JP2007511211A - アデノウイルスおよびそれをコードしている核酸の新たな使用 - Google Patents
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Abstract
Description
a)YB−1核陽性細胞内で、E1B−55K、E3ADPおよびE4orf6およびE4orf3を含む群から選ばれる少なくとも1つのウイルス遺伝子がトランス活性化されること;および
b)核内、特にウイルス発ガン遺伝子タンパク質が存在している細胞の核内でのYB−1の誘導を欠くこと。
1. 頭蓋ならびに脳(頭蓋内)の腫瘍、好ましくは星状細胞腫、オリゴデンドログリオーマ、髄膜腫、神経芽細胞腫、神経細胞腫、上衣細胞腫、神経鞘膠腫、神経繊維腫、血管芽細胞腫、脂肪腫、クラニオファリンジオーマ、奇形腫および脊索腫;
2. 脊髄および脊柱管の腫瘍、好ましくは膠芽腫、髄膜腫、神経芽細胞腫、神経繊維腫、骨肉腫、軟骨肉腫、血管肉腫、繊維肉腫および多発性骨髄腫;ならびに
3. 末梢神経の腫瘍、好ましくは神経鞘膠腫、神経繊維腫、神経繊維肉腫および神経周囲の線維芽細胞腫。
1. 眼瞼および眼瞼腺の腫瘍、好ましくは腺腫、腺ガン、乳頭腫、組織球腫、肥満細胞腫、基底細胞腫瘍、メラノーマ、扁平上皮細胞ガン、繊維腫および繊維肉腫;
2. 結膜および瞬膜の腫瘍、好ましくは扁平上皮細胞ガン、血管腫、血管肉腫、腺腫、腺ガン、繊維肉腫、メラノーマおよび乳頭腫;ならびに
3. 眼窩、視神経および眼球の腫瘍、好ましくは網膜芽細胞腫、骨肉腫、肥満細胞腫、髄膜腫、細網細胞腫瘍、神経膠腫、神経鞘膠腫、軟骨腫、腺ガン、扁平上皮細胞ガン、形質細胞腫瘍、リンパ腫、横紋筋肉腫およびメラノーマ。
組織球腫、脂肪腫、繊維肉腫、繊維腫、肥満細胞腫、悪性メラノーマ、乳頭腫、基底細胞腫瘍、角化棘細胞腫、血管周囲細胞腫、毛嚢腫瘍、汗腺腫瘍、皮脂腺の腫瘍、血管種、血管肉腫、脂肪腫、脂肪肉腫、悪性線維性組織球腫、プラスマ細胞腫およびリンパ管腫、などの腫瘍を含む。
歯槽の軟部組織肉腫、類上皮細胞肉腫、軟組織の軟骨肉腫、軟組織の骨肉腫、軟組織のユーイング肉腫、未分化神経外胚葉性腫瘍(PNET)、繊維肉腫、繊維腫、平滑筋肉腫、平滑筋腫、脂肪肉腫、悪性線維性組織球腫、悪性血管周囲細胞腫、血管腫、血管肉腫、悪性間葉腫、悪性末梢神経鞘腫瘍(MPNST)、悪性神経鞘膠腫、悪性メラノサイト性神経鞘膠腫、横紋筋肉腫、滑膜肉腫、リンパ管腫およびリンパ管肉腫、などの腫瘍を含む。
1. 口腔および舌の腫瘍、好ましくは扁平上皮細胞ガン、繊維肉腫、マーケル細胞腫瘍、誘導性繊維エナメル芽細胞腫、繊維腫、繊維肉腫、ウイルス性乳頭腫症、特発性乳頭腫症、鼻咽頭ポリープ、平滑筋肉腫、筋芽細胞腫および肥満細胞腫;
2. 唾液腺の腫瘍、好ましくは腺ガン;
3. 食道の腫瘍、好ましくは扁平上皮細胞ガン、平滑筋肉腫、繊維肉腫、骨肉腫、バレットのガンおよび食道周囲腫瘍;
4. 膵臓外分泌腺の腫瘍、好ましくは腺ガン;ならびに
5. 胃の腫瘍、好ましくは腺ガン、平滑筋腫、平滑筋肉腫および繊維肉腫。
1. 鼻および鼻腔、喉頭および気管の腫瘍、好ましくは扁平上皮細胞ガン、繊維肉腫、繊維腫、リンパ肉腫、リンパ腫、血管腫、血管肉腫、メラノーマ、肥満細胞腫、骨肉腫、軟骨肉腫、好酸性顆粒細胞腫(横紋筋腫)、腺ガンおよび筋芽細胞腫;ならびに
2. 肺の腫瘍、好ましくは扁平上皮細胞ガン、繊維肉腫、繊維腫、リンパ肉腫、リンパ腫、血管腫、血管肉腫、メラノーマ、肥満細胞腫、骨肉腫、軟骨肉腫、好酸性顆粒細胞腫(横紋筋腫)、腺ガン、筋芽細胞腫、小細胞ガン、非小細胞ガン、気管支の腺ガン、気管支肺胞腺ガンおよび肺胞性腺ガン。
骨肉腫、軟骨肉腫、傍骨性骨肉腫、血管肉腫、滑膜細胞肉腫、血管肉腫、繊維肉腫、悪性間葉腫、巨細胞腫、骨腫および多小葉骨腫、を含む。
1. 甲状腺/副甲状腺の腫瘍、好ましくは腺腫および腺ガン;
2. 腎上体の腫瘍、好ましくは腺腫、腺ガンおよび褐色細胞腫(髄質副腎腫);
3. 視床下部/下垂体の腫瘍、好ましくは腺腫および腺ガン;
4. 膵臓内分泌腺の腫瘍、好ましくはインスリノーマ(β細胞腫瘍、APUDom)およびゾリンジャー−エリソン症候群(膵臓デルタ細胞のガストリン分泌器官腫瘍);ならびに、
5. 多発性内分泌腫瘍症(MEN)および非クロム親和性傍神経節腫(chemodectoma)。
1. 卵巣の腫瘍、好ましくは腺腫、腺ガン、嚢腺腫および未分化ガン;
2. 子宮の腫瘍、好ましくは平滑筋腫、平滑筋肉腫、腺腫、腺ガン、繊維腫、繊維肉腫および脂肪腫;
3. 頚部の腫瘍、好ましくは腺ガン、腺腫、平滑筋肉腫および平滑筋腫;
4. 膣および陰門の腫瘍、好ましくは平滑筋腫、平滑筋肉腫、線維平滑筋腫、繊維腫、繊維肉腫、ポリープおよび扁平上皮細胞ガン。
線維腺腫、腺腫、腺ガン、間充織腫瘍、ガン、ガン肉腫を含む。
1. 睾丸の腫瘍、好ましくは精上皮腫、間細胞腫およびセルトリ細胞腫;
2. 前立腺の腫瘍、好ましくは腺ガン、未分化ガン、扁平上皮細胞ガン、平滑筋肉腫および移行細胞ガン;ならびに
3. 陰茎および外部生殖器の腫瘍、好ましくは肥満細胞腫および扁平上皮細胞ガン。
1. 腎臓の腫瘍、好ましくは腺ガン、移行細胞ガン(上皮性腫瘍)、繊維肉腫、軟骨肉腫(間葉腫瘍)、ウィルムス腫瘍、腎芽腫および腺肉腫(胚の多分化能芽細胞腫);
2. 尿管の腫瘍、好ましくは平滑筋腫、平滑筋肉腫、線維乳頭腫、移行細胞ガン;
