JP2013172714A - プロテインキナーゼ３の発現を阻害するための手段 - Google Patents

プロテインキナーゼ３の発現を阻害するための手段 Download PDF

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Abstract

【課題】プロテインキナーゼ３（ＰＫＮ３）の発現を阻害するのに適した二本鎖核酸を提供する。
【解決手段】第１の鎖と第２の鎖とを含み、第１の鎖は、隣接するヌクレオチドからなる第１のストレッチを含み、該第１のストレッチは、少なくとも部分的に標的核酸と相補的であり、第２の鎖は、隣接するヌクレオチドからなる第２のストレッチを含み、該第２のストレッチは、少なくとも部分的に第１のストレッチと相補的である二本鎖構造を含む核酸分子で、かつ標的核酸は、ＰＫＮ３をコードしているｍＲＮＡである。
【選択図】なし

Description

本発明は、プロテインキナーゼ３（ＰＫＮ３）の発現を阻害するのに適した二本鎖核酸
およびその使用に関する。
発癌は、多段階の生物学的プロセスとしてＦｏｕｌｄｓにより記載され（Ｆｏｕｌｄｓ
，１９５８）、それは現在、遺伝子の損傷の蓄積により起こることが知られている。分子
レベルでは、多段階プロセスの腫瘍形成は正と負の両方の調節エフェクターの破壊を伴う
（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，１９８９）。ヒト結腸癌腫の分子基盤には、多数の癌遺伝子、腫瘍
抑制遺伝子および修復遺伝子が関与していることが、Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎおよび共同研
究者らにより仮定されている（Ｆｅａｒｏｎ ａｎｄ Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，１９９０
）。同様に、網膜芽細胞腫の発生を導く欠損は別の腫瘍抑制遺伝子に関連付けられている
（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，１９８７）。さらに他の癌遺伝子および腫瘍抑制因子が様々な
他の悪性腫瘍において同定されている。残念ながら、治療可能な癌の数は依然として少な
く、癌の作用は壊滅的である。米国だけでも毎年５０万人を超える人が亡くなっている。
癌は、基本的に細胞ＤＮＡへの損傷が細胞の増殖を制御する正常な機構の崩壊を導く遺
伝病である。腫瘍抑制因子がゲノムの完全性を維持する作用機序の２つは、細胞停止によ
るものであり、それによって、損傷したＤＮＡの修復またはアポトーシスにより損傷した
ＤＮＡの除去を可能にする（Ｅｌｌｉｓｅｎ およびＨａｂｅｒ，１９９８）。アポトー
シスは別に「プログラムされた細胞死」とも呼ばれ、不可逆的に損傷した細胞を除去する
ことを目的とする細胞の自殺プログラムとしてはたらく生化学的現象の綿密に調節された
ネットワークである。アポトーシスは、腫瘍壊死因子の結合、ＤＮＡ損傷、増殖因子の離
脱、およびＦａｓ受容体の抗体架橋結合を含む、多数の方法で誘発され得る。アポトーシ
スのプロセスに役割を果たすいくつかの遺伝子が同定されているが、アポトーシスを導く
経路はまだ完全に解明されていない。多くの研究者らは、このような遺伝子が新生細胞に
選択的にアポトーシスを誘導し、患者において癌を治療する手段をもたらすという目的を
持って、新規なアポトーシス促進遺伝子を同定しようと試みた。癌を治療するための代替
的なアプローチは、エンドスタチン（商標）または抗ＶＥＧＦ抗体などの薬剤で血管新生
を抑制するものである。このアプローチでは、目的はさらなる原発腫瘍の血管新生を防ぐ
こと、および転移病巣の大きさを実質的な血管の増殖がなくとも新生細胞の生存を支持す
ることができるまでに潜在的に抑制することである。
特定の群の癌疾患は、腫瘍の増殖速度、正常な組織への浸潤、化学療法または他の従来
の治療に対する耐性、および全身への転移形成の点で攻撃的な癌疾患である。より攻撃的
な癌の場合、癌組織は正常な組織とは一層異なり、腫瘍が拡大する可能性はより高い。そ
のために、現在の癌研究の１つの目的は、腫瘍増殖を阻害し、かつ／または、癌細胞の全
身への拡大を抑制する薬剤を開発することである。
侵襲性の癌疾患がどのようなものあるかに関する定義は、国立癌研究所（Ｎａｔｉｏｎ
ａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）のホームページ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃ
ａｎｃｅｒ．ｇｏｖ／Ｔｅｍｐｌａｔｅｓ／ｄｂ＿ａｌｐｈａ．ａｓｐｘ？ＣｄｒＩＤ＝
４６０５３から得てもよい。また。癌疾患の攻撃力の説明に関しては、典型的には、顕微
鏡で調べた場合にそれらがどの程度異常であるかという点で癌細胞を分類するためのシス
テムである、段階化（ｇｒａｄｉｎｇ）が用いられる。段階化システムの目的は、考えら
れる腫瘍の増殖速度およびその拡大傾向についての情報を提供することである。腫瘍を段
階化するために用いるシステムは、各々の癌の種類によって異なる。段階化は、治療の決
定に役割を果たす。
このような段階化システムは、当業者に公知である。そのうちの１つが、グリーソンス
コアで、前立腺癌組織が顕微鏡でどのように見えるかに基づいてそれを段階化するシステ
ムである。グリーソンスコアは２〜１０の範囲であり、腫瘍が広がる可能性がどの程度か
を示す。低いグリーソンスコアは、その癌組織は正常な前立腺組織と同じようであり、腫
瘍の広がる可能性は少ないことを意味し、高いグリーソンスコアは、その癌組織が正常と
は大いに異なり、腫瘍の広がる可能性が高いことを意味する。
ＰＫＮ３は、プロテインキナーゼＮベータまたはＰＫＮベータとも呼ばれ、癌および腫
瘍に関して価値のある標的である。国際特許出願第ＷＯ２００４／０１９９７３号に記載
されるように、プロテインキナーゼＮベータは腫瘍形成および転移に関係のあるＰＩ−３
キナーゼ／ＰＴＥＮ経路の下流標的である。特に後者の効果は、抑制因子機能、より詳細
にはＰＴＥＮ腫瘍抑制因子機能の消失に強く関連しているように思われる。ＷＯ２００４
／０１９９７３号に示されるように、プロテインキナーゼＮベータは、ＰＩ３キナーゼ経
路に対する阻害剤であるＰＴＥＮが活性化していない条件下で上方調節される。プロテイ
ンキナーゼＮベータの上方調節に起因して、このような上方調節が生じる細胞は、転移挙
動および遊走挙動の増加を示す。これは、プロテインキナーゼＮベータの阻害剤が細胞の
転移および遊走挙動を制御するのに適した手段であることを意味し、これは腫瘍および癌
、より詳細には、転移性であり、その細胞が転移および／または遊走挙動を示す腫瘍およ
び癌の治療に適した手段である。
当技術分野において、腫瘍性疾患の治療のための手段に対して継続する必要性がある。
より具体的には、攻撃的で、侵襲性の挙動を示す腫瘍性疾患に適した手段に対する必要性
がある。
また、血管新生、より具体的には、腫瘍性疾患の根本的な病理学的機序に関与する血管
新生に影響を及ぼすのに適した手段に対する必要性がある。これらは、本発明の根本的な
問題を定義する必要がある。
本発明の根本的な問題は、添付される独立請求項の主題により解決される。好ましい実
施形態は、従属請求項から得てもよい。
本発明の根本的な問題は、二本鎖核酸分子により解決され、
二本鎖構造は、第１の鎖と第２の鎖とを含み、
第１の鎖は、隣接するヌクレオチドからなる第１のストレッチを含み、上記第１のスト
レッチは、少なくとも部分的に標的核酸と相補的であり、かつ
第２の鎖は、隣接するヌクレオチドからなる第２のストレッチを含み、上記第２のスト
レッチは、少なくとも部分的に第１のストレッチと相補的であり、かつ
標的核酸は、ＰＫＮ３をコードしているｍＲＮＡである。
より具体的には、本発明の根本的な問題は、第１の態様において二本鎖構造を含む核酸
分子により解決され、
二本鎖構造は、第１の鎖と第２の鎖とを含み、
第１の鎖は、隣接するヌクレオチドからなる第１のストレッチを含み、上記第１のスト
レッチは、少なくとも部分的に標的核酸と相補的であり、かつ
第２の鎖は、隣接するヌクレオチドからなる第２のストレッチを含み、上記第２のスト
レッチは、少なくとも部分的に第１のストレッチと相補的であり、
第１のストレッチは、少なくとも部分的に配列番号１（ＮＭ＿０１３３５５）に記載の核
酸配列のヌクレオチドコア配列またはその部分と相補的である核酸配列を含み、
ヌクレオチドコア配列は、ヌクレオチド配列
配列番号１のヌクレオチド位置４８２〜５００（配列番号２）、
配列番号１のヌクレオチド位置１５５５〜１５７３（配列番号４）、
配列番号１のヌクレオチド位置１５５６〜１５７４（配列番号６）、
配列番号１のヌクレオチド位置１５５９〜１５７７（配列番号８）、
配列番号１のヌクレオチド位置１５６６〜１５８４（配列番号１０）、
配列番号１のヌクレオチド位置２０９４〜２１１２（配列番号１２）、
配列番号１のヌクレオチド位置２１０２〜２１２０（配列番号１４）、
配列番号１のヌクレオチド位置２２８６〜２３０４（配列番号１６）、
配列番号１のヌクレオチド位置２７６１〜２７７９（配列番号１８）、
配列番号１のヌクレオチド位置２７６３〜２７８１（配列番号２０）、
配列番号１のヌクレオチド位置２７６４〜２７８２（配列番号２２）、
配列番号１のヌクレオチド位置２８４３〜２８６１（配列番号２４）、
配列番号１のヌクレオチド位置２８４４〜２８６２（配列番号２６）、または
配列番号１のヌクレオチド位置２８４６〜２８６４（配列番号２８）を含み、
好ましくは、ヌクレオチドコア配列は、ヌクレオチド配列
配列番号１のヌクレオチド位置１５５５〜１５７３（配列番号４）、
配列番号１のヌクレオチド位置１５５６〜１５７４（配列番号６）、
配列番号１のヌクレオチド位置１５５９〜１５７７（配列番号８）、
配列番号１のヌクレオチド位置１５６６〜１５８４（配列番号１０）、
配列番号１のヌクレオチド位置２０９４〜２１１２（配列番号１２）、または
配列番号１のヌクレオチド位置２２８６〜２３０４（配列番号１６）を含み、
好ましくは、第１のストレッチは、さらに、少なくとも部分的にヌクレオチドコア配列の
５’末端に先行する領域と、かつ／またはヌクレオチドコア配列の３’末端の後に続く領
域と相補的である。
本発明の第１の態様の一実施形態では、核酸の第１のストレッチは、ヌクレオチドコア
配列またはその部分と相補的である。
本発明の第１の態様の一実施形態では、核酸の第１のストレッチは、さらに、ヌクレオ
チドコア配列の３’末端の後に続く領域と、かつ／またはヌクレオチドコア配列の５’末
端に先行する領域と相補的である。
本発明の第１の態様の一実施形態では、核酸の第１のストレッチは、１８以上２９まで
のヌクレオチド、好ましくは１９〜２５ヌクレオチド、より好ましくは１９〜２３ヌクレ
オチドの標的核酸と相補的である。
本発明の第１の態様の好ましい実施形態では、核酸のヌクレオチドは、連続したヌクレ
オチドである。
本発明の第１の態様の一実施形態では、核酸の第１のストレッチおよび／または第２の
ストレッチは、１８〜２９の連続したヌクレオチド、好ましくは１９〜２５の連続したヌ
クレオチド、より好ましくは１９〜２３の連続したヌクレオチドを含む。
本発明の第１の態様の一実施形態では、核酸の第１の鎖は、第１のストレッチからなり
、かつ／または核酸の第２の鎖は、第２のストレッチからなる。
本発明の根本的な問題は、第２の態様において核酸分子により解決され、好ましくは、
第１の態様による核酸分子は二本鎖構造を含み、二本鎖構造は第１の鎖および第２の鎖に
より形成され、第１の鎖は隣接するヌクレオチドからなる第１のストレッチを含み、第２
の鎖は隣接するヌクレオチドからなる第２のストレッチを含み、上記第１のストレッチは
少なくとも部分的に上記第２のストレッチと相補的であり、
第１のストレッチは、配列番号３に記載のヌクレオチド配列からなり、第２のストレッ
チは、配列番号２に記載のヌクレオチド配列からなり、
第１のストレッチは配列番号５に記載のヌクレオチド配列からなり、第２のストレッチ
は、配列番号４に記載のヌクレオチド配列からなり、
第１のストレッチは、配列番号７に記載のヌクレオチド配列からなり、第２のストレッ
チは、配列番号６に記載のヌクレオチド配列からなり、
第１のストレッチは、配列番号９に記載のヌクレオチド配列からなり、第２のストレッ
チは、配列番号８に記載のヌクレオチド配列からなり、
第１のストレッチは、配列番号１１に記載のヌクレオチド配列からなり、第２のストレ
ッチは、配列番号１０に記載のヌクレオチド配列からなり、
第１のストレッチは、配列番号１３に記載のヌクレオチド配列からなり、第２のストレ
ッチは、配列番号１２に記載のヌクレオチド配列からなり、
第１のストレッチは、配列番号１５に記載のヌクレオチド配列からなり、第２のストレ
ッチは、配列番号１４に記載のヌクレオチド配列からなり、
第１のストレッチは、配列番号１７に記載のヌクレオチド配列からなり、第２のストレ
ッチは、配列番号１６に記載のヌクレオチド配列からなり、
第１のストレッチは、配列番号１９に記載のヌクレオチド配列からなり、第２のストレ
ッチは、配列番号１８に記載のヌクレオチド配列からなり、
第１のストレッチは、配列番号２１に記載のヌクレオチド配列からなり、第２のストレ
ッチは、配列番号２０に記載のヌクレオチド配列からなり、
第１のストレッチは、配列番号２３に記載のヌクレオチド配列からなり、第２のストレ
ッチは、配列番号２２に記載のヌクレオチド配列からなり、
第１のストレッチは、配列番号２５に記載のヌクレオチド配列からなり、第２のストレ
ッチは、配列番号２４に記載のヌクレオチド配列からなり、
第１のストレッチは、配列番号２７に記載のヌクレオチド配列からなり、第２のストレ
ッチは、配列番号２６に記載のヌクレオチド配列からなり、または
第１のストレッチは、配列番号２９に記載のヌクレオチド配列からなり、第２のストレ
ッチは、配列番号２８に記載のヌクレオチド配列からなり、
第１のストレッチは、配列番号３１に記載のヌクレオチド配列からなり、第２のストレ
ッチは、配列番号３０に記載のヌクレオチド配列からなり、
第１のストレッチは、配列番号３３に記載のヌクレオチド配列からなり、第２のストレ
ッチは、配列番号３２に記載のヌクレオチド配列からなり、
第１のストレッチは、配列番号３５に記載のヌクレオチド配列からなり、第２のストレ
ッチは、配列番号３４に記載のヌクレオチド配列からなり、
第１のストレッチは、配列番号３７に記載のヌクレオチド配列からなり、第２のストレ
ッチは、配列番号３６に記載のヌクレオチド配列からなり、
第１のストレッチは、配列番号３９に記載のヌクレオチド配列からなり、第２のストレ
ッチは、配列番号３８に記載のヌクレオチド配列からなり、
好ましくは、
第１のストレッチは、配列番号５に記載のヌクレオチド配列からなり、第２のストレッ
チは、配列番号４に記載のヌクレオチド配列からなり、
第１のストレッチは、配列番号７に記載のヌクレオチド配列からなり、第２のストレッ
チは、配列番号６に記載のヌクレオチド配列からなり、
第１のストレッチは、配列番号９に記載のヌクレオチド配列からなり、第２のストレッ
チは、配列番号８に記載のヌクレオチド配列からなり、
第１のストレッチは、配列番号１１に記載のヌクレオチド配列からなり、第２のストレ
ッチは、配列番号１０に記載のヌクレオチド配列からなり、
第１のストレッチは、配列番号１３に記載のヌクレオチド配列からなり、第２のストレ
ッチは、配列番号１２に記載のヌクレオチド配列からなり、
第１のストレッチは、配列番号１７に記載のヌクレオチド配列からなり、第２のストレ
ッチは、配列番号１６に記載のヌクレオチド配列からなり、または
第１のストレッチは、配列番号３１に記載のヌクレオチド配列からなり、第２のストレ
ッチは、配列番号３０に記載のヌクレオチド配列からなる。
本発明の第１および第２の態様の一実施形態では、核酸分子の第１のストレッチおよび
／または第２のストレッチは、規則的な、好ましくは交互の位置パターンを形成する修飾
を２’位に有する複数の群の修飾されたヌクレオチドを含み、ストレッチの内部では、修
飾されたヌクレオチドの各群は片側または両側を１つの隣接するヌクレオチドの群により
フランクされ、隣接するヌクレオチドの群を形成する隣接するヌクレオチドは、修飾され
ていないヌクレオチドであるか、または修飾されたヌクレオチドの修飾とは異なる修飾を
有するヌクレオチドである。
本発明の第１および第２の態様の一実施形態では、核酸の第１のストレッチおよび／ま
たは核酸の第２のストレッチは、修飾されたヌクレオチドの群からなる１つのパターンお
よび／または隣接するヌクレオチドの群からなる１つのパターンを含む。
本発明の第１および第２の態様の一実施形態では、核酸の第１のストレッチおよび／ま
たは核酸の第２のストレッチは、３’末端にジヌクレオチドを含み、このようなジヌクレ
オチドは、好ましくはＴＴである。
本発明の第１および第２の態様の好ましい実施形態では、核酸の第１のストレッチ長お
よび／または核酸の第２のストレッチ長は、１９〜２１ヌクレオチドからなる。
本発明の第１および第２の態様の一実施形態では、核酸の第１および／または第２のス
トレッチは、３’末端に１〜５ヌクレオチドのオーバーハングを含む。
本発明の第１および第２の態様の好ましい実施形態では、核酸の二本鎖構造の長さは約
１６〜２４ヌクレオチド対、好ましくは２０〜２２ヌクレオチド対である。
本発明の第１および第２の態様の一実施形態では、核酸の第１の鎖および核酸の第２の
鎖は相互に共有結合し、好ましくは第１の鎖の３’末端は第２の鎖の５’末端に共有結合
している。
本発明の第１および第２の態様の一実施形態では、核酸の分子は、次の２本の鎖の各々
からなり、下線を引いたヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルである。
Figure 2013172714
Figure 2013172714
 好ましくは、
Figure 2013172714
 である。
本発明の根本的な問題は、第３の態様において第１または第２の態様による核酸を含む
リポソーム製剤により解決される。
本発明の根本的な問題は、第４の態様において第１または第２の態様による核酸を含む
リポプレックス、およびリポソームにより解決される。
本発明の第４の態様の好ましい実施形態では、リポプレックスのリポソームは、
ａ）約５０モル％のβ−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル
−Ｎ−オレイル−アミドトリヒドロクロリド、好ましくは、（β−（Ｌ−アルギニル）−
２，３−Ｌ−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミドトリ−ヒド
ロクロリド）；
ｂ）約４８〜４９モル％の１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタ
ノールアミン（ＤＰｈｙＰＥ）；および
ｃ）約１〜２モル％の１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノー
ルアミン−ポリエチレン−グリコール、好ましくは、Ｎ−（カルボニル−メトキシポリエ
チレングリコール−２０００）−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ
エタノールアミンナトリウム塩
からなる。
本発明の第４の態様のより好ましい実施形態では、リポプレックスのゼータ電位は、約
３５〜６０ｍＶ、好ましくは約４５〜５０ｍＶである。
本発明の第４の態様の一実施形態では、ＱＥＬＳにより測定されるリポプレックスのサ
イズは、約５０〜４００ｎｍ、好ましくは約１００〜１４０ｎｍ、より好ましくは約１１
０ｎｍ〜１３０ｎｍである。
本発明の根本的な問題は、第５の態様において、第１および第２の態様による核酸を含
む、またはコードするベクター、好ましくは発現ベクターにより解決される。
本発明の根本的な問題は、第６の態様において、先行する態様のいずれかに記載の核酸
または先行する態様のいずれかに記載のベクターを含む細胞により解決される。
本発明の根本的な問題は、第７の態様において、第１または第２の態様による核酸、第
３の態様によるリポソーム製剤、第４の態様によるリポプレックス、第５の態様によるベ
クターおよび／または第６の態様による細胞を含む組成物、好ましくは医薬組成物により
解決される。
本発明の第７の態様の好ましい実施形態では、組成物は、場合により医薬品として許容
されるビヒクルをさらに含む、医薬組成物である。
本発明の第７の態様のより好ましい実施形態では、組成物は医薬組成物であり、上記医
薬組成物は、血管形成依存性疾患、好ましくは、不十分、異常もしくは過剰な血管新生に
より特徴付けられるか、またはそれらに起因する疾患の治療のためのものである。
本発明の第７の態様の最も好ましい実施形態では、組成物の血管新生は、脂肪組織、皮
膚、心臓、眼、肺、腸、生殖器、骨および関節の血管新生である。
本発明の第７の態様の一実施形態では、疾患は、感染症、自己免疫障害、血管奇形、ア
テローム性動脈硬化症、移植後動脈疾患（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ａｒｔｅｒｉｏｐａｔ
ｈｙ）、肥満、乾癬、疣贅、アレルギー性皮膚炎、持続性過形成硝子体症候群（ｐｅｒｓ
ｉｓｔｅｎｔ ｈｙｐｅｒｐｌａｓｔｉｃ ｖｉｔｒｏｕｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、糖尿
病性網膜症、未熟児網膜症、加齢性黄斑疾患（ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ ｍａｃｕｌａｒ
ｄｉｓｅａｓｅ）、脈絡膜血管新生、原発性肺高血圧症、喘息、鼻茸、炎症性腸疾患お
よび歯周病、腹水、腹膜癒着、子宮内膜症、子宮出血、卵巣嚢胞、卵巣（ｏｖａｒｉａｎ
）、卵巣過剰刺激、関節炎、滑膜炎、骨髄炎、骨棘形成を含む群から選択される。
本発明の第７の態様の一実施形態では、医薬組成物は、腫瘍性疾患、好ましくは癌疾患
、より好ましくは固形腫瘍の治療のためのものである。
本発明の第７の態様の一実施形態では、医薬組成物は、骨癌、乳癌、前立腺癌、消化器
系の癌、結腸直腸癌、肝癌、肺癌、腎癌、泌尿生殖器癌、膵癌、下垂体癌、精巣癌、眼窩
癌、頭頸部癌、中枢神経系の癌および呼吸器系の癌を含む群から選択される疾患の治療の
ためのものである。
本発明の根本的な問題は、第８の態様において第１または第２の態様による核酸、第３
の態様によるリポソーム製剤、第４の態様によるリポプレックス、第５の態様によるベク
ターおよび／または第６の態様による細胞の、薬剤の製造のための使用により解決される
。
本発明の第８の態様の一実施形態では、薬剤は、本発明の第７の態様に関連して定義さ
れるいずれかの疾患の治療のためにも使用される。
本発明の第８の態様の好ましい実施形態では、薬剤は、１種または数種類の他の治療法
と併用して用いられる。
本発明の第８の態様のより好ましい実施形態では、治療法は、化学療法、寒冷療法、温
熱療法、抗体療法、放射線療法および抗血管新生療法（ａｎｔｉ−ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓ
ｉｓ ｔｈｅｒａｐｙ）を含む群から選択される。
本発明の第８の態様の最も好ましい実施形態では、治療法は抗体療法であり、より好ま
しくは、抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ−Ｒｏｃｈｅにより提供され、ア
バスチンの名称で販売されているものなど）または抗アンジオポエチン抗体を用いる抗体
療法である。
本発明の第８の態様の一実施形態では、抗血管新生療法はキナーゼ受容体阻害剤、好ま
しくはチロシンキナーゼ受容体阻害剤を使用し、このような受容体は、ＶＥＧＦ受容体、
ＰＤＧＦ受容体、Ｔｉｅ−２、ＦＧＦＲおよびＥＧＦＲを含む群から選択される。このよ
うな種類の阻害剤の例は、ＶＥＧＦ−ＲおよびＰＤＧＦ−Ｒを標的にするソラフェニブ（
Ｂａｙｅｒ）、ならびに、ＥＧＦＲを標的にする抗体エルビタックス（Ｍｅｒｃｋ／ｓｅ
ｒｏｎｏ）である。両薬剤は、抗血管新生療法（ａｎｔｉ−ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ｍｏ
ｄａｌｉｔｉｅｓ）とされている。
本発明の第８の態様の好ましい実施形態では、阻害剤は、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス分
子、アプタマー、スピーゲルマー（ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒｓ）、高親和性結合ペプチド、
ペプチドアプタマー、アンチカリン（ａｎｔｉｃａｌｉｎｅｓ）および抗体を含む群から
選択される。
第８の態様の好ましい実施形態では、薬剤は、１種または数種類の他の治療法、好まし
くは抗腫瘍療法もしくは抗癌治療と併用して用いられる。
第８の態様のより好ましい実施形態では、治療法は、化学療法、寒冷療法、温熱療法、
抗体療法および放射線療法を含む群から選択される。
第８の態様のいっそうより好ましい実施形態では、治療法は、抗血管新生療法（ａｎｔ
