MX2011005576A

MX2011005576A - Inhibicion mediada por interferencia de ácido ribonucleico de la expresion del gen del canal de sodio epitelial (enac) usando acido nucleico corto de interferencia (anci).

Info

Publication number: MX2011005576A
Application number: MX2011005576A
Authority: MX
Inventors: Victoria Pickering
Original assignee: Merck Sharp & Dohme
Priority date: 2008-11-26
Filing date: 2009-11-18
Publication date: 2011-08-17
Also published as: CA2744694A1; BRPI0920933A2; EP2370578A1; WO2010062817A1; EA201100847A1; CN102292443A; JP2012509688A; US20110288154A1; AU2009319949A1; KR20110095391A

Abstract

La presente invención se refiere a compuestos, composiciones y métodos para el estudio, diagnóstico, y tratamiento de características, enfermedades y condiciones que responden a la modulación de la expresión y/o actividad génica de ENaC, y/o modulación de una trayectoria de expresión génica de ENaC; específicamente, la invención se refiere a moléculas de ácido nucleico de doble cadena que incluyen moléculas de ácido nucleico pequeñas, tal como ácido nucleico de corta interferencia (NAsi), ARN de corta interferencia (ARNsi), ARN de doble cadena (ARNds), micro-ARN (ARNmi), y moléculas de ARN de horquilla corta (ARNsh) que son capaces de mediar o que median la interferencia de ARN (ARNi) contra la expresión génica de ENaC.

Description

INHIBICION MEDIADA POR INTERFERENCIA DE ÁCIDO RIBONUCLEICO DE LA EXPRESIÓN DEL GEN DEL CANAL DE SODIO EPITELIAL (ENaC) USANDO ÁCIDO NUCLEICO CORTO DE INTERFERENCIA (ANci) Esta solicitud reclama el beneficio de la solicitud provisional de EE. UU. No. 61/158,316, presentada el 6 de marzo de 2009, la solicitud provisional de EE. UU. No. 61/118,160, presentada el 26 de noviembre de 2008, la solicitud provisional de EE. UU. No. 61/118,157, presentada el 26 de noviembre de 2008, la solicitud provisional de EE. UU. No. 61/118,150, presentada el 26 de noviembre de 2008, la solicitud provisional de EE. UU. No. 61/118,144, presentada el 26 de noviembre de 2008. La presente solicitud reclama el beneficio de todas las solicitudes listadas, que se incorporan aquí como referencia en su totalidad, incluyendo los dibujos.

El listado de secuencias presentado vía EFS, en cumplimiento con el título 37 §1.52 (e)(5) del CFR, se incorpora aquí como referencia. El archivo de texto de listado de secuencias presentado vía EFS contiene el archivo "SequenceListing72WPCT", creado el 18 de noviembre de 2009, que tiene un tamaño de 98,183 bytes.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a compuestos, composiciones y métodos para el estudio, diagnóstico y tratamiento de rasgos, enfermedades y condiciones que responden a la modulación de la expresión o actividad del gen del canal de sodio epitelial (en adelante, ENaC), conocido también como canal de sodio no neuronal 1 (SCNN1), o canal de sodio sensible a la amilorida (ASSC).

La presente invención también está dirigida a compuestos, composiciones y métodos que se refieren a rasgos, enfermedades y condiciones que responden a la modulación de la expresión o actividad de los genes implicados en las rutas de expresión del gen del canal de sodio epitelial (ENaC), u otros procesos celulares que median el mantenimiento o desarrollo de dichos rasgos, enfermedades y condiciones. Específicamente, la invención se refiere a moléculas de ácido nucleico de doble cadena que incluyen moléculas de ácido nucleico pequeñas, tales como moléculas de ácido nucleico corto de interferencia (ANci), ARN corto de interferencia (ARNci), ARN de doble cadena (ARNdc), micro-ARN (miARN), y ARN corto de horquilla (ARNch), capaces de mediar o que median la interferencia de ARN (¡ARN) contra la expresión del gen del canal de sodio epitelial (ENaC), que incluye cocteles de dichas moléculas pequeñas de ácido nucleico y formulaciones de nanopartícula de lípido (LNP) de dichas moléculas pequeñas de ácido nucleico. La presente invención también se refiere a moléculas pequeñas de ácido nucleico, tales como ANci, ARNci y otras, que pueden inhibir la función de moléculas endógenas de ARN, tales como micro-ARN (miARN) de ENaC endógeno (por ejemplo inhibidores de miARN) o ARN corto de interferencia (ARNci) de ENaC endógeno (por ejemplo inhibidores de ARNci), o que pueden inhibir la función del RISC (por ejemplo inhibidores de RISC), para modular la expresión del gen ENaC obstaculizando la función reguladora de dichos ARN endógenos o las proteínas asociadas con dichos ARN endógenos (por ejemplo RISC), que incluyen cocteles de dichas moléculas pequeñas de ácido nucleico y formulaciones de nanopartícula de lípido (LNP) de dichas moléculas pequeñas de acido nucleico. Estas moléculas pequeñas de ácido nucleico son útiles por ejemplo para proveer composiciones para el tratamiento de rasgos, enfermedades y condiciones que pueden responder a la modulación de la expresión del gen ENaC en un sujeto u organismo, tales como enfermedades, rasgos y condiciones respiratorias que incluyen, sin limitación, COPD, asma, tos eosinofílica, bronquitis, fibrosis quistica, sarcoidosis, fibrosis pulmonar, rinitis, sinusitis u otros estados patológicos asociados con la expresión o actividad del gen ENaC en un sujeto u organismo.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION La siguiente es una exposición de la técnica relevante que pertenece a la i-ARN. La exposición se provee solo para comprender la invención que sigue. La breve descripción no es una admisión de que cualquiera de los trabajos que se describen más abajo sea técnica anterior a la invención reclamada.

La interferencia de ARN se refiere al proceso de silenciamiento génico postranscripcional específico de secuencia en los animales, mediado por ARN cortos de interferencia (ARNci) (Zamore et al., 2000, Cell, 101 , 25-33; Fire et al., 1998, Nature, 391 , 806; Hamilton et al., 1999, Science, 286, 950-951 ; Lin et al., 1999, Nature, 402, 128-129; Sharp, 1999, Genes & Dev, 13:139-141 ; y Strauss, 1999, Science, 286, 886). El proceso correspondiente en plantas (Heifetz et al., publicación internacional de PCT No. WO 99/61631 ) se denomina comúnmente silenciamiento génico postranscripcional o silenciamiento de ARN, y también se denomina represión en los hongos. Se piensa que el proceso de silenciamiento génico postranscripcional es un mecanismo de defensa celular conservado evolutivamente, usado para impedir la expresión de genes ajenos, y es compartido comúnmente por flora y fila diversa (Fire et al., 1999, Trends Genet, 15, 358). Dicha protección contra la expresión de genes ajenos pudo haber evolucionado en respuesta a la producción de ARN de doble cadena (ARNdc) derivado de infección viral o de la integración aleatoria de elementos de transposón en un genoma de hospedero, por medio de una respuesta celular que destruye específicamente ARN homólogo de una sola cadena o ARN genómico viral. La presencia de ARNdc en las células activa la respuesta de i-ARN mediante un mecanismo que todavía no está completamente caracterizado. Este mecanismo parece ser diferente de otros mecanismos conocidos que implican ribonucleasas específicas de ARN de doble cadena, tales como la respuesta de interferón que se origina de la activación mediada por ARNdc de la proteína cinasa PKR y la 2',5'-ol¡goadenilato sintetasa, dando como resultado el corte inespecífico del ARNm por la ribonucleasa L (véanse por ejemplo las patentes de EE. UU. Nos. 6,107,094; 5,898,031 ; Clemens et al., 1997, J. Interferón & Cytokine Res, 17, 503-524; Adah er a/., 2001 , Curr. Med. Chem, 8, 1 189).

La presencia de ARNdc grandes en las células estimula la actividad de una enzima ribonucleasa III denominada dicer (Bass, 2000, Cell, 101 , 235; Zamore et al., 2000, Cell, 101 , 25-33; Hammond et al., 2000, Nature, 404, 293). La enzima dicer está implicada en el procesamiento del ARNdc en piezas cortas de ARNdc conocidas como ARN corto de interferencia (ARNci) (Zamore et al., 2000, Cell, 101 , 25-33; Bass, 2000, Cell, 101 , 235; Berstein et al., 2001 , Nature, 409, 363). Los ARN cortos de interferencia derivados de la actividad de la dicer normalmente son de aproximadamente 21 nucleótidos a aproximadamente 23 nucleótidos de longitud, y comprenden dúplex de aproximadamente 19 de pares de bases (Zamore et al., 2000, Cell, 101 , 25-33; Elbashír et al., 2001 , Genes Dev, 15, 188). La dicer también ha sido implicada en el corte de ARN temporales pequeños (ARNtp) de 21 y 22 nucleótidos, a partir de ARN precursor de estructura conservada que está implicado en el control de traducción (Hutvagner et al., 2001 , Science, 293, 834). La respuesta de i-ARN también presenta un complejo de endonucleasa, referido comúnmente como un complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC), que media el corte de ARN de una sola cadena que tiene una secuencia complementaria a la cadena de antisentido del dúplex de ARNci. El corte del ARN objetivo ocurre en la parte media de la región complementaria a la cadena de antisentido del dúplex de ARNci (Elbashir et al., 2001 , Genes Dev, 15, 188).

La i-ARN se ha estudiado en una variedad de sistemas. Fire eí al., 1998, Nature, 391 , 806, fueron los primeros en observar ¡-ARN en C. elegans. Bahramian y Zarbl, 1999, Molecular and Cellular Biology, 19, 274-283, y Wianny y Goetz, 1999, Nature Cell Biol, 2, 70, describen i-ARN mediada por ARNdc en sistemas de mamífero. Hammond et al., 2000, Nature, 404, 293, describen i-ARN en células de Drosophila transfectadas con ARNdc. Elbashir eí al., 2001 , Nature, 411 , 494, y Tuschl et al., publicación internacional de PCT No. WO 01/75164, describen i-ARN inducida por la introducción de dúplex de ARN sintéticos de 21 nucleótidos en células de mamífero cultivadas, que incluyen células de riñon embriónico humano y células HeLa. Un trabajo reciente en lisados embriónicos de Drosophila (Elbashir et al., 2001 , EMBO J., 20, 6877, y Tuschl eí al., publicación internacional de PCT No. WO 01/75164) ha revelado algunos requisitos en cuanto a longitud, estructura, composición química y secuencia de ARNci que son esenciales para mediar la actividad eficiente de la i-ARN. Estos estudios han mostrado que los dúplex de ARNci de 21 nucleótidos son más activos cuando contienen tramos salientes 3'-terminales de dinucleótido. Además, la sustitución completa de una o las dos cadenas de ARNci con nucleótidos 2'- desoxi (2'-H) o 2'-O-metilo anula la actividad de i-ARN, mientras que se observó que se tolera la sustitución de los nucleótidos 3'-terminales de tramo saliente del ARNci con nucleótidos 2'-desoxi (2'-H). También se observó que secuencias con una sola discordancia en el centro del dúplex de ARNci anulan la actividad de i-ARN. Además, estos estudios también indican que la posición del sitio de corte en el ARN objetivo es definida por el extremo 5' de la secuencia guía de ARNci, en lugar del extremo 3' de la secuencia guía (Elbashir et al., 2001 , EMBO J, 20, 6877). Otros estudios han indicado que se requiere un 5'-fosfato en la cadena complementaria al objetivo de un dúplex de ARNci para la actividad del ARNci, y que se utiliza ATP para mantener la porción 5'-fosfato en el ARNci (Nykanen et al., 2001 , Cell, 107, 309).

Los estudios han mostrado que el reemplazo con desoxirribonucleótidos de los segmentos salientes 3'-terminales de nucleótidos de un dúplex de ARNci de 21 nucleótidos que tiene dos tramos salientes 3' de nucleótido, no tiene un efecto adverso sobre la actividad de i-ARN. Se ha informado que el reemplazo de hasta cuatro nucleótidos de cada extremo del ARNci con desoxirribonucleótidos es bien tolerado, mientras que la sustitución completa con desoxirribonucleótidos da como resultado anulación de la i-ARN (Elbashir et al., 2001 , EMBO J, 20, 6877, y Tuschl et al., publicación internacional de PCT No. WO 01/75164). Además, Elbashir et al., supra, también informaron que la sustitución de ARNci con nucleótidos 2'-O-metilo anula completamente la i-ARN. Li et al., publicación internacional de PCT No. WO 00/44914, y Beach et al., publicación internacional de PCT WO 01/68836, sugieren preliminarmente que el ARNci puede incluir modificaciones en el esqueleto de fosfato-azúcar o el nucleósido, para incluir por lo menos un heteroátomo de nitrógeno o azufre; sin embargo, ninguna solicitud postula hasta qué grado serían toleradas dichas modificaciones en las moléculas de ARNci, ni proveen guía o ejemplo adicional de dicho ARNci modificado. Kreutzer et al., solicitud de patente canadiense No. 2,359,180, también describen algunas modificaciones químicas para usarse en las construcciones de ARNdc para contrarrestar la activación de la proteína cinasa PKR dependiente de ARN de doble cadena, específicamente nucleótidos 2'-amino o 2'-0-metilo, y nucleótidos que contienen un puente de 2'-0 o 4'-C metileno. Sin embargo, Kreutzer et al. tampoco dan ejemplos ni guías sobre el grado en que serían toleradas estas modificaciones en las moléculas de ARNdc.

Parrish et al., 2000, Molecular Cell, 6, 1077-1087, probaron algunas modificaciones químicas dirigidas al gen unc-22 en C. elegans usando transcritos grandes de ARNci (>25 n). Los autores describen la introducción de residuos de tiofosfato en estos transcritos de ARNci, incorporando análogos de nucleótido de tiofosfato con ARN polimerasa T7 y T3, y observaron que los ARNs con dos bases modificadas de fosforotioato también tienen reducciones sustanciales en la eficiencia de i-ARN. Además, Parrish et al. informaron que la modificación con fosforotioato de más de dos residuos desestabiliza mucho los ARN in vitro, de tal manera que no se pudieron probar actividades de interferencia, ibíd., p. 1081. Los autores también probaron algunas modificaciones en la posición 2' del azúcar de nucleótido en los transcritos grandes de ARNci, y encontraron que sustituyendo los desoxinucleótidos con ribonucleótidos disminuye substancialmente la actividad de interferencia, especialmente en el caso de sustituciones de Uridina a Timidina o Citidina a desoxi-Citidina, ibíd. Además, los autores probaron algunas modificaciones de base que incluyen sustituir, en las cadenas de sentido y antisentido del ARNci, uracilo por 4-tiouracilo, 5-bromouracilo, 5-yodouracilo y 3-(aminoalil)urac¡lo, y guanosina por inosina. Mientras que la sustitución con 4-tiouracilo y 5-bromouracilo pareció tolerarse, Parrish informó que la inosina produjo una disminución sustancial de la actividad de interferencia cuando se incorpora en cualquier cadena. Parrish también informó que la incorporación de 5-yodouracilo y 3-(aminoalil)uracilo en la cadena de antisentido también resultó en una disminución sustancial de la actividad de i-ARN.

Se ha descrito el uso de ARNdc más grande. Por ejemplo, Beach et al., publicación internacional de PCT No. WO 01/68836, describen métodos específicos para atenuar la expresión génica usando ARNdc derivado endógenamente. Tuschl et al., publicación internacional de PCT No. WO 01/75164, describen un sistema de i-ARN de Drosophila in vitro y el uso de moléculas de ARNci específico para ciertas aplicaciones genómicas funcionales y ciertas aplicaciones terapéuticas; sin embargo Tuschl, 2001 , Chem. Biochem., 2, 239-245, duda que se pueda usar i-ARN para curar enfermedades genéticas o infección viral debido al peligro de activar la respuesta de ¡nterferón. Li et al., publicación internacional de PCT No. WO 00/44914, describen el uso de ARNdc grandes específicos (141 p.b. - 488 p.b.), sintetizados enzimáticamente o expresados por vector, para atenuar la expresión de ciertos genes objetivo. Zernicka-Goetz et al., publicación internacional de PCT No. WO 01/36646, describen algunos métodos para inhibir la expresión de genes particulares en células de mamífero usando algunas moléculas grandes de ARNdc (550 p.b. - 714 p.b.), sintetizadas enzimáticamente o expresadas por vector. Fire et al., publicación internacional de PCT No. WO 99/32619, describen métodos particulares para introducir en las células algunas moléculas grandes de ARNdc para usarse en la inhibición de la expresión génica en nemátodos. Plaetinck et al., publicación internacional de PCT No. WO 00/01846, describen algunos métodos para identificar genes específicos responsables de conferir un fenotipo particular en una célula usando moléculas grandes específicas de ARNdc. Mello et al., publicación internacional de PCT No. WO 01/29058, describen la identificación de genes específicos implicados en la ¡-ARN mediada por ARNdc. Pachuck et al., publicación internacional de PCT No. WO 00/63364, describen algunas construcciones grandes de ARNdc (por lo menos 200 nucleótidos). Deschampe Depaillette et al., publicación internacional de PCT No. WO 99/07409, describen composiciones específicas que consisten en moléculas de ARNdc particulares combinadas con algunos agentes antivirales. Waterhouse et al., publicación internacional de PCT No. 99/53050, 1998, y PNAS, 95, 13959-13964, describen algunos métodos para reducir la expresión fenotípica de un ácido nucleico en células de planta usando algunos ARNdc. Driscoll et ai, publicación internacional de PCT No. WO 01/49844, describen construcciones de expresión de ADN específicas para usarse para facilitar el silenciamiento de genes en organismos objetivo.

Otros han informado sobre varios sistemas de i-ARN y silenciamiento de genes. Por ejemplo, Parrish et al., 2000, Molecular Cell, 6, 1077-1087, describen construcciones de ARNdc específicas modificadas químicamente dirigidas al gen unc-22 de C. elegans. Grossniklaus, publicación internacional de PCT No. WO 01/38551 , describe algunos métodos para regular la expresión del gen polycomb en las plantas usando algunos ARNdc. Churikov et al., publicación internacional de PCT No. WO 01/42443, describen algunos métodos para modificar las características genéticas de un organismo usando algunos ARNdc. Cogoni et al., publicación internacional de PCT No. WO 01/53475, describen algunos métodos para aislar un gen silenciador de Neurospora y usos del mismo. Reed et al., publicación internacional de PCT No. WO 01/68836, describen algunos métodos de silenciamiento de genes en las plantas. Honer et al., publicación internacional de PCT No. WO 01/70944, describen algunos métodos de selección de fármacos usando nemátodos transgénicos como modelos de la enfermedad de Parkinson, usando algunos ARNdc. Deak et al., publicación internacional de PCT No. WO 01/72774, describen algunos productos génicos derivados de Drosophila que pueden estar relacionados con la i-ARN en Drosophila. Arndt et al., publicación internacional de PCT No. WO 01/92513, describen algunos métodos para mediar la supresión génica usando factores que incrementan la i-ARN. Tuschl et al., publicación internacional de PCT No. WO 02/44321 , describen algunas construcciones sintéticas de ARNci. Pachuk et al., publicación internacional de PCT No. WO 00/63364, y Satishchandran et al., publicación internacional de PCT No. WO 01/04313, describen algunos métodos y composiciones para inhibir la función de algunas secuencias de polinucleótido usando algunos ARNdc grandes (más de 250 p.b.) expresados por vector. Echeverri et al., publicación internacional de PCT No. WO 02/38805, describen algunos genes de C. elegans identificados por medio de i-ARN. Kreutzer et al., publicaciones internacionales de PCT Nos. WO 02/055692, WO 02/055693 y EP 1 144623 B1 , describen algunos métodos para inhibir la expresión de genes usando ARNdc. Graham et al., publicaciones internacionales de PCT Nos. WO 99/49029 y WO 01/70949 y AU 4037501 , describen algunas moléculas de ARNci expresado por vector. Fire et al., US 6,506,559, describen algunos métodos para inhibir la expresión génica in vitro usando algunas construcciones grandes de ARNdc (299 p.b. -1033 p.b.) que median la i-ARN. Martínez et al., 2002, Ce//, 1 10, 563-574, describen algunas construcciones de ARNci de una sola cadena, que incluyen algunos ARNci 5'-fosforilados de una sola cadena que median la interferencia de ARN en células Hela. Harborth et al., 2003, Antisense & Nucleic Acid Drug Development, 13, 83-105, describen algunas moléculas de ARNci modificadas química y estructuralmente. Chiu y Rana, 2003, RNA, 9, 1034-1048, describen algunas moléculas de ARNci modificadas química y estructuralmente. Woolf et al, publicaciones internacionales de PCT Nos. WO 03/064626 y WO 03/064625, describen algunas construcciones de ARNdc modificadas químicamente. Hornung et al., 2005, Nature Medicine, 1 1 , 263 -270, describen la inducción potente específica de secuencia de IFN-alfa por ARN corto de interferencia en células dendríticas plasmacitoides mediante TLR7. Judge et al., 2005, Nature Biotechnology, publicada en línea: 20 de marzo de 2005, describen la estimulación dependiente de secuencia de la respuesta inmune innata de mamífero por medio de ARNci sintético. Yuki et al., publicaciones internacionales de PCT Nos. WO 05/049821 y WO 04/048566, describen algunos métodos para diseñar secuencias de ARN corto de interferencia y algunas secuencias de ARN corto de interferencia con actividad optimizada. Saigo et al., publicación de la solicitud de patente de EE. UU. No. US20040539332, describen algunos métodos para diseñar secuencias de oligo- o polinucleótido, que incluyen secuencias de ARN corto de interferencia, para lograr la interferencia de ARN. Tei et ai, publicación internacional de PCT No. WO 03/044188, describen algunos métodos para inhibir la expresión de un gen objetivo, que comprenden transfectar una célula, tejido, u organismo individual con un polinucleótido de doble cadena que comprende ADN y ARN, que tiene una secuencia de nucleótidos sustancialmente idéntica por lo menos con una secuencia de nucleótidos parcial del gen objetivo.

Mattick, 2005, Science, 309, 1527-1528; Claverie, 2005, Science, 309, 1529-1530; Sethupathy et al., 2006, RNA, 12, 192-197; y Czech, 2006 NEJM, 354, 11: 1194-1195; Hutvagner et ai, US 20050227256, y Tuschl et al., US 20050182005, describen moléculas de antisentido que pueden inhibir la función de miARN por medio de bloqueo estérico, y todas se incorporan en la presente como referencia en su totalidad.

Las siguientes publicaciones de solicitud de patente de EE. UU. proveen descripciones básicas de moléculas de ARNci y fosfodiesterasas en general: US-20050287551; US-20050164220; US-20050191627; US-20050118594; US-20050153919; US-20050085486; y US- 20030158133; todas incorporadas en la presente como referencia en su totalidad.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere a compuestos, composiciones y métodos útiles para modular la expresión de los genes del canal de sodio epitelial (ENaC), como los genes ENaC asociados con el desarrollo o mantenimiento de enfermedades y condiciones inflamatorias o respiratorias, por medio de interferencia de ARN (i-ARN), utilizando moléculas de ácido nucleico corto de interferencia (ANci). Esta invención también se refiere a compuestos, composiciones y métodos útiles para modular la expresión y actividad de otros genes implicados en las rutas de expresión o actividad del gen ENaC por medio de interferencia de ARN (i-ARN), utilizando moléculas de ácido nucleico pequeñas. En particular, la presente invención presenta moléculas pequeñas de ácido nucleico, tales como moléculas de ácido nucleico corto de interferencia (ANci), ARN corto de interferencia (ARNci), ARN de doble cadena (ARNdc), micro-ARN (miARN), y ARN corto de horquilla (ARNch), y los métodos usados para modular la expresión de los genes ENaC u otros genes implicados en las rutas de expresión o actividad del gen ENaC.

La presente invención también se refiere a moléculas pequeñas de ácido nucleico, tales como ANci, ARNci, y otras que pueden inhibir la función de las moléculas de ARN endógenas, tales como micro-ARN (miARN) endógeno (por ejemplo, inhibidores de miARN) o ARN corto de interferencia (ARNci) endógeno (por ejemplo, inhibidores de ARNci), o que pueden inhibir la función del RISC (por ejemplo, inhibidores de RISC), para modular la expresión del gen ENaC obstaculizando la función reguladora de dichos ARN endógenos o las proteínas asociadas con dichos ARN endógenos (por ejemplo, RISC). Tales moléculas se denominan aquí colectivamente inhibidores de i-ARN.

Un inhibidor de ANci o de i-ARN de la invención puede ser modificado o no modificado químicamente. Un inhibidor de ANci o i-ARN de la presente invención puede ser sintetizado químicamente, expresado de un vector, o sintetizado enzimáticamente. La presente invención también presenta varias moléculas de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) sintéticas modificadas químicamente, capaces de modular la expresión o actividad del gen ENaC mediante interferencia del ARN (i-ARN). La presente invención también presenta varias moléculas de ácido nucleico corto (ANci) sintéticas modificadas químicamente, capaces de modular la actividad de i- ARN en las células, interaccionando con miARN, ARNci, o RISC, y por lo tanto regulando negativamente o inhibiendo la interferencia de ARN (i-ARN), por inhibición de traducción, o silenciamiento transcripcional en una célula u organismo. El uso de inhibidores de ANci o i-ARN modificados químicamente mejora varias propiedades de las moléculas de ANci o inhibidores de i-ARN naturales mediante una mayor resistencia a la degradación por nucleasa in vivo o mediante mejoramiento de la incorporación celular. Además, contrario a los estudios publicados anteriormente, las moléculas de ANci de la invención que tienen múltiples modificaciones químicas, que incluyen ANci completamente modificado, retienen o mejoran su actividad de i-ARN con respecto al ARNci no modificado o modificado mínimamente. Por lo tanto, el solicitante enseña aquí ARNci modificado químicamente (referido generalmente en la presente como ANci), que retiene o mejora la actividad del ARNci natural. Las moléculas de ANci de la presente invención proveen reactivos y métodos útiles para una variedad de aplicaciones terapéuticas, profilácticas, cosméticas, veterinarias, diagnósticas, de validación de objetivo, descubrimiento genómico, ingeniería genética, y farmacogenómicas.

El canal de sodio epitelial (ENaC, o canal de sodio no neuronal 1 (SCNN1), o canal de sodio sensible a la amilorida (ASSC)) es un canal iónico unido a membrana que es permeable a Li+, protones y especialmente Na+. Es un canal "constitutivamente activo", esto es, no requiere un estímulo de control y se abre en el reposo. El ENaC es una proteína heteromérica comprendida de tres subunidades diferentes -a (SCNN1A), ß (SCNN1 B), y ? (SCNN1 G).

Hasta hace poco la estequiometría exacta era poco clara, pero basándose en la homología con los canales ASIC, casi seguramente es un heterotrímero (Jasti, J. et al (2007) Nature 449 p. 316 a 323). Cada subunidad consiste en dos hélices de transmembrana y un asa extracelular. Los extremos amino y carboxi de todos los polipéptidos están localizados en el citosol. Además, hay una cuarta subunidad denominada d, que comparte homología significativa con la subunidad a y puede formar un canal iónico funcional junto con las subunidades ß y ?.

En una modalidad, la invención presenta una o mas moléculas de ANci o inhibidores de ¡ARN y métodos que, independientemente o en combinación, modulan la expresión de los genes ENaC que codifican el canal de sodio epitelial (ENaC), como los genes que codifican las secuencias de la subunidad a (SCNN1A), ß (SCNN1 B), o ? (SCNN1 G), que comprenden las secuencias a las que se refieren los Nos. de Registro de GenBank mostrados en el cuadro 7. Aquí, las referencias a "ENaC" incluyen todas y cada una de las secuencias de la subunidad a (SCNN A), ß (SCNN1 B) y ? (SCNN1 G). En una modalidad preferida, la invención presenta una o más moléculas de ANci o inhibidores de ¡ARN y métodos que, independientemente o en combinación, modulan la expresión de los genes ENaC que codifican la subunidad a (SCNN1A). La descripción siguiente de los diversos aspectos y modalidades de la invención se provee haciendo referencia a genes ejemplares que codifican el canal de sodio epitelial (ENaC). La presente invención también está dirigida a compuestos, composiciones y métodos que se refieren a rasgos, enfermedades y condiciones que responden a la modulación de la expresión o actividad de los genes implicados en las rutas de expresión del gen que codifica el canal de sodio epitelial (ENaC), u otros procesos celulares que median el mantenimiento o desarrollo de dichos rasgos, enfermedades y condiciones. Sin embargo, se entiende que dicha referencia es únicamente ejemplar y que los diversos aspectos y modalidades de la invención también están dirigidos a otros genes que expresan genes ENaC alternativos, tales como genes ENaC mutantes, isotipos de genes ENaC, variantes de ENaC de especie a especie o de sujeto a sujeto, y variantes empalmadas alternativamente del ARNm de ENaC ("variante de empalme"). Dichos genes adicionales se pueden analizar para determinar los sitios objetivo usando los métodos aquí descritos para los genes y secuencias de ENaC ejemplares. De esta manera, la modulación y los efectos de dicha modulación de los otros genes se pueden realizar como se describe en la presente. En otras palabras, el término "ENaC" como se define más abajo y se cita en las modalidades descritas, abarca genes asociados con el desarrollo o mantenimiento de enfermedades, rasgos y condiciones de la presente, como los genes que codifican polipéptidos ENaC, polinucleótidos reguladores de ENaC (por ejemplo miARN y ARNci de ENaC), genes mutantes de ENaC, e isotipos de genes ENaC, así como también otros genes implicados en las rutas de expresión o actividad génica de ENaC. De esta manera, cada una de la modalidades aquí descritas que hace referencia al término "ENaC" es aplicable a todas las moléculas de proteína, péptido, polipéptido o polinucleótido cubiertas por el término "ENaC", como se define aquí este término. De manera integral, dichos objetivos de gen también se denominan aquí en general secuencias "objetivo".

En una modalidad, la invención presenta una composición que comprende dos o más moléculas diferentes de ANci o inhibidores de i-ARN de la invención (por ejemplo, ANci, ANci formador de dúplex, o ANci multifuncional, o cualquier combinación de los mismos), que hacen blanco en diferentes objetivos de polinucleótido, tales como diferentes regiones de ARN o ADN de ENaC (por ejemplo, dos sitios objetivo diferentes como se provee aquí, o cualquier combinación de objetivos de ENaC, tales como diferentes isotipos), u objetivos codificadores y no codificadores. Tales conjuntos de moléculas de ANci pueden proveer un mayor efecto terapéutico.

En una modalidad, la invención presenta un conjunto de dos o más moléculas de ANci diferentes de la invención (por ejemplo, ANci, ANci formador de dúplex, o ANci multifuncional, o cualquier combinación de los mismos), que tienen especificidad por diferentes objetivos de polinucleótido, tales como diferentes regiones de ARN o ADN de ENaC objetivo (por ejemplo, dos sitios objetivo diferentes en la presente, o cualquier combinación de objetivos de ENaC u objetivos de la ruta de ENaC, tales como diferentes isotipos de ENaC), u objetivos tanto codificadores como no codificadores, en donde el conjunto comprende moléculas de ANci que hacen blanco en aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más objetivos de ENaC diferentes.

En una modalidad, la invención presenta un conjunto de dos o más moléculas de ANci o inhibidores de i-ARN diferentes que tienen especificidad por un objetivo de ENaC, tal como objetivos de isotipo de ENaC diferentes, o cualquier combinación de los mismos. En una modalidad la invención presenta un conjunto de dos o más moléculas de ANci o inhibidores de i-ARN diferentes que tienen especificidad por ENaC. En una modalidad la invención presenta un conjunto de dos o más moléculas de ANci o inhibidores de i-ARN diferentes que tienen especificidad por ENaC. En una modalidad la invención presenta un conjunto de dos o más moléculas de ANci o inhibidores de i-ARN diferentes que tienen especificidad por ENaC y un isotipo del mismo.

Debido al potencial de variabilidad de secuencia del gen ENaC a través de diferentes organismos o diferentes sujetos, probablemente la selección de moléculas de ANci para aplicaciones terapéuticas amplias implica las regiones conservadas del gen ENaC. En una modalidad la presente invención se refiere a moléculas de ANci o inhibidores de i-ARN que hacen blanco en regiones conservadas del gen ENaC o en regiones que están conservadas entre diferentes objetivos de ENaC. Las moléculas de ANci o inhibidores de i-ARN diseñados para hacer blanco en las regiones conservadas de varios objetivos de ENaC, permiten la inhibición eficiente de la expresión génica del ENaC objetivo en diversas poblaciones de pacientes. Debido a las variaciones de la actividad enzimática y los patrones de expresión específicos de célula de las isoformas de ENaC, probablemente la selección de las moléculas de ANci para el tratamiento de aplicaciones terapéuticas objetivo implica isotipos específicos de ENaC. En una modalidad la presente invención se refiere a moléculas de ANci o inhibidores de i-ARN que hacen blanco en las regiones conservadas del gen ENaC o en regiones que están conservadas entre diferentes objetivos de ENaC. En otra modalidad la invención presenta un ANci de doble cadena que regula negativamente la expresión de un gen ENaC objetivo o dirige el corte de un ARN objetivo de ENaC, sin afectar la expresión del ENaC. Las moléculas de ENaC o los inhibidores de i-ARN diseñados para hacer blanco en las regiones conservadas de varios objetivos de ENaC permiten la inhibición eficiente de la expresión del isotipo de ENaC en diversas poblaciones de pacientes.

En una modalidad, la invención presenta una molécula de ácido nucleico de doble cadena, tal como una molécula de ANci, en donde una de las cadenas comprende una secuencia de nucleótidos que tiene complementariedad con una secuencia de nucleótidos predeterminada de una molécula de ácido nucleico objetivo de ENaC, o una porción de la misma. En una modalidad la secuencia de nucleótidos predeterminada es una secuencia de nucleótidos de ENaC objetivo descrita en la presente. En otra modalidad la secuencia de nucleótidos predeterminada es una secuencia de ENaC objetivo conocida.

En una modalidad, la invención presenta una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) de doble cadena que regula negativamente la expresión de un gen ENaC objetivo, o que dirige el corte de un ARN de ENaC objetivo, en donde dicha molécula de ANci comprende de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 pares de bases.

En una modalidad, la invención presenta una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) de doble cadena que dirige el corte de un ARN de ENaC objetivo, en donde dicha molécula de ANci comprende de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 pares de bases.

En una modalidad, la invención presenta una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) de doble cadena que dirige el corte de un ARN de ENaC objetivo por medio de interferencia de ARN (i-ARN), en donde la molécula de ANci de doble cadena comprende una primera cadena y una segunda cadena, cada cadena de la molécula de ANci tiene una longitud de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 nucleótidos (por ejemplo, aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30), la primera cadena de la molécula de ANci comprende una secuencia de nucleótidos que tiene una complementahedad suficiente con el ARN de ENaC objetivo para que la molécula de ANci dirija el corte del ARN de ENaC objetivo mediante interferencia de ARN, y la segunda cadena de dicha molécula de ANci comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la primera cadena. En una modalidad específica, por ejemplo, cada cadena de la molécula de ANci tiene una longitud de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 nucleótidos.

En una modalidad, la invención presenta una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) de doble cadena que dirige el corte de un ARN de ENaC objetivo mediante interferencia de ARN (i-ARN), en donde la molécula de ANci de doble cadena comprende una primera cadena y una segunda cadena, cada cadena de la molécula de ANci tiene una longitud de aproximadamente 18 a aproximadamente 23 nucleótidos (por ejemplo, aproximadamente 18, 19, 20, 21 , 22, o 23), la primera cadena de la molécula de ANci comprende una secuencia de nucleótidos que tiene una complementariedad suficiente con el ARN de ENaC objetivo para que la molécula de ANci dirija el corte del ARN de ENaC objetivo mediante interferencia de ARN, y la segunda cadena de dicha molécula de ANci comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la primera cadena.

En una modalidad, la invención presenta una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) de doble cadena sintetizado químicamente, que dirige el corte de un ARN de ENaC objetivo mediante interferencia de ARN (i-ARN), en donde cada cadena de la molécula de ANci tiene una longitud de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 nucleótidos; y una cadena de la molécula de ANci comprende una secuencia de nucleótidos que tiene una complementariedad suficiente con el ARN de ENaC objetivo para que la molécula de ANci dirija el corte del ARN de ENaC objetivo mediante interferencia de ARN.

En una modalidad, la invención presenta una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) de doble cadena sintetizado químicamente, que dirige el corte de un ARN de ENaC objetivo mediante interferencia de ARN (i-ARN), en donde cada cadena de la molécula de ANci tiene una longitud de aproximadamente 18 a aproximadamente 23 nucleótidos; y una cadena de la molécula de ANci comprende una secuencia de nucleótidos que tiene una complementariedad suficiente con el ARN de ENaC objetivo para que la molécula de ANci dirija el corte del ARN de ENaC objetivo mediante interferencia de ARN.

En una modalidad, la invención presenta una molécula de ANci que regula negativamente la expresión de un gen de ENaC objetivo, o que dirige el corte de un ARN de ENaC objetivo, por ejemplo en donde el gen o ARN de ENaC objetivo comprende una secuencia codificadora de proteína. En una modalidad la invención presenta una molécula de ANci que regula negativamente la expresión de un gen de ENaC objetivo, o que dirige el corte de un ARN de ENaC objetivo, por ejemplo en donde el gen o ARN de ENaC objetivo comprende una secuencia no codificadora o elementos reguladores implicados en la expresión del gen de ENaC objetivo (por ejemplo, ARN no codificador, miARN, ARNtp, etcétera).

En una modalidad, un ANci de la invención se usa para inhibir la expresión de genes de ENaC objetivo o una familia de genes de ENaC objetivo, en donde los genes ENaC o las secuencias de la familia del gen ENaC comparten homología de secuencia. Dichas secuencias homologas se pueden identificar como es conocido, por ejemplo usando alineaciones de secuencias. Las moléculas de ANci se pueden diseñar para hacer blanco en dichas secuencias homologas de ENaC, por ejemplo utilizando secuencias perfectamente complementarias, o incorporando pares de bases no canónicas, por ejemplo discordancias o pares de bases de bamboleo, que pueden proveer secuencias adicionales de ENaC objetivo. En casos en donde se identifican discordancias, se pueden usar pares de bases no canónicas (por ejemplo discordancias o bases de bamboleo) para generar moléculas de ANci que hacen blanco en más de una secuencia del gen ENaC. En un ejemplo no limitativo, se usan pares de bases no canónicas tales como pares de bases UU y CC para generar moléculas de ANci que son capaces de hacer blanco en secuencias de objetivos de polinucleótido de ENaC diferentes que comparten homología de secuencia. Por lo tanto, una ventaja del uso de los ANci de la invención es que se puede diseñar un solo ANci para incluir una secuencia de ácido nucleico que es complementaria a la secuencia de nucleótidos conservada entre los genes homólogos. En esta propuesta se puede usar un solo ANci para inhibir la expresión de más un gen, en lugar de utilizar más de una molécula de ANci para hacer blanco en los diferentes genes.

En una modalidad, la invención presenta una molécula de ANci que tiene actividad de i-ARN contra un ARN de ENaC objetivo (por ejemplo ARN codificador o no codificador), en donde la molécula de ANci comprende una secuencia complementaria a cualquier secuencia de ARN de ENaC, tal como las secuencias que tienen los Nos. de Registro de GenBank de ENaC mostrados aquí en el cuadro 7. En otra modalidad la invención presenta una molécula de ANci que tiene actividad de i-ARN contra un ARN de ENaC objetivo, en donde la molécula de ANci comprende una secuencia complementaria a un ARN que tiene una secuencia codificadora variante de ENaC, por ejemplo otros genes mutantes de ENaC conocidos que se asocian con el mantenimiento o desarrollo de las enfermedades, rasgos, trastornos o condiciones aquí descritas o por lo demás conocidas en la técnica. Las modificaciones químicas mostradas en el cuadro 8 o descritas de otra manera en la presente se pueden aplicar a cualquier construcción de ANci de la invención. En otra modalidad, una molécula de ANci de la invención incluye una secuencia de nucleótidos que puede interaccionar con la secuencia de nucleótidos de un gen ENaC objetivo y mediar así el silenciamiento de la expresión del gen ENaC objetivo, por ejemplo, en donde el ANci media la regulación del la expresión del gen ENaC objetivo mediante procesos celulares que modulan la estructura de la cromatina o los patrones de metilación del gen de ENaC objetivo, e impiden la transcripción del gen ENaC objetivo.

En una modalidad se usan moléculas de ANci de la invención para regular negativamente o inhibir la expresión de proteínas ENaC originadas de polimorfismos de haplotipo de están asociados con un rasgo, enfermedad o condición en un sujeto u organismo. Se puede usar el análisis de la cantidad de genes ENaC, o de proteína o ARN de ENaC para identificar sujetos con dichos polimorfismos, o sujetos que están en riesgo de desarrollar los rasgos, condiciones o enfermedades aquí descritas. Estos sujetos son susceptibles de tratamiento, por ejemplo tratamiento con moléculas ANci de la invención y con cualquier otra composición útil en el tratamiento de las enfermedades relacionadas con la expresión del gen objetivo. Por lo tanto, el análisis de la cantidad de proteína o ARN de ENaC se puede usar para determinar el tipo de tratamiento y el curso del tratamiento de un sujeto. Las cantidades de proteína o ARN de ENaC se pueden monitorear para predecir el resultado del tratamiento y determinar la eficacia de los compuestos y composiciones que modulan la concentración o actividad de algunas proteínas de ENaC asociadas con un rasgo, trastorno, condición, o enfermedad.

En una modalidad de la invención, una molécula de ANci comprende una cadena de antisentido que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos de ENaC, o una porción de la misma que codifica una proteína ENaC objetivo. Además, el ANci comprende una cadena de sentido, en donde dicha cadena de sentido comprende una secuencia de nucleótidos de un gen ENaC objetivo, o una porción de la misma.

En otra modalidad, una molécula de ANci comprende una región de antisentido que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína ENaC objetivo, o una porción de la misma. La molécula de ANci comprende también una región de sentido, en donde dicha región de sentido comprende una secuencia de nucleótidos de un gen ENaC objetivo, o una porción de la misma.

En otra modalidad, la invención presenta una molécula de ANci comprende una secuencia de nucleótidos, por ejemplo una secuencia de nucleótidos en la región de antisentido de la molécula de ANci que es complementaria a una secuencia de nucleótidos, o porción de secuencia, de un gen ENaC objetivo. En otra modalidad, la invención presenta una molécula de ANci que comprende una región, por ejemplo la región de antisentido de la construcción de ANci, complementaria a una secuencia que comprende una secuencia del gen ENaC objetivo, o una porción de la misma.

En una modalidad, la región de sentido o la cadena de sentido de una molécula de ANci de la invención es complementaria a la porción de la región de antisentido, o cadena de antisentido, de la molécula de ANci que es complementaria a una secuencia de polinucleótido ENaC objetivo.

En otra modalidad, la invención presenta una molécula de ANci que comprende una secuencia, por ejemplo la secuencia de antisentido de la construcción de ANci, complementaria a una secuencia o porción de secuencia que comprende la secuencia representada por los Nos. de Registro de GenBank mostrados en el cuadro 7. Las modificaciones químicas de los cuadros 1 B y 8 y descritas en la presente, se pueden aplicar a cualquier construcción de ANci de la invención. Las formulaciones de LNP descritas en el cuadro 10 se pueden aplicar a cualquier molécula de ANci o combinación de moléculas de ANci de la presente.

En una modalidad de la invención, una molécula de ANci comprende una cadena de antisentido que tiene de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 nucleótidos (por ejemplo, aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o 30), en donde la cadena de antisentido es complementaria a una secuencia de ARN de ENaC objetivo o una porción de la misma, y en donde dicho ANci también comprende una cadena de sentido que tiene de aproximadamente de 15 a aproximadamente 30 nucleótidos (por ejemplo, aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o 30), y en donde dicha cadena de sentido y dicha cadena de antisentido son secuencias de nucleótidos distintas en donde por lo menos aproximadamente 15 nucleótidos de cada cadena son complementarios a la otra cadena.

En una modalidad, una molécula de ANci de la invención (por ejemplo, una molécula de ácido nucleico de doble cadena) comprende una cadena de antisentido (guía) que tiene de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 nucleótidos (por ejemplo, aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o 30), que son complementarios a una secuencia de ARN de ENaC o una porción de la misma. En una modalidad, por lo menos 15 nucleótidos (por ejemplo, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o 30 nucleótidos) de una secuencia de ARN de ENaC, son complementarios a la cadena de antisentido (guía) de una molécula de ANci de la invención.

En una modalidad, una molécula de ANci de la invención (por ejemplo, una molécula de ácido nucleico de doble cadena) comprende una cadena de sentido (de pasajero) que tiene de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 nucleótidos (por ejemplo, aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o 30) que comprenden la secuencia de un ARN de ENaC o una porción de la misma. En una modalidad, por lo menos 15 nucleótidos (por ejemplo, aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o 30) de una secuencia de ARN de ENaC comprenden la cadena de sentido (de pasajero) de una molécula de ANci de la invención.

En otra modalidad de la invención, una molécula de ANci de la invención comprende una región de antisentido que tiene de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 nucleótidos (por ejemplo, aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o 30), en donde la región de antisentido es complementaria a una secuencia de ADN de ENaC objetivo, y en donde dicho ANci también comprende una región de sentido que tiene de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 nucleótidos (por ejemplo, aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o 30), en donde dicha región de sentido y dicha región de antisentido están comprendidas en una molécula lineal en donde la región de sentido comprende por lo menos aproximadamente 15 nucleótidos que son complementarios a la región de antisentido.

En una modalidad, una molécula de ANci de la invención tiene actividad de i-ARN que modula la expresión de un ARN de ENaC codificado por uno o más genes ENaC. Como los genes ENaC pueden compartir cierto grado de homología de secuencia entre sí, se pueden diseñar moléculas de ANci para hacer blanco en una clase de genes ENaC, seleccionando secuencias que son compartidas entre diferentes ENaC objetivo, o alternativamente que son únicas para un ENaC objetivo específico (por ejemplo, únicas para cualquier isotipo de ENaC). Por lo tanto, en una modalidad, la molécula de ANci se puede diseñar para que haga blanco en las regiones conservadas objetivo de secuencias de polinucleótido ENaC que tienen homología entre varias variantes del gen ENaC, a fin de hacer blanco en una clase de genes ENaC con una molécula de ANci. Por consiguiente, en una modalidad, la molécula de ANci de la invención modula la expresión de una o más isoformas de ENaC en un sujeto u organismo. En otra modalidad, la molécula de ANci se puede diseñar para que haga blanco en una secuencia única para una secuencia específica de polinucleótido ENaC (por ejemplo, una isoforma de ENaC única o un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) de ENaC) debido al alto grado de especificidad que requiere la molécula de ANci para mediar la actividad de i-ARN.

En una modalidad, las moléculas de ácido nucleico de la invención que actúan como mediadores de la respuesta de silenciamiento de gen de interferencia de ARN, son moléculas de ácido nucleico de doble cadena. En otra modalidad, las moléculas de ANci de la invención consisten en moléculas de ácido nucleico dúplex que contienen de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 pares de bases entre oligonucleótidos que comprenden de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 nucleótidos (por ejemplo, aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o 30). En otra modalidad, las moléculas de ANci de la invención comprenden moléculas de ácido nucleico dúplex con extremos salientes de aproximadamente 1 a aproximadamente 3 nucleótidos (por ejemplo aproximadamente 1 , 2 o 3), por ejemplo dúplex de aproximadamente 21 nucleótidos con aproximadamente 19 pares de bases y tramos salientes 3'-terminales de mononucleótido, dinucleótido o trinucleótido. En otra modalidad, las moléculas de ANci de la invención comprenden moléculas de ácido nucleico dúplex con extremos rasurados, en donde los dos extremos están rasurados, o alternativamente en donde uno de los extremos está rasurado.

En una modalidad, una molécula de ácido nucleico de doble cadena (por ejemplo ANci) comprende tramos salientes de nucleótido o que no son de nucleótido. Por "tramo saliente" se entiende una porción terminal de la secuencia de nucleótidos con bases no apareadas entre las dos cadenas de una molécula de ácido nucleico de doble cadena (véanse por ejemplo las figuras 6A-6C). En una modalidad, una molécula de ácido nucleico de doble cadena de la invención puede comprender tramos salientes de nucleótido o no nucleótido en el extremo 3' de una o las dos cadenas de la molécula de ácido nucleico de doble cadena. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico de doble cadena de la invención puede comprender un tramo saliente de nucleótido o no nucleótido en el extremo 3' de la cadena guía o cadena/región de antisentido, el extremo 3' de la cadena de pasajero o cadena/región de sentido, o tanto la cadena guía o cadena/región de antisentido como la cadena de pasajero o cadena/región de sentido, de la molécula de ácido nucleico de doble cadena. En otra modalidad, el tramo saliente de nucleótido de una molécula de ácido nucleico de doble cadena (ANci) de la invención, comprende nucleótidos de 2'-0-metilo, 2'-desoxi, 2'-desoxi-2'-fluoro, 2'-desoxi-2'-fluoroarabino (FANA), 4'-tio-2'-0-trifluorometilo, 2'-0-etil-trifluorometoxi, 2'-0-difluorometoxi-etoxi, base universal, acíclicos, o 5-C-metilo. En otra modalidad, el tramo saliente no nucleotídico de una molécula de ácido nucleico de doble cadena (ANci) de la invención comprende compuestos no nucleótidos de glicerilo, abásicos, o desoxi abásicos invertidos.

En una modalidad, los nucleótidos que comprenden las porciones salientes de una molécula de ácido nucleico de doble cadena de la invención (por ejemplo, ANci) corresponden a los nucleótidos que comprenden la secuencia del polinucleótido ENaC objetivo de la molécula de ANci. Por consiguiente, en dichas modalidades, los nucleótidos que comprenden la porción saliente de una molécula de ANci de la invención comprenden la secuencia basada en la secuencia del polinucleótido ENaC objetivo, en la cual los nucleótidos que comprenden la porción saliente de la cadena guía o cadena/región de antisentido de una molécula de ANci de la invención pueden ser complementarios a los nucleótidos de la secuencia del polinucleótido ENaC objetivo, y los nucleótidos que comprenden la porción saliente de la cadena de pasajero o cadena/región de sentido de una molécula de ANci de la invención pueden comprender los nucleótidos de la secuencia del polinucleótido ENaC objetivo. Dichos tramos salientes de nucleótido comprenden la secuencia que resultaría del procesamiento Dicer de un ARNdc nativo a ARNci.

En una modalidad, los nucleótidos que comprenden la porción saliente de una molécula de ácido nucleico de doble cadena de la invención (por ejemplo ANci) son complementarios a la secuencia del polinucleótido ENaC objetivo, y opcionalmente se modifican químicamente como se describe en la presente. Por lo tanto, en una modalidad, los nucleótidos que comprenden la porción saliente de la cadena guía o cadena/región de antisentido de una molécula de ANci de la invención, pueden ser complementarios a los nucleótidos de la secuencia del polinucleótido ENaC objetivo, es decir, las posiciones de nucleótido de la secuencia del polinucleótido ENaC objetivo que son complementarias a las posiciones de nucleótido de los nucleótidos salientes de la cadena guía o cadena/región de antisentido de una molécula de ANci. En otra modalidad, los nucleótidos que comprenden la porción saliente de la cadena de pasajero o cadena/región de sentido de una molécula de ANci de la invención, pueden comprender los nucleótidos de la secuencia del polinucleótido ENaC objetivo, es decir, las posiciones de nucleótido de la secuencia del polinucleótido ENaC objetivo que corresponden a las mismas posiciones de nucleótido de los nucleótidos salientes de la cadena de pasajero o cadena/región de sentido de una molécula de ANci. En una modalidad, el tramo saliente comprende un tramo saliente de dos nucleótidos (por ejemplo, 3'-GA; 3'-GU¡ 3'-GG; 3'GC; 3'-CA; 3'-CU; 3'-CG; 3'CC; 3'-UA; 3'-UU; 3'-UG; 3'UC; 3'-AA; 3'-AU; 3'-AG; 3'-AC; 3'-TA; 3 -TU; 3'-TG; 3'-TC; 3 -AT; 3'-UT; 3'-GT; 3'-CT) que es complementario a una porción de la secuencia del polinucleótido ENaC objetivo. En una modalidad, el tramo saliente comprende un tramo saliente de dos nucleótidos (por ejemplo, 3'-GA¡ 3'-GU¡ 3'-GG; 3'GC; 3'-CA¡ 3'-CU; 3'-CG; 3'CC; 3'-UA; 3 -UU; 3'-UG; 3'UC; 3'-AA; 3'-AU; 3'-AG; 3'-AC; 3'-TA; 3'-TU; 3'-TG; 3'-TC; 3'-AT; 3'-UT; 3'-GT; 3'-CT), que no es complementario a una porción de la secuencia del polinucleótido ENaC objetivo. En otra modalidad, los nucleótidos salientes de una molécula de ANci de la invención son nucleótidos de 2'-0-metilo, 2'-desoxi-2'-fluoroarabino, o 2'-desoxi-2'-fluoro. En otra modalidad, los nucleótidos salientes de una molécula de ANci de la invención son nucleótidos de 2'-0-metilo cuando los nucleótidos salientes son nucleótidos de purina; o son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro o 2'-desoxi-2'-fluoroarabino cuando los nucleótidos salientes son nucleótidos de pirimidina. En otra modalidad, el nucleótido de purina (cuando está presente) de un tramo saliente de una molécula de ANci de la invención es un nucleótido 2'-O-metilo. En otra modalidad, el nucleótido de pirimidina (cuando está presente) de un tramo saliente de la molécula de ANci de la invención es un nucleótido 2'-desox¡-2'-fluoro o 2'-desoxi-2'-fluoroarabino.

En una modalidad, los nucleótidos que comprenden la porción saliente de una molécula de ácido nucleico de doble cadena de la invención (por ejemplo ANci), no son complementarios a la secuencia del polinucleótido ENaC objetivo, y opcionalmente son modificados químicamente como se describe en la presente. En una modalidad, la porción saliente comprende un tramo saliente 3'-UU que no es complementario a una porción de la secuencia del polinucleótido ENaC objetivo. En otra modalidad, los nucleótidos que comprenden la porción saliente de una molécula de ANci de la invención son 2'-0-metil nucleótidos, 2'-desoxi-2'-fluoroarabino o 2'-desoxi-2'-fluoro nucleótidos.

En una modalidad, la molécula de ácido nucleico de doble cadena de la invención (por ejemplo ANci) comprende un tramo saliente de 2 o 3 nucleótidos, en donde los nucleótidos del tramo saliente son iguales o diferentes. En una modalidad, la molécula de ácido nucleico de doble cadena de la invención (por ejemplo ANci) comprende un tramo saliente de 2 o 3 nucleótidos, en donde los nucleótidos del tramo saliente son iguales o diferentes, y en donde uno o más nucleótidos del tramo saliente están modificados químicamente en la base, azúcar, o esqueleto de fosfato.

En una modalidad, la invención presenta una o más construcciones de ANci químicamente modificado que tienen especificidad por moléculas de ácido nucleico objetivo de ENaC, tales como ADN o ARN que codifica una proteína, o ARN no codificador asociado con la expresión de genes ENaC objetivo. En una modalidad, la invención presenta una molécula de ANci basada en ARN (por ejemplo un ANci que comprende 2'-OH nucleótidos), que tiene especificidad por moléculas de ácido nucleico que incluyen una o más modificaciones químicas aquí descritas. Ejemplos no limitativos de dichas modificaciones químicas incluyen, sin limitación, enlaces internucleotídicos de fosforotioato, 2'-desoxi-ribonucleótidos, 2'-0-metil-ribonucleótidos, 2'-desoxi-2'-fluoro-ribonucleótidos, 4'-tio-ribonucleótidos, 2'-0-trifluorometil-nucleótidos, 2'-0-etil-trifluorometoxi-nucleótidos, 2'-0- difluorometoxi-etoxi-nucleótidos (véase por ejemplo USSN 10/981 ,966, presentada el 5 de noviembre de 2004, incorporada aquí como referencia), nucleótidos de "base universal", nucleótidos "acíclicos", 5-C-metil-nucleótidos, 2'-desoxi-2'-fluoroarabino-nucleótidos (FANA, véase por ejemplo Dowler ef al., 2006, Nucleic Acids Research, 34, 1669-1675), e incorporación de glicerilo terminal o residuo abásico desoxi invertido. Se observa que estas modificaciones químicas, cuando se usan en diversas construcciones de ANci (por ejemplo construcciones de ANci basadas en ARN) conservan la actividad de i-ARN en las células, mientras que al mismo tiempo aumentan notablemente la estabilidad de estos compuestos en el suero.

En una modalidad, una molécula de ANci de la invención comprende las modificaciones químicas aquí descritas (por ejemplo 2'-0-metil-ribonucleótidos, 2'-desoxi-2'-fluoro-ribonucleót¡dos, 4'-tio-ribonucleótidos, 2'-0-trifluorometil-nucleótidos, 2'-0-etil-trifluorometoxi-nucleótidos, 2'-0-difluorometoxi-etoxi-nucleótidos, LNA) en las posiciones internas de la molécula de ANci. Por "posición interna" se entiende las posiciones de bases apareadas de un dúplex de ANci.

En una modalidad, la invención presenta una o más construcciones de ANci químicamente modificadas que tienen especificidad por moléculas de ácido nucleico de ENaC objetivo, tales como ADN de ENaC o ARN de ENaC que codifica una proteína ENaC, o ARN no codificador asociado con la expresión de genes ENaC objetivo.

En una modalidad, la invención presenta una molécula de ANci basado en ARN (por ejemplo un ANci que comprende 2'-OH nucleótidos) que tiene especificidad por moléculas de ácido nucleico que incluyen una o más de las modificaciones químicas aquí descritas. Los ejemplos no limitativos de dichas modificaciones químicas incluyen, sin limitación, enlaces internucleotídicos de fosforotioato, 2'-desoxi-ribonucleótidos, 2'-0-metil-ribonucleótidos, 2'-desoxi-2'-fluoro-ribonucleótidos, 4'-tio-ribonucleótidos, 2 -0-trifluorometil-nucleótidos, 2'-O-etil-trifluorometoxi-nucleótidos, 2'-O-difluorometoxi-etoxi-nucleótidos (véase por ejemplo USSN 10/981 ,966, presentada el 5 de noviembre de 2004, incorporada aquí como referencia), nucleótidos de "base universal", nucleótidos "acíclicos", 5-C-met¡l-nucleótidos, e incorporación de glicerilo terminal o residuo abásico desoxi invertido. Se observa que estas modificaciones químicas, cuando se usan en diversas construcciones de ANci (por ejemplo construcciones de ANci basadas en ARN) conservan la actividad de i-ARN en las células, mientras que al mismo tiempo aumentan notablemente la estabilidad de estos compuestos en el suero. Además, contrario a los datos publicados por Parrish et al., supra, el solicitante muestra que múltiples sustituciones de fosforotioato (más de una) son bien toleradas, y confieren un aumento sustancial de la estabilidad en el suero de las construcciones de ANci modificado.

En una modalidad, una molécula de ANci de la invención comprende nucleótidos modificados pero que mantienen la capacidad para mediar la i-ARN. Los nucleótidos modificados se pueden usar para mejorar las características in vitro o in vivo, tales como la estabilidad, actividad, toxicidad, respuesta inmune o biodisponibilidad. Por ejemplo, una molécula de ANci de la invención puede comprender nucleótidos modificados como un porcentaje del número total de nucleótidos presentes en la molécula de ANci. Por lo tanto, generalmente una molécula de ANci de la invención puede comprender de aproximadamente 5% a aproximadamente 100% de nucleótidos modificados (por ejemplo, aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 100% de nucleótidos modificados). Por ejemplo, en una modalidad, entre aproximadamente 5% y aproximadamente 100% (por ejemplo, aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 100% de nucleótidos modificados) de las posiciones de nucleótido en una molécula de ANci de la invención, comprenden una modificación del azúcar del ácido nucleico, tal como una modificación de 2'-azúcar; por ejemplo 2'-0-metil-nucleótidos, 2'-desoxi-2'-fluoro-nucleótidos, 2'-desoxi-2'-fluoroarabino, 2'-0-metoxietil-nucleótidos, 2'-0-trifluorometil-nucleótidos, 2'-0-etil-trifluorometoxi-nucleótidos, 2'-0-difluorometoxi-etoxi-nucleótidos, o 2'-desoxi-nucleótidos. En otra modalidad, entre aproximadamente 5% y aproximadamente 100% (por ejemplo, aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 100% de nucleótidos modificados) de las posiciones de nucleótido en una molécula de ANci de la invención, comprenden una modificación de la base del ácido nucleico, tal como modificaciones de inosina, purina, piridin-4-ona, piridin-2- ona, fenilo, pseudouracilo, 2,4,6-trimetoxibenceno, 3-metiluracilo, dihidrouridina, naftilo, aminofenilo, 5-alquilc¡t¡d¡nas (por ejemplo, 5-metilcitidina), 5-alqu¡lurid¡nas (por ejemplo, ribotimidina), 5-halouridina (por ejemplo, 5-bromouridina) o 6-azapirimidinas o 6-alquilpirimidinas (por ejemplo 6-metiluridina), o propino. En otra modalidad, entre aproximadamente 5% y aproximadamente 100% (por ejemplo aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 100% de nucleótidos modificados) de las posiciones de nucleótido en una molécula de ANci de la invención, comprenden una modificación del esqueleto del ácido nucleico, tal como una modificación de esqueleto que tiene la fórmula I de la presente. En otra modalidad, entre aproximadamente 5% y aproximadamente 100% (por ejemplo aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 100% de nucleótidos modificados) de las posiciones de nucleótido en una molécula de ANci de la invención, comprenden una modificación del azúcar, base, o esqueleto del ácido nucleico, o cualquier combinación de las mismas (por ejemplo cualquier combinación de modificaciones de azúcar, base, esqueleto, o de compuestos no nucleótidos del ácido nucleico de la presente). En una modalidad, una molécula de ANci de la invención comprende por lo menos aproximadamente 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 100% de nucleótidos modificados. El porcentaje real de nucleótidos modificados presentes en una molécula de ANci dada dependerá del número total de nucleótidos presentes en el ANci. Si la molécula de ANci es de una sola cadena, el porcentaje de modificación se puede basar en el número total de nucleótidos presentes en las moléculas de ANci de una sola cadena. Similarmente, si la molécula de ANci es de doble cadena, el porcentaje de modificación se puede basar en el número total de nucleótidos presentes en la cadena de sentido, la cadena de antisentido, o tanto la cadena de sentido como la de antisentido.

Una molécula de ANci de la invención puede comprender nucleótidos modificados en varios sitios dentro de la molécula de ANci. En una modalidad, una molécula de ANci de doble cadena de la invención comprende nucleótidos modificados en posiciones de bases apareadas internas dentro del dúplex de ANci. Por ejemplo, las posiciones internas pueden comprender las posiciones de aproximadamente 3 a aproximadamente 19 nucleótidos desde el extremo 5' de la cadena o región de sentido o antisentido de un dúplex de ANci de 21 nucleótidos que tiene 19 pares de bases y dos tramos salientes 3' de nucleótido. En otra modalidad, una molécula de ANci de doble cadena de la invención comprende nucleótidos modificados en las regiones de bases no apareadas o tramos salientes de la molécula de ANci. Por "bases no apareadas" se entiende que las bases de los nucleótidos no están apareadas entre la cadena de sentido o región de sentido y la cadena de antisentido o región de antisentido, o la molécula de ANci. Los nucleótidos salientes pueden ser complementarios o de bases apareadas con una secuencia de polinucleótido ENaC objetivo correspondiente (véase por ejemplo la figura 6C). Por ejemplo, las posiciones de tramo saliente pueden comprender las posiciones de aproximadamente 20 a aproximadamente 21 nucleotidos desde el extremo 5' de la cadena o región de sentido o antisentido de un dúplex de ANci de 21 nucleotidos, que tiene 19 pares de bases y 2 tramos salientes 3' de nucleótido. En otra modalidad, una molécula de ANci de doble cadena de la invención comprende nucleotidos modificados en posiciones terminales de la molécula de ANci. Por ejemplo, dichas regiones terminales incluyen la posición 3', la posición 5', o tanto la posición 3' como 5', de la cadena o región de sentido o antisentido de la molécula de ANci. En otra modalidad, una molécula de ANci de doble cadena de la invención comprende nucleotidos modificados en posiciones de bases apareadas o internas, en regiones de bases no apareadas o salientes, o en regiones terminales, o cualquier combinación de las mismas.

Un aspecto de la invención presenta una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) de doble cadena que regula negativamente la expresión de un gen ENaC objetivo, o que dirige el corte de un ARN de ENaC objetivo. En una modalidad, ia molécula de ANci de doble cadena comprende una o más modificaciones químicas, y cada cadena del ANci de doble cadena tiene una longitud de aproximadamente 21 nucleotidos. En una modalidad la molécula de ANci de doble cadena no contiene ningún ribonucleótido. En otra modalidad la molécula de ANci de doble cadena comprende uno o más ribonucleótidos. En una modalidad, cada cadena de la molécula de ANci de doble cadena comprende independientemente de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 nucleotidos (por ejemplo, aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o 30), en donde cada cadena comprende de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 nucleotidos (por ejemplo, aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o 30) que son complementarios a los nucleotidos de la otra cadena. En una modalidad, una de las cadenas de la molécula de ANci de doble cadena comprende una secuencia de nucleotidos que es complementaria a una secuencia de nucleotidos o porción de la misma del gen ENaC objetivo, y la segunda cadena de la molécula de ANci de doble cadena comprende una secuencia de nucleotidos sustancialmente similar a la secuencia de nucleotidos del gen ENaC objetivo o una porción de la misma.

En otra modalidad, la invención presenta una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) de doble cadena que regula negativamente la expresión de un gen ENaC objetivo, o que dirige el corte de un ARN de ENaC objetivo, que comprende una región de antisentido, en donde la región de antisentido comprende una secuencia de nucleotidos que es complementaria a una secuencia de nucleotidos del gen ENaC objetivo o una porción de la misma, y una región de sentido en donde la región de sentido comprende una secuencia de nucleotidos sustancialmente similar a la secuencia de nucleotidos del gen ENaC objetivo o una porción de la misma. En una modalidad, la región de antisentido y la región de sentido comprenden, independientemente, de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 nucleótidos (por ejemplo aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o 30), en donde la región de antisentido comprende de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 nucleótidos (por ejemplo, aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o 30), que son complementarios a los nucleótidos de la región de sentido.

En otra modalidad, la invención presenta una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) de doble cadena que regula negativamente la expresión de un gen ENaC objetivo, o que dirige el corte de un ARN de ENaC objetivo, que comprende una región de sentido y una región de antisentido, en donde la región de antisentido comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos de ARN codificado por el gen ENaC objetivo o una porción de la misma, y la región de sentido comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la región de antisentido.

En una modalidad, la molécula de ANci de la invención comprende extremos rasurados, es decir, extremos que no incluyen ningún nucleótido saliente. Por ejemplo, una molécula de ANci que comprende las modificaciones aquí descritas (por ejemplo que comprende los nucleótidos que tienen las fórmulas l-VII, o las construcciones de ANci que comprenden "Stab 00"-"Stab 36" o "Stab 3F"-"Stab 36F" (cuadro 8), o cualquier combinación de los mismos (véase el cuadro 8)), o cualquier longitud aquí descrita, puede comprender extremos rasurados o extremos sin nucleótidos salientes.

En una modalidad, cualquier molécula de ANci de la invención puede comprender uno o más extremos rasurados, es decir, en donde un extremo rasurado no tiene ningún nucleótido saliente. En una modalidad, la molécula de ANci de extremos rasurados tiene un número de pares de bases igual al número de nucleótidos presentes en cada cadena de la molécula de ANci. En otra modalidad, la molécula de ANci comprende un extremo rasurado, por ejemplo en donde el extremo 5' de la cadena de antisentido y el extremo 3' de la cadena de sentido no tienen nucleótidos salientes. En otro ejemplo, la molécula de ANci comprende un extremo rasurado, por ejemplo en donde el extremo 3' de la cadena de antisentido y el extremo 5' de la cadena de sentido no tienen ningún nucleótido saliente. En otro ejemplo, una molécula de ANci comprende dos extremos rasurados, por ejemplo en donde el extremo 3' de la cadena de antisentido y el extremo 5' de la cadena de sentido, así como también el extremo 5' de la cadena de antisentido y el extremo 3' de la cadena de sentido, no tienen ningún nucleótido saliente. Una molécula de ANci de extremos rasurados puede comprender, por ejemplo, de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 nucleótidos (por ejemplo, aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o 30 nucleótidos). Otros nucleótidos presentes en una molécula de ANci de extremos rasurados pueden comprender, por ejemplo, discordancias, protuberancias, asas o pares de bases de bamboleo, para modular la actividad de la molécula de ANci para mediar la interferencia de ARN.

Por "extremos rasurados" se entiende los extremos simétricos o extremos de una molécula de ANci de doble cadena que no tienen nucleótidos salientes. Las dos cadenas de una molécula de ANci de doble cadena se alinean una con la otra sin nucleótidos salientes en los extremos. Por ejemplo, una construcción de ANci de extremos rasurados comprende nucleótidos terminales que son complementarios entre las regiones de sentido y antisentido de la molécula de ANci.

En una modalidad, la invención presenta una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) de doble cadena que regula negativamente la expresión de un gen ENaC objetivo, o que dirige el corte de un ARN de ENaC objetivo, en donde la molécula de ANci se ensambla de dos fragmentos de oligonucleótido separados, en donde un fragmento comprende la región de sentido y el segundo fragmento comprende la región de antisentido de la molécula de ANci. La región de sentido puede estar unida a la región de antisentido por medio de una molécula enlazadora, tal como un enlazador de polinucleótido o un enlazador no nucleotídico.

En una modalidad, una molécula de ácido nucleico de doble cadena de la invención (por ejemplo, ANci) comprende ribonucleótidos en posiciones que mantienen o incrementan la actividad de i-ARN. En una modalidad, están presentes ribonucleótidos en la cadena de sentido o región de sentido de la molécula de ANci que pueden proveer la actividad de i-ARN permitiendo el corte de la cadena de sentido o la región de sentido con una enzima dentro del RISC (por ejemplo, los ribonucleótidos presentes en la posición de corte de la cadena de pasajero, cadena de sentido o región de sentido, tal como la posición 9 de la cadena de pasajero de un dúplex de 19 pares de bases, que es cortada en el RISC por la enzima AG02; véase por ejemplo Matranga et al., 2005, Cell, 123:1-114 y Rand et al., 2005, Cell, 123:621-629). En otra modalidad, uno o más nucleótidos (por ejemplo 1 , 2, 3, 4 o 5) del extremo 5' de la cadena guía o región guía (conocida también como la cadena de antisentido o la región de antisentido) de la molécula de ANci, son ribonucleótidos.

En una modalidad, una molécula de ácido nucleico de doble cadena de la invención (por ejemplo, ANci) comprende uno o más ribonucleótidos en posiciones dentro de la cadena de pasajero o región de pasajero (conocida también como la cadena de sentido o la región de sentido), que permiten el corte de la cadena de pasajero o región de pasajero por una enzima en el complejo RISC (por ejemplo, los ribonucleótidos presentes en la posición de la cadena de pasajero, tal como la posición 9 de la cadena de pasajero de un dúplex de 19 pares de bases, que es cortada en el RISC, por ejemplo por la enzima AG02; véase por ejemplo Matranga et al., 2005, Cell, 123:1-114 y Rand et al., 2005, Cell, 123:621-629).

En una modalidad, una molécula de ANci de la invención contiene por lo menos 2, 3, 4, 5 o más modificaciones químicas que pueden ser iguales o diferentes. En otra modalidad, una molécula de ANci de la invención contiene por lo menos 2, 3, 4, 5, o más modificaciones químicas diferentes.

En una modalidad, una molécula de ANci de la invención es un ácido nucleico corto de interferencia (ANci) de doble cadena, en donde la molécula de ácido nucleico de doble cadena comprende de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 pares de bases (por ejemplo, aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o 30), y en donde una o más de las posiciones de nucleótido (por ejemplo, por lo menos 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o 30) de cada cadena de la molécula de ANci, comprenden una modificación química. En otra modalidad, el ANci contiene por lo menos 2, 3, 4, 5, o más modificaciones químicas diferentes.

En una modalidad, la invención presenta una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) de doble cadena que regula negativamente la expresión de un gen ENaC objetivo, o que dirige el corte de un ARN de ENaC objetivo, en donde la molécula de ANci comprende de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 pares de bases (por ejemplo, aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o 30), y en donde cada cadena de la molécula de ANci comprende una o más modificaciones químicas. En una modalidad, cada cadena de la molécula de ANci de doble cadena comprende por lo menos dos modificaciones químicas diferentes (por ejemplo 2, 3, 4, 5, o más), por ejemplo diferentes modificaciones del azúcar, base o esqueleto del nucleótido. En otra modalidad, una de las cadenas de la molécula de ANci de doble cadena comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos de un gen ENaC objetivo o una porción de la misma, y la segunda cadena de la molécula de ANci de doble cadena comprende una secuencia de nucleótidos sustancialmente similar a la secuencia de nucleótidos del gen ENaC objetivo o una porción de la misma. En otra modalidad, una de las cadenas de la molécula de ANci de doble cadena comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos de un gen ENaC objetivo o una porción de la misma, y la segunda cadena de la molécula de ANci de doble cadena comprende una secuencia de nucleótidos sustancialmente similar a la secuencia de nucleótidos del gen ENaC objetivo o una porción de la misma. En otra modalidad, cada cadena de la molécula de ANci comprende de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 nucleótidos (por ejemplo, aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o 30), y cada cadena comprende por lo menos de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 nucleótidos (por ejemplo, aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o 30), que son complementarios a los nucleótidos de la otra cadena. El gen ENaC objetivo puede comprender, por ejemplo, las secuencias referidas o incorporadas en la presente como referencia. El gen ENaC puede comprender, por ejemplo, las secuencias a las que se hace referencia aquí por el número de registro de GenBank, por ejemplo en el cuadro 7.

En una modalidad, cada cadena de una molécula de ANci de doble cadena de la invención comprende un patrón diferente de modificaciones químicas, tales como cualquier patrón de modificación "Stab 00"-"Stab 36" o "Stab 3F"-"Stab 36F" (cuadro 8) de la presente, o cualquier combinación de las mismas (véase el cuadro 8). Ejemplos no limitativos de cadenas de sentido y antisentido de dichas moléculas de ANci que tienen varios patrones de modificación, se muestran en las figuras 4A-4F y 5A-5F.

En una modalidad, una molécula de ANci de la invención no comprende ribonucleótidos. En otra modalidad, una molécula de ANci de la invención comprende uno o más ribonucleótidos (por ejemplo, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más ribonucleótidos).

En una modalidad, una molécula de ANci de la invención comprende una región de antisentido que comprende una secuencia de nucleótidos complementaria a una secuencia de nucleótidos de un gen ENaC objetivo o una porción de la misma, y además el ANci comprende una región de sentido que comprende una secuencia de nucleótidos sustancialmente similar a la secuencia de nucleótidos del gen ENaC objetivo o una porción de la misma. En otra modalidad, la región de antisentido y la región de sentido comprenden, cada una, de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 nucleótidos (por ejemplo, aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o 30), y la región de antisentido comprende por lo menos de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 nucleótidos (por ejemplo, aproximadamente 5, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o 30) que son complementarios a los nucleótidos de la región de sentido. En una modalidad, cada cadena de la molécula de ANci de doble cadena comprende por lo menos dos modificaciones químicas diferentes (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, o más), por ejemplo diferentes modificaciones del azúcar, base o esqueleto del nucleótido. El gen ENaC objetivo puede comprender, por ejemplo, las secuencias referidas en la presente o las incorporadas como referencia en la presente. En otra modalidad, el ANci es una molécula de ácido nucleico de doble cadena, en donde cada una de las dos cadenas de la molécula de ANci comprende independientemente de aproximadamente 15 a aproximadamente 40 nucleótidos (por ejemplo, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 23, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, o 40), y en donde una de las cadenas de la molécula de ANci comprende por lo menos aproximadamente 15 nucleótidos (por ejemplo, aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24 o 25, o más), que son complementarios a la secuencia de ácido nucleico del gen ENaC objetivo o una porción de la misma.

En una modalidad, una molécula de ANci de la invención comprende una región de sentido y una región de antisentido, en donde la región de antisentido comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos de ARN codificado por un gen ENaC objetivo, o una porción de la misma, y la región de sentido comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la región de antisentido. En una modalidad, la molécula de ANci se ensambla de dos fragmentos de oligonucleótido separados, en donde un fragmento comprende la región de sentido y el segundo fragmento comprende la región de antisentido de la molécula de ANci. En otra modalidad la región de sentido está unida a la región de antisentido por medio de una molécula enlazadora. En otra modalidad, la región de sentido está unida a la región de antisentido por medio de una molécula enlazadora, tal como un enlazador de nucleótido o no nucleotídico. En una modalidad, cada cadena de la molécula de ANci de doble cadena comprende por lo menos dos modificaciones químicas diferentes (por ejemplo 2, 3, 4, 5, o más), por ejemplo, diferentes modificaciones del azúcar, base o esqueleto del nucleótido. El gen ENaC objetivo puede comprender, por ejemplo, las secuencias referidas en la presente o las que se incorporan en la presente como referencia.

En una modalidad, una molécula de ANci de la invención comprende una o más modificaciones (por ejemplo, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, o más) de 2'-desoxi-2'-fluoro-pirimidina (por ejemplo en donde una o más o todas las posiciones de pirimidina (por ejemplo U o C) del ANci están modificadas con 2'-desoxi-2'-fluoro-nucleótidos). En una modalidad, las modificaciones de 2'-desoxi-2'-fluoro-pirimidina están presentes en la cadena de sentido. En una modalidad, las modificaciones de 2'-desoxi-2'-fluoro-pirimidina están presentes en la cadena de antisentido. En un modalidad, las modificaciones de 2'-desoxi-2'-fluoro-pirimidina están presentes tanto en la cadena de sentido como en la cadena de antisentido de la molécula de ANci.

En una modalidad, una molécula de ANci de la invención comprende una o más modificaciones (por ejemplo, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, o más) de 2'-0-metil-purina (por ejemplo, en donde una o más o todas las posiciones de purina (por ejemplo, A o G) del ANci están modificadas con 2'-0-metil-nucleótidos). En una modalidad, las modificaciones de 2'-0-metil-purina están presentes en la cadena de sentido. En una modalidad, las modificaciones de 2'-0-metil-purina están presentes en la cadena de antisentido. En una modalidad, las modificaciones de 2'-0-metil-purina están presentes tanto en la cadena de sentido como en la cadena de antisentido de la molécula de ANci.

En una modalidad, una molécula de ANci de la invención comprende una o más modificaciones (por ejemplo, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, o más) de 2'-desoxi-purina (por ejemplo, en donde una o más o todas las posiciones de purina (por ejemplo, A o G) del ANci están modificadas con 2'-desoxi-nucleótidos). En una modalidad, las modificaciones de 2'-desoxi-purina están presentes en la cadena de sentido. En una modalidad, las modificaciones de 2'-desoxi-purina están presentes en la cadena de antisentido. En una modalidad, las modificaciones de 2'-desoxi-purina están presentes tanto en la cadena de sentido como en la cadena de antisentido de la molécula de ANci.

En una modalidad, la invención presenta una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) de doble cadena que regula negativamente la expresión de un gen ENaC objetivo, o que dirige el corte de un ARN de ENaC objetivo, que comprende una región de sentido y una región de antisentido, en donde la región de antisentido comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos del ARN codificado por el gen ENaC objetivo o una porción de la misma, y la región de sentido comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la región de antisentido, y en donde la molécula de ANci tiene uno o más nucleótidos de pirimidina o purina modificados. En una modalidad, cada cadena de la molécula de ANci de doble cadena comprende por lo menos dos modificaciones químicas diferentes (por ejemplo 2, 3, 4, 5, o más), por ejemplo diferentes modificaciones del azúcar, base o esqueleto del nucleótido. En una modalidad, los nucleótidos de pirimidina de la región de sentido son nucleótidos de 2'-0-met¡l-pirimidina o nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro-pirimidina, y los nucleótidos de purina presentes en la región de sentido son nucleótidos de 2'-desoxi-purina. En otra modalidad, los nucleótidos de pirimidina de la región de sentido son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro-pirimidina, y los nucleótidos de purina presentes en la región de sentido son nucleótidos de 2'-0-metil-purina. En otra modalidad, los nucleótidos de pirimidina de la región de sentido son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro-pirimidina, y los nucleótidos de purina presentes en la región de sentido son nucleótidos de 2'-desoxi-purina. En una modalidad, los nucleótidos de pirimidina en la región de antisentido son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro-pirimidina, y los nucleótidos de purina presentes en la región de sentido son nucleótidos de 2'-0-metil- o 2'-desoxi-purina. En otra modalidad, de cualquiera de las moléculas de ANci anteriormente descritas, cualquier nucleótido presente en una región no complementaria de la cadena de sentido (por ejemplo, la región saliente) es un 2'-desoxi-nucleótido.

En una modalidad, la invención presenta una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) de doble cadena que regula negativamente la expresión de un gen ENaC objetivo, o que dirige el corte de un ARN de ENaC objetivo, en donde la molécula de ANci se ensambla de dos fragmentos de oligonucleótido separados, en donde un fragmento comprende la región de sentido y el segundo fragmento comprende la región de antisentido de la molécula de ANci, y en donde el fragmento que comprende la región de sentido incluye una porción de casquete terminal en el extremo 5', el extremo 3', o tanto el extremo 5' como el 3' del fragmento. En una modalidad, la porción de casquete terminal es una porción desoxi abásica invertida o una porción de glicerilo. En una modalidad, cada uno de los dos fragmentos de la molécula de ANci comprende, independientemente, de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 nucleótidos (por ejemplo, aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o 30). En otra modalidad, cada uno de los dos fragmentos de la molécula de ANci comprende, independientemente, de aproximadamente 15 a aproximadamente 40 nucleótidos (por ejemplo, aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 23, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, o 40). En un ejemplo no limitativo, cada uno de los dos fragmentos de la molécula de ANci comprende aproximadamente 21 nucleótidos.

En una modalidad, la invención presenta una molécula de ANci que comprende por lo menos un nucleótido modificado, en donde el nucleótido modificado es un 2'-desoxi-2'-fluoro-nucleótido, 2'-desoxi-2'- fluoroarabino, 2'-0-trifluoromet¡l-nucleót¡do, 2'-0-etil-trifluorometox¡-nucleótido, o 2'-0-difluorometox¡-etox¡-nucleótido, o cualquier otro nucleósido /nucleótido modificado descrito en la presente y en USSN 10/981 ,966, presentada el 5 de noviembre de 2004, incorporada aquí como referencia. En una modalidad, la invención presenta una molécula de ANci que comprende por lo menos dos nucleótidos modificados (por ejemplo 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 , 9 ,10, o más), en donde el nucleótido modificado se selecciona del grupo que consiste en 2'-desoxi-2'-fluoro-nucleótido, 2'-desoxi-2'-fluoroarabino, 2'-0-trifluorometil-nucleótido, 2'-0-etil-trifluorometoxi-nucleótido, o 2'-0-difluorometoxi-etoxi-nucleótido, o cualquier otro nucleósido /nucleótido modificado descrito en la presente y en USSN 10/981,966, presentada el 5 de noviembre de 2004, que se incorpora aquí como referencia. El nucleótido/nucleósido modificado puede ser igual o diferente. El ANci puede ser, por ejemplo, de aproximadamente 15 a aproximadamente 40 nucleótidos de longitud. En una modalidad, todos los nucleótidos de pirimidina presentes en el ANci son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro, 2'-desoxi-2'-fluoroarabino, 2'-0-trifluorometilo, 2'-0-etil-trifluorometoxi, 2'-0-difluorometoxi-etoxi, 4'-tio-pirimidina. En una modalidad los nucleótidos modificados del ANci incluyen por lo menos un nucleótido de 2'-desoxi-2'-fluoro-citidina o 2'-desoxi-2'-fluoro-uridina. En otra modalidad, los nucleótidos modificados del ANci incluyen por lo menos una 2'-desoxi-2'-fluoro-citidina y por lo menos una 2'-desoxi-2'-fluoro-uridina. En una modalidad todos los nucleótidos de uridina presentes en el ANci son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro-uridina. En una modalidad todos los nucleótidos de citidina presentes en el ANci son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro-citidina. En una modalidad todos los nucleótidos de adenosina presentes en el ANci son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro-adenosina. En una modalidad todos los nucleótidos de guanosina presentes en el ANci son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro-guanosina. El ANci puede comprender también por lo menos un enlace internucleotídico modificado, tal como un enlace de fosforotioato. En una modalidad, los 2'-desoxi-2'-fluoro-nucleótidos están presentes en sitios específicamente seleccionados del ANci que son sensibles al corte por ribonucleasa, como los sitios que tienen nucleótidos de pirimidina.

En una modalidad, la invención presenta un método para aumentar la estabilidad de una molécula de ANci contra el corte por ribonucleasa, que comprende introducir por lo menos un nucleótido modificado en la molécula de ANci, en donde el nucleótido modificado es un 2'-desoxi-2'-fluoro-nucleótido. En una modalidad todos los nucleótidos de pirimidina presentes en el ANci son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro-pirimidina. En una modalidad, los nucleótidos modificados del ANci incluyen por lo menos un nucleótido de 2'-desoxi-2'-fluoro-citidina o 2'-desoxi-2'-fluoro-uridina. En otra modalidad los nucleótidos modificados del ANci incluyen por lo menos un nucleótido de 2'-fluoro-citidina y por lo menos un nucleótido de 2'-desoxi-2'-fluoro-uridina. En una modalidad todos los nucleótidos de uridina presentes en el ANci son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro-uridina. En una modalidad todos los nucleótidos de citidina presentes en el ANci son nucleótidos de 2'-desox¡-2'-fluoro-cit¡dina. En una modalidad todos los nucleótidos de adenosina presentes en el ANci son nucleótidos de 2'-desoxi- o 2'-fluoro-adenosina. En una modalidad todos los nucleótidos de guanosina presentes en el ANci son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro-guanosina. El ANci también puede comprender por lo menos un enlace internucleotídico modificado, tal como un enlace de fosforotioato. En una modalidad, los 2 -desoxi-2'-fluoro-nucleótidos están presentes en sitios específicamente seleccionados del ANci que son sensibles al corte por ribonucleasas, como los sitios que tienen nucleótidos de pirimidina.

En una modalidad, la invención presenta un método para aumentar la estabilidad de una molécula de ANci contra el corte por ribonucleasa, que comprende introducir por lo menos un nucleótido modificado en la molécula de ANci, en donde el nucleótido modificado es un 2'-desoxi-2'-fluoroarabino-nucleótido. En una modalidad, todos los nucleótidos de pirimidina presentes en el ANci son nucleótidos de 2'-desox¡-2'-fluoroarabino-pirimidina. En una modalidad, los nucleótidos modificados en el ANci incluyen por lo menos un nucleótido de 2'-desoxi-2'-fluoroarabino-citidina o 2'-desoxi-2'-fluoroarabino-uridina. En otra modalidad, los nucleótidos modificados en el ANci incluyen por lo menos un nucleótido de 2'-fluoro citidina y por lo menos un nucleótido de 2'-desoxi-2'-fluoroarabino-uridina. En una modalidad todos los nucleótidos de uridina presentes en el ANci son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoroarabino-uridina. En una modalidad, todos los nucleótidos de citidina presentes en el ANci son nucleótidos de 2'-desoxi-2'- fluoroarabino-citidina. En una modalidad todos los nucleótidos de adenosina presentes en el ANci son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoroarabino-adenosina. En una modalidad todos los nucleótidos de guanosina presentes en el ANci son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoroarabino-guanosina. El ANci también puede comprender por lo menos un enlace internucleotídico modificado, tal como un enlace de fosforotioato. En una modalidad, los 2'-desoxi-2'-fluoroarabino-nucleótidos están presentes en sitios específicamente seleccionados del ANci que son sensibles al corte por ribonucleasa, como los sitios que tienen nucleótidos de pirimidina.

En una modalidad, la invención presenta una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) de doble cadena que regula negativamente la expresión de un gen ENaC objetivo, o que dirige el corte de un ARN de ENaC objetivo, que comprende una región de sentido y una región de antisentido, en donde la región de antisentido comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos de ARN codificada por el gen ENaC objetivo o una porción de la misma, y la región de sentido comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la región de antisentido, y en donde los nucleótidos de purina presentes en la región de antisentido comprenden nucleótidos de 2'-desoxi-purina. En una modalidad alternativa, los nucleótidos de purina presentes en la región de antisentido comprenden nucleótidos de 2'-0-metil-purina. En cualquiera de las modalidades anteriores, la región de antisentido puede comprender un enlace internucleotídico de fosforotioato en el extremo 3' de la región de antisentido. Alternativamente, en cualquiera de las modalidades anteriores, la región de antisentido puede comprender una modificación de glicerilo en el extremo 3' de la región de antisentido. En otra modalidad de cualquiera de las moléculas de ANci anteriormente descritas, cualquier nucleótido presente en una región no complementaria de la cadena de antisentido (por ejemplo, la región saliente) es un 2'-desox¡-nucleótido.

En una modalidad, la región de antisentido de una molécula de ANci de la invención comprende complementariedad de secuencia con una porción de un transcrito endógeno que tiene una secuencia única para un alelo particular relacionado con una enfermedad o rasgo en un sujeto u organismo, dicha secuencia comprendiendo polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) asociado con el alelo específico de enfermedad o rasgo. Por lo tanto, la región de antisentido de una molécula de ANci de la invención puede comprender una secuencia complementaria a las secuencias que son únicas para un alelo particular, para proveer especificidad en la mediación selectiva de i-ARN contra el alelo relacionado con la enfermedad, condición, o rasgo.

En una modalidad, la invención presenta una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) de doble cadena que regula negativamente la expresión de un gen ENaC objetivo, o que dirige el corte de un ARN de ENaC objetivo, en donde la molécula de ANci se ensambla de dos fragmentos de oligonucleótido separados, en donde un fragmento comprende la región de sentido y el segundo fragmento comprende la región de antisentido de la molécula de ANci. En una modalidad, cada cadena de la molécula de ANci de doble cadena es de aproximadamente 21 nucleótidos de longitud, y aproximadamente 19 nucleótidos de cada fragmento de la molécula de ANci tienen sus bases apareadas con los nucleótidos complementarios del otro fragmento de la molécula de ANci, en donde por lo menos dos nucleótidos 3' terminales de cada fragmento de la molécula de ANci no están apareados con los nucleótidos del otro fragmento de la molécula de ANci. En otra modalidad, la molécula de ANci es una molécula de ácido nucleico de doble cadena, en donde cada cadena es de aproximadamente 19 nucleótidos de longitud y en donde los nucleótidos de cada fragmento de la molécula de ANci tienen sus bases apareadas con los nucleótidos complementarios del otro fragmento de la molécula de ANci, para formar por lo menos aproximadamente 15 pares de bases (por ejemplo, 15, 16, 17, 18, o 19), en donde uno o los dos extremos de la molécula de ANci son extremos rasurados. En una modalidad, los dos nucleótidos 3' terminales de cada fragmento de la molécula de ANci son nucleótidos de 2'-desoxi-pirimidina, tales como 2'-desoxi-timidina. En una modalidad, los dos nucleótidos 3' terminales de cada fragmento de la molécula de ANci son nucleótidos de 2'-0-metil-pirimidina, tales como 2'-0-metil- uridina, citidina, o timidina. En otra modalidad, todos los nucleótidos de cada fragmento de la molécula de ANci tienen sus bases apareadas con los nucleótidos complementarios del otro fragmento de la molécula de ANci. En otra modalidad, la molécula de ANci es una molécula de ácido nucleico de doble cadena de aproximadamente 19 a aproximadamente 25 pares de bases, que tiene una región de sentido y una región de antisentido, en donde aproximadamente 19 nucleótidos de la región de antisentido tienen sus bases apareadas con la secuencia de nucleótidos del ARN codificado por el gen ENaC objetivo, o una porción de la misma. En otra modalidad, aproximadamente 21 nucleótidos de la región de antisentido tienen sus bases apareadas con la secuencia de nucleótidos del ARN codificado por el gen ENaC objetivo, o una porción de la misma. En cualquiera de las modalidades anteriores, el extremo 5' del fragmento que comprende dicha región de antisentido puede incluir opcionalmente un grupo fosfato.

En una modalidad, la invención presenta una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) de doble cadena que inhibe la expresión de una secuencia de ARN de ENaC objetivo, en donde la molécula de ANci no contiene ningún ribonucleótido y en donde cada cadena de la molécula de ANci de doble cadena es de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 nucleótidos. En una modalidad, la molécula de ANci tiene una longitud de 21 nucleótidos. Ejemplos de construcciones de ANci que no contienen ribonucleótido son las combinaciones de las químicas de estabilización mostradas en el cuadro 8 en cualquier combinación de químicas de sentido/antisentido, tales como Stab 7/8, Stab 7/11 , Stab 8/8, Stab 18/8, Stab 18/11 , Stab 12/13, Stab 7/13, Stab 18/13, Stab 7/19, Stab 8/19, Stab 18/19, Stab 7/20, Stab 8/20, Stab 18/20, Stab 7/32, Stab 8/32, o Stab 18/32 (por ejemplo, cualquier ANci que tiene cadenas de sentido o antisentido Stab 7, 8, 11 , 12, 13, 14, 15, 17, 18, 19, 20, o 32, o cualquier combinación de las mismas). Aquí, las químicas Stab numéricas pueden incluir versiones tanto 2'-fluoro como 2'-OCF3 de las químicas mostradas en el cuadro 8. Por ejemplo, "Stab 7/8" se refiere tanto a Stab 7/8 como a Stab 7F/8F, etc. En una modalidad, la invención presenta una molécula de ARN de doble cadena sintetizada químicamente que dirige el corte de un ARN de ENaC objetivo por medio de interferencia de ARN, en donde cada cadena de dicha molécula de ARN es de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 nucleotidos de longitud; una cadena de la molécula de ARN comprende una secuencia de nucleotidos que tiene suficiente complementariedad con el ARN de ENaC objetivo para que la molécula de ARN dirija el corte del ARN de ENaC objetivo por medio de interferencia de ARN; y en donde opcionalmente por lo menos una cadena de la molécula de ARN comprende uno o más nucleotidos modificados químicamente como aquí se describen, por ejemplo, sin limitación, desoxi-nucleótidos, 2'-0-metil-nucleótidos, 2'-desoxi-2'-fluoro-nucleótidos, 2'-desox¡-2'-fluoroarabino, 2'-0-metoxietil-nucleótidos, 4'-tio-nucleótidos, 2'-0-trifluorometil-nucleótidos, 2'-0-etil-trifluorometoxi-nucleótidos, 2'-0-difluorometoxi-etoxi-nucleótidos, etc., o cualquier combinación de los mismos. Los nucleotidos modificados químicamente pueden ser iguales o diferentes.

En una modalidad, un ARN de ENaC objetivo de la invención comprende una secuencia que codifica una proteína ENaC.

En una modalidad, un ARN de ENaC objetivo de la invención comprende una secuencia de ARN no codificadora (por ejemplo, miARN, ARNnp, ARNci, etc.,), véase por ejemplo Mattick, 2005, Science, 309, 1527-1528; Claverie, 2005, Science, 309, 1529-1530; Sethupathy et al., 2006, RNA, 12, 192-197; y Czech, 2006 NEJM, 354, 11 : 1194-1195.

En una modalidad la invención presenta un medicamento que comprende una molécula de ANci de la invención.

En una modalidad la invención presenta un ingrediente activo que comprende una molécula de ANci de la invención.

En una modalidad, la invención presenta el uso de una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) de doble cadena para inhibir, regular negativamente, o reducir la expresión de un gen ENaC objetivo, en donde la molécula de ANci comprende una o más modificaciones químicas que pueden ser iguales o diferentes, y cada cadena del ANci de doble cadena es, independientemente, de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 nucleótidos de longitud, o más (por ejemplo, aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30, o más). En una modalidad, la molécula de ANci de la invención es una molécula de ácido nucleico de doble cadena que comprende una o más modificaciones químicas, en donde cada uno de los dos fragmentos de la molécula de ANci comprende, independientemente, de aproximadamente 15 a aproximadamente 40 nucleótidos (por ejemplo, aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 23, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, o 40), y en donde una de las cadenas comprende por lo menos 15 nucleótidos que son complementarios a la secuencia de nucleótidos del ARN codificador del ENaC objetivo, o una porción de la misma. En un ejemplo no limitativo, los dos fragmentos de la molécula de ANci comprenden aproximadamente 21 nucleótidos. En otra modalidad, la molécula de ANci es una molécula de ácido nucleico de doble cadena que comprende una o más modificaciones químicas, en donde cada cadena es de aproximadamente 21 nucleótidos de largo y en donde aproximadamente 19 nucleótidos de cada fragmento de la molécula de ANci tienen bases apareadas con los nucleótidos complementarios del otro fragmento de la molécula de ANci, en donde por lo menos 2 nucleótidos 3' terminales de cada fragmento de la molécula de ANci no tienen bases apareadas con los nucleótidos del otro fragmento de la molécula de ANci. En otra modalidad, la molécula de ANci es una molécula de ácido nucleico de doble cadena que comprende una o más modificaciones químicas, en donde cada cadena es de aproximadamente 19 nucleótidos de longitud, y en donde los nucleótidos de cada fragmento de la molécula de ANci tienen bases apareadas con los nucleótidos complementarios del otro fragmento de la molécula de ANci, para formar por lo menos aproximadamente 15 pares de bases (por ejemplo, 15, 16, 17, 18, o 9), en donde uno o los extremos de la molécula de ANci son extremos rasurados. En una modalidad, los dos nucleótidos 3' terminales de cada fragmento de la molécula de ANci es un nucleótido de 2'-desoxi-pirimidina, tal como 2'-desoxi-timidina. En una modalidad, los dos nucleótidos 3' terminales de cada fragmento de la molécula de ANci es un nucleótido de 2'-0-metil-pirimidina, tal como 2 -O-metil- uridina, citidina, o timidina. En otra modalidad, todos los nucleótidos de cada fragmento de la molécula de ANci tienen sus bases apareadas con los nucleótidos complementarios del otro fragmento de la molécula de ANci. En otra modalidad, la molécula de ANci es una molécula de ácido nucleico de doble cadena de aproximadamente 19 a aproximadamente 25 pares de bases, que tiene una región de sentido y una región de antisentido, y que comprende una o más modificaciones químicas, en donde aproximadamente 19 nucleótidos de la región de antisentido tienen bases apareadas con la secuencia de nucleótidos del ARN codificado por el gen ENaC objetivo, o una porción de la misma. En otra modalidad, aproximadamente 21 nucleótidos de la región de antisentido tienen bases apareadas con la secuencia de nucleótidos del ARN codificado por el gen ENaC objetivo, o una porción de la misma. En cualquiera de las modalidades anteriores, el extremo 5' del fragmento que comprende dicha región de antisentido puede incluir opcionalmente un grupo fosfato.

