JP2004147666A - ヌクレオチド三リン酸およびリボザイム内へのそれらの取り込み - Google Patents
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Abstract
【課題】核酸触媒を含む核酸分子内への新規ヌクレオチド三リン酸(NTP)分子の取り込み方法。
【解決手段】新規ヌクレオチド三リン酸、合成法、およびこれらのヌクレオチド三リン酸をオリゴヌクレオチド内へ取り込む方法、および新規核酸触媒(例えば、リボザイム)の単離が開示されている。オリゴヌクレオチド内に修飾ヌクレオチド三リン酸を取り込ませる方法であって、前記オリゴヌクレオチド内への修飾ヌクレオチド三リン酸の取り込みに適した条件下、修飾ヌクレオチド三リン酸を、核酸鋳型,RNAポリメラーゼ酵素,および修飾ヌクレオチド三リン酸取り込みの促進剤を含む混合物と接触させる工程を含む方法が開示される。
【選択図】 図1
【解決手段】新規ヌクレオチド三リン酸、合成法、およびこれらのヌクレオチド三リン酸をオリゴヌクレオチド内へ取り込む方法、および新規核酸触媒(例えば、リボザイム)の単離が開示されている。オリゴヌクレオチド内に修飾ヌクレオチド三リン酸を取り込ませる方法であって、前記オリゴヌクレオチド内への修飾ヌクレオチド三リン酸の取り込みに適した条件下、修飾ヌクレオチド三リン酸を、核酸鋳型,RNAポリメラーゼ酵素,および修飾ヌクレオチド三リン酸取り込みの促進剤を含む混合物と接触させる工程を含む方法が開示される。
【選択図】 図1
Description
本特許出願は1998年11月4日に出願されたBeigelmanらによるUSSN09/186,675号、1998年4月29日に出願されたBeigelmanらによるUSSN60/083,727号および1997年11月6日に出願されたBeigelmanらによるUSSN60/064,866号に基づく優先権を主張するものであり、これらすべての先の出願は”ヌクレオチド三リン酸およびそれらのオリゴヌクレオチド内への取り込み”と題されている。これらの出願の各々は図を含めて全文が本明細書において援用される。
本発明は新規ヌクレオチド三リン酸(NTP);ヌクレオチド三リン酸の合成法;および新規ヌクレオチド三リン酸をオリゴヌクレオチド内へ取り込むための方法に関している。本発明はさらに、いくつかの新規反応条件下、ポリメラーゼを使用する核酸分子内へのこれらのヌクレオチド三リン酸の取り込みに関している。
以下はヌクレオチド三リン酸の簡単な説明である。本要約は完全であろうとするつもりはなく、以下の発明の理解を助けるためにのみ提供されている。本要約は以下に記載されたすべての研究が、特許請求された本発明に対する先行技術であることを認めるものではない。
ヌクレオチド三リン酸の合成およびポリメラーゼ酵素を用いる核酸内へのそれらの取り込みは核酸研究の進歩の大きな助けとなってきた。ポリメラーゼ酵素はオリゴヌクレオチドを組み立てるための前駆体分子としてヌクレオチド三リン酸を利用する。次のヌクレオチドの5’三リン酸に対するオリゴヌクレオチドの最後の3’ヒドロキシル基の求核攻撃により形成されるホスホジエステル結合により各々のヌクレオチドが結合される。ヌクレオチドはオリゴヌクレオチド内に一度に一つ5’から3’の方向で取り込まれる。この過程は事実上任意のDNAまたはRNA鋳型からのRNAの生成および増幅を可能にする。
ほとんどの天然ポリメラーゼ酵素は標準ヌクレオチド三リン酸を核酸内へ取り込む。例えば、DNAポリメラーゼは dATP、dTTP、dCTPおよびdGTPをDNA内へ取り込み、RNAポリメラーゼは一般にATP、CTP、UTPおよびGTPをRNA内へ取り込む。しかしながら、非標準ヌクレオチド三リン酸を核酸内に取り込むことができるある種のポリメラーゼが存在する(Joyce,1997,PNAS 94,1619−1622,Huang et al.,Biochemistry 36,8231−8242)。
ヌクレオシドは、ポリメラーゼ酵素を用いてRNA転写体内へ取り込ませる前に、これらの酵素が認識できるヌクレオチド三リン酸へ変換されなければならない。POCl3およびトリアルキルリン酸による非保護ヌクレオシドのリン酸化によりヌクレオシド5’−ホスホロジクロリデートが得られることが示されている(Yoshikawa et al.,1969,Bull.Chem.Soc.(Japan)42,3505)。アデノシンまたは2’−デオキシアデノシン5’−三リン酸は、DMF中での過剰のトリ−n−ブチルアンモニウムピロリン酸による処理、続いての加水分解から成る追加工程を加えることにより合成された(Ludwig,1981,Acta Biochim.et Biophys.Acad.Sci.Hung.16,131−133)。
非標準ヌクレオチド三リン酸は伝統的なRNAポリメラーゼでは容易にはRNA転写体内へ取り込まれない。RNA内へのデオキシリボヌクレオチドの取り込みを容易にするため、RNAポリメラーゼに突然変異が導入された(Sousa & Padilla,1995,EMBO J.14,4609−4621,Bonner et al.,1992,EMBO J.11,3767−3775,Bonner et al.,1994,J.Biol.Chem.42,25120−25128,Aurup et al.,1992,Biochemistry 31,9636−9641)。
McGee et al.,国際PCT公開番号WO95/35102、はバクテリオファージT7ポリメラーゼを使用するRNA内への2’−NH2−NTP、2’−F−NTPおよび2’−デオキシ−2’−ベンジルオキシアミノUTPの取り込みを記載している。
Wieczorek et al.,1994,Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 4,987−994、はバクテリオファージT7 RNAポリメラーゼを使用するRNA転写体内への7−デアザ−アデノシン三リン酸の取り込みを記載している。
Lin et al.,1994,Nucleic Acids Research 22,5229−5234はバクテリオファージT7 RNAポリメラーゼおよびポリエチレングリコール含有緩衝液を使用するRNA内への2’−NH2−CTPおよび2’−NH2−UTPの取り込みを報告している。この論文はヒト好中球エラスターゼ(HNE)に対するアプタマーのインビトロ選択におけるポリメラーゼ合成RNAの使用を記載している。
本発明に関連する先行技術文献情報としては以下のものがある。
WO95/35102
US 4879214
SU1775405
WO96/18736
WO95/11910
WO97/26270
WO95/19429
WO98/50530
Lin, Y., et al., Nucleic Acids Research, Vol 22, No. 24, 1994, p5229-5234
Matulic-Adamic J. et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, Vol. 5, No. 22, 1995, p2721-2724
Huang, Y., et al., Biochemistry, Vol. 36, 1997, p8231-8242
Karpeisky, A., et al., Tetrahedron Letters, Vol. 39, No. 10, 1998, p1131-1134
本発明は新規ヌクレオチド三リン酸(NTP)分子、および核酸触媒を含む核酸分子内へのそれらの取り込みに関している。本発明のNTPは本分野で知られている他のNTPとは異なっている。本発明はさらにRNAポリメラーゼを使用するこれらのヌクレオチド三リン酸のオリゴヌクレオチド内への取り込みに関している;本発明はさらに核酸分子内への修飾(非標準)および非修飾NTPの取り込みのための新規転写条件にも関している。さらに、本発明は新規NTP合成のための方法に関している。
本発明は、オリゴヌクレオチド内に修飾ヌクレオチド三リン酸を取り込ませる方法であって、前記オリゴヌクレオチド内への修飾ヌクレオチド三リン酸の取り込みに適した条件下、修飾ヌクレオチド三リン酸を、核酸鋳型,RNAポリメラーゼ酵素,および修飾ヌクレオチド三リン酸取り込みの促進剤を含む混合物と接触させる工程を含む方法を提供する。好ましくは、RNAポリメラーゼは、T7RNAポリメラーゼ、変異体T7RNAポリメラーゼ、SP6RNAポリメラーゼ、変異体SP6RNAポリメラーゼ、T3RNAポリメラーゼ、または変異体T3RNAポリメラーゼである。また好ましくは、修飾ヌクレオチド三リン酸の取り込みの促進剤は、LiCl,メタノール,ポリエチレングリコール,ジエチルエーテル,プロパノール,メチルアミン,およびエタノールからなる群より選択される。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、RNA、酵素的核酸分子、またはアプタマーである。
好ましい態様においては、修飾ヌクレオチド三リン酸は、式I:
[式中、Rは独立して、そのペントース成分の5’位を介して結合しているヌクレオシドであり、前記ヌクレオシドは、2’−O−メチル−2,6−ジアミノプリンリボシド;2’−デオキシ−2’−アミノ−2,6−ジアミノプリンリボシド;2’−(N−アラニル)アミノ−2’−デオキシ−ウリジン;2’−(N−フェニルアラニル)アミノ−2’−デオキシ−ウリジン;2’−(N−β−アラニル)アミノ−2’−デオキシ−ウリジン;2’−(N−リシル)アミノ−2’−デオキシ−ウリジン;2’−デオキシ−2’−C−アリルウリジン;2’−O−アミノ−ウリジン;2’−O−メチルチオメチルアデノシン;2’−O−メチルチオメチルシチジン;2’−O−メチルチオメチルグアノシン;2’−O−メチルチオメチルウリジン;2’−(N−ヒスチジル)アミノ−2’−デオキシ−ウリジン;2’−デオキシ−2’−アミノ−5−メチルシチジン;2’(N−β−アラニル)アミノ−2’−デオキシ−グアノシン;および2’−O−アミノ−アデノシンからなる群より選択される]
を有する。
を有する。
第一の観点において、本発明は式:三リン酸−OR(例えば、下記の式I)を有するNTPを特徴としている:
式中、Rは任意のヌクレオシドであり;特にはヌクレオシド2’−O−メチル−2,6−ジアミノプリン リボシド;2’−デオキシ−2’−アミノ−2,6−ジアミノプリン リボシド;2’−(N−アラニル)アミノ−2’−デオキシ−ウリジン;2’−(N−フェニルアラニル)アミノ−2’−デオキシ−ウリジン;2’−デオキシ−2’−(N−β−アラニル)アミノ;2’−デオキシ−2’−(リシル)アミノ ウリジン;2’−C−アリルウリジン;2’−O−アミノ−ウリジン;2’−O−メチルチオメチル アデノシン;2’−O−メチルチオメチル シチジン;2’−O−メチルチオメチル グアノシン;2’−O−メチルチオメチル ウリジン;2’−デオキシ−2’−(N−ヒスチジル)アミノ ウリジン;2’−デオキシ−2’−アミノ−5−メチル シチジン;2’−(N−β−カルボキサミジン−β−アラニル)アミノ−2’−デオキシ−ウリジン;2’−デオキシ−2’−(N−β−アラニル)−グアノシン;2’−O−アミノ−アデノシン;2’−(N−リシル)アミノ−2’−デオキシ−シチジン;2’−デオキシ−2’−(L−ヒスチジン)アミノ シチジン;および5−イミダゾール酢酸 2’−デオキシ−5’−三リン酸ウリジンである。第二の観点において、本発明はピリミジンヌクレオチド三リン酸(UTP、2’−O−MTM−UTP、dUTPなどのような)の合成のための方法を特徴とする。該方法においては、ピリミジン一リン酸の形成に適した条件下、リン酸化試薬(オキシ塩化リン、ホスホ−トリス−トリアゾライド、ホスホ−トリス−トリイミダゾライドなどのような)、リン酸トリアルキル(リン酸トリエチルまたはリン酸トリメチルなどのような)およびジメチルアミノピリジン(DMAP)を有する混合物とピリミジンヌクレオチドを接触させる一リン酸化工程;およびピリミジン三リン酸の形成に適した条件下、ピロリン酸化試薬(ピロリン酸トリブチルアンモニウムのような)とピリミジン一リン酸を接触させるピロリン酸化工程を含む。
本明細書において使用される場合、用語”ヌクレオチド”とは本分野で認識されているものであり、天然の塩基(標準)および本分野でよく知られている修飾塩基が含まれる。そのような塩基は一般的には糖部分の1’位に位置している。ヌクレオチドは一般的に塩基、糖およびリン酸基を含む。ヌクレオチドは修飾されていなくてもまたは糖、リン酸および/または塩基部分で修飾されていてもよい(またヌクレオチド類似体、修飾ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、非標準ヌクレオチドその他として相互交換的に示される、例えば、Usman and McSwiggen,前記文献;Eckstein et al.,国際PCT公開番号第WO92/07065号;Usman et al.,国際PCT公開番号第WO93/15187号を参照されたい;すべて本明細書において援用される)。Limbach et al.,1994,Nucleic Acids Res.22,2183、に最近要約されているような、本分野で既知の修飾核酸塩基のいくつかの例が存在する。有意には触媒活性に影響せずに核酸内へ導入できる塩基修飾のいくつかの非限定的例としては、イノシン、プリン、ピリジン−4−オン、ピリジン−2−オン、フェニル、プソイドウラシル、2,4,6−トリメトキシベンゼン、3−メチルウラシル、ジヒドロウリジン、ナフチル、アミノフェニル、5−アルキルシチジン(例えば、5−メチルシチジン)、5−アルキルウリジン(例えば、リボチミジン)、5−ハロウリジン(例えば、5−ブロモウリジン)または6−アザピリミジンまたは6−アルキルピリミジン(例えば、6−メチルウリジン)およびその他(Burgin et al.,1996,Biochemistry,35,14090)が挙げられる。この観点においては、”修飾塩基”とは、1’位のアデニン、グアニン、シトシンおよびウラシル以外のヌクレオチド塩基またはそれらの均等物を意味しており;そのような塩基は酵素的核酸分子の触媒コア内におよび/またはそのような分子の基質結合領域中に使用することができる。そのような修飾ヌクレオチドには、本分野でよく知られている医薬有用性、ならびにシークエンシングのような基礎分子生物学法において有用性を有するジデオキシヌクレオチドが含まれる。
”非修飾ヌクレオシド”または”非修飾ヌクレオチド”とはβ−D−リボ−フラノースの1’炭素に連結されている、塩基アデニン、グアニン、シトシン、ウラシルの一つを意味している。
”修飾ヌクレオシド”または”修飾ヌクレオチド”とは非修飾ヌクレオチドの塩基、糖および/またはリン酸の化学構造中に修飾を含むヌクレオチド塩基を意味している。
”ピリミジン”とは6員ピリミジン環の修飾または非修飾誘導体を含むヌクレオチド意味している。ピリミジンの例は修飾または非修飾ウリジンである。
”ヌクレオチド三リン酸”または”NTP”とは、修飾または非修飾リボースまたはデオキシリボース糖の5’ヒドロキシル基に三つの無機リン酸基が結合されているヌクレオシドを意味しており、ここで糖の1’位は核酸塩基または水素を含むことができる。三リン酸部分は、その基の機能性(即ち、RNA分子内への取り込みを可能にする)を破壊しない化学修飾を含むように修飾されていてもよい。
別の好適な態様において、本発明のヌクレオチド三リン酸(NTP)はRNAポリメラーゼ酵素を用いてオリゴヌクレオチド内に取り込まれる。RNAポリメラーゼとしては突然変異体および野生型バクテリオファージT7、SP6またはT3 RNAポリメラーゼが挙げられるがこれらに限定されるわけではない。出願人はまた、本発明のNTPをTaqポリメラーゼのようなある種のDNAポリメラーゼを用いてオリゴヌクレオチド内へ取り込むことができることも発見した。
さらに別の好適な態様において、本発明は、オリゴヌクレオチド内へ修飾NTPを取り込むための方法を特徴とする。該方法は、オリゴヌクレオチド内への修飾NTPの取り込みに適した条件下、DNA鋳型、RNAポリメラーゼ、NTPおよび修飾NTP取り込みの促進剤を含む混合物をインキュベートする工程を含む。
”修飾NTP取り込みの促進剤”とはRNAポリメラーゼによる核酸転写体内への修飾ヌクレオチドの取り込みを容易にする試薬を意味している。そのような試薬にはメタノール;LiCl;ポリエチレングリコール(PEG);ジエチルエーテル;プロパノール;メチルアミン;エタノールなどが挙げられるがこれらに限定されるわけではない。
別の好適な態様において、修飾ヌクレオチド三リン酸は、核酸分子、例えば酵素的核酸、アンチセンス、2−5Aアンチセンスキメラ、オリゴヌクレオチド、三重鎖形成オリゴヌクレオチド(TFO)、アプタマーなど(Stull et al.,l995 Pharmaceutical Res.12,465)の中に、転写により取り込ませることができる。
”アンチセンス”とはRNA−RNA またはRNA−DNAまたはRNA−PNA(タンパク質核酸;Egholm el al.,1993 Nature 365,566)相互作用により標的RNAへ結合し、標的RNAの活性を変化させる非酵素的核酸分子を意味している(総説としてStein and Cheng,1993 Science 261,1004;Agrawal et al.,米国特許第5,591,721号;Agrawal,米国特許第5,652,356号を参照されたい)。典型的には、アンチセンス分子は、アンチセンス分子の1つの連続配列に沿って標的配列と相補的であろう。しかしながらある種の態様では、アンチセンス分子は、基質分子がループを形成するように基質へ結合してもよいし、および/またはアンチセンス分子は、アンチセンス分子がループを形成するように基質へ結合してもよい。従って、アンチセンス分子は二つの(またはそれ以上の)非連続基質配列と相補的であるか、またはアンチセンス分子の二つの(またはそれ以上の)非連続基質配列部分が標的配列と相補的であるか、またはその両方である。
”2−5Aアンチセンスキメラ”とは、5’リン酸化2’−5’結合アデニル酸部分を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを意味している。これらのキメラは配列特異的様式で標的RNAに結合し、細胞性2−5A依存性リボヌクレアーゼを活性化し、それは順に標的RNAを切断する(Torrence et al.,1993 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90,1300)。