ｉａｇｉｏｇｅｎｉｃ ｔｈｅｒａｐｙ）、より好ましくは抗ＶＥＧＦまたは抗アンジオ
ポエチン抗体を用いる抗体療法である。
本発明の様々な態様のさらに好ましい実施形態では、ｍＲＮＡは、ＰＫＮ３のヒトｍＲ
ＮＡである。いっそうより好ましい実施形態では、標的核酸は、配列番号１に記載の核酸
配列を有するｍＲＮＡである。
本明細書においてさらに詳細に概説されるように、それぞれ同じものを含有する核酸分
子および薬剤および製剤は、侵襲性の癌、攻撃的な癌および悪性腫瘍を阻害、または予防
または治療するために特に適している。
本明細書において好ましく用いられるように、侵襲性の癌は、癌の生じた組織の層を超
えて広がり、増殖して健康な組織を取り囲んでいる癌である。浸潤性の癌とも呼ばれる。
本明細書において好ましく用いられるように、攻撃的な癌は、急速に増殖する癌である
。
本明細書において好ましく用いられるように、悪性腫瘍は、近傍の組織に侵入して破壊
し、身体の他の部分へ広がることができる癌性の腫瘍である。
配列番号１の核酸配列を有するｍＲＮＡに比べて、様々な個体または個体の群における
、好ましくは集団におけるｍＲＮＡには１個または数個の単一ヌクレオチドの変化が起こ
る可能性があるということは当業者により認識される。配列番号１の核酸配列を有するｍ
ＲＮＡに比べて、このような１個または数個の単一ヌクレオチドの変化を有するｍＲＮＡ
は、本明細書において好ましく用いられる標的核酸という用語によっても当然網羅される
。なおさらなる実施形態では、本発明の様々な態様による核酸分子は、ＰＫＮ３およびそ
れをコードするｍＲＮＡの発現を阻害するために適している。より好ましくは、このよう
な発現は、ＲＮＡ干渉または転写後遺伝子サイレンシングと呼ばれる機構により阻害され
る。したがって、本発明によれば、ｓｉＲＮＡ分子およびＲＮＡｉ分子は、それぞれ好ま
しくは結果的に標的分子のｍＲＮＡのノックダウンをもたらす、ＲＮＡ干渉応答を誘導す
るために適している。その程度において、この種類の核酸分子は、ｍＲＮＡのレベルで発
現を減少させることにより、標的分子の発現を減少させるために適している。それもまた
本願により包含されるはずの、さらなるｍＲＮＡが存在してもよいことは当業者により認
識される。より具体的には、配列番号１を参照して本明細書において確認された特定のヌ
クレオチド位置は、本明細書に提供される技術的教示に基づいて、当業者によってこのよ
うなさらなるｍＲＮＡにおいて特定され得る。
本発明の本態様による二本鎖核酸が、本明細書に記載されるデザインのいずれかをこの
種類の核酸分子のために有してもよいこともまた認識されるはずである。さらに、上に記
載される機構は、好ましい実施形態において、本明細書において代替的な態様としてみな
される様々な態様および設計原理に関連して、本明細書に開示される核酸にも適用できる
ことも認識されるはずである。
ＲＮＡ干渉とは、動物において、短い干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に媒介される配列特
異的な転写後遺伝子サイレンシングのプロセスをさす（Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９９
８）。植物において相当するプロセスは、一般に転写後遺伝子サイレンシングまたはＲＮ
Ａサイレンシングと呼ばれ、真菌においてはクエリング（ｑｕｅｌｌｉｎｇ）とも呼ばれ
る。転写後遺伝子サイレンシングのプロセスは、多様な植物相および種族により一般に共
有される外来遺伝子の発現を防ぐために用いられる進化的に保存された細胞防御機構であ
ると考えられる（Ｆｉｒｅ，１９９８ ＃２６３）。このような外来遺伝子発現からの保
護は、ウイルス感染、またはトランスポゾンエレメントの宿主ゲノムへのランダム組込み
から、相同一本鎖ＲＮＡまたはウイルスゲノムのＲＮＡを特異的に破壊する細胞応答を介
して誘導される、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の産生に応じて進化してきた可能性がある
。細胞にｄｓＲＮＡが存在すると、未だに十分にはキャラクタライズされていない機構を
経てＲＮＡｉ応答が誘導される。動物細胞に、特に哺乳類細胞にも存在するこの機構は、
ｄｓＲＮＡに媒介されるプロテインキナーゼＰＫＲおよび２’，５’−オリゴアデニル酸
合成酵素の活性化に起因し、結果的にリボヌクレアーゼＬによるｍＲＮＡの非特異的切断
をもたらすインターフェロン応答とは異なるように思われる。
主にサイズの点で異なる、ｓｉＲＮＡ分子またはＲＮＡｉ分子の基本設計は、基本的に
核酸分子が二本鎖構造を含むようにする。二本鎖構造は、第１の鎖と第２の鎖を含む。よ
り好ましくは、第１の鎖は、隣接するヌクレオチドからなる第１のストレッチを含み、第
２のストレッチは、隣接するヌクレオチドからなる第２のストレッチを含む。少なくとも
第１のストレッチと第２のストレッチは本質的に相互に相補的である。このような相補性
は典型的にはワトソン−クリック塩基対形成、または、限定されるものではないが、フー
グスティーン塩基対形成および他を含む、当業者に公知の他の塩基対形成機構に基づく。
このような二本鎖構造の長さにもよるが、塩基相補性の点から見て完全な一致が必ずしも
必要ではないことは、当業者により認識される。しかし、このような完全な相補性は一部
の実施形態において好ましい。特に好ましい実施形態では、相補性および／または同一性
は少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％または９５％である。代替的な特に好まし
い実施形態では、相補性および／または同一性は、その相補的なおよび／または同一な核
酸分子が本発明に記載の核酸分子の鎖の１本とハイブリダイズし、より好ましくは、次の
条件下で２つのストレッチのうちの１つとハイブリダイズし、次の条件下で標的遺伝子転
写物の部分とハイブリダイズすることができ、その条件は、４００ｍＭ ＮａＣｌ、４０
ｍＭ ＰＩＰＥＳ ｐＨ６．４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５０℃または７０℃でのハイブリダ
イゼーションを１２〜１６時間、続いて洗浄、である。それぞれの反応条件は、中でも欧
州特許ＥＰ１２３０３７５号に記載されている。
ミスマッチも、主に、二本鎖構造がなおＲＮＡ干渉機構を誘導するために適し、かつ、
好ましくはこのような二本鎖構造が細胞、組織および生物それぞれに行き渡っている、こ
のような細胞、組織および器官を含むか、または原則として含む生理的条件下で、なお安
定に形を成している条件下で許容される。より好ましくは、この二本鎖構造は、生理緩衝
液中、３７℃で安定である。この種類のミスマッチは、コア領域とは異なる、本発明に記
載の核酸分子の内部の位置に含まれ得ることが好ましいことは、当業者により認識される
であろう。
本明細書において好ましく用いられるように、核酸分子またはストレッチまたはその部
分が標的核酸分子と部分的に相補的である、という用語は、好ましくは、このような標的
核酸が直接または間接にＲＮＡ干渉（が媒介する）核酸により標的化される場合は、その
標的核酸と、上記核酸、ストレッチまたはその部分、あるいは二本鎖構造との間の相補性
が形成されたことを意味する。このような相補性はＲＮＡ干渉を誘導することができるた
めである。このような相補性の要件はＲＮＡ干渉機構に制限されていないが、例えば標的
核酸によりコードされるポリペプチドなどの分子の活性の下方調節または低下をもたらす
任意の機構に制限されることは、当然理解される。一実施形態では、別の核酸分子と部分
的に相補的である核酸分子は、両方の核酸分子の塩基対形成の際に１、２、３、４または
５のミスマッチを含む。より好ましくは、このようにして形成された二本鎖核酸分子は１
９〜２５塩基対を含む。
第１のストレッチは、典型的には少なくとも部分的に標的核酸と相補的であるかまたは
少なくとも部分的に同一であり、第２のストレッチは、特に第１および第２のストレッチ
間の関係を前提として、それぞれ、塩基の相補性に関して、少なくとも部分的に標的核酸
と同一であるかまたは少なくとも部分的に相補的である。この標的核酸はｍＲＮＡである
ことが好ましいが、他の形態のＲＮＡ、例えばｈｎＲＮＡも本明細書に開示される核酸分
子の目的に適している。本明細書で好ましくは用いられるように、標的はＰＫＮ３であり
、標的核酸は、より好ましくはＰＫＮ３をコードするＤＮＡまたはＲＮＡ、あるいは、こ
のような部分が好ましくは、なおもキナーゼとして作用するための全長ＰＫＮ３の特徴を
少なくとも有する場合は、その一部分である。
ＲＮＡ干渉は、それぞれ数十の、特には、さらに数百のヌクレオチドおよびヌクレオチ
ド対を含む長い核酸分子を使用する際に観察することができる場合もあるが、より短いＲ
ＮＡｉ分子が一般に好ましい。第１のストレッチおよび／または第２のストレッチの長さ
のより好ましい範囲は、約１８〜２９の連続したヌクレオチド、好ましくは１９〜２５の
連続したヌクレオチド、より好ましくは１９〜２３の連続したヌクレオチドである。第１
のストレッチと第２のストレッチの両方が同じ長さであることがより好ましい。さらなる
実施形態では、二本鎖構造は、好ましくは１６〜２９、好ましくは１８〜２５、より好ま
しくは１９〜２３、そして最も好ましくは、１９〜２１の塩基対を含む。
本発明によれば、原則として、ＰＫＮ３をコードしているｍＲＮＡのいずれの部分も、
それぞれ、このようなｓｉＲＮＡ分子およびＲＮＡｉ分子のデザインに使用することがで
きるが、本発明者らは、驚くことに、配列番号１の核酸配列を有する配列番号１のｍＲＮ
Ａのヌクレオチド位置１５５５、１５５６、１５５９、１５６６、２０９４、２２８６で
始まる配列が、ＲＮＡ干渉を媒介する分子として扱われるのに特に適していることを見出
した。
より具体的には、本発明者らは、驚くことに、これらの配列および出発点はＰＫＮ３の
発現阻害のために特に好ましい標的配列であるが、ヌクレオチドのコアがこれらの配列の
近傍にあり、それがその程度において特に効果的であることを見出した。このコアは、一
実施形態では上に指定した核酸配列の最後の約９〜１１ヌクレオチドからなる配列である
。それから出発すると、コアは、機能的に活性のある二本鎖核酸分子が得られ、それによ
り、好ましくは、ＰＫＮ３の発現阻害に作用するのに適した機能的に活性のある手段が得
られるように伸長することができる。このような目的のため、ｍＲＮＡの対応する部分、
すなわちコア配列に本質的に同一な第２のストレッチを、５’末端の１つの、好ましくは
数個のヌクレオチドにより長くし、それにより、このようにして付加されたヌクレオチド
は、対応する位置の標的核酸中に存在するヌクレオチドと本質的に同一である。また、こ
のような目的のため、標的核酸と本質的に相補的である第１の鎖を、３’末端の１つの、
好ましくは数個のヌクレオチドにより長くし、それにより、このようにして付加されたヌ
クレオチドは、対応する位置、すなわち５’末端の標的核酸中に存在するヌクレオチドと
相補的である。
この設計原理によると、本発明によるコア配列を次のようにまとめることができる。
Figure 2013172714
より好ましくは、この表示において、各二本鎖分子の上側の鎖はセンス鎖であるのに対
し、下側の鎖はアンチセンス鎖であり、両方とも５’から３’の方向に示されている。
いっそうより好ましくは、センス鎖において、２番目のヌクレオチドから始まる１つ置
きのヌクレオチドは、２’位を修飾されて、好ましくは２’−Ｏ−Ｍｅ修飾されたヌクレ
オチドとなり、アンチセンス鎖において、最初のヌクレオチドから始まる１つ置きのヌク
レオチドは、２’位を修飾されて、好ましくは２’−Ｏ−Ｍｅ修飾されたヌクレオチドと
なる。この種類の修飾あるいは規則的または空間的な修飾パターンは、好ましい実施形態
において本発明の任意の核酸分子で実現することができる。
そのさらなる実施形態では、コア配列は、本発明の二本鎖核酸分子の第２のストレッチ
のヌクレオチド配列と同一であり、第１のストレッチはそれと本質的に相補的である。な
おさらに好ましい実施形態では、本発明による二本鎖核酸分子の長さは、様々な態様およ
び代替的な態様に関連して、それぞれ本明細書に開示される限度の範囲内である。
ｓｉＲＮＡ分子およびＲＮＡｉ分子の特定のデザインは、それぞれ、現在および将来の
設計原理によると変動する可能性があることは、当業者により認識される。当分の間は、
下記でより詳細に考察および開示される設計原理、及び代替的な態様または本発明による
核酸分子の第１の態様の代替的な態様と称される設計原理が存在する。１つの特定の代替
的な態様について説明される全ての特徴および実施形態、すなわち核酸のデザインは、本
発明による核酸の任意の他の態様および代替的な態様にも適用でき、したがって、そのそ
れぞれの実施形態を形成することは、本発明の範囲内である。
第１の代替的な態様は、本発明による核酸に関し、その第１のストレッチは、２’位が
修飾された複数の群の修飾ヌクレオチドを含み、ストレッチの内部では、修飾ヌクレオチ
ドの各群は片側または両側を１つの隣接するヌクレオチドの群により隣接され、隣接する
ヌクレオチドの群を形成する隣接するヌクレオチドは、非修飾ヌクレオチドであるか、ま
たは修飾ヌクレオチドの修飾とは異なる修飾を有するヌクレオチドである。このようなデ
ザインは、中でも、国際特許出願第ＷＯ２００４／０１５１０７号に記載されている。こ
の態様による核酸は、好ましくはリボ核酸であるが、一部の実施形態に概説されるように
、２’位の修飾により、それ自体、純粋に化学的な観点から、結果的に、もはやリボヌク
レオチドでないヌクレオチドとなった。しかし、このような修飾されたリボヌクレオチド
が本明細書においてリボヌクレオチドとみなされ、対処されるものとし、このような修飾
されたリボヌクレオチドを含有する分子をリボ核酸とみなし、対処するものとすることは
本発明の範囲内である。
本発明の第１の代替的な態様によるリボ核酸の一実施形態では、リボ核酸は、二本鎖構
造の片側または両側を平滑末端化されている。より好ましい実施形態では、二本鎖構造は
、１８〜２５、好ましくは１８〜２３、より好ましくは１９、２１または２３塩基対を含
むかあるいはそれらからなり、それにより、二本鎖構造は、好ましくは平滑末端化されて
いる。なおさらに一層好ましい実施形態では、核酸は、第１のストレッチおよび第２のス
トレッチのみからなる。
本発明の第１の代替的な態様によるリボ核酸のさらなる実施形態では、上記第１のスト
レッチおよび／または上記第２のストレッチは、複数の修飾ヌクレオチドの群を含む。さ
らに好ましい実施形態では、第１のストレッチも複数の隣接するヌクレオチドの群を含む
。好ましい実施形態では、複数の群とは、少なくとも２つの群を意味する。
本発明の第１の代替的な態様によるリボ核酸の別の実施形態では、上記第２のストレッ
チは、複数の修飾ヌクレオチドの群を含む。さらに好ましい実施形態では、第２のストレ
ッチも複数の隣接するヌクレオチドの群を含む。好ましい実施形態では、複数の群とは、
少なくとも２つの群を意味する。
さらに好ましい実施形態では、第１および第２の両方のストレッチは、修飾ヌクレオチ
ドの群と隣接するヌクレオチドの群の両方を複数含む。より好ましい実施形態では、複数
の、修飾ヌクレオチドの群と隣接するヌクレオチドの群の両方は、パターン、好ましくは
規則的および／または反復型のパターンを、第１のストレッチおよび／または第２のスト
レッチのいずれかに形成するため、このようなパターンが第１および第２の両方のストレ
ッチに形成されることがいっそうより好ましい。
本発明の第１の代替的な態様によるリボ核酸の好ましい実施形態では、修飾ヌクレオチ
ドの群および／または隣接するヌクレオチドの群は、多数のヌクレオチドを含み、その数
は、１つのヌクレオチド〜１０のヌクレオチドを含む群から選択される。本明細書中で指
定される任意の範囲に関連して、それぞれの範囲が、上記範囲を画定する上記の２つの数
字を含む、その範囲を画定するために用いられるそれぞれの数字の間の任意の個々の整数
を開示することは当然理解される。この場合は、したがって、群は１つのヌクレオチド、
２つのヌクレオチド、３つのヌクレオチド、４つのヌクレオチド、５つのヌクレオチド、
６つのヌクレオチド、７つのヌクレオチド、８つのヌクレオチド、９つのヌクレオチドお
よび１０のヌクレオチドを含む。
本発明の第１の代替的な態様によるリボ核酸の別の実施形態では、上記第１のストレッ
チの修飾ヌクレオチドのパターンは、上記第２のストレッチの修飾ヌクレオチドのパター
ンと同じである。
本発明の第１の代替的な態様によるリボ核酸の好ましい実施形態では、上記第１のスト
レッチのパターンは、上記第２のストレッチのパターンと整列する。
本発明の第１の代替的な態様によるリボ核酸の代替的な実施形態では、上記第１のスト
レッチのパターンは、第２のストレッチのパターンに対して１つ以上のヌクレオチドだけ
移動されている。
本発明の第１の代替的な態様によるリボ核酸の一実施形態では、２’位の修飾は、アミ
ノ、フルオロ、メトキシ、アルコキシおよびアルキルを含む群から選択される。
本発明の第１の代替的な態様によるリボ核酸の別の実施形態では、二本鎖構造は、平滑
末端化されている。
本発明の第１の代替的な態様によるリボ核酸の好ましい実施形態では、二本鎖構造は、
二本鎖構造の両側で平滑末端化されている。
本発明の第１の代替的な態様によるリボ核酸の別の実施形態では、二本鎖構造は、第１
の鎖の５’末端および第２の鎖の３’末端により画定される二本鎖構造の側で平滑末端化
されている。
本発明の第１の代替的な態様によるリボ核酸のさらに別の実施形態では、二本鎖構造は
、第１の鎖の３’末端および第２の鎖の５’末端により画定される二本鎖構造の側で平滑
末端化されている。
本発明の第１の代替的な態様によるリボ核酸の別の実施形態では、２本の鎖のうちの少
なくとも１つは、少なくとも１つのヌクレオチドの５’末端にオーバーハングを有する。
本発明の第１の代替的な態様によるリボ核酸の好ましい実施形態では、オーバーハング
は、少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチドからなる。
本発明の第１の代替的な態様によるリボ核酸のさらなる実施形態では、鎖のうちの少な
くとも１つは、少なくとも１つのヌクレオチドの３’末端にオーバーハングを有する。
第１の代替的な態様のリボ核酸の一実施形態では、二本鎖構造の長さは、約１７〜２３
、より好ましくは、１８または１９塩基もしくは塩基対である。
第１の代替的な態様のリボ核酸の別の実施形態では、上記第１の鎖の長さおよび／また
は上記第２の鎖の長さは、相互に独立に、約１５〜約２３塩基、１７〜２１塩基および１
８または１９塩基もしくは１８または１９塩基対、より好ましくは、１９、２１または２
３塩基対の範囲を含む群から選択される。
本発明の第１の代替的な態様によるリボ核酸の好ましい実施形態では、上記第１の鎖と
標的核酸との間の相補性は完全である。
第１の代替的な態様によるリボ核酸の一実施形態では、第１の鎖と標的核酸との間に形
成された二重鎖は、少なくとも１５のヌクレオチドを含み、この際、上記二本鎖構造を形
成する上記第１の鎖と標的核酸との間には１つのミスマッチまたは２つのミスマッチがあ
る。
第１の代替的な態様によるリボ核酸の一実施形態では、第１の鎖と第２の鎖の両方は、
それぞれ、修飾ヌクレオチドの少なくとも１つの群、およびヌクレオチドの少なくとも１
つの隣接する群を含み、修飾ヌクレオチドの各群は少なくとも１つのヌクレオチドを含み
、各群の隣接するヌクレオチドは少なくとも１つのヌクレオチドを含み、第１の鎖の修飾
ヌクレオチドの各群は、第２の鎖上のヌクレオチドの１つの隣接する群と整列され、それ
により、第１の鎖の最も末端の５’ヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドの群のヌクレオチ
ドであり、かつ、第２の鎖の最も末端の３’ヌクレオチドは、隣接するヌクレオチドの群
のヌクレオチドである。
第１の代替的な態様によるリボ核酸の好ましい実施形態では、修飾ヌクレオチドの各群
は、単一のヌクレオチドからなり、かつ／またはそれぞれの隣接するヌクレオチドの群は
、単一のヌクレオチドからなる。
第１の代替的な態様によるリボ核酸のさらなる実施形態では、第１の鎖上で、隣接する
ヌクレオチドの群を形成するヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドの群を形成するヌクレオ
チドに対して３’方向に配置された、非修飾ヌクレオチドであり、第２の鎖上で、修飾ヌ
クレオチドの群を形成するヌクレオチドは、隣接するヌクレオチドの群を形成するヌクレ
オチドに対して５’方向に配置された、修飾ヌクレオチドである。
第１の代替的な態様によるリボ核酸の別の実施形態では、第１の鎖は８〜１２、好まし
くは９〜１３の、修飾ヌクレオチドの群を含み、第２の鎖は７〜１３、好ましくは８〜１
０の、修飾ヌクレオチドの群を含む。
上に特定したことが、第１および第２のストレッチにも、それぞれ適用できることは、
本発明の範囲内である。これは、鎖がストレッチのみからなる実施形態に特に該当する。
このような第１の代替的な態様により設計され得るリボ核酸分子は、本明細書において
遊離５’ＯＨ基とも称される、遊離５’ヒドロキシル基を第１の鎖に有する場合がある。
遊離５’ＯＨ基とは、第１の鎖を形成する最も末端のヌクレオチドが存在し、したがって
、特に末端修飾によって修飾されていないことを意味する。典型的には、第２の鎖の末端
の５’−ヒドロキシ基は、それぞれ、修飾されていない様式でも存在する。より好ましい
実施形態では、第１の鎖および第１のストレッチの３’末端も、それぞれ、本明細書にお
いて遊離３’ＯＨ基とも称される遊離ＯＨ基を呈するように、修飾されていない。それに
より、５’末端のヌクレオチドのデザインは、前に記載した実施形態のいずれかの１つで
ある。好ましくは、このような遊離ＯＨ基も第２の鎖の３’末端および第２のストレッチ
に、それぞれ存在する。本発明によれば、既に説明したリボ核酸分子の他の実施形態では
、それぞれ、第１の鎖および第１のストレッチの３’末端、ならびに／または、それぞれ
、第２の鎖および第２のストレッチの３’末端は、３’末端に末端修飾を有してもよい。
本明細書において、遊離５’ＯＨ基および３’ＯＨ基という用語はまた、二本鎖構造を
形成する、ポリヌクレオチドの５’末端および３’末端のそれぞれの最も末端のヌクレオ
チドがそれぞれ、すなわち、核酸あるいは鎖およびストレッチのいずれかがそれぞれ、Ｏ
Ｈ基を呈することを示す。このようなＯＨ基は、ヌクレオチドの糖部分、より好ましく５
’ＯＨ基の場合には５’位から、さらに３’ＯＨ基の場合には３’位から、または、それ
ぞれの末端のヌクレオチドの糖部分に結合しているリン酸基のいずれかから生じてもよい
。このリン酸基は、原則としてヌクレオチドの糖部分のいずれのＯＨ基にも結合してもよ
い。好ましくは、リン酸基は、本明細書において遊離５’または３’ＯＨ基と称されるも
のをなお提供する、遊離５’ＯＨ基の場合には５’ＯＨ基の糖部分、かつ／または遊離３
’ＯＨ基の場合には３’ＯＨ基の糖部分に結合する。
本明細書において第１の代替的な態様の任意の実施形態とともに用いられる、末端修飾
という用語は、第１のおよび／または第２の鎖の最も多くの５’または３’ヌクレオチド
に付加された化学的な部分を意味する。このような末端修飾の例としては、限定されるも
のではないが、中でも、欧州特許ＥＰ ０ ５８６ ５２０Ｂ１号またはＥＰ ０ ６１
８ ９２５Ｂ１号に記載される、逆方向（デオキシ）脱塩基、アミノ、フルオロ、クロロ
、ブロモ、ＣＮ、ＣＦ、メトキシ、イミダゾール、カルボキシレート、チオエート、Ｃ１
−Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリルまたはアラルキル、ＯＣＦ３、Ｏ
ＣＮ、Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルケニル；ＳＯ
ＣＨ３；ＳＯ２ＣＨ３；ＯＮＯ２；ＮＯ２、Ｎ３；ヘテロジクロアルキル（ｈｅｔｅｒｏ
ｚｙｃｌｏａｌｋｙｌ）；ヘテロジクロアルカリル（ｈｅｔｅｒｏｚｙｃｌｏａｌｋａｒ
ｙｌ）；アミノアルキルアミノ；ポリアルキルアミノまたは置換シリルが挙げられる。
本明細書において、アルキルまたは「アルキル」を含む任意の用語は、１〜１２個、好
ましくは１〜６個以上、好ましくは、１〜２個のＣ原子を含む任意の炭素原子鎖を意味す
る。
さらなる末端修飾は、ビオチン基である。このようなビオチン基は、好ましくは、第１
のおよび／または第２の鎖の最も末端の５’または最も末端の３’ヌクレオチドのいずれ
か、あるいは両方の末端に結合してもよい。より好ましい実施形態では、ビオチン基はポ
リペプチドまたはタンパク質に結合されている。ポリペプチドまたはタンパク質が、他の
前述の末端修飾のいずれかによって結合されていることも本発明の範囲内である。ポリペ
プチドまたはタンパク質は、本発明の核酸分子にさらなる特徴を付与してもよい。中でも
、ポリペプチドまたはタンパク質は別の分子へのリガンドとしての機能を果たしてもよい
。上記他の分子が受容体である場合は、その受容体の機能および活性は結合リガンドによ