En una modalidad, la invención presenta el uso de una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) de doble cadena que inhibe, regula negativamente o reduce la expresión de un gen ENaC objetivo, en donde una de las cadenas de la molécula de ANci de doble cadena es una cadena de antisentido que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos del ARN de ENaC objetivo, o una porción de la misma, la otra cadena es una cadena de sentido que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos de la cadena de antisentido. En una modalidad, cada cadena tiene por lo menos dos modificaciones químicas (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, o más), que pueden ser iguales o diferentes, tales como modificaciones del azúcar, base, o esqueleto del nucleótido. En una modalidad, la mayoría de los nucleótidos de pirimidina presentes en la molécula de ANci de doble cadena comprenden una modificación de azúcar. En una modalidad, la mayoría de los nucleótidos de purina presentes en la molécula de ANci de doble cadena comprenden una modificación de azúcar.

En una modalidad, la invención presenta una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) de doble cadena que inhibe, regula negativamente o reduce la expresión de un gen ENaC objetivo, en donde una de las cadenas de la molécula de ANci de doble cadena es una cadena de antisentido que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos del ARN del ENaC objetivo o una porción de la misma, en donde la otra cadena es una cadena de sentido que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos de la cadena de antisentido. En una modalidad, cada cadena tiene por lo menos dos modificaciones químicas (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, o más), que pueden ser ¡guales o diferentes, tales como modificaciones de nucleótido, azúcar, base o esqueleto. En una modalidad, la mayoría de los nucleótidos de pirimidina presentes en la molécula de ANci de doble cadena comprenden una modificación de azúcar. En una modalidad, la mayoría de los nucleótidos de purina presentes en la molécula de ANci de doble cadena comprenden una modificación de azúcar.

En una modalidad, la invención presenta una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) de doble cadena que inhibe, regula negativamente o reduce la expresión de un gen ENaC objetivo, en donde una de las cadenas de la molécula de ANci de doble cadena es una cadena de antisentido que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos del ARN del ENaC objetivo o una porción de la misma que codifica una proteína; la otra cadena es una cadena de sentido que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos de la cadena de antisentido; y en donde la mayoría de los nucleótidos de pirimidina presentes en la molécula de ANci de doble cadena comprenden una modificación de azúcar. En una modalidad, cada cadena de la molécula de ANci comprende de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 nucleótidos, o más (por ejemplo, aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o 30, o más), en donde cada cadena comprende por lo menos 15 nucleótidos que son complementarios a los nucleótidos de la otra cadena. En una modalidad, la molécula de ANci está ensamblada de dos fragmentos de oligonucleótido, en donde un fragmento comprende la secuencia de nucleótidos de la cadena de antisentido de la molécula de ANci y un segundo fragmento comprende la secuencia de nucleótidos de la región de sentido de la molécula de ANci. En una modalidad, la cadena de sentido está unida a la cadena de antisentido por medio de una molécula enlazadora, tal como un enlazador de polinucleótido o un enlazador no nucleotídico. En una modalidad adicional, los nucleótidos de pirimidina presentes en la cadena de sentido son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro-pirimidina, y los nucleótidos de purina presentes en la región de sentido son nucleótidos de 2'-desoxi-purina. En otra modalidad, los nucleótidos de pirimidina presentes en la cadena de sentido son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro-pirimidina, y los nucleótidos de purina presentes en la región de sentido son nucleótidos de 2'-0-metil-purina. En otra modalidad, los nucleótidos de pirimidina presentes en la cadena de antisentido son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro-pirimidina, y cualquier nucleótido de purina presente en la cadena de antisentido es un nucleótido de 2'-desoxi-purina. En otra modalidad, la cadena de antisentido comprende uno o más nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro-pirimidina y uno o más nucleótidos de 2'-0-metil-purina. En otra modalidad, los nucleótidos de pirimidina presentes en la cadena de antisentido son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro-pirimidina, y cualquier nucleótido de purina presente en la cadena de antisentido es un nucleótido de 2'-0-metil-purina. En una modalidad adicional, la cadena de sentido comprende un extremo 3' y un extremo 5', en donde está presente una porción de casquete terminal (por ejemplo, una porción abásica desoxi invertida, o una porción de desoxi-nucleótido invertido tal como timidina invertida) en el extremo 5', el extremo 3', o tanto en el extremo 5' como 3' de la cadena de sentido. En otra modalidad la cadena de antisentido comprende un enlace internucleotídico de fosforotioato en el extremo 3' de la cadena de antisentido. En otra modalidad la cadena de antisentido comprende una modificación de glicerilo en el extremo 3'. En otra modalidad el extremo 5' de la cadena de antisentido incluye opcionalmente un grupo fosfato.

En cualquiera de las modalidades anteriormente descritas de una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) de doble cadena que inhibe expresión de un gen ENaC objetivo, en donde la mayoría de los nucleótidos de pirimidina presentes en la molécula de ANci de doble sentido comprende una modificación de azúcar, cada una de las dos cadenas de la molécula de ANci puede comprender de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 nucleótidos o más (por ejemplo, aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o 30, o más). En una modalidad, aproximadamente de 15 a aproximadamente 30 nucleótidos o más (por ejemplo, aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o 30 o más) de cada cadena de la molécula de ANci, tienen bases apareadas con los nucleótidos complementarios de la otra cadena de la molécula de ANci. En otra modalidad, aproximadamente de 15 a aproximadamente 30 nucleótidos o más (por ejemplo, aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o 30 o más) de cada cadena de la molécula de ANci, tienen bases apareadas con los nucleótidos complementarios de la otra cadena de la molécula de ANci, en donde por lo menos dos nucleótidos 3' terminales de cada cadena de la molécula de ANci no tienen bases apareadas con los nucleótidos de la otra cadena de la molécula de ANci. En otra modalidad, los dos nucleótidos 3' terminales de cada fragmento de la molécula de ANci son una 2'-desoxi-pirimidina, tal como 2'-desoxi-tim¡d¡na. En una modalidad, cada cadena de la molécula de ANci tiene bases apareadas con los nucleotidos complementarios de la otra cadena de la molécula de ANci. En una modalidad, aproximadamente de 15 a aproximadamente 30 nucleotidos (por ejemplo, aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o 30) de la cadena de antisentido tienen bases apareadas con la secuencia de nucleotidos del ARN de ENaC objetivo o una porción de la misma. En una modalidad, de aproximadamente 18 a aproximadamente 25 nucleotidos (por ejemplo, aproximadamente 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, o 25) de la cadena de antisentido, tienen bases apareadas con la secuencia de nucleotidos del ARN de ENaC objetivo o una porción de la misma.

En una modalidad, la invención presenta una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) de doble cadena que inhibe la expresión de un gen ENaC objetivo, en donde una de las cadenas de la molécula de ANci de doble sentido es una cadena de antisentido que comprende una secuencia de nucleotidos que es complementaria a una secuencia de nucleotidos del ARN del ENaC objetivo, o una porción de la misma; la otra cadena es una cadena de sentido que comprende una secuencia de nucleotidos que es complementaria a una secuencia de nucleotidos de la cadena de antisentido. En una modalidad, cada cadena tiene por lo menos dos modificaciones químicas diferentes (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, o más), tales como modificaciones del azúcar, base, o esqueleto de nucleótido. En una modalidad, la mayoría de los nucleotidos de pirimidina presentes en la molécula de ANci de doble cadena comprende una modificación de azúcar. En una modalidad, la mayoría de los nucleótidos de purina presentes en la molécula de ANci de doble cadena comprende una modificación de azúcar. En una modalidad, el extremo 5' de la cadena de antisentido incluye opcionalmente un grupo fosfato.

En una modalidad, la invención presenta una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) de doble cadena que inhibe la expresión de un gen ENaC objetivo, en donde una de las cadenas de la molécula de ANci de doble cadena es una cadena de antisentido que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos del ARN del ENaC objetivo, o una porción de la misma, la otra cadena es una cadena de sentido que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos de la cadena de antisentido, y en donde la mayoría de los nucleótidos de pirimidina presentes en la molécula de ANci de doble cadena comprende una modificación de azúcar; y en donde la secuencia de nucleótidos de la cadena de antisentido, o una porción de la misma, es complementaria a una secuencia de nucleótidos de la región no traducida de ARN de ENaC objetivo de ENaC o una porción de la misma.

En una modalidad, la invención presenta una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) de doble cadena que inhibe la expresión de un gen ENaC objetivo, en donde una de las cadenas de la molécula de ANci de doble cadena es una cadena de antisentido que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos de ARN de ENaC objetivo, o una porción de la misma, en donde la otra cadena es una cadena de sentido que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos de la cadena de antisentido, en donde la mayoría de los nucleótidos de pirimidina presentes en la molécula de ANci de doble cadena comprenden una modificación de azúcar, y en donde la secuencia de nucleótidos de la cadena de antisentido es complementaria a una secuencia de nucleótidos del ARN de ENaC objetivo o una porción de la misma, que está presente en el ARN de ENaC objetivo.

En una modalidad, la invención presenta una composición que comprende una molécula de ANci de la invención en un vehículo o diluente farmacéuticamente aceptable. En otra modalidad, la invención presenta dos o más moléculas de ANci diferentes de la invención (por ejemplo, moléculas de ANci que hacen blanco en diferentes regiones del ARN de ENaC objetivo, o moléculas de ANci que hacen blanco en el ARN de la ruta de ENaC), en un vehículo o diluente farmacéuticamente aceptable.

En un ejemplo no limitativo, la introducción de nucleótidos químicamente modificados en las moléculas de ácido nucleico provee una herramienta poderosa para superar las limitaciones potenciales de la estabilidad in vivo y la biodisponibilidad, inherentes a las moléculas de ARN nativas que son suministradas de forma exógena. Por ejemplo, el uso de moléculas de ácido nucleico químicamente modificado puede permitir una dosis más baja de una molécula de ácido nucleico particular para un efecto terapéutico dado, puesto que las moléculas de ácido nucleico químicamente modificadas tienden a tener una vida media más larga en el suero. Además, ciertas modificaciones químicas pueden mejorar la biodisponibilidad de las moléculas de ácido nucleico haciendo blanco en células o tejidos particulares, o mejorando la incorporación celular de la molécula de ácido nucleico. Por lo tanto, incluso si la actividad de una molécula de ácido nucleico químicamente modificado es reducida en comparación con una molécula de ácido nucleico nativa, por ejemplo, cuando en comparación con una molécula de ácido nucleico todo ARN, la actividad general de la molécula de ácido nucleico modificado puede ser mayor que la molécula nativa debido a una mejor estabilidad o suministro de la molécula. A diferencia del ANci no modificado nativo, el ANci químicamente modificado también puede minimizar la posibilidad de activar el interferón o la inmunoestimulación en los humanos. Por lo tanto, estas propiedades mejoran la capacidad del ARNci nativo o ARNci mínimamente modificado para mediar la i-ARN en varias situaciones in vitro e in vivo, incluyendo el uso en aplicaciones de investigación y terapéuticas. El solicitante describe en la presente moléculas de ANci químicamente modificadas con una mejor actividad de i-ARN en comparación con las moléculas correspondientes de ANci no modificadas o modificadas mínimamente. Los motivos de ANci químicamente modificado aquí descrito proveen la capacidad de mantener una actividad de i-ARN que es sustancialmente similar a la del ARNci no modificado o mínimamente modificado (véase por ejemplo Elbashir ef al., 2001 , EMBO J., 20:6877-6888), mientras que al mismo tiempo proveen resistencia a la nucleasa y propiedades farmacocinéticas adecuadas para usarse en aplicaciones terapéuticas.

En cualquiera de las modalidades de las moléculas de ANci aquí descritas, la región de antisentido de una molécula de ANci de la invención puede comprender un enlace internucleotídico de fosforotioato en el extremo 3' de dicha región de antisentido. En cualquiera de las modalidades de las moléculas de ANci aquí descritas, la región de antisentido puede comprender de aproximadamente uno a aproximadamente cinco enlaces internucleotídicos de fosforotioato en el extremo 5' de dicha región de antisentido. En cualquiera de las modalidades de las moléculas de ANci aquí descritas, los tramos salientes de nucleótido 3' terminales de una molécula de ANci de la invención pueden comprender ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos que están modificados químicamente en un azúcar, base, o esqueleto del ácido nucleico. En cualquiera de las modalidades de las moléculas de ANci aquí descritas, los tramos salientes de nucleótido 3' terminales pueden comprender uno o más ribonucleótidos de base universal. En cualquiera de las modalidades de las moléculas de ANci aquí descritas, los tramos salientes de nucleótido 3' terminales pueden comprender uno o más nucleótidos acíclicos.

Una modalidad de la invención provee un vector de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica por lo menos una molécula de ANci de la invención de una manera que permite la expresión de la molécula de ácido nucleico. Otra modalidad de la invención provee una célula de mamífero que comprende dicho vector de expresión. La célula de mamífero puede ser una célula humana. La molécula de ANci del vector de expresión puede comprender una región de sentido y una región de antisentido. La región de antisentido puede comprender una secuencia complementaria a una secuencia de ARN o ADN que codifica un objetivo de ENaC, y la región de sentido puede comprender una secuencia complementaria a la región de antisentido. La molécula de ANci puede comprender dos cadenas distintas que tienen las regiones de sentido y antisentido complementarias. La molécula de ANci puede comprender una sola cadena que tiene regiones de sentido y antisentido complementarias.

En una modalidad, la invención presenta una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) químicamente modificado, capaz de mediar la interferencia de ARN (i-ARN) dentro de una célula o sistema reconstituido in vitro, en donde la modificación química comprende uno o más nucleótidos (por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más) que comprenden un enlace internucleotídico modificado de esqueleto que tiene la fórmula I: en donde cada uno de Ri y R2 es independientemente cualquier nucleótido, no nucleótido, o polinucleótido que puede ser natural o químicamente modificado, y que puede estar incluido en la estructura de la molécula de ANci o servir como un punto de unión con la molécula de ANci, cada X e Y es independientemente O, S, N, alquilo, o alquilo sustituido, cada Z y W es independientemente O, S, N, alquilo, alquilo sustituido, O-alquilo, S-alquilo, alcarilo, aralquilo, o acetilo, y en donde opcionalmente W, X, Y, y Z no son todos O. En otra modalidad, una modificación del esqueleto de la invención comprende un enlace internucleotídico de fosfonoacetato o tiofosfonoacetato (véase por ejemplo Sheehan et al., 2003, Nucleic Acids Research, 31 , 4109-4118).

Los enlaces internucleotídicos químicamente modificados que tienen la fórmula I, por ejemplo, en donde cualquiera de Z, W, X, o Y comprende independientemente un átomo de azufre, pueden estar presentes en una o las dos cadenas de oligonucleótido del dúplex de ANci, por ejemplo en la cadena de sentido, la cadena de antisentido, o ambas cadenas. Las moléculas de ANci de la invención pueden comprender uno o más enlaces internucleotídicos químicamente modificados (por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más), que tienen la fórmula I en el extremo 3', el extremo 5', o tanto el extremo 3' como 5' de la cadena de sentido, la cadena de antisentido, o ambas cadenas. Por ejemplo, una molécula de ANci ejemplar de la invención puede comprender de aproximadamente uno a aproximadamente cinco enlaces internucleotídicos químicamente modificados o más (por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, o más), que tienen la fórmula I en el extremo 5' de la cadena de sentido, la cadena de antisentido, o ambas cadenas. En otro ejemplo no limitativo, una molécula de ANci ejemplar de la invención puede comprender uno o más nucleótidos de pirimidina (por ejemplo aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más), con enlaces internucleotídicos químicamente modificados que tienen la fórmula I en la cadena de sentido, la cadena de antisentido, o ambas cadenas. En otro ejemplo no limitativo, una molécula de ANci ejemplar de la invención puede comprender uno o más nucleótidos de purina (por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más), con enlaces internucleotídicos químicamente modificados que tienen la fórmula I en la cadena de sentido, la cadena de antisentido, o ambas cadenas. En otra modalidad, una molécula de ANci de la invención que tiene enlaces internucleotídicos de fórmula I también comprende un nucleótido o no nucleótido químicamente modificado que tiene cualquiera de las fórmulas l-VII.

En una modalidad, la invención presenta una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) químicamente modificado, capaz de mediar la interferencia de ARN (i-ARN) dentro de una célula o sistema reconstituido in vitro, en donde la modificación química comprende uno o más nucleótidos o no nucleótidos (por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más) que tienen la fórmula II: en donde cada uno de R3) R4, R5, R6, R7, Re, R10, R11 y R12 es independientemente H, OH, alquilo, alquilo sustituido, alcarilo o aralquilo, F, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, OCH3, OCN, O-alquilo, S-alquilo, N-alquilo, O-alquenilo, S-alquenilo, N-alquenilo, SO-alquilo, alquil-OSH, alquil-OH, O-alquil-OH, O-alquil-SH, S-alquil-OH, S-alquil-SH, alquil-S-alquilo, alquil-O-alquilo, ONO2, NO2, N3, NH2, aminoalquilo, aminoácido, aminoacilo, ONH2, O-aminoalquilo, O-aminoácido, O-aminoacilo, heterocicloalquilo, heterocicloalcarilo, aminoalquilamino, polialquilamino, sililo sustituido, o un grupo que tiene cualquiera de las fórmulas I, II, III, IV, V, VI o VII, cualquiera de las cuales puede estar incluida en la estructura de la molécula de ANci o servir como punto de unión con la molécula de ANci; Rg es O, S, CH2, S=O, CHF, o CF2, y B es una base nucleosídica tal como adenina, guanina, uracilo, citosina, timina, 2-aminoadenosina, 5-metilcitosina, 2,6-diaminopurina, o cualquier otra base no natural que puede ser complementaria o no complementaria al ARN objetivo, o una base no nucleosídica tal como fenilo, naftilo, 3-nitropirrol, 5-nitroindol, nebularina, piridona, piridinona, o cualquier otra base universal no natural que puede ser complementaria o no complementaria al ARN objetivo. En una modalidad, R3 o R7 comprende una porción conjugada y un enlazador (por ejemplo, un enlazador nucleotídico o no nucleotídico como se describe aquí o se conoce de otra manera en la técnica). Los ejemplos no limitativos de porciones conjugadas incluyen ligandos para receptores celulares, tales como péptidos derivados de ligandos de proteína naturales; secuencias de localización de proteína que incluyen secuencias de código ZIP celulares; anticuerpos; aptámeros de ácido nucleico, vitaminas y otros cofactores tales como folato y N-acetilgalactosamina; polímeros tales como polietilenglicol (PEG); fosfolípidos; colesterol; esteroides y poliaminas, tales como PEI, espermina o espermidina. En una modalidad, un nucleótido de la invención que tiene la fórmula II es un 2'-desoxi-2'-fluoro-nucleótido. En una modalidad, un nucleótido de la invención que tiene la fórmula II es un 2'-0-metil-nucleótido. En una modalidad, un nucleótido de la invención que tiene la fórmula II es un 2'-desoxi-nucleótido.

El nucleótido o no nucleótido químicamente modificado de fórmula II puede estar presente en una o las dos cadenas de ollgonucleótido del dúplex de ANci, por ejemplo en la cadena de sentido, la cadena de antisentido, o ambas cadenas. Las moléculas de ANci de la invención pueden comprender uno o más nucleótidos o no nucleótidos químicamente modificados de fórmula II en el extremo 3', el extremo 5', o tanto en el extremo 3' como 5' de la cadena de sentido, la cadena de antisentido, o ambas cadenas. Por ejemplo, una molécula de ANci ejemplar de la invención puede comprender de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 nucleótidos o no nucleótidos químicamente modificados de fórmula II, o más (por ejemplo aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, o más), en el extremo 5' de la cadena de sentido, la cadena de antisentido o las dos cadenas. En otro ejemplo no limitativo, una molécula de ANci ejemplar de la invención puede comprender de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 nucleótidos o no nucleótidos químicamente modificados de fórmula II, o más (por ejemplo aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5 o más), en el extremo 3' de la cadena de sentido, la cadena de antisentido, o las dos cadenas.

En una modalidad, la invención presenta una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) químicamente modificado, capaz de mediar la interferencia de ARN (i-ARN) dentro de una célula o sistema reconstituido in vitro, en donde la modificación química comprende uno o más nucleótidos o no nucleótidos (por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más) que tienen la fórmula III: en donde cada uno de R3, R4, s, R6, R7, Re, R10, R11 y R12 es independientemente H, OH, alquilo, alquilo sustituido, alcarilo o aralquilo, F, Cl, Br, CN, CF3l OCF3, OCH3, OCN, O-alquilo, S-alquilo, N-alquilo, O-alquenilo, S-alquenilo, N-alquenilo, SO-alquilo, alquil-OSH, alquil-OH, O-alquil-OH, O-alquil-SH, S-alquil-OH, S-alquil-SH, alquil-S-alquilo, alquil-O-alquilo, ON02, N02, N3, NH2, aminoalquilo, aminoácido, aminoacilo, ONH2, O-aminoalquilo, O-aminoácido, O-aminoacilo, heterocicloalquilo, heterocicloalcarilo, aminoalquilamino, polialquilamino, sililo sustituido, o un grupo que tiene cualquiera de las fórmulas I, II, III, IV, V, VI o VII, cualquiera de las cuales puede estar incluida en la estructura de la molécula de ANci o servir como punto de unión con la molécula de ANci; R9 es O, S, CH2, S=0, CHF, o CF2, y B es una base nucleosídica tal como adenina, guanina, uracilo, citosina, timina, 2-aminoadenosina, 5-metilcitosina, 2,6-diaminopurina, o cualquier otra base no natural que puede ser complementaria o no complementaria al ARN objetivo, o una base no nucleosídica tal como fenilo, naftilo, 3-nitropirrol, 5-nitroindol, nebularina, piridona, piridinona, o cualquier otra base universal no natural que puede ser complementaria o no complementaria al ARN objetivo. En una modalidad, R3 o R7 comprende una porción conjugada y un enlazador (por ejemplo, un enlazador nucleotídico o no nucleotídico como se describe aquí o se conoce de otra manera en la técnica). Los ejemplos no limitativos de las porciones conjugadas incluyen ligandos para receptores celulares, tales como péptidos derivados de ligandos de proteína naturales; secuencias de localización de proteína que incluyen secuencias de código ZIP celulares; anticuerpos; aptámeros de ácido nucleico, vitaminas y otros cofactores tales como folato y N- acetilgalactosamina; polímeros tales como polietilenglicol (PEG); fosfolípidos; colesterol; esteroides y poliaminas, tales como PEI, espermina o espermidina.

El nucleótido o no nucleótido químicamente modificado de fórmula III puede estar presente en una o las dos cadenas de oligonucleótido del dúplex de ANci, por ejemplo, en la cadena de sentido, la cadena de antisentido, o las dos cadenas. Las moléculas de ANci de la invención pueden comprender uno o más nucleótidos o no nucleótidos químicamente modificados de fórmula III en el extremo 3', el extremo 5', o tanto el extremo 3' como 5' de la cadena de sentido, la cadena de antisentido, o las dos cadenas. Por ejemplo, una molécula de ANci ejemplar de la invención puede comprender de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 nucleótidos o no nucleótidos químicamente modificados de fórmula III, o más (por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, o más), en el extremo 5' de la cadena de sentido, la cadena de antisentido, o las dos cadenas. En otro ejemplo no limitativo, una molécula de ANci ejemplar de la invención puede comprender-de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 nucleótidos o no nucleótidos químicamente modificados de fórmula III, o más (por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, o más), en el extremo 3' de la cadena de sentido, la cadena de antisentido, o las dos cadenas.

En otra modalidad, una molécula de ANci de la invención comprende un nucleótido que tiene la fórmula II o III, en donde el nucleótido que tiene la fórmula II o III está en una configuración invertida. Por ejemplo, el nucleótido que tiene la fórmula II o III está unido a la construcción de ANci en una configuración 3'-3', 3'-2', 2'-3', o 5'-5', tal como el extremo 3', el extremo 5', o tanto el extremo 3' como 5' de una o las dos cadenas de ANci.

En una modalidad, la invención presenta una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) modificado químicamente, capaz de mediar la interferencia de ARN (i-ARN) dentro de una célula o sistema reconstituido in vitro, en donde la modificación química comprende un grupo fosfato 5' terminal que tiene la fórmula IV: z X— P— Y— w en donde cada X e Y son independientemente O, S, N, alquilo, alquilo sustituido o alquil-halógeno; en donde cada Z y W es independientemente O, S, N, alquilo, alquilo sustituido, O-alquilo, S-alquilo, alcarilo, aralquilo, alquil-halógeno, o acetilo; y en donde opcionalmente W, X, Y, y Z no son todos O, e Y sirve como un punto de unión con la molécula de ANci.

En una modalidad, la invención presenta una molécula de ANci que tiene un grupo fosfato 5' terminal que tiene la fórmula IV sobre la cadena complementaria al objetivo de ENaC, por ejemplo, una cadena complementaria a un ARN de ENaC objetivo, en donde la molécula de ANci comprende una molécula de ANci toda de ARN. En otra modalidad, la invención presenta una molécula de ANci que tiene un grupo fosfato 5' terminal que tiene la fórmula IV en la cadena complementaria al objetivo E4 de córneas y singeneico no injertado de PD (Lewis-Lewis), en donde la molécula de ANci también comprende de aproximadamente 1 a aproximadamente 3 tramos salientes de nucleótido 3' terminales (por ejemplo aproximadamente 1 , 2, o 3), que tienen de aproximadamente 1 a aproximadamente 4 desoxirribonucleótidos (por ejemplo aproximadamente 1 , 2, 3, o 4) en el extremo 3' de una o las dos cadenas. En otra modalidad, un grupo fosfato 5' terminal que tiene la fórmula IV está presente en la cadena complementaria al objetivo de ENaC de una molécula de ANci de la invención, por ejemplo una molécula de ANci que tiene modificaciones químicas que tienen cualquiera de las fórmulas l-VII.

En una modalidad, la invención presenta una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) modificado químicamente, capaz de mediar la interferencia de ARN (i-ARN) dentro de una célula o sistema reconstituido ¡n vitro, en donde la modificación química comprende uno o más enlaces internucleotídicos de fosforotioato. Por ejemplo, en un ejemplo no limitativo, la invención presenta un ácido nucleico corto de interferencia (ANci) modificado químicamente que tiene aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más enlaces internucleotídicos de fosforotioato en una cadena de ANci. En otra modalidad, la invención presenta un ácido nucleico corto de interferencia (ANci) químicamente modificado que tiene, de forma individual, aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más enlaces internucleotídicos de fosforotioato en las dos cadenas de ANci. Los enlaces internucleotídicos de fosforotioato pueden estar presentes en una o las dos cadenas de oligonucleótido del dúplex de ANci, por ejemplo en la cadena de sentido, la cadena de antisentido, o las dos cadenas. Las moléculas de ANci de la invención pueden comprender uno o más enlaces internucleotídicos de fosforotioato en el extremo 3', el extremo 5', o tanto el extremo 3' como 5' de la cadena de sentido, la cadena de antisentido, o las dos cadenas. Por ejemplo, una molécula de ANci ejemplar de la invención puede comprender de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 o más enlaces internucleotídicos de fosforotioato consecutivos (por ejemplo aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, o más), en el extremo 5' de la cadena de sentido, la cadena de antisentido, o las dos cadenas. En otro ejemplo no limitativo, una molécula de ANci de la invención puede comprender uno o más enlaces internucleotídicos de pirimidina fosforotioato (por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más), en la cadena de sentido, la cadena de antisentido, o las dos cadenas. En otro ejemplo no limitativo, una molécula de ANci ejemplar de la invención puede comprender uno o más enlaces internucleotídicos de purina fosforotioato (por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más), en la cadena de sentido, la cadena de antisentido, o las dos cadenas.

Cada cadena de la molécula de ANci de doble cadena puede tener una o más modificaciones químicas, de tal manera que cada cadena comprende un patrón diferente de modificaciones químicas. Se proveen aquí varios ejemplos no limitativos de esquemas de modificación que pueden producir diferentes patrones de modificaciones.

En una modalidad, la invención presenta una molécula de ANci, en donde la cadena de sentido comprende uno o más enlaces intemucleotídicos de fosforotioato, por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más; o uno o más nucleótidos 2'-desoxi, 2'-0-metilo, 2'-desoxi-2'-fluoro, 2'-0-trifluorometilo, 2'-0-etil-trifluorometoxi, 2'-0-difluorometoxi-etoxi (por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más); o aproximadamente uno o más nucleótidos de base universal modificados (por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más); y opcionalmente una molécula de casquete terminal en el extremo 3', el extremo 5', o tanto el extremo 3' como 5' de la cadena de sentido; y en donde la cadena de antisentido comprende de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 o más enlaces intemucleotídicos de fosforotioato, de forma especifica aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más; o uno o más nucleótidos 2'-desoxi, 2'-0-metilo, 2'-desoxi-2'-fluoro, 2'-0-trifluorometilo, 2'-0-etil-trifluorometoxi, 2'-0-difluorometoxi-etoxi, 4'-tio (por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más), o uno o más nucleótidos de base universal modificados (por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más); y opcionalmente una molécula de casquete terminal en el extremo 3', el extremo 5', o tanto el extremo 3' como 5' de la cadena de antisentido. En otra modalidad, uno o más nucleótidos de pirimidina, por ejemplo aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más, de la cadena de sentido o antisentido de ANci, están modificados químicamente con nucleótidos 2'-desoxi, 2'-0-metilo, 2'-0-trifluorometilo, 2'-0-etil-trifluorometoxi, 2'-0-difluorometoxi-etoxi, 4'-tio o 2'-desoxi-2'-fluoro, con o sin uno o más enlaces internucleotídícos de fosforotioato, por ejemplo aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más; o está presente una molécula de casquete terminal en el extremo 3', el extremo 5', o tanto el extremo 3' como 5' en la misma cadena o en una cadena diferente.

En otra modalidad, la invención presenta una molécula de ANci, en donde la cadena de sentido comprende de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 enlaces internucleotídícos de fosforotioato, de forma específica, aproximadamente 1 , 2, 3, 4, o 5; o uno o más nucleótidos 2'-desoxi, 2'-0-metilo, 2'-desoxí-2'-fluoro, 2'-0-tr¡fluorometilo, 2'-0-etil-trifluorometoxi, 2'-0-difluorometoxi-etoxi, 4'-tio (por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, o más); o uno o más nucleótidos de base universal modificados (por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, o más); y opcionalmente una molécula de casquete terminal en el extremo 3', el extremo 5', o tanto el extremo 3' como 5' de la cadena de sentido; y en donde la cadena de antisentido comprende de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 o más enlaces internucleotídícos de fosforotioato, de forma específica aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, o más; o uno o más nucleótidos 2'-desoxi, 2'-O-metilo, 2'-desoxí-2'-fluoro, 2'-0-trifluorometilo, 2'-0-etil-trifluorometoxi, 2 -0-dífluorometoxi-etoxi, 4'-tio (por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más); o uno o más nucleótidos de base universal modificados (por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más); y opcionalmente una molécula de casquete terminal en el extremo 3', el extremo 5', o tanto el extremo 3' como 5' de la cadena de antisentido. En otra modalidad, uno o más nucleótidos de pirimidina, por ejemplo aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más, de la cadena de sentido o antisentido de ANci, están modificados químicamente con nucleótidos 2'-desoxi, 2'-0-metilo, 2'-0-trifluorometilo, 2'-0-etil-trifluorometoxi, 2'-0-difluorometoxi-etoxi, 4'-tio o 2 -desoxi-2'-fluoro, con o sin aproximadamente 1 a aproximadamente 5 o más enlaces internucleotídicos de fosforotioato, por ejemplo aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, o más; o está presente una molécula de casquete terminal en el extremo 3', el extremo 5', o tanto el extremo 3' como 5' en la misma cadena o en una cadena diferente En una modalidad, la invención presenta una molécula de ANci, en donde la cadena de sentido comprende uno o más enlaces internucleotídicos de fosforotioato, por ejemplo aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más; o uno o más nucleótidos 2'-desoxi, 2'-0-metilo, 2'-desoxi-2'-fluoro, 2'-0-trifluorometilo, 2'-0-etil-trifluorometoxi, 2'-0-difluorometoxi-etoxi, 4'-tio (por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más); o uno o más nucleótidos de base universal modificados (por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más); y opcionalmente una molécula de casquete terminal en el extremo 3', el extremo 5', o tanto el extremo 3' como 5' de la cadena de sentido; y en donde la cadena de antisentido comprende de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 o más enlaces internucleotídicos de fosforotioato, de forma específica aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más; o uno o más nucleótidos 2'-desoxi, 2'-0-metilo, 2'-desoxi-2'-fluoro, 2'-0-trifluorometilo, 2'-0-etil- trifluorometoxi, 2'-0-difluorometoxi-etoxi, 4'-tio (por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más); o uno o más nucleótidos de base universal modificados (por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más); y opcionalmente una molécula de casquete terminal en el extremo 3', el extremo 5', o tanto el extremo 3' como 5' de la cadena de antisentido. En otra modalidad, uno o más nucleótidos de pirimidina, por ejemplo aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más, de la cadena de sentido o antisentido de ANci, están modificados químicamente con nucleótidos 2'-desoxi, 2'-0-metilo, 2'-O-trifluorometilo, 2'-0-etil-trifluorometoxi, 2'-0-difluorometoxi-etoxi, 4'-tio o 2'-desoxi-2'-fluoro, con o sin uno o más enlaces internucleotídicos de fosforotioato, por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más; o está presente una molécula de casquete terminal en el extremo 3', el extremo 5', o tanto el extremo 3' como 5' en la misma cadena o en una cadena diferente.

En otra modalidad, la invención presenta una molécula de ANci, en donde la cadena de sentido comprende de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 o más enlaces internucleotídicos de fosforotioato, de forma específica aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5 o más; o uno o más nucleótidos 2'-desox¡, 2'-0-metilo, 2'-desoxi-2'-fluoro, 2'-0-trifluorometilo, 2'-0-etil-trifluorometoxi, 2'-0-difluorometoxi-etoxi, 4'-tio (por ejemplo, aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más); o uno o más nucleótidos de base universal modificados (por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más); y opcionalmente una molécula de casquete terminal en el extremo 3', el extremo 5', o tanto el extremo 3' como 5' de la cadena de sentido; y en donde la cadena de antisentido comprende de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 o más enlaces internucleotídicos de fosforotioato, de forma específica aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5 o más; o uno o más nucleótidos 2'-desoxi, 2'-0-metilo, 2'-desoxi-2'-fluoro, 2'-0-trifluorometilo, 2'-0-etil-trifluorometoxi, 2'-0-difluorometoxi-etoxi, 4'-tio (por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más); o uno o más nucleótidos de base universal modificados (por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más); y opcionalmente una molécula de casquete terminal en el extremo 3', el extremo 5', o tanto el extremo 3' como 5' de la cadena de antisentido. En otra modalidad, uno o más nucleótidos de pirimidina de la cadena de sentido o antisentido de ANci, por ejemplo aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más, están modificados químicamente con nucleótidos 2'-desoxi, 2'-0-metilo, 2'-0-trifluorometilo, 2'-0-etil-trifluorometoxi, 2'-0-difluorometoxi-etoxi, 4'-tio o 2'-desoxi-2'-fluoro, con o sin aproximadamente 1 a aproximadamente 5 enlaces internucleotídicos de fosforotioato, por ejemplo aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5 o más; o está presente una molécula de casquete terminal en el extremo 3', el extremo 5', o tanto el extremo 3' como 5' en la misma cadena o en una cadena diferente.

En una modalidad, la invención presenta una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) químicamente modificado que tiene de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 o más enlaces internucleotídicos de fosforotioato (de forma específica, aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, o más), en cada cadena de la molécula de ANci.

En otra modalidad, la invención presenta una molécula de ANci que comprende enlaces internucleotídicos 2 -5'. Los enlaces internucleotídicos 2 -5' pueden estar en el extremo 3', el extremo 5', o tanto en el extremo 3' como 5', de una o las dos cadenas de la secuencia del ANci. Además, los enlaces internucleotídicos 2'-5' pueden estar presentes en otras posiciones dentro de una o las dos cadenas de secuencia de ANci, por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más, inclusive cada enlace internucleotídico de un nucleótido de pirimidina en una o las dos cadenas de la molécula de ANci, puede comprender un enlace internucleotídico 2'-5'; o aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más incluyendo cada enlace internucleotídico de un nucleótido de purina en una o las dos cadenas de la molécula de ANci, pueden comprender un enlace internucleotídico 2'-5'.

En otra modalidad, una molécula de ANci químicamente modificado de la invención comprende un dúplex que tiene dos cadenas, una de las cuales o las dos pueden estar modificadas químicamente, en donde cada cadena es independientemente de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 nucleótidos de longitud (por ejemplo, aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o 30), en donde el dúplex tiene de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 pares de bases (por ejemplo, aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o 30), y en donde la modificación química comprende una estructura que tiene cualquiera de las fórmulas l-VII. Por ejemplo, una molécula de ANci químicamente modificada ejemplar de la invención comprende un dúplex que tiene dos cadenas, una de las cuales o las dos se pueden modificar químicamente con una modificación química que tiene cualquiera de las fórmulas l-VII o cualquier combinación de las mismas, en donde cada cadena consiste en aproximadamente 21 nucleótidos, cada una teniendo un tramo saliente 3' terminal de dos nucleótidos, y en donde el dúplex tiene aproximadamente 19 pares de bases. En otra modalidad, una molécula de ANci de la invención comprende una estructura de horquilla de una sola cadena, en donde el ANci es de aproximadamente 36 a aproximadamente 70 nucleótidos de longitud (por ejemplo, aproximadamente 36, 40, 45, 50, 55, 60, 65, o 70), que tiene de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 pares de bases (por ejemplo, aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o 30), y en donde el ANci puede incluir una modificación química que comprende una estructura que tiene cualquiera de las fórmulas l-VII, o cualquier combinación de las mismas. Por ejemplo, una molécula de ANci químicamente modificada ejemplar de la invención comprende un oligonucleótido lineal que tiene de aproximadamente 42 a aproximadamente 50 nucleótidos (por ejemplo, aproximadamente 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, o 50), que están modificados químicamente con una modificación química que tiene cualquiera de las fórmulas l-VII o cualquier combinación de las mismas, en donde el oligonucleótido lineal forma una estructura de horquilla que tiene de aproximadamente 19 a aproximadamente 21 pares de bases (por ejemplo 19, 20, o 21) y un tramo saliente 3' terminal de 2 nucleótidos. En otra modalidad, una molécula lineal de horquilla de ANci de la invención contiene un motivo de tallo y asa, en donde la porción de asa de la molécula de ANci es biodegradable. Por ejemplo, una molécula lineal de ANci de horquilla de la invención se diseña de tal manera que la degradación in vivo de la porción de asa de la molécula de ANci puede generar una molécula de ANci de doble cadena con tramos salientes 3' terminales, tales como porciones salientes de nucleótidos 3' terminales que comprenden aproximadamente 2 nucleótidos.

En otra modalidad, una molécula de ANci de la invención comprende una estructura de horquilla, en donde el ANci es de aproximadamente 25 a aproximadamente 50 nucleótidos de longitud (por ejemplo, aproximadamente 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, o 50), que tiene de aproximadamente 3 a aproximadamente 25 pares de bases (por ejemplo, aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, o 25), y en donde el ANci puede incluir una o más modificaciones químicas que comprenden una estructura que tiene cualquiera de las fórmulas l-VII o cualquier combinación de las mismas. Por ejemplo, una molécula de ANci químicamente modificada ejemplar de la invención comprende un oligonucleótido lineal que tiene de aproximadamente 25 a aproximadamente 35 nucleótidos (por ejemplo, aproximadamente 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, o 35), que están modificados químicamente con una o más modificaciones químicas que tienen cualquiera de las fórmulas l-VII o cualquier combinación de las mismas, en donde el oligonucleótido lineal forma una estructura de horquilla que tiene de aproximadamente 3 a aproximadamente 25 pares de bases (por ejemplo, aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, o 25), y un grupo fosfato 5'-terminal que puede estar modificado químicamente como se describe en la presente (por ejemplo, un grupo fosfato 5'-terminal que tiene la fórmula IV). En otra modalidad, una molécula lineal de ANci de horquilla de la invención contiene un motivo de tallo y asa, en donde la porción de asa de la molécula de ANci es biodegradable. En una modalidad, una molécula lineal de ANci de horquilla de la invención comprende una porción de asa que comprende un enlazador no nucleotídico.

En otra modalidad, una molécula de ANci de la invención comprende una estructura de horquilla asimétrica, en donde el ANci es de aproximadamente 25 a aproximadamente 50 nucleótidos de longitud (por ejemplo, aproximadamente 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, o 50), que tiene de aproximadamente 3 a aproximadamente 25 pares de bases (por ejemplo, aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, o 25), y en donde el ANci puede incluir una o más modificaciones químicas que comprenden una estructura que tiene cualquiera de las fórmulas l-VII o cualquier combinación de las mismas. Por ejemplo, una molécula de ANci químicamente modificada ejemplar de la invención comprende un oligonucleótido lineal que tiene de aproximadamente 25 a aproximadamente 35 nucleótidos (por ejemplo, aproximadamente 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, o 35), que están modificados químicamente con una o más modificaciones químicas que tienen cualquiera de las fórmulas l-VII o cualquier combinación de las mismas, en donde el oligonucleótido lineal forma una estructura de horquilla asimétrica que tiene de aproximadamente 3 a aproximadamente 25 pares de bases (por ejemplo, aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, o 25), y un grupo fosfato 5'-terminal que puede estar modificado químicamente como se describe en la presente (por ejemplo, un grupo fosfato 5'-terminal que tiene la fórmula IV). En una modalidad, una molécula de horquilla asimétrica de ANci de la invención contiene un motivo de tallo y asa, en donde la porción de asa de la molécula de ANci es biodegradable. En otra modalidad, una molécula de horquilla asimétrica de ANci de la invención comprende una porción de asa que comprende un enlazador no nucleotídico.

En otra modalidad, una molécula de ANci de la invención comprende una estructura de doble cadena asimétrica que tiene cadenas de polinucleótido separadas que comprenden la regiones de sentido y antisentido, en donde la región de antisentido es de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 nucleótidos de longitud (por ejemplo, aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o 30), en donde la región de sentido es de aproximadamente 3 a aproximadamente 25 nucleótidos de longitud (por ejemplo, aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, o 25), en donde la región de sentido y la región de antisentido tienen por lo menos 3 nucleótidos complementarios, y en donde el ANci puede incluir una o más modificaciones químicas que comprenden una estructura que tiene cualquiera de las fórmulas l-VI I o cualquier combinación de las mismas. Por ejemplo, una molécula de ANci químicamente modificada ejemplar de la invención comprende una estructura de doble cadena asimétrica que tiene cadenas de polinucleótido separadas que comprenden regiones de sentido y antisentido, en donde la región de antisentido es de aproximadamente 18 a aproximadamente 23 nucleótidos de longitud (por ejemplo, aproximadamente 18, 19, 20, 21 , 22, o 23), y en donde la región de sentido es de aproximadamente 3 a aproximadamente 15 nucleótidos de longitud (por ejemplo, aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, o 15), en donde la región de sentido y la región de antisentido tienen por lo menos 3 nucleótidos complementarios, y en donde el ANci puede incluir una o más modificaciones químicas que comprenden una estructura que tiene cualquiera de las fórmulas l-VII o cualquier combinación de las mismas. En otra modalidad, la molécula de ANci de doble cadena asimétrica también puede tener un grupo fosfato 5'-terminal que puede estar modificado químicamente como se describe en la presente (por ejemplo un grupo fosfato 5'-terminal que tiene la fórmula IV).

En otra modalidad, una molécula de ANci de la invención comprende una molécula de ácido nucleico circular, en donde el ANci es de aproximadamente 38 a aproximadamente 70 nucleótidos de longitud (por ejemplo, aproximadamente 38, 40, 45, 50, 55, 60, 65, o 70), que tiene de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 pares de bases (por ejemplo, aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o 30), y en donde el ANci puede incluir una modificación química que comprende una estructura que tiene cualquiera de las fórmulas l-VII o cualquier combinación de las mismas. Por ejemplo, una molécula de ANci químicamente modificada ejemplar de la invención comprende un oligonucleótido circular que tiene de aproximadamente 42 a aproximadamente 50 nucleótidos (por ejemplo, aproximadamente 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, o 50), que están modificados químicamente con una modificación química que tiene cualquiera de las fórmulas l-VII o cualquier combinación de las mismas, en donde el oligonucleótido circular forma una estructura en forma de pesa que tiene aproximadamente 19 pares de bases y 2 asas.

En otra modalidad, una molécula de ANci circular de la invención contiene dos motivos de asa, en donde una o las dos porciones de asa de la molécula de ANci son biodegradables. Por ejemplo, una molécula de ANci circular de la invención está diseñada de tal manera que la degradación in vivo de las porciones de asa de la molécula de ANci puede generar una molécula de ANci de doble cadena con tramos salientes 3'-terminales, tales como tramos salientes 3'-terminales de nucleótido que comprenden aproximadamente 2 nucleótidos.

En una modalidad, una molécula de ANci de la invención comprende por lo menos una porción abásica (por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más), por ejemplo un compuesto que tiene la fórmula V: en donde cada uno de R3, R4, R5, R6, R7, Re, R10, R11 , R12 y R13 es independientemente H, OH, alquilo, alquilo sustituido, alcarilo o aralquilo, F, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, OCH3, OCN, O-alquilo, S-alquilo, N-alquilo, O-alquenilo, S-alquenilo, N-alquenilo, SO-alquilo, alquil-OSH, alquil-OH, O-alquil-OH, O-alquil-SH, S-alquil-OH, S-alquil-SH, alquil-S-alquilo, alquil-O-alquilo, ONO2, NO2, N3, NH2, aminoalquilo, aminoácido, aminoacilo, ONH2, O-aminoalquilo, O-aminoácido, O-aminoacilo, heterocicloalquilo, heterocicloalcarilo, aminoalquilamino, polialquilamino, sililo sustituido, o un grupo que tiene cualquiera de las fórmulas I, II, III, IV, V, VI o VII, cualquiera de las cuales puede estar incluida en la estructura de la molécula de ANci o servir como punto de unión con la molécula de ANci; R9 es O, S, CH2, S=O, CHF, o CF2. En una modalidad, R3 o R7 comprende una porción conjugada y un enlazador (por ejemplo, un enlazador nucleotídico o no nucleotídico como se describe aquí o se conoce de otra manera en la técnica). Los ejemplos no limitativos de porciones conjugadas incluyen ligandos para receptores celulares, tales como péptidos derivados de ligandos de proteína naturales; secuencias de localización de proteína que incluyen secuencias de código ZIP celulares; anticuerpos; aptámeros de ácido nucleico, vitaminas y otros cofactores tales como folato y N-acetilgalactosamina; polímeros tales como polietilenglicol (PEG); fosfolípidos; colesterol; esteroides y poliaminas, tales como PEI, espermina o espermidina.

En una modalidad, una molécula de ANci de la invención comprende por lo menos una porción abásica invertida (por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más), por ejemplo un compuesto que tiene la fórmula VI: en donde cada uno de R3, R4, Rs, Re, R7, Rs, R10, Rn , R12 y R13 es independientemente H, OH, alquilo, alquilo sustituido, alcarilo o aralquilo, F, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, OCH3, OCN, O-alquilo, S-alquilo, N-alquilo, O-alquenilo, S-alquenilo, N-alquenilo, SO-alquilo, alquil-OSH, alquil-OH, O-alquil-OH, O-alquil-SH, S-alquil-OH, S-alquil-SH, alquil-S-alquilo, alquil-O-alquilo, ONO2, NO2, N3, NH2, aminoalquilo, aminoácido, aminoacilo, ONH2, O-aminoalquilo, O-aminoácido, O-aminoacilo, heterocicloalquilo, heterocicloalcarilo, aminoalquilamino, polialquilamino, sililo sustituido, o un grupo que tiene cualquiera de las fórmulas I, II, III, IV, V, VI o VII, cualquiera de las cuales puede estar incluida en la estructura de la molécula de ANci o servir como punto de unión con la molécula de ANci; Rg es O, S, Ch^, S=0, CHF, o CF2, y cualquiera de R2, R3, Re o R13 sirve como punto de unión con la molécula de ANci de la invención. En una modalidad, R3 o R7 comprende una porción conjugada y un enlazador (por ejemplo, un enlazador nucleotídico o no nucleotídico como se describe aquí o se conoce de otra manera en la técnica). Los ejemplos no limitativos de las porciones conjugadas incluyen ligandos para receptores celulares, tales como péptidos derivados de ligandos de proteína naturales; secuencias de localización de proteína que incluyen secuencias de código ZIP celulares; anticuerpos; aptámeros de ácido nucleico, vitaminas y otros cofactores tales como folato y N-acetilgalactosamina; polímeros tales como polietilenglicol (PEG); fosfolípidos; colesterol; esteroides y poliaminas, tales como PEI, espermina o espermidina.

En otra modalidad, una molécula de ANci de la invención comprende por lo menos una porción de polialquilo sustituido (por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más), por ejemplo un compuesto que tiene la fórmula VII: en donde cada n es independientemente un entero de 1 a 12, cada R-i , R2 y R3 es independientemente H, OH, alquilo, alquilo sustituido, alcarilo o aralquilo, F, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, OCH3, OCN, O-alquilo, S-alquilo, N-alquilo, O-alquenilo, S-alquenilo, N-alquenilo, SO-alquilo, alquil-OSH, alquil-OH, O-alquil-OH, O-alquil-SH, S-alquil-OH, S-alquil-SH, alquil-S-alquilo, alquil-O-alquilo, ONO2, NO2, N3, NH2, aminoalquilo, aminoácido, aminoacilo, ONH2, O-aminoalquilo, O-aminoácido, O-aminoacilo, heterocicloalquilo, heterocicloalcarilo, aminoalquilamino, polialquilamino, sililo sustituido, o un grupo que tiene cualquiera de las fórmulas I, II, III, IV, V, VI o VII, cualquiera de las cuales puede estar incluida en la estructura de la molécula de ANci o sirve como punto de unión con la molécula de ANci. En una modalidad, R3 o R1 comprende una porción conjugada y un enlazador (por ejemplo, un enlazador nucleotídico o no nucleotídico como se describe aquí o se conoce de otra manera en la técnica). Los ejemplos no limitativos de las porciones conjugadas incluyen ligandos para receptores celulares, tales como péptidos derivados de ligandos de proteína naturales; secuencias de localización de proteína que incluyen secuencias de código ZIP celulares; anticuerpos; aptámeros de ácido nucleico, vitaminas y otros cofactores tales como folato y N-acetilgalactosamina; polímeros tales como polietilenglicol (PEG); fosfolípidos; colesterol; esteroides y poliaminas, tales como PEI, espermina o espermidina.

Por "secuencias de código ZIP" se entiende cualquier secuencia de péptido o proteína que está implicada en el transporte mediado por señalización topogénica celular (véase por ejemplo Ray et al., 2004, Science, 306(1501): 1505).

Cada nucleótido dentro de la molécula de ANci de doble cadena puede tener independientemente una modificación química que comprende la estructura de cualquiera de las fórmulas l-VIII. De esta manera, en una modalidad, una o más las posiciones de nucleótido de una molécula de ANci de la invención comprenden una modificación química que tiene la estructura de cualquiera de las fórmulas l-VII o cualquier otra modificación. En una modalidad, cada posición de nucleótido de una molécula de ANci de la invención comprende una modificación química que tiene la estructura de cualquiera de las fórmulas l-VII o cualquier otra modificación de la presente.

En una modalidad, una o más las posiciones de nucleótido de una o las dos cadenas de una molécula de ANci de doble cadena de la invención, comprenden una modificación química que tiene la estructura de cualquiera de las fórmulas l-VII o cualquier otra modificación. En una modalidad, cada posición de nucleótido de una o las dos cadenas de una molécula de ANci de doble cadena de la invención comprende una modificación química que tiene la estructura de cualquiera de las fórmulas I-VII o cualquier otra modificación de la presente.

En otra modalidad, la invención presenta un compuesto que tiene la fórmula VII, en donde Ri y R2 son grupos hidroxilo (OH), n= 1 , y R3 comprende O y es el punto de unión con el extremo 3', el extremo 5', o tanto el extremo 3' como 5' de una o las dos cadenas de una molécula de ANci de doble cadena de la invención, o con una molécula de ANci de una sola cadena de la invención. Esta modificación se denomina en la presente "glicerilo" (por ejemplo, la modificación 6 de la figura 7).

En otra modalidad, un nucleósido o no nucleósido químicamente modificado de la invención (por ejemplo, una porción que tiene cualquiera de las fórmulas V, VI o VII), está en el extremo 3', el extremo 5', o tanto el extremo 3' como el extremo 5' de una molécula de ANci de la invención. Por ejemplo, un nucleósido o no nucleósido químicamente modificado (por ejemplo, una porción que tiene la fórmula V, VI o VII) puede estar presente en el extremo 3', el extremo 5', o tanto el extremo 3' como 5' de la cadena de antisentido, la cadena de sentido, o tanto la cadena de antisentido como la de sentido de la molécula de ANci. En una modalidad, el nucleósido o no nucleósido químicamente modificado (por ejemplo, una porción que tiene la fórmula V, VI o VII), está presente en el extremo 5' y el extremo 3' de la cadena de sentido, y en el extremo 3' de la cadena de antisentido de una molécula de ANci de doble cadena de la invención. En una modalidad, el nucleósido o no nucleósido químicamente modificado (por ejemplo, una porción que tiene la fórmula V, VI o VII), está presente en la posición terminal del extremo 5' y el extremo 3' de la cadena de sentido, y en el extremo 3' de la cadena de antisentido de una molécula de ANci de doble cadena de la invención. En una modalidad, el nucleósido o no nucleósido químicamente modificado (por ejemplo, una porción que tiene la fórmula V, VI o VII), está presente en las dos posiciones terminales del extremo 5' y el extremo 3' de la cadena de sentido, y en el extremo 3' de la cadena de antisentido de una molécula de ANci de doble cadena de la invención. En una modalidad, el nucleósido o no nucleósido químicamente modificado (por ejemplo, una porción que tiene la fórmula V, VI o VII), está presente en la penúltima posición del extremo 5' y el extremo 3' de la cadena de sentido, y en el extremo 3' de la cadena de antisentido de una molécula de ANci de doble cadena de la invención. Además, puede estar presente una porción que tiene la fórmula VII en el extremo 3' o el extremo 5' de una molécula de ANci de horquilla como la que aquí se describe.

En otra modalidad, una molécula de ANci de la invención comprende un residuo abásico que tiene la fórmula V o VI, en donde el residuo abásico que tiene la fórmula V o VI, está unido a la construcción de ANci en una configuración 3'-3', 3'-2', 2'-3', o 5 -5', tal como en el extremo 3', el extremo 5', o tanto el extremo 3' como 5', de una o las dos cadenas de ANci.

En una modalidad, una molécula de ANci de la invención comprende uno o más nucleótidos de ácido nucleico cerrado (LNA) (por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más), por ejemplo en el extremo 5', el extremo 3', tanto el extremo 5' como 3', o en cualquier combinación de los mismos, de la molécula de ANci.

En una modalidad, una molécula de ANci de la invención comprende uno o más 4'-tio-nucleótidos (por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más), por ejemplo, en el extremo 5', el extremo 3', tanto el extremo 5' como 3', o en cualquier combinación de los mismos, de la molécula de ANci.

En otra modalidad, una molécula de ANci de la invención comprende uno o más nucleótidos acíclicos (por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más), por ejemplo, en el extremo 5', el extremo 3', tanto el extremo 5' como 3', o en cualquier combinación de los mismos, de la molécula de ANci.

En una modalidad, una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) químicamente modificado de la invención comprende una cadena de sentido o región de sentido que tiene una o más modificaciones (por ejemplo, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 , 11 , 12, 13 ,14 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o más) de 2 -O-alquilo (por ejemplo 2'-0-metilo), 2'-desoxi-2'-fluoro, 2'-desoxi, FANA, o modificaciones químicas abásicas, o cualquier combinación de las mismas.

En una modalidad, una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) químicamente modificado de la invención comprende una cadena de antisentido o región de antisentido que tiene una o más modificaciones (por ejemplo, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 , 11 , 12, 13 ,14 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o más) de 2'-0-alquilo (por ejemplo 2'-0-metilo), 2'-desoxi-2'-fluoro, 2'-desoxi, FANA, o modificaciones químicas abásicas, o cualquier combinación de las mismas.

En una modalidad, una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) químicamente modificado de la invención comprende una cadena de sentido o región de sentido y una cadena de antisentido o región de antisentido, cada una teniendo una o más modificaciones (por ejemplo, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 , 11 , 12, 13 ,14 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o más) de 2 -O-alquilo (por ejemplo 2'-0-metil), 2'-desoxi-2'-fluoro, 2'-desoxi, FANA, o modificaciones químicas abásicas, o cualquier combinación de las mismas.

En una modalidad, la invención presenta una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) químicamente modificado de la invención que comprende una región de sentido, en donde cualquier nucleótido de pirimidina presente en la región de sentido (por ejemplo, uno o más, o todos) es un nucleótido de 2'-desoxi-2'-fluoro-pirimidina (por ejemplo, en donde todos los nucleótidos de pirimidina son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro-pirimidina, o alternativamente una pluralidad de nucleótidos de pirimidina (es decir, más de uno) son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro-pirimidina).

En una modalidad, la invención presenta una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) químicamente modificado de la invención que comprende una región de sentido, en donde cualquier nucleótido de pirimidina presente en la región de sentido (por ejemplo, uno o más, o todos) es un nucleótido de FANA pirimidina (por ejemplo, en donde todos los nucleótidos de pirimidina son nucleótidos de FANA pirimidina, o alternativamente una pluralidad de los nucleótidos de pirimidina (es decir, más de uno) son nucleótidos de FANA pirimidina).

En una modalidad, la invención presenta una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) químicamente modificado de la invención que comprende una región de antisentido, en donde cualquier nucleótido de pirimidina presente en la región de antisentido (por ejemplo, uno o más, o todos) es un nucleótido de 2'-desoxi-2'-fluoro-pirimidina (por ejemplo, en donde todos los nucleótidos de pirimidina son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro-pirimidina, o alternativamente una pluralidad de los nucleótidos de pirimidina (es decir, más de uno) son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro-pirimidina).

En una modalidad, la invención presenta una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) químicamente modificado de la invención que comprende una región de sentido y una región de antisentido, en donde cualquier nucleótido de pirimidina presente en la región de sentido y la región de antisentido (por ejemplo, uno o más, o todos), es un nucleótido de 2'-desoxi-2'-fluoro-pirimidina (por ejemplo, en donde todos los nucleótidos de pirimidina son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro-pirimidina, o alternativamente una pluralidad de nucleótidos de pirimidina (es decir, más de uno) son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro-pirim¡dina).

En una modalidad, la invención presenta una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) químicamente modificado de la invención, que comprende una región de sentido, en donde cualquiera de los nucleótidos de purina presentes en la región de sentido (por ejemplo uno o más, o todos) son nucleótidos de 2'-desoxi-purina (por ejemplo, en donde todos los nucleótidos de purina son nucleótidos de 2'-desoxi-purina, o alternativamente una pluralidad de los nucleótidos de purina (es decir, más de uno) son nucleótidos de 2'-desoxipurina).

En una modalidad, la invención presenta una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) químicamente modificado de la invención, que comprende una región de antisentido en donde cualquier nucleótido de purina en la región de antisentido (por ejemplo uno o más, o todos) es un nucleótido de 2'-0-metil-purina (por ejemplo, en donde todos los nucleótidos de purina son nucleótidos de 2'-0-metil-purina, o alternativamente una pluralidad de nucleótidos de pirimidina (es decir, más de uno) son nucleótidos de 2'-0-metil-purina).

En una modalidad, la invención presenta una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) químicamente modificado de la invención, que comprende una región de sentido en donde cualquier nucleótido de pirimidina presente en la región de sentido (por ejemplo uno o más, o todos) es un nucleótido de 2'-desoxi-2'-fluoro-pir¡midina (por ejemplo, en donde todos los nucleótidos de pirimidina son nucleótidos de 2'-desox¡-2'-fluoro-pirimidina, o alternativamente una pluralidad de nucleótidos de pirimidina (es decir, más de uno) son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro-pirimidina), y en donde cualquier nucleótido de purina presente en la región de sentido (uno o más, o todos) es un nucleótido de 2'-desoxi-purina (por ejemplo, todos los nucleótidos de purina son nucleótidos de 2'-desoxi-purina, o alternativamente una pluralidad de nucleótidos de purina (es decir, más de uno) son nucleótidos de 2'-desox¡-purina).

En una modalidad, la invención presenta una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) químicamente modificado de la invención, que comprende una región de sentido en donde cualquier nucleótido de pirimidina presente en la región de sentido (por ejemplo, uno o más, o todos) son nucleótidos de 2'-desoxl-2'-fluoro, 4'-tio, 2'-0-trifluorometil, 2'-0-etil-trifluorometoxi, o 2'-0-difluorometoxi-etoxi- pirimidina (por ejemplo, en donde todos los nucleótidos de pirimidina son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro, 4'-tio, 2'-0-trifluorometil, 2'-0-etil-trifluorometoxi, o 2'-0-difluorometoxi-etoxi- pirimidina, o alternativamente una pluralidad de nucleótidos de pirimidina (es decir, más de uno) son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro, 4'-tio, 2'-0-trifluorometil, 2'-O-etil-trifluorometoxi, o 2'-0-difluorometoxi-etoxi-pirimidina), y en donde cualquier nucleótido de purina presente en la región de sentido (por ejemplo, uno o más) es un nucleótido de 2'-desoxi-purina (por ejemplo, en donde todos los nucleótidos de purina son nucleótidos de 2'-desoxi-purina, o alternativamente una pluralidad de nucleótidos de purina (es decir, más de uno) son nucleótidos de 2'-desoxi-purina), en donde cualquier nucleótido que comprende un tramo saliente de nucleótido 3' terminal que está presente en dicha región de sentido, es un 2'-desoxi-nucleótido.

En una modalidad, la invención presenta una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) químicamente modificado de la invención, que comprende una región de sentido en donde cualquier nucleótido de pirimidina presente en la región de sentido (por ejemplo, uno o más, o todos) es un nucleótido de 2'-desoxi-2'-fluoro, 4'-tio, 2'-0-trifluorometil, 2'-0-etil-trifluorometoxi, o 2'-0-difluorometoxi-etoxi- pirimidina (por ejemplo, en donde todos los nucleótidos de pirimidina son nucleótidos de 2'-desox¡-2'-fluoro, 4'-tio, 2'-0-trifluorometil, 2'-0-etil-trifluorometoxi, o 2'-0-difluorometoxi-etoxi- pirimidina, o alternativamente una pluralidad de nucleótidos de pirimidina (es decir, más de uno) son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro, 4'-tio, 2'-0-trifluorometil, 2'-0-etil-trifluorometoxi, o 2'-0-difluorometoxi-etoxi-pirimidina), y en donde cualquier nucleótido de purina presente en la región de sentido (por ejemplo, uno o más, o todos) son nucleótidos de 2'-0-metil-purina (por ejemplo, en donde todos los nucleótidos de purina son nucleótidos de 2'-O-metil, 4'-tio, 2'-0-trifluorometil, 2'-0-etil-trifluorometoxi, o 2 -0-difluorometoxi-etoxi- purina, o alternativamente una pluralidad de nucleótidos de purina (es decir, más de uno) son nucleótidos de 2'-0-metil, 4'-tio, 2'-0-trifluorometil, 2'-0-etil-trifluorometoxi, o 2'-0-difluorometoxi-etoxi-purina).

En una modalidad, la invención presenta una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) químicamente modificado de la invención, que comprende una región de sentido en donde cualquier nucleótido de pirimidina presente en la región de sentido (por ejemplo, uno o más, o todos) es un nucleótido de 2'-desoxi-2'-fluoro, 4'-tio, 2'-0-trifluorometil, 2'-0-etil-trifluorometox¡, o 2'-0-difluorometoxi-etoxi- pirimidina (por ejemplo, en donde todos los nucleótidos de pirimidina son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro, 4'-tio, 2'-0-trifluorometil, 2'-0-etil-trifluorometoxi, o 2'-0-difluorometox¡-etoxi- pirimidina, o alternativamente una pluralidad de nucleótidos de pirimidina (es decir, más de uno) son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro, 4'-tio, 2'-0-trifluorometil, 2'-0-etil-trifluorometoxi, o 2'-0-difluorometoxi-etoxi-pirimidina), en donde cualquier nucleótido de purina presente en la región de sentido (por ejemplo, uno o más, o todos) es un nucleótido de 2'-0-metil, 4'-tío, 2'-0-trifluorometil, 2'-0-etil-trifluorometoxi, o 2'-0-difluorometoxi-etoxi-purina (por ejemplo, en donde todos los nucleótidos de purina son nucleótidos de 2'-0-metil, 4'-tio, 2'-0-trifluorometil, 2'-0-etil-trifluorometoxi, o 2'-0-difluorometoxi-etoxi- purina, o alternativamente una pluralidad de nucleótidos de purina (es decir, más de uno) son nucleótidos de 2'-0-metil, 4'-tio, 2'-0-trifluorometil, 2'-0-etil-trifluorometoxi, o 2'-0-difluorometoxi-etox¡- purina), y en donde cualquier nucleótido que comprende un tramo saliente de nucleótido 3' terminal que está presente en dicha región de sentido es un 2'-desoxi-nucleótido.

En una modalidad, la invención presenta una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) químicamente modificado de la invención, que comprende una región de antisentido en donde cualquier nucleótido de pirimidina presente en la región de antisentido (por ejemplo, uno o más, o todos) es un nucleótido de 2'-desoxi-2'-fluoro, 4'-tio, 2'-0-trifluorometil, 2'-0-etil-trifluorometoxi, o 2'-0-difluorometoxi-etoxi- pirimidina (por ejemplo, en donde todos los nucleótidos de pirimidina son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro, 4'-tio, 2'-0-tr¡fluorometil, 2'-0-etil-tr¡fluorometoxi, o 2'-0-difluorometoxi-etoxi- pirimidina, o alternativamente una pluralidad de nucleótidos de pirimidina (es decir, más de uno) son nucleótidos de 2'-desox¡- 2'-fluoro, 4'-tio, 2'-O-trifluorometil, 2'-0-etil-trifluorometox¡, o 2'-0-difluorometoxi-etoxi- pirimidina), y en donde cualquier nucleótido de purina presente en la región de antisentido (por ejemplo, uno o más, o todos) es un nucleótido de 2'-0-metil, 4 -tio, 2'-0-trifluorometil, 2'-0-etil-trifluorometoxi, o 2'-O-difluorometoxi-etoxi- purina (por ejemplo, en donde todos los nucleotidos de purina son nucleotidos de 2'-O-metil, 4'-tio, 2'-0-trifluorometil, 2'-O-etil-trifluorometoxi, o 2'-O-difluorometoxi-etoxi- purina, o alternativamente una pluralidad de nucleotidos de purina (es decir, más de uno) son nucleotidos de 2'-0-metil, 4'-tio, 2'-O-trifluorometil, 2'-O-etil-trifluorometoxi, o 2'-O-difluorometoxi-etoxi- purina).

En una modalidad, la invención presenta una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) químicamente modificado de la invención, que comprende una región de antisentido en donde cualquier nucleótido de pirimidina presente en la región de antisentido (por ejemplo, uno o más, o todos) es un nucleótido de 2'-desoxi-2'-fluoro, 4'-tio, 2'-O-trifluorometil, 2'-O-etil-trifluorometoxi, o 2'-O-difluorometoxi-etoxi- pirimidina (por ejemplo, en donde todos los nucleotidos de pirimidina son nucleotidos de 2'-desoxi-2'-fluoro, 4'-tio, 2'-0-trifluorometil, 2'-O-etil-trifluorometoxi, o 2'-0-difluorometoxi-etoxi- pirimidina, o alternativamente una pluralidad de nucleotidos de pirimidina (es decir, más de uno) son nucleotidos de 2'-desoxi-2'-fluoro, 4'-tio, 2'-0-trifluorometil, 2'-O-etil-trifluorometoxi, o 2'-0-difluorometoxi-etoxi- pirimidina), en donde cualquier nucleótido de purina presente en la región de antisentido (por ejemplo, uno o más, o todos) es un nucleótido de 2'-0-metil, 4'-tio, 2'-0-trifluorometil, 2'-0-etil-trifluorometoxi, o 2'-O-difluorometoxi-etoxi- purina (por ejemplo, en donde todos los nucleótidos de purina son nucleótidos de 2 -O-metil, 4'-tio, 2'-0-trifluorometil, 2'-0-etil-trifluorometoxi, o 2'-0-difluorometoxi-etoxi- purina, o alternativamente una pluralidad de nucleótidos de purina (es decir, más de uno) son nucleótidos de 2'-0-metil, 4'-tio, 2'-0-trifluorometil, 2'-0-etil-trifluorometoxi, o 2'-0-difluorometoxi-etoxi- purina), y en donde cualquier nucleótido que comprende un tramo saliente de nucleótido 3' terminal que está presente en dicha región de antisentido es un 2'-desoxi-nucleótido.

En una modalidad, la invención presenta una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) químicamente modificado de la invención, que comprende una región de antisentido en donde cualquier nucleótido de pirimidina presente en la región de antisentido (por ejemplo, uno o más, o todos) es un nucleótido de 2'-desoxi-2'-fluoro, 4'-tio, 2'-0-trifluorometil, 2'-0-etil-trifluorometoxi, o 2'-0-difluorometoxi-etoxi- pirimidina (por ejemplo, en donde todos los nucleótidos de pirimidina son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro, 4'-tio, 2'-0-trifluorometil, 2'-0-etil-trifluorometoxi, o 2'-0-difluorometoxi-etoxi- pirimidina, o alternativamente una pluralidad de nucleótidos de pirimidina (es decir, más de uno) son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro, 4'-tio, 2'-0-trifluorometil, 2'-0-etil-trifluorometoxi, o 2'-0-difluorometoxi-etoxi- pirimidina), y en donde cualquier nucleótido de purina presente en la región de antisentido (por ejemplo, uno o más, o todos) es un nucleótido de 2'-desoxi-purina (por ejemplo, en donde todos los nucleótidos de purina son nucleótidos de 2'-desoxi-purina, o alternativamente una pluralidad de nucleótidos de purina (es decir, más de uno) son nucleótidos de 2'-desoxi-purina).

En una modalidad, la invención presenta una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) químicamente modificado de la invención, que comprende una región de antisentido en donde cualquier nucleótido de pirimidina presente en la región de antisentido (por ejemplo, uno o más, o todos) es un nucleótido de 2'-desoxi-2'-fluoro, 4'-tio, 2'-0-trifluorometil, 2'-0-etil-trifluorometoxi, o 2'-0-difluorometoxi-etoxi- pirimidina (por ejemplo, en donde todos los nucleótidos de pirimidina son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro, 4'-tio, 2'-0-trifluorometil, 2'-0-etil-trifluorometoxi, o 2 -O-difluorometoxi-etoxi- pirimidina, o alternativamente una pluralidad de nucleótidos de pirimidina (es decir, más de uno) son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro, 4'-tio, 2'-0-trifluorometil, 2'-0-etil-trifluorometoxi, o 2 -0-difluorometoxi-etoxi- pirimidina), y en donde cualquier nucleótido de purina presente en la región de antisentido (por ejemplo, uno o más, o todos) es un nucleótido de 2'-0-metil, 4'-tio, 2'-0-trifluorometil, 2'-O-etil-trifluorometoxi, o 2'-O-difluorometoxi-etoxi- purina (por ejemplo, en donde todos los nucleótidos de purina son nucleótidos de 2'-O-metil, 4'-tio, 2'-O-trifluorometil, 2'-O-etil-trifluorometoxi, o 2'-O-difluorometoxi-etoxi- purina, o alternativamente una pluralidad de nucleótidos de purina (es decir, más de uno) son nucleótidos de 2'-O-metil, 4'-tio, 2'-O-trifluorometil, 2'-O-etil-trifluorometoxi, o 2'-O-difluorometoxi-etoxi- purina).

En una modalidad, la invención presenta una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) químicamente modificado de la invención, capaz de mediar la interferencia de ARN (i-ARN) dentro de una célula o sistema reconstituido in vitro, que comprende una región de sentido en donde uno o más nucleótidos de pirimidina presentes en la región de sentido son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro, 4'-tio, 2'-0-trifluorometil, 2'-0-etil-trifluorometoxi, o 2'-0-difluorometoxi-etoxi- pirimidina (por ejemplo, en donde todos los nucleótidos de pirimidina son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro, 4'-tio, 2'-0-trifluorometil, 2'-0-etil-trifluorometox¡, o 2'-0-difluorometoxi-etoxi- pirimidina, o alternativamente una pluralidad de nucleótidos de pirimidina (es decir, más de uno) son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro, 4'-tio, 2'-0-trifluorometil, 2'-0-etil-trifluorometoxi, o 2'-0-difluorometoxi-etox¡-pirimidina), y uno o más nucleótidos de purina presentes en la región de sentido son nucleótidos de 2'-desoxi-purina (por ejemplo, en donde todos los nucleótidos de purina son nucleótidos de 2'-desoxi-purina, o alternativamente una pluralidad de nucleótidos de purina (es decir, más de uno) son nucleótidos de 2'-desoxi-purína); y una región de antisentido en donde uno o más nucleótidos de pirimidina presentes en la región de antisentido son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro, 4'-tio, 2'-0-trifluorometil, 2'-0-etil-trifluorometoxi, o 2 -0-difluorometoxi-etoxi- pirimidina (por ejemplo, en donde todos los nucleótidos de pirimidina son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro, 4'-tio, 2'-0-trifluorometil, 2'-0-etil-trifluorometoxi, o 2'-0-difluorometoxi-etoxi- pirimidina, o alternativamente una pluralidad de nucleótidos de pirimidina (es decir, más de uno) son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro, 4'-tio, 2'-0-tr¡fluorometii, 2'-O-etil-trifluorometoxi, o 2'-0-d¡fluorometoxi-etoxi- pirimidina), y uno o más nucleótidos de purina presentes en la región de antisentido son nucleótidos de 2'-0-metil, 4'-tio, 2'-0-trifluorometil, 2'-0-etil-trifluorometoxi, o 2'-0-difluorometoxi-etoxi- purina (por ejemplo, en donde todos los nucleótidos de purina son nucleótidos de 2'-0-metil, 4'-tio, 2'-0-trifluorometil, 2'-0-etil-trifluorometoxi, o 2'-0-difluorometoxi-etoxi- purina, o alternativamente una pluralidad de nucleótidos de purina (es decir, más de uno) son nucleótidos de 2'-0-metil, 4'-tio, 2'-0-trifluorometil, 2'-0-etil-trifluorometoxi, o 2 -0-difluorometoxi-etoxi- purina). La región de sentido o la región de antisentido pueden tener una modificación de casquete terminal, tal como cualquier modificación descrita en la presente o mostrada en la figura 7, que está presente opcionalmente en el extremo 3', el extremo 5', o tanto el extremo 3' como 5' de la secuencia de sentido o antisentido. La región de sentido o antisentido puede comprender opcionalmente un tramo saliente de nucleótido 3' terminal que tiene de aproximadamente 1 a aproximadamente 4 2'-desoxinucleótidos (por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3, o 4). Además, los nucleótidos salientes pueden comprender uno o más enlaces internucleotídicos de fosforotioato, fosfonoacetato, o tiofosfonoacetato (por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3, 4, o más). Los ejemplos no limitativos de estos ANci se muestran en las figuras 4A-4F y 5A-5F y los cuadros Ib y 8 de la presente. En cualquiera de estas modalidades descritas, los nucleótidos de purina presentes en la región de sentido son alternativamente nucleótidos de 2'-0-metil, 4'-tio, 2'-0-trifluoromet¡l, 2'-0-etil-trifluorometoxi, o 2'-0-difluorometoxi-etoxi- purina (por ejemplo, en donde todos los nucleótidos de purina son nucleótidos de 2'-0-metil, 4'-tio, 2'-0-trifluorometil, 2'-0-etil-trifluorometoxi, o 2'-0-difluorometoxi-etoxi- purina, o alternativamente una pluralidad de nucleótidos de purina son nucleótidos de 2'-0-metil, 4'-tio, 2'-0-trifluorometil, 2'-0-etil-trifluorometoxi, o 2'-0-difluorometoxi-etoxi- purina), y uno o más nucleótidos de purina presentes en la región de antisentido son nucleótidos de 2'-0-metil, 4'-tio, 2'-0-trifluorometil, 2'-0-etil-trifluorometoxi, o 2'-0-difluorometoxi-etoxi- purina (por ejemplo, en donde todos los nucleótidos de purina son nucleótidos de 2'-0-metil, 4'-tio, 2'-0-trifluorometil, 2'-O-etil-trifluorometoxi, o 2'-0-difluorometoxi-etoxi- purina, o alternativamente una pluralidad de nucleótidos de purina (es decir, más de uno) son nucleótidos de 2'-0-metil, 4'-tio, 2'-0-trifluorometil, 2'-0-etil-trifluorometox¡, o 2'-0-difluorometoxi-etoxi- purina). También, en cualquiera de estas modalidades, uno o más nucleótidos de purina presentes en la región de sentido son alternativamente ribonucleótidos de purina (por ejemplo, en donde todos los nucleótidos de purina son ribonucleótidos de purina, o alternativamente una pluralidad de nucleótidos de purina (es decir, más de uno) son ribonucleótidos de purina), y cualquier nucleótido de purina presente en la región de antisentido es un nucleótido de 2'-0-metil, 4'-tio, 2'-0-tr¡fluorometil, 2'-0-etil-trifluorometoxi, o 2'-0-difluorometoxi-etox¡- purina (por ejemplo, en donde todos los nucleótidos de purina son nucleótidos de 2'-0-metil, 4'-tio, 2'-0-trifluorometil, 2'-0-etil-trifluorometoxi, o 2'-0-difluorometoxi-etoxi- purina, o alternativamente una pluralidad de nucleótidos de purina (es decir, más de uno) son nucleótidos de 2'-0~metil, 4'-tio, 2'-0-trifluorometil, 2'-0-etil-trifluorometoxi, o 2'-0-difluorometoxi-etoxi- purina). Adicionalmente, en cualquiera de estas modalidades, uno o más nucleótidos de purina presentes en la región de sentido o presentes en la región de antisentido se seleccionan alternativamente del grupo que consiste en 2'-desoxi-nucleótidos, nucleótidos de ácido nucleico cerrado (LNA), 2'-metoxietil-nucleótidos, 4'-tio-nucleótidos, 2'-0-trifluorometil-nucleótidos, 2'-0-etil-trifluorometoxi-nucleótidos, 2'-0-difluorometoxi-etoxi-nucleótidos y 2'-0-metil-nucleótidos (por ejemplo, en donde todos los nucleótidos de purina se seleccionan del grupo que consiste en 2'-desoxi-nucleótidos, nucleótidos de ácido nucleico cerrado (LNA), 2'-metoxietil-nucleótidos, 4'-tio-nucleótidos, 2'-0-trifluorometil-nucleótidos, 2'-0-etil-trifluorometoxi-nucleótidos, 2'-0-difluorometoxi-etoxi-nucleótidos y 2'-0-metil-nucleótidos, o alternativamente una pluralidad de nucleótidos de purina (es decir, más de uno) se seleccionan del grupo que consiste en 2'-desoxi-nucleótidos, nucleótidos de ácido nucleico cerrado (LNA), 2'-metoxietil-nucleótidos, 4'-tio-nucleótidos, 2'-0-trifluorometil-nucleótidos, 2'-0-etil-trifluorometoxi-nucleótidos, 2'-0-difluorometoxi-etoxi-nucleótidos y 2'-0-metil-nucleótidos).

En otra modalidad, cualquier nucleótido modificado presente en las moléculas de ANci de la invención, preferiblemente en la cadena de antisentido de las moléculas de ANci de la invención, pero también opcionalmente en las cadenas de sentido o las cadenas tanto de antisentido como de sentido, comprenden nucleótidos modificados que tienen propiedades o características similares a los ribonucleótidos naturales. Por ejemplo, la invención presenta moléculas de ANci que incluyen nucleótidos modificados que tienen una conformación de Northern (por ejemplo, del ciclo de pseudo-rotación de Northern, véase por ejemplo Saenger, "Principies of Nucleic Acid Structure", Springer-Verlag ed., 1984), conocida también como una configuración de "ribo" o "hélice A". Tales nucleótidos que tienen una conformación de Northern generalmente se consideran "ribo" porque tienen una conformación fruncida de azúcar C3'-endo. Por lo tanto, los nucleótidos químicamente modificados presentes en las moléculas de ANci de la invención, preferiblemente en la cadena de antisentido de las moléculas de ANci de la invención, pero también opcionalmente en la cadena de sentido, o tanto de antisentido como de sentido, son resistentes a la degradación por nucleasa, mientras que al mismo tiempo mantienen la capacidad para mediar i-ARN. Los ejemplos no limitativos de nucleótidos que tienen una configuración de Northern incluyen nucleótidos de ácido nucleico cerrado (LNA) (por ejemplo, 2'-0-, 4'-C-metilen-(D-ribofuranosil)- nucleótidos); 2'-metoxietoxi-nucleótidos (MOE); 2'-metil-tio-etil-, 2'-desoxi-2'-fluoro-nucleótidos, 2'-desoxi-2'-cloro-nucleótidos, 2'-azido-nucleótidos, 2'-0-trifluorometil-nucleótidos, 2'-0-etil-trifluorometoxi-nucleótidos, 2'-0-difluorometoxi-etoxi-nucleótidos, 4'-tio-nucleótidos y 2'-0-metil-nucleót¡dos.

En una modalidad, la cadena de sentido de una molécula de ANci de doble cadena de la invención comprende una porción de casquete terminal (véase por ejemplo la figura 7), tal como una porción desoxi abásica invertida en el extremo 3', el extremo 5', o tanto el extremo 3' como 5' de la cadena de sentido.

En una modalidad, la invención presenta una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) químicamente modificado, capaz de mediar la interferencia de ARN (i-ARN) dentro de una célula o sistema reconstituido in vitro, en donde la modificación química comprende un conjugado unido covalentemente a la molécula de ANci químicamente modificada. Los ejemplos no limitativos de los conjugados contemplados por la invención incluyen los conjugados y ligandos descritos por Vargeese et al., USSN 10/427,160, presentada el 30 de abril de 2003, que se incorpora aquí como referencia en su totalidad, incluyendo los dibujos. En otra modalidad, el conjugado se une covalentemente a la molécula de ANci químicamente modificada por medio de un enlazador biodegradable. En la modalidad, la molécula conjugada se une en el extremo 3' de la cadena de sentido, la cadena de antisentido o las dos cadenas de una molécula de ANci químicamente modificada. En otra modalidad, la molécula conjugada se une en el extremo 5' de la cadena de sentido, la cadena de antisentido o las dos cadenas de la molécula de ANci químicamente modificada. En otra modalidad, la molécula conjugada se une tanto al extremo 3' como al extremo 5' de la cadena de sentido, la cadena de antisentido, o las dos cadenas de la molécula de ANci químicamente modificada, o cualquier combinación de las mismas. En una modalidad, una molécula conjugada de la invención comprende una molécula que facilita el suministro de una molécula de ANci químicamente modificada a un sistema biológico, tal como una célula. En otra modalidad, la molécula conjugada unida a la molécula de ANci químicamente modificada es un ligando de un receptor celular, tal como péptidos derivados de ligandos de proteína naturales; secuencias de localización de proteína, que incluyen secuencias de código ZIP celular; anticuerpos; aptámeros de ácido nucleico; vitaminas y otros cofactores tales como folato y N-acetilgalactosamina, polímeros tales como polietilenglicol (PEG); fosfolípidos; colesterol; esteroides y poliaminas tales como PEI, espermina o espermidina. Los ejemplos de moléculas conjugadas específicas contempladas por la presente invención, que se pueden unir a las moléculas de ANci químicamente modificadas, se describen en Vargeese et al., publicación No. de serie 10/201 ,394 de EE. UU., presentada el 22 de julio de 2002, que se incorpora aquí como referencia. El tipo de conjugados usados y la magnitud de conjugación de las moléculas de ANci de la invención se pueden evaluar para mejorar los perfiles farmacocinéticos, biodisponibilidad o estabilidad de las construcciones de ANci, manteniendo al mismo tiempo la capacidad del ANci para mediar la actividad de i-ARN. Por lo tanto, el experto en la materia puede examinar construcciones de ANci que están modificadas con varios conjugados para determinar si el complejo conjugado de ANci tiene propiedades mejoradas pero manteniendo la capacidad para mediar la i-ARN, por ejemplo en modelos de animal como se conoce generalmente.

En una modalidad, la invención presenta una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) de la invención, en donde el ANci también comprende un enlazador de nucleótido, no nucleótido, o mixto nucleótido/no nucleótido, que une la región de sentido del ANci con la región de antisentido del ANci. En una modalidad, se usa un enlazador de nucleótido, no nucleótido, o mixto de nucleótido/no nucleótido, por ejemplo para unir una porción conjugada al ANci. En una modalidad, un enlazador de nucleótido de la invención puede ser un enlazador de > 2 nucleótidos de longitud, por ejemplo aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 nucleótidos de longitud. En otra modalidad, el enlazador de nucleótido puede ser un aptámero de ácido nucleico. Por "aptámero" o "aptámero de ácido nucleico", como se usa aquí, se entiende una molécula de ácido nucleico que se une específicamente a una molécula objetivo de ENaC, en donde la molécula de ácido nucleico tiene una secuencia que comprende una secuencia reconocida por la molécula objetivo de ENaC en su ambiente natural. Alternativamente, un aptámero puede ser una molécula de ácido nucleico que se une a una molécula objetivo de ENaC en donde la molécula objetivo de ENaC no se une naturalmente a un ácido nucleico. La molécula objetivo de ENaC puede ser cualquier molécula de interés (por ejemplo, ENaC o cualquier isotipo del mismo). Por ejemplo, el aptámero se puede usar para unirlo a un dominio de unión de ligando de una proteína, impidiendo así la interacción del ligando natural con la proteína. Este es un ejemplo no limitativo y los expertos en la materia reconocerán que se pueden generar fácilmente otras modalidades usando las técnicas generalmente conocidas (véase por ejemplo Gold et al., 1995, Annu. Rev. Biochem., 64, 763; Brody y Gold, 2000, J. Biotechnol., 74, 5; Sun, 2000, Curr. Opin. Mol. Ther., 2, 100; Kusser, 2000, J. Biotechnol., 74, 27; Hermann y Patel, 2000, Science, 287, 820; y Jayasena, 1999, Clinical Chemistry, 45, 1628).

En otra modalidad, un enlazador no nucleotídico de la invención comprende un nucleótido abásico, poliéter, poliamina, poliamida, péptido, carbohidrato, lípido, polihidrocarburo, u otro compuesto polimérico (por ejemplo, polietilenglicoles como los que tienen entre 2 y 100 unidades de etilenglicol). Los ejemplos específicos incluyen los descritos por Seela y Kaiser, Nucleic Acids Res. 1990, 18:6353, y Nucleic Acids Res. 1987, 15:3113; Cload y Schepartz, J. Am. Chem. Soc. 1991 , 113:6324; Richardson y Schepartz, J. Am. Chem. Soc. 1991 , 113:5109; Ma et al., Nucleic Acids Res. 1993, 21 :2585, y Biochemistry 1993, 32:1751 ; Durand et al., Nucleic Acids Res. 1990, 18:6353; McCurdy et al., Nucleosides & Nucleotides 1991 , 10:287; Jschke et al., Tetrahedron Lett 1993, 34:301 ; Ono et al., Biochemistry 1991 , 30:9914; Arnold et al., publicación internacional No. WO 89/02439; Usman et al., publicación internacional No. WO 95/06731 ; Dudycz et al., publicación internacional No. WO 95/11910, y Ferentz y Verdine, J. Am. Chem. Soc. 1991 , 113:4000, todas las cuales se incorporan aquí como referencia. Además, un "no nucleótido" significa cualquier grupo o compuesto que se puede incorporar en una cadena de ácido nucleico en lugar de una o más unidades de nucleótido, que incluyen sustituciones de azúcar o fosfato y que permiten a las bases restantes presentar su actividad enzimática. El grupo o compuesto puede ser abásico pues no contiene una base de nucleotido reconocida comúnmente, tal como adenosina, guanina, citosina, uracilo o timina, por ejemplo en la posición C1 del azúcar.

En una modalidad, la invención presenta una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci), capaz de mediar la interferencia de ARN (i-ARN) dentro de una célula o sistema reconstituido in vitro, en donde una o las dos cadenas de la molécula de ANci que están ensambladas de dos oligonucleótidos separados no comprenden ningún ribonucleótido. Por ejemplo, una molécula de ANci se puede ensamblar de un solo oligonucleótido en donde las regiones de sentido y antisentido del ANci comprenden oligonucleótidos separados que no tienen ningún ribonucleótido (por ejemplo, nucleótidos que tienen un grupo 2'-OH) presente en los oligonucleótidos. En otro ejemplo, una molécula de ANci se puede ensamblar de un solo oligonucleótido, en donde las regiones de sentido y antisentido del ANci están enlazadas o en circulo por medio de un enlazador de nucleotido o no nucleotido como se describe en la presente, en donde el oligonucleótido no tiene ningún ribonucleótido (por ejemplo, nucleótidos que tienen un grupo 2'-OH) presente en el oligonucleótido. El solicitante ha encontrado sorprendentemente que la presencia de ribonucleótidos (por ejemplo, nucleótidos que tienen un grupo 2'-hidroxilo) dentro de la molécula de ANci, no se requiere o no es esencial para sostener la actividad de i-ARN. Por lo tanto, en una modalidad, todas las posiciones dentro del ANci pueden incluir nucleótidos o no nucleótidos químicamente modificados, tales como los nucleótidos y no nucleótidos que tienen las fórmulas I, II, III, IV, V, VI, o VII, o cualquier combinación de las mismas, hasta el grado en que se mantenga la capacidad de la molécula de ANci para sostener la actividad de i-ARN en una célula.

En una modalidad, una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) químicamente modificado de la invención comprende una cadena de sentido o región de sentido que tiene dos o más modificaciones 2'-O-alquilo (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 , 11 , 12, 13 ,14 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, o más) (por ejemplo, 2'-0-metilo), o cualquier combinación de las mismas. En otra modalidad, la modificación 2'-0-alquilo está en posiciones alternantes en la cadena de sentido o región de sentido del ANci, tales como las posiciones 1 , 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 17, 19, 21 , etc. o en las posiciones 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, etc.

En una modalidad, una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) químicamente modificado de la invención comprende una cadena de antisentido o región de antisentido que tiene dos o más modificaciones 2'-0-alquilo (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 , 11 , 12, 13 ,14 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, o más) (por ejemplo 2'-0-metilo), o cualquier combinación de las mismas. En otra modalidad, la modificación 2'-0-alquilo está en posiciones alternantes en la cadena de antisentido o región de antisentido del ANci, tales como las posiciones 1 , 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 17, 19, 21 , etc. o en las posiciones 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, etc.

En una modalidad, una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) químicamente modificado de la invención comprende una cadena de sentido o región de sentido y una cadena de antisentido o región de antisentido, cada una teniendo dos o más modificaciones químicas (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 , 11 , 12, 13 ,14 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, o más) de 2'-0-alquilo (por ejemplo 2'-0-metilo), 2'-desoxi-2'-fluoro, 2'-desoxi, o modificaciones abásicas, o cualquier combinación de las mismas. En otra modalidad, la modificación 2'-0-alquilo está en posiciones alternantes en la cadena de sentido o región de sentido del ANci, tales como las posiciones 1 , 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 17, 19, 21 , etc., o las posiciones 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, etc. En otra modalidad, la modificación 2'-0-alquilo está en posiciones alternantes en la cadena de antisentido o región de antisentido del ANci, tales como las posiciones 1 , 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 17, 19, 21 , etc., o las posiciones 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, etc.

En una modalidad, una molécula de ANci de la invención comprende nucleótidos o no nucleótidos químicamente modificados (por ejemplo, que tienen cualquiera de las fórmulas l-VII, tales como nucleótidos 2'-desoxi, 2'-desoxi-2'-fluoro, 4'-tio, 2'-0-trifluorometilo, 2'-0-etil-trifluorometoxi, 2'-0-difluorometoxi-etoxi o 2'-0-metilo), en posiciones alternantes dentro de una o más cadenas o regiones de la molécula de ANci. Por ejemplo, tales modificaciones químicas se pueden introducir en cada tercera posición de una molécula de ANci basada en ARN, empezando en el pnmero o segundo nucleótido del extremo 3' o 5' del ANci. En un ejemplo no limitativo, se presenta una molécula de ANci de doble cadena de la invención en donde cada cadena del ANci es de 21 nucleótidos de longitud, en donde las posiciones 1 , 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 17, 19 y 21 de cada cadena están químicamente modificadas (por ejemplo, con compuestos que tienen cualquiera de las fórmulas l-VII, tales como nucleótidos de 2'-desoxi, 2'-desoxi-2'-fluoro, 4'-tio, 2'-0-trifluorometilo, 2'-0-etil-trifluorometoxi, 2'-0-difluorometoxi-etoxi o 2'-0-metilo). En otro ejemplo no limitativo, se presenta una molécula de ANci de doble cadena de la invención en donde cada cadena del ANci es de 21 nucleótidos de longitud, en donde las posiciones 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, y 20 de cada cadena están químicamente modificadas (por ejemplo, con compuestos que tienen cualquiera de las fórmulas l-VII, tales como nucleótidos 2'-desoxi, 2'-desoxi-2'-fluoro, 4'-tio, 2'-0-trifluorometilo, 2'-0-etil-trifluorometoxi, 2'-0-difluorometoxi-etoxi o 2'-O-metilo). En una modalidad, una cadena de la molécula de ANci de doble cadena comprende modificaciones químicas en las posiciones 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 y 20, y modificaciones químicas en las posiciones 1 , 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 17, 19 y 21. Tales moléculas de ANci pueden comprender, además, porciones de casquete terminal o modificaciones de esqueleto como se describe en la presente.

En una modalidad, una molécula de ANci de la invención comprende las siguientes características: si están presentes nucleótidos de purina en el extremo 5' (por ejemplo, en cualquiera de las posiciones de nucleótido terminal 1 , 2, 3, 4, 5, o 6 del extremo 5') de la cadena de antisentido o región de antisentido (referida de otra manera como la secuencia guía o cadena guía) de la molécula de ANci, entonces tales nucleósidos de purina son ribonucleótidos. En otra modalidad, los ribonucleótidos de purina, cuando están presentes, tienen sus bases apareadas con los nucleótidos de la cadena de sentido o región de sentido (referida de otra manera como la cadena de pasajero) de la molécula de ANci. Tales ribonucleótidos de purina pueden estar presentes en un motivo estabilizador de ANci que por lo demás comprende nucleótidos modificados.

En una modalidad, una molécula de ANci de la invención comprende las siguientes características: si están presentes nucleótidos de pirimidina en el extremo 5' (por ejemplo, en cualquiera de las posiciones de nucleótido terminal 1 , 2, 3, 4, 5, o 6 del extremo 5') de la cadena de antisentido o región de antisentido (referida de otra manera como la secuencia guía o cadena guía) de la molécula de ANci, entonces tales nucleósidos de pirimidina son ribonucleótidos. En otra modalidad, los ribonucleótidos de pirimidina, cuando están presentes, tienen sus bases apareadas con los nucleótidos de la cadena de sentido o región de sentido (referida de otra manera como la cadena de pasajero) de la molécula de ANci. Tales ribonucleótidos de pirimidina pueden estar presentes en un motivo estabilizador de ANci que por lo demás comprende nucleótidos modificados.

En una modalidad, una molécula de ANci de la invención comprende las siguientes características: si están presentes nucleótidos de pirimidina en el extremo 5' (por ejemplo en cualquiera de las posiciones de nucleótido terminal 1 , 2, 3, 4, 5, o 6 del extremo 5') de la cadena de antisentido o región de antisentido (referida de otra manera como secuencia guía o cadena guía) de la molécula de ANci, entonces los nucleósidos de pirimidina son nucleótidos modificados. En otra modalidad, los nucleótidos de pirimidina, cuando están presentes, tienen sus bases apareadas con los nucleótidos de la cadena de sentido o región de sentido (referida de otra manera como la cadena de pasajero) de la molécula de ANci. Ejemplos no limitativos de nucleótidos pirimidina modificados incluyen los que tienen cualquiera de las fórmulas l-VII, tales como los nucleótidos 2 -desoxi, 2'-desoxi-2'-fluoro, 4'-tio, 2'-0-trifluorometilo, 2'-0-etil-trifluorometoxi, 2'-0-difluorometoxi-etoxi o 2'-0-metilo.

En una modalidad, la invención presente una molécula de ácido nucleico (ANci) de doble cadena que tiene la estructura SI: B NX3 (N)X2 B -3' B (N)X ] NX4 [N]X5 -5' SI en donde cada N es independientemente un nucleótido que puede ser o no químicamente modificado; cada B es una porción de casquete terminal que puede estar presente o ausente; (N) representa nucleótidos de bases no apareadas o salientes que pueden ser o no químicamente modificados; [N] representa posiciones de nucleótido en donde cualquier nucleótido de purina, cuando está presente, es un ribonucleótido, X1 y X2 son independientemente enteros de aproximadamente 0 a aproximadamente 4; X3 es un entero de aproximadamente 9 a aproximadamente 30; X4 es un entero de aproximadamente 11 a aproximadamente 30, con la condición de que la suma de X4 + X5 es entre 17 y 36; X5 es un entero de aproximadamente 1 a aproximadamente 6; NX3 es complementario a NX4 y NX5, y (a) cualquier nucleótido de pirimidina presente en la cadena de antisentido (cadena inferior) es un 2'-desoxi-2'-fluoro-nucleótido; cualquier nucleótido de purina presente en la cadena de antisentido (cadena inferior), diferente de los nucleótidos de purina en las posiciones de nucleótido [N], es independientemente un 2'-0-metil-nucleótido, 2'-desoxirribonucleótido, o una combinación de 2'-desoxirribonucleótidos y 2'-0-metil-nucleótidos; (b) cualquier nucleótido de pirimidina presente en la cadena de sentido (cadena superior) es un 2'-desoxi-2'-fluoro-nucleótido; cualquier nucleótido de purina presente en la cadena de sentido (cadena superior) es independientemente un 2'-desoxirribonucleótido, 2'-0-met¡l-nucleótido, o una combinación de 2'-desoxirribonucleótidos y 2'-0-metil-nucleót¡dos; y (c) cualquier nucleótido (N) es opcionalmente 2'-0-metil-, 2'-desoxi-2'-fluoro-, o desoxirribonucleótido.