”三重鎖形成オリゴヌクレオチド(TFO)”とは配列特異的様式で二本鎖DNAに結合して、三本鎖らせんを形成しうるオリゴヌクレオチドを意味している。そのような三本鎖らせん構造の形成は標的遺伝子の転写を阻害することが示されている(Duval−Valentin et al.,1992 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89,504)。
本明細書で使用される場合、”オリゴヌクレオチド”とは二つまたはそれ以上のヌクレオチドを有する分子を意味している。ポリヌクレオチドは一本鎖、二本鎖または多本鎖であり、修飾または非修飾のヌクレオチドまたは非ヌクレオチドまたはそれらの種々の混合物および組み合わせを有していてもよい。
”核酸触媒”とは、ヌクレオチド塩基配列特異的様式で他の別の核酸分子を繰り返して切断する能力(エンドヌクレアーゼ活性)を含む種々の反応を触媒する(速度および/または割合を変える)ことができる核酸分子を意味している。エンドヌクレアーゼ活性を有するそのような分子は基質結合領域において特定の遺伝子標的に対する相補性を有しており、またその標的中のRNAまたはDNAを特異的に切断する酵素活性を有する。即ち、エンドヌクレアーゼ活性を有する核酸分子は分子内または分子間でRNAまたはDNAを切断し、それにより標的RNAまたはDNA分子を不活性化することができる。この相補性は標的RNAまたはRNAに対する酵素的RNA分子の十分なハイブリダイゼーションを可能にし、切断が起こることを可能にする。100%の相補性が好適ではあるが、50−75%の低い相補性もまた本発明では有用である。核酸は塩基、糖および/またはリン酸基が修飾されていてもよい。用語、酵素的核酸は、リボザイム、触媒的RNA、酵素的RNA、触媒的DNA、触媒的オリゴヌクレオチド、ヌクレオザイム、DNAzyme、RNA酵素、エンドリボヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ。ミニザイム、リードザイム、オリゴザイム、ファインデロンまたはDNA酵素のような句と相互交換的に使用される。これらすべての用語は酵素活性を有する核酸分子を記述している。本出願に記載されている特定の酵素的核酸分子は本発明を限定するものではなく、本発明の酵素的核酸分子において重要なことは、一つまたはそれ以上の標的核酸領域に相補的な特異的基質結合部位を有すること、および分子に核酸切断活性を与えるヌクレオチド配列を基質結合部位内または周辺に有すること(Cech et al.,米国特許第4,987,071号、Cech et al.,1988,260 JAMA 3030)であることを当業者は認識するであろう。
”酵素的部分”または”触媒ドメイン”とは核酸基質の切断に必須である酵素的核酸分子の部分/領域を意味している。
”基質結合アーム”または”基質結合ドメイン”とは基質の一部分と相補的な(即ち、塩基対を形成できる)酵素的核酸分子の部分/領域を意味している。一般に、そのような相補性は100%であるが、必要に応じてそれ未満でもよい。例えば、14の内の10程度でも塩基対を形成しうる。即ち、これらのアームは、酵素的核酸分子中に、相補的塩基対形成相互作用により酵素的核酸分子および標的を一緒にすることが意図される配列を含む。本発明の酵素的核酸分子は連続または非連続的である、および色々な長さの結合アームを有していてもよい。結合アームの長さは好適には4ヌクレオチドより長いかまたは等しい;特には12−100ヌクレオチド;より特別には14−24ヌクレオチド長である。もし2つの結合アームが選択される場合、結合アームの長さは対称的(即ち、各々の結合アームは同じ長さである;例えば、5および5ヌクレオチド、6および6ヌクレオチドまたは7および7ヌクレオチド長)または非対称的(即ち、結合アームは異なった長さである;例えば、6および3ヌクレオチド;3および6ヌクレオチド長;4および5ヌクレオチド長;4および6ヌクレオチド長;4および7ヌクレオチド長など)であるように設計される。
本明細書で使用される場合、”核酸分子”とはヌクレオチドを有する分子を意味している。核酸は一本鎖、二本鎖または多本鎖であり、修飾または非修飾のヌクレオチドまたは非ヌクレオチドまたはそれらの種々の混合物および組み合わせを含むであろう。本発明に従った核酸分子の例は、タンパク質のような巨大分子をコードしている遺伝子である。
本発明の好適な態様において、核酸分子(例えば、アンチセンス分子、三重鎖DNAまたは酵素的核酸分子)は13から100ヌクレオチド長であり、特定の態様においては(例えば、特定のリボザイムに対して)35、36、37または38ヌクレオチド長である。特定の態様において核酸分子は15−100、17−100、20−100、21−100、23−100、25−100、27−100、30−100、32−100、35−100、40−100、50−100、60−100、70−100または80−100ヌクレオチド長である。上に特定した鎖長範囲の上限である100ヌクレオチドの代わりに、鎖長範囲の上限は例えば、30、40、50、60、70または80ヌクレオチドでもよい。従っていずれの鎖長範囲についても、特定の態様のための鎖長範囲は明記されたような下限を有し、および下限よりもより高い、明記されたような上限を有する。例えば特定の態様において、鎖長範囲は35−50ヌクレオチド長であろう。すべてのそのような範囲が明白に包含されている。また特定の態様において、核酸分子は上に特定した任意の長さ(例えば、21ヌクレオチド長)を有することができる。
”相補性”とは、伝統的ワトソン−クリックまたは他の非伝統的型により、核酸が別のRNA配列と水素結合を形成できることを意味している。本発明の核酸分子に関しては、核酸分子とその標的または相補的配列との結合自由エネルギーは、核酸の適切な機能が進行するのを可能にするのに十分である(例えば、酵素的核酸切断、アンチセンスまたは三重らせん阻害)。核酸分子の結合自由エネルギーの決定は本分野ではよく知られている(例えば、Turner et al.,1987,CSH Syrnp.Quant.Biol.LII pp.123−133;Frier et al.,1986,Proc.Nat.Acad.Sci.USA 83:9373−9377;Turner et al.,1987,J.Am.Chem.Soc.109:3783−3785)。パーセント相補性とは第二の核酸配列と水素結合(例えば、ワトソン−クリック塩基対形成)を形成できる核酸分子中の連続した残基のパーセントを示している(例えば、10個の内の5、6、7、8、9、10であれば50%、60%、70%、80%、90%および100%の相補性である)。”完全な相補性”とは核酸配列の連続した残基のすべてが第二の核酸配列中の同数の連続した残基と水素結合するであろうことを意味している。
さらに別の好適な態様において、本発明の修飾ヌクレオチド三リン酸は、新規機能を有する核酸分子のコンビナトリアル化学またはインビトロ選択に使用できる。修飾オリゴヌクレオチドは酵素的に合成でき、スクリーニングのためのライブラリーを生成することができる。
別の好適な態様において、本発明は、本発明に記載されている方法を用いて単離される核酸(例えば、酵素的核酸分子、アンチセンス核酸、2−5Aアンチセンスキメラ、三重鎖DNA、RNA切断化学基含有アンチセンス核酸)に基づいた技術、および遺伝子発現の診断、下方制御または阻害のためのそれらの使用法を特徴とする。
”阻害する”とは標的遺伝子の活性または標的遺伝子をコードしているmRNAまたは同等なRNAのレベルが本発明の核酸分子(例えば、酵素的核酸分子、アンチセンス核酸、2−5Aアンチセンスキメラ、三重鎖DNA、RNA切断化学基含有アンチセンス核酸)の不在下で観察されるよりも減じられることを意味している。一つの態様において、酵素的核酸分子による阻害は、好適には、mRNA上の同じ部位に結合できるがそのRNAを切断することはできない酵素的に弱められた核酸分子の存在下で観察されるレベルよりも低い。別の態様において、核酸分子(酵素的核酸およびアンチセンス分子を含む)による阻害は、好適には、例えばスクランブル配列またはミスマッチを有するオリゴヌクレオチドの存在下で観察される阻害よりもより強い。別の態様において、本発明の核酸分子による標的遺伝子の阻害は、核酸分子不在下よりも存在下の方がより強い。
さらに別の好適な態様において、本発明は多数の式Iの化合物を取り込むための方法を特徴とする。
さらに別の態様において、本発明は式IIの触媒活性を有する核酸分子を特徴とする。
上記の式において、X、YおよびZは独立してヌクレオチドまたは非ヌクレオチドリンカーを表し、それらは同じでも異なっていても良い;・は二つの隣接するヌクレオチド間の水素結合形成を示しており;Y’はYに相補的なヌクレオチドであり;Z’はZに相補的なヌクレオチドであり;lは3と等しいかまたはそれより大きな整数であり、好適には20未満、より特別には4、5、6、7、8、9、10、11、12または15であり;mは1より大きな整数であり、好適には10未満、より特別には2,3、4、5、6または7であり;nは1より大きな整数であり、好適には10未満、より特別には3、4、5、6または7であり;oは3と等しいかまたはそれより大きな整数であり、好適には20未満、より特別には3,4、5、6、7、8、9、10、11、12または15であり;lおよびoは同じ長さでもよいし(l=o)または異なった長さでもよい(l≠o);各X(l)およびX(o)は独立して標的核酸配列(標的はRNA、DNAまたはRNA/DNA混合ポリマーでありうる)と安定した相互作用をするのに十分な長さのオリゴヌクレオチドであり;Wは≧2ヌクレオチドの長さのリンカーであるかまたは非ヌクレオチドリンカーであってもよく;A、U、CおよびGはヌクレオチドを表し;Gはヌクレオチドであり、好適には2’−O−メチルであり;Cはヌクレオチドを表し、好適には2’−アミノ(例えば、2’−NH2または2’−O−NH2)であり;および_は化学結合を表す(例えば、リン酸エステル結合、アミド結合、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートまたは本分野で知られている他の結合)。
式IIの酵素的核酸分子は独立してキャップ構造を含んでいてもよく、それは独立して存在してもまたは存在しなくてもよい。
”十分な長さ”とはとは3ヌクレオチドと等しいかまたはそれより大きなオリゴヌクレオチドを意味している。
”安定に相互作用する”とはオリゴヌクレオチドと標的核酸との相互作用を意味している(例えば、生理学的条件下での標的中の相補的ヌクレオチドとの水素結合形成により)。
”キメラ核酸分子”または”キメラオリゴヌクレオチド”とは、分子が修飾または非修飾DNAまたはRNAの両方から成っていてもよいことを意味している。
”キャップ構造”とはオリゴヌクレオチドの末端に取り込まれている化学修飾を意味している。これらの末端修飾は核酸をエキソヌクレアーゼ分解から保護し、細胞内の送達および/または局在化を助けるであろう。キャップは5’末端(5’−キャップ)または3’末端(3’−キャップ)に存在してもよく、両方の末端に存在してもよい。非制限的例において:5’−キャップは反転無塩基部分、4’5’−メチレンヌクレオチド;1−(ベータ−D−エリスロフラノシル)ヌクレオチド、4’−チオヌクレオチド、炭素環式ヌクレオチド;1,5−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド;L−ヌクレオチド;アルファ−ヌクレオチド;修飾塩基ヌクレオチド;ホスホロジチオエート結合;スレオ−ペントフラノシルヌクレオチド;非環式3’−4’−セコヌクレオチド;非環式3,4−ジヒドロキシブチルヌクレオチド;非環式3,5−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、3’−3’−反転ヌクレオチド部分;3’−3’−反転無塩基部分;3’−2’−反転ヌクレオチド部分;3’−2’−反転無塩基部分;リン酸1,4−ブタンジオール;3’−ホスホルアミデート;リン酸ヘキシル;リン酸アミノヘキシル;3’−リン酸;3’−ホスホロチオエート;ホスホロジチオエート;または架橋または非架橋メチルホスホネート部分から成る群より選択される(より詳細にはBeigelman et al.,国際PCT公開番号第WO97/26270号を参照されたい、本明細書において援用される)。さらに別の好適な態様において、3’−キャップは、4’5’−メチレンヌクレオチド;1−(ベータ−D−エリスロフラノシル)ヌクレオチド;4’−チオヌクレオチド、炭素環式ヌクレオチド;リン酸5’−アミノアルキル;リン酸1,3−ジアミノ−2−プロピル;リン酸3−アミノプロピル;リン酸6−アミノヘキシル;リン酸1,2−アミノドデシル;リン酸ヒドロキシプロピル;1,5−アンヒドロヘキシトール;L−ヌクレオチド;アルファ−ヌクレオチド;修飾塩基ヌクレオチド;ホスホロジチオエート結合;スレオ−ペントフラノシルヌクレオチド;非環式3’,4’−セコヌクレオチド;3,4−ジヒドロキシブチルヌクレオチド;3,5−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、5’−5’−反転ヌクレオチド部分;5’,5’−反転無塩基部分;5’−ホスホルアミデート;5’−ホスホロチオエート;リン酸1,4−ブタンジオール;5’−アミノ;架橋および/または非架橋5’−ホスホルアミデート;ホスホロチオエートおよび/またはホスホロジチオエート、架橋または非架橋メチルホスホネートおよび5’−メルカプト部分から成る群より選択される(より詳細にはBeaucage and Iyer,1993,Tetrahedron 49,1925を参照されたい;本明細書において援用される)。用語”非ヌクレオチド”とは一つまたはそれ以上のヌクレオチド単位の代わりに核酸鎖内へ取り込ませることができる任意の基または化合物を意味しており、糖および/またはリン酸置換を含み、残っている塩基が酵素活性を示すことが可能である。該基または化合物は、アデノシン、グアニン、シトシン、ウラシルまたはチミンのような普通に認識されるヌクレオチド塩基を含まない点において無塩基である。本明細書で使用される場合、用語”無塩基”または”無塩基ヌクレオチド”とは塩基を欠くかまたは1’位に塩基の代わりに他の化学基を有する糖部分を包含している。
本発明に記載されているような2’−修飾ヌクレオチドに関連して、”アミノ”とは2’−NH2または2’−O−NH2を意味しており、それは修飾されていてもいなくてもよい。そのように修飾された基は例えば、各々Eckstein et al.,米国特許第5,672,695号およびMatulic−Adamic et al.,WO98/28317に記載されており、それらは全体が本明細書において援用される。
図面
図1はヌクレオシド基質を使用するNTP合成のスキームを示している。
図1はヌクレオシド基質を使用するNTP合成のスキームを示している。
図2はインビトロ選択法のためのスキームを示している。無作為コア領域および一つまたはそれ以上の規定された配列の領域を有する核酸分子のプールを発生させる。これらの核酸分子を規定された配列を有する固定化オリゴヌクレオチドを含むカラムへ結合させ、ここで規定された配列はプール中の核酸分子の規定された配列の領域と相補的である。カラム中の固定化オリゴヌクレオチド(標的)を切断できる核酸分子を単離し、相補的DNA(cDNA)に変換し、続いてNTPを用いる転写により新しい核酸プールを形成させる。
図3は二カラムインビトロ選択法のスキームを示している。無作為コアおよび規定された配列の二つの隣接領域(領域Aおよび領域B)を有する核酸分子のプールを発生させる。このプールは、各々プール中の核酸分子の領域AおよびBと相補的である、領域A’およびB’を有する固定化オリゴヌクレオチドを含むカラムを通過させる。カラムを固定化オリゴヌクレオチド標的が容易に切断されるのに十分な条件にする。標的を切断するプール中の分子(活性分子)はそのA領域に結合している標的のA’領域を有し、一方B領域はフリーである。カラムを洗浄して、結合した標的のA’領域を有する活性分子を単離する。この活性分子のプールはまた、標的を切断する活性がないが(不活性分子)カラムから解離されたある種の分子も含むであろう。混入した不活性分子を活性分子から分離するため、プールを、A’配列を含むがB’配列を含まない固定化オリゴヌクレオチドを含む第二のカラムを通過させる。不活性分子はカラム2に結合するが、活性分子はカラム2に結合しない(なぜなら、それらのA領域はカラム1からの標的オリゴヌクレオチドのA’領域により占領されている)。カラム2を洗浄して活性分子を単離し、図2に示したような次の処理に進む。
図4は新規な48ヌクレオチドの酵素的核酸モチーフの図解であり、これは本発明に記載されているインビトロ法を用いて同定された。示されている分子は単なる例示である。5’および3’末端ヌクレオチド(5’および3’末端上の単なる単一の末端ヌクレオチドではなく基質結合アームのヌクレオチドを指す)はこれらの部分が標的基質配列と塩基対形成しうる限り変更することができる。加えて、基質の切断部位に示されているグアノシン(G)は、その変更が標的配列を切断する酵素的核酸分子の能力を排除しない限り、他のヌクレオチドに変更することができる。核酸分子および/または基質配列中の置換は、例えば本明細書に記載したように容易に試験できる。
図5はクラスI酵素的核酸分子モチーフの効力を示すために使用されたHCVルシフェラーゼアッセイのスキームを示している。
図6はHCV RNA上の部位146を標的とする酵素的核酸分子の用量曲線を示しているグラフである。
図7はHCV RNA内の4つの部位を標的とする酵素的核酸分子が細胞中のRNAレベルを減少させうることを示している棒グラフである。
図8は特徴付けられたクラスII酵素的核酸モチーフの二次構造および切断速度を示している。
ヌクレオチド合成
本分野で知られているリン酸化プロトコールへのジメチルアミノピリジン(DMAP)の添加は反応時間を短くすると同時にヌクレオチド一リン酸の収率を非常に増加させることができる(図1)。本発明のヌクレオシドの合成はいくつかの論文および出願人の以前の出願に記載されている(Beigelman et al.,国際PCT公開番号第WO96/18736号;Dudzcy et al.,国際PCT公開番号第WO95111910号;Usman et al.,国際PCT公開番号第WO95/13378号;Matulic−Adarnic et al.,1997,Tetrahedron Lett.38,203,Matulic−Adarnic et al.,1997,Tetrahedron Lett.38,1669;これらはすべて本明細書において援用される)。これらのヌクレオシドをリン酸トリエチルに溶解し、氷浴で冷却した。オキシ塩化リン(POCl3)を加え、続いてDMAPを導入した。次に反応液を室温まで温めて5時間放置した。この反応はヌクレオチド一リン酸を形成させ、それは次にヌクレオチド三リン酸の形成に使用できる。トリブチルアミンを加え、続いて無水アセトニトリルおよびピロリン酸トリブチルアンモニウムを添加した。反応をTEABで停止させ、室温(約20℃)で一夜撹拌した。三リン酸はカラム精製およびHPLCを使用して精製され、化学構造はNMR分析により確認した。当業者は反応の試薬、温度および精製法は容易に代替物および均等物で変えることができ、それにもかかわらず所望の生成物が得られることを認識するであろう。
