滤膜GE PN UFP-100-C-35A

aa.0.05μm过滤的PBS 100L

bb.0.5N氢氧化钠

cc.WFI

dd.高压灭菌的Nalgene 50硅胶管PN 8060-0040

ee.Master Flex蠕动泵    型号7520-40

i.Master flex泵压头     型号7518-00

ff.渗透物收集容器100L容量

gg.去热原的刻度量筒2L、1l、500mL。

2.程序

a.系统制备

i.将膜安装在Flexstand固定器中，使用用于膜的合适大小的卫生设备配件。使Flexstand与quatroflow泵附着。使管道与渗余物和渗透物连接附着，并且将这些置于合适的废物容器中。

ii.测定系统滞留体积。

1.将1升WFI置于储库中。

2.夹住渗透物线路。

3.启动Quatroflow泵并且再循环，直至渗余物线路不存在气泡。停止泵

4.标记储库且记录读数共1升。

5.将200mL WFI加入储库中，并且标记1200mL水平。

iii.将3升0.5N氢氧化钠加入储库中，并且冲刷通过渗余物至废物。将3升0.5N氢氧化钠加入储库中，再循环渗余物线路，并且冲刷通过渗透物至废物。将第三个3升0.5N氢氧化钠加入储库中，并且再循环通过渗透物线路至储库30分钟。在使用前将系统贮存于0.5N氢氧化钠中过夜

iv.冲刷氢氧化钠至废物。

v.将3L WFI加入储库中，并且冲刷渗余物至废物，直至pH是中性的，根据需要替换WFI。返回渗余物线路至储库。

vi.加入3升WFI，并且冲刷渗透物线路至废物，直至pH是中性的，根据需要替换WFI。排干系统。

vii.将3升柠檬酸盐缓冲液加入储库中。冲刷通过渗透物线路直至pH＜5。根据需要加入柠檬酸盐缓冲液。

viii.排干系统。

b.LNP浓缩

i.将合适长度的管道置于蠕动泵头内。

ii.将进料末端置于稀释的LNP溶液内；将另一个末端置于储库内。

iii.将稀释的LNP溶液注入储库内至4升标记。

iv.将渗透物线路置于干净的废物容器内。

v.启动quatroflow泵，并且调整泵速度，使得渗透物流速是300mL/分钟。

vi.调整蠕动泵至300mL/分钟，使得液体水平在储库中恒定在4L。

vii.当所有稀释的LNP溶液已转移至储库时，停止蠕动泵。

viii.通过根据需要调整泵速度，在240分钟内使稀释的LNP溶液浓缩至3600mL。

ix.监控渗透物流速、注入设置以及进料和渗余物压力。

c.LNP渗滤

i.将蠕动泵的进料管道置于包含72L PBS(0.05μm过滤)的容器内。

ii.启动蠕动泵，并且调整流速以维持在储库中3600mL的定容。

iii.使Quatroflow泵流速增至400mL/分钟。

iv.监控渗透物流速、注入设置以及进料和渗余物压力。

v.通过GC监控乙醇浓度

vi.LNP溶液用PBS(20体积)渗滤180分钟。

vii.停止蠕动泵。从储库中取出管道。

d.最后浓缩

i.使LNP溶液浓缩至1.2升标记。

ii.将LNP溶液收集到去热原的2L刻度量筒内。

iii.将400mL PBS加入储库中。

iv.启动蠕动泵，并且再循环2分钟。

v.收集冲洗液，并且加入在刻度量筒中的收集LNP溶液中。

vi.记录LNP溶液的体积。

vii.转移至2L去热原的玻璃容器。

viii.标记且冷藏。

e.清洁系统

i.将1L WFI加入储库中

ii.再循环5分钟伴随渗透物关闭。

iii.排干系统

iv.将2L 0.5N氢氧化钠加入储库中

v.再循环5分钟。

vi.排干系统

vii.将2L 0.5N氢氧化钠加入储库中。

viii.再循环5分钟且停止泵。

ix.用WFI中和系统。

x.排干系统且弃去膜。

所获得的LNP就粒度大小、ζ电势、含醇量、总脂肪含量、装入胶囊的核酸和总核酸浓度而言进行表征。

本说明书中提及的所有专利和出版物是本发明所属领域技术人员的技术水平的指示。本公开内容中引用的所有参考文献引入作为参考，其程度如同每个参考文献已个别地整体引入作为参考一样。