り活性化され得る。受容体は、本発明の核酸分子に結合したリガンドの効果的なトランス
フェクションを可能にする、インターナリゼーション活性を示し得る。本発明の核酸分子
に結合してもよいリガンドの例はＶＥＧＦであり、対応する受容体はＶＥＧＦ受容体であ
る。
異なる種類の末端修飾を有する、本発明のＲＮＡｉの様々な可能性のある実施形態を次
の表１に提示する。
Figure 2013172714
本明細書に開示される様々な末端修飾は、リボ核酸のヌクレオチドのリボース部分に位
置していることが好ましい。より詳細に、末端修飾は、このように修飾ヌクレオチドが末
端のヌクレオチドであるという条件で、限定されるものではないが、２’ＯＨ、３’ＯＨ
および５’ＯＨの位置を含む、リボース部分のＯＨ基のいずれかに結合または置換されて
もよい。逆方向の脱塩基は、核酸塩基部分を含まない、デオキシリボヌクレオチド（ｄｅ
ｓｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）かまたはリボヌクレオチドのいずれかのヌク
レオチドであり、この種類の化合物は、中でも、（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ
．，２００２）に記載されている。
前述の末端修飾のいずれもが、表１に示されるＲＮＡｉの様々な実施形態に関連して使
用され得る。それと関連して、センス鎖が、好ましくは末端修飾を、より好ましくは５’
末端に有することにより不活化されている、本明細書に開示されるＲＮＡｉ形態または実
施形態はいずれも特に有利であることは注目され、そうでなければその細胞中の関係のな
い一本鎖ＲＮＡに干渉する場合がある、本明細書に記載されるリボ核酸の第２の鎖に対応
するセンス鎖の不活性化に起因する。したがって、細胞のトランスクリプトームの発現お
よび、より詳細には、翻訳パターンは、さらに特異的に影響を受ける。この効果はオフタ
ーゲット効果とも称される。表１を参照すると、実施形態７および８に示される実施形態
は、修飾により（第２の鎖である）ＲＮＡｉの標的非特異的部分の不活性化がもたらされ
、したがって、本発明によるＲＮＡｉが特異的なリボ核酸およびタンパク質を、それぞれ
ノックダウンするために用いられる、細胞または類似の系において、第２の鎖と一本鎖Ｒ
ＮＡの任意の非特異的相互作用を減少させるため、上の意味において特に有利である。
さらなる実施形態では、第１の代替的な態様による核酸は、そのリボ核酸の５’末端に
オーバーハングを有する。より詳細には、このようなオーバーハングは、原則として本発
明によるリボ核酸の第１の鎖および第２の鎖のいずれか、または両方に存在してもよい。
上記オーバーハングの長さは、わずか１ヌクレオチド程度であってもよく、２〜８ヌクレ
オチド程度の長さであってもよく、好ましくは、２、４、６または８ヌクレオチドであっ
てもよい。５’オーバーハングが本願のリボ核酸の第１の鎖および／または第２の鎖に位
置してもよいことは、本発明の範囲内である。オーバーハングを形成するヌクレオチドは
、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドまたはその連続であってもよい。
オーバーハングは、少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチドを含むことが好ましく
、それにより、上記１つのデオキシリボヌクレオチドは、最も５’末端のそれであること
が好ましい。本発明のリボ核酸のそれぞれの逆鎖の３’末端がオーバーハングを有さない
、より好ましくはデオキシリボヌクレオチドオーバーハングを有さないことは、本発明の
範囲内である。ここで再び、任意の本発明のリボ核酸は、表１に関連して概説される末端
修飾スキームおよび／またはおよび本明細書に概説される末端修飾を含んでよい。
連続したヌクレオチドのストレッチをパターンと考えると、好ましくは、ストレッチを
形成するヌクレオチドの修飾の規則的および／または反復パターンは、標準的なホスホロ
ジエステル結合を介して、または、少なくとも部分的に、ホスホロチオエート結合を通し
て相互に共有結合している、単一のヌクレオチドまたはヌクレオチドの群がこのような種
類の修飾を示すような実施形態において実現されてもよい。本明細書において修飾ヌクレ
オチドの群とも称される、このようなヌクレオチドまたはヌクレオチドの群が、上記スト
レッチの５’末端または３’末端を形成していない場合、ヌクレオチドまたはヌクレオチ
ドの群は、先行するヌクレオチドまたはヌクレオチドの群が非修飾ヌクレオチドの両側に
続く。しかし、この種類のヌクレオチドまたはヌクレオチドの群が、異なる修飾を有しと
もよいことに留意されたい。この種類のヌクレオチドまたはヌクレオチドの群は、本明細
書において隣接するヌクレオチドの群とも称される。修飾ヌクレオチドおよび修飾ヌクレ
オチドの群それぞれと、修飾されていないかまたは異なって修飾されたヌクレオチドまた
はヌクレオチドの群のこの配列は１回または数回反復されてもよい。この配列は１回より
多く反復されることが好ましい。明確にするために、このパターンは、一般に修飾ヌクレ
オチドの群または非修飾ヌクレオチドの群（上記の群の各々は実際に少なくとも単一のヌ
クレオチドを含んでもよい）を参照して、以下でより詳細に考察される。本明細書で用い
る非修飾ヌクレオチドとは、それぞれのヌクレオチドまたはヌクレオチドの群を形成する
ヌクレオチドに前述の修飾を有さないか、または、修飾ヌクレオチドおよびヌクレオチド
の群のそれとは異なる修飾を有することをそれぞれ意味する。
また、このような非修飾ヌクレオチドが、修飾ヌクレオチドの修飾とは異なる方法で実
際に修飾されている、非修飾ヌクレオチドの修飾は、上記非修飾ヌクレオチドを形成する
様々なヌクレオチド、または様々な隣接するヌクレオチドの群に対して同じであってもよ
く、異なっていてもよいことも本発明の範囲内である。
修飾ヌクレオチドと非修飾ヌクレオチドのパターンは、鎖またはストレッチの５’末端
のヌクレオチドが修飾ヌクレオチドの群から始まるか、あるいは、非修飾ヌクレオチドの
群から始まるようなパターンであってもよい。しかし、代替的な実施形態では、５’末端
のヌクレオチドが非修飾ヌクレオチドの群により形成されていてもよい。
この種類のパターンは、干渉するＲＮＡの第１のストレッチかまたは第２のストレッチ
で、あるいは両方のいずれかで実現されてもよい。留意されるべき点は、ｓｉＲＮＡ二重
鎖の標的相補鎖の５’ホスフェートがｓｉＲＮＡ機能に必要である点で、細胞が（リン酸
化されうる）遊離５’ＯＨを通じてｓｉＲＮＡの信頼性をチェックし、正真正銘のｓｉＲ
ＮＡだけに標的ＲＮＡ破壊を指示させることが示唆される（Ｎｙｋａｎｅｎ ｅｔ ａｌ
．，２００１）。
好ましくは、第１のストレッチは、修飾ヌクレオチドの群と非修飾ヌクレオチドの群の
、すなわち修飾ヌクレオチドの群と隣接するヌクレオチドの群の、一種類のパターンを示
し、それに対して第２のストレッチはこの種類のパターンを示さないか、またはパターン
を全く示さない。これは、特異性の理由から、第２のストレッチが、ＲＮＡ干渉を媒介す
る際に機能的ではないように化学的に修飾され得るように、第１のストレッチがＲＮＡの
干渉現象の根底にある標的特異的分解プロセスに対して実際により重要である限りにおい
て、有用であり得る。
しかし、第１のストレッチと第２のストレッチとの両方がこの種類のパターンを有する
ことも本発明の範囲内である。好ましくは、修飾と非修飾のパターンは、第１のストレッ
チと第２のストレッチの両方について同じである。
好ましい実施形態では、第２のストレッチを形成し、第１のストレッチの修飾ヌクレオ
チドの群に相当するヌクレオチドの群も修飾されるのに対し、第２のストレッチの非修飾
ヌクレオチドの群または第２のストレッチを形成する非修飾ヌクレオチドの群は、第１の
ストレッチの非修飾ヌクレオチドの群または第１のストレッチを形成する非修飾ヌクレオ
チドの群に相当する。別の代替形態は、第２のストレッチおよび第２の鎖それぞれの修飾
のパターンに対して、第１のストレッチおよび第１の鎖それぞれの修飾のパターンの相の
移動がある点である。好ましくは、この移動は、第１の鎖の修飾ヌクレオチドの群が第２
の鎖の非修飾ヌクレオチドの群に相当し、逆も同じとなるような移動である。修飾のパタ
ーンの相の移動が完全でなく、重複している場合も本発明の範囲内である。
好ましい実施形態では、鎖およびストレッチそれぞれの末端の２番目のヌクレオチドは
、非修飾ヌクレオチドであるか、または非修飾ヌクレオチドの群の先端である。好ましく
は、この非修飾ヌクレオチドまたは非修飾ヌクレオチドの群は第１および第２の鎖それぞ
れの、いっそうより好ましくは第１の鎖の、５’末端に位置する。さらに好ましい実施形
態では、非修飾ヌクレオチドまたは非修飾ヌクレオチドの群は、第１の鎖および第１のス
トレッチそれぞれの５’末端に位置する。好ましい実施形態では、このパターンは、交互
に現れる単一の修飾ヌクレオチドと非修飾ヌクレオチドからなる。
本発明のこの態様のさらに好ましい実施形態では、干渉するリボ核酸対象（ｓｕｂｊｅ
ｃｔ）は２本の鎖を含み、それにより、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドおよび非修飾
ヌクレオチド、好ましくは２’−Ｏ−メチル修飾されていないヌクレオチドは、１つ置き
のヌクレオチドが、それぞれ２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドと非修飾ヌクレオチドで
あることを意味する、交互に並ぶ様式で両方の鎖に組み込まれている。これは、第１の鎖
の１つの２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドの後に、非修飾ヌクレオチドが続き、その後
には順番に２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドが続き、その後も同様であることを意味す
る。２’−Ｏ−メチル修飾および非修飾からなる同一配列は第２の鎖に存在し、それによ
り、好ましくは、第１の鎖の塩基の２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドが第２の鎖の非修
飾ヌクレオチドと対になり、逆も同じとなるような相の移動が存在する。この特定の配置
、すなわち両方の鎖の２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドと非修飾ヌクレオチドの塩基対
形成は短く、干渉するリボ核酸、すなわち短い塩基対形成二本鎖リボ核酸の場合には特に
好ましい。本発明者らは特定の理論に拘束されることを望むものではないが、これは、二
重鎖、好ましくは短い二重鎖を不安定化させ得るある一定の反発力が２つの塩基対を形成
している２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド間に存在するとされているためである。特定
の配置に関して、アンチセンス鎖が５’末端の２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドで始ま
るのであれば好ましく、それにより、その結果として２番目のヌクレオチドは非修飾であ
り、３番目、５番目、７番目などのヌクレオチドは、したがって、再び２’−Ｏ−メチル
修飾され、それに対して２番目、４番目、６番目、８番目等のヌクレオチドは非修飾ヌク
レオチドである。再び、いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、特定の
重要性は、修飾を含まないはずであるアンチセンス鎖の５’末端の２番目、および、場合
により、４番目、６番目、８番目および／または同様の位置に属する場合があると考えら
れ、それに対してアンチセンス鎖の最も５’末端のヌクレオチド、すなわち最初の５’末
端のヌクレオチドは、修飾されてもよいアンチセンス鎖の奇数の位置、例えば１番目、場
合により、３番目、５番目等の位置のこのような修飾を示すことがある。さらなる実施形
態では、修飾および非修飾ヌクレオチドそれぞれの修飾および非修飾は、それぞれ、本明
細書に記載されるいずれのものであってもよい。さらに具体的な実施形態では、本発明の
二本鎖核酸分子は、１９、２１または２３の連続したヌクレオチドの第１の鎖と、１９、
２１または２３の連続したヌクレオチドの第２の鎖からなり、第１の鎖と第２の鎖は本質
的に相互に相補的である。さらに、上記のさらに具体的な実施形態では、二本鎖構造は両
方の末端が平滑末端化されている。標的核酸、すなわちＰＫＮ３をコードしているｍＲＮ
Ａと本質的に相補的な第１の鎖は、５’末端で２’ＯＨ基がメチル化されて２’Ｏ−Ｍｅ
基を形成するヌクレオチドから始まる。この第１の鎖の１つ置きのヌクレオチドは同じ修
飾を有する、すなわち２’ＯＨ基でメチル化されている。したがって、第１の鎖の１番目
、３番目、５番目等の、すなわち任意の奇数のヌクレオチド位置は、そのような方法で修
飾される。第１の鎖の偶数の位置のヌクレオチドは、非修飾ヌクレオチドか修飾ヌクレオ
チドのいずれかであり、その修飾は第１の鎖の奇数のヌクレオチド位置のヌクレオチドの
修飾とは異なっている。第２の鎖はまた、好ましくは、１９、２１または２３ヌクレオチ
ドを含み、２番目、４番目、６番目等の位置に、すなわち任意の偶数のヌクレオチド位置
に修飾されたヌクレオチドを有する。他のヌクレオチドのいずれかは非修飾ヌクレオチド
または修飾ヌクレオチドであり、その修飾は第１の鎖の偶数のヌクレオチド位置のヌクレ
オチドの修飾とは異なっている。したがって、第２の鎖は、上の意味において５’末端で
非修飾ヌクレオチドから始まる。より好ましい実施形態では、第１および第２の鎖の修飾
されたヌクレオチドの修飾は同じであり、第１および第２の鎖の非修飾ヌクレオチドの修
飾も同じである。好ましい実施形態では、アンチセンス、すなわち第１の鎖の５’末端は
、好ましくは、本発明の核酸分子が活性化または作動する細胞中で、好ましくは標的細胞
中でリン酸化されてもよいＯＨ基を有するか、またはリン酸基を有する。センス鎖、すな
わち第２の鎖の５’末端も、好ましくは修飾され、より好ましくは本明細書に開示される
ように修飾されている。３’末端のいずれかまたは両方は、一実施形態では末端にリン酸
を有する。
二本鎖構造が２つの別個の鎖、すなわち第１および第２の鎖により形成されることは、
本発明の範囲内である。しかし、第１の鎖と第２の鎖が相互に共有結合していることも本
発明の範囲内である。このような結合は、第１の鎖および第２の鎖をそれぞれ形成する任
意のヌクレオチド間に起こる場合がある。しかし、両方の鎖間の結合が二本鎖構造の一方
または両方の末端近くに作成されることが好ましい。このような結合は共有もしくは非共
有結合により形成される場合がある。共有結合は、１回または数回、数箇所の位置で、そ
れぞれ、メチレンブルーおよび二官能性基を含む群から選択される化合物により両方の鎖
を結合することにより形成される。このような二官能性基は、好ましくは、ビス（２−ク
ロロエチル）アミン、Ｎ−アセチル（ａｃｅｔｌｙ）−Ｎ’−（ｐ−グリオキシルベンゾ
イル（ｇｌｙｏｘｙｌｂｅｎｚｏｙｌ））シスタミン、４−チオウラシルおよびソラレン
を含む群から選択される。
任意の本発明の第１の代替的な態様によるリボ核酸のさらなる実施形態では、第１の鎖
および第２の鎖は、ループ構造により連結されている。
本発明の第１の代替的な態様によるリボ核酸の好ましい実施形態では、ループ構造は非
核酸ポリマーで構成されている。
その好ましい実施形態では、非核酸ポリマーはポリエチレングリコールである。
任意の本発明の第１の代替的な態様によるリボ核酸の一実施形態では、第１の鎖の５’
末端は第２の鎖の３’末端に連結されている。
本発明の任意の態様によるリボ核酸のさらなる実施形態では、第１の鎖の３’末端は第
２の鎖の５’末端に連結されている。
一実施形態では、ループは核酸からなる。本明細書において、Ｅｌａｙａｄｉ ａｎｄ
Ｃｏｒｅｙに記載されるＬＮＡ（Ｅｌａｙａｄｉ ｅｔ ａｌ．，２００１）；（Ｏｒ
ｕｍ ａｎｄ Ｗｅｎｇｅｌ，２００１）；ならびにＰＮＡは、核酸とみなされ、ループ
を形成するポリマーとして用いられてもよい。基本的に、第１の鎖の５’末端は第２の鎖
の３’末端に連結されてもよい。代替形態として、第１の鎖の３’末端は、第２の鎖の５
’末端に連結されてもよい。上記ループ構造を形成する核酸は、一般に決定的な意味を持
たないとみなされる。しかし、このようなループを形成する核酸配列の長さは、立体的な
理由で決定的な意味を持つと思われる。したがって、４個のヌクレオチドの最小の長さが
、必要とされるループ構造を形成するために適当であると思われる。原則として、ヒンジ
あるいは、ハイブリダイズさせるストレッチまたは鎖の両方の間の結合を形成するヌクレ
オチドの最大数は限定されない。しかし、ポリヌクレオチドが長いほど、二次構造および
三次構造が形成される可能性が高く、したがって、影響を受けるストレッチの必要とされ
る配向が多い。好ましくは、ヒンジを形成するヌクレオチドの最大数は、約１２ヌクレオ
チドである。このことは、本願の開示の範囲内である。上に記載されるデザインのいずれ
もが、本明細書に開示され、当技術分野で公知の他のデザインのいずれともそれぞれ、す
なわち、ループ構造または類似の構造を通じてバックフォールディング（ｂａｃｋ ｆｏ
ｌｄｉｎｇ）が考えられるような方法で２本の鎖を共有結合することにより、組み合わせ
てもよい。
本発明者らは、驚くことに、ループがアンチセンス鎖の３’、すなわち本発明によるリ
ボ核酸の第１の鎖に配置された場合は、この種類のＲＮＡｉの活性は、アンチセンス鎖の
ループ５’の配置と比較して高いことを見出した。したがって、アンチセンス鎖およびセ
ンス鎖、すなわち第１の鎖および第２の鎖それぞれに対するループの特定の配置は重大で
あり、したがって、配向は関連がないと言われる先行技術で表される理解とは対照的であ
る。しかし、本明細書に示される実験結果を考慮するとこれは真実ではないと思われる。
先行技術で表される理解は、いずれのＲＮＡｉもプロセッシングに供され、その間ループ
と連結されていないＲＮＡｉが生成されるという仮定に基づく。しかし、もしこれが真実
である場合は、アンチセンスの３’に配置されたループを有する構造の活性が観察により
明らかに増加したことは説明することができない。その範囲において、この種類の低分子
干渉ＲＮＡｉの５’→３’方向の好ましい配置は、第２の鎖、ループ、第１の鎖である。
それぞれの構築物を適切なベクター系に組み込んでもよい。好ましくは、ベクターは、Ｒ
ＮＡｉのためのプロモーターを含む。好ましくは、それぞれのプロモーターは、ｐｏｌ
ＩＩＩであり、より好ましくは、プロモーターは、Ｇｏｏｄ ｅｔ ａｌ．により記載さ
れるＵ６、Ｈ１、７ＳＫプロモーターである（Ｇｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。
本発明の第１の態様の第２の代替的な態様は、本発明の核酸に関し、その第１のストレ
ッチおよび／または第２のストレッチは、３’末端にジヌクレオチドを含み、このような
ジヌクレオチドは、好ましくはＴＴである。好ましい実施形態では、第１のストレッチお
よび／または第２のストレッチの長さは、１９または２１または２３ヌクレオチドのいず
れかからなり、より好ましくは、二本鎖構造は１８〜２２、より好ましくは１９〜２１塩
基対を含む。この代替的な態様による核酸のデザインは、例えば、国際特許出願第ＷＯ０
１／７５１６４号により詳細に記載されている。
本発明の第１の態様の第３の代替的な態様は、本発明による核酸に関し、その第１およ
び／または第２のストレッチは、３’末端に１〜５ヌクレオチドのオーバーハングを含む
。この代替的な態様による核酸のデザインは、国際特許出願第ＷＯ０２／４４３２１号に
より詳細に記載されている。より好ましくは、このようなオーバーハングはリボ核酸であ
る。好ましい実施形態では、鎖の各々、より好ましくは、本明細書に定義されるストレッ
チの各々の長さは、１９〜２５ヌクレオチドであり、より好ましくは、その鎖は、ストレ
ッチからなる。好ましい実施形態では、本発明による核酸の二本鎖構造は、１７〜２５塩
基対、好ましくは１９〜２３塩基対、より好ましくは、１９、２１または２３塩基対を含
む。
本発明の第１の態様の第４の代替的な態様は、本発明による核酸に関し、その第１およ
び／または第２のストレッチは、３’末端に１〜５ヌクレオチドのオーバーハングを含む
。この代替的な態様による核酸のデザインは、ＷＯ０２／４４３２１号に記載されている
。
本発明の第１の態様の第５の代替的な態様では、本発明による核酸は、ＣＤ３１ ｍＲ
ＮＡの開裂を、好ましくはＲＮＡ干渉を介して指示する、化学的に合成された二本鎖短干
渉核酸（ｓｉＮＡ）分子である二本鎖核酸であり、上記ｓｉＮＡ分子の各鎖の長さは１８
〜２７または１９〜２９ヌクレオチドであり、上記ｓｉＮａ分子は少なくとも１つの化学
修飾されたヌクレオチド非ヌクレオチドを含む。この代替的な態様による核酸のデザイン
は、国際特許出願第ＷＯ０３／０７０９１０号および英国特許２ ３９７ ０６２号によ
り詳細に記載されている。
その一実施形態では、ｓｉＮＡ分子はリボヌクレオチドを含まない。別の実施形態では
、ｓｉＮＡ分子は１つ以上のヌクレオチドを含む。別の実施形態では、化学修飾されたヌ
クレオチドは、２’−デオキシヌクレオチドを含む。別の実施形態では、化学修飾された
ヌクレオチドは、２’−デオキシ２’−フルオロヌクレオチドを含む。別の実施形態では
、化学修飾されたヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを含む。別の実施形態
では、化学修飾されたヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。
さらなる実施形態では、非ヌクレオチドは脱塩基部分を含み、好ましくは、その脱塩基部
分は逆方向デオキシ脱塩基部分を含む。別の実施形態では、非ヌクレオチドは、グリセリ
ル部分を含む。
さらなる実施形態では、第１の鎖および第２の鎖は、リンカー分子を介して連結されて
いる。好ましくは、リンカー分子はポリヌクレオチドリンカーである。あるいは、リンカ
ー分子は非ヌクレオチドリンカーである。
第５の代替的な態様による核酸のさらなる実施形態では、第２の鎖中のピリミジンヌク
レオチドは、２’−Ｏ−メチルピリミジンヌクレオチドである。
第５の代替的な態様による核酸のさらなる実施形態では、第２の鎖中のプリンヌクレオ
チドは、２’−デオキシプリンヌクレオチドである。
第５の代替的な態様による核酸のさらなる実施形態では、第２の鎖中のピリミジンヌク
レオチドは、２’−デオキシ２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである。
第５の代替的な態様による核酸のさらなる実施形態では、第２の鎖は、５’末端に、３
’末端に、または５’末端および３’末端の両方に末端キャップ部分を含む。
第５の代替的な態様による核酸のさらなる実施形態では、第１の鎖中のピリミジンヌク
レオチドは、２’−デオキシ２’フルオロピリミジンヌクレオチドである。
第５の代替的な態様による核酸のさらなる実施形態では、第１の鎖中のプリンヌクレオ
チドは、２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである。
第５の代替的な態様による核酸のさらなる実施形態では、第１の鎖中のプリンヌクレオ
チドは、２’−デオキシプリンヌクレオチドである。
第５の代替的な態様による核酸のさらなる実施形態では、第１の鎖は、ホスホロチオエ
ートヌクレオチド間結合を第１の鎖の３’末端に含む。
第５の代替的な態様による核酸のさらなる実施形態では、第１の鎖は、グリセリル修飾
を第１の鎖の３’末端に含む。
第５の代替的な態様による核酸のさらなる実施形態では、第１および第２の鎖の両方の
約１９〜２３ヌクレオチドが塩基対を形成し、好ましくは少なくともｓｉＮＡ分子の各鎖
の２つの３’末端のヌクレオチドは他の鎖のヌクレオチドと塩基対を形成しない。好まし
くは、ｓｉＮＡ分子の各鎖の２つの３’末端のヌクレオチドの各々は、２’−デオキシ−
ピリミジンである。より好ましくは、２’デオキシ−ピリミジンは２’デオキシ−チミジ
ンである。
第５の代替的な態様による核酸のさらなる態様では、第１の鎖の５’末端はリン酸基を
含む。
特に本発明による核酸の第５の代替的な態様の一実施形態では、本発明のｓｉＮＡ分子
は、ＲＮＡｉを媒介する能力を維持しながら、修飾されたヌクレオチドを含む。修飾ヌク
レオチドは、インビトロまたはインビボでの特徴、例えば安定性、活性、および／または
バイオアベイラビリティを改善するために用いることができる。例えば、本発明のｓｉＮ
Ａ分子は、そのｓｉＮＡ分子中に存在するヌクレオチドの総数の一定の割合の修飾ヌクレ
オチドを含むことができる。そのように、本発明のｓｉＮＡ分子は一般に約５％〜約１０
０％の修飾ヌクレオチド（例えば、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３
５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８
