JP2001504448A

JP2001504448A - 核酸の鏡面対称選択および進化

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Publication number: JP2001504448A
Application number: JP51129798A
Authority: JP
Inventors: フュルステ，イェンス，ペーター; バルト，ロルフ; エルトマン，フォルカー，アー．
Original assignee: フュルステ，イェンス，ペーター; バルト，ロルフ; エルトマン，フォルカー，アー．
Priority date: 1996-08-30
Filing date: 1997-08-29
Publication date: 2001-04-03
Also published as: EP0934331B1; WO1998008856A2; ES2188985T3; AU743469B2; AU743469C; US6605713B1; DE59708838D1; EP0934331A2; AU4456897A; ATE228529T1; WO1998008856A3

Abstract

(57)【要約】天然の立体配置を有する標的分子と相互作用するＬ−核酸の同定および製造方法ならびに該方法で製造されるＬ−核酸が開示される。また、同一の配列を有するＬ−核酸を製造するためのマトリックスとして、標的分子の光学対掌体に結合するＤ−核酸の使用、ならびに該開示されたＬ−核酸を含有する医薬およびキットも開示される。

Description

【発明の詳細な説明】核酸の鏡面対称選択および進化本発明は、天然の立体配置を有する標的分子と相互作用するＬ−核酸の同定および製造方法、ならびにこの方法により生成されるＬ−核酸に関する。さらに、本発明は、同一の配列を有するＬ−核酸を製造するためのマトリックスとして標的分子の光学対掌体に結合するＤ−核酸の使用ならびに本発明のＬ−核酸を含む医薬組成物、キット、診断薬およびセンサーシステムに関する。過去数年間、以前には予想されなかった様式で核酸を使用するために、新しい技術が確立されている。これらの中には、例えば、細胞内または細胞外で起こる生化学反応の触媒、阻害剤または刺激剤のような分子の使用がある。これらの技術は、将来、医学、医薬による診断、バイオテクノロジーおよび農業の分野において最も有力な役割を果たすであろうことはほとんど疑う余地もない。いくつかの新しいＤＮＡおよびＲＮＡ技術の本質的な部分は、イン・ビトロの選択または進化である（例えば、スゾスタック(J．W．Szostak)、TIBS 17(1992) ，89-93、ファムロック(Famulok)とスゾスタック(Szostak)、Angew．Chemie 104 (1992)，1001-1011およびゴールド(Gold)ら、Annu．Rev．Blochem．(1995)の概説論文を参照のこと）。これらの技術は、生物学的システムの作用方法に基づいている。それにより、所望の特性を有する新規なＤＮＡおよびＲＮＡ分子を、改変、選択および複製による不均質の核酸分子の組合せライブラリーから得てもよい。したがって、かかるイン・ビトロのシステムは、生物学的進化において存在するすべての因子を含む。それは、天然の方法のスピードを何倍も加速するイン・ビトロの進化と正当に称されるであろう。このシステムに追加の改変工程が生じない限り、それは、イン・ビトロの進化ではなく、ただ単にイン・ビトロの選択方法である。１０¹⁸個までの異なるＲＮＡ種の群から、高いアフィニティーの結合特性または触媒特性を有するＲＮＡ分子がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、転写、選択的結合および逆転写のサイクルプロセスにより単離される；ゴールドら、上記引用文を参照のこと。この方法の本質的な利点の１つは、選択対象の分子の構造を知ることを要しないという事実であり；「正しい」構造を有する分子を、選択工程により出発集団から濾過して取り出し、所望ならば、その後にシーケンスしてもよい。この選択または進化プロセスの原理を、図１に概略的に示す。かかるイン・ビトロの選択または進化方法の例は、チュルク(Tuerk)とゴールド(Gold)、Science 249(1990)，505-510、ベルザール−ヘランツ（Berzal-Herra nz）ら、Genes & Develpoment 6(1992)，129-134およびロバートソン(Robertson )とジョイス(Joyce)、Nature344(1990)，467-468により提供された。これらの研究グループは、実験上のアプローチをわずかに変更することにより、基質とは異なる前もって決定された核酸を切断または結合する機能的なリボ核酸を選択することに成功した。より最近の研究においては、レーマン(Lehman)とジョイス(Joy ce)は、リボザイムの金属イオン特異性がかかるイン・ビトロの進化プロセスによりＭｇ²⁺からＣａ²⁺に変化するかもしれないことを示した（Nature 361(1993) ，182-185）。高いアフィニティーＲＮＡのみならずＤＮＡもまた、他の核酸との相互作用の目的のためばかりでなく、主として、蛋白質、細胞の他のより小さい分子または合成化合物との相互作用のために構築してもよい。また、細胞のレセプターまたはウイルス粒子との相互作用に関する試みがなされてもよい。通常、高いアフィニティー核酸のかかる相互作用は、生物学的機能を阻害もしくは刺激する目的またはセンサーシステムにおけるシグナルを刺激する目的を有する。他のオリゴマーまたはポリマーの組合せライブラリーと比較したときの核酸ライブラリーの利点は、核酸の二元的性質に見出される。該分子は、遺伝子型（増幅可能な配列）および表現型（機能的構造）を有する。これは、非常に大きな組合せライブラリー由来の機能的分子の増幅およびシーケンスによるそれらの同定を可能にする。「タグ付加」(ジャンダ(Janda)、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 9 1(1994)，10779-10785)等により機能的改変体を同定するための分子ライブラリーの追加の標識およびそれに付随する技術的な問題（ゴールドら、前述；ゴールド、J．Biol．Chem．270(1995)，13581-13584）が回避されるであろう。遺伝子型および表現型の組合せにも関与するペプチドモチーフを同定するための組合せファージライブラリーを用いることにより（スコット(Scott)とスミス(Smith)、 Science 249(1990)，386-390、デブリン(Devlin)ら、Proc．Natl．Acad.Sci．US A(1990)，6378-6382）、他の不都合が生ずる。わずか２５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドは、すでに非常に安定な構造を形成するであろうが、匹敵するオリゴペプチドは、大きなコンフォメーション上の自由度を有する（ゴールドら、前述）。ペプチドの構造的な自由度およびそれから生ずる標的構造との相互作用におけるエントロピーの損失が、高いアフィニティーおよび特異性が該分子の適用に必要である限り、ペプチドの使用可能性を限定する。また、この限定は、ファージライブラリーによる生物学的に安定なＤ−ペプチドの選択においても起こる（シューマッハー（Schumacher）ら、Science 271(1996)；1854-1857）。環状ペプチドの使用は、これらの基本的な不都合を相殺しないかもしれない（ゴールドら、前述）。他のオリゴマーまたはポリマーの代わりに組合せ核酸ライブラリーを使用する際の特に不利な点は、生物学的液体中の核酸の低い安定性である。しかしながら、これまでに知られたすべての選択および進化プロセスは、天然の型の、即ち、基本成分としてのＤ−リボースまたはＤ−デオキシリボースを有する、高いアフィニティーもしくは触媒ＲＮＡまたはＤＮＡを単に生成することが可能なだけである。生物学的環境における使用中に、これらの分子は酵素により分解される。該分解は、これらの高いアフィニティーまたは触媒核酸の短期間の効果に導く。酵素による分解を遅延させるために、未修飾核酸の選択後に標的化される修飾を導入することが可能であるけれども、しかしながら、構造上のこの修飾の影響およびそれによる核酸の機能性における影響は予想されないだろう。さらに、変化した所望しない性質を予想することができない。また、化学的に修飾したＤＮＡまたはＲＮＡの分解は、ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドのアナログの型として重大かつ不利な様式で細胞の代謝に影響するかもしれない産物を生ずる。さらに、核酸の安定性を増加させるヌクレオシド三リン酸を修飾するプロセスに統合することが可能である。この手法の例は、ジェリネック(Jellinek)ら、Bi ochemistry 34(1995)，11363-11372およびイートン(Eaton)とピーケン(Pieken) 、Annu．Rev．Biochem．64(1995)，837-863により記載されている。ヌクレオシド三リン酸は、使用されるポリメラーゼに親和しなければならないので、可能な修飾の範囲は非常に限られている。さらに、これらの修飾した核酸の分解が特に毒性のある作用に導くことを予想しなければならない。したがって、本発明の根底にある技術的な問題は、従来技術で言及した前記不都合を呈しない、高いアフィニティー核酸分子がイン・ビトロの選択または進化を介して生成されうる手段による方法を提供することであった。この技術的な問題は、請求の範囲で特徴付けられた態様により解決する。したがって、本発明は、天然の立体配置を有する標的分子と相互作用するＬ−核酸の製造方法に関し、該方法は、下記工程：（ａ）Ｄ−核酸の不均質集団を生成する工程；（ｂ）工程（ａ）の集団を標的分子の光学対掌体と接触させる工程；（ｃ）標的分子の光学対掌体と相互作用しないＤ−核酸を分離する工程；（ｄ）標的分子の光学対掌体と相互作用するＤ−核酸の配列を決定する工程；（ｅ）工程（ｄ）で決定されたＤ−核酸の配列と同一の配列であるＬ−核酸を合成する工程、を含む。本明細書において、「Ｌ−核酸」とは、天然に存在しないＬ−立体配置で存在するいかなる核酸であってもよい。これは、核酸のバックボーンを天然に形成するＤ−リボースまたはＤ−デオキシリボースの代わりに、Ｌ−リボースまたはＬ −デオキシリボースをＬ−核酸の基本的構成成分として使用することを意味する。「天然の立体配置を有する標的分子」という用語は、その天然の構造で存在する限りは核酸を結合可能ないかなる分子をも含む。かかる分子の例は、Ｌ−アミノ酸から構成される蛋白質、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−ヌクレオチドからなる核酸ならびにＤ−糖およびそれからなるさらに複雑な糖分子である。不均質Ｄ−核酸集団の生成は、従来技術で知られた方法のいかなる手段により行なってもよい。