PT1551868E

PT1551868E - Factor envolvido nas metástases e as respectivas utilizações

Info

Publication number: PT1551868E
Application number: PT03769423T
Authority: PT
Inventors: Anke Klippel-Giese; Joerg Joerg Kkaufmann; Rolf Schwarzer
Original assignee: Silence Therapeutics Ag
Priority date: 2002-10-18
Filing date: 2003-10-20
Publication date: 2009-04-06
Also published as: DE60325754D1; MXPA05004134A; AU2003278112A1; EP1551868B1; ZA200502483B; US20100285038A1; ATE420102T1; CN1705746A; CN100564524C; JP4820092B2; WO2004035615A3; SI1551868T1; CA2501333A1; ES2319891T3; KR20050056244A; KR101154130B1; BR0315411A; AU2010246370A1; CY1110313T1; EP1551868A2

Description

DESCRIÇÃO

FACTOR ENVOLVIDO NAS METÁSTASES E AS RESPECTIVAS

UTILIZAÇÕES A presente invenção tem por objecto a utilização de um factor de polipéptido e um ácido nucleico que o codifica, como um alvo a jusante, como um marcador para um processo regulado por PI 3-cinase e na geração e fabrico de um medicamento e de um agente terapêutico. 0 moderno desenvolvimento de fármacos já não se baseia em abordagens mais ou menos heuristicas, mas envolve normalmente a explicação do mecanismo molecular subjacente a uma doença ou a um estado clinico, a identificação de candidatos a moléculas alvo e a avaliação das referidas moléculas alvo. É óbvio que a identificação de uma molécula alvo candidata é essencial para este processo. Com a sequenciação do genoma humano e a publicação dos respectivos dados da sequência, em principio, estão disponiveis todos os ácidos nucleicos de codificação do homem. Contudo, uma limitação séria destes dados resulta de normalmente não ser dada nenhuma anotação da função da respectiva sequência. Até porque o mero conhecimento de uma sequência de codificação de ácidos nucleicos não é suficiente para prever a função dos polipéptidos in vivo. De acordo com isto, a partir do estudo das entradas do banco de dados sem qualquer anotação de propriedade validada, um especialista na matéria não pode retirar qualquer ensinamento técnico sobre a forma de utilizar estes dados dos ácidos nucleicos. Os processos in sillico permitem uma primeira anotação possível que, contudo, tende a ter erros e não reflecte necessariamente a função real de um polipéptido codificado pelas respectivas sequências de ácidos nucleicos. Colocar o referido 1 polipéptido num contexto apropriado in vivo e in situ e esclarecendo a sua função aí, é ainda uma tarefa exigente que dá origem a descobertas surpreendentes.

Uma vez disponível uma molécula alvo validada, que vai também ser aqui referida como alvo ou a molécula alvo, os candidatos a fármacos dirigidos a ela podem ser rastreados ou desenvolvidos e em seguida podem ser ensaiados. Em muitos casos, esses candidates a fármacos são elementos de uma biblioteca de compostos que pode consistir em compostos sintéticos ou naturais. Também é usual a utilização de bibliotecas combinatórias. Essas bibliotecas de compostos serão aqui referidas também como bibliotecas de compostos candidatos. Embora no passado esta abordagem tenha provado ter sucesso, ainda é muito consumidora de tempo e de dinheiro.

Por isso, numerosos tumores e cancros são uma enorme ameaça para a saúde humana. Para criar fármacos mais seguros e mais potentes e com menos efeitos colaterais, é necessário ter conhecimento sobre as moléculas alvo que, depois de terem sido atingidas pelos compostos apropriados, podem ser especificamente e selectivamente influenciadas no que respeita à sua actividade ou presença. Por causa da interacção preferencialmente selectiva e específica entre o composto, que pode ser um fármaco potencial ou candidato e o alvo, a função do alvo numa doença ou num estado clínico tal como, por exemplo, cancro, formação de tumores e metástases, pode ser influenciada e assim a doença pode ser tratada ou prevenida e o estado clínico pode ser melhorado, respectiva-mente. Independentemente da abordagem terapêutica com base nas moléculas alvo recentemente identificadas e validadas, a abordagem do diagnóstico também é importante. Essa abordagem do diagnóstico é apropriada para monitorizar o estado clínico 2 ou a doença a ser tratada, quer antes do tratamento ou durante ou após o tratamento, para permitir que os decisores, tal como os médicos, decidam se devem prosseguir com o tratamento ou se devem adaptá-lo às necessidades individuais do paciente. 0 problema subjacente à presente invenção é por isso providenciar um alvo que seja especifico para cancros e tumores, respectivamente. Um outro problema subjacente à presente invenção é providenciar um alvo que esteja mais particularmente envolvido na formação do tumor e de metástases. Finalmente, constitui um problema subjacente à presente invenção providenciar um marcador de diagnóstico relacionado com a formação do tumor e com as metástases.

Estes e outros problemas são resolvidos pela matéria das reivindicações em anexo. Podem retirar-se enquadramentos preferidos a partir das reivindicações conexas. 0 pedido de patente internacional WO 02/46465 descreve um polipéptido com a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ.ID.No.2.

Shoshani et al., Molecular and Cellular Biology, vol. 22, n°. 7, páginas 2283-2293 descrevem a identificação de um gene responsável pelo factor 1 que induz hipóxia.

Em qualquer um dos aspectos da presente invenção relacionados com um ácido nucleico, o ácido nucleico pode estar presente sob a forma de ADN ou de ARN. Também está subentendido na presente invenção, que o ácido nucleico pode estar presente como um ácido nucleico de cadeia helicoidal simples, de cadeia helicoidal parcialmente dupla ou de cadeia helicoidal dupla. Num enquadramento preferido, o ácido 3 nucleico, de acordo com a presente invenção, está presente como um ARN de cadeia helicoidal simples. Esse ARN de cadeia helicoidal simples é utilizado, preferencialmente, como um ARNm (mensageiro) num sistema de expressão, enquanto o sistema de expressão é, preferencialmente, um sistema de expressão tal como descrito aqui. Num enquadramento dos ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção, o ácido nucleico tem uma cadeia helicoidal simples e poderá hibridar, excepto para a degenerescência do código genético, com um ácido nucleico que é praticamente complementar do ácido nucleico que codifica para o factor de acordo com a presente invenção. Noutro enquadramento, o ácido nucleico de cadeia helicoidal simples, de acordo com a presente invenção, híbrida em condições severas com um ácido nucleico que é praticamente complementar do ácido nucleico de acordo com o segundo aspecto da presente invenção.

Os requerentes verificaram, surpreendentemente, que o factor de polipéptido que é referido aqui como um factor 1 regulado pela via metabólica de PI3-cinase ou de PRF1 envolvido num certo número de processos biológicos, nomeadamente, na cura de feridas, nas metástases, na formação de tumores, na migração de células, na motilidade das células na matriz extracelular e no crescimento das células na matriz extracelular. Estes processos estão sob o controlo da via metabólica de PI3-cinase. A sequência genómica de PRF1 está localizada no cromossoma 10, mais particularmente, o local é 10 pter-q 26.12. O gene compreende um total de 1.760 nucleótidos, tal como é normalmente definido. A respectiva entrada no banco de dados que representa o ADNc é referida como NM_019058, mais preferencialmente, NM_019058.1 e gi 9506686. O ADNc que codifica para PRFl é referido aqui como a SEQ ID N°. 2 e a 4 sua sequência de codificação como SEQ ID N°. 3. Está também dentro do âmbito da presente invenção que o ácido nucleico que codifica para PRF1 pode ter algumas variantes, tais como, na posição 312, em que C está substituído por G, na posição 991, em que A está substituído por T, na posição 1.247, em que C está substituído por T, na posição complementar 1.297, em que C está substituído por T, na posição 1.958, em que C está substituído por T, na posição complementar 1.666, em que A está substituído por G e na posição 1.743, em que A está substituído por C. Todas as posições mencionadas antes referem-se ao ADNc, que é também referido aqui como a SEQ ID N°. 2. 0 quadro de leitura aberta começa na posição 198 e termina na posição 896. A sequência de aminoácidos de PRF1 é também aqui referida como a SEQ ID N°. 1. A referida entrada no banco de dados que representa a sequência de aminoácidos é NP_061931, mais particularmente, NP_061931.1, e gi 9506687. O polipéptido de acordo com a presente invenção pode ainda também compreender variantes, tais como, por exemplo, na posição 39 do aminoácido, em que R está substituído por G. O polipéptido de acordo com a presente invenção foi recentemente referido na literatura como REDD1 e como tal está descrito por Ellisen, L. W., Molecular Cell, Vol. 10, 995-1005, Novembro, 2002.

Deve entender-se que talvez alguns erros de sequenciação contidos em uma qualquer das referidas referências, contudo, é compreensível por um especialista na matéria que a sequência básica é a especificada antes, que pode ser ainda maturada e a partir dos números de acesso anteriores, pode-se retirar a respectiva sequência emendada, que deve também 5 assim estar contida no âmbito da presente invenção. Também estão contidos no âmbito da presente invenção os enquadramentos em que uma ou mais das variantes anteriores estão contidas ou foram realizadas.

Está dentro do âmbito da presente invenção que as versões derivadas ou truncadas de PRF1 ou dos ácidos nucleicos que codificam para ele podem ser utilizadas de acordo com a presente invenção desde que se possam produzir os efeitos desejados. Os efeitos desejados podem, entre outros, ser um dos compostos particulares, tais como, ácidos nucleicos funcionais, anticorpos, polipéptidos e moléculas pequenas podem ainda ser rastreados ou projectados. Assim, o termo PRF1 também compreende este tipo de versões derivadas ou truncadas. Um derivado preferido de PRF1 é, entre outros, uma sua versão fosforilada ou uma sua versão glicosilada. A extensão da derivação e da truncagem pode assim ser determinada pelos especialistas na matéria por meio de análises de rotina. No que se refere às sequências de ácidos nucleicos, essas sequências de ácidos nucleicos estão também compreendidas pelo termo sequências de ácidos nucleicos que codificam PRF1, que hibridam com o ácido nucleico especificado pelos números de acesso mencionados antes ou qualquer sequência de ácidos nucleicos que possa ser derivada das sequências de aminoácidos mencionadas antes. Essa hibridação e as suas particularidades experimentais são conhecidas dos especialistas na matéria. As particularidades dessa hibridação podem ser, por exemplo, retiradas de Ausubel et al., (1996) Current Protocols in Molecular Biology. J. Wiley and Sons, New York. A hibridação severa, tal como se utiliza aqui, significa, por exemplo, 0,1 x SSC; SDS a 0,1 %, 65 °C, 15 min. Além disso, o termo ácido nucleico que codifica para PRF1 compreende também uma sequência de ácidos nucleicos que é homóloga de qualquer uma das sequências de 6 ácidos nucleicos mencionadas antes, em que o grau de homologia é, preferencialmente, de 75, 80, 85, 90 ou 95 %, incluindo qualquer percentagem entre 70 % e 99 %. O gene de codificação para PRF1 está descrito na literatura sem estar anotada qualquer função que lhe esteja adstrita. Verifica-se que o gene é indutivel de hipóxia e responde ao factor 1 que induz hipóxia (Shoshani T., et al., Molecular and cellular biology, April 2002, p. 2283-2293).

No referido documento, refere-se que PRF1 é regulado pela hipóxia. Contudo, não está descrito que PRF1 é um factor de sobrevivência que está relacionado e envolvido na resposta à hipóxia. Os requerentes verificaram, surpreendentemente, que PRF1 é regulado de uma forma dependente de PI3-cinase e/ou HIFla. A redução da expressão de PRF1 é apropriado para inibir o crescimento das células num ensaio em matrigel, tal como está descrito nos exemplos que se dão aqui. Relacionado com isto, vale a pena notar que a redução da expressão de PRF1 pode também ser mostrada ao nivel da proteína e a perda de função mostra que o fenótipo inibidor é semelhante ao efeito de LY294002 confirmando a verificação dos requerentes de que PRFl é um alvo específico, mais particularmente, um alvo do cancro, que está a jusante de HIFla e Akt. Este é o dado mais relevante, já que há numerosos dados disponíveis que confirmam que HIF é altamente relevante na terapia dos tumores. Também a redução da expressão de PRFl resulta numa inibição de um tumor, tal como está ilustrado, utilizando células PC-3 como um modelo de tumor. A partir destas várias aplicações de PRFl e, mais particularmente, dos compostos que inibem PRFl, podem ser derivados. De acordo com isto, o PRFl como tal, pode ser sobre-expresso num sistema celular de modo a permitir que as células sobrevivam em condições hipóxicas. Essas condições são, por exemplo, verificadas num acidente 7 vascular, insuficiência cardíaca, de modo que essa sobre-expressão ou activação de PRF1 pode ser um meio apropriado para o tratamento ou a prevenção deste tipo de doenças. Será entendido pelos especialistas na matéria que qualquer composto ou mecanismo envolvido na expressão acrescida ou na actividade de PRF1, pode ser assim um meio apropriado para o tratamento e/ou a prevenção deste tipo de doença.

Além disso, está também dentro do âmbito da presente invenção que qualquer diminuição na expressão ou, tal como utilizado aqui numa forma de sinónimo, na actividade de PRF1, é apropriada para pôr um sistema celular respectivo numa condição que corresponda às condições hipóxicas. Nestas condições, Outros processos celulares, tais como, por exemplo, apoptose, podem iniciar-se. Inibindo as condições hipóxicas de PRF1 que se podem realizar simultaneamente, conseque-se apropriadamente tratar essas doenças em que se entende que as células não devem ser fornecidas com oxiqénio suficiente. Há doenças conhecidas que podem ser tratadas conferindo as células envolvidas num estado clínico, em que as referidas células experimentam ou estão expostas ou poderão experimentar hipóxia. Uma dessas doenças é os tumores e os cancros, tal como se descreve aqui. Assim, qualquer composto, particularmente os descritos aqui, que sejam apropriados para diminuir a expressão e/ou a actividade de PRF1 tanto ao nível da transcrição como ao nível da tradução, podem ser apropriados para a prevenção e/ou o tratamento deste tipo de doença. Estas doenças são também referidas aqui como doenças relacionadas com hipóxia. Estes compostos ou meios podem ser eficazes no tratamento, entre outros, de tumores, com base na inibição da anqiogénese do tumor.

Os requerentes verificaram, surpreendentemente, que PRF1 é um alvo válido no que diz respeito ao cancro e aos tumores e a outros processos biológicos, tais como, metástases, formação de tumores, migração de células, motilidade de células na matriz extracelular e crescimento das células na matriz extracelular e guaisquer doenças e condições clinicas que se baseiam ou que envolvem qualquer um destes processos. Mais particularmente, os requerentes descobriram que PRF1 é um alvo a jusante da via metabólica de PI3-cinase/PTEN e/ou da via metabólica de HIFla. Ainda mais surpreendentemente, os requerentes descobriram que PRF1 está ligado a vários dos ramos da via PI3-cinase, tal como descrito na figura 1 que se segue. Adicionalmente, os requerentes descobriram, surpreendentemente, que PRF1 é altamente regulado através da via de HIFla, que é paralela à via de Akt, tal como descrito na figura 7. Em relação com PRF1, o ramo relacionado com as metástases e a migração, é o mais relevante. A importância de PRF1 nestes processos está ilustrada no caso da perda de função de supressor, mais particularmente, a função de supressor dos tumores PTEN. Como será ilustrado nos exemplos, PRF1 será sobre-regulado em condições em que PTEN, que é um inibidor da via de PI3-cinase, não está activo. PRF1 é um marcador válido para o diagnóstico da expressão, a qual está aumentada nas células com menos PTEN, que são caracteristicas para um certo número de tumores de longa duração e certos estados clínicos (Cantley, L. C. and Neel, B. G. (1999). Proc. Natl. Acad. Sei. USA 96, 4240-4245; Ali, I. U. (2000). I. Natl. Câncer Inst. 92, 861-863). Também a perda de PTEN está relacionada com um comportamento crescentemente agressivo e evasivo das respectivas células do tumor. De acordo com isto, PRF1 é um agente válido de diagnóstico relacionado com estes casos. Por outro lado, estes resultados também indicam que PRF1 é um fármaco alvo válido a jusante da via de PI3-cinase/PTEN e/ou da via de HIFla, que pode ser conduzido de acordo com isto, por meio de 9 diferentes abordagens terapêuticas e dos respectivos agentes, tal como também vai ser aqui descrito. Isto significa que um inibidor de PRF1 é um meio apropriado para controlar o comportamento metastásico e de migração das células e é também um meio apropriado para o tratamento de tumores e cancros, mais particularmente, os tumores e cancros que têm metástases e as células que mostram um comportamento metastásico e/ou migracional, que são geralmente referidas aqui como "a doença, tal como descrita aqui" ou como "o estado clinico, tal como descrito aqui". A doença, tal como descrita aqui, assim como, o esta clinico, tal como descrito aqui, também compreende a formação de tumores e metástases, mas não está limitado a elas. Outras doenças e estados clinicos, respectivamente, são geralmente os relacionados com qualquer doença ou condição patológica que envolva a via de PI3-cinase e/ou a via de HIFla e, mais particularmente, os diferentes processos descritos na figura 1 e na figura 12. Uma destas doenças relacionada com a via de PI3-cinase e/ou via de HIFla é, entre outras, a diabetes. Isto aplica-se particularmente às doenças, tal como aqui descritas e aos estados clínicos, tal como aqui descritos, em que as células envolvidas nessas doenças ou nesses estados clinicos são negativas em relação a PTEN, o que significa que o supressor do tumor PTEN não está activo ou tem um nível reduzido de actividade ou aqueles em que está envolvida a via de PI3-cinase e/ou a via de HIFla. Para além dos tumores metastásicos, a diabetes pertence a este tipo de doenças e estados clínicos, respectivamente. Por isso, as células, particularmente, as que estão envolvidas na doença ou no estado clínico, tal como aqui descrito e que são negativas em relação a PTEN, são susceptíveis de serem tratadas com um fármaco cujo modo de acção é tal que reduz ou elimina a actividade de PRF1 nas células que estão respectivamente envolvidas. De acordo com isto, os pacientes cujos tumores 10 são negativos em relação a PTEN ou que têm células que são negativas em relação a PTEN, particularmente se estas células estão envolvidas na doença, tal como aqui descrito ou no estado clinico, tal como aqui descrito, podem ser tratados com vantagem utilizando os referidos fármacos. 0 mesmo se aplica também aos respectivos agentes de diagnóstico ou medicamentos.

Um outro grupo de pacientes que podem ser tratados com vantagem utilizando os referidos fármacos, são aqueles que sofrem de cancros, que têm uma elevada incidência da perda da função de PTEN, especialmente em tumores no último estádio (Cantley, L. C. e Neel, B. G. (1999). New insights into tumor suppression: PTEN suppresses tumor formation by restraining the phosphoinositide 3-kinase/AKT pathway and/or the HIFla pathway. Proc Natl Acad Sei USA 96, 4240-4245; Ali, I. U. (2000) . Gatekeeper for endometrium: the PTEN tumor suppressor gene. J Natl Câncer Inst 92, 861-863) . A perda de PTEN está correlacionada com um comportamento crescentemente agressivo e evasivo das respectivas células do tumor. Por causa disto, em enquadramentos preferidos, esses agentes de diagnóstico e agentes terapêuticos, respectivamente, dirigidos a PRF1, podem ser utilizados para qualquer tumor desde que se verifique o pré-requisito mencionado antes, nomeadamente, que PTEN esteja correlacionado com um comportamento crescentemente agressivo e evasivo. À luz da descrição aqui dada, nomeadamente de que PRF1 é um alvo a jusante da via de PI3-cinase e/ou da via de HIFla, mas também para controlar a proliferação, metástase e migração, um especialista na matéria pode desenvolver tanto agentes terapêuticos como agentes de diagnóstico para as doenças aqui descritas e as condições clinicas aqui descritas, respectivamente. Uma descrição representativa sob 11 a forma como os fármacos podem ser triados uma vez validado um alvo é, por exemplo, a de descrita por Prendergast, Nature Biotechnology, October 2001, Vol. 19, p. 919-921 ou Torrance C. J. et al., Nature Biotechnology, October 2001, Vol. 19, p. 940-945.