En una modalidad, la invención presenta una molécula de ácido nucleico (ANci) de doble cadena que tiene la estructura Sil: B — (?)?2 B -3 B (N)X1 [N]X5 -5' Sil en donde cada N es independientemente un nucleótido que puede ser o no químicamente modificado; cada B es una porción de casquete terminal que puede estar presente o ausente; (N) representa nucleótidos de bases no apareadas o salientes que pueden ser o no químicamente modificados; [N] representa posiciones de nucleótido en donde cualquier nucleótido de purina, cuando está presente, es un ribonucleótido, X1 y X2 son independientemente enteros de aproximadamente 0 a aproximadamente 4; X3 es un entero de aproximadamente 9 a aproximadamente 30; X4 es un entero de aproximadamente 11 a aproximadamente 30, con la condición de que la suma de X4 + X5 es entre 17 y 36; X5 es un entero de aproximadamente 1 a aproximadamente 6; NX3 es complementario a NX4 y NX5, y (a) cualquier nucleótido de pirimidina presente en la cadena de antisentido (cadena inferior) es un 2'-desoxi-2'-fluoro-nucleótido; cualquier nucleótido de purina presente en la cadena de antisentido (cadena inferior), diferente de los nucleótidos de purina en las posiciones de nucleótido [N], es un 2'-0-metil-nucleótido; (b) cualquier nucleótido de pirimidina presente en la cadena de sentido (cadena superior) es un ribonucleótido; cualquier nucleótido de purina presente en la cadena de sentido (cadena superior) es un ribonucleótido; y (c) cualquier nucleótido (N) es opcionalmente un 2'-0-metil-, 2'-desoxi-2'-fluoro-, o desoxirribonucleótido.

En una modalidad, la invención presenta una molécula de ácido nucleico (ANci) de doble cadena que tiene la estructura Sil I: SIN en donde cada N es independientemente un nucleótido que puede ser o no químicamente modificado; cada B es una porción de casquete terminal que puede estar presente o ausente; (N) representa nucleótidos de bases no apareadas o salientes que pueden ser o no químicamente modificados; [N] representa posiciones de nucleótido en donde cualquier nucleótido de purina, cuando está presente, es un ribonucleótido; X1 y X2 son independientemente enteros de aproximadamente 0 a aproximadamente 4; X3 es un entero de aproximadamente 9 a aproximadamente 30; X4 es un entero de aproximadamente 11 a aproximadamente 30, con la condición de que la suma de X4 + X5 es entre 17 y 36; X5 es un entero de aproximadamente 1 a aproximadamente 6; NX3 es complementario a NX4 y NX5, y (a) cualquier nucleótido de pirimidina presente en la cadena de antisentido (cadena inferior) es un 2'-desoxi-2'-fluoro-nucleótido; cualquier nucleótido de purina presente en la cadena de antisentido (cadena inferior), diferente de los nucleótidos de purina en las posiciones de nucleótido [N], es un 2'-0-metil-nucleótido; (b) cualquier nucleótido de pirimidina presente en la cadena de sentido (cadena superior) es un 2'-desoxi-2'-fluoro-nucleótido; cualquier nucleótido de purina presente en la cadena de sentido (cadena superior) es un ribonucleótido; y (c) cualquier nucleótido (N) es opcionalmente un 2'-0-metil-, 2'-desoxi-2'-fluoro-, o desoxirribonucleótido.

En una modalidad, la invención presenta una molécula de ácido nucleico (ANci) de doble cadena que tiene la estructura SIV: B NX3 (N)X2 B -3' B (N)X1 NX4 [N]X5 -5' SIV en donde cada N es independientemente un nucleótido que puede ser o no químicamente modificado; cada B es una porción de casquete terminal que puede estar presente o ausente; (N) representa nucleótidos de bases no apareadas o salientes que pueden ser o no químicamente modificados; [N] representa posiciones de nucleótido en donde cualquier nucleótido de purina, cuando está presente, es un ribonucleótido, X1 y X2 son independientemente enteros de aproximadamente 0 a aproximadamente 4; X3 es un entero de aproximadamente 9 a aproximadamente 30; X4 es un entero de aproximadamente 11 a aproximadamente 30, con la condición de que la suma de X4 + X5 es entre 17 y 36; X5 es un entero de aproximadamente 1 a aproximadamente 6; NX3 es complementario a NX4 y NX5, y (a) cualquier nucleótido de pirimidina presente en la cadena de antisentido (cadena inferior) es un 2'-desoxi-2'-fluoro-nucleótido; cualquier nucleótido de purina presente en la cadena de antisentido (cadena inferior), diferente de los nucleótidos de purina en las posiciones de nucleótido [N], es un 2'-0-metil-nucleótido; (b) cualquier nucleótido de pirimidina presente en la cadena de sentido (cadena superior) es un 2'-desoxi-2'-fluoro-nucleótido; cualquier nucleótido de purina presente en la cadena de sentido (cadena superior) es un desoxirribonucleótido; y (c) cualquier nucleótido (N) es opcionalmente un 2'-0-metil-, 2'-desox¡-2'-fluoro-, o desoxirribonucleótido.

En una modalidad, la invención presenta una molécula de ácido nucleico (ANci) de doble cadena que tiene la estructura SV: B NX3 ( )?2 B -3' B (N)X1 NX4 [N]X5 -5' SV en donde cada N es independientemente un nucleótido que puede ser o no químicamente modificado; cada B es una porción de casquete terminal que puede estar presente o ausente; (N) representa nucleótidos de bases no apareadas o salientes que pueden ser o no químicamente modificados; [N] representa posiciones de nucleótido en donde cualquier nucleótido de purina, cuando está presente, es un ribonucleótido; X1 y X2 son independientemente enteros de aproximadamente 0 a aproximadamente 4; X3 es un entero de aproximadamente 9 a aproximadamente 30; X4 es un entero de aproximadamente 11 a aproximadamente 30, con la condición de que la suma de X4 + X5 es entre 17 y 36; X5 es un entero de aproximadamente 1 a aproximadamente 6; NX3 es complementario a NX4 y NX5, y (a) cualquier nucleótido de pirimidina presente en la cadena de antisentido (cadena inferior) es un nucleótido que tiene una configuración ribo (por ejemplo, una configuración de Northern o de hélice A); cualquier nucleótido de purina presente en la cadena de antisentido (cadena inferior), diferente de los nucleótidos de purina en las posiciones de nucleótido [N], es un 2'-0-metil-nucleótido; (b) cualquier nucleótido de pirimidina presente en la cadena de sentido (cadena superior) es un nucleótido que tiene una configuración ribo (por ejemplo, una configuración de Northern o de hélice A); cualquier nucleótido de purina presente en la cadena de sentido (cadena superior) es un 2'-0-metil-nucleótido; y (c) cualquier nucleótido (N) es opcionalmente un 2'-0-metil-, 2'-desoxi-2'-fluoro-, o desoxirribonucleótido.

En una modalidad, la invención presenta una molécula de ácido nucleico (ANci) de doble cadena que tiene la estructura SVI: SVI en donde cada N es independientemente un nucleótido que puede ser o no químicamente modificado; cada B es una porción de casquete terminal que puede estar presente o ausente; (N) representa nucleótidos de bases no apareadas o salientes que pueden ser o no químicamente modificados; [N] representa posiciones de nucleótido que comprenden una secuencia que hace al extremo 5' de la cadena de antisentido (cadena inferior) menos estable térmicamente que el extremo 5' de la cadena de sentido (cadena superior); X1 y X2 son independientemente enteros de aproximadamente 0 a aproximadamente 4; X3 es un entero de aproximadamente 9 a aproximadamente 30; X4 es un entero de aproximadamente 11 a aproximadamente 30, con la condición de que la suma de X4 + X5 es entre 17 y 36; X5 es un entero de aproximadamente 1 a aproximadamente 6; NX3 es complementario a NX4 y NX5, y (a) cualquier nucleótido de pirimidina presente en la cadena de antisentido (cadena inferior) es un 2'-desox¡-2'-fluoro-nucleótido; cualquier nucleótido de purina presente en la cadena de antisentido (cadena inferior), diferente de los nucleótidos de purina en las posiciones de nucleótido [N], es independientemente un 2'-0-metil-nucleótido, 2'-desoxirribonucleótido, o una combinación de 2'-desoxirribonucleótidos y 2'-0-metil-nucleótidos; (b) cualquier nucleótido de pirimidina presente en la cadena de sentido (cadena superior) es un 2'-desoxi-2'-fluoro-nucleótido; cualquier nucleótido de purina presente en la cadena de sentido (cadena superior) es independientemente un 2'-desoxirribonucleót¡do, 2'-0-metil-nucleótido, o una combinación de 2'-desoxirribonucleót¡dos y 2'-0-metil-nucleótidos; y (c) cualquier nucleótido (N) es opcionalmente un 2'-0-metil-, 2'-desoxi-2'-fluoro-, o desoxirribonucleótido.

En una modalidad, la invención presenta una molécula de ácido nucleico (ANci) de doble cadena que tiene la estructura SVII: B NX3 ( )X2 B -3' B (N)X1 NX4 51 SVII en donde cada N es independientemente un nucleótido que puede ser o no químicamente modificado; cada B es una porción de casquete terminal que puede estar presente o ausente; (N) representa nucleótidos de bases no apareadas o salientes; X1 y X2 son independientemente enteros de aproximadamente 0 a aproximadamente 4; X3 es un entero de aproximadamente 9 a aproximadamente 30; X4 es un entero de aproximadamente 11 a aproximadamente 30; NX3 es complementario a NX4, y cualquier nucleótido (N) es un 2'-0-metil o 2'-desox¡-2'-fluoro- nucleótido.

En una modalidad, la invención presenta una molécula de ácido nucleico (ANci) de doble cadena que tiene la estructura SVIII: B NX7— [N]X6 - NX3 (N)X2 B -3' SVIII en donde cada N es independientemente un nucleótido que puede ser o no químicamente modificado; cada B es una porción de casquete terminal que puede estar presente o ausente; (N) representa nucleótidos de bases no apareadas o salientes que pueden ser o no químicamente modificados; [N] representa posiciones de nucleótido que comprenden secuencias que hacen al extremo 5' de la cadena de antisentido (cadena inferior) menos estable térmicamente que el extremo 5' de la cadena de sentido (cadena superior); [N] representa posiciones de nucleótido que son ribonucleótidos; X1 y X2 son independientemente enteros de aproximadamente 0 a aproximadamente 4; X3 es un entero de aproximadamente 9 a aproximadamente 15; X4 es un entero de aproximadamente 11 a aproximadamente 30, con la condición de que la suma de X4 + X5 es entre 17 y 36; X5 es un entero de aproximadamente 1 a aproximadamente 6; X6 es un entero de aproximadamente 1 a aproximadamente 4; X7 es un entero de aproximadamente 9 a aproximadamente 15; NX7, NX6 y NX3 son complementarios a NX4 y NX5, y (a) cualquier nucleótido de pirimidina presente en la cadena de antisentido (cadena inferior) es un 2'-desoxi-2'-fluoro-nucleótido; cualquier nucleótido de purina presente en la cadena de antisentido (cadena inferior), diferente de los nucleótidos de purina en las posiciones de nucleótido [N], es independientemente un 2'-0-metil-nucleótido, 2'-desoxirribonucleótido, o una combinación de 2'-desoxirribonucleótidos y 2'-0-metil-nucleótidos; (b) cualquier nucleótido de pirimidina presente en la cadena de sentido (cadena superior) es un 2'-desoxi-2'-fluoro-nucleótido diferente de los nucleótidos [N] cualquier nucleótido de purina presente en la cadena de sentido (cadena superior) es independientemente un 2'-desoxirribonucleótido, 2'-0-metil-nucleótido, o una combinación de 2'-desoxirribonucleótidos y 2'-0-metil-nucleótidos diferentes de los nucleótidos [N] y (c) cualquier nucleótido (N) es opcionalmente un 2'-0-metil-, 2'-desoxi-2'-fluoro-, o desoxirribonucleótido.

En una modalidad, la invención presenta una molécula de ácido nucleico (ANci) de doble cadena que tiene la estructura SIX: B NX3 (?)?2 B -3· B (?)?? NX4 [N]X5 -5' SIX en donde cada N es independientemente un nucleótido que puede ser o no químicamente modificado; cada B es una porción de casquete terminal que puede estar presente o ausente; (N) representa nucleótidos de bases no apareadas o salientes que pueden ser o no químicamente modificados; [N] representa posiciones de nucleótido que son ribonucleótidos; X1 y X2 son independientemente enteros de aproximadamente 0 a aproximadamente 4; X3 es un entero de aproximadamente 9 a aproximadamente 30; X4 es un entero de aproximadamente 11 a aproximadamente 30, con la condición de que la suma de X4 + X5 es entre 17 y 36; X5 es un entero de aproximadamente 1 a aproximadamente 6; NX3 es complementario a NX4 y NX5, y (a) cualquier nucleótido de pirimidina presente en la cadena de antisentido (cadena inferior) es un 2'-desoxi-2'-fluoro-nucleótido; cualquier nucleótido de purina presente en la cadena de antisentido (cadena inferior) diferente de los nucleótidos de purina en las posiciones de nucleótido [N], es independientemente un 2'-0-metil-nucleótido, 2'-desoxirribonucleótido, o una combinación de 2'-desoxirribonucleótidos y 2'-0-metil-nucleótidos; (b) cualquier nucleótido de pirimidina presente en la cadena de sentido (cadena superior) es un 2'-desoxi-2'-fluoro-nucleótido; cualquier nucleótido de purina presente en la cadena de sentido (cadena superior) es independientemente un 2'-desoxirribonucleótido, 2'-0-metil-nucleótido, o una combinación de 2'-desoxirribonucleótidos y 2'-0-metil- nucleótidos; y (c) cualquier nucleótido (N) es opcionalmente un 2'-0-metil-, 2'-desoxi-2'-fluoro-, o desoxirribonucleótido.

En una modalidad, la invención presenta una molécula de ácido nucleico (ANci) de doble cadena que tiene la estructura SX: B NX3 (N)X2 B -3' B (N)X1 NX4 [N]X5 -5' SX en donde cada N es independientemente un nucleótido que puede ser o no químicamente modificado; cada B es una porción de casquete terminal que puede estar presente o ausente; (N) representa nucleótidos de bases no apareadas o salientes que pueden ser o no químicamente modificados; [N] representa posiciones de nucleótido que son ribonucleótidos; X1 y X2 son independientemente enteros de aproximadamente 0 a aproximadamente 4; X3 es un entero de aproximadamente 9 a aproximadamente 30; X4 es un entero de aproximadamente 11 a aproximadamente 30, con la condición de que la suma de X4 + X5 es entre 17 y 36; X5 es un entero de aproximadamente 1 a aproximadamente 6; NX3 es complementario a NX4 y NX5, y (a) cualquier nucleótido de pirimidina presente en la cadena de antisentido (cadena inferior) es un 2'-desoxi-2'-fluoro-nucleótido; cualquier nucleótido de purina presente en la cadena de antisentido (cadena inferior) diferente de los nucleótidos de purina en las posiciones de nucleótido [N], es un 2'-0-metil-nucleótido; (b) cualquier nucleótido de pirimidina presente en la cadena de sentido (cadena superior) es un ribonucleótido; cualquier nucleótido de purina presente en la cadena de sentido (cadena superior) es un ribonucleótido; y (c) cualquier nucleótido (N) es opcionalmente un 2'-0-metil-, 2'-desoxi-2'-fluoro-, o desoxirribonucleótido.

En una modalidad, la invención presenta una molécula de ácido nucleico (ANci) de doble cadena que tiene la estructura SXI: B NX3 ( )?2 B -3' B (N)X1 NX4 [N]X5 -5' SXI en donde cada N es independientemente un nucleótido que puede ser o no químicamente modificado; cada B es una porción de casquete terminal que puede estar presente o ausente; (N) representa nucleótidos de bases no apareadas o salientes que pueden ser o no químicamente modificados; [N] representa posiciones de nucleótido que son ribonucleótidos; X1 y X2 son independientemente enteros de aproximadamente 0 a aproximadamente 4; X3 es un entero de aproximadamente 9 a aproximadamente 30; X4 es un entero de aproximadamente 11 a aproximadamente 30, con la condición de que la suma de X4 + X5 es entre 17 y 36; X5 es un entero de aproximadamente 1 a aproximadamente 6; NX3 es complementario a NX4 y NX5, y (a) cualquier nucleótido de pirimidina presente en la cadena de antisentido (cadena inferior) es un 2'-desoxi-2'-fluoro-nucleótido; cualquier nucleótido de purina presente en la cadena de antisentido (cadena inferior) diferente de los nucleótidos de purina en las posiciones de nucleótido [N], es un 2'-0-metil-nucleótido; (b) cualquier nucleótido de pirimidina presente en la cadena de sentido (cadena superior) es un 2'-desoxi-2'-fluoro-nucleótido; cualquier nucleótido de purina presente en la cadena de sentido (cadena superior) es un ribonucleótido; y (c) cualquier nucleótido (N) es opcionalmente un 2'-0-metil-, 2'-desoxi-2'-fluoro-, o desoxirribonucleótido.

En una modalidad, la invención presenta una molécula de ácido nucleico (ANci) de doble cadena que tiene la estructura SXII: SXII en donde cada N es independientemente un nucleótido que puede ser o no químicamente modificado; cada B es una porción de casquete terminal que puede estar presente o ausente; (N) representa nucleótidos de bases no apareadas o salientes que pueden ser o no químicamente modificados; [N] representa posiciones de nucleótido que son ribonucleótidos; X1 y X2 son independientemente enteros de aproximadamente 0 a aproximadamente 4; X3 es un entero de aproximadamente 9 a aproximadamente 30; X4 es un entero de aproximadamente 11 a aproximadamente 30, con la condición de que la suma de X4 + X5 es entre 17 y 36; X5 es un entero de aproximadamente 1 a aproximadamente 6; NX3 es complementario a NX4 y NX5, y (a) cualquier nucleótido de pirimidina presente en la cadena de antisentido (cadena inferior) es un 2'-desoxi-2'-fluoro-nucleótido; cualquier nucleótido de purina presente en la cadena de antisentido (cadena inferior) diferente de los nucleótidos de purina en las posiciones de nucleótido [N], es un 2'-0-metil-nucleótido; (b) cualquier nucleótido de pirimidina presente en la cadena de sentido (cadena superior) es un 2'-desoxi-2'-fluoro-nucleótido; cualquier nucleótido de purina presente en la cadena de sentido (cadena superior) es un desoxirribonucleótido; y (c) cualquier nucleótido (N) es opcionalmente un 2'-0-metil-, 2'-desoxi-2'-fluoro-, o desoxirribonucleótido.

En una modalidad, la invención presenta una molécula de ácido nucleico (ANci) de doble cadena que tiene la estructura SXIII: SXIII en donde cada N es independientemente un nucleótido que puede ser o no químicamente modificado; cada B es una porción de casquete terminal que puede estar presente o ausente; (N) representa nucleótidos de bases no apareadas o salientes que pueden ser o no químicamente modificados; [N] representa posiciones de nucleótido que son ribonucleótidos; X1 y X2 son independientemente enteros de aproximadamente 0 a aproximadamente 4; X3 es un entero de aproximadamente 9 a aproximadamente 30; X4 es un entero de aproximadamente 11 a aproximadamente 30, con la condición de que la suma de X4 + X5 es entre 17 y 36; X5 es un entero de aproximadamente 1 a aproximadamente 6; NX3 es complementario a NX4 y NX5, y (a) cualquier nucleótido de pirimidina presente en la cadena de antisentido (cadena inferior) es un nucleótido que tiene una configuración ribo (por ejemplo, una configuración de Northern o de hélice A); cualquier nucleótido de purina presente en la cadena de antisentido (cadena inferior) diferente de los nucleótidos de purina en las posiciones de nucleótido [N], es un 2'-0-metil-nucleótido; (b) cualquier nucleótido de pirimidina presente en la cadena de sentido (cadena superior) es un nucleótido que tiene una configuración ribo (por ejemplo, una configuración de Northern o de hélice A); cualquier nucleótido de purina presente en la cadena de sentido (cadena superior) es un 2'-0-metil-nucleót¡do; y (c) cualquier nucleótido (N) es opcionalmente un 2'-0-metil-, 2'-desoxi-2'-fluoro-, o desoxirribonucleótido.

En una modalidad, la invención presenta una molécula de ácido nucleico (ANci) de doble cadena que tiene la estructura SXIV: B NX7— [N]X6 - Nx3 (N)X2 B -3' SXIV en donde cada N es independientemente un nucleótido que puede ser o no químicamente modificado; cada B es una porción de casquete terminal que puede estar presente o ausente; (N) representa nucleótidos de bases no apareadas o salientes que pueden ser o no químicamente modificados; [N] representa posiciones de nucleótido que son ribonucleótidos; [N] representa posiciones de nucleótido que son ribonucleótidos; X1 y X2 son independientemente enteros de aproximadamente 0 a aproximadamente 4; X3 es un entero de aproximadamente 9 a aproximadamente 15; X4 es un entero de aproximadamente 11 a aproximadamente 30, con la condición de que la suma de X4 + X5 es entre 17 y 36; X5 es un entero de aproximadamente 1 a aproximadamente 6; X6 es un entero de aproximadamente 1 a aproximadamente 4; X7 es un entero de aproximadamente 9 a aproximadamente 15; NX7, NX6 y NX3 son complementarios a NX4 y NX5, y (a) cualquier nucleótido de pirimidina presente en la cadena de antisentido (cadena inferior) es un 2'-desoxi-2'-fluoro-nucleótido; cualquier nucleótido de purina presente en la cadena de antisentido (cadena inferior) diferente de los nucleótidos de purina en las posiciones de nucleótido [N], es independientemente un 2 -O-metil-nucleótido, 2'-desoxirribonucleótido, o una combinación de 2'-desoxirribonucleótidos y 2'-0-metil-nucleót¡dos; (b) cualquier nucleótido de pirimidina presente en la cadena de sentido (cadena superior) es un 2'-desoxi-2'-fluoro-nucleótido diferente de los nucleótidos [?/]; cualquier nucleótido de purina presente en la cadena de sentido (cadena superior) es independientemente un 2'-desoxirribonucleótido, 2'-0-metil-nucleótido, o una combinación de 2'-desoxirribonucleótidos y 2'-0-metil-nucleótidos diferentes de los nucleótidos [N]; y (c) cualquier nucleótido (N) es opcionalmente un 2'-0-metil-, 2'-desoxi-2'-fluoro-, o desoxirribonucleótido.

En una modalidad, una molécula de ácido nucleico (ANci) de doble cadena que tiene cualquiera de las estructuras SI, Sil, Slll, SIV, SV, SVI, SVII, SVIII, SIX, SX, SXII, SXIII o SXIV, comprende un grupo fosfato terminal en el extremo 5' de la cadena de antisentido o región de antisentido de la molécula de ácido nucleico.

En una modalidad, una molécula de ácido nucleico (ANci) de doble cadena que tiene cualquiera de las estructuras SI, Sil, Slll, SIV, SV, SVI, SVII, SVIII, SIX, SX, SXI, SXII, SXIII o SXIV, comprende X5 = 1 , 2, o 3; cada X1 y X2 = 1 o 2; X3 = 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o 30, y X4 = 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o 30.

En una modalidad, una molécula de ácido nucleico (ANci) de doble cadena que tiene cualquiera de las estructuras SI, Sil, Slll, SIV, SV, SVI, SVII, SVIII, SIX, SX, SXI, SXII, SXIII o SXIV, comprende X5 = 1 ; cada X1 y X2 = 2; X3 = 19, y X4 = 18.

En una modalidad, una molécula de ácido nucleico (ANci) de doble cadena que tiene cualquiera de las estructuras SI, Sil, Slll, SIV, SV, SVI, SVII, SVIII, SIX, SX, SXI, SXII, SXIII o SXIV, comprende X5 = 2; cada X1 y X2 = 2; X3 = 19, y X4 = 17 En una modalidad, una molécula de ácido nucleico (ANci) de doble cadena que tiene cualquiera de las estructuras SI, Sil, Slll, SIV, SV, SVI, SVII, SVIII, SIX, SX, SXI, SXII, SXIII o SXIV, comprende X5 = 3; cada X1 y X2 = 2; X3 = 19, y X4 = 16.

En una modalidad, una molécula de ácido nucleico (ANci) de doble cadena que tiene cualquiera de las estructuras SI, Sil, Slll, SIV, SV, SVI, SVII, SVIII, SIX, SX, SXI, SXII, SXIII o SXIV, comprende B en los extremos 3' y 5' de la cadena de sentido o región de sentido.

En una modalidad, una molécula de ácido nucleico (ANci) de doble cadena que tiene cualquiera de las estructuras SI, Sil, Slll, SIV, SV, SVI, SVII, SVIII, SIX, SX, SXI, SXII, SXIII o SXIV, comprende B en el extremo 3' de la cadena de antisentido o región de antisentido.

En una modalidad, una molécula de ácido nucleico (ANci) de doble cadena que tiene cualquiera de las estructuras SI, Sil, SIN, SIV, SV, SVI, SVII, SVIII, SIX, SX, SXI, SXII, SXIII o SXIV, comprende B en los extremos 3' y 5' de la cadena de sentido o región de sentido, y B en el extremo 3' de la cadena de antisentido o región de antisentido.

En una modalidad, una molécula de ácido nucleico (ANci) de doble cadena que tiene cualquiera de las estructuras SI, Sil, SIN, SIV, SV, SVI, SVII, SVIII, SIX, SX, SXI, SXII, SXIII o SXIV, comprende además uno o más enlaces internucleotídicos de fosforotioato en el primer (N) terminal en el extremo 3' de la cadena de sentido, la cadena de antisentido, o tanto la cadena de sentido como la cadena de antisentido de la molécula de ácido nucleico. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico de doble cadena puede comprender X1 o X2 = 2 que tienen posiciones de nucleótido salientes con un enlace ¡nternucleotídico de fosforotioato, por ejemplo, (NsN) en donde "s" indica fosforotioato.

En una modalidad, una molécula de ácido nucleico (ANci) de doble cadena que tiene cualquiera de las estructuras SI, Sil, SIN, SIV, SV, SVI, SVII, SVIII, SIX, SX, SXI, SXII, SXIII o SXIV, comprende nucleótidos (N) que son 2'-0-metil-nucleótidos.

En una modalidad, una molécula de ácido nucleico (ANci) de doble cadena que tiene cualquiera de las estructuras SI, Sil, SIN, SIV, SV, SVI, SVII, SVIII, SIX, SX, SXI, SXII, SXIII o SXIV, comprende nucleótidos (N) que son 2'-desoxi-nucleótidos.

En una modalidad, una molécula de ácido nucleico (ANci) de doble cadena que tiene cualquiera de las estructuras SI, Sil, Slll, SIV, SV, SVI, SVII, SVIII, SIX, SX, SXI, SXII, SXIII o SXIV, comprende nucleótidos (N) que son 2'-desoxi-2'-fluoro-nucleótidos.

En una modalidad, una molécula de ácido nucleico (ANci) de doble cadena que tiene cualquiera de las estructuras SI, Sil, Slll, SIV, SV, SVI, SVII, SVIII, SIX, SX, SXI, SXII, SXIII o SXIV, comprende nucleótidos (N) en la cadena de antisentido (cadena inferior) que son complementarios a nucleótidos de una secuencia de polinucleótido de ENaC objetivo que tiene complementariedad con los nucleótidos N y [N] de la cadena de antisentido (inferior).

En una modalidad, una molécula de ácido nucleico (ANci) de doble cadena que tiene cualquiera de las estructuras SI, Sil, Slll, SIV, SV, SVI, SVII, SVIII, SIX, SX, SXI, SXII, SXIII o SXIV, comprende nucleótidos (N) en la cadena de sentido (cadena superior) que comprenden una secuencia de nucleótidos contigua de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 nucleótidos de una secuencia de polinucleótido de ENaC objetivo. En una modalidad, una molécula de ácido nucleico (ANci) de doble cadena que tiene cualquiera de las estructuras SI, Sil, Slll, SIV, SV, SVI, SVII, SVIII, SIX, SX, SXI, SXII, SXIII o SXIV, comprende nucleótidos (N) en la cadena de sentido (cadena superior) que comprenden una secuencia de nucleótidos, que corresponde a una secuencia de polinucleótido de ENaC objetivo que tiene complementariedad con la cadena de antisentido (inferior), de tal manera que la secuencia de nucleótidos contiguos (N) y N de la cadena de sentido comprende una secuencia de nucleótidos de la secuencia de ácido nucleico del ENaC objetivo.

En una modalidad, una molécula de ácido nucleico (ANci) de doble cadena que tiene cualquiera de las estructuras SVIII o SXIV comprende B solo en el extremo 5' de la cadena de sentido (superior) de la molécula de ácido nucleico de doble cadena.

En una modalidad, una molécula de ácido nucleico (ANci) de doble cadena que tiene cualquiera de las estructuras SI, Sil, SIN, SIV, SV, SVI, SVII, SVIII, SIX, SX, SXI, SXII, SXIII o SXIV, también comprende un nucleótido terminal no apareado en el extremo 5' de la cadena de antisentido (inferior). El nucleótido no apareado no es complementario a la cadena de sentido (superior). En una modalidad, el nucleótido terminal no apareado es complementario a una secuencia de polinucleótido de ENaC objetivo que tiene complementariedad con los nucleótidos N y [N] de la cadena de antisentido (inferior). En otra modalidad, el nucleótido terminal no apareado no es complementario a una secuencia de polinucleótido de ENaC objetivo que tiene complementariedad con los nucleótidos N y [N] de la cadena de antisentido (inferior).

En una modalidad, una molécula de ácido nucleico (ANci) de doble cadena que tiene cualquiera de las estructuras SVIII o SXIV comprende X6 = 1 y X3 = 10.

En una modalidad, una molécula de ácido nucleico (ANci) de doble cadena que tiene cualquiera de las estructuras SVIII o SXIV comprende X6 = 2 y X3 = 9.

En una modalidad, la invención presenta una composición que comprende una molécula de ANci, o una molécula de ácido nucleico de doble cadena, o un inhibidor de i-ARN, formulado como cualquier formulación LNP-051 ; LNP-053; LNP-054; LNP-069; LNP-073; LNP-077; LNP-080; LNP-082; LNP-083; LNP-060; LNP-061 ; LNP-086; LNP-097; LNP-098; LNP-099; LNP-100; LNP-101 ; LNP-102; LNP-103; o LNP-104 (véase el cuadro 10).

En un aspecto, la invención comprende una molécula de ácido nucleico (ANci) de doble cadena que tiene una primera cadena y una segunda cadena que son complementarias entre sí, en donde por lo menos una cadena comprende: 5'- UGUGCAACCAGAACAAAUC -3' (SEQ ID NO: 10); 5'- GAUUUGUUCUGGUUGCACA -3' (SEQ ID NO: 107); 5'- UUAUGGAUGAUGGUGGCUU -3' (SEQ ID NO: 13); 5'- AAGCCACCAUCAUCCAUAA -3' (SEQ ID NO: 124); 5'- GUGUGGCUGUGCCUACAUC -3' (SEQ ID NO: 16); 5'- GAUGUAGGCACAGCCACAC -3' (SEQ ID NO: 125) 5'- GCUGUGCCUACAUCUUCUA -3' (SEQ ID NO: 21); o 5'- UAGAAGAUGUAGGCACAGC -3' (SEQ ID NO: 126); y en donde opcionalmente uno o más de los nucleótidos están químicamente modificados. En una modalidad de este aspecto, la molécula de ácido nucleico (ANci) de doble cadena comprende nucleótidos que ninguno está modificado. En una modalidad, la molécula de ácido nucleico (ANci) de doble cadena comprende nucleótidos que están todos químicamente modificados.

En otro aspecto, la invención comprende una molécula de ácido nucleico (ANci) de doble cadena que comprende la estructura SIX' que tiene una cadena de sentido y una cadena de antisentido: B NX3 (?)?2 B -3· B (N)xi NX4 [N]X5 -5' SIX' en donde: la cadena superior es la cadena de sentido y las cadena inferior es la cadena de antisentido de la molécula de ácido nucleico de doble cadena, y dicha cadena de sentido comprende una secuencia complementaria a la cadena de antisentido; dicha cadena de antisentido comprende una secuencia complementaria a SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 21 ; cada N es independientemente un nucleótido que no está modificado o está modificado químicamente; cada B es una porción de casquete terminal que está presente o ausente; (N) representa nucleótidos salientes, cada uno de los cuales, independientemente, no está modificado o es un 2'-0-metil-nucleótido, 2'-desoxi-2'-fluoro-nucleótido o 2'-desoxirribonucleótido; [N] representa nucleótidos que son ribonucleótidos; X1 y X2 son independientemente enteros de 0 a 4; X3 es un entero de 9 a 30; X4 es un entero de 11 a 30, siempre que la suma de X4 + X5 sea 17-36; X5 es un entero de 1 a 6; y en donde: (a) cada nucleótido de pirimidina en las posiciones NX4 es independientemente un 2'-desoxi-2'-fluoro-nucleótido o un 2'-O-metil-nucleótido; cada nucleótido de purina en las posiciones ??4 es independientemente un 2'-0-metil-nucleótido o un 2'-desoxirribonucleót¡do; y (b) cada nucleótido de pirimidina en las posiciones NX3 es un 2'-desoxi-2'-fluoro-nucleótido; cada nucleótido de purina en las posiciones NX3 es independientemente un 2'-desoxirribonucleótido o un 2 -O-metil-nucleótido.

En una modalidad, cada B es una porción abásica invertida de casquete como se muestra en la figura 27.

En otro aspecto, la invención también comprende una molécula de ácido nucleico (ANci) de doble cadena en donde el ANci es: 5'- BuGuGcAAccAGAAcAAAucTTB -3' (Sentido) (SlíQ ID NO:5'l ) ¡ I ! I I i I I I I I I I I I I I ¡ I 3'- UUAcAcGuuGGucuuGuuUAG -5; (Antisentido) (SEQ ID NO:52) en donde: cada B es una porción abásica invertida de casquete; c es una 2'-desoxi-2'-fluorocitidina; u es 2'-desoxi-2'-fluorouridina; A es una 2'-desoxiadenosina; G es una 2'-desoxiguanosina; T es una timidina; A es adenosina; G es guanosina; U es uridina; A es una 2'-0-metil-adenosina; G es una 2'-0-metil-guanosina; U es una 2'-0-metil-uridina; y los enlaces internucleotídicos no están modificados o están modificados químicamente.

En una modalidad de este aspecto, los enlaces internucleotídicos no están modificados.

En otro aspecto, la invención también comprende una molécula de ácido nucleico (ANci) de doble cadena en donde el ANci es: 5 ' - Bu uAu GCAu GAu. GGu GGc uuTTB -3 ' (Sentido) (SEQ ID NO:57) I M I I I I I I I I I I M I I M .3 ' -UUAAuAccuAcuAccAccGAA -5 ' (Antisentido) (SBQ 10 NO:58) en donde: cada B es un casquete abásico invertido; c es una 2'-desoxi-2'-fluorocitidina; u es 2'-desoxi-2'-fluorouridina; A es una 2'-desoxiadenosina; G es una 2'-desoxiguanosina; T es una timidina; A es adenosina; G es guanosina; A es una 2'-0-metil-adenosina; U es una 2'-0-metil-uridina; y los enlaces internucleotídicos no están modificados o están modificados químicamente.

En otro aspecto, la invención también comprende una molécula de ácido nucleico (ANci) de doble cadena en donde el ANci es: 5 ' BGuGuGGc uGuGccuAcAucTTB 3 ' (Sentido) (SEQ ID O:63) I I I I I I I I I I I I I I I I I I I 3 ' UücAcAccGAcAcGGAuGUAG 5 ' (Antisentido) (SEQ ID NO:64) en donde: cada B es una porción abásica invertida de casquete; c es una 2'-desoxi-2'-fluorocitidina; u es 2'-desoxi-2'-fluorouridina; A es una 2'-desoxiadenos¡na; G es una 2'-desoxiguanosina; T es una timidina; A es adenosina; G es guanosina; U es uridina; A es una 2'-0-metil-adenosina¡ G es una 2'-0-metil-guanosina¡ U es una 2'-0-metil-uridina; y los enlaces intemucleotídicos no están modificados o están modificados químicamente.

En una modalidad de este aspecto, los enlaces intemucleotídicos no están modificados.

En otro aspecto, la invención también comprende una molécula de ácido nucleico (ANci) de doble cadena, en donde el ANci es: 5 ' - BGcu GuGccuAcAucuucuATTB -3 ' (Sentido) (SEQ I D NO:73) I I I I I I I I I i I I I I I I I I I 3 ' UUcGAcAcGGAuGuAGAAGAU -5 ' (Antisentido) (SI íQ II ) NO:74) en donde: cada B es una porción abásica invertida de casquete; c es una 2'-desoxi-2'-fluorocitidina; u es 2'-desoxi-2'-fluorouridina; A es una 2'-desoxiadenosina; G es una 2'-desoxiguanosina; T es una timidina; A es adenosina; G es guanosina; U es uridina; A es una 2'-0-metil-adenosina¡ G es una 2'-0-metil-guanosina; U es una 2'-0-metil-uridina; y los enlaces internucleótidos no están modificados modificados químicamente.

En una modalidad de este aspecto, los enlaces internucleótidos no están modificados.

En otro aspecto, la invención comprende una molécula de ácido nucleico (ANci) de doble cadena que comprende la estructura SX' que tiene una cadena de sentido y una cadena de antisentido: B 'NX3 B ( )xi ??4 [?]?5 -5' SX' en donde: la cadena superior es la cadena de sentido y la cadena inferior es la cadena de antisentido de la molécula de ácido nucleico de doble cadena; dicha cadena de antisentido comprende una secuencia que tiene complementariedad con SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 16, o SEQ ID NO: 21 , y dicha cadena de sentido comprende una secuencia que tiene complementariedad con la cadena de antisentido; cada N es independientemente un nucleótido que no está modificado o está modificado químicamente; cada B es una porción de casquete terminal que está presente o ausente; (N) representa nucleótidos salientes, cada uno de los cuales, independientemente, no está modificado o es un 2'-O-metil-nucleótido, 2'-desoxi-2 -fluoro-nucleótido, o 2'-desoxirribonucleótido; [N] representa nucleótidos que son ribonucleótidos; X1 y X2 son independientemente enteros de 0 a 4; X3 es un entero de 9 a 30; X4 es un entero de 11 a 30, siempre que la suma de X4 + X5 sea 17-36; X5 es un entero de 1 a 6; y en donde: (a) cada nucleótido de pirimidina en las posiciones NX4 es independientemente un 2'-desoxi-2'-fluoro-nucleótido o un 2'-O-metil-nucleótido; cada nucleótido de purina en las posiciones ??4 es un 2'-0-metil-nucleótido; (b) cada nucleótido de pirimidina en las posiciones ??3 es un ribonucleótido; cada nucleótido de purina en las posiciones ??3 es un ribonucleótido.

En otro aspecto, la invención comprende una molécula de ácido nucleico (ANci) de doble cadena que comprende la estructura SXI' que tiene una cadena de sentido y una cadena de antisentido: B NX3 (N)X2 B -3' B (N)X1 NX4 [N]X5 -5' sxr en donde: la cadena superior es la cadena de sentido y la cadena inferior es la cadena de antisentido de la molécula de ácido nucleico de doble cadena; dicha cadena de antisentido comprende una secuencia complementaria a la SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 16, o SEQ ID NO: 21 , y dicha cadena de sentido comprende una secuencia complementaria a la cadena de antisentido; cada N es independientemente un nucleótido que no está modificado o está modificado químicamente; cada B es una porción de casquete terminal que está presente o ausente; (N) representa nucleótidos salientes, cada uno de los cuales, independientemente, no está modificado o es un 2'-0-metil-nucleótido, 2'-desoxi-2'-fluoro-nucleótido, o 2'-desoxirribonucleótido; [N] representa nucleótidos que son ribonucleótidos; X1 y X2 son independientemente enteros de 0 a 4; X3 es un entero de 9 a 30; X4 es un entero de 1 1 a 30, siempre que la suma de X4 + X5 sea 17-36; X5 es un entero de 1 a 6; y en donde: (a) cada nucleótido de pirimidina en las posiciones ??4 es independientemente un 2'-desoxi-2'-fluoro-nucleótido o un 2'-0-metil-nucleótido; cada nucleótido de purina en las posiciones ??4 es un 2'-0-metil-nucleótido; (b) cada nucleótido de pirimidina en las posiciones NX3 es un 2'-desoxi-2'-fluoro-nucleótido; cada nucleótido de purina en las posiciones NX3 es un ribonucleótido.

En otro aspecto, la invención comprende una molécula de ácido nucleico (ANci) de doble cadena que comprende la estructura SXII' que tiene una cadena de sentido y una cadena de antisentido: B NX3 (N)X2 ? -3' ? (?)?1 ??4 [?]?5 -5' SXII' en donde: la cadena superior es la cadena de sentido y la cadena inferior es la cadena de antisentido de la molécula de ácido nucleico de doble cadena; dicha cadena de antisentido comprende una secuencia complementaria a la SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 16, o SEQ ID NO: 21 , y dicha cadena de sentido comprende una secuencia complementaria a la cadena de antisentido; cada N es independientemente un nucleótido que no está modificado o está modificado químicamente; cada B es una porción de casquete terminal que está presente o ausente; (N) representa nucleótidos salientes, cada uno de los cuales, independientemente, no está modificado o es un 2'-O-metil-nucleótido, 2'-desoxi-2'-fluoro-nucleótido, o 2'-desoxirribonucleótido; [N] representa nucleótidos que son ribonucleótidos; X1 y X2 son independientemente enteros de 0 a 4; X3 es un entero de 9 a 30; X4 es un entero de 11 a 30, siempre que la suma de X4 + X5 sea 17-36; X5 es un entero de 1 a 6; y en donde: (a) cada nucleótido de pirimidina en las posiciones NX es independientemente un 2'-desoxi-2'-fluoro-nucleótido o un 2'-0-metil-nucleótido; cada nucleótido de purina en las posiciones ??4 es un 2'-0-metil-nucleótido; (b) cada nucleótido de pirimidina en las posiciones NX3 es un 2'-desoxi-2'-fluoro-nucleótido; cada nucleótido de purina en las posiciones NX3 es un 2'-desoxirribonucleótido.

En otro aspecto, la invención comprende una molécula de ácido nucleico (ANci) de doble cadena que comprende la estructura SXIII' que tiene una cadena de sentido y una cadena de antisentido: B NX3 (N)X2 B -3' B (N)X1 NX4 [N]X5 -5' SXIII' en donde: la cadena superior es la cadena de sentido y la cadena inferior es la cadena de antisentido de la molécula de ácido nucleico de doble cadena; dicha cadena de antisentido comprende una secuencia complementaria a la SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 16, o SEQ ID NO: 21 , y dicha cadena de sentido comprende una secuencia complementaria a la cadena de antisentido; cada N es independientemente un nucleótido que no está modificado o está modificado químicamente; cada B es una porción de casquete terminal que está presente o ausente; (N) representa nucleótidos salientes, cada uno de los cuales, independientemente, no está modificado o es un 2'-0-metil-nucleótido, 2'-desoxi-2'-fluoro-nucleótido, o 2'-desoxirribonucleótido; [N] representa nucleótidos que son ribonucleótidos; X1 y X2 son independientemente enteros de 0 a 4; X3 es un entero de 9 a 30; X4 es un entero de 11 a 30, siempre que la suma de X4 + X5 sea 17-36; X5 es un entero de 1 a 6; y en donde: (a) cada nucleótido de pirimidina en las posiciones NX4 es un nucleótido que tiene una configuración de ribo, de Northern o de hélice A; cada nucleótido de purina en las posiciones NX4 es un 2'-0-metil-nucleótido; (b) cada nucleótido de pirimidina en las posiciones NX3 es un nucleótido que tiene una configuración de ribo, de Northern o de hélice A; cada nucleótido de purina en las posiciones ??3 es un 2'-0-metil-nucleótido.

En una modalidad de los aspectos anteriores, la molécula de ácido nucleico (ANci) de doble cadena comprende la estructura SIX' en donde X5 es 3. En una modalidad, la molécula de ácido nucleico (ANci) de doble cadena comprende la estructura SIX' en donde X1 es 2 y X2 es 2. En una modalidad, la molécula de ácido nucleico (ANci) de doble cadena comprende la estructura SIX', en donde X5 es 3, X1 es 2 y X2 es 2. En una modalidad, la molécula de ácido nucleico (ANci) de doble cadena comprende la estructura SIX', en donde X5 es 3, X1 es 2, X2 es 2, X3 es 19 y X4 es 16. En una modalidad de los aspectos anteriores, que incluye sin limitación la molécula de ácido nucleico (ANci) de doble cadena de las estructuras SIX", SX', SXI", SXII', y SXIII', X5 = 1, 2, o 3; cada X1 y X2 = 1 o 2; X3 = 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o 30; y X4 = 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o 30.

En una modalidad de los aspectos anteriores, B está presente en los extremos 3' y 5' de la cadena de sentido, y opcionalmente en el extremo 3' de la cadena de antisentido. En una modalidad B está presente en los extremos 3' y 5' de la cadena de sentido únicamente.

La invención también comprende moléculas de ácido nucleico (ANci) de doble cadena por lo demás como se describe arriba en las que la primera cadena y la segunda cadena son complementarias entre sí, y en donde por lo menos una cadena tiene una identidad de por lo menos 80%, 85%, 90%, 95% o 99% con la SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 21 sobre toda su longitud, y en donde cualquiera de los nucleótidos no está modificado o está modificado químicamente. En una modalidad, la primera cadena y la segunda cadena son complementarias entre sí y por lo menos una cadena tiene por lo menos 80%, 85%, 90%, 95%, o 99% de identidad con el complemento de la SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 16, o SEQ ID NO: 21 sobre toda su longitud, y en donde cualquiera de los nucleótidos no está modificado o está modificado químicamente. En una modalidad, la primera cadena y la segunda cadena son complementarias entre sí y por lo menos una cadena tiene por lo menos 95% de identidad con la SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 16, o SEQ ID NO: 21 , o por lo menos 95% de identidad con el complemento de la SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 16, o SEQ ID NO: 21 sobre toda su longitud, y en donde cada uno de los nucleótidos no está modificado o está modificado químicamente. En una modalidad, la primera cadena y la segunda cadena tienen 90% de complementariedad entre sí, en donde por lo menos una cadena tiene por lo menos 95% de identidad con la SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 16, o SEQ ID NO: 21 o su complemento.

La invención también comprende moléculas de ácido nucleico (ANci) de doble cadena por lo demás como se describe arriba, en las que la primera cadena y la segunda cadena son complementarias entre sí, y en donde por lo menos una cadena es hibridable con la secuencia de polinucleótido de la SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 16, o SEQ ID NO: 21 , o su complemento, bajo condiciones de alta severidad, y en donde cualquiera de los nucleótidos no está modificado o está modificado químicamente. En una modalidad, la primera cadena y la segunda cadena tienen 90% de complementariedad entre sí y por lo menos una cadena es hibridable con la secuencia de polinucleótido de la SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 16, o SEQ ID NO: 21 o su complemento, bajo condiciones de alta severidad, y en donde cualquiera de los nucleótidos no está modificado o está modificado químicamente.

Para las secuencias de ácidos nucleicos, el término "identidad" indica el grado de identidad entre dos secuencias de ácido nucleico cuando se alinean óptimamente y se comparan con inserciones o supresiones apropiadas. En otras palabras, el porcentaje de identidad entre dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, % de identidad = No. de posiciones idénticas /No. total de posiciones x 100), tomando en cuenta el número de huecos y la longitud de cada hueco que se requiere introducir para alinear óptimamente las dos secuencias. La comparación de las secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias se realizan usando un algoritmo matemático como se describe más abajo en los ejemplos no limitativos.

El porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos se determina usando el programa GAP en el paquete de software Accelrys GCG (University of Wisconsin), usando una matriz NWSgapdna.CMP y una ponderación de hueco de 40, 50, 60, 70, u 80, y una ponderación de longitud de 1 , 2, 3, 4, 5, o 6. El porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos también se puede determinar usando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988)), que se ha incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0), usando una tabla de residuo de ponderación PAM120, una penalización de longitud de hueco de 12, y una penalización de hueco de 4.

Las técnicas de hibridación son muy conocidas para el experto en la materia (véase por ejemplo Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)). Las condiciones preferidas de hibridación severa incluyen incubación durante la noche a 42°C en una solución que comprende 50% de formamida, SSC5x (150mM de NaCI, 15mM de citrato de trisodio), 50 mM de fosfato de sodio (pH 7.6), solución de Denhardt 5x, 10% de sulfato de dextrano, y 20 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón cortado desnaturalizado; seguido por lavado de los filtros en SSC 0.1 x a aproximadamente 65°C.

Otro aspecto de la invención comprende una composición farmacéutica que comprende un ácido nucleico (ANci) de doble cadena de la invención en un vehículo o diluente farmacéuticamente aceptable.

Otro aspecto de la invención comprende un método de tratamiento de un sujeto humano que padece una condiciones que es mediada por la acción, o pérdida de la acción, de ENaC, dicho método comprende administrar a dicho sujeto una cantidad eficaz de la molécula de ácido nucleico (ANci) de doble cadena de la invención. En una modalidad de este aspecto, la condición es, o es causada por, una enfermedad respiratoria. La enfermedad respiratoria tratable de acuerdo con este aspecto de la invención incluye COPD, asma, fibrosis quística, tos eosinofílica, bronquitis, sarcoidosis, fibrosis pulmonar, rinitis, sinusitis (particularmente COPD, fibrosis quística y asma).

En un aspecto, la invención comprende el uso de un ácido nucleico de doble cadena de acuerdo con la invención para usarse como un medicamento. En una modalidad, el medicamento es para usarse en el tratamiento de una condición que es mediada por la acción, o por la pérdida de acción, de ENaC. En una modalidad el medicamento es para usarse en el tratamiento de una enfermedad respiratoria. En una modalidad el medicamento es para usarse en el tratamiento de una enfermedad respiratoria seleccionada del grupo que consiste en COPD, asma, fibrosis quística, tos eosinofílica, bronquitis, sarcoidosis, fibrosis pulmonar, rinitis y sinusitis. En una modalidad particular el uso es para el tratamiento de una enfermedad respiratoria seleccionada del grupo que consiste en COPD, fibrosis quística y asma.

En otro aspecto, la invención comprende el uso de un ácido nucleico de doble cadena de acuerdo con la invención para usarse en la fabricación de un medicamento. En una modalidad, el medicamento es para usarse en el tratamiento de una condición que es mediada por la acción, o por pérdida de la acción, de ENaC. En una modalidad el medicamento es para usarse en el tratamiento de una enfermedad respiratoria. En una modalidad el medicamento es para usarse en el tratamiento de una enfermedad respiratoria seleccionada del grupo que consiste en COPD, asma, fibrosis quística, tos eosinofílica, bronquitis, sarcoidosis, fibrosis pulmonar, rinitis y sinusitis. En una modalidad particular el uso es para el tratamiento de una enfermedad respiratoria seleccionada del grupo que consiste en COPD, fibrosis quística y asma.

Se apreciará que en las modalidades anteriores, en particular las modalidades descritas arriba, el término "ácido nucleico corto de interferencia (ANci)" se refiere a una molécula de ácido nucleico que es capaz de mediar la interferencia de ARN.

En una modalidad, la invención presenta una composición que comprende una primera molécula de ácido nucleico de doble cadena y una segunda molécula de ácido nucleico de doble cadena, cada una teniendo una primera cadena y una segunda cadena que son complementarias entre sí, en donde la segunda cadena de la primera molécula de ácido nucleico de doble cadena comprende una secuencia complementaria a una primera secuencia de ENaC objetivo, y la segunda cadena de la segunda molécula de ácido nucleico de doble cadena comprende una secuencia complementaria a una segunda secuencia de ENaC objetivo. En una modalidad, la composición también comprende un lípido catiónico, un lípido neutro y un conjugado de polietilenglicol. En una modalidad, la composición también comprende un lípido catiónico, un lípido neutro, un conjugado de polietilenglicol, y un colesterol. En una modalidad, la composición también comprende un conjugado de polietilenglicol, un colesterol y un agente tensoactivo. En una modalidad, el lípido catiónico se selecciona del grupo que consiste en CLinDMA, pCLinDMA, eCLinDMA, DMOBA, y DMLBA. En una modalidad, el lípido neutro se selecciona del grupo que consiste de DSPC, DOBA y colesterol. En una modalidad, el conjugado de polietilenglicol se selecciona del grupo que consiste en PEG-dimiristoil glicerol y PEG-colesterol. En una modalidad el PEG es 2KPEG. En una modalidad el agente tensoactivo se selecciona del grupo que consiste en alcohol palmitílico, alcohol estearílico; alcohol oleílico y alcohol linoleílico. En una modalidad, el lípido catiónico es CLinDMA, el lípido neutro es DSPC, el conjugado de polietilenglicol es 2KPEG-DMG, el colesterol es colesterol, y el agente tensoactivo es alcohol linoleílico. En una modalidad, el CLinDMA, el DSPC, el 2KPEG-DMG, el colesterol y el alcohol linoleílico están presentes en una proporción molar de 43:38:10:2:7, respectivamente.

En cualquiera de las modalidades de la presente, la molécula de ANci de la invención modula la expresión de uno o más objetivos de ENaC por medio de interferencia de ARN, o la inhibición de interferencia de ARN. En una modalidad, la interferencia de ARN es el corte del ENaC objetivo mediado por RISC (por ejemplo, interferencia de ARN mediada por ARNci). En una modalidad, la interferencia de ARN es la inhibición de la traducción del ENaC objetivo (por ejemplo, interferencia de ARN mediada por miARN). En una modalidad, la interferencia de ARN es la inhibición de la transcripción del ENaC objetivo (por ejemplo, silenciamiento de la transcripción mediado por ARNci). En una modalidad, la interferencia de ARN ocurre en el citoplasma. En una modalidad, la interferencia de ARN ocurre en el núcleo.

En cualquiera de las modalidades de la presente, la molécula de ANci de la invención modula la expresión de uno o más objetivos de ENaC mediante la inhibición de un ARN de ENaC endógeno objetivo, tal como un ARNm de ENaC, ARNci de ENaC, miARN de ENaC, o alternativamente mediante inhibición del RISC.

En una modalidad, la invención presenta uno o más inhibidores de i-ARN que modulan la expresión de uno o más objetivos de gen ENaC mediante la inhibición de miARN, inhibición de ARNci, o inhibición de RISC.

En una modalidad, un inhibidor de i-ARN de la invención es una molécula de ANci como la que aquí se describe que tiene una o más cadenas que son complementarias a una o más moléculas de miARN o ARNci objetivo.

En una modalidad, el inhibidor de i-ARN de la invención es una molécula de antisentido que es complementaria a una molécula de miARN o ARNci objetivo, o una porción de la misma. Un inhibidor de i-ARN de antisentido de la invención puede tener una longitud de aproximadamente 10 a aproximadamente 40 nucleótidos (por ejemplo, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, o 40 nucleótidos de longitud). Un inhibidor de i-ARN de antisentido de la invención puede comprender uno o más nucleótidos o no nucleótidos modificados como aquí se describen (véanse por ejemplo las moléculas que tienen cualquiera de las fórmulas l-VII de la presente o cualquier combinación de las mismas). En una modalidad, un inhibidor de i-ARN de antisentido de la invención puede comprender uno o más, o todos son, nucleótidos de 2'-0- metilo. En una modalidad, un inhibidor de i-ARN de antisentido de la invención puede comprender uno o más, o todos son, nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro. En una modalidad, un inhibidor de i-ARN de antisentido de la invención puede comprender uno o más, o todos son, nucleótidos de 2'-0-metoxi-etilo (conocidos también como nucleótidos 2'-metoxietox¡ o MOE). En una modalidad, un inhibidor de i-ARN de antisentido de la invención puede comprender uno o más enlaces internucleotídicos de fosforotioato. En una modalidad, un inhibidor de ARN de antisentido de la invención puede comprender una porción de casquete terminal en el extremo 3', el extremo 5', o tanto el extremo 5' como 3' del inhibidor de ARN de antisentido.

En una modalidad, un inhibidor de i-ARN de la invención es un aptámero de ácido nucleico que tiene afinidad de unión por RISC, tal como un aptámero regulable (véase por ejemplo An et al., 2006, RNA, 12:710-716). Un inhibidor de i-ARN aptámero de la invención puede tener una longitud de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 nucleótidos (por ejemplo, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, o 50 nucleótidos de longitud). Un inhibidor de i-ARN aptámero de la invención puede comprender uno o más nucleótidos o no nucleótidos modificados como se describen en la presente (véanse por ejemplo las moléculas que tienen cualquiera de las fórmulas l-VII de la presente, o cualquier combinación de las mismas). En una modalidad, un inhibidor de i-ARN aptámero de la invención puede comprender uno o más, o todos son, nucleótidos de 2'-0-metilo. En una modalidad, un inhibidor de i-ARN aptámero de la invención puede comprender uno o más, o todos son, nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro. En una modalidad, un inhibidor de i-ARN aptámero de la invención puede comprender uno o más, o todos son, nucleótidos de 2'-0-metoxi-etilo (conocidos también como nucleótidos 2'-metoxietoxi o MOE). En una modalidad, un inhibidor de i-ARN aptámero de la invención puede comprender uno o más enlaces internucleotídicos de fosforotioato. En una modalidad, un inhibidor de i-ARN aptámero de la invención puede comprender una porción de casquete terminal en el extremo 3', el extremo 5', o tanto el extremo 5' como 3' del inhibidor de ARN aptámero.

En una modalidad, la invención presenta un método para modular la expresión de un gen ENaC objetivo dentro de una célula, que comprende: (a) sintetizar una molécula de ANci de la invención, que puede ser o no químicamente, en donde una de las cadenas de ANci comprende complementariedad de secuencia con el ARN del gen ENaC objetivo; y (b) introducir la molécula de ANci en una célula bajo condiciones adecuadas para modular (por ejemplo, inhibir) la expresión del gen ENaC objetivo en la célula.

En una modalidad, la invención presenta un método para modular la expresión de un gen ENaC objetivo dentro de una célula, que comprende: (a) sintetizar una molécula de ANci de la invención, que puede ser o no químicamente, en donde una de las cadenas de ANci comprende complementariedad de secuencia con el ARN del gen ENaC objetivo, y en donde la secuencia de la cadena de sentido del ANci comprende una secuencia idéntica o sustancialmente similar a la secuencia del ARN de ENaC objetivo; y (b) introducir la molécula de ANci en una célula bajo condiciones adecuadas para modular (por ejemplo, inhibir) la expresión del gen ENaC objetivo en la célula.

En otra modalidad, la invención presenta un método para modular la expresión de más de un gen ENaC objetivo dentro de una célula, que comprende: (a) sintetizar moléculas de ANci de la invención, que pueden ser o no químicamente, en donde una de las cadenas de ANci comprende complementariedad de secuencia con el ARN de los genes ENaC objetivo; y (b) introducir las molécula de ANci en una célula bajo condiciones adecuadas para modular (por ejemplo, inhibir) la expresión de los genes ENaC objetivo en la célula.

En otra modalidad, la invención presenta un método para modular la expresión de dos o más genes ENaC objetivo dentro de una célula, que comprende: (a) sintetizar una o más moléculas de ANci de la invención, que pueden ser o no químicamente modificadas, en donde las cadenas de ANci comprenden secuencias complementarias al ARN de los genes ENaC objetivo, y en donde las secuencias de la cadena de sentido de los ANci comprenden secuencias idénticas o sustancialmente similares a las secuencias de los ARN del ENaC objetivo; y (b) introducir las moléculas de ANci en una célula bajo condiciones adecuadas para modular (por ejemplo, inhibir) la expresión de los genes ENaC objetivo en la célula.

En otra modalidad, la invención presenta un método para modular la expresión de más de un gen ENaC objetivo dentro de una célula, que comprende: (a) sintetizar una molécula de ANci de la invención, que puede ser o no químicamente modificada, en donde una de las cadenas de ANci comprende complementariedad de secuencia con el ARN del gen ENaC objetivo, y en donde la secuencia de la cadena de sentido del ANci comprende una secuencia idéntica o sustancialmente similar a las secuencias de los ARN de ENaC objetivo; y (b) introducir la molécula de ANci en una célula bajo condiciones adecuadas para modular (por ejemplo, inhibir) la expresión de los genes ENaC objetivo en la célula.

En otra modalidad, la invención presenta un método para modular la expresión de un gen ENaC objetivo dentro de una célula, que comprende: (a) sintetizar una molécula de ANci de la invención, que puede ser o no químicamente modificada, en donde una de las cadenas de ANci comprende complementariedad de secuencia con el ARN del gen ENaC objetivo, en donde la secuencia de la cadena de sentido del ANci comprende una secuencia idéntica o sustancialmente similar a las secuencias del ARN de ENaC objetivo; y (b) introducir la molécula de ANci en una célula bajo condiciones adecuadas para modular (por ejemplo, inhibir) la expresión del gen ENaC objetivo en la célula.

En una modalidad, las moléculas de ANci de la invención se usan como reactivos en aplicaciones ex vivo. Por ejemplo, los reactivos de ANci se introducen en tejido o células que son transplantados a un sujeto para fines terapéuticos. Las células o tejido se pueden derivar de un organismo o sujeto que después recibe el explante, o se pueden derivar de otro organismo o sujeto antes del transplante. Las moléculas de ANci se pueden usar para modular la expresión de uno o más genes en las células o tejido, de tal manera que las células o tejido obtienen un fenotipo deseado o son capaces de realizar una función cuando se transplantan in vivo. En una modalidad se extraen ciertas células objetivo de un paciente. Estas células extraídas se ponen en contacto con los ANci de ENaC que hacen blanco en una secuencia de nucleótidos específica dentro de las células, bajo condiciones adecuadas para que las células incorporen estos ANci (por ejemplo, usando reactivos de suministro tales como lípidos catiónicos, liposomas, etcétera, o usando técnicas como electroporación para facilitar el suministro de los ANci a las células). Las células se reintroducen entonces al mismo paciente o a otro paciente.

En una modalidad, la invención presenta un método para modular la expresión de un gen ENaC objetivo en un explante de tejido, que comprende: (a) sintetizar una molécula de ANci de la invención, que puede ser modificada químicamente, en donde una de las cadenas de ANci comprende complementariedad de secuencia con el ARN del gen ENaC objetivo; y (b) introducir la molécula de ANci en una célula del explante de tejido derivado de un organismo particular, bajo condiciones adecuadas para modular (por ejemplo, inhibir) la expresión del gen ENaC objetivo en el explante de tejido. En otra modalidad, el método también comprende introducir el explante de tejido de vuelta al organismo del que procede el tejido, o a otro organismo, bajo condiciones adecuadas para modular (por ejemplo, inhibir) la expresión del gen ENaC objetivo en ese organismo.

En una modalidad, la invención presenta un método para modular la expresión de un gen ENaC objetivo en un explante de tejido, que comprende: (a) sintetizar una molécula de ANci de la invención, que puede ser modificada químicamente, en donde una de las cadenas de ANci comprende complementariedad de secuencia con el ARN del gen ENaC objetivo, y en donde la secuencia de la cadena de sentido del ANci comprende una secuencia idéntica o sustancialmente similar a la secuencia del ARN de ENaC objetivo; y (b) introducir la molécula de ANci en una célula del explante de tejido derivado de un organismo particular, bajo condiciones adecuadas para modular (por ejemplo, inhibir) la expresión del gen ENaC objetivo en el explante de tejido. En otra modalidad, el método también comprende introducir el explante de tejido de vuelta al organismo del que procede el tejido, o a otro organismo, bajo condiciones adecuadas para modular (por ejemplo, inhibir) la expresión del gen ENaC objetivo en ese organismo.

En otra modalidad, la invención presenta un método para modular la expresión de más de un gen ENaC objetivo en un explante de tejido, que comprende: (a) sintetizar moléculas de ANci de la invención, que pueden ser modificadas químicamente, en donde una de las cadenas de ANci comprende complementariedad de secuencia con el ARN de los genes de ENaC objetivo; y (b) introducir las moléculas de ANci en una célula del explante de tejido derivada de un organismo particular, bajo condiciones adecuadas para modular (por ejemplo, inhibir) la expresión de los genes ENaC objetivo en el explante de tejido. En otra modalidad, el método también comprende introducir el explante de tejido de vuelta al organismo del que procede el tejido, o a otro organismo, bajo condiciones adecuadas para modular (por ejemplo, inhibir) la expresión de los genes ENaC objetivo en ese organismo.

En una modalidad, la invención presenta un método para modular la expresión de un gen ENaC objetivo en un sujeto u organismo, que comprende: (a) sintetizar una molécula de ANci de la invención, que puede ser modificada químicamente, en donde una de las cadenas de ANci comprende complementariedad de secuencia con el ARN del gen ENaC objetivo; y (b) introducir la molécula de ANci en el sujeto u organismo bajo condiciones adecuadas para modular (por ejemplo, inhibir) la expresión del gen ENaC objetivo en el sujeto u organismo. La cantidad de la proteína o ARN del ENaC objetivo se puede determinar usando varios métodos conocidos.

En otra modalidad, la invención presenta un método para modular la expresión de más de un gen ENaC objetivo en un sujeto u organismo, que comprende: (a) sintetizar moléculas de ANci de la invención, que pueden ser modificadas químicamente, en donde una de las cadenas de 0 ANci comprende complementariedad de secuencia con el ARN de los genes ENaC objetivo; y (b) introducir las moléculas de ANci en el sujeto u organismo bajo condiciones adecuadas para modular (por ejemplo, inhibir) la expresión de los genes ENaC objetivo en el sujeto u organismo. La cantidad de la proteína o ARN del ENaC objetivo se puede determinar usando varios métodos conocidos.

En una modalidad, la invención presenta un método para modular la expresión de un gen ENaC objetivo dentro de una célula (por ejemplo, una célula de pulmón o epitelial de pulmón), que comprende: (a) sintetizar una molécula de ANci de la invención, que puede ser modificada químicamente, en donde el ANci comprende una secuencia de una sola cadena que tiene complementariedad con el ARN del gen ENaC objetivo; y (b) introducir la molécula de ANci en una célula bajo condiciones adecuadas para modular (por ejemplo, inhibir) la expresión del gen ENaC objetivo en la célula.

En otra modalidad, la invención presenta un método para modular la expresión de más de un gen ENaC objetivo dentro de una célula (por ejemplo, una célula de pulmón o epitelial de pulmón), que comprende: (a) sintetizar moléculas de ANci de la invención, que pueden ser modificadas químicamente, en donde el ANci comprende una secuencia de una sola cadena que tiene complementariedad con el ARN del gen ENaC objetivo; y (b) poner en contacto la célula in vitro o in vivo con la molécula de ANci bajo condiciones adecuadas para modular (por ejemplo, inhibir) la expresión de los genes ENaC objetivo en la célula.

En una modalidad, la invención presenta un método para modular la expresión de un gen ENaC objetivo en un explante de tejido (por ejemplo, pulmón o cualquier otro órgano, tejido o célula que pueda ser transplantado de un organismo a otro, o de vuelta al mismo organismo del que procede el órgano, tejido o célula) que comprende: (a) sintetizar una molécula de ANci de la invención, que puede ser modificada químicamente, en donde el ANci comprende una secuencia de una sola cadena que tiene complementariedad con el ARN del gen ENaC objetivo; y (b) poner en contacto una célula del explante de tejido derivado de un sujeto u organismo particular con la molécula de ANci, bajo condiciones adecuadas para modular (por ejemplo, inhibir) la expresión del gen ENaC objetivo en el explante de tejido. En otra modalidad, el método también comprende introducir el explante de tejido de vuelta al sujeto u organismo del que procede el tejido, o a otro sujeto u organismo, bajo condiciones adecuadas para modular (por ejemplo, inhibir) la expresión del gen ENaC objetivo en ese sujeto u organismo.

En otra modalidad, la invención presenta un método para modular la expresión de más de un gen ENaC objetivo en un explante de tejido (por ejemplo, pulmón o cualquier otro órgano, tejido o célula que pueda ser transplantado de un organismo a otro, o de vuelta al mismo organismo del cual procede el órgano, tejido o célula) que comprende: (a) sintetizar moléculas de ANci de la invención, que pueden ser modificadas químicamente, en donde el ANci comprende una secuencia de una sola cadena que tiene complementariedad con el ARN del gen ENaC objetivo; y (b) introducir las moléculas de ANci en una célula del explante de tejido derivado de un sujeto u organismo particular, bajo condiciones adecuadas para modular (por ejemplo, inhibir) la expresión de los genes ENaC objetivo en el explante de tejido. En otra modalidad, el método también comprende introducir el explante de tejido de vuelta al sujeto u organismo del que procede el tejido, o a otro sujeto u organismo, bajo condiciones adecuadas para modular (por ejemplo, inhibir) la expresión de los genes de ENaC objetivo en ese sujeto u organismo.

En una modalidad, la invención presenta un método para modular la expresión de un gen ENaC objetivo en un sujeto u organismo, que comprende: (a) sintetizar una molécula de ANci de la invención, que puede ser modificada químicamente, en donde el ANci comprende una secuencia de una sola cadena que tiene complementariedad con el ARN del gen ENaC objetivo; y (b) introducir la molécula de ANci en el sujeto u organismo bajo condiciones adecuadas para modular (por ejemplo, .inhibir) la expresión del gen ENaC objetivo en el sujeto u organismo.

En otra modalidad, la invención presenta un método para modular la expresión de más de un gen ENaC objetivo en un sujeto u organismo, que comprende: (a) sintetizar moléculas de ANci de la invención, que pueden ser modificadas químicamente, en donde el ANci comprende una secuencia de una sola cadena que tiene complementariedad con el ARN del gen ENaC objetivo; y (b) introducir las moléculas de ANci en el sujeto u organismo bajo condiciones adecuadas para modular (por ejemplo, inhibir) la expresión de los genes ENaC objetivo en el sujeto u organismo.

En una modalidad, la invención presenta un método para modular la expresión de un gen ENaC objetivo en un sujeto u organismo, que comprende poner en contacto el sujeto u organismo con una molécula de ANci de la invención, bajo condiciones adecuadas para modular (por ejemplo, inhibir) la expresión del gen ENaC objetivo en el sujeto u organismo.

En una modalidad, la invención presenta un método de tratamiento o prevención de una enfermedad, trastorno, rasgo o condición relacionada con la expresión o actividad génica en un sujeto u organismo, que comprende poner en contacto al sujeto u organismo con una molécula de ANci de la invención bajo condiciones adecuadas para modular la expresión del gen ENaC objetivo en el sujeto u organismo. La reducción de la expresión génica y por lo tanto la reducción de la cantidad de proteína/ARN respectivos, alivia en algún grado los síntomas de la enfermedad, trastorno, rasgo o condición.

En una modalidad, la invención presenta un método de tratamiento o prevención de una o más enfermedades, rasgos o condiciones respiratorias en un sujeto u organismo, que comprende poner en contacto al sujeto u organismo con una molécula de ANci de la invención bajo condiciones adecuadas para modular la expresión del gen ENaC objetivo en el sujeto u organismo, con lo cual se puede lograr el tratamiento o prevención de la enfermedad, rasgo o condición respiratoria. En una modalidad, la invención presenta el contacto del sujeto u organismo con una molécula de ANci de la invención por medio de la administración local a los tejidos o células relevantes, tales como células y tejidos del pulmón, por ejemplo por medio de suministro pulmonar. En una modalidad, la invención presenta el contacto del sujeto u organismo con una molécula de ANci de la invención por medio de la administración sistémica (por ejemplo, por medio de administración intravenosa o subcutánea del ANci), a los tejidos o células relevantes, como los tejidos y células implicadas en el mantenimiento o desarrollo de la enfermedad, rasgo o condición respiratoria en un sujeto u organismo. La molécula de ANci de la invención se puede formular o conjugar como aquí se describe, o como se conoce en la técnica, para hacer blanco en los tejidos o células apropiadas del sujeto u organismo. La molécula de ANci se puede combinar con otros tratamientos y modalidades terapéuticas como se conoce en la técnica, para el tratamiento o prevención de enfermedades, rasgos o condiciones respiratorias en un sujeto u organismo.

En una modalidad, la invención presenta un método de tratamiento o prevención de la COPD, asma, fibrosis quística, tos eosinofílica, bronquitis, sarcoidosis, fibrosis pulmonar, rinitis o sinusitis en un sujeto u organismo, que comprende poner en contacto al sujeto u organismo con una molécula de ANci de la invención, bajo condiciones adecuadas para modular la expresión del gen ENaC objetivo en el sujeto u organismo, con lo cual se logra el tratamiento o prevención de la COPD, asma, fibrosis quística, tos eosinofílica, bronquitis, sarcoidosis, fibrosis pulmonar, rinitis o sinusitis. En una modalidad, la invención presenta el contacto del sujeto u organismo con una molécula de ANci de la invención por medio de la administración local a los tejidos o células relevantes, tales como las células y tejidos del pulmón o las vías respiratorias implicadas en la COPD, asma, fibrosis quística, tos eosinofílica, bronquitis, rechazo agudo y crónico de aloinjerto de pulmón, sarcoidosis, fibrosis pulmonar, rinitis o sinusitis. En una modalidad, la invención presenta el contacto del sujeto u organismo con una molécula de ANci de la invención por medio de la administración sistémica (por ejemplo, por medio de administración intravenosa o subcutánea del ANci) a los tejidos o células relevantes, tales como los tejidos o células implicadas en el mantenimiento o desarrollo de COPD, asma, fibrosis quística, tos eosinofílica, bronquitis, rechazo agudo y crónico de aloinjerto de pulmón, sarcoidosis, fibrosis pulmonar, rinitis o sinusitis en un sujeto u organismo. La molécula de ANci de la invención se puede formular o conjugar como se describe en la presente o como se conoce en la técnica para hacer blanco en los tejidos o células apropiadas en el sujeto u organismo. La molécula de ANci se puede combinar con otros tratamientos y modalidades terapéuticas como se conoce en la técnica para el tratamiento o prevención de la COPD, asma, fibrosis quística, tos eosinofílica, bronquitis, sarcoidosis, fibrosis pulmonar, rinitis o sinusitis en un sujeto u organismo.

En una modalidad, la invención presenta un método de tratamiento o prevención de una o más enfermedades, rasgos o condiciones respiratorias en un sujeto u organismo, que comprende poner en contacto al sujeto u organismo con una molécula de ANci de la invención, bajo condiciones adecuadas para modular (por ejemplo, inhibir) la expresión de un inhibidor de la expresión del gen ENaC en el sujeto u organismo. En una modalidad el inhibidor de la expresión del gen ENaC es un miARN.

En una modalidad, la invención presenta un método de tratamiento o prevención de una o más enfermedades, rasgos o condiciones inflamatorias en un sujeto u organismo, que comprende poner en contacto al sujeto u organismo con una molécula de ANci de la invención, bajo condiciones adecuadas para modular la expresión del gen ENaC objetivo en el sujeto u organismo, con lo cual se logra el tratamiento o prevención de las enfermedades, rasgos o condiciones inflamatorias. En una modalidad, la invención presenta el contacto del sujeto u organismo con una molécula de ANci de la invención por medio de la administración local a los tejidos o células relevantes, tales como las células y tejidos del pulmón, por ejemplo mediante suministro pulmonar. En una modalidad, la invención presenta el contacto del sujeto u organismo con una molécula de ANci de la invención por medio de la administración sistémica (por ejemplo por medio de administración intravenosa o subcutánea del ANci) a los tejidos o células relevantes, tales como los tejidos o células implicadas en el mantenimiento o desarrollo de la enfermedad, rasgo o condición inflamatoria en un sujeto u organismo. La molécula de ANci de la invención se puede formular o conjugar como se describe en la presente o como se conoce en la técnica para hacer blanco en los tejidos o células apropiadas en el sujeto u organismo. La molécula de ANci se puede combinar con otros tratamientos y modalidades terapéuticas como se conoce en la técnica para el tratamiento o prevención de enfermedades, rasgos o condiciones inflamatorias en un sujeto u organismo.

En una modalidad, la invención presenta un método de tratamiento o prevención de una o más enfermedades, rasgos o condiciones inflamatorias en un sujeto u organismo, que comprende poner en contacto al sujeto u organismo con una molécula de ANci de la invención, bajo condiciones adecuadas para modular (por ejemplo, inhibir) la expresión de un inhibidor de la expresión del gen ENaC en el sujeto u organismo. En una modalidad el inhibidor de la expresión del gen ENaC es un miARN.

En una modalidad, la molécula de ANci o la molécula de ácido nucleico de doble cadena de la invención se formulan como una composición que se describe en la solicitud de patente provisional de EE. UU. No. 60/678,531 , y en la solicitud relacionada de patente provisional de EE. UU. No. 60/703,946, presentada el 29 de julio de 2005, y la solicitud de patente provisional de EE. UU. No. 60/737,024, presentada el 15 de noviembre de 2005 (Vargeese et al.).

En cualquiera de los métodos arriba descritos para el tratamiento o prevención de enfermedades, rasgos o condiciones relacionadas con el canal de sodio epitelial (ENaC) en un sujeto, el tratamiento se combina con la administración de una composición de agonista beta-2 como se reconoce generalmente en la técnica, incluso por ejemplo albuterol o sulfato de albuterol.

En cualquiera de los métodos arriba descritos para el tratamiento o prevención de enfermedades, rasgos, fenotipos o condiciones relacionadas con el canal de sodio epitelial (ENaC) en un sujeto, el tratamiento se combina con la administración de una composición de inhibidor de PDE4 se reconoce generalmente en la técnica (por ejemplo, sildenafil, motapizona, rolipram, y zaprinast, zardaverina y tolafentrina).

En una modalidad, la molécula de ANci o molécula de ácido nucleico de doble cadena de la invención se formula como una composición que se describe en la solicitud de patente provisional de EE. UU. No. 60/678,531 y en la solicitud relacionada de patente provisional de EE. UU. No. 60/703,946, presentada el 29 de julio de 2005, la solicitud de patente provisional de EE. UU. No. 60/737,024, presentada el 15 de noviembre de 2005, y USSN 1 1/353,630, presentada el 14 de febrero de 2006, y USSN 11/586,102, presentada el 24 de octubre de 2006 (Vargeese ef al.).

En cualquiera de los métodos de la presente para modular la expresión de uno o más objetivos o para tratar o prevenir enfermedades, rasgos, condiciones o fenotipos en una célula, sujeto u organismo, la molécula de ANci de la invención modula la expresión de uno o más objetivos de ENaC por medio de interferencia de ARN. En una modalidad, la interferencia de ARN es el corte del ENaC objetivo mediado por RISC (por ejemplo, interferencia de ARN mediada por ARNci). En una modalidad, la interferencia de ARN es la inhibición de la traducción del ENaC objetivo (por ejemplo, interferencia de ARN mediada por miARN). En una modalidad, la interferencia de ARN es la inhibición de la transcripción del ENaC objetivo (por ejemplo, silenciamiento de la transcripción mediado por ARNci). En una modalidad, la interferencia de ARN ocurre en el citoplasma. En una modalidad, la interferencia de ARN ocurre en el núcleo.

En cualquiera de los métodos de tratamiento de la invención, el ANci se puede administrar al sujeto como un curso del tratamiento, por ejemplo administración a varios intervalos de tiempo, por ejemplo una vez al día durante el curso del tratamiento, una vez cada dos días durante el curso del tratamiento, una vez cada tres días durante el curso del tratamiento, una vez cada cuatro días durante el curso del tratamiento, una vez cada cinco días durante el curso del tratamiento, una vez cada seis días durante el curso del tratamiento, una vez por semana durante el curso del tratamiento, una vez cada dos semanas durante el curso del tratamiento, una vez al mes durante el curso del tratamiento, etc. En una modalidad, el curso del tratamiento es una vez cada 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 semanas. En una modalidad, el curso del tratamiento es de aproximadamente 1 semana a aproximadamente 52 semanas o más largo (por ejemplo, indefinidamente). En una modalidad, el curso del tratamiento es de aproximadamente 1 mes a aproximadamente 48 meses o más largo (por ejemplo, indefinidamente).

En una modalidad, un curso de tratamiento incluye un curso de tratamiento inicial, tal como una vez cada 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 semanas o más, durante un intervalo fijo (por ejemplo, 1x, 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x, 10x o más), seguido por un curso de tratamiento de mantenimiento, tal como una vez cada 4, 6, 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 semanas o más, durante un intervalo fijo adicional (por ejemplo, 1x, 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x, 10x o más).

En cualquiera de los métodos de tratamiento de la invención, el ANci se puede administrar al sujeto sistémicamente como se describe en la presente o de otra manera conocida, solo como una monoterapia o en combinación con terapias adicionales descritas en la presente o conocidas. La administración sistémica puede incluir, por ejemplo, administración pulmonar (inhalación, nebulización, etc.), intravenosa, subcutánea, intramuscular, cateterización, nasofaríngea, transdérmica, u oral/gastrointestinal, como se conoce generalmente.

En una modalidad, en cualquiera de los métodos de tratamiento o prevención de la invención, el ANci se puede administrar al sujeto localmente o a tejidos locales como se describe en la presente o como se conoce en la técnica, solo como una monoterapia o en combinación con terapias adicionales conocidas. La administración local puede incluir, por ejemplo, inhalación, nebulización, cateterización, implantación, inyección directa, aplicación dérmica/transdérmica, por medio de stent, gotas óticas/oftálmicas, o administración en la vena porta hacia los tejidos relevantes, o cualquier otra técnica, método o procedimiento de administración local, como se conoce generalmente.

El compuesto y las formulaciones farmacéuticas de acuerdo con la invención se pueden usar en combinación con, o incluir uno o mas de, otros agentes terapéuticos, por ejemplo seleccionados de agentes antiinflamatorios, agentes anticolinérgicos (particularmente un antagonista del receptor M1/M2/M3), agonistas del adrenorreceptor ß2, agentes antiinfecciosos tales como antibióticos, antivirales, o antihistamínicos. Así, la invención provee, en un aspecto adicional, una combinación que comprende un compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable, solvato o derivado fisiológicamente funcional del mismo, junto con uno o más de otros agentes terapéuticamente activos, por ejemplo seleccionados de un agente antiinflamatorio como un corticosteroide o un AINE, un agente anticolinérgico, un agonista del adrenorreceptor ß2, un agente antiinfeccioso tal como un antibiótico o un antiviral, o un antihistamínico. Una modalidad de la invención abarca combinaciones que comprenden un compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable, solvato, o un derivado fisiológicamente funcional del mismo, junto con un agonista del adrenorreceptor ß2, o un anticolinérgico, o un inhibidor de PDE-4, o un antihistamínico.

Una modalidad de la invención abarca combinaciones que comprenden uno o dos de otros agentes terapéuticos. Será evidente para el experto en la materia que, cuando sea apropiado, los otros ingredientes terapéuticos se pueden usar en forma de sales, por ejemplo como sales de metal alcalino o amina, o como sales de adición de ácido, o profármacos, o como ésteres, por ejemplo ésteres de alquilo inferior, o como solvatos, por ejemplo hidratos, para optimizar la actividad o estabilidad, o las características físicas tales como la solubilidad del ingrediente terapéutico. También será evidente que, cuando sea apropiado, los ingredientes terapéuticos se pueden usar en forma ópticamente pura.

En una modalidad, la invención abarca una combinación que comprende un compuesto de la invención junto con un agonista del adrenorreceptor ß2. Los ejemplos no limitativos de los agonistas del adrenorreceptor ß2 incluyen salmeterol (que puede ser un racemato o un solo enantiómero tal como el enantiómero R), salbutamol (que puede ser un racemato o un solo enantiómero, tal como el enantiómero R), formoterol (que puede ser un racemato o un solo diasterómero tal como el diasterómero R,R), salmefamol, fenoterol, carmoterol, etanterol, naminterol, clenbuterol, pirbuterol, flerbuterol, reproterol, bambuterol, indacaterol, terbutalina y sus sales, por ejemplo la sal de xinafoato (1-hidroxi-2-naftalenocarboxilato) del salmeterol, la sal de sulfato o la base libre de salbutamol, o la sal fumarato de formoterol. En una modalidad, los agonistas del adrenorreceptor ß2 son agonistas del adrenorreceptor ß2 de acción prolongada, por ejemplo compuestos que proveen una broncodilatación eficaz durante aproximadamente 12 horas o mas.

Otros agonistas del adrenorreceptor ß2 incluyen los que se describen en WO 02/066422, WO 02/070490, WO 02/076933, WO 03/024439, WO 03/072539, WO 03/091204, WO 04/016578, WO 2004/022547, WO 2004/037807, WO 2004/037773, WO 2004/037768, WO 2004/039762, WO 2004/039766, WO01/42193 y WO03/042160.

Los ejemplos adicionales de agonistas del adrenorreceptor ß2 incluyen 3-(4-{[6-({(2R)-2-hidroxi-2-[4-hidroxi-3-(hidrox¡metil)fenil]etil}amino)-hexil]oxi}butil)bencenosulfonamida; 3-(3-{[7-({(2R)-2-hidroxi-2-[4-hidroxi-3-hídroximetil)fenil] etil}-amino)heptil]oxi}propil)bencenosulfonamida; 4-{(1 R)-2-[(6-{2-[(2,6-diclorobencil)oxi]etoxi}hexil)amino]-1-hidroxietil}-2- (hidroximetil)fenol; 4-{(1 R)-2-[(6-{4-[3-(ciclopentilsulfonil)fenil]butoxi}-hexil)amino]-1-hidroxietil}-2-(hidroximetil)fenol; N-[2-hidroxil-5-[(1 R)-1-htdroxi-2-[[2-4-[[(2R)-2-hidroxi-2-fen¡letil]amino]fenil]etil]amino]etil]fenil]formamida; N-2{2-[4-(3-fenil-4-metoxifenil)aminofenil]etil}-2-hidroxi-2-(8-hidroxi-2(1 H)-quinolinon-5-il)etilamina; y 5-[(R)-2-(2-{4-[4-(2-amino-2-metil-propox¡)-fenilamino]-fenil}-etilamino)-1-hidroxi-etil]-8-hidroxi-1 H-quinolin-2-ona.

En una modalidad, el agonista del adrenorreceptor ß2 puede estar en forma de una sal formada con un ácido farmacéuticamente aceptable seleccionado de ácido sulfúrico, clorhídrico, fumárico, hidroxinaftoico (por ejemplo 1- o 3-hidroxi-2-naftoico), cinámico, cinámico sustituido, trifenilacético, sulfámico, sulfamílico, naftalenoacrílico, benzoico, 4-metoxibenzoico, 2- o 4-hidroxibenzoico, 4-clorobenzoico y 4-fenilbenzoico. Los agentes antiinflamatorios adecuados incluyen los corticosteroides. Los ejemplos de corticosteroides que se pueden usar en combinación con los compuestos de la invención son los corticosteroides orales e inhalados y sus profármacos que tienen actividad antiinflamatoria. Los ejemplos no limitativos incluyen metilprednisolona, prednisolona, dexametasona, propionato de fluticasona, éster S-fluorometilo del ácido 6a,9a-difluoro-1 i -hidroxi-16a-metil-17a-[(4- metil-1 ,3-tiazol-5-carbonil)oxi]-3-oxo-androsta-1 ,4-dieno-l 7 -carbotioico, éster S-fluorometilo del ácido 6a,9a-difluoro-17a-[(2-furanilcarbonil)oxi]-1 ip-hidroxi-16a-metil-3-oxo-androsta-1 ,4-dieno-l 7 -carbotioico (furoato de fluticasona), éster de S-(2-oxo-tetrahidrofuran-3S-il) del ácido 6a,9a-difluoro-1 -hidroxi-16a-metil-3-oxo-17a-propioniloxi-androsta-1 ,4-d¡eno-17 -carbotioico, éster S-cianometilo del ácido 6a,9a-difluoro-1 i -hidroxi-16a-metil-3-oxo-17a-(2,2,3,3-tetrametilciclopropilcarbonil)oxi-androsta-1 ,4-dieno-17 -carbotioico y éster S-fluorometilo del ácido 6a,9a-difluoro-1 i -hidroxi-16a-metil-17a-(1-metilciclopropilcarbonil)oxi-3-oxo-androsta-1 ,4-dieno-l 7 -carbotioico, ésteres de beclometasona (por ejemplo el éster 17-propionato o el éster 17,21-dipropionato), budesonida, flunisolida, ésteres de mometasona (por ejemplo, furoato de mometasona), triamcinolona acetonida, rofleponida, ciclesonida (16a,17-[[(R)-cidohexilmetilen]bis(oxi)]-1 i ,21-dihidroxi-pregna-1 ,4-dieno-3,20-diona), propionato de butixocort, RPR-106541 , y ST-126. En una modalidad, los corticosteroides incluyen propionato de fluticasona, éster S-fluorometilo de ácido 6a,9a-difluoro-1 ip-hidroxi-16a-met¡l-17a-[(4-metil-1 ,3-tiazol-5-carbonil)oxi]-3-oxo-androsta-1 ,4-dieno-17 -carbotioico, éster S-fluorometilo del ácido 6a,9a-difluoro-17a-[(2-furanilcarbonil)oxi]-1 -hidroxi-16a-metil-3-oxo-androsta-1 ,4-dieno-17p-carbotioico, éster S-cianometilo del ácido 6a,9a-difluoro-11 -hidroxi-16a-metil-3-oxo-17a-(2,2,3,3-tetrametilciclopropilcarbonil)oxi-androsta-1 ,4-dieno-17 -carbotioico, y éster S-fluorometilo del ácido 6a,9a-difluoro-1 ^-hidroxi-16a-metil-17a-(1-metilciclopropilcarbonil)oxi-3-oxo-androsta-1 ,4-dieno-17P-carbotioico. Los ejemplos no limitativos de corticosteroides pueden incluir los descritos en las siguientes solicitudes de patente y patentes publicadas: WO02/088167, WO02/100879, WO02/12265, WO02/12266, WO05/005451, WO05/005452, WO06/072599 y WO06/072600.

En una modalidad, los compuestos no esteroideos que tienen agonismo de glucocorticoide que pueden tener selectividad por la transrepresión sobre la transactivación, y que pueden ser útiles en la terapia de combinación, incluyen los cubiertos por las siguientes solicitudes de patente y patentes publicadas : WO03/082827, W098/54159, WO04/005229, WO04/0090 7, WO04/018429, WO03/104195, WO03/082787, WO03/082280, WO03/059899, WO03/101932, WO02/02565, WO01/16128, WO00/66590, WO03/086294, WO04/026248, WO03/061651 , WO03/08277, WO06/000401 , WO06/000398 y WO06/015870.

Los compuestos no esteroideos que tienen agonismo glucocorticoide que pueden tener selectividad por transrepresión sobre la transactivación, y que pueden ser útiles en la terapia de combinación, incluyen los cubiertos por las siguientes patentes: WO03/082827, W098/54159, WO04/005229, WO04/009017, WO04/018429, WO03/104195, WO03/082787, WO03/082280, WO03/059899, WO03/101932, WO02/02565, WO01/16128, WO00/66590, WO03/086294, WO04/026248, WO03/061651 y WO03/08277.

Los ejemplos no limitativos de los agentes antiinflamatorios incluyen los fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINES).

Los ejemplos no limitativos de AINES incluyen cromoglicato de sodio, nedocromil de sodio, inhibidores de fosfodiesterasa (PDE) (por ejemplo teofilina, inhibidores de PDE4 o inhibidores mixtos de PDE3/PDE4), antagonistas de leucotrieno, inhibidores de la síntesis de leucotrieno (por ejemplo montelukast), inhibidores de ¡NOS, inhibidores de triptasa y elastasa, antagonistas de integrina beta 2 y agonistas o antagonistas del receptor de adenosina (por ejemplo agonistas de adenosina 2a), antagonistas de citocina (por ejemplo antagonistas de quimocina tales como un antagonista de CCR3), o inhibidores de la síntesis de citocina, o inhibidores de 5-lipooxigenasa. En una modalidad, la invención abarca inhibidores de ¡NOS (óxido nítrico sintasa inducible) para administración oral. Los ejemplos de los inhibidores de ¡NOS incluyen los que se describen en las siguientes patentes y solicitudes de patente internacionales publicadas: W093/13055, WO98/30537, WO02/50021 , W095/34534 y W099/62875. Los ejemplos de inhibidores de CCR3 incluyen los que se describen en WO02/26722.

En una modalidad, la invención provee el uso de los compuestos de fórmula (I) en combinación con un inhibidor de fosfodiesterasa 4 (PDE-4), por ejemplo en el caso de una formulación adaptada para inhalación. El inhibidor específico de PDE4 útil en este aspecto de la invención puede ser cualquier compuesto conocido que inhibe la enzima PDE4, o que se descubra que actúe como un inhibidor de PDE4, y que solo sea inhibidor de PDE4, no compuestos que inhiben otros miembros de la familia de PDE, tales como PDE3 y PDE5, así como también PDE4.

Los compuestos incluyen ácido cis-4-ciano-4-(3-ciclopentiloxi-4-metoxifenil)ciclohexan-1-carboxílico, 2-carbometoxi-4-ciano-4-(3-c¡clopropilmetoxi-4-d¡fluorometoxifenil)ciclohexan-1 -ona y cis-[4-ciano-4-(3-ciclopropilmetoxi-4-difluorometoxifenil)ciclohexan-1-ol]. También el ácido cis-4-ciano-4-[3-(ciclopentiloxi)-4-metoxifenil]ciclohexano-1 -carboxílico (conocido también como cilomilast), y sus sales, ésteres, profármacos o formas físicas que se describen en la patente de EE. UU. 5,552,438, expedida el 3 de septiembre de 1996; esta patente y los compuestos que describen se incorporan aquí como referencia en su totalidad.

Otros compuestos incluyen AWD-12-281 de Elbion (Hofgen, N. et al. 15° EFMC Int Symp Med Chem (6-10 septiembre, Edinburgh) 1998, Resumen p. 98; referencia CAS No. 247584020-9); un derivado de 9-bencíladenina denominado NCS-613 (INSERM); D-4418 de Chiroscience y Schering-Plough; un inhibidor de PDE4 de benzodiazepina identificado como CI-1018 (PD- 168787) y atribuido a Pfizer; un derivado de benzodioxol descrito por Kyowa Hakko en WO99/16766; K-34 de Kyowa Hakko; V-1 1294A de Napp (Landells, LJ. et al. Eur Resp J [Annu Cong Eur Resp Soc (19-23 septembre, Génova) 1998] 1998, 12 (Supl. 28): Resumen p 2393); roflumilast (referencia CAS No 162401-32-3) y una palazinona (WO99/47505, la descripción de la cual se incorpora aquí como referencia) de Byk-Gulden; Pumafentrine (-)-p-[(4aR*,10bS*)-9-etoxi-1 ,2,3,4,4a, 10b-hexahidro-8-metox¡-2-metilbenzo[c][1 ,6]naftiridin-6-¡l]-N,N-diisopropilbenzamida, que es un inhibidor mixto de PDE4/PDE3 que ha sido preparado y divulgado por Byk-Gulden, ahora Altana; arofilina bajo desarrollo por Almirall-Prodesfarma; VM554/UM565 de Vernalis; o T-440 (Tanabe Seiyaku; Fuji, K. et al. J Pharmacol Exp Tfter, 1998, 284(1): 162), y T2585. Compuestos adicionales se describen en las solicitudes de patente internacional publicadas WO04/024728 (Glaxo Group Ltd), WO04/056823 (Glaxo Group Ltd) y WO04/103998 (Glaxo Group Ltd).

Los ejemplos de anticolinérgicos son los compuestos que actúan como antagonistas en los receptores muscarínicos, en particular los compuestos que son antagonistas de los receptores M1 o M3, antagonistas dobles de los receptores M1/M3 o M2/M3, o pan-antagonistas de los receptores M1/M2/M3. Los compuestos ejemplares para su administración mediante inhalación incluyen ipratropio (por ejemplo como el bromuro, CAS 22254-24-6, vendido con el nombre Atrovent), oxitropio (por ejemplo como el bromuro, CAS 30286-75-0) y tiotropio (por ejemplo como el bromuro, CAS 136310-93-5, vendido con el nombre Spiriva). También son de interés el revatropato (por ejemplo como el bromhidrato, CAS 262586-79-8) y LAS-34273 que se describe en WO 01/04118. Los compuestos ejemplares para administración oral incluyen pirenzepina (CAS 28797-61-7), darifenacina (CAS 133099-04-4, o CAS 133099-07-7 para el bromhidrato vendido con el nombre Enablex), oxibutinina (CAS 5633-20-5, vendido con el nombre Ditropan), terodilina (CAS 124937-51-5, o CAS 124937-52-6, para el tartrato, vendido con el nombre Detrol), otilonio (por ejemplo como el bromuro, CAS 26095-59-0, vendido con el nombre Spasmomen), cloruro de trospio (CAS 10405-02-4) y solifenacina (CAS 242478-37-1 , o CAS 242478-38-2 para el succinato, conocido también como YM-905 y vendido con el nombre Vesicare).

Otros agentes anticolinérgicos incluyen los compuestos de la fórmula (XXI) que se describen en la solicitud de patente de EE. UU. 60/487981 : en la cual la orientación preferida de la cadena de alquilo unida al anillo de propano es endo; R31 y R32 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en grupos alquilo inferior de cadena recta o ramificada que tienen preferiblemente de 1 a 6 átomos de carbono, grupos cicloalquilo que tienen 5 o 6 átomos de carbono, cicloalquil-alquilo que tienen de 6 a 10 átomos de carbono, 2-tienilo, 2-piridilo, fenilo, fenilo sustituido con un grupo alquilo que no tiene más de 4 átomos de carbono, y fenilo sustituido con un grupo alcoxi que no tiene más de 4 átomos de carbono; X" representa un anión asociado con la carga positiva del átomo de N. X" puede ser, sin limitación, cloruro, bromuro, yoduro, sulfato, bencenosulfonato y toluenosulfonato, incluyendo por ejemplo: bromuro de (3-enoO)-3-(2,2-di-2-tieniletenil)-8,8-dimetil-8-azoniabiciclo[3.2.1]octano; bromuro de (3-endo)-3-(2,2-difeniletenil)-8,8-dimetil-8-azoniabiciclo[3.2.1 ]octano; 4-metilbencenosulfonato de (3-encfo)-3-(2,2-d¡fen¡letenil)-8,8-dimetil-8- azoniabiciclo[3.21]octano; bromuro de (3-enoO)-8,8-dimet¡l-3-[2-fenil-2-(2-t¡enil)etenil]-8-azoniabic¡clo[3.2.1]octano; o bromuro de (3-enc/o)-8,8-dimetil-3-[2-fen¡l-2-(2-piridinil)eten¡l]-8-azon¡ab¡ciclo[3.21]octano.