3. 膀胱の腫瘍、好ましくは移行細胞ガン、扁平上皮細胞ガン、腺ガン、ブドウ房形(胚の横紋筋肉腫)、繊維腫、繊維肉腫、平滑筋腫、平滑筋肉腫、乳頭腫および血管肉腫;ならびに
4. 尿道の腫瘍、好ましくは移行細胞ガン、扁平上皮細胞ガンおよび平滑筋肉腫。
1. リンパ腫、リンパ性白血病、非リンパ性白血病、骨髄増殖性白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫。
−腫瘍組織のサンプルを検査するステップ、および
−YB−1が細胞周期とは無関係に核内に局在しているか決定するステップ、を含む方法に関する。
図1はAdE1/E3マイナス、即ちE1/E3欠失アデノウイルスと野生型アデノウイルスおよびアデノウイルスdl520の構造デザインを示している。
図2はp300,p107およびp105の結合に関係するE1Aタンパク質の結合ドメインを示している。P300およびP107は、細胞質結合タンパク質である。腫瘍抑制タンパク質である網膜芽細胞腫タンパク質(pRb)の結合は、CR1およびCR2を通じて媒介される。研究からpRbおよびp107/p300は細胞転写因子E2Fと組み合わさり効率的に転写制御することが示されている。野生型E1Aタンパク質はE2FのRbへの結合を妨害する。即ち放出されたE2FはE2初期プロモーターに結合して、アデノウイルスの複製を誘導する。
100,000個のU2OS細胞をウエルに播いた。翌日細胞に図3に示すような各種アデノウイルスを感染させた。感染は無血清DMEM培地500μl中で、37℃で1時間行った。続いて感染培地を取り除き、完全培地(10%FCS/DMEM)2mlと交換した。3日後にクリスタルバイオレット染色で分析を行った。
100,000個の257RDB細胞をウエルに播いた。翌日細胞に図4に示すような各種アデノウイルスを感染させた。感染は無血清DMEM培地500μl中で、37℃で1時間行った。続いて感染培地を取り除き、完全培地(10%FCS/DMEM)2mlと交換した。3日後にクリスタルバイオレット染色で分析を行った。
図5に示すように、E1Aタンパク質のアミノ酸4〜138およびそれをコードする核酸を欠失しており、さらにアミノ酸218の後に停止コドンを含むために発現する断頭型(truncate)E1Aタンパク質が完全なE1Aタンパク質のCR3領域を含んでいるアデノウイルスdl1119/1131をYB−1核陰性U2OS細胞に感染した場合、20pfu/細胞のMOIでは溶解は起きなかった。陰性コントロールには非感染細胞層を用いた。
本実施例は核内YB−1が転写因子としてmdr1プロモーター(多剤耐性プロモーター)内にあるY−ボックス(CAAT配列)に結合しなければならないという考察に基づいている。これを検出するために、いわゆるEMSA分析(電気泳動移動度シフトアッセイ)を行った。これに関連して、核タンパク質を単離し、続いてタンパク質1〜10μgを短いDNA鎖(オリゴ)と共の37℃でインキュベーションした。核内YB−1を決定するために以下のオリゴヌクレオチドを使用した;U2O3と反対のmdr1プロモーター(位置−86〜−67):TGAGGCTGATTGGCTGGGCA(Xボックスには下線を付した)。
本実施例は初期ウイルス遺伝子E1B−55KおよびE4orf6をプラスミドpE4orf6によるトランスフェクションおよびE1/E3欠失アデノウイルスAd−55Kによる感染で置換えられることを示す。Ad−55KはE1B−55KをE1にクローニングし、CMVの制御下に置いたE1/E3欠失ウイルスである(Dobbelstein, M. ら、 EMBO Journal, 16、 4276-4284、 1997年)。この置換は、AdYB−1、即ちYB−1を発現するアデノウイルスがこれら初期遺伝子を発現していないという事実、および本発明者が核内にYB−1を含む複製系でのこれら初期遺伝子を置換することで複製効率および粒子形成能率をそれぞれ野生型アデノウイルスであるAd5型のそれと同程度まで上げることができることを認識していたという事実より必要であった。
リポフェクタミンを用いた各105個のU2OS細胞へのプラスミドpE4orf6のトランスフェクション。プラスミドpEorf6はCMV制御下にある初期ウイルス遺伝子E4orf6をコードするDNA配列を保持している。プラスミドpE4orf6をトランスフェクションした24時間後に、細胞にYB−1発現E1/E3欠失アデノウイルスAdYB−1(50pfu/細胞)およびE1/E3欠失E1B−55KアデノウイルスAd−55K(50pfu/細胞)を感染させた。Ad−55KはCMV制御下にあるウイルス遺伝子E1B−55Kをトランス遺伝子として保持するE1/E3欠失ウイルスである。
各種細胞増殖抑制薬の添加がヒト転写因子YB−1の核内局在化を誘導することは、先行技術において知られていた。本発明者が見出したように、核内に局在したYB−1は、アデノウイルスのE2−後期プロモーターの活性化によりアデノウイルスの複製をコントロールする。両効果の組み合わせを利用すれば特異的な腫瘍溶解を得ることができる。