Por causa do envolvimento de PRF1 nos mecanismos sublinhados aqui antes, também se pode utilizar PRF1 ou um ácido nucleico que codifica para ele, como um marcador para diagnosticar o estado de uma célula ou de um paciente, que tenha no seu corpo esse tipo de células, se ele sofre de metástases, formação de tumores ou qualquer um dos outros processos aqui descritos e se está a sofrer de falta de oxigénio, glicose e/ou dependência de glicose, que por sua vez é indicativo para as células do tumor, particularmente, para as células de cancro de crescimento rápido. Um exemplo de que este tipo de abordagem funciona e é aplicável para este fim é, por exemplo, o ICAM-1. O ICAM-1 é utilizado no prognóstico de cancros gástricos que exibem metástases (Maruo Y, Gochi A, Kaihara A, Shimamura H, Yamada T, Tanaka N, Orita K. Int J Câncer. 2002 Aug 1; 100 (4): 486- 490), em que os níveis de s-ICAM-1 mostraram ser elevados em pacientes com metástases no fígado. Noutro exemplo, utilizou-se osteopontina como um marcador de prognóstico para o cancro da mama (Rudland PS, Platt-Higgins A, El-Tanani M, De Silva Rudland S, Barraclough R, Winstanley JH, Howitt R, West CR. Câncer Res. 2002 Jun 15; 62 (12) : 3417-3427) . Na medida em que se pode utilizar a presença ou o nível de presença (proteína ou ARNm) ou o nível de actividade de PRFl, como um marcador e também se pode utilizar qualquer composto que interaja mais ou menos especificamente com PRFl, serão portanto agentes de diagnóstico apropriados e/ou ferramentas ou meios analíticos apropriados. 12

Os processos e os princípios de concepção para fármacos e agentes de diagnóstico que em qualquer caso, especificamente e/ou selectivamente, interagem com PRF1 também serão descritos a seguir. À luz destas verificações, PRF1 provou ser um fármaco alvo a jusante apropriado, que permite a modulação selectiva de apenas alguns aspectos que estão normalmente relacionados com a via de PI3-cinase, tal como, metástases e migração, assim como, resposta à hipóxia, crescimento de células e cura de feridas e uma abordagem de diagnóstico selectiva e específica, isto é, detecção de processos normalmente relacionados com a via de PI3-cinase, mais particularmente, metástases e migração.

A via metabólica de PI3-cinase é caracterizada por uma actividade de Pl3-cinase após a indução do factor de crescimento e uma via de sinalização paralela. A estimulação do factor de crescimento das células leva à activação dos seus receptores cognatos na membrana das células que, por sua vez, está associada com moléculas de sinalização intracelular activas, tais como, PI3-cinase. A activação de PI3-cinase (consistindo num p85 regulador e numa subunidade de pllO catalítica) resulta na activação de Akt por fosforilação e/ou a activação de HIFla, suportando assim as respostas celulares, tais como, proliferação, sobrevivência ou a migração mais para jusante. PTEN é assim um supressor do tumor que está envolvido na via da fosfatidilinositol (PI)3-cinase e que já foi amplamente estudada no passado, no que respeita ao seu papel na regulação e na transformação do crescimento das células (para revisões ver, Stein, R. C. and Waterfield, M. D. (2000) . PI3-kinase inhibition: a target for drug development? Mol Med Today 6, 347-357; Vazquez, F. and Sellers, W. R. (2000) and/or the HIFla pathway. The PTEN 13 tumor suppressor protein: an antagonist of phosphoinositide 3-kinase signaling. Biochim Biophys Acta 1470, M21-35; Roymans, D. and Slegers, H. (2001). Phosphatidylinositol 3-kinases in tumor progression. Eur J Biochem 268, 487-498) . As funções de PTEN como supressor do tumor, como um regulador negativo da via de PI3-cinase e/ou de HIFla, por uma reacção inversa catalisada por PI3-cinase e assegura-se assim que a activação dessa via ocorre de uma forma transiente e controlada. A hiperactivação crónica de PI3-cinase e/ou da sinalização da via de HIFla é causada pela inactivação funcional de PTEN. A actividade de PI3-cinase e/ou HIFla pode ser bloqueada pela adição de um inibidor de moléculas pequenas, LY294002. A actividade e as respostas a jusante da sinalização de cinase MEK, que actua numa via paralela pode, por exemplo, ser inibida pelo inibidor de moléculas pequenas PD98059.

Uma activação, particularmente uma activação crónica de uma via PI3-cinase e/ou a actividade de HIFla por meio da perda da função de PTEN, é uma contribuição significativa para a formação de tumores e de metástases, indicando que este supressor do tumor representa um importante checkpoint para uma proliferação controlada de células.

As células que bloqueiam a expressão de PTEN exibem caracteristicas semelhantes às células em que foi induzida a via de PI3-cinase e/ou a via de HIFla, particularmente induzidas cronicamente, por via de formas activadas de PI3-cinase (Di Cristofano, A., Pesce, B., Cordon-Cardo, C. e Pandolfi, P. P. (1998). PTEN is essential for embryonic development and tumour suppression. Nat Genet 19,348-355. Klippel, A., Escobedo, Μ. A., Wachowicz, M. S., Apell, G., Brown, T. W., Giedlin, Μ. A., Kavanaugh, W. M. e Williams, L. T. (1998). A activação de fosfatidilinositol-3-cinase é 14 suficiente para a entrada do ciclo das células e promove alterações celulares caracteristicas da transformação oncogénica. Mol Cell Biol 18, 5699-5711. Kobayashi, M.,

Nagata, S., Iwasaki, T., Yanagihara, K., Saitoh, I., Karouji, Y., Ihara, S. e Fukui, Y. (1999). Dedifferentiation of adenocarcinomas by activation of phosphatidylinositol 3-kinase. Proc Natl Acad Sei USA 96, 4874-4879).

As várias doenças, tal como aqui descritas, podem também ser caracterizadas por uma hiperactivação da via de PI3-cinase e/ou activação da mesma, preferencialmente, hiperactivação da via de HIFla. Esta activação ou hiperactivação é semelhante à situação de uma célula que perde a actividade de PTEN. A hiperactivação de uma via de PI3-cinase e/ou a activação da via de HIFIoí, tal como se utiliza aqui, significa particularmente uma actividade acrescida das vias de Pl3-cinase e/ou das vias de HIFla comparadas com a actividade das referidas vias normalmente observadas, isto é, a actividade da via de PI3-cinase do tipo particular de célula, em que a célula não faz parte ou não está envolvida na doença ou no estado clinico. PTEN está envolvido em várias vias metabólicas que são também referidas como vias relacionadas com PTEN, tais como, a via PI3K/PTEN, a via Akt, a ança de autocrina relacionada com EGF, a via de mTOR e, tal como documentado pelos requerentes, também a via de HIFla. A via de PI3-cinase é actualmente qualquer via que envolva PI3-cinase, quer directa, quer indirectamente. PI3-cinase pode actuar quer como um inibidor, quer como um activador nessa via ou pode ser regulada por outros elementos desta via metabólica. Há uma ampla descrição da técnica anterior destas doenças e estados clínicos que envolvem a via metabólica de 15 PI3-cinase e/ou a via metabólica de HIFla. Qualquer um destes estados clínicos e doença, pode assim ser tratado pelos processos da presente invenção e pelos fármacos e agentes de diagnóstico, que se conceberam, avaliaram e produziram. Por razões de ilustração mas não a título limitativo, refere-se as seguintes: carcinomas colorectais, gliomas, cancro do endométrio, adenocarcinomas, hiperplasia do endométrio, síndroma de Cowden, cancro da mama-ovário, cancro da próstata (Ali, I. U., Journal of the National Câncer Institute, Vol. 92, no. 11, 7 de Junho, 2000, página 861-863), síndroma de Bannayan-Zonana, LDD (síndroma de Lhermitte-Duklos) (Macleod, K., supra), doenças de hamartoma-macrocefalia incluindo a doença de Cowden (DC) e o síndroma de Bannayan-Ruvalcaba-Rily (BRR), triquilemomas, hamartomas gastrointestinais, lipomas, adenomas da tiróide, doença fibroquística da mama, gangliocitoma displásico cerebral e malignidade da mama e da tiróide (Vazquez, F., Sellers, W. R., supra).

Tendo isto em vista, PRF1 é um fármaco alvo válido a jusante da via metabólica de PI3-cinase e/ou da via de HIFla que pode ser utilizado pelos fármacos que têm menos efeitos colaterais que outros fármacos dirigidos a alvos a jusante de PRF1. Assim, a presente invenção providencia um fármaco alvo que é apropriado para a concepção, análise, desenvolvimento e produção de compostos activos sob o ponto de vista farmacêutico, que são mais selectivos dos que os existem na técnica, tais como, por exemplo, LY 294002. Tendo controlo sob esta fracção particular de moléculas efectoras, isto é, PRFl e qualquer outra molécula a jusante envolvida nesta via, apenas um número muito limitado dos seus ramos paralelos ou de outros alvos a jusante na cascata de sinalização, vão causar, provavelmente, efeitos indesejados. Por isso, as outras actividades da via metabólica de PI3-cinase/PTEN e/ou da via de HIFla relacionadas com um ciclo de células, 16 reparação de ADN, apoptose, transporte de glicose, tradução, não serão influenciadas.

Para além de ser uma molécula alvo válida no que respeita às doenças especificadas antes e às redes de regulação, PRF1, tal como se descreve aqui, tanto ao nivel dos ácidos nucleicos como ao nivel das proteínas, é também um alvo particularmente valioso no que respeita ao desenvolvimento ou à aplicação de uma terapia combinatória e medicamentos utilizados para essa terapia combinatória. Por outras palavras, PRF1, isto é, o ácido nucleico que o codifica, assim como, a proteína, podem ser utilizados para a avaliação, geração, fabrico ou concepção de um composto que possa ser utilizado para sensibilizar uma célula, tecido, órgão ou um paciente, de tal modo que essa célula, tecido, órgão ou paciente seja susceptível de tratamento, preferencialmente, um tratamento utilizando um composto ou um medicamento, que é diferente de um composto e de um medicamento, respectivamente dirigindo-se a PRF1 quer ao nivel do ácido nucleico, quer ao nivel da proteína. Está dentro do âmbito da presente invenção que o referido composto é também utilizado para o fabrico de um medicamento para o tratamento de qualquer um dos estados clínicos e doenças, respectivamente, tal como descrito aqui, quer isoladamente ou em conjunto com o composto e medicamento, respectivamente, dirigido a PRF1.

Sem pretender estar ligado a qualquer teoria, verifica-se que PRF1 é regulado quer através do ramo de HIFla, quer através do ramo de Akt da via de PI3-cinase. Como HIFla é sobre-regulado em condições hipóxicas e Akt é sobre-regulado em condições de stress, para avaliar uma resposta de sobrevivência que é uma acção contra a reacção da apóptose de uma célula, descreve-se aqui um composto dirigido a PRF1 e 17 que pode também ser utilizado como um medicamento ou um parceiro de interacção de PRF1 tanto ao nivel do ácido nucleico como ou ao nivel da proteína, que pode transferir a célula num determinado estado clínico, onde outros compostos são particularmente efectivos. Está por isso dentro do âmbito da presente invenção a utilização dos referidos compostos que comportam PRF1 tanto para a avaliação de compostos que podem ser utilizados para o tratamento de qualquer uma das doenças aqui descritas incluindo, mas não se limitando, a doenças de tumores e para o tratamento das referidas doenças. Por isso, a avaliação, pode ser realizada, por exemplo, em condições hipóxicas e/ou aplicando stress a uma célula, tal como, aplicando eitostáticos, por exemplo, cisplatina, radiação, preferencialmente, quando utilizada em conjunto com o tratamento de tumores e hipertermia. Preferencialmente, há assim dois alvos envolvidos na avaliação, geração, fabrico e/ou processos de concepção para um composto de um medicamento, respectivamente, para o tratamento e/ou desenvolvimento de um medicamento para o tratamento de qualquer das doenças aqui descritas, em que um dos referidos alvos é, preferencialmente, diferente de PRF1. A avaliação em função de um factor de transcrição tal como HIFla pode ser realizada com sucesso, conforme se pode retirar de Welsh, S. J. et al., Molecular Câncer Therapeutics Vol. 2, 235-243, Março de 2003.

Também a sinalização de insulina não é induzida, o que significa que as respostas diabéticas ou outros efeitos colaterais observados em relação com a utilização de LY294002 são hoje em dia evitáveis. LY294002 (2-(4-morfolinil)-8-fenilcromona) é um dos vários derivados de cromona, um inibidor de moléculas pequenas desenvolvido pelos Lilly Research Laboratories (Indianapolis) como um inibidor de PI- 18 3Κ (Vlahos et al., 1994, JBC 269, 5241-5248). Atinge a sua subunidade catalítica da molécula de PI-3K, pllO e as suas funções competindo com a ligação de ADP no centro catalítico. Contudo, LY294002 não pode distinguir entre duas isoformas diferentes de pllO (alfa, beta, gama, delta), que se sugere que têm diferentes funções celulares. A PRF1 está também a jusante de mTOR que é dirigida por rapamicina. mTOR (alvo de rapamicina dos mamíferos) também conhecido como Raft ou FRAP, actua a jusante de PI3-cinase para regular processos, tais como, a entrada no ciclo da célula dependente de pp70-S6-cinase. mTOR actua como um sensor para o factor de crescimento e para a disponibilidade de nutriente, para controlar a tradução através da activação pp70-S6-cinase e a iniciação do factor 4E. A função de mTOR é inibida pelo macrólido bacteriano rapamicina, que bloqueia o crescimento das células T e de certas células de tumor (Kuruvilla and Schreiber 1999, Chemistry & Biology 6, R129-R136). 0 facto de a rapamicina e os seus derivados serem fármacos apropriados hoje em dia e que estão a ser utilizados na clínica, prova que um fármaco alvo é o melhor auxiliar e tem menos efeitos colaterais, quanto mais específico for para o mecanismo particular das moléculas como, por exemplo, demonstrado por Yu et al. (Yu, K. et al. (2001) Endrocrine-RelatCanc 8,249). Dado que se utiliza rapamicina para a imunossupressão em fármacos para seres humanos que interferem com PRF1, pode ser ainda mais específico para esta indicação.

Dada a especificidade de PRF1 sublinhada antes em relação à sua utilização como fármaco alvo potencial, pode também ser utilizado como um marcador de diagnóstico e podem conceber-se respectivamente agentes que permitem, 19 preferencialmente, uma detecção selectiva e específica de PRF1, que devem ser utilizados como agentes de diagnóstico. Novamente, quanto mais específico e mais próximo for o marcador em relação a certos fenómenos biológicos ou em termos de vias de sinalização, mais próximo é o efeito finalmente observado e mais fiável é qualquer observação sobre se o processo final vai provavelmente ocorrer o que, no caso presente, se trata de metástases e de formação de tumores. Por isso, os agentes de diagnóstico que se baseiam em PRF1 e que detectam PRF1, respectivamente, são agentes de diagnóstico que permitem uma avaliação mais fiável da probabilidade da formação de tumores e de aparecimento de metástases, respectivamente ou de quaisquer outras doenças aqui descritas e condições clínicas aqui descritas. Estas previsões estão particularmente relacionadas com essas doenças aqui descritas e condições clínicas aqui descritas. Na concepção, avaliação e/ou fabrico de agentes terapêuticos à base de PRF1, tal como descrito aqui, o PRF1 pode ser utilizado como composto contra o qual os compostos químicos que podem ser utilizados como fármacos ou certos candidatos a fármacos ou certos agentes de diagnóstico são dirigidos. Estes compostos químicos pertencem a diferentes classes de compostos, tais como, anticorpos, péptidos, anticalinas, aptâmeros, spiegelmers, ribozimas, oligonucleótidos anti-paralelos e ARNpi, assim como, moléculas pequenas. Os compostos são concebidos, seleccionados, avaliados, gerados e/ou fabricados, quer utilizando o próprio PRF1 como uma entidade física ou química ou informação relacionada com PRF1. Na concepção, selecção, avaliação, geração e/ou no processo de fabrico das referidas classes de compostos, PRF1 será também referido como um alvo, que é utilizado no processo em vez de ser na aplicação final do respectivo composto a um paciente que dele necessite. Nos processos que providenciam as várias classes de compostos, pode-se utilizar 20 quer PRF1, quer um ácido nucleico que codifica PRF1, incluindo qualquer um dos seus enquadramentos, comportando ou compreendendo qualquer uma das variações descritas antes. 0 termo PRF1, tal como se utiliza aqui, compreende qualquer fragmento ou derivado de PRF1, que permita a concepção, selecção, avaliação, geração e/ou fabrico das referidas classes de compostos, das referidas classes de compostos, que por sua vez terão as suas aplicações como medicamentos ou como agentes de diagnóstico activos como tal. 0 termo ácido nucleico que codifica para PRF1, tal como se utiliza aqui, deve compreender qualquer ácido nucleico que contenha um ácido nucleico, desde que ainda seja apropriado para a concepção, selecção, avaliação, geração e/ou fabrico das referidas classes de compostos que, por sua vez, têm as suas aplicações como medicamentos ou como agentes activos de diagnóstico como tal. 0 ácido nucleico que codifica para PRF1 pode ser um ácido nucleico genómico, ARNnh, ARNm, ADNc ou uma parte de cada um deles.

Os compostos quimicos descritos antes estão dentro do âmbito da presente invenção, isto é, incluem, mas não se limita, a anticorpos, péptidos, anticalinas, aptâmeros, spiegelmers, ribozimas, oligonucleótidos anti-paralelos e ARNpi podem ser utilizados com as mesmas finalidades que foram descritas para PRF1 como tal.

Tal como se sublinhou antes, está dentro do âmbito da presente invenção que, independentemente de PRF1 ou de uma parte ou derivado de PRF1 ou uma sua sequência de ácidos nucleicos, tal como descrita aqui, podem utilizar-se todos os outros meios ou compostos de modo a criar ou suprimir os efeitos que aparecem a partir de PRF1 ou do ácido nucleico que codifica PRF1. Esses meios podem ser determinados ou seleccionados num processo de triagem. Nesse processo de 21 triagem, uma primeira etapa consiste em providenciar um ou vários dos chamados compostos candidatos. Os compostos candidatos, tal como se utiliza aqui, são compostos cu j a capacidade de adaptação deve ser ensaiada num sistema de ensaio para o tratamento ou alivio ou várias doenças, tal como aqui descritas e estados clínicos, tal como aqui descritos ou para ser utilizado como um meio ou um agente de diagnóstico para este tipo de doenças e estados clínicos. Se um composto candidato mostra um efeito respectivo num sistema de ensaio, o referido composto candidato é um meio apropriado ou um agente apropriado para o tratamento das referidas doenças e estados clínicos e, em princípio, também como um agente de diagnóstico apropriado para as referidas doenças e estados clínicos. Numa segunda etapa, faz-se o composto candidato contactar com o sistema de expressão de PRF1 ou com um sistema de actividade de PRF1. 0 sistema de actividade de PRFl é também referido aqui como um sistema de detecção da actividade de PRFl.

Um sistema de expressão de PRFl é basicamente um sistema de expressão que mostra ou exibe a expressão de PRFl, embora a extensão ou o nível de expressão basicamente possam ser alterados. Um sistema de actividade de PRFl é essencialmente um sistema de expressão, em que a actividade ou a condição da actividade é medida em vez da expressão de PRFl. Mais particularmente, se é ensaiado se sob a influência de um composto candidato a actividade de PRFl ou do ácido nucleico que codifica PRFl é diferente da situação sem o composto candidato. Independentemente se o sistema particular é um sistema de expressão ou um sistema de actividade, está dentro do âmbito da presente invenção que tanto um aumento como uma diminuição da actividade e da expressão, respectivamente, podem ocorrer e podem ser medidos. Normalmente, o sistema de expressão e/ou o sistema de actividade é um sistema de 22 reacção in vitro, tal como um extracto de célula ou uma fracção do extracto de célula, tal como, um extracto de núcleo. Um sistema de expressão de PRF1 ou um sistema de actividade de PRF1, tal como se utiliza aqui, pode ser uma célula, um tecido ou um órgão, preferencialmente, uma célula ou uma célula de um tecido ou um órgão envolvido nas doenças, tal como foram aqui descritas e nos estados clinicos, tal como foram aqui descritos.

Está também dentro do âmbito da presente invenção o processo para a triagem de um agente de acordo com a presente invenção, que pode ser realizado de tal modo que após a etapa alinea d) , o composto candidato obtido ou identificado na primeira passagem da sequência 1 está nas etapas inerentes ao processo, é submetido à etapa da alinea c) , em que o sistema de expressão ou o sistema de actividade é diferente do sistema de expressão ou do sistema de actividade utilizado durante a primeira passagem com a qual se caracterizou o composto candidato. De acordo com isto, na primeira passagem o sistema de expressão e o sistema de actividade respectivamente, podem ser uma célula envolvida nas doenças, tal como foram aqui descritas, enquanto na segunda passagem a célula pode ser uma célula que não está envolvida nas referidas doenças. Num enquadramento alternativo, a ordem de utilização dos dois tipos de células é inversa.