技术人员应当理解本发明非常适合于执行目标且获得提及的目标和优点，以及其中固有的那些。作为优选实施方案的目前代表的本文描述的方法和组合物是示例性的且不意欲作为对本发明范围的限制。其中的改变和其他用途对于本领域技术人员将是显而易见的，其包含在本发明的精神内，且由权利要求的范围限定。

在不背离本发明的范围和精神的情况下，可对本文公开的本发明进行各种替换和修饰，这对于本领域技术人员将是显而易见的。因此，此类另外的实施方案在本发明和随后权利要求的范围内。本发明教导本领域技术人员测试本文描述的化学修饰的各种组合和/或替换，以产生具有用于介导RNAi活性的改善活性的核酸构建体。此类改善的活性可以包含改善的稳定性、改善的生物利用率、和/或介导RNAi的细胞应答的改善的活化。因此，本文描述的具体实施方案不是限制性的，并且本领域技术人员应当理解无需过度实验即可测试本文描述的修饰的具体组合，以鉴定具有改善的RNAi活性的siNA分子。

表7：ENaC登记号

NM_001038-SEQ ID NO：127

智人钠通道，非电压门控的1α(SCNN1A)，mRNA

gi|47834319|ref|NM_001038.4|[47834319]-版本4，2006年5月14日更新

NM_000336

智人钠通道，非电压门控的1，β(SCNN1B)，mRNA

gi|124301195|ref|NM_000336.2|[124301195]

NM_001130413

智人钠通道，非电压门控的1，δ(SCNN 1D)，转录物变体1，mRNA

gi|194353988|ref|NM_001130413.1|[194353988]

NM_002978

智人钠通道，非电压门控的1，δ(SCNN1D)，转录物变体2，mRNA

gi|34101281|ref|NM_002978.2|[34101281]

NM_001039

智人钠通道，非电压门控的1，γ(SCNN1G)，mRNA

gi|148839327|ref|NM_001039.3|[148839327]

DQ898177

智人钠通道非电压门控的1δ(SCNN1D)mRNA，5′UTR

gi|114325733|gb|DQ898177.1|[114325733]

DQ898176

智人克隆16HBE140L钠通道非电压门控的1δ(SCNN1D)mRNA，完全cds

gi|114325731|gb|DQ898176.1|[114325731]

DQ898175

智人克隆16HBE140S钠通道非电压门控的1δ(SCNN1D)mRNA，完全cds

gi|114325729|gb|DQ898175.1|[114325729]

NM_031548

褐家鼠钠通道，非电压门控的，I型，α(Scnn1a)，mRNA

gi|47575865|ref|NM_031548.2|[47575865]

NM_011324

小家鼠钠通道，非电压门控的1α(Scnn1a)，mRNA

gi|33859617|ref|NM_011324.1|[33859617]

表8

关于化学修饰的siNA构建体的稳定化学物(chemistry)的非限制性例子

CAP＝任何末端帽，参见例如图7

所有Stab 00-34化学物可以包含3′-末端胸苷(TT)残基

所有Stab 00-34化学物一般包含约21个核苷酸，但可以如本文所描述的改变。

所有Stab 00-36化学物还可以包括如从反义或引导链的5′-末端测定的，在双链核酸双链体的第11个碱基配对位置处在有义或过客链中的单个核糖核苷酸(参见图6C)