かかる方法の例は、ゲノム断片の増幅（キンツラー(Kinzler) とヴォーゲルシュタイン(Vogelstein)、Ｎucl．Acids Res．17(1989)，3645-363 5)または合成機によるＤＮＡ分子の化学固相合成（ツィーセン(Thiesen)とバッハ(Bach)、Nucl．Acids Res．18(1990)，3203-3209およびポロック(Pollock)とトレイスマン(Treisman)、Nucleic．Acids Res．18(1990)，6197-6204）である。さらに、当業者であれば、所望の結果にも導く実験上のアレンジによりこれらの方法を変更することが可能である。該核酸は、所望の数のＤ−ヌクレオチドから構成されていてもよい。Ｄ−ヌクレオチドは、少なくとも１５の位置で任意の（前もって決定されていない）ヌクレオチドを提示することが好ましい。不均質Ｄ−核酸集団は、いかなる所望のメンバー数、好ましくは少なくとも１０⁹のメンバーを提示する。工程（ｂ）において、Ｄ−核酸を、標的分子の光学対掌体と接触させ、（高い）アフィニティー核酸と該標的分子の光学対掌体との相互作用をさせる。本明細書において、「標的分子の光学対掌体」という用語は、天然の立体配置で存在する（巨大）分子のエナンチオマー型を意味する。標的分子の光学対掌体は、従来技術で記載された方法に従って製造することができる。したがって、例えば、オラタ(Orata)ら(Nucl．AcidsRes．20(1992)，3325-3332)は、Ｌ−デオキシリボースからなるヘキサデオキシリボヌクレオチドの合成を記載している。さらに、Ｌ−核酸は、実施例１に記載のように製造してもよい。Ｌ−（ポリ）ペプチドの光学対掌体は、例えば、ミルトン(Milton)ら(Science 258(1992)，1445-1 448)またはミューア(Muir)(Structure 3(1995)，649-652)により記載された方法に従って製造してもよい。標的分子と相互作用しないＤ−核酸の分離は、従来技術から知られた方法に従って行なう。分離は、例えば、カラムクロマトグラフィー法により行なってもよく、それにより標的分子の光学対掌体がカラム材料に結合し、アフィニティーまたは場合により高いアフィニティーのＤ−核酸が適する条件下で引き止められる。かかる方法で結合した核酸は、非結合の核酸の洗浄後にカラム材料から溶出されうる。しかしながら、分離は、濾過方法または磁気粒子のような分離技術により行なってもよい。さらに、当業者は、自身の特別な要求のために従来技術に記載された方法を改変することができる。相互作用する核酸から相互作用しない核酸を分離した後、該相互作用する核酸を標的分子の光学対掌体から分離する。但し、工程（ａ）の集団の限定された不均質性が存在し、かつ、十分数の同一または類似の分子が生ずると仮定した場合、標的分子の光学対掌体と既に相互作用しているＤ−核酸を直接に配列決定することができる。適する配列決定技術は、従来技術から知られている；サンブルーク（Sambrook）ら、Molecular Cloning，A Laboratory Mannual，第２版，1989 ，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harborを参照のこと。但し、この選択技術において異なる配列を有する核酸が標的分子の光学対掌体に結合し、その後配列決定された場合、種々の位置で曖昧な配列情報が得られるかもしれない。しかしながら、多くの核酸が一定の位置で保存されていることを参酌してもよい。これは、ブラックウェルら(ブラックウェル(Blackwell)とヴァイントラウブ(Weintraub)、Science250(1990)，1104-1110、ブラックウェルら、Sc ience 250(1990)，1149-1151)により示されたように、標的分子の光学対掌体の結合における役割を示す。この限定された情報により、当業者はすでに、所望の標的分子に結合可能なＬ−核酸を合成することが可能である。まず最初に、標的構造の光学対掌体がエナンチオメリックに純粋な型で調製されなければならないので、多くの適用に対し、鏡面対称核酸を同定する方法がかなり応用されている。エナンチオメリックに純粋な標的構造が自由になるならば、ラセミ体分割を回避してもよい。別の好ましい態様において、したがって、本発明は、Ｄ−核酸と標的分子のラセミ混合物との相互作用を発生させる方法に関する。標的分子のラセミ混合物と相互作用しないＤ−核酸の分離は、当該技術分野において公知の方法に従って行なわれる。分離は、例えば、カラムクロマトグラフィー法により行なってもよく、それにより標的分子のラセミ混合物がカラム材料に結合し、アフィニティーまたは場合により高いアフィニティーのＤ−核酸が適する条件下で引き止められる。この結果、低いキラル識別力により（ａ）標的構造、（ｂ）鏡面対称標的構造または（ｃ）両異性体と相互作用してもよい核酸が最初に結合する。天然に存在するエナンチオマーに結合し、低いキラル特異性を有する高いアフィニティーＤ−核酸の占有は、溶出により天然の標的分子で洗浄してもよい。光学対掌体に結合した残存しているＤ−核酸は、その後、ラセミ混合物で特異的に溶出されてもよい。それにより、標的分子の光学対掌体を単離することさえなく、鏡面対称選択または進化方法を行なうことが可能である。Ｌ−核酸の合成は、従来技術（ウラタら、前述）から知られた方法または実施例１に記載された方法に従って行なわれる。エナンチオマーに関するパスツール(L．Pasteur)の研究（例えば、Soc．Chim ．Paris 1860，1，(1860)において）を考慮して、天然に存在する核酸が、基本的構成要素がＬ−リボースまたはＬ−デオキシリボースである光学対掌体を有することを仮定してもよい。本発明の目的に従って、Ｌ−ＲＮＡまたはＬ−ＤＮＡの化学固相合成が現在いかなる所望の配列においても成功裏に確立している（実施例１を参照のこと）。本発明の方法によって選択された核酸を調べる際に、同一の配列の対応するＬ −ポリマーが同様の様式で標的分子の光学対掌体と相互作用すると仮定してもよい。標的分子のエナンチオマーを進化または選択方法に利用する場合、高いアフィニティーまたは触媒能のＬ−ＲＮＡまたはＬ−ＤＮＡの製造を可能にする配列情報が得られるかもしれない。本方法の原理を図２に示す。鏡面対称選択または進化と称される本方法の利点は、生物学的環境下での生成物の高い安定性である。本方法により、高いアフィニティーで天然に存在するＤ−アデノシンに結合するＬ−オリゴリボヌクレオチドが初めて同定された（実施例２を参照のこと）。ヒト血清中でＬ−オリゴリボヌクレ才チドをインキュベートした後、分解を示すことができなかった。その後の研究において、Ｌ−オリゴリボヌクレオチドはＤ −アデノシンのみに結合し、Ｄ−オリゴリボヌクレオチドはＬ−アデノシンのみに結合することを証明することができた。これは、同一の共有結合したヌクレオチド結合を有するＤ−およびＬ−オリゴヌクレオチドが三次元構造を獲得するために同様の様式で折り畳まれること、ならびにヌクレオチド配列が核酸の三次構造のみを決定することを示す。実施例２に記載したＬ−ＲＮＡのＤ−アデノシンに対するアフィニティー（解離定数１．８μＭ）は、イン・ビトロの進化によりこれまで獲得されたヌクレオシドに対するＤ−ＲＮＡのアフィニティーの範囲内にある（コンネル(Connell)とヤールス(Yarus)、Science 264(1994)，1137-1141 およびヒュイゼンガ(Huizenga)とスゾスタック(Szostak)、Biochemistry 34(199 5)，656-665を参照のこと）。したがって、Ｌ−核酸は、Ｄ−核酸のような天然に存在するキラル標的物質と等しく高いアフィニティーを発揮することが可能であることを初めて示した。該方法の原理は、アルギニン特異的リガンドの同定により確認することができた（実施例３を参照のこと）。鏡面対称進化または選択は、選択を標的分子の光学対掌体に関して行なうという特別な性質を示す。この特殊性は、２つの本質的な利点を有する：一方では標的分子の光学対掌体は、天然に存在するエナンチオマーとの場合のようには、本発明の方法の間ではそう簡単には分解しない。この特徴は、標的分子がＲＮＡである場合に重要な役割を果たす。他方、特に本明細書に記載の方法は、主として、選択または進化手法が終了した後、選択した（高い）アフィニティーＤ−核酸のエナンチオマーが製造されるという、従来技術では知られていない利点を提供する。このＬ−核酸は、生物学的システムにおいてその長期的効果を与える生物学的環境で前記した高い安定性を発揮するのみではない。生物学的システムにおいて適当な分解酵素がないことによるこの安定性の結果として、衛生上の危険を表すかもしれないこれらの核酸の代謝産物がもはや形成されない。さらに、これらのＬ−核酸が免疫系により扱われる量でないか少量しか存在せず、したがって、あるとしてもわずかな免疫反応を剌激するのみであると思われる。よって、本発明の方法の生成物は、さらに躊躇することなく医薬組成物として使用してもよい。したがって、本発明の方法は、天然に存在する核酸の鏡面対称の鏡映物である生成物を提供する。これらの生成物は、一定の配列を有し、所定のリガンドに対して高い結合アフィニティーを保有し、または所望の標的分子で所望の反応を触媒する。それにより、高い生物学的安定性を示し、モノクローナル抗体と同様に使用してもよい化学合成したポリマーが提供される。多彩な加水分解性質、しかし可能な合成特性も、本発明の分子を化学的または医薬的に使用することに関して興味をそそらせる。さらなる好ましい態様において、本発明は、下記工程：（ｃａ）標的分子の光学対掌体と相互作用するＤ−核酸を増幅する工程、を工程（ｃ）に続いてさらに追加する方法に関する。本発明のこの態様により、特に、不均質の出発集団に少数で存在するＤ−核酸を選択してもよい。この好ましい態様の原理を図３に示す。追加の増幅工程は、標的分子の光学対掌体への結合により得られた（高い）アフィニティ−Ｄー核酸を増加させる。前記Ｄ−核酸は、繰り返しの選択工程でさらに濃縮してもよく、または増幅後にそれらを直接配列決定してもよい。しかしながら、増幅は、等温系で行なってもよい。かかる系は、例えば、グアテリ(Guatelli)ら(Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87(1990)，1874-1878)およびウオーカー(Walker)ら(Nucl．Acids Res．20(1992)，1691-1696)により記載されている。本発明の方法の別の好ましい態様において、工程（ａ）集団のＤ−核酸は、その５’および３’末端で、ＰＣＲにより工程（ｃａ）で得られたＤ−核酸の増幅を可能にするプライマー結合部位または、場合によりプライマー結合部位に相補的な配列を提示する。本発明の方法のこの態様は、Ｄ−核酸がＲＮＡレベルで選択される場合に特に好ましい。さらに、ＰＣＲとは別に追加の増幅工程としてＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによる転写の使用がなされうる。