本インビボ試験で使用したHeLa(YB−1核陰性)および257RDB(YB−1核陽性)細胞は、無菌細胞培養条件にて拡大した。細胞をマウス(系統CD1NuNu)に注射して皮下腫瘍を形成させる前に、細胞をトリプシン処理して集め、DMEM培地(10%FCS)に加え、細胞数を測定してからPBSで1回洗浄した。続いて細胞を遠心分離してPBSを除き、細胞を希望数する細胞数になるよう新鮮PBS中に分配した。本研究で皮下注射した細胞の数は両細胞系統とも5×106細胞であった。注射は動物の一方の側腹部に行い、より区別し易いようにHeLa細胞は右側に、そして257RDB細胞は左側に注射した。腫瘍の増殖を週2回調べ、ノギスを使って腫瘍の長さおよび幅を測定した。その結果を用い、次式より腫瘍の容積を計算した:
3/4π*a/2*(b/2)2 a=長さ、b=幅
実施例9に於いて、発生中の腫瘍の中央部から採取した腫瘍サンプルよりDNAを抽出した。抽出にはQiagen社のDneasy Tissueキットを用いた。DNAの単離は製造元の指示書に従い実施した。それによれば、DNAは細胞からアルカリ溶解により放出された。続いて単離したDNAはカラムを使って精製される。次に単離したDNAの濃度を260nmの光度測定より決定した。分析はDNAサンプル2μgを用いて行い、サンプルは制限酵素Kpn I、10単位で消化した。次にサンプルを0.8%のアガロースゲルを用いて電気泳動により分離した。続いてDNAをナイロン膜上にブロッティングした(Schleicher & Schuell社のシステムを用いて実施)。膜上にブロッティングされたDNAを特異的な1501bpのDNAプローブとハイブリダイゼーションさせた。上記1501bpのDNAプローブは、Ad5配列をコードするE2A内にある3369bpのKpn I断片と特異的に結合する。プローブはPCR(プライマー:5’−GTC GGA GAT CAG ATC CGC GT、5’−GAT CCT CGT CGT CTT CGC TT)により準備し、32Pを用いて射線標識した。次に膜を洗い、フィルムに感光した。
100、000〜200、000個の各細胞を6個のウエルを持つプレート(6ウエルプレート)、FCSを10%含むL15培地(耐性細胞)およびDMEM(非耐性細胞)に接種した。24時間後にdl520および野生型アデノウイルスを感染させた(10pfu/細胞)。感染3日後(インフェクション後)、凍結と融解を3回繰り返して細胞浮遊液よりウイルス粒子を放出させた。次に293細胞を使ってプラークアッセイを行い、形成した感染粒子(プラーク形成単位/ml(pfu/ml))を決定した。結果を図15に示す。プラークアッセイの結果は、dl520がYB−1核陽性細胞(257RDBおよび181RDB)では野生型アデノウイルスの場合と同様に複製することを示した。この限りにおいて、本発明に従ってここに記載のアデノウイルスを使用する場合には、野生型アデノウイルスと同様の複製効率が観察できた。
図16は、アデノウイルスベクターXvir03の構造デザインを示す。アデノウイルスXvir03は、いわゆるE1/E3欠失アデノウイルスである。このことは、アデノウイルス複製に機能するE1A、E1B(E1B55kおよびE1B19Kタンパク質)およびE3タンパク質が作られないことを意味する。E1領域の欠失は342〜3528の範囲である;アミノ酸位置27865〜30995のE3領域の欠失。本明細書で使用する場合、用語「E1欠失ウイルス」とは、E1がもはや機能的に作用しないウイルスを意味する。これは、その他のほとんどインタクトな核酸配列およびアミノ酸配列で、それぞれ不活性化することにより達成できるが、しかしこのことは欠失したE1領域がコードするタンパク質が様々なサイズを持つことを意味することにもなる。E1AおよびE1Bタンパク質およびそれらをコードする核酸を欠くことにより、E4orf6の様なE4領域は弱くにしか発現されないか(野生型アデノウイルスの1〜5%)、または全く発現されない。ウイルス遺伝子E1B55kおよびE4orf6はXvir03内に導入された異種のCMVプロモーター(Clontech: Plasmid pShuttle)によりE1領域内で発現する。上記CMVプロモーターに代わって、E1Aの発現に関連して明細書中に開示したその他プロモーターを用いることができる。両遺伝子のオープンリーディングフレームは、いわゆるIRES配列(内部リボソーム進入部位)(Pelletier, J.およびSonenberg, N.Nature、1988年、334、320〜325)により互いに連結している。このエレメント(Novagen:pCITE)は1種類のmRNAから2種類のタンパク質を発現させる。
プラスミドE1B55k−pShuttleを、M.Dobelstein(マールブルグ大学)のpCGNE1Bより、XbaIおよびBfrIおよびBamHIのみそれぞれを用いてE1B55kのオープンリーディングフレームをClontech社製のpShuttleベクター内にクローニングして作製し、このとき、末端を平滑末端化して平滑末端化されたpShuttleにクローニングした。続いてpShuttle内のE1B55kをApaIを使って直線化し、NheIを使って平滑末端化して切断した。
