KR101154130B1 - 전이에 관련된 인자 및 그 용도 - Google Patents

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KR101154130B1
KR101154130B1 KR1020057006488A KR20057006488A KR101154130B1 KR 101154130 B1 KR101154130 B1 KR 101154130B1 KR 1020057006488 A KR1020057006488 A KR 1020057006488A KR 20057006488 A KR20057006488 A KR 20057006488A KR 101154130 B1 KR101154130 B1 KR 101154130B1
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Abstract

본 발명은 생물학적 과정에 관여하는 인자에 대한 핵산코딩에 관한 것으로, 상기 과정은 PI 3-키나아제 경로 조절 과정, 바람직하게는 글루코오스 대사, 아미노산 및 글루코오스 상실과정, 당뇨, 창상치료, 스트레스 반응, 아폽토시스, 전이, 종양형성, 세포이동, 세포외 기질에서의 세포 운동성 및 세포외 기질에서의 세포 성장을 포함하는 그룹으로부터 선택된 과정이며, 상기 인자는 서열번호 1에 따른 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 데이터뱅크 입수번호 gi 9506687 또는 NP_061931, 바람직하게는 NP_061931.1에 따른 서열을 갖는 폴리펩티드이다.
PI 3-키나아제 경로, 핵산, 핵산코딩, 표적분자

Description

전이에 관련된 인자 및 그 용도{FACTORS INVOLVED IN METASTASIS AND USES THEREOF}
본 발명은 전이 및/또는 이동, 글루코오스 대사작용 및 아미노산 대사작용에 관여하는 신규한 인자, 의약 및 진단물질의 제조를 위한 방법 및 그 용도에 관한 것이다.
현대 의약의 개발은 더이상 발견적인 방법에 의존하지 않지만, 일반적으로 질병 또는 질환의 분자 작용기전, 후보 표적 분자의 확인 및 상기 표적 분자에 대한 평가를 포함한다. 표적분자의 확인은 그러한 방법에 있어서 필수적이다. 사람 게놈의 서열화 및 각각의 서열 데이터의 공개와 함께 사람의 핵산에 대한 코딩은은 원칙적으로 이용가능하다. 그러나, 이러한 데이터에 대한 심각한 제한은 상기 서열의 기능에 대한 주석이 전혀 주어지지 않는다는 것이다. 여전히 핵산 서열 코딩에 대한 단순한 지식은 생체내에서 폴리펩티드의 기능을 예측하는데 충분하지 않다. 따라서, 적절하게 입증된 주석없이 데이터뱅크 입수번호 연구로부터 당업자는 이 핵산 데이터를 어떻게 사용하는지에 대해 어떠한 기술적인 방법을 얻을 수가 없다. 상기 폴리펩티드를 적절하게 생체내에 주입하여 그 작용을 밝히는 것은 여전히 힘든 일이다.
확인된 표적 분자가 이용가능하다면, 그로부터 유도된 약물 후보가 검사 또는 개발되어 실험될 것이다. 많은 경우에서 그러한 약물 후보는 합성 또는 천연 화합물을 구성할 수 있는 화합물 라이브러리의 구성요소이다. 조합 라이브러리의 사용 또한 일반적이다. 그러한 화합물 라이브러리는 본원에서 후보 화합물 라이브러리로 불린다. 과거에는 이러한 방법이 성공적인 것으로 입증되었지만, 이는 여전히 시간과 돈이 많이 든다.
여전히 수많은 종양 및 암은 사람의 건강에 있어서 큰 위협이다. 부작용이 적은 안전하고 더 강력한 약물을 개발하기 위해서는 표적 분자에 대해 알아야 하는 바, 이들의 활성 또는 존재에 있어서 특이적으로 또는 선택적으로 영향을 받을 수 있는 적절한 화합물에 의해 해결된다. 잠재적 또는 후보 약물이 될 수 있는 화합물 및 표적간의 선택적 및 특이적 상호작용 때문에, 암, 종양형성 및 전이와 같은 질환 또는 질환상태에서 표적의 기능은 영향을 받을 수 있으므로 치료 또는 예방될 질환 및 질환상태는 호전되었다. 새롭게 확인 및 입증된 표적 분자를 토대로 하는 치료 방법과는 별도로, 진단 방법 역시 중요하다. 그러한 진단방법은 치료될 질환 또는 상태를 모니터하느데 적절하며, 치료전 또는 치료중 또는 치료후에 의사가 치료를 계속할 것인지 여부를 결정하게 한다.
본 발명이 해결하고자 하는 문제는 암 및 종양에 특이적인 표적을 제공하는 것이다. 본 발명이 해결하고자 하는 또 다른 문제는 종양형성 및 전이에 특별히 관련된 표적을 제공하는 것이다. 마지막으로, 본 발명이 해결하고자 하는 문제는 종양형성 및 전이에 관련된 진단 표지(marker)를 제공하하는 것이다.
제 1요지에서 본 발명이 해결하고자 하는 문제는 생물학적 과정에 관여하는 인자를 코딩하는 핵산에 의해 해결되는 바, 상기 과정은 PI 3-키나아제 경로 및/또는 HIF1α경로 조절 과정, 바람직하게는 글루코오스 대사작용, 아미노산 및 글루코오스 상실 과정, 당뇨, 창상 치유, 스트레스 반응, 저산소증, 아폽토시스, 전이, 종양형성, 세포이동, 세포밖 매트리스에서의 세포 운동성 및 세포밖 매트리스에서의 세포성장을 포함하는 그룹으로부터 선택되는 과정이며, 상기 인자는 서열번호 1에 따른 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 데이터뱅크 입수번호 gi 9506687 또는 NP_061931, 바람직하게는 NP_061931.1에 따른 서열을 갖는 폴리펩티드이다.
제 2요지에서 본 발명이 해결하고자 하는 문제는 생물학적 과정에 관여하는 인자를 코딩하는 핵산에 의해 해결되는 바, 상기 과정은 PI 3-키나아제 경로 및/또는 HIF1α경로 조절 과정, 바람직하게는 글루코오스 대사작용, 아미노산 및 글루코오스 상실 과정, 당뇨, 창상 치유, 스트레스 반응, 저산소증, 아폽토시스, 전이, 종양형성, 세포이동, 세포밖 매트리스에서의 세포 운동성 및 세포밖 매트리스에서의 세포성장을 포함하는 그룹으로부터 선택되는 과정이며, 상기 핵산은 서열번호 2 또는 서열번호 3에 따른 핵산 서열 또는 데이터뱅크 입수번호 gi 9506686 또는 NM_019058, 바람직하게는 NM_019058.1에 따른 핵산 서열을 포함한다.
제 3요지에서 본 발명이 해결하고자 하는 문제는 생물학적 과정에 관여하는 인자를 코딩하는 핵산에 의해 해결되는 바, 상기 과정은 PI 3-키나아제 경로 및/또는 HIF1α경로 조절 과정, 바람직하게는 글루코오스 대사작용, 아미노산 및 글루코오스 상실 과정, 당뇨, 창상 치유, 스트레스 반응, 저산소증, 아폽토시스, 전이, 종양형성, 세포이동, 세포밖 매트리스에서의 세포 운동성 및 세포밖 매트리스에서의 세포성장을 포함하는 그룹으로부터 선택되는 과정이며, 상기 핵산은 유전자 코드의 퇴화가 없다면 본 발명의 제 2요지에 따른 핵산과 하이브리다이즈할 것이다.
제 4요지에서 본 발명이 해결하고자 하는 문제는 생물학적 과정에 관여하는 인자를 코딩하는 핵산에 의해 해결되는 바, 상기 과정은 PI 3-키나아제 경로 및/또는 HIF1α경로 조절 과정, 바람직하게는 글루코오스 대사작용, 아미노산 및 글루코오스 상실 과정, 당뇨, 창상 치유, 스트레스 반응, 저산소증, 아폽토시스, 전이, 종양형성, 세포이동, 세포밖 매트리스에서의 세포 운동성 및 세포밖 매트리스에서의 세포성장을 포함하는 그룹으로부터 선택되는 과정이며, 상기 핵산은 엄격한 조건하에서 본 발명의 제 2요지에 따른 핵산과 하이브리다이즈할 것이다.
본 발명의 임의의 요지에 따른 사용의 바람직한 구체예로서, 상기 질병은 상기 질병에 관련된 세포가 PRF1 활성이 부족하고, 증가된 공격성 행동을 나타내며, 또는 말기 단계 종양의 세포인 것을 특징으로 한다.
핵산과 관련된 본 발명의 임의의 요지에 있어서, 상기 핵산은 DNA 또는 RNA로서 존재할 수 있다. 상기 핵산은 단일가닥, 부분적 이중가닥 또는 이중가닥 핵산으로서 존재할 수 있다. 바람직한 구체예로서, 본 발명에 따른 핵산은 단일가닥 RNA로서 존재한다. 그러한 단일가닥 RNA는 바람직하게는 발현 시스템에서 mRNA로서 사용되며, 상기 발현 시스템은 바람직하게는 본원에서 상술한 발현시스템이다. 본 발명에 따른 핵산의 구체예로서, 상기 핵산은 단일가닥이며 유전자 코드의 변형없이 본 발명에 따른 인자를 코딩하는 핵산과 본질적으로 상보적인 핵산과 하이브리다이즈할 것이다. 다른 구체예로서, 상기 단일가닥 핵산은 본 발명의 제 2요지에 따른 핵산과 본질적으로 상보적인 핵산과 엄격한 조건하에서 하이브리다이즈한다.
제 5요지에서 본 발명이 해결하고자 하는 문제는 본 발명에 따른 핵산을 포함하는 벡터, 바람직하게는 발현 벡터에 의해 해결된다. 그러한 목적을 위한 벡터는 당업자에게 공지되어 있다.
제 6요지에서 본 발명이 해결하고자 하는 문제는 본 발명에 따른 벡터를 포함하는 세포, 바람직하게는 포유류 세포에 의해 해결된다.
제 7요지에서 본 발명이 해결하고자 하는 문제는 생물학적 과정에 관여하는 인자에 의해 해결되는 바, 상기 과정은 PI 3-키나아제 경로 및/또는 HIF1α경로 조절 과정, 바람직하게는 글루코오스 대사작용, 아미노산 및 글루코오스 상실 과정, 당뇨, 창상 치유, 스트레스 반응, 저산소증, 아폽토시스, 전이, 종양형성, 세포이동, 세포밖 매트리스에서의 세포 운동성 및 세포밖 매트리스에서의 세포성장을 포함하는 그룹으로부터 선택되는 과정이며, 상기 인자는 서열번호 1에 따른 아미노산 서열번호를 포함하는 폴리펩티드 또는 데이터뱅크 입수번호 gi 9506687 또는 NP_061931, 바람직하게는 NP_0061931.1에 따른 서열을 갖는 폴리펩티드이다.
제 8요지에서 본 발명이 해결하고자 하는 문제는 생물학적 과정에 관여하는 인자에 의해 해결되는 바, 상기 과정은 PI 3-키나아제 경로 및/또는 HIF1α경로 조절 과정, 바람직하게는 글루코오스 대사작용, 아미노산 및 글루코오스 상실 과정, 당뇨, 창상 치유, 스트레스 반응, 저산소증, 아폽토시스, 전이, 종양형성, 세포이동, 세포밖 매트리스에서의 세포 운동성 및 세포밖 매트리스에서의 세포성장을 포함하는 그룹으로부터 선택되는 과정이며, 상기 인자는 본 발명에 따른 핵산에 의해 엔코딩된다.
본 발명에 따른 인자의 구체예로서, 상기 인자는 상기 과정에 대해 표지(marker)이다.
본 발명에 따른 인자의 다른 구체예로서, 상기 인자는 변형된 세포에 대해, 바람직하게는 침윤성 세포에 대해 표지(marker)이다.
제 9요지에서 본 발명이 해결하고자 하는 문제는 본 발명에 따른 인자 또는 이의 단편 또는 유도체의 PI 3-키나아제 경로 및/또는 HIF1α경로의 하류 표적 또는 하류 표지, 바람직하게는 PI 3-키나아제 경로 및/또는 HIF1α경로의 하류 약물 표지로서의 사용에 의해 해결된다.
제 10요지에서 본 발명이 해결하고자 하는 문제는 질환의 치료 및/또는 예방하기 위한 의약 제조 및/또는 질환의 진단용 진단 물질의 제조를 위한 본 발명에 따른 인자 또는 이의 단편 또는 유도체의 사용에 의해 해결되며, 상기 질환은 암, 전이성 암, 당뇨, 창상 치유, 저산소증과 관련된 임의의 질환 및 PI 3-키나아제 경로 및/또는 HIF1α경로를 수반하는 임의의 병리적 상태를 포함하는 그룹으로부터 선택된다.
제 11요지에서 본 발명이 해결하고자 하는 문제는 질환의 치료 및/또는 예방용 및/또는 질환의 진단용 진단 물질의 제조를 위한 본 발명에 따른 인자 또는 이의 단편 또는 유도체의 사용에 의해 해결되며, 상기 질환은 암, 전이성 암, 당뇨, 창상 치유, 저산소증과 관련된 임의의 질환 및 PI 3-키나아제 경로 및/또는 HIF1α경로를 수반하는 임의의 병리적 상태를 포함하는 그룹으로부터 선택된다.
본 발명의 다양한 요지에 따른 사용의 구체예로서, 상기 질환은 상기 질환에 관련된 세포가 PTEN 활성이 없으며 및/또는 공격적 성향의 증가를 나타내거나 및/또는 PI 3-키나아제 경로 및/또는 HIF1α경로의 과잉활성화를 나타내며 및/또는 종양세포 바람직하게는 말기 단계 종양세포인 것을 특징으로 한다.
바람직한 구체예로서, 상기 세포는 포유류 세포, 바람직하게는 사람 세포이다.
본 발명의 다양한 요지에 따른 사용의 구체예로서, 상기 질환은 말기단계 종양이다.
본 발명의 다양한 요지에 따른 사용의 구체예로서, 상기 질환은 글루코오스 대사작용에 관련된 PI 3-키나아제 경로 및/또는 HIF1α경로의 가지에 관련된 질환이며, 바람직하게는 상기 질환은 당뇨병이다.
본 발명의 다양한 요지에 따른 사용의 바람직한 구체예로서, 상기 질환은 종양 성장 및/또는 전이에 관련된 PI 3-키나아제 경로 및/또는 HIF1α경로의 가지에 관련된 질환이다.
제 12요지에서 본 발명이 해결하고자 하는 문제는 질환의 치료 및/또는 예방용 및/또는 질환의 진단을 위한 진단 물질의 제조용 물질의 스크리닝 방법에 의해 해결가능하며, 상기 질환은 하기 단계를 포함하는 암, 전이성 암, 당뇨, 창상 치유, 저산소증과 관련된 임의의 질환 및 PI 3-키나아제 경로 및/또는 HIF1α경로를 수반하는 임의의 병리적 상태를 포함하는 그룹으로부터 선택된다:
a) 후보 화합물을 제공하는 단계;
b) 본 발명에 따른 인자에 대한 발현 시스템 및/또는 시스템, 바람직하게는 본 발명에 따른 인자의 활성을 검출하는 활성 시스템을 제공하는 단계;
c) 상기 후보 화합물을 본 발명에 따른 인자에 대한 발현 시스템 및/또는 시스템, 바람직하게는 본 발명에 따른 인자의 활성을 검출하는 활성 시스템과 접촉시키는 단계;
d) 본 발명에 따른 인자의 발현 및/또는 활성이 후보 화합물의 영향하에서 변하는지 여부를 측정하는 단계.
본 발명에 따른 방법의 바람직한 구체예로서, 상기 후보 화합물은 화합물의 라이브러리내에 함유되어 있다.
본 발명에 따른 방법의 바람직한 구체예로서, 상기 후보 화합물은 펩티드, 단백질, 항체, 안티칼린, 기능적 핵산, 천연 화합물 및 소 분자를 포함하는 화합물 유형의 그룹으로부터 선택된다.
본 발명에 따른 방법의 바람직한 구체예로서, 상기 기능적인 핵산은 아프타머, 아프타짐, 리보자임, 스피에겔머, 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 siRNA를 포함하는 그룹으로부터 선택된다.
제 13요지에서 본 발명이 해결하고자 하는 문제는 질환의 치료 및/또는 예방하기 위한 의약 개발 및/또는 제조 및/또는 질환의 진단용 진단 물질의 제조를 위한 본 발명에 따른 인자 또는 이의 일부 또는 유도체 및/또는 표적 분자로서 본 발명에 따른 핵산 또는 이의 일부 또는 유도체의 사용에 의해 해결되며, 상기 질환은 암, 전이성 암, 당뇨, 창상 치유, 저산소증과 관련된 임의의 질환 및 PI 3-키나아제 경로 및/또는 HIF1α경로를 수반하는 임의의 병리적 상태를 포함하는 그룹으로부터 선택된다.
본 발명의 제 13요지에 따른 사용의 구체예로서, 상기 의약 및/또는 진단 물질은 항체, 펩티드, 안티칼린, 소분자, 안티센스 분자. 아프타머, 스페엘겔머 및 siRNA를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 물질을 포함한다.
본 발명의 제 13요지에 따른 사용의 다른 구체예로서, 상기 물질은 본 발명에 따른 인자 또는 이의 일부 또는 유도체와 상호작용한다.
본 발명의 제 13요지에 따른 사용의 다른 구체예로서, 상기 물질은 본 발명에 따른 핵산 또는 일부분 또는 그 유도체, 특히본 발명에 따른 인자에 대한 mRNA, 게놈 핵산 또는 cDNA와 상호작용한다.
제 14요지에서 본 발명이 해결하고자 하는 문제는 질환의 치료 및/또는 예방하기 위한 의약 개발 및/또는 제조 및/또는 질환의 진단용 진단 물질의 제조를 위한 본 발명에 따른 인자 또는 이의 일부 또는 유도체와 상호작용하는 폴리펩티드의 사용에 의해 해결되며, 상기 질환은 암, 전이성 암, 당뇨, 창상 치유, 저산소증과 관련된 임의의 질환 및 PI 3-키나아제 경로 및/또는 HIF1α경로를 수반하는 임의의 병리적 상태를 포함하는 그룹으로부터 선택된다.
본 발명의 제 14요지에 따른 사용의 다른 구체예로서, 상기 폴리펩티드는 본 발명에 따른 인자 또는 이의 일부 또는 유도체에 대한 항체를 포함하는 그룹으로부터 선택되며 폴리펩티드는 본 발명에 따른 인자 또는 이의 일부 또는 유도체와 결합한다.
제 15요지에서 본 발명이 해결하고자 하는 문제는 질환의 치료 및/또는 예방하기 위한 의약 개발 및/또는 제조 및/또는 질환의 진단용 진단 물질의 제조를 위한 본 발명에 따른 인자 또는 이의 일부 또는 유도체와 상호작용하는 핵산의 사용에 의해 해결되며, 상기 질환은 암, 전이성 암, 당뇨, 창상 치유, 저산소증과 관련된 임의의 질환 및 PI 3-키나아제 경로 및/또는 HIF1α경로를 수반하는 임의의 병리적 상태를 포함하는 그룹으로부터 선택된다.
본 발명의 제 15요지에 따른 사용의 다른 구체예로서, 상기 핵산은 아프타머 및 스피엘겔머를 포함하는 그룹으로부터 선택된다.
제 16요지에서 본 발명이 해결하고자 하는 문제는 질환의 치료 및/또는 예방하기 위한 의약 개발 및/또는 제조 및/또는 질환의 진단용 진단 물질의 제조를 위한 본 발명에 따른 인자 또는 이의 일부 또는 유도체에 대한 핵산 코딩과 상호작용하는 핵산의 사용에 의해 해결되며, 상기 질환은 암, 전이성 암, 당뇨, 창상 치유, 저산소증과 관련된 임의의 질환 및 PI 3-키나아제 경로 및/또는 HIF1α경로를 수반하는 임의의 병리적 상태를 포함하는 그룹으로부터 선택된다.
본 발명의 제 16요지에 따른 사용의 구체예로서, 상호작용하는 상기 핵산은 안티센스 올리고뉴클레오티드, 리보자임 및/또는 siRNA이다.
본 발명의 제 16요지에 따른 사용의 다른 구체예로서, 본 발명에 따른 인자 또는 이의 일부 또는 유도체를 코딩하는 핵산은 cDNA, mRNA 또는 hnRNA이다.
제 17요지에서 본 발명이 해결하고자 하는 문제는 질환의 예방 및/또는 치료하기 위한 본 발명에 따른 인자 또는 이의 일부 또는 유도체, 본 발명에 따른 인자 또는 이의 일부 또는 유도체와 상호작용하거나 또는 본 발명에 따른 인자 또는 이의 일부 또는 유도체를 코딩하는 핵산과 상호작용하는 소분자, 본 발명에 따른 인자 또는 이의 일부 또는 유도체에 대해 특이적인 항체, 본 발명에 따른 인자 또는 이의 일부 또는 유도체와 상호작용하는 폴리펩티드, 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 인자 또는 이의 일부 또는 유도체를 코딩하는 핵산, 본 발명에 따른 인자 또는 이의 일부 또는 유도체와 상호작용하는 핵산 및 본 발명에 따른 인자 또는 이의 일부 또는 유도체를 코딩하는 핵산과 상호작용하는 핵산을 포함하는 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 물질 및 하나 이상의 약제학적 허용가능한 담체을 포함하는 약제학적 조성물에 의해 해결되며, 상기 질환은 암, 전이성 암, 당뇨, 창상 치유, 저산소증과 관련된 임의의 질환 및 PI 3-키나아제 경로 및/또는 HIF1α경로를 수반하는 임의의 병리적 상태를 포함하는 그룹으로부터 선택된다.
제 18요지에서 본 발명이 해결하고자 하는 문제는 암, 전이성 암, 당뇨, 창상 치유, 저산소증과 관련된 임의의 질환 및 PI 3-키나아제 경로 및/또는 HIF1α경로를 수반하는 임의의 병리적 상태를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 질환 또는 상태를 치료하기 위한 키트에 의해 해결되며, 상기 키트는 본 발명에 따른 인자 또는 이의 일부 또는 유도체, 본 발명에 따른 인자 또는 이의 일부 또는 유도체에 대해 특이적인 항체, 본 발명에 따른 인자 또는 이의 일부 또는 유도체와 상호작용하는 폴리펩티드, 본 발명에 따른 핵산과 상호작용하고/거나 본 발명에 따른 인자 또는 이의 일부 또는 유도체를 코딩하는 핵산과 상호작용하는 폴리펩티드, 본 발명에 따른 인자 또는 이의 일부 또는 유도체와 상호작용하는 핵산, 및 본 발명에 따른 핵산과 상호작용하고/거나 본 발명에 따른 인자 또는 이의 일부 또는 유도체를 코딩하는 핵산과 상호작용하는 핵산으로부터 선택된 하나 이상의 물질 및 임의적으로, 적어도 하나의 다른 화합물을 포함한다.
본 발명의 임의의 면에서 상기 종양은 바람직하게는 말기단계 종양이다.
암세포의 대사적 이동(Warburg 효과), 글루코오스 대사작용, 아미노산 대사작용, 아미노산 및 글루코오스 상실 과정, 당뇨, 창상 치유, 전이, 종양형성, 저산소증, 세포이동, 세포밖 매트리스에서의 세포 운동성 및 세포밖 매트리스에서의 세포성장과 같은 다수의 생물학적 과정에 관여하는 신규한 폴리펩티드 인자를 본 발명자들은 놀랍게도 발견하였다. 이들 과정은 PI 3-키나아제 경로의 조절하에 있다. 이 신규한 인자는 본원에서 PI 3-키나아제 경로 조절 인자 1 또는 PRF 1으로 불린다.