５％、９０％、９５％または１００％の修飾ヌクレオチド）を含むことができる。所与の
ｓｉＮＡ分子中に存在する修飾ヌクレオチドの実際の割合は、そのｓｉＮＡ中に存在する
ヌクレオチドの総数によって決まることになる。そのｓｉＮＡ分子が一本鎖である場合は
、修飾パーセントは、一本鎖ｓｉＮＡ分子中に存在するヌクレオチドの総数に基づき得る
。同様に、ｓｉＮＡ分子が二本鎖である場合は、修飾パーセントは、センス鎖、アンチセ
ンス鎖、またはセンス鎖とアンチセンス鎖の両方に存在するヌクレオチドの総数に基づき
得る。
非限定的な例において、化学修飾したヌクレオチドの、特に本発明による核酸の第５の
代替的な態様の核酸分子への導入は、インビボ安定性および外部から送達される天然のＲ
ＮＡ分子に固有の生物学的利用能の潜在的な限界を克服する強力なツールを提供する。例
えば、化学修飾された核酸分子は血清中の半減期を長くする傾向があるため、化学修飾さ
れた核酸分子を使用することにより、一定の治療効果のための特定の核酸分子の用量を減
らすことを可能にすることができる。さらに、ある一定の化学修飾は、特定の細胞組織を
標的化することおよび／または核酸分子の細胞取込みを改善することにより核酸分子の生
物学的利用能を改善することができる。したがって、たとえ化学修飾された核酸分子の活
性が、天然の核酸分子と比較して低下したとしても、例えば、全てＲＮＡの核酸分子と比
較した場合、修飾された核酸分子の全体的な活性は、改善された分子の安定性および／ま
たは送達に起因して天然の分子のものよりも大きくなる可能性がある。天然の修飾されて
いないｓｉＮＡとは異なり、化学修飾されたｓｉＮＡもまた、ヒトのインターフェロン活
性を活性化する可能性を最小化することができる。
好ましくは、本発明による核酸の第５の代替的な態様に関連して、本発明のｓｉＮＡ分
子のアンチセンス鎖、すなわち第１の鎖は、上記アンチセンス領域の３’末端にホスホロ
チオエートヌクレオチド間結合を含むことができる。アンチセンス鎖は、上記アンチセン
ス領域の５’末端に約１〜約５のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むことがで
きる。本発明のｓｉＮＡ分子の３’末端ヌクレオチドオーバーハングは、核酸の糖、塩基
または骨格で化学修飾されたリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドを含むこ
とができる。３’末端ヌクレオチドオーバーハングは、１つ以上のユニバーサル塩基リボ
ヌクレオチドを含むことができる。３’末端ヌクレオチドオーバーハングは、１つ以上の
非環式ヌクレオチドを含むことができる。
特にヌクレオチドから作成されたループを含む本発明の実施形態は、ベクターにより使
用され、発現される場合に適していることは、当業者により認識される。好ましくは、こ
のベクターは発現ベクターである。このような発現ベクターは、いずれの遺伝子治療的ア
プローチにおいても特に有用である。したがって、このようなベクターは、本明細書に開
示される疾患の治療に使用することが好ましい薬剤の製造のために用いることができる。
しかし、天然に存在しない修飾を含む本発明による核酸の任意の実施形態が、ベクターお
よびこのようなベクターのための発現系、例えば、細胞、組織、器官および生物における
発現に直ちに用いることができないことも、当業者より認識される。しかし、修飾が、典
型的にベクターによる核酸の発現の後に、本発明によるベクター由来またはベクター発現
核酸に付加されるか、または導入されてもよいことは、本発明の範囲内である。特に好ま
しいベクターは、プラスミドベクターまたはウイルスベクターである。ｓｉＲＮＡ分子お
よびＲＮＡｉ分子を発現ベクター中でどのように使用すればよいかについての技術的教示
は、例えば、国際特許出願第ＷＯ０１／７０９４９号に記載されている。このようなベク
ターは、本発明による核酸が持続的に存在することが好ましく有用である、治療または診
断のいずれかの方法において、それぞれ有用であることが好ましいが、分子が一時的に存
在することが望ましいあるいは有用である場合には、本発明による非ベクター核酸および
特に本発明による化学修飾されたあるいは化学的に合成された核酸が特に有用であること
は、当業者により認識される。
本明細書に記載される核酸分子の合成のための方法は、当業者に公知である。このよう
な方法は、中でも、（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２）、Ｔｈｏｍｐｓｏ
ｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＴ国際公開第ＷＯ９９／５４４５９号、（Ｗｉｎｃｏｔｔ ｅｔ
ａｌ．，１９９５）、（Ｗｉｎｃｏｔｔ ａｎｄ Ｕｓｍａｎ，１９９７）、Ｂｒｅｎ
ｎａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．，６１，３３
−４５、およびＢｒｅｎｎａｎ、米国特許第６，００１，３１１号に記載されている。こ
れらの参考文献はすべて、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
さらなる態様において、本発明は、１個または数個の本発明による核酸分子を含む、よ
り具体的には含有するリポソーム製剤に関する。好ましくは、このようなリポソーム製剤
は、内部体積を画定する脂質からなる。このような内部体積は、本発明の核酸分子を含む
ことが好ましい。より好ましくは、このような製剤はリポソームを含み、好ましい実施形
態では、リポソームは１種または数種類の陽イオン性脂質を含むかあるいは含有する。最
も好ましい実施形態では、リポソーム製剤は、１個または数個の本発明の核酸分子を、そ
の核酸分子がリポソームの外側の表面で検出できない、または外側の表面上に存在しない
ように含む。本明細書において好ましく用いられるように、リポソームの外側の表面は、
リポソームの周囲の環境と接しているリポソームの表面であり、リポソームにより包含さ
れている流体と接しているリポソームの表面とは特に対照的である。特に好ましい実施形
態では、本発明による核酸分子は、上記リポソームおよびリポソーム製剤それぞれに充填
または封入されている。
さらなる態様において、本発明は、本発明による核酸を含むリポプレックスに関し、こ
のようなリポプレックスは、１個または数個の核酸分子と１個または数個のリポソームと
からなる。好ましい実施形態では、リポプレックスは、１つのリポソームと数個の核酸分
子とからなる。
リポプレックスは次の通り特徴付けることができる。本発明によるリポプレックスのゼ
ータ電位は約４０〜５５ｍＶ、好ましくは約４５〜５０ｍＶである。本発明によるリポプ
レックスの大きさは、動的光散乱（ＱＥＬＳ）により、例えば、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕ
ｌｔｅｒ製のＮ５サブミクロン粒径アナライザーを製造業者の推奨に従って用いることに
より測定して、約８０〜２００ｎｍ、好ましくは約１００〜１４０ｎｍ、より好ましくは
約１１０ｎｍ〜１３０ｎｍである。
本発明によるリポプレックスの形成部分としてのリポソームは、好ましくは、
ａ）約５０モル％のβ−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−
Ｎ−オレイル−アミドトリヒドロクロリド、好ましくは、（β−（Ｌ−アルギニル）−２
，３−Ｌ−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミド トリ−ヒド
ロクロリド）、
ｂ）約４８〜４９モル％の１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノ
ールアミン（ＤＰｈｙＰＥ）、および
ｃ）約１〜２モル％の１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノール
アミン−ポリエチレン−グリコール、好ましくは、Ｎ−（カルボニル−メトキシポリエチ
レングリコール−２０００）−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエ
タノールアミンナトリウム塩
からなる、正に荷電したリポソームである。
リポプレックスおよびリポソームを形成する脂質組成物は、好ましくは、担体の中に含
められている。しかし、リポプレックスは凍結乾燥した形態でも存在することができる。
担体の中に含まれている脂質組成物は、通常分散体を形成する。より好ましくは、担体は
、これも本明細書においてさらに特徴付けられる、水性媒質または水溶液である。脂質組
成物は典型的に担体の中にリポソームを形成する。このようなリポソームも内部に担体を
含むことが好ましい。
個々に担体の中に含まれ、担体を含む脂質組成物の容量オスモル濃度は、約５０〜６０
０ ｍｏｓｍｏｌｅ／ｋｇ、好ましくは約２５０〜３５０ ｍｏｓｍｏｌｅ／ｋｇ、より
好ましくは約２８０〜３２０ ｍｏｓｍｏｌｅ／ｋｇであることが好ましい。
リポソームは、好ましくは、第１の脂質成分と、任意選択的に第１のヘルパー脂質とに
よっても、好ましくは第１の脂質成分と組み合わせて形成され、好ましくは約２０〜２０
０ｎｍ、好ましくは約３０〜１００ｎｍ、より好ましくは約４０〜８０ｎｍの粒径を示す
。
さらに、粒子のサイズがある一定の統計的分布に従うことは認識される。
本発明による脂質組成物のさらなる任意選択的な特徴は、担体のｐＨが、好ましくは約
４．０〜６．０である点である。しかし、他のｐＨ範囲、例えば、４．５〜８．０、好ま
しくは約５．５〜７．５、より好ましくは約６．０〜７．０なども本発明の範囲内である
。
これらの特定の特徴を実現するために、様々な手段を取ってもよい。容量オスモル濃度
を調節するためには、例えば、糖または糖の組合せが特に有用である。その程度において
、本発明の脂質組成物は、１個または数個の次の糖、スクロース、トレハロース、グルコ
ース、ガラクトース、マンノース、マルトース、ラクツロース、イヌリンおよびラフィノ
ースを含んでよく、スクロース、トレハロース、イヌリンおよびラフィノースが特に好ま
しい。特に好ましい実施形態では、主に糖の添加により調節される容量オスモル濃度は、
約３００ ｍｏｓｍｏｌｅ／ｋｇであり、２７０ｍＭのスクロース溶液または２８０ｍＭ
のグルコース溶液に相当する。好ましくは、担体は、このような脂質組成物の投与される
体液に等張性である。本明細書において、容量オスモル濃度は主に糖の添加により調節さ
れるという用語は、少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％の容量オスモル
濃度が上記糖または上記糖の組合せによりもたらされることを意味する。
本発明の脂質組成物のｐＨが調節される場合、それ自体、基本的に当業者に公知の緩衝
物質を用いることにより行われる。好ましくは、陽イオン性脂質、およびより具体的には
カチオン性ヘッドグループのアンモニウム基の塩基性の特徴を補うのに適した塩基性物質
が使用される。塩基性物質、例えば、塩基性アミノ酸および弱塩基などをそれぞれ付加す
る場合、上記の容量オスモル濃度を考慮に入れる。このような脂質組成物およびこのよう
な脂質組成物により形成されるリポソームの粒径は、動的光散乱により、例えば、Ｂｅｃ
ｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ製のＮ５サブミクロン粒径アナライザーを製造業者の推奨に従
って用いることにより測定されることが好ましい。
脂質組成物が１個または数個の核酸を含む場合は、このような脂質組成物は通常リポプ
レックス複合体、すなわちリポソームと核酸からなる複合体を形成する。好ましくは、等
張性２７０ｍＭスクロースまたは２８０ｍＭグルコース中の、リポプレックス中の脂質含
量全体のより好ましい濃度は、約０．０１〜１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．０１〜４
０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．０１〜２５ｍｇ／ｍｌである。この濃度は合理的なス
トックを調製するために、典型的に２〜３倍に増加させることができることは認識される
。これに基づいて、希釈物が調製され、このような希釈物は典型的に容量オスモル濃度が
上に指定した範囲内となるように作成されることも、本発明の範囲内である。より好まし
くは、希釈物は、脂質組成物に関連して用いられる担体、または、脂質組成物が含められ
ている担体と同一であるか、または、機能、より具体的には容量オスモル濃度に関してそ
れに類似する担体中に調製される。脂質組成物も核酸、好ましくは機能的な核酸、例えば
、限定されるものではないが、ｓｉＲＮＡなどを含む、本発明の脂質組成物の実施形態で
は、脂質組成物中のｓｉＲＮＡの濃度は、約０．２〜０．４ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．
２８ｍｇ／ｍｌであり、総脂質濃度は約１．５〜２．７ｍｇ／ｍｌ、好ましくは２．１７
ｍｇ／ｍｌである。核酸分率と脂質分率との間のこの質量比は特に好ましく、電荷比に関
してもこのように実現されることは、認識される。本発明の脂質組成物のさらなる濃度ま
たは希釈に関連して、この特定の実施形態で実現される質量比および電荷比がそれぞれ、
好ましくはこのような濃度または希釈に拘わらずに維持されることは、好ましい。
例えば、医薬組成物に用いられる濃度は、適切な量の媒質、好ましくは生理学的に許容
される緩衝液または本明細書に記載されるに任意の担体中に脂質を分散させることにより
得ることができるか、または適切な手段により濃縮することができる。このような適切な
手段は、例えば、クロスフロー限外濾過を含む限外濾過法である。濾過膜は、１．０００
〜３００．０００Ｄａの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）または５ｎｍ〜１μｍの孔幅を示
してもよい。特に好ましいものは、約１０．０００〜１００．０００Ｄａ ＭＷＣＯの孔
幅である。本発明による脂質組成物、より具体的にはリポプレックスは、凍結乾燥した形
態で存在してもよく、ことも、当業者に認識される。このような凍結乾燥形態は、典型的
に、リポプレックスの保存期間を増やすために適している。中でも、適切な容量オスモル
濃度をもたらすために付加される糖は、それに関連して凍結保護物質として使用される。
それに関連して、前述の特徴である、容量オスモル濃度、ｐＨならびにリポプレックス濃
度は、担体中の脂質組成物の溶解、懸濁または分散形態をさし、このような担体は、原則
として本明細書に記載される任意の担体、一般に水性担体、例えば、水または生理学的に
許容される緩衝液、好ましくは等張性緩衝液もしくは等張性溶液などであることは認識さ
れる。
これらの特定の製剤を別として、本発明による核酸分子は、また当技術分野で公知の医
薬組成物にも処方されてもよい。
したがって、本発明による核酸分子は、好ましくは、単独で、または他の治療法と併用
して、薬剤および診断としての使用に順応させることができる。例えば、本発明による核
酸分子は、被験体への投与のためのリポソーム、担体および希釈剤ならびにそれらの塩を
含む送達ビヒクルを含むことができ、かつ／または医薬品として許容される製剤中に存在
することができる。核酸分子の送達のための方法は、（Ａｇｒａｗａｌ ａｎｄ Ａｋｈ
ｔａｒ，１９９５；Ａｋｈｔａｒ ａｎｄ Ｊｕｌｉａｎｏ，１９９２）、（Ｍａｕｒｅ
ｒ ｅｔ ａｌ．，１９９９）；（Ｈｏｆｌａｎｄ ａｎｄ Ｈｕａｎｇ，１９９５）；
およびＬｅｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，ＡＣＳ Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．，７５２，１８４
−１９２に記載され、それら全ては引用することにより本明細書の一部をなすものとする
。Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．、米国特許第６，３９５，７１３号およびＳｕｌｌ
ｉｖａｎ ｅｔ ａｌ．、ＰＣＴ ＷＯ９４／０２５９５号には、核酸分子の送達のため
の一般的な方法がさらに説明されている。これらのプロトコールは、事実上いずれの核酸
分子の送達にも利用することができる。核酸分子はまた、当業者に公知の様々な方法によ
り細胞に投与することができ、それらに限定されるものではないが、リポソームへのカプ
セル封入、イオン導入法によるもの、または他のビヒクル、例えばヒドロゲル、シクロデ
キストリン（例えば、Ｇｏｎｚａｌｅｚ ｅｔ ａｌ．，１９９９参照）、生分解性ナノ
カプセル、および生体接着性ミクロスフェアなどへの取り込みによるもの、またはタンパ
ク質性ベクターによるもの（Ｏ’Ｈａｒｅ ａｎｄ Ｎｏｒｍａｎｄ、ＰＣＴ国際公開第
ＷＯ００／５３７２２号）が挙げられる。代替的には、核酸／ビヒクルの組合せは、直接
注射によるか、または輸液ポンプを使用して局所に送達される。本発明の核酸分子の直接
注射は、皮下、筋肉内、または皮内であろうと、標準的な針およびシリンジによる方法を
用いて、または無針技術、例えば、（Ｃｏｎｒｙ ｅｔ ａｌ．，１９９９）およびＢａ
ｒｒｙ ら、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ９９／３１２６２号に記載される方法等により行うこ
とができる。本発明の分子は医薬品として使用することができる。好ましくは、医薬品は
、被験体における疾患状態を予防し、発生を調節し、または治療する（症状をある程度ま
で、好ましくは症状のすべてを軽減する）。
したがって、本発明はまた、本発明による１つ以上の核酸を、許容される担体中、例え
ば安定剤、緩衝剤等の中に含む医薬組成物を提供する。本発明のポリヌクレオチドまたは
核酸（分子）は、安定剤、緩衝剤等を含むかあるいは含まずに、任意の標準的な手段によ
り、投与され（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはタンパク質）、被験体に導入されて、医薬
組成物を形成することができる。リポソーム送達機構を使用することを望む場合、リポソ
ームの処方のための標準的なプロトコールに従い得る。本発明の組成物はまた、経口投与
用の錠剤、カプセル剤またはエリキシル剤、直腸投与用の坐剤、注射投与用の無菌溶液、
懸濁剤、および当技術分野で公知の他の組成物として処方され、使用されてもよい。
さらに、本発明による核酸分子の医薬品として許容される製剤が提供される。これらの
製剤には、上記の化合物の塩、例えば、酸付加塩、例えば、塩酸、臭化水素酸、酢酸、お
よびベンゼンスルホン酸の塩が含まれる。
薬理学的組成物もしくは製剤とは、例えばヒトを含む細胞または被験体への投与、例え
ば全身投与に適した形態の組成物または製剤をさす。適切な形態は、一部は、使用または
導入経路、例えば経口、経皮、または注射によって決まる。このような形態は、組成物ま
たは製剤が標的細胞（すなわち、負に荷電した核酸を送達するために望ましい細胞）に到
達することを妨げてはならない。例えば、血流に注入される薬理学的組成物は可溶性であ
るべきである。他の因子は当技術分野で公知であり、組成物または製剤がその効果を発揮
することを妨げる毒性および形態などの考慮点が含まれる。
「全身投与」は、好ましくは、血流中の薬剤のインビボ全身吸収または蓄積、その後全
身の至る所への分布を意味する。全身吸収をもたらす投与経路としては、静脈内、皮下、
腹腔内、吸入、経口、肺内および筋肉内が挙げられるが、これらには限定されない。これ
らの投与経路は各々、本発明のｓｉＮＡ分子を到達できる罹患組織にさらす。循環中への
薬剤の侵入率は、分子量または大きさの関数であることが示された。本発明による核酸を
含むリポソームまたは他の薬剤担体を使用すると、例えば、ある一定の組織種、例えば新
生物組織などに、薬剤を局在させる可能性がある。細胞、例えばリンパ球およびマクロフ
ァージの表面と薬剤の会合を促進することができるリポソーム製剤も有用である。このア
プローチは、異常細胞、例えば新生物組織を形成する細胞などのマクロファージおよびリ
ンパ球免疫認識の特異性を生かして、標的細胞への薬剤の送達の促進をもたらすことがで
きる。
「医薬品として許容される製剤」は、好ましくは、本発明による核酸分子を、それらの
望ましい活性に最も適した身体的位置に効果的に分布することを可能にする組成物または
製剤を意味する。本発明による核酸分子とともに処方に適した薬剤の非限定的な例として
は：薬剤の中枢神経系への侵入を増強することができる、Ｐ糖タンパク質阻害剤（例えば
プルロニックＰ８５など）（Ｊｏｌｌｉｅｔ−Ｒｉａｎｔ ａｎｄ Ｔｉｌｌｅｍｅｎｔ
，１９９９）；大脳内移植後の徐放性送達のための生分解性ポリマー、例えばポリ（ＤＬ
−ラクチド−コグリコリド）ミクロスフェア（Ｅｍｅｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９９
）（Ａｌｋｅｒｍｅｓ，Ｉｎｃ．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）；および、血液脳関門を通
過して薬剤を送達することができ、ニューロンへの取り込み機構を変更することができる
、負荷ナノ粒子、例えばポリブチルシアノアクリレートでできたものなど（Ｐｒｏｇ Ｎ
ｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｂｉｏｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ，２３，９
４１−９４９，１９９９）が挙げられる。本発明の核酸分子のための送達戦略の他の非限
定的な例は、（Ｂｏａｄｏ ｅｔ ａｌ．，１９９８）；Ｔｙｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１
９９９，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，４２１，２８０−２８４；ｐａｒｄｒｉｄｇｅ ｅｔ
ａｌ．，１９９５，ＰＮＡＳ ＵＳＡ．，９２，５５９２−５５９６；Ｂｏａｄｏ，１９
９５，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．，１５，７３−１０７；Ａｌｄｒ
ｉａｎ−Ｈｅｒｒａｄａ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．，２６，４９１０−４９１６；およびＴｙｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９９，ＰＮＡ
Ｓ ＵＳＡ．，９６，７０５３−７０５８に記載されている。
本発明によれば、ポリ（エチレングリコール）脂質を含有する表面修飾されたリポソー
ム（ＰＥＧ修飾された、あるいは長期血中滞留性リポソームまたはステルスリポソーム）
を含む組成物の使用も提供される。これらの製剤は、標的組織において薬剤の蓄積を増大
させるための方法を提供する。このクラスの薬剤担体は、オプソニン化に抵抗して単核食
細胞系（ＭＰＳまたはＲＥＳ）により排除され、それによって、より長い血液循環時間、
およびカプセル封入された薬剤への組織の曝露を増強させることができる（Ｌａｓｉｃ
ｅｔ ａｌ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１９９５，９５，２６０１−２６２７；Ｉｓｈｉｗａｔ
ａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．１９９５，４３，１００５−１０
１１）。このようなリポソームは、推定上、血管外遊出により、および新血管形成した標
的組織の捕獲により、選択的に腫瘍に蓄積されることが示されている、（Ｌａｓｉｃ ｅ
ｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９５，２６７，１２７５−１２７６；Ｏｋｕ ｅｔ
ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１２３８，８６−９０
）。長期血中滞留性リポソームは、特に、ＭＰＳの組織に蓄積することが公知の従来の陽
イオン性リポソームと比較して、ＤＮＡおよびＲＮＡの薬物動態学および薬動力学を増強
する（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９５，４２，２４８６４−
２４７８０；Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＴ国際公開第ＷＯ９６／１０３９１号；Ａｎ
ｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＴ国際公開第ＷＯ９６／１０３９０号；Ｈｏｌｌａｎｄ
ｅｔ ａｌ．，ＰＣＴ国際公開第ＷＯ９６／１０３９２号）。長期循環リポソームはまた
、代謝的に攻撃的なＭＰＳ組織、例えば肝臓および脾臓などでの蓄積を回避するそれらの
能力に基づいて、ヌクレアーゼ分解から薬剤を保護する可能性が陽イオン性リポソームと
