JP2001525667A - Ｃ−ｒａｆの発現レベルに関係した疾患または状態の酵素核酸処置 - Google Patents

Ｃ−ｒａｆの発現レベルに関係した疾患または状態の酵素核酸処置

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Abstract

(57)【要約】 Ｒａｆ遺伝子の発現を調節する核酸触媒、核酸触媒の輸送、スクリーニング、同定、合成、脱保護、精製の方法、および核酸分子を同定する方法が記載される。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｃ−ＲＡＦの発現レベルに関係した疾患または状態の酵素核酸処置発明の背景 本発明は、ｒａｆ遺伝子の発現レベルに関係した疾患または状態の処置のため の方法および試薬に関する。 次は、関連技術の考察であり、本発明の先行技術であると認められるものでは ない。 セリン／トレオニンキナーゼのＲａｆファミリーは、種々の成長因子受容体の 活性化に応答してマイトジエンシグナルを伝達する細胞質シグナリングタンパク 質として機能する（概説については、Daum，1994 Trends in Biochem.Sci.19,47 4；Katz，1997,Curr.Opin.Genet.Devel．7,75；Marais，1996，Cancer Surveys 27；Naumann，1997,Cancer Res．143,237を参照されたい）。ｃ−Ｒａｆは、ネ ズミ肉腫ウイルス３６１１の形質転換因子であるｖ−Ｒａｆの細胞性同族体であ る。Ｒａｆファミリーは、脊椎動物の３種類の高度に保存されたアイソザイム、 すなわち、全ての組織で構成性発現されるｃ−Ｒａｆ−１、泌尿生殖器組織で発 現されるＡ−Ｒａｆ、および大脳および精巣で発現されるＢ−Ｒａｆから成る（ Storm,1990,Oncogene 5,345）。細胞成長および分化に関与するこれら鍵遺伝子 の不適切な発現は、制御されない細胞増殖および／または損傷したＤＮＡの伝播 を引起こして、癌、再狭窄、乾癬および慢性関節リウマチなどの高増殖性障害を もたらすことがありうる。 Ｒａｆは、細胞シグナル伝達経路に関与する小ＧＤＰ／ＧＴＰ結合性タンパク 質のクラスのメンバーであるＲａｓの主な下流エフェクターの一つである（図３ ５；Marshall,1995,Molec.Reprod.Devel.,42,493）。適切なマイトジェンシグナ ルは、ＧＴＰ結合Ｒａｓのレベルを増加させる。そのＧＴＰ結合活性状態におい て、ＲａｓはＲａｆを結合し、形質膜にそれを局在化させる。これは、Ｒａｆキ ナーゼ活性の活性化を引起こす。活性化したＲａｆは、次に、ＭＥＫをリン酸化 し、それによってＭＡＰキナーゼシグナリングカスケードを活性化させて、細胞 周期進行をもたらす。Ｒａｆのアミノ末端切断は、構成的に活性なタンパク質 をもたらす。構成的に活性なＲａｆかまたは構成的に活性なＭＥＫの発現は、線 維芽細胞の癌遺伝子形質転換に充分である(Cowley,1994,Cell 77,81;Mansour,19 94,Science 265,966;Kolch,1991,Nature 349,426)。正常細胞の場合、Ｒａｆの 発現レベルは、細胞形質転換において制限されている（Cuadrado，1993，Oncoge ne 8,2443）。タンパク質のＲａｓおよびＲａｆファミリーが細胞シグナル伝達 経路中に存在する中枢の位置は、正常細胞成長の制御におけるそれらの重要性を 強調している。 哺乳動物細胞でのＲａｆの活性化は、種々の成長因子およびサイトカインによ って引起こされる。Ｒａｆ活性化は、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、エンドセ リンまたはホルボールエステルによって刺激された心臓筋細胞培養物で認められ た（Bogoyevitch,1995,J.Biol.Chem.270,1）。活性化は、ボンベシンおよび血小 板由来成長因子（Mitchell,1995,J.Biol.Chem.270,8623）またはコロニー刺激因 子若しくはリポ多糖（Reimann，1994，J.Immun．153,398）で処理されたSwiss ３Ｔ３細胞において、インスリン様成長因子で刺激されたＬ６筋芽細胞において （Cross,1994,Biochem J.303,21）、更には、免疫グロブリン受容体によって刺 激されたＢ細胞において（Kumar,1995,Biochem J.307,215）も認められた。 Ｒａｓ／Ｒａｆ経路が細胞運動性にも関与しうることを示唆する多数の実験室 からの証拠が増えている（Bar-SagiおよびFeramisco，1986,Science 233,1061； Partinら，1988 Cancer Res．48-6050；Foxら，1994 Oncogene 9,3519）。これ ら研究は、活性化したＲａｓでトランスフェクションされた細胞系が、波うち、 仮足伸長および走化性応答の増加を示すことを示しており、これらはいずれも、 細胞運動性に関係した過程である。制御されない細胞運動性は、再狭窄、血管新 生および創傷治癒などのいくつかの病理学的過程に関与していた。 Ｒａｆ活性化は、ＮＦ−ｋＢおよびＡＰ−１を含めたいくつかの即時型転写因 子の誘導をもたらす（Bruder，1992，Genes Devel．6,545；Finco，1993，J.Bio l.Chem.268,17676）。ＡＰ−１は、種々のプロテアーゼの発現を調節する（Sato ,1994 Oncogene 8,395；Gaire,1994,J Biol Chem 269,2032；Lauricell-Lefbvre ,1993,Invasion Metastasis 13,289;Troen,1991,Cell Growth Differ 2,23）。ＭＭＰおよびセリンプロテイナーゼ発現のカスケードは、侵襲性表現型 の獲得にも、腫瘍中の血管新生にも関与している（MacDougall，1995，Cancer a nd Metastasis Reviews 14,351）。したがって、Ｒａｆシグナリングは、腫瘍細 胞の増加した浸潤性の原因となり、転移をもたらすと考えられる。 Ｒａｆ−１およびＢｃｌ−２の同時発現研究は、これらタンパク質が結合し且 つ相互作用して、アポトーシスを相乗的に抑制することを示した（Wang，1994， Oncogene 9,2751）。したがって、腫瘍細胞でのＲａｆ−１の過発現は、悪性形 質転換および増加した化学療法薬耐性の原因となると考えられる。ｃ−Ｒａｆ− １の過発現は、放射線療法耐性の患者から得られた頸部および頚部の偏平上皮癌 で（Riva,1995,Oral Oncol.,Eur.J.Cancer 31B,384）および肺癌で（Rapp,1988, The Oncogene Handbook,213）認められる。活性化した（切断された）Ｒａｆは 、小細胞肺癌、胃癌、腎臓癌、乳癌および咽頭癌を含めた多数のヒト癌で検出さ れた（Rapp,1988,The Oncogene Handbook,213）。 Ｒａｆ発現をダウンレギュレーションする場合の治療的介入は、アンチセンス オリゴヌクレオチドアプローチに焦点を合わせてきた。 ｃ−Ｒａｆ−１を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて、ＩＬ −２で刺激されたＴ細胞の成長にｃ−ｒａｆが必要であることが示された（Ried el,1993,Eur.J.Immunol.23,3146）。ＳＱ−２０Ｂ細胞中のｃ−Ｒａｆ−１を標 的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、低下したＲａｆ発現および増加し た放射線感受性を示した（Soldatenkov，1997，The Cancer J.from Scientific American 3,13）。Rappらは、ｃ−Ｒａｆ−１遺伝子をアンチセンス配向で発現 するベクターを用いてその遺伝子発現を阻止する方法を開示した（国際ＰＣＴ公 開第ＷＯ９３／０４１７０号）。ＳＱ−２０Ｂ細胞中のｃ−Ｒａｆ−１を標的と するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ラット肝癌細胞中でインスリン刺激に 応答して低下したＤＮＡ合成を示した(Tornkvist,1994,J.Biol.Chem.269,13919) 。Moniaらは、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いてＲａｆ発現を阻止する 方法を開示しており（米国特許第５，５６３，２５５号）、ｃ−Ｒａｆ−１を標 的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドが、細胞培養物中でのＲａｆｍＲＮＡ 発現を阻止できるし、ヒト腫瘍異種移植片モデルの種々の腫瘍種類 の成長を阻止できることを示した（Moniaら，1996，Proc.Natl.Acad.Scl.93,154 81；Moniaら，1:996,Nature Med.2,668）。ｃ−Ｒａｆアンチセンスオリゴヌク レオチドの全身投与を行なうこれら研究において毒性は認められなかったので、 正常組織中のＲａｆの少なくとも部分的なダウンレギュレーションは明らかに毒 性ではないということが示唆される。 合成リボザイムは、脂質デリバリービヒクルの存在下または不存在下で標的細 胞に外因的に到達させることができると考えられてきた（Thompsonら，国際ＰＣ Ｔ公開第ＷＯ９３／２３０５７号;Sullivanら，国際ＰＣＴ公開第ＷＯ９４／０ ２５９５号）。 最近、Sandbergら，1996,Abstract,IBC USA Conferences on Angiogenesis In hibitorsおよびOcular Diseases of Neovascularizationの他の新規治療法は、 正常マウスおよび腫瘍含有マウスにおける毎日のボーラスまたは連続注入後の血 管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）受容体ＲＮＡに対して集中した化学修飾ハンマーヘ ッド型リボザイムの薬動学を報告した。 Desjardinsら，1996,J.Pharmacol.Exptl.Therapeutic,27,8,1419は、１回の静 脈内注射後のラットシトクロムＰ−４５０ ３Ａ２ｍＲＮＡに対する合成化学修 飾ハンマーヘッド型リボザイムの薬動学を報告した。 上に引用された参考文献は、Ｒａｆ ＲＮＡを切断するリボザイムの使用を開 示していないおよび／または考えていないので、ここで請求の範囲に記載された 発明とは異なる。更に、出願人は、それら参考文献が、哺乳動物細胞および／ま たは全動物における正常Ｒａｆ遺伝子発現をダウンレギュレーションするリボザ イムの使用を開示していないおよび／または可能にしないと考えている。発明の要旨 本発明は、細胞成長応答に必要なＲＮＡ種を切断する核酸触媒の識別、合成お よび使用に関する。特に、出願人は、ｃ−ｒａｆ遺伝子によってコードされたＲ ＮＡを切断できるリボザイムの選択および機能を記載する。このようなリボザイ ムは、１種類またはそれ以上の癌、再狭窄、乾癬、線維症および慢性関節リウマ チの腫瘍細胞の過増殖を阻止するのに用いることができる。 本発明では、ｃ−ｒａｆＲＮＡを切断するリボザイムを記載する。更に、出願 人は、これらリボザイムがin vitroおよびin vivoの遺伝子発現および細胞増殖 を阻止できること、およびリボザイムの触媒活性がそれらの阻止作用に必要であ ることを示している。当業者により、本明細書中で記載の実施例から、細胞増殖 に必要な標的ＲＮＡを切断する他のリボザイムは容易に設計されうるし、本発明 の範囲内であるということが明らかである。 “阻止する”により、ｃ−ｒａｆの活性またはｃ−ｒａｆによってコードされ たＲＮＡのレベルが、核酸の不存在下で認められるそれより低く減少する、特に 、リボザイムでの阻止が、好ましくは、ｍＲＮＡ上の同じ部位に結合できるがそ のＲＮＡを切断できない不活性ＲＮＡ分子の存在下で認められるレベル未満であ るということを意味する。 “核酸触媒”により、ヌクレオチド塩基配列特異的様式で他の別個の核酸分子 を繰返し切断する能力（エンドヌクレアーゼ活性）を含めた種々の反応を触媒す る（反応の速度および／または率を変化させる）ことができる核酸分子を意味す る。エンドヌクレアーゼ活性を有するこのような分子は、特定の遺伝子標的への 基質結合領域に相補性を有することがありうるし、その標的中のＲＮＡまたはＤ ＮＡを特異的に切断する酵素活性も有する。すなわち、エンドヌクレアーゼ活性 を有する核酸分子は、ＲＮＡまたはＤＮＡを分子内または分子間で切断すること ができ、それによって、標的ＲＮＡまたはＤＮＡ分子を失活させる。この相補性 は、切断を引起こす標的ＲＮＡまたはＤＮＡへの酵素的ＲＮＡ分子の充分なハイ ブリダイゼーションを可能にするように機能する。１００％相補性が好ましいが 、５０〜７５％程度の低い相補性も、本発明において有用でありうる。これら核 酸は、塩基、糖および／またはリン酸基で修飾されていてよい。酵素核酸という 用語は、リボザイム、触媒ＲＮＡ、酵素ＲＮＡ、触媒ＤＮＡ、触媒オリゴヌクレ オチド、ヌクレオザイム、ＤＮＡザイム、ＲＮＡザイム、エンドリボヌクレアー ゼ、エンドヌクレアーゼ、ミニザイム、リードザイム、オリゴザイムまたはＤＮ Ａ酵素などの句と同じ意味に用いられる。これら専門用語は全て、酵素活性を有 する核酸分子を示している。本出願で記載された具体的な核酸触媒は、本発明に おいて制限するものではなく、当業者は、本発明の核酸触媒において重要である 全て が、標的核酸領域の一つまたはそれ以上に相補性である特異的基質結合部位を有 するものであるおよび核酸切断活性を分子に与えるその基質結合部位中またはそ の周囲のヌクレオチド配列を有するものであるということを理解するであろう。 “基質結合アーム”または“基質結合ドメイン”により、基質の一部分に相補 性である（すなわち、基質の一部分と塩基対合しうる）リボサイムの部分／領域 を意味する。概して、このような相補性は１００％であるが、所望ならばそれよ り少ないことがあありうる。例えば、１４の内１０程度の少ない塩基が塩基対合 していてよい。このようなアームは、概して、図１および３で示される。すなわ ち、これらアームは、相捕的塩基対合相互作用によってリボザイムおよび標的Ｒ ＮＡを一緒にする予定のリボザイム中の配列を含有する。本発明のリボザイムは 、連続したまたは非連続の結合アームを有していてよいし、いろいろな長さであ ってよい。１個または複数の結合アームの長さは、好ましくは、４ヌクレオチド と等しいまたはそれより大；具体的には、１２〜１００ヌクレオチド；より具体 的には１４〜２４ヌクレオチド長さである。２個の結合アームを選択する場合、 その設計は、それら結合アームの長さが対称的（すなわち、結合アームそれぞれ が同じ長さ；例えば、５と５ヌクレオチド、６と６ヌクレオチドまたは７と７ヌ クレオチド長さである）または非対称（すなわち、結合アームが異なった長さ； 例えば、６と３ヌクレオチド；３と６ヌクレオチド長さ；４と５ヌクレオチド長 さ；４と６ヌクレオチド長さ；４と７ヌクレオチド長さ等である）であるように ある。 本発明の好ましい実施態様の一つにおいて、核酸触媒は、ハンマーヘッド型ま たはヘアピン型で形成されているが、ｄ型肝炎ウイルス、グループＩ型イントロ ン、グループII型イントロンまたはＲＮアーゼＰ ＲＮＡ（ＲＮＡガイド配列に 関連して）またはアカパンカビ（Neurospora）ＶＳ ＲＮＡのモチーフで形成さ れてもよい。このようなハンマーヘッド型モチーフの例は、Dreyfus，上記、Ros siら，1992,AIDS Research and Human Retroviruses 8,183によって記載され； ヘアピン型モチーフの例は、Hampelら，ＥＰ０３６０２５７号、HampelおよびTr itz,1989 Biochemistry 28,4929、Feldsteinら,1989,Gene 82,53、Haseloffおよ びGerlach,1989,Gene,82,43、およびHampelら,1990 Nucleic Acids Res.18,299 によって；ｄ型肝炎ウイルスモチーフの例は、PerrottaおよびBeen, 1992 Biochemistry 31,13によって；ＲＮアーゼＰモチーフの例は、Guerrier-Ta kadaら,1983 Cell 35,849;FosterおよびAltman,1990,Science 249,783；Liおよ びAltman,1996,Nucleic Acids Res.24,835によって；アカパンカビＶＳ ＲＮＡ リボザイムモチーフは、Collins（SavilleおよびCollins，1990 Cell 61,685-69 6；SavilleおよびCollins，1991 Proc.Natl.Acad.Scl.USA 88,8826-8830；Colli nsおよびOlive，1993 Biochemistry 32,2795-2799;GuoおよびCollins,1995,EMBO .J.14,363）によって；グループII型イントロンは、Griffinら，1995，Chem.Bio l．2,761；MichelsおよびPyle，1995，Biochemistry 34,2965；Pyleら，国際Ｐ ＣＴ公開第ＷＯ９５／２２６８９号によって記載され；そしてグループＩ型イン トロンの例は、Cechら，米国特許第４，９８７，０７１号によって記載されてい る。これら具体的なモチーフは、本発明において制限するものではなく、当業者 は、本発明の核酸触媒において重要である全てが、標的遺伝子ＲＮＡ領域の一つ またはそれ以上に相補性である特異的基質結合部位を有するものであるおよびＲ ＮＡ切断活性を分子に与えるその基質結合部位中またはその周囲のヌクレオチド 配列を有するものであるということを理解するであろう。 ｃ−ｒａｆと“同等の”ＲＮＡにより、ヒト、齧歯類、霊長類、ウサギおよび ブタを含めた種々の動物の癌に関係した天然に存在するＲＮＡ分子を含むことを 意味する。同等のＲＮＡ配列には、コーディング領域に加えて、５’非翻訳領域 、３’非翻訳領域、イントロン、イントロン−エキソン結合等のような領域も含 まれる。 “相補性”により、伝統的ワトソン−クリック型かまたは他の非伝統的型（例 えば、フーグスティーン型）の塩基対相互作用によって別のＲＮＡ配列と１個ま たは複数の水素結合を形成することができる核酸を意味する。 好ましい実施態様において、本発明は、望ましい標的のＲＮＡに高度の特異性 を示す酵素切断薬の種類を製造する方法を提供する。核酸触媒は、好ましくは、 ある疾患または状態の具体的な処置が１種類または数種類の酵素核酸で与えられ うるようなｃ−ｒａｆタンパク質をコードしている標的ｍＲＮＡの高度に保存さ れた配列領域に集中する。このような核酸触媒は、必要に応じて特定の細胞に外 因的に到達させることができる。或いは、リボザイムは、特定の細胞に到達する ＤＮＡ／ＲＮＡベクターから発現させることができる。 このようなリボザイムは、上で論評された疾患および状態、並びに細胞または 組織中のｃ−Ｒａｆ活性のレベルに関連した任意の他の疾患または状態の予防に 有用である。 “関連した”により、c−ｒａｆＲＮＡの阻止およびそれによるそれぞれのタ ンパク質活性のレベルの低下が、疾患または状態の症状をある程度まで緩和させ るであろうということを意味する。 好ましい実施態様において、リボザイムは、表XII-XIXの標的配列に相補性で ある結合アームを有する。このようなリボザイムの例は、表XII-XIXでも示され る。このようなリボザイムの例は、これら表で明示された配列から本質的に成る 。 “から本質的に成る”により、活性リボザイムが、実施例のものと同等の酵素 中心すなわちコアー、および標的部位での切断が起こるようにｍＲＮＡを結合で きる結合アームを含有することを意味する。このような切断を妨げない他の配列 は存在しうる。 したがって、第一の態様において、本発明は、遺伝子発現および／または細胞 増殖を阻止するリボザイムを特徴とする。これら化学的にまたは酵素的に合成さ れたＲＮＡ分子は、それらの標的ｍＲＮＡの接近可能な部分に結合する基質結合 ドメインを含有する。それらＲＮＡ分子は、ＲＮＡの切断を触媒するドメインも 含有する。それらＲＮＡ分子は、好ましくは、ハンマーヘッド型またはヘアピン 型のモチーフのリボザイムである。結合すると、それらリボザイムは標的ｍＲＮ Ａを切断して、翻訳およびタンパク質蓄積を妨げる。標的遺伝子の発現を欠く場 合、細胞増殖は阻止される。 好ましい実施態様において、リボザイムは、直接的に加えられ、またはリポソ ーム中にパッケージングされた陽イオン脂質と一緒に複合体を形成でき、または それ以外の方法で標的細胞に到達する。核酸または核酸複合体は、適切な組織に ex vivoで、またはin vivoで注射、注入ポンプ若しくはステントによって、生体 高分子中へのそれらの包含を伴ってまたは伴うことなく局所投与することができ る。もう一つの好ましい実施態様において、リボザイムは、適当なリポソーム ビヒクル中でｃ−ｒａｆ発現部位（例えば、腫瘍細胞）に投与される。 本発明のもう一つの態様において、標的分子を切断し且つｃ−ｒａｆ活性を阻 止するリボザイムは、ＤＮＡまたはＲＮＡベクター中に挿入された転写単位から 発現される。組換え体ベクターは、好ましくは、ＤＮＡプラスミドまたはウイル スベクターである。リボザイム発現性ウイルスベクターは、アデノ関連ウイルス 、レトロウイルス、アデノウイルスまたはアルファウイルスに基づいて構築され うるが、これらに制限されるわけではない。好ましくは、リボザイムを発現でき る組換え体ベクターは、上記のように到達し、標的細胞中に存続する。或いは、 リボザイムを一時的に発現させるウイルスベクターを用いることができる。この ようなベクターは、必要に応じて繰返し投与しうる。いったん発現されると、そ れらリボザイムは標的ｍＲＮＡを切断する。リボザイム発現性ベクターのデリバ リーは、静脈内若しくは筋肉内投与による、患者から体外移植された後にその患 者に再導入される標的細胞への投与による、または所望の標的細胞中への導入を 可能にすると考えられる任意の他の手段によるように全身性でありうる（概説に ついては、CoutureおよびStinchcomb,1996,TIG.,12,510を参照されたい）。本発 明のもう一つの態様において、標的分子を切断し且つ細胞増殖を阻止するリボザ イムは、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはウイルスベクター中に挿入された転写単位から発 現される。好ましくは、リボザイムを発現できる組換え体ベクターは、上記のよ うに局所に到達し、平滑筋細胞中に一時的に存続する。しかしながら、ＲＮＡの 発現を支配する他の哺乳動物細胞ベクターをこの目的に用いてよい。 “患者”により、体外移植された細胞のドナー若しくは受容者またはそれら細 胞自体である器官を意味する。“患者”は、核酸触媒を投与されうる器官をも意 味する。好ましくは、患者は、哺乳動物または哺乳動物細胞である。より好まし くは、患者はヒトまたはヒト細胞である。 “ベクター”により、所望の核酸を到達させるのに用いられる任意の核酸およ び／またはウイルスに基づく技術を意味する。 これらリボザイムは、個々にまたは他の薬物と組合せて若しくは連結して、上 で論評された疾患または状態を処置するのに用いることができる。例えば、ｃ− ｒａｆレベルに関係した疾患または状態を処置するには、当業者に明らかである ように、患者を処置することができるし、または他の適当な細胞を処置すること ができる。 更に別の実施態様において、記載されたリボザイムは、上で論評された状態ま たは疾患を処置する他の既知の処置と組合せて用いることができる。例えば、記 載されたリボザイムは、癌を処置する１種類またはそれ以上の既知の治療薬と組 合せて用いることができる。 好ましい実施態様において、これらリボザイムは、配列番号：１〜５０１、１ ０７８〜１１５２、１４６１〜１７６８、１８４１〜１９１２、２３５４〜２７ ９４および２８４６〜２９５６として示される表の配列と相補性である結合アー ムを有する。このようなリボザイムの例は、配列番号：５０２〜１００２、10０ ３〜１０７７、１１５３〜１４６０、１７６９〜１８４０、１９１３〜２３５３ および２７９５〜２８４５として示される。このような切断を妨げない他の配列 は存在してよい。 Ｒａｆ ｍＲＮＡ中の指定された部位を切断するリボザイムは、腫瘍血管新生 、眼疾患、慢性関節リウマチ、乾癬およびその他を処置する新規の治療的アプロ ーチである。出願人は、それらリボザイムがＲａｆの活性を阻止できることおよ びそれらリボザイムの触媒活性がそれらの阻止作用に必要であることを示してい る。当業者は、Ｒａｆ ｍＲＮＡを切断する他のリボザイムが容易に設計されう るし且つ本発明の範囲内であるということが、記載された実施例から明らかであ ることを理解するであろう。 本発明の他の特徴および利点は、次の好ましい実施態様の説明からおよび請求 の範囲から明らかであろう。好ましい態様の説明 まず、図面を簡単に説明する。図面 図１は、７つの異なるクラスの核酸触媒の二次構造モデルを示す。矢印は、切 断の部位を表す。−−−−は標的配列を表す。点線で分断されている線は、三次 相互作用を示すことを意味する。−は、塩基対相互作用を示すことを意味する。 グループＩイントロン：Ｐ１−Ｐ９．０は種々のステム−ループ構造を示す（Ｃ ｅｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃ．Ｂｉｏ．，１， ２７３）。ＲＮａｓｅＰ（Ｍ１ＲＮＡ）：ＥＧＳは、外部ガイド配列を示す（Ｆ ｏｒｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９，７８３；Ｐ ａｃｅ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５，３５８ ７）。グループＩＩイントロン：５’ＳＳは５’スプライス部位を意味し；３’ ＳＳは３’−スプライス部位を意味し；ＩＢＳはイントロン結合部位を意味し； ＥＢＳはエクソン結合部位を意味する（Ｐｙｌｅ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｂ ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３３，２７１６）。ＶＳ ＲＮＡ：Ｉ−ＶＩは６つの ステム−ループ構造を示すことを意味する；影をつけた領域は、三次相互作用を 示すことを意味する（Ｃｏｌｌｉｎｓ，ＷＯ９６／１９５７７）。ＨＤＶリボザ イム：：Ｉ−ＩＶは、４つのステム−ループ構造を示すことを意味する（Ｂｅｅ ｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許５，６２５，０４７）。ハンマーヘッドリボザイム ：Ｉ−ＩＩＩは、３つのステム−ループ構造を示すことを意味し；ステムＩ−Ｉ ＩＩはいかなる長さのものであってもよく、対称でも非対称でもよい（Ｕｓｍａ ｎｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏ．，１，５ ２７）。ヘアピンリボザイム：ヘリックス１、４および５はいかなる長さのもの であってもよく；ヘリックス２は３−８塩基対の長さであり；Ｙはピリミジンで あり；ヘリックス２（Ｈ２）は少なくとも４つの塩基対で提供され（すなわち、 ｎは１、２、３または４）、ヘリックス５は場合により２またはそれ以上の塩基 の長さで提供されることができる（好ましくは３−２０塩基、すなわち、ｍは１ −２０またはそれ以上）。ヘリックス２およびヘリックス５は、１またはそれ以 上 の塩基により共有結合していてもよい（すなわち、ｒは１塩基）。ヘリックス１ 、４または５はまた、２またはそれ以上の塩基対により延長されて（例えば、４ −２０塩基対）リボザイム構造を安定化してもよく、好ましくはこれは蛋白質結 合部位である。いずれの場合も、各ＮおよびＮ’は、独立して、任意の正常また は修飾塩基であり、各ダッシュは、潜在的塩基対形成相互作用を表す。これらの ヌクレオチドは、糖、塩基またはリン酸で修飾されていてもよい。ヘリックス中 では完全な塩基対形成は必要ではないが、好ましい。ヘリックス１および４は、 ある程度の塩基対形成が維持される限り、任意のサイズのものでありうる（すな わち、ｏおよびｐは、それぞれ独立して、０から任意の数、例えば２０である） 。必須の塩基は構造中で特定の塩基として示されているが、当業者は、顕著な影 響なしに、１またはそれ以上を化学的に修飾（脱塩基、塩基、糖および／または リン酸修飾）してもよく、または他の塩基で置き換えてもよいことを認識するで あろう。ヘリックス４は、２つの別々の分子から、すなわち連結ループなしで形 成することができる。連結ループは、存在する場合、その塩基、糖またはリン酸 に修飾を有するかまたは有しないリボヌクレオチドでありうる。”ｑ”は２塩基 である。連結ループはまた、非ヌクレオチドリンカー分子で置き換えてもよい。 Ｈは塩基Ａ、Ｕ、またはＣを表す。Ｙはピリミジン塩基を表す。”＿”は共有結 合を表す（Ｂｕｒｋｅ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ＆ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１０，１２９；Ｃｈｏｗｒｉｒａ ｅｔ ａｌ．， 米国特許５、６３、３５９）。 図２は、核酸触媒を用いる、アクセス可能部位および標的の発見の一般的アプ ローチを示す。 図３は、ハンマーヘッドリボザイムの図である。標的ＲＮＡ中のコンセンサス ハンマーヘッド切断部位は、”Ｕ”および続く”Ｈ”（”Ｇ”以外の任意のもの ）である。ハンマーヘッドリボザイムは”Ｈ”の後を切断する。この単純なジヌ クレオチド配列は、平均して、標的ＲＮＡ中の５ヌクレオチドごとに生ずる。し たがって、２−ＫｂのｍＲＮＡ中には、約４００の潜在的ハンマーヘッド切断部 位が存在する。ステムＩおよびＩＩＩは、ハンマーヘッド結合アームと標的ＲＮ Ａ中の相補的配列とのハイブリダイゼーションにより形成される。ハンマーヘッ ド リボザイムにその標的に対する特異性を付与するのはこれらの結合アームである 。ハンマーヘッドの結合アームは、切断に必要な構造の一部を形成する触媒ドメ インにより分断されている。 図４は、画定ライブラリの設計および合成のスキームを示す。例として、ＩＣ ＡＭを標的とする４００の異なるリボザイムの同時スクリーニングを用いる。Ｉ ＣＡＭを標的とする各リボザイムをコードするＤＮＡオリゴヌクレオチドを個々 に（Ａ）またはプールして（Ｂ）合成し、次にクローニングし、プールとしてレ トロウイルスベクターに変換した。得られたレトロウイルスベクター粒子を用い て、ＩＣＡＭを発現する標的細胞株に形質導入する（Ｂ）。ＦＡＣＳソーティン グにより、ＩＣＡＭ発現を阻害するリボザイムを発現する細胞（低ＩＣＡＭ）を 、無効リボザイムを発現する細胞からソートし（Ｃ）、低ＩＣＡＭの細胞集団中 で濃縮された有効リボザイムを、フィルターハイブリダイゼーションにより同定 する（Ｄ）。 図５Ａ）は、ハンマーヘッドリボザイムの結合アームをランダム化してランダ ムライブラリを製造することを示す。結合アームは任意の長さおよび任意の対称 性でありうる。すなわち、対称でも非対称でもよい。Ｂ）は、６塩基または７塩 基の長さの結合アームを含むハンマーヘッドランダムリボザイムライブラリの複 雑性を示す。 図６は、標的発見戦略の概略図である。オリゴヌクレオチドを１つの反応容器 中で製造し、ここでは、リボザイムの標的結合アーム中に、すべての４種類の標 準ヌクレオチドがランダムな様式で取り込まれて、すべての可能なリボザイムの プールが製造される（Ａ）。このプールを１つのチューブ中の適当なベクター中 にクローニングして、ランダムライブラリ発現ベクターを製造し（Ｂ）、このプ ールから１つのチューブ中でレトロウイルスベクター粒子が生成する（Ｃ）。次 に、得られるランダムリボザイムライブラリのレトロウイルス発現ベクターのプ ールを用いて、目的とするタイプの細胞に形質導入する（Ｄ）。次に、多くの可 能な選択戦略を用いて、所望の表現型を示す細胞を集団の残りから分離する（Ｅ および本文を参照）。次に、選択された集団に含まれるリボザイムの標的結合ア ームを配列決定することにより、選択された表現型の発現に重要な遺伝子を同定 することができる（Ｆ）。 図７は、ランダムリボザイムライブラリを増幅して、ヒトＩＣＡＭ発現の誘導 に重要な遺伝子を同定する例を示す。ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）にラン ダムリボザイムライブラリを形質導入し（Ａ）、ＴＮＦ−アルファを用いてＩＣ ＡＭ発現を誘導し（Ｂ）、低ＩＣＡＭ細胞をソートすることにより、ＩＣＡＭ誘 導を阻害するリボザイムを発現する細胞を、無効なリボザイムを発現する細胞か ら選択する（Ｃ）。低ＩＣＡＭ細胞中の、ＩＣＡＭ発現を阻害するリボザイムの 結合アームを配列決定することにより、ＩＣＡＭ誘導に重要な遺伝子を同定する 。 図８は、画定またはランダムリボザイムライブラリを製造するための効率的な クローニング戦略の例である。リボザイムコード領域およびクローニングのため の制限部位をコードするＤＮＡオリゴを、さらに３’末端にステム−ループ構造 を含むよう設計する（１）。このステムループは、ＤＮＡポリメラーゼにより伸 長して二本鎖分子を形成するための分子内プライマー部位を形成する（２）。二 本鎖フラグメントを適当な制限エンドヌクレアーゼで切断して、続くクローニン グに適した末端を生成する（３）。 図９は、ＰＮＰを標的とする画定リボザイムライブラリの分子分析、すなわち 配列分析を示す。ＰＮＰを標的とする画定リボザイムライブラリからのプラスミ ドＤＮＡを、プールとして調製し、配列決定した。用いた配列決定プライマーは 、リボザイムをコードする領域の非コード鎖を読む。配列は、結合アームでは分 岐しており、触媒ドメインでは保存されており（５’−ＴＴＴＣＧＧＣＣＴＡＡ ＣＧＧＣＣＴＣＡＴＣＡＧ−３’）、そして他方の結合アームでは分岐している ことに注意されたい。これらの結果は、リボザイム結合アームに異なる配列を含 むクローンの異種プールの配列について予測されたものと一致する。 図１０は、ＰＮＰを標的とする画定リボザイムライブラリの分子分析、すなわ ちＳｕｐ Ｔ１ヒトＴ細胞中で増殖させ、１０ｍｍｏｌの６−チオグアノシン中 で選択した後の配列分析を示す。Ｕ６＋２７転写ユニット中にクローニングされ た、ＰＮＰを標的とする４０の異なるリボザイムオリゴからなるレトロウイルス ベクター系画定リボザイムライブラリをＳｕｐ Ｔ１細胞に形質導入した（図１ ＩＤ）。形質導入後、細胞を２週間増殖させ、次に１０ｍｍｏｌの６−チオグア ノシン中で１６日間選択した。生き残った細胞を回収し、選択された細胞の集団 に存在するリボザイム配列を増幅し、配列決定した。４０の異なるリボザイムの 存在のために結合アームの配列があいまいであった元のライブラリと比較して（ 図９）、選択された集団中の結合アームの配列は、ライブラリに含まれる４０の リボザイムのただ１つに対応することに注意されたい。これらの結果は、このリ ボザイムが試験した４０のリボザイムのうち最も強力なリボザイムであることを 示唆する。 図１１は、本発明のリボザイムライブラリの発現に適した転写ユニットの図式 的表示である。Ａ）は、いくつかのＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｏｌ）ＩＩおよびＩ ＩＩリボザイム（ＲＺ）転写ユニットの図解的表示である。ＣＭＶプロモーター 駆動性は、サイトメガロウイルスプロモーターにより駆動されるＰｏｌＩＩ転写 産物であり；転写産物は、リボザイムが５’−領域、３’−領域またはその間の どこかにあり、転写産物が場合によりイントロンを含むように設計することがで きる。ｔＲＮＡ−ＤＣは、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）プロモーターにより駆動され るＰｏｌ ＩＩＩ転写産物であり、ここで、リボザイムは転写産物の３’−末端 にある。転写産物は、場合により、リボザイムの３’側にステム−ループ構造を 含んでいてもよい。Ｕ６＋２７はＵ６小核（ｓｎＲＮＡ）プロモーターにより駆 動されるＰｏｌ ＩＩＩ転写産物である。リボザイムはＵ６ ｓｎＲＮＡの５’ −末端の２７ヌクレオチドに相同な配列の３’側にある。転写産物は、場合によ り、リボザイムの３’−末端にステム−ループ構造を含んでいてもよい。ＶＡＩ −９０は、アデノウイルスＶＡプロモーターにより駆動されるＰｏｌ ＩＩＩ転 写産物である。リボザイムは、ＶＡＩ ＲＮＡの５’−末端の９０ヌクレオチド に相補的な配列の３’側にある。転写産物は、場合により、リボザイムの３’− 末端にステム−ループ構造を含んでいてもよい。ＶＡＣはアデノウイルスＶＡＩ プロモーターにより駆動されるＰｏｌ ＩＩＩ転写産物である。リボザイムは、 ＶＡ ＲＮＡの３’−領域に向けてＳ３５モチーフ中に挿入されている。