PRF 1의 게놈 서열은 염색체 10에 편재되어 있으며, 더 구체적으로는 상기 유전자 좌는 10 pter-q 26.12이다. 상기 유전자는 현재 정의된 바와 같이 총 1,760개 뉴클레오티드를 포함한다. cDNA를 나타내는 각각의 데이터뱅크 입수번호는 픈_019058, 더 바람직하게는 NM_019058.1 및 gi 9506686로 불린다. PRF 1를 코딩하는 cDNA는 본원에서 서열번호 2로 불리며 그 코딩서열은 서열번호 3으로 불린다. PRF 1를 코딩하는 핵산은 위치 312에서 C가 G로 바뀌며, 위치 991에서 A가 T로 바뀌며, 위치 1247에서 C가 T로 바뀌며, 상보적 위치 1297에서 C가 T로 바뀌며, 위치 1958에서 C가 T로 바뀌며, 상보적 위치 1666에서 A가 G로 바뀌며 및 위치 1743에서 A가 C로 바뀌는 것과 같이 일부 변이를 갖을 수 있다. 상술한 모든 위치는 본원에서 서열번호 2로도 불리는 cDNA에 관한 것이다. 오픈 리딩 프레임은 위치 198에서 개시되며 위치 896에서 종결된다.
PRF 1의 아미노산 서열은 본원에서 서열번호 1로 불린다. 아미노산 서열을 나타내는 각각의 데이터뱅크 입수번호는 NP_061931, 더 구체적으로는 NP_061931.1 및 gi 9506687이다.
본 발명에 따른 폴리펩티드는 아미노산 위치 39에서 R이 G로 바뀌는것과 같은 변이를 또한 포함한다.
본 발명에 따른 폴리펩티드는 문헌에서 최근에 REDD1으로 불리며 Ellisen, L. W., Molecular Cell, Vol. 10, 995-1005, November, 2002에 REDD1으로 개시되어 있다.
임의의 상기 서열에 일부 서열 에러가 포함될 수 있지만, 염기서열은 더 발달될 수 있으며 상기 수탁번호로부터 각각의 수정된 서열을 얻을 수 있으므로 본 발명의 범위에 포함된다는 것을 당업자는 알 것이다. 상기 변형중 하나 이상이 포함되거나 제외되는 구체예 또한 본 발명의 범위내에 포함된다.
PRF1 또는 이를 코딩하는 핵산의 유도체 또는 절두된 부분은 바람직한 효과가 실현될 수 있는 한 본 발명에 따라 사용될 수 있다는 것은 본 발명의 범위에 속한다. 바람직한 효과는 기능적 핵산, 항체, 폴리펩티드 및 소분자와 같은 특정 화합물이 검사되거나 또는 고안된다는 것일 것이다. 용어 PRF1은 이러한 유형의 유도체 또는 절두된 부분을 포함한다. 바람직한 PRF1의 유도체는 인산화된 부분 또는 글리코실화된 부분이다. 유도체화 및 절두의 정도는 당업자에 의해 일반적인 분석에 의해 측정될 수 있다. 핵산 서열에 있어서, 이들 핵산 서열은 상기 수탁번호에 의해 특정화된 핵산 또는 상술한 아미노산 서열로부터 유도될 수 있는 임의의 PRF1을 엔코딩하는 핵산과 하이브리다이즈하는 서열에 또한 포함된다. 그러한 하이브리다이즈 및 실험의 특이성은 당업자에게 공지되어 있다. 그러한 하이브리다이즈의 특이성은 Ausubel 등.,(1996) Current Protocols in Molecular Biology. J. Wiley and Sons, New York으로부터 알 수 있다. 엄격한 하이브리다이즈는 본원에서 사용된 바와 같이 예를들면, 0,1 xSSC; 0,1%SDS, 65oC, 15분을 의미한다. 또한, 용어 PRF1을 코딩하는 핵산은 상술한 임의의 핵산 서열과 상동인 핵산서열을 또한 포함하는 바, 상동관계의 정도는 70% 및 99%사이의 임의의 퍼센트를 포함하여 바람직하게는 75, 80, 85, 90 또는 95%이다.
PRF1를 코딩하는 유전자는 그 작용에 대한 주석없이 문헌에 개시되어 있다. 상기 유전자는 저산소증-유도성이며 전산소증 유도성 인자 1에 반응성이다(Shoshani T., 등., Molecular and cellular biology, april 2002, p. 2283-2293).
상기 문헌에서 PRF1은 저산소증에 의해 조절되는 것으로 개시되어져 있다. 그러나, PRF1이 저산소증 반응과 관련된 생존 인자인자라는 것에 대해서는 개시되어 있지 않다. 본 발명자들은 PRF1이 PI 3-키나아제 및/또는 HIF1α의존 방식에서 조절된다는 것을 놀랍게도 발견하였다. PRF1의 녹다운(knockdown)은 본원의 실시예에 개시된 바와 같이 마드리겔 에세이에서 세포의 성장을 억제하는데 적절하다. 이와 관련하여, PRF1의 녹다운은 단백질 수준에서 또한 나타날 수 있으며 기능의 상실은 LY294002에 대한 효과와 유사하게 억제성 표현형을 나타내어 PRF1이 HIF1α 및 Akt의 하류인 특이적 표적, 더 바람직하게는 암 표적이라는 본 발명자들의 발견을 확인시켜주었다. HIF가 종양 치료에 매우 관련되어 있음을 확인시켜주는 수많은 이용가능한 데이터가 존재하기 때문에 이는 더욱더 관련된다. 또한 PRF1의 녹다운은 종양 모델로서 PC-3 세포를 사용하여 설명한 바와 같이 종양의 억제를 초래한다. 이로부터 PRF1에 대한 다양한 적용 및 더 구체적으로는 PRF1을 억제하는 화합물이 유도될 수 있다. 따라서, PRF1은 저산소증 조건에서 생존하는 세포를 얻기 위해 세포계에서 과잉발현될 수 있다. 그러한 조건은 중풍, 심장부전으로 PRF1의 과잉발현 또는 활성화는 이러한 유형의 질환을 치료 또는 예방하는데 있어서 적절한 수단일 것이다. PRF1의 증가된 발현 또는 활성화에 관련된 임의의 화합물 또는 작용기전은 이러한 유형의 질환을 치료 및/또는 예방하기 위한 적절한 수단임을 당업자는 알 것이다.
또한, PRF1의 발현 또는 활성의 감소는 각각의 세포계를 저산소증 조건에 대응하는 조건으로 하는데 적절할 것이다. 이들 조건하에서 추가 세포과정 예를들면, 아폽토시스이 개시될 것이다. PRF1을 억제함으로써 저산소증 조건은 실현될 수 있는 바, 이는 충분한 산소가 공급되지 않을 세포에서 그러한 질환을 치료하는데 적절하다. 세포가 저산소증을 경험하거나 또는 이에 노출되는 조건으로 세포를 부여함으로써 치료될 수 있는 질환이 있다. 그러한 질환은 조양 및 암이다. 전사 수준 및 번역수준에서 PRF1의 발현 및/또는 활성을 감소시키는데 적절한 임의의 화합물은 이러한 유형의 질환을 치료 및/또는 예방하는데 적절할 것이다. 이들 질환은 본원에서 저산소증 관련된 질환으로도 불린다. 이들 화합물은 종양 맥관형성의 억제를 토대로 하는 종양을 치료하는데 효과적일 것이다.
본 발명자들은 PRF1이 암 및 종양 및 전이, 종양형성, 세포이동, 세포밖에서의 세포 운동성 및 세포밖에서의 세포 성장과 같은 다른 생물학적 과정 및 임으의 이들 과정을 토대로 하거나 또는 수반하는 질환 상태와 관련하여 중요한 표적임을 발견하였다. 더 구체적으로, 본 발명자들은 PRF1이 PI 3-키나아제/PRF1 경로 및/또는 HIF1α경로의 하류 표적임을 발견하였다. 더욱 놀랍게도 본 발명자들은 PRF1이 도 1에 도시된 바와 같이 PI 3-키나아제 경로의 몇몇의 가지에 연결되어 있음을 발견하였다. 또한, 본 발명자들은 도 7에 도시된 바와 같이 Akt 경로와 유사한 HIF1α경로를 통해 PRF1이 조절된다는 것을 발견하였다. PRF1과 관련하여, 글루코오스 이동, 성장 번역 및 전이 및 이동과 관련된 가지가 가장 적절하다. 이들 과정에서 PRF1의 중요성은 억제 기능, 더 구체적으로는 PRF1 종양 억제 기능을 상실한 경우에서 나타난다. 실시예에 나타난 바와 같이, PRF1은 PI 3-키나아제 경로에 대해 억제제인 PRF1이 활성이지 않는 조건하에서 상향 조절될 것이다.
PRF1은 중요한 진단 표지이며, PRF1의 발현은 PRF1 미누스(minus) 세포에서 증가하는 바, 이는 다수의 말기단계 종양 및 질환 상태에서 특징적이다(Cantley, L. C. and Neel, B. G. (1999). Proc. Natl. Acad. sci. USA 96, 4240-4245; Ali, I. U. (2000). I. Natl. Cancer Inst. 92, 861-863). 또한, PRF1의 상실은 각 종양 세포의 증가된 공격적 행동 및 침윤성 행동과 관련된다. 따라서, 이와 관련하여 PRF1은 중요한 진단 물질이다. 반면에, 이들 결과는 PRF1이 상이한 치료 방법 및 각각의 물질에 의해 해결될 수 있는 PI 3-키나아제/PRF1 경로 및/또는 HIF1α경로의 중요한 하류 약물 표적임을 또한 나타낸다. 이는 PRF1의 억제제가 세포의 전이 및 이동을 조절하는데 적절한 수단이며, 종양 및 암을 치료하는데 적절한 수단임을 의미하며, 더 구체적으로는 이들 종양 및 암은 전이성이며 이들의 세포는 전이 및/또는 이동 행동을 나타낸다. 본원에서 개시한 질환 및 질환상태는 종양형성 및 전이를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 다른 질환 및 질환 상태는 PI 3-키나아제경로 및/또는 HIF1α경로 및 더 구체적으로는 도 1에 도시된 다른 과정을 포함하는 임의의 질환 또는 병리적 상태와 일반적으로 관련된다. PI 3-키나아제 경로 및/또는 HIF1α경로에 관련된 이들 질환은 다른 무엇보다 당뇨이다. 이는 특히 본원에서 개시된 질환 및 질환상태에 적용가능한 바, 그러한 질환 및 질환 상태에 관련된 세포는 PRF1 음성이며 이는 상기 종양 억제 PRF1이 활성이지 않거나 또는 감소된 활성 수준을 갖는 것을 의미한다. 전이성 종양외에 당뇨는 이러한 유형의 질환 및 질환상태에 속한다. 따라서, 세포, 특히 본원에서 개시한 질환 및 질환상태에 관련되거나 및 PRF1 음성인 세포는 PRF1의 활성을 감소 또는 제거하기 위한 작용방식의 약물에 의한 치료에 취약하다. 따라서, PRF1 음성이거나 또는 PRF1 음성인 세포를 갖는 환자는 상기 약물을 사용하여 유리하게 치료될 수 있다. 각각의 진단 물질 또는 의약에도 동일하게 적용가능하다.
상기 약물을 사용하여 유리하게 치료받을 수 있는 다른 환자 그룹은 PRF1 기능 상실이 매우 높게 발생하는 암 환자, 특히 말기 단계 종양 환자이다(Cantley, L. C. and Neel, B. G. (1999). 종양 억제에 대한 새로운 고찰: PRF1은 포스포이노시티드 3-키나아제/AKT 경로 및/또는 HIF1α경로를 제한함으로써 종양 형성을 억제한다. Proc Natl Acad Sci USA 96, 4240-4245; Ali, I. U. (2000). 자궁내막에 대한 게이트키퍼(gatekeeper): PRF1 종양 억제제 유전자. J. Natl Cancer Inst 92, 861-863). PRF1의 상실은 각 종양 세포의 증가된 공격적 행동 및 침윤성 행동과 관련된다. 이 때문에, 바람직한 구체예로서 PRF1에 유도된 이들 진단물질 및 치료 물질은 상술한 전제조건을 만족시키는 임의의 종양, 즉 증가된 공격적 행동 및 침윤성 행동과 관련된 PRF1에 대해 사용할 수 있다.
PRF1은 PI 3-키나아제 경로 및/또는 HIF1α경로의 하류 표적이며, 증식 조절, 전이 및 이동에 대해서도 당업자는 치료 물질 및 진단물질을 개발할 수 있을 것이다. 표적이 확인되면 어떻게 약물이 검사되는지는 Prendergast, Nature Biotechnology, October 2001, Vol. 19, p. 919-921 또는 Torrance C. J. 등., Nature Biotechnology, October 2001, Vol. 19, p. 940-945에 개시되어 있다.
상술한 바와 같은 작용기전에의 PRF1의 관련 때문에, PRF1 또는 PRF1에 대한 핵산코딩은 세포 또는 그러한 세포를 몸속에 갖고 있는 환자의 상태 즉, 세포가 전이, 종양형성 또는 임의의 다른 과정을 겪는지 및 종양 세포 특히, 빠르게 성장하는 암 세포에 있어서 지표인 산소, 글루코오스 및/또는 글루코오스 결핍으로 고생하는지 여부를 진단하는 표지로서 사용될 수 있다. 일 예로서, 이러한 목적을 위해 ICAM-1이 사용될 수 있다. ICAM-1은 전이를 겪는 위암 세포의 예후에 사용(Maruo Y, Gochi A, Kaihara A, sjimamura H, YamadeT, TanakaN, OritaK. Int J Cancer. 2002 Aug 1: 100(4): 486-490)되는 바, 혈청 ICAM-1 양은 간 전이 환자에 있어서 상승하는 것으로 발견되었다. 다른 예로서, 오스테오폰틴이 유방암 진단 표지로서 사용된다(Rudland PS, Platt-Higgins A, El-Tanani M, De Silva Rudland S, Barraclough R, Winstanley jH, Howitt R, West CR. Cancer Res. 2002 Jun 15: 62(12): 3417-3427). 단백질 또는 mRNA의 존재 또는 존재의 정도 또는 PRF1의 활성의 정도가 표지로서 사용될 수 있으며 PRF1과 다소 특이적으로 상호작용하는 임의의 화합물은 적절한 진단물질 및/또는 적절한 분석수단일 것이다.
어느 경우에서나 특이적 및/또는 선택적으로 PRF1과 상호작용하는 약물 및 진단물질 고안방법 및 원칙은 하기에 개시될 것이다.
PRF1이 PI-3 키나아제 경로에 일반적으로 관련된 일부 면 예를들면, 전이 및 이동, 저산소증, 세포성장, 창상 치유, 번역조절 및 글루코오스 이동 및 선택적 및 특이적 진단방법 즉, PRF1이 PI-3 키나아제 경로에 관련된 과정, 더 구체적으로는 전이 및 이동뿐만 아니라 성장 번역 및 글루코오스 이동의 선택적 조정을 허용하는 적절한 하류 약물 표적이다.
PI-3 키나아제 경로는 성장인자 유도 및 유사한 신호 경로에 대한 PI-3 키나아제 활성을 특징으로 한다. 세포의 성장인자의 자극은 PI-3 키나아제와 같은 세포내 신호분자와 결합하거나 또는 이를 활성화시키는 세포막에서 이들의 동족 수용체의 활성을 초래한다. PI-3 키나아제(조절 p85 및 촉매 p110 서브유닛으로 구성됨)의 활성화는 인산화에 의한 Akt의 활성화 및/또는 HIF1α의 활성화를 초래하므로써 증식, 생존 또는 다른 하류로의 이동과 같은 세포 반응을 지지한다. 따라서, PRF1은 포스파티딜이노시톨(PI)-3 키나아제 경로에 관련된 종양 억제제이며 세포 성장 및 변형을 조절하는데 있어서의 그 역할에 대해 과거에 광범위하게 연구되었다(Stein, R. C. 및 Waterfield, M. D.(2000). PI-3 키나아제 억제: 약물 개발에 대한 표적? Mol Med Today 6, 347-357; Vazques, F. 및 Sellers, W. R.(2000) 및/또는 HIF1α 경로. PRF1 종양 억제제: 포스포이노시티드 3-키나아제 신호의 길항제. Biochim Biophys acta 1470, M21-35; Roymans, D 및 Slegers, H. (2001). 종양 진행에 있어서 포스파티딜이노시톨 3-키나아제. Eur J Biochem 268, 487-498). 종양 억제제 PRF1은 PI-3 키나아제-촉매 반응을 역으로 함으로써 PI-3 키나아제 및/또는 HIF1α 경로의 음성 조절자로서 기능하여 일시적으로 및 제어된 방법으로 발생하는 경로의 활성화를 확보한다. PI-3 키나아제 및/또는 HIF1α 경로 신호의 만성적인 과잉활성화는 PRF1의 기능적인 비활성화에 의해 유발된다. PI-3 키나아제 활성 및/또는 HIF1α활성은 소분자 억제제 LY294002의 부가에 의해 차단될 수 있다. 유사한 경로에서 작용하는 신호 키나아제 MEK의 활성 및 하류 반응은 소분자 억제제 PD98059에 의해 억제될 수 있다.
PRF1 기능의 상실을 통한 PI-3 키나아제 경로의 만성적인 활성 및/또는 HIF1α 활성은 이 종양 억제제가 제어된 세포증식에 있어서 중요한 체크포인트를 나타내는 종양형성 및 전이에 대한 주요한 공헌자이다.
PRF1 녹 아웃 세포는 PI-3 키나아제 및/또는 HIF1α 경로가 유도된, 구체적으로는 PI-3 키나아제의 활성화된 형태를 통해 만성적으로 유도된 세포와 유사한 특징을 나타낸다(Di Cristofano, A., Pesce, B., Cordon-Cordo, C 및 Pandolfi, P. P.(1998). PRF1은 배아 발달 및 종양 억제에 필수적이다. Nat Genet 19, 348-355. Klippel, A., Escobedo, M. A., Wachowicz, M. S., Apell, G., Brown, T. W., Giedlin, M. A., Kavanaugh, W. M. 및 Williams, L. T. (1998). 포스파티딜이노시톨 3-키나아제의 활성화는 세포주기 진입에 있어서 충분하며 종양 유전자 변형의 특징적인 세포 변화를 촉진한다. Mol Cell Biol 18, 5699-5711. Kobayashi, M., Nagata, S., Iwasaki, T., Yanagihara, K., Saitoh, I., Karouji, Y., Ihara, S. 및 Fukui, Y. (1999). 포스파티딜이노시톨 PI-3 키나아제의 활성화에 의한 선암의 분화. Proc Natl Acad Sci USA 96, 4874-4879).
본원에서 개시된 다양한 질환은 PI-3 키나아제 경로의 활성화 및/또는 과잉활성화, 바람직하게는 HIF1α 경로의 과잉활성화를 특징으로 한다. 이 활성화 또는 과잉활성화는 PTEN 활성이 없는 세포의 경우와 유사하다. PI-3 키나아제 경로의 과잉활성화 및/또는 HIF1α 경로의 활성화는 정상적으로 관찰된 활성화 즉, 상기 질환 또는 질환상태의 일부가 아니거나 또는 이에 관련된 특별한 유형의 세포의 PI-3 키나아제 경로의 활성화와 비교시 증가된 PI-3 키나아제 경로 및 HIF1α 경로의 활성화를 의미한다.
PTEN은 PI3K/PTEN 경로, Akt 경로, EGF-관련된 오토크린(autocrine) 루프, mTOR 경로, HIF1α 경로와 같은 PTEN 관련된 경로로도 불리는 몇몇의 경로에 관련된다. PI-3 키나아제 경로는 직접적으로 또는 간접적으로 PI-3 키나아제에 관련된 임의의 경로이다. PI-3 키나아제는 그러한 경로에서 억제제 또는 활성제로서 작용할 수 있거나 또는 경로의 다른 요소에 의해 조절될 수 있다.
PI-3 키나아제 경로 및/또는 HIF1α 경로를 수반하는 질환 및 상태을 개시하는 수많은 선행기술이 있다. 임의의 이들 상태 및 질환은 본원에서 개시한 방법 및 약물 및 진단물질의 고안, 검사 또는 제조방법에 의해 해결될 수 있다. 그러한 질환 및 질병의 예는 다음과 같으나 이에 한정되지 않는다: 자궁내막암, 직장암종, 신경교종, 선종, 자궁내막 비후, 코우덴(Cowden) 증후군, 유전적 비-폴립 직장암종, 리-프라우멘(Li-Fraumene) 증후군, 유방-난소 암, 전립선암(Ali, I. U., Journal of the National Cancer Institute, Vol. 92, no. 11, June 07, 2000, page 861-863), 바나얀-조아나나(Bannayan-Zonana)증후군, LDD(Lhermitte-Duklos’syndrome)(Macelod, K., supra), 카우(Cow) 질환(CD) 및 바나얀-루발카바-릴리(Bannayan-Ruvalcaba-rily) 증후군(BRR)을 포함한 과오종-대두증 질환, 점막피부 병변(예를들면, 트리칠렘몬마스), 대두증, 정신지체, 위장관 과오종, 지방종, 갑상선 선종, 유방의 섬유낭성 질환, 소뇌 형성장애 신경절 세포종 및 유방 및 갑상선 악성종양(Vazquez, F., Sellers, W. R., supra).
이와 관련하여, PRF1은 PRF1의 표적 상류에 유도된 다른 약물보다 부작용이 적은 약물에 의해 해결될 수 있는 PI-3 키나아제 경로 및/또는 HIF1α 경로에 대한 중요한 하류 약물 표적이다. 지금까지 본 발명은 공지된 기술, 예를들면 LY294002보다 더 선택적인 약제학적으로 활성인 화합물의 고안, 스크리닝, 개발 및 제조방법에 적절한 약물 표적을 제공하였다. 작동체 분자의 특정한 단편 즉, PRF1 및 상기 경로에 관련된 임의의 다른 하류 분자에 대한 대조용을 가짐으로써, 그 유사한 가지의 제한된 일부만 또는 신호 캐스케이드내의 다른 상류 표적은 원하지 않는 효과를 초래할 수 있다. 따라서, 세포주기, DNA 회복, 아폽토시스, 글루코오스 이동, 전이에 관련된 PI-3 키나아제/PTEN 경로 및/또는 HIF1α 경로의 다른 활성은 영향받지 않을 것이다.
상기 특이적 질환 및 조절 네트워크와 관련된 중요한 표적 분자는 별도로 하고, 핵산 수준 및 단백질 수준에서의 PRF1은 혼합치료의 개발 또는 적용 및 그러한 혼합 치료용 의약과 관련하여 특히 중요한 표적이다. 다시 말하면, PRF1 즉, 단백질뿐만 아니라 그에 대한 핵산 코딩은 세포, 조직, 기관을 민감하게 하는데 사용될 수 있는 화합물을 스크리닝, 생성, 제조 또는 고안하는데 사용될 수 있다. 상기 화합물은 단독으로 또는 의약과 함께 임의의 질환 및 상태를 치료하기 위한 의약을 제조하는데 사용될 수 있다.