比較して非常に高い。
投与を保存するために調製された組成物がさらに提供され、それには医薬有効量の所望
の化合物が医薬品として許容される担体または希釈剤中に含まれる。治療用途に許容され
る担体または希釈剤は製薬分野で周知であり、例えば、引用することにより本明細書の一
部をなすものとする、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉ
ｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ ｅｄ
ｉｔ．１９８５）に記載されている。例えば、防腐剤、安定剤、染料および香味剤が規定
され得る。これらには、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸およびｐ−ヒドロキシ安息香酸
のエステルが含まれる。さらに、抗酸化剤および沈殿防止剤を用い得る。
医薬有効量は、疾患状態の発生、または脅威を防ぎ、阻害する（症状をある程度、好ま
しくは、症状を全て軽減する）ために必要とされる用量である。医薬有効量は、疾患の種
類、用いる組成物、投与の経路、治療される哺乳類の種類、考慮中の具体的な哺乳類の身
体的特徴、同時に行われる薬剤治療、および医学分野の当業者の認める他の因子によって
決まる。一般に、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ体重／日量の有効成分が、負に荷
電したポリマーの有効性に依存して投与される。
本発明による核酸分子およびその製剤は、従来の無毒の医薬品として許容される担体、
アジュバントおよび／またはビヒクルを含有する投与単位製剤で、経口的に、局所に、非
経口的に、吸入またはスプレーにより、または直腸に投与されてもよい。本明細書におい
て非経口という用語には、経皮、皮下、血管内（例えば、静脈内）、筋肉内、またはくも
膜下腔内の注射もしくは注入技術等が含まれる。さらに、本発明の核酸分子および医薬品
として許容される担体を含む医薬製剤が提供される。本発明による１つ以上の核酸分子は
、１つ以上の無毒の医薬品として許容される担体および／または希釈剤および／またはア
ジュバント、および所望により他の有効成分に付随して存在してもよい。本発明による核
酸分子を含有する医薬組成物は、経口使用に適した形態で、例えば、錠剤、トローチ剤、
ロゼンジ剤、水性もしくは油性懸濁剤、分散性粉末剤もしくは顆粒剤、乳濁液、硬もしく
は軟カプセル剤、またはシロップ剤もしくはエリキシル剤として、存在してもよい。
経口使用を対象とした組成物および特に医薬組成物は、医薬組成物の製造の分野で公知
の任意の方法により調製することができ、このような組成物は、製薬上洗練された口当た
りのよい調製物を提供するために、１つ以上のこのような甘味剤、香味剤、着色剤または
防腐剤を含んでよい。錠剤は、有効成分を、錠剤の製造に適した無毒の医薬品として許容
される賦形剤と混合して含む。これらの賦形剤は、例えば、不活性希釈剤；例えば、炭酸
カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウムまたはリン酸ナトリウムな
ど；造粒剤および崩壊剤、例えば、トウモロコシデンプン、またはアルギン酸；結合剤、
例えばデンプン、ゼラチンまたはアラビアガム；ならびに潤滑剤、例えばステアリン酸マ
グネシウム、ステアリン酸またはタルクであり得る。錠剤は、コーティングされていなく
てもよく、公知の技法でコーティングすることもできる。いくつかの例では、このような
コーティングは、胃腸管での分解および吸収を遅延させるための公知の技法により調製す
ることができ、それによって長期間にわたる持続作用がもたらされる。例えば、時間遅延
物質、例えば、モノステアリン酸グリセリンまたはジステアリン酸グリセリンなどを用い
ることができる。
経口使用のための製剤はまた、有効成分が不活性固体希釈剤、例えば、炭酸カルシウム
、リン酸カルシウムまたはカオリンと混合されている硬ゼラチンカプセル剤として、ある
いは、有効成分が水また油の媒質、例えばピーナッツ油、流動パラフィンまたはオリーブ
油と混合されている軟ゼラチンカプセル剤として存在し得る。
水性懸濁剤は、水性懸濁剤の製造に適した賦形剤との混合物中に活性物質を含む。この
ような賦形剤は、沈殿防止剤、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセ
ルロース、ヒドロプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリ
ドン、トラガカントガムおよびアラビアガムである。分散剤または湿潤剤は天然に存在す
るホスファチド、例えばレシチンであるか、または酸化アルキレンと脂肪酸の縮合生成物
、例えばステアリン酸ポリオキシエチレンであるか、またはエチレンオキシドと長鎖脂肪
族アルコールの縮合生成物、例えばヘプタデカエチレンオキシオクタノールであるか、ま
たはエチレンオキシドと、脂肪酸およびヘキシトールに由来する部分エステルの縮合生成
物、例えば、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレエートなどであるか、またはエチ
レンオキシドと、脂肪酸およびヘキシトール無水物に由来する部分エステルの縮合生成物
、例えばポリエチレンソルビタンモノオレエートであり得る。水性懸濁剤はまた、１つ以
上の防腐剤、例えばエチル、またはｎ−プロピルｐ−ヒドロキシベンゾエート、１つ以上
の着色剤、１つ以上の香味剤、および１つ以上の甘味剤、例えばスクロースまたはサッカ
リンなどを含み得る。
油性懸濁剤は、有効成分を植物油、例えばラッカセイ油、オリーブ油、ゴマ油またはコ
コナッツ油、あるいは鉱油、例えば、流動パラフィンなどに懸濁することにより処方する
ことができる。油性懸濁剤は、増粘剤、例えば蜜蝋、固形パラフィンまたはセチルアルコ
ールを含み得る。甘味剤および香味剤を加えて口当たりのよい経口調製物を得ることがで
きる。これらの組成物は、抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸などを添加することにより
保存することができる。
水を添加することによる水性懸濁剤の調製に適した分散性粉末剤および顆粒剤は、分散
剤または湿潤剤、沈殿防止剤および１つ以上の防腐剤との混合物中に有効成分を提供する
。適切な分散剤または湿潤剤あるいは沈殿防止剤は既に上記で述べたものにより例示され
る。さらなる賦形剤、例えば甘味剤、香味剤および着色剤も含まれ得る。
本発明の医薬組成物はまた、水中油型エマルジョンの形態であり得る。油相は、植物油
または鉱油あるいはこれらの混合物であり得る。適切な乳化剤は、天然に存在するガム、
例えばアラビアガムまたはトラガカントガム、天然に存在するホスファチド、例えばダイ
ズ、レシチン、ならびに脂肪酸およびヘキシトールに由来するエステルもしくは部分エス
テル、無水物、例えばソルビタンモノオレエート、ならびに上記部分エステルとエチレン
オキシドの縮合生成物、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートであり得る
。乳濁液はまた、甘味剤および香味剤を含み得る。
シロップ剤およびエリキシル剤は、甘味剤、例えばグリセロール、プロピレングリコー
ル、ソルビトール、グルコースまたはスクロースとともに処方され得る。このような製剤
はまた、粘滑薬、防腐剤および香味剤および着色剤を含んでもよい。医薬組成物は、無菌
注射用水性もしくは油性懸濁剤の形態であり得る。この懸濁剤は、上に述べた適切な分散
剤または湿潤剤および沈殿防止剤を用いる既知の技術により処方することができる。無菌
注射用製剤はまた、無毒の非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の無菌注射用溶液ま
たは懸濁剤、例えば１，３−ブタンジオール中溶液などであってもよい。許容されるビヒ
クルおよび溶媒の中で用いることができるものは、水、リンゲル液および等張食塩水溶液
である。さらに、無菌の硬化油が溶媒または懸濁媒体として従来用いられている。この目
的において、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含む、任意の無刺激性の硬化油を
用い得る。さらに、脂肪酸、例えば、オレイン酸などは、注射液の調製において使用が見
出される。
本発明の核酸分子はまた、例えば、薬剤の直腸投与用の坐剤の形態で投与することがで
きる。これらの組成物は、常温で固体であるが直腸温度で液体となり、したがって、直腸
で溶けて薬剤を放出する、適切な非刺激性賦形剤と薬剤を混合することにより調製するこ
とができる。このような物質としては、カカオバターおよびポリエチレングリコールが挙
げられる。
本発明の核酸分子は、無菌媒体中で非経口的に投与されてもよい。使用するビヒクルお
よび濃度に依存して、薬剤を、ビヒクル中に懸濁するかまたはビヒクルに溶解することが
できる。有利には、アジュバント、例えば、局所麻酔薬、防腐剤および緩衝剤などをビヒ
クルに溶解させることができる。
薬剤および医薬組成物に対する用量レベルは、それぞれ、常套的な実験法により当業者
が決定し得る。
どのような特定の被験体に対する特定の用量レベルも、用いる特定の化合物の活性、年
齢、体重、一般的健康状態、性別、食事、投与回数、投与経路、および排泄速度、薬剤の
併用および治療を受けている特定の疾患の重篤度を含む、様々な因子によって決まること
は当然理解される。
本発明による薬剤の非ヒト動物、例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツ
ジ、マウス、ラット、ハムスターおよびモルモットなどへの投与のため、組成物を、好ま
しくは、動物飼料または飲用水に加え得る。動物が治療上適切な量の組成物をその食餌と
ともに摂取できるように動物飼料および飲用水組成物を処方することは便宜であり得る。
組成物を飼料または飲用水に加えるためのプレミックスとして与えることも便宜であり得
る。
本発明の核酸分子はまた、全体的な治療効果を高めるために他の治療用化合物と組み合
わせて被験体に投与することができる。適応症状を治療する複数の化合物を使用すると、
副作用の存在を減らすと同時に有益な効果を増大させることができる。
一実施形態では、核酸分子は、それらの様々な実施形態および製剤それぞれにおいて、
他の治療法、例えば、化学療法、寒冷療法、温熱療法、抗体療法、放射線療法および抗血
管新生療法などとともに用い得る。特に好ましい治療法は、抗血管新生療法である。抗血
管新生療法に関連して特に好ましい標的は、ＶＥＧＦ受容体およびＰＤＧＦ受容体である
。抗血管新生療法は、一般に血管新生関連標的、例えば、ＶＥＧＦ受容体およびＰＤＧＦ
受容体などに対する阻害剤を使用することにより達成される。小分子は別として、このよ
うな標的に対する阻害剤として作用する他の種類の化合物も、生成または提供または使用
され得る。したがって、次のクラスの化合物を用いてもよい。中でも、ＷＯ００／４４８
９５号またはＷＯ０１／７５１６４号に記載されるｓｉＲＮＡ、中でも、米国特許第５，
８４９，９０２号、同第５，９８９，９１２号に記載される、または遺伝子ブロックとし
て公知のアンチセンス分子；中でも、ＥＰ０５３３８３８ Ｂ１号に記載されるアプタマ
ー；中でも、ＷＯ９８／０８８５６号に記載されるスピーゲルマー；アプタマーに類似の
形で、それらのアミノ酸配列が異なる１０２〜１０１８ペプチドを含むランダム配列ペプ
チドライブラリーから識別され得る、したがって、時にはペプチドアプタマーと称される
、高親和性結合ペプチド；中でも、ＤＥ１９７４２７０６号に記載されるアンチカリン（
ａｎｔｉｃａｌｉｎｅｓ）類；ならびに、中でも「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ （ｅｄｓ．Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．ａｎｄ Ｌａｎｅ Ｄ．）に記載されている抗
体である。
一実施形態では、本発明による核酸分子を特定の細胞種に投与に適した組成物が提供さ
れ、このような組成物は、典型的に１個または数個の次の原則、および分子をそれぞれ組
み込む。例えば、アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰｒ）（Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ、１
９８７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２，４４２９−４４３２）は、肝細胞に特有であ
り、分枝状のガラクトース末端の糖タンパク質、例えばアシアロオロソムコイド（ＡＳＯ
Ｒ）に結合する。別の例では、葉酸受容体が多くの癌細胞で過剰発現される。このような
糖タンパク質、合成複合糖質、または葉酸の受容体との結合は、オリゴ糖鎖の分枝の程度
に強く依存する親和性によって起こる、例えば、三分枝（ｔｒｉａ−ｔｅｎｎａｒｙ）構
造は、二分枝（ｂｉａｔｅｎａｒｒｙ）または単分枝（ｍｏｎｏａｔｅｎｎａｒｙ）鎖よ
りも高い親和性で結合する（Ｂａｅｎｚｉｇｅｒ ａｎｄ Ｆｉｅｔｅ，１９８０，Ｃｅ
ｌｌ，２２，６１１−６２０；Ｃｏｎｎｏｌｌｙ ｅｔ ａｌ，１９８２，Ｊ．Ｂｉｏｌ
．Ｃｈｅｍ．，２５７，９３９−９４５）。Ｌｅｅ ａｎｄ Ｌｅｅ，１９８７．Ｇｌｙ
ｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｊ．，４，３１７−３２８は、ガラクトースに比べて受容体に
対する親和性が高いＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンを炭水化物部分として使用するこ
とによって、この高い特異性を得た。この「クラスター形成作用」は、マンノシル末端糖
タンパク質または複合糖質の結合及び取り込みについても記載されている（Ｐｏｎｐｉｐ
ｏｍ ｅｔ ａｌ，１９８１，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２４，１３８８−１３９５）。
ガラクトース、ガラクトサミンまたは葉酸系の複合体を用いて、外因性化合物を、細胞膜
を通過して輸送することにより、標的化送達手法を、例えば、肝疾患、肝癌、または他の
癌の治療にもたらすことができる。バイオコンジュゲートの使用により、治療に必要な治
療用化合物の所要量の削減ももたらされ得る。さらに、本発明の核酸バイオコンジュゲー
トの使用により、治療上の生物学的利用能、薬動力学、および薬物動態パラメータを調節
することができる。このようなバイオコンジュゲートの非限定的な例は、２００１年８月
１３日出願の、Ｖａｒｇｅｅｓｅ ｅｔ ａｌ．、米国特許第１０／２０１，３９４号；
および２００２年３月６日出願の、Ｍａｔｕｌｉｃ−Ａｄａｍｉｃ ｅｔ ａｌ．、米国
特許第６０／３６２，０１６号に記載されている。
本発明による、それらの様々な実施形態の核酸分子、それを含有するベクター、細胞、
薬剤、組成物および特に医薬組成物、本発明によれば、このような核酸分子をそれぞれ含
有する組織および動物は、治療用ならびに診断および研究分野の両方において使用され得
る。
以下の疾患に関与する様々な組織および血管内皮におけるＰＫＮ３の分布に起因して、
本発明による核酸分子は、上記疾患、好ましくは、病理学的機序または罹患組織、細胞、
好ましくはＰＴＥＮ陰性である腫瘍細胞に好ましくは関与することを特徴とする疾患の治
療および／または予防のために用いられてもよい。
したがって、本明細書に開示される核酸分子ならびにそれを含む薬剤および医薬組成物
は、血管新生促進療法（ｐｒｏ−ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ）ならびに
抗血管新生療法の両方に用いてもよく、それらは不十分、異常、もしくは過剰な血管新生
により特徴付けられるか、またはそれらに起因する疾患を含む。このような疾患は、感染
症、自己免疫障害、血管奇形、アテローム性動脈硬化症、移植後動脈疾患（ｔｒａｎｓｐ
ｌａｎｔ ａｒｔｅｒｉｏｐａｔｈｙ）、肥満、乾癬、疣贅、アレルギー性皮膚炎、持続
性過形成硝子体症候群、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、加齢黄斑疾患（ａｇｅ−ｒｅｌ
ａｔｅｄ ｍａｃｕｌａｒ ｄｉｓｅａｓｅ）、脈絡膜血管新生、原発性肺高血圧症、喘
息、鼻茸、炎症性腸疾患および歯周病、腹水、腹膜癒着、子宮内膜症、子宮出血、卵巣嚢
胞、卵巣（ｏｖａｒｉａｎ）、卵巣過剰刺激、関節炎、滑膜炎、骨髄炎、骨棘形成および
卒中（ｓｔｒｏｋｅ）、潰瘍、アテローム性動脈硬化症、ならびに関節リウマチを含む。
さらなる疾患は、腫瘍組織に関与するかまたは腫瘍組織により特徴付けられるものであ
る。本明細書において好ましく用いられるように、腫瘍組織という用語は、生物、組織、
あるいは生成させることを意図しないこのような生物の細胞により生成され、病的状態で
ある、すなわちこのような各々の疾患を患わない被験体の中には存在しない、とみなされ
る組織をさす。また、本明細書において好ましく用いられる腫瘍性疾患は、直接的であれ
間接的であれ、腫瘍組織の存在に起因するあらゆる疾患であり、好ましくは、このような
腫瘍組織は、組織の調節不全あるいは制御不能、好ましくは、自主的増殖に起因する。腫
瘍性疾患という用語は、好ましくは、悪性腫瘍性疾患だけでなく良性腫瘍性疾患も含む。
より好ましくは、腫瘍性疾患は、例えば、骨、乳房、前立腺、消化器系、結腸直腸、肝臓
、肺、腎臓、泌尿生殖器、膵臓、下垂体、睾丸、眼窩、頭頸部、中枢神経系、呼吸器など
のいずれの癌を含む群から選択される。
原則として、本発明による医薬組成物および薬剤を用いて処理することができるさらな
る具体的な疾患は、このような脂質組成物およびリポプレックスをそれぞれ含み、次のリ
ストから選択されてもよい。急性リンパ芽球性白血病（成人型）、急性リンパ芽球性白血
病（小児型）、急性骨髄性白血病（成人型）、急性骨髄性白血病（小児型）、副腎皮質癌
腫、副腎皮質癌腫（小児型）、エイズ関連癌、エイズ関連リンパ腫、肛門癌、星細胞腫（
小児型）、小脳星細胞腫（小児型）、大脳（Ｃｅｒｅｂｒａｌ，）、肝外胆管癌、膀胱癌
、膀胱癌（小児型）、骨癌、骨肉腫／骨の悪性線維性組織球腫、脳幹神経膠腫（小児型）
、脳腫瘍（成人型）、脳幹神経膠腫の脳腫瘍（Ｂｒａｉｎ Ｔｕｍｏｒ，Ｂｒａｉｎ Ｓ
ｔｅｍ Ｇｌｉｏｍａ）（小児型）、小脳星細胞腫の脳腫瘍（Ｂｒａｉｎ Ｔｕｍｏｒ，
Ｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ Ａｓｔｒｏｃｙｔｏｍａ）（小児型）、大脳星細胞腫／悪性神経
膠腫の脳腫瘍 （Ｂｒａｉｎ Ｔｕｍｏｒ，Ｃｅｒｅｂｒａｌ Ａｓｔｒｏｃｙｔｏｍａ
／Ｍａｌｉｇｎａｎｔ Ｇｌｉｏｍａ）（小児型）、脳室上衣細胞腫（Ｂｒａｉｎ Ｔｕ
ｍｏｒ，Ｅｐｅｎｄｙｍｏｍａ）（小児型）、髄芽細胞腫の脳腫瘍（Ｂｒａｉｎ Ｔｕｍ
ｏｒ，Ｍｅｄｕｌｌｏｂｌａｓｔｏｍａ）（小児型）、テント上原始神経外胚葉性腫瘍の
脳腫瘍 （Ｂｒａｉｎ Ｔｕｍｏｒ，Ｓｕｐｒａｔｅｎｔｏｒｉａｌ Ｐｒｉｍｉｔｉｖ
ｅ Ｎｅｕｒｏｅｃｔｏｄｅｒｍａｌ Ｔｕｍｏｒｓ）（小児型）、視経路および視床下
部神経膠腫の脳腫瘍 （Ｂｒａｉｎ Ｔｕｍｏｒ，Ｖｉｓｕａｌ Ｐａｔｈｗａｙ ａｎ
ｄ Ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｉｃ Ｇｌｉｏｍａ）（小児型）、脳腫瘍（小児型）、乳癌、
乳癌（小児型）、男性の乳癌（Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ，Ｍａｌｅ）、気管支腺腫／
カルチノイド（小児型）、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍（小児型）、胃腸カル
チノイド腫瘍（Ｃａｒｃｉｎｏｉｄ Ｔｕｍｏｒ，Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ）
、原発不明の癌腫、原発性中枢神経系リンパ腫（Ｃｅｎｔｒａｌ Ｎｅｒｖｏｕｓ Ｓｙ
ｓｔｅｍ Ｌｙｍｐｈｏｍａ，Ｐｒｉｍａｒｙ）、小脳星細胞腫（小児型）、大脳星細胞
腫／悪性神経膠腫（小児型）、子宮頸部癌、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢
性骨髄増殖性障害、結腸癌、結腸直腸癌、（小児型）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、子宮内膜癌
、脳室上衣細胞腫（小児型）、食道癌、食道癌（小児型）、ユーイングファミリー腫瘍、
頭蓋外胚細胞腫瘍（小児型）、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管癌、眼球内黒色腫の眼癌（Ｅ
ｙｅ Ｃａｎｃｅｒ，Ｉｎｔｒａｏｃｕｌａｒ Ｍｅｌａｎｏｍａ）、網膜芽細胞腫の眼
癌（Ｅｙｅ Ｃａｎｃｅｒ，Ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ）、胆嚢癌、胃腸（胃）癌、
胃腸（胃）癌（小児型）、胃腸カルチノイド腫瘍、頭蓋外胚細胞腫瘍（Ｇｅｒｍ Ｃｅｌ
ｌ Ｔｕｍｏｒ，Ｅｘｔｒａｃｒａｎｉａｌ）（小児型）、性腺外胚細胞腫瘍（Ｇｅｒｍ
Ｃｅｌｌ Ｔｕｍｏｒ，Ｅｘｔｒａｇｏｎａｄａｌ）、卵巣胚細胞腫瘍（Ｇｅｒｍ Ｃ
ｅｌｌ Ｔｕｍｏｒ，Ｏｖａｒｉａｎ）、妊娠性絨毛腫瘍、神経膠腫（成人型）、脳幹の
神経膠腫（小児型）（Ｇｌｉｏｍａ，（Ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ），Ｂｒａｉｎ Ｓｔｅｍ）
、大脳星細胞腫の神経膠腫（小児型）（Ｇｌｉｏｍａ，（Ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ），Ｃｅｒ
ｅｂｒａｌ Ａｓｔｒｏｃｙｔｏｍａ）、視経路および視床下部の神経膠腫（小児型）（
Ｇｌｉｏｍａ，（Ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ）Ｖｉｓｕａｌ Ｐａｔｈｗａｙ ａｎｄ Ｈｙｐ
ｏｔｈａｌａｍｉｃ）、毛様細胞白血病、頭頸部癌、肝細胞（肝臓）癌（成人型）（原発
性）、肝細胞（肝臓）癌（小児型）（原発性）、ホジキンリンパ腫（成人型）、ホジキン
リンパ腫（小児型）、下咽頭癌、視床下部および視経路神経膠腫（小児型）、眼球内黒色
腫、島細胞癌腫（内分泌膵臓）、カポジ肉腫、腎臓（腎細胞）癌、腎癌（小児型）、喉頭
癌、喉頭癌（小児型）、急性リンパ性白血病（Ｌｅｕｋｅｍｉａ，Ａｃｕｔｅ Ｌｙｍｐ
ｈｏｂｌａｓｔｉｃ）（成人型）、急性リンパ性白血病（Ｌｅｕｋｅｍｉａ，Ａｃｕｔｅ
Ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ）（小児型）、急性骨髄性白血病（Ｌｅｕｋｅｍｉａ，Ａ
ｃｕｔｅ Ｍｙｅｌｏｉｄ）（成人型）、急性骨髄性白血病 （Ｌｅｕｋｅｍｉａ，Ａｃ
ｕｔｅ Ｍｙｅｌｏｉｄ）（小児型）、慢性リンパ性白血病（Ｌｅｕｋｅｍｉａ，Ｃｈｒ
ｏｎｉｃ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ）、慢性骨髄性白血病（Ｌｅｕｋｅｍｉａ，Ｃｈｒｏ
ｎｉｃ Ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ）、毛様細胞白血病（Ｌｅｕｋｅｍｉａ，Ｈａｉｒｙ
Ｃｅｌｌ）、口唇および口腔癌、肝癌（成人型）（原発性）、肝癌（小児型）（原発性）
、非小細胞肺癌（Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ，Ｎｏｎ−Ｓｍａｌｌ Ｃｅｌｌ）、小細胞肺
癌（Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ，Ｓｍａｌｌ Ｃｅｌｌ）、エイズ関連リンパ腫（Ｌｙｍｐ
ｈｏｍａ，ＡＩＤＳ−Ｒｅｌａｔｅｄ）、バーキットリンパ腫（Ｌｙｍｐｈｏｍａ，Ｂｕ
ｒｋｉｔｔ’ｓ）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（Ｌｙｍｐｈｏｍａ，Ｃｕｔａｎｅｏｕｓ Ｔ−
Ｃｅｌｌ）、ホジキンリンパ腫（Ｌｙｍｐｈｏｍａ，Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ）（成人型）、
ホジキンリンパ腫（Ｌｙｍｐｈｏｍａ，Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ）（小児型）、非ホジキンリ
ンパ腫（Ｌｙｍｐｈｏｍａ，Ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ）（成人型）、非ホジキンリン
パ腫（小児型）（Ｌｙｍｐｈｏｍａ，Ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ，（Ｃｈｉｌｄｈｏｏ
ｄ））、原発性中枢神経系リンパ腫（Ｌｙｍｐｈｏｍａ，Ｐｒｉｍａｒｙ Ｃｅｎｔｒａ
ｌ Ｎｅｒｖｏｕｓ Ｓｙｓｔｅｍ）、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症（Ｍ
ａｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎｅｍｉａ，Ｗａｌｄｅｎｓｔｒｏｍ’ｓ）、骨の悪性線維性組
織球腫／骨肉腫、髄芽細胞腫、（小児型）、黒色腫、眼内（目）黒色腫（Ｍｅｌａｎｏｍ
ａ，Ｉｎｔｒａｏｃｕｌａｒ （Ｅｙｅ））、メルケル細胞癌、悪性中皮腫（成人型）（
Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｏｍａ，（Ａｄｕｌｔ）Ｍａｌｉｇｎａｎｔ）、中皮腫（小児型）、
原発不明の転移性扁平上皮性頸部癌、多発性内分泌腺腫症候群（小児型）、多発性骨髄腫
／血漿細胞新生物、菌状息肉症、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性疾患、慢性
骨髄性白血病（Ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ Ｌｅｕｋｅｍｉａ，Ｃｈｒｏｎｉｃ）、急性骨
髄性白血病（成人型）（Ｍｙｅｌｏｉｄ Ｌｅｕｋｅｍｉａ，（Ａｄｕｌｔ）Ａｃｕｔｅ
）、急性骨髄性白血病（小児型）（Ｍｙｅｌｏｉｄ Ｌｅｕｋｅｍｉａ，（Ｃｈｉｌｄｈ
ｏｏｄ）Ａｃｕｔｅ）、多発性骨髄腫（Ｍｙｅｌｏｍａ，Ｍｕｌｔｉｐｌｅ）、慢性骨髄
増殖性障害（Ｍｙｅｌｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，Ｃｈｒｏｎ
ｉｃ）、鼻腔および副鼻腔癌、上咽頭癌、上咽頭癌（小児型）、神経芽腫、非ホジキンリ
ンパ腫（成人型）、非ホジキンリンパ腫（小児型）、非小細胞肺癌、経口癌（小児型）、
口腔癌、口唇および中咽頭癌、骨肉腫／骨の悪性線維性組織球腫、卵巣癌（小児型）、卵
巣上皮癌、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣低悪性潜在性腫瘍、膵癌、膵癌（小児型）、膵癌、島細
胞、副鼻腔および鼻腔癌、上皮小体癌、陰茎癌、褐色細胞腫、松果体芽腫およびテント上
原始神経外胚葉性腫瘍（小児型）、下垂体腫瘍、血漿細胞新生物／多発性骨髄腫、胸膜胚
芽腫、妊娠および乳癌、妊娠およびホジキンリンパ腫、妊娠および非ホジキンリンパ腫、
原発性中枢神経系リンパ腫、前立腺癌、直腸癌、腎細胞（腎臓）癌、腎細胞（腎臓）癌（
小児型）、腎盂および尿管の移行上皮癌（Ｒｅｎａｌ Ｐｅｌｖｉｓ ａｎｄ Ｕｒｅｔ
ｅｒ，Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎａｌ Ｃｅｌｌ Ｃａｎｃｅｒ）、網膜芽細胞腫、横紋筋肉
腫（小児型）、唾液腺癌、唾液腺癌（小児型）、ユーイング肉腫（Ｓａｒｃｏｍａ，Ｅｗ
ｉｎｇ’ｓ）、カポジ肉腫（Ｓａｒｃｏｍａ，Ｋａｐｏｓｉ’ｓ）、軟部組織肉腫（成人
型）（Ｓａｒｃｏｍａ，Ｓｏｆｔ Ｔｉｓｓｕｅ，（Ａｄｕｌｔ））、軟部組織肉腫（小
児型）、子宮肉腫（Ｓａｒｃｏｍａ，Ｕｔｅｒｉｎｅ）、セザリー症候群、皮膚癌（非黒
色腫）、皮膚癌（小児型）、皮膚癌（黒色腫）、皮膚癌腫、メルケル細胞、小細胞肺癌、
小腸癌、軟部組織肉腫（成人型）、軟部組織肉腫（小児型）、扁平上皮癌、原発不明の転
移性扁平上皮性頸部癌（Ｓｑｕａｍｏｕｓ Ｎｅｃｋ Ｃａｎｃｅｒ ｗｉｔｈ Ｏｃｃ
ｕｌｔ Ｐｒｉｍａｒｙ，Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ）、胃（胃腸）癌、胃（胃腸）癌（小児
型）、テント上原始神経外胚葉性腫瘍（小児型）、皮膚性Ｔ細胞リンパ腫（Ｔ−Ｃｅｌｌ
Ｌｙｍｐｈｏｍａ，Ｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、精巣癌、胸腺腫（小児型）、胸腺腫および
胸腺癌、甲状腺癌、甲状腺癌（小児型）、腎盂および尿管の移行上皮癌、妊娠性絨毛性腫
瘍（Ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ Ｔｕｍｏｒ，Ｇｅｓｔａｔｉｏｎａｌ）、尿管および
腎盂の移行上皮癌（Ｕｒｅｔｅｒ ａｎｄ Ｒｅｎａｌ Ｐｅｌｖｉｓ，Ｔｒａｎｓｉｔ
ｉｏｎａｌ Ｃｅｌｌ Ｃａｎｃｅｒ）、尿道癌、子宮体子宮癌（Ｕｔｅｒｉｎｅ Ｃａ
ｎｃｅｒ，Ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ）、子宮肉腫、膣癌、視経路および視床下部神経膠腫
（小児型）、外陰部癌、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、ウィルムス腫瘍。
血管新生に関与している、より具体的には腫瘍血管新生および腫瘍の遊走に寄与する内
皮細胞の運動性阻害に関与している、より具体的には前立腺癌の場合に関与しているＰＫ
Ｎ３は別として（Ｌｅｅｎｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，２００４，ＥＭＢＯ Ｊ．２３ （
１６）：３３０３−３３１３参照）、ＰＫＮ３はＰＩ３キナーゼ経路の一部である。
ＰＩ３キナーゼ経路は、成長因子誘導および平行シグナル伝達経路に対するＰＩ３キナ
ーゼ活性を特徴とする。細胞の成長因子を刺激すると、細胞膜での同族受容体の活性化が
もたらされ、それらは順々に細胞内シグナル伝達分子、例えばＰＩ３キナーゼなどと会合
し、活性化する。ＰＩ３キナーゼ（調節サブユニットｐ８５および触媒サブユニットｐ１
１０からなる）を活性化すると、リン酸化によるＡｋｔの活性化が生じ、それにより、支
持細胞の応答、例えば、増殖、生存、またはさらに下流への遊走などが引き起こされる。
ＰＴＥＮは、したがって、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）３−キナーゼ経路に関与
し、細胞増殖ならびに形質転換を調節するその役割についてこれまで広範囲に研究されて
きた、腫瘍抑制因子である（概説については、Ｓｔｅｉｎ，Ｒ．Ｃ．ａｎｄ Ｗａｔｅｒ
ｆｉｅｌｄ，Ｍ．Ｄ．（２０００）．ＰＩ３−ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ：ａ
ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ｄｒｕｇ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ？ Ｍｏｌ Ｍｅｄ Ｔｏ
ｄａｙ ６，３４７−３５７；Ｖａｚｑｕｅｚ，Ｆ．ａｎｄ Ｓｅｌｌｅｒｓ，Ｗ．Ｒ．
（２０００）．Ｔｈｅ ＰＴＥＮ ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ
：ａｎ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ ３−ｋｉｎ
ａｓｅ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １４７０，
Ｍ２１−３５；Ｒｏｙｍａｎｓ，Ｄ．ａｎｄ Ｓｉｅｇｅｒｓ，Ｈ．（２００１）．Ｐｈ
ｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ ３−ｋｉｎａｓｅｓ ｉｎ ｔｕｍｏｒ ｐｒ
ｏｇｒｅｓｓｉｏｎ．Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２６８，４８７−４９８を参照）。
腫瘍抑制因子ＰＴＥＮは、ＰＩ３キナーゼ触媒反応を逆転させることによりＰＩ３キナー
ゼの負の制御因子として機能し、それによって確実に経路の活性化が一時的で制御された
方法で起こるようにする。ＰＩ３キナーゼシグナル伝達の慢性過活性化は、ＰＴＥＮの機
能的不活化に起因する。ＰＩ３キナーゼ活性は、小分子阻害剤ＬＹ２９４００２を加える
ことで阻止することができる。平行経路の中で作用するシグナル伝達キナーゼＭＥＫの活
性および下流応答は、例えば、小分子阻害剤ＰＤ９８０５９によって阻害することができ
る。
ＰＴＥＮ機能の消失によるＰＩ３キナーゼ経路の慢性活性化は、腫瘍形成および転移の
主な貢献者であり、この腫瘍抑制因子が制御された細胞増殖に関して重要なチェックポイ
ントを表すことが示される。ＰＴＥＮノックアウト細胞は、ＰＩ３キナーゼの活性化形態
を介して、ＰＩ３キナーゼ経路が慢性的に誘導されている細胞に似た特徴を示す（Ｄｉ
Ｃｒｉｓｔｏｆａｎｏ，Ａ．，Ｐｅｓｃｅ，Ｂ．，Ｃｏｒｄｏｎ−Ｃａｒｄｏ，Ｃ．ａｎ
ｄ Ｐａｎｄｏｌｆｉ，Ｐ．Ｐ．（１９９８）。ＰＴＥＮは胚発生および腫瘍抑制に必須
である。Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ １９，３４８−３５５．Ｋｌｉｐｐｅｌ，Ａ．，Ｅｓｃｏ
ｂｅｄｏ，Ｍ．Ａ．，Ｗａｃｈｏｗｉｃｚ，Ｍ．Ｓ．，Ａｐｅｌｌ，Ｇ．，Ｂｒｏｗｎ，
Ｔ．Ｗ．，Ｇｉｅｄｌｉｎ，Ｍ．Ａ．，Ｋａｖａｎａｕｇｈ，Ｗ．Ｍ．ａｎｄ Ｗｉｌｌ
ｉａｍｓ，Ｌ．Ｔ．（１９９８）。ホスファチジルイノシトール３キナーゼの活性化は細
胞周期エントリーに十分であり、発癌性形質転換に典型的な細胞変化を促進する。 Ｍｏ
ｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １８，５６９９−５７１１．Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｍ．，Ｎａ
ｇａｔａ，Ｓ．，Ｉｗａｓａｋｉ，Ｔ．，Ｙａｎａｇｉｈａｒａ，Ｋ．，Ｓａｉｔｏｈ，
Ｉ．，Ｋａｒｏｕｊｉ，Ｙ．，Ｉｈａｒａ，Ｓ．ａｎｄ Ｆｕｋｕｉ，Ｙ．（１９９９）
。「ホスファチジルイノシトール３−キナーゼの活性化による腺癌の脱分化（Ｄｅｄｉｆ
ｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ｂｙ ａｃｔｉｖ
ａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ ３−ｋｉｎａｓｅ）」
。Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９６，４８７４−４８７９）。
ＰＴＥＮは、ＰＴＥＮ関連経路、例えば、ＰＩ３Ｋ／ＰＴＥＮ経路、Ａｋｔ経路、ＥＧ
Ｆ関連自己分泌ループおよびｍＴＯＲ経路など、とも称されるいくつかの経路に関与する
。ＰＩ３キナーゼ経路とは、実際、ＰＩ３キナーゼを直接あるいは間接のいずれかで伴う
任意の経路である。ＰＩ３キナーゼは、このような経路においてインヒビターまたはアク
チベーターのいずれかとして作用してもよく、あるいはそれ自体、経路の他の要素により
調節されてもよい。
ＰＩ３キナーゼ経路に関連する疾患及び症状を記載している先行技術は豊富に存在する
。したがって、これらの症状及び疾患のいずれもが、本発明の方法および薬剤および診断
薬により対処することができ、その設計、スクリーニングまたは製造法が本発明において
教示される。限定ではなく説明の理由で、以下に言及される。子宮内膜癌、結腸直腸癌、
神経膠腫、子宮内膜癌、腺癌、子宮内膜増殖症、カウデン症候群、遺伝性非ポリポーシス
結腸直腸癌、リー・フラウメニ症候群、乳−卵巣癌、前立腺癌（Ａｌｉ，Ｉ．Ｕ．，Ｊｏ
ｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｖ
ｏｌ．９２，ｎｏ．１１，Ｊｕｎｅ ０７，２０００，ｐａｇｅ ８６１−８６３）、バ
ナヤン・ゾナナ（Ｂａｎｎａｙａｎ−Ｚｏｎａｎａ）症候群、ＬＤＤ（レルミット・デュ
クロス（Ｌｈｅｒｍｉｔｔｅ−Ｄｕｃｌｏｓ’）症候群）（Ｍａｃｌｅｏｄ，Ｋ．，上記
文献）、狂牛病（ＣＤ）およびバナヤン・ルバルカバ・ライリー（Ｂａｎｎａｙａｎ−Ｒ
ｕｖａｌｃａｂａ−Ｒｉｌｅｙ）症候群（ＢＲＲ）を含む過誤腫−巨頭症、粘膜皮膚病変
（例えば、外毛根鞘腫（ｔｒｉｃｈｉｌｅｍｍｏｎｍａｓ））、巨頭症、精神発達遅滞、
胃腸ハーマトマス（ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｈａｒｍａｔｏｍａｓ）、脂肪
腫、甲状腺腺腫、乳房線維嚢胞性疾患、小脳異形成神経節細胞腫ならびに乳房及び甲状腺
の悪性腫瘍（Ｖａｚｑｕｅｚ，Ｆ．，Ｓｅｌｌｅｒｓ，Ｗ．Ｒ．，上記文献）。
この点から見て、ＰＫＮ３は、ＰＫＮ３の上流の標的に対する他の薬剤よりも副作用が
少なくなる薬剤により対処することができる、ＰＩ３キナーゼ経路の価値のある下流の薬
剤標的である。エフェクター分子のこの特定の部分、すなわち、タンパク質ＰＫＮ３およ
びこの経路に関与する任意のさらに下流の分子を制御することにより、その非常に限定さ
れた数の平行分枝またはこのシグナル伝達カスケードのさらに上流の標的だけが、望まし
くない効果を引き起こす傾向がある。したがって、細胞周期、ＤＮＡ修復、アポトーシス
、グルコース輸送、翻訳に関連するＰＩ３キナーゼ／ＰＴＥＮ経路の他の活性は、影響を
受けない。また、インスリンシグナル伝達は誘導されないが、これは、ＬＹ２９４００２
の使用に関連して観察される糖尿病性応答または他の副作用が実際に回避されることを意
味する。ＬＹ２９４００２（２−（４−モルホリニル）−８−フェニルクロモン）は、Ｌ
ｉｌｌｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ）
によりＰＩ−３Ｋのインヒビターとして開発された幾つかのクロモン誘導体の低分子イン
ヒビターの１つである（Ｖｌａｈｏｓ ｅｔ ａｌ．１９９４，ＪＢＣ ２６９，５２４
１−５２４８）。これは、ＰＩ−３Ｋ分子の触媒サブユニットのｐ１１０を標的とし、触
媒中心においてＡＤＰ結合と競合することにより機能する。しかし、ＬＹ２９４００２は
、異なる細胞内機能を有することが示唆されている、ｐ１１０の種々のイソ型（アルファ
、ベータ、ガンマ、デルタ）を識別することができない。
ＰＫＮ３はまた、ラパマイシンにより対処されるｍＴＯＲのさらに下流でもある。Ｒａ
ｆｔ又はＦＲＡＰとしても公知である、ｍＴＯＲ（ラパマイシンの哺乳類標的（ｍａｍｍ
ａｌｉａｎ Ｔａｒｇｅｔ Ｏｆ Ｒａｐａｍｙｃｉｎ））は、ＰＩ３−キナーゼの下流
で作用して、細胞周期へのｐｐ７０ Ｓ６キナーゼ依存性エントリーなどのプロセスを調
節する。ｍＴＯＲは、増殖因子および栄養物の利用可能性のセンサーとして作用して、ｐ
ｐ７０ Ｓ６キナーゼおよび開始因子４Ｅを活性化することにより翻訳を制御する。ｍＴ
ＯＲ機能は、Ｔ細胞およびある一定の腫瘍細胞の増殖をブロックする、細菌性マクロライ
ドのラパマイシンにより阻害される（Ｋｕｒｕｖｉｌｌａ ａｎｄ Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ
１９９９，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｙ ６，Ｒ１２９−Ｒ１３６）。
ラパマイシンとその誘導体が、現在臨床で用いられている適切な薬剤であるという事実
は、薬剤標的がより有用で、副作用が少ないほど、それが、例えば、Ｙｕ ｅｔ ａｌ．
により証明されたように特定の分子機構に対してより特異的であることを証明する（Ｙｕ
，Ｋ．ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ−Ｒｅｌａｔ Ｃａｎｃ ８，２４
９）。
ＰＫＮ３は、それら全てがタンパク質−セリン／トレオニンキナーゼであると言われて
いるプロテインキナーゼＣファミリーのメンバーである。一般に、この種類のプロテイン
キナーゼは、１つの調節サブユニットと１つの触媒サブユニットを含み、カルシウムイオ
ンとリン脂質をコファクターとして使用する。ジアシルグリセロールは、この種類のプロ
テインキナーゼファミリーのアクチベーターとして作用する。プロテインキナーゼＣファ
ミリーのメンバーは、ホルモン又は神経伝達物質につながっているいくつかのシグナル伝
達経路に関与している。これらのプロテインキナーゼは、リン酸化によりその標的タンパ
ク質の活性を調節する。プロテインキナーゼＣの非生理的な連続した活性化の結果、癌の
発生を引き起こす可能性がある形質転換細胞の表現型が生じることは、当技術分野で公知
である。
ｍＲＮＡとしてのＰＫＮ３の完全な配列は、データバンクより、例えば、受託番号ｇｉ
７０１９４８８またはＮＭ＿０１３３５５の下に入手可能である。遺伝暗号を用いて、こ
のｍＲＮＡから特定のアミノ酸配列を推定してもよい。また、ＰＫＮ３のアミノ酸配列は
、データバンクより受託番号ｇｉ７０１９４８９又はＮＰ＿０３７４８７．１の下に入手
可能である。
ヒトＰＫＮ３に対する相同体は、中でも、ハツカネズミ（Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、ド
ブネズミ（Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）、シロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）、線
虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）、キイロショウジョウバエ（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）
及びサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に見出され得る。同一性
パーセントおよび整列領域の長さは、前述の様々な種について、それぞれ、６７％および
２７９アミノ酸、５１％および８６６アミノ酸、３８％および３０５アミノ酸、３６％お
よび８６１アミノ酸、６３％および２９６アミノ酸ならびに４４％および３６２アミノ酸
である。このような相同体を用いて生成された薬剤が、ヒトプロテインキナーゼＮベータ
または任意の他の意図されるプロテインキナーゼＮベータとなお相互作用するものでない
場合、これらまたは他の相同体はいずれも、原則として本発明の実践に適していることは
、当業者により認識される。
ヒトアミノ酸配列はまた、ＰｒｏｔＥＳＴ、受託番号ｐｉｒ：ＪＣ７０８３から取るこ
とができ、ここで、それぞれのプロテインキナーゼＮベータは、ＪＣ７０８３プロテイン
キナーゼと称される。ヒトプロテインキナーゼＮベータの遺伝子は、ヒト９番染色体上に
位置する。プロテインキナーゼＮベータのｃＤＮＡ源は、一般に多数の癌および様々な胎
児もしくは胚組織であり、より詳細には、中でも、胃癌、腺癌、脳腫瘍、乳癌、バーキッ
ト腫、リンパ腫、子宮頚癌、軟骨肉腫、結腸癌、胎児眼、胎児水晶体、胎児前眼部、胎児
視神経、胎児網膜、胎児網膜中心窩、胎児黄斑、胎児脈絡膜、線維莢膜細胞腫（ｆｉｂｒ
ｏｔｈｅｏｍａ）、生殖系、頭部、頚部、心臓、腎臓、大細胞癌、平滑筋肉腫、転移性軟
骨肉腫、卵巣、副甲状腺、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、小細胞癌、扁平上皮癌、精巣、お
よび子宮である。このリストから、本明細書において薬剤とも称される薬剤は、本明細書
に開示される他の疾患のいずれか、および本明細書に開示される病的症状のいずれかに加
えて、これらの疾患または特定の細胞、組織もしくは臓器を巻き込む任意の疾患のいずれ
かの治療および／または予防にも使用されてもよいことは明らかである。これらの疾患お
よび病的症状もまた、「本明細書に記載される疾患」という用語に含まれるものとする。
本発明の核酸分子およびそれを含有する薬剤により治療および／または予防することが
できる、本明細書に記載される疾患ならびに本明細書に記載される病的症状も、腫瘍形成
および転移を含む可能性がある。これは、本明細書に記載される疾患および本明細書に記
載される病的症状に特に該当し、その場合このような疾患または病的症状に関与する細胞
は、腫瘍抑制ＰＴＥＮが活性でないか、または活性レベルが低下していることを意味する
ＰＴＥＮ陰性である。これらの疾患はまた、一般にＰＩ３キナーゼ経路が関わっている疾
患を含む。転移性腫瘍に加えて特に、糖尿病がこの種類の疾患および病的症状のそれぞれ
に属する。したがって、細胞、特に本明細書に記載される疾患または病的症状に関与して
いる細胞およびＰＴＥＮ陰性の細胞は、薬剤による治療に感受性が高く、その作用様式は
、それぞれの関与している細胞においてＰＫＮ３の活性を低下または除去する程度のもの
である。したがって、その腫瘍が、好ましくは、過剰活性化ＰＩ３キナーゼ経路（限定さ
れるものではないが、ＰＩ３キナーゼ経路の成分をコードする遺伝子（ｐ１１０、Ａｋｔ
）の増幅または突然変異による）を特徴とするか、あるいはＰＴＥＮ陰性である患者、あ
るいはＰＴＥＮ陰性の細胞を有する患者は、特にこれらの細胞が本明細書に記載される疾
患または本明細書に記載される病的症状に関与している場合は、上記薬剤を用いて有利に
治療することができる。このような活性の低下は、転写レベルまたは翻訳のレベル、すな
わちＰＫＮ３の酵素活性の低下のいずれかから起こる場合がある。いかなる学説にも拘束
されることを望むものではないが、後者の態様、すなわちＰＫＮ３の活性を修飾すること
もまた、ＰＫＮ３の特徴に起因する、つまり、ＰＫＮ３の酵素活性もまた、上方および下
方調節、より好ましくは下方調節することができる。
上記薬剤を用いて有利に治療することができる患者のさらなる群は、ＰＴＥＮ機能の消
失の発生率の高い癌、特に後期腫瘍に罹患している患者である（Ｃａｎｔｌｅｙ ａｎｄ
Ｎｅｅｌ，１９９９）。ＰＴＥＮの消失は、それぞれの腫瘍細胞の攻撃的および侵襲的
挙動の増大に相関する。
本発明の医薬組成物が使用され得る治療および予防のための本明細書に記載される様々
な疾患はまた、本明細書に記載される薬剤を使用してもよい、予防および／または治療の
ための疾患であり、逆も同様であることは認識される。
本明細書において、疾患の治療という用語は、このような疾患の予防も含むものとする
。
さらなる特徴、実施形態および利点は、以下の図から得る場合がある。
ＰＩ３経路へのＰＫＮ３の関与を示す概略図である。 ヒト細胞株（ＨｅＬａ、ＨＵＶＥＣ）およびマウス細胞株（ＥＯＭＡ）におけるＰＫＮ３特異的ｓｉＲＮＡを用いるノックダウン実験のウエスタンブロット解析の結果を示す。 ＨｅＬａとＨＵＶＥＣ細胞の両方でｓｉＲＮＡ分子のＩＣ５０を測定するためにリポプレックスとして処方した、異なる濃度のＰＫＮ３特異的ｓｉＲＮＡ分子を用いるノックダウン実験の結果を示す。 ノックダウン効力の点で上記分子の有効性を異なる時点で検定した、ＰＫＮ３特異的ｓｉＲＮＡ分子および対照としてＰＫＮ３特異的アンチセンス分子を用いる、ノックダウン実験のウエスタンブロット解析の結果を示す。 ３’末端にリン酸基を提示したかまたは提示しない、異なる濃度のＰＫＮ３特異的ｓｉＲＮＡリポプレックスを用いる、ノックダウン実験のウエスタンブロット解析の結果を示す。 異なるＰＫＮ３特異的ｓｉＲＮＡ分子を用いるノックダウン実験のウエスタンブロット解析の結果（図６Ａ）および細胞外マトリックスでのＨＵＶＥＣ増殖のＰＫＮ３機能の消失を説明する顕微鏡写真（図６Ｂ）を示す。 ＰＫＮ３特異的ｓｉＲＮＡ分子のインビボでの有効性を試験するための実験デザイン（図７Ａ）、ならびに皮下ＰＣ−３異種移植腫瘍マウスモデルにおける、このような分子の腫瘍体積（図７Ｂ）および体重（図７Ｃ）への影響を示す。 ＰＫＮ３特異的ｓｉＲＮＡ分子のインビボでの有効性を試験するための実験デザイン（図８Ａ）、ならびに皮下ＰＣ−３異種移植腫瘍マウスモデルにおける、体重または腫瘍体積の割合として表される、異なる用量のこのようなｓｉＲＮＡ分子の影響（図８Ｂ）、および体重または腫瘍体積の割合として表される、このような分子を用いる異なる投与スケジュールの影響（図８Ｃ）を示す。 ＰＫＮ３特異的ｓｉＲＮＡ分子のインビボでの有効性を試験するための実験デザイン（図９Ａ）、ならびに前立腺内ＰＣ−３異種移植腫瘍マウスモデルにおける、上記分子の前立腺腫瘍体積およびリンパ節転移への影響（図９Ｂ）および上記分子の肺組織でのＰＫＮ−３およびＴｉｅ２ ｍＲＮＡの減少への影響（図９Ｃ）を示す。 全身投与にて特異的ｓｉＲＮＡ分子を用いる異なる治療スキームのインビボでの有効性を試験するための実験デザイン（図１０Ａ）、ならびに前立腺内ＰＣ−３異種移植腫瘍マウスモデルにおける、このような異なる治療スキームの前立腺腫瘍体積への影響（図１０Ｂ）およびリンパ節転移体積への影響（図１０Ｃ）を示す。 全身投与にて様々な用量のＰＫＮ３特異的ｓｉＲＮＡ分子のインビボでの有効性を試験するための実験デザイン（図１１Ａ）、ならびに上記様々な用量の前立腺腫瘍体積への影響（図１１Ｂ）およびリンパ節転移体積への影響（図１１Ｃ）を示す。 Ａは、リポプレックスを形成する化合物を示す図である。Ｂは、本発明のリポプレックスの構造を、リポソームと比較して説明する概略図である。 １９塩基対または２３塩基対のいずれかを有するＰＫＮ３特異的ｓｉＲＮＡ分子を用いるノックダウン実験のウエスタンブロット解析の結果を示す。 異なるＰＫＮ３特異的ｓｉＲＮＡ分子を用いるノックダウン実験のウエスタンブロット解析の結果を示す。 ３種類の異なる細胞株での、１９塩基対または２３塩基対のいずれかを有するｓｉＲＮＡ分子を用いるノックダウン実験のウエスタンブロット解析の結果を示す（ｓｉＲＮＡ分子は異なる濃度で使用される）。 ＰＫＮ３特異的ｓｉＲＮＡ分子のインビボでの有効性を試験するための実験デザイン（図１６Ａ）、ならびに同所性前立腺癌マウスモデルにおける、このような１９塩基対または２３塩基対のいずれかを有するＰＫＮ３特異的ｓｉＲＮＡ分子の、前立腺腫瘍体積の減少への影響（図１６Ｂ）、リンパ節転移体積への影響（図１６Ｃ）およびリンパ節転移拡散への影響（図１６Ｄ）を示す。 様々な用量の、２３塩基対を含むＰＫＮ３特異的ｓｉＲＮＡ分子のインビボでの有効性を試験するための実験デザイン（図１７Ａ）ならびに同所性前立腺癌マウスモデルにおける、このような様々な用量の、前立腺腫瘍体積の減少への影響（図１７Ｂ）、リンパ節転移体積への影響（図１７Ｃ）およびリンパ節転移拡散への影響（図１７Ｄ）を示す。