Se houver um aumento ou uma diminuição do sistema de actividade ou do sistema de expressão, pode determinar-se ao nivel da expressão, por exemplo, medindo o aumento ou a diminuição da quantidade de ácido nucleico que codifica para PRF1, mais particularmente, ARNm ou o aumento ou a diminuição de PRF1 expresso sob a influência do composto candidato. As técnicas necessárias para a medição, mais particularmente, a medição quantitativa deste tipo de alterações, tal como para 23 o ARNm ou a proteína, são conhecidas dos especialistas na matéria. Também conhecidos dos especialistas na matéria são os processos para determinar a quantidade ou o teor de PRF1, por exemplo, pela utilização de anticorpos apropriados. Os anticorpos podem ser gerados, como é sabido, por um especialista na matéria e estão descritos, por exemplo, em Harlow, E., e Lane, D., "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, (1988) .

No caso de um sistema de expressão de PRF1, pode determinar-se um aumento ou uma diminuição da actividade de PRF1, preferencialmente, num ensaio funcional. 0 contacto do composto candidato e do sistema de expressão e do sistema de actividade, respectivamente, realiza-se normalmente pela adição de uma solução aquosa do composto candidato ao sistema de reacção respectivo, que é geralmente referido aqui como o sistema de ensaio. Para além das soluções aquosas, também se podem utilizar suspensões ou soluções do composto candidato em dissolventes orgânicos. A solução aquosa é, preferencialmente, uma solução tampão.

Preferencialmente, em cada passagem utilizando o sistema de expressão e o sistema de actividade, respectivamente, utiliza-se apenas um único composto candidato. Contudo, está também dentro do âmbito da presente invenção o facto de se puderem realizar vários destes tipos de ensaios em paralelo num sistema de elevado rendimento.

Uma outra etapa no processo de acordo com a presente invenção, reside na determinação se, sob a influência do composto candidato, a expressão ou a actividade do sistema de expressão e do sistema de actividade, respectivamente, em 24 relação com PRF1 ou com o ácido nucleico que o codifica, está alterado. Normalmente isto é feito por comparação da reacção do sistema após a adição do composto candidato relativamente a outro sem adição do composto candidato. Preferencialmente, o composto candidato é um elemento de uma biblioteca de compostos. Basicamente, qualquer biblioteca de compostos é apropriada para os fins da presente invenção independentemente da classe de compostos. As bibliotecas destes compostos apropriadas são, entre outras, as bibliotecas compostas por moléculas pequenas de péptidos, proteínas, anticorpos, anticalinas e ácidos nucleicos funcionais. Estes últimos compostos podem ser gerados de uma forma conhecida pelos especialistas na matéria e que se expõe aqui. A produção de um anticorpo específico para PRF1 ou para o ácido nucleico que codifica PRFl, é conhecida dos especialistas na matéria e está descrita, por exemplo, em Harlow, E., e Lane, D., "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, (1988). Preferencialmente, utilizam-se anticorpos monoclonais em ligação com a presente invenção, que podem ser produzidos de acordo com o protocolo de Cesar e Milstein e outros desenvolvimentos que se baseiam nele. Os anticorpos tal como são utilizados aqui incluem, mas não se limitam, a anticorpos completos, fragmentos ou derivados de anticorpos, tais como, fragmentos de Fab, fragmentos de Fc e anticorpos de cadeia helicoidal simples, desde que eles sejam apropriados e capazes de se ligarem à proteína cinase-N-beta. Para além dos anticorpos monoclonais também se podem utilizar anticorpos policlonais e/ou gerados. A geração de anticorpos policlonais é também conhecida dos especialistas na matéria e está descrita, por exemplo, em Harlow, E., e Lane, D., "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor 25

Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, (1988) . Preferencialmente, os anticorpos utilizados para fins terapêuticos são anticorpos humanizados ou humanos, tal como se definiram antes.

Os anticorpos que podem ser utilizados de acordo com a presente invenção podem ter um ou vários marcadores. Esses marcadores podem ser úteis para detectar o anticorpo, quer na sua aplicação de diagnóstico ou na sua aplicação terapêutica. Preferencialmente, os marcadores seleccionam-se no grupo que compreende avidina, estreptavidina, biotina, ouro e fluoresceina. Estes e outros marcadores estão descritos em Harlow et al., (Harlow, E., e Lane, D., "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, (1988)) .

Está também dentro do âmbito da presente invenção o facto de o marcador exibir uma função adicional para além da detecção, tal como, uma interacção com outras moléculas. Essa interacção pode ser, por exemplo, uma interacção especifica com outros compostos. Estes outros compostos podem ser os que são inerentes ao sistema em que se utiliza o anticorpo tal como o corpo humano ou de um animal ou uma amostra que é analisada utilizando o respectivo anticorpo. Os marcadores apropriados podem ser, por exemplo, biotina ou fluoresceina, com os modelos de interacção específicos, tais como, avidina e estreptavidina e similares que estejam presentes no respectivo composto ou estrutura, para interagir com o anticorpo assim marcado.

Uma outra classe de medicamentos assim como de agentes de diagnóstico que podem ser gerados utilizando a proteína de PRF1 ou o ácido nucleico que codifica para PRF1, são péptidos que se ligam a eles. Esses péptidos podem ser gerados 26 utilizando processos de acordo com o estado da técnica, tal como, a exibição de fagos. Basicamente, gera-se uma biblioteca de péptidos, tal como, sob a forma de fagos e este tipo de bibliotecas contacta com a molécula alvo, no presente caso, por exemplo, PRF1. Esses péptidos que se ligam à molécula alvo são em seguida eliminados, preferencialmente, sob a forma de um complexo com a molécula alvo, a partir da respectiva reacção. Um especialista na matéria sabe que as caracteristicas da ligação, pelo menos em certa medida, dependem da experiência particular realizada, tal como a concentração do sal e similares. Depois da separação, esses péptidos de ligação à molécula alvo com uma afinidade maior ou uma força maior, podem ser analisados a partir dos elementos de não ligação da biblioteca e, eventualmente, também depois da eliminação da molécula alvo do complexo da molécula alvo e péptido. Antes da eventual caracterização, realiza-se uma etapa de caracterização, tal como, por exemplo, por propagação dos fagos de codificação do péptido. A caracterização compreende preferencialmente a sequenciação dos péptidos alvo de ligação. Basicamente, os péptidos não estão limitados nos seus comprimentos, contudo, preferencialmente, os péptidos que têm comprimentos entre cerca de 8 e 20 aminoácidos obtêm-se de forma preferencial nos processos respectivos. A dimensão das bibliotecas pode ser de cerca de 102 a 1018, preferencialmente, de 108 a 1015 péptidos diferentes, contudo, não se limita a estes valores.

Uma forma particular de polipéptidos de ligação alvo, são as chamadas "anticalinas" que estão, entre outros, descritas no pedido de patente de invenção alemão DE 197 42 706.

De acordo com a presente invenção, pode-se utilizar PRFl assim como o ácido nucleico que codifica para PRFl como o 27 alvo, para o fabrico ou o desenvolvimento de um medicamento, para o tratamento das doenças aqui descritas e dos estados clínicos aqui descritos, assim como, para a produção e/ou o desenvolvimento de meios para o diagnóstico das referidas doenças e dos referidos estados clínicos, num processo de avaliação, em que as moléculas pequenas do processo de avaliação ou as bibliotecas das moléculas pequenas são utilizados. Esta avaliação compreende a etapa de contacto da molécula alvo com uma única molécula pequena ou com uma variedade de moléculas pequenas ao mesmo tempo ou em sequência, preferencialmente, as da biblioteca tal como foi especificada antes e a identificação dessas moléculas pequenas ou elementos da biblioteca, que se ligam às moléculas-alvo especificadas antes que, se forem tríadas em relação com outras moléculas pequenas, podem ser separadas a partir das moléculas pequenas não ligadas ou que não interagem. Deve entender-se que a ligação e a não ligação podem ser fortemente influenciadas pela experiência particular montada. Quando se modifica a severidade dos parâmetros da reacção é possível fazer variar o grau de ligação ou de não ligação, que permite uma apreciação mais fina deste processo de rastreio. Preferencialmente, depois da identificação de uma ou de várias moléculas pequenas que interagem especificamente com a molécula alvo, esta molécula pequena pode ser melhor caracterizada. Esta caracterização posterior pode residir, por exemplo, na identificação da molécula pequena e na determinação da sua estrutura molecular e ainda das suas características físicas, químicas, biológicas e/ou medicinais. Preferencialmente, os compostos naturais têm um peso molecular de cerca de 100 a 1.000 Da. Também preferencialmente, as moléculas pequenas são aquelas que estão de acordo com as regras de Lepinsky das cinco conhecidas dos especialistas na matéria. Alternativamente, as moléculas pequenas podem também ser definidas de tal modo que 28 elas sejam moléculas pequenas sintéticas, preferencialmente, resultando da química combinatória, em contraste com os produtos naturais, que preferencialmente não são sintéticos. Contudo, deve fazer-se notar que estas definições são apenas complementares do entendimento genérico dos respectivos termos nesta técnica.

Está também dentro do âmbito da presente invenção a utilização de PRF1 e/ou de um ácido nucleico que codifica para PRF1 como uma molécula alvo para o fabrico ou a selecção de aptâmeros e spiegelmers, que podem então ser utilizados directa ou indirectamente quer como medicamentos, quer como agentes de diagnóstico.

Os aptâmeros são ácidos D-nucleicos que são ou de cadeia helicoidais simples ou de cadeia helicoidais duplos e que, especificamente, interagem com uma molécula-alvo. 0 fabrico ou a selecção de aptâmeros está, por exemplo, descrito na patente de invenção europeia EP 0 533 838. Basicamente, realizam-se as seguintes etapas. Primeiro, fornece-se uma mistura de ácidos nucleicos, isto é, aptâmeros potenciais, em que cada ácido nucleico normalmente compreende um segmento de vários, pelo menos, preferencialmente, 8 nucleótidos subsequentes aleatórios. A mistura em seguida contacta com a molécula alvo em que os ácidos nucleicos se ligam à molécula alvo, baseando-se esta ligação numa afinidade acrescida em relação ao alvo ou com uma força acrescida, comparadas com a mistura candidata. Os ácidos nucleicos de ligação são em seguida separados da restante mistura. Eventualmente, os ácidos nucleicos assim obtidos são ampliados utilizando, por exemplo, uma reacção em cadeia de polimerase. Estas etapas podem ser repetidas várias vezes dando no fim uma mistura com uma relação maior de ácidos nucleicos que se ligam especif icamente ao alvo a partir do qual se selecciona, 29 eventualmente, o ácido nucleico final de ligação. Estes ácidos nucleicos de ligação são referidos especificamente como aptâmeros. É óbvio que qualquer etapa deste processo para a geração ou a identificação de amostras de aptâmeros da mistura de ácidos nucleicos individuais, pode ser utilizado para determinar a sua sequência utilizando técnicas padrão. Está dentro do âmbito da presente invenção que os aptâmeros podem ser estabilizados, tal como, por exemplo, pela introdução de grupos quimicos definidos, que são conhecidos dos especialistas da técnica de geração de aptâmeros. Essa modificação pode residir, por exemplo, na introdução de um grupo amino na posição 2' da parte de açúcar dos nucleótidos. Os aptâmeros são normalmente utilizados como agentes terapêuticos. Contudo, está também dentro do âmbito da presente invenção que os aptâmeros assim seleccionados ou gerados, podem ser utilizados para a validação do alvo e/ou como substância principal para o desenvolvimento de medicamentos, preferencialmente, de medicamentos à base de moléculas pequenas. Isto é actualmente feito por meio de um ensaio de comparação, em que a interacção especifica entre a molécula alvo e o aptâmero é inibida por um fármaco candidato, em que após a substituição do aptâmero do complexo de alvo e aptâmero, pode assumir-se que o respectivo fármaco candidato permite uma inibição especifica da interacção entre o alvo e o aptâmero e, se a interacção for especifica, este fármaco candidato será, pelo menos em principio, apropriado para bloquear o alvo e assim diminuir a sua disponibilidade ou actividade biológica no respectivo sistema que contém esse alvo. A molécula pequena assim obtida pode então ser submetida a uma derivação e modificação para optimizar as suas caracteristicas fisicas, quimicas, biológicas e/ou medicinais, tais como, toxicidade, especificidade, biodegradabilidade e biodisponibilidade. 30 A geração ou a produção de spiegelmers, que podem ser utilizados ou gerados de acordo com a presente invenção utilizando PRF1 ou um ácido nucleico que codifica para PRF1, baseia-se num principio semelhante. 0 fabrico de spiegelmers está descrito no pedido de patente de invenção internacional WO 98/08856. Os spiegelmers são ácidos nucleicos L, que significam que são compostos por nucleótidos L em vez de nucleótidos D, tal como se passa com os aptâmeros. Os spiegelmers caracterizados pelo facto de terem uma estabilidade muito elevada nos sistemas biológicos e, comparados com os aptâmeros, interagem especificamente com a molécula alvo contra a qual são dirigidos. No processo de geração de spiegelmers, cria-se uma população heterogénea de ácidos nucleicos D e esta população vai contactar com o antipoda óptico da molécula alvo, no caso presente, por exemplo, com o enantiómero D do enantiómero L de PRF1 de ocorrência natural. Em seguida, separam-se esses ácidos nucleicos D que não interagem com o antipoda óptico da molécula alvo. Mas esses ácidos nucleicos D que interagem com antipoda óptico da molécula alvo são separados, eventualmente, quantificados e/ou sequenciados e, em seguida, sintetizam-se os correspondentes ácidos nucleicos L com base na informação da sequência de ácidos nucleicos obtida a partir dos ácidos nucleicos D. Estes ácidos D que são idênticos, em termos da sequência aos ácidos nucleicos D mencionados antes, interagem com o antipoda óptico da molécula alvo, vão interagir especificamente com a molécula alvo de ocorrência natural em vez de o fazerem com o seu antipoda óptico. Do mesmo modo que no processo de geração de aptâmeros, é também possivel repetir as várias etapas, várias vezes e assim enriquecer estes ácidos nucleicos que interagem especificamente com o antipoda óptico da molécula-alvo. 31

Uma outra classe de compostos que podem ser fabricados ou gerados à base de PRF1 ou de um ácido nucleico que codifica para PRF1, que podem constituir moléculas-alvo, tal como se descreve aqui, é a classe de ribozimas, oligonucleótidos anti-paralelos e ARNpi. Devido à função e ao modo de acção de PRF1, estes tipos de moléculas, que também são aqui referidas e utilizadas como fármacos à base de ácidos nucleicos, são preferencialmente criados e/ou produzidos com base na memória descritiva da presente invenção, mais preferencialmente, com base nas sequências de ácidos nucleicos aqui mencionadas e descritas.

Uma caracteristica comum de todos os ácidos nucleicos mencionados antes consiste no facto de não interagirem com a molécula alvo ao nivel do produto de tradução que, no presente caso, é PRF1, mas ao contrário interagem com o produto da transcrição, isto é, o ácido nucleico que codifica para PRFl, tal como o ácido nucleico genómico ou qualquer ácido nucleico dele derivado, tal como o correspondente ARNnh, ADNc e ARNm, respectivamente. Assim, a molécula-alvo da classe de compostos mencionada antes é, preferencialmente, o ARNm de PRFl.

As ribozimas são ácidos nucleicos activos sob o ponto de vista catalítico que consistem, preferencialmente, em ARN, que basicamente compreende duas partes. A primeira parte exibe uma actividade catalítica, enquanto a segunda parte é responsável pela interacção específica com o ácido nucleico alvo, no caso presente, o ácido nucleico que codifica para a proteína cinase-N-beta. Após a interacção entre o ácido nucleico alvo e a segunda parte da ribozima, normalmente, por hibridação e emparelhamento das bases de Watson-Crick, das extensões complementares principais das bases nas duas cadeias helicoidais de hibridação, a parte activa sob o ponto 32 de vista catalítico pode tornar-se activa, o que significa que vai catalisar, quer intramolecularmente ou intermolecular-mente, o ácido nucleico alvo, no caso a actividade catalítica da ribozima é uma actividade de fosfodiesterase. Em seguida, pode haver ainda uma maior degradação do ácido nucleico alvo, o que finalmente resulta na degradação do ácido nucleico alvo, assim como, da proteína derivada do referido ácido nucleico alvo que, no caso presente é PRF1, devido a uma falta de PRF1 recentemente sintetizado e a uma renovação de PRF1 previamente existentes. As ribozimas, a sua utilização e os princípios da sua concepção são conhecidos dos especialistas na matéria e estão descritos, por exemplo, em Doherty and Doudna (Ribozym structures and mechanism. Annu ref. Biophys. Biomolstruct. 2001; 30: 457-75) e Lewin and Hauswirth (Ribozyme Gene Therapy: Applications for molecular medicine. 2001; 7: 221-8) . A utilização de oligonucleótidos anti-paralelos para o fabrico de um medicamento e como agentes de diagnóstico, respectivamente, basea-se num modo semelhante de actuação. Basicamente, os oligonucleótidos anti-paralelos hibridam com base na complementaridade das bases, com um ARN alvo, preferencialmente, com um ARNm, activando assim RNase H. RNase H é activado tanto pelo ADN acoplado ao fosfodiéster como fosforotioato. O ADN acoplado ao fosfodiéster, contudo, degrada-se rapidamente por meio de nucleases celulares, com excepção do ADN acoplado ao fosforotioato. Estes derivados de ADN de ocorrência não natural, resistentes, não inibem a RNase H após hibridação com ARN. Por outras palavras, os polinucleótidos anti-paralelos são apenas efectivos como complexos híbridos de ADN e ARN. Exemplos destes tipos de oligonucleótidos anti-paralelos, estão descritos, entre outros, nas patentes de invenção norte-americanas U.S. 33 5.849.902 e U.S. 5.989.912. Por outras palavras, com base na sequência de ácidos nucleicos da molécula alvo, que no presente caso é o ácido nucleico que codifica para PRF1, quer a partir da proteina alvo da qual, em principio se pode deduzir a respectiva sequência de ácidos nucleicos ou conhecendo a sequência de ácidos nucleicos como tal, particularmente, o ARNm, podem conceber-se oligonucleótidos anti-paralelos apropriados com base no principio da complementaridade das bases.

Os oligonucleótidos anti-paralelos particularmente preferidos são os que têm uma extensão curta de ADN de fosforotioato (3 a 9 bases) . É necessário no minimo 3 bases de ADN para a activação de RNase H bacteriana e é necessário np mínimo 5 bases para activação de RNase H de mamíferos. Nestes oligonucleótidos quiméricos há uma região central que forma um substrato para RNase H, que está flanqueado por "braços" de hibridação constituídos por nucleótidos modificados que não constituem substratos para RNase H. Os braços de hibridação dos oligonucleótidos quiméricos podem ser modificados por meio de, por exemplo, 2'-0-metilo ou 2'-flúor. Em abordagens alternativas, utilizam-se nos referidos braços ligações de metilfosfonato ou fosforamidato. Outros enquadramentos de oligonucleótidos anti-paralelos úteis na prática da presente invenção são os P-metoxioligonucleótidos, os P-metoxioligodesoxiribonu-cleótidos parciais ou os P-metoxioligonucleótidos parciais.

De particular relevância e utilidade para a presente invenção são os oligonucleótidos anti-paralelos que ainda estão descritos com maior detalhe nas duas patentes de invenção norte-americanas mencionadas antes. Estes oligonucleótidos não contêm nucleótidos ligados a 5'->3' de ocorrência natural. Em vez disso, os oligonucleótidos têm 34 dois tipos de nucleótidos: 2'-desoxifosforotioato, que activa RNase H e nucleótidos 2' modificados que não activam. As liqações entre os 2'-nucleótidos modificados podem ser fosfodiésteres, fosforotioatos ou P-etoxifosfodiésteres. A activação de RNase H é consequida por meio de uma reqião de activação contigua de RNase H, que contém entre 3 e 5 nucleótidos de 2'-desoxifosforotioato para activar a RNase H bacteriana e entre 5 e 10 nucleótidos de 2'-desoxifosforotioatos para activar RNase eucariótica e, particularmente, de mamíferos. Consegue-se uma protecção contra degradação tornando as bases terminais 5' e 3' altamente resistentes às nucleases e, eventualmente, colocando um grupo de bloqueio do terminal 3'.

Mais particularmente, o oligonucleótido anti-paralelo compreende uma terminação 5' e uma terminação 3' ; e de 11 a 59 nucleótidos ligados de 5' ->3' seleccionados independentemente no grupo que consiste em 2' nucleótidos de fosfodiéster modificados e 2' nucleótidos de P-alquiloxifosfotriésteres modificados; e em que o nucleósido do terminal 5' está ligado a uma região de activação de RNase H cpm entre 3 a 10 desoxiribonucleótidos contíguos ligados por f osf orotioato e em que a terminação 3' do referido nucleótido selecciona-se no grupo que consiste num desoxiribonucleótido invertido, uma extensão contigua de 1 a 3 ribonucleótidos de fosforotioato modificados, um grupo biotina e um nucleótido de P-alquiloxifosfotriéster.