어떠한 이론에 제한됨 없이, PRF1은 PI-3 키나아제 경로의 AKT 가지뿐만 아니라 HIF1α 가지를 통해 조절되는 것 같다. 세포반응의 아폽토시스에 역으로 작용하는 생존 반응을 유발하기 위해, HIF1α가 저산소증 조건하에서 상향 조절되며 Akt가 스트레스 조건하에서 상향-조절되는 바와 같이 RPF1을 다루며 핵산 수준 및/또는 단백질 수준에서 의약으로서 또는 RPF1의 파트너와 상호작용으로 사용될 수 있는 화합물은 세포를 임의의 조건으로 이동시킬 수 있으며, 상기 조건에서 다른 화합물은 특히 효과적이다. 따라서, 종양 질환에 한정되지 않고 상술한 임의의 질환을 치료하는데 사용될 수 있는 화합물의 스크리닝을 위한 화합물을 다루는 상기 PRF1을 사용하는 것은 본 발명의 범위에 속한다. 따라서, 상기 스크리닝은 저산소증 조건 및/또는 시스플라티늄, 방사선조사, 고체온 등의 세포증식 억제제를 적용하는 것과 같이 세포에 스트레스를 줌으로써 실시될 수 있다. 바람직하게는, 임의의 질환을 치료하기 위한 의약의 개발을 위해 화합물 및 의약의 스크리닝, 생성, 제조 및/또는 고안과 관련된 두가지 표적이 있는 바, 상기 표적중 하나는 바람직하게는 PRF1과 상이하다.
HIF1α와 같은 전사 인자에 대한 스크리닝은 성공적으로 실시될 수 있으며, Welsh, S. J. 등., Molecular Cancer Therapeutics Vol. 2, 235-243, March 2003에 개시되어 있다.
또한, 인슐린 신호는 유도되지 않으며, 이는 LY294002와 관련된 당뇨 반응 또는 다른 부작용을 실질적으로 피할 수 있다는 것을 의미한다. LY294002(2-(4-모르폴리닐)8-페닐크로몬)은 PI-3K에 대한 억제제로서 Lilly Research Laboratories(Indianapolis)에 의해 개발된 몇몇의 크로몬 유도체 소분자 억제제중 하나이다(Vlahos 등. 1994, JBC 269, 5241-5248). 이는 PI-3K, p110에 대한 이들의 촉매 서브유닛을 표적으로 하며, 촉매 중심에서 ADP 결합과 경쟁함으로써 기능한다. 그러나, LY294002는 상이한 세포 기능을 갖도록 시사하는 p110의 상이한 이소폼(알파, 베타, 감마, 델타)을 구별하지 못한다.
PRF1에 의해 취급되는 mTOR의 다른 하류이다. Raft 또는 FRAP로도 공지되어 있는 mTOR(라파마이신의 포유류 표적)은 세포주기내로 pp70 S6 키나아제 종속을 진입하게 하는 과정을 조절하는 PI 3-키나아제의 하류에 작용한다. mTOR은 pp70 S6 키나아제 및 개시 인자 4E의 활성화를 통해 번역을 조절하기 위해 성장인자 및 영양소 유효성에 대한 센서로서 작용한다. mTOR 기능은 T-세포 및 특정 종양 세포의 성장을 방해하는 세균성 마크로리드 라파마이신에 의해 억제된다(Kuruvilla 및 Scheriber 1999, Chemistry & Biology 6, R129-R136).
라파마이신 및 그 유도체가 현재 임상에서 사용되고 있는 적절한 약물이라는 사실은 표적 약물이 더 유익하고 부작용이 적다는 것을 입증하며, 더 구체적으로는 표적 약물이 특정한 분자 작용기전이라는 것으로 Yu 등에 의해 입증되었다(Yu, K. 등(2001) Endocrine-RelatCanc 8, 249). 라파마이신이 사람의 면역억제를 위해 사용되기 때문에 PRF1과 상호작용하는 약물은 이러한 적용에 있어서 더욱더 특이적일 것이다.
잠재적인 약물 표적으로서의 그 사용과 관련하여 PRF1의 특이성 때문에, PRF1은 선택적 및 특이적 PRF1의 검출을 허용하는 진단 표지 및 고안 물질로서 사용될 수 있다. 특정한 생물학적 현상 또는 신호 경로의 면에 대해 표지가 더 근접하고 특이적일수록, 최종적으로 관찰된 효과에 더 근접해지며 최종 과정, 본원의 경우에서는 전이 및 종양형성이 발생하기 쉬운지 여부에 대한 임의의 진술이 더 신뢰성이 있다. 따라서, PRF1 및 검출 PRF1을 기재로 하는 진단물질은 종양형성 및 전이 또는 상술한 임의의 질환 및 질환 상태의 가능성을 평가하는데 더욱 믿을만한 진단물질이다. PRF1을 기재로 하는 치료 물질의 고안, 스크리닝 및/또는 제조에 있어서, PRF1는 약물 또는 약물 후보 또는 진단물질로서 사용될 수 있는 화학적 화합물에 대해 화합물로서 사용될 수 있다. 이러한 화학적 화합물은 항체, 펩티드, 안티칼린, 아프타머, 스피엘겔머, 리보자임, 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 siRNA와 같은 다른 종류의 화합물뿐만 아니라 소분자에 속한다. 상기 화합물은 물리적 또는 화학적 실체 또는 PRF1에 관련된 정보로서 PRF1 자체를 사용함으로써 고안, 선택, 검사, 생성 및/또는 제조된다. 상기 종류의 화합물의 고안, 스크리닝, 생성 및/또는 제조과정에 있어서, PRF1은 각 화합물의 최종 적용보다는 그 과정에서 사용되는 표적으로 불릴 것이다. 다양한 종류의 화합물을 제공하는 과정에서, PRF1 또는 PRF1에 대한 핵산코딩이 사용될 수 있다. 본원에서 사용된 용어 PRF1은 의약 또는 진단물질로 사용될 각각의 화합물의 고안, 선택, 스크리닝, 생성 및/또는 제조를 허용하는 PRF1의 임의의 단편 또는 유도체를 포함한다. 용어 PRF1에 대한 핵산코딩은 PRF1 또는 그 일부분을 엔코딩하는 핵산을 함유하는 임의의 핵산을 포함할 것이다. PRF1을 코딩하는 핵산의 일부는 의약 또는 진단물질로 사용될 상기 종류의 화합물의 고안, 선택, 스크리닝, 생성 및/또는 제조에 적합한 한 그렇게 간주될 것이다. PRF1을 코딩하는 핵산은 게놈 핵산, hnRNA, mRNA, cDNA 또는 각각의 일부분일 수 있다.
상술한 화합물은 항체, 펩티드, 안티칼린, 아프타머, 스피엘겔머, 리보자임, 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 siRNA를 포함하지만 이에 한정되지 않는다는 것은 본 발명의 범위에 속한다.
PRF1 또는 일부분 또는 그 유도체 또는 그에 대한 핵산 서열은 별도로 하고, PRF1 또는 PRF1을 코딩하는 핵산으로부터 발생하는 효과를 생성 또는 억제하기 위해 다른 수단 또는 화합물이 사용될 수 있다. 그러한 스크리닝 방법에 있어서, 첫번째 단계는 하나 또는 수개의 후보 화합물을 제공하는 것이다. 본원에서 사용된 후보 화합물은 다양한 질환 및 질환 상태를 치료 또는 경감시키기 위한 실험 시스템에서 실험되기에 적합한 화합물을 의미한다. 후보 화합물이 실험 시스템에서 각가의 효과를 나타낸다면, 상기 후보 화합물은 상술한 질환 및 질환 상태를 치료하기 위한 적합한 수단 또는 물질일 뿐만 아니라 적절한 진단물질이다. 두번째 단계는 상기 후보 화합물을 PRF1 발현 시스템 또는 PRF1 활성 시스템과 접촉시키는 것이다. PRF1 활성 시스템은 PRF1 활성을 검출하는 시스템으로 불린다.
PRF1 발현 시스템은 PRF1의 발현을 나타내거나 디스플레이하는 발현 시스템인 반면, 발현의 정도 또는 수준은 기본적으로 변할 수 있다. PRF1 활성 시스템은 PRF1 발현보다 활성 또는 활성의 상태가 측정되는 발현 시스템이다. 더 구체적으로는, 후보 화합물의 영향하에서 PRF1 또는 PRF1을 코딩하는 핵산의 활성이 후보 화합물이 없는 상황과 다른지 여부를 실험하는 것이다. 특정 시스템이 발현 시스템이거나 활성 시스템인지 여부에 관계없이, 활성 및 발현의 증가 또는 감소는 발생 및 측정될 수 있음은 본 발명의 범위에 속한다. 일반적으로, 발현 시스템 및/또는 활성 시스템은 세포 추출물 또는 핵 추출물과 같은 세포 추출물의 단편과 같은 실험관내 반응 시스템이다. PRF1 발현 시스템 또는 활성 시스템은 상술한 질환 및 질환 상태에 관련된 세포 또는 조직 또는 기관의 세포일 수 있다.
본 발명에 따른 물질의 스크리닝 방법이 실시되어 d) 단계 후에 첫번째 단계에서 수득 또는 확인된 후보 화합물이 c) 단계 처리되는 것은 본 발명의 범위에 속하며, 상기에서 발현 시스템 또는 활성 시스템은 첫번째 과정중에 사용된 각각의 발현 시스템 또는 활성 시스템과는 상이하다. 따라서, 첫번째 과정에서 발현 시스템 및 활성 시스템은 상술한 질환에 관련된 세포일 수 있는 반면, 두번째 과정에서 상기 세포는 상기 질환에 관련되지 않는 세포일 수 있다. 다른 구체예로서, 상기 두가지 세포 유형의 사용 순서는 거꾸로 된다.
활성 시스템 또는 발현 시스템의 증가 또는 감소가 있는지 여부는 발현의 각 수준에서 측정될 수 있는 바, 예를들면 PRF1을 코딩하는 핵산, 더욱 특히, mRNA의 양의 증가 또는 감소를 측정함으로써, 또는 후보 화합물의 영향하에서 발현된 PRF1의 증가 또는 감소를 측정함으로써 측정가능하다. 측정에 필요한 기법, 더 구체적으로 mRNA 또는 단백질과 같은 이러한 유형의 변화에 대한 정량 측정은 당업자에게 공지되어 있다. 적절한 항체의 사용에 의해 PRF1의 양 또는 함량을 측정하는 방법 또한 당업자에게 공지되어 있다. 항체는 당업자에게 공지된 바와 같이 생성될 수 있다(Harlow, E., 및 Lane, D.,“Antibodies: A Laboratory Manual, ” Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, (1988).
PRF1 발현 시스템의 경우에서, PRF1의 활성의 증가 또는 감소는 작용 에세이에서 측정될 수 있다.
후보 화합물의 발현 시스템 및 활성 시스템과의 접촉은 각각의 반응 시스템에 후보 화합물의 수용액을 부가함으로써 실시된다. 수용액외에 유기 용매내의 후보 화합물의 현탁액 또는 용액이 사용될 수 있다. 상기 수용액은 바람직하게는 완충 용액이다.
바람직하게는, 발현 시스템 및 활성 시스템을 사용하는 각 단계에서 단일 화합물만이 사용된다. 그러나, 이러한 유형의 실험은 고 유출 시스템과 유사하게 실시된다는 것 또한 본 발명의 범위에 속한다.
본 발명에 따른 다른 단계는 후보 화합물의 영향하에서 PRF1 또는 PRF1을 코딩하는 핵산과 관련된 발현 시스템 및 활성 시스템의 발현 또는 활성이 변하는지 여부를 측정하는데 있다. 일반적으로, 이는 후보 화합물의 부가없이 시스템에 관련된 후보 화합물의 부가시에 시스템 반응를 비교함으로써 실시된다. 기본적으로 임의의 화합물 라이브러리는 화합물 종류에 관계없이 본 벌명의 목적에 적합하다. 그러한 화합물 라이브러리는 소분자, 펩티드, 단백질, 항체, 안티칼린 및 작용 핵산으로 구성된 라이브러리이다. 후자 화합물은 당업자에게 당업자에게 공지된 바와 같이 생성될 수 있다.
PRF1에 대한 특이적 항체 또는 PRF1을 코딩하는 핵산의 제조는 당업자에게 공지되어 있으며 Harlow, E., 및 Lane, D.,“Antibodies: A Laboratory Manual, ” Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, (1988)에 개시되어 있다. 바람직하게는, 단일클론 항체는 Cesar 및 Milstein의 프로토콜에 따라 제조될 수 있는 본 발명과 관련하여 사용될 수 있다. 본원에서의 항체는 단백질 키나아제 N 베타와 결합할 수 있는 한, 완전 항체, 항체 단편 또는 Fab 단편, Fc 단편과 같은 유도체 및 단일 가닥 항체를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 단일클론 항체는 별도로 하고, 다클론 항체가 사용 및/또는 생성될 수 있다. 다클론 항체의 생성은 당업자에게 공지되어 있으며 Harlow, E., 및 Lane, D.,“Antibodies: A Laboratory Manual, ” Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, (1988)에 개시되어 있다. 바람직하게는, 치료 목적으로 사용되는 상기 항체는 사람의 항체이다.
본 발명에 따라 사용될 수 있는 상기 항체는 하나 또는 몇개의 표지 또는 라벨을 가질 수 있다. 그러한 표지 또는 라벨은 진단적 적용 또는 치료적 적용에서 항체를 검출하는데 유용할 수 있다. 바람직하게는, 상기 표지 또는 라벨은 아비딘, 스트렙트아비딘, 비오틴, 골드 및 플루오레세인을 포함하는 그룹으로부터 선택된다. 이들 및 다른 표지는 Harlow 등에 개시되어 있다(Harlow, E., 및 Lane, D.,“Antibodies: A Laboratory Manual, ” Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, (1988).
상기 라벨 또는 표지는 검출은 별도로 하고 다른 분자와의 상호작용과 같은 부가적인 기능을 나타내는 것은 본 발명의 범위에 속한다. 그러한 상호작용은 다른 화합물과의 특이적 상호작용일 수 있다. 이러한 다른 화합물은 사람 또는 동물 몸에 항체가 사용되는 시스템 또는 각각의 항체를 사용하여 분석되는 샘플일 수 있다. 적절한 표지는 아비딘 및 스트렙트아비딘과 같이 그 특이적 상호작용 파트너를 갖는 비오틴 및 플루오레세인 및 표지 또는 라벨 항체와 상호작용하는 화합물 또는 구조상에 존재하는 기타일 수 있다.
PRF1 단백질 또는 PRF1을 코딩하는 핵산을 사용하여 생성될 수 있는 진단물질뿐만 아니라 의약의 다른 종류는 그에 결합하는 펩티드이다. 그러한 펩티드는 본 발명에 따른 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 기본적으로, 펩티드의 라이브러리는 상의 형태로 생성되며 이러한 유형의 라이브러리는 표적분자, 본원의 경우에서는 PRF1과 접촉한다. 표적분자에 결합한 이들 펩티드는 바람직하게는 표적분자를 갖는 복합체로서, 그 후에 각각의 반응으로부터 제거된다. 결합특징, 결합의 정도는 염농도와 같은 특별히 실현된 실험 설정에 따라 다르다는 것은 당업자에게 공지되어 있다. 높은 친화도 또는 큰 힘을 갖는 표적분자에 결합된 이들 펩티드를 라리브러리의 비-결합 구성요소로부터 분리한 후 및 경우에 따라 표적분자의 복합체 및 펩티드로부터 표적분자를 제거한 후, 각각의 펩티드는 이어 특징화될 수 있다. 특징화 이전에 펩티드 코딩 상을 증식시키는 것과 같은 증폭 단계가 경우에 따라 실시될 수 있다. 상기 특징화는 바람직하게는 표적 결합한 펩티드의 서열을 포함한다. 기본적으로, 상기 펩티드는 이들의 길이에 제한되지 않지만, 바람직하게는 상기 펩티드는 약 8 내지 20개 아미노산의 길이를 갖는다. 라이브러리의 크기는 약 102 내지 1018, 바람직하게는 108내지 1015 다른 펩티드일 수 있지만 이에 한정되지 않는다.
표적 결합한 폴리펩티드의 특별한 형태는“안티칼린”으로 독일특허출원 DE 197 42 706에 개시되어 있다.
본 발명에 따른 PRF1 및 PRF1을 코딩하는 핵산은 질환 및 질환 상태를 치료하기 위한 의약의 개발 또는 제조용 뿐만 아니라 스크리닝 과정에서 질환 및 질환 상태를 진단하기 위한 수단을 개발 및/또는 제조하기 위한 표적으로서 사용될 수 있으며, 상기 스크리닝 과정에서 소분자 또는 소분자의 라이브러리가 사용된다. 상기 스크리닝은 상기 표적분자를 단일 소분자 또는 다양한 소분자와 동시에 또는 이후에 접촉시키는 단계 및 그러한 소분자 도는 소분자에 결합한 라이브러이 구성요소를 확인하는 단계를 포함한다. 특정한 실험에 의해 강하게 영향을 받을 수 있는 결합 및 비-결합을 알 것이다. 반응 매개변수의 변경에 있어서, 이 스크리닝 과정의 정교한 튜닝을 허용하는 결합 및 비-결합의 정도를 변경하는 것이 가능할 것이다. 바람직하게는, 특이적으로 표적 분자와 결합하는 하나 또는 수개의 소분자를 확인한 후, 이 소분자는 추가로 특징화가 될 수 있다. 이 추가 특징은 예를들면, 소분자의 확인 및 그 분자구조의 측정 및 다른 물리적, 화학적, 생물학적 및/또는 의료적 특징에 있다. 바람직하게는, 천연 화합물는 약 100 내지 1000Da의 분자량을 갖는다. 또한, 바람직하게는 소분자는 당업자에게 공지된 Lepinsky 규칙에 순응하는 소분자이다. 다르게는, 소분자는 바람직하게는 비합성인 천연 산물과 대조적으로 조합 화학으로부터 생성된 합성 소분자로 정의될 수 있다. 그러나, 이러한 정의는 당해 기술에 있어서 각각의 용어에 대한 일반적인 이해에 부수적일 뿐이다.
후에 직접적으로 또는 간접적으로 의약 또는 진단물질로 사용될 수 있는 아프타머 및 스피엘겔머의 제조 또는 선별을 위한 표적 분자로서 PRF1 및/또는 PRF1을 코딩하는 핵산을 사용하는 것은 본 발명의 범위에 속한다.
아프타머는 단일 또는 이중가닥이며 특이적으로 표적분자와 상호작용하는 D-핵산이다. 아프타머의 제조 또는 선별은 유럽특허 EP 0 533 838에 개시되어 있다. 기본적으로 하기 단계가 실시된다. 첫째로, 핵산의 혼합물 즉, 잠재적 아프타머가 제공되며, 각 핵산은 수개의, 바람직하게는 8개 이상의 연속적으로 무작위 추출된 뉴클레오티드의 단편을 일반적으로 포함한다. 이 혼합물은 이어 표적분자와 접촉하며, 상기 핵산은 후보 혼합물과 비교하여 표적분자에 대한 증가된 친화도를 토대로 하여 표적분자와 결합한다. 결합된 핵산은 이어 혼합물의 나머지로부터 분리된다. 경우에 따라, 이렇게 수득한 핵산은 폴리머라아제 연쇄 반응에 의해 증폭된다. 이러한 단계는 수회 반복되어 최종 결합 핵산으로부터 선택된 표적에 특이적으로 결합한 핵산의 증가된 비율을 갖는 최종 혼합물을 생성한다. 특이적으로 결합하는 이들 핵산은 아프타머로 불린다. 각 핵산 혼합물의 아프타머 샘플을 생성 또는 확인 하기 위한 방법의 임의 단계에서 표준 기법을 사용하여 그 서열을 측정할 수 있다. 당업자에게 공지된 아프타머의 생성기술의 화학 기를 도입함으로써 아프타머가 안정화될 수 있음은 본 발명의 범위에 속한다. 그러한 변형은 뉴클레오티드의 당 잔기의 2'-위치에서 아미노기의 도입에 있다. 아프타머는 현재 치료 물질로 사용되고 있다. 그러나, 이렇게 선별 또는 생성된 아프타머는 표적 확인을 위해 및/또는 의약, 바람직하게는 소분자를 기재로 하는 의약의 개발을 위한 주요 물질로서 사용될 수 있음은 본 발명의 범위에 속한다. 이는 경쟁적 에세이에 의해 실시되며 표적분자와 아프타머간의 특이적 상호작용은 후보 약물에 의해 억제되며 표적과 아프타머의 복합체로부터 아프터머의 교환시 각 약물 후보는 표적과 아프타머간의 상호작용의 특이적 억제를 허용하며 상기 상호작용이 특이적이라면 상기 후보 약물은 적어도 원칙적으로 상기 표적을 차단하는데 적합할 것이므로 그러한 표적을 포함하는 각 시스템에서 생물학적 유용성 또는 활성을 감소시킨다. 이렇게 수득된 소분자는 독성, 특이성, 생물분해성 및 생물유용성과 같은 그 물리적, 화학적, 생물학적 및/또는 의학적 특성을 최적화하기 위해 추가 유도체화 및 변형처리된다.
PRF1 또는 PRF1을 코딩하는 핵산을 사용하여 본 발명에 따라 사용 또는 생성될 수 있는 스피엘겔머의 생성 또는 제조는 유사한 윈칙을 토대로 한다. 스피엘겔머의 제조는 국제특허출원 WO 98/08856에 개시되어 있다. 스피엘겔머는 L-핵산으로, 이는 스피엘겔머가 D-뉴클레오티드보다는 L-뉴클레오티드로 구성되었음을 의미한다. 스피엘겔머는 아프타머와 비교할때 생물학적 계에서 매우 높은 안정성을 갖고 스피엘겔머가 유도된 것에 대해 표적분자와 특이적으로 상호작용하는 것을 특징으로 한다. 스피엘겔머의 생성과정에 있어서, D-핵산의 이종 집단이 생성되며, 이 집단은 표적분자의 광학 대칭체, 본원의 경우에서는 PRF1의 천연산출 L-에난티오머의 D-에난티오머와 접촉한다. 이어, 표적분자의 광학대칭체와 상호작용하지 않는 이들 D-핵산은 분리된다. 그러나, 표적분자의 광학대칭체와 상호작용하는 이들 D-핵산은 분리되며, 경우에 따라 측정 및/또는 서열화되며 및 그 후에 대응하는 L-핵산은 D-핵산으로부터 수득한 핵산 서열 정보를 토대로 합성된다. 표적 분자의 광학 대칭체와 상호작용하는 D-핵산과 서열에 있어서 동일한 이들 L-핵산은 표적분자의 광학대칭체보다는 천연산출 표적분자와 특이적으로 상호작용할 것이다. 아프터머의 생성 방법과 유사하게 다양한 단계를 수회 반복하므로써 표적분자의 광학대칭체와 특이적으로 상호작용하는 이들 핵산이 많아지게 하는 것이 가능하다.
표적분자로서 PRF1 또는 PRF1을 코딩하는 핵산을 토대로 제조 또는 생성할 수 있는 다른 종류의 화합물은 리보자임, 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 siRNA이다. PRF1의 기능 및 작용 방식때문에, 이러한 종류의 분자들은 바람직하게는핵산 서열을 토대로 하여 생성 및/또는 제조된다.
상술한 모든 핵산이 번역 산물의 수준에서, 본원의 경우에서는 PRF1의 수준에서 표적 분자와 상호작용하지 않지만 전사 산물, 즉 PRF1을 코딩하는 핵산 예컨대, 게놈 핵산 또는 이로부터 유래된 임의의 핵산, 예컨대, 상응하는 hnRNA, cDNA 및 mRNA와 상호작용하는 것은 일반적인 특징이다. 상술한 종류의 화합물의 표적 분자는 바람직하게는 PRF1의 mRNA이다.