したがって、これらの両増幅工程の組合せは、標的分子の光学対掌体と相互作用するＤ−核酸材料の特に高い収量を可能にする。本発明の方法のさらに好ましい態様において、以下の工程：（ｃｂ）増幅したＤ−核酸を標的分子の光学対掌体と接触させる工程、を工程（ｃａ）に続いて追加する。この工程後、工程（ｄ）を行なう前に工程（ｂ）および任意に工程（ｃａ）を行ない、それにより工程（ｃｂ）、（ｂ）および任意に（ｃａ）をこの順序で１回または数回繰り返してもよい。ＰＣＲにより選択工程で単離されたＤ−核酸の増幅は、適した様式で所望のＤ −核酸の濃縮に導く。本発明の方法の好ましい態様において、ここで、増幅したＤ−核酸を標的分子の光学対掌体と接触させる複数のサイクル、続く未結合分子の分離（選択）および増幅が起こり、最後に、最も高い結合アフィニティーを有する核酸を選択する。標的分子の光学対掌体とＤ−核酸とのモル比を変えることにより、大多数の（高い）アフィニティーのＤ−核酸（比＞１）または１もしくは数個のみの核酸（比≦１）の観点から選択が起こってもよい。相応じて、工程（ｅ）は、１もしくは複数の高いアフィニティーＬ−核酸または（高い）アフィニティーＬ−核酸の大部分を生ずる。それぞれの結果は、選択工程の数を変えることにより達成してもよく、それにより多数の選択工程が、高い結合アフィニティーを有する１または複数のＤ−核酸を最後に生ずるであろう。本発明の方法の増幅工程は、ＰＣＲにより適当に行なってもよい。ＰＣＲは、その原理がサンブルーク（Sambrook）ら、前述に記載された従来技術で十分確立された方法である。ＤＮＡばかりでなくＲＮＡもＰＣＲを介して増幅してもよく、それにより逆転写酵素によるＲＮＡの対応するｃＤＮＡへの翻訳を生じるプロセス工程が、ＲＮＡの増幅に統合されてもよい。しかしながら、増幅はまた、従来技術から知られた他の技術により達成されてもよい。本発明の方法の別の好ましい態様において、ヌクレオチドは、新規に合成される対象のヌクレオチド鎖に増幅中に組み込まれる。これらのヌクレオチドは、標分子と相互作用し、かつ、工程（ａ）で述べたＤ−核酸のヌクレオチド位置で存在しない。この好ましい態様により、選択は、生物学的イン・ビボの進化と類似の様式で、出発集団には存在しない新規なＤ−核酸種に関して起こってもよい。したがって、これは、イン・ビトロの進化の場合である。この方法のいくつかの変法が考えられ、すべてが本発明の保護の範疇に該当する。他方、このような増幅は、新規に合成される対象の鎖でヌクレオチドの組み込み中に一定の割合のエラーを示す方法を介して行なってもよい。ＰＣＲは、この種の公知の方法である。但し、最適の結合に必要な結合部位が約２５を越えるヌクレオチドを呈示するならば、対応する配列が工程（ａ）の元の集団で得られない一定の蓋然性がある。これは、一定の長さのヌクレオチド配列（２５ヌクレオチドの範囲内にある）から出発して、実用性の理由によりこの集団にはいかなる可能な配列も含まれないかもしれないという事実によるものである。しかしながら、標的分子の対掌体への結合に関して最適な配列が実際に工程（ａ）の集団内に存在しない場合、それは、本発明の方法で選択してもよい。これは、まず、該集団から最適下限の結合アフィニティーを有するＤ−核酸を単離することにより行なう（しかしながら、該集団内ではこの配列は最適の結合アフィニティーを有する分子である）。その後、この配列は、増幅中に変異を導入される。かかる変異導入技術は、従来技術から知られている（例えば、ライト(Light )とレルナー(Lerner)、Bioorg．Med．Chem．3(1995)，995-967およびパンネケーク(Pannekoek)ら、Gene 128(1993)，135-140）。それにより、全配列を変異導入してもよい。変異導入した配列を、さらなる選択工程に供し、それにより複数の増幅、変異導入およびその後の選択サイクルが、最適の結合特性を有するＤ−核酸が得られるまで相互に続く。さらに、実際的な理由として、その集団の最適な結合特性を呈示する短いＤ− 核酸を最初に取り込んでもよい。結合に必須の位置は、従来技術から公知の方法により決定され、他のヌクレオチド領域は、より長いセクションにより置換される。また、この手法後、１以上の増幅および選択サイクルを行なう。結合に必須でない最適の結合特性を有するこのように決定された分子の配列の一部を、ランダム配列により再び置換する。このプロセス工程は、例えば、別の情況で国際公開第９１／１９８１３号パンフレットに記載されており、そこでは「ウオーキング」と称された。本発明のさらなる態様において、Ｌ−核酸は、天然の立体配置を有する標的分子と直接相互作用するように作製される。したがって、本発明は、下記工程：（ａ）Ｌ−核酸の不均質集団を生成する工程；（ｂ）工程（ａ）の集団を標的分子と接触させる工程；（ｃ）標的分子と相互作用しないＬ−核酸を分離する工程；（ｄ）標的分子と相互作用するＬ−核酸を配列決定する工程；（ｅ）配列が工程（ｄ）で決定された配列と同一であるＬ−核酸を合成する工程を含むＬ−核酸の製造方法に関する。Ｌ−核酸の不均質集団の生成は、従来技術から知られた方法（ウラタら、前述）または実施例１に記載の方法に従って行なう。相互作用しないＬ−核酸を相互作用するＬ−核酸から分離した後、該相互作用する核酸を標的分子から分離する。次いで、Ｌ−核酸を、実施例４に記載された方法に従って繰り返し選抜する。実施例４で使用したＬ−蛋白質の代わりに、この方法においてはＤ−蛋白質を使用する。酵素の光学対掌体は、ミルトンら（前述）またはミューア（前述）に記載の方法に従って製造してもよい。鎖は、実施例４に記載の方法または従来技術に記載のいかなる方法によって分離してもよい。かかる方法の例は、鎖分離ゲル（マキサム(Maxam)とギルバート(Gilbert)、Proc．Natl．Acad．Sci．78(1977) ，560-564;マニアティス、前述）または固相シーケンス（フルトマン(Hultman) ら、Nucl．AcidsRes．17(1989)，4937-4946、フルトマンら、BioTechniques 10( 1991)，84-93）である。ＰＣＲ後に得られる一本鎖ＤＮＡのさらなる可能性は、内部スペーサー（例えば、ポリエチレングリコール）を有するプライマーを利用することである（ウイリアムズ(Williams)とバーテル(Bartel)、Nucl．Acids Re s．23，(1995)，4220-4221）。配列決定に必要なＬ−デオキシヌクレオシド三リン酸およびＬ−ジデオキシヌクレオシド三リン酸は、Ｄ−ヌクレオシドに関する従来技術で記載された方法に従って、実施例１に記載されたＬ−ヌクレオシドを化学的に合成することにより得られる。三リン酸塩の合成において、まず、４つのＬ−デオキシヌクレオシドを５’位置でリン酸化する(ヨシカワ(Yoshikawa)ら、Tetrahedron Lett．(50)， 1967，5065-5068)。次いで、５’−モノホスフェートを、その５’−トリホスフェートに置換する（ホアード(Hoard)とオット(Ott)、J．Am．Chem．Soc．87(1 965)，1785-1788）。Ｌ−ジデオキシヌクレオチド三リン酸を合成するために、まず、Ｌ−デオキシヌクレオシドをＬ−ジデオキシヌクレオシドに転換する。ピリミジン−Ｌ−ジデオキシヌクレオシドの合成は、ホルビッツ(Horwitz)ら(J．O rg．Chem．32(1967)，817-818)およびジョシ(Joshi)ら(J．Chem．Soc．(1992)， 2537-2544)に従って多工程プロセスで行なってもよい。グアノシン−Ｌ−ジデオキシヌクレオシドは、ヘルデビジュン(Herdewijn)ら(J．Med．Chem．31(1988)， 2040-2048)に従って合成してもよく、アデノシン−Ｌ−ジデオキシヌクレオシドは、シュー(Chu)ら(J．Org．Chem．54(1989)，2217-2225)に従って合成してもよい。次いで、それにより得られた４つのＬ−ジデオキシヌクレオシドを、ヨシカワ(Yoshikawa)ら(Tetrahedron Lett．50，(1967)，5065-5068)およびホアード(H oard)とオット(Ott)(ホアードとオット、J．Am．Chem．Soc．87(1965)，1785-17 88)の前記方法により５’−モノホスフェートの中間工程を介してそれぞれの５ ’−トリホスフェートに変換する。さらに好ましい態様において、本発明は、下記工程：（ｃａ）標的分子と相互作用するＬ−核酸を増幅する工程を工程（ｃ）の後に追加して導入する方法に関する。Ｌ−核酸の増加は、ミルトンら（前述）またはミューア（前述）に記載の方法に従って生成したＤ−ポリメラーゼにより達成される。特に、不均質の出発集団中に少量で存在するようなＬ−核酸は、本発明の方法のこの態様により選択してもよい。この好ましい態様の原理を図５に示す。追加の増幅工程は、標的分子に結合することにより得られた（高い）アフィニティーのＬ−核酸の数を増加させる。これらは、繰り返しの選択工程により濃縮してもよく、または増幅後に配列決定してもよい。しかしながら、増幅は、対応するＤ−ポリメラーゼの助力により等温系で行なってもよい。かかる系は、例えば、グアテリら（前述）およびウオーカーら（前述）により、Ｌ−ポリメラーゼに関して記載されている。本発明の方法の別の好ましい態様において、工程（ａ）集団のＬ−核酸は、その５’および３’末端で、鏡面対称ＰＣＲにより得られた工程（ｃａ）で得られたＬ−核酸の増幅を可能にするプライマー結合部位または、場合によりプライマー結合部位に相補的な配列を提示する。本発明の方法のこの態様は、Ｌ−核酸がＲＮＡレベルで選択される場合、特に好ましい。さらに、鏡面対称ＰＣＲとは別の追加の増幅工程としてＤＮＡ依存性Ｄ−ＲＮＡポリメラーゼにより鏡面対称転写の使用がなされうる。したがって、これらの両増幅工程のの組合せは、標的分子の光学対掌体と相互作用するＬ−核酸物質の特に高い収量を可能にする。本発明の方法のさらに好ましい態様において、下記工程：（ｃｂ）増幅したＬ−核酸を標的分子と接触させる工程を工程(ca)に続いて追加する。この工程後、工程(d)を行なう前に工程（ｂ）および任意に工程（ｃａ）を行ない、それにより工程（ｃｂ）、（ｂ）および任意に（ｃａ）をこの順序で１回または数回繰り返してもよい。鏡面対称ＰＣＲを介して選択工程で単離されたＬ−核酸の増幅は、適した様式で所望のＬ−核酸の濃縮に至る。本発明の方法の好ましい態様において、ここで、増幅したＬ−核酸を標的分子と接触させ、非結合分子のその後の分離（選択）および増幅の複数のサイクルを行ない、最後に、最高の結合アフィニティーを有する核酸が選択される。標的分子とＬ−核酸とのモル比を変えることにより、大多数の（高い）アフィニティ−Ｌ−核酸（比＞１）または１もしくは数個のみの核酸（比≦１）に関して選択を行なってもよい。相応じて、工程（ｅ）は、１もしくは複数の高いアフィニティーＬ−核酸または大多数の（高い）アフィニティ −Ｌ−核酸を生ずる。それぞれの結果は、選択工程の数を変えることにより達成してもよく、それにより、多数の選択工程が、高い結合アフィニティーを有する１または複数のＬ−核酸を最後に生ずるであろう。