Também se pode utilizar um oligonucleótido anti-paralelo em que o nucleósido do terminal 5' está ligado a uma região de activação de RNase H mas o nucleósido do terminal 3' é tal como se especificou antes. Também o terminal 5' se selecciona de um grupo particular diferente do terminal 3' do referido oligonucleótido. 35

Oligonucleótidos anti-paralelos apropriados e úteis são os que contêm uma região de activação de RNase do terminal 5' e têm entre 5 e 10 nucleótidos de desoxifosforotioato contíguos; entre 11 e 59 de 2'-metoxiribonucleótidos contíguos ligados de 5'—3'; e um grupo de bloqueio de exonuclease presente na extremidade 3' do oligonucleótido que se selecciona no grupo que consiste em nucleótidos não ligados a 5'-3'-fosfodiéster, de 1 a 3 nucleótidos modificados contíguos ligados de 5'->3' e um grupo de bloqueio químico não nucleotídico.

Duas classes de oligonucleótidos anti-paralelos particularmente preferidos podem ser caracterizadas como se segue: A primeira classe de oligonucleótidos anti-paralelos, também referido aqui como oligonucleótidos anti-paralelos de segunda geração, compreende um total de 23 nucleótidos que contêm uma extensão na direcção 5'->3' de sete 2'-0-metilribonucleótidos, uma extensão de nove 2'-desoxiribonucleótidos, uma extensão de seis 2'-0-metilribonucleótidos e um 2'-desoxiribonucleótido do terminal 3'. Deste primeiro grupo de sete 2'-O-metilribonucleótidos os primeiros quatro estão ligados a fosforotioato, enquanto os quatro 2'-O-metilribonucleótidos seguintes estão ligados a fosfodiéster. Também há uma ligação de fosfodiéster entre o último, isto é, a extremidade mais terminal de 3' dos 2'-0-metilribonucleótidos e o primeiro nucleótido da extensão que consiste em nove 2'-desoxiribonucleótidos. Todos os 2'-desoxiribonucleótidos estão ligados a fosforotioato. Uma ligação de fosforotioato está também presente entre o último, isto é, o 2'-desoxinucleótido mais terminal em relação a 3' e o primeiro 2'-O-metilribonucleótido da extensão seguinte, que consiste em 2'-O-metilribonucleótidos. Deste grupo de seis 36 2' -O-metilribonucleótidos, os primeiros quatro, novamente na direcção 5'->3', estão ligados por fosfodiéster, enquanto os últimos três, correspondente às posições 20 a 22, estão ligados por fosforotioatos. O último, isto é, o 2'-desoxinucleótido terminal do terminal 3' , está ligado ao último, isto é, ao 2'-O-metilribonucleótido mais terminal do terminal 3', através de uma ligação de fosforotioato.

Esta primeira classe também pode ser descrita por meio da referência à seguinte estrutura esquemática: RRRnnnuNNNNNNNNNnnnRRRN. Aqui, R indica 2'-0-metilribonucleótidos ligados a fosforotioato (A, G, U, C) ; n significa 2' -O-metilribonucleótidos (A, G, U, C); N representa desoxiribonucleótidos ligados por fosforotioatos (A, G, T, C) . A segunda classe de oligonucleótidos anti-paralelos particularmente preferidos, também referidos aqui como oligonucleótidos anti-paralelos de terceira geração ou blocos de genes, também compreendem um total de 17 a 23 nucleótidos com a seguinte estrutura básica (na direcção 5'->3' ) .

Na extremidade 5' do terminal há um nucleótido abásico invertido que é uma estrutura apropriada para conferir resistência contra a actividade da exonuclease e está descrita, por exemplo, na patente de invenção internacional WO 99/54459. Esta abásica invertida está ligada a uma extensão de cinco a sete 2'-O-metilribonucleótidos que estão ligados a fosfodiéster. No seguimento desta extensão de cinco a sete 2'-O-metilribonucleótidos há uma extensão de seta a nove 2'-desoxiribonucleótidos, todos eles ligados a fosforotioato. A ligação entre o último, isto é, o 2'-0-metilribonucleótido mais terminal do terminal 3' e o primeiro 2'-desoxinucleótido da extensão que compreende o 2'- 37 desoxinucleótido ocorre por via de uma ligação de fosfodiéster. Adjacente à extensão de sete a nove 2'-desoxinucleótidos existe ligada uma extensão consistente com cinco a sete 2'-O-metilribonucleótidos. 0 último 2'- desoxinucleótido está ligado ao primeiro 2'-0-metil- ribonucleótido da última extensão mencionada consistindo em cinco a sete 2'-O-metilribonucleótidos que ocorrem por via de uma ligação de fosforotioato. A extensão de cinco a sete 2’-O-metilribonucleótidos está ligada por fosforodiéster. Na extremidade do terminal 3' da segunda extensão de cinco a sete 2'-O-metilribonucleótido está ligada outra abásica invertida.

Esta segunda classe pode também ser descrita com referência à estrutura esquemática que se segue: (os blocos de genes que representam a 3a geração de oligonucleótidos anti-paralelos, têm a seguinte estrutura esquemática): cap-(np) x (Ns) y (np) z-cap ou cap-nnnnnnnNNNNNNNNNnnnnnnn-cap. Aqui, cap representa abásicas de desoxi invertidas ou modificações similares em ambas as extremidades; n representa 2'-0-metilribonucleótidos (A, G, U, C) ; N representa desoxiribonucleótidos ligados por fosforotioatos (A, G, T, C); x representa um número inteiro de 5 a 7; y representa um número inteiro de 7 a 9; e z representa um número inteiro de 5 a 7.

Deve notar-se que os números inteiros x, y e z podem ser escolhidos independentemente uns dos outros, embora seja preferível que x e z sejam iguais num dado oligonucleótido anti-paralelo. De acordo com isto, os desenhos básicos ou as estruturas dos oligonucleótidos anti-paralelos de 3a geração podem ser como se segue: cap- (np) 5 (Ns) 7 (np) 5-cap, cap- (np) 6 (Ns) 7 (np) s-cap, cap- (np) 7 (Ns) 7 (np) 5-cap, cap- (np) 5 (Ns) 8 (np) 5-cap, cap-(np) 6 (Ns) 8 (np) s-cap, cap- (np) 7 (Ns) 8 (np) 5-cap, cap- 38 (ηρ) 5 (Ns) 9 (ηρ) 5-cap, cap- (np) 6 (Ns) 9 (np) 5-cap, cap- (np) 7 (Ns) 9 (np) 5- cap, cap-(np) 5 (Ns) 7 (np) 6-cap, cap-(np) 6 (Ns) 7 (np) 6-cap, cap- (np) 7 (Ns) 7 (np) e-cap, cap- (np) 5 (Ns) 8 (np) 6-cap, cap- (np) 6 (Ns) 8 (np) 6-cap, cap-(np) 7 (Ns) 8 (np) 6-cap, cap-(np) 5 (Ns) 9 (np) 6-cap, cap- (np) 6 (Ns) 9 (np) e-cap, cap- (np) 7 (Ns) 9 (np) 6-cap, cap- (np) 5 (Ns) 7 (np) 7-cap, cap-(np) 6 (Ns) 7 (np) 7-cap, cap-(np) 7 (Ns) 7 (np) 7-cap, cap- (nP) s (Ns) 8 (np) 7-cap, cap- (np) 6 (ns) 8 (np) 7-cap, cap- (np) 7 (Ns) 8 (np) 7-cap, cap-(np) s (Ns) 9 (np) 7-cap, cap- (np) 6 (Ns) 9 (np) 7-cap e cap-(np) 7 (Ns) 9 (np) 7-cap.

Uma outra classe de compostos que podem ser gerados com base nos ensinamentos técnicos dados aqui e que podem ser utilizados como medicamentos e/ou agentes de diagnóstico são o ARN pequeno de interferência (ARNpi) dirigido ao ácido nucleico, preferencialmente ARNm, que codifica para PRF1. ARNpi é um ARN de cadeia helicoidal duplo, que normalmente tem um comprimento de cerca de 21 até cerca de 23 nucleótidos. A sequência de uma das duas cadeias helicoidais de ARN corresponde à sequência do ácido nucleico alvo, tal como o ácido nucleico que codifica para PRF1, que vai ser degradada. Por outras palavras, conhecendo a sequência de ácidos nucleicos da molécula alvo, no caso presente PRF1, preferencialmente, a sequência de ARNm, pode-se conceber um ARN de cadeia helicoidal duplo com um dos dois cadeia helicoidais a ser complementar do referido, por exemplo, ARNm de PRF1 e, após a aplicação do referido ARNpi a um sistema que contenha o gene, o ADN genómico, o ARNnh ou o ARNm que codifica para PRFl, o respectivo ácido nucleico alvo ficará degradado e assim o respectivo nivel de proteina será reduzido. Os princípios básicos de concepção, construção e utilização do referido ARNpi como medicamento e agente de diagnóstico, respectivamente, está descrito, entre outros, nos pedidos de patente de invenção internacional WO 00/44895 e WO 01/75164. 39

Com base no modo de actuação das classes de compostos mencionadas antes, tais como, anticorpos, péptidos, anticalinas, aptâmeros, spiegelmers, ribozimas, oligo-nucleótidos anti-paralelos, assim como, ARNpi, está também dentro do âmbito da presente invenção a utilização destes compostos que atingem PRF1 e o ácido nucleico que o codifica, respectivamente, para o fabrico de um medicamento ou de um agente de diagnóstico para qualquer uma das doenças aqui descritas e qualquer um dos estados clínicos aqui descritos. Além disso, estes agentes podem ser utilizados para monitorizar a progressão das referidas doenças e dos referidos estados clínicos e o sucesso de qualquer uma das terapias aplicadas, respectivamente.

As várias classes de compostos concebidas de acordo com a presente invenção, tais como, anticorpos, péptidos, anticalinas, moléculas pequenas, aptâmeros, spiegelmers, ribozimas, oligonucleótidos anti-paralelos e ARNpi podem também estar contidos numa composição farmacêutica. Preferencialmente, utiliza-se essa composição farmacêutica para o tratamento das doenças aqui descritas ou os estados clínicos aqui descritos. A composição farmacêutica pode compreender, num enquadramento, uma ou várias classes de compostos mencionadas antes e/ou um ou mais elementos de uma única classe e, eventualmente, um composto activo sob o ponto de vista farmacêutico e um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico. Esse veículo pode ser líquido ou sólido, por exemplo, uma solução, um tampão, uma solução alcoólica ou similar. Os veículos sólidos apropriados são, entre outros, amido e similares. É do conhecido dos especialistas na matéria as respectivas formulações para os vários compostos de acordo com as classes de compostos mencionadas antes de modo a realizar a via particular de administração, tal como, 40 oral, parentérica, subcutânea, intravenosa, intramuscular e similar.

Os vários compostos das diferentes classes de compostos que se mencionaram antes, podem estar isolados ou em combinação contidos num kit. Esse kit compreende, para além dos respectivos compostos, mais um ou vários elementos ou compostos em que esses elementos se seleccionam no grupo que compreende tampões, controlos negativos, controlos positivos e instruções para o uso dos vários compostos. Preferencialmente, os vários compostos estão presentes quer numa forma anidra ou liquida, preferencialmente, como uma dose unitária para uma administração única para cada um deles. 0 kit pode ser utilizado particularmente para terapia, diagnóstico ou monitorização do progresso da doença ou das terapias aplicadas em relação com as doenças e os estados clínicos tal como se descreveram aqui.

Num outro aspecto de PRF1, tanto o ácido nucleico que o codifica como, preferencialmente, a sequência de aminoácidos e o polipéptido ou a proteína de PRF1, podem ser utilizados para o desenvolvimento e/ou a geração e/ou a concepção de compostos que são úteis no tratamento e/ou na prevenção E/ou no diagnóstico de qualquer uma das doenças e dos estados clínicos aqui descritos. Para este fim, numa primeira etapa, determina-se ou rastreia-se um parceiro de interacção de PRF1, preferencialmente, da proteína de PRF1. Mais preferencialmente, esse parceiro de interacção é um parceiro de interacção de ocorrência natural e, ainda mais preferencialmente, esse parceiro de interacção é/são parceiros de interacção naturais. 0 processo para a determinação ou o rastreio desse parceiro de interacção é conhecido pelos especialistas na matéria. Uma tecnologia bem conhecida é a designada por tecnologia de dois híbridos que 41 está descrita, por exemplo, em Ausubel (supra), unit 13.14 "Interaction Trap/Two-Hybrid System to Identify Interacting Proteins" ou Fields S., Song, 0., Nature. 1989 Jul 20; 340 (6230): 245-6. uma alternativa que consiste em precipitar a proteína de PRF1 ou um seu fragmento a partir de extractos de células ou produtos da lise de células e determinar qual um factor que está ligado ao co-precipitado com PRF1. Essa análise pode ser feita utilizando técnicas padrão conhecidas dos especialistas na matéria, tal como, espectrometria de massa. Num enquadramento particular, a precipitação é uma precipitação imune. Num outro enquadramento, a precipitação é conseguida utilizando células marcadas com rádio, preferencialmente, células marcadas com 35S. Independentemente desses parceiros de interacção, os parceiros de interacção naturais particularmente podem ser determinados por meio da utilização de meios cromatográficos e caracterização da fracção obtida, isto é, da fracção eluída. Num enquadramento preferido, esses meios cromatográficos também podem ser cromatografia por afinidade, em que a proteína de PRF1 fica imobilizada no meio de separação. Devido à interacção específica entre a proteína de PRF1 e o possível parceiro de interacção, este parceiro de interacção irá actuar como um ligando no processo cromatográfico e pode assim ser purificado e ainda caracterizado.

Numa segunda etapa, o parceiro de interacção assim identificado pode ser utilizado num processo de rastreio tal como se descreveu aqui para PRF1. Adicionalmente ou alternativamente, o ácido nucleico que codifica o parceiro de interacção, é um polipéptido ou um parceiro de interacção à base de ácido nucleico, que pode ser utilizado para a concepção e/ou o fabrico e/ou a geração das classes de compostos aqui definidas, tais como, mas não se limitando a 42 anticorpos, péptidos, anticalinas, moléculas pequenas, aptâmeros, spiegelmers, ribozimas, moléculas anti-paralelas (também referidas aqui como oligonucleótidos anti-paralelos) e ARNpi. Em ligação com o termo ARNpi pode entender-se qualquer uma das suas formas, incluindo, mas não se limitando a ARNpi, tal como descrito na patente de invenção internacional WO 03/070918.

Deve entender-se que a primeira etapa descrita antes pode ser um processo só por si com a segunda etapa sendo realizada apenas opcionalmente. A presente invenção vai ser agora ilustrada pelas figuras e exemplos que se seguem, que não pretendem constituir um limite do âmbito de protecção mas são dadas apenas por razões de exemplificação. A partir das referidas figuras, exemplificam-se mais características, enquadramentos e vantagens da presente invenção, em que

Fig. 1 mostra uma representação esquemática do factor de crescimento que induziu a activação da via metabólicacde PI3-cinase;

Fig. 2 mostra a medição das metástases de nódulos linfáticos num modelo ortotópico de rato PC-3 do tratamento com rapamicina (Rapamune);

Fig. 3 mostra a abordagem experimental para identificar PRF1 como um fármaco alvo a jusante da via metabólica de PI3-cinase;

Fig. 4 mostra um rasteio primário do GeneBloc em células PC-3; 43

Fig. 5 mostra o crescimento de células PC-3 transfectadas com GeneBlocs específicos de PRF1 em matrigel com a Fig. 5A a mostrar o knock-down do ARNm nestas condições e a Fig. 5B mostra fotografias tiradas ao respectivo crescimento de células em matrigel;

Fig. 6 mostra a extensão da inibição do crescimento do tumor da próstata por interferência do ARN específico de PRF1 (Fig. 6C) e do total de metástases dos nódulos linfáticos após a utilização da mesma interferência de ARN específico de PRF1 (Fig. 6D), com a Fig. 6A a mostrar a concepção do vector básico para a expressão de ARNpi e a Fig. 6B as sequências de ARNpi utilizadas;

Fig. 7 mostra o resultado de uma experiência de expressão diferencial, em que a expressão de PRF1 foi monitorizada em diferentes linhas de células que cresceram em várias superfícies de crescimento com a célula a ser tratada com diferentes compostos dirigidos assim a diferentes elementos na via metabólica de PI3-cinase;

Fig. 8A mostra o resultado de uma análise de "Western blot" realizada para a caracterização da especificidade de um anticorpo policlonal contra PRF1;

Fig. 8B mostra duas fotografias do tecido de cancro da próstata corado com o anticorpo policlonal caracterizado na Fig. 8A e utilizando soro pré-imunizado;

Fig. 9A mostra o resultado de uma análise de "Western blot" de células tratadas com LY294002 (LY) ou DMSO às 24 h, 48 h, 72 h e 96 h; 44

Fig. 9B mostra o resultado de uma análise de "Western blot" de células PC-3 tratadas com uma molécula anti-paralela (GB) específica para ρΙΙΟβ;

Fig. 10A mostra o resultado de uma análise de "Western blot" de uma experiência em que as células PC-3 foram tratadas com uma molécula anti-paralela específica de Akt (GB);

Fig. 10B mostra o resultado de uma análise de "Western blot" de células PC-3 que cresceram em condições hipóxicas e foram tratadas com uma molécula anti-paralela específica para HIFIoí;

Fig. 11A mostra fotografias de células PC-3 tratadas com várias moléculas anti-paralelas (GB) na matriz extracelular;

Fig. 11B mostra uma análise de "Western blot" das células PC-3 mostradas nas fotografias de acordo com a Fig. 5A; e

Fig. 12 mostra uma representação esquemática da activação induzida pelo factor de crescimento da via de PI3-cinase, compreendendo agora também HIFIoí como um elemento a jusante da via paralela Akt convergindo em RPF1, referida REDD1; e

Fig. 13a descreve a sequência de aminoácidos de acordo com NP_0 61931.1; e

Fig. 13b e c descrevem as sequências de ácidos nucleicos de acordo com NM_019058.1. A Fig. 1 mostra uma representação esquemática da activação induzida pelo factor de crescimento na via de PI3-cinase. A estimulação das células pelo factor de crescimento leva à activação dos seus receptor cognatos na membrana da célula, 45 que por sua vez, se associa com as moléculas de sinalização intercelulares activadas, tais como, PI3-cinase. 0 supressor do tumor PTEN interfere com as respostas a jusante mediadas por PI3-cinase e assegura que a activação desta via ocorre de uma forma transiente. LY294002 é um inibidor de moléculas pequenas de PI3-cinase. Um dos genes da via de PI3-cinase a jusante conhecidos é o mTOR (alvo num mamifero de rapamicina) que pode ser inibido pelo fármaco de rapamicina aprovado clinicamente (Rapamune). PI3-cinase está envolvida no ciclo da célula e na reparação do ADN, regulação de apoptose, transporte de glicose, tradução do crescimento, metástase e migração. X são alvos potenciais de fármacos a jusante que se supõe que estão envolvidos na promoção de um comportamento metastásico das células de cancro e que podem ser considerados como os melhores fármacos alvo que atingem mais alvos "a jusante" tal como mTOR, devido aos reduzidos efeitos colaterais. A Fig. 12 mostra uma representação esquemática da activação induzida pelo factor de crescimento da via de PI3-cinase semelhante à representação da Fig. 1. Contudo, devido às descobertas subjacentes à presente invenção, a via de PI3-cinase foi ainda elaborada de tal modo que se identificou HIFla como um ramo da via de PI3-cinase em relação a RPF1 que é moderada por Akt.

Nos exemplos vão dar-se descrições mais detalhadas das outras figuras.

Exemplo 1: Materiais e processos Cultura de células 46

Obtiveram-se células PC-3 de carcinoma humano da próstata da American Type Culture Collection (ATCC). Fez-se a cultura das células numa mistura nutriente F12K (modificação de Kaighn) , contendo soro de bovino fetal a 10 % (SB) , gentamicina (50 pg/mL) e amfotericina (50 ng/mL). Fizeram-se as transfecções em placas de 96 cavidades ou de 10 cm (na confluência de 30 % até 50 %) utilizando vários lípidos catiónicos, tais como, Oligofectamina, Lipofectamina (Life Technologies), NC388 (Ribozyme Pharmaceuticals, Inc., Boulder, CO) ou FuGene 6 (Roche), de acordo com as instruções do fabricante. Transfectaram-se os GeneBlocs por adição do complexo de GeneBloc e lipido em meio isento de soro, pré-formado e concentrado 5X, a células em meio completo. O volume total de transfecção foi de 100 pL para as células colocadas em placas de 96 cavidades e 10 mL para células em placas de 10 cm. A concentração final de lipidos foi de 0,8 a 1,2 pg/mL consoante a densidade das células. A concentração de GeneBloc é a indicada em cada experiência.