S＝有义链

AS＝反义链

^*Stab 23具有与3′-帽邻近的单个核糖核苷酸

^*Stab 24和Stab 28具有在5′-末端处的单个核糖核苷酸

^*Stab 25、Stab 26、Stab 27、Stab 35和Stab 36具有的在5′-末端处3个核糖核苷酸

^*Stab 29、Stab 30、Stab 31、Stab 33和Stab 34在来自5′-末端的前3个核苷酸位置处的任何嘌呤是核糖核苷酸

p＝硫代磷酸酯键

Stab 35具有在3′-突出端处的2′-O-甲基U和在5′-末端处的3个核糖核苷酸

Stab 36具有与靶序列互补的2′-O-甲基突出端(天然存在的突出端)和在5′-末端处的3个核糖核苷酸。

表9

A.2.5μmol合成循环ABI 394仪器

B.0.2μmol合成循环ABI 394仪器

C.0.2μmol合成循环96孔仪器

●等待时间不包含递送期间的接触时间

●串联合成使用接头分子的双重偶联。

表10

脂质纳米颗粒(LNP)制剂

N/P比值＝阳离子脂质和核酸之间的氮∶磷比值

使用的2KPEG是PEG2000，一般可以从～1500到～3000Da不等的多分散剂(即，其中PEG(n)为约33-约67，或平均～45)。

表11

表12：制备流程图

表13：LNP过程流程图

(^*siNA 2是任选的，显示用于输入LNP siNA混合物制剂内，另外的siNA双链体例如siNA 3、siNA 4、siNA 5等可以用于siNA混合物)

Claims (53)

1.一种具有彼此互补的第一条链和第二条链的双链核酸(siNA)分子，其中至少一条链包括：

5’-UGUGCAACCAGAACAAAUC-3’(SEQ ID NO：10)；

5’-GAUUUGUUCUGGUUGCACA-3’(SEQ ID NO：107)；

5’-UUAUGGAUGAUGGUGGCUU-3’(SEQ ID NO：13)；

5’-AAGCCACCAUCAUCCAUAA-3’(SEQ ID NO：124)；

5’-GUGUGGCUGUGCCUACAUC-3’(SEQ ID NO：16)；

5’-GAUGUAGGCACAGCCACAC-3’(SEQ ID NO：125)

5’-GCUGUGCCUACAUCUUCUA-3’(SEQ ID NO：21)；或

5’-UAGAAGAUGUAGGCACAGC-3’(SEQ ID NO：126)；和

其中一个或多个所述核苷酸是任选化学修饰的。

2.权利要求1的双链核酸(siNA)分子，其中所有所述核苷酸是未修饰的。

3.一种双链核酸(siNA)分子，其包括具有有义链和反义链的结构SIX′：

B——————N_X3——————(N)_X2B-3′

B(N)_X1——————N_X4——————[N]_X5-5′

                  SIX′

其中

所述上部链是所述双链核酸分子的有义链，并且所述下部链是所述双链核酸分子的反义链；所述反义链包括与SEQ ID NO：10、SEQ IDNO：13、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：21具有互补性的序列，并且所述有义链包括与所述反义链具有互补性的序列；