プラスミドE1B55k 3’UTR−pShuttle(Clontech)のために、3’UTRを有するオープンリーディングフレームを、アデノウイルス5型のDNAからの増幅により調製して(E1B55kの順方向プライマー=5’−ATGGAGCGAAGAAACCC−3’、および、E1B55k 3’UTRの逆方向プライマー=5’−CACGTCCTGGAAAAAATACAC−3’)、末端を平滑化したNhel制限部位 (それはT末端(TAクローニング)を有しており、Clontech社のpShuttleプラスミドへクローニングされている)に導入した。したがって、トランス遺伝子は、5’末端にhCMV−プロモーターおよび3’末端にウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルを所持していた。しかしながら、さらに、Dobbelstein (Dobbelstein, M. et al., EMBO Journal, 16, 4276-4284, 1997) から得たプラスミドpCGNE1BからBam HIにより得たE1B55kを用いて、末端を平滑化し、TAクローニングを行うことは本発明の範囲内である。クローニングしたE1B55k−3’UTRについては、特に図23と24により詳細に記述する。
アデノウイルス5型DNAを鋳型として用いる(E4orf6の順方向プライマー:5’−CTTCAGGATCCATGACTACGTCCGGCG−3’、および、E4orf6の逆方向プライマー:5’−GAAGTGAATTCCTACATGGGGGTAGAGTCATAATCGT−3’)、およびBam HIにより切断されたプラスミドpCMVE4−34kD (Dobbelstein et al., EMBO, 16, 4276-4284, 1997)からの、増幅物E4orf6、および鋳型としてNovagen社のpCITE−4a(+)を有するIRESエレメント(IRESの順方向プライマー=5’−TCCGGTTATTTTCCACCATATTGC−3’およびIRESの逆方向プライマー=5’−TTATCATCGTGTTTTTCAAAGG−3’)を、続いてpcDNA3.1(+)ベクターのマルチクローニング部位へクローンニングした。そのような目的のために、E4orf6トランス遺伝子に対して、オープンリーディングフレームの5’末端にBamHI切断部位を、および3’末端にEcoRI切断部位を生成するプライマーを用いた。増幅物をそれぞれの制限酵素で消化し、またその末端を、BamHIとEcoRlを用いて開かれたベクター中への指向されたクローニングに適合するようにした。次に、pcDNA3.1(+)中のプラスミドE4orf6をEcoRVにより直線状にして、T末端を加え、増幅物をIRESエレメント中へクローニングした。IRESエレメントの正確な方向をチェックした後に、ベクターをさらなるクローニングに用いた。
現在 Microbix社のアデノウイルス生成システムに用いられているシャトルベクターpΔE1sp1Aは、CMVプロモーターも、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルも包含しないので、これらのエレメントをpΔE1sp1Aへクローニングした。その目的のために、ClaIでpΔE1sp1Aを直線化し、末端を平滑化し、またEcoRIによって切断した。エレメントCMV−MCS(マルチクローニング部位)−polyAをMfeIでpShuttle(Clontech)から直線化し、末端を平滑末端化し、さらにEcoRlにより切断した。続いて、カセット(Clontech から得たXvir−3’UTR pShuttle)を、さらにPmeIで切断されていて続いて脱リン酸化されたCMV−MCS−ポリA pΔE1sp1Aベクター中へ、PmeIによりクローニングした。クローニング生成物Xvir−3’UTR−pΔE1sp1Aをウイルス生成に用いた。
Xvir−3’UTR−pΔE1sp1AおよびpBHGE3(Microbix から得た、野生型アデノウイルス5型に対応するE3領域を含む)をHEK293細胞へ共トランスフェクションした。それにより両方のベクターの相同配列の組換えによりウイルスAd−Xvir−3’UTRE3が生成された。
ここで用いるシステムのためには、ベクターpShuttle−AdEASYは、CMVプロモーターもウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルも包含しないので、これらのエレメントをpShuttle−AdEASYへクローニングした。その目的のために、プラスミドをEcoRIによって消化し、T4ポリメラーゼおよびdNTPsで末端を満たすことによって平滑化し、骨格を脱リン酸化し、また生成された両方の消化生成物を再びライゲーションした。そうすることによって、EcoRIの制限認識部位を除去した。このようにして得られたプラスミドをpShuttle(−EcoRI)−AdEASYと呼んだ。
プラスミドpAdEASYでは実質的にE3領域が欠失しているので、E3領域をプラスミドpAdEASYからSpeIおよびPacIによってプラスミドCMV−MCS−polyA pShuttle(AdEASY)中へ再構成のためにクローニングして、プラスミドE3E4−pShuttle−AdEASYが生成された。
治療用トランス遺伝子のためのスペースを提供するために、および望ましくない相同組換えを回避するために、プラスミドE3E4−pShuttle(−NdeI)−AdEASY中のE4領域を特別に欠失させることができる。その目的のためにE4orf6領域を、約0.6 kB、好ましくは629または634bp、PstIによる切断および再ライゲ−ションによって短縮する。これは図17に記述されているように、Xvir03/01に関連して遂行することができる。それぞれの欠失は、組換えアデノウイルスを生成するための種々のシステムにおいて、当業者によって実現可能である。