Fez-se a tripsinização das células em cultura e colheram-se depois de passar o efeito da tripsina causado pelo meio. Fizeram-se os procedimentos da lavagem (SBF; centrifugação 5 min/1.000 rpm) e finalmente fez-se uma nova suspensão do aglomerado considerando o número de células e o volume a ser inoculado.

Determinação das quantidades relativas dos niveis de ARN por análise de Taqman

Isolou-se o ARN das células transfectadas em 96 cavidades e purificou-se utilizando o kit Invisorb ARN HTS 96 (InVitek GmbH, Berlim). Detectou-se a inibição da expressão do ARNm de PRF1, em tempo real, por RCP-TI (reacção em cadeia de polimerase-trancriptase inversa) (Taqman), utilizando um 47 iniciador de 5' de PRF1 300 nM, o iniciador 3' de PRF1 300 nM e 100 nM da sonda Taqman de PRF1 marcada com Fam-Tamra. Realizou-se a reacção em 50 mL e fez-se um ensaio num detector de sequências ABI PRISM 7700 (Applied Biosystems). De acordo com as instruções do fabricante nas sequintes condições: 48 °C durante 30 min, 95 °C durante 10 min, sequido de 40 ciclos de 15 seg a 95 °C e 1 min a 60 °C.

Crescimento in vltro numa matriz de matrigel

Trataram-se células PC-3 com 10 μΜ de LY294002 ou DMSO quando semeadas em matrigel. Quando as células foram transfectadas antes da sementeira, transfectaram-se as células com GeneBloc e fez-se a sua tripsinização 48 h após a transfecção. Lavaram-se as células num meio e semearam-se em duplicado, em 24 cavidades (100.000 células por cavidade) pré-revestidas com 250 pL de matriz de membrana à base de matrigel (Becton Dickinson). Após incubação durante 24 a 72 h, tiraram-se fotografias com uma ampliação de 5x com uma câmara Axiocam ligada a um microscópio Axiovert S100 (Zeiss).

Affymetrix

Preparou-se o ARN total a partir do crescimento das células em matrigel utilizando um kit de ARN Totally (AMBION) seguindo o protocolo dos fabricantes. Na etapa final o ARN total precipitado foi novamente suspenso em tampão de lise Invisorb e foi purificado utilizando o kit do ARN das células de spin (INVITEK). Preparou-se ARNc marcado com biotina seguindo os protocolos da Affymetrix e hibridou-se 15 pg de ARNc no kit Affymetrix GeneChip HG-U95.

Análise dos dados 48

Analisaram-se os dados brutos utilizando o software Microarray Suite V4.0 da Affymetrix GeneChip. Calculou-se a intensidade de cada conjunto de sondas como a diferença do sinal de hibridação dos oligonucleótidos que se emparelhavam perfeitamente comparado com o dos oligonucleótidos não emparelhados, fazendo-se a média num conjunto de 16 a 20 pares de sondas correspondendo a um transcripto. A diferença da média de um conjunto de sondas é proporcional à abundância de um transcripto. As intensidades totais do sinal de diferentes matrizes foram escalonadas para o mesmo valor antes da comparação. Calculou-se um número de vezes que ocorreram mudanças, utilizando o software da Affymetrix por comparação dos pares, no que respeita às intensidades dos correspondentes pares de sondas de cada experiência e da matriz de base. Utilizando as matrizes de decisão descritas pela Affymetrix, o software também gerou células absolutas (o transcripto está ausente, é marginal ou está presente numa experiência) e células de diferença (abundância de um transcripto numa experiência comparada com a outra: aumento, aumento marginal, sem alteração, decréscimo marginal, decréscimo). Os resultados foram exportados para Excel da Microsoft (opção absoluta, opção da diferença, vezes de alteração) e filtrou-se. Todos os conjuntos de sondas com opções de ausência ou uma opção de não alteração foram rejeitados e o quadro foi construido pelo número de vezes da alteração.

Estudos em animais

Realizaram-se experiências in vivo correspondente às boas práticas laboratoriais para estudos laboratoriais não clinicos (GLP Regulations) da Food and Drug Administration e de acordo com a lei da protecção dos animais da Alemanha, tomando isto como a base legal. 49

Gaiola dos ratos machos: NMRI-nu/nu (Tierzucht Schõnwald GmbH) foram mantidos em condições SPF (equipamento de fluxo de ar da Laminar, Scantainer, Scanbur) serviram como os receptores para as células humanas do carcinoma da próstata. Pesaram-se os animais que tinham idades de 6-8 semanas e que pesavam entre 28-30 g e inocularam-se com 2 x 106/0,03 mL células de tumor, em ambos os lóbus dorso-lateral esquerdo da glândula da próstata (iprost; Orthotopic) ou no lóbus lateralis sinister do figado (ihep; Ectopic) . Para este fim, os ratos receberam uma anestesia geral utilizando uma mistura de Ketanest (Parke-Davis GmbH) e Rompun (Bayer Vital GmbH) a 80:1, com doses de 100 mg/kg e 5 mg/kg, respectivamente. Depois da esterilização da superfície ventral do corpo, fez-se uma incisão através da pele do abdómen e da parede peritonial começando próximo do bordo da glândula prepúcia e medindo cerca de 1 cm. Utilizando um par de pinças e um esfregaço de algodão visualizou-se a glândula prostática. Seguiu-se a estimulação das células ortotópicas com a ajuda de uma lente de aumentar e utilizando uma seringa de 1 mL (Henke Sass Wolf GmbH) munida de agulhas com um micro-bisturi de 30 G 0,30 x 13 (Becton Dickinson) . A administração tem sucesso quando se observa uma postula bem marcada no sítio da inoculação. Fechou-se a ferida com material de sutura (PGA Resorba, Franz Hiltner GmbH) no que respeita à parede peritonial e com agrafes de Michel de 11 x 2 mm (Heiland) , para a pele abdominal. Cobriu-se a lesão com um spray para feridas (Hansaplast Spruhpflaster, Beiersdorf AG) . Durante a fase pós-cirúrgica mantiveram-se os animais num ambiente quente até eles acordarem completamente. Distribuíram-se os animais aleatoriamente de acordo com o número de grupos de tratamento, que consistiam em 5-10 animais por cada grupo. Os animais foram sucessivamente inspeccionados incluído em relação às observações do protocolo. Administrou-se Ssniff NM-Z, lOmm, que tinham passado por autoclave (ssniff 50

Spezialdiáten GmbH) como uma dieta fortificante e acidificou-se a água para beber com HC1, ambos ad libitum.

Avaliações

Para receberem o nivel de dose actual registaram-se os pesos dos corpos nos dias de tratamento. Ao mesmo tempo, pode-se tirar conclusões do desenvolvimento do peso do corpo, no sentido de reconhecer as influências das modalidades do tratamento em todo o organismo. Fizeram-se punções de sangue no dia 0 (linha base); 14; 28; e 35 (dia do sacrifício). 0 sangue foi retirado da veia orbital dos animais anestesiados durante pouco tempo (éter de dietilo, Otto Fischar GmbH). Os parâmetros de avaliação forneceram dados em relação à compatibilidade e aos efeitos colaterais dos tratamentos e foram os seguintes: número de leucócitos; número de trombócitos; enzimas. Ligaram-se a outros parâmetros do sangue (bilirubina; creatinina; proteína; ureia; ácido úrico).

Todos os animais sacrificados foram completamente dissecados e foram documentados fotograficamente. Mediram-se os tumores (glândula prostática) e as metástases (metástases caudais, lombares, renais e dos nódulos linfáticos) em duas dimensões, por meio de um par de cateteres. Calculou-se o volume de acordo com V (mm3) = ab2/2 com b <a. Em geral, o número de células utilizado para as abordagens terapêuticas causou um tumor de 100 % no que respeita à glândula prostática. Os pesos de alguns órgãos (fígado; baço; rim) foram registados para se recolher dados adicionais respeitantes ao conhecimento há cerca dos efeitos colaterais secundários. Para as análises histológicas ficaram-se amostras do tecido do tumor, isto é, tumor da próstata e metástases de nódulos linfáticos, em parafina embebida com 51 formaldeído a 5 %. Por rotina, as secções foram coradas com HE e, quando necessário, fizeram-se colorações especificas (Azan, PAS).

Para detectar a origem humana das células de tumor e das células das metástases, congelaram-se amostras adequadas de tecido em azoto liquido. Quando se utilizou RCP (reacção em cadeia de polimerase) e análise por Taqman com amplicões específicos de HPRT humano, pôde-se detectar 50 células humanas em 5 mg de tecido.

Os resultados terapêuticos foram verificados estatística-mente por meio do teste u de Mann e Whitey.

Exemplo 2: Experiência para provar o conceito sobra a adequação dos fármacos-alvo utilizados a jusante

Tal como se sublinhou na parte introdutória desta memória descrita, que se incorpora aqui como referência, os alvos ligados a jusante a uma via de sinalização, são válidos para a concepção ou o desenvolvimento tanto de medicamentos como de fármacos e de agentes de diagnóstico. É obvio que, se o alvo particular está ligado a outras vias diferentes ou devido à sua posição na via de sinalização, é possível que um certo número de fenómenos biológicos, tais como, por exemplo, metástases e migração, tradução do crescimento, apóptose, ciclo das células, reparação do ADN e outros, tal como no caso da via metabólica de PI3-cinase, qualquer composto que se dirija a este alvo tenha um certo número de efeitos colaterais que podem ser pouco importantes para o sistema mas que podem ser indesejáveis do ponto de vista médico ou podem causar um resultado analítico falso ou não específico. De acordo com isto, os alvos a jusante devem ser a primeira escolha. 52

Os requerentes verificaram que sob o controlo da via metabólica de Pl3-cinase, estão envolvidos outros possíveis alvos para além de mTOR, que são específicos para o controlo dos fenómenos de metástases e migração e assim da formação de tumores e, possivelmente, também da tradução do crescimento e da falta de glicose e/ou aminoácidos. Na indústria farmacêutica verificou-se que a rapamicina, vendida sob o nome comercial de Rapamune, é apropriada para inibir metástases e migração, assim como, imuno-supressão (por exemplo, para a transplantação de orgãos). Isto confirma a adequação da estratégia para dirigir os fármacos-alvo a jusante.

Como se pode inferir da Fig. 2, a rapamicina é apropriada para reduzir o volume das metástases dos nódulos linfáticos e por isso é comparável, no seio efeito, ao bem conhecido inibidor de Pl3-cinase, LY294002 que, contudo, está associado a um certo número de efeitos colaterais, o que não é surpreendente dado o facto de PI3-cinase e mTOR estarem ligados a um certo número de fenómenos biológicos. Como se descreve na Fig. 2A utilizou-se o modelo de tumor para o tratamento com Rapamune, iniciado no Io dia. Ambas as concentrações utilizadas, isto é, 0,4 mg/kg/dose e 2 mg/kg/dose levaram uma tremenda diminuição da extensão das metástases dos nódulos linfáticos, expressas em mm3, compara com o controlo negativo que foi uma solução salina tamponada com fosfato.

Obtiveram-se basicamente os mesmos resultados no caso de tratamento com Rapamune, num modelo de tumor estabelecido com o tratamento a iniciar-se no 28° dia (Fig. 2B). A montagem experimental subjacente foi tal que se mediram as metástases nos nódulos linfáticos num modelo 53 ortotópico de rato PC-3 depois do tratamento com rapamicina (Rapamune). Na Fig. 2A mostram-se os resultados do modelo retirado do tumor. Injectaram-se ratos Nude: NMRI-nu/nu (8 por grupo) com 2 x 106 células PC-3 em 0,03 mL, intraprostaticamente e fez-se o tratamento utilizando doses diárias intraperitoniais de Rapamune, durante 28 dias, em doses de 2 mg/kg e 0,4 mg/kg. Utilizou-se como controlo SBF (soro bovino fetal).

Para o tratamento dos tumores estabelecidos (B), deixou-se que as células crescessem iprós durante 28 dias e realizou-se o tratamento utilizando Rapamune nos dias 29 a 50 após a implantação. Escolheram-se as doses conforme se sublinha em A. Sacrificaram-se animais nos dias 29 e 51, respectivamente e determinaram-se as metástases totais nos nódulos linfáticos.

Exemplo 3: Identificação de PRF1 como um fármaco alvo a jusante da via metabólica de PI3-cinase A Fig. 3 mostra uma abordagem experimental básica. As células PC-3 cresceram em matrigel onde foram tratadas quer com DMSO ou com o inibidor de PI3-K, LY294002 e isolou-se o ARN total de cada amostra. Desenharam-se os perfis de expressão diferencial dos genes segundo Affymetrix e continuou-se o processo de expressão utilizando o ensaio de Taqman e RCP-TI. Utilizou-se pllOa como um padrão não diferencial.

As células PC-3 são PTEN-/- o que significa que o supressor de tumores PTEN tem factualmente falta destas células, de modo que a via metabólica de PI3-cinase está permanentemente activada, o que leva a um aumento da actividade metastásica ou a um comportamento das células que 54 é expresso pelo seu modelo de crescimento no ensaio em matrigel. (Petersen, 0. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R. and Bissel, M. J. (1992) . A interacção com a membrana de base serve para distinguir rapidamente o modelo de crescimento do modelo de diferenciação das células epiteliais normais e das células epiteliais do carcinoma maligno humano. Proc Natl Acad Sei USA, 89, 9064-9068. (Auch: Sternberger et al., 2002 Antisense & Nucleic acid drug development 12: 131-143). Em relação com isto, deve notar-se que as células PC-3 cresceram em matrigel e tomando isto como um sistema modelo, que está próximo do ambiente in vivo do seu ARN isolado, assume-se que se está mais próximo da situação in situ ou se está mais próximo de resultados do que com qualquer preparação obtida a partir de células que crescem em ambientes que não são de matrigel, tal como, a convencional cultura de células em placas.

Para além das células PC-3, fez-se crescer outras células e fizeram-se as respectivas análises, tais como, PNT-1A, MCF-10A e HELA. Utilizaram-se várias superfícies de crescimento e trataram-se as células com os compostos que se cria avaliar ou com compostos conhecidos para afectar a via metabólica de PI3-cinase. Os resultados estão ilustrados no quadro descrito na figura Fig. 7. Tal como se pode inferir da leitura expressa como "mudança" na parte superior das duas colunas da direita, o sinal obtido no perfil de expressão de genes Affymetrix aumentou excepto para as combinações de compostos que se seguem administradas às células, nomeadamente no caso de células PC-3, uma combinação de GBs desemparelhadas, dirigidas contra as subunidades catalíticas de pllOa e pllOb de PI3-cinase e o mesmo desemparelhamento em ligação com LY (que é LY294002), no caso das células PNT-1A, uma molécula anti-paralela designada por PTEN 17 e o respectivo desemparelhamento e no caso das células HELA a 55 combinação de Tam e DMSO após 48 h e 72 mais 96 h, respectivamente. As linhas de células estáveis que expressam uma forma indutivel de PI3-cinase activa sob o ponto de vista constitutivo, MpllO*ER, já foram descritas (Klippel et al., 1998; Sternberger et al., 2002). Estimularam-se os agrupamentos de células transfectadas de modo estável num meio de crescimento com 200 nM do indutor 4-OHTamoxifen (Tam), no seio de DMSO, tal como se descreveu previamente.

Exemplo 4: Rastreio de oligonucleótidos anti-paralelos óptimos dirigidos contra PRF1

Para rastrear os oligonucleótidos anti-paralelos óptimos dirigidos contra PRF1 escolheram-se oito GeneBlocs no total da sequência de ARNm de PRF1.

Transfectaram-se células PC-3 com diferentes concentrações de GeneBloc tal como descrito e determinaram-se os níveis de ARNm 24 horas após a transfecção, utilizando os ensaios de Taqman com 300 nM do iniciador NM_019058 específico do iniciador directo (forward primer) e o iniciador inverso (reverse primer) e 100 nM de sonda e 40 nM de iniciador directo e inverso e 100 nM de sonda para a β-acção humana.

Os resultados deste processo, que também é referido aqui como rastreio primário de GeneBloc, estão descritos na Fig. 4. a partir dos resultados obtidos seleccionaram-se os GeneBlocs 70034 e 70044 para estudos posteriores.

No que respeita ao GeneBloc tal como se utiliza aqui nos vários exemplos, deve notar-se que eles são todos oligonucleótidos, anti-paralelos, de terceira geração, tal como se especifica aqui, o que significa, tal como se torna 56 óbvio a partir do quadro 1, que as letras maiúsculas representam os desoxiribonucleótidos que estavam ligados através de um fosforotioato em vez de terem uma ligação de fosfodiéster.

Quadro 1: Síntese dos vários GeneBlocs utilizados, as suas designações, desemparelhamentos relativos ao ácido nucleico alvo e as características estruturais das sequências N°. do GeneBloc Designação Desemp. Sequência SEQ ID N° . 70040 FLJ:1558L21 0 gctcaaCTCTGCAGTacacga 4 70041 FLJ:1356L21 0 cttggtCCCTTCAGAccagta 5 70042 FLJ:1006L21 0 cagtttTCCAACCACtggaat 6 70043 FLJ:954L21 0 cccaaaAGTTCAGTCgtctct 7 70044 FLJ:975L21 0 gctcctGCCTCTAGTctccac 8 70045 FLJ:470L21 0 gtgttcATCCTCAGGgtcatc 9 70046 FLJ:1412L21 0 ggtcagTAGTGATGCtccgat 10 70047 FLJ:571L21 0 cttaccAACTGGCTAggcatc 11 70168 FLJ:954L21 4 ccgaaaAGAACAGTGctctct 12 70169 FLJ:975L21 4 gctcgtCCCTGTAGTgtccac 13

Além disso, deve notar-se que qualquer dos "t anteriores" são agora "u" pelo facto de que os oligonucleótidos anti-paralelos anteriores são GeneBlocs, isto é, são oligonucleótidos anti-paralelos de terceira geração.

Do quadro 2 podem retirar-se outras moléculas anti-paralelas, tal como foram utilizadas nos vários exemplos e enquadramentos da presente invenção, indicando os nomes, isto é, as referências internas das moléculas anti-paralelas, as suas sequências e as caracteristicas das sequências. Estas moléculas anti-paralelas são GeneBlocs, isto é, oligonucleótidos anti-paralelos de terceira geração. Os 57 sublinhados indicam desemparelhamentos relativos às sequências-alvo.

Quadro 2: Resumo de outros GeneBlocs utilizados PTEN 48 guccuuuCCCAGCTTTacaguga PTEN 52 cuggaucAGAGTCAGTgguguca PTEN 53 ucuccuuTTGTTTCTGcuaacga PTEN 57 ugccacuGGTCTGTAAuccaggt mm PTEN 52 cuggaugAGACTGAGTgcuguca mm PTEN 53 ucucauuTTCTTTGTGcucacga pllOa 79 acuccaaAGCCTCTTGcucaguu pllOa 82 uaccacaCTGCTGAACcagucaa pllOa 88 caaauucCAGTGGTTCauuccaa pllOa 93 ggcuaacTTCATCTTCcuuccca mm pllOa 79 acugcaaACCCTGTTGcucacuu mm pllOa 93 ggcuaagTTCTTCATCcuugcca PTEN 17 cccuuuCCAGCTTTAcaguga mm PTEN 17 ccguuuGCACCTTTAgaguga HIFla 66 gguaguGGTGGCATTagcagu mm HIFla 66 gguagaGGTGCCAATugcagu HIFla 67 ugacucCTTTTCCTGcucugu mm HIFla 67 ugacucCTTTTCCTGcucugu AKT1-GB gucuugATGTACTCCccucgu mm-AKTl guguugATCTAGTCCccuccu AKT2-GB uccuugTACCCAATGaaggag mm AKT2 ucguugTAGCCAATCaacgag

Exemplo 5: Redução da expressão selectlva de PRF1

Para provar que PRF1 é um fármaco alvo apropriado para se utilizar a jusante da via metabólica de Pl3-cinase, obtiveram-se dois GeneBlocs particularmente vantajosos a partir do exemplo 4, isto é, 70044 e 70043, que foram 58 utilizados numa experiência de crescimento com base em matrigel. A experiência de crescimento em matrigel é feita como um modelo de substituição que mostra o comportamento das metástases e da migração das células respectivas. Um crescimento mais confluente das células é tomado como uma indicação de que as suas metástases e o comportamento de migração aumentaram, o que permite que as células se espalhem numa estrutura tridimensional dada pelo matrigel. 0 resultado deste exemplo está ilustrado na Fig. 5.