これは 、リボザイムに隣接する５’−領域の配列と３’−領域の配列との間に塩基対形 成相互作用により形成される安定な８塩基またはそれより長い分子内ステムであ る（Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ９６／１８７３６を参照）。Ｓ３ ５ ドメインは、無関係ドメインとして、主要転写産物からリポザイムを遠ざけるよ う配置する。ＴＲＺはｔＲＮＡプロモーターにより駆動されるＰｏｌ ＩＩＩ転 写産物である。リボザイムはＳ３５ドメイン中に挿入されており、主要転写産物 から遠ざけるよう配置されている（Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ９ ６／１８７３６を参照）。Ｂ）は、Ｕ１小核ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）システムに基 づく種々の転写ユニットを示す。Ｃ）は、リボザイム遺伝子をコードするレトロ ウイルスベクターの図式的表示である。ＮＧＦＲ（神経成長因子レセプターが選 択マーカーとして用いられる）、レトロウイルスのＬＴＲ（長末端反復）、ＵＴ Ｒ（非翻訳領域）。Ｄ）は、Ｕ６ ｓｎＲＮＡに基づくＵ６＋２７ハンマーヘッ ドリボザイム転写ユニットを示す。リボザイム転写産物は、転写産物の安定性に 必要であると報告されている、Ｕ６ ｓｎＲＮＡからの最初の２７ｎｔを含む。 転写産物は、ウリジン残基のストレッチで終了する。図に示されるハンマーヘッ ドリボザイムは、ランダム（Ｎ）結合アーム配列を有する。 図１２は、リボザイム変異体をスクリーニングするコンビナトリアルアプロー チの図解的表示である。 図１３は、図１２に記載されるスクリーニングアプローチにおいて用いるべき 出発リボザイムの配列を示す。出発リボザイムは、標的ＲＮＡ Ａを切断するよ う設計されたハンマーヘッド（ＨＨ）リボザイムである（ＨＨ−Ａ）。本明細書 においては、Ｕ２４が化学合成の間にＨＨ−Ａリボザイム中に取り込まれる２４ 番目のヌクレオチドであることを示すために、ＨＨ−Ａ中の７位は、２４位とも 表される。同様に、４位および３位は、それぞれ２７位および２８位とも表され る。ｓはホスホロチオエート置換を表す。ＨＨ−Ａ配列中の小文字のアルファベ ットは、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを表し、ＨＨ−Ａの配列中の５位、６位 、８位、１２位および１５．１位の大文字のアルファベットはリボヌクレオチド を表す。３位、４位および７位は、図１２に示される方法を用いるスクリーニン グのために選択された位置を示すために、大文字の大きなアルファベットとして 示されている。●は塩基対相互作用を示す。ｉＢは脱塩基反転デオキシリボース 部分を表す。 図１４は、ＨＨ−Ａリボザイムの変異体をスクリーニングするスキームを示す 。 このスキームにおいては、位置２４、２７および２８が分析のために選択された 。 図１５は、リボザイムライブラリを構築するために用いることができるヌクレ オチド類似体のいくつかの非限定的例を示す。２’−Ｏ−ＭＴＭ−Ｕは２’−Ｏ −メチルチオメチルウリジンを表し；２’−Ｏ−ＭＴＭ−Ｃは２’−Ｏ−メチル チオメチルシチジンを表し；６−Ｍｅ−Ｕは６−メチルウリジンを表す（Ｂｅｉ ｇｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ９６／１８７３６（本明細書の一部としてこ こに引用する）。 図１６は、細胞に基づくアッセイにおいて決定されたＨＨ−Ａ変異体リボザイ ムの活性を示す。＊は、最も望ましい特性を与えたリボザイム中の置換を示す。 図１７Ａは、細胞中で最も望ましい特性を示したリボザイムの配列および化学 組成を示す。 図１７Ｂは、４つの異なる新規リボザイムモチーフの式を示す。 図１８は、新規リボザイムモチーフの式を示す。 図１９は、図１４に記載されるスクリーニングアプローチにおいて用いられる べき出発リボザイムの配列を示す。ＲＮＡ Ｂ（ＨＨ−Ｂ）を標的とするＨＨリ ボザイムが、ループＩＩ配列変異体の分析に選択された。 図２０は、ＨＨ−Ｂリボザイムのループ−ＩＩ配列変異体をスクリーニングす るスキームを示す。 図２１は、ＨＨ−Ｂループ−ＩＩ変異体リボザイムにより触媒されるＲＮＡ切 断反応の相対的触媒速度（ｋrel）を示す。 図２２は、ＨＨ−Ｂリボザイム−基質複合体および５’−ＧＡＡＡ−３’また は５’−ＧＵＡＡ−３’のいずれかのループ−ＩＩ配列を有するＨＨ−Ｂリボザ イムの活性の図解的表示である。 図２３は、結合アームを変化させることにより、コンビナトリアルアプローチ を用いて潜在的リボザイム標的を同定するスキームを示す。 図２４は、推定触媒ドメイン配列を変化させることにより、コンビナトリアル アプローチを用いて新規リボザイムを同定するスキームを示す。 図２５は、コンビナトリアルインビトロスクリーニング方法を用いて見いださ れた、Ｂｃｌ−２転写産物（９７５ヌクレオチド）中のアクセス可能部位の表を 示す。 図２６は、コンビナトリアルインビトロスクリーニング方法を用いて見いださ れたＫｒａｓ転写産物（７９６ヌクレオチド）のアクセス可能部位の表、ならび にこれらの部位に対するリボザイムの相対活性のグラフ表示を示す。 図２７は、コンビナトリアルインビトロスクリーニング方法を用いて見いださ れたＵＰＡ転写産物（４００ヌクレオチド）のアクセス可能部位の表、ならびに これらの部位に対するリボザイムの相対活性のグラフ表示を示す。 図２８は、ＭＣＦ−７細胞を転写産物（配列番号９）の部位５４９を標的とす るリボザイムで処理した後の、リボヌクレアーゼ保護アッセイ（ＲＰＡ）からの データを示すグラフを示す。ＭＣＦ−７細胞から単離されたＢｃｌ−２ ｍＲＮ Ａは、やはりＲＰＡにおいて探索したＧＡＰＤＨに対して標準化されている。グ ラフは、未処理対称および無関係リボザイム（Ｂｃｌ−２ ｍＲＮＡとは相補的 でない）を含む。 図２９は、ヌクレオシド基質を用いるＮＴＰ合成の図解的表示を示す。 図３０は、キシロリボヌクレオシドホスホルアミダイトの合成のスキームを示 す。 図３１は、ストロメリシンＲＮＡ（部位６１７）を標的とする、種々の修飾を 有するハンマーヘッド（ＨＨ）リボザイムの図解的表示である。 図３２は、ＲＮＡホスホルアミダイト化学を用いて合成したＲＮＡの１ポット 脱保護の図解的表示である。 図３３は、ＲＮＡの脱保護のための１ポットおよび２ポット方法の比較である 。 図３４は、種々の極性有機試薬を用いた１ポット脱保護の結果を示す。 図３５は、ｒａｓシグナル伝達経路の図解的表示である。 図３６は、ｃ−ｒａｆ ＲＮＡを標的とするハンマーヘッドリボザイムの図解 的表示である。 図３７は、細胞増殖のｃ−ｒａｆ ２’−Ｃ−アリル １１２０ハンマーヘッ ド（ＨＨ）リボザイム媒介性阻害のグラフ表示である。 図３８は、ｃ−ｒａｆ ２’−Ｃ−アリル １１２０および１２５１ハンマー ヘッド（ＨＨ）リボザイムにより媒介される細胞増殖の阻害のグラフ表示である 。 図３９は、マウスにおけるＬＬＣ−ＨＭ原発性腫瘍成長に及ぼすｆｌｔ−１リ ボザイム（活性／不活性)の影響を示す。 図４０は、処置停止直後のＬＬＣ−ＨＭ原発性腫瘍体積に及ぼすｆｌｔ−１リ ボザイムの影響を示す。 図４１は、肺転移指標（転移の数および肺重量）に及ぼすｆｌｔ−１リボザイ ムの影響を示す。 図４２は、マウスにおけるＬＬＣ−ＨＭ原発性腫瘍成長に及ぼすｆｌｋ−１リ ボザイム（活性／不活性）の影響を示す。 図４３は、処置停止直後のＬＬＣ−ＨＭ原発性腫瘍体積に及ぼすｆｌｋ−１リ ボザイムの影響を示す。 図４４は、肺転移指標（転移の数および肺重量）に及ぼすｆｌｋ−１リボザイ ムの影響を示す。核酸触媒； 触媒核酸分子（リボザイム）は、ヌクレオチド塩基配列特異的に離れた場所の 他の核酸分子を繰り返し切断する能力を有する、一つ又はそれ以上の種類の反応 を触媒する能力がある核酸分子である。そのような核酸触媒は、例えば、実質的 にどのようなＲＮＡ転写物を標的とする切断に使用されることも可能である（Ｚ ａｕｇら、３２４，Ｎａｔｕｒｅ ４２９ １９８６；Ｃｅｃｈ、２６０ ＪＡ ＭＡ ３０３０，１９８８；及びＪｅｆｆｅｒｉｅｓら、１７ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １３１７，１９８９）。触媒核酸分子は、一 つ又はそれ以上の型の分子に繰り返し作用する能力を有するヌクレオチド塩基を 含む分子を意味し、核酸触媒をそれに制限されずに含む。それらに制限されるこ とのない例示として、そのような分子は、核酸分子、ペプチド、又は他の高分子 を繰り返し切断することも可能である分子、並びにそのような核酸及び他の高分 子を重合させることも可能である分子を含む。具体的には、そのような分子はリ ボザイム、ＤＮＡザイム、外来性ガイド配列及びそれらと同等の物質を含む。そ のような分子はＤＮＡ及びＲＮＡにおいて標準的に認められるヌクレオチドと比 較して修飾されているヌクレオチドをも含むと推察される。 それらの配列特異的性により、ｔｒａｎｓ−切断核酸触媒はヒトの疾病に対す る治療用薬剤としての将来性を有する（Ｕｓｍａｎ＆ＭｃＳｗｉｇｇｅｎ，１９ ９５ Ａｎｎ Ｒｅｐ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３０，２８５−２９４；Ｃｈｒｉｓ ｔｏｆｆｅｒｓｅｎ及びＭａｒｒ，１９９５ Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３８，２ ０２３−２０３７）。核酸触媒を細胞内ＲＮＡ背景の中から特定の標的ＲＮＡを 切断するように設計することも可能である。そのような切断反応はＲＮＡを機能 不能とし、そしてそのＲＮＡからのタンパク質の発現を抹消する。この方法で、 疾病状態に関連するタンパク質の合成を選択的に阻害することも可能である。さ らに、核酸触媒を治療用遺伝子の標的の確認及び／又は生体系における遺伝子の 機能の決定に使用しても良い（Ｃｈｒｉｓｔｏｆｆｅｒｓｅｎ，１９９７，Ｎａ ｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５，４８３）。 天然に存在する自己切断ＲＮＡから誘導されたＲＮＡ酵素分子には少なくとも ７種類の基本的な種類がある（表１参照）。それぞれが生理学的条件下でｔｒａ ｎｓ位の（従って他のＲＮＡ分子を切断することも出来る）ＲＮＡのホスホジエ ステル結合の加水分解を触媒することが可能である。一般に、核酸酵素は最初に 基質／標的ＲＮＡに結合して作用する。そのような結合は、標的ＲＮＡを切断す る分子の酵素的部位に近接する位置にある核酸触媒の基質／標的結合部位を通じ て発生する。従って、核酸酵素は最初に認識し、そしてその後相補的塩基対合を 通して標的ＲＮＡに結合し、そして一度適切な位置に結合すると、標的ＲＮＡを 切断するように酵素的に作用する。そのような標的ＲＮＡの計画的及び選択的切 断はコードされているタンパク質を直接合成する能力を破壊することになる。核 酸酵素は標的ＲＮＡに結合及び切断した後、他の標的を探すためにそのＲＮＡか ら解離する、従ってそれは新しい標的に繰り返し結合及び切断することも可能で ある。 さらに、いくつかのiｎ ｖｉｔｒｏ選択（進化）法（Ｏｒｇｅｌ、１９７９ ，Ｐｒｏｃ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ，Ｂ２０５，４３５）は、ホスホジエス テル結合及びアミド結合の切断及び連結などの、多種の反応を触媒する能力を有 する新規の核酸触媒を進化させることに使用されている（Ｊｏｙｃｅ、１９８９ ，Ｇｅｎｅ，８２，８３−８７；Ｂｅａｕｄｒｙら、１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７，６３５−６４１；Ｊｏｙｃｅ、１９９２，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａ ｍｅｒｉｃａｎ ２６７，９０−９７；Ｂｒｅａｋｅｒら、１９９４，ＴＩＢＴ ＥＣＨ １２，２６８；Ｂａｒｔｅｌら、１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１： １４１１１−１４１８；Ｓｚｏｓｔａｋ，１９９３，ＴＩＢＳ １７，８９−９ ３；Ｋｕｍａｒら、１９９５，ＦＡＳＥＢ Ｊ．，９，１１８３；Ｂｒｅａｋｅ ｒ、１９９６，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，７，４４２；Ｂｒｅａｋｅ ｒ、１９９７，Ｎａｔｕｅｒ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５，４２７）。 触媒核酸分子の構造及び機能を研究するための多種のｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉ ｎ ｖｉｖｏ選択法の使用法を記載するいつくかの文献がある（Ｃａｍｐｂｅｌ １ら、１９９５，ＲＮＡ １，５９８；Ｊｏｙｃｅ １９８９，Ｇｅｎｅ，８２ ，８３；Ｌｉｅｂｅｒら、１９９５，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１５，５４ ０；Ｌｉｅｂｅｒら、国際ＰＣＴ出願番号ＷＯ９６／０１３１４；Ｓｚｏｓｔａ ｋ １９８８，ｉｎ Ｒｅｄｅｓｉｇｎｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｏｆ Ｌｉｆｅ，Ｅｄ．Ｓ．Ａ．Ｂｅｎｎｅｒ，ｐｐ８７，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒ ｌａｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ；Ｋｒａｍｅｒら、米国特許第５６１６４５９号；Ｄｒ ａｐｅｒら、米国特許第５４９６６９８号；Ｊｏｙｃｅ，米国特許第５５９５８ ７３号；Ｓｚｏｓｔａｋら、米国特許第５６３１１４６号）。 リボザイムの酵素的性質は、治療用処置に十分に効果的であるリボザイムの効 果濃度がアンチセンスオリゴヌクレオチドの対応する濃度よりも一般に低いこと から、他の方法よりも有益である。この利点はリボザイムが酵素的に作用するこ とを反映している。従って、一個のリボザイム（核酸酵素）分子は多数の標的Ｒ ＮＡを切断することも可能である。さらに、リボザイムは、阻害の特異性が結合 時の塩基対合機構だけによるものではなく、それが結合したＲＮＡの発現を阻害 するという機構にも基づく、高度に特異的な阻害剤である。すなわち、阻害は標 的ＲＮＡを切断することにより発生し、そしてその特異性は非標的ＲＮＡ切断速 度の標的ＲＮＡ切断速度に対する比率と定義される。この切断機構はさらに塩基 対合に関与する要因にも依存する。従って、リボザイムの作用の特異性は、同じ ＲＮＡ部位に結合するアンチセンスオイゴヌクレオチドのそれよりも高いことが 予想される。 触媒活性が最適であるリボザイムの発達は、遺伝子発現を制御する目的でＲＮ Ａ切断リボザイムを利用するどのような計画に対しても著しく貢献するであろう 。例えば、ハンマーヘッド型リボザイムは十分濃度（１０ｍＭ）のＭｇ2+補助因 子の存在下で触媒速度（ｋcat）〜１ｍｉｎ-1で機能する。しかし、細胞内で観 察される濃度に近い濃度（０．５−２ｍＭ）のＭｇ2+でのリボザイムの速度は１ ０から１００倍遅くなることも可能である。対照的に、ＲＮａｓｅ Ｐ ホロ酵 素は最適分析条件下において〜３０ｍｉｎ-1のｋcatでプレ−ｔＲＮＡの切断を 触媒することも可能である。人工「ＲＮＡリガーゼ」リボザイム（上記、Ｂａｒ ｔｅｌら）は、〜１００ｍｉｎ-1の速度で対応する自己修飾反応を触媒すること が示されている。さらに、ＤＮＡで構成される基質結合アームを有するある種の 修飾されたハンマーヘッド型リボザイムは、１００ｍｉｎ-1にほぼ等しい複数代 謝回転速度でＲＮＡ切断を触媒することが知られている。最後に、ハンマーヘッ ド型の触媒中心の中の特定の塩基をある種のヌクレオチド類似体に置換すること に より１０倍程度改善した触媒速度を示す修飾リボザイムが得られる。これらの所 見は、主要な天然型自己切断リボザイムがｉｎ ｖｉｔｒｏで示すよりも有意に 速い触媒速度でリボザイムが化学的形質転換を促進することも可能であることを 証明する。従って、ある種の自己切断リボザイムの構造は最高触媒活性を得られ るようには最適化されていないことも可能であり、又はＲＮＡホスホエステル結 合の切断において有意に速い速度を示す完全に新規のＲＮＡモチーフを作製して も良いと言うことも可能である。 本明細書に使用される「ヌクレオチド」は、当該分野で認知されているとおり 天然型塩基（標準型）、及び当該分野において周知である修飾塩基を含む。その ような塩基は一般に糖部の１’位に結合する。ヌクレオチドは一般に塩基、糖及 びリン酸基を含む。ヌクレオチドは、糖、リン酸基及び／又は塩基部において修 飾されていなくとも又は修飾されていても良い、（ヌクレオチド類似体、修飾型 ヌクレオチド、非天然型ヌクレオチド、非標準型ヌクレオチド及びその他もまた 互換的に参照される；例として以下を参照、上記Ｕｓｍａｎ及びＭｃＳｗｉｇｇ ｅｎ；Ｅｃｋｓｔｅｉｎら国際ＰＣＴ出願番号ＷＯ９２／０７０６５；Ｕｓｍａ ｎら、国際ＰＣＴ出願番号ＷＯ９３／１５１８７；全てを参考資料として本明細 書に援用する）。当該技術分野において周知である修飾された核酸塩基は数例存 在しそしてこれらはＬｉｍｂａｃｈら、１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２，２１８３にまとめられている。触媒活性に有意な影響を与える ことなく核酸酵素に導入されることも可能である塩基修飾の例は、これらに制限 されることなく、イノシン、プリン、４位結合ピリジン、２位結合ピリジン、フ ェニル、プソイドウラシル、２，４，６−トリメトキシベンゼン、３−メチルウ ラシル、ジヒドロウリジン、ナフチル、アミノフェニル、５−アルキルシチジン （例、５−メチルシチジン）、５−アルキルウリジン（例、リボチミジン）、５ −ハロウリジン（例、５−ブロモウリジン）、又は６−アザピリミジン又は６− アルキルピリミジン（例、６−メチルウリジン）及びその他（Ｂｕｒｇｉｎら、 １９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３５，１４０９０）を含む。この観点お いて「修飾塩基」は１’位に結合したアデニン、グアニン、シトシン及びウラシ ル以外の核酸塩基又はそれらの同等物と定義され；そのような塩基は酵素の触媒 中心及び ／又は基質結合部位に使用されても良い。 他の好ましい態様において、本発明に記載の分子の触媒活性を、上記Ｄｒａｐ ｅｒらに記載のとおり最適化することも可能である。詳細を本明細書においては 繰り返さないが、しかしリボザイム結合アームの長さを変更すること、又は血清 リボヌクレアーゼによる分解を防ぐため及び／若しくは酵素活性を増大させるた めの修飾（塩基、糖及び／又はリン酸基）を有する化学合成リボザイムを含む（ 例として参照；Ｅｃｋｓｔｅｉｎら、国際出願番号ＷＯ９２／０７０６５；Ｐｅ ｒｒａｕｌｔら、１９９０ Ｎａｔｕｒｅ ３４４，５６５；Ｐｉｅｋｅｎら、 １９９１ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３，３１４；Ｕｓｍａｎ及びＣｅｄｅｒｇｒｅ ｎ，１９９２ Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１７，３３４； Ｕｓｍａｎら、国際出願番号ＷＯ９３／１５１８７；及びＲｏｓｓｉら、国際出 願番号ＷＯ９１／Ｏ３１６２；Ｓｐｒｏａｔ、米国特許第５３３４７１１号；及 び上記Ｂｕｒｇｉｎら；これら全てはＲＮＡ酵素分子塩基、リン酸基及び／又は 糖部に行っても良い多種の化学修飾を記載する）。細胞内のそれらの効率を増大 させる修飾、並びにＲＮＡ合成時間を短縮する及び化学物質必要量を減じるため にステムループ構造の塩基を少なくすることは適当である。（これら全ての文献 を参考資料として本明細書に援用する。） 有意に触媒に影響を与えることなく並びにヌクレアーゼ安定性及び効力を有意 に促進するように核酸触媒に導入することも可能であり、糖及びリン酸基の修飾 を記載した例は当該技術分野において数種ある。リボザイムは安定性を向上させ る及び／又は触媒活性を増大させるために、例えば２’−アミノ、２’−Ｃ−ア リル、２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｈ，ヌクレオチド塩基の修飾 であるヌクレアーゼ耐性基による修飾により改変される（確認のため参照 Ｕｓ ｍａｎ及びＣｅｄｅｒｇｒｅｎ、１９９２ ＴＩＢＳ １７，３４；Ｕｓｍａｎ ら、１９９４ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．３１，１６３ ；Ｂｕｒｇｉｎら、１９９１６ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５，１４０９０ ）。核酸触媒の糖修飾は当該分野において広範に記載されている（参照 Ｅｃｋ ｓｔｅｉｎら、国際出願ＰＣＴ番号ＷＯ９２／０７０６５；Ｐｅｒｒａｕｌｔら 、Ｎａｔｕｒｅ １９９０，３４４，５６５−５６８；Ｐｉｅｋｅｎら、Ｓｃｉ ｅｎ ｃｅ １９９１，２５３，３１４−３１７；Ｕｓｍａｎ及びＣｅｄｅｒｇｒｅｎ 、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１９９２，１７，３３４−３ ３９；Ｕｓｍａｎら、国際出願ＰＣＴ番号ＷＯ９３／１５１８７；Ｓｐｒｏａｔ 、米国特許第５３３４７１１号及びＢｅｉｇｅｌｍａｎら、１９９５ Ｊ．Ｂｉ ｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，２５７０２：全ての参考資料をその全文について参考 資料として本明細書に援用する）。 このような文献は、触媒作用を阻害することなく糖、塩基及び／又はリン酸基 の修飾並びにその類似物質を、リボザイムに結合させる位置を決定するための一 般的な方法及び計画を記載しており、本明細書に参考資料として援用される。そ のような知見を考慮して、本発明の核酸触媒を改変するために本明細書に記載さ れている様に類似の修飾を行うことも可能である。 さらに他の好ましい態様において、酵素活性を維持するまたは増大させる化学 修飾を有する核酸触媒を提供する。そのような核酸はまた、一般に、対応する未 改変の核酸よりもヌクレアーゼに対して安定である。従って、細胞内及び／又は ｉｎ ｖｉｖｏにおいて活性が有意に低下しないことも可能である。本明細書に おいて例示する様にその様なリボザイムは細胞内及び／又はｉｎ ｖｉｖｏにお いてたとえ全ての活性が１／１０に減少してしまっても有用である（Ｂｕｒｇｉ ｎら、１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３５， １４０９０）。本明細書 においてそのような修飾は、全てのＲＮＡリボザイムで酵素活性を「維持する」 と呼ばれる。 好ましい態様において、本発明の核酸触媒は直接投与される、又は陽イオン性 脂質と複合体を形成する、リポソームに包含される、若しくはそうでなければ平 滑筋細胞に送達されることも可能である。ＲＮＡ又はＲＮＡ複合体は関連する組 織にカテーテル、輸液ポンプ又はステントを使用して、生体高分子と混合して又 は混合されずに局所的に投与されることも可能である。本明細書に記載の方法を 使用して、標的核酸を切断する他の核酸触媒が上記のとおり誘導及び使用されて も良い。本発明の核酸触媒の具体的な例は下記の表及び図において提供される。 Ｓｕｌｌｉｖａｎら、ＷＯ９４／０２５９５は、核酸触媒の一般的な送達方法 を記載する。リボザイムは当該分野に精通している者に周知であるリポソームへ の包含法、イオン導入法、又はヒドロゲル、シクロデキストリン、生分解性ナノ カプセル、及び生体粘着性ミクロスフェアなどの他の小胞に混合する方法をこれ らに制限することなく含む多種の方法によって細胞に送達されても良い。いくつ かの適応では、リボザイムはｅｘ ｖｉｖｏから細胞へ又は組織へ前述の小胞と 混合されて又は混合されずに直接送達されても良い。一方、ＲＮＡ／小胞複合体 は直接投与又はカテーテル、輸液ポンプ若しくはステントを使用して局所的に送 達される。他の送達経路は脈管内、筋肉内、皮下若しくは関節注射(ｊｏｉｎｔ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ)、エアロゾル吸引法、経口（錠剤又は丸剤の形態で）、 局所的、全身性、眼、腹腔及び／又は鞘内をこれらの制限することなく含む。リ ボザイムの送達及び投与ついてのさらに詳細な記載は上記Ｓｕｌｌｉｖａｎら、 及びＤｒａｐｅｒら、ＷＯ９３／２３４６９において提供される、これらを参考 資料として本明細書に援用する。 そのような核酸触媒は必要に応じて特定の細胞に外来的に送達されることも可 能である。好ましいハンマーヘッド型リボザイムモチーフにおいて分子が小型( ６０ヌクレオチドより少ない、好ましくは長さが３０−４０ヌクレオチドの間) であることは治療の費用を減少させている。 外来的に送達された治療用リボザイムは、不適当なタンパク質の量が減少する ように十分長時間標的ＲＮＡの転写が阻害されるまで細胞内に安定に残存しなけ ればならない。この時間の長さは疾病の状態に依存して時間単位から日単位まで 変化する。明らかに、リボザイムは、効果的な細胞内治療用薬剤として機能する ためにヌクレアーゼ抵抗性でなければならない。ＲＮＡの化学合成の改良は（Ｗ ｉｎｃｏｔｔら、１９９５ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３，２６ ７７；参考資料として本明細書に援用する）、上記の様にヌクレアーゼ安定性を 増大させるためにヌクレオチド修飾を導入することによりリボザイムを改変する 方法を発展させている。核酸触媒の合成、脱保護、及び精製； 一般に、ＲＮＡ分子は化学的に合成されそして、ＲＮＡのホスホロアミダイト を活性化するテトラゾール、環外アミノ保護基を除去するエタノール−ＮＨ4Ｏ Ｈ、２’−ＯＨアルキルシル保護基を除去するテトラ−ｎ−ブチルアンモニウム フルオリド（ＴＢＡＦ）の使用、及びゲル精製及び脱保護ＲＮＡの分析に基づく 方法によって精製される。ＲＮＡの化学合成、脱保護、精製及び分析方法の例は 、Ｕｓｍａｎら、１９８７ Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０９，７８４５ ；Ｓｃａｒｉｎｇｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９０，１８ ，５４３３−５３４１；ＰｅｒｒｅａｕｌｔらＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９ ９１，３０ ４０２０−４０２５；ＳｌｉｍおよびＧａｉｔ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９１，１９，１１８３−１１８８、により提供される 。上記全ての参考文献は全て本明細書に参考資料としてここに援用される。 長さが１００ヌクレオチドより長い核酸の合成は自動化法を使用したのでは困 難であり、そしてそのような分子ので治療費は高額である。本発明においては、 小型核酸モチーフ（例、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ハンマーヘッド型又 はヘアピン型リボザイム）が外来的送達に使用される。これらの分子が単純構造 であることは核酸がｍＲＮＡの標的部位に侵入する能力を高める。しかしながら 、これらの核酸分子は真核生物のプロモーターから細胞内で発現されることもま た可能である（例、Ｉｚａｎｔ及びＷｅｉｎｔｒａｕｂ、１９８５ Ｓｃｉｅｎ ｃｅ ２２９，３４５；ＭｃＧａｒｒｙ及びＬｉｎｄｑｕｉｓｔ、１９８６ Ｐ ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３，３３９；Ｓｕｌｌｅｎｇ ｅｒＳｃａｎｌｏｎら、１９９１，Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ Ａ，８８，１０５９１−５；Ｋａｓｈａｎｉ−Ｓａｂｅｔら、１９９２ Ａｎｔ ｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．，２，３−１５；Ｄｒｏｐｕｌｉｃら、１９９ ２ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，６６，１４：３２−４１；Ｗｅｅｒａｓｉｎｇｈｅら、１ ９９１ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，６５，５５３１−４；Ｏｊｗａｎｇら、１９９２ Ｐ ｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，１０８０２−６；Ｃｈｅｎ ら、１９９２ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０，４５８１−９； Ｓａｒｖｅｒら、１９９０ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７ １２２２−１２２５；Ｔ ｈｏｍｐｓｏｎら、１９９５ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３，２ ２５９）。当該分野に技能を有する者は、適切なＤＮＡ／ＲＮＡベクターから真 核細胞内に任意の核酸を発現させることが可能であることを認知する。そのよう な核酸の活性がリボ ザイムによって初期転写体から解離されることにより増大されることも可能であ る（Ｄｒａｐｅｒら、ＰＣＴ ＷＯ９３／２３５６９、及びＳｕｌｌｉｖａｎら 、ＰＣＴ ＷＯ９４／０２５９５ 両文献をここにその全文について本明細書に 参考資料として援用する；Ｏｈｋａｗａら、１９９２ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉ ｄｓ Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．，２７，１５−６；Ｔａｉｒａら、１９９１，Ｎｕｃ ｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９，５１２５−３０；Ｖｅｎｔｕｒａら、 １９９３ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２１，３２４９−５５；Ｃ ｈｏｗｒｉｒａら、１９９４ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，２５８５６） 。 リボザイムは化学的に合成された。使用された合成法は、Ｕｓｍａｎら、１９ ８７ Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０９，７８４５；Ｓｃａｒｉｎｇｅら 、１９９０ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８，５４３３；及びＷ ｉｎｃｏｔｔら、１９９５ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３，２６ ７７−２６８４に記載されているような通常のＲＮＡ合成のための方法に従い、 ５’末端にジメトキシトリチル、及び３’末端にホスホロアミダイトなどの慣用 の核酸保護基及びカップリング基を使用する。小量の合成は、改良２．５μｍｏ ｌスケール法を使用して、アルキルシリル保護ヌクレオチドのカップリング段階 は５分間及び２’−Ｏ−メチル化ヌクレオチドのカップリング段階は２．５分間 として、３９４ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．合成機にお いて行われた。表ＩＩは合成サイクル中に使用された試薬の量、及び接触時間を 図解する。ポリマーに結合された５’−ヒドロキシル基と比較して６．５倍過剰 量（０．１Ｍを１６３μＬ＝１６．３μｍｏｌ）のホスホロアミダイト及び２４ 倍過剰量（０．２５Ｍを２３８μＬ＝５９．５μｍｏｌ）のＳ−エチルテトラゾ ールが各カップリングサイクルにおいて使用された。トリチル分画の比色定量に より分析された、３９４ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．合 成機の平均カップリング収率は９７．５−９９％だった。他の３９４ Ａｐｐｌ ｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．合成機用オリゴヌクレオチド合成用試 薬；脱トリチル化試薬は２％ＴＣＡのメチレンクロリド溶液（ＡＢＩ）；キャッ ピングは１６％ Ｎ−メチルイミダゾールのＴＨＦ溶液（ＡＢＩ）及び１０％ 無水酢酸／１０％ ２，６−ルチジンのＴＨＦ溶液（ＡＢＩ）を用いて行った； 酸化溶液は １６．９ｍＭ Ｉ2 、４９ｍＭ ピリジン、９％水のＴＨＦ溶液（Ｍｉｌｌｉ ｐｏｒｅ）とした。Ｂ＆Ｊ合成用アセトニトリルは試薬瓶から直接使用した。Ｓ −エチルテトラゾール溶液（０．２５Ｍのアセトニトリル溶液）はＡｍｅｒｉｃ ａｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｉｎｃ．から入手した 固体を用いて調製した。 ＲＮＡの脱保護は以下のように行った。ポリマー結合オリゴヌクレオチド、脱 トリチル済、は合成機のカラムから４ｍｌネジ蓋付ガラス製バイアルに移され、 そしてメチルアミン（ＭＡ）溶液中に６５℃で１０分間懸濁された。−２０℃に 冷却された後、上清をポリマー担体から除去した。担体はＥｔＯＨ：ＭｅＣＮ： Ｈ2Ｏ／３：１：１ １ｍlで３回洗浄、撹拌し、そして上清を最初の上清に加え た。合わせた上清、オリゴリボヌクレオチドを含む、を白色粉末になるまで乾燥 した。 塩基を脱保護されたオリゴリボヌクレオチドを無水ＴＥＡ・ＨＦ／ＮＭＰ溶液 （１．５ｍＬ Ｎ−メチルピロリジノン、７５０μｌ ＴＥＡ及び１．０ｍｌ ＴＥＡ・３ＨＦを使用してＨＦ濃度１．４Ｍとした溶液より２５０μｌ）に再懸 濁し、そして１．５時間６５℃に加熱した。結果として得られた、完全脱保護済 、オリゴマーを陰イオン交換による脱塩の前に５０ｍＭ ＴＥＡＢ（９ｍｌ）に で反応を停止させた。 脱保護オリゴマーの陰イオン交換による脱塩のために、そのＴＥＡＢ溶液を前 もって５０ｍＭ ＴＥＡＢ（１０ｍｌ）で洗浄されたＱｉａｇｅｎ ５００R陰 イオン交換カートリッジ（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．）にかけた。カートリッジを ５０ｍＭ ＴＥＡＢ（１０ｍｌ）で洗浄した後、ＲＮＡを２Ｍ ＴＥＡＢ（１０ ｍｌ）で溶出しそして白色粉末になるまで乾燥させた。ＲＮＡの脱保護； オリゴリボヌクレオチドの化学合成が高収率であるためには、オリゴリボヌク レオチドの脱保護に関連する２つの主要な段階（すなわち、環外アミノ保護基及 びリン酸保護基を除去する水溶液中での塩基処理並びにｔブチルジメチルシリル 基などの２’−ＯＨ アルキルシリル保護基を除去するフルオリド処理）が短縮 されることが重要である。 上記Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂらは、無水メチルアミン及びトリエチルアミントリ ハロゲンフルオリドを使用する時間短縮（〜２時間）１容器脱保護法を記載して いる。フルオリド処理中の水分の混入は脱シリル化反応の効率を悪くすることも あるということが最近発表されていることから（Ｈｏｇｒｅｆｅら、Ｎｕｃｌｅ ｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９３），２１４７３９−４７４１）、１容器 法で効果的にオリゴリボヌクレオチドを脱保護するためには、３３％メチルアミ ンの無水エタノール溶液などの無水の塩基溶液を使用し、その後濃トリエチルア ミントリヒドロフルオリドを用いることが必要である。しかしながら、２’−ヒ ドロキシル基の脱保護より先に固相担体を部分的に脱保護されたオリゴリボヌク レオチドから分離するプレート形式での脱保護法などにおいてはこの方法は扱い にくいであろう。実際には、使用されるメチルアミン溶液が無水であることから 、塩基処理後に得られる負に荷電したオリゴリボヌクレオチドを溶解するために は適当でないであろう。従って、出願人は１：１混合のメチルアミンのエタノー ル溶液及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド （ＤＭＦ）、メタノール、ヘキサメチルホスホロアミド（ＨＭＰＡ）、１−メチ ル−２−ピロリジノン（ＮＭＰ）又は２−メトキシエチルエーテル（ｇｌｙｍｅ ）などの極性の異なる添加剤を検討した。これら全ての添加剤の中で、ジメチル スルホキシドは部分的に脱保護されたオリゴリボヌクレオチドを効率良く溶解す ることが可能である。１容器及び２容器脱保護方法の比較は図３３において図解 及び説明されている。 脱保護法は一般にＮＨ4ＯＨによる環外アミノ保護基の脱保護を含んでおり、 これは時間がかかり（６〜２４時間）そして非効率的である。