本発明の方法の別の好ましい態様において、ヌクレオチドは、新規に合成されるヌクレオチド鎖に増幅中に組み込まれる。これらのヌクレオチドは、標的分子と相互作用し、かつ、工程（ａ）で述べたＬ−核酸のヌクレオチド位置で生じない。この好ましい態様により、選択は、生物学的イン・ビボの進化と類似の様式で出発集団には存在しない新規なＬ−核酸種に関して起こってもよい。したがって、これは、鏡面対称イン・ビトロ進化の場合である。この方法のいくつかの変法が考えられ、すべてが本発明の保護の範囲に該当する。好ましい態様において、本発明は、相互作用が結合である方法に関する。本発明の方法のさらに好ましい態様において、相互作用は、触媒反応である。相互作用に関与する分子は、触媒反応終了前に互いに相互作用しなければならないので、この態様は、例えば、（高い）アフィニティーＤ−核酸と標的分子の光学対掌体との相互作用も包含する。かかる触媒反応は、例えば、リボザイム（ロバートソンとジョイスら、前述等を参照のこと）に関して記載されている。さらに、新規な触媒の例は、パン(Pan )とウーレンベック(Uhlenbeck)(Biochemistry 33(1994)，9561-9565)およびバーテル(Bartel)とスゾスタック(Szostak)(Science 261(1993)，1411-1418)により記載されている。ロルシュ(Lorsch)とスゾスタック(Nature 371(1994)，31-36) は、イン・ビトロの選択によりキナーゼ活性を有するリボザイムを同定することに成功した。ブレーカー(BreaKer)とジョイス(Chem．Biol．1(1994)，223-229) は、ホスホジエステル結合の切断を触媒する新規なデオキシリボザイムを記載し、一方、キューノイド(Cuenoud)とスゾスタック(Nature 375(1995)，611-614)は、ＤＮＡリガーゼ活性を有するＤＮＡメタロ酵素を同定することができた。本発明の方法の別の好ましい態様において、工程（ａ）の核酸は、デオキシリボ核酸である。本発明の方法の特に好ましい態様において、リボ核酸は、デオキシリボザイムである。本発明の方法のさらに好ましい態様において、核酸は、リボ核酸である。本発明の方法の特に好ましい態様において、リボ核酸は、リボザイムである。本発明の方法のこの好ましい態様は、標的分子の光学対掌体に所望の分子を結合することによるばかりでなく、それらの触媒活性によっても所望の分子の選択を可能にする。したがって、本発明の方法の工程（ｂ）は、前記標的分子の光学対掌体への結合に直接関連して、通常、標的分子またはその一部である基質の切断をも含む。それにより、基質の切断は、さらなる増幅および好適なリボザイムの選択の出発点であってもよい。対応する系は、特にロバートソンとジョイス（前述）により記載されている。本発明の方法のさらなる態様において、標的分子は、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチドまたは複数のポリペプチドからなる蛋白質である。該ポリペプチドまたは蛋白質は、グリコシル化されてもよく、グリコシル化されていなくてもよい。本発明によれば、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチドおよび蛋白質は、Ｄ−核酸またはＬ−核酸（？）が相互作用できるこれらの（巨大）分子のいかなるものであってもよい。かかる（巨大）分子の例は、酵素、構造蛋白質およびホルモンである。したがって、（巨大）分子は、より大きな構造の構成成分であってもよく、または希釈された型で生物学的系に存在してもよい。本発明の方法の別の好ましい態様において、標的分子は、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＤＮＡならびにそれらの組合せである。これらの核酸が種々の条件下で種々のコンフォメーションをとることは当業者にとって当然のことである。本発明の方法は、これらの（巨大）分子またはそれらの組合せがとるであろういかなるコンフォメーションをも含む。さらに、本発明の方法は、これらの巨大分子の組合せを含む。かかる組合せは、例えば、一本鎖および二本鎖ＲＮＡもしくはＤＮＡまたは三重らせんからなってもよい。抗生物質または医薬上有効な基質またはその前駆体が、本発明の方法のさらに好ましい態様の標的分子である。好ましい医薬上有効な基質は、例えば、ステロイド、ＡＣＥインヒビター、β −ブロッカーおよび利尿剤である。したがって、治療法は、本発明のＬ−核酸により有効に妨害されてもよく、抗生物質または医薬上有効な基質の半減期が有効に低下してもよい。本発明の方法のさらに好ましい態様において、標的分子は、分枝状または非分枝状の多糖等の糖分子である。本明細書で用いられる「糖分子」という用語は、モノマーばかりでなく複雑な糖構造の組合せにも関する。本発明の方法の別の態様において、工程（ｅ）のＬ−核酸の合成は、化学的または酵素的手法で行なう。本発明の方法の特に好ましい態様において、工程（ｅ）のＬ−核酸の化学合成は、下記工程：（ｅａ）Ｌ−ヌクレオシドを合成する工程；（ｅｂ）保護されたＬ−ヌクレオシドホスホロアミダイトを合成する工程；および（ｅｃ）合成機でＬ−核酸を固相合成する工程、を含む。さらに、本発明は、前記したように、標的分子に特異的に結合するＬ−核酸に関する。本発明のＬ−核酸は、本発明の方法により製造されることが好ましい。さらに、本発明のＬ−核酸は、標的分子の光学対掌体を利用する選択工程およびマトリックスとしてＤ−核酸を利用する合成工程のみを用いるとすれば、本発明の方法のいかなる変法で製造されてもよい。本発明のＬ−核酸は、種々の異なる方法で使用してもよい。標的分子に対する高いアフィニティーにより、それらは、モノクローナル抗体と類似の様式で用いてもよい。例えば、それらは、マーカーまたは細胞傷害性基とともに提供されてもよい。本発明のＬ−核酸は、標的分子の生物学的機能を刺激または阻害するために用いてもよい。さらに、該Ｌ−核酸は、担体に結合されてもよく、標的分子を精製または分離するためのアフィニティー材料として用いてもよい。固定化されたＬ−核酸は、例えば、エナンチオマーまたはエナンチオマー性不純物を分離するために用いてもよい。さらに、それらは、細胞性因子または細胞の精製および／または分離のために使用してもよい。ＤＮＡ配列に関して知られていることに従って、本発明の方法において、例えば、蛋白質配列に由来する対応する光学対掌体（Ｄ−蛋白質またはＤ−ペプチド）を用い、それにより、アフィニティー材料を特異的に製造することが可能である。さらに、固定化されたＬ−核酸は、透析による毒性成分の分離におけるような細胞性因子または細胞を分離するために、アフィニティー材料として使用してもよい。特に好ましい態様において、本発明のＬ−核酸は、Ｌ−リボ核酸である。このＬ−リボ核酸は、一本鎖または二本鎖の型で存在してもよい。別の特に好ましい態様において、本発明のＬ−核酸は、リボザイムである。本発明は、初めて、高いアフィニティーＬ−オリゴリボヌクレ才チドまたはＬ −オリゴデオキシリボヌクレオチドを記載する（実施例１を参照のこと）。該方法により同定されたＬ−ＲＮＡは、Ｄ−アデノシン（実施例２を参照のこと）またはＬ−アルギニン（実施例３を参照のこと）に特異的に結合する。比較実験により、これらの高いアフィニティーＬ−オリゴリボヌクレオチドは、アデノシンの対応するエナンチオマー型（実施例２を参照のこと）またはアルギニンの対応するエナンチオマー型（実施例３を参照のこと）を結合することが示された。したがって、高いアフィニティーのオリゴリボヌクレオチドの両方のエナンチオマー型は、折り畳まれて正確に同一の様式で三次元構造を獲得してもよいことが証明されえた。したがって、光学エナンチオマーの生物学的活性に関するパスツールの予言（前述）を確認することができた。さらに特に好ましい態様において、本発明のＬ−核酸は、Ｌ−デオキシリボ核酸である。本発明のＬ−リボ核酸に関してすでに述べたように、Ｌ−デオキシリボ核酸は、一本鎖または二本鎖の型で存在してもよい。さらに特に好ましい態様において、本発明のＬ−核酸は、デオキシリボザイムである。さらに、本発明は、同一の核酸配列を有するＬ−核酸の製造用のマトリックスとして工程（ｃ）および／または工程（ｃａ）で得られたＤ−核酸の使用を含む。さらに、本発明は、前記記載の方法により得られたＬ−核酸または前記記載のＬ−核酸の１つ、共有結合の修飾および／または医薬上許容されうる担体との可能な組合せを含む医薬組成物を含む。本発明の医薬組成物は、多くの異なる方法で使用してもよい。しかしながら、当然のこととして、医薬組成物の有効範囲は、Ｌ−核酸の特異性に依存する。本発明の医薬組成物は、例えば、癌、ウイルスおよび細菌感染ならびに高血圧の治療に使用してもよい。各場合において、担当の医師は、適用、投与量および治療の持続期間のそれぞれの方法に関して決定し、そこでは疾患の重症度ならびに患者の年齢および一般的な状態が、担当の医師により考慮されるべきパラメーターのいくつかである。必要と思われるならば、本発明のＬ−核酸を医薬上許容されうる担体との組合せで投与される。添加剤の選択は、特に、適用の型に依存する。しかしながら、当業者であれば、どの担体がそれぞれの医薬組成物に添加されるべきかを従来技術から知っている。最後に、本発明は、前記記載の方法により得られたＬ−核酸または前記Ｌ−核酸を含むキットおよび診断薬に関する。本発明のキットは、診断および分析目的に使用してもよい。前記したように、本発明のＬ−核酸は、抗体と類似の様式で使用してもよいので、当業者は、本発明のキットの適用分野としてそれらを使用するために、当業者の自由にポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の診断可能性の完全な範囲をもっている。本発明のキットのＬ−核酸は、例えば、マーカーとともに提供されてもよく、標的分子のイン・ビトロ証明用に提供されてもよい。また、Ｌ−核酸は、例えば、表面プラズマ共鳴センサー、エバネッセント場センサーまたはグリット結合剤を伴ってバイオセンサーとして使用してもよい。したがって、本発明の方法により得られたＬ−核酸または本発明のＬ−核酸のバイオセンサーとしての使用は、本発明のさらなる主題である：Ｌ−核酸は、除草剤として、食料品の添加剤として、芳香性および／または味覚性物質の決定のような分析方法用または老化防止クリームもしくはサンローションのような化粧品使用のために用いることも考えられうる。この態様および他の態様は、当業者に開示されている。それらは、当業者に自明であり、本発明の明細書および実施例に含まれる。例えば、本発明の意義において適用してもよい前記方法、手段および使用の１つに関するさらなる文献は、電子補助手段等を用いることによる公共の図書館のような従来技術からわかりうる。この目的のために、インターネットを介してアクセスされる「メッドライン（Medline）」のような他の公共のデータベースを、例えば、http://www.ncbi-n lm.nih.gov/PubMed/medline.html.のアドレス下で調べてもよい。