Agentes anticolinérgicos adicionales incluyen los compuestos de las fórmulas (XXII) o (XXIII), que se describen en la solicitud de patente de EE. UU. 60/511009: (XXIII) en donde: el átomo de H indicado está en la posición exo; R41 representa un anión asociado con la carga positiva del átomo de N. R4 puede ser, sin limitación, cloro, bromo, yodo, sulfato, bencenosulfonato y toluenosulfonato; R42 y R43 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en grupos alquilo inferior de cadena recta o ramificada (que tienen preferiblemente de 1 a 6 átomos de carbono), grupos cicloalquilo (que tienen de 5 a 6 átomos de carbono), cícloalquil-alquilo (que tiene de 6 a 10 átomos de carbono), heterocicloalquilo (que tiene 5 o 6 átomos de carbono) y N u O como el heteroátomo, heterocicloalquil-alquilo (que tiene de 6 a 10 átomos de carbono) y N u O como el heteroátomo, arilo, arilo sustituido opcionalmente, heteroahlo y heteroarilo sustituido opcionalmente; R44 se selecciona del grupo que consiste en: alquilo de C1-C6, cicloalquilo de C3-C12, heterocicloalquilo de C3-C7l alquil(Ci-C6)-cicloalqu¡lo de C3-C12, alquil(CrC6)-heterocicloalqu¡lo de C3-C , arilo, heteroarilo, alquil(Ci-C6)-arilo, alquil(Ci-C6)-heteroarilo, -OR45, -CH2OR45, -CH2OH, -CN, -CF3, -CH20(CO)R46, -C02R47, -CH2NH2, -CH2N(R47)S02R45, -S02N(R47)(R48), -CON(R 7)(R48), -CH2N(R48)CO(R46), -CH2N(R48)S02(R46), -CH2N(R48)C02(R45), -CH2N(R 8)CONH(R47); R45 se selecciona del grupo que consiste en alquilo de C1-C6, alquilo(Ci-C6)-cicloalquilo de C3-Ci2) alquil(Ci-C6)-heterocicloalquilo de C3-C7, alquil(Ci-Ce)-arilo, alquil(Ci-C6)-heteroarilo; R46 se selecciona del grupo que consiste en alquilo de C1-C6, cicloalquilo de C3-C12, heterocicloalquilo de C3-C7, alquil(Ci-CeJ-cicloalquilo de C3-C12, alquil(CrC6)-heterocicloalquilo de C3-C7, arilo, heteroarilo, alquil(Ci-C6)-arilo, alquil(Ci-C6)-heteroarilo; R47 y R48 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en: H, alquilo de d-C6, cicloalquilo de C3-Ci2, heterocicloalquilo de C3-C7, alquil(Ci-C6)-cicloalquilo de C3-C-|2, alqu¡l(CrC6)-heterocicloalquilo de C3-C7, alquil(Ci-C6)-arilo y alquil(CrC6)-heteroarilo, incluso por ejemplo: yoduro de (endo)-3-(2-metox¡-2,2-di-tiofen-2-il-etil)-8,8-dimetil-8-azonia-biciclo[3.2.1]octano; 3-((endo)-8-metil-8-aza-biciclo[3.2.1 ]oct-3-il)-2,2-difenil-propionitrilo; (endo)-8-metil-3-(2,2,2-trifenil-etil)-8-aza-biciclo[3.2.1]octano; 3-((endo)-8-metil-8-aza-biciclo[3.2.1]oct-3-il)-2,2-difenil-propionamida; ácido 3-((endo)-8-metil-8-aza-biciclo[3.2.1]oct-3-¡l)-2,2-difenil-propiónico; yoduro de (endo)-3-(2-ciano-2,2-difenil-etil)-8,8-dimetil-8-azonia-biciclo[3.2.1]octano; bromuro de (endo)-3-(2-ciano-2,2-difenil-etil)-8,8-dimetil-8-azonia-biciclo[3.2.1 joctano; 3-((endo)-8-metil-8-aza-biciclo[3.2.1 ]oct-3-¡l)-2,2-difenil-propan-1 -ol¡ A/-bencil-3-((endo)-8- metil-8-aza-biciclo[3.2.1]oct-3-il)-2,2-difenil-propionamida; yoduro de (endo)-3-(2-carbamoil-2,2-difenil-etil)-8,8-dimetil-8-azonia-biciclo[3.2.1]octano; 1-bencil-3-[3-((endo)-8-metil-8-aza-biciclo[3.2.1 ]oct-3-il)-2,2-difen¡l-propil]-urea; 1 -etil-3-[3-((enc/o)-8-metil-8-aza-biciclo[3.2.1]oct-3-il)-2,2-difenil-propil]-urea; ?/-[3-((endo)-8-metil-8-aza-biciclo[3.2.1 ]oct-3-il)-2,2-difenil-propil]-acetamida; ?/-[3-((endo)-8-metil-8-aza-biciclo[3.2.1 ]oct-3-il)-2,2-difenil-propil]-benzamida; 3-((endo)-8-metil-8-aza-biciclo[3.2.1]oct-3-il)-2,2-di-tiofen-2-il-propionitrilo; yoduro de (e ?do)-3-(2-ciano-2,2-di-tiofen-2-il-etil)-8,8-dimetil-8-azonia-b¡ciclo[3.2.1]octano; A/-[3-((endo)-8-metil-8-aza-biciclo[3.2.1]oct-3-il)-2,2-difenil-propilj-bencenosulfonamida; [3-((endo)-8-metil-8-aza-biciclo[3.2.1 ]oct-3-il)-2,2-difenil-propil]-urea; A/-[3-((endo)-8-metil-8-aza-biciclo[3.2.1 ]oct-3-il)-2,2-difenil-propilj-metanosulfonamida; o bromuro de (endo)-3-{2,2-difenil-3-[(1-fenil-metanoil)-amino]-prop¡l]-8,8-dimetil-8-azonia-biciclo[3.2.1]octano.

Compuestos adicionales incluyen: yoduro de (endo)-3-(2-metox¡-2,2-di-tiofen-2-il-etil)-8,8-dimetil-8-azonia-biciclo[3.2.1]octano; yoduro de (endo)-3-(2-ciano-2,2-difenil-etil)-8,8-dimetil-8-azonia-biciclo[3.2.1]octano; bromuro de (endo)-3-(2-ciano-2,2-difenil-etil)-8,8-dimetil-8-azonia-biciclo[3.2.1]octano; yoduro de (e 7do)-3-(2-carbamoil-2,2-difenil-etil)-8,8-dimetil-8-azonia-biciclo[3.2.1]octano; yoduro de (er>do)-3-(2-ciano-2,2-di-t¡ofen-2-il-etil)-8,8-dimetil-8-azonia-biciclo[3.2.1]octano; o bromuro de (e 7do)-3-{2,2-difenil-3-[(1-fenil-metano¡l)-aminol-prop¡l]-8,8-d¡metil-8-azonia-biciclo[3.2.1]octano.

En una modalidad, la invención provee una combinación que comprende un compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, junto con un antagonista H1. Los ejemplos de los antagonistas H1 incluyen, sin limitación, amelexanox, astemizol, azatadina, azelastina, acrivastina, bromofeniramina, cetirizina, levocetirizina, efletirizina, clorfeniramina, clemastina, ciclizina, carebastina, ciproheptadina, carbinoxamina, descarboetoxiloratadina, doxilamina, dimetindeno, ebastina, epinastina, efletirizina, fexofenadina, hidroxizina, ketotifeno, loratadina, levocabastina, mizolastina, mequitazina, mianserin, noberastina, meclizina, norastemizol, olopatadina, picumast, pirilamina, prometazina, terfenadina, tripelenamina, temelastina, trimeprazina y triprolidina, particularmente cetirizina, levocetirizina, efletirizina y fexofenadina. En una modalidad adicional, la invención provee una combinación que comprende un compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, junto con un antagonista (o agonista inverso) H3. Los ejemplos de antagonistas H3 incluyen, por ejemplo, los compuestos descritos en WO2004/035556 y en WO2006/045416. Otros antagonistas del receptor de histamina que se pueden usar en combinación con los compuestos de la presente invención incluyen antagonistas (o agonistas inversos) del receptor H4, por ejemplo los compuestos descritos en Jablonowski et al., J. Med. Chem. 46:3957-3960 (2003).

Así, en un aspecto adicional, la invención provee una combinación que comprende un compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable, solvato o derivado fisiológicamente funcional del mismo, junto con un inhibidor de PDE4.

Así, en un aspecto adicional, la invención provee una combinación que comprende un compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable, solvato o derivado fisiológicamente funcional del mismo, junto con un agonista del adrenorreceptor ß2.

Así, en un aspecto adicional, la invención provee una combinación que comprende un compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable, solvato o derivado fisiológicamente funcional del mismo, junto con un corticosteroide.

Así, en un aspecto adicional, la invención provee una combinación que comprende un compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable, solvato o derivado fisiológicamente funcional del mismo, junto con un anticolinérgico.

Así, en un aspecto adicional, la invención provee una combinación que comprende un compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable, solvato o derivado fisiológicamente funcional del mismo, junto con un antihistamínico.

Así, en un aspecto adicional, la invención provee una combinación que comprende un compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable, solvato o derivado fisiológicamente funcional del mismo, junto con un inhibidor de PDE4 y un agonista del adrenorreceptor ß2.

Así, en un aspecto adicional, la invención provee una combinación que comprende un compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable, solvato o derivado fisiológicamente funcional del mismo, junto con un anticolinérgico y un inhibidor de PDE-4.

Las combinaciones referidas anteriormente se pueden presentar convenientemente para usarse en forma de una formulación farmacéutica y por lo tanto las formulaciones farmacéuticas que comprenden una combinación como la que se define arriba, junto con un diluente o vehículo farmacéuticamente aceptable, representan un aspecto adicional de la invención.

Los compuestos individuales de dichas combinaciones se pueden administrar de forma secuencial o simultánea en formulaciones farmacéuticas separadas o combinadas. En una modalidad, los compuestos individuales se administraran simultáneamente en una formulación farmacéutica combinada. Las dosis apropiadas de los agentes terapéuticos conocidos serán apreciadas fácilmente por los expertos en la materia.

Así, en un aspecto adicional la invención provee una composición farmacéutica que comprende una combinación de un compuesto de la invención junto con otro agente terapéuticamente activo.

Así, en un aspecto adicional la invención provee una composición farmacéutica que comprende una combinación de un compuesto de la invención junto con un inhibidor de PDE4.

Así, en un aspecto adicional la invención provee una composición farmacéutica que comprende una combinación de un compuesto de la invención junto con un agonista del adrenorreceptor ß2.

Así, en un aspecto adicional la invención provee una composición farmacéutica que comprende una combinación de un compuesto de la invención junto con un corticosteroide.

Así, en un aspecto adicional la invención provee una composición farmacéutica que comprende una combinación de un compuesto de la invención junto con un anticolinérgico.

Así, en un aspecto adicional la invención provee una composición farmacéutica que comprende una combinación de un compuesto de la invención junto con antihistamínico.

La composición de la invención (por ejemplo, ANci o formulaciones LNP del mismo) se puede formular para su administración de cualquier manera adecuada, y por lo tanto la invención también incluye dentro de su alcance las composiciones farmacéuticas que comprenden una composición de la invención (por ejemplo ANci o formulaciones de LNP del mismo) juntas, si así se desea, en una mezcla con uno o más diluentes o vehículos fisiológicamente aceptables.

En una modalidad, las composiciones farmacéuticas de la invención (por ejemplo el ANci o formulaciones de LNP del mismo) se preparan mediante un procedimiento que comprende mezclar los ingredientes en una formulación adecuada. Los ejemplos no limitativos de los métodos de administración de la invención incluyen administración oral, bucal, sublingual, parenteral, rectal local u otra administración local. En una modalidad, la composición de la invención se puede administrar por medio de insuflación e inhalación. Los ejemplos no limitativos de varios tipos de formulaciones para administración local incluyen ungüentos, lociones, cremas, geles, espumas, preparados para suministro por medio de parches transdérmicos, polvos, preparados para atomizar, aerosoles, cápsulas o cartuchos para usarse en un inhalador o insuflador, o gotas (por ejemplo gotas oftálmicas o nasales), soluciones/suspensiones para nebulización, supositorios, pesarios, enemas de retención y tabletas o pildoras masticables o succionables (por ejemplo para el tratamiento de úlceras aftosas), o preparados de liposoma o de microencapsulación.

En una modalidad, una composición de la invención (por ejemplo el ANci o formulaciones de LNP del mismo, y composiciones farmacéuticas del mismo) se administra tópicamente en la nariz, por ejemplo para el tratamiento de la rinitis, incluso formulaciones de aerosol presurizadas y formulaciones acuosas administradas en la nariz por medio de una bomba presurizada. Son de particular interés las formulaciones que no están presurizadas y están adaptadas para administrarse tópicamente en la cavidad nasal. Las formulaciones adecuadas contienen agua como diluente o vehículo para este propósito. En una modalidad, se pueden proveer formulaciones acuosas para administrar la composición de la invención en el pulmón o nariz, con excipientes convencionales tales como agentes amortiguadores, agentes modificadores de tonicidad, etc. En otra modalidad también se pueden administrar formulaciones acuosas en la nariz por nebulización.

Las composiciones de la invención (por ejemplo el ANci o formulaciones de LNP del mismo, y las composiciones farmacéuticas del mismo) se pueden formular como una formulación de fluido para el suministro desde un despachador de fluido, por ejemplo un despachador de fluido que tiene una boquilla despachadora u orificio despachador, a través del cual se despacha una dosis medida de la formulación fluida por medio de la fuerza aplicada por el usuario a un mecanismo de bomba del despachador de fluido. En una modalidad, el despachador de fluido de la invención utiliza un depósito de múltiples dosis medidas de la formulación fluida, las dosis siendo despachables por el accionamiento secuencial de la bomba. En una modalidad, la boquilla u orifico de despacho de la invención se puede configurar para su inserción en las fosas nasales del usuario para el despacho de la atomización de la formulación fluida que comprende la composición de la invención en la cavidad nasal. Un despachador de fluido del tipo anteriormente mencionado se describe e ilustra en WO05/044354, cuyo contenido completo se incorpora aquí como referencia. El despachador tiene un alojamiento que aloja un dispositivo de descarga de fluido, que tiene una bomba de compresión montada en un recipiente para contener una formulación de fluido. En una modalidad, el alojamiento tiene por lo menos una palanca lateral operable con el dedo, que es movible hacia dentro con respecto al alojamiento para elevar el recipiente ascendentemente en el alojamiento y hacer que la bomba comprima y bombee una dosis medida de la formulación fuera del vástago de bomba, a través de una boquilla nasal del alojamiento. En otra modalidad, el despachador de fluido es del tipo general ilustrado en las figuras 30-40 de WO05/044354.

Ungüentos, cremas y geles se pueden formular, por ejemplo, con una base acuosa u oleosa con la adición de un agente espesante o gelificante, o disolvente. Los ejemplos no limitativos de dichas bases pueden incluir, por ejemplo, agua o un aceite tal como parafina líquida o un aceite vegetal como el aceite de ajonjolí o aceite de oliva, o un disolvente tal como polietilenglicol. Los agentes espesantes y los agentes gelificantes se pueden usar de acuerdo con la naturaleza de la base. Los ejemplos no limitativos de dichos agentes incluyen parafina blanda, estearato de aluminio, alcohol cetoestearílico, polietilenglicoles, grasa de lana, cera de abejas, carboxipolimetileno y derivados de celulosa, o monoestearato de glicerilo, o agentes emulsionantes no iónicos.

En una modalidad se pueden formular lociones con una base acuosa u oleosa y en general también contendrán uno o más agentes emulsionantes, agentes estabilizadores, agentes dispersantes, agentes de suspensión o agentes espesantes.

En una modalidad se pueden formar polvos para aplicación externa con la ayuda de cualquier base de polvo adecuada, por ejemplo talco, lactosa o almidón. Las gotas se pueden formular con una base acuosa o no acuosa que también comprende uno o mas agentes dispersantes, agentes solubilizantes, agentes de suspensión o conservadores.

Las composiciones para atomizar se pueden formular, por ejemplo, como soluciones o suspensiones acuosas o como aerosoles suministrados desde envases presurizados, tal como un inhalador dosificador, con el uso de un propulsor licuado adecuado. En una modalidad, las composiciones de aerosol de la invención adecuadas para inhalación pueden ser una suspensión o una solución, y generalmente contienen un compuesto de fórmula (I) y un propulsor adecuado tal como un fluorocarburo o clorofluorocarburo que contiene hidrógeno, o mezclas de los mismos, particularmente hidrofluoroalcanos, especialmente 1 ,1 ,1 ,2-tetrafluoroetano, 1 ,1 ,1,2,3,3,3-heptafluoro-n-propano, o una mezcla de los mismos. Opcionalmente la composición de aerosol puede contener excipientes de formulación adicionales muy conocidos, tales como los agentes tensoactivos. Los ejemplos no limitativos incluyen ácido oleico, lecitina o un derivado de ácido oligoláctico, o un derivado como los que se describen en W094/21229 y W098/34596, y cod ¡solventes, por ejemplo etanol. En una modalidad, una formulación farmacéutica de aerosol de la invención comprende un compuesto de la invención y como propulsor un fluorocarburo o clorofluorocarburo que contiene hidrógeno, o mezclas de los mismos, opcionalmente en combinación con un agente tensoactivo o un codisolvente.

Las formulaciones de la composición de la invención pueden comprender un aerosol farmacéutico, en donde el propulsor se selecciona de 1 ,1 ,1,2-tetrafluoroetano, 1 ,1 ,1 , 2,3, 3,3-heptafluoro-n-propano, y mezclas de los mismos.

Las formulaciones de la invención se pueden hacer amortiguadoras agregando agentes amortiguadores adecuados.

Se pueden formular cápsulas y cartuchos que comprenden la composición de la invención para usarse en un inhalador o insuflador, por ejemplo de gelatina, conteniendo una mezcla de polvo para inhalación de un compuesto de la invención y una base de polvo adecuado, tal como lactosa o almidón. En una modalidad, cada cápsula o cartucho puede contener en general de 20 pg a 10 mg del compuesto de fórmula (I). En otra modalidad el compuesto de la invención se puede presentar sin excipientes tales como lactosa.

La proporción del compuesto activo de fórmula (I) en las composiciones locales de acuerdo con la invención depende del tipo preciso de formulación que se va a preparar, pero generalmente estará dentro de la escala de 0.001% a 10% en peso. En una modalidad, la proporción en la mayoría de tipos de preparados usados estará en la escala de 0.005% a 1 %, por ejemplo de 0.01% a 0.5%. En otra modalidad, la composición de la invención comprende polvos para inhalación o insuflación en donde la proporción usada normalmente estará dentro de la escala de 0.1 % a 5%.

Las formulaciones de aerosol que comprenden la composición de la invención preferiblemente se disponen de tal manera que cada dosis medida o "golpe" de aerosol contiene de 20 pg a 10 mg. En una modalidad la formulación de aerosol es de 20 pg a 2000 pg. En otra modalidad la formulación de aerosol es de 20 pg a 500 pg de un compuesto de fórmula (I). La administración puede ser una vez al día o varias veces al día, por ejemplo 2, 3, 4 u 8 veces, dando por ejemplo 1 , 2 o 3 dosis cada vez. En una modalidad, la dosis diaria general con un aerosol que comprende la composición de la invención estará dentro de la escala de 100 pg a 10 mg. En otra modalidad, la dosis diaria general con un aerosol que comprende la composición de la invención estará dentro de la escala de 200 pg a 2000 pg. La dosis diaria general y la dosis medida suministrada por cápsulas y cartuchos en un inhalador o insuflador generalmente será el doble de la suministrada con formulaciones de aerosol.

En el caso de formulaciones de aerosol en suspensión, el tamaño de partícula de las partículas de fármaco (por ejemplo micronizado) debe ser tal que permitan la inhalación de sustancialmente todo el fármaco en los pulmones después de la administración de la formulación de aerosol. En una modalidad, el tamaño de partícula de las partículas será menor de 100 mieras. En otra modalidad, el tamaño de partícula de las partículas será menor de 20 mieras. La escala de tamaño de partículas puede estar dentro de la escala de 1 a 10 mieras. En una modalidad la escala de partículas puede ser de 1 a 5 mieras. En otra modalidad la escala de partículas puede ser de 2 a 3 mieras.

Las formulaciones de la invención se pueden preparar por dispersión o disolución del medicamento y un compuesto de la invención en el propulsor seleccionado en un recipiente adecuado. En una modalidad, la dispersión o disolución es con la ayuda de sonicación o un mezclador de alto esfuerzo cortante. El procedimiento se efectúa preferiblemente bajo condiciones de humedad controlada.

La estabilidad química y física y la aceptación farmacéutica de las formulaciones de aerosol de acuerdo con la invención pueden ser determinadas con técnicas muy conocidas para los expertos en la materia. En una modalidad, la estabilidad química de los componentes puede ser determinada por medio de una prueba de HPLC, por ejemplo después de almacenamiento prolongado del producto. Datos de estabilidad física se pueden obtener de otras técnicas analíticas convencionales. En una modalidad se pueden obtener datos de estabilidad física por medio de pruebas de fuga, mediante la prueba de suministro de válvula (pesos de disparo promedio por accionamiento), mediante una prueba de reproducibilidad de dosis (ingrediente activo por accionamiento), y análisis de distribución de atomización.

La estabilidad de las formulaciones de aerosol en suspensión de acuerdo con la invención se puede medir mediante las técnicas convencionales. En una modalidad, la estabilidad del aerosol en suspensión se puede medir determinando la distribución de tamaño de floculación usando un instrumento de retrodispersión de luz, o midiendo la distribución de tamaño de partícula por impacto de cascada o por medio del proceso analítico "impactador de dos fases".

Como se usa aquí, la referencia a la prueba de "impactador de dos fases" significa la "determinación del depósito de la dosis emitida en inhalaciones presurizadas usándose el aparato A" como se define en la Farmacopea Británica de 1988, p. A204-207, apéndice XVII C. Estas técnicas permiten calcular la "fracción respirable" de las formulaciones de aerosol. En una modalidad, un método usado para calcular la "fracción respirable" es por referencia a la "fracción de partícula fina", que es la cantidad de ingrediente activo recolectado en la cámara de impacto inferior por accionamiento, expresada como el porcentaje de la cantidad total de ingrediente activo suministrado por accionamiento, usando el método de impactador de dos etapas arriba descrito.

El término "inhalador dosificador" o MDI significa una unidad que comprende un bote, una tapa asegurada que cubre el bote y una válvula dosificadora de formulación situada en la tapa. El sistema MDI incluye un dispositivo de canalización adecuado. Los dispositivos de canalización adecuados de la invención comprenden por ejemplo un accionador de válvula y un pasaje cilindrico o cónico, a través del cual el medicamento puede ser suministrado del bote lleno a través de la válvula dosificadora a la nariz o boca de un paciente, por ejemplo un accionador de pieza bucal.

Normalmente los botes de MDI de la invención comprenden un recipiente capaz de resistir la presión de vapor del propulsor usado, tal como una botella de plástico o de vidrio revestido con plástico, o preferiblemente un bote de metal, por ejemplo aluminio o una aleación del mismo, que opcionalmente puede estar anodizado, revestido de laca o revestido de plástico (por ejemplo, WO96/32099, incorporada aquí como referencia, en donde una parte o todas las superficies internas se revisten con uno o más polímeros de fluorocarburo, opcionalmente en combinación con uno o más polímeros que no son fluorocarburo), dicho recipiente se cierra con una válvula dosificadora. En una modalidad, la tapa se puede asegurar sobre el bote por medio de soldadura ultrasónica, acoplamiento de rosca o doblado hacia adentro. Los MDI enseñados en la presente se pueden preparar mediante los métodos conocidos (véase Byron, arriba citado, y WO096/32099). En una modalidad, el bote de la invención se acopla con un ensamble de tapa, en donde una válvula dosificadora de fármaco se sitúa en la tapa, y dicha tapa se dobla hacia adentro a su posición.

En una modalidad de la invención, la superficie interna metálica del bote se reviste con un fluoropolímero, muy preferiblemente mezclado con un compuesto no fluoropolímero. En otra modalidad de la invención, la superficie interna metálica del bote se reviste con una mezcla de polímero de politetrafluoroetileno (PTFE) y polietersulfona (PES). En una modalidad adicional de la invención, toda la superficie interna metálica del bote se reviste con una mezcla de polímero de politetrafluoroetileno (PTFE) y polietersulfona (PES).

Las válvulas dosificadoras se diseñan para suministrar una cantidad medida de la formulación por accionamiento e incorporan un empaque para impedir la fuga del propulsor a través de la válvula. El empaque puede comprender cualquier material elastomérico adecuado, tal como por ejemplo polietileno de baja densidad, clorobutilo, bromobutilo, EPDM, hules de butadieno-acrilonitrilo negros y blancos, hule de butilo y neopreno. Las válvulas adecuadas están disponibles comercialmente de fabricantes muy conocidos en la industria del aerosol, por ejemplo de Valois, Francia (por ejemplo, DFIO, DF30, DF60), Bespak pie, Reino Unido (por ejemplo, BK300, BK357) y 3M-Neotechnic Ltd, Reino Unido (por ejemplo, SpraymiserTM).

En varias modalidades, los MDI también se pueden usar en conjunto con otras estructuras tales como por ejemplo, sin limitación, paquetes de envoltura para guardar y contener los MDI, que incluyen los que se describen en las patentes de EE. UU. Nos. 6,119,853; 6,179,118; 6,315,112; 6,352,152; 6,390,291 ; y 6,679,374, y también las unidades de conteo de dosis tales como por ejemplo, sin limitación, las que se describen en las patentes de EE. UU. Nos. 6,360,739 y 6,431 ,168.

En la fabricación de aerosoles farmacéuticos se pueden utilizar los métodos convencionales de fabricación a granel y maquinaria muy conocida para los expertos, para preparar lotes a gran escala para la producción comercial de los botes llenos. De esta manera, por ejemplo, en un método de fabricación a granel para preparar formulaciones de aerosol en suspensión, una válvula dosificadora se dobla hacia dentro de un bote de aluminio para formar un bote vacío. El medicamento en partículas se añade a un recipiente de carga, y un propulsor licuado junto con los excipientes opcionales se llena a presión a través del recipiente de carga hacia un recipiente de fabricación. La suspensión de fármaco se mezcla antes de reciclar hacia una máquina de llenado y entonces una alícuota de la suspensión de fármaco se dosifica a través de la válvula dosificadora hacia el bote. En un ejemplo del método de fabricación a granel para preparar formulaciones de aerosol en solución, una válvula dosificadora se dobla hacia un bote de aluminio para formar un bote vacío. El propulsor licuado junto con los excipientes opcionales y el medicamento disuelto se llenan a presión a través del recipiente de carga hacia un recipiente de fabricación.

En otra modalidad, una alícuota de la formulación licuada se agrega a un bote abierto bajo condiciones que son suficientemente frías para asegurar que la formulación no se vaporice, y después una válvula dosificadora se dobla hacia el bote.

Normalmente, en los lotes preparados para uso farmacéutico, cada bote lleno se revisa para determinar su peso, se codifica con un número de lote y se empaca en una bandeja para almacenamiento antes de la prueba de liberación.

Los preparados tópicos se pueden administrar por medio de una o más aplicaciones por día en el área afectada; se pueden usar ventajosamente sobre vendajes oclusivos en zonas de la piel. Se puede obtener suministro continuo o prolongado por medio de un sistema de depósito de adhesivo.

Para administración interna, los compuestos de acuerdo con la invención (por ejemplo el ANci o formulaciones de LNP del mismo), se pueden formular por ejemplo de la manera convencional para administración oral, nasal, parenteral o rectal. En una modalidad, las formulaciones para administración oral incluyen jarabes, elíxires, polvos, gránulos, tabletas y cápsulas, que normalmente contienen excipientes convencionales tales como agentes aglutinantes, rellenos, lubricantes, desintegradores, agentes de mojado, agentes de suspensión, agentes emulsionantes, conservadores, sales amortiguadoras, saborizantes, colorantes o edulcorantes, según sea apropiado. Las formas de dosis unitaria se pueden preferir como se describe mas abajo.

Los compuestos de la invención se pueden administrar en general por vía interna cuando está indicada una terapia sistémica de agonista del receptor de glucocorticoide.

Las formulaciones de liberación lenta o con recubrimiento entérico pueden ser ventajosas, particularmente para el tratamiento de trastornos inflamatorios del intestino.

En algunas modalidades, los compuestos de la invención (por ejemplo el ANci o las formulaciones de LNP del mismo) se formularán para administración oral. En otras modalidades el compuesto de la invención se formulará para administración por inhalación.

En otra modalidad, la invención presenta un método para modular la expresión de más de un gen ENaC objetivo en un sujeto u organismo, que comprende poner en contacto al sujeto u organismo con una o más moléculas de ANci de la invención bajo condiciones adecuadas para modular (por ejemplo, inhibir) la expresión de los genes ENaC objetivo en el sujeto u organismo.

Las moléculas de ANci de la invención se pueden diseñar para regular negativamente o inhibir la expresión de genes objetivo mediante ¡ARN haciendo blanco en una variedad de moléculas de ácido nucleico. En una modalidad, las moléculas de ANci de la invención se usan para hacer blanco en varios ADN que corresponden a un gen objetivo, por ejemplo por medio de silenciamiento heterocromático o inhibición transcripcional. En una modalidad, las moléculas de ANci de la invención se usan para hacer blanco en varios ARN que corresponden a un gen objetivo, por ejemplo mediante corte del ARN objetivo o inhibición de la traducción. Los ejemplos no limitativos de tales ARN incluyen ARN mensajero (ARNm), ARN no codificador (ARNnc), o elementos reguladores (véase por ejemplo Mattick, 2005, Science, 309, 1527-1528, y Claverie, 2005, Science, 309, 1529-1530) que incluyen miARN y otros ARN pequeños, isotipos alternos del ARN del gen objetivo, ARN modificado postranscripcionalmente del gen objetivo, pre-ARNm del gen objetivo, o moldes de ARN. Si el empalme alterno produce una familia de transcritos que se distinguen por el uso de exones apropiados, la presente invención se puede usar para inhibir la expresión de genes por medio de los exones apropiados para inhibir o distinguir específicamente entre las funciones de los miembros de la familia de genes. Por ejemplo, una proteína que contiene un dominio de transmembrana empalmado alternativamente puede ser expresada en forma tanto unida a la membrana como secretada. El uso de la invención para hacer blanco en el exón que contiene el dominio de transmembrana, puede servir para determinar las consecuencias funcionales de la terapia farmacéutica dirigida a la forma de la proteína unida a la membrana a diferencia de la forma secretada. Los ejemplos no limitativos de aplicaciones de la invención con respecto a la dirección a estas moléculas de ARN incluyen aplicaciones farmacéuticas terapéuticas, aplicaciones cosméticas, aplicaciones veterinarias, aplicaciones de descubrimiento de fármacos, diagnóstico molecular y aplicaciones de función de genes, y mapeo de genes, por ejemplo usando mapeo de polimorfismo de un solo nucleótido con las moléculas de ANci de la invención. Dichas aplicaciones se pueden poner en práctica usando las secuencias génicas conocidas o las secuencias parciales disponibles de una marca de secuencia expresada (EST).

En otra modalidad, las moléculas de ANci de la invención se usan para hacer blanco en secuencias conservadas objetivo que corresponden a una familia o familias de genes, tales como la familia de genes ENaC (por ejemplo, todos los isotipos conocidos de ENaC, o agrupamientos selectos de isotipos de ENaC). Por lo tanto, las moléculas de ANci que hacen blanco en múltiples objetivos de ENaC pueden aumentar el efecto terapéutico. Además, evadiendo otros isotipos de ENaC se puede evadir la toxicidad.

En una modalidad, las moléculas de ANci se pueden usar para caracterizar las rutas de la función de los genes en una variedad de aplicaciones. Por ejemplo, la presente invención se puede usar para inhibir la actividad de genes objetivo de una ruta para determinar la función de los genes no caracterizados en el análisis de la función de los genes, en el análisis de la función del ARNm, o en el análisis de la traducción. La invención se puede usar en el desarrollo farmacéutico para determinar las rutas potenciales de los genes objetivo implicadas en varias enfermedades y condiciones. La invención también se puede usar para entender las rutas de la expresión génica implicadas por ejemplo en las enfermedades, trastornos, rasgos y condiciones respiratorias, inflamatorias o autoinmunes.

En una modalidad, las moléculas de ANci o los métodos de la invención se usan para regular negativamente la expresión de los genes que codifican un ARN referido por su Registro de Genbank, por ejemplo los genes objetivo que codifican secuencias de ARN referidas aquí por su número de Registro de Genbank, por ejemplo los Nos. de Registro de Genbank mostrados en la presente (por ejemplo, en el cuadro 7).

En una modalidad, la invención también presenta un método que comprende: (a) generar una colección de construcciones de ANci que tienen una complejidad predeterminada; y (b) analizar las construcciones de ANci de (a) bajo condiciones adecuadas para determinar los sitios objetivo de i-ARN dentro de la secuencia de ARN objetivo. En una modalidad, las moléculas de ANci de (a) tienen cadenas de longitud fija, por ejemplo aproximadamente 23 nucleótidos de longitud. En otra modalidad, las moléculas de ANci de (a) son de longitud diferente, por ejemplo tienen cadenas de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 nucleótidos de longitud (por ejemplo, aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o 30). En una modalidad, la prueba puede comprender una prueba de ANci reconstituido in vitro como se describe en la presente. En otra modalidad, la prueba puede comprender un sistema de cultivo de célula en el cual se expresa el ARN objetivo. En otra modalidad, se analiza el grado de corte detectable de los fragmentos del ARN objetivo, por ejemplo, mediante electroforesis en gel, análisis de Northern blot, pruebas de protección de RNasa, para determinar los sitios objetivo más adecuados dentro de la secuencia de ARN objetivo. La secuencia de ARN objetivo se puede obtener como es conocido en la técnica, por ejemplo, por clonación o transcripción para sistemas in vitro, y por expresión celular en sistemas in vivo.

En una modalidad, la invención presenta un método que comprende: (a) generar una colección aleatorizada de construcciones de ANci que tienen una complejidad predeterminada, tal como de 4N, en donde N representa el número de nucleótidos de bases apareadas en cada cadena de la construcción de ANci (por ejemplo, para una construcción de ANci que tiene cadenas de sentido y antisentido de 21 nucleótidos con 19 pares de bases, la complejidad sería 419); y (b) analizar las construcciones de ANci de (a) bajo condiciones adecuadas para determinar los sitios objetivo de i-ARN dentro de la secuencia de ARN objetivo. En otra modalidad, las moléculas de ANci de (a) tienen cadenas de longitud fija, por ejemplo aproximadamente 23 nucleótidos de longitud. En otra modalidad, las moléculas de ANci de (a) son de longitud diferente, por ejemplo tienen cadenas de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 nucleótidos de longitud (por ejemplo, aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o 30). En una modalidad, la prueba puede comprender una prueba de ANci reconstituido in vitro. En otra modalidad, la prueba puede comprender un sistema de cultivo de célula en el cual se expresa el ARN objetivo. En otra modalidad, se analiza el grado de corte detectable de los fragmentos del ARN objetivo, por ejemplo, mediante electroforesis en gel, análisis de Northern blot, pruebas de protección de RNasa, para determinar los sitios objetivo más adecuados dentro de la secuencia de ARN objetivo. La secuencia de ARN objetivo se puede obtener como es conocido en la técnica, por ejemplo, por clonación o transcripción para sistemas in vitro, y por expresión celular en sistemas in vivo.

En otra modalidad, la invención presenta un método que comprende: (a) analizar la secuencia de un ARN objetivo codificado por un gen objetivo; (b) sintetizar uno o más conjuntos de moléculas de ANci que tienen complementariedad de secuencia con una o más regiones del ARN de (a); y (c) analizar las moléculas de ANci de (b) bajo condiciones adecuadas para determinar los objetivos de i-ARN dentro de la secuencia del ARN objetivo. En una modalidad, las moléculas de ANci de (b) tienen cadenas de longitud fija, por ejemplo de aproximadamente 23 nucleótidos de longitud. En otra modalidad, las moléculas de ANci de (b) son de longitud diferente, por ejemplo tienen cadenas de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 nucleótidos de longitud (por ejemplo, aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o 30). En una modalidad, la prueba puede comprender una prueba de ANci reconstituido in vitro como se describe en la presente. En otra modalidad la prueba puede comprender un sistema de cultivo de célula en el cual se expresa el ARN objetivo. Se analiza el grado de corte detectable de los fragmentos del ARN objetivo, por ejemplo, mediante electroforesis en gel, análisis de Northern blot, o pruebas de protección de RNasa, para determinar los sitios objetivo más adecuados dentro de la secuencia de ARN objetivo. La secuencia de ARN objetivo se puede obtener como es conocido en la técnica, por ejemplo, por clonación o transcripción para sistemas in vitro, y por expresión en sistemas in vivo.

Por "sitio objetivo" se entiende una secuencia dentro de un ARN objetivo que es "el blanco" del corte mediado por una construcción de ANci, que contiene secuencias dentro de su región de antisentido que son complementarias a la secuencia objetivo.

Por "grado de corte detectable" se entiende el corte del ARN objetivo (y la formación de productos de ARN cortado) a una magnitud suficiente para distinguir los productos de corte sobre el fondo de los ARN producidos por la degradación aleatoria del ARN objetivo. La producción de productos de corte de 1-5% del ARN objetivo es suficiente para detectar arriba del fondo en la mayoría de los métodos de detección.

En una modalidad, la invención presenta una composición que comprende una molécula de ANci de la invención, que puede ser químicamente modificada, en un vehículo o diluente farmacéuticamente aceptable. En otra modalidad, la invención presenta una composición farmacéutica que comprende moléculas de ANci de la invención, que pueden ser químicamente modificadas, que están dirigidas a uno o más genes, en un vehículo o diluente farmacéuticamente aceptable. En otra modalidad, la invención presenta un método para diagnosticar una enfermedad, rasgo o condición en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una composición de la invención bajo condiciones adecuadas para el diagnóstico de la enfermedad, rasgo o condición en el sujeto. En otra modalidad, la invención presenta un método de tratamiento o prevención de una enfermedad, rasgo o condición, tal como trastornos respiratorios, inflamatorios o autoinmunes en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una composición de la invención bajo condiciones adecuadas para el tratamiento o prevención de la enfermedad, rasgo o condición en el sujeto, sola o en conjunto con uno o más de otros compuestos terapéuticos.

En otra modalidad, la invención presenta un método para validar un gen objetivo, que comprende: (a) sintetizar una molécula de ANci de la invención, que puede ser modificada químicamente, en donde una de las cadenas de ANci incluye complementariedad de secuencia con el ARN de un gen objetivo; (b) introducir la molécula de ANci en una célula, tejido, sujeto, u organismo, bajo condiciones adecuadas para modular la expresión del gen objetivo en la célula, tejido, sujeto, u organismo; y (c) determinar la función del gen examinando cualquier cambio fenotípico en la célula, tejido, sujeto, u organismo.

En otra modalidad, la invención presenta un método para validar un objetivo, que comprende: (a) sintetizar una molécula de ANci de la invención, que puede ser modificada químicamente, en donde una de las cadenas de ANci incluye complementariedad de secuencia con el ARN de un gen objetivo; (b) introducir la molécula de ANci en un sistema biológico bajo condiciones adecuadas para modular la expresión del gen objetivo en el sistema biológico; y (c) determinar la función del gen examinando cualquier cambio fenotípico en el sistema biológico.

Por "sistema biológico" se entiende un material, en forma purificada o no purificada, de fuentes biológicas que incluyen sin limitación un humano o animal, en donde el sistema comprende los componentes requeridos para la actividad de i-ARN. El término "sistema biológico" incluye por ejemplo una célula, tejido, sujeto, u organismo, o extracto de los mismos. El término sistema biológico también incluye sistemas reconstituidos de i-ARN que se pueden usar in vitro.

Por "cambio fenotípico" se entiende cualquier cambio detectable de una célula que ocurre en respuesta al contacto o tratamiento con una molécula de ANci de la invención (por ejemplo, ANci). Tales cambios detectables incluyen, sin limitación, cambios en la forma, tamaño, proliferación, motilidad, expresión de proteína o expresión de ARN, u otros cambios físicos o químicos que se pueden probar por medio de los métodos conocidos. El cambio detectable también puede incluir la expresión de genes/moléculas reporteros tales como la proteína verde fluorescente (GFP) o varias marcas que se usan para identificar una proteína expresada o cualquier otro componente celular que se pueda probar.

En una modalidad, la invención presenta un kit que contiene una molécula de ANci de la invención, que puede ser químicamente modificada, que se puede usar para modular la expresión de un gen objetivo en un sistema biológico, que incluye, por ejemplo, una célula, tejido, sujeto, u organismo. En otra modalidad, la invención presenta un kit que contiene más de una molécula de ANci de la invención, que pueden ser químicamente modificadas, que se pueden usar para modular la expresión de más de un gen objetivo en un sistema biológico, que incluye, por ejemplo, una célula, tejido, sujeto, u organismo.

En una modalidad, la invención presenta una célula que contiene una o más moléculas de ANci de la invención, que pueden ser químicamente modificadas. En otra modalidad, la célula que contiene una molécula de ANci de la invención es una célula de mamífero. En otra modalidad, la célula que contiene una molécula de ANci de la invención es una célula humana.

En una modalidad, la síntesis de una molécula de ANci de la invención, que puede ser químicamente modificada, comprende: (a) la síntesis de dos cadenas complementarias de la molécula de ANci; (b) aparear las dos cadenas complementarias bajo condiciones adecuadas para obtener una molécula de ANci de doble cadena. En otra modalidad, la síntesis de las dos cadenas complementarias de la molécula de ANci es por medio de síntesis de oligonucleótido en fase sólida. En otra modalidad, la síntesis de las dos cadenas complementarias de la molécula de ANci es por medio de síntesis de oligonucleótido en fase sólida en tándem.

En una modalidad, la invención presenta un método para sintetizar una molécula dúplex de ANci, que comprende: (a) sintetizar una primera cadena de secuencia de oligonucleótido de la molécula de ANci, en donde la primera cadena de secuencia de oligonucleótido comprende una molécula enlazadora separable que se puede usar como un andamio para la síntesis de la segunda cadena de secuencia de oligonucleótido del ANci; (b) sintetizar la segunda cadena de secuencia de oligonucleótido de ANci sobre el andamio de la primera cadena de secuencia de oligonucleótido, en donde la segunda cadena de secuencia de oligonucleótido también comprende una porción química que se puede usar para purificar el dúplex de ANci; (c) separar la molécula enlazadora de (a) bajo condiciones adecuadas para que los das dos cadenas de oligonucleótido de ANci se híbriden y formen un dúplex estable; y (d) purificar el dúplex de ANci utilizando la porción química de la segunda cadena de secuencia de oligonucleótido. En una modalidad, la separación de la molécula enlazadora de (c) ocurre durante la desprotección del oligonucleótido, por ejemplo bajo condiciones de hidrólisis usando una base de alquilamina como metilamina. En una modalidad, el método de síntesis comprende síntesis en fase sólida sobre un soporte sólido tal como vidrio de poro controlado (CPG) o poliestireno, en donde la primera secuencia de (a) se sintetiza en un enlazador separable, tal como un enlazador de succinilo, usando el soporte sólido como un andamio. El enlazador separable de (a) usado como andamio para sintetizar la segunda cadena puede comprender una reactividad similar a la del enlazador modificado del soporte sólido, de tal manera que la separación del enlazador modificado del soporte sólido y el enlazador separable de (a) ocurre concomitantemente. En otra modalidad, la porción química de (b) que se puede usar para aislar la secuencia de oligonucleótido enlazado comprende un grupo tritilo, por ejemplo un grupo dimetoxitritilo, que se puede usar en una estrategia de síntesis sobre tritilo como se describe en la presente. En otra modalidad, la porción química, tal como un grupo dimetoxitritilo, se separa durante la purificación, por ejemplo usando condiciones ácidas.

En una modalidad adicional, el método de síntesis de ANci es una síntesis en fase de solución o síntesis en fase híbrida, en donde las dos cadenas del dúplex de ANci se sintetizan en tándem usando un enlazador separable unido a la primera secuencia, que actúa como un andamio para la síntesis de la segunda secuencia. La separación del enlazador bajo condiciones adecuadas para la hibridación de las cadenas de secuencia de ANci separadas da como resultado la formación de la molécula de ANci de doble cadena.

En otra modalidad, la invención presenta un método para sintetizar una molécula de ANci dúplex, que comprende: (a) sintetizar una cadena de secuencia de oligonucleótido de la molécula de ANci, en donde la secuencia comprende una molécula de enlazador separable que se puede usar como un andamio para la síntesis de otra secuencia de oligonucleótido; (b) sintetizar una segunda secuencia de oligonucleótido que tiene complementariedad con la primera cadena de secuencia sobre el andamio de (a), en donde la segunda secuencia comprende la otra cadena de la molécula de ANci de doble cadena, y en donde la segunda secuencia también comprende una porción química que se puede usar para aislar la secuencia de oligonucleótido unida; (c) purificar el producto de (b) utilizando la porción química de la segunda cadena de secuencia de oligonucleótido, bajo condiciones adecuadas para aislar la secuencia de longitud completa que comprende las dos cadenas de oligonucleótido de ANci unidas por el enlazador separable, y bajo condiciones adecuadas para que las dos cadenas de oligonucleótido de ANci se hibriden y formen un dúplex estable. En una modalidad, la separación de la molécula enlazadora de (c) ocurre durante la desprotección del oligonucleótido, por ejemplo bajo condiciones de hidrólisis. En otra modalidad, la separación de la molécula enlazadora de (c) ocurre después de la desprotección del oligonucleótido. En otra modalidad, el método de síntesis comprende síntesis en fase sólida sobre un soporte sólido, tal como vidrio de poro controlado (CPG) o poliestireno, en donde la primera secuencia de (a) se sintetiza sobre un enlazador separable, tal como un enlazador de succinilo, usando el soporte sólido como un andamio. El enlazador separable de (a) usado como andamio para sintetizar la segunda cadena puede comprender una reactividad similar o diferente al enlazador modificado del soporte sólido, de tal manera que la separación del enlazador modificado del soporte sólido y el enlazador separable de (a) ocurre de forma concomitante o secuencial. En una modalidad, la porción química de (b) que se puede usar para aislar la secuencia de oligonucleótido unida comprende un grupo tritilo, por ejemplo un grupo dimetoxitritilo.

En otra modalidad, la invención presenta un método para hacer una molécula de ANci de doble cadena en un solo proceso de síntesis que comprende: (a) sintetizar un oligonucleótido que tiene una primera y una segunda secuencia, en donde la primera secuencia es complementaria a la segunda secuencia, y la primera secuencia de oligonucleótido se une a la segunda secuencia por medio de un enlazador separable, y en donde un grupo protector 5'-terminal, por ejemplo un grupo 5'-0-dimetoxitritilo (5'-0-DMT) permanece sobre el oligonucleótido que tiene la segunda secuencia; (b) desproteger el oligonucleótido dando como resultado la separación del enlazador que une las dos secuencias de oligonucleótido; y (c) purificar el producto de (b) bajo condiciones adecuadas para aislar la molécula de ANci de doble cadena, por ejemplo usando una estrategia de síntesis con tritilo como se describe en la presente.

En otra modalidad, el método de síntesis de las moléculas de ANci de la invención comprende las enseñanzas de Scaringe et al., patentes de EE. UU. Nos. 5,889,136; 6,008,400; y 6,1 1 1 ,086, que se incorporan aquí como referencia en su totalidad.

En una modalidad, la invención presenta construcciones de ANci que median i-ARN contra un polinucleótido de ENaC objetivo, en donde las construcciones de ANci comprenden una o más modificaciones químicas, por ejemplo, una o más modificaciones químicas que tienen cualquiera de las fórmulas ?-? ? I , o cualquier combinación de las mismas, que aumentan la resistencia a la nucleasa de la construcción de ANci.

En otra modalidad, la invención presenta un método para generar moléculas de ANci con mayor resistencia a la nucleasa, que comprende (a) introducir nucleótidos que tienen cualquiera de las fórmulas I-VII, o cualquier combinación de las mismas, en una molécula de ANci, y (b) analizar la molécula de ANci del paso (a) bajo condiciones adecuadas para aislar las moléculas de ANci que tienen mayor resistencia a la nucleasa.

En otra modalidad, la invención presenta un método para generar moléculas de ANci con un perfil toxicológico mejorado (por ejemplo, que tienen propiedades inmunoestimuladoras atenuadas o que no las tienen), que comprende (a) introducir nucleótidos que tienen cualquiera de las fórmulas l-VII (por ejemplo, los motivos de ANci referidos en el cuadro 8), o cualquier combinación de las mismas, en una molécula de ANci, y (b) analizar la molécula de ANci del paso (a) bajo condiciones adecuadas para aislar las moléculas de ANci que tienen los perfiles toxicológicos mejorados.

En otra modalidad, la invención presenta un método para generar formulaciones de ANci con un perfil toxicológico mejorado (por ejemplo, que tienen propiedades inmunoestimuladoras atenuadas o que no las tienen), que comprende (a) generar una formulación de ANci que comprende una molécula de ANci de la invención y un vehículo de suministro o partícula de suministro como se describe en la presente, o como se conoce en la técnica, y (b) analizar la formulación de ANci del paso (a) bajo condiciones adecuadas para aislar las formulaciones de ANci que tienen perfiles toxicológicos mejorados.

En otra modalidad, la invención presenta un método para generar moléculas de ANci que no estimulan una respuesta de interferón en una célula, sujeto, u organismo (por ejemplo, ninguna respuesta de interferón o una respuesta de interferón atenuada), que comprende (a) introducir en una molécula de ANci nucleótidos que tienen cualquiera de las fórmulas l-VII (por ejemplo, los motivos de ANci referidos en el cuadro 8), o cualquier combinación de las mismas, y (b) analizar la molécula de ANci del paso (a) bajo condiciones adecuadas para aislar las moléculas de ANci que no estimulan una respuesta de interferón.

En otra modalidad, la invención presenta un método para generar formulaciones de ANci que no estimulan una respuesta de interferón en una célula, sujeto, u organismo (por ejemplo, ninguna respuesta de interferón o una respuesta de interferón atenuada), que comprende (a) generar una formulación de ANci que comprende una molécula de ANci de la invención y un vehículo de suministro o partícula de suministro como se describe en la presente, o como se conoce en la técnica, y (b) analizar la formulación de ANci del paso (a) bajo condiciones adecuadas para aislar las formulaciones de ANci que no estimulan una respuesta de interferón. En una modalidad, el interferón comprende interferón alfa.

En otra modalidad, la invención presenta un método para generar moléculas de ANci que no estimulan una respuesta inflamatoria o proinflamatoria de citocina en una célula, sujeto, u organismo (por ejemplo, ninguna respuesta de citocina, o una respuesta de citocina atenuada), que comprende (a) introducir en una molécula de ANci nucleótidos que tienen cualquiera de las fórmulas l-VII (por ejemplo, los motivos de ANci referidos en el cuadro 8), o cualquier combinación de las mismas, y (b) analizar la molécula de ANci del paso (a) bajo condiciones adecuadas para aislar las moléculas de ANci que no estimulan una respuesta de citocina. En una modalidad, la citocina comprende una interleucina como la interleucina 6 (IL-6) o el factor de necrosis de tumor alfa (TNF-a).

En otra modalidad, la invención presenta un método para generar formulaciones de ANci que no estimulan una respuesta inflamatoria o proinflamatoria de citocina en una célula, sujeto, u organismo (por ejemplo, ninguna respuesta de citocina, o una respuesta de citocina atenuada), que comprende (a) generar una formulación de ANci que comprende una molécula de ANci de la invención y un vehículo de suministro o partícula de suministro como se describe en la presente, o como se conoce en la técnica, y (b) analizar la formulación de ANci del paso (a) bajo condiciones adecuadas para aislar las formulaciones de ANci que no estimulan una respuesta de citocina. En una modalidad, la citocina comprende una interleucina como la interleucina 6 (IL-6) o el factor de necrosis de tumor alfa (TNF- ).

En otra modalidad, la invención presenta un método para generar moléculas de ANci que no estimulan una respuesta del receptor de tipo Toll (TLR) en una célula, sujeto, u organismo (por ejemplo, ninguna respuesta de TLR o una respuesta de TLR atenuada), que comprende (a) introducir en una molécula de ANci nucleótidos que tienen cualquiera de las fórmulas l-VII (por ejemplo, los motivos de ANci referidos en el cuadro 8), o cualquier combinación de las mismas, y (b) analizar la molécula de ANci del paso (a) bajo condiciones adecuadas para aislar las moléculas de ANci que no estimulan una respuesta de TLR. En una modalidad, el TLR comprende TLR3, TLR7, TLR8 o TLR9.

En otra modalidad, la invención presenta un método para generar formulaciones de ANci que no estimulan una respuesta de receptor de tipo Toll (TLR) en una célula, sujeto, u organismo (por ejemplo, ninguna respuesta de TLR o una respuesta de TLR atenuada), que comprende (a) generar una formulación de ANci que comprende una molécula de ANci de la invención y un vehículo de suministro o partícula de suministro como se describe en la presente, o como se conoce en la técnica, y (b) analizar la formulación de ANci del paso (a) bajo condiciones adecuadas para aislar las formulaciones de ANci que no estimulan una respuesta de TLR. En una modalidad, el TLR comprende TLR3, TLR7, TLR8 o TLR9.

En una modalidad, la invención presenta una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) de doble cadena, químicamente sintetizada, que dirige el corte de un ARN objetivo por medio de interferencia de ARN (i-ARN), en donde: (a) cada cadena de dicha molécula de ANci es de aproximadamente 18 a aproximadamente 38 nucleótidos de longitud; (b) una cadena de dicha molécula de ANci comprende una secuencia de nucleótidos que tiene suficiente complementariedad con dicho ARN objetivo para que la molécula de ANci dirija el corte del ARN objetivo por medio de interferencia de ARN; y (c) en donde las posiciones de nucleótido dentro de dicha molécula de ANci están modificadas químicamente para reducir las propiedades inmunoestimuladoras de la molécula de ANci hasta un grado menor que la molécula de ARNci no modificado correspondiente. Se dice que tales moléculas de ANci tienen un perfil toxicológico mejorado en comparación con un ANci no modificado o mínimamente modificado.

Por "perfil toxicológico mejorado" se entiende que la construcción de ANci químicamente modificada o formulada exhibe una toxicidad en una célula, sujeto u organismo menor en comparación con un ANci no modificado o no formulado o una molécula de ANci que tiene menos modificaciones o que tiene modificaciones que son menos efectivas para disminuir la toxicidad. También se considera que tales moléculas de ANci tienen "una actividad de i-ARN mejorada". En un ejemplo no limitativo, las moléculas y formulaciones de ANci con perfiles toxicológicos mejorados están asociadas con propiedades inmunoestimuladoras reducidas, tales como una respuesta inmunoestimuladora reducida, disminuida o atenuada en una célula, sujeto u organismo, en comparación con un ANci no modificado o no formulado o una molécula de ANci que tiene menos modificaciones o que tiene modificaciones que son menos efectivas para disminuir la toxicidad. Tal perfil toxicológico mejorado se caracteriza por inmunoestimulación suprimida o reducida, tal como reducción o supresión de la inducción de interferones (por ejemplo interferón alfa), citocinas inflamatorias (por ejemplo interleucinas tales como IL-6 o TNF-alfa), o receptores de tipo Toll (por ejemplo, TLR3, TLR7, TLR8 o TLR9). En una modalidad, una molécula o formulación de ANci con un perfil toxicológico mejorado no comprende ribonucleótidos. En una modalidad, una molécula o formulación de ANci con un perfil toxicológico mejorado comprende menos de 5 ribonucleótidos (por ejemplo 1 , 2, 3, o 4 ribonucleótidos). En una modalidad, una molécula o formulación de ANci con un perfil toxicológico mejorado comprende Stab 7, Stab 8, Stab 11 , Stab 12, Stab 13, Stab 16, Stab 17, Stab 18, Stab 19, Stab 20, Stab 23, Stab 24, Stab 25, Stab 26, Stab 27, Stab 28, Stab 29, Stab 30, Stab 31 , Stab 32, Stab 33, Stab 34, Stab 35, Stab 36, o cualquier combinación de las mismas (véase el cuadro 8). Aquí, las químicas numéricas de Stab incluyen las versiones 2'-fluoro y 2'-OCF3 de las químicas mostradas en el cuadro 8. Por ejemplo, "Stab 7/8" se refiere tanto a Stab 7/8 como a Stab 7F/8F, etc. En una modalidad, una molécula o formulación de ANci con un perfil toxicológico mejorado comprende una molécula de ANci de la invención y una formulación como se describe en la publicación de la solicitud de patente de EE. UU. No. 20030077829, que se incorpora en la presente como referencia en su totalidad, incluso los dibujos.

En una modalidad, el grado de respuesta inmunoestimuladora asociada con una molécula de ANci dada se puede medir como se describe en la presente o como se conoce en la técnica, por ejemplo determinando el grado de respuesta de PKR/interferón, proliferación, activación de células B, o producción de citocinas, en pruebas para cuantificar la respuesta inmunoestimuladora de moléculas de ANci particulares (véase por ejemplo Leifer et al., 2003, J Immunother. 26, 313-9; y patente de EE. UU. No. 5,968,909, que se incorporan en su totalidad como referencia). En una modalidad, la respuesta inmunoestimuladora reducida es de entre aproximadamente 10% y aproximadamente 100% en comparación con una molécula de ARNci no modificado o mínimamente modificado, por ejemplo, aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100% de respuesta inmunoestimuladora reducida. En una modalidad, la respuesta inmunoestimuladora asociada con una molécula de ANci se puede modular por medio del grado de modificación química. Por ejemplo, se puede seleccionar una molécula de ANci que tiene modificadas entre aproximadamente 10% y aproximadamente 100% (por ejemplo, aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100%, o por lo menos aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100%) de las posiciones de nucleótido de la molécula de ANci, que tenga un grado correspondiente de propiedades inmunoestimuladoras como se describe en la presente.

En una modalidad, el grado de reducción de la respuesta inmunoestimuladora se selecciona para optimizar la actividad de i-ARN. Por ejemplo, se puede preferir un cierto grado de inmunoestimulación para tratar las infecciones virales, en donde se puede preferir menos de 100% de reducción de la inmunoestimulación para obtener una actividad antiviral máxima (por ejemplo, aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, o 90% de reducción de inmunoestimulación), mientras que la inhibición de la expresión de un gen endógeno objetivo se puede preferir con moléculas de ANci que tienen mínimas propiedades inmunoestimuladoras para prevenir la toxicidad inespecífica o efectos de fuera del blanco (por ejemplo, aproximadamente de 90% a aproximadamente 100% de reducción de inmunoestimulación).

En una modalidad, la invención presenta una molécula de ANci de doble cadena químicamente sintetizada que dirige el corte de un ARN objetivo por medio de interferencia de ARN (i-ARN), en donde (a) cada cadena de dicha molécula de ANci es de aproximadamente 18 a aproximadamente 38 nucleótidos de longitud; (b) una cadena de dicha molécula de ANci comprende una secuencia de nucleótidos que tiene suficiente complementariedad con dicho ARN objetivo para que la molécula de ANci dirija el corte del ARN objetivo por medio de interferencia de ARN; y (c) en donde uno o más nucleótidos de dicha molécula de ANci están modificados químicamente para reducir las propiedades inmunoestimuladoras de la molécula de ANci hasta un grado inferior a una molécula de ANci no modificada correspondiente. En una modalidad, cada cadena comprende por lo menos aproximadamente 18 nucleótidos que son complementarios a los nucleótidos de la otra cadena.

En otra modalidad, la molécula de ANci que comprende nucleótidos modificados para reducir las propiedades inmunoestimuladoras de la molécula de ANci, comprende una región de antisentido que tiene una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos de un gen objetivo, o una porción de la misma, y además comprende una región de sentido, en donde dicha región de sentido comprende una secuencia de nucleótidos sustancialmente similar a la secuencia de nucleótidos de dicho gen objetivo o porción de la misma. En una modalidad de la misma, la región de antisentido y la región de sentido comprenden de aproximadamente 18 a aproximadamente 38 nucleótidos, en donde dicha región de antisentido comprende por lo menos aproximadamente 18 nucleótidos que son complementarios a nucleótidos de la región de sentido. En una modalidad de la misma, los nucleótidos de pirimidina en la región de sentido son nucleótidos de 2'-0-met¡l-pihmidina. En otra modalidad de la misma, los nucleótidos de purina en la región de sentido son nucleótidos de 2'-desoxi-purina. En otra modalidad de la misma, los nucleótidos de pirimidina presentes en la región de sentido son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro-pirimidina. En otra modalidad de la misma, los nucleótidos de pirimidina de dicha región de antisentido son nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro-pirimidina. En otra modalidad de la misma, los nucleótidos de purina de dicha región de antisentido son nucleótidos de 2'-0-metil-purina. En otra modalidad más, los nucleótidos de purina presentes en dicha región de antisentido comprenden nucleótidos de 2'-desoxipurina. En otra modalidad, la región de antisentido comprende un enlace internucleotídico de fosforotioato en el extremo 3' de dicha región de antisentido. En otra modalidad, la región de antisentido comprende una modificación de glicerilo en un extremo 3' de dicha región de antisentido.

En otras modalidades, la molécula de ANci que comprende nucleótidos modificados para reducir las propiedades inmunoestimuladoras de la molécula de ANci, puede comprender cualquiera de las características estructurales de las moléculas de ANci aquí descritas. En otras modalidades, la molécula de ANci que comprende nucleótidos modificados para reducir las propiedades inmunoestimuladoras de la molécula de ANci, puede comprender cualquiera de las modificaciones químicas de las moléculas de ANci aquí descritas.

En una modalidad, la invención presenta un método para generar una molécula de ANci de doble cadena sintetizada químicamente que tiene nucleótidos modificados para reducir las propiedades inmunoestimuladoras de la molécula de ANci, que comprende (a) introducir uno o más nucleótidos modificados en la molécula de ANci, y (b) analizar la molécula de ANci del paso (a) bajo condiciones adecuadas para aislar una molécula de ANci que tiene propiedades inmunoestimuladoras reducidas en comparación con una molécula de ANci correspondiente que no tiene nucleótidos modificados. Cada cadena de la molécula de ANci es de aproximadamente 18 a aproximadamente 38 nucleótidos de longitud. Una cadena de la molécula de ANci comprende una secuencia de nucleótidos que tiene suficiente complementariedad con el ARN objetivo para que la molécula de ANci dirija el corte del ARN objetivo por medio de interferencia de ARN. En una modalidad, las propiedades inmunoestimuladoras reducidas comprenden una inducción suprimida o reducida de las citocinas inflamatorias o proinflamatorias, tales como la interleucina 6 (IL-6) o el factor de necrosis de tumor alfa (TNF-a), en respuesta al ANci introducido en una célula, tejido, u organismo. En otra modalidad, las propiedades inmunoestimuladoras reducidas comprenden una inducción suprimida o reducida de los receptores de tipo Toll (TLR), tales como TLR3, TLR7, TLR8 o TLR9, en respuesta al ANci introducido en una célula, tejido, u organismo. En otra modalidad, las propiedades inmunoestimuladoras reducidas comprenden una inducción suprimida o reducida de interferones, tales como el interferón alfa, en respuesta al ANci introducido en una célula, tejido, u organismo.

En una modalidad, la invención presenta construcciones de ANci que median i-ARN contra un polinucleótido objetivo, en donde la construcción de ANci comprende una o más modificaciones químicas aquí descritas que modulan la afinidad de unión entre las cadenas de sentido y antisentido de la construcción de ANci.

En otra modalidad, la invención presenta un método para generar moléculas de ANci con afinidad de unión incrementada entre las cadenas de sentido y antisentido de la molécula de ANci, que comprende (a) introducir nucleótidos que tienen cualquiera de las fórmulas l-VII, o cualquier combinación de las mismas, en una molécula de ANci, y (b) analizar la molécula de ANci del paso (a) bajo condiciones adecuadas para aislar las moléculas de ANci que tienen afinidad de unión incrementada entre las cadenas de sentido y antisentido de la molécula de ANci.

En una modalidad, la invención presenta construcciones de ANci que median i-ARN contra un polinucleótido objetivo, en donde la construcción de ANci comprende una o más modificaciones químicas descritas en la presente que modulan la afinidad de unión entre la cadena de antisentido de la construcción de ANci y una secuencia de ARN objetivo complementaria dentro de una célula.

En una modalidad, la invención presenta construcciones de ANci que median i-ARN contra un polinucleótido objetivo, en donde la construcción de ANci comprende una o más modificaciones químicas descritas en la presente que modulan la afinidad de unión entre la cadena de antisentido de la construcción de ANci y una secuencia de ADN objetivo complementaria dentro de una célula.

En otra modalidad, la invención presenta un método para generar moléculas de ANci con afinidad de unión incrementada entre la cadena de antisentido de la molécula de ANci y una secuencia de ARN objetivo complementaria, que comprende (a) introducir nucleótidos que tienen cualquiera de las fórmulas l-VII, o cualquier combinación de las mismas, en una molécula de ANci, y (b) analizar la molécula de ANci del paso (a) bajo condiciones adecuadas para aislar las moléculas de ANci que tienen afinidad de unión incrementada entre la cadena de antisentido de la molécula de ANci y una secuencia de ARN objetivo complementaria.

En otra modalidad, la invención presenta un método para generar moléculas de ANci con afinidad de unión incrementada entre la cadena de antisentido de la molécula de ANci y una secuencia de ADN objetivo complementaria, que comprende (a) introducir nucleótidos que tienen cualquiera de las fórmulas I-VI I , o cualquier combinación de las mismas, en una molécula de ANci, y (b) analizar la molécula de ANci del paso (a) bajo condiciones adecuadas para aislar las moléculas de ANci que tienen afinidad de unión incrementada entre la cadena de antisentido de la molécula de ANci y una secuencia de ADN objetivo complementaria.

En una modalidad, la invención presenta construcciones de ANci que median i-ARN contra un polinucleótido objetivo, en donde la construcción de ANci comprende una o más modificaciones químicas descritas en la presente que modulan la actividad de una polimerasa celular capaz de generar moléculas endógenas adicionales de ANci que tienen homología de secuencia con la construcción de ANci químicamente modificada.

En otra modalidad, la invención presenta un método para generar moléculas de ANci capaces de mediar un incremento de la actividad de una polimerasa celular, capaz de generar moléculas endógenas adicionales de ANci que tienen homología de secuencia con una molécula de ANci químicamente modificada, que comprende (a) introducir nucleótidos que tienen cualquiera de las fórmulas l-VII, o cualquier combinación de las mismas, en una molécula de ANci, y (b) analizar la molécula de ANci del paso (a), bajo condiciones adecuadas para aislar las moléculas de ANci capaces de mediar un incremento de la actividad de una polimerasa celular capaz de generar moléculas endógenas adicionales de ANci, que tienen homología de secuencia con la molécula de ANci químicamente modificada.

En una modalidad, la invención presenta construcciones de ANci químicamente modificadas que median i-ARN contra un polinucleótido objetivo en una célula, en donde las modificaciones químicas no afectan significativamente la interacción del ANci con una molécula objetivo de ARN, ADN o proteína, u otros factores que son esenciales para la i-ARN, de una manera que disminuya la eficacia de la i-ARN mediada por dichas construcciones de ANci.

En otra modalidad, la invención presenta un método para generar moléculas de ANci con especificidad de i-ARN mejorada contra objetivos de polinucleótido, que comprende (a) introducir nucleótidos que tienen cualquiera de las fórmulas l-VII, o cualquier combinación de las mismas, en una molécula de ANci, y (b) analizar la molécula de ANci del paso (a) bajo condiciones adecuadas para aislar las moléculas de ANci que tienen especificidad de i-ARN mejorada. En una modalidad, la especificidad mejorada comprende reducción de los efectos de fuera de blanco en comparación con una molécula de ANci no modificada. Por ejemplo, la introducción de porciones de casquete terminal en el extremo 3', el extremo 5', o tanto el extremo 3' como 5' de la cadena o región de sentido de una molécula de ANci de la invención, puede mejorar la especificidad del ANci impidiendo que la cadena de sentido o región de sentido actúe como un molde para la actividad de i-ARN contra un blanco correspondiente que tiene complementariedad con la cadena de sentido o región de sentido.

En otra modalidad, la invención presenta un método para generar moléculas de ANci con actividad de i-ARN mejorada contra un polinucleótido objetivo, que comprende (a) introducir nucleótidos que tienen cualquiera de las fórmulas l-VI I , o cualquier combinación de las mismas, en una molécula de ANci, y (b) analizar la molécula de ANci del paso (a) bajo condiciones adecuadas para aislar las moléculas de ANci que tienen actividad mejorada de i-ARN.

En otra modalidad, la invención presenta un método para generar moléculas de ANci con actividad de i-ARN mejorada contra un ARN objetivo, que comprende (a) introducir nucleótidos que tienen cualquiera de las fórmulas l-VI I , o cualquier combinación de las mismas, en una molécula de ANci, y (b) analizar la molécula de ANci del paso (a) bajo condiciones adecuadas para aislar las moléculas de ANci que tienen actividad de i-ARN mejorada contra el ARN objetivo.

En otra modalidad, la invención presenta un método para generar moléculas de ANci con actividad de i-ARN mejorada contra un ADN objetivo, que comprende (a) introducir nucleótidos que tienen cualquiera de las fórmulas l-VI I , o cualquier combinación de las mismas, en una molécula de ANci, y (b) analizar la molécula de ANci del paso (a) bajo condiciones adecuadas para aislar las moléculas de ANci que tienen actividad de i-ARN mejorada contra el ADN objetivo.

En una modalidad, la invención presenta construcciones de ANci que median i-ARN contra un polinucleótido objetivo, en donde la construcción de ANci comprende una o más modificaciones químicas que se describen en la presente, que modulan la incorporación celular de la construcción de ANci, tal como conjugación con colesterol del ANci.

En otra modalidad, la invención presenta un método para generar moléculas de ANci contra un polinucleótido objetivo con incorporación celular mejorada, que comprende (a) introducir nucleótidos que tienen cualquiera de las fórmulas l-VII, o cualquier combinación de las mismas, en una molécula de ANci, y (b) analizar la molécula de ANci del paso (a) bajo condiciones adecuadas para aislar las moléculas de ANci que tienen incorporación celular mejorada.

En una modalidad, la invención presenta construcciones de ANci que median i-ARN contra un polinucleótido objetivo, en donde la construcción de ANci comprende una o más modificaciones químicas descritas en la presente, que aumentan la biodisponibilidad de la construcción de ANci, por ejemplo, uniendo conjugados poliméricos como polietilenglicol o conjugados equivalentes que mejoran la farmacocinética de la construcción de ANci, o uniendo conjugados que hacen blanco en tipos específicos de tejidos o células in vivo. Ejemplos no limitativos de dichos conjugados se describen en Vargeese et al., serie de EE. UU. No. 10/201 ,394, que se incorpora aquí como referencia.

En una modalidad, la invención presenta un método para generar moléculas de ANci de la invención con biodisponibilidad mejorada, que comprende (a) introducir un conjugado en la estructura de una molécula de ANci, y (b) analizar la molécula de ANci del paso (a) bajo condiciones adecuadas para aislar las moléculas de ANci que tienen biodisponibilidad mejorada. Tales conjugados pueden incluir ligandos para receptores celulares, tales como péptidos derivados de ligandos de proteína naturales; secuencias de localización de proteína que incluyen secuencias celulares de código ZIP; anticuerpos; aptámeros de ácido nucleico; vitaminas y otros cofactores tales como folato y N-acetilgalactosamina; polímeros, tales como polietilenglicol (PEG); fosfolípidos; colesterol; derivados de colesterol, poliaminas, tales como espermina o espermidina; y otros.

En una modalidad, la invención presenta una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) de doble cadena que comprende una primera secuencia de nucleótidos complementaria a una secuencia de ARN objetivo o una porción de la misma, y una segunda secuencia que tiene complementariedad con dicha primera secuencia, en donde dicha segunda secuencia está modificada químicamente de manera que ya no puede actuar como una secuencia guía para mediar eficientemente la interferencia de ARN, o ser reconocida por proteínas celulares que facilitan la i-ARN. En una modalidad, la primera secuencia de nucleótidos del ANci se modifica químicamente como se describe en la presente. En una modalidad, la primera secuencia de nucleótidos del ANci no está modificada (por ejemplo, es toda de ARN).

En una modalidad, la invención presenta una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) de doble cadena que comprende una primera secuencia de nucleótidos complementaria a una secuencia de ARN objetivo o una porción de la misma, y una segunda secuencia que tiene complementariedad con dicha primera secuencia, en donde la segunda secuencia está diseñada o modificada de modo que impide su entrada a la ruta de i-ARN como una secuencia guía o como una secuencia que es complementaria a una secuencia de ácido nucleico objetivo (por ejemplo, ARN). En una modalidad, la primera secuencia de nucleótidos del ANci está modificada químicamente como se describe en la presente. En una modalidad, la primera secuencia de nucleótidos del ANci no está modificada (por ejemplo, es toda de ARN). Es de esperar que tales diseños o modificaciones incrementen la actividad del ANci o mejoren la especificidad de las moléculas de ANci de la invención. También se espera que estas modificaciones minimicen cualquier efecto de fuera de blanco o toxicidad asociada.

En una modalidad, la invención presenta una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) de doble cadena que comprende una primera secuencia de nucleótidos complementaria a una secuencia de ARN objetivo o una porción de la misma, y una segunda secuencia que tiene complementariedad con dicha primera secuencia, en donde dicha segunda secuencia es incapaz de actuar como secuencia guía para mediar la interferencia de ARN. En una modalidad, la primera secuencia de nucleótidos del ANci está modificada químicamente como se describe en la presente. En una modalidad, la primera secuencia de nucleótidos del ANci no está modificada (por ejemplo, es toda de ARN).

En una modalidad, la invención presenta una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) de doble cadena que comprende una primera secuencia de nucleótidos complementaria a una secuencia de ARN objetivo o una porción de la misma, y una segunda secuencia que tiene complementariedad con dicha primera secuencia, en donde dicha segunda secuencia no tiene un grupo terminal 5'-hidroxilo (5'-OH) ni 5'-fosfato.

En una modalidad, la invención presenta una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) de doble cadena que comprende una primera secuencia de nucleótidos complementaria a una secuencia de ARN objetivo o una porción de la misma, y una segunda secuencia que tiene complementariedad con dicha primera secuencia, en donde dicha segunda secuencia comprende una porción de casquete terminal en el extremo 5' de dicha segunda secuencia. En una modalidad, la porción de casquete terminal comprende una porción abásica invertida, desoxi abásica invertida, nucleótido invertido, un grupo mostrado en la figura 7, un grupo alquilo o cicloalquilo, un heterociclo, o cualquier otro grupo que impide la actividad de i-ARN, en el cual la segunda secuencia sirve como secuencia guía o molde para la i-ARN.

En una modalidad, la invención presenta una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) de doble cadena que comprende una primera secuencia de nucleótidos complementaria a una secuencia de ARN objetivo o una porción de la misma, y una segunda secuencia que tiene complementariedad con dicha primera secuencia, en donde dicha segunda secuencia comprende una porción de casquete terminal en el extremo 5' y en el extremo 3' de dicha segunda secuencia. En una modalidad, cada porción de casquete terminal comprende individualmente una porción abásica invertida, desoxi abásica invertida, nucleótido invertido, un grupo mostrado en la figura 7, un grupo alquilo o cicloalquilo, un heterociclo, o cualquier otro grupo que impide la actividad de i-ARN en el cual la segunda secuencia sirve como secuencia guía o molde para la i-ARN.

En una modalidad, la invención presenta un método para generar moléculas de ANci de la invención con especificidad mejorada para regular negativamente o inhibir la expresión de un ácido nucleico objetivo (por ejemplo, un ADN o ARN, tal como un gen o su ARN correspondiente), que comprende (a) introducir una o más modificaciones químicas en la estructura de una molécula de ANci, y (b) analizar la molécula de ANci del paso (a) bajo condiciones adecuadas para aislar las moléculas de ANci que tienen especificidad mejorada. En otra modalidad, la modificación química usada para mejorar la especificidad comprende modificaciones de casquete terminal en el extremo 5', el extremo 3', o los extremos tanto 5' como 3' de la molécula de ANci. Las modificaciones de casquete terminal pueden comprender, por ejemplo, las estructuras mostradas en la figura 7 (por ejemplo, porciones desoxi abásicas invertidas), o cualquier otra modificación química que haga a una porción de la molécula de ANci (por ejemplo la cadena de sentido) incapaz de mediar la interferencia de ARN contra una secuencia de ácido nucleico fuera de blanco. En un ejemplo no limitativo, una molécula de ANci se diseña de tal manera que solo la secuencia de antisentido de la molécula de ANci puede servir como una secuencia guía para la degradación mediada por RISC de una secuencia de ARN objetivo correspondiente. Esto se puede realizar desactivando la secuencia de sentido del ANci por introducción de modificaciones químicas en la cadena de sentido que obstaculizan el reconocimiento de la cadena de sentido como una secuencia guía por la maquinaria de i-ARN. En una modalidad, tales modificaciones químicas comprenden cualquier grupo químico en el extremo 5' de la cadena de sentido del ANci, o cualquier otro grupo que sirva para hacer la cadena de sentido inactiva como secuencia guía para mediar la interferencia de ARN. Estas modificaciones, por ejemplo, pueden producir una molécula en donde el extremo 5' de la cadena de sentido ya no tiene un grupo 5'-hidroxilo (5'-OH) libre ni un grupo 5'-fosfato libre (por ejemplo, fosfato, difosfato, trifosfato, fosfato cíclico, etc.). Se describen en la presente ejemplos no limitativos de dichas construcciones de ANci, tales como la química "Stab 9/10", "Stab 7/8", "Stab 7/19", "Stab 17/22", "Stab 23/24", "Stab 24/25" y "Stab 24/26" (por ejemplo, cualquier ANci que tiene cadenas de sentido Stab 7, 9, 17, 23, o 24), y variantes de las mismas (véase el cuadro 8), en donde el extremo 5' y el extremo 3' de la cadena de sentido del ANci no comprenden un grupo hidroxilo ni un grupo fosfato. Aquí, la química numérica Stab incluye las versiones 2'-fluoro y 2'-OCF3 de las químicas mostradas en el cuadro 8. Por ejemplo, "Stab 7/8" se refiere a Stab 7/8 y Stab 7F/8F, etc.

En una modalidad, la invención presenta un método para generar moléculas de ANci de la invención con especificidad mejorada para regular negativamente o inhibir la expresión de un ácido nucleico objetivo (por ejemplo, un ADN o ARN, tal como un gen ENaC o su ARN codificador o no codificador correspondiente), que comprende introducir una o más modificaciones químicas en la estructura de una molécula de ANci que impiden que una cadena o porción de la molécula de ANci actúe como un molde o secuencia guía para la actividad de i-ARN. En una modalidad, la cadena inactiva o región de sentido de la molécula de ANci es la cadena de sentido o región de sentido de la molécula de ANci, es decir, la cadena o región del ANci que no tiene complementariedad con la secuencia de ácido nucleico objetivo. En una modalidad, dichas modificaciones químicas comprenden cualquier grupo químico en el extremo 5' de la cadena o región de sentido del ANci que no comprende un grupo 5'-hidroxilo (5'-OH) ni 5'-fosfato, o cualquier otro grupo que sirva para hacer la cadena de sentido o región de sentido inactiva como secuencia guía para mediar la interferencia de ARN. En la presente descripción se dan ejemplos no limitativos de dichas construcciones de ANci, tales como la química "Stab 9/10", "Stab 7/8", "Stab 7/19", "Stab 17/22", "Stab 23/24", "Stab 24/25", y "Stab 24/26" (por ejemplo, cualquier ANci que tiene cadenas de sentido Stab 7, 9, 17, 23, o 24) y variantes de las mismas (véase el cuadro IV), en donde el extremo 5' y el extremo 3' de la cadena de sentido del ANci no comprende un grupo hidroxilo ni un grupo fosfato. Aquí, la química numérica Stab incluye las versiones 2'-fluoro y 2'-OCF3 de las químicas mostradas en el cuadro 8. Por ejemplo, "Stab 7/8" se refiere a Stab 7/8 y Stab 7F/8F, etc.

En una modalidad, la invención presenta un método para seleccionar moléculas de ANci que son activas para mediar la interferencia de ARN contra una secuencia de ácido nucleico objetivo, que comprende (a) generar una pluralidad de moléculas de ANci no modificadas, (b) seleccionar las moléculas de ANci del paso (a) bajo condiciones adecuadas para aislar las moléculas de ANci que son activas para mediar la interferencia de ARN contra la secuencia de ácido nucleico objetivo, y (c) introducir modificaciones químicas (por ejemplo modificaciones químicas como aquí se describen o como se conocen en la técnica) en las moléculas activas del ANci de (b). En una modalidad, el método también comprende reseleccionar las moléculas de ANci químicamente modificadas del paso (c) bajo condiciones adecuadas para aislar las moléculas de ANci químicamente modificadas que son activas para mediar la interferencia de ARN contra la secuencia de ácido nucleico objetivo.

En una modalidad, la invención presenta un método para seleccionar moléculas de ANci químicamente modificadas que son activas para mediar la interferencia de ARN contra una secuencia de ácido nucleico objetivo, que comprende (a) generar una pluralidad de moléculas de ANci químicamente modificadas (por ejemplo, las moléculas de ANci que aquí se describen, o que se conocen en la técnica), y (b) seleccionar las moléculas de ANci del paso (a) bajo condiciones adecuadas para aislar las moléculas de ANci químicamente modificadas que son activas para mediar la interferencia de ARN contra la secuencia de ácido nucleico objetivo.

El término "ligando" se refiere a cualquier compuesto o molécula, tal como un fármaco, péptido, hormona o neurotransmisor, que es capaz de interaccionar de forma directa o indirecta con otro compuesto, tal como un receptor. El receptor que interacciona con un ligando puede estar presente sobre la superficie de una célula o alternativamente puede ser un receptor intracelular o intercelular. La interacción del ligando con el receptor puede dar como resultado una reacción bioquímica, o simplemente puede ser una interacción o asociación física.

En otra modalidad, la invención presenta un método para generar moléculas de ANci de la invención con biodisponibilidad mejorada, que comprende (a) introducir una formulación de excipiente en una molécula de ANci, y (b) analizar la molécula de ANci del paso (a) bajo condiciones adecuadas para aislar las moléculas de ANci que tienen biodisponibilidad mejorada. Tales excipientes incluyen polímeros como ciclodextrinas, lípidos, lípidos catiónicos, poliaminas, fosfolípidos, nanopartículas, receptores, ligandos, y otros.

En otra modalidad, la invención presenta un método para generar moléculas de ANci de la invención con biodisponibilidad mejorada, que comprende (a) introducir nucleótidos que tienen cualquiera de las fórmulas l-VII, o cualquier combinación de las mismas, en una molécula de ANci, y (b) analizar la molécula de ANci del paso (a) bajo condiciones adecuadas para aislar las moléculas de ANci que tienen biodisponibilidad mejorada.

En otra modalidad, se puede unir covalentemente polietilenglicol (PEG) a los compuestos de ANci de la presente invención. El PEG unido puede ser de cualquier peso molecular, de preferencia de aproximadamente 100 a aproximadamente 50,000 Daltons (Da).

La presente invención se puede usar sola o como un componente de un kit que tiene por lo menos uno de los reactivos necesarios para introducir in vitro o in vivo ARN a muestras o sujetos de prueba. Por ejemplo, los componentes preferidos del kit incluyen una molécula de ANci de la invención y un vehículo que promueve la introducción del ANci en las células de interés como se describe en la presente (por ejemplo, usando lípidos y otros métodos de transfección conocidos; véase por ejemplo Beigelman et al., US 6,395,713). El kit se puede usar para validar el objetivo, por ejemplo para determinar la función o actividad del gen, o en la optimización de fármacos y en el descubrimiento de fármacos (véase por ejemplo Usman et al., USSN 60/402,996). Dicho kit también puede incluir instrucciones para permitirle al usuario del kit practicar la invención.

Los términos "ácido nucleico corto de interferencia", "ANci", "ARN corto de interferencia", "ARNci", "molécula de ácido nucleico corto de interferencia", "molécula de oligonucleótido corto de interferencia", o "molécula de ácido nucleico corto de interferencia químicamente modificado", como se usan aquí, se refieren a cualquier molécula de ácido nucleico capaz de inhibir o regular negativamente la expresión de genes o la duplicación viral mediando la interferencia de ARN, "i-ARN", o por silenciamiento de genes, de una manera específica de secuencia. Estos términos se pueden referir a moléculas de ácido nucleico individuales, a una pluralidad de dichas moléculas de ácido nucleico, o a conjuntos de dichas moléculas de ácido nucleico. El ANci puede ser una molécula de ácido nucleico de doble cadena que comprende regiones de sentido y antisentido autocomplementarias, en donde la región de antisentido comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos de una molécula de ácido nucleico objetivo o una porción de la misma, y la región de sentido tiene una secuencia de nucleótidos que corresponde a la secuencia de ácido nucleico objetivo o una porción de la misma. El ANci se puede ensamblar de dos oligonucleótidos separados, en donde una cadena es la cadena de sentido y la otra es la cadena de antisentido, en donde las cadenas de antisentido y sentido son autocomplementarias (es decir, cada cadena comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria una secuencia de nucleótidos de la otra cadena; como cuando la cadena de antisentido y la cadena de sentido forman un dúplex o estructura de doble cadena, por ejemplo en donde la región de doble cadena es aproximadamente 15 a aproximadamente 30 pares de bases, por ejemplo, de aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 pares de bases; la cadena de antisentido comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos de una molécula de ácido nucleico objetivo o una porción de la misma, y la cadena de sentido comprende una secuencia de nucleótidos que corresponde a la secuencia de ácido nucleico objetivo o una porción de la misma (por ejemplo, de aproximadamente 15 a aproximadamente 25 nucleótidos o más de la molécula de ANci son complementarios al ácido nucleico objetivo o una porción del mismo). Alternativamente, el ANci se ensambla de un solo oligonucleótido, en donde las regiones de sentido y antisentido autocomplementarias del ANci se enlazan por medio de enlazadores basados o no en ácido nucleico. El ANci puede ser un polinucleótido con una estructura secundaria de dúplex, dúplex asimétrico, horquilla, u horquilla asimétrica, que tiene regiones de sentido y antisentido autocomplementarias, en donde la región de antisentido comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos de una molécula de ácido nucleico objetivo separada o una porción de la misma, y la región de sentido tiene una secuencia de nucleótidos que corresponde a la secuencia de ácido nucleico objetivo o una porción de la misma. El ANci puede ser un polinucleótido circular de una sola cadena que tiene dos o más estructuras de asa y un tallo, que comprende regiones de sentido y antisentido autocornplementarias, en donde la región de antisentido comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos de una molécula de ácido nucleico objetivo o una porción de la misma, y la región de sentido tiene una secuencia de nucleótidos que corresponde a la secuencia de ácido nucleico objetivo o una porción de la misma, y en donde el polinucleótido circular puede ser procesado in vivo o in vitro para generar una molécula de ANci activa capaz de mediar la i-ARN. El ANci también puede comprender un polinucleótido de una sola cadena que tiene una secuencia de nucleótidos complementaria a una secuencia de nucleótidos de un ácido nucleico objetivo o una porción de la misma (por ejemplo, en donde dicha molécula de ANci no requiere la presencia dentro de la molécula de ANci de una secuencia de nucleótidos que corresponde a la secuencia de ácido nucleico objetivo o una porción de la misma), en donde el polinucleótido de una sola cadena puede comprender también un grupo fosfato terminal, tal como 5'-fosfato (véase por ejemplo Martínez et al., 2002, Cell, 1 10, 563-574, y Schwarz et al., 2002, Molecular Cell, 10, 537-568), o 5', 3'-d ¡fosfato. En algunas modalidades, la molécula de ANci de la invención comprende secuencias o regiones de sentido y antisentido separadas, en donde las regiones de sentido y antisentido están unidas covalentemente por moléculas enlazadoras nucleotídicas o no nucleotídicas, como se conoce en la técnica, o alternativamente están unidas no covalentemente por interacciones iónicas, enlaces de hidrógeno, interacciones de Van der Waals, interacciones hidrofóbicas, o interacciones de apilamiento. En algunas modalidades, las moléculas de ANci de la invención comprenden una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos de un gen objetivo. En otra modalidad, la molécula de ANci de la invención interacciona con una secuencia de nucleótidos de un gen objetivo de una manera que ocasiona inhibición de la expresión del gen objetivo. Como se usa aquí, las moléculas de ANci no necesariamente están limitadas a las moléculas que contienen solo ARN, sino que además abarcan nucleótidos y no nucleótidos químicamente modificados. En algunas modalidades, las moléculas cortas de ácido nucleico de la invención carecen de nucleótidos que contienen 2'-hidroxi (2'-OH). En algunas modalidades, el solicitante describe ácidos nucleicos cortos de interferencia que no requieren la presencia de nucleótidos que tienen un grupo 2'-hidroxi para mediar la i-ARN, y por lo tanto, las moléculas de ácido nucleico corto de interferencia de la invención opcionalmente no incluyen ningún ribonucleótido (por ejemplo, nucleótidos que tienen un grupo 2'-OH). Sin embargo, tales moléculas de ANci que no requieren la presencia de ribonucleotidos dentro de la molécula de ANci para sostener la i-ARN, pueden tener uno o más enlazadores, u otros grupos, porciones o cadenas unidas o asociadas, que contienen uno o más nucleótidos con grupos 2'-OH. Opcionalmente, las moléculas de ANci pueden comprender ribonucleotidos en aproximadamente 5, 10, 20, 30, 40, o 50% de las posiciones de nucleótido. Las moléculas de ácido nucleico corto de interferencia químicamente modificadas de la invención también se pueden denominar oligonucleótidos cortos de interferencia modificados, "siMON".

Como se usa aquí, el término ANci se considera equivalente a otros términos usados para describir moléculas de ácido nucleico que son capaces de mediar la i-ARN específica de secuencia, por ejemplo ARN corto de interferencia (ARNci), ARN de doble cadena (ARN de), micro-ARN (miARN), ARN corto de horquilla (ARNch), oligonucleótido corto de interferencia, ácido nucleico corto de interferencia, oligonucleótido corto de interferencia modificado, ARNci químicamente modificado, ARN silenciador de gen postranscripcional (ARNsgp), y otros. Los ejemplos no limitativos de moléculas de ANci de la invención se muestran en las figuras 4A-4F, 5A-5F y 6A-6C, y los cuadros 1A y 1 B de la presente. Tales moléculas de ANci son distintas de los ácidos nucleicos de otras tecnologías conocidas que median la inhibición de la expresión de genes, tales como las tecnologías de ribozimas, antisentido, formación de triplex, aptámero, quimera 2,5-A, u oligonucleótidos de señuelo.

Por "interferencia de ARN" o "i-ARN" se entiende un proceso biológico de inhibición o regulación negativa de la expresión de genes en una célula como se conoce generalmente en la técnica, y que es mediada por moléculas de ácido nucleico corto de interferencia; véase por ejemplo Zamore y Haley, 2005, Science, 309, 1519-1524; Vaughn y Martienssen, 2005, Science, 309, 1525-1526; Zamore et al., 2000, Cell, 101 , 25-33; Bass, 2001 , Nature, 41 1 , 428-429; Elbashir et al., 2001 , Nature, 41 1 , 494-498; y Kreutzer et al., publicación internacional PCT No. WO 00/44895; Zernicka-Goetz et al., publicación internacional PCT No. WO 01/36646; Fire, publicación internacional PCT No. WO 99/32619; Plaetinck et al., publicación internacional PCT No. WO 00/01846; Mello y Fire, publicación internacional PCT No. WO 01/29058; Deschamps-Depaillette, publicación internacional PCT No. WO 99/07409; y Li et al., publicación internacional PCT No. WO 00/44914; Allshire, 2002, Science, 297, 1818-1819; Volpe et al., 2002, Science, 297, 1833-1837; Jenuwein, 2002, Science, 297, 2215-2218; y Hall et al., 2002, Science, 297, 2232-2237; Hutvagner y Zamore, 2002, Science, 297, 2056-60; McManus et al., 2002, RNA, 8, 842-850; Reinhart et al., 2002, Gene & Dev., 16, 1616-1626; y Reinhart & Bartel, 2002, Science, 297, 1831). Además, como se usa aquí, el término i-ARN se considera equivalente a otros términos usados para describir la interferencia de ARN específica de secuencia, tal como silenciamiento de gen postranscripcional, inhibición de traducción, inhibición de transcripción, o epigenética. Por ejemplo, las moléculas de ANci de la invención se pueden usar para silenciar genes epigenéticamente después de la transcripción o antes de la transcripción. En un ejemplo no limitativo, la modulación epigenética de la expresión de genes con las moléculas de ANci de la invención puede resultar de la modificación mediada por el ANci de la estructura de la cromatina o los patrones de metilación, para alterar la expresión de los genes (véase por ejemplo Verdel et al., 2004, Science, 303, 672-676; Pal-Bhadra et al., 2004, Science, 303, 669-672; Allshire, 2002, Science, 297, 1818-1819; Volpe et al., 2002, Science, 297, 1833-1837; Jenuwein, 2002, Science, 297, 2215-2218; y Hall et al., 2002, Science, 297, 2232-2237). En otro ejemplo no limitativo, la modulación de la expresión de genes con las moléculas de ANci de la invención puede resultar del corte de ARN (ARN codificador o no codificador) mediado por ANci por medio de RISC, o alternativamente de la inhibición de traducción como es conocido en la técnica. En otra modalidad, la modulación de la expresión de genes con moléculas de ANci de la invención puede resultar de la inhibición transcripcional (véase por ejemplo Janowski et al., 2005, Nature Chemical Biology, 1 , 216-222).

En una modalidad, una molécula de ANci de la invención es un oligonucleótido formador de dúplex, "DFO" (véanse por ejemplo las figuras 11A-11 D y 12, y Vaish er a/., USSN 10/727,780, presentada el 3 de diciembre de 2003, y la solicitud internacional PCT No. US04/16390, presentada el 24 de mayo de 2004).

En una modalidad, una molécula de ANci de la invención es un ANci multifuncional (véanse, por ejemplo, las figuras 13A-13B, 14A-14B, 15A-15B, 16A-16B, 17, 18, 19A-19H y 20-25, y Jadhav et al., USSN 60/543,480, presentada el 10 de febrero de 2004, y la solicitud internacional PCT No. US04/16390, presentada el 24 de mayo de 2004). En una modalidad, el ANci multifuncional de la invención puede comprender una secuencia que hace blanco, por ejemplo, en dos o más regiones de ARN de ENaC (véanse, por ejemplo, las secuencias objetivo de los cuadros 1A y 1 B). En una modalidad, el ANci multifuncional de la invención puede comprender una secuencia que hace blanco en cualquiera de los objetivos de ENaC seleccionados del grupo que consiste en las secuencias de ENaC objetivo de los cuadros 1A y 1 B, o cualquiera de sus isotipos o cualquier combinación de los mismos.

Por "horquilla asimétrica", como se usa aquí, se entiende una molécula de ANci lineal que comprende una región de antisentido, una porción de asa que puede comprender nucleótidos o no nucleótidos, y una región de sentido que comprende menos nucleótidos que la región de antisentido hasta el grado en que la región de sentido tiene suficientes nucleótidos complementarios para aparearse con las bases de la región de antisentido y formar un dúplex con un asa. Por ejemplo, una molécula de ANci de horquilla asimétrica de la invención puede comprender una región de antisentido que tiene suficiente longitud para mediar i-ARN en una célula o sistema in vitro (por ejemplo, de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 nucleótidos, o aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o 30 nucleótidos), y una región de asa que comprende de aproximadamente 4 a aproximadamente 12 nucleótidos (por ejemplo, aproximadamente 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , o 12), y una región de sentido que tiene de aproximadamente 3 a aproximadamente 25 nucleótidos (por ejemplo, aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, o 25) que son complementarios a la región de antisentido. La molécula de ANci de horquilla asimétrica también puede comprender un grupo fosfato 5' terminal que puede estar químicamente modificado. La porción de asa de la molécula de ANci de horquilla asimétrica puede comprender nucleótidos, no nucleótidos, moléculas enlazadoras, o moléculas conjugadas como aquí se describen.

Por "dúplex asimétrico", como se usa aquí, se entiende una molécula de ANci que tiene dos cadenas separadas que comprenden una región de sentido y una región de antisentido, en donde la región de sentido comprende menos nucleótidos que la región de antisentido hasta el grado en que la región de sentido tiene suficientes nucleótidos complementarios para aparearse con las bases de la región de antisentido y formar un dúplex. Por ejemplo, una molécula de ANci dúplex asimétrica de la invención puede comprender una región de antisentido que tiene suficiente longitud para mediar i-ARN en una célula o sistema in vitro (por ejemplo, de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 nucleótidos, o aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o 30 nucleótidos), y una región de sentido que tiene de aproximadamente 3 a aproximadamente 25 nucleótidos (por ejemplo, aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, o 25) que son complementarios a la región de antisentido.

Por "inhibidor de i-ARN" se entiende cualquier molécula que puede regular negativamente, reducir o inhibir la función o actividad de interferencia de ARN en una célula u organismo. Un inhibidor de i-ARN puede regular negativamente, reducir o inhibir la i-ARN (por ejemplo, el corte mediado por i-ARN de un polinucleótido objetivo, inhibición de traducción, o silenciamiento transcripcional), por interacción o alteración de la función de cualquier componente de la ruta de i-ARN, que incluye componentes de proteína tales como RISC, o componentes de ácido nucleico como miARN o ARNci. Un inhibidor de i-ARN puede ser una molécula de ANci, una molécula de antisentido, un aptámero, o una molécula pequeña que interacciona o afecta la función de RISC, un miARN, o un ARNci, o cualquier otro componente de la ruta de i-ARN en una célula u organismo. Como un inhibidor de i-ARN de la invención puede inhibir la i-ARN (por ejemplo, el corte mediado por i-ARN de un polinucleótido objetivo, inhibición de traducción, o silenciamiento transcripcional), se puede usar para modular (por ejemplo, regular positivamente o regular negativamente) la expresión de un gen objetivo. En una modalidad, un inhibidor de ARN de la invención se usa para regular positivamente la expresión de genes afectando (por ejemplo, reduciendo o impidiendo) la regulación negativa o inhibición endógena de la expresión de genes mediante inhibición de traducción, silenciamiento transcripcional, o corte mediado por RISC de un polinucleótido (por ejemplo, ARNm). Por lo tanto, como los inhibidores de i-ARN de la invención afectan los mecanismos de represión, silenciamiento o inhibición endógena de la expresión de genes, se pueden usar para regular positivamente la expresión de genes para el tratamiento de enfermedades, rasgos, o condiciones que resultan de una pérdida de la función. En una modalidad, el término "inhibidor de i-ARN" se usa en lugar del término "ANci" en varias modalidades de la presente, por ejemplo, con el efecto de aumentar la expresión de genes para el tratamiento de enfermedades, rasgos o condiciones de pérdida de la función.

Por "aptámero" o "aptámero de ácido nucleico", como se usa aquí, se entiende un polinucleótido que se une específicamente a una molécula objetivo, en donde la molécula de ácido nucleico tiene una secuencia que es distinta de la secuencia reconocida por la molécula objetivo en su ambiente natural. Alternativamente, un aptámero puede ser una molécula de ácido nucleico que se une a una molécula objetivo en donde la molécula objetivo no se une naturalmente a un ácido nucleico. La molécula objetivo puede ser cualquier molécula de interés. Por ejemplo, el aptámero se puede usar para unirse a un dominio de unión de ligando de una proteína, impidiendo así la interacción del ligando natural con la proteína. Este es un ejemplo no limitativo y los expertos en la materia reconocerán que se pueden generar fácilmente otras modalidades usando las técnicas conocidas; véase por ejemplo Gold et al., 1995, Annu. Rev. Biochem., 64, 763; Brody y Gold, 2000, J. Biotechnol., 74, 5; Sun, 2000, Curr. Opin. Mol. Ther., 2, 100; Kusser, 2000, J. Biotechnol., 74, 27; Hermann y Patel, 2000, Science, 287, 820; y Jayasena, 1999, Clinical Chemistry, 45, 1628. Las moléculas de aptámero de la invención pueden ser modificadas químicamente como se conoce en la técnica o como se describe en la presente.