この段階の次には アルキルシリル保護基の除去を促進するＴＢＡＦによる処理が続く、これもまた 時間がかかりそして効率的な脱保護を達成するにあたり非常に効果的でない。 このオリゴリボヌクレオチドの脱保護用の２段階法についての最近の改良がＷ ｉｎｃｏｔｔら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９５，２３，２ ６７７−２７８４）及びＶｉｎａｙａｋら、（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓ ｙｍｐｏｓｉｕｍ ｓｅｒｉｅｓ，１９９５．３３，１２３−１２５）によって 報告されている。最適化された条件では、環外アミノ保護基を除去するためにア ンモニウムヒドロキシドカクテルの代わりにメチルアミン水溶液を６５℃１５分 間使用し、そして２’−ＯＨアルキルシリル保護基を除去するために必要な脱シ リル化処理にはトリエチルアミン３フッ水素（ＴＥＡ．３ＨＦ）、Ｎ−メチル− ピロリジノン及びトリエチルアミンの混合物を６５℃９０分間使用する、すなわ ちテトラブチルアンモニウムフルオリドを変更する。 Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら、国際ＰＣＴ出願番号ＷＯ９５／２３２２５はＲＮＡ の１容器脱保護法について記載している。７３頁において記載； 「ＲＮＡの大量合成において脱保護に必要な時間を最少にする及び脱保護段階 を簡素化する試みにおいて、出願人は１容器脱保護法を記載する．．。本方法に 従って、メチルアミン水溶液の代わりに無水メチルアミンが使用される。塩基の 脱保護は６５℃で１５分間行われそして反応物は１０分間冷却される。そして、 ２’−ヒドロキシル基の脱保護が同じ容器内でＴＥＡ・３ＨＦ試薬中で９０分間 行われる。反応は１６ｍＭ ＴＥＡＢ溶液で停止される。」 本発明はＲＮＡ分子脱保護ための１容器法に関する。本発明は、高効率法（例 えば、９６穴形式）において合成ＲＮＡの生産法を加速する、核酸塩基及び２’ −ＯＨ基から保護基を除去する新規の方法を記載する。 ＲＮＡの化学合成は一般に、一度に１本のオリゴリボヌクレオチドだけを合成 するＲＮＡ合成機で伝統的カラム形式を使用して行われる。時間効率化法におい て一つより多いＲＮＡ分子を同時に合成する方法は、伝統的カラム法に代わる合 成法、例えば９６本までのＲＮＡを同時に合成することも出来る９６穴プレート 形式が必要である。複数のＲＮＡ分子を同時合成する本法を発展させるために、 合成後のＲＮＡの脱保護（すなわち、環外アミノ保護基及びリン酸保護基などの 塩基保護基の除去並びにｔブチルジメチルシリルなどの２’−ＯＨ保護基の除去 ）などの時間を消費するいくつかの段階を加速することが重要である。好ましい 態様において、本発明はＲＮＡの迅速脱保護のための１容器法を記載する。 上記Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂらは、無水メチルアミン及びトリエチルアミン３フ ッ化水素を用いるＲＮＡ脱保護のための１容器法を記載している。この方法は３ ３％メチルアミンの無水エタノール溶液に続いて濃トリエチルアミン３フッ化水 素を塩基の無水溶液として用いる１容器法での効果的なオリゴリボヌクレオチド の脱保護法を含む。しかしながら、そのような方法は、９６穴プレートなどでプ レート形式でのＲＮＡ合成の脱保護においては扱いにくいであろう、それは２’ −ＯＨヒドロキシル基の脱保護の前に部分的に脱保護されたＲＮＡを固相担体よ り分離する必要があるためであろう。さらに、使用されるメチルアミン溶液が無 水であることから、塩基処理後に得られる負に荷電したオリゴリボヌクレオチド を溶解することは困難であろう。従って、第一の側面において本発明はメチルア ミンのエタノール溶液と、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ジメチ ルホルムアミド（ＤＭＦ）、メタノール、ヘキサメチルホスホロアミダイト（Ｈ ＭＰＡ）、１−メチル−２−ピロリジノン（ＮＭＰ）、２−メトキシエチルエー テル（ｇｌｙｍｅ）または類似化合物などの極性添加剤との１：１の混合物を使 用することを記載する。より具体的には、部分的に脱保護されたオリゴリボヌク レオチドにジメチルスルホキシドが使用される（図３２）。１容器及び２容器脱 保護法の比較は図３３において図解及び説明される。 本発明は９６穴プレー卜形式においてのＲＮＡ迅速（高効率）脱保護法にさら に関する。より具体的には高い生物学的活性を有するマイクログラム量より多く の、ＲＮＡ酵素分子の迅速脱保護が記載される。酵素的に活性なＲＮＡの高収率 及び高収量での回収はその脱保護の際に行われる特定の決定的段階に依存するこ とが示されている。 好ましい態様において、本発明は保護基を有するＲＮＡ分子の１容器脱保護法 を記載し、その方法は；ａ）ＲＮＡの部分的脱保護に適した条件下において、Ｒ ＮＡ分子を無水アルキルアミン（アルキル基は分岐している又は分岐していない 、エチル、プロピル又はブチルであることも可能でありそして好ましくはメチル 、例えばメチルアミン、である）、トリアルキルアミン（アルキル基は分岐して いる又は分岐していない、メチル、プロピル又はブチルであることも可能であり そして好ましくはエチル、例えばエチルアミン、である）及びジメチルスルホキ シドの、好ましくは１０：３：１３、又は１：０．３：１の割合の混合物に２０ −３０−℃で約３０−１００分間、好ましくは９０分間、接触させ環外アミノ（ 塩基）保護基及びリン酸保護基（例えば２−シアノエチル）を除去し、（対比、 Ｎ Ｈ4ＯＨ／ＥｔＯＨ又はＮＨ3／ＥｔＯＨを使用して５５−６５℃で４−２０時間 、又は４０％メチルアミン水溶液を用いて６５℃で１０−１５分間）；ｂ）ＲＮ Ａの完全な脱保護に適した条件下において、部分的に脱保護されたＲＮＡを無水 トリエチルアミン・フッ化水素（３ＨＦ・ＴＥＡ）に接触させ、そして約５−３ ０分間、好ましくは１５分間、５０−７０℃、好ましくは６５℃、に加熱し、２ ’−ヒドロキシル保護基を除去する（対比、ＴＢＡＦを使用して８−２４時間， 又はＴＥＡ・３ＨＦを使用して２４時間（Ｇａｓｐａｒｕｔｔｏら、Ｎｕｃｌｅ ｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９２，２０，５１５９−５１６６）（他のアル キルアミン・ＨＦ混合物を使用しても良い、例えばトリエチルアミン又はジイソ プロピルエチルアミン））、を含む。そして反応を炭酸水素アンモニウム水溶液 （１．４Ｍ）を用いて停止することもできる。いくつかの他の緩衝液を脱シリル 化反応の停止に使用することも可能であるが（すなわち、炭酸水素トリエチルア ンモニウム、酢酸アンモニウム）、オリゴリボヌクレオチドの５’末端にある５ ’−Ｏ−ジメトキシトリチル基を保持するためには炭酸水素アンモニウム緩衝液 が完全に適当であり、それにより逆相に基づく固相抽出精製法が容易になる。 「１容器」脱保護法は、２容器脱保護法での複数の容器の使用の代わりに、Ｒ ＮＡ脱保護の過程を１個の容器内で行うことを意味する。 他の好ましい態様において、本発明は保護基を有するＲＮＡ分子の１容器脱保 護法を記載し、その方法は；ａ）ＲＮＡの部分的脱保護に適した条件下において 、ＲＮＡ分子を無水アルキルアミン（アルキル基は分岐している又は分岐してい ない、エチル、プロピル又はブチルであることも可能でありそして好ましくはメ チル、例えばメチルアミン、である）、及びジメチルスルホキシドの、好ましく は１：１の割合の混合物に２０−３０−℃で約３０−１００分間、好ましくは９ ０分間、接触させ環外アミノ（塩基）保護基及びリン酸保護基（例えば２−シア ノエチル）を除去し（対比、ＮＨ4ＯＨ／ＥｔＯＨ又はＮＨ3／ＥｔＯＨを使用し て５５−６５℃で４−２０時間、又は４０％メチルアミン水溶液を用いて６５℃ で１０−１５分間）；ｂ）ＲＮＡの完全な脱保護に適した条件下において、部分 的に脱保護されたＲＮＡを無水トリエチルアミン・フッ化水素（３ＨＦ・ＴＥＡ ）に接触させ、そして約５−３０分間、好ましくは１５分間、５０−７０℃、好 ま しくは６５℃、に加熱し、２’−ヒドロキシル保護基を除去する（他のアルキル アミン・ＨＦ混合物を使用しても良い、例えばトリエチルアミン又はジイソプロ ピルエチルアミン）を含む。そして反応を炭酸水素アンモニウム水溶液（１．４ Ｍ）を用いて停止することもできる。いくつかの他の緩衝液を脱シリル化反応の 停止のために使用することも可能であるが（すなわち、炭酸水素トリエチルアン モニウム、酢酸アンモニウム）、オリゴリボヌクレオチドの５’末端にある５’ −Ｏ−ジメトキシトリチル基を保持するためには炭酸水素アンモニウム緩衝液が 完全に適当であり、それにより逆相に基づく固相抽出精製法が容易になる。 他の側面において本発明は、環外アミノ基及びリン酸基脱保護反応がメチルア ミンのエタノール溶液を用いて室温で約９０分間又は６５℃で１５分間または４ ５℃で３０分間又は３５℃で６０分間行われるＲＮＡの脱保護方法について記載 する。 好ましい態様において、本発明のＲＮＡの脱保護方法は（上記、Ｓｃａｒｉｎ ｇｅら；上記、Ｗｉｃｏｔｔら）に記載のカラム形式を用いて合成されたリボザ イムを脱保護するために使用される。 不活性ハンマーヘッド型リボザイムはＧ5をＵに及びＡ14をＵに置換して合成 された（番号はＨｅｒｔｅｌ，Ｋ．Ｊ．ら、１９９２，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉ ｄｓ Ｒｅｓ． ，２０，３２５２による）。 段階ごとの平均カップリング収率は＞９８％だった（Ｗｉｎｃｏｔｔら、１９ ９５ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３，２６７７−２６８４）。 ヘアピン型リボザイムは２個の部分に分けて合成されそして活性型リボザイム に再構築するためにアニールされる（Ｃｈｏｗｒｉｒａ及びＢｕｒｋｅ、１９９ ２ Ｎｕｃｌｅｃｉ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０，２８３５−２８４０）。リ ボザイムはバクテリオファージ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いてＤＮＡの鋳 型からもまた合成される（Ｍｉｌｌｉｇａｎ及びＵｈｌｅｎｂｅｃｋ、１９８９ ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８０，５１）。 リボザイムは、安定性を向上させるため及び／又は触媒活性を向上させるため にヌクレアーゼ抵抗基、例えば２’−アミノ基、２’−Ｃ−アリル基、２’−フ ルオロ基、２’−Ｏ−メチル基、２’−Ｈ−基、ヌクレオチド塩基修飾による修 飾により改変される（参照 Ｕｓｍａｎ及びＣｅｄｅｒｇｒｅｎ、１９９２ Ｔ ＩＢＳ １７，３４；Ｕｓｍａｎら、１９９４ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．３１，１６３；Ｂｕｒｇｉｎら、１９９６ Ｂｉｏｃｈｅｍ ｉｓｔｒｙ ６，１４０９０）。 リボザイムは一般的な方法を用いてゲル電気泳動法で精製させたか又は高圧力 液体クロマトグラフィーを用いて精製され（ＨＰＬＣ；参照 Ｓｔｉｎｃｈｃｏ ｍｂら、国際ＰＣＴ出願番号ＷＯ９５／２３２２５、全文を参考資料として本明 細書に援用する）そして水に再懸濁される。 化学的に合成された、本研究において有用である、リボザイムの配列は表ＸＩ Ｉ−ＸＩＸに示される。当該技術においてこれらの配列は、活性を変化させるた めにリボザイムの酵素部位（結合部位を除く全て）が改変される多数のそのよう な配列の内の代表的なものにすぎないと認識される。例えば、ハンマーヘッド型 リボザイムのステムループＩＩ配列は、最低限２個の塩基対合ステム構造が形成 されることの出来る配列を含むように改変（置換、欠失、及び／又は挿入）され ることも出来る。同様に、ヘアピン型リボザイムのステムループＩＶ配列は、最 低限２個の塩基対合ステム構造が形成されることの出来る配列を含むように改変 （置換、欠失、及び／又は挿入）されることも出来る。好ましくは、これらの位 置に２００より多くない塩基が挿入される。表ＸＩＩ−ＸＩＸに示される配列は リボヌクレオチド又は他のヌクレオチド又は非ヌクレオチドから形成されてもよ い。そのようなリボザイム（酵素活性を有する）は表に具体的に記載するリボザ イムと同等である。ヌクレオチド三リン酸 修飾したヌクレオチド三リン酸を用いることは組合せ化学に大きく寄与したと 考えられる。ヌクレオチド三リン酸の合成さらにはポリメラーゼを用いてヌクレ オチド三リン酸を核酸へ組み込ませることは核酸研究の進歩に大いに貢献してき た。ポリメラーゼはヌクレオシド三リン酸を前駆分子としてオリゴヌクレオチド を組み立てる。各ヌクレオチドはオリゴヌクレオチドの最終ヌクレオチドの３’ ヒドロオキシル基が隣接するヌクレオチドの５’三リン酸を求核攻撃することに よって形成されたフォスフォジエステル結合でオリゴヌクレオチドと結合する。 ヌクレオチドは一回に１個づづオリゴヌクレトチドの５’から３’の方向に組み 込まれる。この過程によって、事実上、DNAあるいはRNA鋳型からRNAが産生され 、増大される。 ほとんどの天然ポリメラーゼは標準のヌクレオシド三リン酸を核酸の中へ組み 込ませる。例えば，DNAポリメラーゼはdATP、dTTP、dCTP、およびdGTPをDNAの中 へ、さらに一般的にRNAポリメラーゼはATP、CTP、UTP、およびGTPをRNAの中へ組 み込ませる。しかし、ある種のポリメラーゼは非標準ヌクレオシド三リン酸をも 組み込むことが可能である(Joyce,1997,PNAS 94,1619-1622,Huang et al.,Bioch emistry)。 ヌクレオシドがポリメラーゼによってRNA転写に組み込まれる前に、まずヌク レオシド三リン酸に転換され、これが当該酵素によって認識されると考えられる 。未ブロックヌクレオシドをPOCL3およびトリアルキルリン酸塩で処理するとヌ クレオシド５’−リン酸ジクロライドを生成することが明らかとなった（Yoshlk awa et al.,1969,Bull,Chem,Soc,(Japan)42,3505）。DMF中で過剰のトリ-n-ブチ ルアンモニウムピロリン酸塩で処理し、加水分解するステップを加えることによ ってアデノシン或いは２’ジオキシアデノシン５’−三リン酸塩が合成された(L udwig,1981,Acta Biochim,et Biophys,Acad.Sci,Hung,16,131-133)。 従来のRNAポリメラーゼでは、非標準ヌクレオシド三リン酸は容易にＲＮＡ転 写には組み込まれない。デオキシリボ核酸のRNAへの組み込みを容易にするため にRNAポリメラーゼに変異が導入された(Sousa & Padilla,1995,EMBO J, 14,4609-4621,Bonner et al.,1992,EMBOJ.11,3767-3775,Bonner et al.,1994,J, Biol.Chem.42,25120-25128,Aurup et al.,1992,Biochemistry 31,9636-9641)。 McGee他のPCT国際公開第WO 95/35102号は、バクテリオファージT7RNAポリメラ ーゼを用いて２’-NH2-NTP’、２’-F-NTP’および２’-デオキシ-2’-ベンチル オキシアミノUTPをRNAに組み込ませる報告をのせている。 Wieczorek他、1994,Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 4,987-9９４ はバクテリオファージT7 RNAポリメラーゼを用いて7-ジアザ−アデノシン三リン 酸をRNA転写に組み込ませる報告を載せている。 Lin他、1994,Nucleic Acids Research 22,5229-5234，は、バクテリオファー ジT7 RNAポリメーゼおよびポリエチレングリコール緩衝液を用いて２’-ＮＨ2-C TPおよび２’-NH2-UTPをRNAに組み込ませる報告をしている。この報告は、ポリ メラーゼで合成したRNAを、in vitroでヒト好中球エラセターゼ(HNE)へのアプテ マーの選択に使用する報告を載せている。 本発明の特徴は、例えば以下の式Ｉのように、NTPが三リン酸-ORを持っている ことである。 Ｒはヌクレオシドで；特定すれば、ヌクレオシド２’-O-メチール-2,6-ジアミ ノプリンリボシド；2’-(N-アラニール)アミノ-2’-デオキシ-ウリジン；2’-(N -フェニールアラニール)アミノ-2’デオキシ-ウリジン；2’-デオキシ-2’-(N- β-アラニール)アミノ；2’-デオキシ-2’-(リシール)アミノウリジン；2’-C- アリルウリジン;2’-O-アミノ-ウリジン;2’-O-メチールチオメチールアデノシ ン;2’-O-メチールチオメチールシチジン；2’-O-メチールチオメチールグアノ シン；2’-O-メチールチオメチールウリジン；2’-デオキシ-2’-(N-ヒッチジー ル)アミノウリジン；2’-デオキシ-2’-アミノ-5-メチールシチジン；2’-(N-β -カルボキサミ ジン-β-アラニール)アミノ-2’-デオキシ-ウリジン;2’-デオキシ-2’-(N-β- アラニール)-グアノシン；および２’-O-アミノ-アデノシンなどである。 第二の特徴は、ピリミジンヌクレオチド三リン酸（UTP、２’-O-MTM-UTP、dUT Pのようなもの）の合成過程についてである、それには一リン酸化のステップが 含まれ、そこでピリミジンヌクレオチドは、ピリミジン一リン酸塩を形成する最 適条件下でリン酸化混合剤（リン酸オキシクロライド、リン酸−トリスートリア ゾ化合物、リン酸-トリス-トリイミダゾール化合物のようなもの）、トリアルキ ルリン酸塩（トリエチールリン酸塩或いはトリメチールリン酸塩など）、および ジメチルアミノピリジン(DMAP)と接触する；次にピリミジン一リン酸塩はピリミ ジン三リン酸塩を形成する最適条件下でピロリン酸化剤（トリブチルアンモニア ピロリンサン塩など）と接触する。 「ピリミジン」は修飾或いは非修飾ピリミジン６員環誘導体を包含するヌクレ オチドを意味する。１つの例として修飾或いは非修飾ウリジンがある。 「ヌクレオチド三リン酸」或いは「NTP」は、修飾或いは非修飾リボース或い はデオキシリボースの５’ヒドロオキシル基で（この場合１位は核酸基或いは水 素）３つの無機リン酸基のヌクレオシド結合を意味する。三リン酸部位はこの基 の機能を損なわない化学分子を入れて修飾することができる（例えばRNA分子へ の組み込み）。 他の好適な実施態様は、速成発明したヌクレオシド三リン酸(NTP'）を、RNAポ リメラーゼを用いてオリゴヌクレオチドに組み込ませることである。RNAポリメ ラーゼは変異型に制約されるわけではなく、自然のバクテリオファージＴ７、SP ６、Ｔ３RNAポリメラーゼも含まれる。 好適な実施態様は、この発明は修飾したNTPをオリゴヌクレオチドへ組み込ま せるプロセスが特徴である。これにはDNA鋳型、RNAポリメラーゼ、NTP、および 修飾NTPを、オリゴヌクレオチドへの組み込み最適条件下でこれを強める促進剤 などの混合体とインキュベートするステップが含まれている。 「修飾NTPの組み込み促進剤」とは、RNAポリメラーゼによる修飾ヌクレオチド の核酸転写への組み込みをよくする試薬を意味する。そのような試薬はメタノー ルに制約されるものではなく；LiCl；ポリエチレングリコール（PEG）；ジ エチールエーテル；プロパノール；メチールアミン；エタノールなどもある。 好適な実施態様は、修飾ヌクレオシド三リン酸塩を転写によって核酸分子の中 へ組み込ませることができることであり、これらには酵素核酸、アンチセンス、 ２-５アンチセンスキメラ、オリゴヌクレオチド、三重体形成オリゴヌクレオチ ド(TFO)、アプタマーなどがある(Stull et al.,1995 Pharmaceutical res.12,46 5)。 「アンチセンス」とは、標的RNAに結合する非核酸触媒を意味する、すなわちR NA-RNA或いはRNA-DNA或いはRNA-PNA（蛋白核酸；Egholm et al.,1993 Nature 36 5,556）の相互作用で、それは標的RNAの活性を変える（Stein and Cheng,1993 S cience 261,1004;Agrawal et al.IU.S.Patent No.5,591,721;Agrawal,U.S.Paten t No.5,652,356参照） 「２-５Ａアンチセンスキメラ」とは、５’がリン酸化され２’-５’がリンク したアデニール酸残基を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを意味する。こ れらのキメラは標的RNAと特異的連鎖で結合し、細胞質２-５依存性リボヌクレア ーゼを活性化するする、これは標的RNAを順番に裂開する（Torrence et al.,199 3 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90,1300）。 「三重体を形成するオリゴヌクレオチド（TFO）」とは、特異的連鎖で二重螺 旋構造のDNAに結合し、三重螺旋構造を形成すことができるオリゴヌクレオチド を意味する。そのような三重螺旋構造の形成は、標的遺伝子の転写を阻害するこ とが明らかとなっている（Duval-Valentin et al.,1992 Proc.Natl.Acad.Sci.U SA89,504）。 ここで用いられる「オリゴヌクレオチド」とは、２つ或いはそれ以上のヌクレ オチドを持っている分子を意味する。ポリヌクレオチドは一重，二重，三重螺旋 になり得るし、さらに修飾或いは非修飾ヌクレオチドまたは非ヌクレオチド或い は各種混合体およびそれらを組合せて持つこともできる。 さらなる好適な実施態様は、速成発明の修飾ヌクレオシド三リン酸塩を組合せ 化学、或いはin vitroで新規機能を有する核酸分子の選択に用いることができる ことである。スクリニングライブラリーを作製する修飾オリゴヌクレオチドは酵 素合成ができる。 塩基および糖でヌクレオシドを修飾するのは、各種の自然発生RNAで発明さ れている（e.g.,tRNA,mRNA,rRNA;reviewed by Hall,1971 The Modified Nucleos ides in Nucleic Acids,Columbia University Press,NewYork;Limbach et al.,1 994 Nucleic Acids Res.22,2183）。生化学的な優位性、構造的および熱力学的 特徴、さらには核酸中のヌクレオシド修飾によるヌクレアーゼに対する耐性など を解明しようとする試みで、多くの研究者はヌクレオシド、ヌクレオチドおよび 各種塩基、糖で修飾したリン酸アミノ化合物、またはそれらをオリゴヌクレオチ ドに組み込ませたものなどの化学的合成を行った。 Uhlmann and peyman,1990,Chem.Reviews 90,543,はアンチセンスオリゴヌクレ オチドを安定化するために、ある種の修正ヌクレオシド使用して検討している。 Usman他、PCT国際公開第WO/93/15187号および第WO 95/13378号は、核酸触媒の ヌクレアーゼに対する安定性を高めるために糖、塩基およびバックボン修飾を用 いることを報告している。 Eckstein他、PCT国際公開第WO 92/07065号は、核酸触媒のヌクレアーゼに対す る安定性を高めるために糖、塩基およびバックボン修飾を用いることを報告して いる。 Grasby他、1994,Proc.Indian Acad.Sci.,106,1003は、RNAの構造と機能を研究 するために、合成したオリゴリボヌクレオチド類似体を適用することを報告して いる。 Eaton and Pieken、1995,Annu.Rev.Biochem.,64,837,はRNA分子のヌクレアー ゼ安定性を高める糖、塩基およびバックボン修飾を報告している。 Rosemeyer他、1991,Helvetica Chem.Acta,74,748,は１-（２’-デオキシ-β-D -キシロフラノシル）チミンを持つオリゴジオキシヌクレオチドの合成を報告し ている。 Seela他、1994,Helve-tica Chem.Acta,77,883,は１−（２’-デオキシ-β-D- キシロフラノシール）シトシンを持つオリゴジオキシヌクレオチド合成を報告し ている。 Seela他、1996,Helvetica Chem.Acta,79,1451,は４個の自然塩基を持つキシロ ースDNAの合成を報告している。 その他の好適な実施態様は、速成発明に記載した分子がDraper et al.,が報告 したように触媒活性を最適化できることである。詳細はここでは述べないが、リ ボザイムの結合アームの長さを変える、或いは化学的に合成した修飾（塩基、糖 および/或いはリン酸塩）リボザイムが含まれている、これは血清リボヌクレア ーゼによるリボザイムの分解を抑えるか、或いはリボザイムの酵素活性を高める ものである（e.g.,Eckstein et al.,International Publication No.WO 92/0706 5;Perrault et al.,1990 Nature 344,565;Pieken et al.,1991 Science 253,314 ;Usman and Cedergren,1992 Trends in Bicchem.Sci.17,334;Usman et al.,Inte rnational Publication No.WO 93/15187;およびRossi et al.,International Pu bblication No.WO 91/03162;Sproat,US Patent No.5,334,711;およびBurgin et al.,supra参照；これらの報告はすべて塩基、リン酸塩および/或いは酵素RNAの 糖分子に対する各種化学的修飾についてである）。細胞内で効力を高める修飾、 およびRNA合成時間を短縮し、化学的必要条件を減らすためにステムループ構造 から塩基を外すことなどが報告されている（これらすべての資料はここに添付さ れている）。 「酵素活性を高める」とは、細胞内で測定された活性および/或いはin vivoで の活性で、これは触媒効果とリボザイム安定性両者の反映であることを意味して いる。本発明において、製品の特徴は、in vivoで、すべてのRNAリボザイムと比 較して有意に増減はしていない。 その他の好適な実施態様は、酵素活性を持続或いは高める化学的修飾をした核 酸触媒を作ることである。このような核酸はまた、一般的に未修飾核酸よりもヌ クレアーゼに対して抵抗性がある。従って、細胞内または/或いはin vivoで活性 が有意に低下することはないと考えられる。ここに示した例のように、このよう なリボザイムは細胞内または/或いはin vivoで、例え活性が全体として１０倍低 下しても有用である（Burgin et al.,1996,Biochemistry,35,14090）。そのよう なリボザイムをここではすべてのRNAリボザイムに対する酵素活性が“持続的” であると表している。 最も好適な実施態様は、本発明は各種サイズのリボザイムライブラリーの合成 法に特色があるということである。本発明は、適合したヌクレオシド類似体から 各種サイズのリボザイムライブラリーを化学的に合成する方法を報告している。 ヌクレオチド形成ブロックの選択およびカップリング効率の決定に対する考察 ：リボザイムライブラリーのデザインに包含される特異的ヌクレオチドの選択的 につながる構造への考察に加えて（水素結合ドーナーおよび受容体、スタッキン グ特性、糖のパカー配向，ヌクレオチドを構成するサブグループの疎水性或いは 親水性）、ヌクレオチド形成ブロックを選択するときに検討されるべき一つの重 要な特徴はリボザイムの合成と形成ブロックとの化学的相溶性である。“ヌクレ オチド形成ブロック”とは、活性化すれば直ちにＰvを含むヌクレオシド内リン ケージを放して即反応する酸化ステートＶで、適切に防御されたリン原子を有す るヌクレオシド或いはヌクレオシド類似体のことである。適合したヌクレオチド 形成ブロックはまた、活性化すれば直ちにＰIIIを有するヌクレオシド内リンケ ージを放して即反応する酸化ステIIIのリン原子を持っている、これは求めるＰv を有するヌクレオシド内リンケージに酸化され得ると考えられる。本出願人はリ ン酸アミノ化合物の性質（ＰIII）がリボザイムライブラリーの合成に対するカ プリング法に適していることを発見した。ある種のリボザイムライブラリーをデ ザインし、合成する間に各種検討がなされた；それはa）大部分が標準の長さの リボザイムであるためには、リボザイムライブラリーのために検討するヌクレオ チド形成ブロックのカプリング効率は９０％以下に落ちてはならない;b）ヌクレ オチド形成ブロックは選択した合成法および特定リボザイムライブラリーの脱防 御条件に化学的に安定でなければならない;c）リボザイムラィブラリー組み込ま れるヌクレオチド形成ブロックに対する脱防御計画は、比較的類似するもので、 さらにリボザイム脱防御プロトコールに完全に適合するものでなければならない 。特に，リボザイムライブラリーの合成においては、脱防御を延長する必要があ るか、或いは粗雑な処理を続けられないようなヌクレオチド形成ブロックは避け なければならない。概して，ヌクレオチド形成ブロックの反応性は、非蛋白性お よびやや極性の溶解液の中で１００mMから２００mMに希釈するとき最適でなけれ ばならない。また、Wincott et al.,supra,の例のように６５℃、４時間エタノ ールと濃縮アンモニア水３：１の混合体を用い、その後フッ素処理をする脱防御 条件は、リボザイム合成には特に有用であるし、またヌクレオチド形成ブロック の脱防御経路としてはむしろ選択すべきものである。 一つの好適な実施態様において、リボザイムライブラリーを作製するための「 ヌクレオチド形成ブロックの混合」というアプローチを報告する。この方法は、 各種ヌクレオチド形成ブロックがその混合体の中でそれぞれ同等に表現されるこ とを確実にする割合で混合することに関してのものである。この混合体はリボザ イムのランダムに選択された位置に組み込まれる。 リボザイムライブラリーに組み込まれるために選択されたヌクレオチド形成ブ ロックは、概して、求められるリン酸アミノ化合物の濃度で混合体を作製するた めに無水アセトニトリルのような試薬の中で最適濃度で混合されたものである。 当該リボザイム内（Ｘ上述）の一つ、或いはそれ以上のランダムの位置でのリボ ザイムライブラリーの組合せ合成に対するこのアプローチは特に有用である、と いうのも、通常のDNA合成機は単一の形成ブロックを含む溶液に類似する形成ブ ロック混合体しか処理することができないからである。そのようなヌクレオチド 形成ブロック混合体は、固相担体にカプリングさせるか或いは固相担体に付着し て発達中のリボザイム連鎖にカプリングさせるしかない。合成されたリボザイム ライブラリーが求められる複合体を確実に作るために、合成スケールは当該ライ ブラリーのトータルの複合体以上に実際は拡大される。例えば、２．５μモルの リボザイム合成には、リボザイムライブラリー１０億の化合物各一づつの化合物 にｎモル弱になるように〜３×１０17のリボザイム分子を準備する。 ジビニールベンゼンを高度にクロスリンクさせたポリスチレ固相担体は、リボ ザイムライブラリー合成においてむしろ定着した状況である。しかし、DNA或い はRNA合成で使われるその他の固相担体システムもリボザイムライブラリーの合 成で使用できる。これにはシリカをベースにした多孔質ガラスビーズ(CPG)或い は重合体ですべてのポリスチレン樹脂誘導体、重合体を接合したもので、エチレ ングリコール、オリゴエチレングリコールとクロスリンクしたクロロメチル化ポ リスチレンなどがある。 混合体中に存在するヌクレオチド形成ブロックのカプリングキネテイックが異 なるため、混合体構成員個々の相対的組み込みに対する評価をし、さらに必要な らば、混合体中形成ブロックの相対濃度が等モルになるように調整し、キネテイ ックパラメータを補完する必要がある。一般的に，遅いカプリングキネテイック を示す形成ブロックは、混合体中で過剰に表現さており、また早いカプリングキ ネテイックを示す場合はこれとは逆になる。等モルでの組み込みが求められると きに、不同等組み込みの限度は一般的に＋/−１０％位と考えられる。 ランダムリボザイムライブラリーの合成は、求められるヌクレオチド形成ブロ ック混合体か、或いはある種のランダム位置の組合せで（１つ或いはそれ以上の 形成ブロック混合体を用いることによって得られる）、または単一ヌクレオチド 形成ブロック剤の組み込みによって導入される１つ或いはそれ以上の固定位置で 行われる。例えば、第２例以下で用いられたオリゴヌクレオチドモデル５’−TT ＸＸＸＸ TTB−３’では、３’−１で終わる位置は２’−デオキシ反転塩基 性リボースで固定（B）、２，３，８および９位は２’−デオキシ−チミジン（T ）で固定されいる、一方Ｘ４−７位は、Ｘ混合体を作るすべてのヌクレオチド形 成ブロックとほぼ等モル配分に対応している。 その他の好適な実施態様において、リボザイムライブラリーを作る「混合およ び分裂」のアプローチを報告している。この方法は、当該ライブラリーに包含さ れるいくつかの選択されたヌクレオシド形成ブロックが巨大で多様（５ヌクレオ シド形成ブロック以上）であるか、または/或いは選択されたヌクレオシド形成 ブロックのカプリングキネテイックが、相対濃度の調整と適正化を行った後でも 競合カプリングを受け入れないときは特に有用である。この方法にはマルチース テッププロセスが関連しており、そこではリボザイムライブラリー合成に使用さ れる固相担体が同じ部分に「分裂」（分割）している（部分の数は、リボザイム の１つ或いはそれ以上のランダムの位置で組み込ませるために選択された異なる ヌクレオシド形成ブロック(n)の数と同じである）。例えば、もしそこに１０個 のリボザイムの１つ或いはそれ以上のランダムの位置で組み込まれるために選択 された異なるヌクレオシド形成ブロックがるとあすれば、固相担体は１０個の異 なる部分に分割される。それぞれの部分は独立して選択されたヌクレオシド形成 ブロックの１つに結合し、その後すべての部分は混合される。その次にリボザイ ム合成は形成ブロックの分割前の状態に戻る。このことはリボザイムライブラリ ーの合成がリボザイムの１つ或いはそれ以上の部分でランダムであることを可能 に する。「分裂」と「混合」ステップはリボザイム内ではランダムである部位の数 に依存している。例えば、ランダムであることが求められる３つの位置があれば 、リボザイムライブラリーを合成するためには３個の分裂と混合ステップが必要 である。 ランダムリボザイムライブラリーは非競合カップリング法を用いて合成される 、そこでは各選択されたヌクレオチド類似体「n」個別に固相担体の均等部分の 逆の「n」（1/n）或いは固相担体上で発達中のリボザイム連鎖の均等部分とカプ リングする。カプリング反応を証明するのに極めて便利な方法は標準分光光度計 のDMT分析を用いることである（Oligonucleotide Synthesis,A Practical Appro ach,ed.M.Gait,pp 48,IRC Press,Oxford,UK;参照）。続いてこれらの均等部分は 結合され、混合され、さらに新しい１つの部分に分離される。最近、オリゴヌク レオチドライブラリーを作製する同じようなアプローチがCookらによって報告さ れた（米国特許第5,587,471号）、参照のためここに挿入。ヌクレオチド合成 既知技術であるジメチルアミノピリジン（DMAP）をリン酸化プロトコールに加 えることで、ヌクレオシド１リン酸塩の収量は大きく増大し、反応時間も短縮さ れた（Fig29）。本発明でのヌクレオシドの合成は各種公表されている、また出 願人は以前の出願で（Beigelman et al.,International PCT publication No.WO 96/18736;Dudzcy et al.,Int.PCT Pub.No.WO 95/11910;Usman et al.,Int.PCT Pub.No.WO 95/13378;Matulic-Adamic et al.,1997,Tetrahedron Lett.38,203;Ma tulic-Adamic et al.,1997,Tetrahedron Lett,38,1669;ここに参照することによ りこれらすべてを関連づける）。これらヌクレオシドはトリエチルリン酸塩に溶 解され、アイスバスで冷却される。次にリン酸オキシクロライドが加えられ、さ らにDMAPが導入される。この反応は室温に暖められ、５時間反応させる。この反 応でヌクレオシド１リン酸塩が生成され、これは次にヌクレオシド三リン酸塩の 生成に用いられる。トイブチルアミンを加え、それに無水アセトニトリルを、さ らにトリブチルアンモニウムピロリン酸塩を加える。次にこの反応はTEABで冷却 され、室温で一晩攪拌される（約２０℃）。三リン酸 塩はカラムとHPLCを用いて純化され、化学構造はNMR分析で確認される。これら の熟練技術は、試薬、反応温度、純化法などは、代替するものや当量によって簡 単に変更でき、なお求める製品が収得できることを明らかにしている。 