本分野で知られているリン酸化プロトコールへのジメチルアミノピリジン(DMAP)の添加は反応時間を短くすると同時にヌクレオチド一リン酸の収率を非常に増加させることができる(図1)。本発明のヌクレオシドの合成はいくつかの論文および出願人の以前の出願に記載されている(Beigelman et al.,国際PCT公開番号第WO96/18736号;Dudzcy et al.,国際PCT公開番号第WO95111910号;Usman et al.,国際PCT公開番号第WO95/13378号;Matulic−Adarnic et al.,1997,Tetrahedron Lett.38,203,Matulic−Adarnic et al.,1997,Tetrahedron Lett.38,1669;これらはすべて本明細書において援用される)。これらのヌクレオシドをリン酸トリエチルに溶解し、氷浴で冷却した。オキシ塩化リン(POCl3)を加え、続いてDMAPを導入した。次に反応液を室温まで温めて5時間放置した。この反応はヌクレオチド一リン酸を形成させ、それは次にヌクレオチド三リン酸の形成に使用できる。トリブチルアミンを加え、続いて無水アセトニトリルおよびピロリン酸トリブチルアンモニウムを添加した。反応をTEABで停止させ、室温(約20℃)で一夜撹拌した。三リン酸はカラム精製およびHPLCを使用して精製され、化学構造はNMR分析により確認した。当業者は反応の試薬、温度および精製法は容易に代替物および均等物で変えることができ、それにもかかわらず所望の生成物が得られることを認識するであろう。
ヌクレオチド三リン酸
本発明は多数の異なった機能に使用できるヌクレオチド三リン酸を提供する。表Iのヌクレオシドから形成されたヌクレオチド三リン酸は本分野で知られている他のヌクレオチド三リン酸と比較して独特で性質が異なっている。DNAまたはRNAオリゴヌクレオチド内への修飾ヌクレオチドの取り込みにより分子の特性を変えることができる。例えば、修飾ヌクレオチドはヌクレアーゼの結合を妨害し、したがって分子の化学的半減期を延長する。もし分子が細胞培養またはインビボで使用されるならば、このことは特に重要である。本分野において、これらの分子内への修飾ヌクレオチドの導入は、分子の安定性を、およびそれによりその有効性を非常に増加させうることが知られている(Burgin et al.,1996,Biochemistry 35,14090−14097;Usman et al.,1996,Curr.Opin.Struct.Biol.6,527−533)。
本発明は多数の異なった機能に使用できるヌクレオチド三リン酸を提供する。表Iのヌクレオシドから形成されたヌクレオチド三リン酸は本分野で知られている他のヌクレオチド三リン酸と比較して独特で性質が異なっている。DNAまたはRNAオリゴヌクレオチド内への修飾ヌクレオチドの取り込みにより分子の特性を変えることができる。例えば、修飾ヌクレオチドはヌクレアーゼの結合を妨害し、したがって分子の化学的半減期を延長する。もし分子が細胞培養またはインビボで使用されるならば、このことは特に重要である。本分野において、これらの分子内への修飾ヌクレオチドの導入は、分子の安定性を、およびそれによりその有効性を非常に増加させうることが知られている(Burgin et al.,1996,Biochemistry 35,14090−14097;Usman et al.,1996,Curr.Opin.Struct.Biol.6,527−533)。
修飾ヌクレオチドは野生型かまたは突然変異体ポリメラーゼを使用して取り込まれる。例えば、突然変異体T7ポリメラーゼは修飾ヌクレオチド三リン酸、DNA鋳型および適した緩衝液存在下で使用される。他のポリメラーゼおよびそれらの各々の突然変異変異体もまた本発明のNTPの取り込みに利用できることを当業者は認識するであろう。核酸転写体は放射性標識ヌクレオチド(α−32P NTP)の取り込みにより検出できる。放射性標識NTPは試験されている修飾三リン酸と同じ塩基を含む。メタノール、PEGおよびLiClの影響が、これらの化合物を独立してまたは組み合わせて添加することにより試験された。核酸転写体の検出および定量はMolecular Dynamics PhosphorImagerを使用して実施された。転写の効率は修飾ヌクレオチド三リン酸取り込みと全リボヌクレオチド取り込み対照を比較することにより評価された。野生型ポリメラーゼは製造元(Boehringer Mannheirn)の緩衝液および使用説明書を用いてNTPの取り込みに使用された。
転写条件
オリゴヌクレオチド内への修飾ヌクレオチド三リン酸の取り込み速度は、従来の緩衝液条件に、修飾NTP取り込みのいくつかの異なった促進剤を加えることにより促進できる。出願人はRNAポリメラーゼを用いるdNTPの取り込み速度を高めるためにメタノールおよびLiClを利用した。これらの修飾NTP取り込みの促進剤は転写を最適にするために異なった組み合わせおよび比率で使用できる。最適反応条件はヌクレオチド三リン酸間で異なり、標準実験により容易に決定できる。しかしながら総合的にいえば、メタノールまたは塩化リチウムのような無機化合物のような修飾NTP取り込みの促進剤の存在は、平均転写速度を速めることが示された。
オリゴヌクレオチド内への修飾ヌクレオチド三リン酸の取り込み速度は、従来の緩衝液条件に、修飾NTP取り込みのいくつかの異なった促進剤を加えることにより促進できる。出願人はRNAポリメラーゼを用いるdNTPの取り込み速度を高めるためにメタノールおよびLiClを利用した。これらの修飾NTP取り込みの促進剤は転写を最適にするために異なった組み合わせおよび比率で使用できる。最適反応条件はヌクレオチド三リン酸間で異なり、標準実験により容易に決定できる。しかしながら総合的にいえば、メタノールまたは塩化リチウムのような無機化合物のような修飾NTP取り込みの促進剤の存在は、平均転写速度を速めることが示された。
本発明の核酸分子の作用機構
アンチセンス:アンチセンス分子は修飾または非修飾のRNA、DNAまたは混合ポリマーオリゴヌクレオチドであり、マッチする配列へ特異的に結合してペプチド合成を阻害することにより主として機能する(Wu−Pong,Nov 1994,BioPharm,20−33)。アンチセンスオリゴヌクレオチドはワトソンクリック塩基対形成により標的RNAへ結合し、立体的阻止かまたはRNase H酵素の活性化により結合した配列のリボソーム翻訳を妨害することにより遺伝子発現を阻止する。アンチセンス分子はまたRNAプロセッシングまたは核から細胞質内への輸送を妨害することによってもタンパク質合成を変化させる(Mukhopadhyay&Roth,1996,Crit.Rev.in Oncogenesis 7,151−190)。
アンチセンス:アンチセンス分子は修飾または非修飾のRNA、DNAまたは混合ポリマーオリゴヌクレオチドであり、マッチする配列へ特異的に結合してペプチド合成を阻害することにより主として機能する(Wu−Pong,Nov 1994,BioPharm,20−33)。アンチセンスオリゴヌクレオチドはワトソンクリック塩基対形成により標的RNAへ結合し、立体的阻止かまたはRNase H酵素の活性化により結合した配列のリボソーム翻訳を妨害することにより遺伝子発現を阻止する。アンチセンス分子はまたRNAプロセッシングまたは核から細胞質内への輸送を妨害することによってもタンパク質合成を変化させる(Mukhopadhyay&Roth,1996,Crit.Rev.in Oncogenesis 7,151−190)。
加えて、RNAへの一本鎖DNAの結合はヘテロ二重鎖のヌクレアーゼ分解を生じる(Wu−Pong、前記文献;Crooke、前記文献)。現在まで、RNase Hの基質として働くであろう唯一の主鎖修飾DNAはホスホロチオエートおよびホスホロジチオエートである。最近、2’−アラビノおよび2’−フルオロアラビノ含有オリゴもまたRNase H活性を活性化することが報告されている。
化学的に修飾されたヌクレオチド、二次構造および/またはRNase H基質ドメインの新規コンフィギュレーションを利用する多数のアンチセンス分子が報告されている(Woolf et al.,国際PCT公開番号第WO98/l3526;1998年4月20日に出願されたThompson et al.,USSN 60/082,404;1998年9月21日に出願されたHartmann et al.,USSN 60/101,174、これらのすべては全体が本明細書において援用される)。
三重鎖形成オリゴヌクレオチド(TFO):一本鎖DNAをゲノムDNAへ配列特異的様式で結合するように設計することができる。TFOはフーグスティーン塩基対形成によりDNAらせんを結合するピリミジンに富んだオリゴヌクレオチドを含む(Wu−Pong、前記文献)。生じた三重らせんはDNAセンス、DNAアンチセンスおよびTFOから構成されており、RNAポリメラーゼによるRNA合成を破壊する。TFO機構は結合が不可逆的であるので遺伝子発現または細胞死を生じる(Mukhopadhyay&Roth、前記文献)。
2−5Aアンチセンスキメラ:2−5Aシステムは高等脊椎動物で発見されたRNA分解のインターフェロン仲介機構である(Mitra et al.,1996,Proc Nat Acad Sci USA 93,6780−6785)。二つの型の酵素、2−5A合成酵素およびRNase LがRNA切断に必要とされる。2−5A合成酵素は2’−5’オリゴアデニレート(2−5A)を形成するために二本鎖RNAを必要とする。2−5Aは次に、一本鎖RNAを切断する能力を有するRNase Lを利用するためのアロステリックエフェクターとして働く。二本鎖RNAを有する2−5Aを形成する能力は、ウイルス複製の阻害にこの系を特に有用なものにしている。
(2’−5’)オリゴアデニレート構造はアンチセンス分子に共有結合で連結され、RNA切断が可能なキメラオリゴヌクレオチドが形成される(Torrence、前記文献)。これらの分子は2−5A依存性RNaseに結合して活性化し、オリゴヌクレオチド/酵素複合体は次に標的RNA分子に結合し、それはRNase酵素により分解されることができると推定されている。
酵素的核酸:一般に、酵素的核酸は最初に標的RNAに結合することにより作用する。そのような結合は標的を切断するために作用する分子の酵素的部分に近接して保たれている酵素的核酸の標的結合部分を通して起こる。従って、酵素的核酸は最初に標的RNAを認識し、次に相補的塩基対生成を通して標的RNAに結合し、一度正しい部位に結合されたら標的RNAを切断するように作用する。そのような標的RNAの戦略的切断は、コードされているタンパク質の合成を指示するその能力を破壊するであろう。酵素的核酸がその標的に結合して切断した後は、別の標的を探すためにそのRNAから放出され、新しい標的に繰り返して結合して切断できる。
治療的処置に影響する酵素的核酸の濃度はより低いので、酵素的核酸の酵素特性は著しい利点である。この利点は酵素的核酸が酵素的に作用するという能力を反映している。従って、一つの酵素的核酸分子は標的RNAの多くの分子を切断できる。加えて、酵素的核酸分子は高度に特異的な阻害剤であり、阻害の特異性は標的RNAへの結合の塩基対形成機構のみでなく標的RNA切断の機構にも依存している。切断部位近くの1つのミスマッチまたは塩基置換を選択して、酵素的核酸分子の触媒活性を完全に除去することができる。
エンドヌクレアーゼ酵素活性を有する核酸分子は、ヌクレオチド塩基配列特異的様式で他の別のRNA分子を繰り返して切断できる。そのような酵素的核酸分子は実質的に任意のRNA転写体を標的にでき、インビトロで効果的な切断が達成される(Zaug et al.,324,Nature 429 1986;Uhlenbeck,1987 Nature 328,596;Kim et al.,84 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8788,1987;Dreyfus,1988,Einstein Quart.J.Bio.Med.,6,92;Haseloff and Gerlach,334 Nature 585,1988;Cech,260 JAMA 3030,1988;およびJefferies et al.,17 Nucleic Acids Research 1371,1989;Santoro et al.,1997 前記文献)。
その配列特異性のため、トランス切断酵素的核酸分子はヒト疾患に対する治療剤として期待されている(Usman&McSwiggen,1995 Ann.Rep.Med.Chem.30,285−294;Christoffersen and Marr,1995 J.Med.Chem.38,2023−2037)。酵素的核酸分子は細胞RNAのバックグラウンド内の特異的RNA標的を切断するように設計できる。そのような切断はRNAを非機能性とし、そのRNAから発現されるタンパク質を消滅させる。この様式で、疾患状態に関連するタンパク質の合成が選択的に阻害される。
核酸触媒活性の最適化
本発明の方法を使用して記載および同定された酵素的核酸分子の触媒活性はDraperら(前記文献)により説明されているようにおよび本分野でよく知られた方法を使用して最適化できる。詳細はここでは繰り返されないが、酵素的核酸分子の結合アームの長さを変化させること、または血清リボヌクレアーゼによる分解を阻害しおよび/または酵素活性を促進する修飾(塩基、糖および/またはリン酸)を有する酵素的核酸分子を化学的に合成すること(例えば、Eckstein et al.,国際公開番号第WO92/07065号;Perrault et al.,1990 Nature 344,565;Pieken et al.,1991 Science 253,314;Usman and Cedergren,1992 Trends in Biochem.Sci.17,334;Usman et al.,国際公開番号第WO93/15187号;Rossi et al.,国際公開番号第WO91/03162号;Sproat,米国特許番号第5,334,711号;およびBurgin et al.,前記文献;これらはすべて酵素的核酸分子の塩基、リン酸および/または糖部分に行うことができる種々の化学修飾を記載している)を含む。細胞内における効力を促進する修飾、合成時間を短くし化学的要求性を低くするためのステムループ構造からの塩基の除去が望ましい。(これらのすべての文献は本明細書において援用される)。
本発明の方法を使用して記載および同定された酵素的核酸分子の触媒活性はDraperら(前記文献)により説明されているようにおよび本分野でよく知られた方法を使用して最適化できる。詳細はここでは繰り返されないが、酵素的核酸分子の結合アームの長さを変化させること、または血清リボヌクレアーゼによる分解を阻害しおよび/または酵素活性を促進する修飾(塩基、糖および/またはリン酸)を有する酵素的核酸分子を化学的に合成すること(例えば、Eckstein et al.,国際公開番号第WO92/07065号;Perrault et al.,1990 Nature 344,565;Pieken et al.,1991 Science 253,314;Usman and Cedergren,1992 Trends in Biochem.Sci.17,334;Usman et al.,国際公開番号第WO93/15187号;Rossi et al.,国際公開番号第WO91/03162号;Sproat,米国特許番号第5,334,711号;およびBurgin et al.,前記文献;これらはすべて酵素的核酸分子の塩基、リン酸および/または糖部分に行うことができる種々の化学修飾を記載している)を含む。細胞内における効力を促進する修飾、合成時間を短くし化学的要求性を低くするためのステムループ構造からの塩基の除去が望ましい。(これらのすべての文献は本明細書において援用される)。
有意に触媒に影響することなくおよび有意にヌクレアーゼ安定性および効力を促進することなく、核酸分子(例えば、酵素的核酸分子)内へ導入できる糖、塩基およびリン酸修飾を記載しているいくつかの例が本分野に存在する。酵素的核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性基、例えば、2’−アミノ、2’−C−アリル、2’−フルオロ、2’−O−メチル、2’−H、ヌクレオチド塩基修飾(総説としてUsman and Cedergren,1992 TIBS 17,34;Usman et al.,1994 Nucleic Acids Symp.Ser.31,163;Burgin et al.,1996 Biochemistry 35,14090を参照されたい)による修飾により安定性を促進および/または触媒活性を促進するように修飾される。酵素的核酸分子の糖修飾は広範囲にわたって本分野で記載されている(Eckstein et al.,国際公開PCT番号第WO92/07065号;PerTault et al.Nature 1990,344,565−568;Pieken et al.Science 1991,253,314−317;Usman and Cedergren,Trends in Biochem.Sci.1992,17,334−339;Usman et al.国際公開PCT番号第WO93/15187号;Sproat,米国特許番号第5,334,711号およびBeigelman et al.,1995 J.Biol.Chem.270,25702;すべての参照文献は全体が本明細書において援用される、を参照されたい)。そのような論文は、触媒を阻害することなく、糖、塩基および/またはリン酸修飾などを取り込む位置を決定するための一般法および戦略を記載しており、本明細書において援用される。そのような教示を考慮すると、同様な修飾が本発明の核酸触媒を修飾するために本明細書に説明したように使用できる。
酵素活性を維持または促進する化学修飾を有する核酸触媒が提供される。そのような核酸分子は一般的に非修飾核酸よりもヌクレアーゼに対して高い耐性を有する。従って、細胞および/またはインビボにおいて、活性は有意に低くならない。本明細書で例示したように、そのような酵素的核酸分子は、たとえ全体の活性が10分の1になっても細胞および/またはインビボにおいて有用である(Burgin et al.,1996,Biochemistry,35,14090)。そのような酵素的核酸分子は本明細書では酵素活性を”維持している”と記述される。