実施例１：材料および方法
［インビトロトランスフェクションおよび免疫ブロット法；抗体］
細胞株に、上に記載される陽イオン性リポソームを用いてｓｉＲＮＡをトランスフェク
トした。簡潔に述べると、細胞の播種から約１２時間後、１０％血清含有培地に希釈した
異なる量のｓｉＲＮＡ−リポプレックス溶液を細胞に添加して、１〜５０ｎＭ ｓｉＲＮ
Ａの範囲のトランスフェクション濃度を達成した。トランスフェクション後（４８時間）
、細胞を溶解させ、説明されるように免疫ブロット法に供した（Ｋｌｉｐｐｅｌ ｅｔ
ａｌ．，１９９８）。タンパク質濃度をＤＣプロテインアッセイ（ＢｉｏＲａｄ）で測定
し、次の抗体：ウサギ抗ＰＴＥＮ（Ａｂ−２、Ｎｅｏｍａｒｋｅｒｓ）、Ａｋｔ−１、ウ
サギ抗ＰＫＮ３（Ｌｅｅｎｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，２００４）を用いて、免疫ブロット
（ｉｍｍｕｎｏｂｏｔ）分析のために等量を負荷した。
［細胞株］
ＰＣ−２、ＨｅＬａ、ＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯（ｕｍｂｉｃａｌ）静脈内皮細胞）、およ
びＥＯＭＡ細胞株であり、ＡＴＣＣの推奨に従って培養した。
［腫瘍異種移植］
雄Ｈｓｄ：ＮＭＲＩ−ｎｕ／ｎｕマウス（８週齢）を本研究に使用した。定着腫瘍異種
移植片での腫瘍治療実験のため、合計５．０×１０６腫瘍 細胞／１００μｌ ＰＢＳ）
を皮下に移植した。キャリパーを用いて腫瘍体積を測定し、式：腫瘍体積＝（長さ×幅２
）／２に従って算出した。腫瘍治療実験のため、ｓｉＲＮＡ−リポプレックス溶液を、低
圧、少量の尾静脈注射により静脈内投与した。同所性腫瘍モデルにおいて、２．０×１０
６ＰＣ−３細胞／３０μｌ ＰＢＳを前立腺の左背側葉に全身麻酔下で注射した（Ｓｔｅ
ｐｈｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２）。動物を手術後５０日目に殺処分し、腫瘍（
前立腺）および局所転移（尾部、腰部および腎リンパ節転移）の体積を上に述べたように
測定した。
静脈内投与のため、１．８８ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡおよび１４．５ｍｇ／ｋｇの脂質
の最終用量で、２００μｌ溶液の単回尾静脈注射によってｓｉＲＮＡリポプレックスを静
脈内に投与することにより、または異なるスケジュールのその改変用量（示す通り）のた
めのｓｉＲＮＡ−リポプレックスを行った。
統計解析
データは、平均値±平均値の標準誤差として表される。差異の統計的有意性は、マンホ
イットニーのＵ検定により判定した。Ｐ値＜０．０５を統計上有意であるとみなした。
マトリゲルアッセイ
マトリゲルマトリックスでの細胞増殖を検定するため、ＨＵＶＥＣに、ｓｉＲＮＡを４
８時間トランスフェクトした。トリプシン処理の後、２５０μｌマトリゲル基底膜マトリ
ックスでプレコートした２４ウェルプレート（１１０，０００細胞／ウェル）に細胞を２
通り播種し、リプレーティングから２０時間後、Ａｘｉｏｖｅｒｔ Ｓ１００顕微鏡に接
続されたＡｘｉｏｃａｍカメラを用いて１．２５×または２．５×の倍率で顕微鏡写真を
撮影した。
実施例２：ＰＫＮ３ ｓｉＲＮＡ分子
本明細書においてｓｉＲＮＡ分子とも称され（ＡｔｕＲＮＡｉ、表１ａおよび１ｂ参照
）、本研究で使用された、本発明による分子は記載される通りであり（Ｃｚａｕｄｅｒｎ
ａ ｅｔ ａｌ．，２００３）、ＢｉｏＳｐｒｉｎｇ（Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ ａ．Ｍ．，
Ｇｅｒｍａｎｙ）により合成された。
上記分子の二重鎖は、それぞれのセンス鎖およびアンチセンス鎖により形成され、それ
らは各々表１ａおよび１ｂに５’→３’方向で示されている。したがって、二本鎖分子は
、それぞれのセンスおよびアンチセンス鎖、例えば、特定の例では本明細書においてＰＫ
Ｎ３（１）とも称される、二本鎖構造を有する分子を形成しているＰＫＮ３−ｈｍ−１ｓ
とＰＫＮ３−ｈｍ−１ａｓを組み合わせることにより形成される。これらの分子は平滑末
端化されているが、しかし、二本鎖分子を形成している各鎖は、３’末端に、より具体的
には末端の３’ＯＨ基に結合したホスフェートを有する。これらの分子は両方の鎖で２’
−Ｏ−メチル糖修飾が交互に存在することにより化学的に安定化され、非修飾ヌクレオチ
ドは、表１ａからもわかるように、反対の鎖の修飾されたヌクレオチドと向かい合う。こ
れらの二本鎖分子は、本発明による核酸分子の特に好ましい実施形態である。
Figure 2013172714
 ２’−Ｏ−メチル修飾されているヌクレオチドには下線が引かれている。このような下
線から、１つ置きのヌクレオチドがこの種類の修飾を有し、このような修飾がアンチセン
ス鎖の１番目のヌクレオチドから始まり、センス鎖の２番目のヌクレオチドから始まるこ
とが（センス鎖とアンチセンス鎖の両方が左から右へ５’−３’の方向で表されている条
件で）明らかである。
ｓは、本明細書において第２の鎖とも称されるセンス鎖を表し、ａｓは、本明細書にお
いて第１の鎖とも称されるアンチセンス鎖を表す。第１の鎖は、隣接するヌクレオチドか
らなる第１のストレッチを含み、上記第１のストレッチは、少なくとも部分的に標的核酸
と相補的である。標的核酸は、本明細書において、好ましくは分解されるか解除された（
ｄｅｓｔｉｌｉｚｅｄ）核酸である。
これらの分子は本明細書においてＰＫＮ３特異的ｓｉＲＮＡとも称され、２つのヒト細
胞株、すなわちＨｅＬａ、ＨＵＶＥＣ、および１つのマウス細胞株（ＥＯＭＡ）でスクリ
ーニングした。２０ｎＭのｓｉＲＮＡをトランスフェクトし、実施例１に記載されるよう
にトランスフェクション後４８時間に全細胞溶解物から免疫ブロッティングを行った。結
果を図２に表す。図２からわかるように、特に好ましい核酸分子は、ＰＫＮ３（２）、Ｐ
ＫＮ３（３）、ＰＫＮ３（４）、ＰＫＮ３（５）、ＰＫＮ３（６）、ＰＫＮ３（８）であ
る。
いっそうより好ましい分子は、ＰＫＮ３（３）であり、さらなる研究の対象とした。
ＰＫＮ３（３）に基づいて、さらなるｓｉＲＮＡ分子を設計し、それらを次の表１ｂに
提示する。それらは、ＰＫＮ３−ｈｍ−３Ａ２３ｖ１分子およびＰＫＮ３−ｈｍ−３Ｂ２
３ｖ１分子からなる分子に対して、ＰＫＮ３−２３−ｖ１、すなわち二つの一本鎖、と注
記され、ＰＫＮ３−ｈｍ−３Ａ２３ｖ２分子およびＰＫＮ３−ｈｍ−３Ｂ２３ｖ２分子か
らなる分子に対して、ＰＫＮ３−２３−ｖ２、すなわち二つの一本鎖、と注記され、ＰＫ
Ｎ３−ｈｍ−３Ａ２３ｖ３分子およびＰＫＮ３−ｈｍ−３Ｂ２３ｖ３分子からなる分子に
対して、ＰＫＮ３−２３−ｖ３、すなわち二つの一本鎖、と注記され、ＰＫＮ３−ｈｍ−
３Ａ２３ｖ４分子およびＰＫＮ３−ｈｍ−３Ｂ２３ｖ４分子からなる分子に対して、ＰＫ
Ｎ３−２３−ｖ４、すなわち二つの一本鎖、と注記され、さらにＰＫＮ３−ｈｍ−３Ａ２
３ｖ５分子およびＰＫＮ３−ｈｍ−３Ｂ２３ｖ５分子からなる分子に対して、ＰＫＮ３−
２３−ｖ５、すなわち二つの一本鎖、と注記されている。
これらのｓｉＲＮＡ分子を提示し、デザインする方法は、表１ａに含められているｓｉ
ＲＮＡ分子に関連して記載されるものと同じである。表１ｂからわかるように、ＰＫＮ３
（３）（表１ｂ中ではＰＫＮ３−ｈｍ−３Ａ１９／ＰＫＮ３−ｈｍ−３Ｂ１９と称される
）から出発して、合計４ヌクレオチドがセンス鎖の３’末端およびアンチセンス鎖の５’
末端に付加され（ＰＫＮ３−２３−ｖ１）、合計４ヌクレオチドがセンス鎖の５’末端に
、合計４ヌクレオチドがアンチセンス鎖の３’末端に付加され（ＰＫＮ３−２３−ｖ２）
、１つのヌクレオチドがセンス鎖の５’末端に、３ヌクレオチドが３’末端に、３ヌクレ
オチドがアンチセンス鎖の５’末端に、１ヌクレオチドが３’末端に付加され（ＰＫＮ３
−２３−ｖ３）、２ヌクレオチドがセンス鎖の５’末端に、２ヌクレオチドが３’末端に
、２ヌクレオチドがセンス鎖の５’末端に、２ヌクレオチドが３’末端に付加され（ＰＫ
Ｎ３−２３−ｖ４）、かつ、３ヌクレオチドがセンス鎖の５’末端に、１ヌクレオチドが
３’末端に、１ヌクレオチドがアンチセンス鎖の５’末端に、３ヌクレオチドが３’末端
に付加される（ＰＫＮ３−２３−ｖ５）。新しく付加されたヌクレオチドは、表１ｂ中で
イタリックで示される。
Figure 2013172714
表１ｂのｓｉＲＮＡ分子をそれらのノックダウン有効性について試験し、長さ１９ヌク
レオチドのＰＫＮ３特異的ｓｉＲＮＡの１つ、より具体的にはＰＫＮ３（３）と比較した
。このような目的のため、ＨｅＬａ Ｂ細胞を６ウェルにプレーティングし（４０ｋ）、
１６時間後に２０ｎＭでトランスフェクトし、トランスフェクションから４８時間後にタ
ンパク質抽出のために溶解させた。それとは逆のことが明示されていない場合、これらの
ｓｉＲＮＡ分子に関して使用される技法および手順は、本明細書の実施例部分に記載され
る、より具体的には実施例１に記載されるものである。
抗ＰＫＮ３抗体および抗ＰＴＥＮ抗体でプローブした溶解物のウエスタンブロットを（
後者は負荷対照としての役割を果たす）、図１３に表す。図１３に記載されているように
、ＰＫＮ３−２３−ｖ１が特に効果的であり、その次に、有効性の点で、ＰＫＮ３−２３
−ｖ４、ＰＫＮ３−２３−ｖ５、ＰＫＮ３−２３−ｖ２およびＰＫＮ３−２３−ｖ３が続
く。センス鎖としてＬｕｃ−ｓｉＲＮＡ−２Ｂ（ｃｇｕａｃｇｃｇｇａａｕａｃｕｕｃｇ
ａ、配列番号５６）およびアンチセンス鎖としてＬｕｃ−ｓｉＲＮＡ−２Ａ（ｕｃｇａａ
ｇｕａｕｕｃｃｇｃｇｕａｃｇ、配列番号５７）を含むルシフェラーゼ特異的ｓｉＲＮＡ
分子を対照（ＫＯ）として用いた。
さらに可能性のあるｓｉＲＮＡ分子をスクリーニングし、それらを表２に表す。提示お
よび修飾の方法は、上の表１ａおよび１ｂに示されるｓｉＲＮＡ分子に関して記載される
ものと同じである。
Figure 2013172714
表２に表したこれらのｓｉＲＮＡ分子を、上記のようにＨＵＶＥＣ細胞での一次スクリ
ーニングにおいてスクリーニングした。細胞を６ウェルにプレーティングし（４０ｋ）、
１６時間後に２０ｎＭ ｓｉＲＮＡおよび１μｇ／ｍｌのＡｔｕＦＥＣＴ０１でトランス
フェクトし、トランスフェクションから７２時間後にタンパク質抽出のために溶解させた
。抗ＰＫＮ３抗体および抗ＰＴＥＮ抗体でプローブした溶解物のウエスタンブロットを（
後者は負荷対照としての役割を果たす）、図１４に表す。ｕｔは未処理を表し、Ｌｕｃｉ
は、上に定義されるルシフェラーゼｓｉＲＮＡを表し、ｃｏ３は、
Figure 2013172714
 である。
それとは逆のことが明示されていない場合、これらのｓｉＲＮＡ分子に関して使用され
る技法および手順は、本明細書の実施例部分に記載される、より具体的には実施例１に記
載されるものである。
実施例３：ＰＫＮ３特異的ｓｉＲＮＡ分子のリポプレックス製剤
リポプレックス製剤を、本質的にＳａｎｔｅｌに記載されるように調製した（Ｓａｎｔ
ｅｌ ｅｔ ａｌ．２００６）。
陽イオン性脂質ＡｔｕＦＥＣＴ０１（β−Ｌ−アルギニル−２，３−Ｌ−ジアミノプロ
ピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミドトリヒドロクロリド、Ａｔｕｇｅｎ
ＡＧ）、中性のリン脂質１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノー
ルアミン（ＤＰｈｙＰＥ）（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ Ｉｎｃ．，Ａｌ
ａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ）およびＰＥＧ化脂質Ｎ−（カルボニル−メトキシポリエチレング
リコール−２０００）−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−エタノ
ールアミンナトリウム塩（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ）（Ｌｉｐｏｉｄ ＧｍｂＨ，Ｌｕｄｗｉｇ
ｓｈａｆｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を、ＲＮアーゼを含まない滅菌スクロース溶液３００ｍ
Ｍ中での脂質膜の再水和により５０／４９／１のモル比で混合して、総脂質濃度を４．３
４ｍｇ／ｍｌとした。それとは逆のことが示されていない場合、典型的に、３０ｇのマウ
スへの単回の静脈注射は、１．８８ｍｇ／ｋｇ ｓｉＲＮＡおよび１４．５ｍｇ／ｋｇ脂
質の標準用量で行った。また、それとは逆のことが示されていない場合、ＰＫＮ３特異的
ｓｉＲＮＡ分子は、実施例２に定義されるＰＫＮ３（３）分子である。ＰＫＮ３（３）を
含む、本発明によるリポプレックスを形成する様々な化合物は、図１２Ａに表されている
。特異的ｓｉＲＮＡ分子が、原則として、本明細書に開示される任意のｓｉＲＮＡ分子、
好ましくは表１ａおよび１ｂに示される任意のｓｉＲＮＡ分子であってもよいことは当然
理解される。
図１２Ｂは、ｓｉＲＮＡリポプレックス、すなわち前述の脂質、すなわち陽イオン性脂
質、ヘルパー脂質とも称されるＤＰｈｙＰＥ、およびＰＧ−脂質、すなわちＤＳＰＥ−Ｐ
ＥＧとｓｉＲＮＡ分子との間に、またはそれらとともに形成される複合体を説明する概略
図を示す。ＰＫＮ３特異的ｓｉＲＮＡのボールド体のヌクレオチドは、個々のヌクレオチ
ドの２’−Ｏ−メチル修飾を示した。
実施例４：ＩＣ５０の測定
実施例３で特定された脂質とともにＰＫＮ３（３）分子により形成されるリポプレック
ス（ｓｉＲＮＡ−ＰＫＮ３（３）−リポプレックスとも称される）のＩＣ５０を、ＨｅＬ
ａおよびＨＵＶＥＣ細胞でのトランスフェクションの後に測定した。トランスフェクショ
ンの４８時間後にタンパク質溶解物を調製し、ＰＫＮ３およびＰＴＥＮ特異的抗体で免疫
ブロットする。
リポプレックス化（リポプレックスに処方された）ｓｉＲＮＡ分子（「ｓｉＲＮＡ−Ｐ
ＫＮ３（３）」）の濃度は、１、５、１０および２０ｎＭであった。
結果を図３に表す。
図３から、ＨｅＬａ細胞において、既に濃度が５ｎＭのｓｉＲＮＡ−ＰＫＮ３（３）は
、タンパク質レベルでＰＫＮ３を有意にノックダウンするのに適していることがわかる。
同じことがＨＵＶＥＣ細胞にも該当し、ＨｅＬａ細胞でのノックダウンと全く同じ程度に
達するためにはわずかに高い濃度が必要である。ＰＴＥＮを負荷対照として用いた。
さらに、本明細書の表１ｂに示されるＰＫＮ３分子、より具体的にはＰＫＮ３−２３−
ｖ１により形成されるリポプレックスを、細胞株ＨＵＶＥＣおよびＥＯＭＡそれぞれにお
いて、１９塩基長のＰＫＮ３（３）と比較する用量滴定に供した。先行する実施例に記載
されるように、細胞を６ウェルにプレーティングし（４０ｋ）、１６時間後に示された濃
度のｓｉＲＮＡでトランスフェクトし、トランスフェクションから４８時間後にタンパク
質抽出のために溶解させた。抗ＰＫＮ３抗体および抗ＰＴＥＮ抗体でプローブした溶解物
のウエスタンブロットを（後者は負荷対照としての役割を果たす）、図１５に表す。
図１５からわかるように、ＰＫＮ３−２３−ｖ１ ｓｉＲＮＡは有効性の点でＰＫＮ３
（３）の１つに匹敵する。１９塩基長および２３塩基長分子のＩＣ５０は、細胞培養トラ
ンスフェクション実験に続いて半定量的免疫ブロットにより検定され、３つの異なる細胞
株について同様の効力（ＩＣ５０ 約５ｎＭ）を示す。ＥＯＭＡが、マウスおよびヒトの
活性を示すマウス由来内皮細胞株であることは、指摘するに値する。
実施例５：ＰＫＮ３特異的ｓｉＲＮＡ分子の一時的効果
ＰＫＮ３特異的ｓｉＲＮＡ分子、すなわちｓｉＲＮＡ−ＰＫＮ−３（３）の、およびＰ
ＫＮ３特異的アンチセンス分子（ＧＢ対照）（Ｌｅｅｎｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，２００
４）のノックダウン効果の一時的な特徴を示すため、これらの分子をＨｅＬａ細胞にトラ
ンスフェクトした。タンパク質溶解物を４８時間、９６時間、１４４時間および１９２時
間に調製した。いずれの場合も、細胞を、ＰＫＮ３（３）分子を含有するｓｉＲＮＡリポ
プレックスに実施例３に記載のように２４時間曝露し、上記ｓｉＲＮＡリポプレックスは
上記２４時間の後に除去した。
結果を図４に表す。
図４から、ｓｉＲＮＡ ＰＫＮ３（３）のＰＫＮ３への効果は、タンパク質レベルで９
６時間まで観察してもよく、それによると、１４４時間後、特定のｓｉＲＮＡ分子の有効
性は低下するように思われ、１９２時間後、本質的にノックダウン効果はもはや観察する
ことができないことがわかる。ＧＢ対照と比較して、本発明によるｓｉＲＮＡ分子は、し
たがって、そのノックダウンは９６時間後に既に有意に減少しているアンチセンス分子と
比較して、より長い持続活性を示す。
実施例６：本発明によるｓｉＲＮＡ分子の３’末端に結合したリン酸基の影響
この実施例では、本発明による二本鎖構造もしくは分子を形成するセンスおよびアンチ
センス鎖の両方の３’末端での３’−ホスフェート修飾の影響を研究した。ＰＫＮ３（３
）をノックダウン介在性核酸分子として用い、調製された実施例３に記載されるそれぞれ
のリポプレックスが形成されるように上記核酸分子を処方した。このようにして得られた
リポプレックスをＨｅＬａ細胞で試験し、異なる量の上記ｓｉＲＮＡ分子およびリポプレ
ックスを、それぞれ、トランスフェクトし、トランスフェクション４８ｈ後にタンパク質
溶解物を調製した。免疫ブロットを本明細書に記載されるように分析した。結果を図５に
示す。
図５からわかるように、ホスフェート修飾は事実上、ｓｉＲＮＡ分子およびそれを含有
するリポプレックスの有効性に何ら影響を与えない。
実施例７：細胞外マトリックスでのＨＵＶＥＣ増殖へのＰＫＮ３機能の消失
本発明による分子を用いるＰＫＮ３のノックダウンの際に、一部の生理学的かつ形態学
的変化も存在することをさらに示すため、細胞外マトリックス増殖アッセイを用いた（Ｌ
ｅｅｎｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，２００４）。
より具体的には、ＨＵＶＥＣに、個別にかつ分離して、ＰＫＮ３（１）、ＰＫＮ３（３
）、ＰＫＮ３（４）およびＰＫＮ３（５）をｓｉＲＮＡ分子として含有する、４つの異な
るｓｉＲＮＡ−ＰＫＮ３リポプレックスを、さらに対照としてｓｉＲＮＡ Ｌｕｃ−リポ
プレックス（２０ｎＭ）をトランスフェクトした。細胞は、トランスフェクションの最初
の４８時間以内に培養密度まで増殖し続けた。４８時間後、細胞をトリプシン処理し、等
しい細胞数（１１０，０００細胞）でリプレーティングし、２４ウェルを含むマトリゲル
にプレーティングした。
代表的な顕微鏡写真を撮ってリプレーティング後２０時間のＨＵＶＥＣ細胞増殖の変化
をモニターした。結果を図６に表す。
予測したとおり、有力なｓｉＲＮＡ ＰＫＮ３リポプレックス、好ましくはＰＫＮ３（
３）リポプレックスおよびＰＫＮ３（５）リポプレックスの場合には、顕著な増殖の阻害
が観察された。
実施例８：皮下注射ＰＣ−３異種移植腫瘍増殖の阻害
ＰＣ−３異種移植腫瘍モデルをＰＣ３細胞の皮下注射により作成した。このようにして
作成した腫瘍を、その後、実施例３に説明されるリポプレックスで処理した。このような
リポプレックスの中に含められたｓｉＲＮＡ分子はＰＫＮ３（３）であった。基本的な実
験デザインを図７Ａに表す。合計３つの異なる治療群を確立した（各群は６匹のマウスか
ら構成される）。第１の群にはスクロースのみを投与し、第２の群にはルシフェラーゼに
対するｓｉＲＮＡを含有するリポプレックス（ｓｉＲＮＡＬｕｃ−リポプレックス（ｌｉ
ｐｏｌｅｘ））を投与し、第３の群にはＰＫＮ３に特異的なｓｉＲＮＡを含有するリポプ
レックス（ｓｉＲＮＡ ＰＫＮ３−リポプレックス）を投与した。
腫瘍細胞の接種後、２５日から開始して３０日まで様々な薬剤を投与した。注射は１日
に８回静脈内に行った。ｓｉＲＮＡリポプレックス用量は、ｓｉＲＮＡ１．８８ｍｇ／ｋ
ｇおよび総脂質１４．５ｍｇ／ｋｇであった（Ｓａｎｔｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００６ａ
；Ｓａｎｔｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００６ｂ）。
平行して、ＰＫＮ３−２３−ｖ１ ｓｉＲＮＡ分子を、ＰＫＮ３（３）と比較して検定
した。それぞれの基本的な実験デザインを図１６Ａに表す。腫瘍細胞の接種後、様々な薬
剤、すなわちスクロース、ＰＫＮ３（３）およびＰＫＮ３−２３−ｖ１を、２９日から開
始して４７日まで投与した。その投与は、１０回の静脈注射を２日に１回（１２匹のマウ
スの群において）行うというものであった。ｓｉＲＮＡリポプレックス用量はｓｉＲＮＡ
２．８ｍｇ／ｋｇおよび総脂質２１．７ｍｇ／ｋｇであった（Ｓａｎｔｅｌ ｅｔ ａｌ
．，２００６ａ；Ｓａｎｔｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００６ｂ）。
このような治療スキームの結果を、ＰＫＮ３（３）について図７Ｂおよび図７Ｃに、Ｐ
ＫＮ３（３）と比較したＰＫＮ３−２３−ｖ１ ｓｉＲＮＡ分子について図１６Ｂ〜１６
Ｄに表す。
図７Ｂからわかるように、定着したＰＣ−３異種移植片の増殖は、示されるようにｓｉ
ＲＮＡ Ｌｕｃ−リポプレックス（三角）処理のもの（標準用量 １．８８ｍｇ／ｋｇ／
日 ｓｉＲＮＡ；１４．５ｍｇ／ｋｇ／日 脂質；矢印）、または等張性スクロース（黒
丸）と比較して、ｓｉＲＮＡ ＰＫＮ３リポプレックス（菱形）を用いて有意に阻害され
た。図７Ｂに示される投与の間、体重の変化をモニターした。個々のデータは、毎日の腫
瘍体積の平均値の標準誤差の平均値を表す。様々なリポプレックスの投与によって体重の
わずかな減少だけが観察され、観察された場合でも、リポプレックスの脂質成分の動物の
健康への影響は最小限のものにすぎないことが確認される。
図１６Ｂ、１６Ｃおよび１６Ｄからわかるように、試験した両方のｓｉＲＮＡ分子、す
なわちＰＫＮ３（３）、すなわち「１９塩基長」、およびＰＫＮ３−２３−ｖ１、すなわ
ち「２３塩基長」は、前立腺腫瘍体積の減少（図１６Ｂ）、リンパ節転移体積の減少（図
１６Ｃ）およびリンパ節転移拡散（図１６Ｄ）に表されるように、この前立腺腫瘍モデル
において同じ有効性を示す。
実施例９：皮下ＰＣ−３異種移植腫瘍増殖の阻害：異なるリポプレックス用量の影響
異なるリポプレックス用量の皮下ＰＣ−３異種移植腫瘍増殖の阻害への影響を調査する
ために、基礎的実験を行った。より具体的には、ｓｉＲＮＡ ＰＫＮ３（３）リポプレッ
クスを使用した。これらのリポプレックスは実施例３に記載されるように調製された。実
験デザインは図８Ａから得ることができる。投与群は６匹のマウスからなり、一方の動物
群は陰性対照としてスクロースを投与され、それに対してもう一方の群はｓｉＲＮＡ Ｐ
ＫＮ３−リポプレックス、より具体的にはｓｉＲＮＡ ＰＫＮ３（３）リポプレックスを
投与された。皮下への腫瘍細胞接種後、動物に２２日から３８日まで１１回の静脈内注射
を毎日投与し、６７日までの生存を検定した。
ｓｉＲＮＡリポプレックス製剤の処方は次の通りであった。１．８８ｍｇ／ｋｇ ｓｉ
ＲＮＡ＋１４．５ｍｇ／ｋｇ ａｔｕＦｅｃｔ０１／１％ ＰＥＧ。
異なるリポプレックス用量は次の通りであった。
−０．９４ｍｇ／ｋｇ ｓｉＲＮＡ 毎日 ２２日〜３２日
−１．８８ｍｇ／ｋｇ ｓｉＲＮＡ 毎日 ２２日〜３２日
−１．８８ｍｇ／ｋｇ ｓｉＲＮＡ １日２回（ｂｉｄａｉｌｙ）５０％用量 ２２日〜
２８日
−１．８８ｍｇ／ｋｇ ２日に１回 ２２日〜３８日
結果を図８Ｂに表す。図８Ｂからわかるように、毎日１．８８ｍｇ／ｋｇの用量は、腫
瘍体積の有意な減少をもたらした。体重はごくわずかに変化し、リポプレックス製剤自体
についてマイナスの効果は観察されなかった。
実施例１０：皮下ＰＣ−３異種移植腫瘍増殖の阻害：異なる投与計画の影響
実験デザインは、実施例８に関して説明されるとおりであった。
結果を図８Ｃに表す。より具体的には、図８Ｃからわかるように、この実施例で調査し
た投与スケジュールの効果は、腫瘍体積の影響の点で異ならなかった。しかし、１日２回
、１日１回および２日に１回からなる投与スケジュールは同じ腫瘍増殖阻害を示し、ＰＫ
Ｎ３−ｓｉＲＮＡリポプレックスでの２日に１回の投与が治療効果を維持するために十分
であることが示された。さらに、１日２回の投与の結果、体重が有意に減少し、さらなる
治療上の利益のない用量制限用量が示唆される（Ｓａｎｔｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００６