每个N独立地是未修饰或化学修饰的核苷酸；

每个B是存在或不存在的末端帽部分；

(N)代表突出端核苷酸，其各自独立地是未修饰的或2’-O-甲基核苷酸、2’-脱氧-2’-氟核苷酸或2′-脱氧核糖核苷酸；

[N]代表其为核糖核苷酸的核苷酸；

X1和X2独立地是0-4的整数；

X3是17-36的整数；

X4是11-35的整数，条件是X4和X5的总和是17-36；

X5是1-6的整数；并且其中

(a)N_X4位置中的每个嘧啶核苷酸独立地是2’-脱氧-2’-氟核苷酸或2’-O-甲基核苷酸；

N_X4位置中的每个嘌呤核苷酸独立地是2’-O-甲基核苷酸或2’-脱氧核糖核苷酸；

(b)N_X3位置中的每个嘧啶核苷酸是2’-脱氧-2’-氟核苷酸；

N_X3位置中的每个嘌呤核苷酸独立地是2’-脱氧核糖核苷酸或2’-O-甲基核苷酸。

4.根据权利要求3的双链核酸(siNA)分子，其中X5是3。

5.根据权利要求3的双链核酸(siNA)分子，其中X1是2，并且X2是2。

6.根据权利要求3的双链核酸(siNA)分子，其中X5是3，X1是2，并且X2是2。

7.根据权利要求3的双链核酸(siNA)分子，其中X5是3，X1是2，X2是2，X3是19，并且X4是16。

8.一种双链短干扰核酸(siNA)分子，其中所述siNA是：

5’-BuGuGcAAccAGAAcAAAucTTB-3’(有义)(SEQ ID NO：51)

     |||||||||||||||||||

3’-UUAcAcGuuGGucuuGuuUAG-5’(反义)(SEQ ID NO：52)

其中：

每个B是反向脱碱基帽部分；

c是2’-脱氧-2’-氟胞苷；

u是2’-脱氧-2’-氟尿苷；

A是2’-脱氧腺苷；

G是2’-脱氧鸟苷；

T是胸苷；

A是腺苷；

G是鸟苷；

U是尿苷

A是2’-O-甲基-腺苷；

G是2’-O-甲基-鸟苷；

U是2’-O-甲基-尿苷；和

所述核苷酸间键合是化学修饰或未修饰的。

9.根据权利要求8的双链短干扰核酸(siNA)分子，其中所述核苷酸间键合是未修饰的。

10.一种双链短干扰核酸(siNA)分子，其中所述siNA是：

5′-BuuAuGGAuGAuGGuGGcuuTTB-3′(有义)(SEQ ID NO：57)

     |||||||||||||||||||

3′UUAAuAccuAcuAccAccGAA-5′(反义)(SEQ ID NO：58)

其中：

每个B是反向脱碱基帽；

c是2’-脱氧-2’-氟胞苷；

u是2’-脱氧-2’-氟尿苷；

A是2’-脱氧腺苷；

G是2’-脱氧鸟苷；

T是胸苷；

A是腺苷；

G是鸟苷；

A是2’-O-甲基-腺苷；

U是2’-O-甲基-尿苷；和

所述核苷酸间键合是化学修饰或未修饰的。

11.根据权利要求10的双链短干扰核酸(siNA)分子，其中所述核苷酸间键合是未修饰的。

12.一种双链短干扰核酸(siNA)分子，其中所述siNA是：

5′BGuGuGGcuGuGccuAcAucTTB 3′(有义)(SEQ ID NO：63)

    |||||||||||||||||||

3′UUcAcAccGAcAcGGAuGUAG 5′(反义)(SEQ ID NO：64)

其中：

每个B是反向脱碱基帽部分；

c是2’-脱氧-2’-氟胞苷；

u是2’-脱氧-2’-氟尿苷；

A是2’-脱氧腺苷；

G是2’-脱氧鸟苷；

T是胸苷；

A是腺苷；

G是鸟苷；

U是尿苷；

A是2’-O-甲基-腺苷；

G是2’-O-甲基-鸟苷；

U是2’-O-甲基-尿苷；和

所述核苷酸间键合是化学修饰或未修饰的。

13.根据权利要求12的双链短干扰核酸(siNA)分子，其中所述核苷酸间键合是未修饰的。

14.一种双链短干扰核酸(siNA)分子，其中所述siNA是：

5′-BGcuGuGccuAcAucuucuATTB-3′(有义)(SEQ ID NO：73)

     |||||||||||||||||||

3′UUcGAcAcGGAuGuAGAAGAU-5′(反义)(SEQ ID NO：74)