他のデータベースとアドルスは、当業者に公知であり、http://www.lycos.com．のアドレス下等のインターネットから利用してもよい。バイオテクノロジー特許または特許出願に関するソースおよび情報の要約は、バークス(Berks)、TIBTECH 12(1994)，3 52-364で与えられる。図面は、以下のように示す：図１：高いアフィニティーＲＮＡの設計。工程（ａ）において、まず、不均質ＤＮＡマトリックスを生成する。このマトリックスの合成は、化学法により行なってもよい。しかしながら、該マトリックスは、例えば、天然に生成されたＤＮＡの切断産物およびライゲーション反応を介してそれに連結したＰＣＲ用プライマーからなってもよい。続く工程（ｂ）において、該マトリックスをＰＣＲにより増幅する。かかる方法で得られたＤＮＡを工程（ｃ）で転写し、続いて、標的分子と接触させる。（高い）アフィニティーＲＮＡは、標的分子に結合する。未結合分子を分離後、（高い）アフィニティーＲＮＡを逆転写酵素によりｃＤＮＡにイン・ビトロで転写する。最後に、工程（ｆ）において、相補的ｃＤＮＡ鎖を合成し、それにより再び二本鎖ｃＤＮＡ分子を得る。次いで、この分子を再び増幅して特異的結合に関して選択することができる。図２：鏡像対称選択：工程（ａ）において、不均質Ｄ−ＤＮＡまたはＤ−ＲＮＡの集団を提供する。工程（ｂ）において、これらを標的分子の光学対掌体と接触させる。標的分子の光学対掌体と相互作用するＤ−核酸を、他のＤ−核酸から分離する（選択）。相対的に同種の組成を有する十分高い量が標的分子の光学対掌体と相互作用するならば、ブラックウェルら（前述）により記載されたストラテジーに従って、これらを配列決定してもよい。ミクローシーケンス法は、例えば、デイビス(Davis)ら(Genet．Anal．Tech．Appl．8(1991)，1-7)およびハーディング(Harding)とケラー(Keller)(Trends Biotechnol．10(1992)，55-57)により記載されている。対応するＬ−ＤＮＡまたはＬ−ＲＮＡは、得られた配列情報の助けを借りて合成してもよい（工程ｄ）。次いで、このＬ−ＤＮＡまたはＬ−ＲＮＡは、標的分子と特異的に相互作用するであろう（工程ｅ）。図３：鏡像対称選択または進化：これらのプロセス工程は、選択工程（ｂ）後に選択された材料を増幅することを除いて、図２に示されたものと一致する。ドゥノボのｃＤＮＡまたはＲＮＡ合成中に増幅された材料でエラーが発生するならば、即ち、増幅された材料が配列情報に関して出発集団よりもさらに不均質であるならば、増幅工程は改変工程をも含む。したがって、生物学的進化を推進するすべての力は、該系においてイン・ビトロで一体化される。図４：Ｌ−核酸での鏡像対称選択。Ｌ−核酸での鏡像対称選択：工程（ａ）において、不均質Ｌ−ＤＮＡまたはＬ−ＲＮＡの集団を提供する。工程（ｂ）において、これらを標的分子と接触させる。標的分子と相互作用するＬ−核酸を、他のＬ−核酸から分離する（選択）。相対的に均質な組成を有する十分高い量のＬ− 核酸が標的分子の光学対掌体と相互作用するならば、ブラックウェルら（前述）により記載されたストラテジーに従って、これらを配列決定してもよく、それにより対応するＬ−蛋白質がＤ−蛋白質によって置換される。ミクローシーケンス法は、例えば、デイビスら（前述）およびハーディングとケラー（前述）により記載されている。対応するＬ−ＤＮＡまたはＬ−ＲＮＡは、得られた配列情報の助けを借りて合成してもよい（工程ｄ）。次いで、このＬ−ＤＮＡまたはＬ−ＲＮＡは、標的分子と特異的に相互作用するであろう（工程ｅ）。図５：鏡像対称選択または進化。該プロセス工程は、不均質Ｌ−核酸の集団が提供され、用いたＬ−蛋白質がＤ−蛋白質によって置換されるという改変を除いて、図３に示されたものと一致する。配列情報は、繰り返しのイン・ビトロの単離後に決定されうる（実施例４を参照のこと）。図６：Ｌ−リボホスホロアミダイトシントン。図７：担体結合Ｌ−リボヌクレ才シド（保護）の合成。図８：Ｌ−ＲＮＡの固相合成。図９：Ｌ−デオキシリボホスホロアミダイトシントン。図１０：担体結合Ｌ−デオキシリボヌクレオシド（保護）の合成。図１１：Ｌ−ＤＮＡの固相合成。図１２：Ｌ−アデノシン結合配列とコンセンサスモチーフとの比較。枠で囲んだヌクレオチドは、保存配列の領域を示す。ＷはＡまたはＴを表し、ＨはＡ、ＣまたはＴを表す。ボックスIIのモチーフは、通常の二次構造との比較後にのみ整合することができた。元のランダム配列を有する領域由来のヌクレオチドを大文字で表し、一方、プライマー領域のヌクレオチドを小文字で表す。下線の位置は、二次構造モデルで塩基対形成に加わる。配列Ｄ−Ａ１２およびＤ−Ａ８３をコンセンサスダイアグラム内に挿入するために、５’末端をスキームの中央に配置した。図１３：Ｄ−Ａ４２ｄの二次構造モデル。保存されたヌクレオチドを丸で囲む。図１４：Ｌ−アデノシンへのＤ−Ａ４２ｄ結合（）およびＤ−アデノシンへのＬ −Ａ４２ｄ結合（○）。図１５：Ｄ−Ａ４２ｄの酵素による消化。５’標識オリゴリボヌクレオチドは、レーンａ−ｈで調べ；３’標識オリゴリボヌクレオチドは、レーンｉ〜ｐで調べた。レーンａ、ｇ、ｉおよびｏ：アルカリ処理剤；レーンｂおよびｎ：ＲＮアーゼＴ₁（変性条件）；レーンｃおよびｍ：ＲＮアーゼＴ₁；レーンｄおよびｌ：ＲＮアーゼＶ₁；レーンｅおよびｋ：ＲＮアーゼＴ₂；レーンｆおよびｊ：ヌクレアーゼＳ₁：レーンｈおよびｐ：未切断。図１６：Ｄ−Ａ４２ｄおよびＬ−Ａ４２ｄのＣＤスペクトル。図１７：Ｌ−Ａ４２ｄの競合結合曲線。Ｄ−アデノシン（○）、Ｄ−ウリジン（ □）、Ｄ−グアノシン（●）、Ｄ−シチジン（■）およびＬ−アデノシン（△）との競合を示す。各実験は２回行なった。図１８：Ｌ−Ａ４２ｄの競合結合ファクター。ヌクレオシドアナログの解離定数（Ｋ_dｃ）およびＤ−アデノシン競合に対する競合剤（Ｋ_dＤ−Ａ）の相対的結合アフィニティー（Ｋ_dｃ／Ｋ_dＤ−Ａ）を示す。図１９：ヒト血清におけるオリゴヌクレオチドリガンドの安定性。（Ａ）Ｄ−オリゴリボヌクレオチドＤ−Ａ４２ｄおよび（Ｂ）Ｌ−オリゴリボヌクレオチドＬ −Ａ４２ｄ。示された時間にアリコートを取った。Ｌはサイズ標準（１０ｂｐコンダクター）を示す。該結果は、独立した実験で再現された。図２０：Ｄ−アルギニン結合配列とコンセンサスモチーフとの比較。該分析において、それぞれが保存された配列モチーフ（ｓｅｑｌおよびｓｅｑ２と称する）を含む２つのクラスのＲＮＡ分子（Ｄ−ＲＡおよびＤ−ＲＢと称する）を決定した。本来ランダム配列を有する領域のヌクレオチドを大文字で示し、一方、プライマー領域のヌクレオチドを小文字で示す。下線の位置は、二次構造モデルで塩基対形成に加わる。図２１：Ｄ−ＲＡおよびＤ−ＲＢのコンセンサスモチーフの二次構造モデル。図２２：Ｄ−Ｒ１６ｃの酵素による消化。図は、変性ポリアクリルアミドゲルで分析した酵素消化産物のオートラジオグラムを示す。保存されたモチーフ中のヌクレオチドを括弧で示す。５’標識オリゴリボヌクレオチドは、レーンａ〜ｉで調べ、３’標識オリゴリボヌクレオチドは、レーンｋ〜ｓで調べた。レーンａ、ｈ、ｋおよびｒ：アルカリ処理剤：レーンｄ〜ｇおよびレーンｎ〜ｑ：固有の条件。レーンｄおよびｎ：ＲＮアーゼＴ₁。レーンｅおよびｏ：ＲＮアーゼＴ₂。レーンｆおよびｐ：ＲＮアーゼＳ₁。レーンｇおよびｑ：ＲＮアーゼＶ₁。レーンｂ、ｃ、ｌおよびｍ：変性条件。レーンｂおよびｌ：Ｂ．セレウス(cereus)。レーンｃおよびｍ：ＲＮアーゼＴ₁。図２３：Ｄ−Ｒ１６ｃの二次構造モデル。矢印は、ＲＮアーゼＴ₁◆）、ＲＮアーゼＴ₂（■）、ＲＮアーゼＳ₁（）およびＲＮアーゼＶ₁（●）の部位を示す。黒塗りの印は、強い切断を示し、白抜きの印は、弱い切断を示す。図２４：Ｄ−Ｒ１６ｃのＤ−アルギニン（■）およびＬ−アルギニン（□）への結合。図２５：Ｄ−Ｒ１６ｃおよびＬ−Ｒ１６ｃのＣＤスペクトル。図２６：Ｌ−Ｒ１６ｃのＬ−アルギニン（●）およびＤ−アルギニン（○）への結合。図２７：Ｌ−Ｒ１６ｃのＬ−アルギニン（）およびＴａｔペプチド（△）との競合結合分析。図２８：反復イン・ビトロ単離および配列決定。まず、不均質のＲＮＡ分子の集団を逆転写酵素によりｃＤＮＡ分子に翻訳する。相補鎖合成後、ＤＮＡ分子をＰＣＲにより増幅する。希釈または分割により、集団の不均質性を低下させてもよい。続いてＰＣＲ増殖後、ＤＮＡ分子が単一化されるまでサイクルで方法を行なってもよい。次いで、配列をジデオキシシーケンスにより決定してもよい。図２９：反復イン・ビトロ単離後に決定された配列。実施例により本発明を説明する。実施例１Ｌ−オリゴリボヌクレオチドの合成Ｌ−アデノシンを、ホリー(Holy)とソーム(Sorm)(Collect．Czech．Chem．Com mun．34(1969)，3383-3401)に従って、Ｌ−アラビノースから出発してベンジル −β−Ｌ−アラビノピラノシドおよび２−Ｏ−トシル−５−Ｏ−トリチル−Ｌ− アラビノースへの転換を介して調製した。Ｌ−ウリジンの合成に関しては、まず、２，２’−Ｏ−アンヒドロ−Ｌ−ウリジンを、ホリー(Holy)(Collect．Czech ．Chem．Commun．37(1972)，4072-4087)に従って、Ｌ−アラビノースから調製した。その後、ホリー(Holy)(Collect．Czech．Chem．Commun．38(1973)，423-427 )に従って、それをベンゾイル化して３’，５’−ジ−Ｏ−ベンゾイル誘導体にし、ボロントリフルオリドエーテレートとの反応後、べンゾイル化Ｌ−ウリジンをアルカリブロッキングに供した。Ｌ−シチジンおよびＬ−グアノシンを、Ｄ− ヌクレオシドに関してフォルブリュッゲン(Vorbruggen)ら(Chem．Ber．114(1981 )，1234-1255)により記載されたように、シリル化複素環および過アシル化ペントースから得て、その際に、ゾウ(Zou)とロビンス(Robins)(Can．J．Chem．65(1 987)，1436-1437)と同様にして、２−Ｎ−アセチル−６−Ｏ−ジフェニルカルバモイルグアニンをＬ−グアノシンの合成に用いた。過アシル化ペントースを調製するために、まず、アベ(Abe)ら(Chem．Pharm．Bull．28(1980)，1324-1326)に従ってエピマー化によりＬ−リボースをＬ−アラビノースから得て、その後、レコンド(Recondo)とリンデルクネッヒト(Rinderknecht)(Helv．Chim．Acta 42(19 59)，1171-1173)によりＤ−異性体に関して記載されたように、三段階の合成で１−Ｏ−アセチル−２，３，５−トリ−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｌ−リボフラノシドに誘導した。固相合成用ホスホロアミダイト（図６）を調製するために、ヌクレオシドの環外アミノ基を、Ｄ−ヌクレオシドに関して記載されたように、チー(Ti)ら(J．Am ．Chem．Soc．104(1982)，1316-1319)に従ってアデノシンおよびシチジンのベンゾイル化ならびにフロッカージ(Flockerzi)ら(Liebigs Ann．Chem(1981)，1568- 1585)に従ってイソブチル化により保護した。