El término "ácido nucleico de antisentido", como se usa aquí, se refiere a una molécula de ácido nucleico que se une al ARN objetivo por medio de interacciones ARN-ARN o ARN-ADN o ARN-ANP (ácido nucleico de proteína; Egholm et al., 1993 Nature 365, 566), y altera la actividad del ARN objetivo (para una revisión, véase Stein y Cheng, 1993, Science 261 , 1004, y Woolf et al., patente de EE. UU. No. 5,849,902) por interacción estérica o por reconocimiento de objetivo mediada por RNasa H. Normalmente, las moléculas de antisentido son complementarias a una secuencia objetivo a lo largo de una sola secuencia contigua de la molécula de antisentido. Sin embargo, en algunas modalidades, una molécula de antisentido se puede unir a un substrato de modo que la molécula de substrato forma un asa, o una molécula de antisentido se puede unir de tal modo que la molécula de antisentido forma un asa. De esta manera, la molécula de antisentido puede ser complementaria a dos secuencias de substrato no contiguas (o incluso más), o dos porciones de secuencia no contiguas de una molécula de antisentido (o incluso más) pueden ser complementarias a una secuencia objetivo o a ambas. Para una revisión de las estrategias actuales de antisentido, véase Schmajuk et al., 1999, J. Biol. Chem., 21 , 21783-21789, Delihas et ai, 1997, Nature, 15, 751-753, Stein et al., 1997, Antisense N. A. Drug Dev., 7, 151 , Crooke, 2000, Methods Enzymol., 313, 3-45; Crooke, 1998, Biotech. Genet. Eng. Rev., 15, 121-157, Crooke, 1997, Ad. Pharmacol., 40, 1-49. Además, se puede usar ADN de antisentido o de antisentido modificado con 2 -MOE y otras modificaciones como se conocen en la técnica, para hacer blanco en el ARN objetivo por medio de interacciones ADN-ARN, activando así la RNasa H, que digiere el ARN objetivo en el dúplex. Los oligonucleótidos de antisentido pueden comprender una o más regiones activadoras de RNsa H, que son capaces de activar el corte de un ARN objetivo por medio de RNsa H. El ADN de antisentido se puede sintetizar químicamente o se puede expresar usando un vector de expresión de ADN de una sola cadena o un equivalente del mismo. Las moléculas de antisentido de la invención se pueden modificar químicamente como se conoce generalmente en la técnica o como se describe en la presente.

Por "modular" se entiende que la expresión del gen, o la cantidad de una molécula de ARN o moléculas equivalentes de ARN que codifican una o más proteínas o subunidades de proteína, o la actividad de una o más proteínas o subunidades de proteína, son reguladas positiva o negativamente, de tal manera que la expresión, cantidad o actividad es mayor o menor que la observada en ausencia del modulador. Por ejemplo, el término "modular" puede significar "inhibir", pero el uso de la palabra "modular" no se limita a esta definición.

Por "inhibir", "regular negativamente" o "reducir" se entiende que la expresión del gen, o la cantidad de moléculas de ARN o moléculas equivalentes de ARN que codifican una o más proteínas o subunidades de proteína, o la actividad de una o más proteínas o subunidades de proteína, se reducen con respecto a lo observado en ausencia de las moléculas de ácido nucleico de la invención (por ejemplo, ANci). En una modalidad, la inhibición, regulación negativa o reducción con una molécula de ANci, son menores que lo observado en presencia de una molécula inactiva o atenuada. En otra modalidad, la inhibición, regulación negativa o reducción con moléculas de ANci son menores que lo observado en presencia de, por ejemplo, una molécula de ANci con secuencia embrollada o con discordancias. En otra modalidad, la inhibición, regulación negativa o reducción de la expresión de genes con una molécula de ácido nucleico de la presente invención, son mayores en presencia de la molécula de ácido nucleico que en su ausencia.

En una modalidad, la inhibición, regulación negativa o reducción de la expresión de genes están asociadas con silenciamiento postranscripcional, tal como corte de una molécula de ácido nucleico objetivo (por ejemplo, ARN) mediada por i-ARN, o con inhibición de la traducción. En una modalidad, la inhibición, regulación negativa o reducción de la expresión de genes están asociadas con silenciamiento pretranscripcional, por ejemplo mediante alteraciones en los patrones de metilación del ADN y la estructura del ADN de la cromatina.

Por "regular positivamente" o "promover" se entiende que la expresión del gen, o la cantidad de las moléculas de ARN o moléculas equivalentes de ARN que codifican una o más proteínas o subunidades de proteína, o la actividad de una o más proteínas o subunidades de proteína, aumentan con respecto a lo observado en ausencia de las moléculas de ácido nucleico de la invención (por ejemplo, ANci). En una modalidad, la regulación positiva o promoción de la expresión de genes con una molécula de ANci, son mayores que lo observado en presencia de una molécula inactiva o atenuada. En otra modalidad, la regulación positiva o promoción de la expresión de genes con moléculas de ANci son mayores que lo observado en presencia de, por ejemplo, una molécula de ANci con secuencia embrollada o con discordancias. En otra modalidad, la regulación positiva o promoción de la expresión de genes con una molécula de ácido nucleico de la presente invención, son mayores en presencia de la molécula de ácido nucleico que en su ausencia. En una modalidad, la regulación positiva o promoción de la expresión de genes están asociadas con la inhibición del silenciamiento de genes mediado por ARN, tal como el corte mediado por i-ARN o el silenciamiento de un ARN objetivo codificador o no codificador que regula negativamente, inhibe o silencia la expresión del gen de interés que se quiere regular positivamente. La regulación negativa de la expresión de genes puede ser inducida por ejemplo por un ARN codificador o su proteína codificada, por ejemplo mediante retroalimentación negativa o efectos antagónicos. La regulación negativa de la expresión de genes puede ser inducida por ejemplo por un ARN no codificador que tiene control regulador sobre un gen de interés, por ejemplo por silenciamiento de la expresión del gen mediante inhibición de la traducción, estructura de la cromatina, metilación, corte de ARN mediado por RISC, o inhibición de la traducción. Por lo tanto, se puede usar la inhibición o regulación negativa de objetivos que regulan negativamente, suprimen o silencian un gen de interés, para regular positivamente o promover la expresión del gen de interés para uso terapéutico.

En una modalidad se usa un inhibidor de i-ARN de la invención para regular positivamente la expresión de genes por inhibición de la i-ARN o silenciamiento de gen. Por ejemplo, un inhibidor de i-ARN de la invención se puede usar para tratar enfermedades y condiciones de pérdida de función regulando positivamente la expresión de los genes, como en los casos de haploinsuficiencia, en donde un alelo de un gen particular aloja una mutación (por ejemplo, una mutación de desplazamiento de marco, codificación errada, o mutación no codificadora de terminación), dando como resultado una pérdida de la función de la proteína codificada por el alelo mutante. En tales casos, el inhibidor de i-ARN se puede usar para regular positivamente la expresión de la proteína codificada por el alelo silvestre o funcional, corrigiendo así la haploinsuficiencia por compensación del alelo mutante o nulo. En otra modalidad, una molécula de ANci de la invención se usa para regular negativamente la expresión de un alelo de ganancia tóxica de función, mientras que un inhibidor de i-ARN de la invención se usa concomitantemente para regular positivamente la expresión del alelo silvestre o funcional, por ejemplo en el tratamiento de las enfermedades, rasgos o condiciones que se describen en la presente, o en otras conocidas (véase por ejemplo Rhodes er al., 2004, PNAS USA, 101 :11 147-11152, y Meisler et al. 2005, The Journal of Clinical Investigation, 115:2010-2017).

Por "gen", o "gen objetivo" o "ADN objetivo" se entiende un ácido nucleico que codifica un ARN, por ejemplo, secuencias de ácido nucleico que incluyen, sin limitación, genes estructurales que codifican un polipéptido. Un gen o gen objetivo también puede codificar un ARN funcional (ARNf) o ARN no codificador (ARNnc), tal como ARN pequeño temporal (ARNpt), micro ARN (miARN), ARN nuclear pequeño (ARNnp), ARN corto de interferencia (ARNci), ARN nucleolar pequeño (ARNnp), ARN ribosomal (ARNr), ARN de transferencia (ARNt) y ARN precursores de los mismos. Tales ARN no codificadores pueden servir como moléculas objetivo de ácido nucleico para interferencia de ARN mediada por ANci para modular la actividad de ARNf o ARNnc implicado en procesos celulares funcionales o reguladores. Por lo tanto, la actividad aberrante de ARNf o ARNnc que produce enfermedad puede ser modulada por las moléculas de ANci de la invención. Las moléculas de ANci dirigidas a ARNf y ARNnc también se pueden usar para manipular o alterar el genotipo o fenotipo de un sujeto, organismo o célula, afectando los procesos celulares tales como impresión genética, transcripción, traducción o procesamiento de ácido nucleico (por ejemplo transaminación, metilación, etc.). El gen objetivo puede ser un gen derivado de una célula, un gen endógeno, un transgen, o genes exógenos tales como los genes de un patógeno, por ejemplo un virus, que están presentes en la célula después de de infección de la misma. La célula que contiene el gen objetivo puede derivarse o estar contenida en cualquier organismo, por ejemplo, una planta, animal, protozoario, virus, bacteria u hongo. Los ejemplos no limitativos de plantas incluyen monocotiledóneas, dicotiledóneas o gimnospermas. Los ejemplos no limitativos de animales incluyen vertebrados o invertebrados. Los ejemplos no limitativos de hongos incluyen mohos o levaduras. Para una revisión véase por ejemplo Snyder y Gerstein, 2003, Science, 300, 258-260.

Por "pares de bases no canónicas" se entiende cualquier par de bases que no es del tipo de Watson-Crick, tales como pares de bases discordantes o pares de bases de bamboleo, que incluyen discordancias volteadas, discordancias sencillas de enlace de hidrógeno, discordancias de tipo trans, interacciones de base triple e interacciones de base cuádruple. Los ejemplos no limitativos de dichos pares de bases no canónicas incluyen, sin limitación, los pares de bases AC inverso de Hoogsteen, bamboleo AC, AU inverso de Hoogsteen, bamboleo GU, AA N7 amino, CC 2-carbonil-amino(H1)-N3-amino(H2), GA cortado, UC 4-carbonil-amino, UU imino-carbonilo, bamboleo inverso AC, AU de Hoogsteen, AU inverso de Watson Crick, CG inverso de Watson Crick, GC N3-amino-amino N3, AA N1 -amino simétrico, AA N7-amino simétrico, GA N7-N1 amino-carbonilo, GA+ carbonil-amino N7-N1 , GG N1-carbonilo simétrico, GG N3-amino simétrico, CC carbonil-amino simétrico, CC N3-amino simétrico, UU 2-carbonil-imino simétrico, UU 4-carbonil-imino simétrico, AA amino-N3, AA N1-amino, AC amino 2-carbonilo, AC N3-amino, AC N7-amino, AU amino-4-carbonilo, AU N1-imino, AU N3-imino, AU N7-imino, CC carbonil-amino, GA amino-N1 , GA amino-N7, GA carbonil-amino, GA N3-amino, GC amino-N3, GC carbonil-amino, GC N3-amino, GC N7-amino, GG amino-N7, GG carbonil-imino, GG N7-amino, GU amino-2-carbonilo, GU carbonil-imino, GU imino-2-carbonilo, GU N7-imino, psiU imino-2-carbonilo, UC 4-carbonil-amino, UC imino-carbonilo, UU imino-carbonilo, AC C2-H-N3, GA carbonil-C2-H, UU imino-4-carbonil 2 carbonil-C5-H, AC amino(A) N3(C)-carbonilo, GC ¡mino amino-carbonilo, Gpsi imino-2-carbonil amino-2- carbonilo, y GU imino-amino-2-carbonilo.

Por "ENaC", como se usa aquí, se entiende cualquier canal de sodio epitelial, o proteína, péptido o polipéptido de ENaC, como los genes que codifican las secuencias de la subunidad a (SCNN1A), ß (SCNN1 B), o ? (SCNN1G), que comprenden las secuencias a las que se hace referencia con los Nos. de Registro de GenBank mostrados en el cuadro 7. Las referencias que se hacen aquí a "ENaC" incluyen cualesquiera o todas las secuencias de las subunidades a (SCNN1A), ß (SCNN1 B) y ? (SCNN1G). En una modalidad preferida, la invención presenta una o más moléculas de ANci o inhibidores de i-ARN y métodos que, independientemente o en combinación, modulan la expresión de los genes de ENaC que codifican la subunidad a (SCNN1A). El término ENaC también se refiere a los ácidos nucleicos que codifican cualquier proteína, péptido o polipéptido de ENaC, por ejemplo ácidos nucleicos que codifican las secuencias de la subunidad a (SCNN1A), ß (SCNN1 B), o y (SCNN1 G), que comprenden las secuencias a las que se hace referencia en la presente con los Nos. de Registro de GenBank mostrados en el cuadro 7. El término "ENaC" también incluye otras secuencias codificadoras de ENaC, tales como secuencias de ENaC derivadas de varios sujetos u organismos, incluso otras isoformas de ENaC, genes mutantes de ENaC, isotipos de genes ENaC, polimorfismos de genes ENaC y variantes de empalme de ENaC.

Por "objetivo", como se usa aquí, se entiende cualquier proteína, péptido o polipéptido de ENaC objetivo, tales como los codificados por los Nos. de Registro de Genbank mostrados en el cuadro 7. El término "objetivo" también se refiere a secuencias de ácido nucleico o secuencias de polinucleótido objetivo que codifican cualquier proteína, péptido o polipéptido objetivo, tal como proteínas, péptidos o polipéptidos codificados por las secuencias que tienen los Nos. de Registro de Genbank mostrados en el cuadro 7. El objetivo de interés puede incluir secuencias de polinucleótido objetivo, tales como ADN objetivo o ARN objetivo. El término "objetivo" también incluye otras secuencias, tales como diferentes isoformas, genes mutantes objetivo, isotipos de polinucleótidos objetivo, polimorfismos objetivo, y secuencias no codificadoras (por ejemplo, ARNnc, miARN, ARNpt, ARNs) u otras secuencias de polinucleótido reguladoras que se describen en la presente. Por lo tanto, en varias modalidades de la invención, una molécula de ácido nucleico de doble cadena de la invención (por ejemplo, ANci) que tiene complementariedad con un ARN objetivo, se puede usar para inhibir o regular negativamente la actividad de un miARN u otro ARNnc. En una modalidad, se puede inhibir la actividad de miARN o ARNnc para regular negativamente o inhibir la expresión de genes (por ejemplo, los genes objetivo descritos en la presente o conocidos en la técnica), que depende de la actividad de miARN o ARNnc. En otra modalidad, la inhibición de la actividad de miARN o ARNnc por moléculas de ácido nucleico de doble cadena de la invención (por ejemplo ANci), que tienen complementariedad con el miARN o ARNnc, se puede usar para regular positivamente o promover la expresión de los genes objetivo (por ejemplo, los genes objetivo descritos en la presente o conocidos en la técnica), en donde la expresión de dichos genes es regulada negativamente, suprimida, o silenciada por el miARN o ARNnc. Esta regulación positiva de la expresión de genes se puede usar para tratar enfermedades y condiciones asociadas con la pérdida de función o haploinsuficiencia como se conoce generalmente en la técnica.

Por "objetivo de la ruta" se entiende cualquier objetivo implicado en las rutas de la expresión o actividad de los genes. Por ejemplo, cualquier objetivo dado puede tener objetivos de ruta relacionados que pueden incluir genes iniciales, finales o modificadores de una ruta biológica. Estos genes objetivo de la ruta pueden proveer efectos aditivos o sinérgicos en el tratamiento de las enfermedades, condiciones y rasgos que se describen en la presente.

En una modalidad, el objetivo es cualquier ARN objetivo o una porción del mismo.

En una modalidad, el objetivo es cualquier ARN de ENaC o una porción del mismo.

En una modalidad, el objetivo es cualquier ADN de ENaC o una porción del mismo.

En una modalidad, el objetivo es cualquier ARNm de ENaC o una porción del mismo.

En una modalidad, el objetivo es cualquier miARN de ENaC o una porción del mismo.

En una modalidad, el objetivo es cualquier ARNci de ENaC o una porción del mismo.

En una modalidad, el objetivo es cualquier ENaC objetivo o una porción del mismo.

En una modalidad, el objetivo es cualquier ENaC (por ejemplo uno o más) de las secuencias objetivo que se describen en la presente o se muestran en el cuadro 7. En una modalidad, el objetivo es cualquiera de las secuencias objetivo (por ejemplo una o más) mostradas en el cuadro 1A o 1 B, o una porción de las mismas. En otra modalidad, el objetivo es un ARNci, miARN o ARNpt que corresponde a cualquier secuencia objetivo (por ejemplo una o más) mostrada en el cuadro 1A o 1 B, o su complemento o un ENaC objetivo o una porción del mismo.

En una modalidad, el objetivo es cualquier ENaC (por ejemplo uno o más) de las secuencias objetivo mostradas en el cuadro 7. En una modalidad, el objetivo es cualquiera de las secuencias objetivo (por ejemplo una o más) mostradas en el cuadro 1A o 1 B (por ejemplo, las SEQ ID NOs: 1 , 2, 3 o 4) o una porción de las mismas. En otra modalidad, el objetivo es un ARNci, miARN o ARNpt que corresponde a cualquiera de los objetivos (por ejemplo uno o más) mostrados en el cuadro 1A o 1 B (por ejemplo, las SEQ ID NOs: 1 , 2, 3 o 4) o su complemento, o una porción de los mismos. En otra modalidad, el objetivo es cualquier ARNci, miARN o ARNpt que corresponden a cualquier secuencia (por ejemplo una o más) que corresponde a una secuencia de la presente o se muestra en el cuadro 7.

Por "secuencia homologa" se entiende una secuencia de nucleótidos que es compartida por una o más secuencias de polinucleótido, tales como genes, transcritos de genes, o polinucleótidos no codificadores. Por ejemplo, una secuencia homologa puede ser una secuencia de nucleótidos que es compartida por dos o más genes que codifican proteínas relacionadas pero diferentes, tales como miembros diferentes de una familia de genes, epítopes de proteína diferentes, isoformas de proteína diferentes o genes completamente divergentes, tales como una citocina y sus receptores correspondientes. Una secuencia homologa puede ser una secuencia de nucleótidos que es compartida por dos o más polinucleótidos no codificadores, tales como ADN o ARN no codificador, secuencias reguladoras, intrones y sitios de control o regulación de transcripción. Las secuencias homologas también pueden incluir regiones de secuencia conservadas compartidas por más de una secuencia de polinucleótido. No es necesario que la homología sea una homología perfecta (por ejemplo, de 100%), ya que la presente invención también contempla las secuencias parcialmente homologas (por ejemplo, 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91 %, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 80%, etc.).

Por "región de secuencia conservada" se entiende una secuencia de nucleótidos de una o más regiones de un polinucleótido que no varía significativamente entre las generaciones, o de un sistema biológico, sujeto u organismo, a otro sistema biológico, sujeto u organismo. El polinucleótido puede incluir ADN y ARN tanto codificadores como no codificadores.

Por "región de sentido" se entiende una secuencia de nucleótidos de una molécula de ANci que tiene complementariedad con una región de antisentido de la molécula de ANci. Además, la región de sentido de una molécula de ANci puede comprender una secuencia de ácido nucleico que tiene homología con una secuencia de ácido nucleico objetivo. En una modalidad, la región de sentido de la molécula de ANci se denomina la cadena de sentido o cadena de pasajero.

Por "región de antisentido" se entiende una secuencia de nucleótidos de una molécula de ANci que tiene complementariedad con una secuencia de ácido nucleico objetivo. Además, la región de antisentido de una molécula de ANci opcionalmente puede comprender una secuencia de ácido nucleico que tiene complementariedad con una región de sentido de la molécula de ANci. En una modalidad, la región de antisentido de la molécula de ANci se denomina la cadena de antisentido o cadena guía.

Por "ácido nucleico objetivo" o "polinucleótido objetivo" se entiende cualquier secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, cualquier secuencia de ENaC), cuya expresión o actividad se requiere modular. El ácido nucleico objetivo puede ser ADN o ARN. En una modalidad, un ácido nucleico objetivo de la invención es ARN o ADN objetivo.

Por "complementariedad" se entiende que un ácido nucleico puede formar enlaces de hidrógeno con otra secuencia de ácido nucleico por medio de mecanismos tradicionales de Watson-Crick u otros no tradicionales como se describen en la presente. En una modalidad, una molécula de ácido nucleico de doble cadena de la invención, tal como una molécula de ANci, en donde cada cadena es de entre 15 y 30 nucleótidos de longitud, comprende entre aproximadamente 10% y aproximadamente 100% de complementariedad (por ejemplo, aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, o 100%) entre las dos cadenas de la molécula de ácido nucleico de doble cadena. En otra modalidad, una molécula de ácido nucleico de doble cadena de la invención, tal como una molécula de ANci, en donde una cadena es la cadena de sentido y la otra cadena es la cadena de antisentido, en donde cada cadena es de entre 15 y 30 nucleótidos de longitud, comprende entre por lo menos aproximadamente 10% y aproximadamente 100% de complementariedad (por ejemplo, por lo menos aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, o 100%) entre la secuencia de nucleótidos de la cadena de antisentido de la molécula de ácido nucleico de doble cadena y la secuencia de nucleótidos de su molécula de ácido nucleico objetivo correspondiente, tal como un ARN objetivo o ARNm objetivo o ARN viral. En una modalidad, una molécula de ácido nucleico de doble cadena de la invención, tal como una molécula de ANci, en donde una cadena comprende una secuencia de nucleótidos referida como la región de sentido y la otra cadena comprende una secuencia de nucleótidos referida como la región de antisentido, en donde cada cadena es de entre 15 y 30 nucleótidos de longitud, comprende entre aproximadamente 10% y aproximadamente 100% de complementariedad (por ejemplo, aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, o 100%) entre la región de sentido y la región de antisentido de la molécula de ácido nucleico de doble cadena. Con respecto a las moléculas de ácido nucleico de la presente invención, la energía libre de unión de una molécula de ácido nucleico con su secuencia complementaria es suficiente para permitir la función relevante del ácido nucleico, por ejemplo, la actividad de i-RN. La determinación de las energías libres de unión de las moléculas de ácido nucleico es muy conocida (véase, por ejemplo, Turner et al., 1987, CSH Symp. Quant. Biol. Lll p.123-133; Frier ef al., 1986, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 83:9373-9377; Turner et al., 1987, J. Am. Chem. Soc. 109:3783-3785). Un porcentaje de complementariedad indica el porcentaje de residuos contiguos en una molécula de ácido nucleico que pueden formar enlaces de hidrógeno (por ejemplo, apareamiento de bases de Watson-Crick), con una segunda secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 nucleótidos de un total de 10 nucleótidos del primer oligonucleótido con bases apareadas con una segunda secuencia de ácido nucleico que tiene 10 nucleótidos, representan 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, y 100% de complementariedad, respectivamente). En una modalidad, una molécula de ANci de la invención tiene complementariedad perfecta entre la cadena de sentido o región de sentido y la cadena de antisentido o región de antisentido de la molécula de ANci. En una modalidad, una molécula de ANci de la invención es perfectamente complementaria a una molécula de ácido nucleico objetivo correspondiente. "Perfectamente complementaria" significa que todos los residuos contiguos de una secuencia de ácido nucleico tendrán enlaces de hidrógeno con el mismo número de residuos contiguos de una segunda secuencia de ácido nucleico. En una modalidad, una molécula de ANci de la invención comprende de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 nucleótidos o más (por ejemplo, aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o 30, o más) que son complementarios a una o más moléculas de ácido nucleico objetivo, o una porción de las mismas. En una modalidad, una molécula de ANci de la invención tiene complementariedad parcial (es decir, menos de 100% de complementariedad) entre la cadena de sentido o región de sentido y la cadena de antisentido o región de antisentido de la molécula de ANci, o entre la cadena de antisentido o región de antisentido de la molécula de ANci y una molécula de ácido nucleico objetivo correspondiente. Por ejemplo, la complementariedad parcial puede incluir varias discordancias o nucleótidos con bases no apareadas (por ejemplo, 1 , 2, 3, 4, 5 o más discordancias o nucleótidos con bases no apareadas) dentro de la estructura del ANci, lo que puede originar protuberancias, asas, o tramos salientes entre la cadena de sentido o región de sentido y la cadena de antisentido o región de antisentido de la molécula de ANci, o entre la cadena de antisentido o región de antisentido de la molécula de ANci y una molécula de ácido nucleico objetivo correspondiente.

En una modalidad, una mólécula de ácido nucleico de doble cadena de la invención, tal como una molécula de ANci, tiene complementariedad perfecta entre la cadena de sentido o región de sentido y la cadena de antisentido o región de antisentido de la molécula de ácido nucleico. En una modalidad, la molécula de ácido nucleico de doble cadena de la invención, tal como una molécula de ANci, es perfectamente complementaria a una molécula de ácido nucleico objetivo correspondiente.

En una modalidad, la molécula de ácido nucleico de doble cadena de la invención, tal como una molécula de ANci, tiene complementariedad parcial (es decir, menos de 100% de complementariedad) entre la cadena de sentido o región de sentido y la cadena de antisentido o región de antisentido de la molécula de ácido nucleico de doble cadena, o entre la cadena de antisentido o región de antisentido de la molécula de ácido nucleico y una molécula de ácido nucleico objetivo correspondiente. Por ejemplo, la complementariedad parcial puede incluir varias discordancias o nucleótidos con bases no apareadas (por ejemplo, 1 , 2, 3, 4, 5 o más discordancias o nucleótidos con bases no apareadas, tales como protuberancias de nucleótido) dentro de la estructura de la molécula de ácido nucleico de doble cadena, lo que origina protuberancias, asas, o tramos salientes entre la cadena de sentido o región de sentido y la cadena de antisentido o región de antisentido de la molécula de ácido nucleico de doble cadena, o entre la cadena de antisentido o región de antisentido de la molécula de ácido nucleico de doble cadena y una molécula de ácido nucleico objetivo correspondiente. En algunas modalidades, la complementariedad parcial puede estar relacionada con nucleótidos de bases no apareadas (por ejemplo, 1 , 2, 3, 4, 5, o 6, o más nucleótidos con bases no apareadas), localizados en los extremos 3' o 5' de la molécula de ácido nucleico de doble cadena. En tales modalidades, el resto de la molécula de ácido nucleico de doble cadena puede ser perfectamente complementario entre las cadenas o la secuencia objetivo.

En una modalidad, la molécula de ácido nucleico de doble cadena de la invención es un microARN (miARN). Por "microARN" o "miARN" se entiende un ARN pequeño de doble cadena que regula la expresión de ARN mensajeros objetivo, por corte del ARNm, represión/inhibición de la traducción o silenciamiento heterocromático (véase por ejemplo Ambros, 2004, Nature, 431 , 350-355; Bartel, 2004, Cell, 116, 281-297; Cullen, 2004, Virus Research., 102, 3-9; He et al., 2004, Nat. Rev. Gene , 5, 522-531 ; Ying et al., 2004, Gene, 342, 25-28; y Setupathy et al., 2006, RNA, 12:192-197). En una modalidad, el microARN de la invención tiene complementariedad parcial (es decir, menos de 100% de complementariedad) entre la cadena de sentido o región de sentido y la cadena de antisentido o región de antisentido de la molécula de miARN, o entre la cadena de antisentido o región de antisentido del miARN y una molécula de ácido nucleico objetivo correspondiente. Por ejemplo, la complementariedad parcial puede incluir varias discordancias o nucleótidos con bases no apareadas (por ejemplo, 1 , 2, 3, 4, 5 o más discordancias o nucleótidos con bases no apareadas, tal como protuberancias de nucleotido), dentro de la molécula de ácido nucleico de doble cadena, estructura que puede originar protuberancias, asas, o tramos salientes entre la cadena de sentido o región de sentido y la cadena de antisentido o región de antisentido del miARN, o entre la cadena de antisentido o región de antisentido del miARN y una molécula de ácido nucleico objetivo correspondiente.

En una modalidad, las moléculas de ANci de la invención que regulan negativamente o reducen la expresión de genes objetivo, se usan para tratar o prevenir enfermedades, trastornos, rasgos o condiciones respiratorias en un sujeto u organismo, como se describe en la presente o se conoce en la técnica.

En una modalidad de la presente invención, cada secuencia de una molécula de ANci de la invención es, de forma independiente, de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 nucleótidos de longitud, en modalidades específicas de aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o 30 nucleótidos de longitud. En otra modalidad, los dúplex de ANci de la invención comprenden, de forma independiente, de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 pares de bases (por ejemplo, aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o 30). En otra modalidad, una o más cadenas de la molécula de ANci de la invención comprenden, de forma independiente, de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 nucleótidos (por ejemplo, aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o 30) que son complementarios a una molécula de ácido nucleico objetivo. En otra modalidad, las moléculas de ANci de la invención que comprenden estructuras de horquilla o circulares son de aproximadamente 35 a aproximadamente 50 nucleótidos de longitud (por ejemplo, aproximadamente 35, 40, 45, 50 o 55), o de aproximadamente 38 a aproximadamente 44 nucleótidos de longitud (por ejemplo, aproximadamente 38, 39, 40, 41 , 42, 43, o 44), y comprenden de aproximadamente 15 a aproximadamente 25 pares de bases (por ejemplo, aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, o 25). Las moléculas de ANci ejemplares de la invención se muestran en los cuadros II y III o las figuras 4A-4F y 5A-5F.

Como se usa aquí, "célula" se usa en su sentido biológico usual y no se refiere a un organismo multicelular completo, específicamente no se refiere a un humano. La célula puede estar presente en un organismo, por ejemplo en aves, plantas y mamíferos tales como humanos, vacas, ovejas, monos, simios, cerdos, perros y gatos. La célula puede ser procariótica (por ejemplo, célula bacteriana) o eucariótica (por ejemplo, célula de mamífero o de planta). La célula puede ser de origen somático o de línea germinal, totipotente o pluripotente, en división o no. La célula también se puede derivar o puede comprender un gameto o embrión, una célula madre, o una célula complétamente diferenciada.

Las moléculas de ANci de la invención se añaden directamente, o se pueden unir en complejo con lípidos catiónicos, se pueden empaquetar dentro de liposomas, o suministrarse de otra manera a las células o tejidos objetivo. El ácido nucleico o complejos de ácido nucleico se pueden administrar localmente a los tejidos relevantes ex vivo o in vivo mediante suministro local al pulmón, con o sin su incorporación en biopolímeros. En modalidades particulares, las moléculas de ácido nucleico de la invención comprenden las secuencias mostradas en los cuadros 1A y 1 B o las figuras 4A-4F y 5A-5F. Los ejemplos de dichas moléculas de ácido nucleico consisten esencialmente en las secuencias definidas en estos cuadros y figuras. Además, las construcciones químicamente modificadas descritas en el cuadro 8 y las formulaciones de nanopartícula de lípido (LNP) mostradas en el cuadro 10, se pueden aplicar a cualquier secuencia de ANci o grupo de secuencias de ANci de la invención.

En otro aspecto, la invención provee células de mamífero que contienen una o más moléculas de ANci de esta invención. Las moléculas de ANci pueden estar dirigidas independientemente a los mismos sitios o a sitios diferentes dentro de un polinucleótido objetivo de la invención.

Por "ARN" se entiende una molécula que comprende por lo menos un residuo de ribonucleótido. Por "ribonucleótido" se entiende un nucleótido con un grupo hidroxilo en la posición 2' de una porción de ß-D-ribofuranosa. Los términos incluyen ARN de doble cadena, ARN de una sola cadena, ARN aislado tal como ARN parcialmente purificado, ARN esencialmente puro, ARN sintético, ARN producido de forma recombinante, así como también ARN alterado que difiere del ARN natural por la adición, supresión, sustitución, o alteración de uno o más nucleótidos. Dichas alteraciones pueden incluir la adición de material no nucleotídico, por ejemplo a los extremos del ANci, o internamente, por ejemplo en uno o más nucleótidos del ARN. Los nucleótidos de las moléculas del ARN de la presente invención también pueden comprender nucleótidos no estándares, tales como nucleótidos no naturales o nucleótidos sintetizados químicamente o desoxinucleótidos. Estos ARN alterados pueden ser referidos como análogos o análogos de ARN natural.

Por "sujeto" se entiende un organismo, que es un donador o aceptor de células explantadas o las células mismas. "Sujeto" también se refiere a un organismo al cual se le pueden administrar las moléculas de ácido nucleico de la invención. Un sujeto puede ser un mamífero o células de mamífero, que incluye un humano o células de humano. En una modalidad, el sujeto es un bebé (por ejemplo, sujetos menores de un mes de edad, o de 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 10, 11 , o 12 meses de edad). En una modalidad, el sujeto es un niño (por ejemplo, de 1 , 2, 3, 4, 5 o 6 años de edad). En una modalidad, el sujeto es un adulto mayor (por ejemplo cualquiera mayor de aproximadamente 65 años).

Por "modificación química", como se usa aquí, . se entiende cualquier modificación de la estructura química de los nucleótidos que difiere de los nucleótidos de ARNci o ARN nativo. El término "modificación química" abarca la adición, sustitución o modificación de nucleósidos y nucleótidos nativos de ARNci o ARN con nucleósidos y nucleótidos modificados como se describe aquí o como se conoce en la técnica. Los ejemplos no limitativos de dichas modificaciones químicas incluyen, sin limitación, las composiciones que tienen cualquiera de las fórmulas I, II, III, IV, V, VI o VII de la presente, enlaces internucleotídicos de fosforotioato, 2'-desoxirribonucleótidos, 2'-0-metil-ribonucleótidos, 2'-desoxi-2'-fluoro-ribonucleótidos, 4'-tio-ribonucleótidos, 2'-0-trifluorometil-nucleótidos, 2'-0-etil-trifluorometoxi-nucleótidos, 2'-0-difluorometoxi-etoxi-nucleótidos (véase por ejemplo USSN 10/981 ,966, presentada el 5 de noviembre de 2004, que se incorpora aquí como referencia), FANA, nucleótidos de "base universal", nucleótidos "acíclicos", nucleótidos 5-C-metilo, incorporación de residuo de glicerilo terminal o residuo abásico desoxi invertido, o una modificación que tiene cualquiera de las fórmulas l-VII de la presente. En una modalidad, las moléculas de ácido nucleico de la invención (por ejemplo, ARNdc, ANci, etc.) están parcialmente modificadas (por ejemplo, aproximadamente 5%, 10,%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, o 95% modificadas) con modificaciones químicas. En otra modalidad, las moléculas de ácido nucleico de la invención (por ejemplo, ARNdc, ANci, etc.) están completamente modificadas (por ejemplo aproximadamente 100% modificadas) con modificaciones químicas.

El término "fosforotioato", como se usa aquí, se refiere a un enlace internucleotídico que tiene la fórmula I, en donde Z o W comprenden un átomo de azufre. Por lo tanto, el término fosforotioato se refiere a enlaces internucleotídicos de fosforotioato y fosforoditioato.

El término "fosfonoacetato", como se usa aquí, se refiere a un enlace internucleotídico que tiene la fórmula I, en donde Z o W comprenden un grupo acetilo o acetilo protegido.

El término "tiofosfonoacetato", como se usa aquí, se refiere a un enlace internucleotídico que tiene la fórmula I, en donde Z comprende un grupo acetilo o acetilo protegido y W comprende un átomo de azufre, o alternativamente W comprende un grupo acetilo o acetilo protegido, y Z comprende un átomo de azufre.

El término "base universal", como se usa aquí, se refiere a análogos de base de nucleótido que forman pares de bases con cada una de las bases naturales de ADN/ARN, con poca discriminación entre ellas. Los ejemplos no limitativos de las bases universales incluyen C-fenilo, C-naftilo y otros derivados aromáticos, inosina, azolcarboxamidas, y derivados de nitroazol tales como 3-nitropirrol, 4-nitroindol, 5-nitroindol, y 6-nitroindol, como se conoce en la técnica (véase por ejemplo Loakes, 2001 , Nucleic Acids Research, 29, 2437-2447).

El término "nucleótido acíclico", como se usa aquí, se refiere a cualquier nucleótido que tiene un azúcar acíclico de ribosa, por ejemplo en donde cualquiera de los carbonos de la ribosa (C1 , C2, C3, C4, o C5) está, independientemente o en combinación, ausente del nucleótido.

Las moléculas de ácido nucleico de la presente invención, individualmente o en combinación, o en conjunto con otros fármacos, se pueden usar para prevenir o tratar las enfermedades, trastornos, condiciones y rasgos que se describen en la presente, o que se conocen en la técnica, en un sujeto u organismo.

En una modalidad, las moléculas de ANci de la invención se pueden administrar a un sujeto o se pueden administrar a otras células adecuadas evidentes para los expertos en la materia, individualmente o en combinación con uno o más fármacos, bajo condiciones adecuadas para el tratamiento.

En una modalidad adicional, las moléculas de ANci se pueden usar en combinación con otros tratamientos conocidos para prevenir o tratar enfermedades, trastornos o condiciones respiratorias en un sujeto u organismo. Por ejemplo, las moléculas descritas se pueden usar en combinación con uno o más compuestos, tratamientos, o procedimientos conocidos para prevenir o tratar las enfermedades, trastornos, condiciones y rasgos que se describen aquí, en un sujeto u organismo, como se conoce en la técnica, tales como los inhibidores de PDE que incluyen 8-metoximetil-IBMX (inhibidor de PDE4B 1), rolipram (inhibidor de PDE4B), y denbufilina (inhibidor de PDE4B).

En una modalidad, la invención presenta un vector de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica por lo menos una molécula de ANci de la invención, de una manera que permite la expresión de la molécula de ANci. Por ejemplo, el vector puede contener secuencias que codifican las dos cadenas de una molécula de ANci que comprenden un dúplex. El vector también puede contener secuencias que codifican una sola molécula de ácido nucleico que es autocomplementaria y forma así una molécula de ANci. Los ejemplos no limitativos de dichos vectores de expresión se describen en Paul et al., 2002, Nature Biotechnology, 19, 505; Miyagishi y Taira, 2002, Nature Biotechnology, 19, 497; Lee et al., 2002, Nature Biotechnology, 19, 500; y Novina et al., 2002, Nature Medicine, publicación anticipada en línea doi:10.1038/nm725.

En otra modalidad, la invención presenta una célula de mamífero, por ejemplo, una célula humana, que incluye un vector de expresión de la invención.

En otra modalidad más, el vector de expresión de la invención comprende una secuencia para una molécula de ANci que tiene complementariedad con una molécula de ARN referida por números de Registro de Genbank, por ejemplo los Nos. de Registro de Genbank mostrados en el cuadro 7 de la presente.

En una modalidad, un vector de expresión de la invención comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica dos o más moléculas de ANci, que pueden ser iguales o diferentes.

En otro aspecto de la invención, las moléculas de ANci que interaccionan con las moléculas de ARN objetivo y regulan negativamente los genes que codifican las moléculas de ARN objetivo (por ejemplo las moléculas de ARN objetivo referidas con los números de Registro de Genbank de la presente), son expresadas desde unidades de transcripción insertadas en vectores de ADN o ARN. Los vectores recombinantes pueden ser plásmidos de ADN o vectores virales. Se pueden construir vectores virales que expresan el ANci basándose, sin limitación, en virus adeno-asociados, retrovirus, adenovirus, o alfavirus. Los vectores recombinantes capaces de expresar las moléculas de ANci pueden ser suministrados como aquí se describe y persisten en las células objetivo. Alternativamente, se pueden usar vectores virales que proveen la expresión transitoria de las moléculas de ANci. Tales vectores se pueden administrar repetidamente conforme sea necesario. Una vez expresadas, las moléculas de ANci se unen y regulan negativamente la función o expresión génica por interferencia de ARN (i-ARN). El suministro de vectores que expresan el ANci puede ser sistémico, por ejemplo por administración intravenosa o intramuscular, por administración a células objetivo explantadas de un sujeto seguida de reintroducción en el sujeto, o por cualquier otro medio que permita su introducción en la célula objetivo deseada.

Por "vectores" se entiende cualquier técnica basada en ácido nucleico o virus usada para suministrar un ácido nucleico deseado.

Otras características y ventajas de la invención se harán evidentes de la siguiente descripción de las modalidades preferidas de la misma, y de las reivindicaciones.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 muestra un ejemplo no limitativo de un esquema de síntesis de las moléculas de ANci. Las cadenas complementarias de la secuencia de ANci, la cadena 1 y la cadena 2, se sintetizan en tándem y se unen por medio de un enlazador separable, tal como un succinato de nucleótido o succinato abásico, que puede ser igual o diferente del enlazador separable usado para la síntesis en fase sólida sobre un soporte sólido. La síntesis puede ser en fase sólida o en fase de solución; en el ejemplo mostrado, la síntesis es en fase sólida. La síntesis se realiza de tal manera que un grupo protector, tal como un grupo dimetoxitritilo, permanece intacto en el nucleótido terminal del oligonucleótido en tándem. Después de corte y desprotección del oligonucleótido, las dos cadenas del ANci se hibridan espontáneamente para formar un dúplex de ANci, que permite la purificación del dúplex utilizando las propiedades del grupo protector terminal, por ejemplo aplicando un método de purificación sobre tritilo en donde solo se aislan dúplex/oligonucleótidos con el grupo protector terminal.

La figura 2 muestra un espectro de masa MALDI-TOF de un dúplex de ANci purificado sintetizado por medio de un método de la invención. Los dos picos mostrados corresponden a la masa predicha de las cadenas separadas de la secuencia de ANci. Este resultado muestra que el dúplex de ANci generado de la síntesis en tándem se puede purificar como una sola entidad usando una metodología simple de purificación sobre tritilo.

La figura 3 muestra una representación mecanística propuesta, no limitativa, de la degradación de ARN objetivo implicada en la i-ARN. ARN de doble cadena (ARNdc), que es generado por ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRP) de ARN ajeno de una sola cadena, por ejemplo ARN viral, de transposón, u otro ARN exógeno, activa la enzima DICER, que a su vez genera el dúplex de ANci. Alternativamente, el ANci sintético o expresado se puede introducir directamente en una célula por medio de los métodos adecuados. Se forma un complejo de ANci activo que reconoce un ARN objetivo, dando como resultado la degradación del ARN objetivo por el complejo de endonucleasa de RISC, o la síntesis de ARN adicional por ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRP), que puede activar la DICER, resultando moléculas de ANci adicionales y amplificando así la respuesta de i-ARN.

Las figuras 4A-4F muestran ejemplos no limitativos de construcciones de ANci químicamente modificado de la presente invención. En la figura, N representa cualquier nucleótido (adenosina, guanosina, citosina, uridina, u opcionalmente timidina; por ejemplo, la timidina puede estar sustituida en las regiones salientes designadas entre paréntesis (N N)). Se muestran varias modificaciones para las cadenas de sentido y antisentido de las construcciones de ANci. Las posiciones de nucleótido (N N) pueden estar químicamente modificadas como aquí se describe (por ejemplo, 2'-0-metilo, 2'-desoxi-2'-fluoro, etc.) y pueden derivar o no de una secuencia correspondiente de ácido nucleico objetivo (véase por ejemplo la figura 6C). Además, las secuencias mostradas en las figuras 4A-4F opcionalmente pueden incluir un ribonucleótido en la novena posición desde el extremo 5' de la cadena de sentido, o la onceava posición basada en el extremo 5' de la cadena guía, contando 11 posiciones de nucleótido desde el extremo 5' de la cadena guía (véase la figura 6C).

La figura 4A muestra que la cadena de sentido comprende 21 nucleótidos en donde opcionalmente los dos nucleótidos 3' terminales tienen sus bases apareadas, y en donde todos los nucleótidos presentes son ribonucleótidos excepto los nucleótidos (N N) que pueden comprender ribonucleótidos, desoxinucleótidos, bases universales, u otras modificaciones químicas que se describen en la presente. La cadena de antisentido comprende 21 nucleótidos, tiene opcionalmente una porción glicerilo 3'-terminal en donde opcionalmente los dos nucleótidos 3' terminales son complementarios a la secuencia de ARN objetivo, y en donde todos los nucleótidos presentes son ribonucleótidos excepto los nucleótidos (N N) que pueden comprender ribonucleótidos, desoxinucleótidos, bases universales, u otras modificaciones químicas que se describen en la presente. Un enlace internucleotídico modificado, tal como fosforotioato, fosforoditioato u otro enlace internucleotídico modificado como se describe en la presente, mostrado como "s", une opcionalmente los nucleótidos (N N) en la cadena de antisentido.

La figura 4B muestra que la cadena de sentido comprende 21 nucleótidos en donde opcionalmente los dos nucleótidos 3' terminales tienen sus bases apareadas, y en donde todos los nucleótidos de pirimidina que pueden estar presentes son nucleótidos modificados 2'-desoxi-2'-fluoro, y todos los nucleótidos de purina que pueden estar presentes son nucleótidos modificados 2'-0-metilo, excepto los nucleótidos (N N) que pueden comprender ribonucleótidos, desoxinucleótidos, bases universales, u otras modificaciones químicas que se describen en la presente. La cadena de antisentido comprende 21 nucleótidos, tiene opcionalmente una porción glicerilo 3' terminal en donde opcionalmente los dos nucleótidos 3' terminales son complementarios a la secuencia de ARN objetivo, y en donde todos los nucleótidos de pirimidina que pueden estar presentes son nucleótidos modificados 2'-desoxi-2'-fluoro, y todos los nucleótidos de purina que pueden estar presentes son nucleótidos modificados 2'-0-metilo, excepto los nucleótidos (N N) que pueden comprender ribonucleótidos, desoxinucleótidos, bases universales, u otras modificaciones químicas que se describen en la presente. Opcionalmente, un enlace internucleotídico modificado, tal como fosforotioato, fosforoditioato u otro enlace internucleotídico modificado como se describe en la presente, mostrado como "s", une los nucleótidos (N N) en la cadena de sentido y antisentido.

La figura 4C muestra que la cadena de sentido comprende 21 nucleótidos que tienen porciones de casquete 5' y 3' terminales, en donde opcionalmente los dos nucleótidos 3' terminales tienen sus bases apareadas, y en donde todos los nucleótidos de pirimidina que pueden estar presentes son nucleótidos modificados 2'-0-metilo o 2'-desoxi-2'-fluoro, excepto los nucleótidos (N N) que pueden comprender ribonucleótidos, desoxinucleótidos, bases universales, u otras modificaciones químicas que se describen en la presente. La cadena de antisentido comprende 21 nucleótidos, tiene opcionalmente una porción glicerilo 3' terminal en donde opcionalmente los dos nucleótidos 3' terminales son complementarios a la secuencia de ARN objetivo, y en donde todos los nucleótidos de pirimidina que pueden estar presentes son nucleótidos modificados 2'-desoxi-2'-fluoro, excepto los nucleótidos (N N) que pueden comprender ribonucleótidos, desoxinucleótidos, bases universales, u otras modificaciones químicas que se describen en la presente. Opcionalmente, un enlace internucleotídico modificado, tal como fosforotioato, fosforoditioato u otro enlace internucleotídico modificado como se describe en la presente, mostrado como "s", une los nucleótidos (N N) en la cadena de antisentido.

La figura 4D muestra que la cadena de sentido comprende 21 nucleótidos que tienen porciones de casquete 5' y 3' terminales, en donde opcionalmente los dos nucleótidos 3' terminales tienen sus bases apareadas, y en donde todos los nucleótidos de pirimidina que pueden estar presentes son nucleótidos modificados 2'-desoxi-2'-fluoro, excepto los nucleótidos (N N) que pueden comprender ribonucleótidos, desoxinucleótidos, bases universales, u otras modificaciones químicas que se describen en la presente, y en donde todos los nucleótidos de purina que pueden estar presentes son nucleótidos 2'-desoxi. La cadena de antisentido comprende 21 nucleótidos, tiene opcionalmente una porción glicerilo 3' terminal, y en donde opcionalmente los dos nucleótidos 3' terminales son complementarios a la secuencia de ARN objetivo, en donde todos los nucleótidos de pirimidina que pueden estar presentes son nucleótidos modificados 2'-desoxi-2'-fluoro, y todos los nucleótidos de purina que pueden estar presentes son nucleótidos modificados 2'-0-metilo, excepto los nucleótidos (N N) que pueden comprender ribonucleótidos, desoxinucleótidos, bases universales, u otras modificaciones químicas que se describen en la presente. Opcionalmente, un enlace internucleotídico modificado, tal como fosforotioato, fosforad itioato u otro enlace internucleotídico modificado que se describe en la presente, mostrado como "s", une los nucleótidos (N N) en la cadena de antisentido.

La figura 4E muestra que la cadena de sentido comprende 21 nucleótidos que tienen porciones de casquete 5' y 3' terminales, en donde opcionalmente los dos nucleótidos 3' terminales tienen sus bases apareadas, y en donde todos los nucleótidos de pirimidina que pueden estar presentes son nucleótidos modificados 2'-desoxi-2'-fluoro, excepto los nucleótidos (N N) que pueden comprender ribonucleótidos, desoxinucleótidos, bases universales, u otras modificaciones químicas que se describen en la presente. La cadena de antisentido comprende 21 nucleótidos, tiene opcionalmente una porción glicerilo 3' terminal en donde opcionalmente los dos nucleótidos 3' terminales son complementarios a la secuencia de ARN objetivo, y en donde todos los nucleótidos de pirimidina que pueden estar presentes son nucleótidos modificados 2'-desoxi-2'-fluoro, y todos los nucleótidos de purina que pueden estar presentes son nucleótidos modificados 2'-0-metilo, excepto los nucleótidos (N N) que pueden comprender ribonucleótidos, desoxinucleótidos, bases universales, u otras modificaciones químicas que se describen en la presente. Opcionalmente, un enlace internucleotídico modificado, tal como fosforotioato, fosforad itioato u otro enlace internucleotídico modificado que se describe en la presente, mostrado como "s", une los nucleótidos (N N) en la cadena de antisentido.

La figura 4F muestra que la cadena de sentido comprende 21 nucleótidos que tienen porciones de casquete 5' y 3' terminales, en donde opcionalmente los dos nucleótidos 3' terminales tienen sus bases apareadas y en donde todos los nucleótidos de pirimidina que pueden estar presentes son nucleótidos modificados 2'-desoxi-2'-fluoro, excepto los nucleótidos (N N) que pueden comprender ribonucleótidos, desoxinucleótidos, bases universales, u otras modificaciones químicas que se describen en la presente, y en donde todos los nucleótidos de purina que pueden estar presentes son nucleótidos 2'-desoxi. La cadena de antisentido comprende 21 nucleótidos, tiene opcionalmente una porción glicerilo 3' terminal en donde opcionalmente los dos nucleótidos 3' terminales son complementarios a la secuencia de ARN objetivo, y tiene un enlace internucleotidico de fosforotioato 3' terminal, y en donde todos los nucleótidos de pirimidina que pueden estar presentes son nucleótidos modificados 2'-desoxi-2'-fluoro, y todos los nucleótidos de purina que pueden estar presentes son nucleótidos 2'-desox¡, excepto los nucleótidos (N N) que pueden comprender ribonucleótidos, desoxinucleótidos, bases universales, u otras modificaciones químicas que se describen en la presente. Opcionalmente, un enlace internucleotidico modificado, tal como fosforotioato, fosforoditioato u otro enlace internucleotidico modificado que se describe en la presente, mostrado como "s", une los nucleótidos (N N) en la cadena de antisentido. La cadena de antisentido de las construcciones A-F comprende complementariedad de secuencia con cualquier secuencia de ácido nucleico objetivo de la invención. Además, cuando está presente una porción glicerilo (L) en el extremo 3' de la cadena de antisentido en cualquier construcción mostrada en las figuras 4A-4F, el enlace internucleotidico modificado es opcional.

Las figuras 5A-5F muestran ejemplos no limitativos de secuencias del ANci específico químicamente modificado de la invención. A-F se aplica a las modificaciones químicas descritas en las figuras 4A-4F para una secuencia de ANci de ENaC ejemplar. Tales modificaciones químicas se pueden aplicar a cualquier secuencia de ENaC. Además, opcionalmente las secuencias mostradas en las figuras 5A-5F pueden incluir un ribonucleótido en la novena posición desde el extremo 5' de la cadena de sentido o la onceava posición basada en el extremo 5' de la cadena guía, contando 11 posiciones de nucleótido desde el extremo 5' de la cadena guía (véase la figura 6C). Además, opcionalmente las secuencias mostradas en las figuras 5A-5F pueden incluir ribonucleótidos terminales en hasta aproximadamente 4 posiciones en el extremo 5' de la cadena de antisentido (por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3, o 4 ribonucleótidos terminales en el extremo 5' de la cadena de antisentido).

Las figuras 6A-6C muestran ejemplos no limitativos de diferentes construcciones del ANci de la invención.

Los ejemplos mostrados en la figura 6A (construcciones 1 , 2 y 3) tienen 19 pares de bases representativos; sin embargo, diferentes modalidades de la invención incluyen cualquier número de pares de bases descritos en la presente. Las regiones entre paréntesis representan tramos salientes de nucleótido que comprenden, por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3 o 4 nucleótidos de longitud, de preferencia aproximadamente 2 nucleótidos. Las construcciones 1 y 2 se pueden usar independientemente para la actividad de i-ARN. La construcción 2 puede comprender un enlazador polinucleótido o no nucleótido, que opcionalmente puede ser diseñado como enlazador biodegradable. En una modalidad, la estructura de asa mostrada en la construcción 2 puede comprender un enlazador biodegradable que resulta en la formación de la construcción 1 in vivo o in vitro. En otro ejemplo, la construcción 3 se puede usar para generar la construcción 2 bajo el mismo principio, en donde se usa un enlazador para generar la construcción 2 de ANci activo in vivo o in vitro, usando opcionalmente otro enlazador biodegradable para generar la construcción 1 del ANci activo in vivo o in vitro. Por lo tanto, la estabilidad o actividad de las construcciones de ANci se puede modular basándose en el diseño de la construcción del ANci para uso in vivo o in vitro y/o in vitro.

Los ejemplos mostrados en la figura 6B representan diferentes variaciones de la molécula de ácido nucleico de doble cadena de la invención, tal como microARN, que pueden incluir tramos salientes, protuberancias, asas y estructuras de tallo y asa que resultan de complementariedad parcial. Tales motivos que tienen protuberancias, asas y estructuras de tallo y asa generalmente son características del miARN. Las protuberancias, asas y estructuras de tallo y asa pueden originarse de cualquier grado de complementariedad parcial, tal como discordancias o protuberancias de aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más nucleótidos en una o las dos cadenas de la molécula de ácido nucleico de doble cadena de la invención.

El ejemplo mostrado en la figura 6C representa una molécula de ácido nucleico de doble cadena modelo de la invención que comprende un dúplex de 19 pares de bases de dos secuencias de 21 nucleótidos que tienen tramos salientes 3' de dinucleótido. La cadena superior (1 ) representa la cadena de sentido (cadena de pasajero), la cadena media (2) representa la cadena de antisentido (cadena guía), y la cadena inferior (3) representa una secuencia de polinucleótido objetivo. Los tramos salientes de dinucleótido (NN) pueden comprender una secuencia derivada del polinucleótido objetivo. Por ejemplo, la secuencia 3'-(NN) de la cadena guía puede ser complementaria a la secuencia 5'-[NN] del polinucleótido objetivo. Además, la secuencia 5'-(NN) de la cadena de pasajero puede comprender la misma secuencia que la secuencia 5'-[NN] de la secuencia de polinucleótido objetivo. En otras modalidades, los tramos salientes (NN) no derivan de la secuencia de polinucleótido objetivo, por ejemplo en donde la secuencia 3'-(NN) de la cadena guía no es complementaría a la secuencia 5'-[NN] del polinucleótido objetivo, y la secuencia 5'-(NN) de la cadena de pasajero puede comprender una secuencia diferente de la secuencia 5'-[NN] de la secuencia de polinucleótido objetivo. En modalidades adicionales, cualquier nucleótido (NN) está modificado químicamente, por ejemplo, como las modificaciones 2'-O-metilo, 2'-desoxi-2'-fluoro, u otras modificaciones de la presente. Además, la cadena de pasajero puede comprender una posición de ribonucleótido N de la cadena de pasajero. Para el dúplex representativo mostrado de 21 elementos y 19 pares de bases, la posición N puede ser 9 nucleotidos desde el extremo 3' de la cadena de pasajero. Sin embargo, en dúplex de longitud diferente, la posición N se determina basándose en el extremo 5' de la cadena guía, contando 1 1 posiciones de nucleótido desde el extremo 5' de la cadena guía, y escogiendo el nucleótido de base apareada correspondiente en la cadena de pasajero. El corte con Ago2 ocurre entre las posiciones 10 y 11 como lo indica la flecha. En modalidades adicionales, hay dos ribonucleótidos, NN, en las posiciones 10 y 1 1 basadas en el extremo 5' de la cadena guía, contando 10 y 1 1 posiciones de nucleótido desde el extremo 5' de la cadena guía y escogiendo los nucleótidos de bases apareadas correspondientes en la cadena de pasajero.

La figura 7 muestra ejemplos no limitativos de diferentes químicas de estabilización (1-10) que se pueden usar, por ejemplo, para estabilizar el extremo 3' de las secuencias de ANci de la invención, que incluyen (1 ) desoxirribosa [3-3']-invertida; (2) desoxirribonucleótido; (3) [5'-3']-3'-desoxirribonucleótido; (4) [5'-3']-ribonucleótido; (5) [5'-3']-3'-0-metil-ribonucleótido; (6) 3 -glicerilo; (7) [3'-5']-3'-desoxirribonucleótido; (8) [3'-3']-desoxirribonucleótido; (9) [5'-2']-desoxirribonucleótido; y (10) [5-3']-didesoxirribonucleótido. Además de las químicas del esqueleto modificado y no modificado indicadas en la figura, estas químicas se pueden combinar con diferentes modificaciones de esqueleto que se describen en la presente, por ejemplo, las modificaciones de esqueleto que tienen la fórmula I. Además, el 2'-desoxi-nucleótido mostrado en 5' a las modificaciones terminales mostradas, puede ser otro nucleótido o no nucleótido modificado o no modificado descrito en la presente, por ejemplo las modificaciones que tienen cualquiera de las fórmulas l-VII o cualquier combinación de las mismas.

La figura 8 muestra un ejemplo no limitativo de una estrategia usada para identificar las construcciones de ANci químicamente modificadas de la invención, que son resistentes a nucleasa pero que conservan la capacidad para mediar la actividad de i-ARN. Las modificaciones químicas se introducen en la construcción de ANci basándose en parámetros de diseño preparados (por ejemplo introduciendo modificaciones 2', modificaciones de base, modificaciones de esqueleto, modificaciones de casquete terminal, etc.). La construcción modificada se prueba en un sistema adecuado (por ejemplo suero humano para resistencia a nucleasa, o un modelo de animal para los parámetros de PK/suministro). En paralelo, se prueba la actividad de i-ARN de la construcción de ANci, por ejemplo en un sistema de cultivo de células, tal como una prueba de reportero de luciferasa. Entonces se identifican las construcciones de ANci principales que poseen una característica particular pero que mantienen la actividad de i-ARN, y se pueden modificar más y volverse a probar. Esta misma propuesta se puede usar para identificar moléculas de conjugado de ANci con perfiles farmacocinéticos, de suministro y actividad de i-ARN mejorados.

La figura 9 muestra ejemplos no limitativos de moléculas de un ANci fosforilado de la invención, que incluyen construcciones lineales y dúplex y derivados asimétricos de las mismas.

La figura 10 muestra ejemplos no limitativos de grupos fosfato terminales químicamente modificados de la invención.

La figura 1 1A muestra un ejemplo no limitativo de la metodología usada para diseñar construcciones DFO autocomplementarias utilizando secuencias de ácido nucleico de palíndromo o repetición que son identificadas en una secuencia de ácido nucleico objetivo, (i) Se identifica una secuencia de palíndromo o repetición en una secuencia de ácido nucleico objetivo; (ii) se diseña una secuencia que es complementaria a la secuencia de ácido nucleico objetivo y la secuencia de palíndromo; (¡ii) se agrega una secuencia repetida inversa de la porción que no es palíndromo/repetición de la secuencia complementaria al extremo 3' de la secuencia complementaria, para generar una molécula DFO autocomplementaria que comprende complementariedad de secuencia con el ácido nucleico objetivo; (iv) la molécula DFO se puede autoensamblar para formar un oligonucleótido de doble cadena. La figura 1 1 B muestra un ejemplo representativo no limitativo de una secuencia de oligonucleótido formadora de dúplex. La figura 1 1C muestra un ejemplo no limitativo del autoensamble esquemático de una secuencia de oligonucleótido formadora de dúplex representativa. La figura 1 1 D muestra un ejemplo no limitativo del autoensamble esquemático de una secuencia de oligonucleótido formadora de dúplex representativa, seguido por la interacción con una secuencia de ácido nucleico objetivo, dando como resultado la modulación de la expresión del gen.

La figura 12 muestra un ejemplo no limitativo del diseño de construcciones DFO autocomplementarias que utilizan secuencias de ácido nucleico de palíndromo o repetición que se incorporan en las construcciones DFO, que tienen complementariedad de secuencia con cualquier secuencia de ácido nucleico objetivo de interés. La incorporación de estas secuencias de palíndromo/repetición permite el diseño de construcciones de DFO que forman dúplex en los cuales cada cadena es capaz de modular la expresión del gen objetivo, por ejemplo por i-ARN. En primer lugar, se identifica la secuencia objetivo. Después se genera una secuencia complementaria en la cual se introducen modificaciones de nucleótido o no nucleótido (mostradas como X o Y) en la secuencia complementaria, que generan un palíndromo artificial (mostrado como XYXYXY en la figura). Una repetición inversa de la secuencia complementaria no palíndromo/repetición se agrega al extremo 3' de la secuencia complementaria para generar un DFO autocomplementario que comprende la secuencia complementaria al ácido nucleico objetivo. El DFO se puede autoensamblar para formar un oligonucleótido de doble cadena.

Las figuras 13A y 13B muestran ejemplos no limitativos de moléculas de ANci multifuncionales de la invención que comprenden dos secuencias de polinucleótido separadas, cada una capaz de mediar el corte dirigido por i-ARN de diferentes secuencias de ácido nucleico objetivo. La figura 13A muestra un ejemplo no limitativo de una molécula de ANci multifuncional que tiene una primera región que es complementaria a una primera secuencia de ácido nucleico objetivo (región complementaria 1), y una segunda región que es complementaria a una segunda secuencia de ácido nucleico objetivo (región complementaria 2), en donde la primera y segunda región complementaria están situadas en los extremos 3' de cada secuencia de polinucleótido en el ANci multifuncional. Las porciones de trazos de cada secuencia de polinucleótido de la construcción de ANci multifuncional tienen complementariedad con respecto a porciones correspondientes del dúplex de ANci, pero no tienen complementariedad con las secuencias de ácido nucleico objetivo. La figura 13B muestra un ejemplo no limitativo de una molécula de ANci multifuncional que tiene una primera región que es complementaria a una primera secuencia de ácido nucleico objetivo (región complementaria 1 ), y una segunda región que es complementaria a una segunda secuencia de ácido nucleico objetivo (región complementaria 2), en donde la primera y segunda región complementarias están situadas en los extremos 5' de cada secuencia de polinucleótido en el ANci multifuncional. Las porciones de trazos de cada secuencia de polinucleótido de la construcción de ANci multifuncional tienen complementariedad con respecto a porciones correspondientes del dúplex de ANci, pero no tienen complementariedad con las secuencias de ácido nucleico objetivo.

Las figuras 14A y 14B muestran ejemplos no limitativos de moléculas de ANci multifuncionales de la invención que comprenden una sola secuencia de polinucleótido que comprende regiones distintas, cada una capaz de mediar el corte dirigido por i-ARN de diferentes secuencias de ácido nucleico objetivo. La figura 14A muestra un ejemplo no limitativo de una molécula de ANci multifuncional que tiene una primera región que es complementaria a una primera secuencia de ácido nucleico objetivo (región complementaria 1 ), y una segunda región que es complementaria a una segunda secuencia de ácido nucleico objetivo (región complementaria 2), en donde la segunda región complementaria está situada en el extremo 3' de cada secuencia de polinucleótido en el ANci multifuncional. Las porciones de trazos de cada secuencia de polinucleótido de la construcción de ANci multifuncional tienen complementariedad con respecto a porciones correspondientes del dúplex de ANci, pero no tienen complementariedad con las secuencias de ácido nucleico objetivo. La figura 14B muestra un ejemplo no limitativo de una molécula de ANci multifuncional que tiene una primera región que es complementaria a una primera secuencia de ácido nucleico objetivo (región complementaria 1 ), y una segunda región que es complementaria a una segunda secuencia de ácido nucleico objetivo (región complementaria 2), en donde la primera región complementaria está situada en el extremo 5' de la secuencia de polinucleótido en el ANci multifuncional. Las porciones de trazos de cada secuencia de polinucleótido de la construcción de ANci multifuncional tienen complementariedad con respecto a porciones correspondientes del dúplex de ANci, pero no tienen complementariedad con las secuencias de ácido nucleico objetivo. En una modalidad, estas construcciones de ANci multifuncionales son procesadas in vivo o in vitro para generar construcciones de ANci multifuncionales como se muestra en las figuras 13A y 13B.

Las figuras 15A y 15B muestran ejemplos no limitativos de moléculas de ANci multifuncionales de la invención que comprenden dos secuencias de polinucleótido separadas, cada una capaz de mediar el corte dirigido por i-ARN de diferentes secuencias de ácido nucleico objetivo, y en donde la construcción de ANci multifuncional también comprende una región autocomplementaria, palíndromo, o repetición, permitiendo así construcciones de ANci bifuncionales más cortas que pueden mediar la interferencia de ARN contra diferentes secuencias de ácido nucleico objetivo. La figura 15A muestra un ejemplo no limitativo de una molécula de ANci multifuncional que tiene una primera región que es complementaria a una primera secuencia de ácido nucleico objetivo (región complementaria 1 ), y una segunda región que es complementaria a una segunda secuencia de ácido nucleico objetivo (región complementaria 2), en donde la primera y segunda región complementanas están situadas en los extremos 3' de cada secuencia de polinucleótido en el ANci multifuncional, y en donde la primera y segunda región complementanas también comprenden una región autocomplementaria, palíndromo, o repetición. Las porciones de trazos de cada secuencia de polinucleótido de la construcción de ANci multifuncional tienen complementariedad con respecto a porciones correspondientes del dúplex de ANci, pero no tienen complementariedad con las secuencias de ácido nucleico objetivo. La figura 15B muestra un ejemplo no limitativo de una molécula de ANci multifuncional que tiene una primera región que es complementaria a una primera secuencia de ácido nucleico objetivo (región complementaria 1), y una segunda región que es complementaria a una segunda secuencia de ácido nucleico objetivo (región complementaria 2), en donde la primera y segunda región complementarias están situadas en los extremos 5' de cada secuencia de polinucleótido en el ANci multifuncional, y en donde la primera y segunda región complementaria también comprenden una región autocomplementaria, palíndromo, o repetición. Las porciones de trazos de cada secuencia de polinucleótido de la construcción de ANci multifuncional tienen complementariedad con respecto a porciones correspondientes del dúplex de ANci, pero no tienen complementariedad con las secuencias de ácido nucleico objetivo.

Las figuras 16A y 16B muestran ejemplos no limitativos de moléculas de ANci multifuncionales de la invención, que comprenden una sola secuencia de polinucleótido que comprende regiones distintas, cada una capaz de mediar el corte dirigido por i-ARN de diferentes secuencias de ácido nucleico objetivo, y en donde la construcción de ANci multifuncional también comprende una región autocomplementaria, palíndromo, o repetición, permitiendo así construcciones de ANci bifuncionales más cortas que pueden mediar la interferencia de ARN contra diferentes secuencias de ácido nucleico objetivo. La figura 16A muestra un ejemplo no limitativo de una molécula de ANci multifuncional que tiene una primera región que es complementaria a una primera secuencia de ácido nucleico objetivo (región complementaria 1 ), y una segunda región que es complementaria a una segunda secuencia de ácido nucleico objetivo (región complementaria 2), en donde la segunda región complementaria está situada en el extremo 3' de la secuencia de polinucleótido en el ANci multifuncional, y en donde la primera y segunda región complementaria también comprenden una región autocomplementaria, palíndromo o repetición. Las porciones de trazos de cada secuencia de polinucleótido de la construcción de ANci multifuncional tienen complementanedad con respecto a porciones correspondientes del dúplex de ANci, pero no tienen complementanedad con las secuencias de ácido nucleico objetivo. La figura 16B muestra un ejemplo no limitativo de una molécula de ANci multifuncional que tiene una primera región que es complementaria a una primera secuencia de ácido nucleico objetivo (región complementaria 1 ), y una segunda región que es complementaria a una segunda secuencia de ácido nucleico objetivo (región complementaria 2), en donde la primera región complementaria está situada en el extremo 5' de la secuencia de polinucleótido en el ANci multifuncional, y en donde la primera y segunda región complementaria también comprenden una región autocomplementaria, palíndromo o repetición. Las porciones de trazos de cada secuencia de polinucleótido de la construcción de ANci multifuncional tienen complementanedad con respecto a porciones correspondientes del dúplex de ANci, pero no tienen complementanedad con las secuencias de ácido nucleico objetivo. En una modalidad, estas construcciones de ANci multifuncionales son procesadas ¡n vivo o in vitro para generar construcciones de ANci multifuncionales como se muestra en las figuras 15A y 15B.

La figura 17 muestra un ejemplo no limitativo de cómo las moléculas de ANci multifuncionales de la invención pueden hacer blanco en dos moléculas separadas de ácido nucleico objetivo, tales como moléculas de ARN separadas que codifican diferentes proteínas (por ejemplo, cualquier ENaC objetivo en la presente), por ejemplo, una citocina y su receptor correspondiente, diferentes cepas virales, un virus y una proteína celular implicada en la infección o duplicación viral, o diferentes proteínas implicadas en una ruta biológica común o divergente que está implicada en el mantenimiento del avance de la enfermedad. Cada cadena de la construcción de ANci multifuncional comprende una región que tiene complementariedad con moléculas separadas de ácido nucleico objetivo. La molécula de ANci multifuncional está diseñada de tal manera que cada cadena del ANci puede ser utilizada por el complejo RISC para iniciar el corte mediado por interferencia de ARN de su objetivo correspondiente. Estos parámetros de diseño pueden incluir desestabilización de cada extremo de la construcción de ANci (véase por ejemplo Schwarz et al., 2003, Cell, 1 15, 199-208). Tal desestabilización puede ser efectuada, por ejemplo, usando pares de bases guanosina-citidina, pares de bases alternos (por ejemplo, bamboleos), o nucleótidos químicamente modificados desestabilizadores en posiciones de nucleótido terminales como se conoce en la técnica.

La figura 18 muestra un ejemplo no limitativo de cómo las moléculas de ANci multifuncionales de la invención pueden hacer blanco en dos secuencias separadas de ácido nucleico objetivo dentro de la misma molécula de ácido nucleico objetivo, tales como regiones codificadoras alternas de un ARN, regiones codificadoras y no codificadoras de un ARN, o regiones de isotipo alternativo de un ARN. Cada cadena de la construcción de ANci multifuncional comprende una región que tiene complementariedad con las regiones separadas de la molécula de ácido nucleico objetivo. La molécula de ANci multifuncional está diseñada de tal manera que cada cadena del ANci puede ser utilizada por el complejo RISC para iniciar el corte mediado por interferencia de ARN de su región objetivo correspondiente. Estos parámetros de diseño pueden incluir desestabilización de cada extremo de la construcción de ANci (véase por ejemplo Schwarz et al., 2003, Cell, 1 15, 199-208). Tal desestabilización puede ser efectuada, por ejemplo, usando pares de bases guanosina-citidina, pares de bases alternos (por ejemplo, bamboleos), o nucleótidos químicamente modificados desestabilizadores en posiciones de nucleótido terminales como se conoce en la técnica.

Las figuras 19A-19H muestran ejemplos no limitativos de construcciones de ANci multifuncionales atadas de la invención. En los ejemplos mostrados, un enlazador (por ejemplo enlazador nucleotídico o no nucleotídico) une dos regiones de ANci (por ejemplo dos regiones de sentido, dos regiones de antisentido, o alternativamente una región de sentido y una región de antisentido juntas). Secuencias separadas de sentido (o sentido y antisentido) que corresponden a una primera secuencia objetivo y una segunda secuencia objetivo, se hibridan con sus secuencias correspondientes de sentido o antisentido en el ANci multifuncional. Además, se pueden añadir varios conjugados, ligandos, aptámeros, polímeros o moléculas reporteras a la región enlazadora, para lograr propiedades de suministro o farmacocinéticas selectivas o mejoradas.

La figura 20 muestra un ejemplo no limitativo de varios diseños de ANci multifuncional basados en dendrímero.

La figura 21 muestra un ejemplo no limitativo de varios diseños de ANci multlfuncional supramoleculares.

La figura 22 muestra un ejemplo no limitativo de un diseño de ANci multlfuncional habilitado por la Dicer usando una construcción de ANci precursor de 30 nucleótidos. Un dúplex de 30 pares de bases es cortado por Dicer en productos de 22 y 8 pares de bases desde cualquier extremo (los fragmentos de 8 p.b. no se muestran). Para facilidad de presentación, no se muestran los tramos salientes generados por Dicer -pero pueden ser compensados. Se muestran tres secuencias objetivo. La identidad de secuencia requerida traslapada se indica con cuadros en gris. Los N del ANci original de 30 p.b. son sitios sugeridos de posiciones 2'-OH para habilitar el corte de Dicer, si este es probado en químicas estabilizadas. Es de notar que el procesamiento de un dúplex de 30 elementos por la RNasa Dicer III no da un corte preciso de 22+8, sino que más bien produce una serie de productos estrechamente relacionados (siendo 22+8 el sitio primario). Por lo tanto, el procesamiento por Dicer producirá una serie de ANci activos.

La figura 23 muestra un ejemplo no limitativo de un diseño de ANci multifuncional habilitado por la Dicer que usa una construcción de ANci precursor de 40 nucleótidos. Un dúplex de 40 pares de bases es cortado por Dicer en productos de 20 pares de bases desde cualquier extremo. Para facilidad de presentación no se muestran los tramos salientes generados por Dicer -pero pueden ser compensados. Se muestran cuatro secuencias objetivo. Las secuencias objetivo que tienen homología están encerradas por cuadros. Este formato de diseño puede ser extendido a ARN más grandes. Si se unen ANci químicamente estabilizados con Dicer, entonces enlaces de ribonucleótido localizados estratégicamente pueden permitir al diseñador cortar productos que permitan obtener un repertorio más extenso de diseños multifuncionales. Por ejemplo, los productos de corte no limitados al estándar de Dicer de aproximadamente 22 nucleótidos pueden permitir construcciones de ANci multifuncionales con un traslape de identidad de secuencia objetivo que varía por ejemplo de aproximadamente 3 a aproximadamente 15 nucleótidos.

La figura 24 muestra un ejemplo no limitativo de diseños adicionales de construcción del ANci multifuncional de la invención. En un ejemplo, se añade un conjugado, ligando, aptámero, marca u otra porción a una región del ANci multifuncional para poder mejorar los perfiles de suministro o farmacocinéticos.

La figura 25 muestra un ejemplo no limitativo de diseños adicionales de construcción del ANci multifuncional de la invención. En un ejemplo, se añade un conjugado, ligando, aptámero, marca u otra porción a una región del ANci multifuncional para poder mejorar los perfiles de suministro o farmacocinéticos.

La figura 26 muestra un ejemplo no limitativo de una fosforamidita enlazada a colesterol que se puede usar para sintetizar las moléculas de ANci de la invención conjugadas con colesterol. Se muestra un ejemplo con la porción de colesterol enlazada al extremo 5' de la cadena de sentido de una molécula de ANci.

La figura 27 representa una modalidad de las porciones abásicas invertidas 5' y 3' de casquete enlazadas a una cadena de ácido nucleico.

La figura 28 muestra la expresión relativa de ARNm de IL8 (n=4 con 6 duplicados por punto dato) en células TLR7-U20S después del tratamiento con ARNci, en comparación con el control Resiquimod (R848) que es un agonista ¡nmunoestimulador.

La figura 29 muestra la expresión relativa de ARNm de IL8 (n=4 con 6 duplicados por punto dato) en células TLR8-U20S después del tratamiento con ARNci, en comparación con el control ssRNA40, que es un agonista ¡nmunoestimulador.

La figura 30 muestra la inhibición del transporte de sodio en una prueba FLIPR (Lectura de Placa de Imagen de Fluorescencia), después de la transfección de células HEK recombinantes con los ARNci modificados de ENaC para los sitios objetivo 782 (SEQ ID NOs: 51 y 52) y 1 181 (SEQ ID NOs: 57 y 58), a concentraciones de 100, 50, 20 y 10 nM.

La figura 31 muestra un diagrama de flujo de fabricación.

La figura 32 muestra un diagrama de flujo del procedimiento de preparación de un LNP.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Mecanismo de acción de las moléculas de ácido nucleico de la invención A continuación se expone el mecanismo propuesto de interferencia de ARN mediada por ARN corto de interferencia como se conoce actualmente, y no significa que sea limitativo, ni es una admisión de la técnica anterior. El solicitante muestra aquí que ácidos nucleicos cortos de interferencia químicamente modificados poseen una capacidad similar o mejorada para mediar la i-ARN con respecto-a las moléculas de ARNci, y se espera que tengan una estabilidad y actividad in vivo mejoradas; por lo tanto, esta exposición no significa que está limitada únicamente a ARNci, y se puede aplicar a un ANci en general. Por "capacidad mejorada para mediar i-ARN" o "actividad de i-ARN mejorada" se entiende que incluye la actividad de i-ARN medida in vitro o in vivo, en donde la actividad de i-ARN es un reflejo tanto de la capacidad del ANci para mediar la i-ARN como de la estabilidad de los ANci de la invención. En esta invención, el producto de estas actividades se puede incrementar in vitro o in vivo en comparación con un ARNci todo ARN o un ANci que contiene una pluralidad de ribonucleótidos. En algunos casos, la actividad o estabilidad de la molécula de ANci se puede reducir (es decir, menos de 10 veces), pero la actividad general de la molécula de ANci se incrementa in vitro o in vivo.

La interferencia de ARN se refiere al proceso de silenciamiento de gen posterior a la transcripción específico de secuencia en animales, mediado por ARN cortos de interferencia (ARNci) (Fire et al., 1998, Nature, 391 , 806). El proceso correspondiente en plantas es referido comúnmente como silenciamiento de gen postranscripcional o silenciamiento de ARN, y también es referido como represión en hongos. Se piensa que el proceso postranscripcional de silenciamiento de gen es un mecanismo de defensa celular conservado evolutivamente, usado para prevenir la expresión de genes extraños, que es compartido comúnmente por flora y filo diversa (Fire et al., 1999, Trends Genet., 15, 358). Tal protección de la expresión de genes extraños pudo haber evolucionado en respuesta a la producción de ARN de doble cadena (ARNdc) derivados de infección viral, o la integración aleatoria de elementos de transposón en un genoma de hospedero, por medio de una respuesta celular que destruye específicamente ARN homólogo de una sola cadena o ARN genómico viral. La presencia de ARNdc en las células activa la respuesta de i-ARN mediante un mecanismo que todavía no está completamente caracterizado. Este mecanismo parece ser diferente de la respuesta de interferón que resulta de la activación mediada por ARNdc de la proteína cinasa PKR y 2',5'-oligoadenilato ciclasa, dando como resultado el corte inespecífico de ARNm por la ribonucleasa L.

La presencia de ARNdc grandes en las células estimula la actividad de una enzima ribonucleasa III llamada Dicer. La Dicer está implicada en el procesamiento de ARNdc en piezas cortas de ARNdc conocidas como ARN cortos de interferencia (ARNci) (Berstein et al., 2001 , Nature, 409, 363). Los ARN cortos de interferencia derivados de la actividad de la Dicer normalmente son de aproximadamente 21 a aproximadamente 23 nucleótidos de longitud y comprenden dúplex de aproximadamente 19 pares de bases. La Dicer también se ha implicado en el corte de ARN pequeños temporales (ARNpt) de 21 y 22 nucleótidos, de un ARN precursor de estructura conservada que está implicado en el control de traducción (Hutvagner et al., 2001 , Science, 293, 834). La respuesta de i-ARN también presenta un complejo de endonucleasa que contiene un ARNci, denominado comúnmente complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC), que media el corte de ARN de una sola cadena que tiene secuencia homologa con el ARNci. El corte del ARN objetivo ocurre en la parte media de la región complementaria a la secuencia guía del dúplex de ARNci (Elbashir et al., 2001 , Genes Dev., 15, 188). Además, la interferencia de ARN también puede incluir silenciamiento de gen mediado por ARN pequeño (por ejemplo, micro-ARN o miARN), presumiblemente mediante mecanismos celulares que regulan la estructura de la cromatina y así impiden la transcripción de secuencias de gen objetivo (véase por ejemplo Allshire, 2002, Science, 297, 1818-1819; Volpe et al., 2002, Science, 297, 1833-1837; Jenuwein, 2002, Science, 297, 2215-2218; y Hall et al., 2002, Science, 297, 2232-2237). Por lo tanto, las moléculas de ANci de la invención se pueden usar para mediar el silenciamiento de genes mediante interacción con transcritos de ARN o alternativamente por interacción con secuencias de gen particulares, en donde dicha interacción resulta en el silenciamiento del gen, ya sea en la transcripción o después de la transcripción.

La i-ARN se ha estudiado en una variedad de sistemas. Fire et al., 1998, Nature, 391 , 806, fueron los primeros en observar i-ARN en C. elegans. Wianny y Goetz, 1999, Nature Cell Biol., 2, 70, describen i-ARN mediada por ARNdc en embriones de ratón. Hammond et al., 2000, Nature, 404, 293, describen i-ARN en células de Drosophila transfectadas con ARNdc. Elbashir et al., 2001 , Nature, 411 , 494, describen i-ARN inducida por introducción de dúplex de ARN sintéticos de 21 nucleótidos en células cultivadas de mamífero, que incluyen células de riñon embriónico humano y células HeLa. Un trabajo reciente en lisados embriónicos de Drosophila ha revelado algunos requisitos en cuanto a la longitud, estructura, composición química y secuencia del ARNci, que son esenciales para mediar la actividad eficiente de i-ARN. Estos estudios han mostrado que los dúplex de ARNci de 21 nucleótidos son más activos cuando contienen tramos salientes 3' terminales de 2 nucleótidos. Además, la sustitución de una o las dos cadenas de ARNci con 2'-desoxi o 2'-0-metil- nucleótidos suprime la actividad de i-ARN, mientras que se mostró que la sustitución de los nucleótidos de ARNci 3' terminales con desoxi-nucleótidos era tolerada. También se observó que las secuencias discordantes en el centro del dúplex del ARNci suprimen la actividad de i-ARN. Además, estos estudios también indican que la posición del sitio de corte en el ARN objetivo es definido por el extremo 5' de la secuencia guía de ARNci, en lugar del extremo 3' (Elbashir et al, 2001 , EMBO J., 20, 6877). Otros estudios han indicado que se requiere un 5'-fosfato en la cadena complementaria al objetivo de un dúplex de ARNci para la actividad de ARNci, y que se utiliza ATP para mantener la porción 5'-fosfato en el ARNci (Nykanen ef al., 2001 , Cell, 107, 309); sin embargo, las moléculas de ARNci que carecen de un 5'-fosfato son activas cuando se introducen de forma exógena, sugiriendo que puede ocurrir in vivo 5'-fosforilación de las construcciones de ARNci.

Oliqonucleótidos formadores de dúplex (DFO) de la invención En una modalidad, la invención presenta moléculas de ANci que comprenden oligonucleótidos formadores de dúplex (DFO) que se pueden autoensamblar en oligonucleótidos de doble cadena. Los oligonucleótidos formadores de dúplex de la invención se pueden sintetizar químicamente o se pueden expresar partiendo de unidades o vectores de transcripción. Las moléculas de DFO de la presente invención proveen reactivos y métodos útiles para una variedad de aplicaciones terapéuticas, diagnósticas, agrícolas, veterinarias, de validación de objetivo, descubrimiento genómico, ingeniería genética y farmacogenómica.

El solicitante muestra aquí que algunos oligonucleótidos, referidos en la presente por conveniencia y no por limitación como oligonucleótidos formadores de dúplex o moléculas DFO, son potentes mediadores de la regulación de la expresión génica específica de secuencia. Los oligonucleótidos de la invención son distintos de otras secuencias de ácido nucleico conocidas (por ejemplo, ARNci, miARN, ARNpt, ARNch, oligonucleótidos de antisentido, etc.), ya que representan una clase de secuencias de polinucleótido lineal que están diseñadas para autoensamblarse en oligonucleótidos de doble cadena, en donde cada cadena del oligonucleótido de doble cadena comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una molécula de ácido nucleico de ENaC objetivo. Las moléculas de ácido nucleico de la invención, de esta manera, se pueden autoensamblar en dúplex funcionales, en los cuales cada cadena del dúplex comprende la misma secuencia de polinucleótido y cada cadena comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una molécula de ácido nucleico de ENaC objetivo.

Generalmente, los oligonucleótidos de doble cadena se forman mediante el ensamble de dos secuencias de oligonucleótido distintas en donde la secuencia de oligonucleótido de una cadena es complementaria a la secuencia de oligonucleótido de la segunda cadena; dichos oligonucleótidos de doble cadena se ensamblan de dos oligonucleótidos separados, o de una sola molécula que se pliega sobre sí misma para formar una estructura de doble cadena, denominada frecuentemente en el campo estructura de horquilla o de tallo y asa (por ejemplo, ARNch o ARN corto de horquilla). Todos estos oligonucleótidos de doble cadena conocidos tienen la característica común de que cada cadena del dúplex tiene una secuencia de nucleótidos distinta.

De forma distinta a las moléculas de ácido nucleico de doble cadena conocidas, los solicitantes han desarrollado un método novedoso, potencialmente económico y simple, de formar una molécula de ácido nucleico de doble cadena, empezando de un oligonucleótido lineal o de una sola cadena. Las dos cadenas del oligonucleótido de doble cadena formado de acuerdo con la presente invención tienen la misma secuencia de nucleótidos y no están unidas covalentemente entre si. Tales moléculas de oligonucleótido de doble cadena pueden ser enlazadas fácilmente después de la síntesis mediante los métodos y reactivos conocidos, y están dentro del alcance de la invención. En una modalidad, el oligonucleótido de una sola cadena de la invención (el oligonucleótido formador de dúplex) que forma un oligonucleótido de doble cadena, comprende una primera región y una segunda región, en donde la segunda región incluye una secuencia de nucleótidos que es una repetición invertida de la secuencia de nucleótidos de la primera región, o una porción de la misma, de tal manera que el oligonucleótido de una sola cadena se autoensambla para formar un oligonucleótido dúplex en el cual la secuencia de nucleótidos de una cadena del dúplex es la misma secuencia de nucleótidos de la segunda cadena. Los ejemplos no limitativos de dichos oligonucleótidos formadores de dúplex se ilustran en las figuras 1 1A-1 1 D y 12. Estos oligonucleótidos formadores de dúplex (DFO) pueden incluir opcionalmente algunas secuencias de palíndromo o repetición en donde dichas secuencias de palíndromo o repetición están presentes entre la primera región y la segunda región del DFO.

En una modalidad, la invención presenta una molécula de oligonucleótido formadora de dúplex (DFO), en donde el DFO comprende una secuencia de ácido nucleico autocomplementaria formadora de dúplex que tiene una secuencia de nucleótidos complementaria a una secuencia de ácido nucleico de ENaC objetivo. La molécula de DFO puede comprender una sola secuencia autocomplementaria o un dúplex que resulta del ensamble de dichas secuencias autocomplementarias.

En una modalidad, un oligonucleótido formador de dúplex de la invención (DFO) comprende una primera región y una segunda región, en donde la segunda región comprende una secuencia de nucleótidos que comprende una repetición invertida de la secuencia de nucleótidos de la primera región, de tal manera que la molécula de DFO se puede ensamblar en un oligonucleótido de doble cadena. Dichos oligonucleótidos de doble cadena pueden actuar como un ácido nucleico corto de interferencia (ANci) para modular la expresión génica. Cada cadena del dúplex del oligonucleótido de doble cadena formado por moléculas de DFO de la invención, puede comprender una región de secuencia de nucleótidos que es complementaria a la misma secuencia de nucleótidos en una molécula de ácido nucleico de ENaC objetivo (por ejemplo, el ARN del ENaC objetivo).

En una modalidad, la invención presenta un DFO de una sola cadena que se puede ensamblar en un oligonucleótido de doble cadena. El solicitante ha encontrado sorprendentemente que un oligonucleótido de una sola cadena con regiones de nucleótido de autocomplementariedad se puede ensamblar fácilmente en construcciones de oligonucleótido de dúplex. Dichos DFO se pueden ensamblar en dúplex que pueden inhibir la expresión de genes de una manera especifica de secuencia. Las moléculas de DFO de la invención comprenden una primera región con secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos de una segunda región, y en donde la secuencia de la primera región es complementaria a un ácido nucleico de ENaC objetivo (por ejemplo, un ARN). El DFO puede formar un oligonucleótido de doble cadena, en donde una porción de cada cadena del oligonucleótido de doble cadena comprende una secuencia complementaria a una secuencia de ácido nucleico de ENaC objetivo.

En una modalidad, la invención presenta un oligonucleótido de doble cadena, en donde las dos cadenas del oligonucleótido de doble cadena no están enlazadas covalentemente una con la otra, y en donde cada cadena del oligonucleótido de doble cadena comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la misma secuencia de nucleótidos en una molécula de ácido nucleico de ENaC objetivo o una porción de la misma (por ejemplo, ARN de ENaC objetivo). En otra modalidad, las dos cadenas del oligonucleótido de doble cadena comparten una secuencia de nucleótidos idéntica de por lo menos aproximadamente 15 nucleótidos, de preferencia por lo menos aproximadamente 16, 17, 18, 19, 20, o 21 nucleótidos.

En una modalidad, una molécula de DFO de la invención comprende una estructura que tiene la fórmula DFO-I: 5 -p-X Z X -3† en donde Z comprende una secuencia palindrómica o de repetición de ácido nucleico, opcionalmente con uno o más nucleótidos modificados (por ejemplo, un nucleótido con una base modificada, tal como 2-amino-purina, 2-amino-1 ,6-dihidro-purina o una base universal), por ejemplo de una longitud de aproximadamente 2 a aproximadamente 24 nucleótidos en números pares (por ejemplo, aproximadamente 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, o 22 o 24 nucleótidos), X representa una secuencia de ácido nucleico, por ejemplo de una longitud de aproximadamente 1 a aproximadamente 21 nucleótidos (por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, o 21 nucleótidos), X' comprende una secuencia de ácido nucleico, por ejemplo de una longitud de aproximadamente 1 y aproximadamente 21 nucleótidos (por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o 21 nucleótidos), que tiene una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia X o una porción de la misma, p comprende un grupo fosfato terminal que puede estar presente o ausente, y en donde las secuencias X y Z, independientemente o juntas, comprenden una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de ácido nucleico de ENaC objetivo o una porción de la misma, y es de longitud suficiente para interaccionar (por ejemplo, por apareamiento de bases) con la secuencia de ácido nucleico de ENaC objetivo o una porción de la misma (por ejemplo, ARN del ENaC objetivo). Por ejemplo, X puede comprender independientemente una secuencia de aproximadamente 12 a aproximadamente 21 nucleótidos de longitud o más (por ejemplo, aproximadamente 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , o más), que es complementaria a una secuencia de nucleótidos de un ARN de ENaC objetivo o una porción de la misma. En otro ejemplo no limitativo, la longitud de la secuencia de nucleótidos de X y Z juntos, cuando está presente X, que es complementaria al ARN de ENaC objetivo o una porción de la misma (por ejemplo, ARN del ENaC objetivo), es de aproximadamente 12 a aproximadamente 21 nucleótidos o más (por ejemplo, aproximadamente 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , o más). En otro ejemplo no limitativo, cuando X está ausente, la longitud de la secuencia de nucleótidos de Z que es complementaria al ARN de ENaC objetivo o una porción de la misma, es de aproximadamente 12 a aproximadamente 24 nucleótidos o más (por ejemplo, aproximadamente 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, o más). En una modalidad, X, Z y X' son independientemente oligonucleótidos, en donde X o Z comprende una secuencia de nucleótidos de longitud suficiente para interaccionar (por ejemplo, por apareamiento de bases) con una secuencia de nucleótidos del objetivo o una porción de la misma (por ejemplo, ARN del ENaC objetivo). En una modalidad, las longitudes de los oligonucleótidos X y X' son idénticas. En otra modalidad, las longitudes de los oligonucleótidos X y X' no son idénticas. En otra modalidad, las longitudes de los oligonucleótidos X y Z, o Z y X', o X, Z y X', son idénticas o diferentes.

Cuando en esta especificación se describe que una secuencia es de longitud "suficiente" para interaccionar (es decir, aparearse con sus bases) con otra secuencia, se entiende que la longitud es tal que el número de enlaces formados entre las dos secuencias (por ejemplo enlaces de hidrógeno), es suficiente para permitir que las dos secuencias formen un dúplex bajo las condiciones de interés. Dichas condiciones pueden ser in vitro (por ejemplo para fines de diagnóstico o de prueba), o in vivo (para fines terapéuticos). Es cuestión simple y de rutina determinar dichas longitudes.

En una modalidad, la invención presenta una construcción de oligonucleótido de doble cadena que tiene la formula DFO-I(a): 3 -Xf Z X-p-5f en donde Z comprende una secuencia de ácido nucleico palindrómica o de repetición, o una secuencia de ácido nucleico similar a palíndromo o repetición, con uno o más nucleótidos modificados (por ejemplo, nucleótidos con una base modificada, tal como 2-amino-purina, 2-amino-1 ,6-dihidro-purina o una base universal), por ejemplo de una longitud de aproximadamente 2 a aproximadamente 24 nucleótidos en números pares (por ejemplo, aproximadamente 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 o 24 nucleótidos), X representa una secuencia de ácido nucleico, por ejemplo de una longitud de aproximadamente 1 a aproximadamente 21 nucleótidos (por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, o 21 nucleótidos), X' comprende una secuencia de ácido nucleico, por ejemplo de una longitud de aproximadamente 1 a aproximadamente 21 nucleótidos (por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o 21 nucleótidos), que tiene complementariedad de secuencia de nucleótidos con la secuencia X o una porción de la misma, p comprende un grupo fosfato terminal que puede estar presente o ausente, y en donde cada X y Z comprenden independientemente una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de ácido nucleico de ENaC objetivo, o una porción de la misma (por ejemplo, un ARN del ENaC objetivo), y es de longitud suficiente para interaccionar con la secuencia de ácido nucleico de ENaC objetivo o una porción de la misma (por ejemplo, ARN del ENaC objetivo). Por ejemplo, la secuencia X puede comprender independientemente una secuencia de aproximadamente 12 a aproximadamente 21 nucleótidos de longitud, o más (por ejemplo, aproximadamente 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , o más), que es complementaria a una secuencia de nucleótidos objetivo o una porción de la misma (por ejemplo, ARN del ENaC objetivo). En otro ejemplo no limitativo, la longitud de la secuencia de nucleótidos de X y Z juntos (cuando está presente X), que es complementaria a la secuencia objetivo o una porción de la misma, es de aproximadamente 12 a aproximadamente 21 nucleótidos o más (por ejemplo, aproximadamente 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , o más). En otro ejemplo no limitativo, cuando X está ausente, la longitud de la secuencia de nucleótidos de Z que es complementaria a la secuencia objetivo o una porción de la misma, es de aproximadamente 12 a aproximadamente 24 nucleótidos o más (por ejemplo, aproximadamente 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 o más). En una modalidad X, Z y X' son independientemente oligonucleótidos, en donde X o Z comprenden una secuencia de nucleótidos de longitud suficiente para interaccionar (por ejemplo, por apareamiento de bases) con la secuencia de nucleótidos de la secuencia objetivo o una porción de la misma (por ejemplo, ARN del ENaC objetivo). En una modalidad, las longitudes de los oligonucleótidos X y X' son idénticas. En otra modalidad, las longitudes de los oligonucleótidos X y X' no son idénticas. En otra modalidad, las longitudes de los oligonucleótidos X y Z, o Z y X', o X, Z y X', son idénticas o diferentes. En una modalidad, la construcción de oligonucleótido de doble cadena de fórmula l(a) incluye una o más discordancias, específicamente 1 , 2, 3 o 4, en la medida que dichas discordancias no disminuyan significativamente la capacidad del oligonucleótido de doble cadena para inhibir la expresión del gen ENaC objetivo.

En una modalidad, una molécula de DFO de la invención comprende la estructura que tiene la fórmula DFO-II: 5'-p-X X»-3f en donde cada X y X' son independientemente oligonucleótidos de una longitud de aproximadamente 12 nucleótidos a aproximadamente 21 nucleótidos, en donde X comprende, por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico de una longitud de aproximadamente 12 a aproximadamente 21 nucleótidos (por ejemplo, aproximadamente 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o 21 nucleótidos), X' comprende una secuencia de ácido nucleico, por ejemplo de una longitud de aproximadamente 12 a aproximadamente 21 nucleótidos (por ejemplo, aproximadamente 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, o 21 nucleótidos), que tiene una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia X o una porción de la misma, p comprende un grupo fosfato terminal que puede estar presente o ausente, y en donde X comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de ácido nucleico objetivo (por ejemplo, ARN del ENaC objetivo), o una porción de la misma, y es de longitud suficiente para interaccionar (por ejemplo, por apareamiento de bases) con la secuencia de ácido nucleico objetivo o una porción de la misma. En una modalidad, la longitud de los oligonucleótidos X y X' es idéntica. En otra modalidad, la longitud de los oligonucleótidos X y X' no es idéntica. En una modalidad, la longitud de los oligonucleótidos X y X' es suficiente para formar un oligonucleótido de doble cadena relativamente estable.