外から送達された治療的核酸分子(例えば、酵素的核酸分子およびアンチセンス核酸分子)は、望ましくないタンパク質のレベルが減少するように、最適には標的RNAの翻訳を十分長く阻害するまで細胞内で安定でなければならない。この時間は疾患状態に依存して数時間から数日の間で変化する。明らかに、これらの核酸分子は有効な細胞内治療剤として機能するためにヌクレアーゼに対して耐性でなければならない。本発明および本分野で記載されている核酸分子の化学合成の改良は、前記のようにヌクレアーゼ安定性を促進するためのヌクレオチド修飾の導入により、修飾核酸分子の能力を拡大した。
”促進された酵素活性”とは、活性が触媒活性および酵素的核酸分子安定性の両方を反映している、細胞および/またはインビボで測定された活性を含む。本発明において、これらの特性の積は、非修飾酵素的核酸分子と比較して、インビボで増加するかまたは有意に(10分の1以下)減少しなかった。
さらに別の好適な態様において、酵素活性を維持または促進する化学修飾を有する核酸触媒が提供される。そのような核酸はまた一般的に非修飾核酸よりもヌクレアーゼに対して耐性が高い。従って、細胞および/またはインビボにおいて活性は有意に低下しないであろう。本明細書で例示したようにそのような酵素的核酸分子は、たとえ全体の活性が10分の1になっても細胞および/またはインビボにおいて有用である(Burgin et al.,1996,Biochemistry,35,14090)。そのような酵素的核酸分子は本明細書では全RNAの酵素的核酸分子の酵素活性を”維持している”と記述される。
これらの分子の使用は併用療法の可能性を与えることにより疾患進行のより良好な処置を導くであろう(例えば、異なった遺伝子を標的にした多数の酵素的核酸分子、既知の小分子阻害剤と結合された酵素的核酸分子、または酵素的核酸分子(異なった酵素的核酸分子モチーフを含む)および/または他の化学または生物学的分子と組み合わせた間欠性処置)。核酸分子による患者の処置は、異なった型の核酸分子の組み合わせも含むであろう。疾患の徴候を軽減するために一つまたはそれ以上の標的に対する酵素的核酸分子(異なった酵素的核酸分子モチーフを含む)、アンチセンスおよび/または2−5Aキメラ分子の混合物を含む治療が工夫されるであろう。
ヌクレオチド一、二または三リン酸および核酸分子の投与
本発明のヌクレオチド一リン酸、二リン酸または三リン酸または核酸分子は、単独でまたは他の医薬成分と組み合わせて治療薬として使用できる。本発明のこれらの分子はSullivan et al.,PCT WO94/02595;Alchtar et al.,1992,Trends Cell Bio.,2,139;およびアンチセンスオリゴヌクレオチド治療薬の送達法、Akhtar編,1995(本明細書において援用される)の方法を使用して患者に投与できる。本発明の分子は当業者には知られている種々の方法により細胞に投与され、例えばリポソームへのカプセル化、イオン導入法により、またはヒドロゲル、シクロデキストリン、生物分解性ナノカプセルおよび生物接着性ミクロスフェアーのような他の賦形剤内に取り込ませることなどが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。いくつかの適用では、酵素的核酸分子は前記の賦形剤と共に、または無しでエクスビボで細胞または組織に直接送達される。もしくは、修飾ヌクレオチド三リン酸、二リン酸または一リン酸/賦形剤の組み合わせが直接注射またはカテーテル、注入ポンプまたはステントの使用により局所的に送達される。送達の他の経路には、血管内、筋肉内、皮下または関節注射、エアロゾル吸入、経口(錠剤またはピル剤の形で)、局所的、全身的、眼内、腹腔内および/またはクモ膜下送達が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。より詳細な送達および投与の記述は本明細書において援用されるSullivan et al.,前記文献およびDraper et al.,PCT WO93/23569に提供されている。
本発明のヌクレオチド一リン酸、二リン酸または三リン酸または核酸分子は、単独でまたは他の医薬成分と組み合わせて治療薬として使用できる。本発明のこれらの分子はSullivan et al.,PCT WO94/02595;Alchtar et al.,1992,Trends Cell Bio.,2,139;およびアンチセンスオリゴヌクレオチド治療薬の送達法、Akhtar編,1995(本明細書において援用される)の方法を使用して患者に投与できる。本発明の分子は当業者には知られている種々の方法により細胞に投与され、例えばリポソームへのカプセル化、イオン導入法により、またはヒドロゲル、シクロデキストリン、生物分解性ナノカプセルおよび生物接着性ミクロスフェアーのような他の賦形剤内に取り込ませることなどが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。いくつかの適用では、酵素的核酸分子は前記の賦形剤と共に、または無しでエクスビボで細胞または組織に直接送達される。もしくは、修飾ヌクレオチド三リン酸、二リン酸または一リン酸/賦形剤の組み合わせが直接注射またはカテーテル、注入ポンプまたはステントの使用により局所的に送達される。送達の他の経路には、血管内、筋肉内、皮下または関節注射、エアロゾル吸入、経口(錠剤またはピル剤の形で)、局所的、全身的、眼内、腹腔内および/またはクモ膜下送達が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。より詳細な送達および投与の記述は本明細書において援用されるSullivan et al.,前記文献およびDraper et al.,PCT WO93/23569に提供されている。
本発明の分子は医薬として使用できる。医薬は患者の疾患状態を防止し、発生を阻害し、または治療する(徴候をある程度、好適にはすべての徴候を軽減する)。
陰性に荷電した本発明のヌクレオチド一リン酸、二リン酸または三リン酸は、安定化剤、緩衝液などと(または無しで)医薬組成物を形成させ、任意の標準的手段で患者に投与または導入できる。リポソーム送達機構の使用が望まれる場合、リポソーム形成のための標準プロトコールに従うことができる。本発明の組成物はまた経口投与のための錠剤、カプセルまたはエリキシル;直腸投与のための座剤;滅菌溶液;注射可能な投与のための懸濁剤;などとして処方および使用されるであろう。
本発明はまた記載された化合物の医薬として受容可能な処方を含む。これらの処方には前記の化合物の塩、例えば、アンモニウム、ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、リチウムおよびカリウム塩が含まれる。
医薬組成物または処方とは、細胞または患者(好適にはヒト)への投与(例えば、全身投与)に適した形の組成物または処方を意味している。適した形は、一部は、例えば経口、経皮または注射によるような使用または投与経路に依存している。そのような形は、組成物または処方が標的細胞(即ち、陰性に荷電したポリマーが送達されるべきと望まれている細胞)に到達することを妨げてはならない。例えば、血流内へ注射される医薬組成物は可溶性であるべきである。他の因子は本分野で知られており、毒性および組成物または処方がその効果を果たすのを妨げる形のような考慮が含まれている。
”全身投与”とはインビボでの全身吸収または血流での薬剤の蓄積に続く全身を通しての分布を意味している。全身吸収を導く投与経路には静脈内、皮下、腹腔内、吸入、経口、肺内および筋肉内が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。これらの投与経路の各々は所望の陰性に荷電したポリマー(例えば、NTP)を接近可能な疾患組織へ暴露させる。循環系内への薬剤の入り込み速度は分子量または大きさに関係している。本発明の化合物を含むリポソームまたは他の薬剤担体の使用は、例えば、網膜内皮系(RES)の組織のようなある種の組織型に薬剤を局在化させることができる可能性がある。リンパ球およびマクロファージのような、薬剤の細胞表面との結合を容易にできるリポソーム処方もまた有用である。この方法は、マクロファージまたはリンパ球による癌細胞のような異常細胞の免疫認識特異性を利用することにより標的細胞への薬剤送達を促進させる。
本発明はまたポリ(エチレングリコール)脂質を含む表面修飾リポソーム(PEG修飾、または長期循環リポソームまたはステルスリポソーム)から成る組成物の使用も特徴とする。これらの処方は標的細胞における薬剤の蓄積を増加させるための方法を提供する。この類の薬剤担体は単球食細胞系(MPSまたはRES)によるオプソニン作用および除去に抵抗し、それにより封入された薬剤のより長期の血流循環時間および促進された組織暴露を可能にしている(Lasic et al.Chem.Rev.1995,95,2601−2627;Ishiwata et al.,Chem.Pharm.Bull.1995,43,1005−1011)。そのようなリポソームはおそらく血管新生化標的組織における血管外遊出および捕捉により、腫瘍に選択的に蓄積されることが示されている(Lasic et al.,Science 1995,267,1275−1276;Oku et al.,1995,Biochim.Biophys.Acta,1238,86−90)。長期循環リポソームは、MPSの組織に蓄積することが知られている通常の陽イオン性リポソームと比較すると特に、薬剤の薬物動態および薬力学を促進する(Liu et al.,J.Biol.Chem.1995,42,24864−24870;Choi et al.,国際PCT公開番号第WO96/10391号;Ansell et al.,国際PCT公開番号第WO96/10390号;Holland et al.,国際PCT公開番号第WO96/10392;これらはすべて本明細書において援用される)。長期循環リポソームはまた、肝臓および脾臓のような代謝的に活動的なMPS組織での蓄積を避けるそれらの能力に基づき、陽イオン性リポソームと比較して非常にヌクレアーゼ分解から薬剤を保護しているようである。これらの参照文献のすべては本明細書において援用される。
本発明はまた、医薬として受容可能な担体または希釈剤中に医薬として有効量の所望の化合物を含む、貯蔵または投与のために製造された組成物も含む。治療的使用のために受容可能な担体または希釈剤は薬学分野ではよく知られており、例えば、本明細書において援用されるRemington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.(A.R.Gennaro編、1985)に記載されている。例えば、保存剤、安定化剤、色素および芳香化剤が提供されるであろう(上掲、1449)。これらには安息香酸ナトリウム、ソルビン酸およびp−ヒドロキシ安息香酸のエステルが含まれる。加えて、抗酸化剤および懸濁化剤を使用してもよい。
”患者”とは外殖細胞の供与者または受容者である生物体または細胞それ自体を意味している。”患者”とはまた、本発明の化合物が投与される生物体も意味している。好適には、患者は哺乳動物(例えば、ヒト)、霊長類または齧歯動物である。
薬理学的有効量とは、疾患状態を防止する、発生を阻害する、または処置する(徴候をある程度、好適にはすべての徴候を軽減する)のに必要とされる用量である。薬理学的有効量は疾患の型、使用される組成物、投与経路、処置されている哺乳動物の型、考慮されている特別な哺乳動物の生理学的特性、同時に行う薬物療法および当業者により認識されるであろうその他の因子に依存している。一般に、陰性に荷電したポリマーの効力に依存して、0.1mg/kgから100mg/kg体重/日の間の量が許容される。一つの態様において、本発明は必要に応じ特定の細胞へ外来的に送達できる酵素的核酸分子を提供する。
本発明の核酸分子はまた、全体の治療効果を増加させるため、他の治療化合物と組み合わせて患者に投与される。適応症を処置するための多数の化合物の使用は有益な効果を増加させ、一方副作用を減少させるであろう。
以下は非制限的な例であり、本発明のヌクレオチド三リン酸の合成、取り込み、および分析、そして酵素的核酸の活性を示す。
出願人はDMAPを反応に使用してピリミジンヌクレオチド三リン酸を合成した。プリンには当該分野で既に報告されている標準的なプロトコールを使用した(Yoshikawaら, 上記;Ludwig, 上記)。以下に記載するのはピリミジンヌクレオチド三リン酸およびプリンヌクレオチド三リン酸の合成の一例である。
実施例1:プリンヌクレオチド三リン酸の合成:2’−O−メチル−グアノシン−5’−三リン酸
2’−O−メチルグアノシンヌクレオシド(0.25グラム、0.84mmol)をリン酸トリエチル(5.0ml)に、100℃まで5分間加熱して溶解した。得られた無色透明の溶液を、氷浴を使用してアルゴン雰囲気下で0℃まで冷却した。次いでオキシ塩化リン(1.8当量、0.141ml)を激しく攪拌しながら反応混液に添加した。反応液をHPLC(過塩素酸ナトリウムのグラジエントを使用)でモニタリングした。0℃で5時間後、トリブチルアミン(0.65ml)を添加し、次いで無水アセトニトリル(10.0ml)を添加し、5分後(0℃に再平衡化)ピロリン酸トリブチルアンモニウム(4.0当量、1.53g)を添加した。0℃で15分後、反応混液を20mlの2M TEABでクエンチングし(上記条件でのHPLC分析は、10分で一リン酸が消費されたことを示した)、その後室温で一晩攪拌し、混合液を減圧下でメタノールと共蒸発(4x)させた後、50mlの0.05M TEABで希釈した。DEAEセファデックス精製(0.05から0.6MのTEABグラジエント)を行い、純粋な三リン酸(0.52g、収率66.0%)(0.3M TEAB付近で溶出)を得た;純度はHPLCおよびNMR分析で確認した。
2’−O−メチルグアノシンヌクレオシド(0.25グラム、0.84mmol)をリン酸トリエチル(5.0ml)に、100℃まで5分間加熱して溶解した。得られた無色透明の溶液を、氷浴を使用してアルゴン雰囲気下で0℃まで冷却した。次いでオキシ塩化リン(1.8当量、0.141ml)を激しく攪拌しながら反応混液に添加した。反応液をHPLC(過塩素酸ナトリウムのグラジエントを使用)でモニタリングした。0℃で5時間後、トリブチルアミン(0.65ml)を添加し、次いで無水アセトニトリル(10.0ml)を添加し、5分後(0℃に再平衡化)ピロリン酸トリブチルアンモニウム(4.0当量、1.53g)を添加した。0℃で15分後、反応混液を20mlの2M TEABでクエンチングし(上記条件でのHPLC分析は、10分で一リン酸が消費されたことを示した)、その後室温で一晩攪拌し、混合液を減圧下でメタノールと共蒸発(4x)させた後、50mlの0.05M TEABで希釈した。DEAEセファデックス精製(0.05から0.6MのTEABグラジエント)を行い、純粋な三リン酸(0.52g、収率66.0%)(0.3M TEAB付近で溶出)を得た;純度はHPLCおよびNMR分析で確認した。
実施例2:ピリミジンヌクレオチド三リン酸の合成:2’−O−メチルチオメチル−ウリジン−5’−三リン酸
2’−O−メチルチオメチル−ウリジンヌクレオシド(0.27グラム、1.0mmol)をリン酸トリエチル(5.0ml)に溶解した。得られた無色透明の溶液を、氷浴を使用してアルゴン雰囲気下で0℃まで冷却した。次いでオキシ塩化リン(2.0当量、0.190ml)を激しく攪拌しながら反応混液に添加した。ジメチルアミノピリジン(DMAP、0.2当量、25mg)を添加し、溶液を室温まで加温し、反応をHPLC(過塩素酸ナトリウムのグラジエントを使用)でモニタリングした。20℃で5時間後、トリブチルアミン(1.0ml)を添加し、次いで無水アセトニトリル(10.0ml)を添加し、5分後ピロリン酸トリブチルアンモニウム(4.0当量、1.8g)を添加した。20℃で15分後、反応混液を20mlの2M TEABでクエンチングし(上記条件でのHPLC分析は、10分で一リン酸が消費されたことを示した)、その後室温で一晩攪拌した。混合液を減圧下でメタノールと共蒸発(4x)させた後、50mlの0.05M TEABで希釈した。DEAE高速セファロース精製(0.05から1.0MのTEABグラジエント)を行い、HPLCおよびNMR分析で確認したところ、純粋な三リン酸(0.40g、収率44%)(0.3M TEAB付近で溶出)を得た。
2’−O−メチルチオメチル−ウリジンヌクレオシド(0.27グラム、1.0mmol)をリン酸トリエチル(5.0ml)に溶解した。得られた無色透明の溶液を、氷浴を使用してアルゴン雰囲気下で0℃まで冷却した。次いでオキシ塩化リン(2.0当量、0.190ml)を激しく攪拌しながら反応混液に添加した。ジメチルアミノピリジン(DMAP、0.2当量、25mg)を添加し、溶液を室温まで加温し、反応をHPLC(過塩素酸ナトリウムのグラジエントを使用)でモニタリングした。20℃で5時間後、トリブチルアミン(1.0ml)を添加し、次いで無水アセトニトリル(10.0ml)を添加し、5分後ピロリン酸トリブチルアンモニウム(4.0当量、1.8g)を添加した。20℃で15分後、反応混液を20mlの2M TEABでクエンチングし(上記条件でのHPLC分析は、10分で一リン酸が消費されたことを示した)、その後室温で一晩攪拌した。混合液を減圧下でメタノールと共蒸発(4x)させた後、50mlの0.05M TEABで希釈した。DEAE高速セファロース精製(0.05から1.0MのTEABグラジエント)を行い、HPLCおよびNMR分析で確認したところ、純粋な三リン酸(0.40g、収率44%)(0.3M TEAB付近で溶出)を得た。
実施例3:ウリジン5’−三リン酸合成におけるDMAPの使用
反応は、20mgアリコートのヌクレオシドを1mlのリン酸トリエチルおよび19μlのオキシ塩化リンに溶解したもので実施した。反応を40分間隔でHPLCで自動的にモニタリングし、18時間までの時間に対する収量曲線を作成した。逆相カラムおよび酢酸アンモニウム/酢酸ナトリウムバッファー系(それぞれ50mMおよび100mM、pH4.2)を使用して5’、3’、2’−一リン酸(一リン酸はこの順序で溶出する)を5’−三リン酸および出発ヌクレオシドから分離した。データを表2に示す。これらの条件により収量は2倍となり、最大収量が得られるまでの反応時間は10倍改善した(90%の収率を得るのに1200分から120分に短縮)。5’−一リン酸化の選択性が全ての反応で観察された。その後の三リン酸化はほぼ同量の収率で発生した。