리보자임은 주개의 잔기를 기본적으로 포함하는 RNA로 구성되는 촉매 활성 핵산이다. 첫번째 잔기는 촉매 활성을 나타내는 반면, 두번째 잔기는 표적 핵산, 본원의 경우에서는 단백질 키나아제 N 베타을 코딩하는 핵산과의 특이적 상호작용에 관여한다. 하이브리다이즈 및 두 하이브리다이즈 가닥상의 염기의 본질적으로 상보적인 스트레치의 Watson-Crick 염기쌍에 의해 표적 핵산과 리보자임의 두번째 잔기간의 상호작용시, 상기 촉매 활성 잔기는 활성화될 수 있는 바, 이는 상기 잔기가 분자간 또는 분자내에서 촉매작용을 한다는 의미이며, 리보자임의 촉매 활성의 경우에 상기 표적 핵산은 포스포디에스테라아제 활성이다. 그 결과, 표적 핵산의 추가 분해가 있을 수 있어 결국 표적 핵산뿐만 아니라 상기 표적핵산으로부터 유도된 단백질, 본원의 경우에서는 PRF1 분해를 초래하는데 이는 새롭게 합성된 PRF1의 결핍 및 이전에 존재하는 PRF1의 전복때문이다. 리보자임, 이들의 용도 및 고안 원칙은 당업자에게 공지되어 있으며 Doherty 및 Doudna(Ribozyme structure and mechanism, Annu ref. Biophys. Biomolstruct. 2001; 30: 457-75) 및 Lewin 및 Hauswirth(Ribozyme Gene Therapy: Application for molecular medicine. 2001 7: 221-8)에 개시되어 있다.
의약 및 진단물질의 제조를 위한 안티센스 올리고뉴클레오티드의 사용은 유사한 작용방식을 토대로 한다. 기본적으로, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 표적 RNA, 바람직하게는 mRNA를 갖는 염기 상보성을 토대로 하이브리다이즈하므로써 RNase H를 활성화시킨다. RNase H는 포스포디에스테르 및 포스포로티오에이트-결합된 DNA에 의해 활성화된다. 포스포디에스테르-결합된 DNA는 포스포로티오에이트-결합된 DNA를 제외하고는 세포 뉴클레아제에 의해 빠르게 분해된다. 이러한 내성의, 비-천연 산출 DNA 유도체는 RNA와 하이브리다이즈시 RNase H를 억제하지 않는다. 즉, 안티센스 폴리뉴클레오티드는 DNA RNA 하이브리다이즈 복합체로서 효과적일 뿐이다. 이러한 유형의 안티센스 올리고뉴클레오티드의 예는 미국특허 US 5,849,902 및 US 5,989,912에 개시되어 있다. 즉 표적 분자의 핵산서열, 본원의 경우에서는 PRF1을 코딩하는 핵산을 토대로 각각의 핵산 서열이 유도될 수 있는 표적 단백질로부터 또는 특정한 mRNA와 같은 핵산 서열을 앎으로써 적절한 안티센스 올리고뉴클레오티드가 염기 상보성의 윈칙을 토대로 고안될 수 있다.
포스포로티오에이트 DNA(3 내지 9개 염기)의 짧은 가닥을 갖는 안티센스-올리고뉴클레오티드가 특히 바람직하다. 박테리아 RNase H를 활성화하기 위해서는 최소한 3개 DNA 염기가 필요하며 포유류 RNase H의 활성화에는 최소한 5개 염기가 필요하다. 이러한 올리고뉴클레오티드에는 RNase H에 대한 기질을 형성하지 않는 변형된 뉴클레오티드로 구성되는 “암스(arms)”를 하이브리다이즈함으로써 측면위치하는 RNase H에 대한 기질을 형성하는 중심 영역이 존재한다. 올리고뉴클레오티드의 하이브리다이즈되는 암스는 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로에 의해 변형될 수 있다. 본 발명의 실시예에 유용한 안티센스 올리고뉴클레오티드의 다른 구체예는 P-메톡시올리고뉴클레오티드, 부분적 P-메톡시올리고데옥시리보뉴클레오티드 또는 P-메톡시올리고뉴클레오티드이다.
본 발명에 있어서 특히 관련되고 유용한 것은 이들 안티센스 올리고뉴클레오티드이다. 이들 뉴클레오티드는 천연산출 5'→3' 결합 뉴클레오티드를 함유하지 않는다. 오히려, 상기 뉴클레오티드는 2가지 형태의 뉴클레오티드를 갖는다: RNase H를 활성화하는 2'-데옥시포스포로티오에이트 및 RNase H를 활성화하지 않는 2'-변형된 뉴클레오티드. 2'-변형된 뉴클레오티드간의 결합은 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트 또는 P-에톡시포스포디에스테르일 수 있다. RNase H의 활성화는 박테리아 RNase H를 활성화하는 3 및 5 2'-데옥시포스포로티오에이트 및 포유류 RNase H를 활성화하는 5 및 10 2'-데옥시포스포로티오에이트를 함유하는 인접하는 RNase H-활성화 영역에 의해 이루어진다. 퇴화로부터의 보호는 5' 및 3' 말단 염기를 뉴클레아제 내성을 높게 만듬으로써 및 경우에 따라 3' 말단 차단기를 놓음으로써 이루어진다.
더 구체적으로, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 5' 말단 및 3' 말단을 포함한다; 및 2'-변형된 포스포디에스테르 뉴클레오티드 및 2'-변형된 P-알킬옥시포스포트리에스테르 뉴클레오티드로 구성되는 그룹으로부터 독립적으로 선택된 11 내지 59개 5'→3'-결합 뉴클레오티드; 및 상기에서 5'-말단 뉴클레오티드는 3개 및 10개의 인접하는 포스포로티오에이트-결합 데옥시리보뉴클레오티드간의 RNase H-활성화 영역에 부착되며, 및 상기 올리고뉴클레오티드의 3'-말단은 전화된 데옥시리보뉴클레오티드, 인접하는 스트레치의 1개 내지 3개의 포스포로티오에이트 2'-변형된 리보뉴클레오티드, 비오틴 기 및 P-알킬옥시포스포트리에스테르 뉴클레오티드로 구성되는 그룹으로부터 선택된다.
또한 안티센스 올리고뉴클레오티드가 사용될 수 있는 바, 상기에서 RNase H-활성화 영역에 부착된 것은 5' 말단 뉴클레오시드가 아니고 3' 말단 뉴클레오시드이다.
적절하고 유용한 안티센스 올리고뉴클레오티드는 5' 말단 RNase H 활성화 영역을 포함하며 5개 및 10개의 인접하는 데옥시포스포로티오에이트 뉴클레오티드를 갖는 것들이다; 11 내지 59개의 인접하는 5'→3'-결합 2'-메톡시리보뉴클레오티드; 및 엑소뉴클레아제 차단기는 비-5'-3'-포스포디에스테르-결합 뉴클레오티드, 1개 내지 3개의 인접하는 5'-3'-결합 변형된 뉴클레오티드 및 비-뉴클레오티드 화학적 차단기로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드의 3' 말단에 존재한다.
특히 바람직한 안티센스 뉴클레오티드의 두가지 유형은 다음과 같이 특징화될 수 있다:
첫번째 유형의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 5'→3' 방향으로 7개의 2'-O-메틸리보뉴클레오티드의 스트레치, 9개의 2'-데옥시리보뉴클레오티드의 스트레치, 6개의 2'-O-메틸리보뉴클레오티드 및 3'-말단 2'-데옥시리보뉴클레오티드로 구성되는 총 23개 뉴클레오티드를 포함한다. 7개의 2'-O-메틸리보뉴클레오티드의 첫번째 그룹으로부터 첫번째 4개는 포스포로티오에이트 결합된 반면, 다음의 4개 2'-O-메틸리보뉴클레오티드는 포스포디에스테르 결합되어 있다. 또한, 2'-O-메틸리보뉴클레오티드의 가장 3' 말단 및 9개의 2'-데옥시리보뉴클레오티드로 구성되는 스트레치의 첫번째 뉴클레오티드사이에 포스포디에스테르 결합이 존재한다. 모든 2'-데옥시리보뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 결합되어 있다. 포스포로티오에이트 결합은 가장 3'-말단 2'-데옥시리보뉴클레오티드 및 6개의 2'-O-메틸리보뉴클레오티드로 구성되는 그다음 스트레치의 첫번째 2'-O-메틸리보뉴클레오티드사이에 존재한다. 6개의 2'-O-메틸리보뉴클레오티드의 그룹으로부터 첫번째 4개는 5'→3' 방향으로 포스포디에스테르 결합되어 있는 반면, 위치 20 내지 22에 대응하는 나머지 3개는 포스포로티오에이트 결합되어 있다. 3'-말단 2'-데옥시뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 결합을 통해 가장 3'-말단 2'-O-메틸리보뉴클레오티드에 결합되어 있다.
이 첫번째 유형은 하기 구조식으로 나타낼 수 있다:RRRnnnnNNNNNNNNNnnnRRRN. 상기에서, R은 포스포로티오에이트 결합된 2'-O-메틸리보뉴클레오티드(A, G, U, C)를 나타내며; n은 2'-O-메틸리보뉴클레오티드(A, G, U, C)를 나타내며; N은 포스포로티오에이트 결합된 데옥시리보뉴클레오티드(A, G, T, C)를 나타낸다.
두번째 유형의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 Gene Blocs으로도 불리며 하기 염기 구조식(5'→3' 방향으로)을 갖는 총 17 내지 23개 뉴클레오티드를 또한 포함한다.
5'-말단부에는 뉴클레아제 활성에 대한 내성을 부여하기에 적절한 구조인 전화된 염기 뉴클레오티드가 존재하며 이는 WO 99/54459에 개시되어 있다. 이 전화된 염기는 포스포디에스테르 결합된 5개 내지 7개의 2'-O-메틸리보뉴클레오티드의 스트레치에 결합되어 있다. 이 5개 내지 7개의 2'-O-메틸리보뉴클레오티드의 스트레치 다음에는 모두 포스포로티오에이트 결합되어 있는 7개 내지 9개의 2'-데옥시리보뉴클레오티드의 스트레치가 존재한다. 가장 3'-말단 2'-O-메틸리보뉴클레오티드 및 스트레치를 포함하는2'-데옥시뉴클레오티드의 첫번째 2'-데옥시뉴클레오티드간의 결합은 포스포디에스테르 결합을 통해 발생한다. 7개 내지 9개의 2'-데옥시리보뉴클레오티드의 스트레치에 인접하여 5개 내지 7개의 2'-O-메틸리보뉴클레오티드로 구성되는 스트레치가 결합되어 있다. 마지막 2'-데옥시뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 결합을 통해 발생하는 5개 내지 7개의 2'-O-메틸리보뉴클레오티드로 구성되는 상기 후자 스트레치의 첫번째 2'-O-메틸리보뉴클레오티드에 결합되어 있다. 5개 내지 7개의 2'-O-메틸리보뉴클레오티드의 스트레치 및 포스포디에스테르가 결합되어 있다. 5개 내지 7개의 2'-O-메틸리보뉴클레오티드의 두번째 스트레치의 3'-말단에서 다른 전화된 염기가 부착되어 있다.
이 두번째 유형은 하기 구조식으로 나타낼 수 있다:(세번째 생성의 안티센스 올리고뉴클레오티드를 나타내는 GeneBlocs 또한 하기 구조식을 갖는다:) cap-(np)x(Ns)y(np)x-cap 또는 cap-nnnnnnnNNNNNNNNNnnnnnnn-cap. 상기에서, cap는 전화된 데옥시 염기 또는 양쪽 단부에서 유사한 변형을 나타낸다; n은 2'-O-메틸리보뉴클레오티드(A, G, U, C)를 나타내며; N은 포스포로티오에이트 결합된 데옥시리보뉴클레오티드(A, G, T, C)를 나타낸다; x는 5 내지 7의 정수를 나타낸다; y는 7 내지 9의 정수를 나타낸다; 및 z는 5 내지 7의 정수를 나타낸다.
x 및 z가 주어진 안티센스 올리고뉴클레오티드에서 동일한게 바람직하지만, 상기 정수 x, y 및 z는 서로 독립적으로 선택될 수 있다. 따라서, 세번째 생성의 안티센스 올리고뉴클레오티드의 염기 구조식은 다음과 같다: cap-(np)5(Ns)7(np)5-cap, cap-(np)6(Ns)7(np)5-cap, cap-(np)6(Ns)7(np)5-cap, cap-(np)6(Ns)8(np)5-cap, cap-(np)6(Ns)8(np)5-cap, cap-(np)7(Ns)8(np)5-cap, cap-(np)5(Ns)9(np)5-cap, cap-(np)6(Ns)9(np)5-cap, cap-(np)7(Ns)9(np)5-cap, cap-(np)5(Ns)7(np)5-cap, cap-(np)6(Ns)7(np)5-cap, cap-(np)7(Ns)7(np)5-cap, cap-(np)5(Ns)8(np)6-cap, cap-(np)6(Ns)8(np)6-cap, cap-(np)7(Ns)8(np)6-cap, cap-(np)5(Ns)9(np)6-cap, cap-(np)6(Ns)9(np)6-cap, cap-(np)7(Ns)9(np)6-cap, cap-(np)5(Ns)7(np)7-cap, cap-(np)6(Ns)7(np)7-cap, cap-(np)7(Ns)7(np)7-cap, cap-(np)5(Ns)8(np)7-cap, cap-(np)6(Ns)8(np)7-cap, cap-(np)7(Ns)8(np)7-cap, cap-(np)5(Ns)9(np)7-cap, cap-(np)6(Ns)9(np)7-cap 및 cap-(np)7(Ns)9(np)7-cap.
본원의 기술적인 방법을 토대로 하여 제조 및 의약 및/또는 진단물질로 사용될 수 있는 다른 유형의 화합물은 PRF1을 코딩하는 핵산, 바람직하게는 mRNA로 유도된 소간섭 RNA(siRNA)이다. siRNA는 약 21 내지 23개 뉴클레오티드의 길이를 갖는 이중가닥 RNA이다. 두 RNA 가닥중 하나의 서열은 PRF1을 코딩하는 핵산과 같이 퇴화될 표적핵산의 서열에 대응한다. 즉, 표적분자, 본원의 경우에서는 PRF1, 바람직하게는 mRNA 서열의 핵산 서열을 앎으로써, 이중가닥 RNA는 PRF1의 mRNA에 상보적인 두 가닥중 하나를 사용하여 고안될 수 있으며, 유전자, 게놈 DNA, hnRNA 또는PRF1에 대한 mRNA 코딩을 함유하는 시스템에 상기 siRNA를 적용할 때, 각각의 표적 핵산은 퇴화될 것이므로 각각의 단백질의 수준은 감소된다. 의약 및 진단물질로서 상기 siRNA를 고안, 구성 및 사용의 기본 원칙은 국제특허출원 WO 00/44895 및 WO 01/75164에 개시되어 있다.
항체, 펩티드, 안티칼린, 아프타머, 스피엘겔머, 리보자임, 안티센스 올리고뉴클레오티드뿐만 아니라 siRNA와 같은 상술한 유형의 화합물의 작용 방식을 토대로 의약 또는 진단물질의 제조를 위해 PRF1 및 이를 코딩하는 핵산을 표적으로 하는 이들 화합물의 사용은 본 발명의 범위에 속한다. 또한, 이들 물질은 상기 질환 및 질환 상태 및 적용한 임의의 치료 성공을 모니터하는데 사용될 수 있다.
항체, 펩티드, 안티칼린, 소분자, 아프타머, 스피엘겔머, 리보자임, 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 siRNA와 같은 본 발명에 따라 고안된 다양한 유형의 화합물은 약제학적 조성물에 함유될 수 있다. 바람직하게는 그러한 약제학적 조성물은 상술한 질환 및 질환상태를 치료하는데 사용된다. 상기 약제학적 조성물은 한 또는 수개의 상술한 유형의 화합물 및/또는 하나 이상의 단일 유형 및 경우에 따라 약제학적으로 활성인 화합물 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 그러한 담체는 용액, 완충액, 알코올 용액 등과 같이 액체 또는 고체일 수 있다. 적절한 고체 담체는 녹말 등이다. 경구, 비경구, 피하, 정맥내, 근육내 투여를 하기 위해 상술한 유형의 화합물에 따른 다양한 화합물의 제형은 당업자에게 공지되어 있다.
상술한 바와 같이 상이한 유형의 다양한 화합물은 단독으로 또는 혼합하여 키트 처리되거나 또는 키트내에 포함될 수 있다. 그러한 키트는 각각의 화합물을 제외하고 하나 또는 수개의 다른 인자 또는 화합물을 부가적으로 포함하며 상기 요소는 완충액, 음성 대조용, 양성 대조용 및 다양한 화합물의 사용에 관한 지침을 포함하는 그룹으로부터 선택된다. 바람직하게는, 다양한 화합물은 건조된 형태 또는 액체 형태, 바람직하게는 단일 투여용 단위 복용량으로 존재한다. 상기 키트는 상술한 질환 및 질환상태와 관련된 질환의 예후를 치료, 진단 또는 모니터링하는데 사용될 수 있다.
다른 요지에서 PRF1 및 이를 코딩하는 핵산 및 바람직하게는 아미노산 서열 및 PRF1 폴리펩티드 또는 단백질은 상술한 질환 및 질환상태를 치료 및/또는 예방 및/또는 진단하는데 유용한 화합물의 개발 및/또는 생성 및/또는 고안하는데 사용될 수 있다. 이를 위해, 첫번째 단계에서 PRF1, 바람직하게는 PRF1 단백질의 상호작용 파트너가 측정 또는 검사된다. 더 바람직하게는 그러한 상호작용 파트너는 천연산출 상호작용 파트너이며 더욱더 바람직하게는 그러한 상호작용 파트너는 천연 상호작용 파트너이다. 그러한 상호작용 파트너를 측정 또는 스크리닝하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 공지된 기술은 Ausubel(supra), unit 13.14“Interaction Trap/Two-Hybrid System to Identify Interacting Proteins”or Rields S., Song, O., Nature. 1980 Jul 20; 340(6230): 245-6에 개시되어 있는 2-하이브리다이즈 시스템이다. 다른 상호작용 파트너는 세포 추출물 또는 세포 용해물로부터 PRF1 단백질 또는 그 단편을 침강시키며, PRF1에 부착되거나 또는 같이 침강되는 다른 인자를 측정한다. 그러한 분석은 질량 분광학과 같이 당업자에게 공지된 표준 기법을 사용하요 실시될 수 있다. 특정 구체예로서, 상기 침강은 면역침강이다. 다른 구체예로서, 상기 침강은 방사성-표지된 세포, 바람직하게는 35S 표지된 세포를 사용하여 이루어진다. 상호작용 파트너을 제외하고, 특히 천연 상호작용 파트너는 수득된 즉, 녹여서 분리된 단편을 특징으로 하여 크로마토그래피 수단에 의해 측정될 수 있다. 바람직한 구체예로서, 그러한 크로마토그래피 수단은 친화력 크로마토그래피일 수 있으며, 상기에서 PRF1 단백질은 분리 배지상에 고정된다. PRF1 단백질과 가능한 상호작용 파트너간의 특이적 상호작용때문에, 이 상호작용 파트너는 크로마토그래피 과정에서 리간드로 작용할 것이므로 정제될 수 있다.
두번째 단계에서, 이렇게 확인된 상호작용 파트너는 PRF1에 대한 스크리닝 과정에 사용될 수 있다. 부가적으로 또는 다르게는, 폴리펩티드 또는 핵산 기제된 상호작용 파트너일 경우, 상호작용 파트너를 코딩하는 핵산은 항체, 펩티드, 안티칼린, 소분자, 아프타머, 스피엘겔머, 리보자임, 안티센스 분자(안티센스 올리고뉴클레오티드) 및 siRNA를 포함하나 이에 한정되지 않는 화합물의 고안 및/또는 제조 및/또는 생성에 사용될 수 있다. 용어 siRNA와 관련하여 그 임의의 형태는 WO 03/070918에 개시된 바와 같은 siRNAㄹ르 포함하나 이에 한정되지 않는다.
상술한 첫번째 단계는 두번째 단계만의 선택적인 실시와 함께 그 자체적인 방법일 수 있음이 이해되어야 한다.
본 발명은 본 발명의 범위를 제한하지 않고 하기 도면, 실시예에 의해 더 상세하게 설명될 것이다.
도 1은 PI 3-키나아제 경로의 성장인자 유도된 활성성의 개략도를 나타내며;
도 2는 라파마이신(Rapamune)으로 처리한 동소 PC-3 마우스 모델에서 림프절 전이의 측정을 나타내며;
도 3은 PI 3-키나아제 경로의 하류 약물 표적으로서 PRF1을 확인하는 실험방법을 나타내며;
도 4는 PC-3 세포상의 일차 GeneBloc 스크린을 나타내며;
도 5는 마트리겔상의 PRF1 특이적 GeneBloc에 형질감염된 PC-3 세포의 성장을 나타내며 도 5a는 이들 조건하에서의 mRNA 녹다운을 나타내며 도 5b는 마트리겔상에서 성장한 각각의 세포로부터 찍은 사진을 나타내며;
도 6은 PRF1 특이적 RNA 간섭에 의한 전립선 종양 성장 억제의 정도를 나타내며(도 6c), 및 동일한 PRF1 특이적 RNA 간섭을 사용하여 총 림프절 전이의 정도를 나타내며(도 6d) 도 6a는 siRNA의 발현에 대한 염기성 벡터 고안을 나타내며 도 6b는 사용된 siRNA 서열을 나타내며;
도 7은 분화 발현 실험의 결과를 나타내는 바, 상기에서 PRF1의 발현은 PI 3-키나아제 경로의 상이한 요소를 해결하기 위해 상이한 화합물로 처리된 세포를 사용하여 다양한 세포 성장 표면상에서 성장한 상이한 세포주를 모니터링하였으며;
도 8a는 PRF1에 대한 다클론성 항체의 특이성을 특징으로 하는 웨스턴 블럿 분석의 결과를 나타내며;
도 8b는 예비면역 혈청을 사용하여 도 8a에서 특징화된 다클론성 항체로 염색된 전립선 종양 조직에 대한 두개의 사진을 나타내며;
도 9a는 24시간, 49시간 및 96시간에서 LY294002(LY) 또는 DMSO로 처리된 세포에 대한 웨스턴 블럿 분석의 결과를 나타내며;
도 9b는 p110β에 특이적인 안티센스 분자로 처리된 PC-3 세포의 웨스턴 블럿 분석의 결과를 나타내며;
도 10a는 실험의 웨스턴 블럿 분석의 결과를 나타내는 바, 상기에서 PC-3 세포는 Akt 특이적 안티센스 분자(GB)로 처리하였으며;
도 10b는 저산소증 상태에서 성장하고 HIF1α에 특이적인 안티센스 분자로 처리된 PC-3 세포의 웨스턴 블럿 분석의 결과를 나타내며;
도 11a는 세포외 매트리스상에서 다양한 안티센스 분자(GB)로 처리된 PC-3 세포의 사진을 나타내며;
도 11b는 도 5a에 따른 사진에 나타난 PC-3 세포의 웨스턴 블럿 분석을 나타내며; 및
도 12는 본원에서 REED1으로도 불리는, PRF1상에 집중되어 있는 Akt에 유사한 경로의 하류 요소로서 HIF1α를 또한 포함하는 PI 3-키나아제 경로의 성장인자 유도된 활성의 개략도를 나타낸다.