塩基を保護したヌクレオシドおよびウリジンを、ウスマン(Usman)ら(J．Am．Chem．Soc．109(1987)，7845-7854) と同様にして、それらの５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−トリイソプロピルシリル誘導体に転換した。次いで、該誘導体を、ミレッキ(Milecki)ら(Nu cleosides Nucleotides 8(1989)，463-474)に従って、それぞれそれらの３’− Ｏ−（β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホロアミダイトに転換した。ウスマン(Usman)ら(J．Am．Chem．Soc．109(1987)，7845-7854)によりＤ −異性体に関して記載されたように、担体に結合した保護ヌクレオシドを生成した（図７）。Ｌ−オリゴリボヌクレオチドの化学固相合成に関して、アプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems)社の装置（モデル３９１ＰＣＲ−ＭＡＴＥ^TMＥＰおよびモデル３９４）が使用された。合成は、ＤＮＡ標準サイクルにより０．２μｍｏｌのスケールで行ない（図８）、その際に、カップリング工程を１５分まで延長した。合成後、担体からオリゴヌクレオチドを分離して保護基を切断するために、担体に結合した保護Ｌ−オリゴリボヌクレオチドを、３２％アンモニアとエタノールの３：１（ｖ／ｖ）混合物１ｍｌ中で５５℃で２４時間インキュベートした。溶液を除去し、担体物質をエタノールと水の１：１（ｖ／ｖ）混合物４００μｌで洗浄した。５μｌのアリコートを回収した上清から取り、２６０ｎｍでのＵＶ吸収を決定した。その後、試料を乾燥濃縮した。２’−ヒドロキシル保護基を切断するために、オリゴリボヌクレオチドを（１０×Ａ₂₆₀）μｌのテトラブチルアンモニウムフルオリド（テトラヒドロフラン中１．１Ｍ）でインキュベートし、（１×Ａ₂₆₀）μｌのエタノール−水（１：１、ｖ／ｖ）で希釈し、ＲＴで７２時間インキュベートした。過剰のテトラブチルアンモニウムフルオリドを、チップ５００カラム(QIAGEN) により除去した。したがって、試料を０．１Ｍトリエチルアンモニウムアセテート（ＴＥＡＡｃ）、ｐＨ７．０により総量１０ｍｌに希釈し、０．１ＭＴＥＡＡｃ、ｐＨ７．０で平衡化したカラム上に置いた。該カラムを、各３０ｍｌの０．１ＭＴＥＡＡｃ、ｐＨ７．０で２回洗浄し、次いで、試料を１０ｍｌの２ＭＴＥＡＡｃ、ｐＨ７．０で溶出した。溶出液を乾燥濃縮し、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製した。生成物のバンドをＵＶ明暗により検出し、切り出した。Ｌ−オリゴリボヌクレオチドをＨ₂Ｏで１０時間ゲル片から溶出し、溶出液を、ＮＡＰ^TM１０カラム(Pharmacia)で脱塩した。Ｌ−オリゴデオキシリボヌクレオチドの合成Ｌ−２’−デオキシアデノシンおよびＬ−２’−デオキシグアノシンを、ロビンス(Robins)ら(J．Am．Chem．Soc．105(1983)，4059-4065)によりＤ−ヌクレオシドに関して記載されたように、Ｌ−アデノシンまたはＬ−グアノシンから出発して還元により調製した。Ｌ−２’−デオキシチミジンおよびＬ−２’−デオキシシチジンを、ホリー(Holy)(Collect．Czech．Chem．Commun．37(1972)，407 2-4087)に従って、数段階で調製した：Ｌ−ウリジン−合成からの中間体生成物３’，５’−ジ−Ｏ−ベンゾイル−２，２’−アンヒドロ−Ｌ−ウリジンを、還元および脱ブロック化後にＬ−２’−デオキシウリジンを供給する２’−クロロ −２’−デオキシ誘導体に転換した。ホルムアルデヒドを伴う水酸化カリウム溶液への移送およびその後の触媒還元は、Ｌ−２’−デオキシチミジンを供給した。Ｌ−２’−デオキシシチジンは、３’，５’−ジ−Ｏ−ベンゾイル−２’−デオキシウリジンから加圧によるメタノールアンモニアでの変換によりそれを４− チオ誘導体に置換した後に得られた。ホスホロアミダイトの調製は、Ｄ−デオキシヌクレオシドに関して記載されたように行なった（図９）。Ｌ−２’−デオキシアデノシンおよびＬ−２’−デオキシシチジンの場合、環外アミノ基を、チーら、前述に従ってベンゾイル化した；２’−デオキシグアノシンの場合、それらをイソブチル化した。Ｌ−２’−デオキシヌクレオシドの５’−ヒドロキシル基を、シャラー(Schaller)ら(J．Am． Chem．Soc．85(1963)，3821-3827)に従って、４，４’−ジメトキシトリチルクロリドによりそれぞれのトリチルエーテルに変換した。Ｌ−２’−デオキシヌクレオシドホスホロアミダイトを、ミレッキら、前述に従って、保護されたＬ−２ ’−デオキシヌクレオシドをβ−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイトで変換することにより調製した。担体に結合した保護Ｌ−２’−デオキシヌクレオシドを、アトキンソン(Atkinson)とスミス(S mith)(ガイト（編）、Oligonucleotide Synthesis，1984，IRL Press，Oxford， p.35-81中)のＤ−異性体と同様に調製した（図１０）。Ｌ−オリゴデオキシヌクレオチドの固相合成は、０．２μｍｏｌのＤＮＡ標準サイクルで、アプライド・バイオシステムズ(AppliedBiosystems)社の装置（モデル３９１ＰＣＲ−ＭＡＴＥ^TM ＥＰおよびモデル３９４）を用いて行なった（図１１）。合成後、担体からオリゴヌクレオチドを分離してリン酸基または塩基保護基を切断するために、担体に結合した保護Ｌ−オリゴリボヌクレオチドを、３２％アンモニア１ｍｌ中で５５℃で２４時間インキュベートした。溶液を除去し、乾燥濃縮した。取り出されたＬ−オリゴデオキシリボヌクレオチドを、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製した。生成物のバンドをＵＶ明暗により検出し、切り出した。Ｌ−オリゴデオキシリボヌクレオチドをＨ₂Ｏで１０時間ゲル片から溶出し、溶出液を、ＮＡＰ^TM１０カラム(Pharmacia)で脱塩した。実施例２Ｄ−アデノシン特異的Ｌ−オリゴリボヌクレオチドの同定方法Ｌ−アデノシンのカップリングアフィニティークロマトグラフィーによりアフィニティーオリゴヌクレオチドリガンドを選択するために、Ｌ−アデノシンをセファロースに固定した。Ｌ−ヌクレオシドを、実施例１に記載のように合成し、ジョーンズ(Jones)とロビンス( Robins)(J．Am．Chem．Soc．85(1963)，193-201)と同様に、ヨード酢酸でアルキル化して１−カルボキシメチル−Ｌ−アデノシンにした。０．２５ＭＮａＯＨ中９５℃で２時間のアルカリ転位後、生じたＮ⁶−カルボキシメチル−Ｌ−アデノシンを、リンドバーグ(Lindberg)とモスバッハ(Mosbach)(Eur．J．Biochem．5 3(1975)，481-486)に従って、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミドの存在下で、１，６−ジアミノヘキサンで縮合してＮ⁶−［( ６−アミノヘキシル)−カルバモイルメチル］−Ｌ−アデノシンとした。Ｌ−アデノシン誘導体を、３．５ｍＭの最終濃度でＣＮＢｒ−活性化セファロース４Ｂ (Pharmacia)にカップリングした。アデノシン結合モチーフの同定約１０¹⁵のランダム配列を有する組合せＤ−ＲＮＡライブラリーを、６０ヌクレオチドの長さのランダム配列を有する領域を含むＤＮＡ分子の混合物からＴ７ −ＲＮＡ−ポリメラーゼでのイン・ビトロ転写により得た。該領域は、２０ヌクレオチドの長さで下記所定の配列を有するＤＮＡエリアによって限定された：（５’−ＣＣＡ’ＡＧＣ’ＴＴＧ’ＣＡＴ’ＧＣＣ’ＴＧＣ’ＡＧＮ₆₀’ＧＧＴ ’ＡＣＣ’ＧＡＧ’ＣＴＣ’ＧＡＡ’ＴＴＣ’ＣＣ−３’）。カラムアフィニティーリガンドの濃縮を回避するために、まず、ＲＮＡを、すべての選択サイクルにおいて負荷していないカラム材料を有するプレカラム上に置いた。第１の選択サイクルにおいて、プレカラムの基礎カラム容量は、１５０μ ｌであり、メインカラムのそれは、４００μｌであった。約４ｎｍｏ１のプールＲＮＡ（１．３×１０¹⁵の異なる分子）を、結合緩衝液（２５０ｍＭＮａＣｌ、４０ＭＴｒｉｓ／ＨＣｌｐＨ７．６、５ｍＭＭｇＣｌ₂および０．５ｍＭＥＤＴＡ）中のカラム上に置いた。１回目の選択サイクル中に、用いたＲＮＡの０．０６〜０．０７％を、結合緩衝液中１５ｍＭＬ−アデノシンでアフィニティーカラムから特異的に溶出することができた。すべての他の選択サイクルにおいて、約１ｎｍｏｌのＲＮＡを適用し、１００μｌ−プレカラムまたは２５０μｌメインカラムを用いた。６回目の選択サイクルにおいて、結合したＲＮＡ分子の３８％を、Ｌ−アデノシンで特異的に溶出することができた。リガンドの立体特異性を増加させるために、このサイクルを繰り返した。Ｌ−アデノシンで溶出する前に、アフィニティー材料をＤ−アデノシンで洗浄し、それによりＬ− アデノシンで溶出されるＲＮＡの一部が１８％に低下した。さらに４回の選択サイクルの後、特異的に結合したＲＮＡリガンドの画分が再び４０％に上昇した。このサイクルのＰＣＲ産物を制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩおよびｐｓｔＩで消化し、ベクタープラスミドｐＴ７／Ｔ３（Gibco BRL）にクローニングし、サンガーの方法に従ってシーケンスした。選択されたＲＮＡ分子の配列分析は、シーケンスしたクローンの２０％に見られたコンセンサスモチーフを得た（図１２）。共通の二次構造モデルは、コンセンサスモチーフを有する配列に関して提案することができた（図１３）。Ｌ−アデノシン特異的ＲＮＡ分子のキャラクタライゼーション個々の解離定数（Ｋ_d）を、微量透析チャンバーでの平衡透析により決定した析膜（分子量の境界：２０００）により隔てられた。ＲＮＡ濃度は、２６０ｎｍでの分光光度計で決定した。ＲＮＡ分子の個々の吸光係数を、完全アルカリ加水分解によりゾウグ（A．J．Zaug）ら(Biochemistry 27(1988)，8924-8931)に従って決定した。解離定数を測定するために、ＲＮＡを結合緩衝液中、９０℃で１０分変性し、１０分以内に室温まで冷却し、次いで、１０ｎＭＤ−［２，８−³ Ｈ］アデノシン(Moravek Biochemicals，Inc.)またはＬ−[２，８（ｎ）−³Ｈ] アデノシン（Amershamによりトリチル化）の溶液に対して０．１〜５０μＭの濃度で結合緩衝液で平衡化した。各区画を４０μｌの溶液で満たした。１８℃で２４時間インキュベートした後、３５μｌのアリコートを取り、試料の放射能をシンチレーションカウンターで測定した。ＲＮＡ含有区画での放射能と比較した２つの区画の放射能の差は、ＲＮＡへのアデノシン結合のパーセントであると仮定した。データは、コノーズ(Connors)(Binding constants，1987，John Wiley & Sons，NewYork)に従って非直線回帰分析により１：１の化学量論の標準結合式に適合させた。