反応は、20mgアリコートのヌクレオシドを1mlのリン酸トリエチルおよび19μlのオキシ塩化リンに溶解したもので実施した。反応を40分間隔でHPLCで自動的にモニタリングし、18時間までの時間に対する収量曲線を作成した。逆相カラムおよび酢酸アンモニウム/酢酸ナトリウムバッファー系(それぞれ50mMおよび100mM、pH4.2)を使用して5’、3’、2’−一リン酸(一リン酸はこの順序で溶出する)を5’−三リン酸および出発ヌクレオシドから分離した。データを表2に示す。これらの条件により収量は2倍となり、最大収量が得られるまでの反応時間は10倍改善した(90%の収率を得るのに1200分から120分に短縮)。5’−一リン酸化の選択性が全ての反応で観察された。その後の三リン酸化はほぼ同量の収率で発生した。
バクテリオファージT7 RNAポリメラーゼ反応に使用する物質
バッファー1:試薬を混合してバッファー1の10Xストック溶液を調製する(400mM トリス−Cl(pH8.1)、200mM MgCl2、100mM DTT、50mM スペルミジン、および0.1% トリトンX−100)。ポリメラーゼ反応の開始に先立ち、メタノール、LiClを添加してバッファーを希釈し、バッファー1の最終の反応液の条件が以下から成るようにする:40mM トリスpH(8.1)、20mM MgCl2、10mM DTT、5mM スペルミジン、0.01% トリトンX−100、10% メタノール、および1mM LiCl。
バッファー1:試薬を混合してバッファー1の10Xストック溶液を調製する(400mM トリス−Cl(pH8.1)、200mM MgCl2、100mM DTT、50mM スペルミジン、および0.1% トリトンX−100)。ポリメラーゼ反応の開始に先立ち、メタノール、LiClを添加してバッファーを希釈し、バッファー1の最終の反応液の条件が以下から成るようにする:40mM トリスpH(8.1)、20mM MgCl2、10mM DTT、5mM スペルミジン、0.01% トリトンX−100、10% メタノール、および1mM LiCl。
バッファー2:試薬を混合してバッファー2の10Xストック溶液を調製する(400mM トリス−Cl(pH8.1)、200mM MgCl2、100mM DTT、50mM スペルミジン、および0.1% トリトンX−100)。ポリメラーゼ反応の開始に先立ち、PEG、LiClを添加してバッファーを希釈し、バッファー2の最終の反応液の条件が以下から成るようにする:40mM トリスpH(8.1)、20mM MgCl2、10mM DTT、5mM スペルミジン、0.01% トリトンX−100、4% PEG、および1mM LiCl。
バッファー3:試薬を混合してバッファー3の10Xストック溶液を調製する(400mM トリス−Cl(pH8.0)、120mM MgCl2、50mM DTT、10mM スペルミジン、および0.02% トリトンX−100)。ポリメラーゼ反応の開始に先立ち、PEGを添加してバッファーを希釈し、バッファー3の最終の反応液の条件が以下から成るようにする:40mM トリスpH(8.0)、12mM MgCl2、5mM DTT、1mM スペルミジン、0.002% トリトンX−100、および4% PEG。
バッファー4:試薬を混合してバッファー4の10Xストック溶液を調製する(400mM トリス−Cl(pH8.0)、120mM MgCl2、50mM DTT、10mM スペルミジン、および0.02% トリトンX−100)。ポリメラーゼ反応の開始に先立ち、PEG、メタノールを添加してバッファーを希釈し、バッファー4の最終の反応液の条件が以下から成るようにする:40mM トリスpH(8.0)、12mM MgCl2、5mM DTT、1mM スペルミジン、0.002% トリトンX−100、10% メタノール、および4% PEG。
バッファー5:試薬を混合してバッファー5の10Xストック溶液を調製する(400mM トリス−Cl(pH8.0)、120mM MgCl2、50mM DTT、10mM スペルミジン、および0.02% トリトンX−100)。ポリメラーゼ反応の開始に先立ち、PEG、LiClを添加してバッファーを希釈し、バッファー5の最終の反応液の条件が以下から成るようにする:40mM トリスpH(8.0)、12mM MgCl2、5mM DTT、1mM スペルミジン、0.002% トリトンX−100、1mM LiCl、および4% PEG。
バッファー6:試薬を混合してバッファー6の10Xストック溶液を調製する(400mM トリス−Cl(pH8.0)、120mM MgCl2、50mM DTT、10mM スペルミジン、および0.02% トリトンX−100)。ポリメラーゼ反応の開始に先立ち、PEG、メタノールを添加してバッファーを希釈し、バッファー6の最終の反応液の条件が以下から成るようにする:40mM トリスpH(8.0)、12mM MgCl2、5mM DTT、1mM スペルミジン、0.002% トリトンX−100、10% メタノール、および4% PEG。
バッファー7:試薬を混合してバッファー7の10Xストック溶液を調製する(400mM トリス−Cl(pH8.0)、120mM MgCl2、50mM DTT、10mM スペルミジン、および0.02% トリトンX−100)。ポリメラーゼ反応の開始に先立ち、PEG、メタノール、およびLiClを添加してバッファーを希釈し、バッファー7の最終の反応液の条件が以下から成るようにする:40mM トリスpH(8.0)、12mM MgCl2、5mM DTT、1mM スペルミジン、0.002% トリトンX−100、10% メタノール、4% PEG、および1mM LiCl。
実施例4:変異体T7RNAポリメラーゼを用いる修飾型ヌクレオチド三リン酸のスクリーニング
それぞれの修飾型ヌクレオチド三リン酸をバッファー1から6中で、2つの異なる温度(25および37℃)で個々に試験した。25℃で試験したバッファー1−6を条件1−6とし、37℃で試験したバッファー1−6を条件7−12とした(表3)。それぞれの条件で、Y639F変異体T7ポリメラーゼ(SousaおよびPadilla、上記)(0.3−2mg/20ml反応液)、NTP(各2mM)、DNAテンプレート(10pmol)、無機ピロホスファターゼ(5U/ml)、およびα−32P NTP(0.8mCi/pmolテンプレート)を合一し、表示した温度で1−2時間加熱した。使用した放射能標識したNTPは試験する修飾型三リン酸と異なるものである。サンプルをポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した。PhosphorImager(Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA)を使用して完全長の転写産物の量を定量し、全RNA対照反応液と比較した。データを表4に示す;それぞれの反応の結果を、全リボヌクレオチド三リン酸(rNTP)対照に対するパーセントで表す。対照は変異体T7ポリメラーゼで、市販のポリメラーゼバッファー(Boehringer Mannheim, Indianapolis IN)を使用して行った。
それぞれの修飾型ヌクレオチド三リン酸をバッファー1から6中で、2つの異なる温度(25および37℃)で個々に試験した。25℃で試験したバッファー1−6を条件1−6とし、37℃で試験したバッファー1−6を条件7−12とした(表3)。それぞれの条件で、Y639F変異体T7ポリメラーゼ(SousaおよびPadilla、上記)(0.3−2mg/20ml反応液)、NTP(各2mM)、DNAテンプレート(10pmol)、無機ピロホスファターゼ(5U/ml)、およびα−32P NTP(0.8mCi/pmolテンプレート)を合一し、表示した温度で1−2時間加熱した。使用した放射能標識したNTPは試験する修飾型三リン酸と異なるものである。サンプルをポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した。PhosphorImager(Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA)を使用して完全長の転写産物の量を定量し、全RNA対照反応液と比較した。データを表4に示す;それぞれの反応の結果を、全リボヌクレオチド三リン酸(rNTP)対照に対するパーセントで表す。対照は変異体T7ポリメラーゼで、市販のポリメラーゼバッファー(Boehringer Mannheim, Indianapolis IN)を使用して行った。
実施例5:野生型T7−RNAポリメラーゼを使用する修飾型NTPの取り込み
バクテリオファージT7 RNAをBoehringer Mannheimから0.4U/μLの濃度で購入した。出願人は、反応液50μLに混合した酵素および0.2μCi アルファ−32P NTPを市販のバッファーに補充したものを2mMずつのヌクレオチド三リン酸と共に使用した。テンプレートは2本鎖PCRフラグメントであり、これは前のスクリーニングに使用したものである。反応は37℃で1時間実施した。10μLのサンプルを7.5%分析用PAGEで泳動し、PhosphorImagerを使用してバンドを定量した。“全リボ”対照(非修飾型ヌクレオチド三リン酸)と比較して結果を算出し、結果を表5に示す。
バクテリオファージT7 RNAをBoehringer Mannheimから0.4U/μLの濃度で購入した。出願人は、反応液50μLに混合した酵素および0.2μCi アルファ−32P NTPを市販のバッファーに補充したものを2mMずつのヌクレオチド三リン酸と共に使用した。テンプレートは2本鎖PCRフラグメントであり、これは前のスクリーニングに使用したものである。反応は37℃で1時間実施した。10μLのサンプルを7.5%分析用PAGEで泳動し、PhosphorImagerを使用してバンドを定量した。“全リボ”対照(非修飾型ヌクレオチド三リン酸)と比較して結果を算出し、結果を表5に示す。
実施例6:複数の修飾型ヌクレオチド三リン酸のオリゴヌクレオチドへの取り込み
修飾型ヌクレオチド三リン酸の組み合わせを実施例4に記載する転写プロトコールで試験し、2つ以上のこれらの三リン酸の取り込みの割合を測定した。2’−デオキシ−2’−(L−ヒスチジン)アミノウリジン(2’−his−NH2−UTP)の取り込みを、反応条件9番で非修飾型シチジンヌクレオチド三リン酸、γATP、およびγGTPを用いて試験した。データを全γNTP対照に対する修飾型NTPの取り込みのパーセンテージで表し、表6aに示す。
修飾型ヌクレオチド三リン酸の組み合わせを実施例4に記載する転写プロトコールで試験し、2つ以上のこれらの三リン酸の取り込みの割合を測定した。2’−デオキシ−2’−(L−ヒスチジン)アミノウリジン(2’−his−NH2−UTP)の取り込みを、反応条件9番で非修飾型シチジンヌクレオチド三リン酸、γATP、およびγGTPを用いて試験した。データを全γNTP対照に対する修飾型NTPの取り込みのパーセンテージで表し、表6aに示す。
2つの修飾型シチジン(2’−NH2−CTPまたは2’dCTP)が2’−his−NH2−UTPと共に同じ割合で取り込まれた。次いで2’−his−NH2−UTPおよび2’−NH2−CTPを種々の非修飾型および修飾型アデノシン三リン酸を用いて同じバッファー中で試験した(表6b)。2’−his−NH2−UTPおよび2’−NH2−CTPの両方との取り込みに最良の修飾型アデノシン三リン酸は2’−NH2−DAPTPであった。
実施例7:修飾型ヌクレオチド三リン酸の取り込みのための反応条件の最適化
2’−his−NH2−UTP、2’−NH2−CTP、2’−NH2−DAP、およびγGTPの組み合わせをいくつかの反応条件で(表7)、実施例9に記載する取り込みプロトコールを使用して試験した。結果が示すところによれば、試験したバッファー条件のうち、これらの修飾型ヌクレオチド三リン酸の取り込みはメタノールおよびLiClの両方の存在下で起こる。
2’−his−NH2−UTP、2’−NH2−CTP、2’−NH2−DAP、およびγGTPの組み合わせをいくつかの反応条件で(表7)、実施例9に記載する取り込みプロトコールを使用して試験した。結果が示すところによれば、試験したバッファー条件のうち、これらの修飾型ヌクレオチド三リン酸の取り込みはメタノールおよびLiClの両方の存在下で起こる。
実施例8:2’−デオキシ−2’−アミノ修飾したGTPおよびCTPを使用する新規の酵素的核酸分子モチーフの選択
新規の酵素的核酸分子モチーフの選択のために、酵素的核酸分子のプールを、2つの基質結合アーム(5および16ヌクレオチド長)および中間のランダムな領域を有するように設計した。基質は5’−末端のビオチン、プールの短い結合アームに相補的な5個のヌクレオチド、不対のG(所望の開裂部位)、およびプールの長い結合アームに相補的な16個のヌクレオチドを有する。基質はアビジン−ビオチン複合体によってカラム樹脂に結合する。選択の一般的な過程を図2に示す。以下に記載するプロトコールは酵素的核酸分子の選択に使用しうる1つの可能な方法を表し、コンビナトリアル・ライブラリーを用いる酵素的核酸分子の選択の非制限的例として提供する。
新規の酵素的核酸分子モチーフの選択のために、酵素的核酸分子のプールを、2つの基質結合アーム(5および16ヌクレオチド長)および中間のランダムな領域を有するように設計した。基質は5’−末端のビオチン、プールの短い結合アームに相補的な5個のヌクレオチド、不対のG(所望の開裂部位)、およびプールの長い結合アームに相補的な16個のヌクレオチドを有する。基質はアビジン−ビオチン複合体によってカラム樹脂に結合する。選択の一般的な過程を図2に示す。以下に記載するプロトコールは酵素的核酸分子の選択に使用しうる1つの可能な方法を表し、コンビナトリアル・ライブラリーを用いる酵素的核酸分子の選択の非制限的例として提供する。
ライブラリーの構築:以下に挙げるオリゴヌクレオチドをOperon Technologies(Alameda, CA)によって合成した。テンプレートをゲル精製した後、製造者のプロトコールに従ってSep−Pakカートリッジ(Waters, Millford MA)を通過させた。プライマー(MST3、MST7c、MST3del)は精製せずに使用した。
プライマー:
MST3(30量体):5’−CACTTAGCATTAACCCTCACTAAAGGCCGT−3’
MST7c(33量体):5’−TAATACGACTCACTATAGGAAAGGTGTGCAACC−3’
MST3del(18量体):5’−ACCCTCACTAAAGGCCGT−3’
テンプレート:
MSN60c(93量体):5’−ACCCTCACTAAAGGCCGT(N)60GGTTGCACACCTTTG−3’
MSN40c(73量体):5’−ACCCTCACTAAAGGCCGT(N)40GGTTGCACACCTTTG−3’
MSN20c(53量体):5’−ACCCTCACTAAAGGCCGT(N)20GGTTGCACACCTTTG−3’
プライマー:
MST3(30量体):5’−CACTTAGCATTAACCCTCACTAAAGGCCGT−3’
MST7c(33量体):5’−TAATACGACTCACTATAGGAAAGGTGTGCAACC−3’
MST3del(18量体):5’−ACCCTCACTAAAGGCCGT−3’
テンプレート:
MSN60c(93量体):5’−ACCCTCACTAAAGGCCGT(N)60GGTTGCACACCTTTG−3’
MSN40c(73量体):5’−ACCCTCACTAAAGGCCGT(N)40GGTTGCACACCTTTG−3’
MSN20c(53量体):5’−ACCCTCACTAAAGGCCGT(N)20GGTTGCACACCTTTG−3’
N60ライブラリーはMSN60cをテンプレート、MST3/MST7cをプライマーとして使用して構築した。N40およびN20ライブラリーはMSN40c(またはMSN20c)をテンプレート、MST3del/MST7cをプライマーとして使用して構築した。
1本鎖のテンプレートを以下のプロトコールによって2本鎖DNAに変換した:標準PCRバッファー、dNTP、およびtaq DNAポリメラーゼを使用した反応溶液10ml中に5nmolのテンプレート、10nmolの各プライマーを混合(試薬は全てBoerhinger Mannheimより入手)。合成サイクルの条件は94℃、4分間;(94℃、1分間;42℃、1分間;72℃、2分間)x4;72℃、10分間。生成物をアガロースゲルでチェックし、それぞれのフラグメントの長さを確認し(N60=123bp、N40=91bp、N20=71bp)、その後フェノール/クロロホルム抽出し、エタノール沈殿を行った。2本鎖生成物の濃度は25μMであった。
最初のプールの転写は以下を含有する1ml容量中:500pmolの2本鎖テンプレート(3x1014分子)、40mM トリス−HCl(pH8.0)、12mM MgCl2、1mM スペルミジン、5mM DTT、0.002% トリトンX−100、1mM LiCl、4% PEG8000、10% メタノール、2mM ATP(Pharmacia)、2mM GTP(Pharmacia)、2mM 2’−デオキシ−2’−アミノ−CTP(USB)、2mM 2’−デオキシ−2’−アミノ−UTP(USB)、5U/ml 無機ピロホスファターゼ(Sigma)、5U/μl T7 RNAポリメラーゼ(USB;場合によって、Y639F変異体を0.1mg/mlで使用した(SousaおよびPadilla、上記))、37℃で2時間実施した。転写したライブラリーを変性PAGEで精製し(N60=106ヌクレオチド、N40=74、N20=54)、得られた生成物をSep−Pakカラムを使用して脱塩した後、エタノール沈殿を行った。
最初のカラム選択:以下のビオチン化した基質を標準的なプロトコールを使用して合成した(Usmanら, 1987, J. Am. Chem. Soc., 109, 7845;Scaringeら, 1990, Nucleic Acids Res., 18, 5433;およびWincottら, 1995, Nucleic Acids Res., 23, 2677−2684):
5’−ビオチン−C18スペーサー−GCC GUG GGU UGC ACA CCU UUC C−C18スペーサー−チオール・モディファイアーC6S−S反転無塩基−3’
5’−ビオチン−C18スペーサー−GCC GUG GGU UGC ACA CCU UUC C−C18スペーサー−チオール・モディファイアーC6S−S反転無塩基−3’