ａ）。
実施例１１：同所性異種移植腫瘍モデルにおけるｓｉＲＮＡ ＰＫＮ３（３）リポプレ
ックスを用いるマウスへの全身投与
この実験は、同所性異種移植腫瘍モデルにおける腫瘍増殖への、ｓｉＲＮＡ ＰＫＮ３
リポプレックス、より具体的にはｓｉＲＮＡ−ＰＫＮ３（３）リポプレックスを用いる、
マウスへの全身投与の影響を研究するために行われた。（実験の詳細については（Ｓａｎ
ｔｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００６ａ）参照）。
同所性ＰＣ−３前立腺腫瘍およびリンパ節転移モデルにおけるｓｉＲＮＡ ＰＫＮ３リ
ポプレックス投与の有効性を分析するための実験デザインを図９Ａに表す。各々９匹のマ
ウスからなる合計４つの投与群、すなわち、スクロース、ｓｉＲＮＡ Ｌｕｃ−リポプレ
ックス、ｓｉＲＮＡ ＰＫＮ３−リポプレックスおよびｓｉＲＮＡ Ｔｉｅ２−リポプレ
ックスの投与される群を定めた。前立腺内腫瘍細胞接種の後、１．８８ｍｇ／ｋｇ ｓｉ
ＲＮＡおよび１４．５ｍｇ／ｋｇ ａｔｕＦｅｃｔ０１／１％ ＰＥＧからなるｓｉＲＮ
Ａリポプレックス用量を、３５日から４９日まで２日に１回、８回の静脈内注射を注射し
た。３５日に対照に前処理を行った。
この実験から、より具体的に図９Ｂに表される（前立腺腫瘍の体積サイズおよびリンパ
節転移の体積）スクロースまたはルシフェラーゼ特異的ｓｉＲＮＡ分子（ｓｉＲＮＡＬｕ
ｃ）で処理した群と比較して、示されたｓｉＲＮＡリポプレックスを用いる投与の後に、
マウスにおいて前立腺ＰＣ−３腫瘍およびリンパ節転移の体積の減少が観察された。
投与開始前の腫瘍転移体積は左に示される（３５日対照）。統計的有意性はアスタリス
クで示される。上記図からわかるように、ＰＫＮ３特異的ｓｉＲＮＡ分子、より具体的に
はそれを含有するリポプレックスは、前立腺腫瘍の体積およびリンパ節転移の体積の両方
の減少に関して非常に効果的であった。
ＰＫＮ３−ｓｉＲＮＡリポプレックスの静脈内投与によるインビボＲＮＡ干渉を実証す
るため、肺組織でのｍＲＮＡノックダウンを分析した。より具体的には、定量的ＴａｑＭ
ａｎ逆転写ポリメラーゼ連鎖反応により明らかとなった、対応するｓｉＲＮＡリポプレッ
クスで投与したマウス由来の肺組織でのＰＫＮ−３およびＴｉｅ２ ｍＲＮＡレベルの減
少を図９Ｃに表す。インビボでリポプレックスに媒介される干渉をインビボで実証するた
めに、ＣＤ３４ ｍＲＮＡに標準化した、肺でのＴｉｅ２またはＰＫＮ３ ｍＲＮＡレベ
ルの相対平均量が示される。対照ＴＩＥ−２受容体特異的ｓｉＲＮＡリポプレックスを平
行して試験し、同様に標的特異的ｍＲＮＡの減少が証明された（図９、右パネル）、しか
し、陰性のルシフェラーゼ特異的ｓｉＲＮＡ−リポプレックスと比較して、腫瘍増殖また
はリンパ節転移の形成の有意な阻害を明らかにはならなかった。これらのデータは、ＰＫ
Ｎ３−ｓｉＲＮＡ−リポプレックスを用いる標的遺伝子特異的治療効果を示す。
実施例１２：同所性異種移植腫瘍モデルにおけるｓｉＲＮＡ−ＰＫＮ３（３）−リポプ
レックスを用いるマウスへの全身投与：投与スケジュールの影響
この実験は、同所性異種移植腫瘍モデルにおけるｓｉＲＮＡ−ＰＫＮ３−リポプレック
ス、より具体的にはｓｉＲＮＡ−ＰＫＮ３（３）リポプレックスを用いるマウスへの全身
投与に関して異なる投与スケジュールを試験するために行った。
実験用のセットアップは図１０Ａに表される。各群が９匹のマウスからなる２つの投与
群があり、各群はスクロースまたはｓｉＲＮＡ ＰＫＮ３リポプレックスのいずれかが投
与された。前立腺内腫瘍細胞接種の後、３５日から５３日まで２日に１回または３日に１
回、１０／７回の静脈内注射を行った。２つの異なるｓｉＲＮＡリポプレックス用量を次
のとおり用いた。１．８８／２．８ｍｇ／ｋｇ ｓｉＲＮＡ １４．５／２１．７ｍｇ／
ｋｇ ａｔｕＦｅｃｔ０１／１％ ＰＥＧ、すなわち１４．５／２１．７ｍｇ／ｋｇの総
脂質を含む。
結果は、前立腺腫瘍の体積（図１０Ｂ）およびリンパ節転移の体積（図１０Ｃ）として
表す。両方のパラメータ、腫瘍体積およびＬＮ転移形成について、阻害が観察された、し
かし、３日に１回の投与と比較した場合、２日に１回の投与で有効性の有意な増大は観察
されなかった。しかし日用量が高くなると（２．８ｍｇ／ｋｇ ｓｉＲＮＡ）より顕著な
転移形成の阻害が観察される。これらのデータは、ｓｉＲＮＡに媒介される阻害が毎日の
静脈内投与に制限されず、治療効果は２日に１回の投与で得ることができることを示す。
実施例１３：同所性異種移植腫瘍モデルにおけるｓｉＲＮＡ−ＰＫＮ３（３）−リポプ
レックスを用いるマウスへの全身投与：異なる用量の影響
この実験は、同所性異種移植腫瘍モデルにおいて、異なる用量のｓｉＲＮＡ−ＰＫＮ３
リポプレックスを、このようなリポプレックス、より具体的にはｓｉＲＮＡ−ＰＫＮ３（
３）リポプレックス（図１１）、さらにｓｉＲＮＡ−ＰＫＮ３−２３−ｖ１（図１７）を
用いるマウスへの全身投与に関して試験するために行った。
実験用のセットアップは図１１Ａに表される。各群が１０匹のマウスからなる３つの投
与群があり、各群はスクロース、ｓｉＲＮＡ−ＰＫＮ３リポプレックスまたはリポプレッ
クスのみのいずれかが投与された。前立腺内腫瘍細胞接種の後、２８日から４６日まで２
日に１回、１０回の静脈内注射を行った。ｓｉＲＮＡリポプレックス用量は次のとおりで
あった。０．７／１．４／２．８ｍｇ／ｋｇ ｓｉＲＮＡ；５．４／１０．９／２１．７
ｍｇ／ｋｇの総脂質（リポプレックス中、３群全てを合計：ａｔｕＦｅｃｔ０１／ヘルパ
ー脂質／１％ ＰＥＧ）。２日に１回の静脈内注射により３種類の投与計画を投与した。
結果は、前立腺腫瘍の体積（図１１Ｂ）およびリンパ節転移の体積（図１１Ｃ）として
表す。両方の場合において、１日用量２．８ｍｇまたは１．４ｍｇのｓｉＲＮＡ／ｋｇで
有意な阻害が観察され、これらのｓｉＲＮＡ分子に対する治療濃度域を示す。
また、ｓｉＲＮＡ種としてＰＫＮ３（３）よりもＰＫＮ３−２３−ｖ１を含むｓｉＲＮ
Ａ ＰＫＮ３リポプレックスの場合、各群が７〜８匹のマウスからなる３つの異なる投与
群があり、各群に、スクロース、ｓｉＲＮＡ−ＰＫＮ３リポプレックスまたはリポプレッ
クスのみが投与された。前立腺内腫瘍細胞接種の後、７日から６３日まで、４日に１回、
１５回の静脈内注射を行った。ｓｉＲＮＡリポプレックス用量は、それぞれ１．４ｍｇ／
ｋｇ ｓｉＲＮＡ（総脂質１０．９ｍｇ／ｋｇ）／および０．７ｍｇ／ｋｇ ｓｉＲＮＡ
（総脂質５．４ｍｇ／ｋｇ）であった。
結果は、前立腺腫瘍体積（図１７Ｂ）およびリンパ節転移の体積（図１７Ｃ）として表
す。両方の場合において、用量１．４ｍｇおよび０．７ｍｇのｓｉＲＮＡ／ｋｇでそれぞ
れ有意な阻害が観察され、これらのｓｉＲＮＡ分子用量に対する治療濃度域を示す。
さらに、細胞接種後のマウスの体重が記録され、図１７Ｄに表される。この図から、こ
のような投与計画下ではマウスの体重は減少しないことがわかり、動物の健康の全般的指
標である体重によって全体的な毒性効果のないことが示される。
［参考文献］
先行技術の様々な文献が本明細書において言及される程度まで、その完全な文献データ
が次の通り記載されるこのような文献は、引用することにより本明細書の一部をなすもの
とする。
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本明細書、特許請求の範囲、配列表および／または図面に開示される本発明の特徴は、
別々に、またはそれらの任意の組合せの両方で、本発明をそれらの様々な形態で実現する
ための材料となってもよい。

Claims (37)

  1. 二本鎖構造を含む核酸分子であって、
    前記二本鎖構造は、第１の鎖と第２の鎖とを含み、
    前記第１の鎖は、隣接するヌクレオチドからなる第１のストレッチを含み、前記第１の
    ストレッチが、標的核酸と少なくとも部分的に相補的であり、かつ
    前記第２の鎖は、隣接するヌクレオチドからなる第２のストレッチを含み、前記第２の
    ストレッチが、少なくとも部分的に第１のストレッチと相補的であり、
    前記第１のストレッチが、配列番号１（ＮＭ＿０１３３５５）に記載の核酸配列のヌク
    レオチドコア配列またはその部分と少なくとも部分的に相補的である核酸配列を含み、
    前記ヌクレオチドコア配列は、ヌクレオチド配列
    配列番号１のヌクレオチド位置４８２〜５００（配列番号２）；
    配列番号１のヌクレオチド位置１５５５〜１５７３（配列番号４）；
    配列番号１のヌクレオチド位置１５５６〜１５７４（配列番号６）；
    配列番号１のヌクレオチド位置１５５９〜１５７７（配列番号８）；
    配列番号１のヌクレオチド位置１５６６〜１５８４（配列番号１０）；
    配列番号１のヌクレオチド位置２０９４〜２１１２（配列番号１２）；
    配列番号１のヌクレオチド位置２１０２〜２１２０（配列番号１４）；
    配列番号１のヌクレオチド位置２２８６〜２３０４（配列番号１６）；
    配列番号１のヌクレオチド位置２７６１〜２７７９（配列番号１８）；
    配列番号１のヌクレオチド位置２７６３〜２７８１（配列番号２０）；
    配列番号１のヌクレオチド位置２７６４〜２７８２（配列番号２２）；
    配列番号１のヌクレオチド位置２８４３〜２８６１（配列番号２４）；
    配列番号１のヌクレオチド位置２８４４〜２８６２（配列番号２６）；または
    配列番号１のヌクレオチド位置２８４６〜２８６４（配列番号２８）を含み、
    好ましくは、前記ヌクレオチドコア配列は、ヌクレオチド配列
    配列番号１のヌクレオチド位置１５５５〜１５７３（配列番号４）；
    配列番号１のヌクレオチド位置１５５６〜１５７４（配列番号６）；
    配列番号１のヌクレオチド位置１５５９〜１５７７（配列番号８）；
    配列番号１のヌクレオチド位置１５６６〜１５８４（配列番号１０）；
    配列番号１のヌクレオチド位置２０９４〜２１１２（配列番号１２）；または
    配列番号１のヌクレオチド位置２２８６〜２３０４（配列番号１６）を含み、
    好ましくは、前記第１のストレッチが、さらに、前記ヌクレオチドコア配列の５’末端
    に先行する領域、および／または前記ヌクレオチドコア配列の３’末端の後に続く領域と
    少なくとも部分的に相補的である核酸分子。
  2. 前記第１のストレッチが、前記ヌクレオチドコア配列またはその一部と相補的である、
    請求項１に記載の核酸。
  3. 前記第１のストレッチが、さらに、前記ヌクレオチドコア配列の３’末端の後に続く領
    域、および／または前記ヌクレオチドコア配列の５’末端に先行する領域と相補的である
    、請求項１および２のいずれかに記載の核酸。
  4. 前記第１のストレッチが、１８を超え２９までのヌクレオチド、好ましくは１９〜２５
    ヌクレオチド、より好ましくは１９〜２３ヌクレオチドの標的核酸と相補的である、請求
    項１〜３のいずれか一項に記載の核酸。
  5. 前記ヌクレオチドが連続したヌクレオチドである、請求項４に記載の核酸。
  6. 前記第１のストレッチおよび／または第２のストレッチが、１８〜２９の連続したヌク
    レオチド、好ましくは１９〜２５の連続したヌクレオチド、より好ましくは１９〜２３の
    連続したヌクレオチドを含む、請求項１に記載の核酸。
  7. 前記第１の鎖が、前記第１のストレッチからなり、および／または、前記第２の鎖が、
    前記第２のストレッチからなる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の核酸。
  8. 二本鎖構造を含む核酸分子、好ましくは、請求項１〜７のいずれか一項に記載の核酸分
    子であって、前記二本鎖構造が、第１の鎖と第２の鎖とにより形成され、前記第１の鎖が
    、隣接するヌクレオチドからなる第１のストレッチを含み、前記第２の鎖が、隣接するヌ
    クレオチドからなる第２のストレッチを含み、前記第１のストレッチが、前記第２のスト
    レッチと少なくとも部分的に相補的であり、
    前記第１のストレッチが、配列番号３に記載のヌクレオチド配列からなり、前記第２の
    ストレッチが、配列番号２に記載のヌクレオチド配列からなり；
    前記第１のストレッチが、配列番号５に記載のヌクレオチド配列からなり、前記第２の
    ストレッチが、配列番号４に記載のヌクレオチド配列からなり；
    前記第１のストレッチが、配列番号７に記載のヌクレオチド配列からなり、前記第２の
    ストレッチが、配列番号６に記載のヌクレオチド配列からなり；
    前記第１のストレッチが、配列番号９に記載のヌクレオチド配列からなり、前記第２の
    ストレッチが、配列番号８に記載のヌクレオチド配列からなり；
    前記第１のストレッチが、配列番号１１に記載のヌクレオチド配列からなり、前記第２
    のストレッチが、配列番号１０に記載のヌクレオチド配列からなり；
    前記第１のストレッチが、配列番号１３に記載のヌクレオチド配列からなり、前記第２
    のストレッチが、配列番号１２に記載のヌクレオチド配列からなり；
    前記第１のストレッチが、配列番号１５に記載のヌクレオチド配列からなり、前記第２
    のストレッチが、配列番号１４に記載のヌクレオチド配列からなり；
    前記第１のストレッチが、配列番号１７に記載のヌクレオチド配列からなり、前記第２
    のストレッチが、配列番号１６に記載のヌクレオチド配列からなり；
    前記第１のストレッチが、配列番号１９に記載のヌクレオチド配列からなり、前記第２
    のストレッチが、配列番号１８に記載のヌクレオチド配列からなり；
    前記第１のストレッチが、配列番号２１に記載のヌクレオチド配列からなり、前記第２
    のストレッチが、配列番号２０に記載のヌクレオチド配列からなり；
    前記第１のストレッチが、配列番号２３に記載のヌクレオチド配列からなり、前記第２
    のストレッチが、配列番号２２に記載のヌクレオチド配列からなり；
    前記第１のストレッチが、配列番号２５に記載のヌクレオチド配列からなり、前記第２
    のストレッチが、配列番号２４に記載のヌクレオチド配列からなり；
    前記第１のストレッチが、配列番号２７に記載のヌクレオチド配列からなり、前記第２
    のストレッチが、配列番号２６に記載のヌクレオチド配列からなり；または
    前記第１のストレッチが、配列番号２９に記載のヌクレオチド配列からなり、前記第２
    のストレッチが、配列番号２８に記載のヌクレオチド配列からなり；
    前記第１のストレッチが、配列番号３１に記載のヌクレオチド配列からなり、前記第２
    のストレッチが、配列番号３０に記載のヌクレオチド配列からなり；
    前記第１のストレッチが、配列番号３３に記載のヌクレオチド配列からなり、前記第２
    のストレッチが、配列番号３２に記載のヌクレオチド配列からなり；
    前記第１のストレッチが、配列番号３５に記載のヌクレオチド配列からなり、前記第２
    のストレッチが、配列番号３４に記載のヌクレオチド配列からなり；
    前記第１のストレッチが、配列番号３７に記載のヌクレオチド配列からなり、前記第２
    のストレッチが、配列番号３６に記載のヌクレオチド配列からなり；
    前記第１のストレッチが、配列番号３９に記載のヌクレオチド配列からなり、前記第２
    のストレッチが、配列番号３８に記載のヌクレオチド配列からなり；
    好ましくは、
    前記第１のストレッチが、配列番号５に記載のヌクレオチド配列からなり、前記第２の
    ストレッチが、配列番号４に記載のヌクレオチド配列からなり；
    前記第１のストレッチが、配列番号７に記載のヌクレオチド配列からなり、前記第２の
    ストレッチが、配列番号６に記載のヌクレオチド配列からなり；
    前記第１のストレッチが、配列番号９に記載のヌクレオチド配列からなり、前記第２の
    ストレッチが、配列番号８に記載のヌクレオチド配列からなり；
    前記第１のストレッチが、配列番号１１に記載のヌクレオチド配列からなり、前記第２
    のストレッチが、配列番号１０に記載のヌクレオチド配列からなり；
    前記第１のストレッチが、配列番号１３に記載のヌクレオチド配列からなり、前記第２
    のストレッチが、配列番号１２に記載のヌクレオチド配列からなり；
    前記第１のストレッチが、配列番号１７に記載のヌクレオチド配列からなり、前記第２
    のストレッチが、配列番号１６に記載のヌクレオチド配列からなり、または
    前記第１のストレッチが、配列番号３１に記載のヌクレオチド配列からなり、前記第２
    のストレッチが、配列番号３０に記載のヌクレオチド配列からなる核酸分子。
  9. 前記第１のストレッチおよび／または前記第２のストレッチが、規則的な位置パターン
    、好ましくは交互の位置パターンを形成する修飾を２’位に有する複数の群の修飾された
    ヌクレオチドを含み、好ましくは、前記ストレッチの内部では、修飾されたヌクレオチド
    の各群が、片側または両側を１つの隣接するヌクレオチドの群によりフランクされ、前記
    隣接するヌクレオチドの群を形成する隣接するヌクレオチドが、修飾されていないヌクレ
    オチドであるか、または修飾されたヌクレオチドの修飾とは異なる修飾を有するヌクレオ
    チドである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の核酸分子。
  10. 前記第１のストレッチおよび／または前記第２のストレッチが、修飾されたヌクレオチ
    ドの群からなる１つのパターンおよび／または隣接するヌクレオチドの群からなる１つの
    パターンを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の核酸。
  11. 前記第１のストレッチおよび／または前記第２のストレッチが、３’末端にジヌクレオ
    チドを含み、該ジヌクレオチドが、好ましくはＴＴである、請求項１〜１０、好ましくは
    、請求項１〜８のいずれか一項に記載の核酸。
  12. 前記第１のストレッチおよび／または前記第２のストレッチの長さが、１９〜２１ヌク
    レオチドからなる、請求項１１に記載の核酸。
  13. 前記第１のストレッチおよび／または前記第２のストレッチが、３’末端に１〜５ヌク
    レオチドのオーバーハングを含む、請求項１〜１０、好ましくは、請求項１〜８のいずれ
    か一項に記載の核酸。
  14. 前記二本鎖構造の長さが、約１６〜２４ヌクレオチド対、好ましくは、２０〜２２ヌク
    レオチド対である、請求項１３に記載の核酸。
  15. 前記第１の鎖と前記第２の鎖とが、相互に共有結合し、好ましくは、前記第１の鎖の３
    ’末端が前記第２の鎖の５’末端に共有結合している、請求項１〜１４のいずれか一項に
    記載の核酸。
  16. 前記分子が、次の２本の鎖の各々
    Figure 2013172714
    Figure 2013172714
     好ましくは、
    Figure 2013172714
     からなり、下線を引いたヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルである、請求項１〜１５のいず
    れか一項に記載の核酸。
  17. 請求項１〜１６のいずれか一項に記載の核酸を含むリポソーム製剤。
  18. 請求項１〜１６のいずれか一項に記載の核酸と、リポソームとを含むリポプレックス。
  19. 前記リポソームが、
    ａ）約５０モル％のβ−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル
    −Ｎ−オレイル−アミドトリヒドロクロリド、好ましくは、（β−（Ｌ−アルギニル）−
    ２，３−Ｌ−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミドトリ−ヒド
    ロクロリド）；
    ｂ）約４８〜４９モル％の１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタ
    ノールアミン（ＤＰｈｙＰＥ）；および
    ｃ）約１〜２モル％の１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノー
    ルアミン−ポリエチレン−グリコール、好ましくは、Ｎ−（カルボニル−メトキシポリエ
    チレングリコール−２０００）−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ
    エタノールアミンナトリウム塩
    からなる、請求項１８に記載のリポプレックス。
  20. 前記リポプレックスのゼータ電位が、約３５４０〜６０５５ｍＶ、好ましくは約４５〜
    ５０ｍＶである、請求項１９に記載のリポプレックス。
  21. ＱＥＬＳにより測定されるリポプレックスのサイズが、約５０〜４００ｎｍ、好ましく
    は約１００〜１４０ｎｍ、より好ましくは約１１０ｎｍ〜１３０ｎｍである、請求項１９
    または２０に記載のリポプレックス。
  22. 請求項１〜１６のいずれか一項に記載の核酸を含むまたはコードするベクター、好まし
    くは発現ベクター。
  23. 請求項１〜１６のいずれか一項に記載の核酸、または請求項２２に記載のベクターを含
    む細胞。
  24. 請求項１〜１６のいずれか一項に記載の核酸、請求項１７に記載のリポソーム製剤、１
    ８〜２１のいずれか一項に記載のリポプレックス、請求項２２に記載のベクターおよび／
    または請求項２３に記載の細胞を含む組成物、好ましくは、医薬組成物。
  25. 前記組成物が、任意選択的に、医薬品として許容されるビヒクルをさらに含む、医薬組
    成物である、請求項２４に記載の組成物。
  26. 前記組成物が医薬組成物であり、前記医薬組成物が、血管新生依存性疾患、好ましくは
    、不十分、異常もしくは過剰な血管新生により特徴付けられるか、またはそれらに起因す
    る疾患の治療のためのものである、請求項２５に記載の組成物。
  27. 前記血管新生が、脂肪組織、皮膚、心臓、眼、肺、腸、生殖器、骨および関節の血管新
    生である、請求項２６に記載の医薬組成物。
  28. 前記疾患が、感染症、自己免疫障害、血管奇形、アテローム性動脈硬化症、移植後動脈
    疾患、肥満、乾癬、疣贅、アレルギー性皮膚炎、持続性過形成硝子体症候群、糖尿病性網
    膜症、未熟児網膜症、加齢性黄斑疾患、脈絡膜血管新生、原発性肺高血圧症、喘息、鼻茸
    、炎症性腸疾患および歯周病、腹水、腹膜癒着、子宮内膜症、子宮出血、卵巣嚢胞、卵巣
    、卵巣過剰刺激、関節炎、滑膜炎、骨髄炎、骨棘形成を含む群から選択される、請求項２
    ６または２７に記載の医薬組成物。
  29. 腫瘍性疾患、好ましくはがん疾患、より好ましくは固形腫瘍の治療のための、請求項２
    ５〜２８のいずれか一項、好ましくは、請求項２５に記載の医薬組成物。
  30. 骨癌、乳癌、前立腺癌、消化器系の癌、結腸直腸癌、肝癌、肺癌、腎癌、泌尿生殖器癌
    、膵癌、下垂体癌、精巣癌、眼窩癌、頭頸部癌、中枢神経系の癌および呼吸器系の癌を含
    む群から選択される疾患の治療のための、請求項２５〜２９のいずれか一項、好ましくは
    請求項２９に記載の医薬組成物。
  31. 請求項１〜１６のいずれか一項に記載の核酸、請求項１７に記載のリポソーム製剤、請
    求項１８〜２１のいずれか一項に記載のリポプレックス、請求項２２に記載のベクターお
    よび／または請求項２３に記載の細胞の、薬剤の製造のための使用。
  32. 前記薬剤が、請求項２６〜３０のいずれか一項に定義されるいずれかの疾患の治療のた
    めのものである、請求項３１に記載の使用。
  33. 前記薬剤が、１種または数種類の他の治療と併用して用いられる、請求項３２に記載の
    使用。
  34. 前記治療法が、化学療法、寒冷療法、温熱療法、抗体療法、放射線療法および抗血管新
    生療法を含む群から選択される、請求項３３に記載の使用。
  35. 前記治療法が抗体療法であり、より好ましくは、抗ＶＥＧＦ抗体または抗アンジオポエ
    チン抗体を用いる抗体療法である、請求項３４に記載の使用。
  36. 前記抗血管新生療法が、キナーゼ受容体阻害剤、好ましくはチロシンキナーゼ受容体阻
    害剤を使用し、該受容体が、ＶＥＧＦ受容体、ＰＤＧＦ受容体、Ｔｉｅ−２、ＦＧＦＲお
    よびＥＧＦＲを含む群から選択される、請求項３４に記載の使用。
  37. 前記阻害剤が、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス分子、アプタマー、スピーゲルマー、高親和
    性結合ペプチド、ペプチドアプタマー、アンチカリンおよび抗体を含む群から選択される
    、請求項３６に記載の使用。
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