コンセンサスモチーフを有するクローンのＴ７転写物は、Ｌ−アデノシンの結合に対して１．１〜１０μＭの範囲の解離定数を示した。最良のリガンドＤ−Ａ４２（１．１±０．１μＭのＫ_d）の短縮バージョンを調べた。５８マーのＤ− Ａ４２ｄ（図１３）は、１．７±０．１μＭの解離定数を示した（図１４）。５ ’−および３’末端での短縮とは別に、Ｄ−Ａ４２ｄは、３１／３２位および４１／４２位の間の２個のＧヌクレオチドが欠失している。また、５４位のＡは、Ｃに置換されていた。Ｄ−Ａ４２ｄの二次構造モデルは、ヌクレアーゼ消化から得られたデータ（図１５）と一致している。固有の消化に関して、５’−および３’−標識オリゴリボヌクレオチドを９０℃で変性させ、結合緩衝液中でハイブリダイズさせた。各切断反応に対して、１００，０００ｃｐｍ（約３０ｆｍｏｌ）の標識才リゴリボヌクレオチドを用いた。切断は、ナップ(G．Knapp)(MethodsEnzymol．180(1989) ,192-212)により記載されたように行なった。切断産物を、変性２５％ポリアクリルアミドゲルで分離した。予想された一本鎖領域の３７位でのＧのみがＲＮアーゼＴ₁により明らかに切断された。ＲＮアーゼＴ₂のＧ４７位およびＡ４８位での切断ならびにＧ１０、Ｃ１１、Ａ１２、Ａ１３およびＡ２７位での一本鎖特異的ヌクレアーゼＳ₁の切断は、Ｇ１０／Ｇ１６とＧ４７／Ｇ５１との間の保存された内部ループならびにＵ３４／Ａ４０間のループ領域を確認した。Ｕ２−Ａ７、Ｇ１０、Ｃ３０−Ｕ３２、Ｕ４５およびＵ５２−Ｇ５６位の二本鎖特異的ＲＮアーゼＶ₁での切断は、二次構造モデルと一致する。Ｇ１６／Ｃ２６位間の予想されたヘアピン領域中の一本鎖および二本鎖特異的ヌクレアーゼの反応性は、低かった；したがって、コンパクトな三次構造が発生することを予想してもよい。逆の結合特異性Ｄ−Ａ４２ｄを同定後、同一のヌクレオチド配列を有するＬ−オリゴリボヌクレオチド（図１３）を、実施例１に記載のように化学固相合成により調製した。Ｌ−オリゴリボヌクレオチドの立体化学的純度を円二色性分光光度法により評価した。ＣＤスペクトルは、ＪＡＳＣＯＪ−６００分光旋光計で、４℃、０．１ＭＮａＣｌおよび１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０中で１Ａ₂₆₀オリゴヌクレオチドにより取った。Ｄ−Ａ４２ｄとＬ−Ａ４２ｄのスペクトルは、同様の大きさの相反する光学反応を示す（図１６）。Ｄ−Ａ４２ｄとＬ−アデノシンとの結合を比較した場合に、鏡面対称リガンドＬ−Ａ４２ｄは、Ｄ−アデノシンに対する同一のアフィニティーを示した（１．８±０．１μＭのＫ_d）（図１４）。キラル結合特異性の証明は、競合により確認することができた。Ｄ−アデノシンに対するＤ−Ａ４２ｄおよびＬ−アデノシンに対するＬ−Ａ４２ｄのアフィニティーは、２０ｍＭを越えている（図１７および１８）。したがって、ホモキラル相互作用は、ヘテロキラルアフィニティーに比べて９０００倍弱い。リガンドの逆のキラル特異性は、核酸の等価性がダメージを受けず、かつ、結合活性がヌクレオチド配列により独占的に決定されることを示す。Ｌ−Ａ４２ｄとの相互作用の分子成分Ｌ−オリゴリボヌクレオチドとＤ−アデノシンとの相互作用は、ヌクレオシドアナログとの競合によりキャラクタライズされた（図１７および１８）。競合実験は、前記記載のように微量透析チャンバーでの平衡透析により決定し、それにより３μＭＲＮＡは、２４０ｎＭアデノシンおよび漸増する濃度の競合剤で平衡化された。結合したアデノシンのパーセントは、前記記載のように決定し、競合剤の非存在下で１に標準化した。データは、リン(Lin)とリッジ(Riggs)(前述)に従って、競合剤とＲＮＡとの１：１化学量論で標準競合式に適用させ、それにより、Ｄ−アデノシンへのＬ−Ａ４２ｄ結合に関して１．８μＭの解離定数を使用した。Ｄ−グアノシンは４．８μＭのＫ_dｃを示し、一方、Ｄ−ウリジンおよびＤ−シチジンの競合解離定数はミリモルの範囲内であるので、ヌクレオシドのＮ−グリコシド結合は、相互作用において重要な機能を有する。２’−ヒドロキシル基の非存在下では、Ｋ_dｃは、２’−デオキシ−Ｄ−アデノシンに対して１．４ｍＭに、および２’−Ｏ−メチル−Ｄ−アデノシンに対して１２．９ｍＭに増加し、一方、３’−デオキシ−Ｄ−アデノシンと３’−Ｏ−メチル−Ｄ− アデノシンとの競合は、Ｄ−アデノシンに関して得られたようなＫ_dｃと類似かさらによいことになる。したがって、Ｎ−グリコシド結合を除いて、２’−ヒドロキシル基も分子の相互作用に重要であると思われる。アデノシン特異的リガンドの血清安定性Ｄ−およびＬ−オリゴリボヌクレオチドを、１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０で緩衝化した９０％ヒト血清（Sigma、H-1388）中、１０μＭの濃度でインキュベートした。長期実験で一定の容量とｐＨ条件を得るために、長期実験は、３７℃、９４．５％湿度および５％ＣＯ₂でインキュベーター中で行なった。分取したアリコートを同容量の停止溶液（８Ｍ尿素、５０ｍＭＥＤＴＡおよび２％ＳＤＳ）と混合し、液体窒素で凍結した。試料（５５ｐｍｏｌＲＮＡ）を変性１２％ポリアクリルアミドゲルで分離した。該ゲルを臭化エチジウム溶液（１μｇ／ｍｌ）で染色し、バンドを２５４ｎｍで可視化した。ビデオデンシトメーターによるデジタル化ゲル記録を、コンピュータープログラムにより評価した。Ｄ−オリゴリボヌクレオチドＤ−Ａ４２ｄは、ヒト血清中で数秒以内に分解されるのに対して、同一の条件下でＬ−オリゴリボヌクレオチドＬ−Ａ４２ｄに関しては６０時間後でさえも分解を測定されない（図１９）。実施例３Ｌ−アルギニン特異的Ｌ−オリゴリボヌクレオチドの同定方法Ｄ−アルギニンのカップリングアフィニティー材料は、Ｄ−アルギニンをエポキシ活性化アガロースにカップリングすることにより調製した。即ち、５ｇのエポキシ活性化アガロース６Ｂ(P harmacia）を水およびカップリング緩衝液（０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９．５）で洗浄した。該アガロースを、カップリング緩衝液中１０ｍＭＤ− アルギニン(Sigma)およびトレースのＬ−[４，５−³Ｈ]アルギニンに再懸濁した。室温で２４時間のインキュベーション後、わずかに振盪させることにより、該材料をカップリング緩衝液と水で洗浄した。次いで、該アガロースを、残存している活性基をブロックするために、１Ｍエタノールアミン、ｐＨ１０．０中、３２℃で４時間インキュベートした。ゲルの許容量は、シンチレーションカウンティングにより決定した。カップリング工程を除いて、プレカラム材料は、同一の様式で調製した。Ｄ−アルギニン結合モチーフの同定１０¹⁴個のランダム配列を有する組合せＤ−ＲＮＡライブラリーを、５０ヌクレオチドの長さを有するランダム配列の領域を含むＤＮＡ分子の混合物からＴ７ −ＲＮＡポリメラーゼによりイン・ビトロの転写によって得た。該領域は、所定の配列および２０ヌクレオチドの長さを有するＤＮＡエリアにより限定された（実施例２を参照のこと）。実施例２に記載のように１１回の選択サイクルを行ない、それによりアフィニティー材料に１ｍＭＤ−アルギニンを負荷し、３２０ｍＭＮａＣｌ、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５および５ｍＭＭｇＣｌ₂の溶液をクロマトグラフィー用選択緩衝液として使用した。カラム材料にアフィニティーを有するＲＮＡ改変体は、アガロースプレカラム材料に結合させることによりすべてのサイクルで除去した。Ｄ−アルギニン特異的ＲＮＡ分子を、４倍のカラム容量の選択緩衝液中１５ｍＭＤ−アルギニン溶液で溶出した。リガンドの立体選択性を増加させるために、該アフィニティーカラムを５回目のサイクル後まずＬ−アルギニンで洗浄し、次いで、未だ結合しているＲＮＡ分子のみをＤ−アルギニンで溶出した。１１回の選択サイクル後、ＲＮＡ分子を逆転写し、クローニングして配列を決定した。５５クローンの配列決定中に、４１個の異なる配列を発見することができた。配列の比較（図２０）により、該配列の約６０％に存在する２つの高度に保存された配列エレメント：９ヌクレオチドの長さを有するモチーフ（ｓｅｑ１）および８ヌクレオチドの長さを有するモチーフ（ｓｅｑ２）が得られた。１１個の配列では、ｓｅｑ１は、ｓｅｑ２よりも５’末端に近く、一方、１３個の配列では、該コンセンサスモチーフは逆の順に存在していた。コンセンサスモチーフを有する配列は、ズーカー(Zuker)のアルゴリズム（前述）で共通の二次構造モデルに折り畳まれることが可能であった（図２１）。このモデルから出発して、Ｄ− Ｒ１６由来の短縮改変体を化学的ＲＮＡ合成により調製した。３８ヌクレオチドの長さを有するＲＮＡ分子である改変体Ｄ−Ｒ１６ｃ（図２３）は、Ｄ−アルギニンの特異的結合に関して必須の構造エレメントを含む（以下を参照のこと）。Ｌ−アルギニン特異的ＲＮＡ分子のキャラクタライゼーションＤ−Ｒ１６ｃのヌクレアーゼＴ１、Ｔ２、Ｓ１およびＶ１での酵素消化による構造解析（図２２）は、二次構造モデルと一致する（図２３）。ヘアピンループおよび内部ループ中のホスホジエステル結合は、一本鎖特異的ヌクレアーゼにより切断することが可能であった。該ヌクレオチドは、内部ＡＵＡループ内およびＧＡＮバルジ中で高度に保存されているが、ｓｅｑ１およびｓｅｑ２と連結するヘアピン構造中のヌクレオチドに関しては保存位置を見出すことができなかった。したがって、ヘアピン領域は、アルギニンの結合に直接関与するとは思われない。逆の結合特異性Ｄ−Ｒ１６ｃのＬ−エナンチオマー（Ｌ−Ｒ１６ｃと称する）を、化学固相合成により得た（実施例１を参照のこと）。円二色性分光光度法でＤ−Ｒ１６ｃおよびＬ−Ｒ１６ｃをキャラクタライズした場合、予想されたように鏡面対称スペクトルを得た（図２５、実施例２を参照のこと）。Ｄ−またはＬ−アルギニンに対するオリゴヌクレオチドーリガンドのアフィニティーを、実施例２に記載のように、微量透析チャンバーでの平衡透析により決定した。漸増量のＬ−[４，５ −³Ｈ]アルギニン（ＩＣＮ）またはＤ−[２，３−³Ｈ]アルギニン(DuPont，NEN ，依頼合成)を、結合緩衝液（５０ｍＭＮａＣｌ、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．５、５ｍＭＭｇＣｌ₂）中、１０μＭのＤ−またはＬ−ＲＮＡと平衡化した。Ｄ−Ｒ１６ｃは、Ｄ−アルギニンとの相互作用に対して１３５±２５μＭの係数（Ｋ_d）を示した（図２４）。Ｌ−Ｒ１６ｃは、１２９±１８μＭの見分けのつきにくいＫ_dでＬ−アルギニンに結合することができた（図２６）。Ｄ−Ｒ１６ｃのＤ−アルギニンへの結合は、Ｌ−アルギニンのそれよりも１．７倍高いＤ−アルギニン選択性で立体選択的に起こった（図２４）。Ｌ−Ｒ１６ｃは、Ｌ−アルギニンに対して１．８倍高い立体選択性を示した（図２６）。これらの結果は、オリゴヌクレオチドエナンチオマーの逆に同一の結合特性を強調する。