基質を変性PAGEおよびエタノール沈殿で精製した。10nmolの基質を以下のプロトコールを使用してNeutrAvidinカラムに結合させた:400μl UltraLink固定化NeutrAvidinスラリー(200μl ビーズ、Pierce, Rockford, IL)をポリスチレンカラム(Pierce)に充填した。カラムを1mlの結合バッファー(20mM NaPO4(pH7.5)、150mM NaCl)で2回洗浄した後、キャップを閉じた(すなわちキャップをカラムの底に付けて流出を止めた)。結合バッファーに懸濁した基質200μlを適用し、溶液が樹脂に均一に結合および分配されるように時々ボルテックスで攪拌しながら室温で30分間インキュベートした。インキュベーション後、キャップを除去し、カラムを1mlの結合バッファー、次いで1mlのカラムバッファー(50mM トリス−HCl(pH8.5)、100mM NaCl、50mM KCl)で洗浄した。これでカラムはすぐに使用できる状態となり、キャップを閉じた。1nmolの最初のRNAプールを200μlのカラムバッファーでカラムに負荷した。時々ボルテックスで攪拌しながら室温で30分間インキュベートし、基質を結合させた。インキュベーション後、キャップを除去し、カラムを1mlのカラムバッファーで2回洗浄してキャップを閉じた。200μlの溶出バッファー(50mM トリス−HCl(pH8.5)、100mM NaCl、50mM KCl、25mM MgCl2)をカラムに適用し、時々ボルテックスで攪拌しながら室温で30分間インキュベートした。キャップを除去して4つの200μl画分を、溶出バッファーを使用して回収した。
第二のカラム(逆選択):第二のカラムにおける事象の図式を一般的に図3に示し、使用される基質オリゴヌクレオチドを以下に示す:
5’−GGU UGC ACA CCU UUC C−C18スペーサー−ビオチン反転無塩基−3’
5’−GGU UGC ACA CCU UUC C−C18スペーサー−ビオチン反転無塩基−3’
このカラム基質を前述のようにUltraLink NeutrAvidin樹脂に結合させ(40pmol)、溶出バッファーで2回洗浄した。第一のカラム精製からの溶出物を第二のカラムに適用した。このカラムを使用することにより、第一のカラムから非特異的に溶出された(diluted)RNAが結合し、一方、触媒事象を起こしてそれに結合した生成物を有するRNAは、第二のカラムを通過して流出する。キャリアーとしてグリコーゲンを使用して画分をエタノールで沈殿させ、増幅のために無菌水で再水和させた。
増幅:RNAおよびプライマーMST3(10−100pmol)を水中で、90℃で3分間変性させ、その後氷上で1分間急冷した。以下の試薬を試験管に添加した(最終濃度を示す):1X PCRバッファー(Boerhinger Mannheim)、1mM dNTP(PCRのために。Boerhinger Mannheim)、2U/μl RNアーゼ−阻害剤(Boerhinger Mannheim)、10U/μl Superscript II逆転写酵素(BRL)。反応液を42℃で1時間インキュベートし、その後95℃で5分間インキュベートしてSuperscriptを破壊した。次いで以下の試薬を試験管に添加し、PCR段階のために容量を5倍に増加させた(最終濃度/量を示す):MST7cプライマー(10−100pmol、RT段階と同じ量)、1X PCRバッファー、taq DNAポリメラーゼ(0.025−0.05 U/μl、Boerhinger Mannheim)。反応は以下のようなサイクルで行った:94℃、4分間;(94℃、30秒間;42−54℃、30秒間;72℃、1分間)x4−30サイクル;72℃、5分間;30℃、30分間。サイクル数およびアニール温度はラウンド毎に決定した。ヘテロデュプレックスが観察された場合、反応液をフレッシュな試薬で5倍に希釈し、更に2回の増幅サイクルを進行させた。得られた生成物をアガロースゲルでサイズについて分析し(N60=123bp、N40=103bp、N20=83bp)、その後エタノール沈殿を行った。
転写:増幅産物の転写は上記の条件に以下の変更を加えたものを使用して行った:10−20%の増幅反応液をテンプレートとして使用し、反応容量は100−500μlであり、生成物のサイズはわずかに異なった(N60=106ヌクレオチド、N40=86、N20=66)。少量の32P−GTPを定量目的で反応液に添加した。
以降のラウンド:以降の選択ラウンドには20pmolのインプットRNAおよび40pmolの22ヌクレオチド基質をカラムに使用した。
プールの活性:プールの活性を、3から4ラウンド毎に1回転(turnover)の条件下でアッセイした。活性アッセイ条件は以下の通りである:50mM トリス−HCl(pH8.5)、25mM MgCl2、100mM NaCl、50mM KCl、痕跡量の32P標識した基質、10nM RNAプール。バッファーに混合した2Xプール、およびバッファーに混合した2X基質を別々に90℃で3分間、次いで37℃で3分間インキュベートした。その後、等量の2X基質を2Xプールの試験管に添加した(t=0)。最初のアッセイの時点は4および24時間とした:5μlを除去し、8μlの冷STOPバッファー(96% ホルムアミド、20mM EDTA、0.05% ブロムフェニルブルー/キシレンシアノール)。サンプルを90℃で3分間加熱し、20%シーケンシング・ゲルに負荷した。Molecular Dynamics PhosphorimagerおよびImageQuaNTソフトウェアを使用して定量を行った。データを表8に示す。
オリゴヌクレオチドのプールからのサンプルをベクター中にクローニングし、標準的なプロトコールを使用してシーケンシングした(Sambrookら, 分子クローニング:実験マニュアル, Cold Spring Harbor Laboratory Press)。本出願に記載する方法を使用して、酵素的核酸分子を代表数のこれらのクローンから転写した。それぞれのプールからの個体をN60およびN40からのRNA開裂について試験するために、クローンからの酵素的核酸分子を、2mM MgCl2、pH7.5、10mM KClに混合した5/16基質と共に37℃でインキュベートした。表10のデータは、プールから単離された酵素的核酸分子がそれぞれに活性を有することを示している。
動力学活性:表10に示す酵素的核酸分子の動力学活性の測定は、酵素的核酸分子(10nM)を開裂バッファー(pH8.5、25mM MgCl2、100mM NaCl、50mM KCl)中で基質と共に37℃でインキュベートして行った。
マグネシウム依存性:N20の15ラウンド目のマグネシウム依存性を、MgCl2を変化させ、他の条件は一定に保持して(50mM トリス pH8.0、100mM NaCl、50mM KCl、1回転、10nM プール)試験した。データを表11に示すが、マグネシウム濃度が増加するほど活性が増加することを示している。
実施例9:2’−デオキシ−2’−(N−ヒスチジル)アミノUTP、2’−フルオロ−ATP、そして2’−デオキシ−2’−アミノCTPおよびGTPを使用する新規の酵素的核酸分子モチーフの選択
実施例8に記載した方法を、2’−デオキシ−2’−(N−ヒスチジル)アミノUTP、2’−フルオロ−ATP、そして2’−デオキシ−2’−アミノCTPおよびGTPを使用して反復した。しかしながら、最初のカラムにおいてMgCl2で開裂を誘引するのではなく、最初の無作為な修飾型RNAプールを以下のバッファー中で基質−樹脂に負荷した:5mM NaOAc pH5.2、1M NaCl、4℃。アンプルの洗浄後、樹脂を22℃とし、バッファーを20mM HEPES pH7.4、140mM KCl、10mM NaCl、1mM CaCl2、1mM MgCl2に変更した。N60オリゴヌクレオチドのある選択では、2価のカチオン(MgCl2、CaCl2)を使用しなかった。樹脂を10分間インキュベートして反応させ、溶出物を回収した。
実施例8に記載した方法を、2’−デオキシ−2’−(N−ヒスチジル)アミノUTP、2’−フルオロ−ATP、そして2’−デオキシ−2’−アミノCTPおよびGTPを使用して反復した。しかしながら、最初のカラムにおいてMgCl2で開裂を誘引するのではなく、最初の無作為な修飾型RNAプールを以下のバッファー中で基質−樹脂に負荷した:5mM NaOAc pH5.2、1M NaCl、4℃。アンプルの洗浄後、樹脂を22℃とし、バッファーを20mM HEPES pH7.4、140mM KCl、10mM NaCl、1mM CaCl2、1mM MgCl2に変更した。N60オリゴヌクレオチドのある選択では、2価のカチオン(MgCl2、CaCl2)を使用しなかった。樹脂を10分間インキュベートして反応させ、溶出物を回収した。
酵素的核酸分子プールは2価のカチオンの非存在下でも、存在する基質の1−3%を開裂する能力があり、バックグラウンド(修飾されたプールの非存在下)は0.2−0.4%であった。
実施例10:5−イミダゾ−ル酢酸2’−デオキシ−5’−三リン酸ウリジンの合成
5−ジニトロフェニルイミダゾール酢酸2’−デオキシウリジンヌクレオシド(80mg)を5mlのトリエチルリン酸にアルゴン下で攪拌しながら溶解し、反応混液を0℃まで冷却した。オキシ塩化リン(1.8当量、22ml)を0℃で反応混液に添加し、更に3アリコートを48時間の過程にわたって室温で添加した。次いで反応混液を無水MeCN(5ml)で希釈して0℃まで冷却し、その後トリブチルアミン(0.65ml)およびピロリン酸トリブチルアンモニウム(4.0当量、0.24g)を添加した。45分後、反応液を10mlのメチルアミン水で4時間クエンチングした。MeOH(3x)と共蒸発させた後、物質をDEAEセファデックス、次いでRPクロマトグラフィーで精製し、15mgの三リン酸を得た。
5−ジニトロフェニルイミダゾール酢酸2’−デオキシウリジンヌクレオシド(80mg)を5mlのトリエチルリン酸にアルゴン下で攪拌しながら溶解し、反応混液を0℃まで冷却した。オキシ塩化リン(1.8当量、22ml)を0℃で反応混液に添加し、更に3アリコートを48時間の過程にわたって室温で添加した。次いで反応混液を無水MeCN(5ml)で希釈して0℃まで冷却し、その後トリブチルアミン(0.65ml)およびピロリン酸トリブチルアンモニウム(4.0当量、0.24g)を添加した。45分後、反応液を10mlのメチルアミン水で4時間クエンチングした。MeOH(3x)と共蒸発させた後、物質をDEAEセファデックス、次いでRPクロマトグラフィーで精製し、15mgの三リン酸を得た。
実施例11:2’−(N−リシル)アミノ−2’−デオキシ−シチジン三リン酸の合成
2’−(N−リシル)アミノ−2’−デオキシ−シチジン(0.180g、0.22mmol)をリン酸トリエチル(2.00ml)にアルゴン下で溶解した。溶液を氷浴中で0℃まで冷却した。オキシ塩化リン(99.999%、3当量、0.0672mL)を溶液に添加し、反応液を0℃で2時間攪拌した。ピロリン酸トリブチルアンモニウム(4当量、0.400g)を3.42mLのアセトニトリルおよびトリブチルアミン(0.165mL)に溶解した。アセトニトリル(1mL)を一リン酸溶液に添加し、次いでピロリン酸溶液を滴加した。溶液は透明であった。反応液を室温まで温まらせた。45分間の攪拌後、メチルアミン(5mL)を添加し、反応液を室温で2時間攪拌した。2層の混合物となった(フラスコの底部に小さいビーズが存在した)。TLC(7:1:2 iPrOH:NH4OH:H2O)は三リン酸物質の様相を示した。溶液を濃縮し、水に溶解し、新たに調製したDEAEセファデックスA−25カラムに負荷した。カラムを0.6MまでのTEABバッファーのグラジエントで洗浄し、生成物は画分90−95に溶出した。画分をイオン交換HPLCで分析した。それぞれの画分は1つの三リン酸のピーク(約4.000分に溶出)を示した。画分を合一し、メタノールからポンプダウン(pumped down)してバッファー塩を除去し、15.7mgの生成物を得た。
2’−(N−リシル)アミノ−2’−デオキシ−シチジン(0.180g、0.22mmol)をリン酸トリエチル(2.00ml)にアルゴン下で溶解した。溶液を氷浴中で0℃まで冷却した。オキシ塩化リン(99.999%、3当量、0.0672mL)を溶液に添加し、反応液を0℃で2時間攪拌した。ピロリン酸トリブチルアンモニウム(4当量、0.400g)を3.42mLのアセトニトリルおよびトリブチルアミン(0.165mL)に溶解した。アセトニトリル(1mL)を一リン酸溶液に添加し、次いでピロリン酸溶液を滴加した。溶液は透明であった。反応液を室温まで温まらせた。45分間の攪拌後、メチルアミン(5mL)を添加し、反応液を室温で2時間攪拌した。2層の混合物となった(フラスコの底部に小さいビーズが存在した)。TLC(7:1:2 iPrOH:NH4OH:H2O)は三リン酸物質の様相を示した。溶液を濃縮し、水に溶解し、新たに調製したDEAEセファデックスA−25カラムに負荷した。カラムを0.6MまでのTEABバッファーのグラジエントで洗浄し、生成物は画分90−95に溶出した。画分をイオン交換HPLCで分析した。それぞれの画分は1つの三リン酸のピーク(約4.000分に溶出)を示した。画分を合一し、メタノールからポンプダウン(pumped down)してバッファー塩を除去し、15.7mgの生成物を得た。
実施例12:2’−デオキシ−2’−(L−ヒスチジン)アミノシチジン三リン酸
2’−[N−Fmoc,Nimid−ジニトロフェニル−ヒスチジル]アミノ−2’−シチジン(0.310g、4.04mmol)をアルゴン下でリン酸トリエチル(3ml)に溶解した。溶液を0℃まで冷却した。オキシ塩化リン(1.8当量、0.068mL)を溶液に添加し、冷凍庫で一晩保存した。翌朝TLC(10% MeOH/CH2Cl2)は多くの出発物質を示したため、更に1当量のPOCl3を添加した。2時間後、TLCはなおも出発物質を示した。トリブチルアミン(0.303mL)およびピロリン酸トリブチルアンモニウム(4当量、0.734g)を6.3mLのアセトニトリルに溶解したもの(滴加した)を一リン酸溶液に添加した。反応液を室温まで温まらせた。15分間の攪拌後、メチルアミン(10mL)を室温で添加し、攪拌を2時間継続した。TLC 7:1:2 iPrOH:NH4OH:H2O)は三リン酸物質の様相を示した。溶液を濃縮し、水に溶解し、DEAEセファデックスA−25カラムに負荷した。カラムを0.6MまでのTEABバッファーのグラジエントで洗浄し、生成物は画分170−179に溶出した。画分をイオン交換HPLCで分析した。それぞれの画分は1つの三リン酸のピーク(−6.77分に溶出)を示した。画分を合一し、メタノールからポンプダウンしてバッファー塩を除去し、17mgの生成物を得た。
2’−[N−Fmoc,Nimid−ジニトロフェニル−ヒスチジル]アミノ−2’−シチジン(0.310g、4.04mmol)をアルゴン下でリン酸トリエチル(3ml)に溶解した。溶液を0℃まで冷却した。オキシ塩化リン(1.8当量、0.068mL)を溶液に添加し、冷凍庫で一晩保存した。翌朝TLC(10% MeOH/CH2Cl2)は多くの出発物質を示したため、更に1当量のPOCl3を添加した。2時間後、TLCはなおも出発物質を示した。トリブチルアミン(0.303mL)およびピロリン酸トリブチルアンモニウム(4当量、0.734g)を6.3mLのアセトニトリルに溶解したもの(滴加した)を一リン酸溶液に添加した。反応液を室温まで温まらせた。15分間の攪拌後、メチルアミン(10mL)を室温で添加し、攪拌を2時間継続した。TLC 7:1:2 iPrOH:NH4OH:H2O)は三リン酸物質の様相を示した。溶液を濃縮し、水に溶解し、DEAEセファデックスA−25カラムに負荷した。カラムを0.6MまでのTEABバッファーのグラジエントで洗浄し、生成物は画分170−179に溶出した。画分をイオン交換HPLCで分析した。それぞれの画分は1つの三リン酸のピーク(−6.77分に溶出)を示した。画分を合一し、メタノールからポンプダウンしてバッファー塩を除去し、17mgの生成物を得た。
実施例13:修飾したNTP(クラスIモチーフ)を使用する新規の酵素的核酸分子モチーフのスクリーニング
出願人の最初のプールは3x1014の2’−アミノ−dCTP/2’−アミノ−dUTP RNAの個別配列を含有した。出願人は転写条件を最適化して、メタノールおよび塩化リチウムを含ませることによってRNA生成物の量を増加させた。2’−アミノ−デオキシヌクレオチドは選択の逆転写および増幅段階に干渉せずにヌクレアーゼ耐性を与える。出願人は、無作為な40ヌクレオチド領域で分離された、基質に相補的な2つの結合アームを有するようにプールを設計した。16量体の基質は5および10ヌクレオチド長の2つのドメインを有し、これらはプールに結合し、不対のグアノシンで分離されている。基質の5’−末端にはC18リンカーで結合したビオチンがある。これによって、カラム・フォーマットのNeutrAvidin樹脂への基質の結合が可能となった。所望の反応液は、マグネシウム補助因子の添加時に不対のGで開裂し、次いで5塩基対へリックスの不安定性によってカラムから解離させることである。詳細なプロトコールは以下の通りである:
出願人の最初のプールは3x1014の2’−アミノ−dCTP/2’−アミノ−dUTP RNAの個別配列を含有した。出願人は転写条件を最適化して、メタノールおよび塩化リチウムを含ませることによってRNA生成物の量を増加させた。2’−アミノ−デオキシヌクレオチドは選択の逆転写および増幅段階に干渉せずにヌクレアーゼ耐性を与える。出願人は、無作為な40ヌクレオチド領域で分離された、基質に相補的な2つの結合アームを有するようにプールを設計した。16量体の基質は5および10ヌクレオチド長の2つのドメインを有し、これらはプールに結合し、不対のグアノシンで分離されている。基質の5’−末端にはC18リンカーで結合したビオチンがある。これによって、カラム・フォーマットのNeutrAvidin樹脂への基質の結合が可能となった。所望の反応液は、マグネシウム補助因子の添加時に不対のGで開裂し、次いで5塩基対へリックスの不安定性によってカラムから解離させることである。詳細なプロトコールは以下の通りである:
酵素的核酸分子プールの調製:最初のプールのDNAを調製するために、以下のテンプレート・オリゴヌクレオチドをtaqポリメラーゼで充填して2本鎖DNAに変換した。(テンプレート=5'−ACC CTC ACT AAA GGC CGT(N)40 GGT TGC ACA CCT TTC−3';プライマー1=5'−CAC TTA GCA TTA ACC CTC ACT AAA GGC CGT−3';プライマー2=5'−TAA TAC GAC TCA CTA TAG GAA AGG TGT GCA ACC−3')。全てのDNAオリゴヌクレオチドはオペロン法によって合成した。テンプレートオリゴを変性PAGEおよびSep−Pakクロマトグラフィーカラム(Waters)で精製した。RNA基質オリゴは標準的な固相化学を使用し、変性PAGE、次いでエタノール沈殿で精製した。インビトロでの開裂アッセイのための基質は5’−末端をガンマ−32P−ATPおよびT4ポリヌクレオチドキナーゼで標識し、変性PAGE精製、次いでエタノール沈殿を行った。