本発明は、ヌクレオシド三リン酸塩を得るものであり、これらは多くの別な目 的のために使用され得るものである。ヌクレオシドから形成されたヌクレオシド 三リン酸塩は表IIIの通りであり、これらは既知物質よりも新規性があり独特の ものである。DNA或いはRNAオリゴヌクレオチドに修正ヌクレオチドを組み込ませ ると、当該分子の性質を変えることができる。例えば、修正ヌクレオチドはヌク レアーゼの結合を阻害することができる、従って当該分子の化学的半減期は長く なる。これは当該分子が細胞培養基としてin vivoで使用されるときは特に重要 である。これらの分子に修正ヌクレオチドを導入すると、安定性が増大し、それ によってその分子の効果も大きくなることは既知のことである（Burgin et al., 1996,Biochemistry 35,14090-14097;Usman et al.,1996,Curr.Opin.Struct.Biol .6,527-533）。 修正ヌクレオチドは野生型および変異型ポリメラーゼのいづれかを用いて組み 込まれる。例えば、変異T77ポリメラーゼは、修正ヌクレオチド三リン酸塩、DNA 鋳型、および適切な緩衝液の存在下で使用される。これらの既知技術は、本発明 のNTPの組み込みにおいても他のポリメラーゼ、およびそれらの変異型を利用で きることを明らかにしている。核酸転写は放射性同位元素でラベルしたヌクレオ チド（α-32P NTP）の組み込みによって検出された。放射性同位元素でラベルし たNTPは試験された修正三リン酸塩と同じ塩基を含んでいた。メタノール、PEG、 およびLiClの効果は、これら化合物を個々に或いは組み合わせて加えることによ って試験された。核酸転写の検出と定量はMolecular Dynamics PhosphorImager を用いて行われた。転写効率は修正ヌクレオチド三リン酸塩の組み込みをすべて のリボ核酸コントロールのそれと比較することで評価した。野生型ポリメラーゼ が、自家製緩衝液および指図（Boehringer Mannheim）によってNTPの組み込みに 用いられた。転写条件 修正ヌクレオシド三リン酸塩のオリゴヌクレオチドへの組み込み率は、従来の 緩衝液条件に各種異なる修正NTP組み込み賦活剤を加えることによって増大させ ることができる。本出願人は、RNAポリメラーゼを使い、dNTPの組み込み率を上 げる目的でメタノールおよびLiClを用いている。これら修正NTP組み込み賦活剤 は転写を適正にするような異なった組合せと率で使用できる。ヌクレオシド三リ ン酸塩間で異なる最適反応条件は、従来の実験で簡単に決定できる。しかし平均 転写率を上げるようなメタノール或いはリチウムクロラドのような無機化合物な どの修正NTP組み込み賦活剤の包括的な投入については出願人が示している通り である。モノ、ジ、三リン酸ヌクレオシドの投与 ヌクレオチド一リン酸塩、二リン酸塩、或いは三塩酸塩は単独或いは他の薬剤 と配合して治療剤として使用できる。本発明の分子はSullivan他の,PCT国際公開 第WO 94/02595号の方法で患者に投与可能である。本発明の分子は、よく知られ ている各種の方法、これに制約されるわけではないが、リポソームカプセルに挿 入するか、イオン導入か、他の賦形剤、例えばヒトロゲル、サイクロデキストリ ン、生分解性ナノカプセル、および生体接着性マイクロカプセルなどに入れて細 胞に投与できると考えられる。ある適応症に対しては、リボザイムをex vivoで 、上記賦形剤と一緒或いは単独で、細胞或いは組織に直接投与することも可能で ある。代替的には、修正ヌクレオチド三リン酸塩、二リン酸塩、一リン酸塩／賦 形剤の配合を、局所的に直接注射，或いはカテーテル、注入ポンプ或いはステン トで投与できる。その他の投与法としては、制約されるわけではないが、血管、 筋肉、皮下或いは関節注射、噴霧吸入、経口（錠剤或いは丸剤）、局所性、全身 性、眼、腹膜内および/或いは鞘内などがある。より詳細な投与法はSullivan et al.,supra and Draper et al.,PCT WO93/23569に示されている、それはここに 参照として関連づけられる。 本発明はさらに式IIのような化合物と関連している： R1はOH、O-R3のR3はアルキル、アルケニル、アルキニル、アリル、アルキルア リル、カルボキシリックアリル、複素環式アリル、アミドおよびエステルなどか ら無関係に選択される；輪状、NHR4(R4=アルキル(C1-22)、アシル(C1-22)、置換 或いは非置換アリル)或いはOCH2SCH3(メチールチオメチール)、ONHR5R5は独立し たＨ、アミノアシル基、ペプチジール基、ビオチニール基、コレステリール基、 リポ酸残基、レチノイン酸残基、葉酸残基、アスクロビン酸残基、ニコチン酸残 基、６-ペニシラニン酸残基，７−アミノセファロスポリン酸残基、アルキル、 アルケニル、アルキニル、アリル、アルキルアリル、カルボシリックアリル、複 素環式アリル、アミド、或いはエステル、ON=R6でR6は独立したピリドキサール 残基、ピリドキサール-5-リン酸塩残基、１３-シス-レチナル残基、９-シス−レ チナル残基，アルキル、アルケニル、アルキニル、アルキルアリル、カルボシリ ックアルキルアリル、或いは複素環式アルキルアリル；Ｂは独立したヌクレオチ ド塩基或いはその類似体或いはハロゲン；Ｘは独立したリン酸含有基；それとR2 は独立したブロック基或いはリン酸含有基である。 とりわけ、“アルキル”基は、飽和脂肪族炭化水素、それには直鎖、分枝鎖、 およびサイクリックアルキル基などを指している。むしろ、このアルキル基は１ から１２の炭素を持っているものがよく。より好ましいのは、炭素が１から７の 低位アルキルで、さらに好ましいのは炭素が１から４のものである。アルキル基 は置換されるか、或いはされない可能性がある。置換された場合の置換基はヒド ロオキシ、シアノ、アルコキシ、NO2或いはN(CH3)2、アミノ、或いはSHが適して いる。 「アルケニル」基という用語は、未飽和炭化水素基で少なくとも１つの炭素２ 重結合を持っているものを指しており、それらには直鎖、分枝鎖、および環状基 がある。アルケニル基は１から１２の炭素を持っているものがよい。よりよいの は炭素が１から７の低位アルケニル基で、さらによいのは炭素が１から４のもの である。アルケニル基は置換されるか、或いはされない可能性がある。置換され た場合の置換基はヒドロオキシ、シアノ、アルコキシ、NO2、ハロゲン、N(CH3)2 、アミノ、或いはSHが適している。 「アルキニル」基という用語は、未飽和炭化水素基で少なくとも１つの炭素３ 重結合を持っているものを指しており、それらには直鎖、分枝鎖、および環状基 がある。アルキニル基は１から１２の炭素を持っているものがよい。よりよいの は炭素が１から７の低位アルキニル基で、さらによいのは炭素が１から４のもの である。アルキニル基は置換されるか、或いはされない可能性がある。置換され た場合の置換基はヒドロオキシ、シアノ、アルコキシ、=Ｏ、=Ｓ、NO2、或いはN (CH3)2、アミノ、或いはSHが適している。 「アリル基」は、芳香族基で少なくとも１つの共役ｐ電子システムを有する環 を持っているものを指しており、それらにはカルボサイクリックアリル、複素環 式、およびジアリル基があり、すべてオプションで置換できる。アリル基の置換 基には、ハロゲン、トリハロメチール、ハイドロキシル、SH、シアノ、アルコキ シ、アルキル、アルケニル、アルキニル、およびアミノ基などがある。 「アルキルアリル」基は、アリル基と共役結合したアルキル基（上述）を指す 。 「カルボサイクリックアリル」基は、その中の芳香族環を構成する原子がすべ て炭素であるものを指す。この炭素原子はオプションで置換される。 「複素環式アリル」基は、芳香族環に１から３の異種原子を持ち、残りの環を 構成する原子は炭素であるものを指す。適する異種原子としては、酸素、硫黄， および窒素、さらにフラニル、チエニル、ピリジル、ピロリル、ピロロ、ピリミ ジル、ピラジニル、イミダゾリル、などがあり、すべてオプションで置換される 。 「アミド」は、-C(O)-NH-RでＲはアルキル、アリル、アルキルアリル、或いは ハロゲンを指す。 「エステル」は、-C(O)-OR’で、Ｒはアルキル、アリル、或いはアルキルアリ ルを指す。 「ブロック基」は、ポリヌクレオチド合成後除去できるものを指し、および/ 或いはこれは固相ポリヌクレオチド合成と両立するものである。 「リン酸含有基」は、ジチオ酸塩、リン酸アミノ化合物、および/或いはオリ ゴ ヌクレオチドの一部を指す。 好適な実施態様で、本発明は式IIの化合物の合成プロセスが特徴である。 好適な実施態様で、本発明は、キシロフラノシルヌクレオシドリン酸塩の合成 プロセスが特徴であり、次のステップで構成されている：a）２’および５’を 防御したリボヌクレオシドを酸化剤、酸化クロム/ピリジン/無水酢酸、ジメチー ルスルフォキシド/無水酢酸、或いはデス-マーチン試薬（ペリオジナン）などで 酸化し、次に還元剤、トリアセトキシナトリム水酸化ホウ素、ナトリウム水酸化 ホウ素、或いはリチウム水酸化ホウ素などで、２’および５’を防御したキシロ フラノシルヌクレオシド合成の最適条件下で還元する;b）キシロフラノシルヌク レオシドリン酸塩の形成に最適な条件下でリン酸化する。 その他の好適な実施態様は、本発明は、式IIの化合物をポリヌクレオチドに組 み入れるのが特徴である。これらの化合物は、酵素的にポリヌクレオチドへ組み 入れることができる。例えば、バクテリオファージＴ７RNAポリメラーゼを用い 、これらの新規ヌクレオチド類似体は、RNAの１つ或いはそれ以上の位置に組み 込まれる（Milligan et al.,1989,Methods Enzymol.,180,51）。代替的には、新 規ヌクレオシド類似体は、固相合成を用いてポリヌクレオチドに組み込むことが できる。（Brown and Brown,1991,in Oligonucleotides and Analogues:A Pract ical Approoach,P.1,ed.F.Eckstein,Oxford University Press,New York;Wincot t et al.,1995,Nucleic Acids Res.,23,2677;Beaucage & caruthers,1996,in Bi oorganic Chemistry:Nucleic Acids,p36,ed．S．M．Hecht,Oxford University P ress,New York.） 式ＩＩの化合物は、ヌクレオチド三リン酸および／またはホスホルアミダイト の化学合成に、オリゴヌクレオチド中への選択的取り込みのための構築ブロック として用いることができる。これらのオリゴヌクレオチドは、アンチセンス分子 、２−５Ａアンチセンスキメラ、トリプレックス形成オリゴヌクレオチド（ＴＦ Ｏ）または核酸触媒として用いることができる。オリゴヌクレオチドはまた、Ｒ ＮＡまたはＤＮＡの合成および／または配列決定のためのプローブまたはプライ マーとして用いることができる。 本発明の化合物は、標準的なプロトコルを用いて、ヌクレオチド二リン酸およ びヌクレオチド三リン酸に容易に変換することができる（総説として、Ｈｕｔｃ ｈｉｎｓｏｎ，１９９１，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，ｖ．２，ｐｐ８１−１６０，Ｅｄ．Ｌ．Ｂ ．Ｔｏｗｎｓｅｎｄ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ； （本明細書の一部としてここに引用する）を参照されたい）。 式ＩＩの化合物はまた、単独でまたは組み合わせて、抗ウイルス剤、抗癌剤ま たは抗腫瘍剤として用いることができる。これらの化合物はまた、単独で、また は他の抗ウイルス剤、抗癌剤または抗腫瘍剤と組み合わせて用いることができる 。 本明細書に記載される本発明の好ましい態様の１つにおいては、核酸触媒はハ ンマーヘッドまたはヘアピンモチーフで形成されるが、デルタ肝炎ウイルス、グ ループＩイントロン、グループＩＩイントロンまたはＲＮａｓｅＰ ＲＮＡ（Ｒ ＮＡガイド配列に伴う）またはＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ ＶＳ ＲＮＡのモチーフ で形成してもよい。そのようなハンマーヘッドモチーフの例は、Ｄｒｅｙｆｕｓ ，(上掲)，Ｒｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ.，１９９２，ＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ ８，１８３に、ヘアピンモ チーフの例はＨａｍｐｅｌ ｅｔ ａｌ．，ＥＰ０３６０２５７，Ｈａｍｐｅｌ ａｎｄ Ｔｒｉｔｚ，１９８９，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８，４９２９ ，Ｆｅｌｄｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｇｅｎｅ ８２，５３、Ｈａ ｓｅｌｏｆｆ ａｎｄ Ｇｅｒｌａｃｈ，１９８９，Ｇｅｎｅ，８２，４３，お よびＨａｍｐｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒ ｅｓ．１８，２９９に、デルタ肝炎ウイルスモチーフの例は、Ｐｅｒｒｏｔｔａ ａｎ ｄ Ｂｅｅｎ，１９９２，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３１，１６に、ＲＮａｓ ｅ Ｐモチーフの例は、Ｇｕｅｒｒｉｅｒ−Ｔａｋａｄａ ｅｔ ａｌ．，１９ ８３，Ｃｅｌｌ ３５，８４９；Ｆｏｒｓｔｅｒ ａｎｄ Ａｌｔｍａｎ，１９ ９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９，７８３；Ｌｉ ａｎｄ Ａｌｔｍａｎ，１９９ ６，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４、８３５に、Ｎｅｕｒｏｓｐｏ ｒａ ＶＳ ＲＮＡリボザイムモチーフの例は、Ｃｏｌｌｉｎｓ（Ｓａｖｉｌｌ ｅ ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｎｓ，１９９０，Ｃｅｌｌ ６１，６８５−６９６；Ｓ ａｖｉｌｌｅ ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｎｓ，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８，８８２６−８８３０；Ｃｏｌｌｉｎｓ ａｎｄ Ｏｌｉｖｅ，１９９３，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３２，２７９５−２７９９ ；Ｇｕｏ ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｎｓ，１９９５，ＥＭＢＯ．Ｊ．１４，３６３） に、グループＩＩイントロンの例は、Ｇｒｉｆｆｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５ ，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２，７６１；Ｍｉｃｈｅｌｓ ａｎｄ Ｐｙｌｅ，１９ ９５，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４，２９６５；Ｐｙｌｅ ｅｔ ａｌ．， ＷＯ９６／１２２６８９に、グループＩイントロンの例は、Ｃｅｃｈ ｅｔ ａ ｌ．，米国特許４，９８７，０７１に記載されている。これらの特定のモチーフ は、本発明において限定的なものではなく、当業者は、本発明の核酸触媒におい て重要なすべては、これが標的遺伝子ＲＮＡ領域の１またはそれ以上に相補的で ある特異的基質結合部位を有すること、および基質結合部位の中またはその周辺 に分子にＲＮＡ切断活性を付与するヌクレオチド配列を有することであることを 理解するであろう。 好ましい態様においては、本発明のポリヌクレオチドは、モノマーユニットに 直接または適当なスペーサーを介して結合した１またはそれ以上の２’−ヒドロ キシルアミノ官能基を有するであろう。オリゴヌクレオチドはアルデヒドもヒド ロキシルアミノ基も有しないため、オリゴを高分子テンプレートとして用いて、 オキシムの形成が選択的に生ずるであろう。このアプローチは、実質上所望のい かなる分子（ペプチド、ポリアミン、補酵素、オリゴサッカライド、脂質等）も 、目的とする分子中のアルデヒドまたはカルボン酸官能基のいずれかを用いて、 オリゴヌクレオチドに直接結合させることを容易にするであろう。 スキーム１．合成後オキシム結合形成 スキーム２．オリゴヌクレオチドの化学的ライゲーションオキシム結合形成の利点 ・オキシム化反応は水中で進行する ・定量的収率 ・広いｐＨ範囲（５−８）における加水分解安定性 ・オキシムの両性の性質のため、弱酸または弱塩基のいずれかとして作用するこ とができる ・オキシムは、金属イオンと錯化する強い傾向を示す さらに別の好ましい態様においては、オリゴヌクレオチド（例えばリボザイム ）中のアミノオキシ”テザー”は、カルボキシル基を有する種々の化合物（例え ば、アミノ酸、ペプチド、”キャップ”構造等）と反応して、以下に示すように オキシアミドを形成する。 スキーム３．合成後オキシアミド結合形成 標的の発見： 本出願人は、細胞中において所望の機能を行うことができる触媒的核酸分子の ライブラリをスクリーニングする効率的かつ迅速な方法を開発した。本発明はま た、触媒的核酸ライブラリを使用して、生物学的システム（例えば哺乳動物細胞 ）においてある特性またはプロセスを調節し、ａ）目的とする細胞プロセス／特 性の調節に関与する、ライブラリからの核酸触媒；およびｂ）核酸触媒の配列を 用いる、所望の細胞プロセス／特性の調節剤、を同定し単離することを特徴とす る。 より詳細には、本発明の方法は、触媒的核酸ライブラリの設計および構築を含 み、ここで、触媒的核酸は触媒的ドメインおよび基質結合ドメインを含み、基質 結合ドメイン（アーム）はランダム化されている。このランダム化されている結 合アームを有する触媒的核酸分子のライブラリは、生物学的システムにおいてあ るプロセス／特性を調節するために用いられる。本明細書に記載される方法は、 １またはそれ以上の位置において種々の置換を有する触媒的核酸分子のライブラ リまたはプールを同時にスクリーニングし、所望の機能または特徴または特性を 有するリボザイムを選択することを含む。本発明はまた、触媒的核酸分子を構築 し、所定の標的核酸分子または未知の標的核酸分子（例えばＲＮＡ）を切断して 、その標的分子またはそれによりコードされる任意の蛋白質の生物学的機能を阻 害する能力について選択する方法を特徴とする。 この細胞システムにおいて標的を切断しうる触媒的核酸分子を選択するために は、標的核酸分子の配列または構造のいずれかを知ることは必要ではない。本明 細書に記載される、細胞に基づくスクリーニングプロトコル（すなわち、細胞内 部で生ずるもの）は、細胞外システムと比較して多くの利点を提供する。これは 、触媒的核酸分子の有効性を評価する前に、酵素的または化学的方法により大量 のＲＮＡを合成する必要がないからである。本発明はさらに、触媒的核酸分子ラ イ ブラリを用いて細胞内部における遺伝子配列の生物学的機能を同定する迅速な方 法を記載する。本出願人は、触媒的核酸分子ライブラリを用いて、生物学的プロ セスに関与する核酸分子（例えば遺伝子）を同定する方法を記載する。この核酸 分子は、既知の機能を有する既知の分子であってもよく、またはこれまで機能が 明確になっていない既知の分子であってもよく、または完全に新規な分子であっ てもよい。これは、例えば、細胞経路（例えば、細胞増殖、細胞移動、細胞死等 ）に関与する遺伝子を同定する迅速な手段である。この遺伝子発見の方法は、所 望の生物学的プロセスを研究する新規なアプローチであるのみならず、この細胞 プロセスを精密に調節しうる活性な試薬を同定する手段でもある。 本出願人は、本明細書において、触媒的核酸分子ライブラリの１またはそれ以 上のメンバーが、生物学的システム（例えば、植物、動物または細菌）中のある 特性／プロセスを調節する能力を同時にアッセイする一般的アプローチを記載し 、該方法は、ライブラリを所望の細胞に導入し、特定の”特性”、”特徴”また は”プロセス”の変化をアッセイすることを含む。特定の特性には、細胞増殖、 細胞生存、細胞死、細胞移動、脈管形成、腫瘍体積、腫瘍転移、特定のｍＲＮＡ の細胞内のレベル、特定の蛋白質の細胞内のレベル、分泌される特定の蛋白質の レベル、細胞表面マーカー、細胞形態学、細胞分化パターン、軟骨減損、移植、 再狭窄、ウイルス複製、ウイルス負荷等が含まれる。触媒的核酸分子ライブラリ を用いて特定の生物学的経路を調節することにより、その経路に関与する遺伝子 を同定することが可能であり、これは新規遺伝子または新規な機能を有する遺伝 子の発見につながるであろう。この方法は細胞内部の遺伝子機能を研究する協力 な道具を提供する。このアプローチはまた、新規な触媒的オリゴヌクレオチドの 設計、標的中のリボザイムアクセス可能部位の同定、および遺伝子発現のリボザ イム媒介性調節のための新規核酸標的の同定の可能性を提供する。 本発明の別の観点においては、本発明は、ランダム結合アーム核酸触媒ライブ ラリ（ランダムライブラリ）を合成し、細胞中でランダムライブラリのすべての メンバーを同時に試験することを含む。このライブラリは、ランダム基質結合ア ームおよび画定触媒ドメインを有するリボザイムを有する。ランダムライブラリ のメンバーとの相互作用の結果として変化した特性（例えば細胞増殖の阻害）を 有する細胞を選択し、これらの細胞からのリボザイムの配列を決定する。これら のリボザイムの結合アームからの配列情報を用いて、所望の細胞特性に重要な経 路に関与するであろう核酸分子を、当該技術分野において知られる標準的な技術 、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）等の技術を用いる核酸増幅を用いて単 離することができる。この方法は、新規な遺伝子または新規な機能を有する遺伝 子を単離する強力な手段である。 本明細書において用いる場合、”ランダムライブラリ”とは、所定のリボザイ ムモチーフの結合アーム中にすべての可能な変異体を含むリボザイムライブラリ を意味する。ここでは、ライブラリの複雑性および内容物は画定されない。ラン ダムライブラリは、選択されたリボザイムモチーフについて、生物のゲノム中の すべての潜在的な標的配列に相補的な配列を含むと予測される。このランダムラ イブラリを用いて、既知の標的配列中または未知の標的中のリボザイム切断部位 をスクリーニングすることができる。第１の例においては、ランダムライブラリ を選択された細胞中に導入し、既知の標的遺伝子の発現をアッセイする。標的の 変化した発現を有する細胞から、既知の標的に対する最も有効なリボザイムが得 られるであろう。第２の例においては、ランダムライブラリを選択された細胞中 に導入し、特定の特性、例えば細胞の生存について細胞をアッセイする。ランダ ムライブラリとの相互作用から生き残った細胞を単離し、これらの細胞からのリ ボザイム配列を決定する。次に、リボザイムの結合アームの配列をプローブとし て用いて、細胞死に関与する遺伝子を単離することができる。ランダムライブラ リからのリボザイムは細胞死に関与する遺伝子の発現を調節（例えばダウンレギ ュレーション）しうるため、この細胞は、さもなくば死亡していたであろう条件 下で生き延びることができる。これは、遺伝子発見の新規な方法である。このア プローチは、ある細胞プロセスのメディエーターに関する情報を提供するのみな らず、これらの調節剤の発現を調節する手段をも提供する。この方法を用いて、 任意の生物（哺乳動物、植物および細菌を含むが、これらに限定されない）にお いて、任意の細胞プロセスの調節剤を同定することができる。 本発明は、所望の標的の核酸配列に対して高度の特異性を示す一群の酵素的切 断剤を製造する方法を提供する。核酸触媒は、好ましくは、単一の酵素的核酸に より疾患または状態の特異的診断および／または治療が与えられるように、標的 の高度に保存的な配列領域を標的とする。 本発明の第１の観点においては、本発明は、生物学的システム（例えば細胞） においてプロセス（例えば、細胞成長、増殖、アポトーシス、形態学、脈管形成 、分化、移動、ウイルス増殖、薬剤耐性、シグナル伝達、細胞サイクル制御、温 度感受性、化学物質感受性等）に関与する１またはそれ以上の核酸分子（例えば 遺伝子）を同定する方法を特徴とする。該方法は、以下の工程を含む：ａ）基質 結合ドメインおよび触媒ドメインを有する核酸触媒のランダムライブラリを、プ ロセスを変化させるのに適した条件下で生物学的システムに与え、ここで基質結 合ドメインはランダム配列を有し；ｂ）いずれかの核酸触媒によりプロセスが変 化した生物学的システム中に存在する核酸触媒を同定し；そしてｃ）そのような 核酸触媒の結合アームの少なくとも一部のヌクレオチド配列を決定して、その生 物学的システムにおいてプロセスに関与する核酸分子を同定する。 本発明の関連する態様においては、本発明は、生物学的システムにおいてプロ セスを調節しうる核酸分子を同定する方法を特徴とする。該方法は、以下の工程 を含む：ａ）基質結合ドメインおよび触媒ドメインを有する核酸触媒のライブラ リを、プロセスを調節するのに適した条件下で生物学的システム中に導入し、こ こで基質結合ドメインはランダム配列を有し；そしてｂ）プロセスが調節された 生物学的システムからの核酸触媒の基質結合ドメインの少なくとも一部のヌクレ オチド配列を決定して、その生物学的システムにおいて前記プロセスを調節しう る核酸分子の前記同定を行う。 第２の観点においては、本発明はさらに、生物学的システムにおいてプロセス を調節しうる核酸触媒を同定する方法に関する。該方法は、ａ）基質結合ドメイ ンおよび触媒ドメインを有する核酸触媒のライブラリを、プロセスを調節するの に適した条件下で生物学的システムに導入し、ここで基質結合ドメインはランダ ム配列を有しており、そして、ｂ）プロセスが調節された生物学的システムから 核酸触媒を同定する、ことを含む。 ”酵素的部分”または”触媒ドメイン”とは、核酸基質の切断に必須のリボザ イムの部分／領域を意味する（例えば、図３を参照）。 本明細書において用いる場合、”核酸分子”とは、ヌクレオチドを有する分子 を意味する。核酸は、一本鎖、二本鎖、または多数鎖であってもよく、修飾され たまたは非修飾のヌクレオチドまたは非ヌクレオチド、またはこれらの種々の混 合物および組み合わせを含んでいてもよい。本発明に従う核酸分子の例は、高分 子（例えば蛋白質）をコードする遺伝子である。 本明細書において用いる場合、”生物学的システム”とは、真核生物システム であっても原核生物システムであってもよく、細菌細胞、植物細胞または哺乳動 物細胞であってもよく、植物起源、哺乳動物起源、酵母起源、ショウジョウバエ 起源、または始原細菌起源のものであってもよい。 本発明は、さらに、ＲＮＡまたはＤＮＡの切断に特に有用な、触媒活性を有す る新規核酸分子に関する。本発明の核酸触媒は、当該技術分野において知られる 他の核酸触媒とは区別されるものである。本発明はまた、標準的なヌクレオチド または修飾ヌクレオチドを用いて核酸触媒の変異体をスクリーニングする方法に 関する。本出願人は、触媒的核酸分子、特に１またはそれ以上の位置において化 学的修飾を有する分子のライブラリをスクリーニングする効率的な方法を決定し た。本明細書に記載される方法は、１またはそれ以上の位置において種々の置換 を有するリボザイムのライブラリまたはプールを系統的にスクリーニングし、所 望の機能または特徴または特性を有するリボザイムを選択することを含む。 １つの好ましい態様においては、細胞におけるプロセスに関与する核酸分子を 同定する方法が記載され、該方法は、以下の工程を含む：ａ）基質結合ドメイン および触媒ドメインを有する核酸触媒のライブラリを合成し、ここで基質結合ド メインはランダム配列を有し；ｂ）ライブラリを、細胞におけるプロセスの変更 （例えば、細胞増殖の阻害、脈管形成の阻害、成長および／または分化の調節等 ）を引き起こすのに適した条件下で細胞中で試験し；ｃ）変更されたプロセスを 有する細胞を単離または濃縮し；ｄ）変化した細胞中の核酸触媒を同定し、単離 し；ｅ）変化した細胞から単離された核酸触媒の基質結合ドメインの配列と相同 の配列を有するオリゴヌクレオチドをプローブとして用いて、細胞または変化し た細胞から核酸分子を単離する。上述の選択／スクリーニング方法を用いて同定 された核酸分子は、リボザイムライブラリのメンバーによる変化についてアッセ イさ れているプロセスに関与するであろう。これらの核酸分子は、新規な遺伝子配列 であるかもしれず、または新規の機能を有する既知の遺伝子配列であるかもしれ ない。この方法の利点の１つは、生物学的プロセス（例えば、分化、細胞成長、 および癌、腫瘍脈管形成、動脈硬化、心臓血管疾患、炎症、再狭窄、脈管疾患等 の疾患プロセス）に関与する核酸配列（例えば遺伝子）を、ランダムライブラリ アプローチを用いて容易に同定することができることである。すなわち、理論的 には、所定のリボザイムモチーフについて１つのランダムライブラリを用いて、 いかなる生物学的システムのいかなるプロセスをもアッセイすることができる。 別の好ましい態様においては、本発明は、画定アーム核酸触媒ライブラリ（画 定ライブラリ）を合成し、細胞中の既知の標的に対してこれを同時に試験するこ とを含む。ライブラリは、既知の複雑性の結合アーム（画定）および画定された 触媒ドメインを有するリボザイムを含む。ライブラリ中のリボザイムによる標的 遺伝子の発現の調節は、細胞が変更された表現型を有することを引き起こすであ ろう。そのような細胞を単離する。これらの細胞中のリボザイムは、細胞におけ る所望の遺伝子の発現を調節するのに最も適したものである。 本明細書において用いる場合、”画定ライブラリ”とは、核酸触媒の各メンバ ーが独立して設計され製造され、次にライブラリに加えられる、核酸触媒のライ ブラリを意味する。すなわち、内容物、複雑性（ライブラリ中に含まれる異なる リボザイムの数）およびライブラリのメンバーの比率は、最初に画定される。画 定ライブラリは、２以上のリボザイムを含む。該プロセスは、既知の標的ＲＮＡ の配列を、あるリボザイムモチーフにより切断されうるすべての可能な部位につ いてスクリーニングすることを含み、これは例えば、ＭｃＳｗｉｇｇｅｎ、米国 特許５，５２５，４６８（本明細書の一部としてここに引用する）に記載される 。標的配列に対して代表的な数の異なるリボザイムを合成する。リボザイムを混 合し、プールされたリボザイムを、前記生物学的システムにおける標的ＲＮＡの 発現を調節することを容易にするのに適した条件下で、標的ＲＮＡを含む生物学 的システムに導入する。核酸触媒のスクリーニング 本出願人は、本明細書において、リボザイム活性および／またはリボザイムの 特定の”特性”（例えば、切断速度、細胞での有効性、安定性、輸送、局在化等 ）に基づいてリボザイム変異体をアッセイするための一般的コンビナトリアルア プローチを記載する。このアプローチの改変法もまた、新規な触媒的オリゴヌク レオチドの設計、標的中のリボザイムアクセス可能部位の同定、および遺伝子発 現のリボザイム媒介性調節のための新規な核酸標的の同定の可能性を提供するで あろう。 １つの好ましい態様においては、該方法は、個々のリボザイムではなく、種々 のヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、または他の類似体置換を有するリボザイ ムの混合物（ライブラリ）を試験して、リボザイム中の１またはそれ以上の位置 において可変であるヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、または他の類似体を迅 速に同定することに基づく。第１の工程においては（工程１、図２）、第１のリ ボザイムモチーフにおいて変化させる所望の数の位置（例えば、図２に示される ように３つの位置）が選択される（出発リボザイム）。変化させることができる 位置の数には要件はなく、これらの位置はリボザイムの系統発生的に保存されて いてもされていなくてもよい。さらに、これらの位置は、触媒的コア、結合アー ム、またはアクセサリドメイン中に存在してもよい。変化させるべく選択される 位置の数は、合成されるリボザイムライブラリの”クラス”の数を規定する。図 ２に示される例においては、３つの位置（位置１、２および３と称される）を変 化させ、したがって、３つの異なるクラスのリボザイムプールが合成される。次 の工程（工程２）においては、”固定”位置（”Ｆ”と称される）である１つを のぞく、変化させるべき所望のすべての位置（”Ｘ”と称される）に異なるヌク レオチド、ヌクレオチド類似体、または他の類似体のランダム混合物を含むよう に、リボザイムプールを合成する。固定位置は特定のヌクレオチド、ヌクレオチ ド類似体または他の類似体を含む。用いるべきヌクレオチドまたは類似体の数に ついては要件はない。ヌクレオチドまたは類似体の数は、各クラスにおけるプー ルの数（ｎと称される）を規定する。例えば、１０個の異なるヌクレオチドまた は類似体が選択される場合、各クラスについて１０個の異なるプール（ｎ＝１０ ）が合成されるであろう。プールの各々は、１つの固定位置（Ｆと称される）に 特 定の修飾を含み、他の位置（Ｘと称される）に１０個すべての修飾の等量混合物 を含むであろう。次の工程（工程３）においては、所望の活性、表現型、特徴ま たは特性についてリボザイムの異なるプールを試験する。例えば、試験は、各プ ールについて、標的核酸切断のインビトロ速度の決定、リボザイム−基質結合親 和性の試験、ヌクレアーゼ耐性の試験、薬力学的特性の決定、または細胞または 動物モデル系においていずれのプールがもっとも有効であるかの決定でありうる 。試験の後、特定のプールが所望の変異体として同定され（”所望の変異体−１ ”と称される）、所望の変異体−１中の固定位置に存在するヌクレオチドまたは 類似体を、続くすべての実験において不変（”Ｚ”と称される）とする。したが って、リボザイム中の１つの位置が変化する。すなわち、他のすべてのＸ位置が ランダムであるとき、リボザイムモチーフ中の１つの位置の可変ヌクレオチドま たは類似体が同定される。次に、１つの固定位置および１またはそれ以上の不変 位置を除く最適化されるべき残りの位置にすべてのヌクレオチドまたは類似体の 等量混合物を含む、新たなリボザイムプール（クラス２、３等）を合成する。こ こでも、ランダム化されていない１つの位置で特定のヌクレオチドまたは類似体 が”固定”されており、プールを特定の表現型または特性についてアッセイする （工程４）。このプロセスを、すべての所望の位置を変化させてスクリーニング するまで繰り返す。例えば、最適化のために３つの位置が選択される場合、合成 および試験は、３回（３クラス）繰り返す必要があるだろう。最初の２つのクラ スにおいてはプールが合成され、最後のクラスにおいては、特定のリボザイムが 合成され試験されるであろう。最後の位置を分析するとき（工程５）、ランダム 位置は残っておらず、したがって、個々のリボザイムのみを合成し試験する。得 られる１つまたはそれ以上のリボザイム（”第２のリボザイムモチーフ”と称さ れる）は、出発リボザイムモチーフ（第１のリボザイムモチーフ）とは区別され る画定された化学組成を有するであろう。これは、リボザイムモチーフ中の１ま たはそれ以上の位置の変化性をスクリーニングする迅速な方法である。 別の好ましい態様においては、本発明は、ハンマーヘッドリボザイムモチーフ 中の１またはそれ以上の位置における化学的修飾のスクリーニングを含むに関す る。より詳細には、本発明は、ハンマーヘッドリボザイムの触媒的コア配列にお ける変化性に関する。特に、本発明は、ハンマーヘッドリボザイム中の３位、４ 位および７位の変化性についてのスクリーニングを記載する。本発明はまた、ハ ンマーヘッドリボザイム中の最適ループＩＩ配列についてのスクリーニングを特 徴とする。 さらに別の好ましい態様においては、本発明は、標的配列中のアクセス可能な リボザイム切断部位をスクリーニングする迅速な方法を特徴とする。この方法は 、リボザイムの結合アーム中のすべての可能な配列をスクリーニングすることを 含む。結合アームの配列は、あるリボザイムの作用の部位を決定する。コンビナ トリアルアプローチを用いて、本質的にすべての可能なアーム配列を試験するこ とにより、標的配列中の望ましいおよび／またはアクセス可能な部位を同定する ことができる。このアプローチの困難性は、機能的にかつ配列特異的に結合する ためにはリボザイムがある数の塩基対（例えば、ハンマーヘッドリボザイムにつ いては、結合アーム長さは約１２−１６ヌクレオチドである）を必要とする点に ある。このため、例えば１２−１６の異なる群のハンマーヘッドリボザイムプー ルが必要となる。すなわち、１２−１６の位置を最適化しなければならず、これ には１２−１６の異なる群を合成し試験することが必要である。