En una modalidad, la invención presenta una construcción de oligonucleótido de doble cadena que tiene la fórmula DFO-ll(a): 5'-p-X X'-3' 3f-X' X-p-5' en donde cada X y X' son independientemente oligonucleótidos de una longitud de aproximadamente 12 nucleótidos a aproximadamente 21 nucleótidos, en donde X comprende una secuencia de ácido nucleico, por ejemplo de una longitud de aproximadamente 12 a aproximadamente 21 nucleótidos (por ejemplo, aproximadamente 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o 21 nucleótidos), X' comprende una secuencia de ácido nucleico, por ejemplo de una longitud de aproximadamente 12 a aproximadamente 21 nucleótidos (por ejemplo, aproximadamente 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o 21 nucleótidos), que tiene una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia X o una porción de la misma, p comprende un grupo fosfato terminal que puede estar presente o ausente, y en donde X comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de ácido nucleico objetivo o una porción de la misma (por ejemplo, ARN del ENaC objetivo), y es de longitud suficiente para interaccionar (por ejemplo, por apareamiento de bases) con la secuencia de ácido nucleico objetivo (por ejemplo, ARN del ENaC objetivo) o una porción de la misma. En una modalidad, las longitudes de los oligonucleótidos X y X' son idénticas. En otra modalidad, las longitudes de los oligonucleótidos X y X' no son idénticas. En una modalidad, las longitudes de los oligonucleótidos X y X' son suficientes para formar un oligonucleótido de doble cadena relativamente estable. En una modalidad, la construcción de oligonucleótido de doble cadena de fórmula ll(a) incluye una o más discordancias, específicamente 1 , 2, 3 o 4, en la medida en que dichas discordancias no disminuyan significativamente la capacidad del oligonucleótido de doble cadena para inhibir la expresión del gen ENaC objetivo.

En una modalidad, la invención presenta una molécula de DFO que tiene la fórmula DFO-I(b): 5'-p-Z-3' en donde Z comprende una secuencia de ácido nucleico palindrómica o de repetición que incluye opcionalmente uno o más nucleótidos modificados o no estándares (por ejemplo, un nucleótido con una base modificada, tal como 2-amino-purina o una base universal), que puede facilitar el apareamiento de bases con otros nucleótidos. Z puede ser, por ejemplo, de una longitud suficiente para interaccionar (por ejemplo, por apareamiento de bases) con una secuencia de nucleótidos de una molécula de ácido nucleico objetivo (por ejemplo, ARN de ENaC objetivo), de preferencia de una longitud de por lo menos 12 nucleótidos, específicamente de aproximadamente 12 a aproximadamente 24 nucleótidos (por ejemplo, aproximadamente 12, 14, 16, 18, 20, 22 o 24 nucleótidos); p representa un grupo fosfato terminal que puede estar presente o ausente.

En una modalidad, una molécula de DFO que tiene cualquiera de las fórmulas DFO-I, DFO-I(a), DFO-I(b), DFO-ll(a) o DFO-II, puede comprender modificaciones químicas como aquí se describen, por ejemplo sin limitación, los nucleótidos que tienen cualquiera de las fórmulas l-VII, las químicas de estabilización que se describen en el cuadro 8, o cualquier otra combinación de nucleótidos y no nucleótidos modificados como se describe en las diversas modalidades de la presente.

En una modalidad, la secuencia de palíndromo o repetición o nucleótidos modificados (por ejemplo, un nucleótido con una base modificada, tal como 2-amino-purina o una base universal) en Z de las construcciones DFO que tienen las fórmulas DFO-I, DFO-I(a) y DFO-I(b), comprenden nucleótidos químicamente modificados que son capaces de interaccionar con una porción de la secuencia de ácido nucleico de ENaC objetivo (por ejemplo, análogos de base modificada que pueden formar pares de bases de Watson-Crick o pares de bases que no son de Watson-Crick).

En una modalidad, una molécula de DFO de la invención, por ejemplo un DFO que tiene la fórmula DFO-I o DFO-II, comprende de aproximadamente 15 a aproximadamente 40 nucleótidos (por ejemplo, aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, o 40 nucleótidos). En una modalidad, una molécula de DFO de la invención comprende una o más modificaciones químicas. En un ejemplo no limitativo, la introducción de nucleótidos o no nucleótidos químicamente modificados en las moléculas de ácido nucleico de la invención provee una herramienta poderosa para superar las limitaciones potenciales de la estabilidad in vivo y la biodisponibilidad, inherentes a las moléculas de ARN no modificadas que son suministradas de forma exógena. Por ejemplo, el uso de moléculas de ácido nucleico químicamente modificadas puede permitir una dosis mas baja de una molécula de ácido nucleico particular para un efecto terapéutico dado, puesto que las moléculas de ácido nucleico químicamente modificado tienden a tener una vida media mas larga en el suero o en las células o tejido. Además, algunas modificaciones químicas pueden mejorar la biodisponibilidad o potencia de las moléculas de ácido nucleico, aumentando no solo la vida media sino también facilitando el alcance de las moléculas de ácido nucleico a órganos, células o tejidos particulares, o mejorando la incorporación celular de las moléculas de ácido nucleico. Por lo tanto, aunque la actividad de una molécula de ácido nucleico químicamente modificado se reduce in vitro en comparación con una molécula de ácido nucleico nativo/no modificado, por ejemplo en comparación con una molécula de ARN no modificada, la actividad general de la molécula de ácido nucleico modificado puede ser mayor que la molécula de ácido nucleico nativo o no modificado, debido a una mayor estabilidad, potencia, duración de efecto, biodisponibilidad o suministro de la molécula.

Moléculas de ANci multifuncionales o multidirigidas de la invención En una modalidad, la invención presenta moléculas de ANci que comprenden moléculas de ácido nucleico corto de interferencia multifuncionales (ANci multifuncional) que modulan la expresión de uno o más genes objetivo en un sistema biológico, tal como una célula, tejido, u organismo. Las moléculas de ácido nucleico corto de interferencia multifuncionales de la invención (ANci multifuncional) pueden hacer blanco en mas de una región de la secuencia de ácido nucleico objetivo, o pueden hacer blanco en secuencias de mas de una molécula de ácido nucleico objetivo distinta (por ejemplo, objetivos de ARN de ENaC). Las moléculas de ANci multifuncionales de la invención se pueden sintetizar químicamente o se pueden expresar de unidades o vectores de transcripción. Las moléculas de ANci multifuncionales de la presente invención proveen reactivos y métodos útiles para una variedad de aplicaciones humanas, aplicaciones terapéuticas, diagnósticas, agrícolas, veterinarias, de validación de objetivo, descubrimiento genómico, ingeniería genética y aplicaciones farmacogenómicas.

El solicitante muestra aquí que algunos oligonucleótidos, denominados aquí por conveniencia, más no por limitación, moléculas de ácido nucleico corto de interferencia multifuncionales o ANci multifuncional, son potentes mediadores de la regulación de la expresión de genes específica de secuencia. Las moléculas de ANci multifuncional de la invención son distintas de otras secuencias de ácido nucleico conocidas (por ejemplo, ARNci, miARN, ARNpt, ARNch, oligonucleótidos de antisentido, etc.), ya que representan una clase de moléculas de polinucleótido que están diseñadas de tal manera que cada cadena de la construcción de ANci multifuncional comprende una secuencia de nucleótidos, que es complementaría a una secuencia de ácido nucleico distinta de una o mas moléculas de ácido nucleico objetivo. De esta manera, una sola molécula de ANci multifuncional de la invención (generalmente una molécula de doble cadena), puede hacer blanco en más de una molécula de ácido nucleico objetivo diferente (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, o más). Las moléculas de ácido nucleico de la invención también pueden hacer blanco en más de una región (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, o más) de la misma secuencia de ácido nucleico objetivo. Por lo tanto, las moléculas de ANci multifuncionales de la invención son útiles para regular negativamente o inhibir la expresión de una o más moléculas de ácido nucleico objetivo. Por ejemplo, una molécula de ANci multifuncional de la invención puede hacer blanco (por ejemplo, tener complementariedad) en moléculas de ácido nucleico seleccionadas del grupo que consiste en ENaC, isotipos de ENaC, o cualquier combinación de los mismos. Al reducir o inhibir la expresión de más de una molécula de ácido nucleico objetivo con una construcción de ANci multifuncional, las moléculas de ANci multifuncional de la invención representan una clase de agentes terapéuticos potentes que pueden proveer inhibición simultánea de múltiples objetivos dentro de una ruta relacionada con una enfermedad (por ejemplo respiratoria). Dicha inhibición simultánea puede proveer estrategias de tratamiento terapéutico sinérgicas sin la necesidad de esfuerzos de desarrollo preclínico y clínico separados, ni los complejos procesos regulatorios de aprobación.

Se espera que el uso de moléculas de ANci multifuncionales que hacen blanco en más de una región de una molécula de ácido nucleico objetivo (por ejemplo, ARN o ADN de ENaC objetivo), provea una potente inhibición de la expresión de genes. Por ejemplo, una sola construcción de ANci multifuncional de la invención puede hacer blanco tanto en las regiones conservadas como variables de una molécula de ácido nucleico objetivo (por ejemplo, ARN o ADN de ENaC), permitiendo así la regulación negativa o inhibición de diferentes isoformas o variantes de ENaC objetivo para optimizar la eficacia terapéutica y minimizar la toxicidad, o permitiendo hacer blanco en las regiones codificadoras y no codificadoras de la molécula de ácido nucleico del ENaC objetivo.

Generalmente, los oligonucleótidos de doble cadena se forman por el ensamble de dos oligonucleótidos distintos, en donde la secuencia de oligonucleótido de una cadena es complementaria a la secuencia de oligonucleótido de la segunda cadena; dichos oligonucleótidos de doble cadena generalmente se ensamblan de dos oligonucleótidos separados (por ejemplo, ARNci). Alternativamente, se puede formar un dúplex de una sola molécula que se pliega sobre si misma (por ejemplo, ARNci o ARN corto de horquilla). Se sabe que estos oligonucleótidos de doble cadena median la interferencia de ARN y todos tienen la característica común de que solo una región de la secuencia de nucleótidos (secuencia guía o secuencia de antisentido) tiene complementariedad con una secuencia de ácido nucleico objetivo, y la otra cadena (secuencia de sentido) comprende una secuencia de nucleótidos que es homologa a la secuencia de ácido nucleico objetivo. Generalmente, la secuencia de antisentido es retenida en el complejo RISC activo y guía al RISC hacia la secuencia de nucleótidos objetivo por medio de apareamiento de bases complementarias de la secuencia de antisentido con la secuencia objetivo, para mediar la interferencia de ARN específica de secuencia. Se sabe que en algunos sistemas de cultivo de células, algunos tipos de ARNci no modificados pueden exhibir efectos "fuera de objetivo". Se cree que este efecto de fuera de objetivo implica la participación de la secuencia de sentido en lugar de la secuencia de antisentido del ARNci en el complejo RISC (véase por ejemplo Schwarz et al., 2003, Cell, 1 15, 199-208). En este caso se cree que la secuencia de sentido dirige el complejo RISC a una secuencia (secuencia fuera de objetivo) que es distinta de la secuencia objetivo buscada, dando como resultado la inhibición de la secuencia fuera de objetivo. En estas moléculas de ácido nucleico de doble cadena, cada cadena es complementaria a una secuencia de ácido nucleico objetivo distinta. Sin embargo, los objetivos no buscados que son afectados por estos ARNdc no son completamente predecibles ni son específicos.

De manera distinta a las moléculas de ácido nucleico de doble cadena conocidas, los solicitantes han desarrollado un método novedoso, potencialmente económico y simplificado, para regular negativamente o inhibir la expresión de más de una secuencia de ácido nucleico objetivo usando una sola construcción de ANci multifuncional. Las moléculas de ANci multifuncional de la invención están diseñadas para ser de doble cadena o parcialmente de doble cadena, de tal manera que una porción de cada cadena o región del ANci multifuncional es complementaria a una secuencia de ácido nucleico objetivo de elección. Por lo tanto, las moléculas de ANci multifuncionales de la invención no se limitan a las secuencias de objetivo que son complementarias una a la otra, sino más bien a dos secuencias de ácido nucleico objetivo diferentes. Las moléculas de ANci multifuncionales de la invención están diseñadas de tal manera que cada cadena o región de la molécula de ANci multifuncional, que es complementaria a una secuencia de ácido nucleico objetivo dada, es de longitud adecuada (por ejemplo de aproximadamente 16 a aproximadamente 28 nucleótidos de longitud, de preferencia de aproximadamente 18 a aproximadamente 28 nucleótidos de longitud), para mediar la interferencia de ARN contra la secuencia de ácido nucleico objetivo. La complementariedad entre la secuencia de ácido nucleico objetivo y una cadena o región del ANci multifuncional debe ser suficiente (por lo menos aproximadamente 8 pares de bases) para el corte de la secuencia de ácido nucleico objetivo por interferencia de ARN. Se espera que el ANci multifuncional de la invención minimice los efectos de fuera de objetivo observados con algunas secuencias de ARNci, como las que se describen en Schwarz et al., supra.

Se ha informado que ARNdc de longitud entre 29 pares de bases y 36 pares de bases (TuschI et al., publicación internacional de PCT No. WO 02/44321) no median la i-ARN. Una razón de que estos ARNdc sean inactivos puede ser la falta de recambio o disociación de la cadena que interacciona con la secuencia de ARN objetivo, de tal manera que el complejo RISC no es capaz de interaccionar eficientemente con copias múltiples del ARN objetivo, dando como resultado una reducción significativa de la potencia y eficiencia del proceso de i-ARN. El solicitante ha encontrado sorprendentemente que los ANci multifuncionales de la invención pueden superar este problema y son capaces de aumentar la eficiencia y potencia del proceso de i-ARN. Por lo tanto, en algunas modalidades de la invención, se pueden diseñar ANci multlfuncionales de una longitud de aproximadamente 29 a aproximadamente 36 pares de bases, de tal manera que una porción de dicha cadena de la molécula de ANci multifuncional comprende una región de secuencia de nucleótidos que es complementaria a un ácido nucleico objetivo de longitud suficiente para mediar la i-ARN de forma eficiente (por ejemplo, de aproximadamente 15 a aproximadamente 23 pares de bases), y una región de secuencia de nucleótidos que no es complementaria al ácido nucleico objetivo. Al tener porciones tanto complementarias como no complementarias en cada cadena del ANci multifuncional, el ANci multifuncional puede mediar la interferencia de ARN contra una secuencia de ácido nucleico objetivo, sin ser prohibitivo para el recambio o disociación (por ejemplo, cuando la longitud de cada cadena es demasiado grande para mediar i-ARN contra la secuencia de ácido nucleico objetivo respectiva). Además, el diseño de moléculas de ANci multlfuncionales de la invención con regiones traslapadas internas permite que las moléculas de ANci multlfuncionales sean de tamaño favorable (disminuido) para mediar la interferencia de ARN, y de tamaño adecuado para usarse como un agente terapéutico (por ejemplo, en donde cada cadena es, de forma independiente, de aproximadamente 18 a aproximadamente 28 nucleótidos de longitud). Los ejemplos no limitativos se ilustran en las figuras 13A-13B, 14A-14B, 15A-15B, 16A-16B, 17, 18, 19A-19H, 20-25, y cuadro 1 B.

En una modalidad, una molécula de ANci multifuncional de la invención comprende una primera región y una segunda región, en donde la primera región del ANci multifuncional comprende una secuencia de nucleotidos complementaria a una secuencia de ácido nucleico de una primera molécula de ácido nucleico objetivo, y la segunda región del ANci multifuncional comprende una secuencia de ácido nucleico complementaria a una secuencia de ácido nucleico de una segunda molécula de ácido nucleico objetivo. En una modalidad, una molécula de ANci multifuncional de la invención comprende una primera región y una segunda región, en donde la primera región del ANci multifuncional comprende una secuencia de nucleotidos complementaria a una secuencia de ácido nucleico de la primera región de una molécula de ácido nucleico objetivo, y la segunda región del ANci multifuncional comprende una secuencia de nucleotidos complementaria a una secuencia de ácido nucleico de una segunda región de la molécula de ácido nucleico objetivo. En otra modalidad, la primera región y la segunda región del ANci multifuncional pueden comprender secuencias de ácido nucleico separadas que comparten cierto grado de complementariedad (por ejemplo, de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 nucleotidos complementarios). En algunas modalidades, las construcciones de ANci multifuncional que comprenden secuencias de ácido nucleico separadas pueden ser enlazadas fácilmente después de su síntesis por medio de los métodos y reactivos conocidos, y tales construcciones enlazadas están dentro del alcance de la invención. Alternativamente, la primera región y la segunda región del ANci multifuncional pueden comprender una secuencia de un solo ácido nucleico que tiene cierto grado de autocomplementariedad, tal como en una estructura de horquilla o de tallo y asa. Los ejemplos no limitativos de dichos ácidos nucleicos cortos de interferencia multifuncionales de doble cadena y horquilla se ilustran en las figuras 13A-13B y 14A-14B, respectivamente. Estos ácidos nucleicos cortos de interferencia (ANci) multifuncionales pueden incluir opcionalmente cierta secuencia de nucleótidos traslapada, en donde dicha secuencia de nucleótidos traslapada está presente entre la primera región y la segunda región del ANci multifuncional (véanse por ejemplo las figuras 15A-15B y 16A-16B). En una modalidad, la primera molécula de ácido nucleico objetivo y la segunda molécula de ácido nucleico objetivo son una o más secuencias de ENaC objetivo, por ejemplo cualquier secuencia de ácido nucleico de ENaC o secuencia de ácido nucleico de isotipo de ENaC.

En una modalidad, la invención presenta una molécula de ácido nucleico corto de interferencia multifuncional (ANci multifuncional), en donde cada cadena del ANci multifuncional comprende independientemente una primera región de secuencia de ácido nucleico que es complementaria a una secuencia de ácido nucleico objetivo distinta, y una segunda región de la secuencia de nucleótidos que no es complementaria a la secuencia objetivo. La secuencia de ácido nucleico objetivo de cada cadena está en la misma molécula de ácido nucleico objetivo o en moléculas diferentes de ácido nucleico objetivo. En una modalidad, las moléculas de ácido nucleico objetivo comprenden una o más secuencias de ENaC objetivo, tales como cualquier secuencia de ácido nucleico de ENaC o isotipo de ENaC.

En otra modalidad, el ANci multifuncional comprende dos cadenas, en donde: (a) la primera cadena comprende una región que tiene complementariedad de secuencia con una secuencia de ácido nucleico objetivo (región complementaria 1 ), y una región que no tiene complementariedad de secuencia con la secuencia de nucleótidos objetivo (región no complementaria 1 ); (b) la segunda cadena del ANci multifuncional comprende una región que tiene complementariedad de secuencia con una secuencia de ácido nucleico objetivo que es distinta de la secuencia de nucleótidos objetivo complementaria a la secuencia de nucleótidos de la primera cadena (región complementaria 2), y una región que no tiene complementariedad de secuencia con la secuencia de nucleótidos objetivo de la región complementaria 2 (región no complementaria 2); (c) la región complementaria 1 de la primera cadena comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos de la región no complementaria 2 de la segunda cadena, y la región complementaria 2 de la segunda cadena comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos de la región no complementaria 1 de la primera cadena. La secuencia de ácido nucleico objetivo de la región complementaria 1 y la región complementaria 2 está en la misma molécula de ácido nucleico objetivo o en diferentes moléculas de ácido nucleico objetivo. En una modalidad, las moléculas de ácido nucleico objetivo comprenden una o más secuencias de ENaC objetivo, tales como cualquier secuencia de ácido nucleico de ENaC o isotipo de ENaC.

En otra modalidad, el ANci multifuncional comprende dos cadenas, en donde: (a) la primera cadena comprende una región que tiene complementariedad de secuencia con una secuencia de ácido nucleico objetivo derivada de un gen (por ejemplo, un primer gen de ENaC) (región complementaria 1 ), y una región que no tiene complementariedad de secuencia con la secuencia de nucleótidos objetivo de la región complementaria 1 (región no complementaria 1 ); (b) la segunda cadena del ANci multifuncional comprende una región que tiene complementariedad de secuencia con una secuencia de ácido nucleico objetivo derivada de un gen (por ejemplo, un segundo gen de ENaC) que es distinto del gen de la región complementaria 1 (región complementaria 2), y una región que no tiene complementariedad de secuencia con la secuencia de nucleótidos objetivo de la región complementaria 2 (región no complementaria 2); (c) la región complementaria 1 de la primera cadena comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos de la región no complementaria 2 de la segunda cadena, y la región complementaria 2 de la segunda cadena comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos de la región no complementaria 1 de la primera cadena. En una modalidad, la secuencia de ácido nucleico objetivo comprende una o más secuencias de ENaC objetivo, tal como cualquier secuencia de ácido nucleico de ENaC o isotipo de ENaC.

En otra modalidad, el ANci multifuncional comprende dos cadenas, en donde: (a) la primera cadena comprende una región que tiene complementariedad de secuencia con una secuencia de ácido nucleico objetivo derivada de un primer gen (por ejemplo, un gen ENaC) (región complementaria 1), y una región que no tiene complementariedad de secuencia con la secuencia de nucleótidos objetivo de la región complementaria 1 (región no complementaria 1 ); (b) la segunda cadena del ANci multifuncional comprende una región que tiene complementariedad de secuencia con una segunda secuencia de ácido nucleico objetivo distinta de la primera secuencia de ácido nucleico objetivo de la región complementaria 1 (región complementaria 2); sin embargo, con la condición de que la secuencia de ácido nucleico objetivo para la región complementaria 1 y la secuencia de ácido nucleico objetivo para la región complementaria 2 deriven ambas del mismo gen, y una región que no tiene complementariedad de secuencia con la secuencia de nucleótidos objetivo de la región complementaria 2 (región no complementaria 2); (c) la región complementaria 1 de la primera cadena comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos de la región no complementaria 2 de la segunda cadena, y la región complementaria 2 de la segunda cadena comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos de la región no complementaria 1 de la primera cadena. En una modalidad, la secuencia de ácido nucleico objetivo comprende una o más secuencias de ENaC objetivo, tales como cualquier secuencia de ácido nucleico de ENaC o isotipo de ENaC.

En una modalidad, la invención presenta una molécula de ácido nucleico corto de interferencia multifuncional (ANci multifuncional), en donde el ANci multifuncional comprende dos secuencias complementarias de ácido nucleico, en donde la primera secuencia comprende una primera región que tiene una secuencia de nucleótidos complementaria a una secuencia de nucleótidos dentro de una molécula de ácido nucleico objetivo, y en donde la segunda secuencia comprende una primera región que tiene una secuencia de nucleótidos complementana a una secuencia de nucleótidos distinta dentro de la misma molécula de ácido nucleico objetivo. De preferencia, la primera región de la primera secuencia también es complementaria a la secuencia de nucleótidos de la segunda región de la segunda secuencia, y en donde la primera región de la segunda secuencia es complementaria a la secuencia de nucleótidos de la segunda región de la primera secuencia. En una modalidad, la secuencia de ácido nucleico objetivo comprende una o más secuencias de ENaC objetivo, tales como cualquier secuencia de ácido nucleico de ENaC o isotipo de ENaC.

En una modalidad, la invención presenta una molécula de ácido nucleico corto de interferencia multifuncional (ANci multifuncional), en donde el ANci multifuncional comprende dos secuencias complementarias de ácido nucleico en donde la primera secuencia comprende una primera región, que tiene una secuencia de nucleótidos complementaria a una secuencia de nucleótidos dentro de una primera molécula de ácido nucleico objetivo, y en donde la segunda secuencia comprende una primera región que tiene una secuencia de nucleótidos complementaria a una secuencia de nucleótidos distinta, dentro de una segunda molécula de ácido nucleico objetivo. Preferiblemente, la primera región de la primera secuencia también es complementaria a la secuencia de nucleótidos de la segunda región de la segunda secuencia, y en donde la primera región de la segunda secuencia es complementana a la secuencia de nucleótidos de la segunda región de la primera secuencia. En una modalidad, la secuencia de ácido nucleico objetivo comprende una o más secuencias de ENaC objetivo, tales como cualquier secuencia de ácido nucleico de ENaC o isotipo de ENaC.

En una modalidad, la invención presenta una molécula de ANci multifuncional que comprende una primera región y una segunda región, en donde la primera región comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene de aproximadamente 18 a aproximadamente 28 nucleótidos complementarios a una secuencia de ácido nucleico dentro de una primera molécula de ácido nucleico objetivo, y la segunda región comprende una secuencia de nucleótidos que tiene de aproximadamente 18 a aproximadamente 28 nucleótidos complementarios a una secuencia distinta de ácido nucleico dentro de una segunda molécula de ácido nucleico objetivo. En una modalidad, la primera molécula de ácido nucleico objetivo y la segunda molécula de ácido nucleico objetivo se seleccionan del grupo que consiste en cualquiera de las secuencias de ENaC objetivo, tales como cualquier secuencia de ácido nucleico de ENaC o de isotipo de ENaC.

En una modalidad, la invención presenta una molécula de ANci multifuncional que comprende una primera región y una segunda región, en donde la primera región comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene de aproximadamente 18 a aproximadamente 28 nucleotidos complementarios a una secuencia de ácido nucleico dentro de una molécula de ácido nucleico objetivo, y la segunda región comprende una secuencia de nucleotidos que tiene de aproximadamente 18 a aproximadamente 28 nucleotidos complementarios a una secuencia distinta de ácido nucleico dentro de la misma molécula de ácido nucleico objetivo. En una modalidad, la molécula de ácido nucleico objetivo se selecciona del grupo que consiste en cualquiera de las secuencias de ENaC objetivo, tales como cualquier secuencia de ácido nucleico de ENaC o de isotipo de ENaC.

En una modalidad, la invención presenta una molécula de ácido nucleico corto de interferencia de doble cadena multifuncional (ARci multifuncional), en donde una cadena del ANci multifuncional comprende una primera región que tiene una secuencia de nucleotidos complementaria a una primera secuencia de ácido nucleico objetivo, y la segunda cadena comprende una primera región que tiene una secuencia de nucleotidos complementaria a una segunda secuencia de ácido nucleico objetivo. La primera y segunda secuencia objetivo de ácido nucleico pueden estar presentes en moléculas de ácido nucleico objetivo separadas, o pueden ser diferentes regiones dentro de la misma molécula del ácido nucleico objetivo. Por lo tanto, las moléculas de ANci multifuncionales de la invención se pueden usar para alterar la expresión de genes diferentes, isotipos del mismo gen, regiones mutantes y conservadas de uno o más transcritos de gen, o secuencias tanto codificadoras como no codificadoras de genes o transcritos de gen iguales o diferentes. En una modalidad, la primera secuencia de ácido nucleico objetivo y la segunda secuencia de ácido nucleico objetivo se seleccionan del grupo que consiste en cualquiera de las secuencias de ENaC objetivo, tales como cualquier secuencia de ácido nucleico de ENaC o de isotipo de ENaC.

En una modalidad, una molécula de ácido nucleico objetivo de la invención codifica una sola proteína. En otra modalidad, una molécula de ácido nucleico objetivo codifica más de una proteína (por ejemplo, 1 , 2, 3, 4, 5 o más proteínas). Por lo tanto, una construcción de ANci multifuncional de la invención se puede usar para regular negativamente o inhibir la expresión de varias proteínas (por ejemplo, cualquier proteína ENaC o cualquier proteína de isotipo de ENaC, o cualquier combinación de las mismas). Por ejemplo, una molécula de ANci multifuncional que comprende una región en una cadena, que tiene una secuencia de nucleótidos complementaria a una primera secuencia de ácido nucleico objetivo derivada de un ENaC objetivo, tal como cualquiera de ENaC o un isotipo de ENaC, y la segunda cadena que comprende una región con secuencia de nucleótidos complementaria a un segundo ENaC objetivo, tal como cualquiera de ENaC o un isotipo de ENaC, se puede usar para regular negativamente, inhibir o detener una ruta biológica particular, haciendo blanco en múltiples genes ENaC.

En una modalidad, la invención aprovecha las secuencias de nucleótidos conservadas presentes en diferentes isoformas de ENaC, tales como cualquiera de ENaC o los isotipos del mismo. Diseñando ANci multifuncionales de manera que una cadena incluya una secuencia que es complementaria a una secuencia de ácido nucleico objetivo conservada entre varios miembros de la familia ENaC, y la otra cadena incluya opcionalmente una secuencia complementaria a secuencias de ácido nucleico objetivo de la ruta de ENaC, es posible modular o inhibir selectiva y eficientemente una ruta biológica relacionada con una enfermedad asociada con ENaC usando un solo ANci multifuncional.

En una modalidad, un ácido nucleico corto de interferencia multifuncional (ANci multifuncional) de la invención comprende una primera región y una segunda región, en donde la primera región comprende complementariedad de secuencia de nucleótidos con un primer ARN de ENaC de un primer ENaC objetivo, y la segunda región comprende complementariedad de secuencia de nucleótidos con un segundo ARN de ENaC de un segundo ENaC objetivo. En una modalidad, la primera y segunda regiones pueden comprender complementariedad de secuencia de nucleótidos con secuencias de ARN compartidas o conservadas de diferentes sitios objetivo de ENaC dentro de la misma isoforma de ENaC, o compartidas entre diferentes clases de isoformas de ENaC.

En una modalidad, una molécula de ANci multifuncional de doble cadena de la invención comprende una estructura que tiene la fórmula MF-I: 5 '-?-? ? X -3' 3 -Yf ? ?-?-5? en donde cada 5'-?-???'-3' y 5'-?-???'-3' son independientemente un oligonucleótido de longitud de aproximadamente 20 nucleótidos a aproximadamente 300 nucleótidos, de preferencia de aproximadamente 20 a aproximadamente 200 nucleótidos, de aproximadamente 20 a aproximadamente 100 nucleótidos, de aproximadamente 20 a aproximadamente 40 nucleótidos, de aproximadamente 20 a aproximadamente 40 nucleótidos, de aproximadamente 24 a aproximadamente 38 nucleótidos, o de aproximadamente 26 a aproximadamente 38 nucleótidos; XZ comprende una secuencia de ácido nucleico que es complementaria a una primera secuencia de ácido nucleico de ENaC objetivo; YZ es un oligonucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico complementaria a una segunda secuencia de ácido nucleico de ENaC objetivo; Z comprende una secuencia de nucleótidos de una longitud de aproximadamente 1 a aproximadamente 24 nucleótidos (por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, o 24 nucleótidos), que es autocomplementaria; X comprende una secuencia de nucleótidos de una longitud de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 nucleótidos, de preferencia de aproximadamente 1 a aproximadamente 21 nucleótidos (por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, o 21 nucleótidos), que es complementaria a una secuencia de nucleótidos presente en la región Y'; Y comprende una secuencia de nucleótidos de una longitud de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 nucleótidos, de preferencia de aproximadamente 1 a aproximadamente 21 nucleótidos (por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o 21 nucleótidos), que es complementaria a una secuencia de nucleótidos presente en la región X'; cada p comprende un grupo fosfato terminal que independientemente está presente o ausente; cada XZ y YZ es independientemente de una longitud suficiente para interaccionar establemente (es decir, por apareamiento de bases) con la primera y la segunda secuencia de ácido nucleico objetivo, respectivamente, o una porción de las mismas. Por ejemplo, cada secuencia X e Y puede comprender independientemente una secuencia de aproximadamente 12 a aproximadamente 21 nucleótidos de longitud, o más (por ejemplo, aproximadamente 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , o más), que es complementaria a una secuencia de nucleótidos objetivo en moléculas de ácido nucleico objetivo diferentes, tales como ARN objetivo, o una porción de la misma. En otro ejemplo no limitativo, la longitud de la secuencia de nucleótidos de X y Z juntos, que es complementaria a la primera secuencia de ácido nucleico de ENaC objetivo o una porción de la misma, es de aproximadamente 12 a aproximadamente 21 nucleótidos o más (por ejemplo, aproximadamente 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , o más). En otro ejemplo no limitativo, la longitud de la secuencia de nucleótidos de Y y Z juntos, que es complementaria a la segunda secuencia de ácido nucleico de ENaC objetivo o una porción de la misma, es de aproximadamente 12 a aproximadamente 21 nucleótidos o más (por ejemplo, aproximadamente 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , o más). En una modalidad, la primera secuencia de ácido nucleico de ENaC objetivo, y la segunda secuencia de ácido nucleico de ENaC objetivo están presentes en la misma molécula de ácido nucleico objetivo (por ejemplo, el ARN objetivo de ENaC o el ARN objetivo de la ruta de ENaC). En otra modalidad, la primera secuencia de ácido nucleico de ENaC objetivo y la segunda secuencia de ácido nucleico de ENaC objetivo están presentes en diferentes moléculas de ácido nucleico objetivo (por ejemplo, el ARN objetivo de ENaC y el ARN objetivo de la ruta de ENaC). En una modalidad, Z comprende un palíndromo o una secuencia de repetición. En una modalidad, las longitudes de los oligonucleótidos X y X' son idénticas. En otra modalidad, las longitudes de los oligonucleótidos X y X' no son idénticas. En una modalidad, las longitudes de los oligonucleótidos Y e Y' son idénticas. En otra modalidad, las longitudes de los oligonucleótidos Y e Y' no son idénticas. En una modalidad, la construcción de oligonucleótido de doble cadena de fórmula MF-I incluye una o más discordancias, específicamente 1 , 2, 3 o 4, en la medida en que dichas discordancias no disminuyan significativamente la capacidad del oligonucleótido de doble cadena para inhibir la expresión del gen objetivo.

En una modalidad, una molécula de ANci multifuncional de la invención comprende una estructura que tiene la fórmula MF-II: 5f-p-X X -3' 3'-?' ?-?-5' en donde cada 5'-p-XX'-3' y 5'-p-YY'-3' son independientemente un oligonucleótido de una longitud de aproximadamente 20 nucleótidos a aproximadamente 300 nucleótidos, de preferencia de aproximadamente 20 a aproximadamente 200 nucleótidos, de aproximadamente 20 a aproximadamente 100 nucleótidos, de aproximadamente 20 a aproximadamente 40 nucleótidos, de aproximadamente 20 a aproximadamente 40 nucleótidos, de aproximadamente 24 a aproximadamente 38 nucleótidos, o de aproximadamente 26 a aproximadamente 38 nucleótidos; X comprende una secuencia de ácido nucleico que es complementaria a una primera secuencia de ácido nucleico objetivo; Y es un oligonucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico que es complementaria a una segunda secuencia de ácido nucleico objetivo; X comprende una secuencia de nucleótidos de una longitud de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 nucleótidos, de preferencia de aproximadamente 1 a aproximadamente 21 nucleótidos (por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, o 21 nucleótidos), que es complementaria a una secuencia de nucleótidos presente en la región Y'; Y comprende una secuencia de nucleótidos de una longitud de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 nucleótidos, de preferencia de aproximadamente 1 a aproximadamente 21 nucleótidos (por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o 21 nucleótidos), que es complementaria a una secuencia de nucleótidos presente en la región X'; cada p comprende un grupo fosfato terminal que, independientemente, está presente o ausente; cada X e Y es independientemente de una longitud suficiente para interaccionar establemente (es decir, por apareamiento de bases) con la primera y segunda secuencia de ácido nucleico objetivo, respectivamente, o una porción de las mismas. Por ejemplo, cada secuencia X e Y puede comprender independientemente una secuencia de aproximadamente 12 a aproximadamente 21 nucleótidos de longitud o más (por ejemplo, aproximadamente 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , o más), que es complementaria a una secuencia de nucleótidos objetivo de moléculas de ácido nucleico objetivo diferentes, tales como ARN de ENaC objetivo, o una porción de la misma. En una modalidad, la primera secuencia de ácido nucleico de ENaC objetivo y la segunda secuencia de ácido nucleico de ENaC objetivo están presentes en la misma molécula de ácido nucleico objetivo (por ejemplo, ARN objetivo de ENaC o ARN objetivo de la ruta de ENaC). En otra modalidad, la primera secuencia de ácido nucleico de ENaC objetivo y la segunda secuencia de ácido nucleico de ENaC objetivo están presentes en diferentes moléculas de ácido nucleico objetivo (por ejemplo, ARN objetivo de ENaC o ARN objetivo de la ruta de ENaC). En una modalidad, Z comprende un palíndromo o una secuencia de repetición. En una modalidad, las longitudes de los oligonucleótidos X y X' son idénticas. En otra modalidad, las longitudes de los oligonucleótidos X y X' no son idénticas. En una modalidad, las longitudes de los oligonucleótidos Y e Y' son idénticas. En otra modalidad, las longitudes de los oligonucleótidos Y e Y' no son idénticas. En una modalidad, la construcción de oligonucleótido de doble cadena de fórmula 1(a) incluye una o más discordancias, específicamente 1 , 2, 3 o 4 discordancias, en la medida en que dichas discordancias no disminuyan significativamente la capacidad del oligonucleótido de doble cadena para inhibir la expresión del gen objetivo.

En una modalidad, una molécula de ANci multifuncional de la invención comprende una estructura que tiene la fórmula MF-lll: X X' Y'-W-Y en donde cada X, X', Y, e Y' es independientemente un oligonucleótido de una longitud de aproximadamente 15 nucleótidos a aproximadamente 50 nucleótidos, de preferencia de aproximadamente 18 a aproximadamente 40 nucleótidos, o de aproximadamente 19 a aproximadamente 23 nucleótidos; X comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos presente en la región Y'; X' comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos presente en la región Y; cada X y X' es independientemente de una longitud suficiente para interaccionar establemente (es decir, por apareamiento de bases) con una primera y una segunda secuencia de ácido nucleico de ENaC objetivo, respectivamente, o una porción de las mismas; W representa un enlazador nucleotídico o no nucleotídico que une las secuencias Y' e Y; y el ANci multifuncional dirige el corte de la primera y segunda secuencia de ENaC objetivo por medio de interferencia de ARN. En una modalidad, la primera secuencia de ácido nucleico de ENaC objetivo y la segunda secuencia de ácido nucleico de ENaC objetivo están presentes en la misma molécula de ácido nucleico objetivo (por ejemplo, en ARN objetivo de ENaC o ARN objetivo de la ruta de ENaC). En otra modalidad, la primera secuencia de ácido nucleico de ENaC objetivo y la segunda secuencia de ácido nucleico de ENaC objetivo están presentes en diferentes moléculas de ácido nucleico objetivo o una porción de las mismas (por ejemplo, ARN objetivo de ENaC o ARN objetivo de la ruta de ENaC). En una modalidad, la región W une el extremo 3' de la secuencia Y' con el extremo 3' de la secuencia Y. En una modalidad, la región W une el extremo 3' de la secuencia Y' con el extremo 5' de la secuencia Y. En una modalidad, la región W une el extremo 5' de la secuencia Y' con el extremo 5' de la secuencia Y. En una modalidad, la región W une el extremo 5' de la secuencia Y' con el extremo 3' de la secuencia Y. En una modalidad está presente un grupo fosfato terminal en el extremo 5' de la secuencia X. En una modalidad está presente un grupo fosfato terminal en el extremo 5' de la secuencia X'. En una modalidad está presente un grupo fosfato terminal en el extremo 5' de la secuencia Y. En una modalidad está presente un grupo fosfato terminal en el extremo 5' de la secuencia Y'. En una modalidad, W une las secuencias Y e Y' por medio de un enlazador biodegradable. En una modalidad, W también comprende un conjugado, marca, aptámero, ligando, lípido, o polímero.

En una modalidad, una molécula de ANci multifuncional de la invención comprende una estructura que tiene la fórmula MF-IV: X X' Y'-W-Y en donde cada X, X', Y, e Y' es independientemente un oligonucleótido de una longitud de aproximadamente 15 nucleotidos a aproximadamente 50 nucleotidos, de preferencia de aproximadamente 18 a aproximadamente 40 nucleotidos, o de aproximadamente 19 a aproximadamente 23 nucleotidos; X comprende una secuencia de nucleotidos que es complementaria a una secuencia de nucleotidos presente en la región Y'; X' comprende una secuencia de nucleotidos que es complementaria a una secuencia de nucleotidos presente en la región Y; cada Y e Y' es independientemente de longitud suficiente para interaccionar establemente (es decir, por apareamiento de bases) con una primera y una segunda secuencia de ácido nucleico de ENaC objetivo, respectivamente, o una porción de las mismas; W representa un enlazador nucleotídico o no nucleotídico que une las secuencias Y' e Y; y el ANci multifuncional dirige el corte de la primera y segunda secuencia de ENaC objetivo por medio de interferencia de ARN. En una modalidad, la primera secuencia de ácido nucleico de ENaC objetivo y la segunda secuencia de ácido nucleico de ENaC objetivo están presentes en la misma molécula de ácido nucleico objetivo (por ejemplo, ARN objetivo de ENaC o ARN objetivo de la ruta de ENaC). En otra modalidad, la primera secuencia de ácido nucleico de ENaC objetivo y la segunda secuencia de ácido nucleico de ENaC objetivo están presentes en diferentes moléculas de ácido nucleico objetivo o una porción de las mismas (por ejemplo, ARN objetivo de ENaC o ARN objetivo de la ruta de ENaC). En una modalidad, la región W une el extremo 3' de la secuencia Y' con el extremo 3' de la secuencia Y. En una modalidad, la región W une el extremo 3' de la secuencia Y' con el extremo 5' de la secuencia Y. En una modalidad, la región W une el extremo 5' de la secuencia Y' con el extremo 5' de la secuencia Y. En una modalidad, la región W une el extremo 5' de la secuencia Y' con el extremo 3' de la secuencia Y. En una modalidad está presente un grupo fosfato terminal en el extremo 5' de la secuencia X. En una modalidad está presente un grupo fosfato terminal en el extremo 5' de la secuencia X'. En una modalidad está presente un grupo fosfato terminal en el extremo 5' de la secuencia Y. En una modalidad está presente un grupo fosfato terminal en el extremo 5' de la secuencia Y'. En una modalidad, W une las secuencias Y e Y' por medio de un enlazador biodegradable. En una modalidad, W también comprende un conjugado, marca, aptámero, ligando, lípido, o polímero.

En una modalidad, una molécula de ANci multifuncional de la invención comprende una estructura que tiene la fórmula MF-V: X ?' Y'-W-Y en donde cada X, X', Y, e Y' es independientemente un oligonucleótido de una longitud de aproximadamente 15 nucleótidos a aproximadamente 50 nucleótidos, de preferencia de aproximadamente 18 a aproximadamente 40 nucleótidos, o de aproximadamente 19 a aproximadamente 23 nucleótidos; X comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos presente en la región Y'; X' comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos presente en la región Y; cada X, X', Y, o Y' es independientemente de longitud suficiente para interaccionar establemente (es decir, por apareamiento de bases) con una primera, segunda, tercera, o cuarta secuencia de ácido nucleico de ENaC objetivo, respectivamente, o una porción de las mismas; W representa un enlazador nucleotídico o no nucleotídico que une las secuencias Y' e Y; y el ANci multifuncional dirige el corte de la primera, segunda, tercera, o cuarta secuencia objetivo por medio de interferencia de ARN. En una modalidad, la primera, segunda, tercera y cuarta secuencia de ácido nucleico de ENaC objetivo están todas presentes en la misma molécula de ácido nucleico objetivo (por ejemplo, ARN objetivo de ENaC o ARN objetivo de la ruta de ENaC). En otra modalidad, la primera, segunda, tercera y cuarta secuencia de ácido nucleico de ENaC objetivo, independientemente, están presentes en diferentes moléculas de ácido nucleico objetivo (por ejemplo, ARN objetivo de ENaC o ARN objetivo de la ruta de ENaC). En una modalidad, la región W une el extremo 3' de la secuencia Y' con el extremo 3' de la secuencia Y. En una modalidad, la región W une el extremo 3' de la secuencia Y' con el extremo 5' de la secuencia Y. En una modalidad, la región W une el extremo 5' de la secuencia Y' con el extremo 5' de la secuencia Y. En una modalidad, la región W une el extremo 5' de la secuencia Y' con el extremo 3' de la secuencia Y. En una modalidad está presente un grupo fosfato terminal en el extremo 5' de la secuencia X. En una modalidad está presente un grupo fosfato terminal en el extremo 5' de la secuencia X'. En una modalidad está presente un grupo fosfato terminal en el extremo 5' de la secuencia Y. En una modalidad está presente un grupo fosfato terminal en el extremo 5' de la secuencia Y'. En una modalidad, W une las secuencias Y e Y' por medio de un enlazador biodegradable. En una modalidad, W también comprende un conjugado, marca, aptámero, ligando, lípido, o polímero.

En una modalidad, las regiones X e Y de la molécula de ANci multifuncional de la invención (por ejemplo, que tienen cualquiera de las fórmulas MF-I - MF-V), son complementarias a secuencias de ácido nucleico objetivo diferentes que son porciones de la misma molécula de ácido nucleico objetivo. En una modalidad, tales secuencias de ácido nucleico objetivo están en sitios diferentes dentro de la región codificadora de un transcrito de ARN. En una modalidad, dichas secuencias de ácido nucleico objetivo comprenden regiones codificadoras y no codificadoras del mismo transcrito de ARN. En una modalidad, dichas secuencias de ácido nucleico objetivo comprenden regiones de transcritos empalmados alternativamente o precursores de tales transcritos empalmados alternativamente.

En una modalidad, una molécula de ANci multifuncional que tiene cualquiera de las fórmulas MF-I - MF-V puede comprender modificaciones químicas como se describen en la presente, tales como por ejemplo, sin limitación, nucleotidos que tienen cualquiera de las fórmulas l-VII que se describen en la presente, químicas de estabilización que se describen en el cuadro 8, o cualquier otra combinación de nucleotidos y no nucleotidos modificados y como se describe en las diversas modalidades de la presente.

En una modalidad, el palíndromo o secuencia de repetición o nucleótido modificado (por ejemplo, un nucleótido con una base modificada, tal como 2-amino-purina o una base universal) en Z de las construcciones de ANci multifuncional que tienen las fórmulas MF-I o MF-II, comprende nucleotidos químicamente modificados que son capaces de interaccionar con una porción de la secuencia de ácido nucleico objetivo (por ejemplo, análogos de bases modificadas que pueden formar pares de bases de Watson-Crick o pares de bases que no son del tipo Watson-Crick).

En una modalidad, una molécula de ANci multifuncional de la invención, por ejemplo cada cadena de un ANci multifuncional que tiene MF-I - MF-V, independientemente, comprende de aproximadamente 15 a aproximadamente 40 nucleotidos (por ejemplo, aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, o 40 nucleotidos). En una modalidad, una molécula de ANci multifuncional de la invención comprende una o más modificaciones químicas. En un ejemplo no limitativo, la introducción de nucleótidos o no nucleótidos químicamente modificados en las moléculas de ácido nucleico de la invención, provee una herramienta poderosa para superar las limitaciones potenciales de estabilidad in vivo y biodisponibilidad inherentes a las moléculas de ARN no modificadas que son suministradas exógenamente. Por ejemplo, el uso de moléculas de ácido nucleico químicamente modificadas permite reducir la dosis de una molécula de ácido nucleico particular para un efecto terapéutico dado, puesto que las moléculas de ácido nucleico químicamente modificadas tienden a tener una vida media prolongada en el suero, las células o los tejidos. Además, ciertas modificaciones químicas pueden mejorar la biodisponibilidad o potencia de las moléculas de ácido nucleico, no solo aumentando la vida media sino también facilitando el direccionamiento de las moléculas de ácido nucleico a órganos, células o tejidos particulares, o mejorando la incorporación celular de las moléculas de ácido nucleico. Por lo tanto, aunque la actividad de la molécula de ácido nucleico químicamente modificada se reduce in vitro en comparación con una molécula de ácido nucleico nativo/ no modificado, por ejemplo en comparación con una molécula de ARN no modificada, la actividad general de la molécula de ácido nucleico modificado puede ser mayor que la molécula de ácido nucleico nativo o no modificado, debido a un mejoramiento de la estabilidad, potencia, duración de efecto, biodisponibilidad o suministro de la molécula.

En otra modalidad, la invención presenta ANci multifuncionales en donde los ANci multifuncionales se ensamblan de dos ANci de doble cadena separados, con uno de los extremos de cada cadena de sentido atado al extremo de la cadena de sentido de la otra molécula de ANci, de tal manera que las dos cadenas de antisentido del ANci se aparean con su cadena de sentido correspondiente, que están atadas una a otra en un extremo (véanse las figuras 19A-19H). Los atadores o enlazadores pueden ser enlazadores basados en nucleótido o enlazadores basados en moléculas no nucleotídicas, como se conoce generalmente en la técnica y como se describe en la presente.

En una modalidad, la invención presenta un ANci multifuncional en donde el ANci multifuncional se ensambla de dos ANci de doble cadena separados, con el extremo 5' de una cadena de sentido del ANci atado al extremo 5' de la cadena de sentido de la otra molécula de ANci, de tal manera que los extremos 5' de las dos cadenas de antisentido de ANci apareadas con su cadena de sentido correspondiente, que están atadas una a otra en un extremo, apuntan (en dirección opuesta) una a otra (véase la figura 19A). Los atadores o enlazadores pueden ser enlazadores basados en nucleótido o enlazadores basados en moléculas no nucleotídicas, como se conoce generalmente en la técnica y como se describe en la presente.

En una modalidad, la invención presenta un ANci multifuncional, en donde el ANci multifuncional se ensambla de dos ANc de doble cadena separados, con el extremo 3' de una cadena de sentido del ANci atado al extremo 3' de la cadena de sentido de la otra molécula de ANci, de tal manera que los extremos 5' de las dos cadenas de antisentido de ANci apareadas con su cadena de sentido correspondiente, que están atadas una a otra en un extremo, quedan frente a frente (véase la figura 19B). Los atadores o enlazadores pueden ser enlazadores basados en nucleótido o enlazadores basados en moléculas no nucleotídicas, como se conoce generalmente en la técnica y como se describe en la presente.

En una modalidad, la invención presenta un ANci multifuncional en donde el ANci multifuncional se ensambla de dos ANc de doble cadena separados, con el extremo 5' de una cadena de sentido del ANci atado al extremo 3' de la cadena de sentido de la otra molécula de ANci, de tal manera que el extremo 5' de una de las cadenas de antisentido de ANci apareada con su cadena de sentido correspondiente, que están atadas una a otra en un extremo, queda frente al extremo 3' de la otra cadena de antisentido (véanse las figuras 19C-19D). Los atadores o enlazadores pueden ser enlazadores basados en nucleótido o enlazadores basados en moléculas no nucleotídicas, como se conoce generalmente en la técnica y como se describe en la presente.

En una modalidad, la invención presenta un ANci multifuncional en donde el ANci multifuncional se ensambla de dos ANc de doble cadena separados, con el extremo 5' de una la cadena de antisentido del ANci atado al extremo 3' de la cadena de antisentido de la otra molécula de ANci, de tal manera que el extremo 5' de una de las cadenas de sentido de ANci apareada con su cadena de antisentido sentido correspondiente, que están atadas una a otra en un extremo, queda frente al extremo 3' de la otra cadena de sentido (véanse las figuras 19G-19H). En una modalidad, el enlace entre el extremo 5' de la primera cadena de antisentido y el extremo 3' de la segunda cadena de antisentido, se diseña de tal manera que sea fácilmente escindible (por ejemplo, un enlazador biodegradable) para que el extremo 5' de cada cadena de antisentido del ANci multifuncional tenga un extremo 5' libre adecuado para mediar el corte mediado por interferencia de ARN del ARN objetivo. Los atadores o enlazadores pueden ser enlazadores basados en nucleótido o enlazadores basados en moléculas no nucleotídicas, como se conoce generalmente en la técnica y como se describe en la presente.

En una modalidad, la invención presenta un ANci multifuncional en donde el ANci multifuncional se ensambla de dos ANc de doble cadena separados, con el extremo 5' de cadena de antisentido del ANci atado al extremo 5' de la cadena de antisentido de la otra molécula de ANci, de tal manera que el extremo 3' de una de las cadenas de sentido de ANci apareada con su cadena de antisentido sentido correspondiente, que están atadas una a otra en un extremo, queda frente al extremo 3' de la otra cadena de sentido (véase la figura 19E). En una modalidad, el enlace entre el extremo 5' de la primera cadena de antisentido y el extremo 5' de la segunda cadena de antisentido se diseña de tal manera de ser fácilmente escindible (por ejemplo, un enlazador biodegradable), para que el extremo 5' de cada cadena de antisentido del ANci multifuncional tenga un extremo 5' libre adecuado para mediar el corte del ARN objetivo mediado por interferencia de ARN. Los atadores o enlazadores pueden ser enlazadores basados en nucleótido o enlazadores basados en moléculas no nucleotídicas, como se conoce generalmente en la técnica y como se describe en la presente.

En una modalidad, la invención presenta un ANci multifuncional en donde el ANci multifuncional se ensambla de dos ANci de doble cadena separados, con el extremo 3' de una cadena de antisentido del ANci atado al extremo 3' de la cadena de antisentido de la otra molécula de ANci, de tal manera que el extremo 5' de una de las cadenas de sentido del ANci apareada con su cadena de antisentido sentido correspondiente, que están atadas una a otra en un extremo, queda frente al extremo 3' de la otra cadena de sentido (véase la figura 19F). En una modalidad, el enlace entre el extremo 5' de la primera cadena de antisentido y el extremo 5' de la segunda cadena de antisentido se diseña de tal manera de ser fácilmente escindible (por ejemplo, un enlazador biodegradable), para que el extremo 5' de cada cadena de antisentido del ANci multifuncional tenga un extremo 5' libre adecuado para mediar el corte del ARN objetivo mediado por interferencia de ARN. Los atadores o enlazadores pueden ser enlazadores basados en nucleótido o enlazadores basados en moléculas no nucleotídicas, como se conoce generalmente en la técnica y como se describe en la presente.

En cualquiera de las modalidades anteriores, una primera secuencia de ácido nucleico objetivo o una segunda secuencia de ácido nucleico objetivo, independientemente, pueden comprender ENaC o un isotipo de ENaC. En cualquiera de las modalidades anteriores, una primera secuencia de ácido nucleico objetivo o una segunda secuencia de ácido nucleico objetivo, independientemente, pueden comprender ARN de ENaC o de un isotipo de ENaC. En una modalidad la primera secuencia de ácido nucleico de ENaC objetivo es un ARN blanco de ENaC o una porción del mismo, y la segunda secuencia de ácido nucleico de ENaC objetivo es un ARN o ADN objetivo de la ruta de ENaC. En una modalidad, la primera secuencia de ácido nucleico objetivo es un ARN objetivo, un ADN objetivo, o una porción de los mismos, y la segunda secuencia de ácido nucleico objetivo es otro ARN, ADN, o una porción de los mismos.

En una modalidad, en cualquiera de las modalidades de la presente, la primera secuencia objetivo es una secuencia de ENaC objetivo o una porción de la misma, y la segunda secuencia objetivo es una secuencia de ENaC objetivo o una porción de la misma. En una modalidad, en cualquiera de las modalidades de la presente, la primera secuencia objetivo es una secuencia de ENaC objetivo (por ejemplo, cualquiera de ENaC o isotipos de ENaC) o una porción de la misma, y la segunda secuencia objetivo es una secuencia de ENaC objetivo (por ejemplo, cualquiera de ENaC o isotipos de ENaC) o una porción de la misma.

Síntesis de moléculas de ácido nucleico La síntesis de ácidos nucleicos mayores de 100 nucleótidos de longitud es difícil usando los métodos automáticos y el costo terapéutico de dichas moléculas es prohibitivo. En esta invención, se usan preferiblemente motivos de ácido nucleico pequeños ("pequeños" se refiere a motivos de ácido nucleico de no mas de 100 nucleótidos de longitud, de preferencia de no más de 80 nucleótidos de longitud, muy de preferencia de no más de 50 nucleótidos de longitud, por ejemplo secuencias de oligonucleótido de ANci individuales o secuencias de ANci sintetizadas en tándem), para suministro exógeno. La estructura simple de estas moléculas aumenta la capacidad del ácido nucleico para invadir las regiones objetivo de la estructura de proteína o ARN. Las moléculas ejemplares de la presente invención se sintetizan químicamente y otras se pueden sintetizar de forma similar.

Los oligonucleótidos (por ejemplo algunos oligonucleótidos o porciones de oligonucleótidos modificados que carecen de ribonucleótidos) se sintetizan usando los protocolos conocidos, por ejemplo como lo describen Caruthers et al., 1992, Methods in Enzymology 2 1 , 3-19, Thompson ef al., publicación internacional de PCT No. WO 99/54459, Wincott ef al., 1995, Nucleic Acids Res. 23, 2677-2684, Wincott et al., 1997, Methods Mol. Bio., 74, 59, Brennan et al., 1998, Biotechnol Bioeng., 61 , 33-45, y Brennan, patente de EE. UU. No. 6,001 ,311. Todas estas referencias se incorporan aquí como referencia. La síntesis de los oligonucleótidos utiliza grupos comunes de protección y acoplamiento de ácido nucleico, tales como dimetoxitritilo en el extremo 5' y fosforamiditas en el extremo 3'. En un ejemplo no limitativo, se realiza síntesis a pequeña escala en un sintetizador 394 de Applied Biosystems, Inc. usando un protocolo a escala de 0.2 µ???? con un paso de acoplamiento de 2.5 minutos para nucleótidos 2'-0-metilados y un paso de acoplamiento de 45 segundos para 2'-desoxi-nucleótidos o 2'-desoxi-2'-fluoro-nucleótidos. El cuadro 9 indica las cantidades y tiempos de contacto de los reactivos usados en el ciclo de síntesis. Alternativamente, se puede hacer síntesis en la escala de 0.2 pmol en un sintetizador de placa de 96 pocilios, tal como el instrumento producido por Protogene (Palo Alto, California) con modificación mínima al ciclo. Se puede usar un exceso de 33 veces (60 µ?_ de 0.1 1 M = 6.6 pmol) de 2'-0-metil-fosforamidita, y un exceso de 105 veces de S-etil-tetrazol (60 µ?_ de 0.25 M = 15 pmol) en cada ciclo de acoplamiento de los residuos de 2'-0-met¡lo con respecto al 5'-hidroxilo unido al polímero. Se puede usar un exceso de 22 veces (40 pL de 0.1 1 M = 4.4 pmol) de desoxi-fosforamidita, y un exceso de 70 veces de S-etil-tetrazol (40 µ?_ de 0.25 M = 10 µ????) en cada ciclo de acoplamiento de los residuos desoxi con respecto al 5'-hidroxilo unido a polímero. Los rendimientos de acoplamiento promedio en el sintetizador 394 de Applied Biosystems, Inc., determinados por cuantificación colorimétrica de las fracciones de titrilo, normalmente son de 97.5-99%. Otros reactivos de síntesis de oligonucleótido para el sintetizador 394 de Applied Biosystems, Inc., incluyen los siguientes: la solución de destritilación es TCA al 3% en cloruro de metileno (ABI); el bloqueado se realiza con /V-metil-imidazol al 16% en THF (ABI) y anhídrido acético 10% /2,6-lutidina 10% en THF (ABI); y la solución de oxidación es 16.9 mM de l2, 49 mM de piridina, 9% de agua en THF (PerSeptive Biosystems, Inc.). Se usa acetonitrilo grado síntesis de Burdick & Jackson directamente del recipiente del reactivo. Se prepara una solución de S-etiltetrazol (0.25 M en acetonitrilo) del sólido obtenido de American International Chemical, Inc. Alternativamente, para la introducción de enlaces de fosforotioato se usa el reactivo de Beaucage (1 ,1-dióxido de 3H-1 ,2-benzoditiol-3-ona, 0.05 M en acetonitrilo).

La desprotección de los oligonucleótidos basados en ADN se realiza de la siguiente manera: el oligorribonucleótido tritilado enlazado a polímero se transfiere a un frasco de vidrio de tapa de rosca de 4 mi y se suspende en una solución de metilamina acuosa al 40% (1 mi) a 65°C durante 10 minutos. Después de enfriar a -20°C, el sobrenadante se retira del soporte de polímero. El soporte se lava 3 veces con 1.0 mi de EtOH:MeCN:H20 /3:1 :1 , se agita con vórtice y el sobrenadante se añade entonces al primer sobrenadante. El sobrenadante combinado, que contiene el oligorribonucleótido, se seca hasta quedar un polvo blanco. En una modalidad, las moléculas de ácido nucleico de la invención se sintetizan, desprotegen y analizan de acuerdo con los métodos descritos en US 6,995,259, US 6,686,463, US 6,673,918, US 6,649,751 , US 6,989,442, y USSN 10/190,359, todas los cuales se incorporan aquí como referencia en su totalidad.

El método de síntesis usado para ARN que incluye algunas moléculas de ANci de la invención sigue el procedimiento que describen Usman et al., 1987, J. Am. Chem. Soc, 109, 7845; Scaringe et al., 1990, Nucleic Acids Res., 18, 5433; y Wincott et al., 1995, Nucleic Acids Res 23, 2677-2684, Wincott et al., 1997, Methods Mol. Bio., 74, 59, y utiliza los grupos comunes protectores y de acoplamiento de ácido nucleico, tales como dimetoxitritilo en el extremo 5', y fosforamiditas en el extremo 3'. En un ejemplo no limitativo, se realiza síntesis a pequeña escala en un sintetizador 394 de Applied Biosystems, Inc. usando un protocolo a escala de 0.2 pmol con un paso de acoplamiento de 7.5 minutos para nucleótidos protegidos con alquilsililo, y un paso de acoplamiento de 2.5 minutos para nucleótidos 2'-0-metilados. El cuadro 9 indica las cantidades y tiempos de contacto de los reactivos usados en el ciclo de síntesis. Alternativamente, se pueden hacer síntesis en la escala de 0.2 pmol en un sintetizador de placa de 96 pocilios, tal como el instrumento producido por Protogene (Palo Alto, California) con mínima modificación al ciclo. Se puede usar un exceso de 33 veces (60 µ?_ de 0.1 1 M = 6.6 pmol) de 2'-0-metil-fosforamidita, y un exceso de 75 veces de S-etil-tetrazol (60 µ?_ de 0.25 M = 15 pmol) en cada ciclo de acoplamiento de los residuos de 2'-0-metilo con respecto al 5'-hidroxilo unido al polímero. Se puede usar un exceso de 66 veces (120 pl_ de 0.1 1 M = 13.2 pmol) de fosforamidita (ribo) protegida con alquilsililo, y un exceso de 150 veces de S-etil-tetrazol (120 µ?_ de 0.25 M = 30 pmol) en cada ciclo de acoplamiento de residuos ribo con respecto al 5' hidroxilo unido al polímero. Los rendimientos de acoplamiento promedio en el sintetizador 394 de Applied Biosystems, Inc., determinados por cuantificación colorimétrica de las fracciones de trifilo, normalmente son de 97.5-99%. Otros reactivos de síntesis de oligonucleótido para el sintetizador 394 de Applied Biosystems, Inc. incluyen los siguientes: la solución de destritilación es TCA al 3% en cloruro de metileno (ABI); el bloqueado se realiza con /V-metil-imidazol al 16% en THF (ABI) y anhídrido acético 10% /2,6-lutidina 10% en THF (ABI); la solución de oxidación es 16.9 mM de ½, 49 mM de piridina, 9% de agua en THF (PerSeptive Biosystems, Inc.). Se usa acetonitrilo grado síntesis de Burdick & Jackson directamente del recipiente del reactivo. Se prepara una solución de S-etiltetrazol (0.25 M en acetonitrilo) del sólido obtenido de American International Chemical, Inc. Alternativamente, para la introducción de enlaces de fosforotioato se usa el reactivo de Beaucage (1 , 1 -dióxido de 3H-1 ,2-benzoditiol-3-ona, 0.05 M en acetonitrilo).

La desprotección del ARN se realiza usando un protocolo de dos recipientes o un recipiente. Para el protocolo de dos recipientes, el oligorribonucleótido tritilado unido al polímero se transfiere a un frasco de vidrio de tapa de rosca de 4 mi y se suspende en una solución de metilamina acuosa al 40% (1 mi) a 65°C durante 10 minutos. Después de enfriar a -20°C, el sobrenadante se retira del soporte de polímero. El soporte se lava tres veces con 1.0 mi de EtOH:MeCN:H20 /3:1 :1 , se agita con vórtice y el sobrenadante se añade entonces al primer sobrenadante. El sobrenadante combinado, que contiene el oligorribonucleótido, se seca hasta quedar un polvo blanco. El oligorribonucleótido de base desprotegido se resuspende en una solución de TEA anhidra /HF / NMP (300 µ? de una solución de 1.5 mi de N-metilpirrolidinona, 750 µ? de TEA y 1 mi de TEA»3HF, para dar una concentración de 1.4 M de HF) y se calienta a 65 °C. Después de 1.5 h, el oligómero se desactiva con 1.5 M de NH4HCO3. En una modalidad, las moléculas de ácido nucleico de la invención se sintetizan, desprotegen y analizan de acuerdo con los métodos descritos en US 6,995,259, US 6,686,463, US 6,673,918, US 6,649,751 , US 6,989,442, y USSN 10/190,359, todas los cuales se incorporan aquí como referencia en su totalidad.

Alternativamente, para el protocolo de un recipiente, el oligorribonucleótido tritilado unido al polímero se transfiere a un recipiente de vidrio de tapa de rosca de 4 mi y se suspende en una solución de metilamina etanólica al 33% /DMSO, 1/1 (0.8 mi), a 65 °C durante 15 minutos. El frasco se lleva a temperatura ambiente, se le agrega TEA»3HF (0.1 mi), y se calienta a 65°C durante 15 minutos. La muestra se enfría a -20°C y después se desactiva con 1 .5 M NH4HC03.

• Para la purificación de los oligómeros tritilados, la solución de NH4HCO3 desactivada se carga en un cartucho que contiene C18 que se había lavado previamente con acetonitrilo, seguido por 50 mM de TEAA. Después de lavar el cartucho cargado con agua, el ARN se des-tritila con 0.5% de TFA durante 13 minutos. Después, el cartucho se vuelve a lavar con agua, se intercambia la sal con NaCI 1 M y se lava nuevamente con agua. Después se eluye el oligonucleótido con 30% de acetonitrilo.

Los rendimientos promedio del acoplamiento por pasos normalmente son >98% (Wincott et al., 1995 Nucleic Acids Res. 23, 2677-2684). Los expertos en la materia reconocerán que la escala de síntesis se puede adaptar para que sea mayor o menor que el ejemplo anteriormente descrito, que incluye sin limitación el formato de 96 pocilios.

Alternativamente, las moléculas de ácido nucleico de la presente invención se pueden sintetizar separadamente y unirse después de la síntesis, por ejemplo por ligación (Moore et ai, 1992, Science 256, 9923; Draper et al., publicación internacional de PCT No. WO 93/23569; Shabarova et al., 1991 , Nucleic Acids Research 19, 4247; Bellon et al., 1997, Nucleosides & Nucleotides, 16, 951 ; Bellon et al., 1997, Bioconjugate Chem. 8, 204), o por hibridación después de síntesis o desprotección.

Las moléculas de ANci de la invención también se pueden sintetizar mediante una metodología de síntesis en tándem como se describe en el ejemplo 1 de la presente, en donde las dos cadenas de ANci se sintetizan como un solo fragmento o cadena contiguos de oligonucleótido separado por un enlazador escindible que subsiguientemente se separa para proveer fragmentos o cadenas de ANci separados que se hibridan y permiten la purificación del dúplex de ANci. El enlazador puede ser un enlazador de polinucleótido o un enlazador no nucleotídico. La síntesis en tándem del ANci como se describe aquí, se puede adaptar fácilmente a plataformas de síntesis de múltiples pocilios/múltiples placas, tales como plataformas de 96 pocilios o similarmente plataformas de multipocillos mas grandes. La síntesis en tándem del ANci como se describe aquí también se puede adaptar fácilmente a plataformas de síntesis de gran escala que usan reactores por lote, columnas de síntesis, etcétera.

Una molécula de ANci también se puede ensamblar de dos cadenas o fragmentos distintos de ácido nucleico, en donde un fragmento incluye la región de sentido y el segundo fragmento incluye la región de antisentido de la molécula de ARN.

Las moléculas de ácido nucleico de la presente invención se pueden modificar extensamente para aumentar la estabilidad por modificación con grupos resistentes a la nucleasa, por ejemplo 2'-amino, 2'-C-alilo, 2'-fluoro, 2'-0-metilo, 2'-H (para una revisión véase Usman y Cedergren, 1992, TIBS 17, 34; Usman et al., 1994, Nucleic Acids Symp. Ser. 31 , 163). Las construcciones de ANci se pueden purificar por electroforesis en gel usando los métodos generales, o se pueden purificar mediante cromatografía de líquidos de alta presión (HPLC; véase Wincott et al., supra, la totalidad de la cual se incorpora aquí como referencia), y se resuspenden en agua.

En otro aspecto de la invención, las moléculas de ANci de la invención se expresan desde unidades de transcripción insertadas en vectores de ADN o ARN. Los vectores recombinantes pueden ser plásmidos de ADN o vectores virales. Se pueden construir vectores virales que expresan ANci basándose, sin limitación, en virus adeno-asociados, retrovirus, adenovirus, o alfavirus. Los vectores recombinantes capaces de expresar las moléculas de ANci pueden ser suministrados como se describe aquí y persisten en las células objetivo. Alternativamente, se pueden usar vectores virales que proveen la expresión transitoria de las moléculas de ANci.

Optimización de la actividad de la molécula de ácido nucleico de la invención Las moléculas de ácido nucleico sintetizadas químicamente con modificaciones (base, azúcar o fosfato) pueden impedir su degradación por las ribonucleasas del suero, lo que puede aumentar su potencia (véase por ejemplo Eckstein et al., publicación internacional No. WO 92/07065; Perrault et al., 1990 Nature 344, 565; Pieken et al., 1991 , Science 253, 314; Usman y Cedergren, 1992, Trends in Biochem. Sci. 17, 334; Usman et al., publicación internacional No. WO 93/15187; y Rossi et al., publicación internacional No. WO 91/03162; Sproat, patente de EE. UU. No. 5,334,711 ; Gold et al., patente de EE. UU. No. 6,300,074; y Burgin et al., supra todas las cuales se incorporan en la presente como referencia). Todas las referencias anteriores describen varias modificaciones químicas que se pueden hacer a las porciones de base, fosfato o azúcar de las moléculas de ácido nucleico que se describen en la presente. Son deseables las modificaciones que pueden aumentar la eficacia en las células, y la remoción de bases de las moléculas de ácido nucleico para acortar los tiempos de síntesis del oligonucleótido y reducir los requerimientos químicos.

Existen varios ejemplos en la técnica que describen modificaciones de azúcar, base y fosfato que se pueden introducir en las moléculas de ácido nucleico, que aumentan significativamente su estabilidad frente a la nucleasa y su eficiencia. Por ejemplo, los oligonucleótidos se modifican para aumentar su estabilidad o aumentar su actividad biológica por modificación con grupos resistentes a la nucleasa, por ejemplo modificaciones de base de nucleótidos 2'-amino, 2'-C-alilo, 2'-fluoro, 2'-0-metilo, 2'-0-alilo, 2'-H (para una revisión véase Usman y Cedergren, 1992, TIBS. 17, 34; Usman et al., 1994, Nucleic Acids Symp. Ser. 31 , 163; Burgin et al., 1996, Biochemistry, 35, 14090). La modificación de azúcar de las moléculas de ácido nucleico se ha descrito extensamente en la literatura (véase Eckstein et al., publicación internacional de PCT No. WO 92/07065; Perrault et al., Nature, 1990, 344, 565-568; Pieken ef al., Science, 1991 , 253, 314-317; Usman y Cedergren, Trends in Biochem. Sci., 1992, 17, 334-339; Usman ef al., publicación internacional de PCT No. WO 93/15187; Sproat, patente de EE. UU. No. 5,334,71 1 , y Beigelman et al., 1995, J. Biol. Chem., 270, 25702; Beigelman et al., publicación internacional de PCT No. WO 97/26270; Beigelman ef al., patente de EE. UU. No. 5,716,824; Usman et al., patente de EE. UU. No. 5,627,053; Woolf et al., publicación internacional de PCT No. WO 98/13526; Thompson ef al., USSN 60/082,404, que se presentó el 20 de abril de 1998; Karpeisky ef al., 1998, Tetrahedron Lett, 39, 1 131 ; Earnshaw y Gait, 1998, Biopolymers (Nucleic Acid Sciences), 48, 39-55; Verma y Eckstein, 1998, Annu. Rev. Biochem., 67, 99-134; y Burlina et al., 1997, Bioorg. Med. Chem., 5, 1999-2010; todas estas referencias se incorporan aquí en su totalidad como referencia). Dichas publicaciones describen métodos y estrategias generales para determinar el sitio de incorporación de las modificaciones de azúcar, base o fosfato, etc. en las moléculas de ácido nucleico, sin modular la catálisis, y se incorporan aquí como referencia. En vista de dichas enseñanzas, se pueden usar modificaciones similares como se describe en la presente para modificar las moléculas de ácido nucleico de ANci de la presente invención, siempre que no resulte inhibida significativamente la capacidad del ANci para promover i-ARN en las células.

En una modalidad, una molécula de ácido nucleico de la invención se modifica químicamente como se describe en US 20050020521 , que se incorpora aquí en su totalidad como referencia.

Aunque la modificación química de los enlaces internucleotídicos del oligonucleótido con enlaces de fosforotioato, fosforad itioato o 5'-metilfosfonato mejora la estabilidad, las modificaciones excesivas pueden ocasionar cierta toxicidad o disminuir la actividad. Por lo tanto, cuando se diseñan las moléculas de ácido nucleico, la cantidad de estos enlaces internucleotídicos se debe minimizar. La reducción en la concentración de estos enlaces disminuiría la toxicidad, aumentando la eficacia y dando mayor especificidad de estas moléculas.

Se proveen moléculas de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) que tienen modificaciones químicas que mantienen o aumentan la actividad. Dicho ácido nucleico por lo general también es más resistente a las nucleasas que un ácido nucleico no modificado. Por consiguiente, la actividad in vitro o in vivo no debe disminuir significativamente. En los casos en que la meta es la modulación, las moléculas de ácido nucleico terapéutico suministradas exógenamente deben ser óptimamente estables dentro de las células hasta que la traducción del ARN objetivo haya sido modulada el tiempo suficiente para reducir la cantidad de proteína indeseable. Este periodo varía entre horas a días dependiendo del estado patológico. Los mejoramientos en la síntesis química de ARN y ADN (Wincott et al, 1995, Nucleic Acids Res. 23, 2677; Caruthers et al., 1992, Methods in Enzymology 211 , 3-19 (que se incorporan aquí como referencia)), han expandido la capacidad para modificar las moléculas de ácido nucleico introduciendo modificaciones de nucleótido para aumentar su estabilidad a la nucleasa, como se describe arriba.

En una modalidad, las moléculas de ácido nucleico de la invención incluyen uno o mas nucleótidos de abrazadera G (por ejemplo aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más). Un nucleótido de abrazadera G es un análogo de citosina modificado en donde las modificaciones confieren la capacidad de formación de enlaces de hidrógeno de las caras de Watson-Crick y Hoogsteen de una guanina complementaria dentro de un dúplex; véase por ejemplo Lin y Matteucci, 1998, J. Am. Chem. Soc, 120, 8531-8532. Una sustitución análoga de una sola abrazadera G dentro de un oligonucleótido puede aumentar sustancialmente la estabilidad térmica helicoidal y la discriminación de discordancia cuando se híbrida con oligonucleótidos complementarios. La inclusión de dichos nucleótidos en las moléculas de ácido nucleico de la invención da como resultado mayor afinidad y especificidad para objetivos de ácido nucleico, secuencias complementarias o cadenas de molde. En otra modalidad, las moléculas de ácido nucleico de la invención incluyen uno o mas nucleótidos (por ejemplo aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más) de "ácido nucleico cerrado", LNA, tal como un 2',4'-C-metilen-biciclo-nucleótido (véase por ejemplo Wengel et al., publicación internacional de PCT No. WO 00/66604 y WO 99/14226).

En otra modalidad, la invención presenta conjugados o complejos de moléculas de ANci de la invención. Dichos conjugados o complejos se pueden usar para facilitar el suministro de las moléculas de ANci a un sistema biológico, tal como una célula. Los conjugados y complejos provistos por la presente invención pueden impartir actividad terapéutica transfiriendo los compuestos terapéuticos a través de las membranas celulares, alterando la farmacocinética o modulando la localización de las moléculas de ácido nucleico de la invención. La presente invención abarca el diseño y síntesis de conjugados y complejos novedosos para el suministro de moléculas, que incluyen sin limitación, moléculas pequeñas, lípidos, colesterol, fosfolípidos, nucleósidos, nucleótidos, ácidos nucleicos, anticuerpos, toxinas, polímeros cargados negativamente y otros polímeros, por ejemplo proteínas, péptidos, hormonas, carbohidratos, polietilenglicoles, o políaminas, a través de las membranas celulares. En general, los transportadores descritos están diseñados para ser usados individualmente o como parte de un sistema multicomponente, con o sin enlazadores degradables. Se espera que estos compuestos mejoren el suministro o localización de las moléculas de ácido nucleico de la invención en varios tipos de célula originados de diferentes tejidos, en presencia o ausencia de suero (véase Sullenger y Cech, patente de EE. UU. No. 5,854,038). Los conjugados de las moléculas aquí descritas se pueden unir a moléculas biológicamente activas por medio de enlazadores que son biodegradables, tales como moléculas enlazadoras de ácido nucleico biodegradables.

El término "enlazador biodegradable" como se usa aquí, se refiere a una molécula enlazadora de ácido nucleico, o que no es ácido nucleico, que está diseñada como un enlazador biodegradable para unir una molécula con otra, por ejemplo una molécula biológicamente activa con una molécula de ANci de la invención, o las cadenas de sentido y antisentido de una molécula de ANci de la invención. El enlazador biodegradable se diseña de tal manera que se pueda modular su estabilidad para un propósito particular, tal como el suministro a un tipo de tejido o célula particular. La estabilidad de una molécula enlazadora biodegradable basada en ácido nucleico se puede modular usando varias químicas, por ejemplo combinaciones de ribonucleótidos, desoxirribonucleótidos, y nucleótidos químicamente modificados, tales como nucleótidos de 2'-0-metilo, 2'-fluoro, 2'-amino, 2'-0-amino, 2'-C-alilo, 2'-0-alilo, y otros nucleótidos 2'-modificados o de base modificada. La molécula enlazadora de ácido nucleico biodegradable puede ser un dimero, trímero, tetrámero, o molécula de ácido nucleico mas grande, por ejemplo un oligonucleótido de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 nucleótidos de longitud, o puede comprender un solo nucleótido con un enlace basado en fósforo, por ejemplo un enlace de fosforamidato o fosfodiéster. La molécula enlazadora de ácido nucleico biodegradable también puede comprender modificaciones de esqueleto de ácido nucleico, azúcar de ácido nucleico, o base de ácido nucleico.

El término "biodegradable", como se usa aquí, se refiere a la degradación en un sistema biológico, por ejemplo degradación enzimática o degradación química.

El término "molécula biológicamente activo", como se usa aquí, se refiere a compuestos o moléculas que son capaces de provocar o modificar una respuesta biológica en un sistema. Los ejemplos no limitativos de moléculas de ANci biológicamente activas, solas o en combinación con otras moléculas contempladas por la presente invención, incluyen moléculas terapéuticamente activas tales como anticuerpos, colesterol, hormonas, agentes antivirales, péptidos, proteínas, agentes quimioterapéuticos, moléculas pequeñas, vitaminas, cofactores, nucleósidos, nucleótidos, oligonucleótidos, ácidos nucleicos enzimáticos, ácidos nucleicos de antisentido, oligonucleótidos formadores de triplex, quimeras 2,5-A, ANci, ARNdc, alozimas, aptámeros, señuelos y análogos de los mismos. Las moléculas biológicamente activas de la invención también incluyen moléculas capaces de modular la farmacocinética o farmacodinamia de otras moléculas biológicamente activas, por ejemplo, lípidos y polímeros tales como poliaminas, poliamidas, polietilenglicol y otros poliéteres.

El término "fosfolípido", como se usa aquí, se refiere a una molécula hidrofóbica que comprende por lo menos un grupo de fósforo. Por ejemplo, un fosfolípido puede comprender un grupo que contiene fósforo y un grupo alquilo saturado o insaturado, sustituido opcionalmente con OH, COOH, oxo, amino, o grupos arilo sustituidos o no sustituidos.

Preferiblemente las moléculas de ácido nucleico terapéuticas (por ejemplo las moléculas de ANci), suministradas de forma exógena, deben ser estables dentro de las células hasta que la transcripción inversa del ARN haya sido modulada el tiempo suficiente para reducir la cantidad del transcrito de ARN. Las moléculas de ácido nucleico son resistentes a las nucieasas para funcionar como agentes terapéuticos intracelulares efectivos. Las mejoras en la síntesis química de las moléculas de ácido nucleico descritas en la presente invención y en la literatura, han expandido la capacidad para modificar las moléculas de ácido nucleico introduciendo modificaciones de nucleótido para aumentar su estabilidad a la nucleasa como se describe arriba.

En otra modalidad, se proveen moléculas de ANci que tienen modificaciones químicas que mantienen o aumentan la actividad enzimática de proteínas implicadas en i-ARN. Tales ácidos nucleicos por lo general también son más resistentes a las nucieasas que los ácidos nucleicos no modificados. De esta manera, la actividad in vitro o in vivo no se reduciría significativamente.

El uso de las moléculas basadas en ácido nucleico de la invención conducirá a mejores tratamientos, produciendo la posibilidad de terapias de combinación (por ejemplo múltiples moléculas de ANci dirigidas a diferentes genes; moléculas de ácido nucleico acopladas con moduladores de molécula pequeña conocidos; o tratamiento intermitente con combinaciones de moléculas, que incluyen diferentes motivos u otras moléculas químicas o biológicas). El tratamiento de sujetos con moléculas de ANci también puede incluir combinaciones de diferentes tipos de moléculas de ácido nucleico, tales como moléculas de ácido nucleico enzimático (ribozimas), alozimas, de antisentido, 2,5-A, oligoadenilato, señuelos y aptámeros.

En otro aspecto, una molécula de ANci de la invención comprende una o mas estructuras de casquete 5' o 3', por ejemplo únicamente sobre la cadena de sentido del ANci, la cadena de antisentido del ANci, o las dos cadenas del ANci.

Por "estructura de casquete" se entiende modificaciones químicas que han sido incorporadas en cualquier extremo del oligonucleótido (véase por ejemplo Adamic et al., patente de EE. UU. No. 5,998,203, que se incorpora en la presente como referencia). Estas modificaciones terminales protegen a la molécula de ácido nucleico de degradación por exonucleasa, y pueden ayudar al suministro o localización dentro de una célula. El casquete puede estar presente en el extremo 5' (casquete 5') o en el extremo 3' (casquete 3'), o puede estar presente en los dos extremos. En ejemplos no limitativos, el casquete 5' incluye, sin limitación, glicerilo, residuo (porción) desoxi abásico invertido; 4',5'-metilen-nucleótido; l-(beta-D-eritrofuranosil)-nucleótido, 4'-tio-nucleótido; nucleótido carbocíclico 1 ,5-anhidrohexitol-nucleótido; L-nucleótidos; alfa-nucleótidos; nucleótido de base modificada; enlace de fosforoditioato; treo-pentofuranosil-nucleótido; nucleótido acíclico 3',4'-seco; nucleótido acíclico de 3, 4-dihidroxi-butilo; nucleótido acíclico de 3,5-dihidroxipentilo, porción de nucleótido 3'-3'-invertida¡ porción abásica 3'-3'-invertida; porción de nucleótido 3'-2'-invertido; porción abásica 3'-2'-invertida; 1 ,4-butanodiol fosfato; 3'-fosforamidato; hexilfosfato; aminohexilfosfato; 3'-fosfato; 3'-fosforotioato; fosforoditioato; o porción de metilfosfonato de puente o sin puente. Los ejemplos no limitativos de las porciones de casquete se muestran en la figura 10.

Los ejemplos no limitativos del casquete 3' incluyen, sin limitación, glicerilo, residuo (porción) desoxi abásico invertido, 4',5'-metilen-nucleótido; 1-(beta-D-eritrofuranosil)-nucleótido; 4'-tio-nucleótido, nucleótido carbocíclico; 5'-amino-alquil-fosfato; 1 ,3-diamino-2-propil-fosfato; 3-aminopropil-fosfato; 6-aminohexil-fosfato; 1 ,2-aminododecil-fosfato; hidroxipropil-fosfato; 1 ,5-anhidrohexitol-nucleótido; L-nucleótido; alfa-nucleótido; nucleótido de base modificada; fosforoditioato; treo-pentofuranosil-nucleótido; nucleótido acíclico 3',4'-seco; 3,4-dihidroxibutil-nucleótido; 3,5-dihidroxipentil-nucleótido, porción de nucleótido 5'-5'-invertido; porción abásica 5'-5'-invertida; 5'-fosforamidato; 5'-fosforotioato; 1 ,4-butanodiolfosfato; 5'-amino; 5'-fosforamidato de puente y sin puente, fosforotioato o fosforoditioato, metilfosfonato de puente y sin puente, y porciones 5'-mercapto (para más detalles véase Beaucage e lyer, 1993, Tetrahedron 49, 1925; que se incorpora aquí como referencia).

Por el término "no nucleótido" o "no nucleotídico" se entiende cualquier grupo o compuesto que se puede incorporar en una cadena de ácido nucleico en lugar de una o más unidades de nucleótido, que incluye sustituciones de azúcar o fosfato, y permite que las bases restantes muestren su actividad enzimática. El grupo o compuesto es abásico pues no contiene una base de nucleótido reconocida comúnmente, tal como adenosina, guanina, citosina, uracilo o timina, y por lo tanto carece de una base en la posición 1 '.

Un grupo "alquilo" se refiere a un hidrocarburo alifático saturado, que incluye grupos alquilo de cadena recta, ramificada y cíclicos. Preferiblemente, el grupo alquilo tiene de 1 a 12 carbonos. Muy preferiblemente es un alquilo inferior de 1 a 7 carbonos, de preferencia de 1 a 4 carbonos. El grupo alquilo puede estar sustituido o no sustituido. Cuando está sustituido, el grupo sustituyente es de preferencia hidroxilo, ciano, alcoxi, =0, =S, N02 o N(CH3)2, amino, o SH. El término también incluye grupos alquenilo que son grupos hidrocarburos insaturados que contienen por lo menos un doble enlace carbono-carbono, que incluyen grupos de cadena recta, ramificada y cíclicos. Preferiblemente, el grupo alquenilo tiene de 1 a 12 carbonos. De preferencia, es un alquenilo inferior de 1 a 7 carbonos, de preferencia de 1 a 4 carbonos. El grupo alquenilo puede estar sustituido o no sustituido. Cuando está sustituido, el grupo sustituyente es preferiblemente hidroxilo, ciano, alcoxi, =0, =S, N02, halógeno, N(CH3)2, amino o SH. El término "alquilo" también incluye grupos alquinilo que tienen un grupo hidrocarburo insaturado que contiene por lo menos un triple enlace carbono-carbono, que incluye grupos de cadena recta, ramificada y cíclica. Preferiblemente, el grupo alquinilo tiene de 1 a 12 carbonos. De preferencia es un alquinilo inferior de 1 a 7 carbonos, de preferencia de 1 a 4 carbonos. El grupo alquinilo puede estar sustituido o no sustituido. Cuando está sustituido, los grupos sustituyentes son preferiblemente hidroxilo, ciano, alcoxi, =0, =S, N02 o N(CH3)2, amino o SH.

Dichos grupos alquilo también pueden incluir grupos arilo, alquilarilo, arilo carbocíclico, arilo heterocíclico, amida y éster. Un grupo "arilo" se refiere a un grupo aromático que tiene por lo menos un anillo que tiene un sistema de electrones pi conjugado e incluye grupos de arilo carbocíclico, arilo heterocíclico y biarilo, todos los cuales pueden estar sustituidos opcionalmente. Los sustituyentes preferidos de los grupos arilo son los grupos halógeno, trihalometilo, hidroxilo, SH, OH, ciano, alcoxi, alquilo, alquenilo, alquinilo y amino. Un grupo "alquilarilo" se refiere a un grupo alquilo (como se describe arriba) unido covalentemente a un grupo arilo (como se describe arriba). Los grupos arilo carbocíclicos son grupos en los que todos los átomos del anillo aromático son átomos de carbono. Los átomos de carbono están sustituidos opcionalmente. Los grupos arilo heterocíclicos son grupos que tienen de 1 a 3 heteroátomos como átomos de anillo en el anillo aromático, y el resto de los átomos de anillo son átomos de carbono. Los heteroátomos adecuados incluyen oxígeno, azufre y nitrógeno, e incluyen furanilo, tienilo, piridilo, pirrolilo, N-alquilo inferior, pirrólo, pirimidilo, pirazinilo, imidazolilo, etcétera, todos sustituidos opcionalmente. Una "amida" se refiere a un -C(O)-NH-R, en donde R es alquilo, arilo, alquilarilo o hidrógeno. Un "éster" se refiere a un -C(O)-OR\ en donde R es alquilo, arilo, alquilarilo o hidrógeno.

Por "nucleótido", como se usa aquí, es como se reconoce en la técnica e incluye bases naturales (estándares) y bases modificadas muy conocidas. Tales bases generalmente se localizan en la posición 1 ' de una porción de azúcar de nucleótido. Por lo general, los nucleótidos comprenden una base, un azúcar y un grupo fosfato. Los nucleótidos pueden ser no modificados o modificados en la porción de azúcar, fosfato o base (también denominados intercambiablemente análogos de nucleótido, nucleótidos modificados, nucleótidos no naturales, nucleótidos no estándares y otros; véase por ejemplo Usman y McSwiggen, supra; Eckstein et al., publicación internacional de PCT No. WO 92/07065; Usman et al., publicación internacional de PCT No. WO 93/15187; Uhlman y Peyman, supra, todas las cuales se incorporan aquí como referencia). Existen varios ejemplos de bases de ácido nucleico modificadas conocidas, como lo resumen Limbach er al., 1994, Nucleic Acids Res. 22, 2183. Algunos de los ejemplos no limitativos de modificaciones de base que se pueden introducir en las moléculas de ácido nucleico incluyen inosina, purina, piridin-4-ona, piridin-2-ona, fenilo, pseudouracilo, 2, 4, 6-trimetoxibenceno, 3-metiluracilo, dihidrouridina, naftilo, aminofenilo, 5-alquilcitidinas (por ejemplo, 5-metilcitidina), 5-alquiluridinas (por ejemplo, ribotimidina), 5-halouridina (por ejemplo, 5-bromouridina) o 6-azapirimidinas o 6-alquilpirimidinas (por ejemplo 6-metiluridina), propino, y otras (Burgin et al., 1996, Biochemistry, 35, 14090; Uhlman y Peyman, supra). En este aspecto, por "bases modificadas" se entiende bases de nucleótido diferentes de adenina, guanina, citosina y uracilo en la posición 1 ' o sus equivalentes.

En una modalidad, la invención presenta moléculas de ANci modificadas, con modificaciones de esqueleto de fosfato que comprenden una o mas sustituciones de fosforotioato, fosforoditioato, metilfosfonato, fosfotriéster, morfolino, amidato, carbamato, carboximetilo, acetamidato, poliamida, sulfonato, sulfonamida, sulfamato, formacetal, tioformacetal, o alquilsililo; para consultar las modificaciones de esqueleto de oligonucleótidos véase Hunziker y Leumann, 1995, "Nucleic Acid Analogues: Synthesis and Properties", en Modern Synthetic Methods, VCH, 331 -417, y Mesmaeker et al., 1994, "Novel Backbone Replacements for Oligonucleotides" en Carbohydrate Modifications in Antisense Research, ACS, 24-39.

Por "abásico" se entiende porciones de azúcar que carecen de una nucleobase o que tienen un átomo de hidrógeno (H) u otros grupos químicos que no son nucleobase, en lugar de una nucleobase en la posición 1 ' de la porción de azúcar, véase por ejemplo Adamic et al., patente de EE. UU. No. 5,998,203. En una modalidad, una porción abásica de la invención es un azúcar de ribosa, desoxirribosa o didesoxirribosa.

Por "nucleósido no modificado" se entiende una de las bases adenina, citosina, guanina, timina, o uracilo, unidas al carbono 1 ' de ß-D-ribo-furanosa.

Por "nucleósido modificado" se entiende cualquier base de nucleótido que contiene una modificación en la estructura química de una base de nucleótido, azúcar o fosfato no modificado. Los ejemplos no limitativos de nucleótidos modificados se muestran con las formulas l-VII u otras modificaciones descritas en la presente.

Con respecto a los nucleótidos 2'-modificados como se describe para la presente invención, por "amino" se entiende 2'-NH2 o 2'-0-NH2, que puede ser modificado o no modificado. Dichos grupos modificados se describen por ejemplo en Eckstein et al., patente de EE. UU. No. 5,672,695, y Matulic-Adamic et al., patente de EE. UU. No. 6,248,878, que se incorporan como referencia en su totalidad.

Se pueden hacer varias modificaciones a la estructura de ácido nucleico del ANci para aumentar la utilidad de estas moléculas. Tales modificaciones aumentarán la vida útil de anaquel, la vida media in vitro, la estabilidad, y la facilidad de introducción de dichos oligonucleótidos en el sitio objetivo, por ejemplo para aumentar la penetración de las membranas celulares, y conferir la capacidad para reconocer y unirse a las células objetivo.

Administración de las moléculas de ácido nucleico Una molécula de ANci de la invención se puede adaptar para usarse en el tratamiento, prevención, inhibición o reducción de enfermedades, rasgos, condiciones y fenotipos respiratorios, inflamatorios y autoinmunes, u otros rasgos, enfermedades, condiciones o fenotipos que están relacionados o que responden a los niveles de objetivos de ENaC u objetivos de la ruta de ENaC en una célula o tejido, sola o en combinación con otras terapias. En una modalidad, las moléculas de ANci de la invención y las formulaciones o composiciones de las mismas se administran al pulmón como se describe en la presente y como sabe generalmente en la técnica. En una modalidad las moléculas de ANci de la invención y las formulaciones o composiciones de las mismas se administran a una célula, sujeto u organismo como se describe en la presente y como sabe generalmente en la técnica.

En una modalidad, para su administración a un sujeto, una composición de ANci de la invención puede comprender un vehículo de suministro que incluye liposomas, vehículos y diluentes, y sus sales, o se puede presentar en formulaciones farmacéuticamente aceptables. Se describen métodos para el suministro de las moléculas de ácido nucleico en Akhtar et al., 1992, Trends Cell Bio., 2, 139; "Delivery Strategies for Antisense Oligonucleitide Therapeutics", ed. Akhtar, 1995, Maurer et al., 1999, Mol. Membr. Biol., 16, 129-140; Hofl y Huang, 1999, Handb. Exp. Pharmacol., 137, 165-192; y Lee et al., 2000, ACS Symp. Ser., 752, 184-192, todas las cuales se incorporan aquí como referencia. Beigelman et al., patente de EE. UU. No. 6,395,7 3 y Sullivan eí al., PCT WO 94/02595, describen además los métodos generales para suministrar moléculas de ácido nucleico. Estos protocolos se pueden utilizar para el suministro de virtualmente cualquier molécula de ácido nucleico. Las moléculas de ácido nucleico se pueden administrar a las células mediante una variedad de métodos conocidos para el experto en la materia, que incluyen sin limitación encapsulación en liposomas, por iontoforesis, o por incorporación en otros vehículos tales como polímeros biodegradables, hidrogeles, coclodextrinas (véase por ejemplo González et al., 1999, Bioconjugate Chem., 10, 1068-1074; Wang et al., publicaciones internacionales de PCT Nos. WO 03/47518 y WO 03/46185), como ácido poli-(láctico-co-glicólico) (PLGA) y microesferas de PLCA (véase por ejemplo la patente de EE. UU. 6,447,796, y la publicación de la solicitud de patente de EE.UU. No. US 2002130430), nanocápsulas biodegradables y microesferas bioadhesivas, o mediante vectores proteináceos (O'Hare y Normand, publicación internacional de PCT No. WO 00/53722). En otra modalidad, las moléculas de ácido nucleico de la invención también se pueden formular o hacer en complejo con polietilenimina y sus derivados, tales como derivados de polietilenimina-polietilenglicol-N-acetilgalactosamina (PEI-PEG-GAL) o polietilenimina-polietilenglicol-tri-N-acetilgalactosamina (PEI-PEG-triGAL). En una modalidad, las moléculas de ácido nucleico de la invención se formulan como se describe en la publicación de la solicitud de patente de EE.UU. No. 20030077829, que se incorpora aquí como referencia en su totalidad.

En una modalidad, una molécula de ANci de la invención se formula como una composición descrita en la solicitud de patente provisional de EE. UU. No. 60/678,531 , y en la solicitud de patente provisional de EE.UU. relacionada No. 60/703,946, presentada el 29 de julio de 2005, la solicitud de patente provisional de EE.UU. No. 60/737,024, presentada el 15 de noviembre de 2005, USSN 1 1/353,630, presentada el 14 de febrero de 2006, y USSN 1 1/586,102, presentada el 24 de octubre de 2006 (Vargeese er al.), todas las cuales se incorporan aquí como referencia en su totalidad. Dichas formulaciones de ANci se refieren en general como "partículas de ácido nucleico de lípido" (LNP). En una modalidad, una molécula de ANci de la invención se formula con una o mas composiciones de LNP que se describen en la presente en el cuadro 10 (véase también USSN 1 1/353,630 supra).

En una modalidad, las moléculas de ANci de la invención y las formulaciones o composiciones de las mismas se administran a tejidos y células del pulmón como se describe en US 2006/0062758; US 2006/0014289; y US 2004/0077540.

En una modalidad, una molécula de ANci de la invención se forma en complejo con agentes de ruptura de membrana como los que se describen en la publicación de la solicitud de patente de EE. UU. No. 20010007666, que se incorpora aquí como referencia en su totalidad, incluyendo los dibujos. En otra modalidad, el agente o agentes de ruptura de membrana y la molécula de ANci también se unen en complejo con un lípido catiónico o molécula de lípido ayudadora, como los lípidos que se describen en la patente de EE. UU. No. 6,235,310, que se incorpora aquí en su totalidad como referencia, incluyendo los dibujos.

En una modalidad, una molécula de ANci de la invención se forma en complejo con sistemas de suministro como se describe en la publicación de la solicitud de patente de EE. UU. No. 2003077829, y las publicaciones internacionales de PCT Nos. WO 00/03683 y WO 02/087541 , todas incorporadas aquí como referencia en su totalidad, incluyendo los dibujos.

En una modalidad, una molécula de ANci de la invención se forma en complejo con sistemas de suministro como los que se describen generalmente en las publicaciones de las solicitudes de patente de EE. UU. Nos. US-20050287551 ; US-20050164220; US-20050191627; US-20050118594; US-20050153919; US-20050085486; y US-20030158133; todas incorporadas aquí como referencia en su totalidad, incluyendo los dibujos.

En una modalidad, las moléculas de ácido nucleico de la invención se administran a tejidos esqueléticos (por ejemplo hueso, cartílago, tendón, ligamento), o a tumores metastásicos de hueso por medio de formación de complejo o conjugación con atelocolágeno (véase por ejemplo Takeshita et al., 2005, PNAS, 102, 12177-12182). Por lo tanto, en una modalidad, la presente invención presenta una o más moléculas de ANdc como una composición en complejo con atelocolágeno. En otra modalidad, la presente invención presenta una o mas moléculas de ANci conjugadas con atelocolágeno por medio de un enlazador como se describe aquí o se conoce de otra manera en la técnica.