As células PC-3 foram transfectadas e semeadas em matrigel tal como já se descreveu e controlou-se o seu crescimento. Isolou-se o ARNm a partir de uma aliquota de células semeadas em matrigel e analisou-se utilizando um ensaio por Taqman (painel da esquerda). 0 ARNm especifico de PRF1 (NM_019058) foi padronizado para os niveis de ARNm de pllOa. Utilizou-se um GeneBloc específico de PTEN como o controlo negativo nas células PTEN-/-PC-3 e um GeneBloc específico de ρΙΙΟβ foi utilizado como um controlo positivo para o crescimento numa matriz extracelular. A inibição específica do crescimento está ilustrada pela comparação do crescimento das células tratadas com o GeneBlocs específicos de PRF1, 70043 e 70044, respectivamente, versus os seus correspondentes oligonucleótidos 70168 e 70169 desemparelhados, respectivamente. A partir da Fig. 5A e da Fig. 5B pode retirar-se que dois GeneBlocs preferidos, nomeadamente 70043 e 70044, resultam numa significativa redução da expressão do ARNm de PRF1 em que este resultado corresponde aos obtidos a partir do ensaio de crescimento em matrigel. O eixo dos y representa a quantidade de ARNm determinada pelo processo DCt de acordo com as instruções da Applied Biosystems. 59

Exemplo 6: Geração e especificidade de um anticorpo policlonal contra PRF1

Gerou-se um anticorpo policlonal contra PRF1 utilizando técnicas padrão. 0 anticorpo policlonal assim obtido foi analisado quanto à sua especificidade para PRF1. Com este fim, trataram-se células PC-3 submetidas a uma lise com moléculas anti-paralelas especificas de PRF1, mais particularmente, blocos de genes ou os correspondentes desemparelhados e células transfectadas com plasmidos de expressão foram preparadas por PRF1 marcado com HA recombinante. Analisaram-se os produtos da lise por análise de "Western blot" utilizando o anticorpo policlonal e os resultados estão ilustrados na Fig. 8A.

Tal como se pode inferir da Fig. 8A, as células PC-3 tratadas com o bloco de genes número 70043 (GB43, ver quadro 1) que é especifico para a sequência de ácidos nucleicos, tal como se descreveram aqui, mostra uma clara redução na proteina de PRF1 expressa em resultado do que a PI3-cinase ainda é amplamente expressa conforme ilustrado pelos anticorpos específicos de pllOcx e p85. Uma segunda molécula anti-paralela, designadamente GB44, também concebida contra PRF1, também levou a uma diminuição significativa da expressão da proteína de PRF1. Novamente, a molécula desemparelhada também como no caso do desemparelhamento com GB43, MM43, proteína de PRF1, foi significativamente expressa nas células. Os produtos da lise das células transfectadas com plasmidos de expressão para PRF1 marcado com HA recombinante mostram duas bandas, uma para PRF1 marcado com HA e a outra para PRF1 endógeno.

Estes resultados confirmam que o anticorpo policlonal exibe uma especificidade para PRF1 e é assim um instrumento 60 válido na monitorização da presença ou da ausência, respectivamente, de PRF1.

Exemplo 7: Imuno-coloração para PRF1 em tecido de tumor da próstata 0 anticorpo cuja geração e a caracterização estão descritas no exemplo 6 foi utilizado para corar tecido de tumor humano da próstata. Utilizando soro policlonal numa diluição de 1:1.000, a expressão de PRF1, ao nivel da proteina, pode ser claramente visualizada, conforme descrito na Fig. 8B, em que a fotografia do lado esquerdo mostra a coloração utilizando o anticorpo policlonal descrito no exemplo 6, enquanto a fotografia do lado direito mostra uma lâmina do tumor da próstata corado, utilizando um soro pré-imuni zado.

Exemplo 8: A expressão da proteina de PRF1 depende de vários elementos da via metabólica de PI3-cinase

Para demonstrar que PRF1 é um alvo a jusante da via metabólica de PI3-cinase e da via metabólica de HIFla, realizaram-se várias experiências nas quais se utilizaram compostos conhecidos por serem especificos para vários elementos das respectivas vias metabólicas e investigou-se o impacto desses compostos no nivel da proteina de PRF1. a) Impacto da actividade de PI3-cinase na expressão da proteina de PRF1

Para investigar se a actividade de PI3-cinase tem impacto na expressão da proteina de PRFl, trataram-se células PC-3 quer com LY294002 ou com DMSO como controlo. Realizou-se a análise por meio de uma análise de "Western Blot" 61 utilizando o anticorpo policlonal como meio de detecção da proteína de PRF1. Independentemente da proteína de PRFl, toda a expressão de Akt e de Akt fosforilada (P*Akt), foi monitorizada utilizando os respectivos anticorpos específicos. Adicionalmente, monitorizou-se a expressão de pllOa e de p85.

Os resultados estão ilustrados na Fig. 9A.

Passadas 72 e 96 h, respectivamente, a proteína de PRFl podia apenas ser detectada nas células tratadas com DMSO. Sob a influência de LY294002 a cascata que consistia em Akt e Akt fosforilada, respectivamente e proteína de PRFl, foi desregulada.

Utilizando os mesmos marcadores, as células foram então tratadas com uma molécula anti-paralela, nomeadamente, um GeneBloc (GB) designado por ρΙΙΟβ-GB 88 para inibir especificamente PI3-cinase.

Os resultados estão ilustrados na Fig. 9B.

Como se pode inferir da terceira e da quinta colunas, o GeneBloc contra a subunidade ρΙΙΟβ activa sob o ponto de vista catalítico, tinha um efeito similar ao já conhecido efeito do inibidor de PI3-cinase LY294002, confirmando que PRFl é um alvo a jusante de expressão da proteína, que é influenciado por PI3-cinase. Uma molécula anti-paralela dirigida contra pllOa ou uma molécula anti-paralela, desemparelhada ou DMSO não tiveram qualquer efeito na expressão de PRFl ao nível da proteína. b) Impacto de Akt e HIFla na expressão da proteína PRFl 62

Para investigar se a expressão de PRF1 ao nivel da proteina será dependente da actividade de Akt (PKB) e da actividade de HIFla, trataram-se células PC-3 com moléculas anti-paralelas especificas de Akt. Mais particularmente, duas moléculas anti-paralelas, designadas por moléculas de Aktl-GB e Akt2, foram utilizadas dando a mesma leitura, tal como a que se discutiu em relação à Fig. 9, em que, adicionalmente, a expressão da proteina de HIFla foi monitorizada utilizando um anticorpo policlonal purificado de proteina G disponível comercialmente (R&DSystems, Lot Number: IUG013071). 0 resultado está ilustrado na Fig. 10A. Tal como se pode inferir da figura Fig. 10A, 72 h após o tratamento com as moléculas anti-paralelas, as células tratadas com o GeneBloc de Akt2 e as células tratadas com o GeneBloc de Aktl em conjunto com o GeneBloc de Akt2 mostravam uma redução no nivel da proteina de PRF1 indicando que Aktl e Akt2, respectivamente, exibiam um certo efeito inibidor ao nivel da expressão da proteina de PRF1.

Realizou-se a mesma experiência utilizando os mesmos marcadores para monitorização excepto Akt e P*Akt sem o crescimento das células em condições hipóxicas, que foi realizado tratando as células com C0CI2. Utilizam-se duas formas diferentes de moléculas anti-paralelas, nomeadamente, HIFla-GB66 e HIFla-GB67 e utilizaram-se os respectivos desemparelhamentos como controlos. Os GeneBlocs reduziram significativamente a expressão de HIFla ao nivel da proteina que, por sua vez, reduziu a expressão da proteina de PRF1. Este resultado foi obtido 72 h após o tratamento com GeneBlocs e o tratamento com C0CI2 às 24 h. A partir deste resultado pode inferir-se que o nivel de proteina de PRF1 tanto é dependente da actividade de Akt como da HIFla, embora o impacto de HIFla na expressão de PRF1 ao 63 nível da proteína pareça ser mais pronunciado do que o de Akt. Estes resultados confirmam que PRF1 é um infector a jusante de PI3-cinase e da sinalização de HIFla. Estes dados sobre o desaparecimento da via metabólica sugerem que PRF1 é dependente da actividade de HIFla em condições hipóxicas de crescimento. Além disso, parece haver uma dependência adicional de Akt da expressão de PRF1, que parece não ser dependente de HIFla. Esta relação reguladora está ilustrada na Fig. 12.

Exemplo 9: Análise fenotipica das células comportando proteína HIFla e inibindo a proteína de PRF1 A finalidade da experiência subjacente para este exemplo consistiu em investigar a alterações fenotípicas das células que mostram uma inibição da expressão de HIFla e PRF1, respectivamente, ao nivel da proteína.

As células cresceram numa superfície de matrigel e foram tratadas com moléculas anti-paralelas (blocos de genes) e com os respectivos controlos e nas condições descritas nas experiências anteriores.

Os resultados estão ilustrados na Fig. 11A e na Fig. 11B, onde cada fila consiste numa parte da Fig. 11A e da Fig. 11B, que serão discutidas em conjunto. A Fig. 11A mostra uma sequência de fotografias de células em crescimento numa superfície de matrigel e tratadas com as respectivas moléculas anti-paralelas, enquanto a Fig. 11B mostra o resultado de uma análise de "Western Blot" realizada em células que foram obtidas a partir da superfície de matrigel. Uma coluna de manchas representa os produtos da lise de células das células ilustradas na fotografia correspondente. Como leitura, pllOa e p85 são exibidas como 64 controlo da carga e a componente da via metabólica de PI3-cinase investigada, isto é, Akt, monitorizada como P*Akt, HIFIoí e PRF1.

As células não tratadas mostram o modelo de crescimento de células normais de tumor no ensaio de matrigel. Observa-se um fenótipo semelhante quando um desemparelhamento da molécula anti-paralela dirigida contra ρΙΙΟβ é utilizado. Utilizando uma molécula anti-paralela dirigida contra PTEN, que por sua vez inibe PI3-cinase, mostra o fenótipo de uma linha de células que não é afectado por este repressor do tumor (Fig. 11A, primeira linha). Tal como se esperava, P*Akt é significativamente reduzida nestas condições e representa a leitura para a redução de expressão de ρΙΙΟβ funcional (Fig. 11B, primeira linha). Observa-se um fenótipo semelhante devido a perda de função tal como na redução da expressão de ρΙΙΟβ, quando se utilizam moléculas anti-paralelas contra HIFIoí com os desemparelhamentos não causando uma alteração no fenótipo (Fig. 11A, segunda linha). A análise por "Western Blot" confirmou isto e indica um nivel reduzido de proteína de HIFla para ambas as moléculas anti-paralelas específicas de HIFla (Fig. 11B, segunda linha). Finalmente, utilizando moléculas anti-paralelas específicas de PRF1 contra a mesma perda do fenótipo de função pode-se observar (figura 1 e 3, da terceira linha da Fig. 11A), simultaneamente com um decréscimo de expressão da proteína de PRF1, na análise de "Western Blot" (Fig. 11B, terceira linha).

Para resumir, estes resultados confirmam que PRF1 é também, ao nível da proteína, um infector a jusante, da sinalização de PI3-cinase. PRF1 é também dependente da actividade de HIFla em condições hipóxicas de crescimento. Além disso, parece haver uma dependência adicional de Akt da expressão de PRF1 que parece não ser dependente de HIFla. 65

Exemplo 10: Inibição do crescimento do tumor prostático por interferência especifica do ARN

Esta experiência é um exemplo de uma concepção com sucesso de ARN de interferência pequeno (ARNip), que permite que o fármaco alvo a jusante PRF1 seja dirigido especificamente. As moléculas de ARNip foram geradas pelo promotor (U6+2) da expressão induzida de sequências-alvo especificas.

Construção do plasmidos de expressão de ARNip

As cassetes do promotor pol III U6+2 foram geradas por RCP utilizando oligonucleótidos sintéticos e foram clonadas num sitio de restrição EcoRI/Xhol de um vector derivado de pUC. Esta inserção especifica de ARNip foi clonada utilizando uma enzima de restrição não palindrómica (BsmBI com uma ramificação em 5' TTTT, ramificação em 3' GGCA). As inserções foram geradas por enrolamento de dois oligonucleótidos sintéticos com as ramificações em 5' CCGT e em 3' AAAA. A cassete de expressão compreende o promotor, o ARNip a ser expresso e uma leitura de sequência terminadora no caso de ARNip especifico de PRF1, como se segue: 5' gaattcctatttcccatgattccttcatatttgcatatttttaaaatggactatcatatgc ttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatata tcttgggaaaggacgaaacacc gggagactagaggcaggagc aaaaaaaaaaa ctcctgcctctagtctccac tttttctcgag 3' (SEQ ID N°. 17) promotor sintético de U6+2 e ARNip especifico de PRF1 a negrito (EcoRI; Xhol) 66

Esta cassete de expressão pode, em princípio, ser clonada em qualquer vector de expressão. 0 desenho básico de uma estrutura de expressão de ARNip está também descrito na Fig. 6A. A partir dele pode-se inferir que os ARNips, tal como estão desenhados, formam um anel intracelular que é gerado pela extensão de poli-A. A Fig. 6B mostra as várias estruturas de ARNip utilizadas no presente exemplo, nomeadamente para pllO beta (SEQ ID N°. 14), pllO alfa (SEQ ID N°. 15) e para o ARNm de PRF1.

As várias estruturas de ARNip tal como as dirigidas a pllO alfa, pllO beta e PTEN, assim como, ARNip específico de PRF1, foram clonadas na mesma estrutura de vector. Transfectaram-se células PC-3 (1 x 106 células) com 6 pg dos plasmidos de expressão de ARNip respectivos ou um plasmido de expressão de EGFP utilizando Effectene™ (Qiagen, Hilden, Alemanha), de acordo com as instruções do fabricante, expressando ARNips com ρΙΙΟα, ρΙΙΟβ ou PRF1 ou expressando EGFP de comprimento completo que serviu como controlo para o crescimento do tumor das células PC-3 transfectadas estavelmente, que foram transfectadas. 48 horas após a transfecção das células, foram tripsinizadas e diluídas e novamente semeadas em pratos de 150 mm contendo 500 pg/mL de geneticina. O meio com 500 pg/mL de geneticina foi substituído diariamente e 7 dias após a transfecção substitui-se por um meio contendo 600 pg/mL de geneticina. Expandiram-se os aglomerados resistentes de células e colheram-se, determinou-se o número de células e preparou-se para uma experiência em animais tal como descrito.

Os resultados estão ilustrados na Fig. 6 na qual, mais particularmente na Fig. 6C, se mostra o volume dos tumores primários da próstata em mm3, 56 dias após a inoculação e na 67

Fig. 6D mostram-se os volumes das metástases totais dos nódulos linfáticos em mm3, 56 dias após a inoculação.

Pode inferir-se das referidas figuras que o crescimento do tumor prostático pode ser significativamente inibido por meio da administração de um ARNip especifico de PRF1. A extensão da inibição é assim semelhante a uma estrutura de ARNip dirigida a pllO beta. Contudo, dada a posição de pllO beta e PRF1, respectivamente, na via metabólica de Pi3-cinase, deve entender-se que ARNip especifico para PRF1 permite uma comunicação mais especifica e assim a modulação de uma parte ou de um ramo da via metabólica de PI3-cinase e dos processos a ela ligados, quando se comparam com uma comunicação com pllO beta. 0 mesmo também é verdadeiro no caso de se tomar em consideração as metástases totais dos nódulos linfáticos em que os efeitos efeitos são menos proeminentes.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

<110> atugen AG <120> Novo factor para as metástases e as respectivas utilizações

<130> A 19011 PCT <160> 17 <170> Patentln versão 3.1 <210> 1 68

<211> 232 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>

<221> CARACTERÍSTICAS VARIADAS <223> sequência de aminoácidos de NMF <4 0 0> 1

Met Pro Ser Leu Trp Asp Arg Fen Ser Ser Ser Ser Tre Ser Ser Ser 1 5 10 15 Pro Ser Ser Leu Pro Arg Tre Pro Tre Pro Asp Arg Pro Pro Arg Ser 20 25 30 Ala Trp Gli Ser Ala Tre Arg Glu Glu Gli Fen Asp Arg Ser Tre Ser 35 40 45 Leu Glu Ser Ser Asp Cis Glu Ser Leu Asp Ser Ser Asn Ser Gli Fen 50 55 60 Gli Pro Glu Glu Asp Tre Ala Tir Leu Asp Gli Vai Ser Leu Pro Asp 65 70 75 80 Fen Glu Leu Leu Ser Asp Pro Glu Asp Glu His Leu Cis Ala Asn Leu 85 90 95 Met Gin Leu Leu Gin Glu Ser Leu Ala Gin Ala Arg Leu Gli Ser Arg 100 105 110 Arg Pro Ala Arg Leu Leu Met Pro Ser Gin Leu Vai Ser Gin Vai Gli 115 120 125 Lis Glu Leu Leu Arg Leu Ala Tir Ser Glu Pro Cis Gli Leu Arg Gli 130 135 140 Ala Leu Leu Asp Vai Cis Vai Glu Gin Gli Lis Ser Cis His Ser Vai 69 145 160 150 155

Gli Gin Leu Ala Leu Asp Pro Ser Leu Vai Pro Tre Fen Gin Leu Tre 165 170 175 Leu Vai Leu Arg Leu Asp Ser Arg Leu Trp Pro Lis Ile Gin Gli Leu 180 185 190 Fen Ser Ser Ala Asn Ser Pro Fen Leu Pro Gli Fen Ser Gin Ser Leu 195 200 205 Tre Leu Ser Tre Gli Fen Arg Vai Ile Lis Lis Lis Leu Tir Ser Ser 210 215 220 Glu Gin Leu Leu Ile Glu Gin Cis 225 230 >210> 2 <211> 1.760 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 2 gcagcaggcc aagggggagg tgcgagcgtg gacctgggac gggtctgggc ggctctcggt 60 ggttggcacg ggttcgcaca cccattcaag cggcaggacg cacttgtctt agcagttctc 120 gctgaccgcg ctagctgcgg cttctacgct ccggcactct gagttcatca gcaaacgccc 180 tggcgtctgt cctcaccatg cctagccttt gggaccgctt ctcgtcgtcg tccacctcct 240 cttcgccctc gtccttgccc cgaactccca ccccagatcg gccgccgcgc tcagcctggg 300 ggtcggcgac ccgggaggag gggtttgacc gctccacgag cctggagagc tcggactgcg 360 agtccctgga cagcagcaac agtggcttcg ggccggagga agacacggct tacctggatg 420 gggtgtcgtt gcccgacttc gagctgctca gtgaccctga ggatgaacac ttgtgtgcca 480 acctgatgca gctgctgcag gagagcctgg cccaggcgcg gctgggctct cgacgccctg 540 cgcgcctgct gatgcctagc cagttggtaa gccaggtggg caaagaacta ctgcgcctgg 600 cctacagcga gccgtgcggc ctgcgggggg cgctgctgga cgtctgcgtg gagcagggca 660 agagctgcca cagcgtgggc cagcaggcac tcgaccccag cctggtgccc accttccagc 720 tgaccctcgt gctgcgcctg gactcacgac tctggcccaa gatacagggg ctgtttagct 780 ccgccaactc tcccttcctc cctggcttca gccagtccct gacgctgagc actggcttca 840 gagtcatcaa gaagaagctg tacagctcgg aacagctgct cattgaggag tgttgaactt 900 caacctgagg gggccgacag tgccctccaa gacagagacg actgaacttt tggggtggag 960 actagaggca gggtctgagg gactgattcc agtggttgga aaactgaggc agccacctaa 1020 70 gttggaggtg gcattgggga ggcttccagc agtggtgtga ggaagaggca ggggtttgtg ttgtttttct tgaatgtaag aaattacacc gcaggggagg gtcttccatc atgttcaagt aacaaaaaaa ggggaatagt cacatacccc tggatgtgtg catccagaga cgtgctcctc tatcttactg gatcggagca agtaggaagg tgacagctgc gtctgagagg tagaactgtt attaagacct aaaaaaaaaa gtttcccagg tcagtactgt tgtagcatgt gcagctgggc agagcagccg gtctgaaggg tcactactga ggtgggtgtc gtttaagcct gtgggggctg tacatgaaga atgcaatatt aagctcattg agcatggaac accttattat tgctcccgcc gagggagggg accaagtgtg cctgttgtag agggatcact tcccccatcg gaacccctcc taagatactc ttttactttt agttgtgttc aaaggcttag ttttgttact ccagcctggc ggaggtcgga tttgttgttt gcagctatct tgggatcttt tgtactgcag ccgggaggag actgttaatg ctaataaaca gggtggctgt gggccaacaa gacagttaac ccagggtgaa ggtcgtggag gttttgtatc tacagacgca gacacttgaa agttgagctg tgccatctgg aatacacttg tgtttgttaa 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1760