도 1은 PI 3-키나아제 경로의 성장인자 유도된 활성의 개략도를 나타낸다. 세포의 성장인자 자극은 세포막에서 이들의 동일 수용체의 활성화를 초래하여 PI 3-키나아제와 같은 세포내 신호분자와 결합하거나 이들을 활성화시킨다. 종양 억제제 PRF1은 PI 3-키나아제 매개된 하류 반응을 방해하며 일시적인 방식으로 발생하는 경로의 활성화를 확보한다. LY294002는 PI 3-키나아제의 소분자 억제제이다. PI 3-키나아제 경로의 공지된 하류 유전자중 하나는 mTOR(라파마이신의 포유류 포적)인 바, 이는 임상적으로 허용된 약물 라파마이신(Rapamune)에 의해 억제될 수 있다. PI 3-K는 세포주기 및 DNA 회복, 아폽토시스의 조절, 글루코오스 이동, 성장 번역, 전이 및 이동에 관여한다. X는 암세포의 전이 행동을 향상시키는데 관여하는 것으로 추정되는 잠재적인 하류 약물 표적을 나타내며 감소된 부작용때문에 mTOR과 같은 상류 표적보다는 더 나은 약물 표적인 것으로 간주될 수 있다.
도 12는 도 1에서 나타난 바와 유사하게 PI 3-키나아제 경로의 성장인자 유도된 활성의 개략도를 나타낸다. 그러나, HIF1α이 Akt 매개된 경로에 유사한 PRF1에 대한 PI 3-키나아제 경로의 가지로서 확인될 정도로 PI 3-키나아제 경로는 더 정교하다.
다른 도면에 대한 더 상세한 설명은 하기 실시예를 통해서 개시될 것이다.
실시예 1: 재료 및 방법
세포배양
사람 전립선 암종 PC-3 세포를 American Type Culture Collection(ATCC)로부터 수득하였다. 세포는 10% 우태혈청(CS), 겐타마이신(50㎍/ml) 및 암포테리신(50ng/ml)을 함유하는 F12K Nutrient Mixture(Kaighn 변형)에서 배양시켰다. 형질감염은 올리고펙타민, 리포펙타민(Life Technologies), NC388(Ribozyme Pharmaceuticals, Inc, Boulder, CO) 또는 Fugene 6(Roche)과 같은 다양한 양이온성 지질을 사용하여 제조자 지시에 따라 96 웰 또는 10-cm 플레이트(30% 내지 50% 콘플루언시에서)에서 실시하였다. GeneBloc은 GeneBloc의 예비형성된 5x 농축된 복합체 및 무혈청 배지내의 지질을 완전배지내의 세포에 부가함으로써 형질감염시켰다. 96 웰에 놓인 세포당 총 형질감염 부피는 100㎕이었으며, 10cm 플레이트내의 세포에 대해서는 10ml였다. 최종 지질 농도는 세포밀도에 따라 0.8 내지 1.2㎍/ml였다; 상기 GeneBloc의 농도는 각 실험에 표시되어 있다.
배양된 세포를 트립신처리하고 배지에 의한 트립신 효과를 멈춘 다음에 채취하였다. 세척과정(PBS; 원심분리 5분/1.000rpm)을 부가하고 마지막으로 접종될 세포 수 및 부피를 고려하여 펠렛을 재현탁시켰다.
Taqman 분석에 의한 RNA 수준의 상대량의 측정
96-웰에서 형질감염된 세포의 RNA를 분리시키고 Invisorb RNA HTS 96 키트(InVitek GmbH, Berlin)를 사용하여 정제하였다. PRF1 mRNA 발현의 억제는 300nM PRF1 5’프라이머, 300nM PRF1 3’프라이머 및 100nM의 PRF1 Taqman 탐침 Fam-Tamra 라벨을 사용한 실시간 RT-PCR(Taqman) 분석에 의해 검출하였다. 상기 반응은 50㎕에서 실시하였으며 하기 조건하에서 제조자 지시에 따라 ABI PRISM 7700 서열 검출기(Applied Biosystems)로 평가하였다: 48℃에서 30분간, 95℃에서 10분간 이후에 95℃에서 15초간 및 60℃에서 1분간의 40주기.
마트리겔 매트릭스상의 실험관내 성장
PC3 세포는 Matrigel상에 살포시 10μM LY294002 또는 DMSO로 처리하였다. 세포가 살포전에 형질감염되었다면, 세포를 GeneBloc으로 형질감염시키고 형질감염 48시간 후 트립신처리하였다. 상기 세포를 배지에서 세척하고 250 ㎕ 마트리겔 기저 막 매트릭스(Becton Dickinson)로 예비 -피막된 이중 24-웰(웰당 100.000 세포)내로 살포하였다. 24시간 내지 72시간동안 배양한 후, Axiovert S100 현미경(Zeiss)에 부착된 Axiocam 카메라를 사용하여 5x 확대에서 사진을 찍었다.
Affymetrix
Matrigel상에서 성장한 세포로부터의 총 RNA는 Totally RNA 키트(AMBION)를 사용한 하기의 제조자 프로토콜에 따라 제조하였다. 최종 단계에서 침전된 총 RNA는 Invisorb 용해 완충액에서 재현탁시키고 Invisorb 스핀 세포-RNA 키트(INVITEK)를 사용하여 정제시켰다. 비오틴-라벨의 cRNA는 하기 Affymetrix 프로토콜에 따라 제조하였으며 15㎍ cRNA는 Affymetrix GeneChip set HG-U95상에서 하이브리다이즈시켰다.
데이터 분석
원자료는 Affymetrix GeneChip software Microarray Suite v4.0을 사용하여 분석하였다. 각 탐침 세트의 강도는 한개의 전사에 대응하는 16 내지 20개 탐침 쌍의 세트에 대하여 평균으로 나타낸 미스매치 올리고뉴클레오티드와 비교할 때 완벽한 매치 올리고뉴클레오티드의 하이브리다이즈 신호의 차이로서 계산하였다. 탐침 세트의 평균 차이는 다수의 전사에 비례한다. 상이한 어레이의 총 신호 강도는 비교하기 전 동일한 수치로 측정하였다. 중첩 변화는 실험 및 베이스라인 어레이로부터 대응하는 탐침 쌍의 강도를 쌍방향으로 비교함으로써 Affymetrix software를 사용하여 계산하였다. Affymetrix에 의해 개시된 결정 매트릭스를 사용하여 상기 소프트웨어는 절대적 콜(absolute call, 실험에서 전사가 없거나, 최저 또는 존재) 및 차이 콜(difference call, 다른 실험과 비교할 때 하나의 실험에서 전사의 풍부함: 증가, 근소한 증가, 무변화, 근소한 감소, 감소)을 또한 생성한다. 결과는 Microsoft Excel(절대적 콜, 차이 콜, 중첩변화)로 정리하였다. 콜이 없거나 또는 무변화 콜을 갖는 모든 탐침 세트는 버리고 상기 테이블을 중첩 변화에 의해 분류하였다.
동물 연구
생체내 실험은 식품 및 의약청의 Nonclinical Laboratory Studies(GLP Regulation)에 대한 대응하는 Good Laboratory Practice 및 법률적 토대로서 독일 동물보호법에 따라 실시하였다.
수컷 Shoe: SPF 조건(Laminar air flow equipment, Scantainer, Scanbur)하에 유지된 NMRI-nu/nu 마우스(Tierzucht Schonwalde GmbH)를 사람 전립선 암종 세포에 대한 수용체로서 사용하였다. 생후 6-8주 및 몸무게 28-30g의 상기 동물에게 전립선의 양쪽, 왼쪽 배측 엽(iprost; 동소이식) 또는 간의 Lobus 측면 왼쪽의 팁(ihep; 이소성)내로 2x106/0.03ml 종양세포를 접종하였다. 이를 위해, 상기 마우스는 Ketanest(Parke-Davis GmbH) 및 Rompun(Bayer Vital GmbH)을 각각 100mg/kg 및 5mg/kg의 복용량으로 80:1의 혼합물을 사용하여 전신마취시켰다. 복부 표면을 소독한 다음 복부피부 및 포피선의 경계 부근에서 시작하는 복막벽을 통해 1cm 정도로 절개를 하였다. 쪽집게 및 면봉을 사용하여 전립선이 보이게 하였다. 확대유리 및 30G 0,30x13 마이크로랜스 바늘(Becton Dickinson)을 갖는 1ml 주사기(Henke Sass Wolf GmbH)를 사용하여 동소이식 세포에 접근하였다. 접종부위에서 표시된 수포가 발견되면 접종은 성공한 것이다. 복막 벽에 대해서는 창상를 봉합 재료(PGA Resorba, Franz Hiltner GmbH)에 의해 봉합하였으며 복부 피부에 대해서는 Michel 클램프 11x2mm로 봉합하였다. 창상 스프레이(Hansaplast Spruhpflaster, Beiersdorf AG)는 병변을 보호하였다. 수술후 단계중에 상기 동물을 완전히 깨어날 때까지 따뜻한 환경에서 유지시켰다. 각 그룹당 5-10마리 동물로 구성되는 치료 그룹의 수에 따라 상기 동물을 무작위로 추출하였다. 조사결과 프로토콜링을 포함하여 상기 동물들을 연속적으로 검사하였다. 임으로, Ssniff NM-Z, 10mm, 고압력(ssniff Spezialdiaten GmbH)을 강화된 식이로서 투여하였으며 음료수는 HCl에 의해 산성화하였다.
평가
실질적인 복용량 수준을 얻기위해, 치료당일에 체중을 측정하였다. 동시에, 전체 유기체에 대한 치료양상의 영향을 인식하는 것은 체중발달로부터 유도될 수 있다.
혈액천자를 실험 당일(베이스 라인); 14일; 28일 및 35일(Sacrificing)에 실시하였다. 혈액은 짧은기간 마취된 동물의 안와 정맥으로부터 채취하였다(Diethylether, Otto Fischar GmbH). 적합성에 대한 주어진 데이터 매개변수 평가 및 치료 부작용은 다음과 같다: 백혈구 수; 혈소판 수; 효소. 추가의 혈액관련 매개변수는 빌리루빈; 크레아티닌; 단백질; 요소; 요산이다.
모든 실험 동물은 완전히 해부하여 사진으로 기록하였다. 종양(전립선) 및 전이(미골부, 요추, 신장 림프절 전이)는 한쌍의 캘리퍼스에 의해 2차원으로 측정하였다. 부피는 V(㎣) = ab2/2 with b〈 a에 따라 측정하였다. 일반적으로, 치료방법에 대해 실시한 세포수는 전립선을 고려할 때 100% 종양을 유발한다. 2차적 부작용을 고려하여 추가 데이터를 발견하기 위해 일부 기관(간; 비장; 신장)의 중량을 등록하였다.
조직학적 분석을 위해, 종양 조직 샘플 즉, 전립선 종양 및 림프절 전이 샘플을 5% 포름알데히드 및 부가된 파라핀에 고정시켰다. 일상적으로, 상기 부분을 HE 착색하였으며 필요하다면, 특이적 착색을 실시하였다(Azan, PAS).
사람 기원의 종양 및 전이성 세포를 검출하기 위해, 적절한 조직 샘플을 액체 질소에서 냉동시켰다. PCR 및 huHPRT 특이적 암플리콘에 의한 Taqman 분석을 사용할 때 본 발명자들은 5mg 조직에서 50개 사람 세포를 검출할 수 있었다.
상기 치료결과는 Mann 및 Whitney의 u-실험에 의해 통계적으로 입증되었다.
실시예 2: 하류 약물 표적의 적합성에 대한 개념의 실험적 입증
도입부에서 강조한 바와 같이, 신호 경로에 대한 표적 연결된 하류는 의약 및 진단 물질의 고안 및 개발에 있어서 중요하다. 특정 표적이 상이한 다른 경로에 연결되거나 또는 신호 경로내의 그 위치로 인하여 전이 및 이동, 성장, 번역, 세포괴사, 세포주기, DNA 회복 및 PI-3 키나아제의 경우등과 같은 다수의 생물학적 현상에 연결되어 있다면, 이 표적을 해결하는 임의의 화합물은 상기 시스템에 해로우며 의학적 관점에서 보면 바람직하지 않은 다수의 부작용을 가질 것이다. 따라서, 추가 하류에 작용하는 표적은 치료적 중개에 있어서 첫번째 선택이되어야 한다.
PI-3 키나아제 경로의 조절하에서 mTOR과는 별도로 추가의 가능한 약물 표적이 관련된다는 것을 발견하였는 바, 이는 전이 및 이동 및 종양형성의 현상을 조절하는데 특이적이다. 약학 분야에 있어서, Rapamune 상표명으로 판매되는 라파마이신이 전이 및 이동을 억제하는데 적합하다는 것을 발견하였다. 이는 하류 약물 표적을 해결하기 위한 방법의 적합성을 확인시켜주었다.
도 2에서 알수 있는 바와 같이, 라파마이신은 림프절 전이의 부피를 줄이는데 적합하며 공지된 PI-3 키나아제 억제제 LY294002에 대한 효과에 있어서 비교할 만하다. 도 2a에 도시된 바와 같이, 종양 모델을 선택하여 Rapamune에 의한 치료를 첫째날 시작하였다. 사용된 농도 즉, 0.4mg/kg/복용량-2mg/kg/복용량은 인산염 완충 식염수인 음성 대조용과 비교할 때 측정된 전이의 부피(㎣)로 나타낸 림프절 전이의 정도를 상당히 감소시켰다.
치료 개시 28일째에 확정된 종양모델에 대한 Rapamune 처리의 경우에서 기본적으로 동일한 결과를 수득하였다.
라파마이신(Rapamune)에 의한 처리 후, 동소이식 PC-3 마우스 모델에서 림프절 전이를 측정하였다. 도 2a에 모델로 택한 종양이 도시되어 있다. Nude shoe: NMRI-nu/nu 마우스(그룹당 8마리)에게 0.03ml 전립선내에서 2x106 PC3 세포를 주입하였으며, 치료는 Rapamune을 사용하여 28일동안 매일 복막강내로 2mg/kg 및 0.4mg/kg의 복용량으로 실시하였다. PBS는 대조용으로 사용하였다.
확정된 종양(b)의 치료를 위해, 세포를 28일동안 ipros에서 성장시켰으며, 치료는 주입 후 29일 내지 50일째에 Rapamune을 사용하여 경구로 실시하였다. 복용량은 a에 나타난 바와 같이 선택하였다. 동물은 각각 29일 및 51일째에 치사시켰으며 총 림프절 전이를 측정하였다.
실시예 3: PI 3-키나아제 경로내의 하류 약물 표적으로서 PRF1 확인
기본적인 실험방법은 도 3에 도시되어 있다. Matrigel상에서 성장한 PC3 세포를 DMSO 또는 PI 3-K 억제제 LY294002로 처리하고 총 RNA는 각 샘플로부터 분리시켰다. 차등 Affymetrix 유전자 발현 프로파일링을 실시하였으며 발현은 실시간 RT-PCR Taqman 에세이를 사용하여 확인하였다. p110α는 비-감별 표준으로서 사용하였다.
PC3 세포는 PTEN -/-이며, 이는 종양억제제 PTEN은 이들 세포가 없어서 PI 3-키나아제 경로가 영구적으로 활성화되어 마트리겔 에세이에서 세포의 성장 패턴에 의해 표현되는 세포의 증가된 전이성 활성 또는 행동을 초래한다. 잠재적인 침윤성 성장을 하는 세포는 마트리겔 매트릭스와 같은 기저막상에서 향상된 성장을 나타낸다(Peterson, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A.R. 및 bissell, M. J. (1992). 기저막과의 상호작용은 정상 및 종양 사람 유방 상피세포의 성장 및 감별 패턴을 빠르게 구별하게 한다. Proc Natl Acad Sci USA, 89, 9064-9068.(Auch: Sternberger 등., 2002 안티센스 & 핵산 의약 개발 12: 131-143).
이와 관련하여, PC3 세포는 마트리겔상에서 성장하며 이를 생체내 환경과 유사한 모델 시스템으로 택하였으며, 그로부터 분리된 RNA는 원위치 환경 또는 전통 적 세포 배양 플레이트와 같은 비-마트리겔 환경에서 성장한 세포로부터 수득한 임의의 제조에서보다 결과에 더 유사할 것으로 추측됨을 알아야 한다.
PC3 세포외에, PNT-1A, MCF-10A 및 HELA와 같은 다른 세포를 성장시켜 실험하였다. 다양한 성장 표면을 사용하였으며 화합물로 처리한 세포들은 PI 3-키나아제 경로에 영행을 주는 것 같다. 상기 결과는 도 7에 도시되어 있다. 가장 오른쪽 칼럼의“변화”로 표현된 판독으로부터 알 수 있는 바와 같이, Affymetrix 유전자 발현 프로파일링링에서 수득한 신호는 세포에 투여한 화합물의 조합을 제외하고즉, PC3 세포의 경우 PI 3-키나아제 p110a 및 p110b의 촉매 서브유닛에 대해 유도된 미스매치 GB의 조합 및 LY(LY294002)와 관련된 동일한 미스매치, PNT-1A 세포의 경우 PRF1 17로 지정된 안티센스 분자 및 각각의 미스매치 및 HELA 세포의 경우 48시간간, 72시간 및 96시간 후 Tam 및 DMSO의 조합을 제외하고 증가되었다. 구조적으로 활성인 PI 3- 키나아제, Mp110*ER의 유도된 형태를 발현하는 안정된 세포주는 개시되어 있다(Klippel 등., 1998; Sternberger 등., 2002). 성장배지에서 안정하게 형질감염된 세포의 집단은 DMSO중의 200nM 유도인자 4-OHTamoxifen으로 자극하였다.
실시예 4: PRF1에 대해 유도된 최적 안티센스 올리고뉴클레오티드에 대한 스크리닝
PRF1에 대해 유도된 최적의 안티센스 올리고뉴클레오티드를 스크리닝하기 위해, PRF1의 총 mRNA 서열에 대해 8개 GeneBloc를 선택하였다.
PC3 세포는 개시된 바와 같이 상이한 GeneBloc 농도로 형질감염시켰으며, mRNA 수준은 형질감염 24시간 후 300nM NM_019058 특이적 정방향 및 역방향 프라이머, 100nM 탐침 및 40nM 정방향 및 역방향 프라이머 및 사람 β-액틴에 대한 100nM 탐침에 의한 Taqman 에세이를 사용하여 측정하였다. mRNA 수준을 내부 액틴 수준으로 표준화하였으며 양은 GBC(Gene Bloc Control에 의해 형질감염된 세포)에 대해 상대적으로 나타냈다.
그 결과는 도 4에 도시되어 있다. 추가 연구를 위해, 도 4로부터 특히 유리한 안티센스 올리고뉴클레오티드로서 GeneBloc 70034 및 70044을 선택하였다.
본원에 사용된 다양한 실시예에서 GeneBloc과 관련하여, 이들은 모두 세번째 발생 안티센스 올리고뉴클레오티드이며 이는 표 1로부터 명백하듯이 상부 글자는 포스포르디에스테르 연결보다는 오히려 포스포로티오에이트를 통해 연결된 데옥시리보뉴클레오티드를 나타낸다
Figure 112005019532098-pct00001
또한, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드가 GeneBloc인 즉, 세번째 발생 안티센스 올리고뉴클레오티드인 점을 고려할 때 임의의 “t”는 실제적으로 “u”이다.
본 발명의 다양한 실시예 및 구체예에 사용된 다른 안티센스 분자는 안티센스 분자의 이름 즉, 내부 참조, 이들의 서열 및 서열 특징을 나타내는 표 2로부터 알 수 있다.
Figure 112005019532098-pct00002
Figure 112005019532098-pct00003
실시예 5: PRF1의 선택적 녹다운
PRF1이 PI 3-키나아제 경로의 적절한 하류 약물 표적이라는 것을 입증하기 위해 실시예 4로부터 수득한 특히 이로운 두개의 GeneBloc 즉 70044 및 70043을 마트리겔 기저 성장 실험에 사용하였다. 상기 마트리겔 성장 실험은 각 세포의 전이 및 이동 행동을 나타내는 대리 모델로서 채택하였다. 세포의 전이 및 이동 행동에 대한 표시로서 채택한 상기 세포의 융합 성장은 증가하였으며, 이는 상기 세포가 마트리겔에 의해 제공된 삼차원 구조에 걸쳐서 퍼지게 한다. 이 실험 결과는 도 5에 도시되어 있다.
개시된 바와 같이, PC3 세포를 형질감염시키고 마트리겔상에 살포하여 성장을 모니터하였다. 마트리겔상에 살포된 세포의 동분량으로부터 mRNA를 분리시키고 Taqman 에세이를 사용하여 분석하였다(왼쪽패널). PHN 베타 특이적 mRNA를 내인성 p110α mRNA 수준으로 표준화시켰다. PTEN 특이적 GeneBloc은 PTEN-/-PC3 세포내의 음성 대조용으로 사용하고 p110β특이적 GeneBloc은 세포외 매트릭스내의 성장에 대한 양성 대조용으로 사용하였다. 특이적 성장 억제는 PRF1 특이적 GeneBloc 70043 또는 70044로 처리된 세포의 성장과 이들의 대응하는 미스매치 올리고뉴클레오티드 70168 및 70169을 비교함으로써 나타냈다.
도 5a 및 5b로부터 두개의 바람직한 GeneBloc 즉, 70043 및 70044가 PRF1의 mRNA에 대한 중요한 녹다운을 초래함을 알 수 있는 바, 이 결과는 마트리겔 성장 에세이로부터 수득한 결과에 대응한다. y축은 applied Biosystems의 지시에 따라 DCt 방법에 의해 측정된 mRNA의 양을 나타낸다.
실시예 6: PRF1에 대한 다클론성 항체의 생성 및 특이성
표준 기법을 사용하여 PRF1에 대한 다클론성 항체를 생성하였다. 이렇게 수득한 다클론성 항체는 PRF1에 대한 그 특이성을 실험하였다. 그 목적을 위해, PC-3 세포로부터 세포 용해물은 PRF1 특이적 안테센스 분자, 더 구체적으로는 유전자 블럭 또는 그 미스매치로 처리하였으며 재조합 HA-태그 PRF1에 대한 발현 플라스미드로 형질감염된 세포를 제조하였다. 상기 용해물은 다클론성 항체를 사용하여 웨스턴 블럿 분석에 의해 분석하였으며 결과를 도 8a에 도시하였다.
도 8a로부터 알 수 있는 바와 같이, 핵산 서열에 특이적인 유전자 블럭 번호 70043(GB43, 표 1 참조)으로 처리된 PC-3 세포는 발현된 PRF1-단백질의 명확한 감소를 나타내며, 상기에서 PI 3-키나아제는 p110α및 p85 특이적 항체에 의해 개시된 바와 같이 광범위하게 발현된다. 두번째 안티센스 분자, 즉 GB44는 PRF1 단백질의 발현의 상당한 감소를 초래한다. GB43, MM43, PRF1 단백질에 대한 미스매치의 경우와 같이 미스매치된 분자는 세포에서 상당히 발현된다. 재조합 HA-태그 PRF1에 대한 발현 플라스미드로 형질감염된 세포로부터의 용해물은 두개의 밴드, 즉 HA-태그 PRF1에 대한 한개 밴드 및 내인성 PRF1에 대한 다른 한개 밴드를 나타낸다.
이들 결과는 다클론성 항체가 PRF1에 대한 특이성을 나타내므로 PRF1의 존재 및 부존재에서 모니터링하는데 유용한 도구임을 확인해주었다.