En una modalidad, las moléculas de ácido nucleico de la invención y las formulaciones de las mismas (por ejemplo formulaciones de LNP de las moléculas de ácido nucleico de doble cadena de la invención), se administran mediante suministro pulmonar, por ejemplo por inhalación de una formulación de aerosol o secada por aspersión, administrada mediante un dispositivo de inhalación o nebulizador, que suministra una rápida incorporación local de las moléculas de ácido nucleico en los tejidos pulmonares relevantes. Se pueden preparar composiciones sólidas en partículas que contienen partículas secas respirables de composiciones de ácido nucleico micronizadas, moliendo las composiciones de ácido nucleico seco o liofilizado y después pasando la composición micronizada, por ejemplo, a través de un tamiz de malla 400, para romper o separar los aglomerados grandes. Opcionalmente, una composición sólida en partículas que comprende las composiciones de ácido nucleico de la invención puede contener un dispersante que facilita la formación de un aerosol, y también otros compuestos terapéuticos. Un dispersante adecuado es la lactosa, que se puede mezclar con el compuesto de ácido nucleico en cualquier proporción adecuada, tal como una proporción de 1 a 1 en peso.

Los aerosoles de partículas líquidas o no líquidas que comprenden una composición de ácido nucleico de la invención (por ejemplo ANci o formulaciones de LNP del mismo), se pueden producir mediante cualquier medio adecuado, por ejemplo con un dispositivo que comprende un nebulizador (véase por ejemplo US 4,501,729, que se incorpora aquí como referencia). En una modalidad, se usan dispositivos nebulizadores de la invención en aplicaciones para sujetos concientes que respiran espontáneamente, y para sujetos con ventilación controlada de todas las edades. Los dispositivos nebulizadores de la invención se pueden usar para el suministro dirigido tópico y sistémico del fármaco al pulmón. En una modalidad se usa un dispositivo que comprende un nebulizador para suministrar una composición de la invención (por ejemplo, ANci o formulaciones de LNP del mismo), localmente al pulmón o los tejidos pulmonares. En una modalidad se usa un dispositivo que comprende un nebulizador para suministrar sistémicamente una composición de la invención (por ejemplo ANci o formulaciones de LNP del mismo). Los ejemplos no limitativos de enfermedades y condiciones que pueden ser tratadas o manejadas usando un dispositivo que comprende un nebulizador de la invención, incluyen asma, bronquitis, COPD, fibrosis quística, enfisema, virus sincitial respiratorio, virus de la influenza, y otras enfermedades e infecciones pulmonares o del aparato respiratorio. Los dispositivos nebulizadores de la invención se pueden usar para suministrar varias clases de fármacos y combinaciones de los mismos que incluyen, por ejemplo y sin limitación, la composición de ANci o las formulaciones de LNP del mismo, antihistamínicos, agentes antiinfecciosos, agentes antivirales, agentes antibacterianos, modificadores de la sangre, agentes cardiovasculares, descongestionantes, agentes de diagnóstico, inmunosupresores, estabilizadores de mastocitos, antiinflamatorios, agentes respiratorios, agentes para la piel y la membrana mucosa, y otras clases. En una modalidad, un dispositivo nebulizador de la invención se usa para el suministro eficaz de proteínas, péptidos, oligonucleótidos, plásmidos y moléculas pequeñas (es decir, interleucinas, DNasa, ARN de antisentido, polipéptidos de estreptococos B e integrasas de VIH). En otra modalidad, los dispositivos nebulizadores de la invención se usan para suministrar dispersiones respiratorias que comprenden emulsiones, microemulsiones o suspensiones de submicras y nanopartículas de por lo menos un agente activo; véase por ejemplo la patente de EE. UU. No. 7128,897 y 7,090,830 B2, ambas incorporadas en la presente como referencia.

El suministro de aerosoles líquidos o no líquidos que comprenden la composición de la invención (por ejemplo, ANci o formulaciones de LNP del mismo) se puede realizar usando cualquier dispositivo adecuado, tal como un nebulizador ultrasónico o de chorro de aire. En una modalidad, el dispositivo que comprende un nebulizador se basa en señales de oscilación para impulsar un oscilador piezoeléctrico de cerámica para producir ondas ultrasónicas de alta energía que agitan mecánicamente una composición de la invención (por ejemplo, ANci o formulaciones de LNP del mismo), generando una nube de aerosol de medicamento (véanse por ejemplo las patentes de EE. UU. Nos. 7,129, 619 B2 y 7,131 ,439 B2, que se incorporan aquí como referencia). En otra modalidad, el dispositivo que comprende un nebulizador se basa en el mezclado de chorro de aire comprimido con una composición de la invención (por ejemplo, ANci o formulaciones de LNP del mismo), para formar gotitas en una nube de aerosol.

Los dispositivos nebulizadores se pueden usar para administrar aerosoles que comprenden una composición de la invención (por ejemplo ANci o formulaciones de LNP del mismo), de forma continua o periódica, y se pueden regular manualmente, automáticamente, o en coordinación con la respiración del paciente (véase la patente de EE. UU. No. 3,812,854, WO 92/11050). En una modalidad, un dispositivo que comprende un nebulizador puede administrar periódicamente una composición de la invención (por ejemplo, ANci o formulaciones de LNP del mismo), por medio de una cámara de extrusión de microcanal o un solo bolo de presurización cíclica. En otra modalidad se pueden usar dispositivos que comprenden un nebulizador para administrar continuamente aerosoles en suspensión que comprenden la composición de la invención (por ejemplo, ANci o formulaciones de LNP del mismo).

Los dispositivos nebulizadores de la invención pueden usar vehículos, normalmente agua o soluciones acuosas o no acuosas diluidas que comprenden las composiciones de la invención (por ejemplo, ANci o formulaciones de LNP del mismo). En una modalidad, un dispositivo que comprende un nebulizador utiliza una solución alcohólica, preferiblemente hecha isotónica con los fluidos corporales agregando, por ejemplo, cloruro de sodio u otras sales adecuadas que comprenden la composición de la invención (por ejemplo, ANci o formulaciones de LNP del mismo). En otra modalidad, los dispositivos nebulizadores de la invención utilizan vehículos no acuosos fluoroquímicos que comprenden la composición de la invención (por ejemplo, ANci o formulaciones de LNP del mismo). Un dispositivo que comprende un nebulizador puede suministrar la composición de la invención en cantidades de aproximadamente 0.001% a 90% p/p de formulación de vehículo. En una modalidad, un dispositivo que comprende un nebulizador utiliza formulaciones adecuadas que comprenden la composición de la invención (por ejemplo, ANci o formulaciones de LNP del mismo), en un vehículo líquido en una cantidad de hasta 40% p/p, de preferencia menos de 20% p/p de la formulación. En otra modalidad, un dispositivo que comprende un nebulizador utiliza suspensiones estabilizadas de partículas no líquidas, partículas de submicras o nanopartículas, que comprenden una cantidad tan baja como 0.001 % hasta 90% p/p de la composición de la invención (por ejemplo, ANci o formulaciones de LNP del mismo), con respecto al peso de la partícula no líquida, partícula de submicras o nanopartícula (patente de EE. UU. No.6,946,1 17 B1).

Las formulaciones de aerosol pueden incluir aditivos opcionales que incluyen conservadores si la formulación no se prepara de forma estéril. Los ejemplos no limitativos incluyen hidroxibenzoato de metilo, antioxidantes, saborizantes, aceites volátiles, agentes amortiguadores y emulsionantes y otros agentes tensoactivos de formulación. En una modalidad se usan vehículos de fluorocarburo o perfluorocarburo para reducir la degradación y proveer composiciones de suspensión de partículas no líquidas biocompatibles y más seguras de la invención (por ejemplo, ANci o formulaciones de LNP del mismo). En otra modalidad, un dispositivo que comprende un nebulizador suministra una composición de la invención (por ejemplo, ANci o formulaciones de LNP del mismo) que comprende compuestos químicos fluorados que son bacteriostáticos, disminuyendo asi el potencial del crecimiento bacteriano en dispositivos compatibles.

Similarmente el aerosol de partículas sólidas que comprende la composición activa y un agente tensoactivo se puede producir con cualquier generador de aerosol de partículas sólidas. En una modalidad, los generadores de aerosol para administrar agentes sólidos en partículas a un sujeto producen partículas que son respirables, como se explica arriba, y generan un volumen de aerosol que contiene una dosis medida predeterminada de una composición. En otra modalidad, el aerosol comprende una combinación de partículas que comprenden por lo menos una composición de la invención (por ejemplo, ANci o formulaciones de LNP del mismo), con un volumen predeterminado de medio de suspensión o agente tensoactivo para proveer una mezcla respiratoria.

En una modalidad, un generador de aerosol de partículas sólidas de la invención es un insuflador. Las formulaciones adecuadas para administración por insuflación incluyen polvos finamente divididos que pueden ser suministrados por medio de un insuflador. En el insuflador, el polvo, por ejemplo una dosis medida del mismo, efectiva para realizar los tratamientos que aquí se describen, es contenido en cápsulas o cartuchos, hechos normalmente de gelatina o plástico, que se perforan o abren ¡n situ y el polvo es suministrado por extracción de aire a través del dispositivo por inhalación o por medio de una bomba operada manualmente. El polvo usado en el insuflador consiste únicamente del ingrediente activo o de una mezcla de polvos que comprende el ingrediente activo, un excipiente en polvo adecuado como lactosa, y un agente tensoactivo opcional. Normalmente el ingrediente activo comprende de 0.1 % a 100% p/p de la formulación. Un segundo tipo de generador de aerosol ilustrativo comprende un inhalador dosificador. Los inhaladores dosificadores son dispensadores de aerosol presurizados que contienen normalmente una formulación en suspensión o solución del ingrediente activo en un propulsor licuado. Durante el uso, estos dispositivos descargan la formulación a través de una válvula adaptada para suministrar un volumen medido y atomizar partículas finas que contienen el ingrediente activo. Los propulsores adecuados incluyen algunos compuestos de clorofluorocarburo, por ejemplo diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, y mezclas de los mismos. Adicionalmente, la formulación puede contener uno o mas codisolventes, por ejemplo etanol, emulsionantes y otros agentes tensoactivos de formulación, tales como ácido oleico o trioleato de sorbitán, antioxidantes y agentes saborizantes adecuados. Otros métodos de suministro pulmonar se describen por ejemplo en la solicitud de patente de EE. UU. No. 20040037780, y las patentes de EE. UU. Nos. 6,592,904; 6,582,728; 6,565,885, todas incorporadas aquí como referencia.

En una modalidad, las composiciones y formulaciones de ANci y LNP provistas en la presente para usarse en el suministro pulmonar comprenden también uno o más agentes tensoactivos. Los agentes tensoactivos o componentes tensoactivos adecuados para mejorar la incorporación de las composiciones de la invención, incluyen formas sintéticas y naturales, completas y truncadas, de proteína A tensoactiva, proteína B tensoactiva, proteína C tensoactiva, proteína D tensoactiva y proteína E tensoactiva, fosfatidilcolina di-saturada (diferente de dipalmitoilo), dipalmitoilfosfatidilcolina, fosfatidilcolina, fosfatidilglicerol, fosfatidilinositol, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina; ácido fosfatídico, ubiquinonas, lisofosfatidiletanolamina, lisofosfatidilcolina, palmitoil-lisofosfatidilcolina, deshidroepiandrosterona, dolicoles, ácido sulfatídico, glicerol-3-fosfato, dihidroxiacetona fosfato, glicerol, glicero-3-fosfocolina, dihidroxiacetona, palmitato, difosfato de citidina (CDP), diacilglicerol, CDP colina, colina, fosfato de colina; así como también cuerpos laminares naturales o artificiales que son los vehículos portadores naturales de los componentes tensoactivos, ácidos grasos omega 3, ácido poliénico, ácido polienoico, lecitina, ácido palmitínico, copolímeros de bloque no iónicos de óxidos de etileno o propileno, polioxipropileno, monomérico y polimérico, polioxietileno, monomérico y polimérico, poli(vinilamina) con cadenas laterales de dextrano o alcanoilo, Brij 35, Tritón X-100, y los tensoactivos sintéticos ALS, Exosurf, Survan y Atovaquone, entre otros. Estos agentes tensoactivos se pueden usar solos o como parte de un tensoactivo componente múltiple en una formulación, o como adiciones unidas covalentemente a los extremos 5' o 3' del componente de ácido nucleico de una composición farmacéutica de la presente.

La composición de la presente invención se puede administrar al sistema respiratorio como una formulación que incluye partículas de tamaño respirable, por ejemplo partículas de un tamaño suficientemente pequeño para pasar a través de la nariz, boca y laringe por inhalación y a través de los bronquios y alvéolos de los pulmones. En general, las partículas respirables varían en tamaño de aproximadamente 0.5 a 10 mieras. Las partículas de tamaño no respirable que se incluyen en el aerosol tienden a depositarse en la garganta y a ser tragadas, y por lo tanto se minimiza la cantidad de partículas no respirables en el aerosol. Para administración nasal se prefiere un tamaño de partícula en la escala de 10-500 um para asegurar la retención en la cavidad nasal.

En una modalidad, las moléculas de ANci de la invención y las formulaciones o composiciones de las mismas se administran al hígado como se conoce generalmente en la técnica (véase por ejemplo Wen et al., 2004, World J Gastroenterol., 10, 244-9; Murao et al., 2002, Pharm Res., 19, 1808-14; Liu et al., 2003, Gene Ther., 10, 180-7; Hong et al., 2003, J Pharm Pharmacol., 54, 51-8; Herrmann et al., 2004, Arch Virol., 149, 161 1-7; y Matsuno er a/., 2003, Gene Ther., 10, 1559-66).

En una modalidad, la invención presenta el uso de métodos para suministrar las moléculas de ácido nucleico de la presente invención a células hematopoyéticas, que incluyen monocitos y linfocitos. Estos métodos se describen en detalle en Hartmann er al., 1998, J. Pharmacol. Exp. Ther., 285(2), 920-928; Kronenwett et al., 1998, Blood, 91 (3), 852-862; Filion y Phillips, 1997, Biochim. Biophys. Acta., 329(2), 345-356; Ma y Wei, 1996, Leuk. Res., 20(1 1/12), 925-930; y Bongartz et al., 1994, Nucleic Acids Research, 22(22), 4681 -8. Dichos métodos, como se describió arriba, incluyen el uso de oligonucleótido libre, formulaciones de lípido catiónico, formulaciones de liposoma que incluyen liposomas sensibles al pH e inmunoliposomas, y bioconjugados que incluyen oligonucleótidos conjugados con péptidos fusogénicos, para la transfección de células hematopoyéticas con oligonucleótidos.

En una modalidad, las moléculas de ANci de la invención y las formulaciones o composiciones de las mismas se administran directamente o tópicamente (por ejemplo localmente) a la dermis o los folículos como se conoce generalmente (véase por ejemplo Brand, 2001 , Curr. Opin. Mol. Ther., 3, 244-8; Regnier et al., 1998, J. Drug Target, 5, 275-89; Kanikkannan, 2002, BioDrugs, 16, 339-47; Wraight et al., 2001 , Pharmacol. Ther., 90, 89-104; y Preat y Dujardin, 2001 , STP PharmaSciences, 1 , 57-68). En una modalidad, las moléculas de ANci de la invención y las formulaciones o composiciones de las mismas se administran directamente o tópicamente usando una formulación de gel hidroalcohólico que comprende un alcohol (por ejemplo etanol o isopropanol), agua e incluyendo opcionalmente agentes adicionales tales como miristato de isopropilo y carbomer 980.

En una modalidad, una molécula de ANci de la invención se administra por iontoforesis, por ejemplo a un órgano o compartimiento particular (por ejemplo, el ojo, parte posterior del ojo, el corazón, hígado, riñon, vejiga, próstata, tumor, SNC, etc.). Los ejemplos no limitativos del suministro iontoforético se describen por ejemplo en WO 03/043689 y WO 03/030989, que se incorporan aquí en su totalidad como referencia.

En una modalidad, los compuestos y las composición de ANci de la invención se administran por vía sistémica o local aproximadamente cada 1-50 semanas (por ejemplo aproximadamente cada 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, o 50 semanas), solos o en combinación con otros compuestos o terapias. En una modalidad, los compuestos y composiciones de ANci de la invención se administran sistémicamente (por ejemplo por vía intravenosa, subcutánea, intramuscular, infusión, bomba, implante, etc.), aproximadamente cada 1 -50 semanas (por ejemplo, aproximadamente cada 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, o 50 semanas), solos o en combinación con otros compuestos o terapias aquí descritas o conocidas en la técnica.

En una modalidad, los sistemas de suministro de la invención incluyen, por ejemplo, geles acuosos y no acuosos, cremas, emulsiones múltiples, microemulsiones, liposomas, ungüentos, soluciones acuosas y no acuosas, lociones, aerosoles, bases de hidrocarburo y polvos, y pueden contener excipientes tales como solubilizantes, incrementadores de penetración (por ejemplo ácidos grasos, ésteres de ácido graso, alcoholes grasos y aminoácidos) y polímeros hidrofílicos (por ejemplo policarbófilo y polivinilpirolidona). En una modalidad, el vehículo farmacéuticamente aceptable es un liposoma o ¡ncrementador transdérmico. Los ejemplos de liposomas que se pueden usar en esta invención incluyen los siguientes: (1) CelIFectin, 1 :1 .5 (M/M), formulación de liposoma del lípido catiónico ?,??,???,??? l-tetrametil- , NI , N U , N II l-tetrapalmitil-espermina y dioleoil-fosfatidiletanolamina (DOPE) (GIBCO BRL); (2) Cytofectin GSV, 2: 1 (M/M), formulación de liposoma de un lípido catiónico y DOPE (Glen Research); (3) DOTAP (N-[1-(2,3-dioleoiloxi)-N,N,N-tri-metil-amonio-etilsulfato) (Boehringer Manheim); y (4) Lipofectamine 3:1 (M/M), formulación de liposoma del lípido policatiónico DOPSA y el lípido neutro DOPE (GIBCO BRL).

En una modalidad, los sistemas de suministro de la invención incluyen parches, tabletas, supositorios, pésanos, geles y cremas, y pueden contener excipientes tales como solubilizantes e incrementadores (por ejemplo propilenglicol, sales biliares y aminoácidos), y otros vehículos (por ejemplo polietilenglicol, ésteres de ácido graso y sus derivados, y polímeros hidrofílicos tales como hidroxipropilmetilcelulosa y ácido hialurónico).

En una modalidad, las moléculas de ANci de la invención se formulan o forman en complejo con polietilenimina (por ejemplo PEI lineal o ramificada) o derivados de polietilenimina, que incluyen por ejemplo PEI injertados tales como galactosa PEI, colesterol PEI, anticuerpo modificado con PEI, y derivados de polietilenglicol PEI (PEG-PEI) (véase por ejemplo Ogris et al., 2001 , A APA PharmSci, 3, 1-1 1 ; Furgeson et al., 2003, Bioconjugate Chem., 14, 840-847; Kunath et al., 2002, Pharmaceutical Research, 19, 810-817; Choí et al., 2001 , Bul!. Korean Chem. Soc, 22, 46-52; Bettinger et al., 1999, Bioconjugate Chem., 10, 558-561 ; Peterson et al., 2002, Bioconjugate Chem,, 13, 845-854; Erbacher ef a/., 1999, Journal of Gene Medicine, preimpresión 1 , 1-18; Godbey et al., 1999, PNAS USA, 96, 5177-5181 ; Godbey er al., 1999, Journal of Controlled Reléase, 60, 149-160; Diebold et al., 1999, Journal of Biological Chemistry, 274, 19087-19094; Thomas y Klibanov, 2002, PNAS USA, 99, 14640-14645; y Sagara, US 6,586,524, que se incorporan aquí como referencia.

En una modalidad, una molécula de ANci de la invención comprende un bioconjugado, por ejemplo un conjugado de ácido nucleico como se describe en Vargeese et al., USSN 10/427, 160, presentada el 30 de abril de 2003; US 6,528,631 ; US 6,335,434; US 6, 235,886; US 6,153,737; US 5,214,136; US 5,138,045, todas incorporadas aquí como referencia.

De esta manera, la invención presenta una composición farmacéutica que comprende uno o más ácidos nucleicos de la invención en un vehículo aceptable, tal como un estabilizador, amortiguador, etcétera. Los polinucleótidos de la invención (por ejemplo ARN, ADN o proteína) se pueden administrar e introducir en un sujeto mediante cualquier medio estándar, con o sin estabilizadores, amortiguadores, etc., para formar una composición farmacéutica. Cuando se desea usar un mecanismo de suministro de liposoma se pueden seguir los protocolos estándares para la formación de liposomas. Las composiciones de la presente invención también se pueden formular y usar como cremas, geles, preparados para atomizar, aceites y otras composiciones adecuadas para administración tópica, dérmica o transdérmica, como se conoce en la técnica.

La presente invención también incluye formulaciones farmacéuticamente aceptables de los compuestos descritos. Estas formulaciones incluyen sales de los compuestos anteriores, por ejemplo sales de adición de ácido, por ejemplo sales de ácido clorhídrico, bromhídrico, acético y bencenosulfónico.

Una composición o formulación farmacológica se refiere a una composición o formulación en una forma adecuada para su administración a una célula o sujeto que incluye por ejemplo un humano, por ejemplo administración sistémica o local. Las formas adecuadas dependen en parte del uso o la vía de entrada, por ejemplo oral, transdérmica o por inyección. Tales formas no deben impedir que la composición o formulación alcance la célula objetivo (es decir, una célula en la cual se busca el suministro del ácido nucleico cargado negativamente). Por ejemplo, las composiciones farmacológicas que se inyectan en la corriente sanguínea deben ser solubles. Otros factores son conocidos e incluyen consideraciones tales como la toxicidad y las formas que impiden que la composición o formulación ejerza su efecto.

En una modalidad, las moléculas de ANci de la invención se administran a un sujeto mediante administración sistémica en una composición o formulación farmacéuticamente aceptable. Por "administración sistémica" se entiende la absorción o acumulación sistémica in vivo de los fármacos en la corriente sanguínea, seguido por su distribución en todo el cuerpo. Las vías de administración que producen absorción sistémica incluyen, sin limitación: intravenosa, subcutánea, en la vena porta, intraperitoneal, inhalación, oral, intrapulmonar e intramuscular. Cada una de estas vías de administración expone las moléculas de ANci de la invención a un tejido enfermo accesible (por ejemplo, el pulmón). Se ha mostrado que la velocidad de entrada de un fármaco a la circulación es una función del tamaño o peso molecular. El uso de un liposoma u otro vehículo de fármaco que comprende los compuestos de la presente invención, puede potencialmente llevar el fármaco a cierto tipo de tejidos, tales como los tejidos del sistema reticular endotelial (RES). También es de utilidad una formulación de liposoma que puede facilitar la asociación del fármaco con la superficie de las células, tales como linfocitos y macrófagos. Esta propuesta puede mejorar el suministro del fármaco a células objetivo aprovechando la especificidad del reconocimiento inmune de macrófago y linfocito de las células anormales.

Por "formulación farmacéuticamente aceptable" o "composición farmacéuticamente aceptable" se entiende una composición o formulación que permite la distribución eficiente de las moléculas de ácido nucleico de la presente invención en el sitio físico más adecuado para la actividad deseada. Los ejemplos no limitativos de agentes adecuados para formulación con las moléculas de ácido nucleico de la presente invención incluyen: inhibidores de P-glicoproteína (tales como Pluronic P85); polímeros biodegradable tales como microesferas de poli(DL-láctido-co-glicólido) para suministro de liberación sostenida (Emerich, DF et al., 1999, Cell Transplant, 8, 47-58); y nanopartículas cargadas como las hechas de polibutilcianoacrilato. Otros ejemplos no limitativos de estrategias de suministro para las moléculas de ácido nucleico de la presente invención, incluyen el material descrito por Boado et ai, 1998, J. Pharm. Sci., 87, 1308-1315; Tyler et al., 1999, FEBS Lett., 421 , 280-284; Pardridge et al., 1995, PNAS USA., 92, 5592-5596; Boado, 1995, Adv. Drug Delivery Rev., 15, 73-107; Aldrian-Herrada et ai, 1998, Nucleic Acids Res., 26, 4910-4916; y Tyler eí al., 1999, PNAS USA., 96, 7053-7058.

La invención también presenta el uso de una composición que comprende liposomas modificados en superficie que contienen poli(etilenglicol) lípidos (liposomas modificados por PEG, o liposomas de circulación prolongada o liposomas de sigilo), y moléculas de ácido nucleico de la invención. Estas formulaciones ofrecen un método para aumentar la acumulación de fármacos (por ejemplo ANci) en tejidos objetivo. Esta clase de vehículos de fármaco resiste la opsonización y eliminación por parte del sistema fagocítico mononuclear (MPS o RES), permitiendo así tiempos de circulación sanguínea prolongados y mayor exposición del fármaco encapsulado al tejido (Lasic et al. Chem. Rev. 1995, 95, 2601-2627; Ishiwata et al., Chem. Pharm. Bul!. 1995, 43, 1005-1011 ). Se ha mostrado que dichos liposomas se acumulan selectivamente en los tumores, presumiblemente por extravasación y captura en los tejidos objetivo neovascularizados (Lasic eí ai, Science 1995, 267, 1275-1276; Oku eí a/., 1995, Biochim. Biophys. Acta, 1238, 86-90). Los liposomas de circulación prolongada incrementan la farmacocinética y farmacodinámica del ADN y ARN particularmente en comparación con ios liposomas catiónicos convencionales que se sabe se acumulan en tejidos del MPS (Liu et al., J. Biol. Chem. 1995, 42, 24864-24870; Choi et al., publicación internacional de PCT No. WO 96/10391 ; Ansell et al., publicación internacional de PCT No. WO 96/10390; Holland et al., publicación internacional de PCT No. WO 96/10392). También, probablemente los liposomas de circulación prolongada protegen a los fármacos de degradación por nucleasa a un grado mayor en comparación con los liposomas catiónicos, basándose en su capacidad para evitar la acumulación del MPS metabólicamente agresivo en tejidos tales como el hígado y el bazo.

En una modalidad, una formulación de liposoma de la invención comprende una molécula de ácido nucleico de doble cadena de la invención (por ejemplo, ANci), formulada o en complejo con compuestos y composiciones descritos en US 6,858,224; 6,534,484; 6,287,591 ; 6,835,395; 6,586,410; 6,858,225; 6,815,432; US 6,586,001 ; 6,120,798; US 6,977,223; US 6,998, 1 15; 5,981 ,501 ; 5,976,567; 5,705,385; US 2006/0019912; US 2006/0019258; US 2006/0008909; US 2005/0255153; US 2005/0079212; US 2005/0008689; US 2003/0077829, US 2005/0064595, US 2005/0175682, US 2005/0118253; US 2004/0071654; US 2005/0244504; US 2005/0265961 y US 2003/0077829, todos los cuales se incorporan aquí como referencia en su totalidad.

La presente invención también incluye composiciones preparadas para almacenamiento o administración que incluyen una cantidad farmacéuticamente eficaz de los compuestos deseados en un vehículo o diluente farmacéuticamente aceptable. Los vehículos o diluentes aceptables para uso terapéutico son muy conocidos en el ámbito farmacéutico y se describen por ejemplo en "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co. (A.R. Gennaro edit. 1985), que se incorpora aquí como referencia. Por ejemplo, se pueden proveer conservadores, estabilizadores, colorantes y agentes saborizantes. Estos incluyen benzoato de sodio, ácido sórbico y ésteres de ácido p-hidroxibenzoico. Además, se pueden usar antioxidantes y agentes de suspensión.

Una dosis farmacéuticamente eficaz es aquella dosis requerida para prevenir, inhibir la ocurrencia, o tratar un estado patológico (aliviar un síntoma a cierto grado, preferiblemente todos los síntomas). La dosis farmacéuticamente eficaz depende del tipo de enfermedad, la composición usada, la vía de administración, el tipo de mamífero tratado, las características físicas del mamífero específico bajo consideración, la medicación concurrente y otros factores que reconocerán los expertos en el ámbito médico. En general se administra una cantidad de entre 0.1 mg/kg y 100 mg/kg de peso corporal/día de ingredientes activos, dependiendo de la potencia del polímero cargado negativamente.

Las moléculas de ácido nucleico de la invención y las formulaciones de las mismas se pueden administrar por vía oral, tópica, parenteral, por inhalación o atomización, o por vía rectal, en formulaciones de dosis unitarias que contienen vehículos, adyuvantes o excipientes inocuos farmacéuticamente aceptables convencionales. El término parenteral, como se usa aquí, incluye inyección percutánea, subcutánea, intravascular (por ejemplo intravenosa), intramuscular o intratecal, o técnicas de infusión, etcétera. Además, se provee una formulación farmacéutica que comprende una molécula de ácido nucleico de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Una o más moléculas de ácido nucleico de la invención pueden estar presentes en asociación con uno o más vehículos, o diluentes o adyuvantes inocuos farmacéuticamente aceptables y, si se desea, otros ingredientes activos. Las composiciones farmacéuticas que contienen moléculas de ácido nucleico de la invención pueden estar en una forma adecuada para uso oral, por ejemplo como tabletas, trociscos, pastillas, suspensiones acuosas u oleosas, polvos o gránulos dispersables, emulsión, cápsulas duras o blandas, o jarabes o elíxires.

Las composiciones destinadas a uso oral se pueden preparar de acuerdo con cualquier método conocido para la fabricación de composiciones farmacéuticas, y dichas composiciones pueden contener uno o más de dichos agentes edulcorantes, saborizantes, colorantes o conservadores, para proveer preparaciones farmacéuticamente elegantes y aceptables. Las tabletas contienen el ingrediente activo en mezcla con excipientes inocuos farmacéuticamente aceptables que son adecuados para la fabricación de tabletas. Estos excipientes pueden ser por ejemplo diluentes inertes tales como carbonato de calcio, carbonato de sodio, lactosa, fosfato de calcio o fosfato de sodio; agentes de granulación y desintegración, por ejemplo almidón de maíz o ácido algínico; agentes aglutinantes, por ejemplo almidón, gelatina o acacia; y agentes lubricantes, por ejemplo estearato de magnesio, ácido esteárico o talco. Las tabletas pueden ser descubiertas o se pueden recubrir mediante las técnicas conocidas. En algunos casos dichos recubrimientos se pueden preparar mediante las técnicas conocidas para retrasar la desintegración y absorción en el tracto gastrointestinal, y así proveer una acción sostenida durante un período prolongado. Por ejemplo, se puede usar un material de retraso tal como monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo.

Las formulaciones para uso oral también se pueden presentar como cápsulas de gelatina dura, en donde el ingrediente activo se mezcla con un diluente sólido inerte, por ejemplo carbonato de calcio, fosfato de calcio o caolín, o como cápsulas de gelatina blanda, en donde el ingrediente activo se mezcla con agua o un medio oleoso, por ejemplo aceite de cacahuate, parafina líquida o aceite de oliva.

Las suspensiones acuosas contienen los materiales activos en mezcla con excipientes adecuados para la fabricación de suspensiones acuosas. Dichos excipientes son agentes de suspensión, por ejemplo carboximetilcelulosa de sodio, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, alginato de sodio, polivinilpirolidona, goma de tragacanto y goma acacia; los agentes dispersantes o de mojado pueden ser un fosfátido natural, por ejemplo lecitina, o productos de condensación de un óxido de alquileno con ácidos grasos, por ejemplo polioxietilen estearato, o productos de condensación de óxido de etileno con alcoholes alifáticos de cadena grande, por ejemplo heptadecaetilenoxicetanol, o productos de condensación de óxido de etileno con ésteres parciales derivados de ácidos grasos y un hexitol, tal como un monooleato de polioxietilensorbitol, o productos de condensación de óxido de etileno con ésteres parciales derivados de ácidos grasos y anhídridos de hexitol, por ejemplo monooleato de polietilensorbitán. Las suspensiones acuosas también pueden contener uno o más conservadores, por ejemplo p-hidroxibenzoato de etilo, o n-propilo, uno o más agentes colorantes, uno o más agentes saborizantes, y uno o más agentes edulcorantes, tales como sacarosa o sacarina.

Se pueden formular suspensiones oleosas suspendiendo los ingredientes activos en un aceite vegetal, por ejemplo aceite de cacahuate, aceite de oliva, aceite de ajonjolí o aceite de coco, o en un aceite mineral tal como parafina líquida. Las suspensiones oleosas pueden contener un agente espesante, por ejemplo cera de abejas, parafina dura o alcohol cetílico. Los agentes edulcorantes y los agentes saborizantes se pueden añadir para proveer preparaciones orales aceptables. Estas composiciones se pueden conservar mediante la adición de un antioxidante tal como ácido ascórbico.

Los polvos y gránulos dispersables adecuados para la preparación de una suspensión acuosa por adición de agua proveen el ingrediente activo en mezcla con un agente dispersante o de mojado, agente de suspensión y uno o mas conservadores. Los agentes de dispersión o mojado o agentes de suspensión adecuados son ejemplificados por los ya mencionados anteriormente. También pueden estar presentes excipientes adicionales, por ejemplo agentes edulcorantes, saborizantes y colorantes.

Las composiciones farmacéuticas de la invención también pueden estar en forma de emulsiones de aceite en agua. La fase oleosa puede ser un aceite vegetal o un aceite mineral o mezcla de estos. Los agentes emulsionantes adecuados pueden ser gomas naturales, por ejemplo goma acacia o goma tragacanto, fosfátidos naturales, por ejemplo soya, lecitina y ésteres o ésteres parciales derivados de ácidos grasos y hexitol, anhídridos, por ejemplo monooleato de sorbitán, y productos de condensación de dichos ésteres parciales con óxido de etileno, por ejemplo monooleato de polioxietilensorbitán. Las emulsiones también pueden contener agentes edulcorantes y saborizantes.

Los jarabes y elíxires se pueden formular con agentes edulcorantes, por ejemplo glicerol, propilenglicol, sorbitol, glucosa o sacarosa. Dichas formulaciones también pueden contener un emoliente, un conservador y agentes saborizantes y colorantes. Las composiciones farmacéuticas pueden estar en forma de una suspensión acuosa u oleosa inyectable estéril. Esta suspensión se puede formular de acuerdo con la técnica conocida usando los agentes dispersantes o de mojado y los agentes de suspensión adecuados que se mencionaron ya anteriormente. La preparación inyectable estéril también puede ser una solución o suspensión inyectable estéril en un diluente o disolvente inocuo aceptable para uso parenteral, por ejemplo una solución en 1 ,3-butanodiol. Entre los vehículos y disolventes aceptables que se pueden usar están el agua, solución de Ringer, y solución isotónica de cloruro de sodio. Además, convencionalmente se usan aceites fijos estériles como medio de disolvente o suspensión. Para este propósito se puede usar cualquier aceite fijo blando que incluye mono- o diglicéridos sintéticos. Además en la preparación de inyectables se pueden usar ácidos grasos tales como ácido oleico.

Las moléculas de ácido nucleico de la invención también se pueden administrar en forma de supositorios, por ejemplo para administración rectal del fármaco. Estas composiciones se pueden preparar mezclando el fármaco con un excipiente no irritante adecuado que es sólido a la temperatura ordinaria pero líquido a la temperatura rectal, y por lo tanto se fundirá en el recto para liberar el fármaco. Tales materiales incluyen manteca de cacao y polietilenglicoles.

Las moléculas de ácido nucleico de la invención se pueden administrar por vía parenteral en un medio estéril. El fármaco, dependiendo del vehículo y la concentración usada, se puede suspender o disolver en el vehículo. Ventajosamente se pueden disolver en el vehículo adyuvantes tales como anestésicos locales, conservadores, y agentes amortiguadores.

Las escalas de dosis del orden de aproximadamente 0.1 mg a aproximadamente 140 mg por kilogramo de peso corporal por día son útiles en el tratamiento de las afecciones anteriormente indicadas (de aproximadamente 0.5 mg a aproximadamente 7 g por sujeto por día). La cantidad de ingrediente activo que se puede combinar con los materiales de vehículo para producir una forma farmacéutica unitaria varía dependiendo del hospedero tratado y el modo de administración particular. Por lo general, las formas farmacéuticas unitarias contienen entre aproximadamente 1 mg y aproximadamente 500 mg de un ingrediente activo.

Se entiende que la escala de dosis específica para cualquier sujeto particular depende de una variedad de factores que incluyen la actividad del compuesto específico usado, la edad, peso corporal, salud general, sexo, dieta, tiempo de administración, vía de administración y velocidad de excreción, combinación de fármacos, y la severidad de la enfermedad particular sometida a la terapia.

Para administración a animales no humanos, la composición también se puede añadir al alimento o agua para beber del animal. Puede ser conveniente formular composiciones de alimento y agua para beber del animal de modo que el animal tome una cantidad terapéuticamente adecuada de la composición junto con su dieta. También puede ser conveniente presentar la composición como una premezcla para su adición al alimento o agua de beber.

Las moléculas de ácido nucleico de la presente invención también se pueden administrar a un sujeto en combinación con otros compuestos terapéuticos para aumentar el efecto terapéutico general. El uso de compuestos múltiples para tratar una indicación puede aumentar los efectos benéficos reduciendo la presencia de efectos secundarios.

En una modalidad, la invención comprende composiciones adecuadas para la administración de moléculas de ácido nucleico de la invención a tipos específicos de células. Por ejemplo, el receptor de asialoglicoproteína (ASGPr) (Wu y Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262, 4429-4432) es único para los hepatocitos y se une a glicoproteínas ramificadas de galactosa terminal, tales como asialorosomucoide (ASOR). En otro ejemplo, el receptor de folato se sobreexpresa en muchas células de cáncer. La unión de dichas glicoproteínas, glicoconjugados sintéticos, o folatos al receptor ocurre con una afinidad que depende en gran forma del grado de ramificación de la cadena de oligosacárido, por ejemplo las estructuras triatenarias se unen con mayor afinidad que las cadenas biatenarias o monoatenarias (Baenziger y Fíete, 1980, Cell, 22, 61 1-620; Connolly et al., 1982, J. Biol. Chem., 257, 939-945). Lee y Lee, 1987, Glycoconjugate J., 4, 317-328, obtuvieron esta especificidad alta usando N-acetil-D-galactosamina como la porción de carbohidrato, que tiene mayor afinidad por el receptor en comparación con la galactosa. Este "efecto de agrupamiento" también se ha descrito para la unión e incorporación de glicoproteínas terminadas en manosilo o glicoconjugados (Ponpipom et al., 1981 , J. Med. Chem., 24, 1388-1395). El uso de galactosa, galactosamina o conjugados basados en folato para transportar compuestos exógenos a través de las membranas celulares, puede proveer un suministro dirigido, por ejemplo para el tratamiento de enfermedad hepática, cáncer del hígado, u otros tipos de cáncer. El uso de bioconjugados también puede proveer una reducción de la dosis requerida de los compuestos terapéuticos para el tratamiento. Además, usando los bioconjugados de ácido nucleico de la invención se puede modular la biodisponibilidad terapéutica, farmacodinamia y parámetros farmacocinéticos. Los ejemplos no limitativos de dichos bioconjugados se describen en Vargeese et al., USSN 10/201 ,394, presentada el 13 de agosto de 2001 ; y Matulic-Adamic et al., USSN 60/362,016, presentada el 6 de marzo de 2002.

Alternativamente, algunas moléculas de ANci de la presente invención se pueden expresar dentro de las células partiendo de promotores eucarióticos (por ejemplo, Izant y Weintraub, 1985, Science, 229, 345; McGarry y Lindquist, 1986, Proc. Nati. Acad. Sci., USA 83, 399; Scanlon et al., 1991 , Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 88, 10591-5; Kashani-Sabet et al., 1992, Antisense Res. Dev., 2, 3-15; Dropulic er al., 1992, J. Virol., 66, 1432-41 ; Weerasinghe et al., 1991 , J. Virol., 65, 5531-4; Ojwang et ai, 1992, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 89, 10802-6; Chen et al., 1992, Nucleic Acids Res., 20, 4581-9; Sarver et al., 1990 Science, 247, 1222-1225; Thompson et al., 1995, Nucleic Acids Res., 23, 2259; Good et al., 1997, Gene Therapy, 4, 45). Los expertos en la materia se darán cuenta que cualquier ácido nucleico puede ser expresado en células eucarióticas a partir del vector apropiado de ADN/ARN. La actividad de dichos ácidos nucleicos puede ser aumentada mediante su liberación del transcrito primario por un ácido nucleico enzimático (Draper et al., PCT WO 93/23569, y Sullivan er al., PCT WO 94/02595; Ohkawa et al., 1992, Nucleic Acids Symp. Ser., 27, 15-6; Taira et al., 1991 , Nucleic Acids Res., 19, 5125-30; Ventura et al., 1993, Nucleic Acids Res., 21 , 3249-55; Chowrira et al., 1994, J. Biol. Chem., 269, 25856).

En otro aspecto de la invención, las moléculas de ARN de la presente invención se pueden expresar partiendo de unidades de transcripción (véase por ejemplo Couture et al., 1996, TIG., 12, 510) insertadas en los vectores de ADN o ARN. Los vectores recombinantes pueden ser plásmidos de ADN o vectores virales. Se pueden construir vectores virales que expresan el ANci basándose, sin limitación, en virus adeno-asociados, retrovirus, adenovirus o alfavirus. En otra modalidad, se usan construcciones basadas en pol III para expresar moléculas de ácido nucleico de la invención (véase por ejemplo Thompson, patentes de los EE. UU. Nos. 5,902,880 y 6,146,886). Los vectores recombinantes capaces de expresar las moléculas de ANci pueden ser suministrados como se describe arriba, y persisten en las células objetivo. Alternativamente, se pueden usar vectores virales que proveen la expresión transitoria de moléculas de ácido nucleico. Dichos vectores se pueden administrar repetidamente conforme sea necesario. Una vez expresada, la molécula se ANci interacciona con el ARNm objetivo y genera una respuesta de i-ARN. El suministro de los vectores que expresan la molécula de ANci puede ser sistémico, por ejemplo por administración intravenosa o intramuscular, o por administración a células objetivo explantadas de un sujeto, seguida por reintroducción al sujeto o mediante cualquier otro método que permita la introducción en la célula objetivo deseada (para una revisión véase Couture er a/., 1996, TIG., 12, 510).

En un aspecto, la invención presenta un vector de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica por lo menos una molécula de ANci de la presente invención. El vector de expresión puede codificar una o las dos cadenas de un dúplex de ANci o una sola cadena autocomplementaria que se autohibrida en un dúplex de ANci. Las secuencias de ácido nucleico que codifican las moléculas de ANci de la presente invención se pueden enlazar operativamente de una manera que permita la expresión de la molécula de ANci (véase por ejemplo Paul et al., 2002, Nature Biotechnology, 19, 505; Miyagishi y Taira, 2002, Nature Biotechnology, 19, 497; Lee et al., 2002, Nature Biotechnology, 19, 500; y Novina et al., 2002, Nature Medicine, publicación anticipada en linea doi:10.1038/nm725).

En otro aspecto, la invención presenta un vector de expresión que comprende: a) una región de iniciación de transcripción (por ejemplo región de iniciación pol I, II o III eucariótica); b) una región de terminación de transcripción (por ejemplo región de terminación pol I, II o III eucariótica); y c) una secuencia de ácido nucleico que codifica por lo menos una de las moléculas de ANci de la presente invención, en donde dicha secuencia está enlazada operativamente a dicha región de iniciación y dicha región de terminación, de una manera que permite la expresión o suministro de la molécula de ANci. Opcionalmente el vector puede incluir un marco de lectura abierto (ORF) para una proteína enlazada operativamente en el lado 5' o el lado 3' de la secuencia que codifica el ANci de la invención; o un intrón (secuencias intermedias).

La transcripción de las secuencias de la molécula de ANci puede ser manejada desde un promotor para ARN polimerasa I (pol I) eucariótica, ARN polimerasa II (pol II) o ARN polimerasa III (pol III). Los transcritos de los promotores pol II o pol III se expresan en altos niveles en todas las células; las concentraciones de un promotor pol II dado en un tipo de célula dada depende de la naturaleza de las secuencias reguladoras de gen que están presentes de cerca (incrementadores, silenciadores, etc.). También se usan promotores de ARN polimerasa procarióticos, siempre que la enzima ARN polimerasa procariótica sea expresada en las células apropiadas (Elroy-Stein y Moss, 1990, Proc. Nati. Acad. Sci. U S A, 87, 6743-7; Gao y Huang 1993, Nucleic Acids Res., 21 , 2867-72; Lieber et al., 1993, Methods Enzymol., 217, 47-66; Zhou et al., 1990, Mol. Cell. Biol., 10, 4529-37). Varios investigadores han demostrado que las moléculas de ácido nucleico expresadas de dichos promotores pueden funcionar en las células de mamífero (por ejemplo Kashani-Sabet et al., 1992, Antisense Res. Dev., 2, 3-15; Ojwang et al., 1992, Proc. Nati. Acad. Sci. U S A, 89, 10802-6; Chen et al., 1992, Nucleic Acids Res., 20, 4581-9; Yu er a/., 1993, Proc. Nati. Acad. Sci. U S A, 90, 6340-4; L'Huillier et al., 1992, EMBO J., 11 , 441 1-8; Lisziewicz et al., 1993, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A, 90, 8000-4; Thompson et al., 1995, Nucleic Acids Res., 23, 2259; Sullenger & Cech, 1993, Science, 262, 1566). Más específicamente, las unidades de transcripción, tales como las que derivan de los genes que codifican ARN pequeño nuclear (ARNpn) U6, ARN de transferencia (ARNt) y ARN de adenovirus VA, son útiles para generar en las células altas concentraciones de las moléculas de ARN deseadas, tales como ANci (Thompson et al., supra; Couture y Stinchcomb, 1996, supra; Noonberg et al., 1994, Nucleic Acid Res., 22, 2830; Noonberg et al., patente de EE. UU. No. 5,624,803; Good et al., 1997, Gene Ther., 4, 45; Beigelman et al., publicación internacional de PCT No. WO 96/18736). Las unidades de transcripción de ANci anteriores se pueden incorporar en una variedad de vectores para su introducción en células de mamífero, que incluyen sin restricción vectores de ADN plasmídico, vectores de ADN virales (tales como vectores de adenovirus o adenovirus asociados) o vectores de ARN viral (tales como vectores retrovirales o alfavirus) (para una revisión véase Couture y Stinchcomb, 7996, supra).

En otro aspecto, la invención presenta un vector de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica por lo menos una de las moléculas de ANci de la invención de una manera que permite la expresión de esa molécula de ANci. El vector de expresión comprende en una modalidad: a) una región de iniciación de transcripción; b) una región de terminación de transcripción; y c) una secuencia de ácido nucleico que codifica por lo menos una cadena de la molécula de ANci, en donde la secuencia está enlazada operativamente a la región de iniciación y la región de terminación de una manera que permite la expresión o suministro de la molécula de ANci.

En otra modalidad, el vector de expresión comprende: a) una región de iniciación de transcripción; b) una región de terminación de transcripción; c) un marco de lectura abierto; y d) una secuencia de ácido nucleico que codifica por lo menos una cadena de una molécula de ANci, en donde la secuencia está enlazada operativamente al extremo 3' del marco de lectura abierto, y en donde la secuencia está enlazada operativamente a la región de iniciación, el marco de lectura abierto y la región de terminación, de una manera que permite la expresión o suministro de la molécula de ANci. En otra modalidad, el vector de expresión comprende: a) una región de iniciación de transcripción; b) una región de terminación de transcripción; c) un intrón; y d) una secuencia de ácido nucleico que codifica por lo menos una molécula de ANci, en donde la secuencia está enlazada operativamente a la región de iniciación, el intrón y la región de terminación, de una manera que permite la expresión o suministro de la molécula de ácido nucleico.

En otra modalidad, el vector de expresión comprende: a) una región de iniciación de transcripción; b) una región de terminación de transcripción; c) un intrón; d) un marco de lectura abierto; y e) una secuencia de ácido nucleico que codifica por lo menos una cadena de una molécula de ANci, en donde la secuencia está enlazada operativamente al extremo 3' del marco de lectura abierto, y en donde la secuencia está enlazada operativamente a la región de iniciación, el intrón, el marco de lectura abierto y la región de terminación, de una manera que permite la expresión o suministro de la molécula de ANci.

Biología v bioquímica del ENaC El canal de sodio epitelial (ENaC, o canal de sodio no neuronal 1 (SCNN1 ) o canal de sodio sensible a la amilorida (ASSC)) es un canal iónico unido a membrana que es permeable para Li\ protones y especialmente Na+. Es un canal "constitutivamente activo", esto es, no requiere un estimulo de control y se abre en el reposo. El ENaC es una proteína heteromérica comprendida de tres subunidades diferentes - a (SCNN1A), ß (SCNN1 B), y ? (SCNN1G). Hasta hace poco la estequiometría exacta no era muy clara, pero basándose en la homología con los canales ASIC, casi seguramente es un heterotrímero (Jasti, J. et al. supra). Cada subunidad consiste en dos hélices de transmembrana y un asa extracelular. Los extremos amino y carboxi de todos los polipéptidos están localizados en el citosol. Además hay una cuarta subunidad denominada d, que comparte homología significativa con la subunidad a y puede formar un canal iónico funcional junto con las subunidades ß y ?. Tales tetrámeros 52, ß, ? aparecen en el páncreas, testículos y ovarios aunque su función es desconocida todavía.

El ENaC está localizado en la membrana apical de las células epiteliales polarizadas, particularmente en el riñon, los pulmones y el colon. Está implicado en el transporte transepitelial de los iones Na+, que efectúa junto con la Na+/K+-ATPasa. Desempeña una función principal en la homeostasis de los iones Na+ y K+ de la sangre, el epitelio y los fluidos extraepiteliales por resorción de los iones Na+.

Las vías respiratorias están revestidas con una película de líquido de aproximadamente 10 micrómetros de grosor que está en dos capas. Alrededor de los cilios está la fase de sol periciliar acuosa. Sobre esta se encuentra un manto mucoso que atrapa las partículas inhaladas. La capa mucosa misma atrapa patógenos/partículas inhaladas, permitiendo su eliminación mediante depuración mucociliar, sin la necesidad de activar una respuesta inflamatoria potencialmente nociva. La baja viscosidad de la fase de sol periciliar permite que los cilios puedan batir e impulsar el manto mucoso a lo largo de las vías respiratorias hasta la boca. En las vías respiratorias mayores el moco llega predominantemente de las glándulas mucosas pero también de las células caliciformes en el epitelio superficial. Es añadida agua a la superficie de las vías respiratorias por secreción de glándula, que es manejada por la secreción activa de CI" por las células serosas. El agua es eliminada por transporte de Na+ mediante el ENaC a través del epitelio de la superficie. En las enfermedades de las vías respiratorias el equilibrio se desplaza de la secreción de agua a la secreción de moco (Widdicombe, J.H. (2002) J. Anat. 201 p. 313 a 318). De esta manera, el ENaC representa el paso limitativo de la reacción de la absorción de sodio a través del epitelio de las vías respiratorias y por lo tanto controla la absorción de agua de la superficie del epitelio de las vías respiratorias. Tanto la COPD (Melton, L. (2002) Lancet 359 p 1924; Hogg, J.C. et al (2004) N. Engl. J. Med. 350 p. 2645 a 2653; deMarco, R. et al (2007) Am. J. Respir. Crit. Care Med. 175 p. 32 a 39) como la fibrosis quística se caracterizan por una deshidratación relativa de las vías respiratorias que ocasionan la adhesión de moco. El resultado es una estasis de moco. El moco adherido obstruye las vías respiratorias y se puede convertir en el nido de aparición de infección/exacerbación de la enfermedad de las vías respiratorias, primero intermitentemente y después crónicamente.

La deshidratación del moco en la COPD probablemente es multifactorial. Es importante hacer notar que la deshidratación relativa puede ser manifiesta como menos líquido en la superficie de las vías respiratorias o como un aumento del porcentaje de materiales sólidos presente en el lumen. Aunque la hiperplasia de las células caliciformes, una característica clave de la COPD (Hogg et al. supra) y la hipersecreción resultante de mucina per se pueden aumentar el porcentaje de contenido de sólidos del líquido de superficie de las vías respiratorias, ocasionando deshidratación relativa en la COPD, también es probablemente que contribuyan los defectos del transporte de iones y agua (Boucher, R.C. (2004) Proc. Am. Thorac. Soc. 1 p. 66-70). Quizá los datos más apremiantes de que la deshidratación del moco es un problema en la COPD, son los de Hogg (Hogg et al. supra), que describe la adhesión del moco en las superficies de las vías respiratorias y la obstrucción de moco en las vías respiratorias menores. En este estudio, se determinaron los efectos patológicos progresivos de la obstrucción de las vías respiratorias en pacientes con COPD en el tejido de pulmón resectado quirúrgicamente. El avance de la COPD estuvo fuertemente asociado con un aumento de volumen de tejido en la pared (P<0.001) y la acumulación de exudados de moco inflamatorios en el lumen (P<0.001) de las vías respiratorias menores.

Con respecto a la fibrosis quística, Knowles et al. (Knowles, M, ef al. (1981 ) N. Engl. J. Med. 305 p. 1489 a 1495) midieron la diferencia de potencial eléctrico transepitelial a través de la mucosa respiratoria en pacientes con fibrosis quística y sujetos de control. Las diferencias de potencial transepiteliales en las vías respiratorias de fibrosis quística fueron significativamente mayores que en los controles. Esto se debió al transporte excesivo de Na+ mediado por el ENaC, ya que la superfusión de la superficie luminal con amilorida indujo reducciones mayores de la diferencia de potencial transepitelial en la fibrosis quística en comparación con los controles. Estas observaciones seminales cambiaron el punto de vista de la causa subyacente de la patología respiratoria de la fibrosis quística, de un defecto debido únicamente a una falta de secreción de iones CI", a uno asociado con absorción excesiva de Na+.

La mayor reducción de la diferencia de potencial en respuesta a la amilorida indicó absorción excesiva de sal y por lo tanto absorción de líquido desde las superficies epiteliales respiratorias. Esto fue apoyado fuertemente por una variedad de estudios in vitro e in vivo (Boucher, R. C (2007) Annu. Rev. Med. 58 p. 157 a 170; Boucher, R.C. (2007) Trends Mol. Med. 13 p. 231 a 240; Boucher, R.C. (2007) J. Int. Med. 261 p. 5 a 16; Donaldson, S.H. y Boucher, R.C. (2007) Chest 132 p. 1631-1636). El resultado de la deshidratación de la superficie de las vías respiratorias es la estasis de moco. El moco adherido obstruye las vías respiratorias y se puede convertir en el nido de aparición de infección/exacerbación de la enfermedad de las vías respiratorias, primero intermitentemente y después crónicamente. El desarrollo de estrategias de tratamiento que maneje este defecto es un medio lógico y provisorio de retardo, demora o prevención potencial de estas enfermedades del pulmón.

EJEMPLOS Los siguientes son ejemplos no limitativos que muestran la selección, aislamiento, síntesis y actividad de los ácidos nucleicos de la presente invención.

EJEMPL0 1 Diseño, síntesis e identificación de ARNci activos contra ENaCa Síntesis de ANci de ENaCa Se diseñó, sintetizó y evaluó una serie de 64 cadenas de ANci para determinar su eficacia contra el ENaC. Los criterios primarios para el diseño de los ANci de ENAC fueron: (i) conservación del ENaC en todas las isoformas humanas, de ratón y de rata, y (ii) puntuaciones de eficacia alta determinadas por medio de un algoritmo patentado. También se examinaron los efectos de los ANci sobre la producción de proteína de ENaC y la cantidad de ARN. Las secuencias de los ANci que fueron diseñados, sintetizados y evaluados para determinar su eficacia contra ENaC se describen en el cuadro 1A (secuencias objetivo) y el cuadro 1 B (secuencias modificadas).

CUADRO 1A Secuencias obietivo de ENaCa, indicando el sitio obietivo Comp. a/s = Compuesto de antisentido; Comp. s = Compuesto de sentido; Sitio obj. = Sitio objetivo EJEMPLO 2 Síntesis en tándem de las construcciones de ANci Moléculas de ANci ejemplares de la invención son sintetizadas en tándem usando un enlazador separable, por ejemplo un enlazador basado en succinilo. La síntesis en tándem, como se describe aquí, va seguida por un procedimiento de purificación en un paso que provee moléculas de i-ARN con alto rendimiento. Este enfoque es muy dócil para la síntesis de ANci para apoyar el examen de i-ARN de alto rendimiento, y se puede adaptar fácilmente a plataformas de síntesis de múltiples columnas o múltiples pocilios.

Después de terminar una síntesis en tándem de un oligonucleótido de ANci y su complemento en el cual el grupo dimetoxitritilo 5' terminal (5'-0-DMT) permanece intacto (síntesis sobre tritilo), los oligonucleótidos se desprotegen como se describe arriba. Después de la desprotección, las cadenas de secuencia del ANci se dejan hibridar espontáneamente. Esta hibridación produce un dúplex en el cual una cadena ha retenido el grupo 5'-0-DMT, mientras que la cadena complementaria comprende un 5'-hídroxilo terminal. El dúplex recién formado se comporta como una sola molécula durante la purificación por extracción en fase sólida rutinaria (purificación sobre el tritilo), aunque solo una molécula tiene un grupo dimetoxi-tritilo. Como las cadenas forman un grupo estable, este grupo dimetoxi-tritilo (o un grupo equivalente, tal como otros grupos tritilo u otras porciones hidrofóbicas), es todo lo que se requiere para purificar el par de oligonucleótidos, por ejemplo usando un cartucho C18.

Se usa la química estándar de síntesis de fosforamidita hasta el punto de introducir un enlazador de tándem, tal como un enlazador abásico de desoxisuccinato invertido o glicerilo succinato (véase la figura 1 ), o un enlazador separable equivalente. Un ejemplo no limitativo de condiciones de acoplamiento de enlazador que se pueden usar incluye una base impedida tal como diisopropiletilamina (DIPA) o DMAP, en presencia de un reactivo activador tal como hexaflurorofosfato de bromotripirrolidinofosfonio (PyBrOP). Después de acoplar el enlazador, se utiliza química de síntesis estándar para terminar la síntesis de la segunda secuencia, dejando intacto el 5'-0-DMT terminal. Después de la síntesis, el oligonucleótido resultante se desprotege de acuerdo con los procedimientos aquí descritos, y se desactiva con un amortiguador adecuado, por ejemplo con NaOAc 50mM o NH4H2CO3 1.5M.

La purificación del dúplex de ANci se puede realizar fácilmente usando extracción en fase sólida, por ejemplo usando un cartucho Waters C18 SepPak de 1g acondicionado con un volumen de columna (VC) de acetonitrilo, 2 VC H20, y 2 VC NaOAc 50mM. La muestra se carga y después se lava con 1 VC H20 o NaOAc 50mM. Las secuencias fallidas se eluyen con 1 VC ACN al 14% (acuoso con NaOAc 50 mM y NaCI 50 mM). Después, la columna se lava, por ejemplo con 1 VC H20, seguido por des-tritilación en la columna, por ejemplo pasando 1 VC de ácido trifluoroacético acuoso (TFA) al 1 % por la columna, después agregando un segundo VC de TFA acuoso 1 % a la columna, y dejando reposar durante aproximadamente 10 minutos. La solución de TFA remanente se remueve y la columna se lava con H20, seguida por 1 VC de NaCI 1 M y más H20. Después, el producto dúplex de ANci se eluye, por ejemplo usando 1 VC de CAN acuoso al 20%.

La figura 2 da un ejemplo de análisis de espectrometría de masa MALDI-TOF de una construcción de ANci purificada en la cual cada pico corresponde a la masa calculada de una cadena de ANci individual del dúplex de ANci. El mismo ANci purificado provee tres picos, analizado por electroforesis en gel capilar (CGE), un pico correspondiendo presumiblemente al ANci dúplex, y dos picos correspondiendo presumiblemente a las cadenas de la secuencia de ANci separadas. El análisis de HPLC de intercambio iónico de la misma construcción de ANci muestra solamente un pico. El análisis de la construcción de ANci purificada usando la prueba de reportero de luciferasa que se describe más abajo mostró la misma actividad de i-ARN, en comparación con las construcciones de ANci generadas de cadenas de secuencia de oligonucleótido sintetizadas separadamente.

EJEMPLO 3 Síntesis química y purificación del ANci Se pueden diseñar moléculas de ANci para que interaccionen con varios sitios en el mensaje de ARN, por ejemplo secuencias objetivo, dentro de las secuencias de ARN aquí descritas. La secuencia de una cadena de las moléculas de ANci es complementaria a las secuencias del sitio objetivo anteriormente descritas. Las moléculas de ANci se pueden sintetizar químicamente usando los métodos aquí descritos. Las moléculas de ANci inactivas que se usan como secuencias de control se pueden sintetizar revolviendo la secuencia de las moléculas de ANci de tal manera que no sea complementaria con la secuencia objetivo. Generalmente las construcciones de ANci se pueden sintetizar usando métodos de síntesis de oligonucleótido en fase sólida, como se describe en la presente (véase por ejemplo Usman et al., patentes de EE. UU. Nos. 5,804,683; 5,831 ,071 ; 5,998,203; 6,117,657; 6,353,098; 6,362,323; 6,437, 1 17; 6,469, 158; Scaringe et al., patentes de EE. UU. Nos. 6, 1 1 ,086; 6,008,400; 6,1 1 1 ,086, todas incorporadas aquí como referencia en su totalidad).

En un ejemplo no limitativo, se sintetizan oligonucleótidos de ARN de manera gradual usando la química de fosforamidita como se conoce en la técnica. La química estándar de fosforamidita incluye el uso de nucleósidos que comprenden cualquiera de los grupos 5'-0-dimetoxitritilo, 2'-O-ter-butildimetilsililo, 3'-0-2-cianoetilo, ?,?-düsopropilfosforoamidita, y grupos protectores de amina exocíclicos (por ejemplo N6-benzoil adenosina, N4-acetil citidina, y N2-isobutiril guanosina). Alternativamente, en la síntesis de ARN se pueden usar éteres de 2'-0-sililo en conjunto con grupos protectores 2'-ortoéster lábiles al ácido, como lo describe Scaringe supra. Diversas químicas de 2' pueden requerir diferentes grupos protectores, por ejemplo, en 2'-desoxi-2'-amino nucleósidos se puede utilizar protección con N- ftaloilo como lo describe Usman et al., patente de EE. UU. 5,631 ,360, que se incorpora aquí como referencia en su totalidad.

Durante la síntesis en fase sólida, cada nucleótido se añade secuencialmente (dirección 3' a 5') al oligonucleótido unido al soporte sólido. El primer nucleósido en el extremo 3' de la cadena se une covalentemente a un soporte sólido (por ejemplo vidrio o poliestireno de poro controlado), usando varios enlazadores. El nucleótido precursor, un ribonucleósido fosforamidita, y un activador, se combinan dando como resultado el acoplamiento del segundo nucleósido fosforamidita en el extremo 5' del primer nucleósido. Después se lava el soporte y cualquier grupo 5'-hidroxilo sin reaccionar se bloquea con un reactivo bloqueador tal como anhídrido acético, para hacer inactivas las porciones 5'-acetilo. El enlace de fósforo trivalente se oxida entonces a un enlace de fosfato más estable. Al final del ciclo de adición de nucleótido el grupo 5'-0-protector se separa bajo condiciones adecuadas (por ejemplo condiciones ácidas para grupos basados en trifilo, y fluoruro para grupos basados en sililo). El ciclo se repite para cada nucleótido subsiguiente.

Se pueden modificar las condiciones de la síntesis para optimizar la eficiencia de acoplamiento, por ejemplo usando diferentes tiempos de acoplamiento, diferentes concentraciones de reactivo/fosforamidita, diferentes tiempos de contacto, diferentes soportes sólidos, y químicas de enlazador de soporte sólido, dependiendo de la composición química particular del ANci por sintetizar. La desprotección y purificación del ANci se puede realizar como se describe generalmente en Usman et al., US 5,831 ,071 , US 6,353,098, US 6,437,1 17, y Bellon et al., US 6,054,576, US 6, 162,909, US 6,303,773, o Scaringe supra, que se incorpora aquí como referencia en su totalidad. Adicionalmente, las condiciones de desprotección se pueden modificar para proveer el mejor rendimiento y pureza posibles de las construcciones de ANci. Por ejemplo, el solicitante ha observado que los oligonucleótidos que comprenden 2'-desoxi-2'-fluoro-nucleótidos se pueden degradar bajo condiciones de desprotección inadecuadas. Dichos oligonucleótidos se desprotegen usando metilamina acuosa, aproximadamente a 35°C durante 30 minutos. Si el oligonucleótido que contiene 2'-desoxi-2'-fluoro también comprende ribonucleótidos, después de la desprotección con metilamina acuosa aproximadamente a 35°C durante 30 minutos, se le añade TEA-HF y la reacción se mantiene aproximadamente a 35°C durante 15 minutos más. Las cadenas individuales desprotegidas de ANci se purifican por intercambio de aniones para lograr una pureza alta, manteniendo al mismo tiempo altos rendimientos. Para formar la molécula dúplex del ANci las cadenas individuales se combinan en relaciones molares iguales en una solución salina para formar el dúplex. El dúplex del ANci se concentra y se desala por filtración tangencial antes de liofilización.

A continuación se muestra un cuadro que muestra varios ANci sintetizados.

CUADRO 1 B Cadenas sintetizadas de ANci de ENaCa CUADRO 1 B (continuación) Sitio SEQ Secuencia objetivo Secuencia modificada SEQ obj. ID ID NO: NO: en donde: A, C, G y U = ribosa A, C, G o U; c y u = 2'-desoxi-2'-fluoro C o U A, U y G = 2'-0-metil (2'-O e) A, U A y G = desoxi A o G B = abásico invertido T= timidina Fabricación de composiciones de ANci En un ejemplo no limitativo, para cada composición de ANci, las dos cadenas complementarias individuales del ANci se sintetizan separadamente usando síntesis en fase sólida, después se purifican separadamente por cromatografía de intercambio iónico. Las cadenas complementarias se aparean para formar la doble cadena (dúplex). Después el dúplex se somete a ultrafiltracion y se liofiliza para formar la composición sólida de ANci (por ejemplo una composición farmacéutica). Un ejemplo no limitativo del procedimiento de fabricación se muestra en el diagrama del flujo de la figura 31.

Síntesis en fase sólida Los oligonucleótidos de una sola cadena se sintetizan usando química de fosforamidita en un sintetizador automático de fase sólida, tal como un Amersham Pharmacia AKTA Oligopilot (por ejemplo, Oligopilot u Oligopilot 100 plus). Una columna de síntesis ajustable se empaca con un soporte sólido modificado con el primer residuo de nucleósido. La síntesis se inicia mediante des-tritilación del grupo 5'-0-dimetoxitritilo lábil al ácido para liberar el 5'-hidroxilo. Se suministran simultáneamente a la columna de síntesis fosforamidita y un activador adecuado en acetonitrilo, dando como resultado el acoplamiento de la amidita con el 5'-hidroxilo. Después, la columna se lava con acetonitrilo. Se bombea yodo a través de la columna para oxidar el enlace de triéster de fosfito P(lll) a su análogo de fosfotriéster P(V). Los grupos 5'-hidroxilo sin reaccionar se bloquen usando reactivos tales como anhídrido acético, en presencia de 2,6-lutidina y N-metilimidazol. El ciclo de alargamiento se reasume con el paso de des-tritilación para la siguiente incorporación de fosforamidita. Este procedimiento se repite hasta haber sintetizado la secuencia deseada. La síntesis concluye con la remoción del grupo dimetoxi-tritilo terminal.

Separación y desprotección Al terminarse la síntesis, el soporte sólido y el oligonucleótido asociado se transfieren a un embudo de filtración, se seca al vacío y se transfiere a un recipiente de reacción. Se añade una base acuosa y la mezcla se calienta para romper el enlace de succinilo, remover el grupo protector cianoetilfosfato y desproteger la amina exocíclica.

Se realiza el siguiente procedimiento sobre cadenas individuales que no contienen ribonucleótidos: Después de tratar el soporte sólido con la base acuosa, la mezcla se filtra al vacío para separar el soporte sólido del material de síntesis crudo desprotegido. Después, el soporte sólido se enjuaga con agua que se combina con el filtrado. La solución básica resultante se neutraliza con ácido para proveer una solución de la cadena individual cruda.

Se realiza el siguiente procedimiento sobre cadenas individuales que contienen ribonucleótidos: Después de tratar el soporte sólido con la base acuosa, la mezcla se filtra al vacío para separar el soporte sólido del material de síntesis crudo desprotegido. Después, el soporte sólido se enjuaga con sulfóxido de dimetilo (DMSO) que se combina con el filtrado. La mezcla se enfría, se le añade reactivo de fluoruro tal como trihidrofluoruro de trietilamina, y se calienta la solución. La reacción se desactiva con un amortiguador adecuado para proveer una solución de la cadena individual cruda.

Purificación de intercambio aniónico La solución de cada cadena individual cruda se purifica por cromatografía. El producto se eluye usando un gradiente de amortiguador adecuado. Las fracciones se recogen en recipientes cerrados sanitizados, se analizan por HPLC, y las fracciones adecuadas se combinan para obtener una reserva de producto cuya pureza (HPLC), identidad (HPLC), y concentración (UV A260) se analizan.

Apareamiento Basándose en el análisis de las reservas de producto, se transfieren a un recipiente de reacción cantidades molares iguales de las cadenas de oligonucleótido de sentido y antisentido (calculadas usando el coeficiente de extinción teórico). La solución se mezcla y se analiza para determinar la pureza del dúplex por medio de métodos cromatográficos. Si el análisis indica un exceso de cualquier cadena, entonces se titula cadena adicional sin exceso hasta completar la formación del dúplex. Cuando el análisis indica que se ha logrado la pureza del producto objetivo, el material se transfiere al sistema de filtración de flujo tangencial (TFF) para concentración y desalación.

Ultrafiltración La solución de producto apareado se concentra usando un sistema TFF que contiene una membrana adecuada de corte de peso molecular. Después de concentrar, la solución de producto se desala por medio de diafiltración utilizando agua de calidad WFI (agua para la fabricación de inyectables) hasta que la conductividad del filtrado es la del agua.

Liofilización La solución concentrada se transfiere a charolas sanitizadas en un liofilizador de anaquel. Después, el producto se seca en congelación hasta formar un polvo. Las charolas se retiran del liofilizador y se transfieren a una campana de flujo de aire laminar (LAF) de clase 100 para envasado.

Envasado de la sustancia farmacéutica Las charolas del liofilizador que contienen el producto secado por congelación se abren en una campana de LAF de clase 100. El producto se transfiere a recipientes sanitizados de tamaño adecuado que después se sellan y etiquetan.

Sistema de cierre de recipiente de la sustancia farmacéutica La sustancia farmacéutica liofilizada se empaca a granel en recipientes de Nalgene sanitizados, con tapas sanitizadas. El tamaño del recipiente usado depende de la cantidad de material por colocar en el mismo. Después de llenar, cada recipiente se sella adicionalmente en el cierre con cinta de polietileno.

Métodos y especificaciones analíticas Materia prima y métodos de proceso: Se prueba la identidad de las materias primas antes de introducirlas en el procedimiento de fabricación de la sustancia farmacéutica. Las materias primas críticas, las incorporadas en la molécula de la sustancia farmacéutica, se prueban adicionalmente usando una prueba de pureza o un ensayo según sea apropiado. Se prueban muestras en proceso en puntos de control clave en el procedimiento de fabricación, para monitorear y asegurar la calidad de la sustancia farmacéutica final.

Métodos y especificaciones analíticas de la sustancia farmacéutica: Se establecen controles que incorporan métodos analíticos y criterios de aceptación de los oligonucleótidos antes del análisis clínico de las composiciones del ANci a granel. Los siguientes métodos de prueba y criterios de aceptación son ejemplos de estos controles.

Resumen de métodos analíticos Pruebas de identificación (ID): ID del pico principal del oligonucleótido: La identidad de la sustancia farmacéutica se establece usando un método cromatográfico. Los datos usados para esta determinación son generados por uno de los métodos de prueba de HPLC (véanse las pruebas de pureza). Se comparan los tiempos de retención de pico de la muestra de la sustancia farmacéutica y las inyecciones de estándar. La identidad de la sustancia farmacéutica es apoyada por una comparación favorable de los tiempos de retención de los picos principales.

Peso molecular: La identidad de la sustancia farmacéutica se establece usando un método espectroscópico. Se prepara una muestra de sustancia farmacéutica para análisis por precipitación con acetato de amonio acuoso. El peso molecular de la sustancia farmacéutica se determina por espectrometría de masa. La prueba se controla hasta dentro de un número establecido de unidades de masa atómica del peso molecular teórico.

Temperatura de fusión: Este método apoya la identidad de la sustancia farmacéutica por medición de la temperatura de fusión (Tm) de la sustancia farmacéutica de doble cadena. Una muestra en solución se calienta mientras se monitorea la absorbancia en ultravioleta (UV) de la solución. La Tm es marcada por el punto de inflexión de la curva de absorbancia conforme aumenta la absorbancia debido a la disociación del dúplex en cadenas individuales.

Ensayos: Contenido de oligonucleótido: Este ensayo determina el contenido total de oligonucleótido en la sustancia farmacéutica. El oligonucleótido absorbe la luz UV con un máximo local a 260 nm. Las especies de oligonucleótido presentes consisten en el producto de ARNci de doble cadena y otras sustancias de oligonucleótido relacionadas menores del proceso de fabricación, que incluyen cadenas individuales residuales. Una muestra de la sustancia farmacéutica se pesa con exactitud, se disuelve y se diluye volumétricamente en agua. La absorbancia se mide en una celda de cuarzo usando un espectrofotómetro UV. Se calcula el valor del ensayo de oligonucleótido total usando la absortividad molar determinada experimentalmente del estándar de trabajo, y se reporta en microgramos de oligonucleótido de sodio por miligramo de sustancia farmacéutica sólida.

Pruebas de pureza: La pureza se medirá usando uno o más métodos cromatográficos. Dependiendo de la separación y número de análogos de ácido nucleico de la sustancia farmacéutica presente, se pueden usar métodos de separación ortogonal para monitorear la pureza del API. La separación se puede lograr por medio de los siguientes métodos: SAX-HPLC: Una interacción de intercambio iónico entre los fosfodiésteres de oligonucleótido y una columna de HPLC de intercambio amónico fuerte, que usa un gradiente de sal de amortiguador para realizar la separación.

RP-HPLC: Una interacción de partición entre el oligonucleótido y una columna de HPLC hidrofóbica de fase inversa que usa amortiguador acuoso contra gradiente de disolvente orgánico para realizar la separación.

Electroforesis en gel capilar (CGE): Una separación electroforética por tamizado molecular en una solución amortiguadora con un capilar lleno de gel. La separación ocurre conforme se aplica un campo eléctrico que ocasiona que los oligonucleótidos aniónicos se separen por tamaño molecular conforme emigran a través de la matriz de gel. En todos los métodos de separación los picos se eluyen generalmente en el orden de la longitud del oligonucleótido y son detectados por UV a 260 nm.

Otras pruebas Apariencia física: La muestra de la sustancia farmacéutica se examina visualmente. Esta prueba determina que el material tiene el carácter de un sólido liofilizado, identifica el color del sólido, y determina si está presente algún contaminante visible.

Prueba de endotoxinas bacterianas: Se realiza una prueba de endotoxina bacteriana por medio de la prueba de lisado de amebocito de limulus (LAL) usando el método turbidimétrico cinético en una placa de 96 pocilios. Los límites de endotoxina para la sustancia farmacéutica se establecerán adecuadamente de tal manera que cuando se combine con los excipientes, no se excedan los límites diarios admisibles para la endotoxina en el producto farmacéutico administrado.

Biocarga aeróbica: Es realizada una determinación de biocarga aeróbica por un laboratorio contratado usando un método basado en la USP, capitulo 61.

Contenido de acetonitrilo: Es realizado un análisis de acetonitrilo residual por un laboratorio contratado usando cromatografía de gas (GC). El acetonitrilo es el disolvente orgánico principal usado en el paso inicial de la síntesis, aunque se usan en la síntesis otros reactivos orgánicos. Normalmente los pasos del proceso de purificación subsiguiente remueven los disolventes de las sustancias farmacéuticas. Otros disolventes se pueden monitorear dependiendo del resultado del trabajo de desarrollo del proceso. Los disolventes estarán limitados dentro de los límites ICH.

Contenido de agua: El contenido de agua es determinado por medio de titulación volumétrica de Karl Fischer (KF) usando una unidad evaporadora sólida (horno). Normalmente está presente agua en las sustancias farmacéuticas de ácido nucleico como diverso porcentaje de la composición en peso, y por lo tanto será monitoreada. pH: El pH de la sustancia farmacéutica reconstituida será monitoreado para asegurar que sea adecuada para inyección humana.

Contenido iónico: Se realizará análisis de sodio, cloruro y fosfato por un laboratorio contratado usando absorción atómica estándar y métodos de cromatografía iónica. Se realizará monitoreo general de iones para asegurar que la osmolalidad del producto farmacéutico que incorpora las sustancias farmacéuticas esté dentro de una escala fisiológica aceptable.

Contenido de metales: Será realizado análisis de metales pertinentes por un laboratorio contratado usando un método estándar de análisis, espectroscopia de plasma acoplada inductivamente (ICP).

EJEMPLO 4 Prueba de i-ARN in vitro para determinar la actividad del ANci Se usa una prueba in vitro que recapitula la i-ARN en un sistema libre de célula para evaluar las construcciones de ANci dirigidas a objetivos de ARN. La prueba comprende el sistema descrito por Tuschl et al. 1999, Genes and Development, 13, 3191-3197, y Zamore et al. 2000, Cell, 101 , 25-33, adaptada para usarse con un ARN objetivo. Un extracto de Drosophila derivado de blastodermo sincitial se usa para reconstituir la actividad de i-ARN in vitro. Se genera ARN objetivo por medio de transcripción in vitro de un plásmido que expresa el blanco adecuado usando ARN polimerasa T7 o mediante síntesis química como aquí se describe. Las cadenas de sentido y antisentido de ANci (por ejemplo 20 uM cada una) se aparean por incubación en solución amortiguadora (tal como 100 mM acetato de potasio, 30 mM HEPES-KOH, pH 7.4, 2 mM acetato de magnesio), durante un minuto a 90°C, seguido por una hora a 37°C; después se diluye en amortiguador de lisis (por ejemplo 100 Mm acetato de potasio, 30 mM HEPES-KOH pH 7.4, 2 mM acetato de magnesio). El apareamiento se puede monitorear por electroforesis en gel sobre un gel de agarosa en amortiguador TBE, y se tiñe con bromuro de etidio. El lisado de Drosophila se prepara usando embriones de cero a dos horas de edad de moscas Oregon R recogidas sobre agar de melaza con levadura que están descorionados y lisados. El lisado se centrifuga y el sobrenadante se aisla. La prueba comprende una mezcla de reacción que contiene 50% de lisado [vol/vol], ARN (concentración final 10-50 pM), y 10% [vol/vol] de amortiguador de lisis que contiene ANci (concentración final 10 nM). La mezcla de reacción también contiene 10 mM de fosfato de creatinina, 10 ug/ml de creatinina fosfocinasa, 100 uM GTP, 100 uM UTP, 100 uM CTP, 500 uM ATP, 5 mM DTT, 0.1 U/µ? RNasin (Promega), y 100 uM de cada aminoácido. La concentración final de acetato de potasio se ajusta a 100 mM. Las reacciones se ensamblan previamente sobre hielo y se incuba previamente a 25°C durante 10 minutos antes de agregar el ARN, y después se incuba a 25°C durante 60 minutos más. Las reacciones se desactivan con 4 volúmenes de amortiguador de lisis pasiva 1.25x (Promega). El corte del ARN objetivo se prueba por medio de análisis de RT-PCR u otros métodos conocidos, y se compara con reacciones de control en las cuales se omite el ANci de la reacción.

Alternativamente, para la prueba se prepara ARN objetivo marcado internamente mediante transcripción in vitro en presencia de [alfa-3 P]-CTP, se pasa sobre una columna de G50 Sephadex por cromatografía de giro y se usa como ARN objetivo sin mayor purificación. Opcionalmente, el ARN objetivo se marca con 32P en el extremo 5' usando la enzima polinucleótido cinasa T4. Las pruebas se realizan como se describe arriba y el ARN objetivo y los productos de corte de ARN específicos generados por i-ARN se visualizan sobre una autorradiografía de un gel. El porcentaje de corte se determina por medio de cuantificacion PHOSPHOR IMAGER® (autorradiografía) de las bandas que representan ARN de control intacto o ARN de reacciones de control sin ANci, y los productos de corte generados por la prueba.

En una modalidad, esta prueba se usa para determinar sitios objetivo en el ARN objetivo para el corte de i-ARN mediado por ANci, en donde una pluralidad de construcciones de ANci se examinan para determinar corte mediado por i-ARN del ARN objetivo, por ejemplo analizando la reacción de prueba por electroforesis del ARN objetivo marcado, o por medio de Northern blotting, así como también mediante otros métodos muy conocidos.

EJEMPLO 5 Modelos de animal útiles para evaluar la regulación negativa de la expresión del gen ENaC Después de la identificación de construcciones de ANci activas in vitro, se puede usar un modelo de roedor de la función de ENaC en las vías respiratorias para evaluar la eficacia de los ANci que hacen blanco en ENaC para reducir el transporte de iones. Un modelo adecuado es el modelo de conejillo de indias descrito por Coote, KJ. et al (2008) Br. J. Pharmacol (edición en línea del 22 de septiembre de 2008, p. 1-9; doi: 10.1038/bjp.2008.363). Este modelo utiliza una diferencia de potencial traqueal para medir el transporte iónico epitelial de las vías respiratorias en el conejillo de indias.

EJEMPLO 6 Inhibición mediada por iARN de la expresión del gen ENaC Las construcciones de ANci (cuadro 1 B) se pueden probar para determinar su eficacia para reducir la expresión del ARN de ENaC, por ejemplo, en células de carcinoma de pulmón de humano A549. Las células A549 (humanas; ATCC No. cat. CCL-185) se cultivaron a 37°C en presencia de 5% de C02 y se desarrollaron en un medio F12K de Ham con 2 mM de L-glutamina ajustada para contener 1.5 g/l de bicarbonato de sodio, y suplementado con suero bovino fetal a una concentración final de 10%, y 100 U/ml de penicilina. Las células A549 se cultivaron en placa aproximadamente 24 horas antes de transfección en placas de 96 pocilios, a 7,500 células/pocilio, 100 µ?/pocillo. Después de 24 horas se crearon complejos que contenían ANci y Lipofectamine 2000 (Invitrogen), de la siguiente manera: se preparó una solución de Lipofectamine 2000 en OPTI-MEM que contenía Lipofectamine 2000 a una concentración final de 14 pg/ml. En paralelo, se prepararon soluciones de los ANci en OPTI-MEM a una concentración final de 150nM. Después de incubar las dos soluciones a 20°C durante 20 minutos, se agregaron juntos un volumen igual de las soluciones de ANci y la solución de Lipofectamine 2000 para cada uno de los ANci. La solución resultante tenía los ANci a una concentración final de 75nM y Lipofectamine 2000 a una concentración final de 7pg/ml. Esta solución se incubó a 20°C durante 20 minutos. Después de incubar, a cada uno de los pocilios se les agregaron 50µ? de la solución (por triplicado). La concentración final de ANci en cada pocilio fue de 25nM, y la concentración final de Lipofectamine 2000 en cada pocilio fue de 2.33Mg/ml. Las placas se incubaron 48 horas sin cambio de medio antes de cosechar. Se determinaron curvas de dosis-respuesta de una manera similar con cada concentración, haciéndose por triplicado y manteniendo una cantidad constante de Lipofectamine 2000 en cada transfección.

Se extrajo ARN de las placas de 96 pocilios usando el kit Invitek Invisorb RNA Cell HTS 96 Kit/C (No. cat. 70619000) con un protocolo ligeramente modificado. Los detalles del protocolo para aislar el ARN de cada placa se describen de la siguiente manera: 1) Aspirar los medios con raspador. 2) Agregar 150 ul/pocillo de amortiguador de Tisis. 3) Poner en un agitador de placa durante 1 minuto. 4) Poner la placa de unión de ADN encima de la placa de recolección de 0.5 mi. 5) Pipetear 190 ul hacia arriba y hacia abajo dos veces, y agregar a la placa de unión de ADN. 6) Cubrir la placa. 7) Centrifugar las placas 4 minutos a 4000 RPM. 8) Desechar la placa de unión de ADN. 9) Poner la placa de unión de ARN encima de la placa de recolección de 2 mi. 10) Agregar 50 ul/pocillo de amortiguador de unión R a la placa de recolección de 0.5 mi. 1 1 ) Transferir el contenido de la placa de recolección de 0.5 mi a la placa de unión de ARN. 12) Dejar incubar durante 1 minuto. 13) Centrifugar las placas 4 minutos a 4000 RPM. * 14) Agregar 600 ul/pocillo de amortiguador de lavado R1 a la placa de unión de ARN. 15) Centrifugar las placas 4 minutos a 4000 RPM. 16) Verter el amortiguador de lavado de la placa de recolección de 2 mi. 17) Agregar 400 ul/pocillo de amortiguador de lavado R2 a la placa de unión de ARN. 18) Centrifugar las placas 4 minutos a 4000 RPM. 19) Agregar 400 ul/pocillo de amortiguador de lavado R2 a la placa de unión de ARN. 20) Centrifugar las placas 10 minutos a 4000 RPM. 21 ) Verter el amortiguador de lavado de la placa de recolección de 2 mi. 22) Centrifugar las placas 3 minutos a 4000 RPM. 23) Desechar la placa de recolección de 2 mi y poner la placa de unión de ARN sobre la placa de microtitulación. 24) Agregar 100 ul/pocillo de amortiguador de elución a la placa de unión de ARN. 25) Incubar 2 minutos. 26) Sellar la placa. 27) Centrifugar las placas 3 minutos a 4000 RPM. 28) Desechar la placa de unión de ARN. 29) Cubrir la placa de microtitulación para almacenamiento en el congelador a -80°C.

Protocolo de transfección de placa de 6 pocilios El día de la transfección se sembraron aproximadamente 150,000 células en una placa de 6 pocilios en 2 mi de medio de crecimiento. Después de aproximadamente 3 horas, las células se transfectaron con ANci a una concentración final de 12.5, 25, 50 o100 nM, usando el reactivo Lipofectamine 2000 (2.5 pl por pocilio). El complejo ANci-Lipofectamine 2000 (a una Cf de 25nM) se preparó de la siguiente manera: (a) se diluyó 1 µ? de solución de reserva de ANci en 250µ? de medio de suero reducido Opti-MEM (la concentración resultante del ANci fue de 250 nM); (b) la solución de trabajo del reactivo Lipofectamine 2000 se preparó diluyendo la solución de reserva en Opti-MEM a una proporción de 1 :100, después se mezcló y se incubó durante 5 minutos a temperatura ambiente; (c) 250 µ? del ANci diluido se combinaron con un volumen igual de la solución de trabajo de Lipofectamine 2000 (la concentración resultante del ANci fue de 125 nM); y (d) se agregaron 500 µ? de la mezcla al pocilio (la concentración resultante del ANci fue de 25 nM). Después las células se incubaron a 37°C durante 48 horas.

RT-PCR cuantitativa (Taqman) Se usó una serie de sondas de iniciadores para detectar los diversos transcritos de ARNm de los genes ENaCa y GAPDH en líneas de células de ratón, rata y humano. Las pruebas se hicieron en un instrumento ABI 7500 de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En cada experimento se estableció la línea de base en la fase exponencial de la curva de amplificación, y se basó en el punto de intersección de las líneas de base con la curva de amplificación; un valor de Ct fue asignado por el instrumento. Este valor de Ct se asignó entonces a un valor de QTY basado en la curva patrón. En la curva patrón de los diversos experimentos de la presente se utilizaron de 1 ng a 300 ng de ARN extraído de la misma línea celular usada para la transfecciones experimentales.

Western Blot del ENaCa La fuente de proteína para los experimentos de Western Blot fue de la transfección de las células A549 en una placa de 6 pocilios. Las células se sembraron (- 50,000/pocillo) en 2 mi de medid completo (F12 de Ham, Cellgro Cat# 0-080-CV + 10% FBS). Las células se transfectaron de 3 a 4 horas después de la siembra con moléculas de ANci, a una concentración final de 25 nM (por triplicado), usando Lipofectamine 2000. Los ANci se dejaron incubando durante 48 horas. Se prepararon muestras de proteína usando el sistema de aislamiento de proteina y ARN "PARIS" (Ambion, Cat# 1921 ), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La cantidad total de proteína en los lisados celulares se midió usando un reactivo colorante Bradford (Bio-Rad, Cat# 500-0205).

Se hicieron análisis de Western blot en geles previamente vaciados NuPAGE de 4-12% (Invitrogen, Cat# NPO0322BOX) diluyendo las muestras de proteína a 1 :1 en amortiguador de Laemmli 2X con 5% de 2-mercaptoetanol, y se incubaron 5 minutos a 95°C. Cada carril se cargó con 20 g de proteína (excepto los carriles marcadores que se trataron de acuerdo con el protocolo recomendado por el fabricante). Los geles se corrieron a 100V durante aproximadamente 2 horas o hasta que el marcador estándar de 20 kD alcanzara el fondo del gel. Después de la resolución por electroforesis, las proteínas se transfirieron a una membrana de PVDF (1 hora a 100V). Usando caseína en PBS (al 1 %), la membrana se bloqueó (60 minutos a temperatura ambiente; en un agitador de placa). Un anticuerpo policlonal primario de conejo (Abcam # ab3464) se diluyó 1 :500 en caseína al 1 %/PBS, y se incubó con la membrana a 4°C en un agitador oscilatorio durante la noche. El blot se lavó tres veces durante 5 minutos, cada vez con solución de Tween 0.1 % /PBS. El blot se incubó con una solución de anticuerpo secundario (anticuerpo anti-conejo de cabra, Jactson Immunoresearch, Cat. # 1 1 1-035-144), a una dilución de 1 :25,000, durante 30 minutos a temperatura ambiente en un oscilador. Después de esta incubación, el blot se enjuagó rápidamente tres veces durante 5 minutos cada vez con solución de Tween al 0.1 %/PBS. El blot se incubó 1-2 minutos con reactivos ECL+ (Amersham # RPN2133) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después se tomaron imágenes del blot.

Las pruebas de Western Blot arriba descritas se usaron para confirmar que las moléculas del ANci de la invención redujeron la cantidad de proteína de ENaCa.

Análisis de RACE Usando placas de 96 pocilios, las células A549 se trataron con 25nM de ANci activo o 25nM de ANci de control. Para obtener suficiente ARN (5 µ), se usó una placa de 96 pocilios para cada tratamiento (96 duplicados). Después de 24 horas de transfección se aisló el ARN total usando aislamiento estándar de Trizol (Invitrogen), usando 2 mi de Trizol por placa de 96 pocilios. El ARN aislado se usó para el protocolo de RACE.

El GeneRacer Oligo se ligó en el ARN total agregando 5pg de ARN total en 7µ? de H20, a GeneRacer Oligo liofilizado, e incubando a 65°C durante 5 minutos. La mezcla se puso sobre hielo durante 2 minutos, se centrifugó brevemente, y después a esto se le agregó 1 µ? de amortiguador de ligasa 10x, 1 µ? de ATP 10mM, 1 µ? de RNAse Out (40?/µ?), y 1 µ? de ARN ligasa T4 (5?/µ?). La mezcla se mezcló suavemente y después se incubó a 37°C durante 1 hora. Después de 1 hora de incubación se le agregaron 90µ? de DEPC H2O y 10?µ? de fenol:cloroformo. La mezcla se agitó con vórtice en alta velocidad durante 30 segundos y después se centrifugó 5 minutos en alta velocidad. La capa acuosa se transfirió a un tubo de Eppendorf nuevo. A esta capa se le agregaron 2µ? de glucógeno, 30µ? de acetato de sodio 3M y después se mezcló. Después se le agregaron 220µ? de etanol. La mezcla se invirtió varias veces para mezclar y luego se puso sobre hielo seco durante 10 minutos. Se centrifugó a alta velocidad a 4°C durante 20 minutos. Después, el sobrenadante se aspiró con etanol al 70%. Se centrifugó durante 5 minutos a alta velocidad y el sobrenadante se retiró. La pella se dejó secar durante 2-3 minutos. La pella se suspendió en 10µ? de DEPC H20.

A 10µ? del ARN ligado se le agregó 1 µ? de iniciador de RT 10µ? (iniciador 1 de ENaCa), 1 µ? de mezcla de dNTP 10m , y 1 µ? de DEPC H20; después la mezcla se incubó a 65°C durante 5 minutos, seguido por colocación sobre hielo durante 2 minutos y centrifugación breve. A esto se le agregaron 4µ? de amortiguador de primera cadena 5x, 1 µ? de DTT 0.1 M, 1 µ? de RNAse Out (40U/pl), y 1 µ? de Superscript III RT (200?/µ?). La mezcla se agitó suavemente y luego se incubó a 50°C durante 45 minutos, seguido por 65°C durante 7 minutos. La reacción de RT se desactivó incubando a 70°C durante 15 minutos y después se colocó sobre hielo. La mezcla se centrifugó brevemente. A esto se le agregó entonces 1 µ? de RNAsa H (2U), seguido por agitación suave, y después se incubó a 37°C durante 20 minutos. Después, esta mezcla se guardó a -20°C o se usó inmediatamente para PCR.

Usando 1 µ? de la reacción de RT anterior como molde se hizo una amplificación de PCR estándar por 34 ciclos, usando el iniciador 5' Gene Racer y el iniciador 3' Gene Specific (iniciador 1 de ENaCa). La especificidad se aumentó usando una temperatura de apareamiento de 60°C. Usando 1 µ? de la reacción de PCR anterior como molde se hizo una PCR anidada durante 34 ciclos, usando el iniciador 5' anidado Gene Racer y los iniciadores 3' anidados 3' específicos de gen (iniciador 2 de ENaCa). La especificidad se aumentó usando una temperatura de apareamiento de 60°C. Las muestras se analizaron sobre PAGE nativo al 6%. Las bandas del tamaño esperado se cortaron y se eluyeron del gel usando columnas SNAP provistas con el kit GeneRacer. Las bandas eluidas se clonaron usando un kit de clonación TOPO TA Cloning, provisto con el kit GeneRacer. Se examinaron y secuenciaron las placas de agar LB-Amp que contenían las colonias.

CUADRO 2 Secuencias de iniciador usadas en el método de RACE INICIADOR SECUENCIA SEQ ID NO: Iniciador 5' GeneRacer 5'-CGACTGGAGCACGAGGACACTGA 97 Iniciador 5' anidado GeneRacer 5'-GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA 98 Sitio 782: Iniciador 1 de ENaCa 5'-GGAAGACATCCAGAGGTTGG 99 Sitio 782: Iniciador 2 de ENaCa 5'-GGTTGCAGGAGACCTGGTT 100 Sitio 1 181 Iniciador 1 de ENaCa 5'-GCCGCGGATAGAAGATGTAG 101 Sitio 1 181 Iniciador 2 de ENaCa 5'-TCCTGGAAGCAGGAGTGAAT 102 Sitio 1383 Iniciador 1 de ENaCa 5'-TTCTGTCGCGATAGCATCTG 103 Sitio 383 Iniciador 2 de ENaCa 5'-CCAGGTGGTCTGAGGAGAAG 104 Sitio 1388 Iniciador 1 de ENaCa 5 -TTCTGTCGCGATAGCATCTG 105 Sitio 1388 Iniciador 2 de ENaCa 5'-GCAGAGAGCTGGTAGCTGGT 106 Cálculos Se calcularon todos los valores de Cl50 de los datos usando el software GraphPad Prizm, específicamente una curva sigmoide de pendiente variable para unión de ligando simple. También, a menos que se indique de otra manera, todos los cálculos de la eficacia y potencia (por ejemplo, % de knockdown) de los ANci se hicieron con respecto a un ANci de control no objetivo. Si se reportan, los valores P se calcularon usando la prueba t de Student, incluyendo la corrección de Welch para varianzas desiguales.

En todos los cálculos del % de knock-down del ARNm, el cálculo se hizo con respecto al grado de expresión normalizado del gen de interés en las muestras tratadas con el control no objetivo (NTC), a menos que se indique de otra manera. El grado de expresión del gen de interés se dividió entre el grado de expresión de GAPDH o 36B4 (dependiendo de la especie) en cada muestra. Los tres duplicados de cada condición en cada experimento se promediaron y se calculó la desviación estándar de las muestras. Después se usó la siguiente fórmula para calcular el % de knock-down del gen de interés: (Grado de expresión del ANci tratado activo normalizado) (1 ). * 100% (Grado de expresión del ANci tratado NTC normalizado) Los datos normalizados se grafican y se determina el porcentaje de reducción del ARNm objetivo por un ANci activo, en comparación con su ANci de control invertido respectivo.

Resultados Los ANci de ENaCa se diseñaron y se sintetizaron como se describió previamente. Los ANci se examinaron en tres líneas celulares. Células A549 humanas, células NIH 3T3 de ratón, y células H-4-II-E de rata. Los datos del examen de los ANci de ENaCa en las tres especies se muestran en los cuadros 3A, 3B, 4A, 4B, 5A y 5B, y en el cuadro 6 se presenta un resumen de los datos para algunas moléculas de ANci. Cada examen se realizó a las 24 horas. La decisión de usar este punto de tiempo se basó en el grado de knockdown del ARNm observado en ese punto de tiempo.

CUADRO 3A Examen de ANci de ENaCa en células A549 humanas Nota: Expresión de ENaCa en las células transfectadas, los grados de expresión de GAPDH, el grado de expresión de ENaCa normalizado al grado de GAPDH y el % de reducción del ARNm de ENaCa, con respecto a un ANci de control no objetivo (NTC) en las células transfectadas. Para cada valor, n=3, y las células se cosecharon 24 horas después de la transfección. El % de reducción del ARNm de ENaCa con respecto a un ANci de control no objetivo (NTC) en las células transfectadas. UNT es control no tratado y LF2K es Lipofectamine 2K sola.

CUADRO 3B Examen de ANci de ENaCa en células A549 humanas Nota: Expresión de ENaCa en las células transfectadas, los grados de expresión de GAPDH, el grado de expresión de ENaCa normalizado al grado de GAPDH y el % de reducción del ARNm de ENaCa, con respecto a un ANci de control no objetivo (NTC) en las células transfectadas. Para cada valor, n=3, y las células se cosecharon 24 horas después de la transfección. El % de reducción del ARNm de ENaCa con respecto a un ANci de control no objetivo (NTC) en las células transfectadas. UNT es control no tratado y LF2K es Lipofectamine 2K sola.

CUADRO 4A Examen de ANci de ENaCa en células NIH 3T3 de ratón Nota: Expresión de mSCNNIA, m36B4, y los grados de expresión de mSCNNIA son normalizados al grado de m36B4 y el % de reducción del ARNm de mSCNNIA con respecto a un ANci de control no objetivo. Para cada punto, n=3, y las células se cosecharon 24 horas después de la transfección.

CUADRO 4B Examen de ANci de ENaCa en células NIH 3T3 de ratón Nota: Expresión de mSCNNIA, m36B4, y los grados de expresión de mSCNNIA son normalizados al grado de m36B4 y el % de reducción del ARNm de mSCNNIA con respecto a un ANci de control no objetivo. Para cada punto, n=3, y las células se cosecharon 24 horas después de la transfección.