感染力を増大させるために、ファイバーノブ領域のHIループを Dmitriev et al. 1998 (An Adenovirus Vector with Genetically Modified Fibers Demonstrates Expanded Tropism via Utilization of a Coxsackievirus and Adenovirus Receptor-Independent Cell Entry Mechanism)に従って修飾する:それぞれの領域をプライマーRGD−Hpa順方向(5’−GAGgttaacCTAAGCACTGCCAAG−3’)、RGD−EcoRV逆方向(5’−CATAGAGTATGCAGATATCGTTAGTGTTACAGGTTTAGTTTTG−3’)、および RGD−EcoRV順方向(5’−GTAACACTAACGATATCTGCATACTCTATGTCATTTTCATGG−3’)およびRGD−Bfr逆方向(5’−CAGCGACATGAActtaagTGAGCTGC−3’)を用いて増幅し、これにより、EcoRV制限部位が生成された。この制限部位に、Arg−Gly−Asp(RGD)−ペプチドをコードする対のオリゴヌクレオチド:RGD−oligo 1(5’−CACACTAAACGGTACACAGGAAACAGGAGACACAACTTGTGACTGCCGCGGAGA CTGTTTCTGCCC−3’)およびRGD−oligo 2(5’−GGGCAGAAACAG TCTCCGCGGCAGTCACAAGTTGTGTCTCCTGTTTCCTGTGTACCGTTTAGTGTG−3’)をクローニングした。これにより、RGDモチーフがファイバーノブ領域のHIループ中に存在する。
図17から分かるように、Xvir03/01はXvir03を更に発展させたものである。例えばここに記した遺伝子の様な治療目的の遺伝子やトランス遺伝子をE3領域内にクローニングできる。さらに、E4領域内に欠失を導入してXvir03の発現カセットに由来するE4orf6との間で相同的組換えが起こるのを回避した。これによってより大型のトランス遺伝子をこの構築体内にクローニングすることが可能になった。欠失型のE3領域にはカセット導入に適したSacI、NdeIおよびNheI制限部位があり、ここに例えば治療用トランス遺伝子をクローニングすることができる。しかし、E3領域はまたインタクトのままに留まってもよい。また、治療用遺伝子はE4領域中への連続体でありうる。これにより、特に、アデノウイルス細胞死タンパク質ADPの発現が保証される。
Clontech社製pAdenoX−Plasmidには3’ITR領域の後に野生型アデノウイルスには無いSfuI向けの制限部位がある。E3〜E4領域をSpeI(位置23644)およびSfuIを使ってpAdenoX(Clontech)から取り出し、pcDNA3.1(+)(Invitrogen)内にトランスフェクションした=pcDNA3.1−E3Δ27865−30995−E4。E4ORF6の大部分、即ち33241〜33875をPstIを用いて取り出した=pcDNA3.1−E3Δ27865−30995、E4Δ33241−33875。Xvir03を更に発展させるために、pcDNA3.1−E3Δ27865−30995、E4Δ33241−33875由来の欠失E3/E4領域をSfuIおよびSpeIを使ってプラスミドpAdenoX内にクローニングした=pAdnoXE3Δ27865−30995、E4Δ33241−33875。
100、000個の細胞(257RDBおよび181RDB)を6個のウエルを持つプレート(6ウエルプレート)の各ウエルに接種した。翌日細胞に、図18に示すようにAd312(20pfu/ml)およびXvir03(5pfu/ml)を感染させた。感染は無血清DMEM培地500μl中で、37℃、1時間実施した。次に感染培地を取り除き、完全培地(10%FCS/DMEM)2mlと交換した。5日後にクリスタルバイオレット染色による分析を行った。結果を図18Aおよび18Bに示す。
アデノウイルスの複製に対するイリノテカンの影響を決定するために、106個のU373腫瘍細胞を10 cm2 のペトリ皿にプレートした。最初の反応では、5μM イリノテカンを24時間後に加えた。さらに24時間の後、細胞に10 pfu/細胞のdl520を感染させた。イリノテカンなしで3日間インキュベーション後に、実施例10に記述した手順に従ってDNAを単離した。
アデノウイルスの複製に対するトリコスタチンAの影響をテストするために、106個のU373腫瘍細胞を10 cm2 のペトリ皿にプレートした。24時間後に0、0.25、0.5、および0.75μM のトリコスタチンAを加えた。さらに24時間後、細胞に10 pfu/細胞のdl520を感染させた。
200,000個のU373細胞を6ウエルプレートにプレートした。24時間後、細胞を1μM トリコスタチンと共に24時間培養した。さらに24時間後、細胞を単離した。次にCAR発現の解析を、Facs解析および Upstate社から得た一次抗体、抗−CARクローンRmcB、および二次抗体としてウサギ−抗−マウスFITC(DAKO社)を用いる標準プロトコルにより実施した。