실시예 7: 전립선 종양 조직에서 PRF1에 대한 면역착색
실시예 6에 개시되어 있는 특징을 갖는 항체를 사람 전립선 종양 조직을 착색하는데 사용하였다. 1:1000 희석액중의 다클론성 혈청을 사용한 단백질 수준에서 PRF1 발현은 도 8b에 도시된 바와 같이 육안으로 명확하게 볼 수 있는 바, 상기에서 왼쪽 사진은 도 6에 개시된 다클론성 항체를 사용한 착색을 나타내는 반면, 오른쪽 사진은 예비면역 혈청을 사용한 전립선 종양 착색 조각을 나타낸다.
실시예 8: PRF1 단백질 발현은 다양한 수의 PI 3-키나아제 경로에 따라 다름
PRF1이 PI 3-키나아제 경로 및 HIF1α경로의 하류 표적임을 입증하기 위해, 다양한 실험을 실시하였으며, 사용된 화합물은 각 경로의 다양한 요소에 특이적인 것으로 공지되었으며, PRF1 단백질 수준에 대한 그러한 화합물의 영향을 조사하였다.
a) PRF1 단백질 발현에 대한 PI 3-키나아제 활성의 영향
PI 3-키나아제 활성이 PRF1 단백질 발현에 영향을 미치는지 여부를 조사하기 위해, 대조용으로 PC-3 세포를 LY294002 또는 DMSO로 처리하였다. PRF1 단백질에 대한 검출 수단으로서 다클론성 항체를 사용한 웨스턴 블럿 분석에 의해 분석을 실시하였다. PRF1 단백질외에, 각각의 특이적 항체를 사용하여 Akt의 발현 및 인산화된 Akt(P* Akt)를 모니터링하였다. 또한, p110α및 p85의 발현은 모니터링하였다.
상기 결과는 도 9a에 도시되어 있다.
72시간 및 96시간 후, PRF1 단백질은 DMSO로 처리된 세포에서만 검출되었다. LY294002의 영향하에서 Akt 및 인산화된 Akt로 구성되는 캐스케이드 및 PRF1 단백질은 하향 조절되었다.
동일한 표지를 사용하여, 상기 세포들은 안티센스 분자, 즉 PI 3-키나아제를 특이적으로 억제하는 GeneBloc(GB) 지정된 p110β-GB 88로 처리하였다.
상기 결과는 도 9b에 도시되어 있다.
세번째 및 다섯번째 레인으로부터 알 수 있는 바와 같이, 촉매 활성 서브유닛 p110β에 대한 GeneBloc은 PRF1이 하류 표적임을 확인시켜주는 공지된 PI 3-K 억제제 LY294002과 같은 동일한 효과를 가져 단백질 발현이 PI 3-키나아제에 의해 영향을 받는다. p110α 또는 미스매치 안티센스 분자 또는 DMSO에 대해 유도된 안티센스 분자는 단백질 수준에서 PRF1의 발현에 아무런 효과가 없다.
b) PRF1 단백질 발현에 대한 Akt 및 HIF1의 영향
단백질 수준에서 PRF1의 발현이 Akt(PKB) 활성 및 HIF1α 활성에 따라 다른지를 조사하기 위해, PC-3 세포를 Akt 특이적 안티센스 분자로 처리하였다. 더 구체적으로, Akt1-GB 및 Akt2-분자로 지정된 두개의 안티센스 분자는 도 9와 관련하여 논의된 바와 같이 동일한 판독으로 사용하였는 바, 상기에서 HIF1α단백질 발현은 상업적으로 시판되는 G-정제된 다클론성 항체(R&DSystems, Lot Number: IUGO13071)를 사용하여 모니터링하였다. 상기 결과는 도 10a에 나타나 있다. 도 10a로부터 알 수 있는 바와 같이, 안티센스 분자로 처리한 지 72시간 후, 세포는 Akt2 GeneBloc로 처리하였으며, Akt2 GeneBloc과 함께 Akt1 GeneBloc처리된 이들 세포는 PRF1 단백질 수준의 감소를 나타내는 바, 이는 Akt1 및 Akt2는 PRF1 단백질 발현의 정도에 특정한 억제 효과를 나타냄을 의미한다.
세포를 CoCl2로 처리함으로써 만들어지는 저산소증 조건하에서 성장한 세포를 사용하여 Akt 및 P*-Akt를 제외한 모니터링을 하기 위한 동일한 표지를 사용한 동일한 실험을 실시하였다. 상이한 두개 형태의 안티센스 분자, 즉 HIF1α-GB66 및 HIF1α-GB67를 사용하였으며 각각의 미스매치를 대조용으로 사용하였다. 상기 GeneBloc는 단백질 수준에서 HIF1α의 발현을 상당히 감소시켜 결국에는 PRF1 단백질의 발현을 감소시켰다. 이 결과는 GeneBloc으로 처리한지 72시간 후 및 CoCl2로 24시간동안 처리하여 수득하였다.
상기 결과로부터, 단백질 수준에서 PRF1의 발현에 대한 HIF1α의 영향은 Akt의 발현보다 더 영향을 미치는 것으로 보이나, PRF1의 단백질 수준은 Akt 및 HIF1α의 활성에 따라 다르다는 것을 알 수 있다.
이들 결과는 PRF1이 PI 3- 키나아제 및 HIF1α 신호의 하류 작동체임을 확증하였다. 경로 검출상에 제시된 데이터는 PRF1이 저산소 성장 조건하에서는 HIF1α 활성 의존성임을 시사한다. 또한, HIF1α 의존성이 아닌 것 같은 PRF1 발현에 대한 부가적인 Akt 의존성이 있는 것 같다. 이 조절 관계는 도 12에 도시되어 있다.
실시예 9: HIF1α 단백질 및 억제된 PRF1 단백질을 갖는 세포의 표현형 분석
이 실시예에서 강조하는 실험의 목적은 단백질 수준에서 HIF1α 및 PRF1의 발현을 억제를 나타내는 세포의 표현형 변화를 조사하는 것이다.
마트리겔 표면상에서 세포를 성장시켰으며 상술한 실험에서 개시된 바와 같은 조건하에서 안티센스 분자 및 각 대조용으로 처리하였다.
상기 결과는 도 11a 및 11b에 각각 도시되어 있는 바, 상기에서 각 열은 11a 및 11b의 부분으로 구성된다.
도 11a는 마트리겔 표면에서 성장하고 각각의 안티센스 분자로 처리된 세포 사진의 서열을 나타내는 반면, 도 11b는 상기 마트리겔 표면으로부터 수득한 세포에 대해 실시한 웨스턴 블럿 분석의 결과를 나타낸다. 블럿의 레인은 대응하는 사진에 나타나 있는 세포의 세포 용해물을 나타낸다. 판독으로서, p110α 및 p85는 대조용으로 나타내져 있으며 조사된 PI-3K의 구성요소, 즉 AKT는 P*AKT 알파 및 PRF1으로서 모니터링하였다.
비처리된 세포는 마트리겔 에세이에서 정상 종양 세포의 성장 패턴을 나타낸다. p110β에 대해 유도된 안티센스 분자의 미스매치가 사용될 때, 유사한 표현형이 관찰되었다. PI-3K를 억제하는 PTEN에 대해 유도된 안티센스 분자의 사용은 이 종양 억제제에 의해 영향을 받지 않는 세포주의 표현형을 나타낸다(도 11a, 첫번째 열). 예상한 바와 같이, P*-AKT는 이러한 조건하에서 상당히 감소되며 기능적인 p110β 녹다운에 대한 판독을 나타낸다(도 11b, 첫번째 열). p110β의 녹다운과 같은 기능의 손실로 인한 유사한 표현형은 표현형에서 변화를 초래하지 않는 미스매치와 함께 HIF1α에 대한 안티센스 분자를 사용할 때 관찰된다(도 11a, 두번째 열). 웨스턴 블럿 분석은 이를 확인시켜 주었으며 HIF1α 특이적 안티센스 분자에 대한 HIF1α의 감소된 단백질 수준을 나타낸다(도 11b, 두번째 열). 마지막으로, PRF1 특이적 안티센스 분자를 사용한 기능 표현형의 동일한 손실이 웨스턴 블럿 분석에서 PRF1 단백질의 감소된 발현과 함께 관찰될 수 있다(도 11b, 세번째 열).
요약하면, 이들 결과는 PRF1이 단백질 수준에서 하류, PI 3-키나아제 신호의 작동체임을 확증하였다. 또한, PRF1은 저산소 성장 조건하에서 HIF1α 활성에 의존한다. HIF1α의존성이 아닌 것 같은 PRF1 발현에 대한 부가적인 Akt 의존성이 있는 것 같다.
실시예 10: 특이적 RNA 간섭에 의한 전립선 종양 성장의 억제
이 실험은 하류 약물 표적 PRF1이 특이적으로 작용하게 하는 작은 간섭 RNA(siRNA)의 성공적인 고안의 예이다. siRNA 분자는 프로모터(u6+2)에 의해 생성된다.
siRNA 발현 플라스미드의 작제
pol III 프로모터 카세트 U6+2는 합성 올리고뉴클레오티드를 사용한 PCR에 의해 생성되어 pUC-유도된 벡터의 EcoRI/Xhol 제한부위내로 클론화하였다.상기 특이적 siRNA 삽입은 비회문식 제한 효소를 사용하여 클론화하였다(BsmBI과 5'오버행 TTTT, 3'오버행 GGCA). 삽입은 두개의 합성 올리고뉴클레오티드를 5'CCGT 및 3'AAAA 오버행과 어닐링함으로써 생성되었다. 프로모터, 발현될 siRNA를 포함하는 발현 카세트 및 말단 서열은 PRF1 특이적 siRNA의 경우 하기와 같이 나타낸다:
5'gaattcctatttcccatgattccttcatatttgcatatttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatata tcttgggaaaggacgaaacacc gggagactagaggcaggagc aaaaaaaaaaa ctcctgcctctagtctccac tttttctcgag 3'(서열번호 17).
U6+2 합성 프로모터 및 PRF1 특이적 siRNA는 굵게 표시되었으며, (EcoRI; Xhol)
이 발현 카세트는 원칙적으로 임의의 발현 벡터로 클론화될 수 있다.
siRNA 발현 작제물에 대한 기본적인 고안은 도 6a에 도시되어 있으며, 이로부터 폴리-A-스트레치에 의해 생성되는 세포간 루프를 형성하도록 siRNA가 고안됨을 알 수 있다. 도 6b는 본 실시예에 사용된 다양한 siRNA 작제물, 즉 p110 베타(서열번호 14) p110 알파(서열번호 15) 및 PRF1의 mRNA에 대한 siRNA 작제물을 나타낸다.
PRF1 특이적 siRNA뿐만 아니라 p110 알파, p110 베타 및 PTEN에 유도된 것과 같은 다양한 siRNA 작제물은 동일한 벡터 작제물에서 클론화하였다. PC-3 세포(1x106 세포)는 제조자 지시에 따라 Effectene TM (Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 p110α, p110β 또는 PRF1에 대한 siRNA를 발현 또는 안정하게 형질감염된 PC-3 세포의 종양 성장에 대한 대조용으로 작용하는 최대-길이 EGFP를 발현하는 6㎍의 siRNA 발현 플라스미드 또는 EGFP 발현 플라스미드로 형질감염시켰다. 형질감염 48시간 후 세포는 트립신처리 및 희석하였으며 500㎍/ml 게네티신을 함유하는 150mm 접시에 다시 살포하였다. 500㎍/ml 게네티신을 사용한 배지를 매일 교체하였으며 형질감염 7일 후 600㎍/ml 게네티신을 함유하는 배지로 교체하였다. 세포의 집단 내성을 확장시켜 채취하였으며 세포수를 측정하여 동물 실험용으로 준비하였다.
상기 결과는 도 6에 나타나 있으며, 더 구체적으로는 도 6c에 접종한지 56일 후 ㎣내의 일차 전립선 종양의 체적이 나타나 있으며 도 6d에는 접종한지 56일 후 ㎣내의 총 림프절 전이의 체적이 나타나 있다.
전립선 종양은 PRF1 특이적 siRNA 투여에 의해 현저하게 억제될 수 있다는 것을 상기 도면으로부터 알 수 있다. 억제의 정도는 p110 베타에 유도된 siRNA 작제물과 유사하다. 그러나, PI 3-키나아제 경로에서 p110 베타 및 PRF1의 위치를 고려할 때, PRF1에 대해 특이적인 siRNA는 더 구체적인 해결을 허용함으로써 p110 베타와 비교할 때 PI 3-키나아제 경로의 가지 또는 일부의 조절함은 이해되어야 한다. 동일한 것은 총 림프절 전이의 경우에서도 적용된다.
SEQUENCE LISTING <110> atugen AG <120> New factor for metastasis and uses thereof <130> A 19011 PCT <160> 17 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 232 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> amino acid sequence of NMF <400> 1 Met Pro Ser Leu Trp Asp Arg Phe Ser Ser Ser Ser Thr Ser Ser Ser 1 5 10 15 Pro Ser Ser Leu Pro Arg Thr Pro Thr Pro Asp Arg Pro Pro Arg Ser 20 25 30 Ala Trp Gly Ser Ala Thr Arg Glu Glu Gly Phe Asp Arg Ser Thr Ser 35 40 45 Leu Glu Ser Ser Asp Cys Glu Ser Leu Asp Ser Ser Asn Ser Gly Phe 50 55 60 Gly Pro Glu Glu Asp Thr Ala Tyr Leu Asp Gly Val Ser Leu Pro Asp 65 70 75 80 Phe Glu Leu Leu Ser Asp Pro Glu Asp Glu His Leu Cys Ala Asn Leu 85 90 95 Met Gln Leu Leu Gln Glu Ser Leu Ala Gln Ala Arg Leu Gly Ser Arg 100 105 110 Arg Pro Ala Arg Leu Leu Met Pro Ser Gln Leu Val Ser Gln Val Gly 115 120 125 Lys Glu Leu Leu Arg Leu Ala Tyr Ser Glu Pro Cys Gly Leu Arg Gly 130 135 140 Ala Leu Leu Asp Val Cys Val Glu Gln Gly Lys Ser Cys His Ser Val 145 150 155 160 Gly Gln Leu Ala Leu Asp Pro Ser Leu Val Pro Thr Phe Gln Leu Thr 165 170 175 Leu Val Leu Arg Leu Asp Ser Arg Leu Trp Pro Lys Ile Gln Gly Leu 180 185 190 Phe Ser Ser Ala Asn Ser Pro Phe Leu Pro Gly Phe Ser Gln Ser Leu 195 200 205 Thr Leu Ser Thr Gly Phe Arg Val Ile Lys Lys Lys Leu Tyr Ser Ser 210 215 220 Glu Gln Leu Leu Ile Glu Glu Cys 225 230 <210> 2 <211> 1760 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 gcagcaggcc aagggggagg tgcgagcgtg gacctgggac gggtctgggc ggctctcggt 60 ggttggcacg ggttcgcaca cccattcaag cggcaggacg cacttgtctt agcagttctc 120 gctgaccgcg ctagctgcgg cttctacgct ccggcactct gagttcatca gcaaacgccc 180 tggcgtctgt cctcaccatg cctagccttt gggaccgctt ctcgtcgtcg tccacctcct 240 cttcgccctc gtccttgccc cgaactccca ccccagatcg gccgccgcgc tcagcctggg 300 ggtcggcgac ccgggaggag gggtttgacc gctccacgag cctggagagc tcggactgcg 360 agtccctgga cagcagcaac agtggcttcg ggccggagga agacacggct tacctggatg 420 gggtgtcgtt gcccgacttc gagctgctca gtgaccctga ggatgaacac ttgtgtgcca 480 acctgatgca gctgctgcag gagagcctgg cccaggcgcg gctgggctct cgacgccctg 540 cgcgcctgct gatgcctagc cagttggtaa gccaggtggg caaagaacta ctgcgcctgg 600 cctacagcga gccgtgcggc ctgcgggggg cgctgctgga cgtctgcgtg gagcagggca 660 agagctgcca cagcgtgggc cagctggcac tcgaccccag cctggtgccc accttccagc 720 tgaccctcgt gctgcgcctg gactcacgac tctggcccaa gatccagggg ctgtttagct 780 ccgccaactc tcccttcctc cctggcttca gccagtccct gacgctgagc actggcttcc 840 gagtcatcaa gaagaagctg tacagctcgg aacagctgct cattgaggag tgttgaactt 900 caacctgagg gggccgacag tgccctccaa gacagagacg actgaacttt tggggtggag 960 actagaggca ggagctgagg gactgattcc agtggttgga aaactgaggc agccacctaa 1020 ggtggaggtg ggggaatagt gtttcccagg aagctcattg agttgtgtgc gggtggctgt 1080 gcattgggga cacatacccc tcagtactgt agcatggaac aaaggcttag gggccaacaa 1140 ggcttccagc tggatgtgtg tgtagcatgt accttattat ttttgttact gacagttaac 1200 agtggtgtga catccagaga gcagctgggc tgctcccgcc ccagcctggc ccagggtgaa 1260 ggaagaggca cgtgctcctc agagcagccg gagggagggg ggaggtcgga ggtcgtggag 1320 gtggtttgtg tatcttactg gtctgaaggg accaagtgtg tttgttgttt gttttgtatc 1380 ttgtttttct gatcggagca tcactactga cctgttgtag gcagctatct tacagacgca 1440 tgaatgtaag agtaggaagg ggtgggtgtc agggatcact tgggatcttt gacacttgaa 1500 aaattacacc tggcagctgc gtttaagcct tcccccatcg tgtactgcag agttgagctg 1560 gcaggggagg ggctgagagg gtgggggctg gaacccctcc ccgggaggag tgccatctgg 1620 gtcttccatc tagaactgtt tacatgaaga taagatactc actgttcatg aatacacttg 1680 atgttcaagt attaagacct atgcaatatt ttttactttt ctaataaaca tgtttgttaa 1740 aacaaaaaaa aaaaaaaaaa 1760 <210> 3 <211> 699 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 atgcctagcc tttgggaccg cttctcgtcg tcgtccacct cctcttcgcc ctcgtccttg 60 ccccgaactc ccaccccaga tcggccgccg cgctcagcct gggggtcggc gacccgggag 120 gaggggtttg accgctccac gagcctggag agctcggact gcgagtccct ggacagcagc 180 aacagtggct tcgggccgga ggaagacacg gcttacctgg atggggtgtc gttgcccgac 240 ttcgagctgc tcagtgaccc tgaggatgaa cacttgtgtg ccaacctgat gcagctgctg 300 caggagagcc tggcccaggc gcggctgggc tctcgacgcc ctgcgcgcct gctgatgcct 360 agccagttgg taagccaggt gggcaaagaa ctactgcgcc tggcctacag cgagccgtgc 420 ggcctgcggg gggcgctgct ggacgtctgc gtggagcagg gcaagagctg ccacagcgtg 480 ggccagctgg cactcgaccc cagcctggtg cccaccttcc agctgaccct cgtgctgcgc 540 ctggactcac gactctggcc caagatccag gggctgttta gctccgccaa ctctcccttc 600 ctccctggct tcagccagtc cctgacgctg agcactggct tccgagtcat caagaagaag 660 ctgtacagct cggaacagct gctcattgag gagtgttga 699 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(6) <223> RNA <220> <221> misc_feature <222> (7)..(15) <223> DNA linked through phosphorothioate linkages <220> <221> misc_feature <222> (16)..(21) <223> RNA <400> 4 gcucaactct gcagtacacg a 21 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(6) <223> RNA <220> <221> misc_feature <222> (7)..(15) <223> DNA linked through phosphorothioate linkages <220> <221> misc_feature <222> (16)..(21) <223> RNA <400> 5 cuugguccct tcagaccagu a 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(6) <223> RNA <220> <221> misc_feature <222> (7)..(15) <223> DNA linked through phosphorothioate linkages <220> <221> misc_feature <222> (16)..(21) <223> RNA <400> 6 caguuutcca accacuggaa u 21 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(6) <223> RNA <220> <221> misc_feature <222> (7)..(15) <223> DNA linked through phosphorothioate linkages <220> <221> misc_feature <222> (16)..(21) <223> RNA <400> 7 cccaaaagtt cagtcgucuc u 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(6) <223> RNA <220> <221> misc_feature <222> (7)..(15) <223> DNA linked through phosphorothioate linkages <220> <221> misc_feature <222> (16)..(21) <223> RNA <400> 8 gcuccugcct ctagtcucca c 21 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(6) <223> RNA <220> <221> misc_feature <222> (7)..(15) <223> DNA linked through phosphorothioate linkages <220> <221> misc_feature <222> (16)..(21) <223> RNA <400> 9 guguucatcc tcagggucau c 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(6) <223> RNA <220> <221> misc_feature <222> (7)..(15) <223> DNA linked through phosphorothioate linkages <220> <221> misc_feature <222> (16)..(21) <223> RNA <400> 10 ggucagtagt gatgcuccga u 21 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(6) <223> RNA <220> <221> misc_feature <222> (7)..(15) <223> DNA linked through phosphorothioate linkages <220> <221> misc_feature <222> (16)..(21) <223> RNA <400> 11 cuuaccaact ggctaggcau c 21 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(6) <223> RNA <220> <221> misc_feature <222> (7)..(15) <223> DNA linked through phosphorothioate linkages <220> <221> misc_feature <222> (16)..(21) <223> RNA <400> 12 ccgaaaagaa cagtgcucuc u 21 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(6) <223> RNA <220> <221> misc_feature <222> (7)..(15) <223> DNA linked through phosphorothioate linkages <220> <221> misc_feature <222> (16)..(21) <223> RNA <400> 13 gcucguccct gtagtgucca c 21 <210> 14 <211> 54 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 14 gggaaugaac cacuggaaua gcaaaaaaaa aaaagcuucc agugguucau uccc 54 <210> 15 <211> 54 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 15 acugagcaag aggcuuugga gaaaaaaaaa aaacuccaaa gccucuugcu cagu 54 <210> 16 <211> 54 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 16 guggagacua gaggcaggag caaaaaaaaa aaagcuccug ccucuagucu ccac 54 <210> 17 <211> 187 <212> DNA <213> Artificial <400> 17 gaattcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatattt ttaaaatgga ctatcatatg 60 cttaccgtaa cttgaaagta tttcgatttc ttggctttat atatcttggg aaaggacgaa 120 acaccgggag actagaggca ggagcaaaaa aaaaaactcc tgcctctagt ctccactttt 180 tctcgag 187

Claims (33)

  1. 실험관내 (in-vitro)에서 폴리펩티드 인자 또는 이의 단편을 포함하는, PI 3-키나아제 경로의 표지로서,
    상기 인자는
    a) 서열번호 1에 따른 아미노산 서열을 포함하며;
    b) 데이터뱅크 입수번호 gi 9506687 또는 NP_061931에 따른 아미노산 서열을 가지며;
    c) 핵산에 의해 엔코딩되며,
    ca) 상기 핵산은 i) 서열번호 2 또는 3에 따른 핵산; 또는 ii) 데이터뱅크 입수번호 gi 9506686 또는 NM_019508에 따른 핵산 서열을 포함하거나;
    cb) 상기 핵산은 상기 인자를 코딩하며, 유전자 코드의 변형 없이 ca)에 따른 핵산 또는 이의 일부에 하이브리다이즈 (hybridise)하거나;
    cc) 상기 핵산은 상기 인자를 코딩하며, ca)에 따른 핵산 또는 이의 일부에 상보적인 핵산에 0.1xSSC, 0.1% SDS, 65℃ 및 15분의 엄격한 하이브리디제이션 조건하에서 하이브리다이즈되며,
    상기 단편은 폴리펩티드 인자와 동일한 효과를 가짐을 특징으로 하는 표지.