各プールは４つ の異なるヌクレオチド（Ａ、Ｃ、ＵおよびＧ）またはヌクレオチド類似体を含む であろう（ヌクレオチドについてはｐ＝４）。各群を試験し、最良のプールを同 定し、１つの追加の位置を不変としたリボザイムプールの別の群を合成し、１２ −１６群のすべてを試験するまでこの方法を繰り返すということは、非常に時間 を消費する。しかし、多数の位置を１つのクラス中で試験することにより、クラ スの数を減少させることが可能である。この場合、クラス中のプールの数は、ラ ンダム混合物中のヌクレオチドまたは類似体の数（すなわちｎ）のｗ乗（ｗは各 クラスにおいて固定される位置の数と等しい）に等しい。最終的なリボザイムを 最適化するために合成することが必要なクラスの数は、最適化されるべき位置の 総数を各クラスにおいて試験される位置の数（ｗ）で割ったものと等しい。 各クラス中のプールの数＝ｎw クラスの数＝位置の総数／ｗ 別の好ましい態様においては、本発明は、結合アームを不変に維持し、推定触 媒ドメイン中の１またはそれ以上の位置を変化させることにより、新規な触媒的 核酸モチーフをスクリーニングする迅速な方法を特徴とする。本出願人は、新規 な触媒的モチーフを同定するために、結合アーム中の位置を変更せずに触媒ドメ イン中の位置を変化させる方法を記載する。図２４に例が示されている。核酸分 子中の機能的触媒ドメインを得るためにいくつの位置が必要であるかは不明であ るが、多数の機能的に多様なヌクレオチド類似体を用いてプールを構築すること ができれば、比較的少ない数の位置が機能的触媒ドメインを構成すると推定する ことは合理的であろう。これは、特に、触媒（例えば、酸／塩基触媒、金属結合 等）に関係していると予測される類似体が選択される場合には正しい。例示され る例においては、４つの位置（１、２、３および４と称される）が選択される。 第１の工程においては、リボザイムライブラリ（クラス１）を構築する：位置１ を固定（Ｆ1）し、位置２、３および４をランダム（それぞれＸ2、Ｘ3およびＸ4 ）とする。工程２においては、プール（試験されるプールの数は、用いられる類 似体の数による；ｎ）を活性についてアッセイする。この試験は、インビトロで 行ってもよく、細胞または動物モデルで行ってもよい。どのようなアッセイが用 いられようと、所望の特徴を有するプールを同定し、位置１をクラス１において 同定された類似体で不変（Ｚ1）として再びライブラリ（クラス２）を合成する 。クラス２においては、位置２が固定（Ｆ2）され、位置３および４はランダム （Ｘ3およびＸ4）である。このプロセスを、すべての位置が不変とされるまで繰 り返し、触媒ドメインの化学組成を決定する。触媒ドメインにおける変化させる べき位置の数が多い場合には、多数の位置を１つのクラス中で試験することによ り、クラスの数を減少させることが可能である。クラス中のプールの数は、ラン ダム混合物中のヌクレオチドまたは類似体の数（すなわちｎ）のｗ乗（ｗは各ク ラスにおいて固定される位置の数と等しい）と等しい。最終的なリボザイムを最 適化するために合成することが必要なクラスの数は、最適化されるべき位置の総 数を各クラス中で試験される位置の数（ｗ）で割ったものである。 各クラス中のプールの数＝ｎw クラスの数＝位置の総数／ｗ 好ましい態様においては、核酸触媒の変異体を同定する方法が記載される。該 方法は、以下の各工程を含む： ａ）前記核酸触媒中で、異なるヌクレオチドのあらかじめ決定された群で変化さ せるべき少なくとも３つ、好ましくは３−１２、特に４−１０の位置を選択し、 これらのヌクレオチドは修飾または非修飾であり（この方法において用いること ができるヌクレオチドの非限定的例が図１５に示されている）； ｂ）前記核酸触媒の異なるプールの第１のクラスを合成し、ここで、合成される プールの数は、異なるヌクレオチドのあらかじめ決定された群中のヌクレオチド の数と等しく（例えば、あらかじめ決定されたヌクレオチドの群に１０個の異な るヌクレオチドが含まれるように選択される場合、核酸触媒の１０個の異なるプ ールを合成しなければならない）、ここで、各プール中で変化させるべき位置の 少なくとも１つは、異なるヌクレオチドのあらかじめ決定された群から選択され る画定ヌクレオチドを含み（固定位置；Ｆ）、変化させるべき残りの位置は、異 なるヌクレオチドのあらかじめ決定された群から選択されるヌクレオチドのラン ダム混合物を含み（Ｘ位置）； ｃ）前記プールが所望の特性（改良された切断速度、細胞または動物への効力、 ヌクレアーゼ安定性、増強された輸送、望ましい局在化などがあげられるが、こ れらに限定されない）を示すのに適した条件下で、前記核酸触媒の異なるプール を試験し、そして前記所望の特性を有するプールを同定し、ここで、所望の特性 を有するプールの画定ヌクレオチド（Ｆ）を有する位置を、続く工程において不 変（Ｚ位置）とし； ｄ）核酸触媒の異なるプールの第２のクラスを合成し、ここで、異なるプールの 第２のクラスのそれぞれの中の変化させるべき位置の少なくとも１つは、異なる ヌクレオチドのあらかじめ決定された群から選択される画定ヌクレオチド（Ｆ） を含み、変化させるべき残りの位置は、異なるヌクレオチドのあらかじめ決定さ れた群から選択されるヌクレオチドのランダム混合物（Ｘ）を含み（したがって 、この第２のクラスのプールは、Ｆ、ＸおよびＺ位置を有する）； ｅ）前記核酸触媒の異なるプールの第２のクラスを、所望の特性を示すのに適し た条件下で試験し、そして前記所望の特性を有するプールを同定し、ここで、所 望の特性を有するプール中で画定されたヌクレオチドを有する位置を、続く工程 において不変（Ｚ）とし；そして ｆ）前記核酸触媒中で変化させるべく選択されたすべての位置が不変となるまで このプロセスを繰り返す。 さらに別の好ましい態様においては、生物学的システムにおいて新規核酸分子 を同定する方法が記載される。該方法は、以下の各工程を含む： ａ）基質結合ドメインおよび触媒ドメインを有する核酸触媒のプールを合成し、 ここで前記基質結合ドメインはランダム配列を含み； ｂ）核酸触媒のプールを、所望の効果（例えば、細胞増殖の阻害、脈管形成の阻 害、成長および／または分化の調節等）を示すのに適した条件下で試験し、そし て前記所望の特性を有する触媒を同定し； ｃ）前記所望の効果を示す核酸触媒の基質結合ドメインの配列を含むオリゴヌク レオチドをプローブとして用いて、前記プローブに相補的な核酸分子について前 記生物学的システムをスクリーニングし；そして ｄ）前記相補的核酸分子を単離し、配列決定する。 上述の核酸スクリーニング方法を用いて同定されるこれらの核酸分子は、新規 遺伝子配列または既知の遺伝子配列でありうる。この方法の利点は、生物学的プ ロセス（例えば、分化、細胞成長、および癌、腫瘍、脈管形成、関節炎、心臓血 管疾患、炎症、再狭窄、脈管疾患等の疾患プロセス）に関与する核酸配列（例え ば遺伝子）を容易に同定することができることである。 好ましい態様においては、本発明は、式ＩＩＩ−ＶＩＩのいずれかを有する、 触媒活性を有する核酸分子を特徴とする。 上記の各公式において、Ｎは同一であっても異なってもよい、独立したヌクレ オチドまたは非ヌクレオチドリンカーを表す；ＭおよびＱは標的核酸分子（標的 はRNA、DNAまたはRNA/DNA混合ポリマーであってもよい）と安定して相互作用す る（例えば、標的における相補的なヌクレオチドと水素結合を形成することによ り）のに十分な長さの独立したオリゴヌクレオチドである；好ましくはＱの長さ は、３ヌクレオチドより大きいかまたは等しく、そしてＭの長さは、好ましくは ５ヌクレオチドより大きいかまたは等しい；ｏおよびｎは１より大きいかまたは 等しい整数であり、そして好ましくは約100より小さく、ここで（Ｎ）ｏおよび （Ｎ）ｎがヌクレオチドであれば、（Ｎ）ｏおよび（Ｎ）ｎは、所望により水素 結合相互作用により、相互作用することが可能である；Ｌは存在していても欠け ていても（すなわち、該分子が２つの別個の分子から組み立てられている）よい リンカーであるが、存在する場合、ヌクレオチドおよび／または非ヌクレオチド リンカーであり、一本鎖および／または二本鎖領域でもよい；そして＿は化学結 合を表す（例えば、リン酸エステル結合、アミド結合または当業に知られる他の もの）。2'−Ｏ−MTM−Ｕおよび2'−Ｏ−MTM−Ｃは、それぞれ2'−Ｏ−メチルチ オメチルウリジンおよび2'−Ｏ−メチルチオメチルシチジンを指す。Ａ、Ｃ、Ｕ およびＧは、それぞれアデノシン、シチジン、ウリジンおよびグアノシンヌクレ オチドを指す。該公式中のヌクレオチドは、当業に知られるように、糖、塩基、 および／またはリン酸部分で修飾されていないかまたは修飾されている。 さらに別の態様において、ヌクレオチドリンカー（Ｌ）は、ATPアプタマー、H IV Revアプタマー（RRE）、HIV Tatアプタマー（TAR）および他のものなど、核 酸アプタマーである（概説には、Goldら,1995,Annu.Rev.Biochem.,64,763；およ びSzostakおよびEllington，1993,The RNA World,GestelandおよびAtkins監修中 ,pp 511,CSH Laboratory Pressを参照されたい）。「核酸アプタマー」は本明細 書において、リガンドと相互作用することが可能である核酸配列を示すよう意味 する。リガンドは、限定されるわけではないが、樹脂、代謝産物、ヌクレオシド 、ヌクレオチド、薬剤、毒素、遷移状態類似体、ペプチド、脂質、タンパク質、 アミノ酸、核酸分子、ホルモン、炭水化物、受容体、細胞、ウイルス、細菌およ びその他を含む、いかなる天然または合成分子であってもよ い。 さらに別の態様において、非ヌクレオチドリンカー（Ｌ）は、本明細書に定義 される通りである。 特に、本発明は、ピリジン−４−オン、ピリジン−２−オン、フェニル、プソ イドウラシル、2,4,6−トリメトキシベンゼン、３−メチルウラシル、ジヒドロ ウラシル、ナフチル、６−メチル−ウラシルおよびアミノフェニルから選択され る塩基置換を有する修飾リボザイムを特徴とする。 さらに別の態様において、非ヌクレオチドリンカー（Ｌ）は本明細書に定義さ れる通りである。「非ヌクレオチド」という用語は、本明細書において、無塩基 性ヌクレオチド、ポリエーテル、ポリアミン、ポリアミド、ペプチド、炭水化物 、脂質、またはポリ炭化水素化合物のいずれかを含む。特定の例は、すべて本明 細書に援用される、SeelaおよびKaiser,Nucleic Acids Res.1990,18:6353および Nucleic Acids Res.1987,15:3113；CloadおよびSchepartz,J.Am.Chem.Soc.1991, 113:6324；RichardsonおよびSchepartz,J．Am．Chem．Soc．1991,113:5109；Ma ら,Nucleic Acids Res.1993,21:2585およびBiochemistry 1993,32:1751；Durand ら，Nucleic Acids Res．1990,18:6353；McCurdyら,Nucleosides & Nucleotides 1991,10:287；Jschkeら,Tetrahedron Lett.1993,34:301；Onoら,Biochemistry 1991,30:9914；Arnoldら、国際公告第WO 89/02439号；Usmanら、国際公告第WO 9 5/06731号；Dudyczら、国際公告第WO 95/11910号およびFerentzおよびVerdine,J ．Am．Chem．Soc．1991,113:4000により記載されるものを含む。したがって、好 ましい態様において、本発明は、１つまたはそれ以上の非ヌクレオチド部分を有 し、そしてRNAまたはDNA分子を切断する酵素活性を有する核酸触媒を特徴とする 。「非ヌクレオチド」という用語により、糖および／またはリン酸置換のいずれ かを含む、１つまたはそれ以上のヌクレオチド単位の代わりに、核酸鎖に組み込 まれてもよく、そして残った塩基がそれらの酵素活性を示すことを認める、いか なる基または化合物も意味する。該基または化合物は、アデノシン、グアニン、 シトシン、ウラシルまたはチミンなどの通常認められるヌクレオチド塩基を含ま ない、無塩基性である。「無塩基性」または「無塩基性ヌクレオチド」という用 語は、本明細書に おいて、塩基を欠く、または1'位で塩基の代わりに他の化学基を有する糖部分を 含む。 好ましい態様において、酵素核酸は、該分子に酵素活性を提供し、非ヌクレオ チド部分に連結される、１つまたはそれ以上のRNA伸長（stretch of RNA）を含 む。必要なRNA構成要素は当業に知られており、例えばUsman、前記を参照された い。RNAにより、少なくとも１つのリボヌクレオチド残基を含む分子を意味する 。 本出願に使用される用語として、非ヌクレオチド含有酵素核酸は、リボザイム の一部を置き換える少なくとも１つの非ヌクレオチド構成要素、例えば、限定さ れるわけではないが、二本鎖ステム、一本鎖「触媒コア」配列、一本鎖ループま たは一本鎖認識配列を含む核酸分子を意味する。これらの分子は、別個のRNAま たはDNA分子を、ヌクレオチド塩基配列に特異的な様式で切断（好ましくは連続 的に切断）することが可能である。こうした分子はまた、望ましい場合、分子内 切断するよう作用することも可能である。こうした酵素分子は、実質的にいかな るRNA転写物を標的としてもよい。 本出願に記載される特異的な核酸触媒は、本発明に制限されず、そして当業者 は、本発明の核酸触媒に重要なことは、該触媒が、標的核酸領域の１つまたはそ れ以上に相補的な、特異的基質結合部位（例えば上記の公式IIIからVIIのＭおよ び／またはＱ）を有し、そして該基質結合部位の内部または周囲に、該分子に核 酸切断活性を与えるヌクレオチド配列を有することのみであることを認識するで あろう。酵素核酸のベクター発現 本発明の核酸触媒は、真核細胞プロモーターから細胞内で発現されてもよい( 例えばIzantおよびWeintraub,1985 Science 229,345;McGarryおよびLindquist,1 986 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83,399；Scanlonら,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA ,88,10591-5；Kashani-Sabetら,1992 Antisense Res.Dev.,2,3-15；Dropulicら ，1992 J.Virol,66,1432-41；Weerasingheら，1991 J.Virol.65,5531-4;Ojwang ら,1992 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89,10802-6;Chenら,1992 Nucleic Acids Res.,20,4581-9；Sarverら,1990 Science 247,1222-1225；Thomp sonら,1995 Nucleic Acids Res.23,2259；Goodら,1997 Gene Therapy,4,45；該 参考文献はすべて、完全に本明細書に援用される)。当業者は、いかなる核酸も 適切なDNA/RNAベクターから、真核細胞内で発現されてもよいことを認識する。 こうした核酸の活性は、リボザイムにより一次転写物から放出されることにより 増大させてもよい（Draperら、PCT WO 93/23469、およびSullivanら、PCT WO 94 /02595；Ohkawaら,1992 Nucleic Acids Symp.Ser.,27,15-6；Tairaら,1991,Nucl eic Acids Res.,19,5125-30;Venturaら,1993 Nucleic Acids Res.,21,3249-55； Chowriraら,1994 J.Biol.Chem.269,25856；該参考文献はすべて、完全に本明細 書に援用される）。 本発明の別の側面において、標的分子を切断する核酸触媒は、DNAまたはRNAベ クターに挿入される転写単位（例えば図11を参照されたい）から発現される。組 換えベクターは、好ましくはDNAプラスミドまたはウイルスベクターである。リ ボザイムを発現するウイルスベクターは、限定されるわけではないが、アデノ関 連ウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、またはアルファウイルスに基づ き構築されてもよい。好ましくは、リボザイムを発現することが可能な組換えベ クターは、上記のように搬送され、そして標的細胞に存続する。また別に、リボ ザイムの一過性発現を提供するウイルスベクターを用いてもよい。こうしたベク ターは必要に応じ、連続して投与されてもよい。ひとたび発現されれば、リボザ イムは標的mRNAを切断する。活性リボザイムは、実施例のものと同等の酵素中心 またはコア、および標的部位での切断が起こるように標的核酸分子に結合するこ とが可能な結合アームを含む。こうした切断に干渉しない他の配列が存在しても よい。リボザイム発現ベクターの搬送は、静脈内または筋内投与により、患者か ら体外移植された標的細胞に投与し、その後患者に再導入することにより、また は望ましい標的細胞への導入を可能にするであろう他の手段のいずれかによるな ど、全身性でもよい(概説には、CoutureおよびStinchcomb,1996,TIG.,12,510を 参照されたい)。 好ましい態様において、少なくとも１つの本発明の核酸触媒をコードする核酸 配列を含む発現ベクターが開示される。本発明の核酸触媒をコードする核酸配列 は、該核酸分子の発現を可能にする様式で、機能的に連結されている。 １つの態様において、発現ベクターは：a）転写開始領域（例えば、真核ポルI 、IIまたはIII開始領域）；b）転写終結領域（例えば、真核ポルI、IIまたはIII 終結領域）；c）少なくとも１つの本発明の核酸触媒をコードする遺伝子；そし てここで前記遺伝子は、前記開始領域および前記終結領域に、前記核酸分子の発 現および／または搬送を可能にする様式で、機能可能であるように連結されてい る、を含む。該ベクターは、所望により、本発明の核酸触媒をコードする遺伝子 の5'側または3'側に機能可能であるように連結されたタンパク質の読み枠（ORF ）；および／またはイントロン（介在配列）を含んでもよい。 リボザイム配列の転写は、真核RNAポリメラーゼI（ポルI）、RNAポリメラーゼ II（ポルII）、またはRNAポリメラーゼIII（ポルIII）のプロモーターからドラ イブされる。ポルIIまたはポルIIIプロモーターからの転写物は、すべての細胞 で高レベルで発現されるであろう；既定の細胞種における既定のポルIIのレベル は、近傍に存在する遺伝子制御配列（エンハンサー、サイレンサーなど）の性質 に依存するであろう。原核RNAポリメラーゼ酵素が適切な細胞で発現されるなら ば、該原核RNAポリメラーゼプロモーターもまた用いられる（Elroy-Steinおよび Moss,1990 Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87,6743-7；GaoおよびHuang 1993 Nucleic Acids Res.,21,2867-72；Lieberら,1993 Methods Enzymol.,217,47-66；Zhouら, 1990 Mol.Cell.Biol.,10,4529-37）。何人かの研究者が、こうしたプロモーター から発現されるリボザイムが哺乳動物細胞で機能可能であることを立証している （例えば、Kashani-Sabetら,1992 Antisense Res.Dev.,2,3-15；Ojwangら,1992 Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89,10802-6；Chenら,1992 Nucleic Acids Res.,20,458 1-9;Yuら,1993 Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90,6340-4；L'Huillerら,1992 EMBO J. 11,4411-8；Lisziewiczら,1993 Proc Natl.Acad.Sci.USA,90,8000-4；Thompson ら,1995 Nucleic Acids Res.23,2259；SullengerおよびCech,1993 Science,262, 1566）。より具体的には、細胞内で、リボザイムなどの望ましいRNA分子を高濃 度で生成するには、U6核内低分子(snRNA)、トランスファーRNA(tRNA)およびアデ ノウイルスVA RNAをコードする遺伝子由来のものなどの転写単位が有用である（ Thompsonら、前 記；CoutureおよびStinchcomb,1996,前記；Noonbergら,1994,Nucleic Acids Res .,22,2830;Noonbergら、米国特許第5,624,803号;Goodら,1997,Gene Ther.4,45； Beigelmanら、国際PCT公告第WO 96/18736号；これらの参考文献はすべて、本明 細書に援用される）。本発明のリボザイムの発現に適した転写単位の例は、図11 に示される。上記のリボザイム転写単位は、哺乳動物に導入するための多様なベ クターに組み込んでもよく、制限されるわけではないが、プラスミドDNAベクタ ー、ウイルスDNAベクター（アデノウイルスまたはアデノ関連ウイルスベクター など）、またはウイルスRNAベクター（レトロウイルスまたはアルファウイルス ベクターなど）が含まれる（概説には、CoutureおよびStinchcomb,1996,前記を 参照されたい）。 好ましい態様において、少なくとも１つの本発明の触媒核酸分子を、該核酸分 子の発現を可能にする様式で、コードする核酸配列を含む発現ベクター。１つの 態様において、発現ベクターは；a）転写開始領域；b）転写終結領域；c）少な くとも１つの前記核酸分子をコードする遺伝子；そしてここで前記遺伝子は、前 記開始領域および前記終結領域に、前記核酸分子の発現および／または搬送を可 能にする様式で、機能可能であるように連結されている、を含む。別の好ましい 態様において、発現ベクターは：a）転写開始領域；b）転写終結領域；c）読み 枠；d）少なくとも１つの前記核酸分子をコードする遺伝子、ここで前記遺伝子 は前記読み枠の3'端に機能可能であるように連結されており；そして前記遺伝子 は、前記開始領域、前記読み枠および前記終結領域に、前記核酸分子の発現およ び／または搬送を可能にする様式で、機能可能であるように連結されている、を 含む。さらに別の態様において、発現ベクターは：a）転写開始領域；b）転写終 結領域；c）イントロン；d）少なくとも１つの前記核酸分子をコードする遺伝子 ；そしてここで前記遺伝子は、前記開始領域、前記イントロンおよび前記終結領 域に、前記核酸分子の発現および／または搬送を可能にする様式で、機能可能で あるように連結されている、を含む。別の態様において、発現ベクターは：a） 転写開始領域；b）転写終結領域；c）イントロン；d）読み枠；e）少なくとも１ つの前記核酸分子をコードする遺伝子、ここで前記遺伝子は前記読み枠の3'端に 機能可能であるように連結されており；前記遺伝子は、前記開始領域、前記イン ト ロン、前記読み枠および前記終結領域に、前記核酸分子の発現および／または搬 送を可能にする様式で、機能可能であるように連結されている、を含む。核酸触媒の搬送 好ましい態様において、核酸触媒は直接添加され、または陽イオン脂質と複合 体化され、リポソーム内に内包（package）され、またはそうでなければ平滑筋 細胞に搬送されてもよい。RNAまたはRNA複合体は、バイオポリマー（biopolymer ）への取り込みを伴いまたは伴わず、カテーテル、注入ポンプまたはステントの 使用を通じて、適切な組織に局所的に投与してもよい。本明細書に記載される方 法を用い、標的核酸を切断する他の核酸触媒を得、そして上記のように用いても よい。本発明の核酸触媒の特定の例は、以下の表および図に提供される。 Sullivanら、前記は、酵素RNA分子を搬送する一般的な方法を記載する。リボ ザイムは、当業者に知られる多様な方法により細胞に投与してもよく、制限され るわけではないが、リポソームへの被包（encapsulation）、イオン導入法（ion tophoresis）による、またはヒドロゲル、シクロデキストリン、生分解性ナノカ プセル、および生接着性微小球体（bioadhesive microsphere）などの他の賦形 剤（vehicle）への取り込みによるものを含む。いくつかの徴候には、前述の賦 形剤を含みまたは含まず、リボザイムをex vivoで細胞または組織に直接搬送し てもよい。また別に、RNA／賦形剤の組み合わせを、直接注射により、またはカ テーテル、注入ポンプまたはステントの使用により、局所的に搬送してもよい。 搬送の他の経路には、限定されるわけではないが、血管内、筋内、皮下または関 節注射、エアロゾル吸入、経口（錠剤または丸剤型）、局所、全身性、目、腹腔 内および／または鞘内搬送が含まれる。リボザイム搬送および投与のより詳細な 説明は、本明細書に援用されているSullivanら、前記およびDraperら、前記に提 供される。 本発明はまた、記載される化合物の薬学的に許容される処方も含む。これらの 処方は上記の化合物の塩、例えばアンモニウム、ナトリウム、カルシウム、マグ ネシウム、リチウムおよびカリウム塩を含む。 薬理学的組成物または処方は、細胞または患者、好ましくはヒトへの、例えば 全身性投与などの投与に適した型の組成物または処方を指す。適した型は部分的 に、用途、または例えば経口、経皮、または注射によるなどの進入経路に依存す る。こうした型は、組成物または処方が標的細胞（すなわち、陰電荷ポリマーが 搬送されることが望ましい細胞）に到達するのを妨げてはならない。例えば、血 流内に注射される薬理学的組成物は、可溶性でなければならない。他の要因が当 業に知られ、そして毒性、および組成物または処方がその効果を発揮するのを妨 げる型などの考慮すべき事柄が含まれる。 「全身性投与」により、in vivo全身性吸収、または血流内の薬剤の集積に続 く全体内至るところへの分布を意味する。全身性吸収につながる投与経路には、 限定されることなく：静脈内、皮下、腹腔内、吸入、経口、肺内および筋内が含 まれる。これらの各投与経路は、望ましい陰電荷ポリマー、例えばNTPを、到達 可能な疾患組織に曝露する。循環への薬剤の進入速度は、分子量または大きさに 相関することが示されている。本発明の化合物を含むリポソームまたは他の薬剤 キャリアーの使用は、潜在的に、例えばある種の組織、例えば細網内皮系（reti cular endothelial system）（RES）に薬剤を局在させる可能性がある。リンパ 球およびマクロファージなどの細胞の表面と、薬剤との結合を容易にすることが 可能であるリポソーム処方もまた有用である。本アプローチは、癌細胞など、異 常な細胞へのマクロファージおよびリンパ球免疫認識の特異性を利用することに より、標的細胞への薬剤の亢進した搬送を提供することも可能である。 本発明はまた、ポリ（エチレングリコール）脂質を含む表面修飾リポソーム（ PEG修飾、または長期循環リポソームまたは秘匿（stealth）リポソーム）を含む 組成物の使用を特徴とする。これらの処方は標的細胞における薬剤の集積を増加 させる方法を提供する。この種の薬剤キャリアーは、オプソニン化および単核食 細胞系（MPSまたはRES）による除去に抵抗し、それにより被包薬剤の、より長い 血液循環時間および亢進した組織曝露を可能にする（Lasicら,Chem.Rev.1995,95 ,2601-2627；Ishiwataら,Chem.Pharm.Bull.1995,43,1005-1011）。こうしたリポ ソームは、おそらく新たに血管新生された標的組織での浸出および捕捉により、 腫瘍に選択的に集積することが示されている（Lasicら, Science 1995,267,1275-1276；Okuら,1995,Biochim.Biophys.Acta,1238,86-90） 。長期循環リポソームは、特にMPSの組織に集積することが知られる慣用的な陽 イオンリポソームと比較して、薬剤の薬物動態学および薬力学を亢進する（Liu ら,J.Biol.Chem.1995,42,24864-24870；Choiら、国際PCT公告第WO 96/10391号： Ansellら、国際PCT公告第WO 96/10390号；Hollandら、国際PCT公告第WO 96/1039 2号；これらはすべて本明細書に援用される）。長期循環リポソームはまた、肝 臓および脾臓など、代謝が盛んなMPS組織での集積を避ける該リポソームの能力 に基づき、陽イオンリポソームと比較して、よりヌクレアーゼ分解から薬剤を保 護するようである。これらの参考文献はすべて、本明細書に援用される。 本発明はまた、貯蔵または投与のため調製される、薬学的に有効な量の望まし い化合物を薬学的に許容されるキャリアーまたは希釈剤中に含む組成物も含む。 治療的使用に許容されるキャリアーまたは希釈剤は、薬学業によく知られ、そし て例えば本明細書に援用されるRemington's Pharmaceutical Sciences,Mack Pub lishing Co.（A.R.Gennaro監修、1985）に記載される。例えば、保存剤、安定剤 、染料および香料剤（flavoring agent）が提供されてもよい。Id.、1449。これ らには安息香酸ナトリウム、ソルビン酸およびｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステ ルが含まれる。さらに、酸化防止剤および懸濁剤を用いてもよい。 薬学的に有効な用量は、疾患状態を予防し、その発生を阻害し、または治療す る（症状をある程度、好ましくはすべての症状を緩和する）のに必要な用量であ る。薬学的に有効な用量は、疾患の種類、用いられる組成物、投与経路、治療さ れる哺乳動物種、考慮する特定の哺乳動物の身体特性、共存する投薬、および医 業の当業者が認識するであろう他の要因に依存する。一般的に、１日当たり、主 成分の0.1mg/kgおよび100mg/kg体重の間の量が、陰電荷ポリマーの効能に依存し て投与される。１つの側面において、本発明は、必要に応じ、特定の細胞に外因 性に搬送されることが可能である核酸触媒を提供する。 局所リボザイム投与は、リボザイムの高組織濃度を達成し、そしてその異化お よび排出機構への曝露を制限する利点を提供する。局所投与経路は、多くの器官 系を冒す病変への接近を提供するが、全身性投与はいくつかの他の主要なヒト疾 患のリボザイム治療を実行可能にするであろう。 ある組織は、全身性投与後に、オリゴヌクレオチドおよび／またはオリゴヌク レオチド処方を集積することが立証されている。これらの組織には、炎症部位（ Wuら,1993,Cancer Res.53:3765-3767）、固形腫瘍（Yuanら,1994,Cancer Res.54 :3352-3356）、腎臓(Cossumら,1993,J.Pharmaco.and Exp.Ther.267:1181-1190) 、脳（Wuら,1996,J.Pharmacol.Exp.Ther.276:206-11）および細網内皮細胞が豊 富なもの（肝臓、脾臓、リンパ管;Litzingerら,1994,Biochim.Biophys.Acta 119 0:99-107；Agrawalら,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:7595-7599；Agrawalら, 1995,Clin.Pharmacology 28:7-16；Sandsら,1994,Molecular Pharmacol.45:932- 943；Saijoら,1994,Oncology Research 6：243-249）が含まれる。 腎臓は、細網内皮系（RES）の器官と共に、静脈内（i．v.）投与後のリボザイ ムのクリアランスに主に責を負う。こうした組織を冒す疾患は、リボザイムを集 積する傾向があるため、全身性リボザイム療法のよい候補である。 一つの好適な態様において、本発明はリボザイムを用いた炎症を処置するため の方法を特色としている。炎症は多数のヒト疾患の病理の基にある過程である。 これらの過程の多くは炎症性メディエーターおよび／またはそれらのレセプター の発現を阻害することにより阻止できる（Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．１９９５，Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ ．９９：４５Ｓ−５２Ｓ）。これらのメディエーターに特異的 なモノクローナル抗体の全身投与は慢性関節リュウマチ、炎症性腸疾患、および 急性呼吸窮迫症候群の動物モデルにおいて有用であることが示されている（Ａｒ ｅｎｄ ｅｔ ａｌ．１９９０，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ｒｈｅｕｍａｔ ｉｓｍ ３３：３０５−３１５）。全身炎症性疾患に影響を与えるリボザイムの 一つの可能な様式は、マクロファージによるＴＮＦ−α産生の阻害を通したもの である。ＴＮＦ−αは種々の炎症過程に関与し、およびカチオン性脂質処方リボ ザイムを蓄積することが知られているマクロファージにより主として産生される ことが示されている（Ｍａｓａｈｉｒｏ ｅｔ ａｌ．１９９０，Ｊ．Ｉｍｍｕ ｎｏｌｏｇｙ ．１４４：１４２５−１４３１）。抗マウスＴＮＦ−αリボザイム は細胞培養において有効であり、それ故、リポソーム処方によるリボザイムの全 身送達が前記の炎症性疾患状態において有効な処置となることは可能であろう。 別の好適な態様において、本発明はリボザイムを用いたＲＥＳが関与する疾患 を処置する方法を特色としている。全身的に投与されたオリゴヌクレオチドはＲ ＥＳ組織（肝臓、脾臓およびリンパ管）に分布することを多くの研究が示してい る。カチオン性脂質結合オリゴヌクレオチドを用いたいくつかの研究もまたこれ らへの特異的生体分布を示している。ＲＥＳが関与する病理学には、ヒト免疫不 全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒト型結核菌（ＴＢ）、トリ型結核菌およびらい菌（ら い病）を含むマイコバクテリウム感染のようなより重要な多くの感染性疾患が含 まれている。これらの疾患にはすべて例えば、強力な免疫抑制サイトカインであ るインターロイキン−１０（ＩＬ−１０）の過剰産生が付随している（Ｂａｒｎ ｅｓ ｅｔ ａｌ．１９９３，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６１：３４８２−９ ）。これらの感染のいくつかはＩＬ−１０の中和抗体を投与することにより、軽 減できる可能性がある。 さらに別の好適な態様において、本発明はリボザイムを用いた癌を処置する方 法を特色としている。抗癌剤としての全身的オリゴヌクレオチド使用可能性の証 拠として、アンチセンスホスホロチオエートがバーキットリンパ腫のマウスモデ ルで抗腫瘍効能を示すことが報告されている（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．１９９ ５，Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．１：６４７−６５８）。全身性抗新生物リボザイムの分子 標的には癌遺伝子、原癌遺伝子、または血管新生因子およびレセプターが含まれ るであろう。癌遺伝子および腫瘍発生間の関連は現在よく確立されており、原癌 遺伝子の活性化を導く特異的突然変異は広範囲でさまざまである。原癌遺伝子産 物のアップレギュレーションもまたヒトの癌に共通している。これらの遺伝子産 物のレベルを減少させることが癌の処置に有利であろう。加えて、多くの腫瘍は 高度に血管網が発達しているので、血管新生因子またはレセプターは、固形腫瘍 およびそれらの転移の治療のために癌遺伝子に代わるまたは補助となる良好な標 的を提供するであろう。以下の非制限的実施例において、血管新生メディエータ ーを標的とするリボザイムが示される。 癌における分子標的の潜在的数は非常に多数である。これらの中で、標的は癌 遺伝子、原癌遺伝子、メタロプロテイナーゼ、増殖因子および血管新生因子であ る。しかしながら、転移性固形腫瘍の多くの形における共通の要素は腫瘍の広範 な血管新生である。約１ｍｍの直径で腫瘍が広がるにつれて、腫瘍は連続的増殖 のために新しい血管新生を必要とする（Ｇｉｍｂｒｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，１９ ７２，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１３６，２６１）。加えて、腫瘍内での新しい血 管の出現は転移過程の開始と相関している（Ｍａｒｔｉｎｙ−Ｂａｒｏｎ ａｎ ｄ Ｍａｒｍｅ，１９９５）。血管新生の鍵となるものを標的とするリボザイム の全身投与を行うことにより、原発腫瘍増殖、腫瘍進行および腫瘍転移を減少さ せることが可能である。 ”血管新生”とは存在する血管からの新しい血管の形成を意味しており、それ は再生、分化および傷回復に必須の過程である。 ”腫瘍血管新生”とは固形腫瘍内への周りの組織からの血管成長の誘導を意味 している。腫瘍増殖および腫瘍転移は血管新生に依存している（総説としてＦｏ ｌｋｍａｎ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．１：２７−３１；Ｆｏｌｋｍａ ｎ １９９０ Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．，８２，４；Ｆｏｌｋ ｍａｎ ａｎｄ Ｓｈｉｎｇ，１９９２ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７，１ ０９３１を参照されたい）。 ”腫瘍転移”とは原発腫瘍に由来する腫瘍細胞の、体の一部分から別の器官へ の輸送および／または移動を意味している。ほとんどの悪性腫瘍は転移する能力 を持っている。 ”腫瘍”とは細胞が制御されずに増加、分裂および成長する組織の新しい増殖 を意味している。 好適な態様において、本発明はリボザイムを用いた非肝性腹水を処置する方法 を特色としている。腹部癌および卵巣過剰刺激症候群（ＯＨＳＳ）により生じる 非肝性腹水または腹膜液蓄積は血管内空間からの著しい液体の喪失および血液量 減少を起こす。もし腹水量が多い場合、腹部の痛み、血液量減少性低血圧、電解 質異常および呼吸困難が続いて起こる。従って、もし腹水が処置されずに残され ると、生命を脅かすものとなりうる。非肝性腹水は少なくとも一部は血管内皮増 殖因子（ＶＥＧＦ）により誘導されるであろうという証拠が現在蓄積されている 。このため、非肝性腹水では、全身的にまたは腹膜へ局所的に送達された、血管 内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）レセプターに対するリボザイムを治療的に適用できる 可能性がある。 卵巣は受精処置間のホルモン治療により過剰刺激されうる。その結果、女性は ひどく大きくなった卵巣および極度の腹水液蓄積を伴う卵巣過剰刺激症候群を経 験する。この液の蓄積は腹腔の血管と相互作用するであろう血管透過剤の放出に より誘導されると考えられており、血漿血管外遊出を導く。Ａｂｒａｍｏｖおよ び共同研究者（１９９７，Ｆｅｒｔｉｌ．Ｓｔｅｒｉｌ．６７：２６１）は血漿 ＶＥＧＦレベルがＯＨＳＳで上昇しており、症候群の回復により正常に復帰する ことを示している。初期の研究は、ＶＥＧＦがＯＨＳＳ患者の血清および濾胞液 中で上昇していること、およびこのＶＥＧＦの起源は卵巣の黄体化顆粒膜細胞で あろうことを示している（Ｋｒａｓｎｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｆｅｒｔ ｉｌ．Ｓｔｅｒｉｌ ．６５：５５２）。ＭｃＣｌｕｒｅら（１９９４，Ｌａｎｃ ｅｔ ３４４，２３５）は、ｒｈＶＥＧＦはＯＨＳＳ腹水を増加させるが肝性腹 水は増加させないこと、およびこの増加はｒｈＶＥＧＦ抗血清により逆転可能 であることから、ＶＥＧＦがＯＨＳＳ腹水産生の鍵となるメディエーターである と結論している。従って、腹膜血管系中のＶＥＧＦレセプターの発現を減少させ ることはＯＨＳＳ刺激腹水産生を大いに減少させることによりＯＨＳＳにおいて 治療的利益を持っているであろう。全身的循環内へのＶＥＧＦの卵巣放出により ＶＥＧＦは腹膜の至る所で血管上のＶＥＧＦレセプターと相互作用できるので、 全身的処置はこの症候群を処置するための最良の選択であろう。 悪性腹水：腹水の別の形は乳腺、膵臓、子宮および結腸直腸の癌を含む腹膜の 悪性腫瘍により誘導できる。ある種の癌は血漿血管外遊出を導く腹膜血管透過性 に影響する因子を生成していると考えられている（Ｇａｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａ ｌ．，１９８６；Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．２０３：６４４；Ｇａｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７，２０ Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．４２：１２６；Ｎａｇｙ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：２６３１）。いくつか の結腸直腸および乳癌腫を含むいくつかの固形腫瘍は持続性増殖および転移のた めの血管を動員するためにＶＥＧＦを分泌することが知られている。この分泌さ れたＶＥＧＦはまた局所血管透過性を増加させるために働くであろう。この仮説 を支持するものとして、Ｎａｇｙら（上記文献）はマウスにおいて、ＭＯＴおよ びＴＴＡ３／Ｓｔ癌腫から生じる腹膜液は上昇したレベルのＶＥＧＦを含んでお り、その濃度は液蓄積および高透過性微小血管の発生と直接的に相関しているこ とを示した。従って、全身的に投与されたＶＥＧＦレセプターに向かうリボザイ ムは腫瘍増殖およびＶＥＧＦ分泌腫瘍の転移、ならびに腹膜血管と相互作用する ＶＥＧＦにより誘導される腹水の両方に強い影響を与えるであろう。全身送達のための戦略 組織蓄積を上昇させるための方法 リボザイムの組織蓄積は処方、結合またはリボザイムのさらなる化学的安定化 により改良することができる。糸球体濾過による除去はリボザイムの見かけの分 子量を増加させることにより遅くできる、例えば、リポソームカプセル化または ＰＥＧへの生体結合により。出願者は異化の速度がＤＭＲＩＥ／ＤＯＰＥ試薬で の処方により１００倍遅くでき、および肺蓄積が５００倍に増加できることを観 察している。リポソームカプセル化は異化速度に対して同様の効果を持っている ようである。非標的組織への排出速度もまた、もしリポソームがＲＥＳ排出が避 けられるようにＰＥＧで表面修飾されているとすると、リポソーム内へのカプセ ル化により減少できる。標的組織による取り込み速度の増加も、例えば、リボザ イムへのコレステロールの結合により促進できる。出願者はまた、ＲＥＳの組織 中で、カチオン性脂質担体との複合体生成により蓄積が数百倍増加したことも観 察している。暴露を増加させる手段としての持続放出 ＡＬＺＥＴR浸透圧ミニポンプのような持続的または連続的送達装置もまた大 量静脈内投与と比較すると暴露を増加させることにより標的組織中の蓄積を促進 させるであろう。ＡＬＺＥＴRポンプからの持続的送達は、マウスにおいて腫瘍 増殖を阻害するためのホスホロチオエートアンチセンス分子を投与する有効な様 式であることが示されている（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．１９９５，上記文献） 。出願者は、循環系におけるリボザイムの異化速度および排出速度は濃度依存的 でありおよびリボザイムの平衡血漿タンパク質結合へ相関していることを観察し ている。ホスホロチオエートＤＮＡは、静脈内大量投与後の場合のように、その 濃度が血漿タンパク質結合定数を超えている場合、循環系から急速に排出される 。浸透圧ポンプはオリゴヌクレオチドをより遅いおよび一定の速度で投与し、そ のため血漿レベルを平衡結合能力近くに維持するであろう。これにより、糸球体 濾過（排出）および肝臓抽出（異化）により失われる投与量をより少なくする； より以上の投与量が標的組織内への取り込みのために利用可能となるであろう。動物モデル マウスモデルの使用 典型的な全身研究には、用量群当たり１０匹のマウス（各々２０ｇ）、５段階 の用量（１、３、１０、３０および１００ｍｇ／ｋｇ毎日、１４日の連続投与） 、約４００ｍｇのリボザイム、が含まれ、塩溶液に処方されて使用されるであろ う。若い成体ラット（２００ｇ）は４ｇ以上を必要とするであろう。平行薬物動 態研 究には類似の量のリボザイムが使用され、マウスモデルの使用がさらに正当化さ れた。リボザイムおよびルイス肺癌腫およびＢ−１６メラノーママウスモデル リボザイムの全身効能試験のために共通な動物モデルを同定することは全身効 能のためのリボザイムスクリーニングの効率のよい方法である。 ルイス肺癌腫およびＢ−１６マウスメラノーマモデルは原発および転移癌の広 く受け入れられているモデルであり、抗癌剤の最初のスクリーニングに使用され ている。これらのマウスモデルは免疫不全マウスの使用に依存せず、比較的安価 であり、およびケージの心配が最少ですむ。ルイス肺およびＢ−１６メラノーマ モデルの両方ともＣ５７ＢＬ／６Ｌマウス中の転移的に進行性の腫瘍細胞株（ル イス肺株３ＬＬまたはＤ１２２、ＬＬｃ−ＬＮ７；Ｂ−１６−ＢＬ６メラノーマ ）からの約１０6腫瘍細胞が皮下移植される。もしくは、ルイス肺モデルは腫瘍 領域（直径約０．８ｍｍ）の手術的移植により製造できる。転移はまた、腫瘍細 胞を直接静脈内へ注射することによりモデル化される。ルイス肺モデルにおいて 、微視的転移は移植後約１４日で観察でき、定量可能巨視的転移腫瘍は２１−２ ５日以内に発生する。Ｂ−１６は同様の時間経過を示し、腫瘍新血管新生は移植 後４日で始まった。同じ動物において２１−２５日後にこれらのモデルで原発お よび転移腫瘍の両方が存在するので、効能の指標として多数の測定が行われた。 原発腫瘍容量および増殖可能性ならびに微視的および巨視的転移性肺病巣の数、 または転移を示している動物の数が定量できた。寿命のパーセント増加もまた測 定できる。従って、これらのモデルは全身投与リボザイム／リボザイム処方のス クリーニングのための適した一次効能アッセイを提供する。 ルイス肺およびＢ−１６メラノーマモデルにおいて、広範囲に多様な薬剤によ る全身薬物治療は通常、連続的かまたは多数回の投与計画を用い、移植／接種１ −７日後に始まる。同時の薬物動態学研究は、期待されるべき薬物動態学的効果 についてリボザイムの十分な組織レベルが達成できたかどうかを決定するために 実施される。さらに、原発腫瘍および二次肺転移は種々のインビトロ研究（即ち 、標的ｍＲＮＡ減少）へ移され、検討される。抗ＶＥＧＦレセプターリボザイム 持続的腫瘍増殖および転移は血管新生に依存している。実際、増殖している腫 瘍における血管の出現は転移可能性の始まりと相関している。いくつかの研究は 、抗血管新生剤単独または細胞毒性薬剤との組み合わせはルイス肺およびＢ−１ ６メラノーマモデルにおける肺転移および／または原発腫瘍容量を減少させるこ とを示している（Ｂｏｒｇｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．１９９５，Ａｎｔｉｃａｎ ｃｅｒ Ｒｅｓ ．１５：７１９−７２８；Ｋａｔｏ ｅｔ ａｌ．１９９４，Ｃ ａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ．５４：５１４３−５１４７；Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ ｅｔ ａ ｌ．１９９４，Ｃｅｌｌ ７９：３１５−３２８；Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．１９ ９５，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．８６：３７４−３８２）。 固形腫瘍血管新生の誘導において関係があるとされている主因子は血管内皮増 殖因子（ＶＥＧＦ；Ｆｏｌｋｍａｎ，１９９５，前記文献）である。いくつかの ヒト腫瘍は合成および分泌することが示されている。肺転移の処置に関して、Ｖ ＥＧＦおよび両方のサブ型のＶＥＧＦレセプターおよびそれらの発現が低酸素条 件下でアップレギュレートされている（Ｔｕｄｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９４，Ｊ ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ ．９５：１７９８−１８０７）。このことは、腫瘍細 胞が循環系へ近づく手段を提供する新血管形成を導くであろう（Ｍａｒｉｎｙ− Ｂａｒｏｎ ａｎｄ Ｍａｒｍｅ，１９９５）。従って、ＶＥＧＦおよびそのレ セプターは転移性疾患の処置における重要な標的であろう。 出願者はｆｌｔ−１ ＲＮＡを標的としている触媒的に活性なリボザイムは、 血管新生のラット角膜モデルにおいてＶＥＧＦ誘導新血管形成を阻害することを 示した。抗血管新生リボザイムと組み合わされた細胞毒性薬剤での試験も有用で あることを証明するであろう。抗Ｋおよび抗Ｈ−ｒａｓリボザイム ｒａｓが関与する突然変異は多くのヒト癌の基になっている。ｒａｓはまた転 移可能性にも役割を果たしており（Ｓｈｅｋｈａｒ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ，１ ９９４，Ｉｎｖａｓｉｏｎ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ １４：２７−３７）、およ び一部、内皮細胞移動に影響することにより働くのであろう（Ｆｏｘ ｅｔ ａ ｌ．１９９４，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ９：３５１９−２６）。肺癌に関しては、ｒ ａｓ は肺繊維芽細胞において異常な有糸分裂を誘導することが示されており（Ｌ ｙｕｂｕｓｋｉ ｅｔ ａｌ．１９９４，Ｃｙｔｏｂｉｏｓ ８０：１６１−１ ７８）、非小細胞肺腫瘍における臨床マーカーである（Ｎｉｋｌｉｎｓｋｉ ａ ｎｄ Ｆｕｒｍａｎ，１９９５，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｐｒｅｖ．４：１ ２９−１３８）。ヒト小細胞肺腫瘍異種移植片から培養された細胞の研究で、Ｋ −ｒａｓの過剰発現が示された（Ａｒｖｅｌｏ ｅｔ ａｌ．１９９４，Ａｎｔ ｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ．１４：１８９３−１９０１）。この証拠は、前に議論 したマウス癌モデル（原発および二次転移）におけるＨ−およびＫ−ｒａｓに対 して向けられたリボザイムの全身性試験を十分に支持している。 ヒトＫ−ｒａｓに対して向けられた４つの現在の合成リボザイムは相同的マウ スＫ−ｒａｓ標的を４つの部位で切断し、培養ラット大動脈平滑筋細胞増殖を阻 害するであろう。抗ｃ−ｆｏｓリボザイム 原癌遺伝子ｃ−ｆｏｓのタンパク質産物は腫瘍発生に関与する核転写因子であ る。ｃ−ｆｏｓに対して方向付けられた全身投与リボザイムの使用可能性を支持 するものとして、ｃ−ｆｏｓヌルマウス突然変異は生存可能マウスを生じること が示されている。このマウスモデルを用いて、ｃ−ｆｏｓは乳頭腫の悪性変換に 重要であることが示されている。さらに、ｃ−ｆｏｓは腫瘍メタロプロテイナー ゼをアップレギュレートすることが示されている（Ｓｃｈｏｎｔｈａｌ ｅｔ ａｌ．１９８８，Ｃｅｌｌ ５４：３２５−３３４）。ｃ−ｆｏｓ欠損腫瘍でＶ ＥＧＦ ｍＲＮＡレベルが著しく減少していることにより明らかなように、腫瘍 血管新生にｃ−ｆｏｓが役割を果たしている可能性がある。また、ｃ−ｆｏｓは いくつかのＢ−１６細胞およびヒトメラノーマ細胞株で高度に発現されているこ とも示されている（Ｋｒｏｕｍｐｏｕｚｏｓ ｅｔ ａｌ．１９９４，Ｐｉｇｍ ｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ ．７：３４８−３５３；Ｎａｋａｙａｍａ ｅｔ ａ ｌ．１９９５，Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．２２：５４９−５５９；Ｐｅｒｉｓ ｅ ｔ ａｌ．１９９１，Ａｒｃｈ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｒｅｓ．２８３：５００− ５０５）。ｃ−ｆｏｓの発現はＢ−１６メラノーマ細胞株における転移可能性と 直接的に比例している。この証拠により、ｃ−ｆｏｓはルイス肺、Ｂ−１６メラ ノーマまたはヒトメラノーマモデルにおいて適した全身性リボザイム標的である と結論するのは合理的である。ルイス肺モデルにおけるリボザイムおよびリボザイム処方の送達 炎症性疾患に有用であろうカチオン性脂質複合体（例えば、ＤＩＭＲＩＥ／Ｄ ＯＰＥ他）およびリボザイムの血管暴露を促進するために使用されるであろうＲ ＥＳ回避リポソームを含むいくつかのリボザイム処方は、それらの肺への生体分 布が仮定されるため癌モデルにおいて興味が持たれる。それ故、血管新生応答と 結びついた病理学の部位へリボザイムを送達するためにリポソーム処方が使用で きる。 本研究に有用な化学的に合成されたリボザイムの配列は非制限的例である。当 業者は、これらの配列は活性に影響を及ぼすためにリボザイムの酵素的部分（ほ とんど結合アーム）が変えられているずっとより多いそのような配列の代表であ ることを認識するであろう。例えば、ハンマーヘッドリボザイムのステムループ II配列は、最小限二つの塩基対ステム構造が形成できるという条件で任意の配列 を含むように改変（置換、欠失および／または挿入）できる。同様に、表IVに掲 げたヘアピンリボザイムのステムループIV配列(５'−ＣＡＣＧＵＵＧＵＧ−３') は最小限二つの塩基対ステム構造が形成できるという条件で任意の配列を含むよ うに改変（置換、欠失および／または挿入）できる。好適には、これらの位置に わずか２００の塩基が挿入される。表IIIおよびIVに掲げた配列はリボヌクレオ チドまたは他のヌクレオチドまたは非ヌクレオチドから形成されるであろう。そ のようなリボザイム（酵素活性を持っている）は表に特別に記載したリボザイム の均等物である。標的部位 有用なリボザイムのための標的はＤｒａｐｅｒら，ＷＯ９３／２３５６９；Ｓ ｕｌｌｉｖａｎら，ＷＯ９３／２３０５７；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら，ＷＯ９４／０ ２５９５；Ｄｒａｐｅｒら，ＷＯ９５／０４８１８；ＭｃＳｗｉｇｇｅｎら，米 国特許第５，５２５，４６８号（全部が本明細書において援用される）に開示さ れているように決定できる。これらの文献に提供されている手引きを繰り返すと いうより、以下ではそのような方法の特別な実施例が提供されており、当業者を 制限するものではない。そのような標的へのリボザイムはこれらの出願に記載さ れているように設計され、また記載されているようにインビトロおよびインビボ で試験されるように合成された。 ヒトｃ−ｒａｆ ｍＲＮＡの配列はコンピューター折りたたみアルゴリズムを 用いて至適リボザイム標的部位に対してスクリーニングされた。ハンマーヘッド またはヘアピンリボザイム切断部位が同定された。これらの部位は表ＸII−ＸIX に示されている（表中、すべての配列は５’から３’である）。ヌクレオチド塩 基位置は表に示されており、指示された型のリボザイムにより切断されるべき部 位も示されている。 Ｒａｆ ＲＮＡはある領域では高度に相同的であるので、いくつかのリボザイ ム標的部位もまた相同的である（表ＸVIIIおよびＸIX参照）。この場合、単一の リボザイムはＲａｆ ＲＮＡの異なった組を標的とするであろう。Ｒａｆ ＲＮ Ａのいくつかの組を標的とする一つのリボザイムの利点は明らかである（特にこ れらのＲＮＡの一つまたはそれ以上が疾患状態に寄与する場合）。 ハンマーヘッドまたはヘアピンリボザイムは結合できるように設計され、およ びリボザイム配列が適切な二次構造へ折りたたまれるかどうかを評価するために コンピューターによる折りたたみ（Ｊａｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８９ Ｐ ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ，８６，７７０６）により個々に 分析された。結合アームおよび触媒的コア間の好ましくない分子内相互作用を持 つリボザイムは考慮から外された。結合アーム長を変化させて最適な活性になる ように選択できる。一般的に、各々のアームの少なくとも５塩基が標的ＲＮＡに 結合、またはさもなくば相互作用できる。ハンマーヘッドまたはヘアピンモチー フのリボザイムはｍＲＮＡメッセージ中の種々の部位へアニールするように設計 されている。結合アームは前記の標的部位配列と相補的である。実施例 以下は、本発明の酵素的核酸の選別、単離、合成および活性を示す、非限定的 な実施例である。 以下の実施例では、c-raf RNAを切断するリボザイムの選別を明らかにする。 本明細書中に記載の方法は、細胞分裂に必要な他のRNA標的を切断するようなリ ボザイムをもたらし得る計画の典型である。そのようなリボザイムをいかにして 細胞に輸送し得るかという説明をも提供する。実施例では、輸送の際にリボザイ ムが培養中の細胞増殖を阻害し、in vivoで遺伝子発現を調節するということを 明らかにする。さらに、触媒として不活性な変異リボザイムを細胞に使用する場 合には、阻害の有意な減少が観察される。従って、阻害にはこのリボザイムの触 媒活性が必要である。実施例1：ヒトc-raf RNA中の潜在的リボザイム切断部位の同定 コンピューター折りたたみアルゴリズムを用いて、接近可能な部位に関してヒ トc-raf RNAの配列をスクリーニングした。二次折りたたみ構造を形成せず、潜 在的なハンマーヘッドおよび/またはヘアピンリボザイム切断部位を含むようなm RNAの領域を同定した。これらの切断部位の配列を表XII-XIXに示す。 実施例2：ヒトc-raf RNA中のリボザイム切断部位の選別 コンピューターに基づいたRNA折りたたみアルゴリズムにより予想された部位 が、c-raf RNA中の接近可能な部位に一致したのかどうかを判断するために、20 個のハンマーヘッド部位を解析のために選択した。ヒトc-rafのゲノム配列（Gen Bank Accession No.X03484;Bonner et al.,1986,Nucleic Acids Research,14,10 09-1015）を解析し、折りたたみに基づいてその部位に優先順位をつけることに より、リボザイム標的部位を選んだ。各標的に結合可能なハンマーヘッドリボザ イムを設計し（図１参照）、そのリボザイム配列が適切な二次構造に折りたたま れるかどうかを評価するために、コンピューター折りたたみにより個別に解析し た（Christoffersen et al.,1994 J.Mol.Struc.Theochem,311,273;Jaeger et al .,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86,7706）。結合アームと 触媒中心の間の好ましくない分子内相互作用を持ったリボザイムを考察から除外 した。以下に記すように、多様な結合アーム長を選択して、活性を最適化し得る 。一般的に、各アーム上の少なくとも５塩基が標的RNAと結合、あるいは別な方 法で相互作用できる。A-Raf内のリボザイム標的部位を、ヒトA-raf-1のゲノム配 列（GenBank Accession No.X04790;Beck et al.,1987,Nudeic Acids Research,1 15,595-609）を解析することにより選択した。B-Raf内のリボザイム標的部位を 、ヒトB-raf-1のゲノム配列（GenBank Accession No.M95712 M95720 X54072;Sit anandam et al.,1990,Oncogene,5,1775-1780）を解析することにより選択した。実施例3：c-raf RNAの効果的な切断のためのリボザイムの化学合成および精製 RNAメッセージ内の様々な部位にアニールするように、ハンマーヘッドあるい はヘアピンモチーフのリボザイムを設計した。結合アームは上に記載した標的部 位配列に相補的である。このリボザイムを化学合成した。用いた合成方法は、Us manら（1987 J.Am.Chem.Soc.,109,7845）、Scaringeら（1990 Nucleic Acids Re s.,18,5433）および上記Wincottらに記載の、標準的なRNA合成の手順に従ったも ので、5'末端のジメトキシトリチル、3'末端のホスホロアミダイトなどの一般的 な核酸保護基およびカップリング基を利用した。段階的カップリング平均収率は >98％であった。 G5をＵで、A14をＵで（Hertel et al.,1992 Nucleic Acids Res.20,3252によ る番号付け）置換することにより、不活性リボザイムを合成した。２部分に分け てヘアピンリボザイムを合成し、アニールさせて活性リボザイムを再構築した（ Chowrira and Burke,1992 Nucleic Acids Res.,20,2835-2840）。バクテリオフ ァージT7 RNAポリメラーゼを用いてDNA鋳型からもリボザイムを合成した（Milli gan and Uhlenbeck,1989,Methods Enzymol.180,51）。例えば2'-アミノ、2'-C- アリル、2'-フルオロ、2'-O-メチル、2'-Hなどのヌクレアーゼ耐性基による修飾 により、リボザイムを修飾して安定性を増強した（総説として、Usman and Cede rgren,1992 TIBS 17,34を参照のこと）。リボザイムを、一般的な方法を用いた ゲル電気泳動により精製したか、あるいは高圧液体クロマトグラフィ ー（HPLC；上記Wincottらを参照のこと；これにより、その全体を本明細書中で 参考文献として援用している）により精製し、水に再懸濁した。本研究に用いた 化学合成したリボザイムの配列を、以下の表XII-XIXに示す。実施例4：in vitroにおけるc-raf RNA標的のリボザイム切断 上に記載のように、ヒトc-raf RNAを標的とするリボザイムを設計し、合成し た。これらのリボザイムは、例えば以下の手順を用いて、in vitroにおける切断 活性に関して分析し得る。c-raf mRNA内の標的配列およびヌクレオチド位置を表 XIIに示す。 切断反応：リボザイム切断アッセイ用の、全長あるいは部分的に全長の、内部 標識した標的RNAを[a-32P]CTPの存在下でのin vitro転写により調製し、スピン クロマトグラフィーによりG50 Sephadexカラムに通して、さらに精製することな く基質RNAとして用いた。あるいは、T4ポリヌクレオチドキナーゼ酵素を用いて 基質を5'-32P末端標識する。2X濃度の精製リボザイムをリボザイム切断バッファ ー（50mM Tris-HCl,37℃でpH7.5、10mM MgCl2）中であらかじめ温めることによ りアッセイを行い、やはり切断バッファー中であらかじめ温めておいた等量の基 質RNA（最大1-5nM）に2Xリボザイム混合物を加えることにより切断反応を開始し た。最初のスクリーニングとして、40nMあるいは１mMリボザイム、すなわちリボ ザイム過剰、のいずれかの最終濃度を用い、１時間、37℃でアッセイを行う。等 量の95％ホルムアミド、20mM EDTA、0.05％ブロモフェノールブルーおよび0.05 ％キシレンシアノールを加えることにより反応をしずめ、その後、試料を95℃で ２分間熱し、急冷し、変性ポリアクリルアミドゲルにのせる。基質RNAおよびリ ボザイム切断により生じた特異的なRNA切断産物を、ゲルのオートラジオグラフ 上に可視化する。切断のパーセンテージを、無 実施例5：c-rafリボザイムの平滑筋細胞増殖阻害能 c-Raf mRNA内のリボザイム標的部位を、ヌクレアーゼ耐性を付与するような修 飾を用いて合成した（Beigelman,1995,J.Biol.Chem.270,257-2）。そのリ ボザイムを、Jarvisら（1996,RNA 2,419；本明細書中で参考文献として援用して いる）に記載のように、血清飢餓状態にしたラット初代大動脈平滑筋細胞におけ る細胞増殖阻害能に関してスクリーニングした。Seq ID No 175および198により 表されるリボザイム標的部位は、細胞増殖を阻害することにおいて取り分け高い 活性を示した。同一の基質結合アームを持つが、切断活性を消滅させるような変 異を触媒中心に含む、不活性な対照リボザイムを合成した。活性対不活性c-Raf リボザイムによる細胞増殖の阻害を図37および38に示す。データは、血清剌激し た無処理の対照細胞と比較した増殖として表す。明らかに、無処理の対照および 対応する不活性対照の両方と比較して、活性リボザイムはかなりの阻害を示して おり、従ってこれは、増殖の阻害がリボザイムを介するc-Rafの切断によって仲 介されるということを示している。 他のいくつかの系において、陽イオン性脂質は培養中の細胞へのオリゴヌクレ オチドのバイオアベイラビリティーを増強することが示された(Bennet,C.F.,et al.,1992,Mol.Pharmacology,41,1023-1033)。以下の実験の多くにおいて、リボ ザイムを陽イオン性脂質と複合体化した。陽イオン性脂質である、Lipofectamin e（DOSPA(2,3-ジオレイロキシ-N-[2(スペルミンカルボキシアミド)エチル]-N,N- ジメチル-1-プロパンアミニウムトリフルオロ酢酸)とジオレオイルフォスファチ ジルエタノールアミン(DOPE)の3:1（w/w）製剤）を、Life Technologies,Incよ り購入した。DMRIE(臭化N-[1-(2,3-ジテトラデシロキシ)プロピル]-N,N-ジメチ ル-N-ヒドロキシエチルアンモニウム)をVICALより得た。DMRIEをCHCl3に再懸濁 し、ジオレオイルフォスファチジルエタノールアミン（DOPE）と1:1モル比で混 合した。CHCl3を蒸発させ、脂質を水に再懸濁し、１分間ボルテックスし、５分 間、高温槽超音波処理した。リボザイムと陽イオン性脂質の混合物を、細胞に加 える直前に無血清DMEMにて調製した。添加物を加えたDMEMを室温（約20-25℃） まで温め、陽イオン性脂質を望みの最終濃度になるまで加え、溶液を手短にボル テックスした。RNAオリゴヌクレオチドを望みの最終濃度になるまで加え、溶液 を再び手短にボルテックスし、10分間、室温でインキュベートした。用量反応実 験では、RNA/脂質複合体をDMEMにて連続的に希釈し、10分間インキュベートした 。 血清飢餓状態にした平滑筋細胞をPBSで２回洗い、RNA/脂質複合体を加えた。 プレートを４時間、37℃にてインキュベートした。それから、培地を除き、10％ FBS、添加物および10μMブロモデオキシウリジン（BrdU）を含むDMEMを加えた。 いくつかのウェルでは、無刺激の増殖のベースラインを求めるためにFBSを省い た。 プレートを37℃にて20-24時間インキュベートし、0.3％H2O2の100％メタノー ル溶液にて固定し、標準的な方法によりBrdU取り込みについて染色した。個の手 順において、増殖し、BrdUを取り込んだ細胞は茶色に染色され；増殖していない 細胞は明紫色に対比染色される。BrdU陽性およびBrdU陰性の両方の細胞を顕微鏡 下で計数した。ウェルあたり全300-600細胞を計数した。以下の実験では、BrdU を取り込んだ全細胞のパーセンテージ（％細胞増殖）を表す。誤差は二重のウェ ルの範囲を表す。また、パーセント阻害を％細胞増殖値から以下のようにして計 算する。すなわち、％阻害=100-100((リボザイム-0％血清)/(対照-0％血清)。 この最初のスクリーニングから、c-raf部位1120（図36）を標的とするハンマ ーヘッドリボザイムをさらに分析した。この活性リボザイムは平滑筋細胞の増殖 を阻害することができたのに対し、触媒中心配列内の改変のためにc-raf RNAを 切断できない対照の不活性リボザイムは平滑筋細胞の増殖を阻害できない（図37 ）。従って、これらのハンマーヘッド配列による細胞増殖の阻害は、c-raf RNA を切断する能力のためであり、いかなる非リボザイム活性のためでもない。実施例6：限定的および無作為なライブラリーをクローニングするためのオリゴ ヌクレオチドの設計および調製 本研究で限定的および無作為なリボザイムライブラリーを構築するために用い るDNAオリゴヌクレオチドを、Life Technologies(BRL)から購入した。前記限定 的あるいは包括的なリボザイムライブラリーを構築するのに用いたオリゴヌクレ オチド設計の概略図を図８に示す。本実施例は、そのようなライブラリーを構築 するための１つの可能な手段の例証を意図したものである。本明細書中に記載の 方法は、そのようなライブラリーを構築するためのあらゆる可能な方法を含め たものであるとは意図していない。ハンマーヘッドリボザイムライブラリーを構 築するために用いたオリゴヌクレオチドを、以下のように設計した。 5'-CGAAATCAATTG-(N1)X-{触媒中心}-(N2)X-CGTACGACACGAAAGTATCG-3' 式中、N1=長さＸのStem I標的特異的結合アーム、触媒中心＝ハンマーヘッド 触媒ドメイン5'-CTGATGAGGCCGUUAGGCCGAAA-3'、およびN2=長さＸのStem III標的 特異的結合アームである。オリゴの3'末端にコードされるステム-ループ構造の 形成を介して自己プライムするように、オリゴヌクレオチドを設計した（図8A） 。この分子内相互作用は、リボザイムがコードするオリゴヌクレオチドの複合体 プールの偏りのない拡大に好都合である。以下に記載の限定的リボザイムライブ ラリー（図9-10）の場合は、N1およびN2はそれぞれ８ntであり、プリンヌクレオ シドホスホリラーゼ（PNP）遺伝子によってコードされるRNAに相補的であるよう に設計した。無作為なリボザイムライブラリーの場合は、N1およびN2は合成の間 に無作為化され、あらゆる可能なハンマーヘッドリボザイムのただ一つのプール をもたらした。 示した実施例（図9-10）においては、40個の異なるPNP特異的ハンマーヘッド リボザイム（40個以上のリボザイムを用い得る）をコードするオリゴヌクレオチ ドを、最終濃度１μMの総オリゴヌクレオチド（個々のオリゴそれぞれ2.5nM）に なるようにプールした。オリゴを68℃に30分間熱し、それから周囲の温度まで冷 却して、自己プライミングのために3'ステム-ループの形成を促進した（図8A） 。Klenow DNAポリメラーゼ（1mlの50mM Tris pH7.5、10mM MgCl2、100mg/ml BSA 、25μg M dNTP混合物、および200U Klenow中に１μM総オリゴヌクレオチド）を 用いて、30分間、37℃でインキュベートすることにより、3'ステムループを伸長 した（図8B）。それから、反応混合物を65℃に15分間熱し、ポリメラーゼを失活 させた。二本鎖オリゴ（およそ30μg）を、製造者が記載するように100Ｕの5'制 限エンドヌクレアーゼMfe I（NEB）にて消化し、それから、3'制限エンドヌクレ アーゼBsi WIにて同様に消化した（図8C）。クローニングの過程の間に複数のリ ボザイムインサートが生じる率を減らすために、切断した産物を製造者が記載す るようにウシ腸ホスファターゼ(CIP、Boehringer Mnnheim）にて処理し、5'末端のリン酸基を除去した。この過程はリボザイムが コードする断片の分子内および分子間連結を阻害する。二本鎖の、制限酵素消化 してホスファターゼ処理した産物に対応する全長産物を、クローニングの前の10 ％非変性アクリルアミドゲルによる電気泳動に続き、全長物質を濃縮するために ゲル精製した。実施例7：限定的および無作為なライブラリーのクローニング 用いたクローニングベクターには、以下のクローニング部位、すなわち5'-Mfe I-ClaＩ-BsiWI-3'が含まれていた。用いる前にベクターをMfeＩおよびBsiWIにて 消化した。従って、両方の酵素で切断されたベクターは、この部位の間に存在す るClaＩ部位を欠いているはずだが、酵素のうちの一つでのみ切断されたベクタ ーはClaＩ部位を依然失っていないはずである。1xリガーゼバッファー（Boehrin ger Mannheim）中、500ngのベクターおよび５Ｕのリガーゼを含む50mLの反応溶 液中でベクターに対して二本鎖オリゴが2:1あるいは5:1のモル比を用いて、プー ルされたオリゴをベクターに連結した。ライゲーション反応溶液を16℃で一晩イ ンキュベートし、それから65℃に10分間熱してリガーゼ酵素を失活させた。望み の産物は、単一のリボザイムインサートを含み、MfeＩおよびBsiWIクローニング 部位の間に含まれる元のClaＩ部位を欠いている。産物を５Ｕの制限エンドヌク レアーゼClaＩにて１時間、37℃で切断することにより、リボザイムインサート を欠き、それゆえ依然としてClaＩ部位を含む、あらゆる不必要な、バックグラ ウンドのベクターを不活性化した。およそ150ngの連結されたベクターを用いて 、100μlのXL-2 Blueコンピテント細菌を供給者（Stratagene）が記載するよう に形質転換した。実施例8：限定的なリボザイムライブラリーを用いた、PNPを標的とする40個の異 なるリボザイムの一斉スクリーニング PNPを標的とする40個の異なるハンマーヘッドリボザイムを含む、限定的なリ ボザイムライブラリーを、上に記載のようにして構築した（図8-10）。PNPはプ リン代謝/再生経路において決定的な役割を果たす酵素である。PNP活性が 減少した細胞は野生型の活性量を持った細胞から薬剤6-チオグアノシンを用いて 容易に選別できるため、PNPを標的として選択した。