200,000個のU373細胞を6ウエルプレートにプレートした。24時間後に、2μM イリノテカンまたは1μM トリコスタチンAのみ、あるいは1μM イリノテカン + 0.5μM トリコスタチンを培地に加えた。24時間のインキュベーションの後、細胞に10、20、および30 pfu/細胞のdl520を感染させた。3〜5日後に、クリスタルバイオレット染色を用いて、解析を行なった。解析を二重に行なった。
Claims (70)
- ウイルスが核内にYB−1がない細胞では複製できず、そのときウイルスが発ガン遺伝子または発ガン遺伝子産物、特に発ガン遺伝子タンパク質をコードしており、それが少なくとも1つのウイルス遺伝子、好ましくはアデノウイルス遺伝子をトランス活性化し、そのときの遺伝子がE1B55kDa、E4orf6、E4orf3およびE3ADPを含む群から選ばれることを特徴とする、医薬製造のためのウイルス、好ましくはアデノウイルスの使用。
- ウイルスが核内にYB−1がない細胞では複製できず、そのときウイルスが発ガン遺伝子または発ガン遺伝子産物、特に発ガン遺伝子タンパク質をコードしており、それが少なくとも1つのウイルス遺伝子、好ましくはアデノウイルス遺伝子をトランス活性化し、そのときの遺伝子がE1B55kDa、E4orf6、E4orf3およびE3ADPを含む群から選ばれることを特徴とする、核内にYB−1を示す細胞内における複製のためのウイルス、好ましくはアデノウイルスの使用。
- ウイルス、好ましくはアデノウイルスが、核内にYB−1を有する細胞内で複製することを特徴とする、請求項1または2に記載の使用。
- ウイルス発ガン遺伝子タンパク質がE1Aであり、そして/または発ガン遺伝子がE1Aをコードする遺伝子であり、そして/または発ガン遺伝子タンパク質がE1Aであることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか1項に記載の使用。
- ウイルス発ガン遺伝子タンパク質E1Aが、機能的Rb腫瘍抑制遺伝子産物を結合することができることを特徴とする、請求項4に記載の使用。
- ウイルス発ガン遺伝子タンパク質E1Aが、機能的Rb腫瘍抑制遺伝子産物を結合することができないことを特徴とする、請求項4に記載の使用。
- ウイルス発ガンタンパク質E1Aが、YB−1の核内局在化を誘導しないことを特徴とする、請求項4〜6のいずれか1項に記載の使用。
- 医薬が、細胞がRb陽性であるか、またはRb陰性である患者向けであることを特徴とする、請求項1または3〜7のいずれか1項に記載の使用。
- 細胞が、医薬により影響を受ける状態の形成に関係している細胞であることを特徴とする、請求項8に記載の使用。
- 細胞がRb陰性であり、細胞核がYB−1陽性であり、好ましくは細胞周期とは無関係に核内がYB−1陽性であることを特徴とする、請求項1〜9のいずれか1項に記載の使用。
- 医薬が腫瘍の処置向けであることを特徴とする、請求項1または3〜10のいずれか1項に記載の使用。
- 細胞、好ましくは腫瘍またはその一部を形成する細胞が、医薬、好ましくは抗ガン剤、より好ましくは細胞増殖抑制薬に対し耐性、好ましくは多重耐性であることを特徴とする、請求項11に記載の使用。
- 細胞が、膜結合輸送タンパク質であるP糖タンパク質の発現、好ましくは過剰発現を示すことを特徴とする、請求項12に記載の使用。
- 細胞が、p53陽性であるか、またはp53陰性であることを特徴とする、請求項1〜13のいずれか1項に記載の使用。
- 発ガン遺伝子タンパク質が、野生型発ガン遺伝子タンパク質E1Aと比較して1または複数の突然変異もしくは欠失を示し、このときの欠失がCR3領域の欠失およびN−末端の欠失およびC−末端の欠失を含む群より好ましくは選ばれることを特徴とする、請求項5または7〜14のいずれか1項に記載の使用。
- E1A発ガン遺伝子タンパク質がRbに結合することができることを特徴とする、請求項15に記載の使用。
- 発ガン遺伝子タンパク質が、野生型発ガン遺伝子タンパク質と比較して1または複数の突然変異もしくは欠失を含み、このときの欠失が好ましくはCR1領域および/またはCR2領域内の欠失であることを特徴とする、請求項6〜14のいずれか1項に記載の使用。
- 発ガン遺伝子タンパク質E1AがRbに結合することができないことを特徴とする、請求項17に記載の使用。
- ウイルス発ガン遺伝子タンパク質、好ましくはE1Aが、組織および/または腫瘍特異的プロモーターの制御下にあることを特徴とする、請求項1〜18のいずれか1項に記載の使用。
- ウイルス、好ましくはアデノウイルスが、YB−1をコードしていることを特徴とする、請求項1〜19のいずれか1項に記載の使用。
- YB−1が、組織特異的および/または腫瘍特異的プロモーターの制御下にあることを特徴とする、請求項20に記載の使用。
- ウイルス、好ましくはアデノウイルスが、少なくとも1つのタンパク質をコードしており、そのときタンパク質がE4orf6、E4orf3、E1B55kおよびアデノウイルスE3ADPタンパク質を含む群より選ばれることを特徴とする、請求項1〜21のいずれか1項に記載の使用。
- 細胞が核内にYB−1を含むこと、好ましくは腫瘍またはその一部を形成する細胞が核内にYB−1を有することを特徴とする、請求項1〜22のいずれか1項に記載の使用。
- 核内へのYB−1輸送の誘導後に、腫瘍がその核内にYB−1を含むことを特徴とする、請求項1〜23のいずれか1項に記載の使用。
- YB−1の輸送が、放射線、細胞増殖抑制薬および高温を含む群より選ばれる少なくとも1つの手段により始動することを特徴とする。請求項24に記載の使用。