<210> 3 <211> 699 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 3 atgcctagcc tttgggaccg cttctcgtcg tcgtccacct cctcttcgcc ctcgtccttg 60 ccccgaactc ccaccccaga tcggccgccg cgctcagcct gggggtcggc gaccctggag 120 gaggggtttg accgctccac gagcctggag agctcggact gcgagtccct ggacagcagc 180 aacagtggct tcgggccgga ggaagacacg gcttacctgg atggggtgtc gttgcccgac 240 ttcgagctgc tcagtgaccc tgaggatgaa cacttgtgtg ccaacctgat gcagctgctg 300 caggagagcc tggcccaggc gcggctgggc tctcgacgcc ctgcgcgcct gctgatgcct 360 agccagttgg taagccaggt gggcaaagaa ctactgcgcc tggcctacag cgagccgtgc 420 ggcctgcggg gggcgctgct ggacatctgc gtggagcagg gcaagagctg ccacagcgtg 460 ggccagctgg cactcgacce cagcctggtg cccaccttcc agctgaccct cgtgctgcgc 540 ctggactcac gactctggcc caagatccag gggctgttta gctccgccaaa ctctcccttc 600 ctccctggct tcagccagtc cctgacgctg agcactggct tccgagtcat caagaagaag 660 ctgtacagct cggaacagct gctcattgag gagtgttga 699

<210> 4 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência Artificial 71 <22 0> <223> oligonucleótido anti-paralelo <22 0> <221> características variadas <222> (D · · (6) <223> ARN <22 0> <221> características variadas <222> (7) .. (15) <223> ADN ligado através de ligações de fosforotioato <22 0> <221> características variadas <222> (16) . . (21) <223> ARN <4 0 0> 4 gcucaactct gcagtacacg a 21

<210> 5 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> oligonucleótido anti-paralelo <22 0> <221> características variadas <222> (1) . . (6) <223> ARN <22 0> 72 <221> características variadas <222> (7)..(15) <223> ADN ligado através de ligações de fosforotioato <22 0> <221> caracteristicas variadas <222> (16)..(21)

<223> ARN <400> 5 cuugguccct tcagaccagu a 21

<210> 6 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> oligonucleótido anti-paralelo <22 0> <221> caracteristicas variadas <222> (1) . . (6)

<223> ARN <22 0> <221> caracteristicas variadas <222> (7)..(15) <223> ADN ligado através de ligações de fosforotioato <22 0> <221> caracteristicas variadas <222> (16) . . (21)

<223> ARN 73 <4Ο0> 6 caguuutcca accacuggaa u 21 <210> 7 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> oligonucleótido anti-paralelo <22 0> <221> caracteristicas variadas <222> (D · · (6) <223> ARN <22 0> <221> caracteristicas variadas <222> (7)..(15) <223> ADN ligado através de ligações de fosforotioato <22 0> <221> caracteristicas variadas <222> (16) . . (21) <223> ARN <4 0 0> 7 cccaaaagtt cagtcgucuc u 21 <210> 8 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> 74 <223> oligonucleótido anti-paralelo <22 0> <221> características variadas <222> (1) . . (6)

<223> ARN <22 0> <221> características variadas <222> (7) .. (15) <223> ADN ligado através de ligações de fosforotioato <22 0> <221> características variadas <222> (16) . . (21)

<223> ARN <400> 8 gcuccugcct ctagtcucca c 21

<210> 9 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> oligonucleótido anti-paralelo <22 0> <221> características variadas <222> (1) .. (6)

<223> ARN <22 0> 75 <221> características variadas <222> (7)..(15) <223> ADN ligado através de ligações de fosforotioato <22 0> <221> caracteristicas variadas <222> (16) . . (21) <223> ARN <400> 9 guguucatcc tcagggucau c 21 <210> 10 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> oligonucleótido anti-paralelo <22 0> <221> caracteristicas variadas <222> (D · · (6) <223> ARN <22 0> <221> caracteristicas variadas <222> (7)..(15) <223> ADN ligado através de ligações de fosforotioato <22 0> <221> caracteristicas variadas <222> (16) . . (21)

<223> ARN 76 <4 Ο 0> 10 ggucagtagt gatgcuccga u 21 <210> 11 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> oligonucleótido anti-paralelo <22 0> <221> caracteristicas variadas <222> (D · · (6) <223> ARN <22 0> <221> caracteristicas variadas <222> (7)..(15) <223> ADN ligado através de ligações de fosforotioato <22 0> <221> caracteristicas variadas <222> (16) . . (21) <223> ARN <4 0 0> 11 cuuaccaact ggctaggcau c 21 <210> 12 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> 77 <223> oligonucleótido anti-paralelo <22 0> <221> caracteristicas variadas <222> (1) . . (6)

<223> ARN <22 0> <221> caracteristicas variadas <222> (7) .. (15) <223> ADN ligado através de ligações de fosforotioato <22 0> <221> caracteristicas variadas <222> (16) . . (21) <223> ARN <4 0 0> 12 ccgaaaagaa cagtgcucuc u 21 <210> 13 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> oligonucleótido anti-paralelo <22 0> <221> caracteristicas variadas <222> (D · · (6) <223> ARN <22 0> <221> caracteristicas variadas 78 <222> (7)..(15) <223> ADN ligado através de ligações de fosforotioato <22 0> <221> caracteristicas variadas <222> (16)..(21)

<223> ARN <4 0 0> 13 gcucguccct gtagtgucca c 21

<210> 14 <211> 54 <212> ARN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> ARNip <4 0 0> 14 gggaaugaac cacuggaaua gaaaaaaaaa aaaagcuucc agugguucau uccc 54

<210> 15 <211> 54 <212> ARN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> ARNip <4 0 0> 15 acugagcaag aggcuuugga gaaaaaaaaa aaacuccaaa gccucuugcu cagu 54 <210> 16 <211> 54 79 <212> ARN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> ARNip <4 0 0> 16 guggagacua gaggcaggag caaaaaaaaa aaagcuccug ccucuagucu ccac 54 <210> 17 <211> 187

<212> ADN <213> Artificial <4 0 0> 17 gaattcctat cttaccgtaa acaccgggag tctcgag ttcccatgat cttgaaagta actagaggca tccttcatat tttcgatttc ggagcaaaaa ttgcatattt ttaaaatgga ctatcatatg 60 ttggctttat atatcttggg aaaggacgaa 120 aaaaaactcc tgcctctagt ctccactttt 180 187