5nmolのテンプレート、10nmolの各プライマー、および250Uのtaqポリメラーゼを、1X PCRバッファー(10mM トリス−HCl(pH8.3)、1.5mM MgCl2、50mM KCl)および0.2mMの各dNTPと共に10ml容量中で以下のようにインキュベートした:94℃、4分間;(94℃、1分間;42℃、1分間;72℃、2分間)を4サイクル;そして72℃、10分間。生成物を2% Separideアガロースゲルでサイズについて分析した後、フェノール緩衝液で2回、次いでクロロホルム−イソアミルアルコールで抽出し、エタノール沈殿を行った。500pモル(3x1014分子)のこのDNAを以下のように転写して最初のRNAプールを生成した。テンプレートDNAを40mM トリス−HCl(pH8.0)、12mM MgCl2、5mM ジチオトレイトール(DTT)、1mM スペルミジン、0.002% トリトンX−100、1mM LiCl、4% PEG−8000、10% メタノール、2mM ATP、2mM GTP、2mM 2’−アミノ−dCTP、2mM 2’−アミノ−dUTP、5U/ml 無機ピロホスファターゼ、および5U/μl T7 RNAポリメラーゼに室温で添加し、総容量を1mlとした。個々の反応液に痕跡量のアルファ−32P−GTPを検出のために含有させた。転写反応液を37℃で2時間インキュベートし、次いで等量のSTOPバッファー(94% ホルムアミド、20mM EDTA、0.05% ブロモフェノールブルー)を添加した。得られたRNAを6%変性PAGEゲル、Sep−Pakクロマトグラフィー、そしてエタノール沈殿で精製した。
最初の選択:2nmolの16量体5’−ビオチン化基質(5’−ビオチン−C18リンカー−GCC GUG GGU UGC ACA C−3’)を、結合バッファー(20mM NaPO4(pH7.5)、150mM NaCl)に混合したUltraLink固定化NeutrAvidin樹脂(400μlスラリー、Pierce)200μlに室温で30分間結合させた。得られた基質カラムを2mlの結合バッファー、次いで2mlのカラムバッファー(50mM トリスーHCl(pH8.5)、100mM NaCl、50mM KCl)で洗浄した。キャップして流出を止め、1000pmolの最初のプールRNAを200μlのカラムバッファーに混合したものをカラムに添加し、室温で30分間インキュベートした。カラムのキャップを除去し、2mlのカラムバッファーで洗浄した後、キャップをして流出を止めた。200μlの溶出バッファー(=カラムバッファー+25mM MgCl2)をカラムに添加し、室温で30分間インキュベートした。カラムのキャップを除去し、溶出物を回収した後、200μlの溶出バッファーで3回洗浄した。溶出物/洗浄液を、キャリアーとしてグリコーゲンを使用してエタノール沈殿し、50μlの無菌H2Oで再度水和した。溶出したRNAを標準的な逆転写/PCR増幅法で増幅した。5−31μlのRNAを20pmolのプライマー1と共に14μl容量で90℃3分間インキュベートした後、氷上に1分間放置した。以下の試薬を添加した(最終濃度を示す):1X PCRバッファー、1mMの各dNTP、2U/μl RNアーゼ阻害剤、10U/μl SuperScript II 逆転写酵素。反応液を42℃で1時間、次いで95℃で5分間インキュベートし、逆転写酵素を不活性化した。次いで容量を100μlに増加させるために水およびPCRのための試薬(1X PCRバッファー、20pmol プライマー2、および2.5U taqDNAポリメラーゼ)を添加した。Hybaid熱サイクラーで反応を行った:94℃、4分間;(94℃、30秒間;54℃、30秒間;72℃、1分間)x25;72℃、5分間。生成物をアガロースゲルでサイズによって分析し、エタノール沈殿を行った。PCR DNAの1/3から1/5を使用して、次の世代の転写を100μl容量で上記のように実施した。40pmolの基質を含有するカラムに20pmolのRNAを使用して連続ラウンドを行った。
2カラム選択:8世代目(G8)で、カラム選択を2カラム・フォーマットに変更した。200pmolの22量体5’−ビオチン化基質(5’−ビオチン−C18リンカー−GCC GUG GGU UGC ACA CCU UUC C−C18リンカー−チオール・モディフィアーC6 S−S反転無塩基−3’)を上記のように選択カラムに使用した。溶出を200μlの溶出バッファーで行い、次いで1mlの溶出バッファーで洗浄した。1200μlの溶出物を重力によって生成物トラップカラムを通過させた。生成物トラップカラムは以下のように調製した:200pmol 16量体5’−ビオチン化“生成物”(5’−GGU UGC ACA CCU UUC C−C18リンカー−ビオチン−3’)を上記のようにカラムに結合させ、カラムを溶出バッファーで平衡化した。生成物カラムからの溶出物を前記のように沈殿させた。生成物を上記のように増幅したが、ただし2.5倍多い容量で100pmolの各プライマーを使用した。100μlのPCR反応液をサイクル過程に使用した;残りの画分を、生成物に必要な最小限のサイクル回数で増幅した。3ラウンド後(G11)、1回転の開裂アッセイで明らかな活性があった。13世代目までに、45%の基質が4時間で開裂した;プールのkobsは25mM MgCl2中で0.037分-1であった。出願人は13世代目をサブクローニングおよびシーケンシングした;プールはまだ非常に多様であった。出願人の目的は生理学的条件下で作用する酵素的核酸分子なので、G13を網羅的に分析するのではなく選択圧を変化することにした。
N40プールの再選択を、G12 DNAから開始した。G12 DNAの一部を超変異導入PCRに適用し(Vartanianら, 1996, Nucleic Acids Research 24, 2627−2631)、部位当たり10%の頻度の変異を導入し、これをN40Hとした。19ラウンド目で、DNAの一部に再び超変異を導入し、N40MおよびN40HMを得た(計4つの平行するプール)。カラム基質は同じままであった:バッファーを変更し、結合および溶出の温度を37℃に上昇させた。カラムバッファーを生理学的バッファー(50mM トリス−HCl(pH7.5)、140mM KCl、10mM NaCl)で置き換え、溶出バッファーを1mM Mgバッファー(生理学的バッファー+1mM MgCl2)で置き換えた。プールをカラムに結合させる時間は最終的に10分間まで短縮し、溶出時間は徐々に30分から20秒に短縮した。18ラウンド目と23ラウンド目の間では、N40プールのkobsは0.035−0.04分-1で相対的に一定のままであった。4プールのそれぞれからの22世代目をクローニングおよびシーケンシングした。
クローニングおよびシーケンシング:13世代目および22世代目を、NovagenのPerfectly Blunt Cloningキット(pT7Blue−3ベクター)を使用してキットのプロトコールに従ってクローニングした。ベクター特異的プライマーを使用したPCR増幅によって、挿入物についてクローンをスクリーニングした。ABI Prism 7700配列検出システムおよびベクター特異的プライマーを使用して陽性クローンをシーケンシングした。配列はMacVectorソフトウェアを使用してアラインメントした;2次元の折りたたみはMulfoldソフトウェアを使用して行った(Zuker, 1989, Science 244, 48−52;Jaegerら, 1989, Biochemistry 86, 7706−7710;Jaegerら, 1989, R. F. Doolittle編, Methods in Enzymology, 183, 281−306)。個々のクローン転写ユニットをPCR増幅によって構築したが、これには50pmolのプライマー1およびプライマー2のそれぞれを1XPCRバッファーに混合したもの、0.2mMの各dNTP、そして2.5Uのtaqポリメラーゼを使用し、100μl容量で以下のようなサイクルで行った:94℃、4分間;(94℃、30秒間;54℃、30秒間;72℃、1分間)X20;72℃、5分間。転写ユニットをエタノール沈殿し、30μlのH2Oに再度水和し、10μlを100μl容量で転写し、前記のように精製した。
各プールからの36個のクローンをシーケンシングし、同じコンセンサス・モチーフの変種であることが観察された。独特なクローンを、1mM MgCl2および生理学的条件下で活性についてアッセイした;9個のクローンはコンセンサス配列を示し、その後の実験に使用した。活性が有意に上昇した変異は無かった;変異のほとんどはデュプレックスであると考えられる領域内であり、これは提案される2次構造に基づく。モチーフをより短くするために、出願人は増幅のためのプライマーに結合するのに必要な3’−末端の25ヌクレオチドを削除した。完全長の分子および端を切断した分子の速度を測定したところ、どちらも0.04分-1であった;従ってモチーフのサイズを86から61ヌクレオチドに減少させることができた。分子を更に一層短くするためにステム・ループ構造並びに基質認識アームの塩基対を切断し、48ヌクレオチドの分子を得た。更に、多くのリボヌクレオチドを2−O−メチル修飾型ヌクレオチドで置換して分子を安定化した。新しいモチーフの例を図4に示す。当業者に認識されるように、分子は図に示す化学修飾に限定されず、図は1つの可能性のある化学修飾型分子を示しているにすぎない。
反応速度分析
一回転の反応速度を、痕跡量の5’−32P−標識した基質および10−1000nMの酵素的核酸分子のプールで行った。1X バッファーに混合した2X 基質および1X バッファーに混合した2X プール/酵素的核酸分子を別々に90℃で3分間インキュベートした後、37℃まで3分間平衡化した。等量の2X 基質をプール/酵素的核酸分子にt0で添加し、反応液を37℃でインキュベートした。各時点において、氷上、1.2容量のSTOPバッファー中でクエンチングした。サンプルを90℃で3分間加熱した後、15%シーケンシング・ゲルで分離した。PhosphorImagerを使用してゲルをイメージ化し、ImageQuantソフトウェア(Molecular Dynamics)を使用して定量した。曲線はほとんどの場合、二重指数減衰(double−exponential decay)に適合したが、いくつかの曲線は直線への適合が必要であった。
一回転の反応速度を、痕跡量の5’−32P−標識した基質および10−1000nMの酵素的核酸分子のプールで行った。1X バッファーに混合した2X 基質および1X バッファーに混合した2X プール/酵素的核酸分子を別々に90℃で3分間インキュベートした後、37℃まで3分間平衡化した。等量の2X 基質をプール/酵素的核酸分子にt0で添加し、反応液を37℃でインキュベートした。各時点において、氷上、1.2容量のSTOPバッファー中でクエンチングした。サンプルを90℃で3分間加熱した後、15%シーケンシング・ゲルで分離した。PhosphorImagerを使用してゲルをイメージ化し、ImageQuantソフトウェア(Molecular Dynamics)を使用して定量した。曲線はほとんどの場合、二重指数減衰(double−exponential decay)に適合したが、いくつかの曲線は直線への適合が必要であった。
安定性:血清安定性アッセイを先に記載されているように実施した(Beigelmanら, 1995, J. Biol. Chem. 270, 25702−25708)。1μgの5’−32P−標識した合成の酵素的核酸分子を13μlの非標識物質に添加し、ヒト血清における減衰についてアッセイした。ゲルおよび定量は反応速度の項に記載した通りである。
実施例14:新しいモチーフを使用するHCVの阻害
HCV感染の際、ウィルスRNAはいくつかの過程、すなわち、脱外被、翻訳、RNAの複製、およびパッケージングにおいて、酵素的核酸分子開裂の潜在的な標的として存在する。標的RNAは、これらの段階のいずれか一つで酵素的核酸分子開裂により高度に、またはより少なく利用されうる。HCVの開始リボソーム進入部位(IRES)と翻訳装置との会合はHCVの5’UTR/ルシフェラーゼ・レポーター系において擬態されるが(実施例9)、これらの他のウィルスの過程はOST7系に表れない。得られるRNA/タンパク質複合体が標的ウィルスRNAと会合したものも存在しない。更に、これらの過程はHCV感染細胞において連結し、標的RNAの利用のしやすさに強い影響を与えるであろう。従って、出願人はHCVの5’−UTRを開裂するように設計した酵素的核酸分子がウィルスの複製システムに影響を与えるかどうかを試験した。
HCV感染の際、ウィルスRNAはいくつかの過程、すなわち、脱外被、翻訳、RNAの複製、およびパッケージングにおいて、酵素的核酸分子開裂の潜在的な標的として存在する。標的RNAは、これらの段階のいずれか一つで酵素的核酸分子開裂により高度に、またはより少なく利用されうる。HCVの開始リボソーム進入部位(IRES)と翻訳装置との会合はHCVの5’UTR/ルシフェラーゼ・レポーター系において擬態されるが(実施例9)、これらの他のウィルスの過程はOST7系に表れない。得られるRNA/タンパク質複合体が標的ウィルスRNAと会合したものも存在しない。更に、これらの過程はHCV感染細胞において連結し、標的RNAの利用のしやすさに強い影響を与えるであろう。従って、出願人はHCVの5’−UTRを開裂するように設計した酵素的核酸分子がウィルスの複製システムに影響を与えるかどうかを試験した。
近年、LuおよびWimmerはHCV−ポリオウィルス・キメラを特性決定したが、これはポリオウィルスのIRESがHCV由来のIRESで置換されたものである(LuおよびWimmer, 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 1412−1417)。ポリオウィルス(PV)はHCVと同様、ポジティブ鎖RNAウィルスであるが、HCVとは異なり、エンベロープを有さず、培養細胞中で効率的に複製する。HCV−PVキメラは、野生型PVに比較して安定な小型プラークの表現型を発現する。
新規の酵素的核酸分子モチーフが細胞内でHCV RNAを阻害する能力を試験するために、ホタルおよびウミシイタケ・ルシフェラーゼの両方を利用するデュアル・レポーター・システムを使用した(図5)。新規のクラスIモチーフを有する多くの酵素的核酸分子を設計し、試験した(表XII)。5’HCV UTR領域を標的とする新規の酵素的核酸分子モチーフは、開裂の際に転写産物のルシフェラーゼへの翻訳を阻害しうる。OST−7細胞を、10%ウシ胎仔血清、1% ペニシリン/ストレプトマイシン、および1% L−グルタミンを含有するDMEM培養液中、黒色96ウェルプレート(Packard)にウェル当たり12,500細胞で播種し、37℃で一晩インキュベートした。5’−HCV UTRを発現するT7プロモーターおよびホタル・ルシフェラーゼを含有するプラスミド(T7C1−341(Wangら, 1993, J. of Virol. 67, 3338−3344))をpRLSV40 ウミシイタケ対照プラスミド(Promega社)と、次いで酵素的核酸分子およびカチオン脂質と混合し、5X濃度の試薬を調製した(T7C1−341(4μg/ml)、pRLSV40 ウミシイタケ・ルシフェラーゼ対照(6μg/ml)、酵素的核酸分子(250nM)、トランスフェクション試薬(28.5μg/ml)。
複合体混合物を37℃で20分間インキュベートした。培地を細胞から除去し、120μlのOpti−mem培地をウェルに添加し、次いで30μlの5X 複合体混合物を添加した。150μlのOpti−memを、未処理の細胞の入ったウェルに添加した。複合体混合物をOST−7細胞上で4時間インキュベートし、受動溶菌バッファー(Promega社)で溶菌し、デュアル・ルシフェラーゼ・アッセイキットを使用し、製造者のプロトコールを使用して(Promega社)蛍光シグナルを定量した。図6に示すデータはHCV RNAの部位146を標的とする酵素的核酸分子の用量曲線であり、ホタルおよびウミシイタケ・ルシフェラーゼ蛍光間の比として表している。酵素的核酸分子は全ての酵素的核酸分子濃度でHCV RNAの量を低下することができ、IC50は約5nMとなった。他の部位も有効であり(図7)、特に133、209、および273を標的とする酵素的核酸分子は無関係な(IRR)対照に比較してHCV RNAを低下させることができた。
実施例15:完全に修飾したオリゴヌクレオチドを使用する基質の開裂
すべての2’位を修飾した酵素的核酸分子が標的RNAを開裂する能力を試験し、いずれのリボヌクレオチド部位が必要であるのかどうかを確認した。リボザイムを2’−O−メチルおよび2’−アミノ(NH2)修飾したヌクレオチドで構築し(表12;遺伝子名:リボなし)、反応速度分析を実施例13に記載するようにして行った。100nMの酵素的核酸を痕跡量の基質と、1mM MgCl2の存在下で生理学的条件(37℃)で混合した。リボなしヌクレオチドはリボヌクレオチドを含有する表12(リボ)に示す酵素的核酸分子に比較して0.13のKrelを有する。
すべての2’位を修飾した酵素的核酸分子が標的RNAを開裂する能力を試験し、いずれのリボヌクレオチド部位が必要であるのかどうかを確認した。リボザイムを2’−O−メチルおよび2’−アミノ(NH2)修飾したヌクレオチドで構築し(表12;遺伝子名:リボなし)、反応速度分析を実施例13に記載するようにして行った。100nMの酵素的核酸を痕跡量の基質と、1mM MgCl2の存在下で生理学的条件(37℃)で混合した。リボなしヌクレオチドはリボヌクレオチドを含有する表12(リボ)に示す酵素的核酸分子に比較して0.13のKrelを有する。
実施例16:新規の酵素的核酸分子モチーフ(クラスIIモチーフ)のスクリーニング
選択は>1014の以下の配列の修飾型RNAのプールで開始した:5’−GGGAGGAGGAAGUGCCU(N)35UGCCGCGCUCGCUCCCAGUCC−3’。Rui Souzaによって調製された変異体T7 Y639F RNAポリメラーゼを使用してRNAを酵素的に生成した。以下の修飾型NTPを導入した:2’−デオキシ−2’−フルオロ−アデニン三リン酸、2’−デオキシ−2’−フルオロ−ウリジン三リン酸または2’−デオキシ−2’−フルオロ−5−[(N−イミダゾール−4−アセチル)プロピルアミン]ウリジン三リン酸、および2’−デオキシ−2’−アミノ−シチジン三リン酸;天然型グアニジン三リン酸を全ての選択に使用し、アルファ−32P−GTPを使用してプールのRNAを標識できるようにした。RNAプールを、変性ゲル電気泳動(8% ポリアクリルアミド 7M 尿素)で精製した。