  2. 실험관내에서 폴리펩티드 인자를 포함하는, 글루코오스 대사, 아미노산 및 글루코오스 상실과정, 당뇨, 창상 치유 (wound healing), 스트레스 반응, 아폽토시스, 전이, 종양형성, 세포이동, 세포외 기질에서의 세포 운동성 및 세포외 기질에서의 세포 성장을 포함하는 그룹으로부터 선택된 PI 3-키나아제 경로 조절 과정에 대한 표지로서,
    상기 인자는
    a) 서열번호 1에 따른 아미노산 서열을 포함하며;
    b) 데이터뱅크 입수번호 gi 9506687 또는 NP_061931에 따른 아미노산 서열을 가지며;
    c) 핵산에 의해 엔코딩되며,
    ca) 상기 핵산은 i) 서열번호 2 또는 3에 따른 핵산; 또는 ii) 데이터뱅크 입수번호 gi 9506686 또는 NM_019508에 따른 핵산 서열을 포함하거나;
    cb) 상기 핵산은 상기 인자를 코딩하며, 유전자 코드의 변형 없이 ca)에 따른 핵산 또는 이의 일부에 하이브리다이즈하거나;
    cc) 상기 핵산은 상기 인자를 코딩하며, ca)에 따른 핵산 또는 이의 일부에 상보적인 핵산에 0.1xSSC, 0.1% SDS, 65℃ 및 15분의 엄격한 하이브리디제이션 조건하에서 하이브리다이즈됨을 특징으로 하는 표지.
  3. 제 2항에 있어서, 형질전환 세포에 대한 표지임을 특징으로 하는 표지.
  4. 폴리펩티드 인자 또는 이의 단편을 포함하는, 말기단계 종양, 전이성 암, 당뇨 및 PI 3-키아나제 경로와 관련된 병리적 상태를 포함하는 그룹으로부터 선택된 질환의 치료 또는 예방을 위한, 또는 창상 치유를 위한 약제 조성물로서;
    상기 인자는
    a) 서열번호 1에 따른 아미노산 서열을 포함하며;
    b) 데이터뱅크 입수번호 gi 9506687 또는 NP_061931에 따른 아미노산 서열을 가지며;
    c) 핵산에 의해 엔코딩되며,
    ca) 상기 핵산은 i) 서열번호 2 또는 3에 따른 핵산; 또는 ii) 데이터뱅크 입수번호 gi 9506686 또는 NM_019508에 따른 핵산 서열을 포함하거나;
    cb) 상기 핵산은 상기 인자를 코딩하며, 유전자 코드의 변형 없이 ca)에 따른 핵산 또는 이의 일부에 하이브리다이즈하거나;
    cc) 상기 핵산은 상기 인자를 코딩하며, ca)에 따른 핵산 또는 이의 일부에 상보적인 핵산에 0.1xSSC, 0.1% SDS, 65℃ 및 15분의 엄격한 하이브리디제이션 조건하에서 하이브리다이즈되며,
    상기 병리적 상태는 자궁내막암, 직장암종 (colorectal carcinomas), 신경교종, 선종, 자궁내막 비후, 코우덴(Cowden) 증후군, 유전성 비-용종증 (hereditary non-polypsis) 직장암종, 리-프라우멘(Li-Fraumene) 증후군, 유방-난소 암, 전립선암, 바나얀-조아나나(Bannayan-Zonana)증후군, LDD(Lhermitte-Duklos’syndrome), 카우(Cow) 질환(CD) 및 바나얀-루발카바-릴리(Bannayan-Ruvalcaba-rily) 증후군(BRR)을 포함한 과오종-대두증 질환, 트리칠렘몬마스 (trichilemmonmas)를 포함하는 점막피부 병변, 대두증, 정신지체, 위장관 과오종, 지방종, 갑상선 선종, 유방의 섬유낭성 질환, 소뇌 형성장애 신경절 세포종 및 유방 및 갑상선 악성종양을 포함하는 그룹으로부터 선택되며,
    상기 단편은 폴리펩티드 인자와 동일한 효과를 가짐을 특징으로 하는 조성물.
  5. 폴리펩티드 인자 또는 이의 단편을 포함하는, 말기단계 종양, 전이성 암, 당뇨 및 PI 3-키아나제 경로와 관련된 병리적 상태를 포함하는 그룹으로부터 선택된 질환에 대한 또는 창상 치유에 대한 진단용 조성물로서;
    상기 인자는
    a) 서열번호 1에 따른 아미노산 서열을 포함하며;
    b) 데이터뱅크 입수번호 gi 9506687 또는 NP_061931에 따른 아미노산 서열을 가지며;
    c) 핵산에 의해 엔코딩되며,
    ca) 상기 핵산은 i) 서열번호 2 또는 3에 따른 핵산; 또는 ii) 데이터뱅크 입수번호 gi 9506686 또는 NM_019508에 따른 핵산 서열을 포함하거나;
    cb) 상기 핵산은 상기 인자를 코딩하며, 유전자 코드의 변형 없이 ca)에 따른 핵산 또는 이의 일부에 하이브리다이즈하거나;
    cc) 상기 핵산은 상기 인자를 코딩하며, ca)에 따른 핵산 또는 이의 일부에 상보적인 핵산에 0.1xSSC, 0.1% SDS, 65℃ 및 15분의 엄격한 하이브리디제이션 조건하에서 하이브리다이즈되며,
    상기 병리적 상태는 자궁내막암, 직장암종, 신경교종, 선종, 자궁내막 비후, 코우덴 증후군, 유전성 비-용종증 직장암종, 리-프라우멘(Li-Fraumene) 증후군, 유방-난소 암, 전립선암, 바나얀-조아나나 증후군, LDD, 카우(Cow) 질환(CD) 및 바나얀-루발카바-릴리 증후군(BRR)을 포함한 과오종-대두증 질환, 트리칠렘몬마스를 포함하는 점막피부 병변, 대두증, 정신지체, 위장관 과오종, 지방종, 갑상선 선종, 유방의 섬유낭성 질환, 소뇌 형성장애 신경절 세포종 및 유방 및 갑상선 악성종양을 포함하는 그룹으로부터 선택되며,
    상기 단편은 폴리펩티드 인자와 동일한 효과를 가짐을 특징으로 하는 조성물.
  6. 핵산 또는 이의 단편을 포함하는, 말기단계 종양, 전이성 암, 당뇨 및 PI 3-키아나제 경로와 관련된 병리적 상태를 포함하는 그룹으로부터 선택된 질환의 치료 또는 예방을 위한, 또는 창상 치유을 위한 약제 조성물로서;
    핵산은
    a) 인자를 코딩하는 핵산으로서, 이러한 인자는 i) 서열번호 1에 따른 아미노산을 포함하는 폴리펩티드 또는 ii) 데이터뱅크 입수번호 gi 9506687 또는 NP_061931에 따른 서열을 갖는 폴리펩티드이거나;
    b) 인자를 코딩하는 핵산으로서, 이러한 핵산은 i) 서열번호 2 또는 3에 따른 핵산; 또는 ii) 데이터뱅크 입수번호 gi 9506686 또는 NM_019508에 따른 핵산 서열을 포함하거나;
    c) 인자를 코딩하는 핵산으로서, 이러한 핵산은 유전자 코드의 변형없이 b)에 따른 핵산 또는 이의 일부에 하이브리다이즈하거나;
    d) 인자를 코딩하는 핵산으로서, 이러한 핵산은 b)에 따른 핵산 또는 이의 일부와 상보적인 핵산에 0.1xSSC, 0.1% SDS, 65℃ 및 15분의 엄격한 하이브리디제이션 조건하에서 하이브리다이즈되며,
    상기 병리적 상태는 자궁내막암, 직장암종, 신경교종, 선종, 자궁내막 비후, 코우덴 증후군, 유전성 비-용종증 직장암종, 리-프라우멘(Li-Fraumene) 증후군, 유방-난소 암, 전립선암, 바나얀-조아나나 증후군, LDD, 카우(Cow) 질환(CD) 및 바나얀-루발카바-릴리 증후군(BRR)을 포함한 과오종-대두증 질환, 트리칠렘몬마스를 포함하는 점막피부 병변, 대두증, 정신지체, 위장관 과오종, 지방종, 갑상선 선종, 유방의 섬유낭성 질환, 소뇌 형성장애 신경절 세포종 및 유방 및 갑상선 악성종양을 포함하는 그룹으로부터 선택되며,
    상기 단편은 상기 핵산과 동일한 효과를 가짐을 특징으로 하는 조성물.
  7. 핵산 또는 이의 단편을 포함하는, 말기단계 종양, 전이성 암, 당뇨 및 PI 3-키아나제 경로와 관련된 병리적 상태를 포함하는 그룹으로부터 선택된 질환 또는 창상 치유에 대한 진단용 조성물로서;
    핵산은
    a) 인자를 코딩하는 핵산으로서, 이러한 인자는 i) 서열번호 1에 따른 아미노산을 포함하는 폴리펩티드 또는 ii) 데이터뱅크 입수번호 gi 9506687 또는 NP_061931에 따른 서열을 갖는 폴리펩티드이거나;
    b) 인자를 코딩하는 핵산으로서, 이러한 핵산은 i) 서열번호 2 또는 3에 따른 핵산; 또는 ii) 데이터뱅크 입수번호 gi 9506686 또는 NM_019508에 따른 핵산 서열을 포함하거나;
    c) 인자를 코딩하는 핵산으로서, 이러한 핵산은 유전자 코드의 변형없이 b)에 따른 핵산 또는 이의 일부에 하이브리다이즈하거나;
    d) 인자를 코딩하는 핵산으로서, 이러한 핵산은 b)에 따른 핵산 또는 이의 일부와 상보적인 핵산에 0.1xSSC, 0.1% SDS, 65℃ 및 15분의 엄격한 하이브리디제이션 조건하에서 하이브리다이즈되며,
    상기 병리적 상태는 자궁내막암, 직장암종, 신경교종, 선종, 자궁내막 비후, 코우덴 증후군, 유전성 비-용종증 직장암종, 리-프라우멘(Li-Fraumene) 증후군, 유방-난소 암, 전립선암, 바나얀-조아나나 증후군, LDD, 카우(Cow) 질환(CD) 및 바나얀-루발카바-릴리 증후군(BRR)을 포함한 과오종-대두증 질환, 트리칠렘몬마스를 포함하는 점막피부 병변, 대두증, 정신지체, 위장관 과오종, 지방종, 갑상선 선종, 유방의 섬유낭성 질환, 소뇌 형성장애 신경절 세포종 및 유방 및 갑상선 악성종양을 포함하는 그룹으로부터 선택되며,
    상기 단편은 상기 핵산과 동일한 효과를 가짐을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제 4항 내지 제 7항중의 어느 한 항에 있어서, 상기 질환은 상기 질환에 관련된 세포가 PTEN 활성이 결여되어 있거나, PI 3-키나아제 경로의 과잉 활성화를 나타내거나 증가된 공격적 성향을 보이거나, 종양 세포임을 특징으로 하는 조성물.
  9. 표적 분자로서 실험관내 폴리펩티드 인자 또는 이의 단편을 포함하는, 말기단계 종양, 전이성 암, 당뇨 및 PI 3-키아나제 경로를 포함하는 병리적 상태를 포함하는 그룹으로부터 선택된 질환의 치료 또는 예방을 위한, 또는 창상 치유를 위한 의약 개발용 조성물로서,
    상기 인자는
    a) 서열번호 1에 따른 아미노산 서열을 포함하며;
    b) 데이터뱅크 입수번호 gi 9506687 또는 NP_061931에 따른 아미노산 서열을 가지며;
    c) 핵산에 의해 엔코딩되며,
    ca) 상기 핵산은 i) 서열번호 2 또는 3에 따른 핵산; 또는 ii) 데이터뱅크 입수번호 gi 9506686 또는 NM_019508에 따른 핵산 서열을 포함하거나;
    cb) 상기 핵산은 상기 인자를 코딩하며, 유전자 코드의 변형 없이 ca)에 따른 핵산 또는 이의 일부에 하이브리다이즈하거나;
    cc) 상기 핵산은 상기 인자를 코딩하며, ca)에 따른 핵산 또는 이의 일부에 상보적인 핵산에 0.1xSSC, 0.1% SDS, 65℃ 및 15분의 엄격한 하이브리디제이션 조건하에서 하이브리다이즈되며,
    상기 병리적 상태는 자궁내막암, 직장암종, 신경교종, 선종, 자궁내막 비후, 코우덴 증후군, 유전성 비-용종증 직장암종, 리-프라우멘(Li-Fraumene) 증후군, 유방-난소 암, 전립선암, 바나얀-조아나나 증후군, LDD, 카우(Cow) 질환(CD) 및 바나얀-루발카바-릴리 증후군(BRR)을 포함한 과오종-대두증 질환, 트리칠렘몬마스를 포함하는 점막피부 병변, 대두증, 정신지체, 위장관 과오종, 지방종, 갑상선 선종, 유방의 섬유낭성 질환, 소뇌 형성장애 신경절 세포종 및 유방 및 갑상선 악성종양을 포함하는 그룹으로부터 선택되며,
    상기 단편은 폴리펩티드 인자와 동일한 효과를 가짐을 특징으로 하는 조성물.
  10. 폴리펩티드 인자 또는 이의 단편을 포함하여, 말기단계 종양, 전이성 암, 당뇨 및 PI 3-키아나제 경로와 관련된 병리적 상태를 포함하는 그룹으로부터 선택된 질환 또는 창상 치유에 대한 진단물질 개발용 조성물로서;
    상기 인자는
    a) 서열번호 1에 따른 아미노산 서열을 포함하며;
    b) 데이터뱅크 입수번호 gi 9506687 또는 NP_061931에 따른 아미노산 서열을 가지며;
    c) 핵산에 의해 엔코딩되며,
    ca) 상기 핵산은 i) 서열번호 2 또는 3에 따른 핵산; 또는 ii) 데이터뱅크 입수번호 gi 9506686 또는 NM_019508에 따른 핵산 서열을 포함하거나;
    cb) 상기 핵산은 상기 인자를 코딩하며, 유전자 코드의 변형 없이 ca)에 따른 핵산 또는 이의 일부에 하이브리다이즈하거나;
    cc) 상기 핵산은 상기 인자를 코딩하며, ca)에 따른 핵산 또는 이의 일부에 상보적인 핵산에 0.1xSSC, 0.1% SDS, 65℃ 및 15분의 엄격한 하이브리디제이션 조건하에서 하이브리다이즈되며,
    상기 병리적 상태는 자궁내막암, 직장암종, 신경교종, 선종, 자궁내막 비후, 코우덴 증후군, 유전성 비-용종증 직장암종, 리-프라우멘(Li-Fraumene) 증후군, 유방-난소 암, 전립선암, 바나얀-조아나나 증후군, LDD, 카우(Cow) 질환(CD) 및 바나얀-루발카바-릴리 증후군(BRR)을 포함한 과오종-대두증 질환, 트리칠렘몬마스를 포함하는 점막피부 병변, 대두증, 정신지체, 위장관 과오종, 지방종, 갑상선 선종, 유방의 섬유낭성 질환, 소뇌 형성장애 신경절 세포종 및 유방 및 갑상선 악성종양을 포함하는 그룹으로부터 선택되며,
    상기 단편은 폴리펩티드 인자와 동일한 효과를 가짐을 특징으로 하는 조성물.
  11. 핵산 또는 이의 단편을 포함하는, 말기단계 종양, 전이성 암, 당뇨 및 PI 3-키아나제 경로와 관련된 병리적 상태를 포함하는 그룹으로부터 선택된 질환의 치료 또는 예방을 위한, 또는 창상 치유를 위한 의약 개발용 조성물로서;
    핵산은
    a) 인자를 코딩하는 핵산으로서, 이러한 인자는 i) 서열번호 1에 따른 아미노산을 포함하는 폴리펩티드 또는 ii) 데이터뱅크 입수번호 gi 9506687 또는 NP_061931에 따른 서열을 갖는 폴리펩티드이거나;
    b) 인자를 코딩하는 핵산으로서, 이러한 핵산은 i) 서열번호 2 또는 3에 따른 핵산; 또는 ii) 데이터뱅크 입수번호 gi 9506686 또는 NM_019508에 따른 핵산 서열을 포함하거나;
    c) 인자를 코딩하는 핵산으로서, 이러한 핵산은 유전자 코드의 변형없이 b)에 따른 핵산 또는 이의 일부에 하이브리다이즈하거나;
    d) 인자를 코딩하는 핵산으로서, 이러한 핵산은 b)에 따른 핵산 또는 이의 일부와 상보적인 핵산에 0.1xSSC, 0.1% SDS, 65℃ 및 15분의 엄격한 하이브리디제이션 조건하에서 하이브리다이즈되며,
    상기 병리적 상태는 자궁내막암, 직장암종, 신경교종, 선종, 자궁내막 비후, 코우덴 증후군, 유전성 비-용종증 직장암종, 리-프라우멘(Li-Fraumene) 증후군, 유방-난소 암, 전립선암, 바나얀-조아나나 증후군, LDD, 카우(Cow) 질환(CD) 및 바나얀-루발카바-릴리 증후군(BRR)을 포함한 과오종-대두증 질환, 트리칠렘몬마스를 포함하는 점막피부 병변, 대두증, 정신지체, 위장관 과오종, 지방종, 갑상선 선종, 유방의 섬유낭성 질환, 소뇌 형성장애 신경절 세포종 및 유방 및 갑상선 악성종양을 포함하는 그룹으로부터 선택되며,
    상기 단편은 상기 핵산과 동일한 효과를 가짐을 특징으로 하는 조성물.
  12. 핵산 또는 이의 단편을 포함하는, 말기단계 종양, 전이성 암, 당뇨 및 PI 3-키아나제 경로와 관련된 병리적 상태를 포함하는 그룹으로부터 선택된 질환 또는 창상 치유에 대한 진단물질 개발용 조성물로서;
    핵산은
    a) 인자를 코딩하는 핵산으로서, 이러한 인자는 i) 서열번호 1에 따른 아미노산을 포함하는 폴리펩티드 또는 ii) 데이터뱅크 입수번호 gi 9506687 또는 NP_061931에 따른 서열을 갖는 폴리펩티드이거나;
    b) 인자를 코딩하는 핵산으로서, 이러한 핵산은 i) 서열번호 2 또는 3에 따른 핵산; 또는 ii) 데이터뱅크 입수번호 gi 9506686 또는 NM_019508에 따른 핵산 서열을 포함하거나;
    c) 인자를 코딩하는 핵산으로서, 이러한 핵산은 유전자 코드의 변형없이 b)에 따른 핵산 또는 이의 일부에 하이브리다이즈하거나;
    d) 인자를 코딩하는 핵산으로서, 이러한 핵산은 b)에 따른 핵산 또는 이의 일부와 상보적인 핵산에 0.1xSSC, 0.1% SDS, 65℃ 및 15분의 엄격한 하이브리디제이션 조건하에서 하이브리다이즈되며,
    상기 병리적 상태는 자궁내막암, 직장암종, 신경교종, 선종, 자궁내막 비후, 코우덴 증후군, 유전성 비-용종증 직장암종, 리-프라우멘(Li-Fraumene) 증후군, 유방-난소 암, 전립선암, 바나얀-조아나나 증후군, LDD, 카우(Cow) 질환(CD) 및 바나얀-루발카바-릴리 증후군(BRR)을 포함한 과오종-대두증 질환, 트리칠렘몬마스를 포함하는 점막피부 병변, 대두증, 정신지체, 위장관 과오종, 지방종, 갑상선 선종, 유방의 섬유낭성 질환, 소뇌 형성장애 신경절 세포종 및 유방 및 갑상선 악성종양을 포함하는 그룹으로부터 선택되며,
    상기 단편은 상기 핵산과 동일한 효과를 가짐을 특징으로 하는 조성물.
  13. 제 9항 내지 제 12항중 어느 한 항에 있어서, 상기 의약 또는 진단 물질은 항체, 펩티드, 안티칼린, 소 분자, 안티센스 분자, 아프타머, 스피엘겔머 (spiegelmer) 및 RNAi 분자를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  14. 제 13항에 있어서, 상기 물질이 폴리펩티드 인자 또는 이의 단편과 상호작용하며,
    상기 인자는
    a) 서열번호 1에 따른 아미노산 서열을 포함하며;
    b) 데이터뱅크 입수번호 gi 9506687 또는 NP_061931에 따른 아미노산 서열을 가지며;
    c) 핵산에 의해 엔코딩되며,
    ca) 상기 핵산은 i) 서열번호 2 또는 3에 따른 핵산; 또는 ii) 데이터뱅크 입수번호 gi 9506686 또는 NM_019508에 따른 핵산 서열을 포함하거나;
    cb) 상기 핵산은 상기 인자를 코딩하며, 유전자 코드의 변형 없이 ca)에 따른 핵산 또는 이의 일부에 하이브리다이즈하거나;
    cc) 상기 핵산은 상기 인자를 코딩하며, ca)에 따른 핵산 또는 이의 일부에 상보적인 핵산에 0.1xSSC, 0.1% SDS, 65℃ 및 15분의 엄격한 하이브리디제이션 조건하에서 하이브리다이즈되며,
    상기 단편은 폴리펩티드 인자와 동일한 효과를 가짐을 특징으로 하는 조성물.
  15. 제 13항에 있어서, 상기 물질이 핵산, 폴리펩티드 인자에 대한 mRNA, 게놈 핵산 또는 cDNA와 상호작용하며,
    핵산은
    a) 인자를 코딩하는 핵산으로서, 이러한 인자는 i) 서열번호 1에 따른 아미노산을 포함하는 폴리펩티드 또는 ii) 데이터뱅크 입수번호 gi 9506687 또는 NP_061931에 따른 서열을 갖는 폴리펩티드이거나;
    b) 인자를 코딩하는 핵산으로서, 이러한 핵산은 i) 서열번호 2 또는 3에 따른 핵산; 또는 ii) 데이터뱅크 입수번호 gi 9506686 또는 NM_019508에 따른 핵산 서열을 포함하거나;
    c) 인자를 코딩하는 핵산으로서, 이러한 핵산은 유전자 코드의 변형없이 b)에 따른 핵산 또는 이의 일부에 하이브리다이즈하거나;
    d) 인자를 코딩하는 핵산으로서, 이러한 핵산은 b)에 따른 핵산 또는 이의 일부와 상보적인 핵산에 0.1xSSC, 0.1% SDS, 65℃ 및 15분의 엄격한 하이브리디제이션 조건하에서 하이브리다이즈되며,
    상기 인자는
    a) 서열번호 1에 따른 아미노산 서열을 포함하며;
    b) 데이터뱅크 입수번호 gi 9506687 또는 NP_061931에 따른 아미노산 서열을 가지며;
    c) 핵산에 의해 엔코딩되며,
    ca) 상기 핵산은 i) 서열번호 2 또는 3에 따른 핵산; 또는 ii) 데이터뱅크 입수번호 gi 9506686 또는 NM_019508에 따른 핵산 서열을 포함하거나;
    cb) 상기 핵산은 상기 인자를 코딩하며, 유전자 코드의 변형 없이 ca)에 따른 핵산 또는 이의 일부에 하이브리다이즈하거나;
    cc) 상기 핵산은 상기 인자를 코딩하며, ca)에 따른 핵산 또는 이의 일부에 상보적인 핵산에 0.1xSSC, 0.1% SDS, 65℃ 및 15분의 엄격한 하이브리디제이션 조건하에서 하이브리다이즈됨을 특징으로 하는 조성물.