CUADRO 5A Examen de ANci de ENaCa en H-4-II-E de rata Nota: Se muestra la expresión de rSCNNIA, rGAPDH, el grado de expresión de rSCNNIA normalizado al grado de rGAPDH y el % de reducción del ARNm de r ENaCa con respecto a un ANci de control no objetivo (NTC). Para cada punto, n=3, y las células se cosecharon 24 horas después de la transfección.

CUADRO 5B Examen de ANci de ENaCa en H-4-II-E de rata Nota: Se muestra la expresión de rSCNNIA, rGAPDH, el grado de expresión de rSCNNIA normalizado al grado de rGAPDH y el % de reducción del ARNm de r ENaCa con respecto a un ANci de control no objetivo (NTC). Para cada punto, n=3, y las células CUADRO 6 Resumen de la eficacia (%KD) y potencia (CI5o) del knockdown de ARNm de ENaCa para algunos ANci en líneas de células de humano, rata y ratón Los experimentos de RACE confirmaron que las construcciones de ANci que corresponden a los sitios del cuadro 6 mostraron el corte del ARN objetivo mediado por RISC, verificando así que el knockdown del ARN fue el resultado directo de la actividad de iARN.

EJEMPLO 7 Knockdown máximo de ARNm de ENaC y potencia de los ANci de ENaC en células epiteliales bronquiales humanas Preparación del cultivo de células Células epiteliales bronquiales humanas (células NHBE) obtenidas de Lonza (Cat. No. CC-2540) se desarrollaron a 37°C en presencia de 5% de CO2 y se cultivaron en medio basal BEBM (Lonza Cat. No. CC- 3171 ) en matraces revestidos con Biocoat Collagen 1 (Becton Dickinson).

Células U20S-TLR7 humanas y células U20S-TLR8 humanas se desarrollaron a 37° en presencia de 5% de C02 y se cultivaron en medio Eagle modificado de Dulbeco (DMEM), 1 % de aminoácidos no esenciales, suplementado con suero bovino fetal al 10% y 100 ug/ml de estreptomicina y 100u/ml de penicilina. Se mantuvo la expresión estable de TLR7 y TLR8 agregando 300 ug/ml de gentamicina.

La línea de células HEK293 recombinantes (que expresan ENaC beta y gamma), SCNNIB (P618AY620L) + SCNN1 G (P624stop) #24, se desarrolló a 37° en presencia de C02 y se cultivaron en medio M1 , M1 +0.5mg/ml de geneticina y 0.2mg/ml de higromicina.

Transfección Knockdown de ARNm y CE5o en NHBE: Las células se depositaron en placas revestidas con colágeno 1 y se cultivaron en medios de cultivos apropiados. Las células se cultivaron 24 horas después de depositar a 37° en presencia de 5% de C02. Los ANci se diluyeron en OptiMEM 1 a 1 uM y el lípido de suministro GSK212357A a 25ug/ml. Para la formulación de los ANci se combinaron volúmenes iguales del ANci diluido y el lípido de suministro, y se incubaron 20 minutos a temperatura ambiente. Entretanto, las células se sometieron a tripsinación y se resuspendieron en medio BEBM libre de antibiótico a 150,000 células/ml. Se agregaron 20µ? del ANci formulado y 80µ? de medio BEBM por pocilio de una placa de 96 pocilios (6 duplicados/punto dato/concentración de ARNci), a fin de dar una escala de dosis de nueve puntos de los ARNci (100nM, 30nM, 10nM, 3nM, 1 nM, 0.3n , 0.1 nM, 0.03nM, 0.01 nM). El tiempo de incubación con los complejos de GSK212357A-ANci fue de 48 horas, con un cambio de medio a las 24 horas.

Inmunoestimulación mediada por TLR3: Las células NHBE se trataron como arriba para medir la inmunoestimulación mediada por TLR3 endosómico, con la inclusión de Polyl:C como control positivo para la regulación positiva de ARNm de OAS1. Para medir la inmunoestimulación mediada por TLR3 unido a membrana, las células NHBE se cultivaron a 1200 células/por 96 pocilios y los ARNci se administraron en PBS en ausencia de un vehículo de suministro a (100nM, 30nM, 10nM, 3nM, 1 nM, 0.3nM, 0.1 nM, 0.03nM, 0.01nM).

Inmunoestimulación mediada por TLR7 y TLR8: Células de osteosarcoma U20S que expresan TLR7 y TLR8 se sembraron en un formato de placa de 96 pocilios a una concentración de 2xl04 células/pocilio, 24 horas antes de la transfeccion. Las células se transfectaron con los ARNci usando el reactivo de transfeccion de lípido DharmaFECTI , usando Resiquimod (R848) y el oligonucleótido ssRNA40 rico en GU en complejo con LyoVec, respectivamente, como controles (100 µ?/pocillo). El medio de tratamiento se reemplazó después de 6 horas con DMEM que contenía antibiótico. Las células se cosecharon 24 horas después de la transfeccion. R848 y ssRNA40 son agonistas caracterizados de los dos receptores por estimulación; las células de osteosarcoma transformadas mostraron un aumento de la expresión de IL8 en respuesta a la dosis. Se estableció una escala de concentración de agonista de 10pg/ml puesto que esta ocasionó el grado óptimo de expresión de ARNm de IL8 para la prueba. No se observó expresión significativa de IL8 en la línea de células U20S nativas que carecen de TLR, después del tratamiento con los dos agonistas, R848 y ssRNA40.

Se usó DharmaFECTI como el agente de suministro para los ARNci, ya que combina efectos inmunoestimuladores bajos con eficiencia de suministro alta.

Efectos funcionales sobre ENaC por medio de FLIPR en células que sobreexpresan ENaCa: Se usó una metodología de transfección inversa para transfectar la línea celular recombinante HEK. Se combinaron 5µ? de ARNci (diluido en Optimem a la concentración apropiada) con 5µ? del reactivo de transfección de lípido Gemini, diluido en Optimem, en una placa de FLIPR no recubierta de 384 pocilios. Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 20 minutos para permitir la formación del complejo. Las células se cosecharon, se centrifugaron, se diluyeron a 3X105/ml y se depositaron en un formato de placa de 384 pocilios, a 40pl/pocillo (12K/pocillo) que contenía el complejo de transfección. Las placas se incubaron durante la noche durante 20 horas. Después, las células se sometieron a transducción con el virus BacMam que expresa el ENaC alfa (virus BacMam que expresan SCNN1A, GRITS 29703, título de 0.356x 08/ml). Se agregaron 30µ? del virus (1.7%) 20K/pocillo, la MOI fue aproximadamente 1. Las células se incubaron 24 horas. El día de la prueba FLIPR el medio se aspiró, dejando un volumen de 10µ?. Se cargaron 20µ? de colorante por pocilio (colorante azul FMP2 Blue, R8181 , MDS. Para cada cavidad se diluyeron 133 mi de amortiguador Tyrodes para hacer una solución de reserva 1X antes de la prueba). La placa se incubó 0.5 horas a temperatura ambiente y se le agregaron 10µ? del compuesto en línea antes de la lectura de FLIPR (ajustes del FLIPR: protocolo Na MP.fcf, con longitud de exposición de 0.4 s, y filtro No.2). Placa de compuesto: volumen de 1 µ?, columna 1 , 2 y 3 son de concentración final de amilorida 16, 4 y 0 uM (dilución 1/200) (CI80, CI50 y Ctrl). El colorante FMP2/desactivador agregado mide el Na+ en la prueba FLIPR, el inhibidor agregado amiloriada a CI80 (16uM) o CI50 (4uM).

Aislamiento del ARN en la placa de 96 pocilios: Se aislo ARN total de las células en el formato de placa de 96 pocilios usando el sistema automático de aislamiento de ARN total SV96 (Promega), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se usó la estación de trabajo automático Biomek 2000 Laboratory Automation Workstation (Beckman Coulter) para aplicar los lisados celulares transfectados a una membrana de sílice. Después se aplicó DNasa I libre de ribonucleasa directamente a la membrana de sílice para digerir el ADN genómico contaminante. El ARN total unido se purificó adicionalmente de las sales, proteínas e impurezas celulares contaminantes mediante pasos de lavado simples. Finalmente se eluyó de la membrana el ARN total agregando agua libre de nucleasa.

Aislamiento del ARN en la placa de 384 pocilios: Se extrajo el ARNm usando el kit de preparación Qiagen Turbo Capture RNA, siguiendo las instrucciones del fabricante.

RT-PCR cuantitativa (TaqMan): Se usó una serie de sondas e iniciadores para detectar transcritos de ARNm de ENaCa, OASI, IL8 y GAPDH (como control/normalización) en las líneas celulares humanas. Las pruebas se hicieron en un instrumento ABI 7900HT de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las series de sondas de iniciador utilizaron: GAPDH Delantero 5'- CAAGGTCATCCATGACAACTTTG-3' (SEQ ID NO: 128), 'Inverso 5'- GGGCCATCCAC AGTCTTCT-3' (SEQ ID NO: 129), Sonda 5'd FAM- ACCACAGTCCATGCCATCACTGCCA-TAMRA 3' (SEQ ID NO: 130), ENaCa Delantero 5' -ACATCCCAGGAATGGGTCTTC-3' (SEQ ID NO: 131 ), Inverso 5'- ACTTTGGCCACTCCATTTCTCT-3' (SEQ ID NO: 132), Sonda 5'd FAM- TGCTATCGCGACAGAACAATTACACCGTC-TAMRA 3' (SEQ ID NO: 133), OAS1 Delantero 5' -ACCTAACCCCCAAATCTATGTCAA-3' (SEQ ID NO: 134), Inverso 5'-TGGAGAACTCGCCCTCTTTC-3' (SEQ ID NO: 135), Sonda 5'd FAM-CTCATCGAGGAGTGCACCGACCTG-TAMRA 3' (SEQ ID NO: 136), IL8 Delantero 5'- CTGGCCGTGGCTCTCTTG-3' (SEQ ID NO: 137), Inverso 5'-CCTTGGCAAAACTGCACCTT-3' (SEQ ID NO: 138), Sonda 5'd FAM-CAGCCTTCCTGATTTCTGCAGTCTGTG-TAMRA 3' (SEQ ID NO: 139).

Cálculos: TaqMan: Los valores de umbral críticos (Ct) se convirtieron en números de copias que corresponden al gen particular analizado en cada pocilio de la placa de 384 pocilios. Se prepararon seis pocilios idénticos en cada placa para un tratamiento dado. Por lo tanto, se calculó el número promedio de copias de gen y la desviación estándar. La determinación del porcentaje del coeficiente de variación (CV) (% C.V.= [desviación estándar/promedio]*100) permitió la omisión de pocilios cuyo valor era un valor atípico (de tal manera que % C.V. <25). La abundancia relativa (conocida también como expresión relativa) de un gen se determinó dividiendo el número medio de copias de este gen con su contraparte de GAPDH en esa muestra particular.

Análisis estadístico de los datos Se calcularon los valores de CE50 de los datos usando la gráfica sigma. Todos los cálculos de la eficacia y potencia de los ANci se hicieron con respecto al ANci de control no objetivo.

El porcentaje de knockdown se comparó entre los cuatro ANci químicamente modificados (sitio objetivo 1181 , (SEQ ID NOs: 57 y 58), sitio objetivo 782 (SEQ ID NOs: 51 y 52), sitio objetivo 1383 (SEQ ID NOs: 63 y 64), y sitio objetivo 1388 (SEQ ID NOs 73 y 74). Los datos se analizaron usando una prueba de ANOVA y después los valores p se corrigieran por comparaciones múltiples usando la corrección de proporción de descubrimiento falso (FDR). También se produjo una gráfica de 95% de intervalo de confianza para mostrar gráficamente en dónde las guías fueron significativamente diferentes entre sí.

Resultados Se han usado ANci altamente eficaces y potentes para hacer blanco en los sitios 782 (SEQ ID NOs: 51 y 52), 1 181 (SEQ ID NOs: 57 y 58), 1383 (SEQ ID NOs: 63 y 64), y 1388 (SEQ ID NOs: 73 y 74), para demostrar un knock-down (KD) máximo y también dependiente de la dosis del ARNm de ENaCa en células epiteliales bronquiales normales humanas (NHBE).

CUADRO 12 Eficacia (%KD) y potencia (CE ) de ANci que hacen blanco en ENaCa de humano 48 horas después de la transfección Adicionalmente se determinó el porcentaje de aumento de inmunoestimulación mediada por TLR3 en los niveles de ARNm de OAS1 (biomarcador inmunoestimulador) de 4 ANci, a una dosis máxima de 100nM. Se hizo una gráfica de dosis-respuesta de nueve puntos con 0.01-100 nM de ANci.

La inmunoestimulación mediada por TLR3 endosómico se midió registrando el porcentaje de aumento de los niveles de ARNm de OAS1 cuando las células NHBE se transfectaron con los ANci que se habían formulado con el vehículo de suministro (el tensoactivo GSC170 Dab de Gemini, ejemplo 37 de WO 03/82809) (porcentaje de aumento de los niveles de ARNm de OAS1 con respecto al control de vehículo de suministro Gemini). Se usó el agonista de TLR3 Poly I: C como control positivo para la inducción de ARNm de OAS1.

La inmunoestimulación mediada por TLR7 y TLR8 se midió por el aumento de los niveles de ARNm de IL8 cuando los ANci se formularon con DharmaFectl (Gibco BRL) y se suministraron a las células U20S que se construyeron por ingeniería para expresar establemente TLR7 o TLR8. Las células se trataron con los agonistas de TLR7 y TLR8 Resiquimod (R848) y ssRNA40/LyoVec, respectivamente, para actuar como controles positivos para la inducción de ARNm de IL8. Los niveles de ARNm de IL8 se usaron como un biomarcador de la inmunoestimulación mediada por TLR7 y TLR8.

Los resultados del análisis de inmunoestimulación arriba descrito se muestran en las figuras 28 y 29 y en el cuadro 13.

CUADRO 13 Resumen de la actividad inmunoestimuladora deTLR3, TLR7 y TLR8 de los ANci También se probó la capacidad de los ANci de ENaC para inhibir la actividad funcional del ENaC. La figura 30 muestra que la transfección de las células HEK recombinantes con los ANci de ENaC alcanza los sitios 782 y 1 181 , específicamente los ANci que corresponden a las SEQ ID NOs: 51 y 52 y las SEQ ID NOs: 57 y 58, respectivamente.

Se observó una inhibición dependiente de la dosis de la respuesta con ambos ANci de ENaC-alfa. Se observó una inhibición de hasta 90% de la respuesta a la concentración más alta de ANci. El grado de inhibición en la prueba FLIPR se correlaciona con el grado de knockdown del ARNm de ENaC. El knockdown del ARNm de ENaC-alfa de hasta 85% se observó a la concentración más alta de ANci. Los resultados se resumen en el cuadro 14. La transfección con el ANci de control (Ctrl) (UC-3) dio como resultado una inhibición de fondo de 10-30% en comparación con las células no transfectadas en la prueba FLIPR.

CUADRO 14 Resumen de la inhibición de la respuesta en la prueba FLIPR y knockdown del ARNm de ENaC (n=6, datos medios de 3 experimentos independientes) Inhibición de Inhibición de Knockdown la respuesta Motivo de Concentración la respuesta de ARNm de máxima ANci de final de ANci máxima (4uM ENaC-alfa, (16uM de ENaC-alfa de amilorida), (nM) % amilorida), % % 782 10 61.7 37.1 40.8 782 20 67.7 41.4 47.9 782 50 75.1 52.5 59.7 782 100 73.1 81.5 85.2 1 181 10 52.6 43.8 45.8 1 181 20 65.6 48.9 51.4 1 181 50 76.1 62.2 65.5 1 181 100 76.9 77.5 77.5 EJEMPLO 8 Indicaciones El presente cuerpo de conocimiento en la investigación del ENaC indica la necesidad de métodos para determinar la actividad del ENaC y para compuestos que pueden regular la expresión del ENaC para uso de investigación, diagnóstico y terapéutico. Como se describe aquí, las moléculas de ácido nucleico de la presente invención se pueden usar en pruebas para diagnosticar la enfermedad relacionada con los niveles de ENaC. Además, las moléculas de ácido nucleico se pueden usar para tratar la enfermedad relacionada con los niveles de ENaC. Las enfermedades particulares que pueden estar asociadas con la modulación de la expresión de ENaC incluyen, sin limitación, enfermedades, rasgos, condiciones y fenotipos respiratorios, inflamatorios y autoinmunes. Los ejemplos no limitativos de dichas indicaciones se exponen a continuación.

La enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD) es un ejemplo de una enfermedad inflamatoria de las vías respiratorias y alveolar, en donde se piensa que tiene una función la regulación positiva persistente de la inflamación. La inflamación en la COPD se caracteriza por un aumento de la infiltración de neutrófilos, linfocitos CD8 positivos y macrófagos en las vías respiratorias. Los neutrófilos y macrófagos desempeñan una función importante en la patogénesis de la inflamación de las vías respiratorias en la COPD, debido a su capacidad para liberar varios mediadores que incluyen elastasa, metaloproteasa y radicales de oxígeno que promueven inflamación y daño del tejido. Se ha sugerido que la acumulación de células inflamatorias en las vías respiratorias de los pacientes con COPD es impulsada por un aumento en la liberación de citocinas proinflamatorias y quimocinas que atraen a las células inflamatorias a las vías respiratorias, las activan y mantienen su presencia. Las células que están presentes también liberan enzimas (como metaloproteasas) y radicales de oxígeno que pueden tener un efecto negativo sobre el tejido y perpetuar la enfermedad. Se ha mostrado que una basta gama de citocinas proinflamatorias y quimocinas aumentan dentro de los pulmones de los pacientes con COPD. Entre ellas, el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-alfa), el factor estimulador de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF) y la interleucina 8 (IL8), desempeñan una función importante y aumentan en las vías respiratorias de los pacientes con COPD.

Otros ejemplos de enfermedades respiratorias en donde la inflamación parece tener una función incluyen: asma, fibrosis quística, tos eosinofílica, bronquitis, rechazo agudo y crónico de aloinjerto de pulmón, sarcoidosis, fibrosis pulmonar, rinitis, bronquiectasia y sinusitis. El asma se define por la inflamación de las vías respiratorias, obstrucción reversible e hipersensibilidad de las vías respiratorias. En esta enfermedad las células que están implicadas son predominantemente eosinófilos, linfocitos T y mastocitos, aunque también pueden ser importantes los neutrófilos y macrófagos. Se ha mostrado que una vasta gama de citocinas y quimocinas aumentan en las vías respiratorias en esta enfermedad y desempeñan una función en la patofisiología, promoviendo inflamación, obstrucción e hipersensibilidad.

La tos eosinofílica se caracteriza por tos crónica y presencia de células inflamatorias, principalmente eosinófilos, dentro de las vías respiratorias de los pacientes, en ausencia de obstrucción de las vías respiratorias o hipersensibilidad. Varias citocinas y quimocinas aumentan en esta enfermedad, aunque principalmente están dirigidas a eosinófilos. Los eosinófilos son reclutados y activados dentro de las vías respiratorias y posiblemente liberan enzimas y radicales de oxígeno que tienen una función en la perpetuación de la inflamación y la tos.

La bronquitis aguda es una enfermedad aguda que ocurre durante un evento de infección o irritación de las vías respiratorias inferiores, por ejemplo por contaminación, polvo, gas o agentes químicos. La bronquitis crónica se define por la presencia de tos y la producción de flema, la mayoría de los días durante por lo menos tres meses al año, durante dos años. También durante el bronquitis agudo o crónico se pueden encontrar dentro de las vías respiratorias células inflamatorias, principalmente neutrófilos, con una amplia gama de quimocinas y citocinas. Se piensa que estos mediadores tienen una función en la inflamación, los síntomas y la producción de moco que ocurren durante estas enfermedades.

La sarcoidosis es una enfermedad de causa desconocida en donde ocurren granulomas crónicos no caseificantes dentro del tejido. El pulmón es el órgano afectado más comúnmente. El lavado bronquioalveolar del pulmón muestra un aumento principalmente de linfocitos, macrófagos y, algunas veces, neutrófilos y eosinófilos. Estas células también son reclutadas y activadas por citocinas y quimocinas que se piensa que están implicadas en la patogénesis de la enfermedad.

La fibrosis pulmonar es una enfermedad del tejido del pulmón caracterizada por fibrosis progresiva y crónica (cicatrización) que producirá insuficiencia respiratoria crónica. Existen diferentes tipos y causas de la fibrosis pulmonar pero todas se caracterizan por afluencia de células inflamatorias y persistencia, activación y proliferación de fibroblastos con depósito de colágeno en el tejido del pulmón. Parece ser que estos eventos están relacionados con la liberación de citocinas y quimocinas dentro del tejido del pulmón.

La rinitis aguda es una enfermedad aguda que ocurre durante un evento de infección o irritación de la nariz o las vías respiratorias superiores, por ejemplo por contaminación, polvo, gas o agentes químicos. La rinitis crónica se define por la presencia de un catarro crónico constante, congestión nasal, estornudos y prurito. Durante la rinitis aguda o crónica también se pueden encontrar dentro de las vías respiratorias superiores células inflamatorias con una amplia variedad de quimocinas y citocinas. Se piensa que estos mediadores tienen una función en la inflamación, los síntomas y la producción de moco que ocurre durante estas enfermedades.

La sinusitis aguda es una enfermedad aguda, usualmente infecciosa, de los senos paranasales, caracterizada por congestión nasal, catarro, flema purulenta, cefalea o dolor de los senos paranasales, con o sin fiebre. La sinusitis crónica se define por la persistencia de los síntomas de la sinusitis aguda durante más de seis meses. Durante la sinusitis aguda o crónica también se pueden encontrar dentro de las vías respiratorias superiores y los senos paranasales células inflamatorias con una amplia gama de quimocinas y citocinas. Se piensa que estos mediadores tienen una función en la inflamación, los síntomas y la producción de flema que ocurren durante estas enfermedades.

La bronquiectasia es una enfermedad respiratoria caracterizada por vías respiratorias inflamadas de paredes gruesas y dilatadas. El daño de esta enfermedad es el resultado de un ciclo vicioso de inflamación e infecciones que surge por varias causas tales como fibrosis quística, causas diferentes de fibrosis quística, daño posterior a infección, etc. Los síntomas pueden incluir tos crónica, producción de esputo y malestar, ya que las vías respiratorias se infectan crónicamente con bacterias.

Como se describe arriba, todas estas enfermedades inflamatorias respiratorias se caracterizan por la presencia de mediadores que recluían y activan diferentes células inflamalorias que liberan enzimas o radicales de oxígeno que ocasionan síntomas, la presencia de inflamación y, cuando es crónica, destrucción o rompimiento del tejido normal.

EJEMPLO 9 Inhibición de ANci multifuncional de la expresión de ARN objetivo Diseño del ANci multifuncional Una vez que se han identificado los sitios objetivo para las construcciones de ANci multifuncionales, cada cadena del ANci se diseña con una región complementaria de longitud de, por ejemplo, aproximadamente 18 a aproximadamente 28 nucleótidos, que es complementaria a una secuencia de ácido nucleico objetivo diferente. Cada región complementaria se diseña con una región de flanqueo adyacente de aproximadamente 4 a aproximadamente 22 nucleótidos, que no es complementaria a la secuencia objetivo, pero que comprende complementariedad con la región complementaria de la otra secuencia (véanse por ejemplo las figuras 13A y 13B). Similarmente, se pueden diseñar construcciones de horquilla (véanse por ejemplo las figuras 14A y 14B). La identificación de secuencias complementarias, de palíndromo o de repetición que son compartidas entre las diferentes secuencias de ácido nucleico objetivo, se puede usar para acortar la longitud general de las construcciones de ANci multifuncional (véanse por ejemplo las figuras 15A y 15B, y 16A y 16B).

En un ejemplo no limitativo, se presentan tres categorías adicionales de diseños de ANci multifuncionales que permiten que una sola molécula de ANci silencie múltiples objetivos. El primer método utiliza enlazadores para unir ANci (o ANci multifuncionales) de manera directa. Esto puede permitir que los ANci más potentes se unan sin crear un tramo continuo grande de ARN que tiene el potencial de activar una respuesta de interferón. El segundo método es una extensión dendrimérica del traslapo o el diseño multifuncional enlazado; o alternativamente la organización de ANci en un formato supramolecular. El tercer método utiliza longitudes de hélice mayores de 30 pares de bases. El procesamiento de estos ANci por medio de Dicer revelará nuevos extremos de antisentido 5' activos. Por lo tanto, los ANci grandes pueden hacer blanco en los sitios definidos por los extremos 5' originales y los definidos por los extremos nuevos que son creados por procesamiento de Dicer. Cuando se usan en combinación con ANci multifuncionales tradicionales (en donde las cadenas de sentido y antisentido definen, cada una, un objetivo), la propuesta se puede usar por ejemplo para hacer blanco en 4 sitios o más. 1. ANci bifuncionales atados La idea básica es una propuesta novedosa al diseño de ANci multifuncionales en la cual dos cadenas de ANci de antisentido se aparean con una sola cadena de sentido. El oligonucléotido de cadena de sentido contiene un enlazador (por ejemplo enlazador no nucleotídico como aquí se describe), y dos segmentos que se aparean con las cadenas de antisentido de ANci (véanse las figuras 19A-19H). Opcionalmente, los enlazadores también pueden comprender enlazadores basados en nucléotido. Varias ventajas potenciales y variaciones de esta propuesta incluyen, sin limitación: 1 . Los dos ANci de antisentido son independientes. Por lo tanto, la elección de sitios objetivo no está restringida por un requerimiento de conservación de secuencia entre dos sitios. Cualesquiera dos ANci altamente activos se pueden combinar para formar un ANci multifuncional. 2. Cuando se usan en combinación con sitios objetivo que tienen homología, los ANci dirigidos a una secuencia presente en dos genes (por ejemplo isotipos diferentes), el diseño se puede usar para hacer blanco en mas de dos sitios. Por ejemplo, un solo ANci multifuncional se puede usar para hacer blanco en el ARN de dos ARN objetivo diferentes. 3. Los ANci multifuncionales que usan cadenas tanto de sentido como de antisentido para hacer blanco en un gen también se pueden incorporar en un diseño multifuncional atado. Esto deja abierta la posibilidad de hacer blanco en 6 sitios o más dentro de un solo complejo. 4. Puede ser posible aparear más de dos ANci de cadena de antisentido con una sola cadena de sentido atada. 5. El diseño evita tramos continuos grandes de ARNdc. Por lo tanto, es menos probable que inicie una respuesta de interferón. 6. El enlazador (o modificaciones unidas al mismo, tales como los conjugados que aquí se describen) puede mejorar las propiedades farmacocinéticas del complejo o mejorar su incorporación en liposomas. Las modificaciones introducidas al enlazador no deben tener impacto sobre la actividad del ANci en la misma medida en que lo harían si se unen directamente al ANci (véanse por ejemplo las figuras 24 y 25). 7. La cadena de sentido se puede extender mas allá de las cadenas de antisentido apareadas para proveer sitios adicionales de unión de los conjugados. 8. La polaridad del complejo se puede cambiar de tal manera que los dos extremos 3' de antisentido queden adyacentes al enlazador, y los extremos 5' queden distales al enlazador, o combinaciones de los mismos.

ANci de dendrímero y supramoleculares En la propuesta de ANci dendrímero, la síntesis de ANci se inicia sintetizando primero el molde del dendrímero, seguido por la unión de varios ANci funcionales. En la figura 20 se representan varias construcciones. El número de ANci funcionales que se pueden unir está limitado únicamente por las dimensiones del dendrímero usado.

Propuesta supramolecular para ANci multifuncional El formato supramolecular simplifica el desafío de la síntesis del dendrímero. En este formato, las cadenas de ANci son sintetizadas por química de ARN estándar, seguida por apareamiento de varias cadenas complementarias. La síntesis de cadena individual contiene una secuencia de antisentido sentido de un ANci en el extremo 5', seguido por un ácido nucleico o enlazador sintético, tal como hexaetilenglicol, que a su vez va seguido por la cadena de sentido de otro ANci en dirección 5' a 3'. De esta manera, la síntesis de las cadenas de ANci se puede efectuar en una dirección estándar 3' a 5'. En la figura 21 se muestran ejemplos representativos de ANci trifuncionales y tetrafuncionales. Basándose en un principio similar, se pueden diseñar construcciones de ANci de funcionalidad superior, siempre que se logre un apareamiento eficiente de varias cadenas.

ANci multifuncional habilitado por Dicer Utilizando análisis bioinformático de múltiples objetivos, se pueden identificar tramos de secuencias idénticas compartidas entre diferentes secuencias objetivo, que varían de aproximadamente 2 a aproximadamente 14 nucleótidos de longitud. Estas regiones idénticas se pueden diseñar en forma de hélices de ANci extendidas (por ejemplo >30 pares de bases), de tal manera que el procesamiento por Dicer revela un sitio de antisentido 5' secundario funcional (véase por ejemplo la figura 22). Por ejemplo, cuando los 17 primeros nucleótidos de una cadena de antisentido de ANci' (por ejemplo cadenas de 21 nucleótidos en un dúplex con tramos salientes 3'-TT) son complementarios a un ARN objetivo, se observó un silenciamiento fuerte a 25nM. Se observó 80% de silenciamiento con solo 16 nucleótidos de complementariedad en el mismo formato.

La incorporación de esta propiedad en los diseños de ANci de aproximadamente 30 a 40 pares de bases o más, resulta en construcciones de ANci multifuncionales adicionales. El ejemplo de la figura 22 ilustra cómo un dúplex de 30 pares de bases puede hacer blanco en 3 secuencias distintas después de procesamiento por la RNasa Dicer III; estas secuencias pueden estar sobre el mismo ARNm o ARN separados, tales como mensajes de factor viral y hospedero, o múltiples puntos a lo largo de una ruta dada (por ejemplo, cascadas inflamatorias). Además, un dúplex de 40 pares de bases se puede combinar con un diseño bifuncional en tándem, para proveer un solo dúplex que hace blanco en cuatro secuencias objetivo. Una propuesta aún más extensa puede incluir el uso de secuencias homologas para permitir que 5 o 6 objetivos sean silenciados por un dúplex multifuncional. El ejemplo de la figura 22 muestra como se puede lograr esto. Un dúplex de 30 pares de bases es cortado por Dicer en productos de 22 y 8 pares de bases desde cada extremo (fragmentos de 8 pares de bases no mostrados). Para facilidad de presentación, los tramos salientes generados por Dicer no se muestran -pero pueden ser compensados. Se muestran tres secuencias objetivo. La identidad de secuencia requerida traslapada se indica con cuadros en gris. Los N del ANci original de 30 pares de bases son sitios sugeridos de posiciones 2'-OH para permitir el corte de Dicer, si este es probado en químicas estabilizadas. Es de notar que el procesamiento de un dúplex de 30 elementos por RNasa Dicer III no da un corte preciso de 22 + 8, sino que en su lugar produce una serie de productos estrechamente relacionados (siendo 22 + 8 el sitio primario). Por lo tanto, el procesamiento por Dicer producirá una serie de ANci activos. En la figura 23 se muestra otro ejemplo no limitativo. Un dúplex de 40 pares de bases es cortado por Dicer en productos de 20 pares de bases desde cualquier extremo. Para facilidad de presentación, los tramos salientes generados por Dicer no se muestran -pero pueden ser compensados. Se muestran 4 secuencias objetivo en 4 colores, azul, azul claro, rojo y anaranjado. La identidad de secuencia requerida traslapada se indica con cuadros de color gris. Este formato de diseño se puede extender a ARN más grandes. Si los ANci estabilizados químicamente son unidos por Dicer, entonces enlaces de ribonucleótido localizados estratégicamente pueden permitir al diseñador cortar productos que permiten un repertorio más extenso de diseños multifuncionales. Por ejemplo, productos de corte no limitados al estándar de Dicer de aproximadamente 22 nucleótidos pueden permitir construcciones de ANci multifuncionales con un traslapo de identidad de secuencia objetivo que varía por ejemplo de aproximadamente 3 a aproximadamente 15 nucleótidos.

EJEMPLO 10 Usos diagnósticos Las moléculas de ANci de la invención se pueden usar en una variedad de aplicaciones diagnósticas, tales como en la identificación de objetivos moleculares (por ejemplo ARN) en una variedad de aplicaciones, por ejemplo en medios clínicos, industriales, ambientales, agrícolas o de investigación. Dicho uso diagnóstico de las moléculas de ANci implica la utilización de sistemas reconstituidos de i-ARN, por ejemplo usando lisados celulares o lisados celulares parcialmente purificados. Las moléculas de ANci de esta invención se pueden usar como herramientas diagnósticas para examinar la deriva genética y las mutaciones dentro de células enfermas, o para detectar la presencia de ARN endógeno o exógeno, por ejemplo viral, en una célula. La estrecha relación entre la actividad del ANci y la estructura del ARN objetivo permite la detección de mutaciones en cualquier región de la molécula, que altera el apareamiento de bases y la estructura tridimensional del ARN objetivo. Usando las múltiples moléculas de ANci descritas en esta invención se pueden mapear cambios de nucleótido, que son importantes para la estructura y función del ARN in vitro, así como también en células y tejidos. El corte de ARN objetivo con las moléculas de ANci se puede usar para inhibir la expresión de genes y definir la función de productos de gen específicos en el avance de una enfermedad o infección. De esta manera, se pueden definir otros objetivos genéticos como mediadores importantes de la enfermedad. Estos experimentos producirán un mejor tratamiento de la enfermedad produciendo la posibilidad de combinar terapias (por ejemplo moléculas de ANci múltiples dirigidas a genes diferentes, moléculas de ANci acopladas con inhibidores de molécula pequeña conocidos, o tratamiento intermitente con combinaciones de moléculas de ANci u otras moléculas químicas o biológicas). Otros usos in vitro de las moléculas de ANci de esta invención son muy conocidos e incluyen la detección de la presencia de ARNm asociados con una enfermedad, infección o condición relacionada. Dicho ARN se detecta determinando la presencia de un producto de corte después del tratamiento con un ANci, usando métodos estándares, por ejemplo transferencia de emisión de resonancia de fluorescencia (FRET).

En un ejemplo específico, se usan para la prueba moléculas de ANci que cortan solo formas silvestres o mutantes del ARN objetivo. Las primeras moléculas de ANci (es decir, aquellas que cortan solo las formas silvestres del ARN objetivo) se usan para identificar el ARN de tipo silvestre presente en la muestra, y las segundas moléculas de ANci (es decir, aquellas que cortan solo formas mutantes de ARN objetivo) se usan para identificar el ARN mutante en la muestra. Como controles de reacción, substratos sintéticos de ARN tanto silvestre como mutante son cortados por las dos moléculas de ANci para mostrar la eficiencia relativa del ANci en las reacciones, y la ausencia de corte de las especies de ARN "no alcanzadas". Los productos de corte de los substratos sintéticos también sirven para generar marcadores de tamaño para el análisis de ARN de tipo silvestre y mutante en la población de la muestra. De esta manera, cada análisis requiere dos moléculas de ANci, dos substratos, y una muestra desconocida que se combina en seis reacciones. La presencia de productos de corte se determina usando una prueba de protección de RNasa de tal manera que los fragmentos de longitud completa y corte de cada ARN se pueden analizar en un carril de un gel de poliacrilamida. No es absolutamente necesario cuantificar los resultados para obtener información sobre la expresión de ARN mutantes y el riesgo putativo de los cambios fenotípicos deseados en las células objetivo. La expresión de ARNm cuyo producto de proteína está implicado en el desarrollo del fenotipo (es decir, relacionado con la enfermedad o relacionado con la infección), es adecuada para establecer el riesgo. Si se usan sondas de actividad específica comparable para los dos transcritos, entonces es adecuada una comparación cualitativa de las concentraciones de ARN y reduce el costo del diagnóstico inicial. Las proporciones superiores de forma muíante a tipo silvestre se correlacionan con un mayor riesgo si se comparan las concentraciones de ARN cualitativa o cuantitativamente.

Todas las patentes y publicaciones mencionadas en la especificación son indicativas del grado de experiencia de los expertos en la materia a la que pertenece la invención. Todas las referencias citadas en esta descripción se incorporan como referencia en la misma medida que si cada referencia se hubiera incorporado individualmente en su totalidad como referencia.

El experto en la materia apreciará fácilmente que la presente invención está bien adaptada para lograr los objetivos y ventajas mencionadas, así como las inherentes a las mismas. Los métodos y composiciones aquí descritas actualmente son representativas de las modalidades preferidas, y son ejemplares y no se consideran limitaciones del alcance de la invención. A los expertos en la materia se les ocurrirán cambios y otros usos que están abarcados dentro del espíritu de la invención, definida por el alcance de las reivindicaciones.

Será evidente para el experto en la materia que se pueden hacer diversas sustituciones y modificaciones a la invención descrita sin apartarse del alcance y espíritu de la invención. De esta manera, dichas modalidades adicionales están dentro del alcance de la presente invención y las siguientes reivindicaciones. La presente invención enseña al experto en la materia a probar varias combinaciones o sustituciones de las modificaciones químicas descritas en la presente para generar construcciones de ácido nucleico con actividad mejorada para mediar la actividad de i-ARN. Dicha actividad mejorada puede comprender estabilidad mejorada, biodisponibilidad mejorada, o activación mejorada de respuestas celulares que median la i-ARN. Por lo tanto, las modalidades específicas aquí descritas no son limitativas y el experto en la materia puede apreciar fácilmente qué combinaciones específicas de las modificaciones aquí descritas se pueden probar sin mayor experimentación para identificar moléculas de ANci con actividad mejorada de i-ARN.

La invención descrita ilustrativamente en la presente puede ser practicada convenientemente en ausencia de cualquier elemento o limitación que no sea descrita específicamente en la presente. De esta manera, por ejemplo, en cada caso cualquiera de los términos "que comprende", "que consiste esencialmente en", y "que consiste en" puede ser reemplazado con cualquiera de los otros dos términos. Los términos y expresiones que se han usado son descriptivos y no limitativos, y no tienen la intención de excluir cualquier equivalente de las características mostradas y descritas o porciones de las mismas, sino que se reconoce que son posibles varias modificaciones dentro del alcance de la invención reclamada. De esta manera, se debe entender que aunque la presente invención ha sido descrita específicamente por medio de modalidades preferidas, los expertos en la materia pueden diseñar características, modificaciones y variaciones opcionales de los conceptos aquí descritos, y que dichas modificaciones y variaciones se consideran dentro del alcance de esta invención definida por la descripción y las reivindicaciones anexas.

Además, cuando las características o aspectos de la invención se describen en función de los grupos de Markush u otros agrupamientos de alternativas, los expertos en la materia reconocerán que la invención también se describe así en función de cualquier miembro individual o subgrupo de miembros del grupo de Markush u otro grupo.

EJEMPLO 11 Preparación de formulaciones de ANci/vehículo encapsulados con nanopartícula Preparación general de LNP Se prepararon soluciones de nanopartícula de ANci disolviendo moléculas de ANci o vehículo en solución amortiguadora de citrato 25 mM (pH 4.0) a una concentración de 0.9 mg/ml. Se prepararon soluciones de lípido disolviendo una mezcla de lípido catiónico (por ejemplo CLinDMA o DOBMA, véanse las estructuras y proporciones de las formulaciones en el cuadro 10), DSPC, colesterol, y PEG-DMG (proporciones mostradas en el cuadro 10), en etanol absoluto, a una concentración de aproximadamente 15 mg/ml. La proporción de nitrógeno a fosfato fue de aproximadamente 3:1.

Se suministró un volumen igual de soluciones de ANci/vehículo y lípido con dos bombas de FPLC a las mismas velocidades de flujo, a un conector T de mezclado. Se usó una válvula de contrapresión para ajustar al tamaño de partícula deseado. La mezcla lechosa resultante se recogió en una botella de vidrio estéril. Después, esta mezcla se diluyó lentamente con un volumen igual de la solución amortiguadora de citrato, y se filtró a través de una membrana de intercambio iónico para remover cualquier ANci /vehículo libre en la mezcla. Se utilizó ultrafiltración contra la solución amortiguadora de citrato (pH 4.0) para remover el etanol (tira de prueba de ALCO-screen), y contra PBS (pH 7.4) para intercambiar el amortiguador. El LNP final se obtuvo concentrando a un volumen deseado y se filtró en estéril a través de un filtro de 0.2pm. Los LNP obtenidos se caracterizaron en función del tamaño de partícula, el potencial zeta, contenido de alcohol, contenido total de lípido, ácido nucleico encapsulado y concentración total de ácido nucleico.

Procedimiento de fabricación de LNP En un ejemplo no limitativo se prepara una formulación de LNP-086 ANci /vehículo a granel de la siguiente manera. En la figura 32 se muestra un diagrama de flujo del procedimiento que se puede adaptar para cocteles de ANci /vehículo (se muestran dos dúplex de ANci /vehículo) o para un solo dúplex de ANci /vehículo. El procedimiento consiste en (1 ) preparar una solución de lípido; (2) preparar una solución de ANci /vehículo; (3) mezclado/formación de partícula; (4) incubación; (5) dilución; (6) ultrafiltración y concentración. 1. Preparación de la solución de lípido Resumen: A un matraz de fondo redondo de 3 cuellos equipado con un condensador se le agregó una mezcla de CLinDMA, DSPC, colesterol, PEG-DMG, y alcohol linoleílico. Después se le agregó etanol. La suspensión se agitó con una barra agitadora bajo argón y se calentó a 30°C usando una mantilla de calentamiento controlada con un controlador de proceso. Después de que la suspensión se hizo transparente, la solución se dejó enfriar a temperatura ambiente.

Procedimiento detallado para formular un lote de LNP de 8 L 1 . Despirogenar un matraz de fondo redondo de 3 cuellos de 2L, un condensador, probetas y dos recipientes cónicos de vidrio de 10L. 2. Calentar los lipidos a temperatura ambiente. Tarar el peso del matraz de fondo redondo. Transferir el CLinDMA (50.44g) con una pipeta, usando un auxiliar de pipeta, al matraz de fondo redondo de 3 cuellos. 3. Pesar el DSPC (43.32g), colesterol (5.32g) y PEG-DMG (6.96g) con un papel de pesada secuencialmente hacia el matraz de fondo redondo. 4. En un frasco de vidrio separado (despirogenado) se pesa alcohol linoleílico (2.64g). Tarar el primer frasco y después transferir el compuesto al frasco con una pipeta. 5. Tomar el peso total del matraz de fondo redondo con los lípidos, restar el peso de la tara. Usualmente el error fue mucho menor de ± 1.0%. 6. Transferir una octava parte del etanol (1 L) necesario para la solución de lípido al matraz de fondo redondo. 7. El matraz de fondo redondo puesto en una mantilla de calentamiento se conecta a un controlador de proceso J-CHEM. La suspensión de lípidos se agita bajo argón con una barra agitadora y un condensador encima. Se pone una sonda de termopar en la suspensión a través de un cuello del matraz de fondo redondo con un adaptador sellado. 8. La suspensión se calentó a 30°C hasta que se hizo transparente. La solución se dejó enfriar a temperatura ambiente y se transfirió a un recipiente de vidrio cónico y se selló con una tapa. 2 Preparación de la solución de ANci /vehículo.

Resumen: La solución de ANci /vehículo puede comprender un solo dúplex de ANci o vehículo, o alternativamente puede comprender un coctel de dos o mas dúplex de ANci o vehículos. En el caso de un solo dúplex de ANci /vehículo, el ANci /vehículo se disuelve en una solución amortiguadora de citrato 25mM (pH 4.0, 100mM de NaCI) para dar una concentración final de 0.9 mg/ml. En el caso de un coctel de dos moléculas de ANci /vehículo, las soluciones de ANci /vehículo se preparan disolviendo cada molécula de ANci /vehículo en 50% del volumen total esperado de una solución amortiguadora de citrato 25mM (pH 4.0, 100m de NaCI), para dar una concentración final de 0.9 mg/ml. Este procedimiento se repitió para la otra molécula de ANci /vehículo. Las dos soluciones de ANci /vehículo de 0.9 mg/ml se combinaron para dar una solución de 0.9 mg/ml al volumen total que contenía dos moléculas de ANci.

Procedimiento detallado para formular un lote de 8L de LNP con un coctel de ANci. 1. Pesar 3.6 g por el factor de corrección de agua (aproximadamente 1.2) del polvo de ANcí-1 en un recipiente estéril tal como una botella de almacenamiento Corning. 2. Transferir el ANci a un recipiente de vidrio despirogenado de 5L. Enjuagar el recipiente de pesada 3x con solución amortiguadora de citrato (25mM, pH 4.0 y 100mM NaCI), poniendo los enjuagues en el recipiente de 5L, es. con solución amortiguadora de citrato a 4L. 3. Determinar la concentración de la solución de ANci con el espectrómetro de UV. En general, tomar 20 µ? de la solución, diluir 50 veces a 1000 µ? y registrar la lectura de UV a A260 nm después de blanquear con solución amortiguadora de citrato. Hacer una muestra paralela y medir. Si las lecturas para las dos muestras son consistentes, tomar un promedio y calcular la concentración basándose en los coeficientes de extinción de los ANci. Si la concentración final está fuera de la escala de 0.90 ± 0.01 mg/ml, ajustar la concentración agregando mas ANci /vehículo en polvo, o agregar más solución amortiguadora de citrato. 4. Repetir para el ANci 2. 5. En un recipiente de vidrio despirogenado de 10L transferir 4L de cada solución de ANci 0.9 mg/ml.

Filtración en estéril El procedimiento describe el procedimiento para filtrar en estéril la solución de lipido/etanol. La finalidad es proveer un material inicial estéril para el proceso de encapsulación. El proceso de filtración se corrió a una escala de 80 mi con un área de membrana de 20 cm2. La velocidad de flujo es de 280 ml/min. Este proceso es escalable aumentando el diámetro de la tubería y el área de la filtración. 1. Materiales a) Tubería de silicón Nalgene 50 PN 8060-0040, esterilizada en autoclave. b) Bomba peristáltica Master Flex modelo 7520-40. i) Cabeza de bomba Master Flex modelo 7518-00. c) Filtro estéril Pall Acropak 20 0.8/0.2µ?? PN 2203. d) Recipiente de vidrio despirogenado de 10L. e) Tapa esterilizada en autoclave para el recipiente de vidrio. 2. Procedimiento a) Poner la tubería en la cabeza de la bomba. Poner la bomba a 50% de la velocidad total de la bomba y medir el flujo durante 1 minuto con una probeta. b) Ajustar los parámetros de la bomba y medir el flujo a 280 ml/min. c) Acoplar la tubería con el filtro, montar firmemente con unas pinzas. d) Acoplar la bomba y poner la tubería en la cabeza de la bomba. e) Poner el extremo de alimentación de la tubería en el material que se va a filtrar. f) Poner el lado del filtrado del filtro con la campana de llenado hacia el recipiente de vidrio despirogenado. g) Bombear el material a través del filtro hasta filtrar todo el material.

Montaje de la bomba AKTA 1. Materiales a) Bomba AKTA P900. b) Tubería de teflón 2mm ID x 3 mm OD 2 cada uno x 20.5 cm Upchurch PN 1677. c) Tubería de teflón 1 mm ID x 3 mm OD 6.5cm Upchurch PN 1675. d) Té Peek 1 mm ID 1 cada uno Upchurch PN P-714. e) ¼ - 28F a 10-32M 2 cada uno Upchurch PN P-652. f) ETFE Ferrule para tubería de OD 3.0 mm 6 cada uno Upchurch PN P-343x. g) Tuerca Flangless 6 cada una Upchurch PN P-345x. h) Tapa ETFE para accesorio de fondo plano ¼ - 28 cada uno Upchurch PN P-755 i) Gas argón comprimido, j) Regulador 0-0.41 MPa. k) Tubería de teflón.

I) Conexión Y Peek. m) Material de vidrio despirogenado base cónica 2/bomba. n) Tapas esterilizadas en autoclave, o) Tapas de presión. 2. Acoplamiento de la bomba a) Encender la bomba. b) Dejar que la bomba realice la autoprueba c) Asegurarse de que no haya tapas ni reguladores de presión montados en la tubería (esto ocasionaría sobrepresión en las bombas). d) Oprimir "OK" para sincronizar las bombas. e) Girar la perilla 4 clics a la derecha a "Setup" -oprimir "OK". f) Girar la perilla 5 clics a la derecha a "Setup Gradient Mode" -oprimir "OK". g) Girar la perilla un clic a la derecha a "D" -oprimir "OK". h) Oprimir "Esc" dos veces. 3. Sanitización de la bomba a) Colocar 1000 mi de NaOH 1 N en un recipiente de vidrio de 1 L. b) Montar una tapa de presión en la bomba. c) Poner 1000 mi de etanol al 70% en un recipiente de vidrio de 1 L. d) Montar una tapa de presión en la bomba. e) Colocar un recipiente de vidrio de 2000 mi debajo de la salida de la bomba. f) Girar la perilla 1 clic a la derecha a "Set Flow Rate" -oprimir "OK". g) Girar la perilla a la derecha para aumentar la velocidad de flujo a 40 ml/min; a la izquierda para reducir; oprimir "OK" cuando se desee fijar la velocidad de flujo. h) Poner el tiempo de 40 minutos. i) Abrir el gas argón a 0.07 MPa. j) Girar la perilla 2 clics a la izquierda a "Run" -oprimir "OK" e iniciar el temporizador. k) Girar la perilla 1 clic a la izquierda a "End Hold Pause". I) Cuando suena el temporizador oprimir "OK" en la bomba. m) Cerrar el gas. n) Guardar la bomba en soluciones sanitizadoras hasta que esté lista para usarse (¿durante la noche?). 4. Verificación del flujo de la bomba a) Poner 200 mi de etanol en una botella de vidrio despirogenada de 500 mi. b) Montar una tapa de presión en la bomba. c) Poner 200 mi de solución amortiguadora de citrato estéril en una botella de vidrio de 500 mi despirogenada. d) Montar una tapa de presión en la bomba. e) Poner una probeta de 100 mi debajo de la salida de la bomba. f) Girar la perilla 1 clic a la derecha a "Set Flow Rate" -oprimir "OK". g) Girar la perilla a la derecha para aumentar la velocidad de flujo a 40 ml/min; a la izquierda para reducir; oprimir "OK" cuando se desee fijar la velocidad de flujo. h) Poner el tiempo para 1 minuto. i) Abrir el gas argón a 0.07 MPa. j) Girar la perilla 2 clics a la izquierda a "Run" -oprimir "OK" e iniciar el temporizador. k) Girar la perilla 1 clic a la izquierda a "End Hold Pause".

I) Cuando suena el temporizador oprimir "OK" en la bomba. m) Cerrar el gas. n) Verificar que se hallan suministrado 40 mi de la solución de etanol/citrato. 3. Formación de partícula -paso de mezclado o) Montar en la bomba AKTA la solución estéril de lípido/etanol. p) Montar en la bomba AKTA el ANci /vehículo o coctel de ANci /vehículo/solución amortiguadora de citrato estériles. q) Montar la tapa en el recipiente despirogenado recibido (tamaño de lote 2x). r) Poner el tiempo de mezclado calculado. s) Abrir el gas argón y mantener la presión entre 0.034 y 0.07 MPa. t) Girar la perilla 2 clics a la izquierda a "Run" -oprimir ??" e iniciar el temporizador. u) Girar la perilla 1 clic a la izquierda a "End Hold Pause". v) Cuando suena el temporizador oprimir "OK" en la bomba. w) Cerrar el gas. 4. Incubación La solución se mantiene después de mezclar durante una incubación de 22 + 2 horas. La incubación es a temperatura ambiente (20-25°C) y la solución en proceso se protege de la luz. 5. Dilución La solución de lípido y ANci se diluye con un volumen igual de solución amortiguadora de citrato. La solución se diluye con una bomba peristáltica de doble cabeza, se acopla con longitudes iguales de tubería y una conexión de Te. La velocidad de flujo es de 360 ml/minuto. 1. Materiales h) Tubería de silicón Nalgene 50 PN 8060-0040, esterilizada en autoclave. i) Té 6.35 mm ID j) Bomba peristáltica Master Flex modelo 7520-40. i) Cabeza de bomba Master Flex modelo 7518-00. ii) Cabeza de bomba Master Flex modelo 7518-00. k) Recipiente de vidrio despirogenado 2 x 20 L.

I) Tapas esterilizadas en autoclave para los recipientes de vidrio. 2. Procedimiento a) Montar dos longitudes iguales de la tubería en el conector de Te. La tubería debe ser de aproximadamente 1 metro de longitud.

Montar una tercera pieza de la tubería aproximadamente 50 cm hacia el extremo de salida del conector de Te. b) Poner el aparato de tubería en las cabezas dobles de bomba. c) Poner un extremo de la alimentación del aparato de tubería hacia una solución de etanol. Poner el otro extremo de alimentación hacia un volumen igual de solución amortiguadora de citrato. d) Poner el control de velocidad de la bomba a 50%. Poner un tiempo para 1 minuto. e) Poner el extremo de salida del aparato de tubería hacia una probeta de 500 mi. f) Encender la bomba e iniciar el temporizador. g) Cuando suena el temporizador detener la bomba y determinar el volumen suministrado. h) Ajustar la velocidad de flujo de la bomba a 360 ml/minuto. i) Drenar la tubería cuando se fija la velocidad de flujo. j) Poner un extremo de la alimentación del aparato de tubería hacia la solución de lípido/ANci. Poner el otro extremo de alimentación hacia un volumen igual de solución amortiguadora de citrato (16L). k) Poner el extremo de salida del aparato de tubería hacia el primero de los recipientes de vidrio despirogenado de 20 L.

I) Poner el temporizador para 90 minutos y encender la bomba. Monitorear visualmente el avance de la dilución para asegurarse de que las velocidades de flujo sean iguales. m) Cuando el recipiente receptor está en 16L, cambiar al siguiente recipiente y recoger 16L. n) Detener la bomba cuando todo el material haya sido transferido. 6. Ultrafiltración y concentración Resumen: El proceso de ultrafiltración es un proceso cronometrado y las velocidades de flujo se deben monitorear cuidadosamente. El área de la membrana se ha determinado basándose en el volumen del lote. Este es un proceso de dos pasos; el primero es un paso de concentración tomando el material diluido de 32L a 3600 mi y una concentración de aproximadamente 2 mg/ml. El paso de concentración es de 4 horas ±15 minutos. El segundo paso es un paso de diafiltración que intercambia la solución amortiguadora de citrato y etanol en solución salina amortiguadora de fosfato. El paso de diafiltración es de 3 horas y nuevamente se deben monitorear cuidadosamente las velocidades de flujo. Durante este paso la concentración de etanol se monitorea mediante GC del espacio superior. Después de 3 horas (20 volúmenes de diafiltración) se hace una segunda concentración para concentrar la solución a aproximadamente 6 mg/ml o un volumen de 1.2 litros. Este material se recoge en un recipiente de vidrio despirogenado. El sistema se enjuaga con 400 mi de PBS a velocidad de flujo alta y se cierra el forro permeable. Este material se recoge y se añade a la primera recolección. La concentración esperada en este punto es de 4.5 mg/ml. Se determina la concentración y el volumen final. 1. Materiales x) Bomba Quatroflow. y) Sistema Flexstand con depósito de 5 L esterilizado en autoclave. z) Membrana de ultrafiltración GE PN UFP- 100-C-35A. aa) PBS filtrada a 0.05 µ?t?, 100 L bb) Hidróxido de sodio 0.5 N. ce) WFI dd) Tubería de silicón Nalgene 50 PN 8060-0040 esterilizada en autoclave. ee) Bomba peristáltica Master Flex modelo 7520-40. i) Cabeza de bomba Master Flex modelo 7518-00. ff) Recipientes de recolección permeables de capacidad 100 L. gg) Probetas despirogenadas 2 L, 1 L, 500 mi. 2. Procedimiento a) Preparación del sistema i) Instalar la membrana en el soporte Flexstand usando los accesorios sanitarios del tamaño apropiado para la membrana. Montar el Flexstand en la bomba Quatroflow. Montar la tubería en las conexiones de producto retenido y penetrado y poner estas en un recipiente de desecho adecuado. ii) Determinar el volumen de retención del sistema. 1 . Poner 1 litro de WFI en el depósito. 2. Sujetar la línea de producto permeado. 3. Iniciar la bomba Quatroflow y reciclar hasta que no haya burbujas en la línea del producto retenido. Detener la bomba. 4. Marcar el depósito y registrar la lectura para 1 litro. 5. Agregar 200 mi de WFI al depósito y marcar el nivel de 1200 mi. iii) Agregar 3 litros de hidróxido de sodio 0.5 N al depósito y lavar a través del producto retenido al desecho. Agregar 3 L de hidróxido de sodio 0.5 N al depósito; reciclar la línea de producto retenido y lavar a través del producto permeado al desecho. Agregar 3 L de hidróxido de sodio 0.5 N al depósito y reciclar a través de la línea de producto permeado al depósito durante 30 minutos. Guardar el sistema en hidróxido de sodio 0.5 N durante la noche antes de usarse. iv) Lavar el hidróxido de sodio al desecho. v) Agregar 3 L de WFI al depósito y lavar el producto retenido al desecho hasta que el pH sea neutro, reemplazar el WFI en caso necesario. Regresar la línea de producto retenido al depósito. vi) Agregar 3 litros de WFI y lavar la línea de producto permeado al desecho hasta que el pH sea neutro, reemplazando el WFI en caso necesario. Drenar el sistema. vii) Agregar 3 litros de sol. amortiguadora de citrato al depósito. Lavar a través de la línea de producto permeado hasta que el pH sea <5. Agregar sol. amortiguadora de citrato en caso necesario. viii) Drenar el sistema, b) Concentración de LNP i) Poner una longitud adecuada de tubería en la cabeza de la bomba peristáltica. ii) Poner el extremo de alimentación hacia la solución de LNP diluida; poner el otro extremo en el depósito. iii) Bombear la solución de LNP diluida al depósito hasta la marca de 4 litros. ¡v) Poner la línea de producto permeado en un recipiente de desecho limpio. v) Arrancar la bomba Quatroflow y ajustar la velocidad de la bomba de modo que la velocidad de flujo del producto permeado sea de 300 ml/min. vi) Ajustar la bomba peristáltica a 300 ml/min de modo que el nivel de líquido sea constante a 4 L en el depósito. vii) Cuando se haya transferido toda la solución de LNP diluido al depósito detener la bomba peristáltica. viii) Concentrar la solución de LNP diluido a 3600 mi en 240 minutos, ajustando la velocidad de la bomba conforme sea necesario. ix) Monitorear la velocidad de flujo del producto permeado, los ajustes de la bomba y las presiones de alimentación y producto retenido. c) Diafiltración de LNP i) Poner la tubería de alimentación de la bomba peristáltica en un recipiente que contiene 72 L de PBS (filtrada por 0.05 pm). ¡i) Arrancar la bomba peristáltica y ajustar la velocidad de flujo para mantener un volumen constante de 3600 mi en el depósito. iii) Aumentar la velocidad de flujo de la bomba Quatroflow a 400 ml/min. iv) Monitorear la velocidad de flujo del producto permeado, los ajustes de la bomba y las presiones de alimentación y del producto retenido. v) Monitorear la concentración de etanol por medio de GC. vi) La solución de LNP se diafiltra con PBS (20 volúmenes) durante 180 minutos. vii) Detener la bomba peristáltica. Retirar la tubería del depósito. d) Concentración final i) Concentrar la solución de LNP a la marca de 1.2 L. ii) Recoger la solución de LNP en una probeta despirogenada de 2 L. iii) Agregar 400 mi de PBS al depósito. iv) Arrancar la bomba y reciclar 2 minutos. v) Recoger el enjuague y añadirlo a la solución de LNP recogida en la probeta. vi) Registrar el volumen de la solución de LNP. vii) Transferir a un recipiente de vidrio despirogenado de 2 L. viü) Etiquetar y refrigerar, e) Limpiar el sistema i) Agregar 1 L de WFI al depósito. ii) Reciclar 5 min con el producto permeado cerrado. iii) Drenar el sistema. iv) Agregar 2 L de hidróxido de sodio 0.5 N al depósito. v) Reciclar 5 minutos. vi) Drenar el sistema vii) Agregar 2 L de hidróxido de sodio 0.5 N al depósito. viü) Reciclar durante 5 min y detener la bomba. ix) Neutralizar el sistema con WFI. x) Drenar el sistema y desechar la membrana.

Los LNP obtenidos se caracterizaron en función de su tamaño de partícula, potencial zeta, contenido de alcohol, contenido total de lípido, ácido nucleico encapsulado y concentración total de ácido nucleico.

CUADRO 7 Números de Registro de ENaC NM_001038- SEO. ID NO: 127 ARNm, canal de sodio no controlado por voltaje 1 alfa (SCNN1A) de Homo sapiens gil47834319lreflNM_001038.4l[47834319] - Versión 4, actualizado el 14 de mayo de 2006 NM_000336 ARNm, canal de sodio no controlado por voltaje 1 beta (SCNN1 B) de Homo sapiens, gill2430 195lreflNM_000336.2l[124301195] NM_1 130413 ARNm, canal de sodio de Homo sapiens, no controlado por voltaje 1 delta (SCNN1 D), variante de transcrito 1 gill94353988lreflNM_001 130413.1 l[194353988] NM_002978 ARNm, canal de sodio no controlado por voltaje 1 delta (SCNN1 D) de Homo sapiens, variante de transcrito 2, gil34 01281 lreflNM_002978.2l[34101281 ] NM_001039 ARNm, canal de sodio no controlado por voltaje 1 gamma (SCNN1 G) de Homo sapiens gill48839327lreflNM_001039.31(148839327] DQ898177 ARNm, canal de sodio no controlado por voltaje 1 delta (SCNN1 D) de Homo sapiens, 5' UTR gilí l4325733lgblDQ898177.1 l[114325733] DQ898176 ARNm, canal de sodio no controlado por voltaje 1 delta (SCNN1 D) de Homo sapiens clon 16HBE140L, cds completo gilí I4325731 lgblDQ898 76.11[ 4325731 ] DQ898175 ARNm, canal de sodio no controlado por voltaje 1 delta (SCNN1 D) de Homo sapiens clon 16HBE140S, cds completo gilí l4325729lgblDQ898175. 1[114325729] NM_031548 ARNm, canal de sodio no controlado por voltaje alfa tipo I (Scnnla) de Rattus norvegicus gil47575865lreflNMJJ31548.2?G47575865] NM_01 1324 ARNm, canal de sodio no controlado por voltaje 1 alfa (Scnnla) de Mus musculus gil33859617lreflNMJJH324.1 l[33859617] CUADRO 8 Ejemplos no limitativos de químicas de estabilización para construcciones de ANci químicamente modificado Química Pirimidina Purina casquete p=S Cadena "Stab 00" Ribo Ribo TT en S/AS extremos 3' "Stab 1 " Ribo Ribo - 5 en extremo 5' S/AS 1 en extremo 3' "Stab 2" Ribo Ribo - todos los enlaces Usualmente AS "Stab 3" 2'-fluoro Ribo - 4 en extremo 5' Usualmente S 4 en extremo 3' "Stab 4" 2'-fluoro Ribo extremos 5' y - Usualmente S 3' "Stab 5" 2'-fluoro Ribo - 1 en extremo 3' Usualmente AS "Stab 6" 2'-0-Metil Ribo extremos 5' y - Usualmente S 3' "Stab 7" 2'-fluoro 2'-desox¡ extremos 5' y - Usualmente S 3' "Stab 8" 2'-ftuoro 2'-0-Metil - 1 en extremo 3' S/AS "Stab 9" Ribo Ribo extremos 5' y - Usualmente S 3' "Stab 10" Ribo Ribo - 1 en extremo 3' Usualmente AS "Stab 11 " 2'-fluoro 2'-desoxi - 1 en extremo 3' Usualmente AS "Stab 12" 2'-fluoro LNA extremos 5' y Usualmente S 3' "Stab 13" 2'-fluoro LNA 1 en extremo 3' Usualmente AS "Stab 14" 2'-fluoro 2'-desox¡ 2 en extremo 5' Usualmente AS 1 en extremo 3' "Stab 15" 2'-desox¡ 2'-desoxi 2 en extremo 5' Usualmente AS "Stab 16" Ribo 2'-0- etil extremos 5' y Usualmente S 3' "Stab 17" 2'-0-Metil 2'-0-Metil extremos 5' y Usualmente S 3' "Stab 18" 2'-fluoro 2'-0-Metl extremos 5' y Usualmente S 3' "Stab 19" 2'-fluoro 2'-0- etil extremo 3' S/AS "Stab 20" 2'-fluoro 2'-desox¡ extremo 3' Usualmente AS "Stab 21 " 2'-fluoro Ribo extremo 3' Usualmente AS "Stab 22" Ribo Ribo extremo 3' Usualmente AS "Stab 23" 2'-fluoro* 2'-desoxi* extremos 5' y Usualmente S 3' "Stab 24" 2'-fluoro* 2'-0-Metil* - 1 en extremo 3' S/AS "Stab 25" 2'-fluoro* 2'-0-Metil* - 1 en extremo 3' S/AS "Stab 26" 2'-fluoro* 2'-0-Metil* - S/AS "Stab 27" 2'-fluoro* 2'-0-Metir extremo 3' S/AS "Stab 28" 2'-fluoro* 2'-0- etir extremo 3' S/AS "Stab 29" 2'-fluoro* 2'-0- etil* 1 en extremo 3' S/AS CUADRO 8 (Continuación) Química Pirimidina Purina casquete p=S Cadena "Stab 30" 2'-fluoro* 2 -O-Metil* S/AS "Stab 31 " 2'-fluoro* 2 -O-Metil* extremo 3' S/AS "Stab 32" 2'-fluoro 2'-0-Metil S/AS "Stab 33" 2'-fluoro 2'-desox¡* extremos 5' y - Usualmente S 3' "Stab 34" 2'-fluoro 2 -O-Metil* extremos 5' y Usualmente S 3' "Stab 35" 2'-fluoro*T 2'-0- etil*T Usualmente AS "Stab 36" 2'-fluoro*T 2'-0-Metil*T Usualmente AS "Stab 3F" 2'-OCF3 Ribo - 4 en extremo 5' Usualmente S 4 en extremo 3' "Stab 4F" 2'-OCF3 Ribo extremos 5' y - Usualmente S 3' "Stab 5F" 2'-OCF3 Ribo - 1 en extremo 3' Usualmente AS "Stab 7F" 2'-OCF3 2'-desoxi extremos 5' y - Usualmente S 3' "Stab 8F" 2'-OCF3 2'-0-Metil - 1 en extremo 3' S/AS "Stab 11 F" 2'-OCF3 2'-desoxi - 1 en extremo 3' Usualmente AS "Stab 12F" 2'-OCF3 LNA extremos 5' y Usualmente S 3' "Stab 13F" 2'-OCF3 LNA 1 en extremo 3' Usualmente AS "Stab 14F" 2'-OCF3 2'-desoxi 2 en extremo 5' Usualmente AS 1 en extremo 3' "Stab 15F" 2'-OCF3 2'-desoxi 2 en extremo 5' Usualmente AS 1 en extremo 3' "Stab 18F" 2'-OCF3 2'-0-Metil extremos 5' y Usualmente S 3' "Stab 19F" 2'-OCF3 2'-0-Metil extremo 3' S/AS "Stab 20F" 2'-OCF3 2'-desoxi extremo 3' Usualmente AS "Stab 21 F" 2'-OCF3 Ribo extremo 3' Usualmente AS "Stab 23F" 2'-OCF3* 2'-desox¡* extremos 5' y Usualmente S 3' "Stab 24F" 2'-OCF3* 2'-0-Metil* - 1 en extremo 3' S/AS "Stab 25F" 2'-OCF3* 2'-0-Metil* - 1 en extremo 3' S/AS "Stab 26F" 2'-OCF3* 2'-0-Metil* - S/AS "Stab 27F" 2'-OCF3* 2'-0-Metil* extremo 3' S/AS "Stab 28F" 2'-0CF3* 2'-0-Metil* extremo 3' S/AS "Stab 29F" 2'-OCF3* 2'-0-Metil* 1 en extremo 3' S/AS "Stab 30F" 2'-OCF3* 2 -O-Metil* S/AS "Stab 31 F" 2'-OCF3* 2'-0-Metil* extremo 3' S/AS "Stab 32F" 2'-OCF3 2'-0-Metil S/AS "Stab 33F" 2'-OCF3 2'-desoxi* extremos 5' y - Usualmente S 3' "Stab 34F" 2'-OCF3 2'-0-Metil* extremos 5' y Usualmente S 3' "Stab 35F" 2'-OCF3*T 2'-0-Metil*T Usualmente AS "Stab 36F" 2'-OCF3*T 2'-0-Metil*r Usualmente AS Notas: CAP = cualquier casquete terminal, véase por ejemplo la figura 7.

Todas las químicas Stab 00-34 pueden comprender residuos de timidina 3' -terminales (TT) Todas las químicas Stab 00-34 normalmente comprenden aproximadamente 21 nucleótidos, pero puede variar como se describe en la presente.

Todas las químicas Stab 00-36 también pueden incluir un solo ribonucleótido en la cadena de sentido o pasajero en la posición de 1 1a base apareada del dúplex de ácido nucleico de doble cadena determinado desde el extremo 5' de la cadena de antisentido o guía (véase la figura 6C) S = cadena de sentido AS = cadena de antisentido *Stab 23 tiene un solo ribonucleótido adyacente a 3'-CAP *Stab 24 y Stab 28 tienen un solo ribonucleótido en el extremo 5' *Stab 25, Stab 26, Stab 27, Stab 35 y Stab 36 tienen tres ribonucleótidos en el extremo 5' *Stab 29, Stab 30, Stab 31 , Stab 33, y Stab 34 cualquier purina en las primeras tres posiciones de nucleótido desde el extremo 5' son ribonucleótidos p = enlace de fosforotioato †Stab 35 tiene 2 -O-metil U en tramos salientes 3' y tres ribonucleótidos en el extremo 5' †Stab 36 tiene tramos salientes 2'-0-metilo que son complementarías a la secuencia objetivo (tramos salientes naturales) y tres ribonucleótidos en el extremo 5'.

CUADRO 9 A- Ciclo de síntesis de 2.5 µ????, instrumento ABI 394 Reactivo Equivalentes Cantidad Tiempo Tiempo espera * Tiempo espera espera* ADN 2'-0-metil *ARN Fosforamiditas 6.5 163 ML 45 s 2.5 min 7.5 min S-Etil-tetrazol 23.8 238 uL 45 s 2.5 min 7.5 min Anhídrido 100 233 ML 5 s 5 s 5 s acético N-Metilimidazol 186 233 uL 5 s 5 s 5 s TCA 176 2.3 mL 21 s 21 s 21 s Yodo 1 1 .2 1 .7 mL 45 s 45 s 45 s Beaucage 12.9 645 uL 100 s 300 s 300 s Acetonitrilo NA 6.67 mL NA NA NA B- Ciclo de síntesis de 0.2 µ????, instrumento ABI 394 C- Ciclo de síntesis de 0.2 µ?t???, instrumento de 96 pocilios El tiempo de espera no incluye tiempo de contacto durante el suministro La síntesis en tándem utiliza acoplamiento doble de la molécula enlazadora CUADRO 10 Formulaciones de nanopartícula de lípido (LNP) Formulación Composición Proporción molar No.

L051 CLinDMA / DSPC / Col / PEG-n-DMG 48/40/10/2 L053 DMOBA / DSPC / Col / PEG-n-DMG 30/20/48/2 L054 DMOBA / DSPC / Col / PEG-n-DMG 50/20/28/2 L069 CLinDMA / DSPC / Colesterol / PEG- 48/40/ 10/2 Colesterol L073 pCLinDMA o CLin DMA/ DMOBA / DSPC / 25/25/20/28/2 Col / PEG-n-DMG L077 eCLinDMA / DSPC / Colesterol / 2KPEG-Col 48/40/10/2 L080 eCLinDMA / DSPC / Colesterol / 2KPEG- 48/40/10/2 DMG L082 pCLinDMA / DSPC / Colesterol / 2KPEG- 48/40/ 10/2 DMG L083 pCLinDMA / DSPC / Colesterol / 2KPEG-Col 48/40/10/2 L086 CLinDMA/DSPC/Colesterol/2KPEG- 43/38/ 10/2/7 DMG/alcohol linoleílico L061 DMLBA/Colesterol/2KPEG-DMG 52/45/3 L060 DMOBA/Colesterol/2KPEG-DMG proporción 52/45/3 N/P de 5 L097 DMLBA/DSPC/Colesterol/2KPEG-DMG 50 / 20 / 28 L098 DMOBA/Colesterol/2KPEG-DMG, proporción 52/45/3 N/P de 3 L099 DMOBA/Colesterol/2KPEG-DMG, proporción 52/45/3 N/P de 4 L100 DMOBA/DOBA/3% PEG-DMG, proporción 52/45/3 N/P de 3 L101 DMOBA/Colesterol/2KPEG-Colesterol 52/45/3 L102 DMOBA/Colesterol/2KPEG-Colesterol, 52/45/3 proporción N/P de 5 L103 DMLBA/Colesterol/2KPEG-Colesterol 52/45/3 L104 CLinDMA/DSPC/Colesterol/2KPEG- 43/38/10/2/7 colesterol/ alcohol linoleílico L105 DMOBA/Colesterol/2KPEG-Col, proporción 52/45/3 N/P de 2 L106 DMOBA/Colesterol/2KPEG-Col, proporción 67/30/3 N/P de 3 L107 DMOBA/Colesterol/2KPEG-Col, proporción 52/45/3 N/P de 1.5 L108 DMOBA/Colesterol/2KPEG-Col, proporción 67/30/3 N/P de 2 L109 DMOBADSPC/Colesterol/2KPEG-Col, 50 / 20/28 / 2 proporción N/P de 2 CUADRO 10 (Continuación) Formulación Composición Proporción molar No.

L110 DMOBA/Colesterol/2KPEG-DMG, proporción 52/45/3 N/P de 1.5 L111 DMOBA/Colesterol/2KPEG-DMG, proporción 67/30/3 N/P de 1.5 L112 DMLBA/Colesterol/2KPEG-DMG, proporción 52/45/3 N/P de 1.5 L113 DMLBA/Colesterol/2KPEG-DMG, proporción 67 /30 / 3 N/P de 1.5 L114 DMOBA/Colesterol/2KPEG-DMG, proporción 52/45/3 N/P de 2 L115 DMOBA/Colesterol/2KPEG-DMG, proporción 67/30/3 N/P de 2 L116 DMLBA/Colesterol/2KPEG-DMG, proporción 52/45/3 N/P de 2 L117 DMLBA/Colesterol/2KPEG-DMG, proporción 52/45/3 N/P de 2 L118 LinCDMA/DSPC/Colesterol/2KPEG-DMG/ 43/38/10/2/7 alcohol linoleilico, proporción N/P de 2.85 L121 2-CLIM/DSPC/Colesterol/2KPEG-DMG/, 48/40/10/2 proporción N/P de 3 L122 2-CLI / Colesterol/2KPEG-DMG/, proporción 68/30/2 N/P de 3 L123 CLinDMA/DSPC/Colesterol/2KPEG-DMG/ 43/38/ 10/3/7 alcohol linoleilico, proporción N/P de 2.85 L124 CLinDMA/DSPC/Colesterol/2KPEG-DMG/ 43/36/ 10/4/7 alcohol linoleilico, proporción N/P de 2.85 L130 CLinDMA / DOPC / Col / PEG-n-DMG, 48/39/10/3 proporción N/P de 3 L131 DMLBA/Colesterol/2KPEG-DMG, proporción 52/43/5 N/P de 3 L132 DMOBA/Colesterol/2KPEG-DMG, proporción 52/43/5 N/P de 3 L133 CLinDMA / DOPC / Col / PEG-n-DMG, 48/40/10/2 proporción N/P de 3 L134 CLinDMA / DOPC / Col / PEG-n-DMG, 48/37/10/5 proporción N/P de 3 L149 COIM/DSPC/Colesterol/2 PEG-DMG/, 48/40/10/2 proporción N/P de 3 L155 CLinDMA/DOPC/Colesterol/2KPEG- 43/38/10/2/7 DMG/Linoleil alcohol, proporción N/P de 2.85 L156 CLinDMA/DOPC/Colesterol/2KPEG-DMG, 45/43/10/2 proporción N/P de 2.85 CUADRO 10 (Continuación) Formulación Composición Proporción molar No.

L162 CLinDMA/DOPC/Colesterol/2KPEG-DMG, 45/43/10/2 proporción N/P de 2.5 L163 CLinDMA/DOPC/Colesterol/2KPEG-DMG, 45/43/ 10/2 proporción N/P de 2 L164 CLinD A/DOPC/Colesterol/2KPEG-DMG, 45/43/10/2 proporción N/P de 2.25 L165 CLinDMA/DOPC/Colesterol/2KPEG-DMG, 40/43/15/2 proporción N/P de 2.25 L166 CLinDMA/DOPC/Colesterol/2KPEG-DMG, 40/43/15/2 proporción N/P de 2.5 L167 CLinDMA/DOPC/Colesterol/2KPEG-DMG, 40/43/15/2 proporción N/P de 2 L174 CünDMA/DSPC/DOPC/Colesterol/2KPEG- 43/9/27/ 10/4/7 DMG/ alcohol linoleílico, proporción N/P de 2.85 L175 CLinDMA/DSPC/DOPC/Colesterol/2KPEG- 43/27/9/ 10/4/7 DMG/ alcohol linoleílico, proporción N/P de 2.85 L176 CLinDMA/DOPC/Colesterol/2KPEG-DMG/ 43/38/10/4/7 alcohol linoleílico, proporción N/P de 2.85 L180 CLinD A/DOPC/Colesterol/2KPEG-DMG/ 43/38/10/4/7 alcohol linoleílico, proporción N/P de 2.25 L181 CLinDMA/DOPC/Colesterol/2KPEG-DMG/ 43/38/10/4/7 alcohol linoleílico, proporción N/P de 2 L182 CLinDMA/DOPC/Colesterol/2KPEG-DMG, 45/41 / 10/4 proporción N/P de 2.25 L197 CODMA/DOPC/Colesterol/2KPEG-DMG, 43/36/10/4/7 proporción N/P de 2.85 L198 CLinD A/DOPC/Colesterol/2KPEG- 43/34/10/4/2/7 DMG/2KPEG-DSG/alcohol linoleílico, proporción N/P de 2.85 L199 CLinDMA/DOPC/Colesterol/2KPEG- 43/34/ 10/6/7 DMG/alcohol linoleílico, proporción N/P de 2.85 L200 CLinDMA/Colesterol/2KPEG-DMG, 50/46/4 proporción N/P de 3.0 L201 CLinD A/Colesterol/2KPEG-DMG, 50/44/6 proporción N/P de 3.0 L206 CLinDMA/Colesterol/2 PEG-DMG, 40/56/4 proporción N/P de 3.0 CUADRO 10 (Continuación) Proporción N/P = proporción de Nitrógeno/Fósforo entre el lípido catiónico y el ácido nucleico El 2KPEG utilizado es PEG2000, una polidispersión que normalmente puede variar de -1500 a -3000 Da (es decir, en donde PEG(n) es de aproximadamente 33 a aproximadamente 67, o en promedio -45).

CUADRO 11 Estructura de CLinDMA Estructura de pCLinDMA Estructura de eCLinD A Estructura de DEGCLinDMA Estructura de PEG-n-DMG n = aproximadamente 33 a 67, promedio = 45 para 2KPEG/PEG2000 Estructura de DMOBA Estructura de DMLBA Estructura de DSPC Estructura de colesterol Estructura de 2KPEG-Colesterol n = aproximadamente 33 a 67, promedio = 45 para 2KPEG/PEG2000 Estructura de 2KPEG-DMG n = aproximadamente 33 a 67, promedio = 45 para 2KPEG/PEG2000 Estructura de COI M Estructura de 5-CLIM y 2-CLIM

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Una molécula de ácido nucleico (ANci) de doble cadena que tiene una primera cadena y una segunda cadena que son complementarias entre sí, en donde por lo menos una cadena comprende: 5'- UGUGCAACCAGAACAAAUC -3' (SEQ ID NO: 10); 5'- GAUUUGUUCUGGUUGCACA -3' (SEQ ID NO: 107); 5'- UUAUGGAUGAUGGUGGCUU -3' (SEQ ID NO: 13); 5'- AAGCCACCAUCAUCCAUAA -3' (SEQ ID NO: 124); 5'- GUGUGGCUGUGCCUACAUC -3' (SEQ ID NO: 16); 5'- GAUGUAGGCACAGCCACAC -3' (SEQ ID NO: 125) 5'- GCUGUGCCUACAUCUUCUA -3' (SEQ ID NO: 21 ); o 5'- U AGAAGAU G U AGGCACAGC -3' (SEQ ID NO: 126); y en donde opcionalmente uno o más de los nucleótidos están químicamente modificados.

2. - La molécula de ácido nucleico (ANci) de doble cadena de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque ninguno de los nucleótidos está modificado.

3. - Una molécula de ácido nucleico (ANci) de doble cadena que comprende la estructura SIX' que tiene una cadena de sentido y una cadena de antisentido: B NX3 (?)?2 ? -3· ? (?)? 1 ??4 [?]?5 -5' SIX' en donde: la cadena superior es la cadena de sentido y las cadena inferior es la cadena de antisentido de la molécula de ácido nucleico de doble cadena; dicha cadena de antisentido comprende una secuencia que tiene complementariedad con la SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 21 , y dicha cadena de sentido comprende una secuencia que tiene complementariedad con la cadena de antisentido; cada N es independientemente un nucleótido que no está modificado o está modificado químicamente; cada B es una porción de casquete terminal que está presente o ausente; (N) representa nucleótidos salientes, cada uno de los cuales, independientemente, no está modificado o es un 2'-O-metil-nucleótido, 2'-desoxi-2'-fluoro-nucleótido o 2'-desoxirribonucleótido; [N] representa nucleótidos que son ribonucleótidos; X1 y X2 son independientemente enteros de 0 a 4; X3 es un entero de 17 a 36; X4 es un entero de 1 1 a 35, siempre que la suma de X4 + X5 sea 17-36; X5 es un entero de 1 a 6; y en donde: (a) cada nucleótido de pirimidina en las posiciones NX4 es independientemente un 2'-desoxi-2'-fluoro-nucleótido o un 2'-O-met¡l-nucleótido; cada nucleótido de purina en las posiciones ??4 es independientemente un 2'-O-metil-nucleótido o un 2'-desoxirribonucleótido; (b) cada nucleótido de pirimidina en las posiciones ??3 es un 2'-desoxi-2'-fluoro-nucleótido; cada nucleótido de purina en las posiciones ??3 es independientemente un 2'-desoxirribonucleótido o un 2'-0-metil-nucleótido.

4. - La molécula de ácido nucleico (ANci) de doble cadena de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada además porque X5 es 3.

5. - La molécula de ácido nucleico (ANci) de doble cadena de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada además porque X1 es 2.

6. - La molécula de ácido nucleico (ANci) de doble cadena de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada además porque X5 es 3, X1 es 2 y X2 es 2.

7. - La molécula de ácido nucleico (ANci) de doble cadena de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada además porque X5 es 3, X1 es 2, X2 es 2, X3 es 19 y X4 es 16.

8. - Una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) de doble cadena en donde el ANci es: 5'- BuGuGcAAccAGAAcAAAucTTB -3' (Sentido) (SEQ ID NO:51 ) I I I I I I I I I I I I i I I I I I I 3'- UUACACGUUGGUCUUGUUUAG -5' (Antisentido) (SEQ ID NO:52) en donde: cada B es una porción abásica invertida de casquete; c es una 2'-desoxi-2'-fluorocitidina; u es 2'-desoxi-2'-fluorouridina; A es una 2'- desoxiadenosina; G es una 2'-desoxiguanosina; T es una timidina; A es adenosina; G es guanosina; U es uridina; A es una 2'-0-metil-adenosina; G es una 2'-0-metil-guanosina; U es una 2'-0-metil-uridina; y los enlaces internucleotídicos no están modificados o están modificados químicamente.

9. - La molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) de doble cadena de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada además porque los enlaces internucleotídicos no están modificados.

10. - Una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) de doble cadena en donde el ANci es: 5 ' - BUUAUGGAUGAU GGUGGCUUTTB -3 ' (Sentido) (SEQ ID NO:57) I I I I I I I I I I I I I I I I I I I 3 ' UUAAUACCUACUACCAC CGAA -5 ' (Antisentido) (SEQ ID NO:58) en donde: cada B es un casquete abásico invertido; c es una 2'- desoxi-2'-fluorocitidina; u es 2'-desoxi-2'-fluorouridina; A es una 2'-desoxiadenosina; G es una 2'-desoxiguanosina; T es una timidina; A es adenosina; G es guanosina; A es una 2'-0-metil-adenosina; U es una 2'-0- metil-uridina; y los enlaces internucleotídicos no están modificados o están modificados químicamente.

1 1.- La molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) de doble cadena de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada además porque los enlaces internucleotídicos no están modificados.

12.- Una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) de doble cadena en donde el ANci es: 5 ' BGuGuGGcuGuGccuAcAucTTB 3 ' (Sentido) (SEQ ID NO:63) M I I I I I I I I I I I I I I I I I 3 ' uucAcAccGAcAcGGAuGUAG 5 ' (Antisentido) (SEQ ID NO:64) en donde: cada B es una porción abásica invertida de casquete; c es una 2'-desoxi-2'-fluorocitidina; u es 2'-desoxi-2'-fluorourid¡na; A es una 2'- desoxiadenosina; G es una 2'-desoxiguanosina; T es una timidina; A es adenosina; G es guanosina; U es uridina; A es una 2'-0-metil-adenosina; G es una 2'-0-metil-guanosina; U es una 2'-0-metil-uridina; y los enlaces internucleotídicos no están modificados o están modificados químicamente.

13.- La molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) de doble cadena de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada además porque los enlaces internucleotídicos no están modificados.

14.- Una molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) de doble cadena, en donde el ANci es: 5'- B GCU GUGC CUACAUCUUCUATTB -3' (Sentido) (SEQ ID NO:73) I I I I I I I I M I I I I I I I I I 3' uucGAcAcGGAuGuAGAAGAU -5 ' (Antisentido) (SEQ ID NO:74) en donde: cada B es una porción abásica invertida de casquete; c es una 2'-desoxi-2'-fluorocit¡dina; u es 2'-desoxi-2'-fluorouridina; A es una 2'-desoxiadenosina; G es una 2'-desoxiguanosina; T es una timidina; A es adenosina; G es guanosina; U es uridina; A es una 2'-0-metil-adenosina; G es una 2'-0-metil-guanosina; U es una 2'-0-metil-uridina; y los enlaces internucleotídicos no están modificados o están modificados químicamente.

15.- La molécula de ácido nucleico corto de interferencia (ANci) de doble cadena de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada además porque los enlaces internucleotídicos no están modificados.

16.- Una molécula de ácido nucleico (ANci) de doble cadena que comprende la estructura SX' que tiene una cadena de sentido y una cadena de antisentido: B NX3 (?)?2 B -3' B (?)?, NX4 [N]X5 -5' SX' en donde: la cadena superior es la cadena de sentido y la cadena inferior es la cadena de antisentido de la molécula de ácido nucleico de doble cadena; dicha cadena de antisentido comprende una secuencia que tiene complementariedad con la SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 16, o SEQ ID NO: 21 , y dicha cadena de sentido comprende una secuencia que tiene complementariedad con la cadena de antisentido; cada N es independientemente un nucleótido que no está modificado o está modificado químicamente; cada B es una porción de casquete terminal que está presente o ausente; (N) representa nucleótidos salientes, cada uno de los cuales, independientemente, no está modificado o es un 2'-O-metil-nucleótido, 2'-desoxi-2'-fluoro-nucleótido, o 2'-desoxirribonucleótido; [N] representa nucleótidos que son ribonucleótidos; X1 y X2 son independientemente enteros de 0 a 4; X3 es un entero de 17 a 36; X4 es un entero de 1 1 a 35, siempre que la suma de X4 + X5 sea 17-36; X5 es un entero de 1 a 6; y en donde: (a) cada nucleótido de pirimidina en las posiciones NX es independientemente un 2'-desoxi-2'-fluoro-nucleótido o un 2'-O-metil-nucleótido; cada nucleótido de purina en las posiciones NX4 es un 2'-O-metil-nucleótido; (b) cada nucleótido de pirimidina en las posiciones ??3 es un ribonucleótido; cada nucleótido de purina en las posiciones NX3 es un ribonucleótido.

17.- Una molécula de ácido nucleico (ANci) de doble cadena que comprende la estructura SXI' que tiene una cadena de sentido y una cadena de antisentido: B NX3 (?)?2 B -3' B (N)X 1 NX4 [N]X5 -5' SXI' en donde: la cadena superior es la cadena de sentido y la cadena inferior es la cadena de antisentido de la molécula de ácido nucleico de doble cadena; dicha cadena de antisentido comprende una secuencia que tiene complementariedad con la SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 16, o SEQ ID NO: 21 , y dicha cadena de sentido comprende una secuencia que tiene complementariedad con la cadena de antisentido; cada N es independientemente un nucleótido que no está modificado o está modificado químicamente; cada B es una porción de casquete terminal que está presente o ausente; (N) representa nucleótidos salientes, cada uno de los cuales, independientemente, no está modificado o es un 2'-O-metil-nucleótido, 2'-desoxi-2'-fluoro-nucleótido, o 2'-desoxirribonucleótido; [N] representa nucleótidos que son ribonucleótidos; X1 y X2 son independientemente enteros de 0 a 4; X3 es un entero de 17 a 36; X4 es un entero de 1 1 a 35, siempre que la suma de X4 + X5 sea 17-36; X5 es un entero de 1 a 6; y en donde: (a) cada nucleótido de pirimidina en las posiciones NX4 es independientemente un 2'- desoxi-2'-fluoro-nucleót¡do o un 2'-0-met¡l-nucleótido; cada nucleótido de purina en las posiciones NX4 es un 2'-0-metil-nucleótido; (b) cada nucleótido de pirimidina en las posiciones NX3 es un 2'-desoxi-2'-fluoro-nucleótido; cada nucleótido de purina en las posiciones ??3 es un ribonucleótido.

18.- Una molécula de ácido nucleico (ANci) de doble cadena que comprende la estructura SXII' que tiene una cadena de sentido y una cadena de antisentido: B NX3 (N)X2 B -3' B (N)x, NX4 [N]X5 -5' sxir en donde: la cadena superior es la cadena de sentido y la cadena inferior es la cadena de antisentido de la molécula de ácido nucleico de doble cadena; dicha cadena de antisentido comprende una secuencia que tiene complementariedad con la SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 16, o SEQ ID NO: 21 , y dicha cadena de sentido comprende una secuencia que tiene complementariedad con la cadena de antisentido; cada N es independientemente un nucleótido que no está modificado o está modificado químicamente; cada B es una porción de casquete terminal que está presente o ausente; (N) representa nucleótidos salientes, cada uno de los cuales, independientemente, no está modificado o es un 2'-O-metil-nucleótido, 2 -desoxi-2'-fluoro-nucleótido, o 2'-desoxirribonucleótido; [N] representa nucleótidos que son ribonucleótidos; X1 y X2 son independientemente enteros de 0 a 4; X3 es un entero de 17 a 36; X4 es un entero de 1 a 35, siempre que la suma de X4 + X5 sea 17-36; X5 es un entero de 1 a 6; y en donde: (a) cada nucleótido de pirimidina en las posiciones ??4 es independientemente un 2 -desox¡-2'-fluoro-nucleótido o un 2'-0-metil-nucleótido; cada nucleótido de purina en las posiciones ??4 es un 2'-0-metil-nucleótido; (b) cada nucleótido de pirimidina en las posiciones ? 3 es un 2'-desoxi-2'-fluoro-nucleótido; cada nucleótido de purina en las posiciones ??3 es un 2'-desoxirribonucleótido.

19 - Una molécula de ácido nucleico (ANci) de doble cadena que comprende la estructura SXIII' que tiene una cadena de sentido y una cadena de antisentido: B NX3 (N)X2 B -3' B (N)xi NX4 [N]X5 -5' SXIII' en donde: la cadena superior es la cadena de sentido y la cadena inferior es la cadena de antisentido de la molécula de ácido nucleico de doble cadena; dicha cadena de antisentido comprende una secuencia que tiene complementariedad con la SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 16, o SEQ ID NO: 21 , y dicha cadena de sentido comprende una secuencia que tiene complementariedad con la cadena de antisentido; cada N es independientemente un nucleótido que no está modificado o está modificado químicamente; cada B es una porción de casquete terminal que está presente o ausente; (N) representa nucleótidos salientes, cada uno de los cuales, independientemente, no está modificado o es un 2'-O-metil-nucleótido, 2'-desoxi-2'-fluoro-nucleótido, o 2'-desoxirribonucleótido; [N] representa nucleótidos que son ribonucleótidos; X1 y X2 son independientemente enteros de 0 a 4; X3 es un entero de 17 a 36; X4 es un entero de 1 1 a 35, siempre que la suma de X4 + X5 sea 17-36; X5 es un entero de 1 a 6; y en donde: (a) cada nucleótido de pirimidina en las posiciones ??4 es un nucleótido que tiene una configuración de ribo, de Northern o de hélice A; cada nucleótido de purina en las posiciones ?? es un 2'-0-metil-nucleótido; (b) cada nucleótido de pirimidina en las posiciones ??3 es un nucleótido que tiene una configuración de ribo, de Northern o de hélice A; cada nucleótido de purina en las posiciones NX3 es un 2'-0-metil-nucleótido.

20.- Una composición farmacéutica que comprende el ácido nucleico de doble cadena (ANci) de la reivindicación 1 , en un vehículo o diluente farmacéuticamente aceptable.

21 - Una composición farmacéutica que comprende la molécula de ácido nucleico de doble cadena (ANci) de la reivindicación 3, en un vehículo o diluente farmacéuticamente aceptable.

22. - Una composición farmacéutica que comprende la molécula de ácido nucleico de doble cadena (ANci) de la reivindicación 8, en un vehículo o diluente farmacéuticamente aceptable.

23. - Una composición farmacéutica que comprende la molécula de ácido nucleico de doble cadena (ANci) de la reivindicación 10, en un vehículo o diluente farmacéuticamente aceptable.

24. - Una composición farmacéutica que comprende la molécula de ácido nucleico de doble cadena (ANci) de la reivindicación 12, en un vehículo o diluente farmacéuticamente aceptable.

25. - Una composición farmacéutica que comprende la molécula de ácido nucleico de doble cadena (ANci) de la reivindicación 14, en un vehículo o diluente farmacéuticamente aceptable.

26. - Una composición farmacéutica que comprende la molécula de ácido nucleico de doble cadena (ANci) de la reivindicación 16, en un vehículo o diluente farmacéuticamente aceptable.

27.- Una composición farmacéutica que comprende la molécula de ácido nucleico de doble cadena (ANci) de la reivindicación 17, en un vehículo o diluente farmacéuticamente aceptable.

28. - Una composición farmacéutica que comprende la molécula de ácido nucleico de doble cadena (ANci) de la reivindicación 18, en un vehículo o diluente farmacéuticamente aceptable.

29. - Una composición farmacéutica que comprende la molécula de ácido nucleico de doble cadena (ANci) de la reivindicación 19, en un vehículo o diluente farmacéuticamente aceptable.

30. - Una composición farmacéutica que comprende la molécula de ácido nucleico de doble cadena (ANci) de la reivindicación 3, que está adaptada para suministro inhalado.

31.- Una composición farmacéutica que comprende la molécula de ácido nucleico de doble cadena (ANci) de la reivindicación 8, que está adaptada para suministro inhalado.

32 - Una composición farmacéutica que comprende la molécula de ácido nucleico de doble cadena (ANci) de la reivindicación 10, que está adaptada para suministro inhalado.

33 - Una composición farmacéutica que comprende la molécula de ácido nucleico de doble cadena (ANci) de la reivindicación 12, que está adaptada para suministro inhalado.

34 - Una composición farmacéutica que comprende la molécula de ácido nucleico de doble cadena (ANci) de la reivindicación 14, que está adaptada para suministro inhalado.

35. - El uso de la molécula de ácido nucleico de doble cadena (ANci) de la reivindicación 3, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un sujeto humano que padece una condición que es mediada por la acción, o pérdida de la acción, de ENAC.

36. - El uso de la molécula de ácido nucleico de doble cadena (ANci) de la reivindicación 8, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un sujeto humano que padece una condición que es mediada por la acción, o pérdida de la acción, de ENaC.

37. - El uso de la molécula de ácido nucleico de doble cadena (ANci) de la reivindicación 10, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un sujeto humano que padece una condición que es mediada por la acción, o pérdida de la acción, de ENaC.

38. - El uso de la molécula de ácido nucleico de doble cadena (ANci) de la reivindicación 12, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un sujeto humano que padece una condición que es mediada por la acción, o pérdida de la acción, de ENaC.

39. - El uso de la molécula de ácido nucleico de doble cadena (ANci) de la reivindicación 14, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un sujeto humano que padece una condición que es mediada por la acción, o pérdida de la acción, de ENaC.

40. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 35, en donde la condición es una enfermedad respiratoria.

41. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 36, en donde la condición es una enfermedad respiratoria.

42. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 37, en donde la condición es una enfermedad respiratoria.

43. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 38, en donde la condición es una enfermedad respiratoria.

44. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 39, en donde la condición es una enfermedad respiratoria.

45. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 40, en donde la enfermedad respiratoria se selecciona del grupo que consiste en COPD, asma, fibrosis quística, tos eosinofílica, bronquitis, sarcoidosis, fibrosis pulmonar, rinitis, sinusitis y bronquiectasia.

46.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 41 , en donde la enfermedad respiratoria se selecciona del grupo que consiste en COPD, asma, fibrosis quística, tos eosinofílica, bronquitis, sarcoidosis, fibrosis pulmonar, rinitis, sinusitis y bronquiectasia.

47.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 42, en donde la enfermedad respiratoria se selecciona del grupo que consiste en COPD, asma, fibrosis quística, tos eosinofílica, bronquitis, sarcoidosis, fibrosis pulmonar, rinitis, sinusitis y bronquiectasia.

48. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 43, en donde la enfermedad respiratona se selecciona del grupo que consiste en COPD, asma, fibrosis quística, tos eosinofílica, bronquitis, sarcoidosis, fibrosis pulmonar, rinitis, sinusitis y bronquiectasia.

49. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 44, en donde la enfermedad respiratoria se selecciona del grupo que consiste en COPD, asma, fibrosis quística, tos eosinofílica, bronquitis, sarcoidosis, fibrosis pulmonar, rinitis, sinusitis y bronquiectasia.

50. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 45, en donde la enfermedad respiratoria se selecciona del grupo que consiste en COPD, fibrosis quística, bronquiectasia y asma.

51.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 46, en donde la enfermedad respiratoria se selecciona del grupo que consiste en COPD, fibrosis quística, bronquiectasia y asma.

52. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 47, en donde la enfermedad respiratoria se selecciona del grupo que consiste en COPD, fibrosis quística, bronquiectasia y asma.

53. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 48, en donde la enfermedad respiratoria se selecciona del grupo que consiste en COPD, fibrosis quística, bronquiectasia y asma.

54. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 49, en donde la enfermedad respiratoria se selecciona del grupo que consiste en COPD, fibrosis quística, bronquiectasia y asma.