- 手段が細胞、器官、または生体に適用されることを特徴とする、請求項25に記載の使用。
- ウイルス、好ましくはアデノウイルスが、AdΔ24、dl922−947、E1Ad/01/07、dl1119/1131、CB 016、dl520および機能的Rb腫瘍抑制遺伝子産物を結合することができる発現したウイルス発ガン遺伝子を欠くウイルスを含む群より選ばれることを特徴とする、請求項1〜26のいずれか1項に記載の使用。
- 医薬の製造のためのウイルス、好ましくはアデノウイルスの使用であって、当該ウイルス、好ましくはアデノウイルスがE2−後期プロモーターの活性化を介してYB−1により複製が制御され、好ましくは活性化が主にE2−後期プロモーターの活性化により制御されるようデザインされているウイルスの使用。
- 核内にYB−1を有する細胞内における複製のためのウイルス、好ましくはアデノウイルスの使用であって、当該ウイルス、好ましくはアデノウイルスが、E2−後期プロモーターの活性化を介して、好ましくは主にE2−後期プロモーターの活性化を介してYB−1により複製が制御されるようデザインされているウイルスの使用。
- 以下の特徴:
a)少なくとも1つのウイルス遺伝子をトランス活性化し、そのときウイルス遺伝子がE1B−55k、E3ADPおよびE4orf6およびE4orf3を含む群より選ばれること、ならびに
b)核内、好ましくはその中にウイルス発ガン遺伝子タンパク質が存在している細胞の核内へのYB−1誘導を欠いていること、
を含むことを特徴とするウイルス発ガン遺伝子タンパク質、好ましくは単離されたウイルス発ガン遺伝子タンパク質。 - ウイルス発ガン遺伝子タンパク質がE1Aであることを特徴とする、請求項30に記載のウイルス発ガン遺伝子タンパク質。
- ウイルス発ガン遺伝子タンパク質が、野生型発ガン遺伝子タンパク質と比較して1または複数の突然変異または欠失を含み、このときの欠失がCR3領域の欠失およびN−末端の欠失およびC−末端の欠失を含む群より好ましくは選ばれることを特徴とする、請求項30または31に記載のウイルス発ガン遺伝子タンパク質。
- Rbに結合することができることを特徴とする、請求項32に記載のウイルス発ガン遺伝子タンパク質。
- ウイルス発ガン遺伝子タンパク質が、1または複数の突然変異または欠失を含み、このとき欠失が好ましくはE1A発ガン遺伝子タンパク質のCR1領域および/またはCR2領域内の欠失であることを特徴とする、請求項30または31に記載のウイルス発ガン遺伝子タンパク質。
- ウイルス発ガン遺伝子タンパク質がRbに結合することができないことを特徴とする、請求項34に記載のウイルス発ガン遺伝子タンパク質。
- 請求項1〜29のいずれか1項に記載のウイルス、好ましくはアデノウイルスをコードする核酸を含み、そしてヘルパーウイルスの核酸を含むウイルス複製系、好ましくはアデノウイルス複製系の使用であって、このときヘルパーウイルスの核酸がYB−1をコードする核酸を含む使用。
- ウイルス核酸、好ましくはアデノウイルスの核酸および/またはヘルパーウイルスの核酸が複製可能なベクターとして存在していることを特徴とする、請求項36に記載のウイルス複製系、好ましくはアデノウイルス複製系の使用。
- 医薬の製造、好ましくは腫瘍の処置を目的とする医薬の製造のための、ウイルス、好ましくはアデノウイルスをコードする核酸の請求項1〜29のいずれか1項に記載の使用。
- 細胞、好ましくは腫瘍もしくはその一部を形成する細胞が、医薬的活性作用物質、好ましくは抗ガン剤、より好ましくは細胞増殖抑制薬に対する耐性、好ましくは多重耐性を有することを特徴とする、請求項38に記載の使用。
- ウイルスが核内にYB−1を持たない細胞では複製せず、そしてウイルスが少なくとも1つのウイルス遺伝子、好ましくはアデノウイルス遺伝子をトランス活性化する発ガン遺伝子または発ガン遺伝子産物をコードしており、そのとき遺伝子がE1B55kDa、E4orf6、E4orf3およびE3ADPを含む群から選ばれることを特徴とする、核内にYB−1を有する細胞における複製のための請求項1〜29のいずれか1項に記載の、ウイルス、好ましくはアデノウイルスをコードする核酸の使用。
- 複製がE2−後期プロモーターの活性化を通して、好ましくは主にE2−後期プロモーターの活性化を通して制御されるようにウイルスがデザインされている、医薬の製造のための、請求項1〜29のいずれか1項に記載のウイルス、好ましくはアデノウイルスをコードする核酸の使用。
- 複製がE2−後期プロモーターの活性化を通して、好ましくは主にE2−後期プロモーターの活性化を通して制御されるようにウイルスがデザインされている、細胞内における複製のための、請求項1〜29のいずれか1項に記載のウイルス、好ましくはアデノウイルスをコードする核酸の使用。
- 請求項1〜29のいずれか1項に記載の使用を目的とする、請求項36〜42のいずれか1項に記載の核酸を含むベクターの使用。
- 細胞、腫瘍組織の細胞または患者を、請求項1〜29のいずれか1項に記載のウイルス、好ましくはアデノウイルスと接触させるべきか、および/またはそれらにより処置すべきか決定するために、細胞、腫瘍組織の細胞または患者を特徴付けすることを目的とする、YB−1と相互作用する化合物の使用。