其中：

每个B是反向脱碱基帽部分；

c是2’-脱氧-2’-氟胞苷；

u是2’-脱氧-2’-氟尿苷；

A是2’-脱氧腺苷；

G是2’-脱氧鸟苷；

T是胸苷；

A是腺苷；

G是鸟苷；

U是尿苷；

A是2’-O-甲基-腺苷；

G是2’-O-甲基-鸟苷；

U是2’-O-甲基-尿苷；和

所述核苷酸间键合是化学修饰或未修饰的。

15.根据权利要求14的双链短干扰核酸(siNA)分子，其中所述核苷酸间键合是未修饰的。

16.一种双链核酸(siNA)分子，其包括具有有义链和反义链的结构SX′：

B——————N_X3——————(N)_X2B-3′

B(N)_X1——————N_X4——————[N]_X5-5′

                 SX′

其中

所述上部链是所述双链核酸分子的有义链，并且所述下部链是所述双链核酸分子的反义链；所述反义链包括与SEQ ID NO：10、SEQ IDNO：13、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：21具有互补性的序列，并且所述有义链包括与所述反义链具有互补性的序列；

每个N独立地是未修饰或化学修饰的核苷酸；

每个B是存在或不存在的末端帽部分；

(N)代表突出端核苷酸，其各自独立地是未修饰的或2’-O-甲基核苷酸、2’-脱氧-2’-氟核苷酸或2′-脱氧核糖核苷酸；

[N]代表其为核糖核苷酸的核苷酸；

X1和X2独立地是0-4的整数；

X3是17-36的整数；

X4是11-35的整数，条件是X4和X5的总和是17-36；

X5是1-6的整数；并且其中

(a)N_X4位置中的每个嘧啶核苷酸独立地是2’-脱氧-2’-氟核苷酸或2’-O-甲基核苷酸；

N_X4位置中的每个嘌呤核苷酸是2’-O-甲基核苷酸；

(b)N_X3位置中的每个嘧啶核苷酸是核糖核苷酸；

N_X3位置中的每个嘌呤核苷酸是核糖核苷酸。

17.一种双链核酸(siNA)分子，其包括具有有义链和反义链的结构SXI′：

B——————N_X3——————(N)_X2B-3′

B(N)_X1——————N_X4——————[N]_X5-5′

                 SXI′

其中

所述上部链是所述双链核酸分子的有义链，并且所述下部链是所述双链核酸分子的反义链；所述反义链包括与SEQ ID NO：10、SEQ IDNO：13、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：21具有互补性的序列，并且所述有义链包括与所述反义链具有互补性的序列；

每个N独立地是未修饰或化学修饰的核苷酸；

每个B是存在或不存在的末端帽部分；

(N)代表突出端核苷酸，其各自独立地是未修饰的或2’-O-甲基核苷酸、2’-脱氧-2’-氟核苷酸或2′-脱氧核糖核苷酸；

[N]代表其为核糖核苷酸的核苷酸；

X1和X2独立地是0-4的整数；

X3是17-36的整数；

X4是11-35的整数，条件是X4和X5的总和是17-36；

X5是1-6的整数；并且其中

(a)N_X4位置中的每个嘧啶核苷酸独立地是2’-脱氧-2’-氟核苷酸或2’-O-甲基核苷酸；

N_X4位置中的每个嘌呤核苷酸是2’-O-甲基核苷酸；

(b)N_X3位置中的每个嘧啶核苷酸是2’-脱氧-2’-氟核苷酸；

N_X3位置中的每个嘌呤核苷酸是核糖核苷酸。

18.一种双链核酸(siNA)分子，其包括具有有义链和反义链的结构SXII′：

B——————N_X3——————(N)_X2B-3′

B(N)_X1——————N_X4——————[N]_X5-5′

                 SXII′

其中

所述上部链是所述双链核酸分子的有义链，并且所述下部链是所述双链核酸分子的反义链；所述反义链包括与SEQ ID NO：10、SEQ IDNO：13、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：21具有互补性的序列，并且所述有义链包括与所述反义链具有互补性的序列；