  16. 폴리펩티드 인자 또는 이의 단편과 상호작용하는 폴리펩티드를 포함하는, 질환의 치료 또는 예방하기 위한 또는 상치 치유를 위한 의약 개발용 또는 제조용 또는 질환 또는 상치 치유에 대한 진단물질 제조용 조성물로서,
    상기 질환은 말기단계 종양, 전이성 암, 당뇨 및 PI 3-키아나제 경로를 포함하는 병리적 상태를 포함하는 그룹으로부터 선택되며,
    상기 병리적 상태는 자궁내막암, 직장암종, 신경교종, 선종, 자궁내막 비후, 코우덴 증후군, 유전성 비-용종증 직장암종, 리-프라우멘(Li-Fraumene) 증후군, 유방-난소 암, 전립선암, 바나얀-조아나나 증후군, LDD, 카우(Cow) 질환(CD) 및 바나얀-루발카바-릴리 증후군(BRR)을 포함한 과오종-대두증 질환, 트리칠렘몬마스를 포함하는 점막피부 병변, 대두증, 정신지체, 위장관 과오종, 지방종, 갑상선 선종, 유방의 섬유낭성 질환, 소뇌 형성장애 신경절 세포종 및 유방 및 갑상선 악성종양을 포함하는 그룹으로부터 선택되며,
    상기 폴리펩티드는 폴리펩티드 인자 또는 이의 단편에 대한 항체, 및 폴리펩티드 인자 또는 일부에 결합하는 폴리펩티드를 포함하는 그룹으로부터 선택되며,
    상기 폴리펩티드 인자는
    a) 서열번호 1에 따른 아미노산 서열을 포함하며;
    b) 데이터뱅크 입수번호 gi 9506687 또는 NP_061931에 따른 아미노산 서열을 가지며;
    c) 핵산에 의해 엔코딩되며,
    ca) 상기 핵산은 i) 서열번호 2 또는 3에 따른 핵산; 또는 ii) 데이터뱅크 입수번호 gi 9506686 또는 NM_019508에 따른 핵산 서열을 포함하거나;
    cb) 상기 핵산은 상기 인자를 코딩하며, 유전자 코드의 변형 없이 ca)에 따른 핵산 또는 이의 일부에 하이브리다이즈하거나;
    cc) 상기 핵산은 상기 인자를 코딩하며, ca)에 따른 핵산 또는 이의 일부에 상보적인 핵산에 0.1xSSC, 0.1% SDS, 65℃ 및 15분의 엄격한 하이브리디제이션 조건하에서 하이브리다이즈되며,
    상기 단편은 폴리펩티드 인자와 동일한 효과를 가짐을 특징으로 하는 조성물.
  17. 폴리펩티드 인자 또는 이의 단편과 상호작용하는 핵산을 포함하는, 질환의 치료 또는 예방하기 위한 또는 상치 치유를 위한 의약 개발용 또는 제조용, 또는 질환 또는 상치 치유에 대한 위한 진단물질 제조용 조성물로서,
    상기 질환은 말기단계 종양, 전이성 암, 당뇨 및 PI 3-키아나제 경로를 포함하는 병리적 상태를 포함하는 그룹으로부터 선택되며,
    상기 병리적 상태는 자궁내막암, 직장암종, 신경교종, 선종, 자궁내막 비후, 코우덴 증후군, 유전성 비-용종증 직장암종, 리-프라우멘(Li-Fraumene) 증후군, 유방-난소 암, 전립선암, 바나얀-조아나나 증후군, LDD, 카우(Cow) 질환(CD) 및 바나얀-루발카바-릴리 증후군(BRR)을 포함한 과오종-대두증 질환, 트리칠렘몬마스를 포함하는 점막피부 병변, 대두증, 정신지체, 위장관 과오종, 지방종, 갑상선 선종, 유방의 섬유낭성 질환, 소뇌 형성장애 신경절 세포종 및 유방 및 갑상선 악성종양을 포함하는 그룹으로부터 선택되며,
    상기 핵산은 아프타머 및 스피엘겔머를 포함하는 그룹으로부터 선택되며,
    상기 폴리펩티드 인자는
    a) 서열번호 1에 따른 아미노산 서열을 포함하며;
    b) 데이터뱅크 입수번호 gi 9506687 또는 NP_061931에 따른 아미노산 서열을 가지며;
    c) 핵산에 의해 엔코딩되며,
    ca) 상기 핵산은 i) 서열번호 2 또는 3에 따른 핵산; 또는 ii) 데이터뱅크 입수번호 gi 9506686 또는 NM_019508에 따른 핵산 서열을 포함하거나;
    cb) 상기 핵산은 상기 인자를 코딩하며, 유전자 코드의 변형 없이 ca)에 따른 핵산 또는 이의 일부에 하이브리다이즈하거나;
    cc) 상기 핵산은 상기 인자를 코딩하며, ca)에 따른 핵산 또는 이의 일부에 상보적인 핵산에 0.1xSSC, 0.1% SDS, 65℃ 및 15분의 엄격한 하이브리디제이션 조건하에서 하이브리다이즈되며,
    상기 단편은 폴리펩티드 인자와 동일한 효과를 가짐을 특징으로 하는 조성물.
  18. 폴리펩티드 인자 또는 이의 단편을 코딩하는 핵산과 상호작용하는 핵산을 포함하는, 질환의 치료 또는 예방을 위한 또는 상치 치유를 위한 의약 개발용 또는 제조용, 또는 질환 또는 상치 치유에 대한 진단물질 제조용 조성물로서,
    상기 질환은 말기단계 종양, 전이성 암, 당뇨 및 PI 3-키아나제 경로를 포함하는 병리적 상태를 포함하는 그룹으로부터 선택되며,
    상기 병리적 상태는 자궁내막암, 직장암종, 신경교종, 선종, 자궁내막 비후, 코우덴 증후군, 유전성 비-용종증 직장암종, 리-프라우멘(Li-Fraumene) 증후군, 유방-난소 암, 전립선암, 바나얀-조아나나 증후군, LDD, 카우(Cow) 질환(CD) 및 바나얀-루발카바-릴리 증후군(BRR)을 포함한 과오종-대두증 질환, 트리칠렘몬마스를 포함하는 점막피부 병변, 대두증, 정신지체, 위장관 과오종, 지방종, 갑상선 선종, 유방의 섬유낭성 질환, 소뇌 형성장애 신경절 세포종 및 유방 및 갑상선 악성종양을 포함하는 그룹으로부터 선택되며,
    상호작용하는 상기 핵산은 안티센스 올리고뉴클레오티드, 리보자임 또는 siRNA이며,
    상기 폴리펩티드 인자는
    a) 서열번호 1에 따른 아미노산 서열을 포함하며;
    b) 데이터뱅크 입수번호 gi 9506687 또는 NP_061931에 따른 아미노산 서열을 가지며;
    c) 핵산에 의해 엔코딩되며,
    ca) 상기 핵산은 i) 서열번호 2 또는 3에 따른 핵산; 또는 ii) 데이터뱅크 입수번호 gi 9506686 또는 NM_019508에 따른 핵산 서열을 포함하거나;
    cb) 상기 핵산은 상기 인자를 코딩하며, 상기 핵산은 유전자 코드의 변형 없이 ca)에 따른 핵산 또는 이의 일부에 하이브리다이즈 (hybridise)하거나;
    cc) 상기 핵산은 상기 인자를 코딩하며, 상기 핵산을 ca)에 따른 핵산 또는 이의 일부에 상보적인 핵산에 0.1xSSC, 0.1% SDS, 65℃ 및 15분의 엄격한 하이브리디제이션 조건하에서 하이브리다이즈되며,
    상기 단편은 폴리펩티드 인자와 동일한 효과를 가짐을 특징으로 하는 조성물.
  19. 제 18항에 있어서, 폴리펩티드 인자 또는 이의 단편을 코딩하는 핵산이 cDNA, mRNA 또는 hnRNA임을 특징으로 하는 조성물.
  20. 말기단계 종양, 전이성 암, 당뇨 및 PI 3-키아나제 경로를 포함하는 병리적 상태를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 질환 또는 상태를 특성결정하기 위한 키트에 있어서,
    상기 병리적 상태는 자궁내막암, 직장암종, 신경교종, 선종, 자궁내막 비후, 코우덴 증후군, 유전성 비-용종증 직장암종, 리-프라우멘(Li-Fraumene) 증후군, 유방-난소 암, 전립선암, 바나얀-조아나나 증후군, LDD, 카우(Cow) 질환(CD) 및 바나얀-루발카바-릴리 증후군(BRR)을 포함한 과오종-대두증 질환, 트리칠렘몬마스를 포함하는 점막피부 병변, 대두증, 정신지체, 위장관 과오종, 지방종, 갑상선 선종, 유방의 섬유낭성 질환, 소뇌 형성장애 신경절 세포종 및 유방 및 갑상선 악성종양 및 창상을 포함하는 그룹으로부터 선택되며,
    상기 키트는
    폴리펩티드 인자 또는 이의 단편;
    상기 폴리펩티드 인자 또는 이의 단편에 대해 특이적인 항체;
    상기 폴리펩티드 인자 또는 이의 단편과 상호작용하는 폴리펩티드;
    a) i) 서열번호 1에 따른 아미노산을 포함하는 폴리펩티드 또는 ii) 데이터뱅크 입수번호 gi 9506687 또는 NP_061931에 따른 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산,
    b) 인자를 코딩하는 핵산으로서, i) 서열번호 2 또는 3에 따른 핵산; 또는 ii) 데이터뱅크 입수번호 gi 9506686 또는 NM_019508에 따른 핵산 서열을 포함하는 핵산,
    c) 인자를 코딩하는 핵산으로서, 유전자 코드의 변형없이 b)에 따른 핵산 또는 이의 일부에 하이브리다이즈하는 핵산, 또는
    d) 인자를 코딩하는 핵산으로서, b)에 따른 핵산 또는 이의 일부와 상보적인 핵산에 0.1xSSC, 0.1% SDS, 65℃ 및 15분의 엄격한 하이브리디제이션 조건하에서 하이브리다이즈되는 핵산과 상호작용하는 폴리펩티드;
    상기 폴리펩티드 인자 또는 이의 단편과 상호작용하는 핵산; 및
    a) i) 서열번호 1에 따른 아미노산을 포함하는 폴리펩티드 또는 ii) 데이터뱅크 입수번호 gi 9506687 또는 NP_061931에 따른 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산,
    b) 인자를 코딩하는 핵산으로서, 이러한 핵산은 i) 서열번호 2 또는 3에 따른 핵산; 또는 ii) 데이터뱅크 입수번호 gi 9506686 또는 NM_019508에 따른 핵산 서열을 포함하는 핵산,
    c) 인자를 코딩하는 핵산으로서, 이러한 핵산은 유전자 코드의 변형없이 b)에 따른 핵산 또는 이의 일부에 하이브리다이즈하는 핵산, 또는
    d) 인자를 코딩하는 핵산으로서, 이러한 핵산은 b)에 따른 핵산 또는 이의 일부와 상보적인 핵산에 0.1xSSC, 0.1% SDS, 65℃ 및 15분의 엄격한 하이브리디제이션 조건하에서 하이브리다이즈되는 핵산과 상호작용하는 핵산을 포함하는 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 제제 및 경우에 따라 하나 이상의 다른 화합물을 포함하며,
    상기 폴리펩티드 인자는
    a) 서열번호 1에 따른 아미노산 서열을 포함하며;
    b) 데이터뱅크 입수번호 gi 9506687 또는 NP_061931에 따른 아미노산 서열을 가지며;
    c) 핵산에 의해 엔코딩되며,
    ca) 상기 핵산은 i) 서열번호 2 또는 3에 따른 핵산; 또는 ii) 데이터뱅크 입수번호 gi 9506686 또는 NM_019508에 따른 핵산 서열을 포함하거나;
    cb) 상기 핵산은 상기 인자를 코딩하며, 상기 핵산은 유전자 코드의 변형 없이 ca)에 따른 핵산 또는 이의 일부에 하이브리다이즈 (hybridise)하거나;
    cc) 상기 핵산은 상기 인자를 코딩하며, 상기 핵산을 ca)에 따른 핵산 또는 이의 일부에 상보적인 핵산에 0.1xSSC, 0.1% SDS, 65℃ 및 15분의 엄격한 하이브리디제이션 조건하에서 하이브리다이즈되며,
    상기 단편은 폴리펩티드 인자와 동일한 효과를 가짐을 특징으로 하는 키트.
  21. 제 20항에 있어서, 상기 폴리펩티드 인자는 생물학적 과정에 관여하며, 상기 생물학적 과정은 PI 3-키나아제 경로 조절 과정임을 특징으로 하는 키트.
  22. 제 21항에 있어서, 상기 과정은 글루코오스 대사, 아미노산 및 글루코오스 상실과정, 당뇨, 창상 치유, 스트레스 반응, 아폽토시스, 전이, 종양형성, 세포이동, 세포외 기질에서의 세포 운동성 및 세포외 기질에서의 세포 성장을 포함하는 그룹으로부터 선택되는 과정임을 특징으로 하는 키트.
  23. 질환의 치료 또는 예방을 위한, 또는 창상 치유를 위한 의약 제조용 또는 질환 또는 창상 치유에 대한 진단물질 제조용 물질의 스크리닝 방법에 있어서,
    상기 질환은 말기단계 종양, 전이성 암, 당뇨 및 PI 3-키아나제 경로를 포함하는 병리적 상태를 포함하는 그룹으로부터 선택되며,
    a) 후보 화합물을 제공하는 단계;
    b) 폴리펩티드 인자에 대한 발현 시스템 또는 상기 폴리펩티드 인자의 활성을 검출하는 활성시스템을 제공하는 단계로서, 상기 인자는
    ba) 서열번호 1에 따른 아미노산 서열을 포함하며;
    bb) 데이터뱅크 입수번호 gi 9506687 또는 NP_061931에 따른 아미노산 서열을 가지며;
    bc) 핵산에 의해 엔코딩되며,
    bca) 상기 핵산은 i) 서열번호 2 또는 3에 따른 핵산; 또는 ii) 데이터뱅크 입수번호 gi 9506686 또는 NM_019508에 따른 핵산 서열을 포함하거나;
    bcb) 상기 핵산은 상기 인자를 코딩하며, 상기 핵산은 유전자 코드의 변형 없이 bca)에 따른 핵산 또는 이의 일부에 하이브리다이즈 (hybridise)하거나;
    bcc) 상기 핵산은 상기 인자를 코딩하며, 상기 핵산을 ca)에 따른 핵산 또는 이의 일부에 상보적인 핵산에 0.1xSSC, 0.1% SDS, 65℃ 및15분의 엄격한 하이브리디제이션 조건하에서 하이브리다이즈되는 단계;
    c) 상기 후보 화합물을 상기 폴리펩티드 인자에 대한 발현 시스템 또는 상기 폴리펩티드 인자의 활성을 검출하는 활성 시스템과 접촉시키는 단계;
    d) 상기 폴리펩티드 인자에 대한 발현 또는 활성이 후보 화합물의 영향하에서 변하는지 여부를 측정하는 단계를 포함하며,
    상기 병리적 상태는 자궁내막암, 직장암종, 신경교종, 선종, 자궁내막 비후, 코우덴 증후군, 유전성 비-용종증 직장암종, 리-프라우멘(Li-Fraumene) 증후군, 유방-난소 암, 전립선암, 바나얀-조아나나 증후군, LDD, 카우(Cow) 질환(CD) 및 바나얀-루발카바-릴리 증후군(BRR)을 포함한 과오종-대두증 질환, 트리칠렘몬마스를 포함하는 점막피부 병변, 대두증, 정신지체, 위장관 과오종, 지방종, 갑상선 선종, 유방의 섬유낭성 질환, 소뇌 형성장애 신경절 세포종 및 유방 및 갑상선 악성종양 및 창상을 포함하는 그룹으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 23항에 있어서, 상기 후보 화합물이 화합물 라이브러리에 함유됨을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 23항 또는 제 24항에 있어서, 상기 후보 화합물은 펩티드, 단백질, 항체, 안티칼린, 작용성 핵산, 천연 화합물 및 소분자를 포함하는 그룹으로서터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 25항에 있어서, 상기 작용성 핵산이 아프타머, 아프타짐, 리보자임, 스피에겔머, 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 siRNA를 포함하는 그룹으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 실험관내 (in-vitro)에서 폴리펩티드 인자 또는 이의 단편을 포함하는, PI 3-키나아제 경로의 표적으로서,
    상기 인자는
    a) 서열번호 1에 따른 아미노산 서열을 포함하며;
    b) 데이터뱅크 입수번호 gi 9506687 또는 NP_061931에 따른 아미노산 서열을 가지며;
    c) 핵산에 의해 엔코딩되며,
    ca) 상기 핵산은 i) 서열번호 2 또는 3에 따른 핵산; 또는 ii) 데이터뱅크 입수번호 gi 9506686 또는 NM_019508에 따른 핵산 서열을 포함하거나;
    cb) 상기 핵산은 상기 인자를 코딩하며, 유전자 코드의 변형 없이 ca)에 따른 핵산 또는 이의 일부에 하이브리다이즈하거나;
    cc) 상기 핵산은 상기 인자를 코딩하며, ca)에 따른 핵산 또는 이의 일부에 상보적인 핵산에 0.1xSSC, 0.1% SDS, 65℃ 및 15분의 엄격한 하이브리디제이션 조건하에서 하이브리다이즈됨을 특징으로 하는 표적.
  28. 제 27항에 있어서, PI3-키나아제 경로의 약물 표적임을 특징으로 하는 표적.
  29. 제 3항에 있어서, 변형된 세포가 침윤 세포임을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 8항에 있어서, 종양 세포가 말기 단계 종양세포임을 특징으로 하는 조성물.
  31. 삭제
  32. 삭제
  33. 삭제
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Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7405292B2 (en) 2002-02-19 2008-07-29 The Children's Hospital Of Philadelphia Cellular genes regulated by HIV-1 infection and methods of use thereof
DK3222724T3 (en) 2002-08-05 2018-12-03 Silence Therapeutics Gmbh ADDITIONALLY UNKNOWN FORMS OF INTERFERRING RNA MOLECULES
EP2072619A1 (en) * 2002-10-18 2009-06-24 Silence Therapeutics Aktiengesellschaft Factor involved in metastasis and uses thereof
MX2007002043A (es) 2004-08-16 2007-10-11 Quark Biotech Inc Usos terapeuticos de los inhibidores del rtp801.
CN100357323C (zh) * 2006-01-05 2007-12-26 清华大学 一种细胞迁移相关蛋白及其编码基因与应用
DOP2007000015A (es) 2006-01-20 2007-08-31 Quark Biotech Inc Usos terapéuticos de inhibidores de rtp801
US7825099B2 (en) 2006-01-20 2010-11-02 Quark Pharmaceuticals, Inc. Treatment or prevention of oto-pathologies by inhibition of pro-apoptotic genes
FR2898908A1 (fr) 2006-03-24 2007-09-28 Agronomique Inst Nat Rech Procede de preparation de cellules aviaires differenciees et genes impliques dans le maintien de la pluripotence
GB2450840B (en) * 2006-05-11 2010-12-29 Quark Pharmaceuticals Inc Screening Systems Utilizing RTP801
WO2008106102A2 (en) 2007-02-26 2008-09-04 Quark Pharmaceuticals, Inc. Inhibitors of rtp801 and their use in disease treatment
EP2326351B1 (en) 2008-08-19 2017-12-27 Nektar Therapeutics Conjugates of small-interfering nucleic acids
US8916693B2 (en) 2009-09-17 2014-12-23 Nektar Therapeutics Monoconjugated chitosans as delivery agents for small interfering nucleic acids
CN104619844A (zh) 2012-09-12 2015-05-13 夸克制药公司 靶向p53的双链寡核苷酸分子及其使用方法

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE318832T1 (de) 1990-06-11 2006-03-15 Gilead Sciences Inc Verfahren zur vervendung von nukleinsäureliganden
DE59708838D1 (de) 1996-08-30 2003-01-09 Jens Peter Fuerste Spiegelselektion und spiegelevolution von nucleinsäuren
US5989912A (en) 1996-11-21 1999-11-23 Oligos Etc. Inc. Three component chimeric antisense oligonucleotides
US5849902A (en) 1996-09-26 1998-12-15 Oligos Etc. Inc. Three component chimeric antisense oligonucleotides
DE19742706B4 (de) 1997-09-26 2013-07-25 Pieris Proteolab Ag Lipocalinmuteine
WO1999054459A2 (en) 1998-04-20 1999-10-28 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid molecules with novel chemical compositions capable of modulating gene expression
US5958773A (en) * 1998-12-17 1999-09-28 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of AKT-1 expression
DE19956568A1 (de) 1999-01-30 2000-08-17 Roland Kreutzer Verfahren und Medikament zur Hemmung der Expression eines vorgegebenen Gens
CA2382748A1 (en) * 1999-06-11 2000-12-21 Human Genome Sciences, Inc. 50 human secreted proteins
US6133032A (en) * 1999-09-09 2000-10-17 Isis Pharmaceutical Inc. Antisense modulation of PI3 kinase p110 beta expression
WO2003070918A2 (en) 2002-02-20 2003-08-28 Ribozyme Pharmaceuticals, Incorporated Rna interference by modified short interfering nucleic acid
KR20080023768A (ko) 2000-03-30 2008-03-14 화이트헤드 인스티튜트 포 바이오메디칼 리서치 Ｒｎａ 간섭의 ｒｎａ 서열 특이적인 매개체
US6673545B2 (en) * 2000-07-28 2004-01-06 Incyte Corporation Prostate cancer markers
WO2002046465A2 (en) * 2000-12-08 2002-06-13 Oxford Biomedica (Uk) Limited Method for identification of genes involved in specific diseases
WO2003010205A1 (en) * 2001-07-26 2003-02-06 Duke University Medical Center Genes induced by hypoxia
CN102220423A (zh) * 2002-08-20 2011-10-19 千年药品公司 用于鉴定,评估,预防和治疗子宫颈癌的组合物,试剂盒及方法
EP2072619A1 (en) * 2002-10-18 2009-06-24 Silence Therapeutics Aktiengesellschaft Factor involved in metastasis and uses thereof
MX2007002043A (es) * 2004-08-16 2007-10-11 Quark Biotech Inc Usos terapeuticos de los inhibidores del rtp801.

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
WO 0077022(2000. 12. 21) *
WO 0246465(2002.6.13) *

Also Published As

Publication number Publication date
DE60325754D1 (de) 2009-02-26
MXPA05004134A (es) 2005-10-05
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EP1551868B1 (en) 2009-01-07
ZA200502483B (en) 2005-11-30
US20100285038A1 (en) 2010-11-11
ATE420102T1 (de) 2009-01-15
CN1705746A (zh) 2005-12-07
CN100564524C (zh) 2009-12-02
JP4820092B2 (ja) 2011-11-24
WO2004035615A3 (en) 2004-06-03
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CA2501333A1 (en) 2004-04-29
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EP2072619A1 (en) 2009-06-24
IL167801A (en) 2012-10-31
US20060240022A1 (en) 2006-10-26
JP2011125339A (ja) 2011-06-30
DK1551868T3 (da) 2009-04-20
WO2004035615A2 (en) 2004-04-29

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