- 手段が、抗体、アンチカリン、アプタマー、アプタザイムおよびシュピーゲルマーを含む群から選ばれることを特徴とする、請求項44に記載の使用。
- 請求項1〜29のいずれか1項に記載された使用に関連して用いられ得るウイルス、好ましくはアデノウイルスの製造を目的とした、請求項30〜35のいずれか1項に記載のウイルス発ガン遺伝子タンパク質またはそれをコードする核酸の使用。
- ウイルスが、トランス遺伝子をコードする核酸を含んでいる、請求項1〜29のいずれか1項に記載のウイルス、好ましくはアデノウイルスの使用。
- ウイルスが、トランス遺伝子の翻訳および/または転写産物を含んでいる、請求項1〜29のいずれか1項に記載のウイルス、好ましくはアデノウイルスの使用。
- アデノウイルス複製系の核酸および/またはヘルパーウイルスの核酸が、トランス遺伝子またはトランス遺伝子をコードする核酸を含んでいる、請求項36または37に記載のアデノウイルス複製系の使用。
- 核酸が、トランス遺伝子またはトランス遺伝子をコードする核酸を含んでいる、請求項38〜42のいずれか1項に記載の核酸の使用。
- トランス遺伝子が、プロドラッグ遺伝子、サイトカイン、アポトーシス誘導遺伝子、腫瘍抑制因子遺伝子、金属プロテアーゼインヒビターの遺伝子、および血管新生インヒビターの遺伝子を含む群から選ばれる、請求項47〜50のいずれか1項に記載の使用。
- トランス遺伝子が、siRNA、アプタマー、アンチセンス分子およびリボザイムに関する核酸を含む群より選ばれ、そしてsiRNA、アプタマー、アンチセンス分子および/またはリボザイムが標的分子を標的している、請求項47〜50のいずれか1項に記載の使用。
- 標的分子が、耐性関連因子、抗アポトーシス因子、発ガン遺伝子、血管新生因子、DNA合成酵素、DNA修復酵素、成長因子、成長因子レセプター、転写因子、金属プロテアーゼ、好ましくはマトリックス金属タンパク質キナーゼ、およびウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子を含む群より選ばれる、請求項52に記載の使用。
- 医薬が医薬的に活性な化合物を更に含む、請求項1〜53のいずれか1項に記載の使用。
- 医薬的に活性な化合物が、サイトカイン、金属プロテアーゼインヒビター、血管新生インヒビター、細胞増殖抑制薬および細胞周期インヒビター、プロテオソームインヒビター、組換え抗体、情報伝達カスケードのインヒビターおよびプロテインキナーゼ、を含む群より選ばれる、請求項54に記載の使用。
- 医薬が少なくとも2つの薬剤の組合せを含み、各薬剤は細胞増殖抑制薬を含む群より個々におよび独立して選択されることを特徴とする、先行する請求項のいずれか1項に記載の使用。
- 少なくとも薬剤の2つが、異なる標的分子を対象にすることを特徴とする、請求項56に記載の使用。
- 少なくとも薬剤の2つが、異なる作用様式によって活性を有することを特徴とする、請求項57に記載の使用。
- 少なくとも1つの薬剤が、細胞が感染される能力を増加させ、そのような細胞中でウイルスが複製することを特徴とする、請求項56〜58のいずれか1項に記載の使用。
- 少なくとも1つの薬剤が、細胞の成分の有効性に影響を及ぼし、好ましくは成分の有効性を増大し、その成分はウイルスの取り込みを仲介することを特徴とする、請求項56〜59のいずれか1項に記載の使用。
- 少なくとも1つの薬剤が、YB−1の核の中への輸送を仲介し、好ましくは該輸送を増大させることを特徴とする、請求項56〜60のいずれか1項に記載の使用。
- 少なくとも1つの薬剤がヒストンデアシラーゼインヒビターであることを特徴とする、請求項56〜61のいずれか1項に記載の使用。
- ヒストンデアシラーゼインヒビターが、トリコスタチンA、FR901228、MS−27−275、NVP−LAQ824、PXD101 アピシジンおよびスクリプタイドを含む群より選択されることを特徴とする、請求項62に記載の使用。
- 少なくとも1つの薬剤が、トリコスタチンA、FR901228、MS−27−275、NVP−LAQ824、PXD101 アピシジンおよびスクリプタイドを含む群より選択されることを特徴とする、請求項56〜62のいずれか1項に記載の使用。
- 少なくとも1つの薬剤がトポイソメラーゼインヒビターであることを特徴とする、請求項56〜64のいずれか1項に記載の使用。
- トポイソメラーゼインヒビターが、カンプトテシン、イリノテカン、トポテカン、DX−895If、SN−38、9−アミノカンプトテシン、9−ニトロカンプトテシン、ダウノルビシンおよびエトポシドを含む群より選択されることを特徴とする、請求項65に記載の使用。
- 薬剤がトリコスタチンAおよびイリノテカンを含むことを特徴とする、先行する請求項のいずれか1項に記載の使用。
- ウイルスが、特に先行する請求項のいずれかに記載のウイルスが、少なくとも2つの薬剤から分離されていることを特徴とする、先行する請求項のいずれか1項に記載の使用。
- ウイルスの少なくとも1単位の用量が、1つまたは少なくとも2つの薬剤の少なくとも1単位の用量から分離されていることを特徴とする、請求項68に記載の使用。
- ウイルス、好ましくは先行する請求項のいずれかに記載のウイルス、および少なくとも2つの薬剤(任意の薬剤が細胞増殖抑制薬を含む群より個々におよび独立して選択される)を含むキット。
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