每个N独立地是未修饰或化学修饰的核苷酸；

每个B是存在或不存在的末端帽部分；

(N)代表突出端核苷酸，其各自独立地是未修饰的或2’-O-甲基核苷酸、2’-脱氧-2’-氟核苷酸或2′-脱氧核糖核苷酸；

[N]代表其为核糖核苷酸的核苷酸；

X1和X2独立地是0-4的整数；

X3是17-36的整数；

X4是11-35的整数，条件是X4和X5的总和是17-36；

X5是1-6的整数；并且其中

(a)N_X4位置中的每个嘧啶核苷酸独立地是2’-脱氧-2’-氟核苷酸或2’-O-甲基核苷酸；

N_X4位置中的每个嘌呤核苷酸是2’-O-甲基核苷酸；

(b)N_X3位置中的每个嘧啶核苷酸是2’-脱氧-2’-氟核苷酸；

N_X3位置中的每个嘌呤核苷酸是2’-脱氧核苷酸。

19.一种双链核酸(siNA)分子，其包括具有有义链和反义链的结构SXIII′：

B——————N_X3——————(N)_X2B-3′

B(N)_X1——————N_X4——————[N]_X5-5′

                  SXIII′

其中

所述上部链是所述双链核酸分子的有义链，并且所述下部链是所述双链核酸分子的反义链；所述反义链包括与SEQ ID NO：10、SEQ IDNO：13、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：21具有互补性的序列，并且所述有义链包括与所述反义链具有互补性的序列；