Ｌ−Ｒ１６ｃとの相互作用の分子成分結合に関与する特異的成分をキャラクタライズするために、競合結合実験を行なった（実施例２を参照のこと）。漸増量の競合剤を、１０μＭＬ−[４，５ −³Ｈ]アルギニンに加え、１０μＭＬ−Ｒ１６ｃに対して平衡化させた。結合したＬ−アルギニンの占有率は、競合剤ありで結合したアルギニンと競合剤なしで結合したアルギニンとの比から決定した。データは、リン(Lin)とリッジ(Rigg s)(前述）に従って標準結合方程式に適用させ、それにより、１３０μＭのＫ_dをＬ−Ｒ１６ｃのＬ−アルギニンへの結合に用いた。６０±１０μＭの競合解離定数（Ｋ_dｃ）は、競合剤としてのＬ−アルギニンによりＬ−Ｒ１６ｃに対して決定された。Ｌ−Ｒ１６ｃのＬ−リジンに対する結合アフィニティー（Ｋ_dｃ＝２７０±５０μＭ）は、Ｄ−リジンに対する（Ｋ_dｃ＞１０ｍＭ）よりも約４０倍高かった。結果は、α−カルボキシル基が結合に役割を果たすことを示唆した。。α−カルボキシル基を欠くアルギニンアナログであるアグマチンは、２７０± ７０μＭの競合解離定数を示した。この結果は、Ｌ−ＲＮＡもまたグアニジニウム側鎖と相互作用することを示唆する。側鎖とα−カルボキシル基との同時結合は、結合領域のＬ−選択性に導く。側鎖への相対的に強い結合は、Ｌ−アルギニンに対するＬ−Ｒ１６の低い立体選択性を説明する。ＨＩＶ−Ｔａｔ−ペプチドへのＬ−Ｒ１６ｃの結合ペプチドとの相互作用を試験するために、Ｌ−Ｒ１６ｃのアルギニン特異的結合特性を用いた。競合結合実験は、ＨＩＶ−Ｔａｔ−蛋白質由来の配列ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰを有するペプチドで行なった。前記記載の競合分析とは離れて、８０００の分子量限界を有する透析膜を使用した。Ｌ−Ｒ１６ｃのＴａｔ−ペプチドに対するアフィニティー（Ｋ_dｃ＝２６±５μＭ）は、Ｌ−アルギニンに対するアフィニティーよりも２倍高かった（図２７）。アルギニン特異的リガンドの血清安定性Ｄ−Ｒ１６ｃおよびＬ−Ｒ１６ｃの安定性は、実施例２に記載のようにヒト血清中で調べた。Ｄ−Ｒ１６ｃは１分未満後にもはや証明できなかったのに対し、Ｌ−Ｒ１６ｃの分解は、３７℃で６０時間のインキュベーション後でさえも示され得なかった。実施例４反復イン・ビトロ単離およびシーケンス方法実施例２で記載した１０回目の選択サイクルのＲＮＡ分子を、再び逆転写酵素により相補的ｃＤＮＡに転写した。続いて、反対鎖の合成および最後にＰＣＲ増幅を行なった（図２８）。実施例２から離れて、ＲＮＡ−もしくはＤＮＡマトリックスをそれぞれ２０ヌクレオチド越えるプライマーとして、オリゴヌクレオチドを用いた（プライマーＣおよびＤ、図２８）。ＰＣＲ産物のこの伸長は、ジデオキシシーケンスによりランダム領域を完全に決定するために行なった。ＰＣＲ産物を変性ポリアクリルアミドゲル（７Ｍ尿素）により精製した。ＤＮＡ分子をゲルから水で溶出し、ゲル濾過により脱塩した。ＤＮＡ産物の単離量は、２６０ｎｍでの吸収により決定した。反復単離後、ＤＮＡ分子を、理論上約１００分子数に達するような方法で数段階で希釈した。この希釈度から、ＤＮＡ分子数のさらなる減少を分割により達成することができた。アリコートに存在する複数の残存ＤＮＡ分子を、ＰＣＲにより増殖させた（プライマーＥおよびＦ、図２８）。ＤＮＡ分子がポリアクリルアミドゲル上で証明されうる（５ｐｍｏｌ）ような方法でＤＮＡ分子を増幅するためには、各サイクルに対し複数のＰＣＲ反応を要した。各ＰＣＲ反応後、得られた材料をグリコーゲンの存在下でエタノール沈澱により精製した。一本鎖を単離するために、５’末端がリン酸化されているプライマーを各新しいＰＣＲ反応に用いた（プライマーＥおよびＦ、図２８）。５’−リン酸基は、プライマーの固相合成中に導入した。実際のシーケンス反応を行なう前に、ラムダエキソヌクレアーゼ（ヒグチ(Higuchi)とオッチマン(Ochman)、Nucleic Acids Res．17(1989)，5865）によるリン酸化された鎖の選択的分解により、二本鎖ＰＣＲ産物から一本鎖ＤＮＡを生成させた。次いで、慣用のジデオキシヌクレオチド技術(サンガー(Sanger)ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 74(1977)，5463-546 7)に従って、シーケンスを行なった。シーケンスゲルの評価が、より多くの改変体が存在するということを明らかにしたならば、希釈プロセスを個々の配列を決定することが可能となるまで繰り返した。この方法により、既に知られた改変体（図１２）とは別に、３つの新規な改変体を同定することが可能であった（図２９）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 9/12 Ａ６１Ｐ 9/12 31/12 31/12 35/00 35/00 Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｑ 1/68 ＡＣ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者フュルステ，イェンス，ペータードイツ連邦共和国ベルリンデー― 14057 ヴィッツレベンプラッツ５ (72)発明者バルト，ロルフドイツ連邦共和国ベルリンデー― 10829 グスタフ―ミュラー―シュトラーセ 46 (72)発明者エルトマン，フォルカー，アー. ドイツ連邦共和国ベルリンデー― 14163 アルゲンティニッシェアレー２

Claims

【特許請求の範囲】１．天然の立体配置を有する標的分子と相互作用するＬ−核酸の製造方法であって、下記工程：（ａ）Ｄ−核酸の不均質集団を生成する工程；（ｂ）工程（ａ）の集団を標的分子の光学対掌体と接触させる工程；（ｃ）標的分子の光学対掌体と相互作用しないＤ−核酸を分離する工程；（ｄ）標的分子の光学対掌体と相互作用するＤ−核酸の配列を決定する工程；および（ｅ）工程（ｄ）で決定されたＤ−核酸の配列と同一の配列であるＬ−核酸を合成する工程、を含む方法。２．標的分子の光学対掌体が該標的分子のラセミ混合物として存在する請求項１記載の方法。３．下記工程：（ｃａ）標的分子の光学対掌体と相互作用するＤ−核酸を増幅する工程、を工程（ｃ）の後に追加する請求項１または２記載の方法。４．工程（ａ）の集団のＤ−核酸がその５’および３’末端で、ＰＣＲによる工程（ｃａ）で得られたＤ−核酸の増幅を可能にするプライマー結合部位またはプライマー結合部位に相補的な配列を提示する請求項３記載の方法。５．工程（ａ）の集団のＤ−核酸がその５’および３’末端で、工程（ｃａ）で得られたｃＤＮＡのイン・ビトロ転写を可能にするＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの結合部位または該結合部位に相補的な配列を提示する請求項３または４記載の方法。６．標的分子と相互作用する工程（ａ）に存在するＤ−核酸中の核酸位置には存在せず、新規に合成される対象のヌクレオチド鎖にヌクレオチドが増幅中に取り込まれる請求項３〜５いずれか記載の方法。７．下記工程：（ｃｂ）増幅したＤ−核酸を標的分子の光学対掌体と接触させる工程、を工程（ｃａ）後に追加し、次いで、工程（ｄ）を行なう前に工程（ｂ）および任意に工程（ｃａ）を行ない、ここで工程（ｃｂ）、（ｂ）および任意に（ｃａ）をこの順序で１回または数回繰り返してもよい、請求項３〜６いずれか記載の方法。８．下記工程：（ａ）Ｌ−核酸の不均質集団を生成する工程；（ｂ）工程（ａ）の集団を標的分子と接触させる工程；（ｃ）標的分子と相互作用しないＬ−核酸を分離する工程；（ｄ）標的分子と相互作用するＬ−核酸を配列決定する工程；（ｅ）配列が工程（ｄ）で決定された配列と同一であるＬ−核酸を合成する工程を含むＬ−核酸の製造方法。９．下記工程：（ｃａ）標的分子と相互作用するＬ−核酸を増幅する工程を工程（ｃ）の後にさらに導入する請求項８記載の方法。１０．工程（ａ）の集団のＬ−核酸が５’および３’末端で、鏡面対称ＰＣＲにより工程（ｃａ）で得られたＬ−核酸の増幅を可能にするプライマー結合部位またはプライマー結合部位に相補的な配列を提示する請求項９記載の方法。１１．標的分子と相互作用する工程（ａ）に存在するＬ−核酸の核酸位置には存在せず、新規に合成される対象のヌクレオチド鎖にヌクレオチドが増幅中に取り込まれる請求項９または１０記載の方法。１２．下記工程：（ｃｂ）増幅したＬ−核酸を標的分子と接触させる工程を工程（ｃａ）後に追加し、次いで、工程（ｄ）を行なう前に工程（ｂ）および任意に工程（ｃａ）を行ない、ここで、工程（ｃｂ）、（ｂ）および任意に（ｃａ）をこの順序で１回または数回繰り返してもよい請求項９〜１１いずれか記載の方法。１３．相互作用が結合である請求項１〜１２いずれか記載の方法。１４．相互作用が触媒反応である請求項１〜１３いずれか記載の方法。１５．核酸がデオキシリボ核酸および好ましくはデオキシリボザイムである請求項１〜１４いずれか記載の方法。１６．核酸がリボ核酸である請求項１〜１４いずれか記載の方法。１７．リボ核酸がリボザイムである請求項１６記載の方法。１８．標的分子がアミノ酸、ペプチド、ポリペプチドまたは複数のポリペプチドからなる蛋白質である請求項１〜１７いずれか記載の方法。１９．標的分子が一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡもしくは二本鎖ＤＮＡまたはそれらの組合せである請求項１〜１８いずれか記載の方法。２０．標的分子が抗生物質または別の医薬上有効な基質またはその前駆体である請求項１〜１８いずれか記載の方法。２１．標的分子が非分枝状または分枝状の多糖等の糖分子である請求項１〜１８いずれか記載の方法。２２．工程（ｅ）のＬ−核酸の合成を化学的または酵素的に行なう請求項１〜２１いずれか記載の方法。２３．化学合成が下記工程：（ｅａ）Ｌ−ヌクレオシドを合成する工程；（ｅｂ）保護されたＬ−ヌクレオシドホスホロアミダイトを合成する工程：および（ｅｃ）合成機でＬ−核酸を固相合成する工程、を含む請求項２２記載の方法。２４．請求項１〜２０いずれかに規定された標的分子と特異的に相互作用するＬ−核酸。２５．リボ核酸である請求項２４記載のＬ−核酸。２６．リボザイムである請求項２５記載のＬ−核酸。２７．Ｌ−デオキシリボ核酸である請求項２４記載のＬ−リボ核酸。２８．デオキシリボザイムである請求項２７記載のＬ−リボ核酸。２９．同一の核酸配列を有するＬ−核酸の製造用のマトリックスとして、工程（ｃ）および／または工程（ｃａ）において請求項１〜２３いずれか記載の方法で得られたＤ−核酸の使用。３０．請求項１〜２３いずれか記載の方法により得られうるＬ−核酸または請求項２４〜２８いずれか記載のＬ−核酸、任意に医薬上許容されうる担体との組合せを含んでなる医薬組成物。３１．請求項１〜２３いずれか記載の方法により得られうるＬ−核酸または請求項２４〜２８いずれか記載のＬ−核酸を含有してなるキットまたは診断薬。３２．バイオセンサー、除草剤、食料品の添加剤、分析方法用もしくは化粧品使用目的としての請求項１〜２３いずれか記載の方法により得られうるＬ−核酸または請求項２４〜２８いずれか記載のＬ−核酸の使用。