選択は>1014の以下の配列の修飾型RNAのプールで開始した:5’−GGGAGGAGGAAGUGCCU(N)35UGCCGCGCUCGCUCCCAGUCC−3’。Rui Souzaによって調製された変異体T7 Y639F RNAポリメラーゼを使用してRNAを酵素的に生成した。以下の修飾型NTPを導入した:2’−デオキシ−2’−フルオロ−アデニン三リン酸、2’−デオキシ−2’−フルオロ−ウリジン三リン酸または2’−デオキシ−2’−フルオロ−5−[(N−イミダゾール−4−アセチル)プロピルアミン]ウリジン三リン酸、および2’−デオキシ−2’−アミノ−シチジン三リン酸;天然型グアニジン三リン酸を全ての選択に使用し、アルファ−32P−GTPを使用してプールのRNAを標識できるようにした。RNAプールを、変性ゲル電気泳動(8% ポリアクリルアミド 7M 尿素)で精製した。
以下の標的RNA(樹脂A)を合成し、Iodoacetyl Ultralink樹脂(Pierce)に製造者の方法に従って結合させた:5’−b−L−GGACUGGGAGCGAGCGCGGCGCAGGCACUGAAG−L−S−B3’;式中、bはビオチン(Glenn Research カタログ#10−1953−nn)、Lはポリエチレングリコール・スペーサー(Glenn Research カタログ#10−1918−nn)、Sはチオール・モディファイアーC6 S−S(Glenn Research カタログ#10−1936−nn)、Bは標準的な反転デオキシ無塩基。
バッファーA(20mM HEPES pH7.4、140mM KCl、10mM NaCl)に混合した5μMの樹脂A 100μlにRNAプールを添加し、22℃で5分間インキュベートした。次いで温度を37℃まで10分間上昇させた。樹脂を5mlのバッファーAで洗浄した。バッファーB(20mM HEPES pH7.4、140mM KCl、10mM NaCl、1mM MgCl2、1mM CaCl2)を添加して反応を開始させた。第一世代で20分間インキュベーションを継続し、逐次低下させて最終世代で1分間とした;合計13世代。反応溶出物を5M NaCl中に回収し、最終濃度2MのNaClを得た。これに100μlの50% スラリーUltralink NeutraAvidin(Pierce)を添加した。22℃で20分間インキュベートし、開裂したビオチン生成物をアビジン樹脂に結合させた。次いで樹脂を5mlの20mM HEPES pH7.4、2M NaClで洗浄した。1.2mlの変性洗浄液 1M NaCl、10M 尿素により、94℃で10分間にわたって所望のRNAを除去した。RNAを0.3M酢酸ナトリウム中で2回沈殿させ、逆転写を阻害するCl-イオンを除去した。標準的なプロトコールの逆転写およびPCR増幅を実施した。RNAを上記の修飾型NTPで再び転写した。13世代後、クローニングおよびシーケンシングにより、標的基質を開裂できる14の配列を得た。6配列を特性決定し、二次構造および開裂反応速度を求めた。構造および反応速度のデータを図8に示す。他の8個の酵素的核酸分子の配列を表XIIIに示す。これらの分子のサイズ、配列、および化学組成は、上記の実施例13および当業者に周知のように修飾することができる。
核酸触媒の操作
クラスIおよびクラスII酵素的核酸分子の配列、化学、および構造変異体を、本出願に示す方法および当該分野で知られる方法を使用して操作および再操作することができる。例えばクラスIおよびクラスII酵素的核酸分子のサイズは当該分野で知られる方法(Zaugら, 1986, Nature, 324, 429;Ruffnerら, 1990, Biochem, 29, 10695;Beaudryら, 1990, Biochem., 29, 6534;McCallら, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 5710;Longら, 1994, 上記;Hendryら, 1994, BBA 1219, 405;Benselerら, 1993, JACS, 115, 8483;Thompsonら, 1996, Nucl. Acids Res., 24, 4401;Michelsら, 1995, Biochem., 34, 2965;Beenら, 1992, Biochem., 31, 11843;Guoら, 1995, EMBO. J., 14,368;Panら, 1994, Biochem., 33, 9561;Cech, 1992, Curr. Op. Struc. Bio., 2, 605;Sugiyamaら, 1996, FEBS Lett., 392, 215;Beigelmanら, 1994, Bioorg. Med. Chem., 4, 1715;Santoroら, 1997, PNAS 94, 4262;全て、その全体を本明細書の一部としてここに引用する)によって、リボザイムの全触媒活性が有意に低下しない程度まで小さく、あるいは大きくすることができる。
クラスIおよびクラスII酵素的核酸分子の配列、化学、および構造変異体を、本出願に示す方法および当該分野で知られる方法を使用して操作および再操作することができる。例えばクラスIおよびクラスII酵素的核酸分子のサイズは当該分野で知られる方法(Zaugら, 1986, Nature, 324, 429;Ruffnerら, 1990, Biochem, 29, 10695;Beaudryら, 1990, Biochem., 29, 6534;McCallら, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 5710;Longら, 1994, 上記;Hendryら, 1994, BBA 1219, 405;Benselerら, 1993, JACS, 115, 8483;Thompsonら, 1996, Nucl. Acids Res., 24, 4401;Michelsら, 1995, Biochem., 34, 2965;Beenら, 1992, Biochem., 31, 11843;Guoら, 1995, EMBO. J., 14,368;Panら, 1994, Biochem., 33, 9561;Cech, 1992, Curr. Op. Struc. Bio., 2, 605;Sugiyamaら, 1996, FEBS Lett., 392, 215;Beigelmanら, 1994, Bioorg. Med. Chem., 4, 1715;Santoroら, 1997, PNAS 94, 4262;全て、その全体を本明細書の一部としてここに引用する)によって、リボザイムの全触媒活性が有意に低下しない程度まで小さく、あるいは大きくすることができる。
当業者はここに記載するインビトロ選択戦略の更なるラウンドおよびその変法を使用して更なる核酸触媒を得ることができ、そのような新規の触媒も本発明の範囲内である。
適用
本発明に記載するNTPの使用法にはいくつかの研究および市販への適用がある。これらの修飾型ヌクレオチド三リン酸を、新規の機能を有するオリゴヌクレオチドのインビトロ選択(発展)に使用できる。インビトロ選択プロトコールの例を本明細書の一部としてここに引用する(Joyce, 1989, Gene, 82, 83−87;Beaudryら, 1992, Science 257, 635−641;Joyce, 1992, Scientific American 267, 90−97;Breakerら, 1994, TIBTECH 12, 268;Bartelら, 1993, Science 261:1411−1418;Szostak, 1993, TIBS 17, 89−93;Kumarら, 1995, FASEB J., 9, 1183;Breaker, 1996, Curr. Op. Biotech., 7, 442)。
本発明に記載するNTPの使用法にはいくつかの研究および市販への適用がある。これらの修飾型ヌクレオチド三リン酸を、新規の機能を有するオリゴヌクレオチドのインビトロ選択(発展)に使用できる。インビトロ選択プロトコールの例を本明細書の一部としてここに引用する(Joyce, 1989, Gene, 82, 83−87;Beaudryら, 1992, Science 257, 635−641;Joyce, 1992, Scientific American 267, 90−97;Breakerら, 1994, TIBTECH 12, 268;Bartelら, 1993, Science 261:1411−1418;Szostak, 1993, TIBS 17, 89−93;Kumarら, 1995, FASEB J., 9, 1183;Breaker, 1996, Curr. Op. Biotech., 7, 442)。
更に、これらの修飾型ヌクレオチド三リン酸を使用して修飾型オリゴヌクレオチドのコンビナトリアル化学ライブラリーを作成することができる。この技術に関するいくつかの文献があり(Brennerら, 1992, PNAS 89, 5381−5383, Eaton, 1997, Curr. Opin. Chem. Biol., 1, 10−16)、それらは全て本明細書の一部としてここに引用する。
診断用途
本発明の酵素的核酸分子を診断手段として使用し、疾病に罹患した細胞内の遺伝的浮動および変異を検査する、または細胞において特定のRNAの存在を検出してもよい。酵素的核酸分子の活性と標的RNAの構造間の密接な関係により、分子のいずれの領域においても、標的RNAの塩基対形成および3次元構造を変更する変異を検出することができる。本発明に記載する酵素的核酸分子を複数使用することにより、インビトロ並びに細胞および組織におけるRNAの構造および機能に重要なヌクレオチド変化をマッピングしうる。酵素的核酸分子による標的RNAの開裂を使用して遺伝子の発現を阻害し、疾病の進行における特定の遺伝子産物の役割を(本質的に)明らかにしうる。このような方法で、他の遺伝子標的を疾病の重要な介在物として明らかにしうる。これらの実験により、併用療法の可能性を与えることによって疾病の進行のよりよい治療ができるようになる(例えば、異なる遺伝子を標的とする複数の酵素的核酸分子、既知の小型分子阻害剤に結合させた酵素的核酸分子、酵素的核酸分子および/または他の化学もしくは生物分子の組み合わせによる放射線もしくは間欠治療)。本発明の酵素的核酸分子の他のインビトロにおける使用は当業者に周知であり、関連する症状に関係するmRNAの存在の検出がある。そのようなRNAの検出は、標準的な方法論を使用して酵素的核酸分子で処理した後、開裂産物の存在を確認することによって行う。
本発明の酵素的核酸分子を診断手段として使用し、疾病に罹患した細胞内の遺伝的浮動および変異を検査する、または細胞において特定のRNAの存在を検出してもよい。酵素的核酸分子の活性と標的RNAの構造間の密接な関係により、分子のいずれの領域においても、標的RNAの塩基対形成および3次元構造を変更する変異を検出することができる。本発明に記載する酵素的核酸分子を複数使用することにより、インビトロ並びに細胞および組織におけるRNAの構造および機能に重要なヌクレオチド変化をマッピングしうる。酵素的核酸分子による標的RNAの開裂を使用して遺伝子の発現を阻害し、疾病の進行における特定の遺伝子産物の役割を(本質的に)明らかにしうる。このような方法で、他の遺伝子標的を疾病の重要な介在物として明らかにしうる。これらの実験により、併用療法の可能性を与えることによって疾病の進行のよりよい治療ができるようになる(例えば、異なる遺伝子を標的とする複数の酵素的核酸分子、既知の小型分子阻害剤に結合させた酵素的核酸分子、酵素的核酸分子および/または他の化学もしくは生物分子の組み合わせによる放射線もしくは間欠治療)。本発明の酵素的核酸分子の他のインビトロにおける使用は当業者に周知であり、関連する症状に関係するmRNAの存在の検出がある。そのようなRNAの検出は、標準的な方法論を使用して酵素的核酸分子で処理した後、開裂産物の存在を確認することによって行う。
特定の例では、標的RNAの野生型または変異型のみしか開裂できない酵素的核酸分子をアッセイに使用する。第一の酵素的核酸分子を使用してサンプル中の野生型RNAの存在を確認し、第二の酵素的核酸分子はサンプル中の変異型RNAを同定するのに使用する。反応対照として野生型および変異型の両方のRNAの合成基質を両方の酵素的核酸分子で開裂し、反応における酵素的核酸分子の相対効率および“非標的”RNA種を開裂しないことを明らかにする。合成基質からの開裂産物はサンプル集団中の野生型および変異型RNAの分析のためのサイズマーカーの生成にも役立つ。従ってそれぞれの分析は2つの酵素的核酸分子、2つの基質、および1つの未知のサンプルを必要とし、これらを組み合わせて6つの反応を行う。開裂産物の存在をRNアーゼ・プロテクション・アッセイを使用して確認し、各RNAの完全長および開裂フラグメントをポリアクリルアミドゲルの1レーンで分析できるようにする。標的細胞における変異体RNAの発現および所望の表現型の変化の推定されるリスクへの洞察を得るために、結果を必ずしも定量する必要はない。そのタンパク質産物が表現型の発生に関係するようなmRNAの発現はリスクを確立するのに十分である。同等の比活性のプローブを両方の転写産物に使用すれば、RNAレベルの定性的比較で十分であり、初期の診断のコストが低減する。RNAレベルを定性的に比較するにしても定量的に比較するにしても、より高い変異型と野生型の比率はより高いリスクと相関関係がある。
更なる使用法
本発明の配列特異的酵素的核酸分子の潜在的な有用性は、RNAの研究のための多くの同様の適用を有し、これはDNA制限ヌクレアーゼがDNAの研究のために有するものである(Nathansら, 1975 Ann. Rev. Biochem. 44:273)。例えば、制限フラグメントのパターンを使用して2つの関連するRNA間の配列の関係を確立することができ、大型のRNAは研究のために有用なサイズのフラグメントに特異的に開裂できる。酵素的核酸分子の配列特異性を操作できることは未知の配列のRNAの開裂に理想的である。出願人は、細菌、微生物、真菌、ウィルス、および真核系(植物または哺乳動物細胞を含む)における標的遺伝子の遺伝子発現を抑制的に調節するための核酸分子の使用について記載する。
本発明の配列特異的酵素的核酸分子の潜在的な有用性は、RNAの研究のための多くの同様の適用を有し、これはDNA制限ヌクレアーゼがDNAの研究のために有するものである(Nathansら, 1975 Ann. Rev. Biochem. 44:273)。例えば、制限フラグメントのパターンを使用して2つの関連するRNA間の配列の関係を確立することができ、大型のRNAは研究のために有用なサイズのフラグメントに特異的に開裂できる。酵素的核酸分子の配列特異性を操作できることは未知の配列のRNAの開裂に理想的である。出願人は、細菌、微生物、真菌、ウィルス、および真核系(植物または哺乳動物細胞を含む)における標的遺伝子の遺伝子発現を抑制的に調節するための核酸分子の使用について記載する。
本明細書で言及する特許および出版物は全て、本発明が属する分野の技術者のレベルを示すものである。本明細書で引用する参考文献は全て、それぞれの参考文献が個別にその全体を参照によって組み込まれたように同じ程度まで、参照により本明細書の一部として組み込まれる。
当業者に容易に評価されるように、本発明は目的を実施し、言及した結果及び利点、並びにそれに固有のものを得るために十分である。現在の好ましい態様の代表例としてここに記載する方法および組成物は例証であり、本発明の範囲を制限することを意図するものではない。その変更および他の使用法が当業者に着想されるであろうが、これは本発明の意図に含まれ、請求項の範囲で定義される。
当業者に容易に明らかなように、種々の置換および修飾を、本発明の範囲および意図から逸脱することなくここに開示する本発明に施与してもよい。従ってそのような更なる態様は本発明および上記の請求項の範囲内である。
ここに適切に例証的に記載する本発明を、要素、制限(ここに特に記載はしない)の非存在下で実施してもよい。従って、例えばここでのそれぞれの例で、“を含む”、“本質的に・・・から成る”、および“から成る”という用語のいずれかを他の2つのいずれかで置き換えてもよい。使用した用語および表現は説明に関係して使用するものであり、制限ではなく、そのような用語および表現の使用において表示および記載される特徴の同等物またはその一部を除外することを意図するものではなく、理解されるように種々の修飾が請求する本発明の範囲内で可能である。従って、本発明は好ましい態様で明確に開示したが、ここに開示するコンセプトの任意の特性、修飾、および変法に当業者が頼ってもよく、そのような修飾および変法が明細書および付帯の請求項に定義されるような本発明の範囲内であると考慮されることは理解されるべきである。
更に、本発明の特徴または観点をマーカッシュのグループまたはそれに代わる他のグループの見地から記載する場合、当業者に認識されるように本発明はマーカッシュのグループまたは他のグループの個々のメンバーまたはメンバーのサブグループの見地からも記載される。
従って更なる態様は本発明の範囲および上記の請求項に含まれる。
Claims (12)
- オリゴヌクレオチド内に修飾ヌクレオチド三リン酸を取り込ませる方法であって、前記オリゴヌクレオチド内への修飾ヌクレオチド三リン酸の取り込みに適した条件下、修飾ヌクレオチド三リン酸を、核酸鋳型,RNAポリメラーゼ酵素,および修飾ヌクレオチド三リン酸取り込みの促進剤を含む混合物と接触させる工程を含む方法。
- 前記RNAポリメラーゼがT7RNAポリメラーゼである、請求項1記載の方法。
- 前記RNAポリメラーゼが変異体T7RNAポリメラーゼである、請求項1記載の方法。
- 前記RNAポリメラーゼがSP6RNAポリメラーゼである、請求項1記載の方法。
- 前記RNAポリメラーゼが変異体SP6RNAポリメラーゼである、請求項1記載の方法。
- 前記RNAポリメラーゼがT3RNAポリメラーゼである、請求項1記載の方法。
- 前記RNAポリメラーゼが変異体T3RNAポリメラーゼである、請求項1記載の方法。
- 前記修飾ヌクレオチド三リン酸の取り込みの促進剤が、LiCl,メタノール,ポリエチレングリコール,ジエチルエーテル,プロパノール,メチルアミン,およびエタノールからなる群より選択される、請求項1記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドがRNAである、請求項1記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドが酵素的核酸分子である、請求項1記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドがアプタマーである、請求項1記載の方法。
- 修飾ヌクレオチド三リン酸が、式I:
を有する、請求項1記載の方法。
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