每个N独立地是未修饰或化学修饰的核苷酸；

每个B是存在或不存在的末端帽部分；

(N)代表突出端核苷酸，其各自独立地是未修饰的或2’-O-甲基核苷酸、2’-脱氧-2’-氟核苷酸或2′-脱氧核糖核苷酸；

[N]代表其为核糖核苷酸的核苷酸；

X1和X2独立地是0-4的整数；

X3是17-36的整数；

X4是11-35的整数，条件是X4和X5的总和是17-36；

X5是1-6的整数；并且其中

(a)N_X4位置中的每个嘧啶核苷酸是具有核糖样、Northern或A形螺旋构型的核苷酸；

N_X4位置中的每个嘌呤核苷酸是2’-O-甲基核苷酸；

(b)N_X3位置中的每个嘧啶核苷酸是具有核糖样、Northern或A形螺旋构型的核苷酸；

N_X3位置中的每个嘌呤核苷酸是2’-O-甲基核苷酸。

20.一种药物组合物，其包括在药学上可接受的载体或稀释剂中的权利要求1的双链核酸(siNA)。

21.一种药物组合物，其包括在药学上可接受的载体或稀释剂中的权利要求3的双链核酸(siNA)分子。

22.一种药物组合物，其包括在药学上可接受的载体或稀释剂中的权利要求8的双链核酸(siNA)分子。

23.一种药物组合物，其包括在药学上可接受的载体或稀释剂中的权利要求10的双链核酸(siNA)分子。

24.一种药物组合物，其包括在药学上可接受的载体或稀释剂中的权利要求12的双链核酸(siNA)分子。

25.一种药物组合物，其包括在药学上可接受的载体或稀释剂中的权利要求14的双链核酸(siNA)分子。

26.一种药物组合物，其包括在药学上可接受的载体或稀释剂中的权利要求16的双链核酸(siNA)分子。

27.一种药物组合物，其包括在药学上可接受的载体或稀释剂中的权利要求17的双链核酸(siNA)分子。

28.一种药物组合物，其包括在药学上可接受的载体或稀释剂中的权利要求18的双链核酸(siNA)分子。

29.一种药物组合物，其包括在药学上可接受的载体或稀释剂中的权利要求19的双链核酸(siNA)分子。

30.一种包括权利要求3的双链核酸(siNA)分子的药物组合物，其适合于吸入递送。

31.一种包括权利要求8的双链核酸(siNA)分子的药物组合物，其适合于吸入递送。

32.一种包括权利要求10的双链核酸(siNA)分子的药物组合物，其适合于吸入递送。

33.一种包括权利要求12的双链核酸(siNA)分子的药物组合物，其适合于吸入递送。

33.一种包括权利要求14的双链核酸(siNA)分子的药物组合物，其适合于吸入递送。

34.一种治疗患有状况的人受试者的方法，所述状况通过ENaC的作用或通过ENaC作用的丧失介导，所述方法包括给所述受试者施用有效量的权利要求3的双链核酸(siNA)分子。

35.一种治疗患有状况的人受试者的方法，所述状况通过ENaC的作用或通过ENaC作用的丧失介导，所述方法包括给所述受试者施用有效量的权利要求8的双链核酸(siNA)分子。

36.一种治疗患有状况的人受试者的方法，所述状况通过ENaC的作用或通过ENaC作用的丧失介导，所述方法包括给所述受试者施用有效量的权利要求10的双链核酸(siNA)分子。

37.一种治疗患有状况的人受试者的方法，所述状况通过ENaC的作用或通过ENaC作用的丧失介导，所述方法包括给所述受试者施用有效量的权利要求12的双链核酸(siNA)分子。

38.一种治疗患有状况的人受试者的方法，所述状况通过ENaC的作用或通过ENaC作用的丧失介导，所述方法包括给所述受试者施用有效量的权利要求14的双链核酸(siNA)分子。

39.根据权利要求34的方法，其中所述状况是呼吸性疾病。

40.根据权利要求35的方法，其中所述状况是呼吸性疾病。

41.根据权利要求36的方法，其中所述状况是呼吸性疾病。

42.根据权利要求37的方法，其中所述状况是呼吸性疾病。

43.根据权利要求38的方法，其中所述状况是呼吸性疾病。

44.根据权利要求39的方法，其中所述呼吸性疾病选自COPD、哮喘、囊性纤维化、嗜酸粒细胞性咳嗽、支气管炎、肉瘤样病、肺纤维化、鼻炎、窦炎和支气管扩张。

45.根据权利要求40的方法，其中所述呼吸性疾病选自COPD、哮喘、囊性纤维化、嗜酸粒细胞性咳嗽、支气管炎、肉瘤样病、肺纤维化、鼻炎、窦炎和支气管扩张。

46.根据权利要求41的方法，其中所述呼吸性疾病选自COPD、哮喘、囊性纤维化、嗜酸粒细胞性咳嗽、支气管炎、肉瘤样病、肺纤维化、鼻炎、窦炎和支气管扩张。

47.根据权利要求42的方法，其中所述呼吸性疾病选自COPD、哮喘、囊性纤维化、嗜酸粒细胞性咳嗽、支气管炎、肉瘤样病、肺纤维化、鼻炎、窦炎和支气管扩张。

48.根据权利要求43的方法，其中所述呼吸性疾病选自COPD、哮喘、囊性纤维化、嗜酸粒细胞性咳嗽、支气管炎、肉瘤样病、肺纤维化、鼻炎、窦炎和支气管扩张。

49.根据权利要求44的方法，其中所述呼吸性疾病选自COPD、囊性纤维化、支气管扩张和哮喘。

50.根据权利要求45的方法，其中所述呼吸性疾病选自COPD、囊性纤维化、支气管扩张和哮喘。

51.根据权利要求46的方法，其中所述呼吸性疾病选自COPD、囊性纤维化、支气管扩张和哮喘。

52.根据权利要求47的方法，其中所述呼吸性疾病选自COPD、囊性纤维化、支气管扩张和哮喘。

53.根据权利要求48的方法，其中所述呼吸性疾病选自COPD、囊性纤维化、支气管扩张和哮喘。

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