Lisboa, 27 de Março de 2009 80

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Utilização, in vitro, de um factor do tipo de polipéptido ou de um seu fragmento, em que o fragmento tem os efeitos do factor do tipo de polipéptido em termos de cicatrização de feridas, crescimento de tumores, formação de tumores, metástases, migração de células, motilidade de células em matrizes extracelulares e crescimento de células em matrizes extracelulares, caracterizada pelo facto de o factor a) compreender uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID n°. 1; b) ter uma sequência de aminoácidos de acordo com as entradas do banco de dados gi 9506687 ou NP_0 61931.1; c) ser codificado por um ácido nucleico em que ca) o ácido nucleico compreende i) um ácido nucleico de acordo com a SEQ ID N° . 2 ou a SEQ ID N°. 3; ou ii) uma sequência de ácidos nucleicos de acordo com as entradas do banco de dados gi 9506686 ou NM_019058.1; cb) o ácido nucleico codifica para o factor tanto para a alínea a) como para a alínea b) e em que o ácido nucleico vai hibridar excepto para a degenerescência do código genético, com um ácido nucleico de acordo com a alínea ca); ou 1 cc) o ácido nucleico codifica para o factor tal como os da alinea a) ou da alínea b) e em que o ácido nucleico híbrida em condições severas com um ácido nucleico que é complementar do ácido nucleico de acordo com ca); como um alvo a jusante ou um marcador a jusante da via metabólica de Pl3-cinase, preferencialmente, como um fármaco alvo a jusante da via metabólica de Pl3-cinase, no rastreio de um fármaco, na concepção de um fármaco e no desenvolvimento de um fármaco, em que esse fármaco é útil para curar feridas, inibir o crescimento de tumores, a formação de tumores, as metástases, a migração de células, a motilidade de células em matrizes extracelulares e o crescimento de células em matrizes extracelulares.
2. Utilização, in vitro, de um factor do tipo de polipéptido, caracterizado pelo facto de a) compreender uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID n°. 1; b) ter uma sequência de aminoácidos de acordo com as entradas do banco de dados gi 9506687 ou NP_0 61931.1; c) ser codificado por um ácido nucleico em que ca) o ácido nucleico compreende i) um ácido nucleico de acordo com a SEQ ID N°. 2 ou a SEQ ID N°. 3; ou 2 ii) uma sequência de ácidos nucleicos de acordo com as entradas do banco de dados gi 9506686 ou NM_019058.1; cb) o ácido nucleico codifica para o factor tal como o de a) ou de b) e em que o ácido nucleico vai hibridir excepto para a degenerescência do código genético, com um ácido nucleico de acordo com ca); ou o ácido nucleico codifica para o factor tal como os de a) ou de b) e em que o ácido nucleico híbrida em condições severas com um ácido nucleico que é complementar do ácido nucleico de acordo com ca); como um marcador para um processo em que o processo é um processo é regulado pela via metabólica de Pl3-cinase, em que o processo se selecciona no grupo que consiste em cura de feridas, metástases, migração de células, motilidade de células em matrizes extracelulares e crescimento de células em matrizes extracelulares.
3. Utilização de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo facto de o factor ser um marcador para células transformadas, preferencialmente, para células invasivas.
4. Utilização de um factor do tipo de polipéptido ou de um seu fragmento, em que o fragmento tem os efeitos do factor do tipo de polipéptido em termos de cicatrização de feridas, crescimento de tumores, formação de tumores, metástases, migração de células, motilidade de células em matrizes extracelulares e crescimento de células em 3 matrizes extracelulares, em que o factor se caracteriza pelo facto de a) compreender uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID n°. 1 ; b) ter uma sequência de aminoácidos de acordo com as entradas do banco de dados gi 9506687 ou NP_0 61931.1; c) ser codificado por um ácido nucleico em que ca) o ácido nucleico compreende i) um ácido nucleico de acordo com a SEQ ID N° . 2 ou a SEQ ID N°. 3; ou ii) uma sequência de ácidos nucleicos de acordo com as entradas do banco de dados gi 9506686 ou NM_019058.1; cb) o ácido nucleico codifica para o factor tal como para o de a) ou de b) e em que o ácido nucleico vai hibridar excepto para a degenerescência do código genético, com um ácido nucleico de acordo com ca); ou cc) o ácido nucleico codifica para factores tais como os de a) ou de b) e em que o ácido nucleico híbrida em condições severas com um ácido nucleico que é complementar do ácido nucleico de acordo com ca); 4 para o fabrico de um medicamento para o tratamento e/ou a prevenção de uma doença, em que a doença se selecciona no grupo que consiste em tumores em estádios terminais, cancros com metástases e quaisquer estados clínicos patológicos que envolvam a via metabólica de Pl3-cinase, em que essas condições se seleccionam no grupo que consiste em carcinomas colorectais, gliomas, cancros do endométrio, adenocarcinomas, hiperplasias do endométrio, síndroma de Cowden, cancro da mama-ovário, cancro da próstata, síndroma de Bannayan-Zonana, LDD (síndroma de Lhermitte-Duclos), doenças de macrocefalia de hamartomas incluindo doença de Cowden (DC) e síndroma de Bannayan-Ruvacaba-Riley (BRR), triquilemomas, hamartomas gastrointestinais, lipomas, adenomas da tiróide, doenças fibroquísticas da mama, gangliocitomas cerebrais displásicos e malignidades da mama e da tiróide, ou em que o medicamento é utilizado para a cura de feridas.
5. Utilização de um factor do tipo de polipéptido ou de um seu fragmento, em que o fragmento tem os efeitos do factor do tipo de polipéptido em termos de cicatrização de feridas, crescimento de tumores, formação de tumores, metástases, migração de células, motilidade de células em matrizes extracelulares e crescimento de células em matrizes extracelulares, em que o factor se caracteriza pelo facto de a) compreender uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID n°. 1; 5 b) ter uma sequência de aminoácidos de acordo com as entradas do banco de dados gi 9506687 ou NP_0 61931.1; c) ser codificado por um ácido nucleico em que ca) o ácido nucleico compreende i) um ácido nucleico de acordo com a SEQ ID N° . 2 ou a SEQ ID N°. 3; ou ii) uma sequência de ácidos nucleicos de acordo com as entradas do banco de dados gi 9506686 ou NM_019058.1; cb) o ácido nucleico codifica para o factor tal como o de a) ou de b) e em que o ácido nucleico vai hibridar, excepto para a degenerescência do código genético, com um ácido nucleico de acordo com ca); ou cc) o ácido nucleico codifica para o factor tal como os de a) ou de b) e em que o ácido nucleico híbrida em condições severas com um ácido nucleico que é complementar do ácido nucleico de acordo com ca); para o fabrico de um agente de diagnóstico para o diagnóstico de uma doença, em que a doença se selecciona no grupo que consiste em tumores em estados terminais, cancros com metástases e quaisquer estados clínicos patológicos que envolvam a via metabólica de Pl3-cinase, em que essas condições se seleccionam no grupo que consiste em carcinomas colorectais, gliomas, cancros do 6 endométrio, adenocarcinomas, hiperplasias do endométrio, síndroma de Cowden, cancro da mama-ovário, cancro da próstata, síndroma de Bannayan-Zonana, LDD (síndroma de Lhermitte-Duclos) , doenças de macrocefalia de hamartomas incluindo doença de Cowden (DC) e síndroma de Bannayan-Ruvacaba-Riley (BRR), triquilemomas, hamartomas gastrointestinais, lipomas, adenomas da tiróide, doenças fibroquísticas da mama, gangliocitomas cerebrais displásicos e malignidades da mama e da tiróide, ou em que o agente de diagnóstico é utilizado para cura de feridas.
6. Utilização de um ácido nucleico, caracterizada pelo facto de esse ácido nucleico ser a) um ácido nucleico que codifica para um factor ou um seu fragmento, em que o factor é i) um polipéptido que compreende um aminoácido de acordo com a SEQ ID N°. 1; ou ii) um polipéptido com uma sequência de acordo com as entradas do banco de dados gi 9506687 ou NP_0 61931.1; b) um ácido nucleico que codifica para um factor de acordo com a alínea a) , em que o ácido nucleico compreende i) um ácido nucleico de acordo com a SEQ ID N°. 2 ou a SEQ ID N°. 3; ou 7 ii) uma sequência de ácidos nucleicos de acordo com as entradas do banco de dados gi 9506686 ou NM_019058.1; c) um ácido nucleico que codifica para o factor tal como o de a), em que o ácido nucleico irá hibridar, excepto para a degenerescência do código genético, com um ácido nucleico de acordo com b); ou d) um ácido nucleico que codifica para o factor tal como definido na alínea a), em que o ácido nucleico hibrida em condições severas com um ácido nucleico que é complementar do ácido nucleico de acordo com b) ; para o fabrico de um medicamento para o tratamento e/ou a prevenção de uma doença, em que o fragmento tem os efeitos do factor do tipo de polipéptido em termos de cura de feridas, crescimento de tumores, formação de tumores, metástases, migração de células, motilidade de células em matrizes extracelulares e crescimento de células em matrizes extracelulares, em que a doença se selecciona no grupo que consiste em tumores em estados terminais, cancros com metástases e quaisquer estados clínicos patológicos que envolvam a via metabólica de Pl3-cinase, em que essas condições se seleccionam no grupo que consiste em carcinomas colorectais, gliomas, cancros do endométrio, adenocarcinomas, hiperplasias do endométrio, sindroma de Cowden, cancro da mama-ovário, cancro da próstata, sindroma de Bannayan-Zonana, LDD (sindroma de Lhermitte-Duclos), doenças de macrocefalia de hamartomas incluindo doença de Cowden (DC) e sindroma de Bannayan-Ruvacaba-Riley (BRR), hamartomas gastrointestinais, lipomas, adenomas da tiróide, doenças fibroquísticas da mama, gangliocitomas cerebrais displásicos e malignidades da mama e da tiróide, ou em que o medicamento é utilizado para a cura de feridas.
7. Utilização de um ácido nucleico, em que esse ácido nucleico é a) um ácido nucleico que codifica para um factor ou um seu fragmento, em que o factor é i) um polipéptido que compreende um aminoácido de acordo com a SEQ ID N°. 1; ou ii) um polipéptido com uma sequência de acordo com as entradas do banco de dados gi 9506687 ou NP_061931.1; b) um ácido nucleico que codifica para um factor de acordo com a), em que o ácido nucleico compreende i) um ácido nucleico de acordo com a SEQ ID N°. 2 ou a SEQ ID N°. 3; ou ii) uma sequência de ácidos nucleicos de acordo com as entradas do banco de dados gi 9506686 ou NM_019058.1; c) um ácido nucleico que codifica para o factor tal como o de a), em que o ácido nucleico irá hibridar, excepto para a degenerescência do código genético, com um ácido nucleico de acordo com b); ou 9 d) um ácido nucleico que codifica para um factor tal como em a), em que o ácido nucleico híbrida, em condições severas, com um ácido nucleico que é complementar do ácido nucleico de acordo com b); caracterizada pelo facto de se destinar ao fabrico de um agente de diagnóstico para o diagnóstico de uma doença, em que o fragmento tem os efeitos do factor do tipo de polipéptido em termos de cura de feridas, crescimento do tumor, formação do tumor, metástases, migração de células, motilidade de células em matrizes extracelulares e crescimento de células em matrizes extracelulares, em que a doença se selecciona no grupo que consiste em tumores em estádios terminais, cancros com metástases e quaisquer estados clínicos patológicos que envolvam a via metabólica de Pl3-cinase, em que essas condições se seleccionam no grupo que consiste em carcinomas colorectais, gliomas, cancros do endométrio, adenocarcinomas, hiperplasias do endométrio, síndroma de Cowden, cancro da mama-ovário, cancro da próstata, síndroma de Bannayan-Zonana, LDD (síndroma de Lhermitte-Duclos), doenças de macrocefalia de hamartomas incluindo doença de Cowden (DC) e síndroma de Bannayan-Ruvacaba-Riley (BRR), lesões muco-cutâneas, tais como triquilemomas, hamartomas gastrointestinais, lipomas, adenomas da tiróide, doenças fibroquísticas da mama, gangliocitomas cerebrais displásicos e malignidades da mama e da tiróide, ou em que o agente de diagnóstico é utilizado para a cura de feridas. 10
8. Utilização de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 e 3 a 7, em que a doença é caracterizada pelo facto de as células estarem envolvidas na referida doença de falta de actividade de PTEN ou mostrarem uma hiperactivação da via metabólica de Pl3-cinase ou mostrarem um comportamento mais agressivo ou serem células de tumor, preferencialmente células de um tumor em estado terminal.
9. Utilização, in vitro, de um factor do tipo de polipéptido ou de um seu fragmento, caracterizada pelo facto de o factor a) compreender uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID n°. 1; b) ter uma sequência de aminoácidos de acordo com as entradas do banco de dados gi 9506687 ou NP_0 61931.1; c) ser codificado por um ácido nucleico em que ca) o ácido nucleico compreende i) um ácido nucleico de acordo com a SEQ ID N° . 2 ou a SEQ ID N°. 3; ou ii) uma sequência de ácidos nucleicos de acordo com as entradas do banco de dados gi 9506686 ou NM_019058.1; cb) o ácido nucleico codifica para o factor tal como para a) ou para b) e em que o ácido nucleico vai hibridar, excepto para a 11 degenerescência do código genético, com um ácido nucleico de acordo com ca); ou cc) o ácido nucleico codifica para factores tais como os de a) ou b) e em que o ácido nucleico híbrida em condições severas com um ácido nucleico que é complementar do ácido nucleico de acordo com ca); como uma molécula alvo para o desenvolvimento de um medicamento para o tratamento e/ou a prevenção de uma doença, em que o fragmento tem os efeitos do factor do tipo de polipéptido em termos de cura de feridas, crescimento do tumor, formação do tumor, metástases, migração de células, motilidade de células em matrizes extracelulares e crescimento de células em matrizes extracelulares, em que a doença se selecciona no grupo que consiste em tumores em estados terminais, cancros com metástases e quaisquer estados clínicos patológicos que envolvam a via metabólica de Pl3-cinase, em que essas condições se seleccionam no grupo que consiste em carcinomas colorectais, gliomas, cancros do endométrio, adenocarcinomas, hiperplasias do endométrio, síndroma de Cowden, cancro da mama-ovário, cancro da próstata, síndroma de Bannayan-Zonana, LDD (síndroma de Lhermitte-Duclos), doenças de macrocefalia de hamartomas incluindo doença de Cowden (DC) e síndroma de Bannayan-Ruvacaba-Riley (BRR), triquilemomas, hamartomas gastrointestinais, lipomas, adenomas da tiróide, doenças fibroquísticas da mama, gangliocitomas cerebrais displásicos e malignidades da mama e da tiróide, ou em que o medicamento é utilizado para a cura de feridas. 12
10. Utilização, in vitro, de um factor do tipo de polipéptido ou de um seu fragmento, caracterizada pelo facto de o factor a) compreender uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID n°. 1; b) ter uma sequência de aminoácidos de acordo com as entradas do banco de dados gi 9506687 ou NP_0 61931.1; c) ser codificado por um ácido nucleico em que ca) o ácido nucleico compreende i) um ácido nucleico de acordo com a SEQ ID N°. 2 ou a SEQ ID N°. 3; ou ii) uma sequência de ácidos nucleicos de acordo com as entradas do banco de dados gi 9506686 ou NM_019058.1; cb) o ácido nucleico codifica para o factor tal como para a) ou para b) e em que o ácido nucleico vai hibridar, excepto para a degenerescência do código genético, com um ácido nucleico de acordo com ca); ou cc) o ácido nucleico codifica para factores tais como os de a) ou de b) e em que o ácido nucleico híbrida, em condições severas, com um ácido nucleico que é complementar do ácido nucleico de acordo com ca); como uma molécula alvo para o desenvolvimento de um agente de diagnóstico para o diagnóstico de uma doença, 13 em que o fragmento ou derivado tem os efeitos do factor do tipo polipéptido em termos de cura de feridas, crescimento de tumores, formação de tumores, metástases, migração de células, motilidade celular em matriz extracelular e crescimento de células em matriz extracelular, em que a doença se selecciona no grupo que consiste em tumores em estados terminais, cancros com metástases e quaisquer estados clínicos patológicos que envolvam a via metabólica de Pl3-cinase, em que essas condições se seleccionam no grupo que consiste em carcinomas colorectais, gliomas, cancros do endométrio, adenocarcinomas, hiperplasias do endométrio, síndroma de Cowden, cancro da mama-ovário, cancro da próstata, síndroma de Bannayan-Zonana, LDD (síndroma de Lhermitte-Duclos) , doenças de macrocefalia de hamartomas incluindo doença de Cowden (DC) e síndroma de Bannayan-Ruvacaba-Riley (BRR), triquilemomas, hamartomas gastrointestinais, lipomas, adenomas da tiróide, doenças fibroquísticas da mama, gangliocitomas cerebrais displásicos e malignidades da mama e da tiróide, ou em que o agente de diagnóstico é utilizado para cura de feridas.
11. Utilização de um ácido nucleico, caracterizado pelo facto de esse ácido nucleico ser a) um ácido nucleico que codifica para um factor ou um seu fragmento, em que o factor é i) um polipéptido que compreende um aminoácido de acordo com a SEQ ID N°. 1; ou 14 ii) um polipéptido com uma sequência de acordo com as entradas do banco de dados gi 9506687 ou NP_0 61931.1; b) um ácido nucleico que codifica para um factor de acordo com a), em que o ácido nucleico compreende i) um ácido nucleico de acordo com a SEQ ID N°. 2 ou a SEQ ID N°. 3; ou ii) uma sequência de ácidos nucleicos de acordo com as entradas do banco de dados gi 9506686 ou NM_019058.1; c) um ácido nucleico que codifica para o factor tal como o de a), em que o ácido nucleico irá hibridar, excepto para a degenerescência do código genético, com um ácido nucleico de acordo com b); ou d) um ácido nucleico que codifica para o factor tal como o de a) , em que o ácido nucleico híbrida em condições severas com um ácido nucleico que é complementar do ácido nucleico de acordo com b); como uma molécula alvo para o desenvolvimento de um medicamento para o tratamento e/ou a prevenção de uma doença, em que o fragmento tem os efeitos do factor do tipo de polipéptido em termos de cura de feridas, crescimento de tumor, formação de tumor, metástases, migração de células, motilidade de células em matrizes extracelulares e crescimento de células em matrizes extracelulares, em que a doença se selecciona no grupo que consiste em tumores em estados terminais, cancros com metástases e 15 quaisquer estados clínicos patológicos que envolvam a via metabólica de Pl3-cinase, em que essas condições se seleccionam no grupo que consiste em carcinomas colorectais, gliomas, cancros do endométrio, adenocarcinomas, hiperplasias do endométrio, síndroma de Cowden, cancro da mama-ovário, cancro da próstata, síndroma de Bannayan-Zonana, LDD (síndroma de Lhermitte-Duclos), doenças de macrocefalia de hamartomas incluindo doença de Cowden (DC) e síndroma de Bannayan-Ruvacaba-Riley (BRR), triquilemomas, hamartomas gastrointestinais, lipomas, adenomas da tiróide, doenças fibroquísticas da mama, gangliocitomas cerebrais displásicos e malignidades da mama e da tiróide, ou em que o medicamento é utilizado para a cura de feridas.
12. Utilização de um ácido nucleico, in vivo, caracterizada pelo facto de esse ácido nucleico ser a) um ácido nucleico que codifica para um factor ou um seu fragmento, em que o factor é i) um polipéptido que compreende um aminoácido de acordo com a SEQ ID N°. 1; ou ii) um polipéptido com uma sequência de acordo com as entradas do banco de dados gi 9506687 ou NP_0 61931.1; b) um ácido nucleico que codifica para um factor de acordo com a), em que o ácido nucleico compreende i) um ácido nucleico de acordo com a SEQ ID N°. 2 ou a SEQ ID N°. 3; ou 16 ii) uma sequência de ácidos nucleicos de acordo com as entradas do banco de dados gi 9506686 ou NM_019058.1; c) um ácido nucleico que codifica para um factor tal como em a), em que o ácido nucleico irá hibridar, excepto para a degenerescência do código genético, com um ácido nucleico de acordo com b); ou d) um ácido nucleico que codifica para um factor tal como o de a) , em que o ácido nucleico hibrida em condições severas com um ácido nucleico que é complementar do ácido nucleico de acordo com b); como uma molécula alvo para o desenvolvimento de um agente de diagnóstico para o diagnóstico de uma doença, em que o fragmento tem os efeitos do factor do tipo de polipéptido em termos de cura de feridas, crescimento de tumores, formação de tumores, metástases, migração de células, motilidade de células em matrizes extra-celulares e crescimento de células em matrizes extracelulares, em que a doença se selecciona no grupo que consiste em tumores em estados terminais, cancros com metástases e quaisquer estados clínicos patológicos que envolvam a via metabólica de Pl3-cinase, em que essas condições se seleccionam no grupo que consiste em carcinomas colorectais, gliomas, cancros do endométrio, adenocarcinomas, hiperplasias do endométrio, síndroma de Cowden, cancro da mama-ovário, cancro da próstata, síndroma de Bannayan-Zonana, LDD (síndroma de Lhermitte-Duclos), doenças de macrocefalia de hamartomas incluindo doença de Cowden (DC) e síndroma de Bannayan-Ruvacaba-Riley (BRR), triquilemomas, hamartomas gastrointestinais, lipomas, adenomas da tiróide, doenças 17 fibroquísticas da mama, gangliocitomas cerebrais displásicos e malignidades da mama e da tiróide, ou em que o agente de diagnóstico é utilizado para cura de feridas.
13. Utilização de acordo com uma qualquer das reivindicações 9 a 12, caracterizada pelo facto de o medicamento e/ou o agente de diagnóstico compreender um agente que se selecciona no grupo que consiste em anticorpos, péptidos de ligação de elevada afinidade, anti-calinas, moléculas anti-paralelas, aptâmeros, spiegelmeres e moléculas de ARNi .
14. Utilização de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo facto de o agente interagir com um factor ou um seu fragmento, tal como definido na reivindicação 1.
15. Utilização de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo facto de o agente interagir com o ácido nucleico, tal como definido na reivindicação 6, em particular, com ARNm, ácido nucleico genómico ou ADNc que codifica para o factor do tipo de polipéptido, tal como definido na reivindicação 1.
16. Utilização de um anticorpo ou de parte dele, que interage com o factor do tipo polipéptido ou um seu fragmento, tal como definido na reivindicação 1, para o desenvolvimento ou o fabrico de um medicamento para o tratamento e/ou a prevenção de uma doença e/ou para o fabrico de um agente de diagnóstico para o diagnóstico de uma doença, em que a doença se selecciona no grupo que consiste em tumores em estado terminal, cancros com metástases e 18 quaisquer estados clínicos patológicos que envolvam uma via metabólica de Pl3-cinase, em que esses estados clínicos se seleccionam no grupo que consiste em carcinomas colorectais, gliomas, cancros do endométrio, adenocarcinomas, hiperplasias do endométrio, síndroma de Cowden, cancro da mama-ovário, cancro da próstata, síndroma de Bannayan-Zonana, LDD (síndroma de Lhermitte-Duclos), doenças de macrocefalia de hamartomas incluindo doença de Cowden (DC) e síndroma de Bannayan-Ruvacaba-Riley (BRR), triquilemomas, hamartomas gastrointestinais, lipomas, adenomas da tiróide, doenças fibroquísticas da mama, gangliocitomas cerebrais displásicos e malignidades da mama e da tiróide, ou em que o medicamento e/ou o agente de diagnóstico é utilizado para cura de feridas.
17. Utilização de um aptâmero ou spigelmer, que interage com o factor do tipo polipéptido ou um seu fragmento, tal como definido na reivindicação 1, para o desenvolvimento ou o fabrico de um agente de diagnóstico para o diagnóstico de uma doença em que a doença se selecciona no grupo que consiste em tumores em estado terminal, cancros com metástases e quaisquer estados clínicos patológicos que envolvam uma via metabólica de Pl3-cinase, em que esses estados clínicos se seleccionam no grupo que consiste em carcinomas colorectais, gliomas, cancros do endométrio, adenocarcinomas, hiperplasias do endométrio, síndroma de Cowden, cancro da mama-ovário, cancro da próstata, síndroma de Bannayan-Zonana, LDD (síndroma de Lhermitte-Duclos) , doenças de macrocefalia de hamartomas incluindo doença de Cowden (DC) e síndroma de Bannayan-Ruvacaba-Riley (BRR), triquilemomas, hamartomas gastrointestinais, lipomas, adenomas da 19 tiróide, doenças fibroquísticas da mama, gangliocitomas cerebrais displásicos e malignidades da mama e da tiróide, ou em que o agente de diagnóstico é utilizado para a cura de feridas.
18. Utilização de um ácido nucleico, que interage com o ácido nucleico que codifica para o factor do tipo polipéptido ou um seu fragmento, tal como definido na reivindicação 1, para o desenvolvimento ou o fabrico de um medicamento para o tratamento e/ou a prevenção de uma doença e/ou para o fabrico de um agente de diagnóstico para o diagnóstico de uma doença, em que a doença se selecciona no grupo que consiste em tumores em estado terminal, cancros com metástases e quaisquer estados clínicos patológicos que envolvam a via metabólica de Pl3-cinase, em que esses estados clínicos se seleccionam no grupo que consiste em carcinomas colorectais, gliomas, cancros do endométrio, adenocarcinomas, hiperplasias do endométrio, síndroma de Cowden, cancro da mama-ovário, cancro da próstata, síndroma de Bannayan-Zonana, LDD (síndroma de Lhermitte-Duclos) , doenças de macrocefalia de hamartomas incluindo doença de Cowden (DC) e síndroma de Bannayan-Ruvacaba-Riley (BRR), triquilemomas, hamartomas gastrointestinais, lipomas, adenomas da tiróide, doenças fibroquísticas da mama, gangliocitomas cerebrais displásicos e malignidades da mama e da tiróide, ou em que o medicamento e/ou o agente de diagnóstico é utilizado para cura de feridas, em que o ácido nucleico que interage é um oligonucleótido anti-paralelo, uma ribozima e /ou um ARNsi. 20
19. Utilização de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo facto do ácido nucleico que codifica para o factor do tipo de polipéptido ou para uma parte dele ser ADNc, ARNm ou ARNnh.
20. Utilização de um kit para a caracterização de uma doença ou de um estado clinico que se selecciona no grupo que consiste em tumores em estado terminal, cancros com metástases e quaisquer estados clínicos patológicos que envolvam a via metabólica de Pl3-cinase, em que esses estados clínicos se seleccionam no grupo que consiste em carcinomas colorectais, gliomas, cancros do endométrio, adenocarcinomas, hiperplasias do endométrio, síndroma de Cowden, cancro da mama-ovário, cancro da próstata, síndroma de Bannayan-Zonana, LDD (síndroma de Lhermitte-Duclos) , doenças de macrocefalia de hamartomas incluindo doença de Cowden (DC) e síndroma de Bannayan-Ruvacaba-Riley (BRR), triquilemomas, hamartomas gastrointestinais, lipomas, adenomas da tiróide, doenças fibroquísticas da mama, gangliocitomas cerebrais displásicos, malignidades da mama e da tiróide e cura de feridas, kit esse caracterizado pelo facto de compreender pelo menos um agente que se selecciona no grupo que consiste em a) o factor do tipo de polipéptido ou um seu fragmento tal como definido na reivindicação 1, b) anticorpos ou partes deles específicos para o factor do tipo polipéptido ou um seu fragmento, tal como em a), c) um ácido nucleico que codifica para um factor, em que o factor é 21 i) um polipéptido que compreende um aminoácido de acordo com a SEQ ID N°. 1; ou ii) um polipéptido com uma sequência de acordo com as entradas do banco de dados gi 9506687 ou NP_061931.1; d) um ácido nucleico que codifica para um factor ou um seu fragmento de acordo com a) , em que o ácido nucleico compreende i) um ácido nucleico de acordo com a SEQ ID N°. 2 ou a SEQ ID N°. 3; ou ii) uma sequência de ácidos nucleicos de acordo com as entradas do banco de dados gi 9506686 ou NM_019058.1; e) um ácido nucleico que codifica para o factor ou um seu fragmento tal como em a) , em que o ácido nucleico irá hibridar, excepto para a degenerescência do código genético, com um ácido nucleico de acordo com d); ou f) um ácido nucleico que codifica para o factor ou um seu fragmento tal como a) , em que o ácido nucleico híbrida em condições severas com um ácido nucleico que é complementar do ácido nucleico de acordo com d); g) ácidos nucleicos que interagem com o referido factor do tipo polipéptido ou um seu fragmento, em que o fragmento tem os efeitos do factor do tipo de polipéptido em termos de cura de feridas, crescimento do tumor, formação do tumor, metástases, migração de células, motilidade de células em matrizes extracelulares e crescimento de células em matrizes extracelulares e em que os 22 ácidos nucleicos se seleccionam no grupo que consiste em aptâmeros e spigelmeres, e h) ácidos nucleicos que interagem com ha) um ácido nucleico que codifica para um factor, factor esse que é i) um polipéptido que compreende um aminoácido de acordo com a SEQ ID N°. 1; ou ii) um polipéptido com uma sequência de acordo com as entradas do banco de dados gi 9506687 ou NP_061931.1; hb) um ácido nucleico que codifica para um factor, em que o ácido nucleico compreende i) um ácido nucleico de acordo com a SEQ ID N°. 2 ou a SEQ ID N°. 3; ou ii) uma sequência de ácidos nucleicos de acordo com as entradas do banco de dados gi 9506686 ou NM_019058; hc) um ácido nucleico que codifica para o factor ou um seu fragmento tal como em a), em que o ácido nucleico irá hibridar, excepto para a degenerescência do código genético, com um ácido nucleico de acordo com d); ou hd) um ácido nucleico que codifica para o factor ou o seu fragmento tal como em a) , em que o ácido nucleico híbrida em condições severas com um ácido nucleico que é 23 complementar do ácido nucleico de acordo com a alínea d); e, eventualmente, pelo menos um outro composto.
21. Utilização de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 20, caracterizada pelo facto de o factor do tipo de polipéptido estar envolvido num processo biológico, processo esse que é um processo regulado pela via metabólica de Pl3-cinase.
22. Utilização de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo facto de o processo ser um processo seleccionado no grupo que consiste em cura de feridas, metástases, formação de tumores, migração de células, motilidade de células em matrizes extracelulares e crescimento de células em matrizes extracelulares.
23. Processo para o rastreio de um agente para o fabrico de um medicamento para o tratamento e/ou a prevenção de uma doença e/ou para o rastreio de um agente para a produção de um agente de diagnóstico para o diagnóstico de uma doença, em que a doença se selecciona no grupo que consiste em tumores em estado terminal, cancros com metástases e quaisquer estados clínicos patológicos que envolvam a via metabólica de Pl3-cinase, em que esses estados clínicos se seleccionam no grupo que consiste em carcinomas colorectais, gliomas, cancros do endométrio, adenocarcinomas, hiperplasias do endométrio, síndroma de Cowden, cancro da mama-ovário, cancro da próstata, síndroma de Bannayan-Zonana, LDD (síndroma de Lhermitte-Duclos) , doenças de macrocefalia de hamartomas incluindo doença de Cowden (DC) e síndroma de Bannayan-Ruvacaba-Riley (BRR), triquilemomas, 24 hamartomas gastrointestinais, lipomas, adenomas da tiróide, doenças fibroquísticas da mama, gangliocitomas cerebrais displásicos e malignidades da mama e da tiróide, ou em que o medicamento e/ou o agente de diagnóstico serve para a cura de feridas, compreendendo as seguintes etapas: a) providenciar um composto candidato, b) providenciar um sistema de expressão para um factor do tipo de polipéptido ou um seu fragmento, em que o fragmento tem os efeitos do factor do tipo de polipéptido em termos de cura de feridas, crescimento de tumores, formação de tumores, metástases, migração de células, motilidade de células em matrizes extracelulares e crescimento de células em matrizes extracelulares, em que o factor ba) compreende uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID N°. 1; ou bb) tem uma sequência de aminoácidos de acordo com as entradas do banco de dados gi 9506687 ou NP_061931.1; bc) é codificado por um ácido nucleico em que bca) o ácido nucleico compreende i) um ácido nucleico de acordo com a SEQ ID N°. 2 ou a SEQ ID N°. 3; ou ii) uma sequência de ácidos nucleicos de acordo com as entradas do banco de dados gi 9506686 ou NM_019058.1; 25 bcb) o ácido nucleico codifica para o factor tal como para b) , ba) ou bb) e em que o ácido nucleico vai hibridar, excepto para a degenerescência do código genético, com um ácido nucleico de acordo com a alínea bca); ou bcc) o ácido nucleico codifica para o factor ou os seus fragmentos tais como os de b) , ba) ou bb) e em que o ácido nucleico híbrida em condições severas com um ácido nucleico que é complementar do ácido nucleico de acordo com bca); e/ou um sistema, preferencialmente, um sistema de actividade, que detecta a actividade do referido factor do tipo de polipéptido; c) fazer contactar o composto candidato com o sistema de expressão para o referido factor do tipo de polipéptido e/ou um sistema, preferencialmente, um sistema de actividade, detectando a actividade do referido factor do tipo de polipéptido; d) determinar se a expressão e/ou a actividade do referido factor do tipo de polipéptido fica alterada sob a influência do composto candidato.
24. Processo de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo facto de o composto candidato estar contido numa biblioteca de compostos.
25. Processo de acordo com a reivindicação 23 ou 24, caracterizado pelo facto de o composto candidato se seleccionar no grupo de classes de compostos que consistem em péptidos de ligação de elevada afinidade, 26 proteínas, anticorpos, anticalinas, ácidos nucleicos funcionais, compostos naturais e moléculas pequenas.
26. Processo de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo facto de os ácidos nucleicos funcionais se seleccionarem no grupo que compreende aptâmeros, aptazimas, ribozimas, spiegelmeres, oligonucleótidos anti-paralelos e ARNpi.
27. Utilização, in vitro, do factor do tipo de polipéptido ou de um seu fragmento tal como definido na reivindicação 1, como um marcador da actividade de PI3-cinase.
28. Utilização, in vitro, de um ácido nucleico, tal como definido na reivindicação 6, como um marcador da actividade de Pl3-cinase.
29. Utilização de um ácido nucleico anti-paralelo ou de um ARN de interferência, caracterizada pelo facto de se destinar ao fabrico de um medicamento para o tratamento de uma doença, em que essa doença é um cancro e o ácido nucleico anti-paralelo e o ARN de interferência são dirigidos contra um ácido nucleico, tal como definido na reivindicação 6.
30. Utilização de acordo com a reivindicação 29, caracterizada pelo facto de o cancro se seleccionar no grupo que consiste em carcinomas colorectais, gliomas, cancros do endométrio, adenocarcinomas, hiperplasias do endométrio, síndroma de Cowden, cancro da mama-ovário, cancro da próstata, síndroma de Bannayan-Zonana, LDD (síndroma de Lhermitte-Duclos) , doenças de macrocefalia de hamartomas incluindo doença de Cowden (DC) e síndroma 27 de Bannayan-Ruvacaba-Riley (BRR), triquilemomas, hamartomas gastrointestinais, lipomas, adenomas da tiróide, doenças fibroquísticas da mama, gangliocitomas cerebrais displásicos e malignidades da mama e da tiróide. Lisboa, 27 de Março de 2009 28