この試薬は、PNPによって6- チオグアニンに変換されるまでは細胞に対して無毒である。従って、PNP活性が 減少した細胞は、この薬剤に対してより耐性であり、野生型の活性量を持った細 胞に対して有毒であるような濃度の6-チオグアノシン中で選択的に増殖できる。 PNPを標的とした限定的なリボザイムライブラリー発現ベクターをレトロウイ ルスベクター粒子に変換し、得られた粒子を用いてSup T1ヒトＴ細胞株に形質導 入した。Ｔリンパ球はプリン再生経路により依存的であり、それゆえ6-チオグア ノシン傷害に対して非常に感受性であるため、Ｔ細胞株を研究のために選択した 。形質導入から２週間後、細胞に10mmolの6-チオグアノシンを投与した。選別の 開始から２週間後に耐性細胞が出現し始めた。6-チオグアノシン耐性細胞を回収 し、発現ベクターのリボザイムをコードする領域をPCRを用いて増幅し、配列決 定した。選別された細胞におけるリボザイム領域の配列パターンは、図９に示す 出発ライブラリーから得られたものとは有意に異なっていた。元のライブラリー では、PNPを標的とする全40個のリボザイムの存在のため、結合アームの配列は 不明瞭であった（図9）。しかし、6-チオグアノシン選別した細胞に由来するリ ボザイムをコードする領域の配列は、元のプールに含まれるリボザイムのうちの 一つ-PNP mRNAのヌクレオチド#32で切断するように設計されたリボザイムに明ら かに偏っていた。これらのデータは、リボザイムが標的とするPNP mRNAの位置32 はプールに含まれるPNPを標的とする他の39個のリボザイムよりも活性であるよ うだということを示唆している。実施例9：触媒速度の増強のための、ハンマーヘッドリボザイム（HH-B）のルー プII配列の最適化 図12のアプローチに記載したコンビナトリアルアプローチの実行可能性を分析 するために、申請者はハンマーヘッドリボザイム（HH-B）のループIIの配列を最 適化することに決めた（図22参照）。ループII内の様々な化学修飾および異なる 配列は、この配列が系統発生的に保存されておらず、実際に完全に欠失し て得るという事実にも関わらず、in vitroにおける切断の速度に有意な影響を与 え得るということが以前の研究により実証されていた。ハンマーヘッドリボザイ ムに関する標準的な番号付けシステムに従い、ループII内の４つの位置に12.1、 12.2、12.3、および12.4と番号が付いている。出発リボザイム（HH-B）には、配 列G12.1A12.2A12.3A12.4が含まれていた。簡単のために、４つの位置に5'から3' に、G12.1=1；A12.2=2；A12.3=3；A12.4=4と番号付けをするだろう。ハンマーヘ ッドリボザイム“鋳型”の残余は、不変のままであり、以前に記載したハンマー ヘッドモチーフ（本明細書中に参考文献として援用しているDraper et al.,Inte rnational PCT公示番号WO 95/13380）に基づいている。 ４つ（クラスの数=4）のループII位置を最適化するための戦略を、図180に図 解する。４つの標準的なリボースヌクレオチド（Ａ、Ｃ、ＵおよびＧ）を選び、 リボザイムプールを構築した（n=4）。第一段階では、本明細書中に記載したヌ クレオチド基礎単位混合アプローチにより４つの異なるプールを合成した。予備 的な実験により位置３の塩基が一致していることが活性に対して最も深い影響を 持つことが示されていたため、申請者はまずこの位置を“固定”することに決め た。位置１、２、および４は無作為である。４つのプールを化学量論条件（1μM リボザイム；1μM基質）下でアッセイし、各プール中のリボザイムの完全な集団 をアッセイしたことを保証するのを助けた。基質およびリボザイムをあらかじめ アニールさせ、10mM MgCl2を加えることにより反応を開始した。各ライブラリー の切断速度を、時間の関数としての切断された基質の画分のプロットから導いた 。出発リボザイム（ずなわち、均質な、ループII=GAAA）にても反応を一斉に行 った。ライブラリーの観察された速度を対照/出発リボザイムの速度で割ること により各ライブラリーの切断の相対速度（krel）を算出し、図21にプロットした 。誤差バーは曲線フィットから導いた標準誤差を示す。結果は、４つのプール全 てが同様の速度（krel）を持っていたが、位置３に“Ｕ”を持つライブラリーが わずかに速かったということを示している。 位置３を一定にし（U3）、位置４を固定して（F4）、位置１および２を無作為 にして（Ｘ）、リボザイムプールを再び合成した（クラス2）。４つのプールを 前と同様にアッセイし、位置４に“Ａ”を含むプールを最も望ましいプールとし て 同定した。それゆえ、次のプール（クラス3）の合成の間、位置３および４をU3 およびA4に一定にし、位置２を固定して（F2）位置１を無作為にした（Ｘ）。４ つのプールを再びアッセイしたところ、４つのプール全てが非常に類似している が実質上は高まった切断速度を示した。位置２にＵを含むプールを最も速いもの として同定した。それゆえ、最後の４つのリボザイム（クラス4）の合成の間、 位置３、４および２をU3、A4およびU2に一定にし、位置１をＡ、Ｕ、ＣまたはＧ に固定した。位置４にＧを含む最後のリボザイムを最も速いリボザイムとして明 確に同定し、最適化されたリボザイムモチーフとしてG12.1U12.2U12.3A12.4の同 定ができた。 最終的なリボザイム（G12.1U12.2U12.3A12.4）が出発リボザイム（G12.1A12.2 A12.3A12.4)よりも本当に速いということを確認するために、飽和リボザイム濃 度で単回ターンオーバー条件下、２つのリボザイム（図22に図解してある）を比 較した。観察された速度は、それゆえこの化学段階の速度ｋ2を測定するはずで ある。時間の関数としての切断されずに残っている基質の画分を、図22に示し（ 下のパネル）、導かれた速度定数を示す。結果は、最適化されたリボザイムは出 発リボザイムよりも>10倍速く（3.7min-1対0.35min-1）切断するということを示 している。実施例10：ハンマーヘッドリボザイム（HH-A）の中心の化学的性質の最適化 図12に記載したアプローチの実行可能性をさらに分析するために、ハンマーヘ ッドリボザイム（HH-A）の中心内の３つのピリミジン残基を最適化することに決 めた。以前の研究により、これらの位置がこのリボザイムの安定性（上記Beigel man et al.，1995）および活性（上記Ruffner et al.,1990；上記Burgin et al. ,1996）の両方に決定的であることが示されていたため、これらの３つの位置（ 図13にU7、U4およびC3として示されている）を選んだ。ハンマーヘッドリボザイ ムに関する標準的な番号付けシステムに従えば、３つのピリミジン位置は７、４ および３である。ライブラリーの構築に関しては、このリボザイムの位置を3'か ら5'に、位置24=7、位置27=4、および位置28=3と番号を付ける（図13参照）。ハ ンマーヘッドリボザイム“鋳型”の残余は、不変のままであり、以前に記載した ハンマーヘッドモチーフ（本明細書中に参考文献として援用 しているThompsonら、アメリカ合衆国特許番号5,610,052）に基づいている。出 発リボザイム鋳型はk-ras mRNAのヌクレオチド位置823（部位Ａ）を標的として いる。リボザイム作用の結果としてのこのメッセージの負の制御は、細胞が増殖 できない結果になる。それゆえ、リボザイムを最適化するために、細胞増殖を阻 害するのに成功した“変異体”を同定することに決めた。細胞培養アッセイ： リボザイム：脂質複合体形成 リボザイムおよびLipofectAMINEを、それぞれ100nMおよび3.6μMの最終濃度で DMEM中で結合させた。血清および抗生物質の非存在下、37℃で15分間、複合体を 形成させた。 増殖アッセイ 初代ラット大動脈平滑筋細胞（RASMC）を、48ウェルプレートに2500細胞/ウェ ルの密度でまいた。20％ウシ胎児血清（FBS）、Na-ピルビン酸、ペニシリン（50 U/ml）、およびストレプトマイシン（50μg/ml）を補ったDMEM中で細胞を一晩イ ンキュベートした。続いて、0.5％ FBSを含むDMEM中で48時間インキュベートす ることにより、細胞を休止状態にした。 細胞を無血清のDMEM リボザイム：脂質複合体と共に1.5時間インキュベート した。培地を交換し、0.25％ FCSを含むDMEM中で細胞を24時間インキュベートし た。 それから、細胞を10％ FBSにて24時間刺激した。3H-チミジン（0.3μCi/ウェ ル）が血清刺激の最後12時間、存在した。 刺激期間の最後に培地を吸引し、細胞を氷冷TCA（10％）にて15分間固定した 。TCA溶液を除き、ウェルを水で一回洗った。0.1N NaOHにてRTで15分間インキュ ベートすることにより、DNAを抽出した。可溶化されたDNAを定量的にミニバイア ルに移した。プレートを水で一回洗った。最後に、3H-チミジン取り込みを、液 体シンチレーション計数により求めた。 ３つ（クラスの数=3）のピリミジン残基を最適化するための戦略を図20に図解 する。リボザイムライブラリー（n=10）を構築するために10個の異なるヌク レオチドアナログ（図15に図解してある）を選んだ。第一段階では、本明細書中 に記載した混合および分離アプローチにより、10個の異なるプール（クラス1） を合成した。10個の異なるアナログのそれぞれについて位置24および27は無作為 にし、位置28は固定した。この10個の異なるプールを陽イオン性脂質で製剤し（ Jarvis et al.,1996,RNA,2,419;本明細書中で参考文献として援用している）、 細胞にin vitroで輸送し、続いて細胞増殖をアッセイした（図16を参照）。陽性 の対照（活性リボザイム）は細胞増殖を50％阻害し、不活性な対照（不活性）は 細胞増殖について25％以下の減少という結果だった。10個のリボザイムプールは 中間の量の減少という結果だった。しかし、最良のプールをX24X272'-MTM-U28（ 位置24および27は無作為；位置28は2'-O-MTM-U）であると同定できた。それゆえ 、位置28を一定にし（2'-O-MTM-U）、位置24を無作為に（X24）、10個の異なる アナログのそれぞれについて位置27を固定して（F27）、第二のリボザイムライ ブラリー（クラス2）を合成した。さらに、細胞増殖を阻害する能力に関してこ の10個のプールをアッセイした。クラス２の中では、２個のプールが同等によく 増殖を阻害した、すなわち、X242'-C-アリル-U272'-MTM-U28およびX242'-O-MTM- C272'-MTM-U28である。クラス２では単一の“勝者”が同定できなかったため、 位置27を2'-C-アリル-Uあるいは2'-O-MTM-Cのいずれかで一定にし、位置24で10 個アナログを個別に定めた（クラス3）。それゆえクラス３では、細胞増殖を阻 害する能力に関して20個の異なるリボザイムをアッセイした。位置27および28の 両方が一定であるため、最後の20個のリボザイムは無作為な位置を全く含まない 。従って最後の群（クラス3）では、純粋なリボザイムであってプールではない ものをアッセイした。最後の群のうち、４個のリボザイムが対照のリボザイムよ りも大いに細胞増殖を阻害した（図22）。これらの４個の勝者を図23Aに図解す る。図23Bは４つの異なるモチーフの一般式を示す。新規のリボザイムモチーフ の式を図18に示す。実施例11：標的内のリボザイム作用に関わる接近可能部位の同定 前の２つの実施例（9および10）では、ハンマーヘッドリボザイムの触媒ドメ イン内の位置を最適化した。分析する必要のある群の数は、分析するために選ん だリボザイム内の位置の総数に等しい。同様の手順を、リボザイムの結合アーム に用い得る。結合アームの配列はリボザイムの作用部位を決める。ずべての可能 なアーム配列を完全に分析することにより、コンビナトリアルアプローチを用い てそれらの部位を同定し得る。このアプローチの難点は、しっかりとかつ特異的 に結合するためにはリボザイムは一定の数の塩基対（12-16）を必要とすること である。上に概説した手順に従えば、これには12-16の異なるリボザイムプール の群が必要だろう、すなわち、合成し分析する12-16の異なる群を必要とするで あろう12-16個の位置を最適化しなければならないだろう。各プールには４つの 異なるヌクレオチド（Ａ、Ｃ、ＵおよびＧ）またはヌクレオチドアナログ（n=4 ）が含まれるだろう。各グループを分析し、最良のプールを同定し、さらに一カ 所を一定にしてリボザイムプールの別の群を合成し、それから全12-16個の群を 分析しきるまでこの手順を繰り返すのは、時間の非常な浪費だろう。しかし、単 一の群内の複数の位置を分析することにより、群の数を減らすことが可能である 。この場合、ある郡内のプールの数は、ｗ力までの無作為な混合物（すなわち、 n）中のヌクレオチドまたはアナログの数に等しく、ｗは各群内で固定した位置 の数に等しい。最終的なリボザイムを最適化するために合成する必要のある群の 数は、最適化するべき位置の総数を各郡内で分析した位置の数（ｗ）で除したも のに等しい。各群内のプールの数＝nw。群の数＝位置の総数/w。 例えば、図23は12塩基対の結合アームを含むハンマーヘッドリボザイムに関す るこの概念を図解している。２つの結合アームのそれぞれがその対応するRNA標 的と６塩基対を形成する。ハンマーヘッドリボザイムに関しては、一残基（A15. 1）を一定にしておかねばならず、A15.1は基質ヌクレオチド（U16.1）と塩基対 を形成するが、リボザイム活性にも絶対に必要であるということに注意すること が重要である。これは、ハンマーヘッドリボザイム内で、触媒ドメインと結合ド メイン（アーム）の両方の一部である唯一の残基である。この例では、この位置 は最適化されていない。最初の群では、３つの位置を４つの異なる2'-O-メチル ヌクレオチド（Ａ、Ｃ、ＵおよびＧ）で固定する（Ｆと呼ぶ）。2'-O-メチル修 飾は、リボザイムをヌクレアーゼ分解に対して安定にし、その基質との結合親和 性を増す。前の実施例と同様に、各群内のプールの総数はｎに等しくない。 各群中のプールの数は、４3=（4つのアナログ）∧（固定した位置の数；3）=64 に等しい。全64個のプールでは、アーム内の他の全ての位置がヌクレオチド混合 基礎単位アプローチにより無作為にされている（Ｘと呼ぶ）。触媒ドメインは、 この例では考慮しておらず、それゆえリボザイム鋳型の一部のままである（すな わち、一定）。 第一段階では、全64個のリボザイムプールを分析する。この分析は、in vitro での切断（実施例９参照）、あるいは細胞（実施例10参照）または動物モデル、 あるいは他のアッセイ可能なあらゆる終点における効率であり得る。しかし、こ の終点は特定のRNA標的に特異的でなければならない。例えば、遺伝子ＢのmRNA 内の接近可能部位を同定しようと望むならば、適切な終点はリボザイム処理後の 遺伝子Ｂ mRNA量の減少を期待することであろう。勝者となったプールを同定し た後、各プールは３つの位置（ｗ）が同一であることを条件として指定するため 、３つの位置を次の群（クラス2）のために一定にし得る。クラス２は64個の異 なるプールを含むように合成し、クラス１で固定した３つの位置を今度は一定に して（Ｚと呼ぶ）、さらに３つの位置を固定し（Ｆ）、残りの位置（Ｘ）を４つ のヌクレオチドの無作為な混合物とする。64個のプールを前と同様にアッセイし 、勝者となったプールを同定し、さらに３つの位置をリボザイムプールの次のク ラス（クラス3）で一定にさせて、この過程を再び繰り返す。リボザイムの最終 的なクラス（クラス4）では、ただ２つの位置を固定し、他の全ての位置は以前 に固定されたものである。それゆえ、リボザイムの総数はnw=42＝16であり、こ れらのリボザイムも無作為な位置を全く含まない。最終段階（段階4）では、16 個のリボザイムを分析し、勝者となったリボザイムが特定の標的に関する結合ア ームの配列を明らかにする。 単一の郡内の複数の位置を固定し、分析する必要のある群の総数を減らすこと が可能である。言及した通り、これは多数の異なる位置を最適化する必要がある 場合にはとりわけ有用である。このアプローチの第二の利点は、各プール内の分 子の複雑さを減らすということである。ある特定のプール内の多くの組み合わせ が不活性であろうと予想される場合には、各プール内の異なるリボザイムの数を 減らすことにより、“勝者となる”プールを同定することがより容易になるだろ う。このアプローチでは、各群内でより多数のプールを分析しなければならない が、群の数はより少なく、各リボザイムプールの複雑さがより小さい。結局、分 析し得る位置またはアナログの数についての制限は無いということを強調すべき である。各群内でいくつの位置を分析するかについても制限は無い。実施例12：リボザイムの新規RNA標的の同定 リボザイム接近可能部位の同定に関して上に記載したように、“勝者となる” リボザイムのプールを同定するのに用いるアッセイは、限定されてはなく、in v itroにおける切断（実施例８参照）、あるいは細胞（実施例９参照）または動物 モデル、あるいは他のアッセイ可能なあらゆる終点における効率であり得る。接 近可能部位を同定するために、この終点は特定のRNA標的に対して特異的でなけ ればならない（例えば、mRNA量など）。しかし、終点は非特異的でもあり得る。 例えば、ある疾患モデルを選び、望みの効果を提供する能力に基づいて勝者とな るリボザイムプールを簡単に同定することができる。この場合、リボザイムが作 用する細胞標的が何であるかを知っている必要さえもない。望みの効果を有する リボザイムを簡単に同定できる。このアプローチの利点は、結合アームの配列は RNA標的と相補的であろうということである。それゆえ、疾患過程あるいは他の あらゆるアッセイ可能な表現型に関わる遺伝子産物を同定することが可能である 。研究を始める前に標的が何であるかを知っていなくともよい。最適化されたリ ボザイムを同定する過程（アームコンビナトリアル）は、薬剤（リボザイム）お よび、既知のRNA配列あるいは新規遺伝子の発見につながる新規配列であり得る ような、RNA標的の両方を同定する。実施例13：新規リボザイム触媒ドメイン 前の２つの実施例では、ハンマーヘッドリボザイムの結合ドメイン内の位置を 変化させ、触媒ドメイン内の位置は変えなかった。逆に、新規触媒モチーフを同 定するために、結合アーム内の位置を変えずに触媒ドメイン内の位置を変化させ ることが可能である。一例を図24に図解する。このハンマーヘッドリボザイムは 、例えば触媒ドメイン内に約23残基を含む。これら23個の位置のいくつが機 能的な触媒ドメインを得るのに必要であるかは明らかではないが、プールを構築 するのに多数の機能的に多様なヌクレオチドアナログを用い得るならば、比較的 少数の位置で機能的な触媒ドメインを構築し得るだろうと推定することは妥当で ある。これは、触媒作用（例えば、酸/塩基触媒作用、金属結合など）に寄与す ると期待されるであろうアナログを選ぶ場合には特に真実であり得る。図24に図 解した例では、４つの位置（１、２、３および４と呼ぶ）が選ばれている。第一 段階では、リボザイムライブラリー（クラス1）を構築する、すなわち、位置１ を固定して（F1）、位置２、３、および４を無作為にする（それぞれX2、X3およ びX4）。段階２では、このプール（分析するプールの数は用いるアナログの数に 依存する；n）を活性に関してアッセイする。この分析は、in vitroあるいは細 胞または動物モデルにおいて行い得る。いかなるアッセイを用いても、最も高い 活性を持ったプールが同定され、今度は位置１をクラス１で同定したアナログで 一定にし（Z1）、ライブラリー（クラス2）を再び合成する。クラス２では、位 置２を固定し（F2）、位置３および４を無作為にする（X3およびX4）。すべての 位置が一定にされるまでこの過程は繰り返され、従って、触媒ドメインまたは新 規モチーフが同定される。実施例１４：分割・混合法に使用されるホスホルアミダイト誘導体、２’−Ｃ− アリル−ウリジン、１；４’−チオ−シチジン、２；２’−メチルチオメチル− ウリジン、３；２’−メチルチオメチル−シチジン、４；２’−アミノ−ウリジ ン、５；Ｎ３−メチル−ウリジン、６；１−ｂ−Ｄ−（リボフラノシル）−ピリ ジン−４−オン、７；１−ｂ−Ｄ−（リボフラノシル）−ピリジン−２−オン、 ８；１−ｂ−Ｄ−（リボフラノシル）−フェニル、９；６−メチル−ウリジン、 １０のカップリング効率の測定 アミダイト１〜１０のカップリング効率の傾向を評価するために１０個のモデ ル配列ａｇａｃＸＧＡｕＧａを使用した（大文字はリボヌクレオチド残基、小文 字は２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド残基を表し、Ｘはアミダイト１〜１０で あり、修飾されたアミダイト１〜１０が取り込まれるハンマーヘッドリボザイム ライブラリーの構築に使用される。１０個のモデル配列の合成に使用したのは１ ０個の０．１１２ｇ画分の５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−Ｍｅ−アデノシンポリ スチレン（ＰＳ）固相支持体であり、これは２２．３μｍｏｌ／ｇで負荷し、２ ．５μｍｏｌのスケールの合成に相当する。これらの１０個の１０量体の合成は ＡＢＩ ３９４ ＤＮＡ合成装置（Applied Biosystems,Foster City,Calif.） で行い、標準的な核酸合成試薬および合成プロトコールを使用したが、カップリ ング時間は延長し、リボヌクレオシドホスホルアミダイトおよびホスホルアミダ イト１、２、３、４、６、７、８、９、１０は７．５分間、２’−アミノ−ウリ ジンホスホルアミダイト、アミダイト５は１２．５分間、そして２’−Ｏ−メチ ルヌクレオシドホスホルアミダイトは２．５分間とした。 オリゴマーを固相支持体から開裂するために、水酸化アンモニウム：無水エタ ノールの３：１混合物を用いて６５℃で４時間処理し、その後脱シリル化処理し 、そしてWincottらに記載されるブタノール沈殿を行った（Wincottら,Nucleic A cids Res，1995,232677-2684；本明細書の一部としてここに引用する）。オリゴ ヌクレオチドを陰イオン交換ＨＰＬＣカラム（Dionex,Nucleopac,PA-100,4x250m m）で直接分析したが、これには１２分間にわたる５０％〜８０％のＢのグラジ エント（Ａ＝１０ｍＭ 過塩素酸ナトリウム、１ｍＭ トリス、ｐＨ９． ４３；Ｂ＝３００ｍＭ 過塩素酸ナトリウム；１ｍＭ トリス、ｐＨ９．３６） およびHewlett-Packard 1090 HPLCシステムを使用した。 平均段階収率（ＡＳＷＹ）はホスホルアミダイト１〜１０のカップリング効率 を示すが、ピーク面積の百分率から以下の式に従って算出した：ＡＳＷＹ＝（Ｆ LP％）1/n（式中、ＦＬＰ％は粗製のクロマトグラムにおける全長の生成物の百 分率であり、ｎは合成サイクル数である）。ホスホルアミダイト１〜１０で９６ ．５％〜９７．５％の範囲のＡＳＷＹを得た。実験に基づくホスホルアミダイト １〜１０のカップリング効率を標準的なジメトキシトリチル分光光度アッセイを 使用して測定したところＡＳＷＹと完全に一致し、Ｘ２４、Ｘ２７、Ｘ２８リボ ザイムライブラリーの合成を続行するのに満足であると判断された。実施例１５：４つのヌクレオチドを等しく表現する２’−Ｏ−メチル−グアノシ ン、シチジン、ウリジン、およびアデノシンの最適な相対濃度の決定 混合物Ｎは４つの２’−Ｏ−Ｍｅ−ヌクレオシドホスホルアミダイト（ｍＧ＝ ２’−Ｏ−メチルグアノシン；ｍＡ＝２’−Ｏ−メチルアデノシン；ｍＣ＝２’ −Ｏ−メチルシチジン；ｍＵ＝２’−Ｏ−メチルウリジン）の等モル混合物から なるが、これを使用してモデル配列ＴＴＸＸＸＸＴＴＢを合成した（式中、Ｔは ２’−デオキシ−チミジンであり、Ｂは実施例１４に記載した２’−デオキシ変 換した非塩基性ポリスチレン固相支持体である）。標準的な脱保護（Wincottら ，上記）の後、粗製の９量体を陰イオン交換ＨＰＬＣカラム（実施例６参照）で 分析した。ＨＰＬＣ分析から、平均段階収率（ＡＳＷＹ）は９９．３％と算出さ れ（実施例１４参照）、混合物Ｎの全体のカップリング効率が２’−デオキシチ ミジンのものに匹敵することを示した。混合物Ｎ中のそれぞれの成分の相対的な 取り込みを更に評価するために、全長の生成物ＴＴＸＸＸＸＴＴＢ（粗製段階で ＞９４．３％）を更に精製し、ここに記載する塩基組成分析を行った。不完全な ものからＦＬＰを精製することが、正確な塩基組成を得るために望ましい。 塩基組成分析の概要： 標準的な消化／ＨＰＬＣ分析を実施した：０．５Ａ．ｓｕｂ．２６０ユニット のＴＴＸＸＸＸＴＴＢを含有する乾燥サンプルに、５０μｌの混合物に１ｍｇの ヌクレアーゼＰ１（５５０ユニット／ｍｇ）、２．８５ｍｌの３０ｍＭ 酢酸ナ トリウム、および０．３ｍｌの２０ｍＭ 塩化亜鉛水溶液を含有させたものを添 加した。反応混液を５０℃で一晩インキュベートした。次いで、５０μｌの混合 液に５００μｌのアルカリホスファターゼ（１ユニット／μｌ）、３１２μｌの ５００ｍＭ トリスｐＨ７．５、および２３１６μｌの水を含有させたものを反 応混液に添加し、３７℃で４時間インキュベートした。インキュベートの後、サ ンプルを遠心分離して沈殿物を除去し、上清をＨＰＬＣ（逆相Ｃ１８カラムを２ ５ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4で平衡化）で分析した。サンプルの分析は、８分間の５％ア セトニトリルのアイソクラティックグラジエント、次いで８分間にわたる５％〜 ７０％までのアセトニトリルグラジエントで行った。 種々のヌクレオシドのＨＰＬＣのピーク面積の百分率をいったん個々のヌクレ オシドの吸光係数で補正したが、これは直接そのモル比に比例する。 これらのカップリングの結果を表IVに示す。 表IVに見られるように、４つの２’−Ｏ−メチルホスホルアミダイトの等モル 混合物を使用した場合、４つのアミダイト全てが等しく取り込まれるのではなく 、２’−Ｏ−メチル−ＵおよびＧが多く、２’−Ｏ−メチル−ＡおよびＣはより 効率が低い。これを解決するために、２’−Ｏ−メチル−Ａ、Ｇ、Ｕ、およびＣ アミダイトの相対濃度を、相対的な取り込みの逆数をガイドラインとして使用し て調整した。数回の反復の後、４つのアミダイト全てをほぼ等しく取り込む最適 な 混合物を得たが、これを以下の表−Ｖに示す。相対的な表現は、最も多く取り込 まれた残基と最も少なかったものとの差異が１２％以下であり、これは等モルの 取り込みから＋／−６％の偏差に相当する。 実施例１６：Ｘ２４、Ｘ２７、およびＮ２８リボザイムライブラリー、５’−ａ SｃSａSａSａｇ ａＦＸ ＧＡＸ Ｇａｇ ｇｃｇ ａａａ ｇｃｃ Ｇａａ Ａｇｃ ｃｃｕ ｃＢ−３’の作成のための非競合カップリング法（２’−Ｃ− アリル−ウリジン、１；４’−チオ−シチジン、２；２’−メチルチオメチル− ウリジン、３；２’−メチルチオメチル−シチジン、４；２’−アミノ−ウリジ ン、５；Ｎ３−メチル−ウリジン、６；１−ｂ−Ｄ−（リボフラノシル）−ピリ ミジン−４−オン、７；１−ｂ−Ｄ−（リボフラノシル）−ピリミジン−２−オ ン、８；１−ｂ−Ｄ−（リボフラノシル）−フェニル、９；および／または６− メチル−ウリジン、１０を、混合・分割法によってＸ２４、Ｘ２７、およびＦ２ ８位に取り込む） １０個の異なるバッチの２．５μｍｏｌスケールのＧａｇ ｇｃｇ ａａａ ｇｃｃ Ｇａａ Ａｇｃ ｃｃｕ ｃＢ配列の合成を、２’−デオキシ変換した 非塩基性ポリスチレン固相支持体Ｂ上で、３９４ ＡＢＩ ＤＮＡ合成装置（Ap plied Biosystems,Foster City,CA）を使用して実施した。次いで、これらの１ ０画分を個別にホスホルアミダイト構成要素１〜１０と反応させたが、これは実 施例１１に記載した条件に従った。アミダイト１〜１０の個々の取り込みが完了 した後、それらのカップリング効率が９５％より高いことをトリチルモニタリン グで確認した。１０個の異なる配列を有する１０個の異なる画分を完全に混 合し、１０個の等しいサブセットに分割した。その後、これらの画分のそれぞれ をリボ−Ａ、リボ−Ｇアミダイト、およびアミダイト１〜１０のうちの１つと逐 次反応させた。１０個の画分を合一し、混合して再び１０個のサブセットに分割 した。その時点で、１０個の異なるポリスチレン画分（以下の配列をもつ：Ｘ ＧＡＸ Ｇａｇ ｇｃｇ ａａａ ｇｃｃ Ｇａａ Ａｇｃ ｃｃｕ ｃＢ）を 再びアミダイト１〜１０と個別に反応させた。画分は混合せず、個別に保存して １０個のプールのそれぞれが２８番目の位置に独自の残基を有するようにした。 その後、リボザイム合成を独立して終了し、１０個のランダムなリボザイムプー ルを得た。それぞれのプールは、３’−末端を変換した非塩基性残基Ｂ、それに 続く配列Ｇａｇ ｇｃｇ ａａａ ｇｃｃ Ｇａａ Ａｇｃ ｃｃｕ ｃ、それ に続く２４番目の位置にアミダイト１〜１０の混合物に対応する１個のランダム な位置Ｘ、それに続く配列ＧＡ、それに続く２７番目の位置にアミダイト１〜１ ０の混合物に対応する１個のランダムな位置Ｘ、それに続く２８番目の位置の固 定されたモノマーＦ（アミダイト１〜１０の１つ）、そして最後に５’−末端配 列ａSｃSａSａSａｇａを含有する。これは配列表記法では５’−ａSｃSａSａSａ ｇ ａＦＸ ＧＡＸ Ｇａｇ ｇｃｇ ａａａ ｇｃｃ Ｇａａ Ａｇｃ ｃｃ ｕ ｃＢ−３’と表され、Ｘはランダムな位置、Ｆは独自の固定の位置である。 それらのリボザイムライブラリーの全体の複雑さは１０3または１０００メンバ ーであり、これは１００個ずつの異なるリボザイム配列の１０個のプールに分け られる。実施例１７：ｘ2-6およびＸ30-35“結合アーム”リボザイムライブラリーの作成 のための競合カップリング法（モノマー混合法） ５’−ｘSｘSｘ ｘＦＦ ｃｕＧ Ａｕ Ｇ Ａｇｇ ｃｃｇ ｕｕａ ｇｇ ｃ ｃＧＡ ＡＡＦ ｘｘｘ ｘＢ−３’の合成について記載するが、Ｆは２’ −Ｏ−メチル−リボ−アデノシン（ｍＡ）、−グアノシン（ｍＧ）、−シチジン （ｍＣ）、−ウリジン（ｍＵ）の中から選択される規定の２’−Ｏ−メチル−リ ボヌクレオシドであり、ｘは２’−Ｏ−メチル−リボ−アデノシン、−グアノシ ン、−シチジン、−ウリジンの等量混合物である。 このリボザイムライブラリーの合成はＡＢＩ ３９４ ＤＮＡ合成装置 （Applied Biosystems,Foster City,CA）で、標準的な核酸合成試薬および合成 プロトコールを使用して行ったが、カップリング時間は延長して７．５分間（リ ボヌクレオシドホスホルアミダイト（大文字）および２’−アミノ−ウリジンホ スホルアミダイト、ｕ）、および２．５分間（２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオ シドホスホルアミダイト（小文字）および２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオシド ホスホルアミダイト混合物、ｎ）とした。 ６４バッチの０．０８６ｇ画分の３’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−デオキシ変換した 非塩基性ポリスチレン（Ｂ）固相支持体（２９μｍｏｌ／ｇで負荷し、２．５μ ｍｏｌスケールの合成に相当する）を実施例７に記載するように、ｍＡ：ｍＣ： ｍＧ：ｍＵの２７：３２：１９：２２／ｖ：ｖ：ｖ：ｖ混合物ｘを乾燥アセトニ トリルで希釈して０．１Ｍとしたものと個別に反応させた。この合成サイクルを 合計４回繰り返した。次いで６４画分を１６画分ずつの４つのサブセット（クラ ス１）に分類し、ｍＡ、ｍＧ、ｍＣ、ｍＵのいずれかと反応させてｎ６位を合成 した。これが完了すると、配列：５’−ｃｕＧ Ａｕ Ｇ Ａｇｇ ｃｃｇ ｕ ｕａ ｇｇｃ ｃＧＡ ＡＡを、クラス１を構成する６４個の画分の６位に添加 した。その後、クラス１のそれぞれのサブセットを４画分ずつの４つのサブセッ ト（クラス２）に分類し、ｍＡ、ｍＧ、ｍＣ、ｍＵのいずれかと反応させてＦ３ ０位を合成した。次いで、クラス２のそれぞれのサブセットを１画分ずつの４つ のサブセット（クラス３）に分類し、ｍＡ、ｍＧ、ｍＣ、ｍＵのいずれかと反応 させてＦ３１位を合成した。最後に、ランダムな配列５’−ｘsｘsｘｘを６４個 の画分のそれぞれに添加した。 リボザイムライブラリーから６４個のランダムなリボザイムプールが得られ、 そのそれぞれは、ｘ２〜６位およびｘ３０〜３５位に４つの２’−Ｏ−メチルヌ クレオシドの等量混合物、そしてＦ６、Ｆ３０、およびＦ３１位に、ｍＡ、ｍＣ 、ｍＧ、ｍＵから選択した規定の２’−Ｏ−メチルヌクレオシドを有する。それ らの“結合アーム”リボザイムライブラリーの全体の複雑さは、４11または４， １９４，３０４メンバーであり、これは６５，５３６個ずつの異なるリボザイム 配 列の６４個のプールに分けられる。実施例１８：１５〜１８位の“ループII”リボザイムライブラリーの作成のため の競合カップリング法（モノマー混合法） ５’ＵＣＵ ＣＣＡ ＵＣＵ ＧＡＵ ＧＡＧ ＧＣＣ ＸＸＦ ＸＧＧ Ｃ ＣＧ ＡＡＡ ＡＵＣ ＣＣＵ ３’の合成について記載するが、Ｆはアデノシ ン（Ａ）、グアノシン（Ｇ）、シチジン（Ｃ）、ウリジン（Ｕ）から選択される 規定のリボヌクレオシドであり、Ｘはアデノシン（Ａ）、グアノシン（Ｇ）、シ チジン（Ｃ）、ウリジン（Ｕ）の等量混合物である。 このリボザイムライブラリーの合成はＡＢＩ ３９４ ＤＮＡ合成装置（Appl ied Biosystems,Foster City,CA）で、標準的な核酸合成試薬および合成プロト コールを使用して行ったが、リボヌクレオシドホスホルアミダイト（Ａ、Ｇ，Ｃ 、Ｕ）およびリボヌクレオシドホスホルアミダイト混合物Ｘのカップリング時間 は延長して７．５分間とした。 ４バッチの２．５μｍｏｌスケールのＧＧ ＣＣＧ ＡＡＡ ＡＵＧ ＣＣＵ 配列の合成を、２９．８μｍｏｌ／ｇで負荷した０．０８５ｇの５’−Ｏ−ＤＭ Ｔ−２’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ−３’−スクシニル−ウリジン−ポリスチレン（Ｕ） 固相支持体サンプルで行った。Ｘ１５位を合成するために、４画分の固相支持体 を、Ａ：Ｃ：Ｇ：Ｕの３０：２６：２４：２０／ｖ：ｖ：ｖ：ｖ混合物Ｘを乾燥 アセトニトリルで希釈して０．１Ｍとしたものと個別に反応させたが、これはＤ ＮＡ合成過程のマニュアル（Perkin-Elmer-Applied Biosystem Division発行） に記載されるＤＮＡホスホルアミダイト混合塩基カップリングの最適条件に従っ た。（DNA Synthesis Course Manual：合成オリゴヌクレオチドの評価と単離、 完全ガイド（Evaluating and Isolating synthetic oligonucleotides,the comp lete guide）,p.2-4,Alex Andrus,1995年８月）。次いで４画分の固相支持体を 、４つのリボヌクレオシドホスホルアミダイト（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕ）のいずれかと 個別に反応させてＦ１６位を生成した。その後Ｘ１７およびＸ１８位を４画分の 固相支持体のＦ１６（Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＵのいずれか）に付加したが、これは Ｘ１ ５位に使用したのと同一の方法を２回繰り返して行った。 その後、配列５’−ＵＣＵ ＣＣＡ ＵＣＵ ＧＡＵ ＧＡＧ ＧＣＣを、リ ボザイムライブラリーの４つのサブセットのそれぞれのＸ１８位に添加してリボ ザイムライブラリーの合成を終了した。リボザイムライブラリーから４つのラン ダムなリボザイムプールが得られ、それぞれはＸ１５、Ｘ１７、およびＸ１８位 に４つのリボヌクレオシド（Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵ）の等量混合物を、そしてＦ １６位にＡ、Ｃ、Ｇ、またはＵから選択された別個のリボヌクレオシドを有する 。それらのループIIリボザイムライブラリーの全体の複雑さは２５６メンバーで あり、これは６４個の異なるリボザイム配列の４つのプールに分けられる。実施例１９：アーム−コンビナトリアルライブラリーのＢｃｌ−２、Ｋ−ｒａｓ 、およびウロキナーゼプラスミノーゲン活性化物質（ＵＰＡ）についてのスクリ ーニング ｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写による基質の合成：Ｂｃｌ−２およびＫｒａｓのラ ンオフ転写物を、直線化したプラスミドを使用して調製した（それぞれ９７５お よび７９６ヌクレオチド）。ＵＰＡの転写物を、Ｔ７プロモーターを含有するＤ ＮＡフラグメントからのＰＣＲで生成した（４００ヌクレオチド）。転写はＴ７ Megascript転写キット（Ambion社）を使用し、以下の条件で行った：５０μｌの 反応容量中に、７．５ｍＭずつのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、およびＧＴＰ、２ｍ Ｍグアノシン、５μｌの１０ｘＴ７反応バッファー、５μｌのＴ７酵素混合物、 そして０．５μｇの直線化したプラスミドまたはＰＣＲしたＤＮＡテンプレート を含有する。混合液を３７℃で４時間（＜５００塩基の転写には６時間）インキ ュベートした。グアノシンを転写反応液に添加することにより、最終的な転写物 の５’−末端を、事前にホスファターゼ処理をすることなく効率的に標識できる ようにした。次いで、５０ｍＭ トリス（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ ＫＣｌ、 および２ｍＭ ＭｇＣｌ2を含有するバッファーで転写反応液の容量を２００μ ｌに増量し、同様のバッファーで平衡化したＢｉｏ−Ｇｅｌ Ｐ−６０(BioRad) でスピンカラム精製を行った。スピンカラムのフロースルーを、以下のように５ ’ −末端の標識反応に直接使用した（最終容量１００μｌ）：８２μｌのＰ−６０ スピンカラム精製をした転写物、１０μｌの１０ｘポリヌクレオチドキナーゼバ ッファー、４μｌの１０Ｕ／μｌ ポリヌクレオチドキナーゼ(Boehringer/Mann heim)、および４μｌの１５０μＣｉ／μｌのガンマ−３２Ｐ−ＡＴＰ(ＮＥＮ) を合わせて３７℃で１時間インキュベートした。５０ｍＭ トリス（ｐＨ７．５ ）、１００ｍＭ ＫＣｌ、および２ｍＭ ＭｇＣｌ2を含有するバッファーで反 応液の容量を２００μｌに増量し、次いでＢｉｏ−Ｇｅｌ Ｐ−６０を充填した スピンカラムで上記のようにサンプルを精製した。５’−末端を標識した転写物 のおおよその比活性をＢｉｏＳｃａｎで測定し、−２０℃で凍結保存した。 リボザイムプールの合成： ｉｎ ｖｉｔｒｏでのリボザイム転写物開裂反応：開裂反応は以下のように実施 した：５’−末端を標識した転写物（最終〜２−４ｘ１０4ｄｐｍ／μｌ）を、 ５０ｍＭ トリス（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ2、 および０．０１％ ＳＤＳ中の１０μＭのリボザイムプールと共に室温（〜２２ ℃）で２４〜４８時間インキュベートした。等量のゲル負荷色素（９５％ホルム アルデヒド、０．０１Ｍ ＥＤＴＡ、０．０３７５％ ブロモフェノールブルー 、および０．０３７５％ キシレンシアノール）を添加して反応を停止させ、サ ンプルを９５℃に加熱した。反応液（１〜２ｘ１０5ｄｐｍ／レーン）を、７Ｍ 尿素および１ｘ ＴＢＥを含有する５％変性ポリアクリルアミドゲルで展開し た。ゲルを乾燥し、PhosphorImagerシステム（Molecular Dynamics）を使用して イメージングした。Ambion社のRNA Century Marker Plus RNA標準体を上記のよ うなT7 Megascript反応で３μｌの１０ｍＣｉ／ｍｌ アルファ−32Ｐ−ＡＴＰ （BioRad）および０．５μgのCentury RNAテンプレートを使用して標識し、続い てBio-Gel P-6（BioRad）でスピンカラム精製し、これをゲル上の対照サイズと して使用した。開裂産物のサイズをＲＮＡ標準を使用して測定し、おおよその開 裂部位を得た（図中のest.Size）。それぞれのリボザイムプールは結合アーム中 に３つの固定位置を含有するので、そのプールによって開裂される可能性のある リボザイム部位を全て同定することが可能である。従って、開裂産 物の推定サイズを可能性のある部位と比較して正確な開裂部位を同定する。この プロトコールは３つの異なる転写物で完了していた：Ｂｃｌ−２（図−２５）、 ｋｒａｓ（図−２６）、およびＵＰＡ（図−２７）。データを図中に要約した。 可能性のあるハンマーヘッドリボザイムの開裂部位の全てを短い垂線でグラフ中 に示す。同定された実際の部位をグラフ中に示す。バーのサイズは開裂反応から の開裂産物の強度を表す。それぞれの部位、それぞれの部位の実際の配列、転写 物中の開裂位置（既知の配列に基づく）、および開裂産物の推定サイズ（ゲル分 析に基づく）の同定に使用したコンビナトリアルプールの一覧を示す。実施例２０：最適化したリボザイムを使用するＢｃｌ−２ ｍＲＮＡの低減 ｂｃｌ−２転写物中の同一部位を標的とする２つのリボザイム（Ｓｅｑ．ＩＤ ＃９、図−２５）を合成したが、２つのリボザイムは２つの異なる化学（Ｕ４／ Ｕ７アミノおよびＵ４ｃ−アリル）で安定化した。リボザイム（２００ｎＭ）を 、リポフェクトアミン（７．２ｍＭ）を使用してＭＣＦ−７細胞（５０％の集密 度）に３時間施与した。細胞ＲＮＡを施与の２４時間後に回収し、ＲＮアーゼプ ロテクションアッセイ（ＲＰＡ）で分析し、３点のサンプルについてＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡで標準化した。両リボザイムともｂｃｌ−２ ｍＲＮＡを減少させた （図−２８参照）。無関係なｍＲＮＡを標的とするリボザイム（ｃ−ｍｙｂ）は ｂｃｌ−２ ｍＲＮＡとＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡの割合に影響を与えなかった。全 てのｂｃｌ−２ ＲＮＡの低減は、未処理のサンプルおよび無関係なリボザイム で処理したサンプルに関して、統計学的に有意であった。実施例２１：プリンヌクレオシド三リン酸：２’−Ｏ−メチル−グアノシン−５ ’−三リン酸の合成 ２’−Ｏ−メチルグアノシンヌクレオシド（０．２５グラム、０．８４ｍｍｏ ｌ）を、１００℃で５分間加熱して、リン酸トリエチル（５．０ｍｌ）に溶解し た。生じた無色透明の溶液を、氷浴を用いてアルゴン雰囲気下で０℃まで冷却し た。次いで、オキシ塩化リン（１．８当量、０．１４１ｍｌ）を反応混液に激し く撹拌しながら添加した。反応をＨＰＬＣで過塩素酸ナトリウムグラジエントを 使用してモニタリングした。０℃で５時間後、トリブチルアミン（０．６５ｍｌ ）を添加した後、無水アセトニトリル（１０．０ｍｌ）を添加し、５分後（０℃ に平衡化）、ピロリン酸トリブチルアンモニウム（４．０当量、１．５３ｇ）を 添加した。０℃で１５分後（上記の条件でＨＰＬＣ分析したところ１０分で一リ ン酸は消費されていた）、反応混液を２０ｍｌの２Ｍ ＴＥＡＢでクエンチング し、次いで室温で一晩撹拌し、混合液を真空でメタノールと共エバポレートし( ４ｘ)、その後５０ｍｌの０．０５Ｍ ＴＥＡＢで希釈した。ＤＥＡＥセファデ ックスを使用して０．０５〜０．６ＭのＴＥＡＢグラジエントで精製し、純粋な 三リン酸を得た（０．５２ｇ、収率６６．０％）（０．３Ｍ ＴＥＡＢ付近で溶 出）；純度はＨＰＬＣおよびＮＭＲ分析で確認した。実施例２２：ピリミジンヌクレオシド三リン酸：２’−Ｏ−メチルチオメチル− ウリジン−５’−三リン酸の合成 ２’−Ｏ−メチルチオメチルウリジンヌクレオシド（０．２７グラム、１．０ ｍｍｏｌ）をリン酸トリエチル（５．０ｍｌ）に溶解した。生じた無色透明の溶 液を、氷浴を用いてアルゴン雰囲気下で０℃まで冷却した。次いで、オキシ塩化 リン（２．０当量、０．１９０ｍｌ）を反応混液に激しく撹拌しながら添加した 。ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ、０．２当量、２５ｍｇ）を添加し、溶液 を室温まで加温し、反応をＨＰＬＣで過塩素酸ナトリウムグラジエントを使用し てモニタリングした。２０℃で５時間後、トリブチルアミン（１．０ｍｌ）を添 加した後、無水アセトニトリル（１０．０ｍｌ）を添加し、５分後、ピロリン酸 トリブチルアンモニウム（４．０当量、１．８ｇ）を添加した。２０℃で１５分 後（上記の条件でＨＰＬＣ分析したところ１０分で一リン酸は消費されていた） 、反応混液を２０ｍｌの２Ｍ ＴＥＡＢでクエンチングし、次いで室温で一晩撹 拌した。混合液を真空でメタノールと共エバポレートし（４ｘ）、その後５０ｍ ｌの０．０５Ｍ ＴＥＡＢで希釈した。ＤＥＡＥ高速セファロースを使用して０ ．０５〜１．０ＭのＴＥＡＢグラジエントで精製し、純粋な三リン酸を得、ＨＰ ＬＣおよびＮＭＲ分析で確認した（０．４０ｇ、収率４４％）（０．３Ｍ ＴＥ ＡＢ付近で溶出）。実施例２３：ウリジン５’−三リン酸合成におけるＤＭＡＰの利用 反応は、２０ｍｇ画分のヌクレオシドを１ｍｌのリン酸トリエチルおよび１９ μｌのオキシ塩化リンに溶解したもので行った。反応を４０分間隔で自動的にＨ ＰＬＣでモニタリングし、１８時間までの生成物収量曲線を得た。逆相カラムと 酢酸アンモニウム／酢酸ナトリウムバッファーシステム（それぞれ５０ｍＭ＆１ ００ｍＭ、ｐＨ４．２）を使用して５’、３’、２’一リン酸（一リン酸はこの 順序で溶出する）を５’−三リン酸および開始ヌクレオシドから分離した。デー タを表VIに示す。これらの条件により収率は２倍になり、最大収率を得るための 反応時間は１０倍向上した（９０％の収率を得るために１２００分間から１２０ 分間に短縮）。５’−一リン酸化の選択性を全ての反応で観察した。その後の三 リン酸化はほぼ定量的な収率であった。バクテリオファージＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ反応に使用した物質 バッファー１：試薬を混合してバッファー１の１０Ｘストック溶液を調製する（ ４００ｍＭ トリス−Ｃｌ（ｐＨ８．１）、２００ｍＭ ＭｇＣｌ2、１００ｍ Ｍ ＤＴＴ、５０ｍＭ スペルミジン、および０．１％ トリトンＸ−１００。 ポリメラーゼ反応の開始に先立って、メタノール、ＬｉＣｌを添加してバッファ ーを希釈し、最終的な反応液を以下からなる条件１とする：４０ｍＭ トリス（ ｐＨ８．１）、２０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ ＤＴＴ、５ｍＭ スペルミジ ン、０．０１％ トリトンＸ−１００、１０％ メタノール、および１ｍＭ Ｌ ｉＣｌ。 バッファー２：試薬を混合してバッファー２の１０Ｘストック溶液を調製する( ４００ｍＭ トリス−Ｃｌ（ｐＨ８．１）、２００ｍＭ ＭｇＣｌ2、１００ｍ Ｍ ＤＴＴ、５０ｍＭ スペルミジン、および０．１％ トリトンＸ−１００。 ポリメラーゼ反応の開始に先立って、ＰＥＧ、ＬｉＣｌを添加してバッファーを 希釈し、最終的な反応液を以下からなるバッファー２とする：４０ｍＭ トリス （ｐＨ８．１）、２０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ ＤＴＴ、５ｍＭ スペルミ ジン、０．０１％ トリトンＸ−１００、４％ ＰＥＧ、および１ｍＭ ＬｉＣ ｌ。 バッファー３：試薬を混合してバッファー３の１０Ｘストック溶液を調製する( ４００ｍＭ トリス−Ｃｌ（ｐＨ８．０）、１２０ｍＭ ＭｇＣｌ2、５０ｍＭ Ｄ ＴＴ、１０ｍＭ スペルミジン、および０．０２％ トリトンＸ−１００。ポリ メラーゼ反応の開始に先立って、ＰＥＧを添加してバッファーを希釈し、最終的 な反応液を以下からなるバッファー３とする：４０ｍＭ トリス（ｐＨ８．０） 、１２ｍＭ ＭｇＣｌ2、５ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ スペルミジン、０．００２ ％ トリトンＸ−１００、および４％ ＰＥＧ。 バッファー４：試薬を混合してバッファー４の１０Ｘストック溶液を調製する( ４００ｍＭ トリス−Ｃｌ（ｐＨ８．０）、１２０ｍＭ ＭｇＣｌ2、５０ｍＭ ＤＴＴ、１０ｍＭ スペルミジン、および０．０２％ トリトンＸ−１００。 ポリメラーゼ反応の開始に先立って、ＰＥＧ、メタノールを添加してバッファー を希釈し、最終的な反応液を以下からなるバッファー４とする：４０ｍＭ トリ ス(ｐＨ８．０)、１２ｍＭ ＭｇＣｌ2、５ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ スペルミジ ン、０．００２％ トリトンＸ−１００、１０％ メタノール、および４％ Ｐ ＥＧ。 バッファー５：試薬を混合してバッファー５の１０Ｘストック溶液を調製する( ４００ｍＭ トリス−Ｃｌ（ｐＨ８．０）、１２０ｍＭ ＭｇＣｌ2、５０ｍＭ ＤＴＴ、１０ｍＭ スペルミジン、および０．０２％ トリトンＸ−１００。 ポリメラーゼ反応の開始に先立って、ＰＥＧ、ＬｉＣｌを添加してバッファーを 希釈し、最終的な反応液を以下からなるバッファー５とする：４０ｍＭ トリス （ｐＨ８．０）、１２ｍＭ ＭｇＣｌ2、５ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ スペルミジ ン、０．００２％ トリトンＸ−１００、１ｍＭ ＬｉＣｌ、および４％ ＰＥ Ｇ。 バッファー６：試薬を混合してバッファー６の１０Ｘストック溶液を調製する( ４００ｍＭ トリス−Ｃｌ（ｐＨ８．０）、１２０ｍＭ ＭｇＣｌ2、５０ｍＭ ＤＴＴ、１０ｍＭ スペルミジン、および０．０２％ トリトンＸ−１００。 ポリメラーゼ反応の開始に先立って、ＰＥＧ、メタノールを添加してバッファー を希釈し、最終的な反応液を以下からなるバッファー６とする：４０ｍＭ トリ ス(ｐＨ８．０)、１２ｍＭ ＭｇＣｌ2、５ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ スペルミジ ン、０．００２％ トリトンＸ−１００、１０％ メタノール、および４％ Ｐ ＥＧ。実施例２４：変異体Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いる修飾ヌクレオシド三リン 酸のスクリーニング 修飾ヌクレオチド三リン酸それぞれを別個に、緩衝液１〜６中において２種類 の温度（２５および３７℃）で試験した。２５℃で試験した緩衝液１〜６を条件 １〜６、３７℃で試験した緩衝液１〜６を条件７〜１２と表示した（表ＶＩＩ） 。各条件でＹ６３９Ｆ変異体Ｔ７ポリメラーゼ（ＳｏｕｓａおよびＰａｄｉｌｌ ａ、前掲）（０．３〜２ｍｇ／２０ｍｌ反応液）、ＮＴＰ類（各２ｍＭ）、ＤＮ Ａ鋳型（１０ｐｍｏｌ）、無機ピロホスファターゼ（５Ｕ／ｍｌ）およびα−32 Ｐ ＮＴＰ（０．８ｍＣｉ／ｐｍｏｌ鋳型）を混和し、表示した温度に１〜２時 間加熱した。用いた放射性標識ＮＴＰは、試験した修飾三リン酸エステルとは異 なっていた。試料をポリアクリルアミドゲル電気泳動により解析した。ホスファ ーイマジャー（モレキュラー・ダイナミックス、カリフォルニア州サニーベール ）を用いて、全長転写体の量を測定し、全ＲＮＡ対照反応と比較した。データを 表ＶＩＩＩに示す。各反応の結果を、全リボヌクレオチド三リン酸（ｒＮＴＰ） 対照と比較した％として表す。対照は、変異体Ｔ７ポリメラーゼにつき、市販の ポリメラーゼ緩衝液（ベーリンガー・マンハイム、インディアナ州インディアナ ポリス）を用いて試験された。実施例２５：野生型Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いる修飾ＮＴＰの取込み バクテリオファージＴ７ ＲＮＡポリメラーゼは、ベーリンガー・マンハイム から０．４Ｕ／μＬ濃度のものを購入した。この酵素と共に供給された市販の緩 衝液、および０．２μＣｉのα−32Ｐ ＮＴＰを、５０μＬの反応液中で、各２ ｍＭのヌクレオチド三リン酸との反応に用いた。鋳型は前記スクリーニングに用 いた二本鎖ＰＣＲフラグメントであった。反応を３７℃で１時間行った。１０μ Ｌの試料を７．５％分析用ＰＡＧＥ上で試験し、各バンドをホスファーイマジャ ーで定量した。結果を“全リボ”対照（非修飾ヌクレオシド三リン酸）と比較し て計算し、結果を表ＩＸに示す。実施例２６：オリゴヌクレオチド中への複数の修飾ヌクレオシド三リン酸の取込 み 修飾ヌクレオシド三リン酸の組合わせを実施例９に記載した転写プロトコール により試験して、２種類以上のこれらの三リン酸エステルの取込み速度を測定し た。２’−デオキシ−２’−（Ｌ−ヒスチジン）アミノウリジン（２’−ｈｉｓ −ＮＨ2−ＵＴＰ）の取込みを、非修飾シチジンヌクレオシド三リン酸、ｒＡＴ ＰおよびｒＧＴＰと共に、反応条件番号９で試験した。このデータを全ｒＮＴＰ 対照と比較した修飾ＮＴＰ類の取込み率％として提示し、表Ｘａに示す。 ２種類の修飾シチジン（２’−ＮＨ2−ＣＴＰまたは２’ｄＣＴＰ）は、２’ −ｈｉｓ−ＮＨ2−ＵＴＰと共に、等しい効率で取込まれた。次いで２’−ｈｉ ｓ−ＮＨ2−ＵＴＰおよび２’−ＮＨ2−ＣＴＰを、種々の非修飾および修飾アデ ノシン三リン酸と共に、同じ緩衝液中で試験した（表Ｘｂ）。２’−ｈｉｓ−Ｎ Ｈ2−ＵＴＰおよび２’−ＮＨ2−ＣＴＰ両方との取込みに最良の修飾アデノシン 三リン酸は、２’−ＮＨ2−ＤＡＰＴＰであった。実施例２７：修飾ヌクレオチド三リン酸取込みのための反応条件の最適化 ２’−ｈｉｓ−ＮＨ2−ＵＴＰ、２’−ＮＨ2−ＣＴＰ、２’−ＮＨ2−ＤＡＰ およびｒＧＴＰの組合わせを、実施例１４に記載した取込みプロトコールを用い て、幾つかの反応条件（表ＸＩ）で試験した。結果は、これらの修飾ヌクレオシ ド三リン酸の取込みが試験した緩衝液条件のうちメタノールおよびＬｉＣｌ両方 の存在下で起きることを示す。実施例２８：９６ウエルプレート内でのリボザイムの脱保護 本明細書の記載に従って、９６ウェルプレートのウェル内においてポリスチレ ン固体支持体上で、リボザイム配列（２００ｎｍｏｌ）を合成した。無水メチル アミン（３０８μＬ）、トリエチルアミン（９２μＬ）およびジメチルスルホキ シド（ＤＭＳＯ）（４００μＬ）の１０：３：１３混合物（８００μＬ）を調製 し、その半分（４００μＬ）をウェルに添加し、室温で４５分間インキュベート した。反応後、溶液を残り４００μＬと交換し、前記と同様にインキュベートし た。反応終了時に固体支持体を濾去し、全８００μＬのＭＡ／ＴＥＡ／ＤＭＳＯ 溶液を合わせ、１００μＬのＴＥＡ．３ＨＦを添加した。次いで反応物を６５℃ に１５分間加熱し、次いで室温に冷却した。次いで溶液をＮＨ4 +ＨＣＯ3 -水溶液 （１ｍＬ）で反応停止した（図３０参照）。反応混合物のＨＰＬＣクロマトグラ フィーにより３２ Ｏ．Ｄ．ｕ260nmが得られ、そのうち４６％は全長リボザイ ムであった。実施例２９：カラムによるリボザイムの脱保護 本明細書に記載したカラム方式でリボザイムを合成した。保護されたオリゴリ ボヌクレオチドまたは修飾されたオリゴリボヌクレオチド（２００ｎｍｏｌ）を 含むポリスチレン固体支持体を、スクリューキャップ付きガラスバイアルに移し た。無水メチルアミン（３０８μＬ）、トリエチルアミン（９２μＬ）およびジ メチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（４００μＬ）の１０：３：１３混合物（８０ ０μＬ）を添加し、次いでガラスバイアルを渦撹拌した。１．５時間反応させた 後、固体支持体を濾去した。１００μＬのＴＥＡ．３ＨＦを室温でバイアルに添 加し、反応物を混合して溶液をゲル化させた。次いで反応物を６５℃に１５分間 加熱した後、室温に冷却した。次いで溶液を１．５Ｍ ＮＨ4 +ＨＣＯ3 -水溶液( １ｍＬ)で反応停止した。反応混合物のＨＰＬＣクロマトグラフィーにより３２ Ｏ．Ｄ．ｕ260nmが得られ、そのうち４６％は全長リボザイムであった。実施例３０：無水エタノール性メチルアミンを用いたカラムによるリボザイムの 脱保護 本明細書に記載したカラム方式でリボザイムを合成した。保護されたオリゴリ ボヌクレオチドまたは修飾されたオリゴリボヌクレオチド（２００ｎｍｏｌ）を 含むポリスチレン固体支持体を、スクリューキャップ付きガラスバイアルに移し た。無水エタノール性メチルアミン（４００μＬ）およびジメチルスルホキシド （ＤＭＳＯ）（４００μＬ）の１：１混合物を添加し、次いでガラスバイアルを 渦撹拌した。１．５時間反応させた後、固体支持体を濾去した。１００μＬのＴ ＥＡ．３ＨＦを室温でバイアルに添加し、反応物を混合してゲル化させた。次い で反応物を６５℃に１５分間加熱し、次いで室温に冷却した。次いで溶液を１． ５Ｍ ＮＨ4 +ＨＣＯ3 -水溶液（１ｍＬ）で反応停止した。反応混合物のＨＰＬＣ クロマトグラフィーにより３２ Ｏ．Ｄ．ｕ260nmが得られ、そのうち４６％は 全長リボザイムであった。実施例３１：リボザイムの大規模ワンポット脱保護 本明細書に記載したカラム方式により、０．５ｍｍｏｌ規模でリボザイムを合 成した。保護されたオリゴリボヌクレオチドまたは修飾されたオリゴリボヌクレ オテド（５００μｍｏｌ）を含むポリスチレン固体支持体（２４ｇ）を、１Ｌの スクリューキャップ付きショット（Ｓｃｈｏｔｔ）びんに移した。無水エタノー ル性メチルアミン（１５０ｍＬ）およびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（２ ００ｍＬ）の１：１．３混合物（２００ｍＬ）を添加し、次いでガラスびんを１ ．５時間渦撹拌した（２００ｒｐｍ）。次いで反応混合物を−７０℃で３０分間 凍結した。次いで５０ｍＬの生ＴＥＡ．３ＨＦを室温で反応混合物に添加し、反 応物を振とうオーブン（２００ｒｐｍ）に入れ、６５℃に６０分間加熱した後、 −７０℃で３０分間凍結した。次いで溶液を１．５Ｍ ＮＨ4 +ＨＣＯ3 -水溶液（ ２００ｍＬ）で反応停止した。反応混合物を焼結ガラス漏斗（多孔度１０〜２０ μｍ）で濾過することによりポリスチレン固体支持体から分離した。反応混合物 のＵ．Ｖ．分光測光定量およびＨＰＬＣクロマトグラフィーにより１６０，００ ０Ｏ．Ｄ．ｕ260nmが得られ、そのうち４６．４％は全長リボザイムであった。 １．５時間反応させた後、固体支持体を濾去した。実施例３２：原発腫瘍増殖および転移のマウスルイス肺−ＨＭ癌モデルにおける ２つのＶＥＧＦ受容体サブタイプ（ｆｌｔ−１およびｆｌｋ−１）をコードする ｍＲＮＡに指向性のリボザイムの抗腫瘍および抗転移効果 ルイス肺癌（ＬＬＣ）モデルは、抗腫瘍薬効果のスクリーニングに慣用される 転移性癌の同遺伝子型マウスモデルである。Ｆｏｌｋｍａｎ（１９９５，前掲） によれば、このモデルでの原発腫瘍の増殖および転移は、ＶＥＧＦ誘発性血管形 成に依存する。ＬＬＣモデルの２変異体がある。低転移性形態は、腫瘍を通常は 皮下に移植することにより微小転移巣を肺へ送り込んだ場合、その増殖が原発腫 瘍の存在により抑制されるものである。高転移性（ＨＭ）形態は、転移巣の増殖 が原発腫瘍の存在により抑制されないという点で低転移性変異体と異なる。した がってＨＭ形態は、原発腫瘍を切除せずに同じマウスで原発腫瘍増殖と転移の両 方に対する薬理効果を測定できるモデルである。 本発明者らは、ＶＥＧＦ受容体（ｆｌｔ−１およびｆｌｋ−１）ｍＲＮＡ指向 性リボザイムの抗−腫瘍／転移スクリーニングのために、ルイス肺癌モデルの高 転移性変異体を選択した。これらのリボザイムは、培養ＭＶＥＣ‘ｓにおけるＶ ＥＧＦ結合およびＶＥＧＦ刺激による増殖、ならびにラット角膜のＶＥＧＦ誘発 血管新生を低下させることが示されている（Ｃｕｓｈｍａｎら，１９９６，血管 新生による眼疾患のための血管形成阻害薬および他の新規療法，ＩＢＣ Ｃｏｎ ｆｅｒｅｎｃｅ Ａｂｓｔｒａｃｔ）。本発明者らは、薬物動態からみて、リボ ザイムが連続静注（アルゼット（Ａｌｚｅｔ）浸透圧ポンプによる）後に皮下移 植腫瘍を含めた大部分の組織内に有意濃度で全身分布することを見いだした。こ の試験は、ＬＬＣ−ＨＭモデルに連続静注したｆｌｔ−１およびｆｌｋ−１リボ ザイムの抗腫瘍／抗転移効果を調べるものである。方法 リボザイム この試験に用いたリボザイムは、４塩基対ステムＩＩ、５’−末端の４つのホ スホロチオエート結合、４位の２’−Ｃ−アリル置換（図１参照）、および３’ −末端の逆ａｂａｓｉｃヌクレオチド置換を含む、ハンマーヘッドリボザイムで あった。触媒活性および不活性リボザイムは、それぞれｆｌｔ−１およびｆｌｋ −１メッセージ指向性のＲＰＩ．４６１０／４６１１（活性／不活性）およびＲ ＰＩ．４７３３／４７３４であった。リボザイム溶液を生理食塩液（米国薬局方 ）中に調製した。 被験溶液（リボザイムまたは生理食塩液対照）をアルゼット（登録商標）浸透 圧ミニポンプ（＃１００２型―全容量２００μｌ以上）に分注した。これは間質 水に暴露されると３７℃で０．５μｌ／時を分配する。ポンプに生理食塩液(米 国薬局方)、またはリボザイム１６７．０、５０．０、１６．７、５．０または １.７ｍｇ／ｍｌ溶液を充填した。浸透圧ミニポンプを動物に埋め込む前に３７ ℃の無菌水に少なくとも４時間入れて、ポンプ作用を活性化した。 腫瘍の接種 この試験において動物の処置はすべて、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ：実験動物の飼育と使用に関する指針（１９９６）、ＵＳＤＡ 規則、およびＲＰＩ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅの方針と方法に従って行われた。体重２０ 〜２５ｇのＣ５７ＢＬ／６Ｊ雌マウス合計２１０匹をこの試験に用いた。すべて の動物を１２時間点灯／１２時間消灯サイクル下に収容し、飼料と水を任意に摂 取 させた。 高転移性変異体ルイス肺癌（ＬＬＣ−ＨＭ）腫瘍をインビボでＬＬＣ−ＨＭ細 胞系から伝播させた。これらの腫瘍は培養中に低転移性表現型に復帰する可能性 があるので、インビボで伝播させる必要がある。ＬＬＣ−ＨＭ細胞をまずＤＭＥ Ｍ＋１０％ＦＣＳ＋１％ＧＰＳ中で培養した。インビボ伝播のために、５×１０6 個の細胞をマウスに皮下注射した。腫瘍を２５日間増殖させた後、動物をＣＯ2 吸入により安楽死させ、肺の肉眼的転移巣を計数した。最大数（約１５〜２０） の肉眼的転移巣をもつ動物を、腫瘍ブライの調製および伝播のために選択した。 伝播のために選択した動物で腫瘍が約１５００ｍｍ3の体積に達したとき、動物 をＣＯ2吸入により安楽死させ、腫瘍を切除した。腫瘍を１００μｍ細孔サイズ の無菌ナイロンメッシュでふるい分けた。ＬＬＣ−ＨＭ細胞を生存細胞５５×１ ０6個／ｍｌ（血球計数器）となるように生理食塩液に再懸濁した。リボザイム 投与の３日前に、すべての動物の右側腹部に５×１０6個の細胞（１００μｌ容 量で）を皮下注射した。 リボザイムまたは生理食塩液の投与 １００、３０、１０、３または１ｍｇ／ｍｌ／日を１２ｍｌ容量で投与するた めに、各リボザイム溶液を調製した。腫瘍接種の３日後、投与群または生理食塩 液群当たり合計１０匹の動物の左側腹部に、予め各被験溶液を充填した浸透圧ミ ニポンプを外科的に埋め込んだ。ポンプを頚静脈留置カテーテルに接続した。＃ １００２型アルゼット浸透圧ミニポンプの説明書には、それらが水溶液を正確に ０．５μｌ／時を１４日間送達すると示されている。表ＩＩＩに実験群をまとめ て示す。 腫瘍の体積および転移指数の定量 腫瘍接種後、最初の４日間と最後の２４日間、すべての原発腫瘍の長さと幅を １日おきにミクロカリパスで測定した。楕円体積の標準方程式（ＬＷ2）／２を 用いて腫瘍の体積を計算した。腫瘍の体積は各動物につき三重に計算された。各 動物につき平均腫瘍体積を計算した。各動物の平均腫瘍体積から、群平均値およ び群平均値の標準偏差を計算した。 腫瘍接種後、すべての動物を２５日目にＣＯ2吸入により安楽死させ、肺およ び原発腫瘍を採取した。解剖顕微鏡（倍率２．５倍）下で肺の肉眼的転移巣を計 数した。肺および原発腫瘍の重量も化学天秤で秤量した。肺の重量を全肺転移負 荷の指標として用いた。 統計分析 すべての処置群につき、１８日目（処置の最終日）の群腫瘍体積平均値、なら びに原発腫瘍および肺重量の平均値、ならびに肺転移巣の数を正常度につき評価 し、分散分析した。群平均値間の統計差をターキィークレイマーポスト−ホック 試験（Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ ｐｏｓｔ−ｈｏｃ ｔｅｓｔ）により評価し た（α＝０．０５）。対照群（食塩液対照）との比較をダンネット試験により行 った（α＝０．０５）。結果 Ｆｌｔ−１ 数種の用量の活性および不活性ｆｌｔ−１リボザイム（それぞれＲＰＩ．４６ １０／４６１１）が原発ＬＬＣ−ＨＭ腫瘍の増殖に与える影響を、図３９（Ａ〜 Ｅ）にまとめる。最低用量（図３９Ａ）では、活性体および不活性体の両方とも 原発腫瘍増殖の抑制は全期間を通して対照食塩液と比較して同程度であった。し かし、用量の増加に伴って、活性リボザイムは不活性リボザイムより著しく原発 腫瘍の増殖を抑制し、３０ｍｇ／ｋｇ／日で最大差が観察された（図３９Ｄ）。 食塩液と比較した最大低下の大きさは活性リボザイムＲＰＩ．４６１０ ３０ｍ ｇ／ｋｇ／日で約４倍であった。処置を７日早く終えたにもかかわらず、観察さ れたこの４倍低下は２４日目にもみられたことに注目すべきである。 増殖曲線データを指数回帰分析した。曲線適合度は、腫瘍増殖データが高い相 関係数（Ｒ＞０．９５）で指数曲線に適合することを示す。したがって、腫瘍の 増殖に対する長期持続毒性はないと思われる。計算した指数曲線の勾配はどの点 でも腫瘍の増殖速度を示すので、処置間の増殖速度を比較できるはずである。曲 線適合度は腫瘍の増殖が同一時点から開始したと前提する（すべての腫瘍が同一 腫瘍細胞接種濃度から出発するので、この前提は適正である）のではないから、 指数曲線の勾配を正確に計算することはできない。曲線適合度アルゴリズムをｔ ＝０での腫瘍サイズに外挿し、次いでこれを用いて勾配を計算するからである。 この分析においてｔ＝０での食塩液の腫瘍サイズは他の処置群よりはるかに大き いので、食塩液との比較は必ずしも正確でない。曲線適合度アルゴリズムを同一 腫瘍サイズに限定すると、活性リボザイムについては用量依存性の腫瘍増殖速度 低下がみられる。しかし場合によっては曲線適合度はより低い相関係数を示す。 リボザイム処置が統計学的に原発腫瘍増殖を抑制するか否かを調べるために、 処置直後（１８日目）に各用量につき原発腫瘍体積の測定値を比較した(図４０) 。活性リボザイムＲＰＩ．４６１０は、統計学的に有意（ｐ＜０．０５）かつ用 量依存性の原発腫瘍体積低下を生じた。不活性リボザイム（ＲＰＩ．４６１１） は最低および最高用量で、ある程度の原発腫瘍体積低下を示したが、用量依存性 の低下はみられなかった。不活性リボザイムは、３〜３０ｍｇ／ｋｇ／日の用量 では有意の原発腫瘍体積低下を示さなかった。１０および３０ｍｇ／ｋｇ／日の 用量では、活性リボザイムと不活性リボザイムの間に有意差（ｐ＜０．０５）が あった（ターキィ−クレイマー試験）。 本発明者らは、活性リボザイムＲＰＩ．４６１０が接種後２５日目に、試験し たすべての用量（１〜１００ｍｇ／ｋｇ／日）で原発腫瘍の質量を有意に低下さ せることも観察した。 図４１ＡおよびＢは、活性リボザイムが肺転移巣数と肺質量の両方を用量依存 性様式で低下させたことを示す。活性ｆｌｔ−１リボザイムは、３０および１０ ０ｍｇ／ｋｇ／日の用量で食塩液と比較して肺転移巣数の有意の減少（ダネット によりｐ＜０．０５）を示した。これらの用量では活性リボザイムと不活性リボ ザイムの間にも有意差があった（スチューデントのｔ検定によりｐ＜０．０５） 。ＲＰＩ．４６１０は、最高用量（１００ｍｇ／ｋｇ／日）で肺重量をほぼ正常 なレベルにまで減少させた。不活性リボザイムには、肺転移巣数または肺重量の いずれに対しても認めうるほどの用量依存性効果がみられなかった。食塩液と活 性リボザイムの間では、肺質量（転移負荷の指標）に有意の低下がみられた（ｐ ＜０．０５、スチューデントのｔ検定）。すべての群内での分散を考慮したさら に厳格な統計学的検査法（ダネット法またはターキィ−クレイマー法）を用いて 有意性が得られなかったのは、特に不活性リボザイムにおいて変動性が高いため であった。しかし５種類の用量を試験したので、肺転移巣数／肺重量の低下に用 量 依存性の傾向があるということができる。実施例３３：ｆｌｋ−１リボザイム（活性／不活性）がマウスのＬＬＣ−ＨＭ原 発腫瘍の増殖に与える影響 活性および不活性のｆｌｋ−１指向性リボザイム（それぞれＲＰＩ．４７３３ ／４７３４）が原発ＬＬＣに与える用量依存性の影響を図３８Ａ〜Ｅに示す。 活性および不活性のｆｌｋ−１指向性リボザイム（それぞれＲＰＩ．４７３３ ／４７３４）が原発ＬＬＣに与える用量依存性の影響を図４２Ａ〜Ｅに示す。最 低用量では、活性ｆｌｋ−１リボザイムを用いても原発腫瘍の増殖に認めうるほ どの影響はなかった（図４２Ａ）。不活性リボザイムは中程度の原発腫瘍増殖低 下を示した。、活性ｆｌｋ−１リボザイムはより高い用量（３〜１００ｍｇ／ｋ ｇ／日、図４２Ｂ〜Ｅ）では原発腫瘍の増殖を低下させたが、不活性リボザイム は１０〜１００ｍｇ／ｋｇ／日の用量範囲にわたってほとんど（たとえ示したと しても）抗腫瘍効果を示さなかった（図４２Ｃ〜Ｅ）。３ｍｇ／ｋｇ／日では活 性および不活性ｆｌｋ−１リボザイム両方の抗腫瘍効果が類似する（図４２Ｂ） 。 ｆｌｔ−１リボザイムの場合と同様に、腫瘍の増殖は指数増殖速度を示した。 この場合もｔ＝０の腫瘍サイズを曲線適合度プログラムで正確に推定することは できないので、ｆｌｋ−１リボザイムにつき指数曲線適合度の勾配を計算するこ とができない。 処置を終えた直後（１８日目）、活性ｆｌｋ−１リボザイムは３〜１００ｍｇ ／ｋｇ／日で原発腫瘍体積の有意の低下を示した（図４３）。低下の程度は３ｍ ｇ／ｋｇ／日で約４倍であり、最大であると思われた。最低用量は原発腫瘍体積 に有意の影響を与えなかった。不活性ｆｌｋ−１リボザイムは１および３ｍｇ／ ｋｇ／日の用量で有意の抗腫瘍効果を示したが、この効果は１０〜１００ｍｇ／ ｋｇ／日では消失した。 ｆｌｋ−１リボザイムの抗転移効果を図４４ＡおよびＢに示す。肺転移巣数に 対してはいずれのリボザイムもいかなる用量でも統計学的に有意の効果を示さな かったが、肺質量に対しては活性ｆｌｋ−１リボザイムが３〜１００ｍｇ／ｋｇ ／日の用量にわたって有意の低下を示した。 本発明者らはさらに、全用量範囲にわたって肺質量が正常にまで低下すること を見いだした。不活性リボザイムは１および３ｍｇ／ｋｇ／日で肺質量を低下さ せた（図４１Ｃ）。しかしこの傾向はより高い用量（３〜１００ｍｇ／ｋｇ／日 ）ではみられなかった。実施例３４：リボザイム仲介による腫瘍の血管分布の低下 ３処置群（食塩液対照、不活性ＲＰＩ．４６１１および活性ＲＰＩ．４６１０ 、用量３０ｍｇ／ｋｇ／日のみ）それぞれからの３腫瘍につき、内皮細胞のＣＤ ３１（ＰＥＣＡＭ）を染色する免役組織化学的アッセイ法で分析した。血管分布 をブラインド方式（ｂｌｉｎｄｅｄ ｆａｓｈｉｏｎ）で定量した。生データか ら、高倍率視野（４００倍）当たりの平均血管数を計算した。それらは以下のと おりである：食塩液対照＝２４．１；ＲＰＩ．４６１１（不活性）＝２７．６； ＲＰＩ．４６１０（活性）＝１６．０。 活性ｆｌｔ−１リボザイムはルイス肺腫瘍においてリボザイム特異性の抗血管 形成効果を示すことが示唆される。したがって、観察された原発腫瘍体積減少に 関する作用機序は、抗血管形成効果によるものと思われる。同様な送達方式を用 いて、ｃ−ｒａｆリボザイムを多様な疾病の治療に使用できる。ｃ−ｒａｆをターゲティングするリボザイムの使用 ｃ−ｒａｆ癌遺伝子の過剰発現が多数の癌で報告されている（前記参照）。し たがって、インビトロおよびインビボでｃ−ｒａｆ発現を阻害すると（たとえば リボザイムを用いて）、多くの癌の細胞増殖を低下させ、それらの増殖能を低下 させることができる。侵入性表現型の獲得にも腫瘍の血管形成にも、ＭＭＰのカ スケードおよびセリンプロテイナーゼ発現が関連している（ＭａｃＤｏｕｇａｌ ｌ ＆ Ｍａｔｒｉｓｉａｎ，１９９５，Ｃａｎｃｅｒ ＆ Ｍｅｔａｓｔａｓ ｉｓ Ｒｅｖｉｅｗｓ １４，３５１；Ｒｉｔｃｈｌｉｎ ＆ Ｗｉｎｃｈｅｓ ｔｅｒ，１９８９，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｓｅｍｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ .，１１，２１９）。 ヒトの多数の疾病が、正常組織構造に対する傷害または損傷部位の不適切な細 胞増殖を特徴とする。これらの疾病には、外科処置により分断された部位の動脈 壁の内側平滑筋細胞の局所増殖により起きる再狭窄；皮膚の内皮細胞損傷領域で 表皮細胞の増殖により起きる乾癬、および創傷治癒過程で細胞の不適切な複製に より起きる種々の線維症が含まれる。ある種の炎症プロセスでは、細胞増殖は病 因ではないが、その疾病の病態を悪化させる。たとえば慢性関節リウマチでは、 滑膜過形成によって滑膜線維芽細胞集団が拡張することによりプロテアーゼが分 泌されるため、軟骨損傷が促進される。細胞増殖または増殖制御喪失を伴うこれ らおよび他の多数の疾病（たとえば癌）は、細胞Ｒａｆ遺伝子産物の発現を阻害 するリボザイムにより治療することができるであろう。あるいは、細胞増殖因子 受容体のリボザイム阻害を利用して、下流のシグナル化経路を阻害することがで きるであろう。関与する特異的成長因子は、増殖事象において指示される細胞タ イプに依存するであろう。 触媒活性をもち、かつ部位特異性の増大したリボザイム（前記参照）は、癌治 療のための有効かつ安全な療法分子になると思われる。本発明においては、リボ ザイムが平滑筋細胞の増殖を阻害することを示した。本明細書に記載した実施例 から、同じリボザイムを同様な様式で癌細胞へ送達してそれらの増殖を遮断でき ることが当業者には明らかである。診断用としての使用 本発明のリボザイムは、罹患細胞内の遺伝的浮動および変異を検査し、または 細胞内のｃ−ｒａｆ ＲＮＡの存在を検出するための診断用具として使用できる 。リボザイム活性とターゲットＲＮＡ構造が密接に関連しているので、ターゲッ トＲＮＡの塩基対合および三次元構造を変化させるいかなる分子内領域の変異も 検出できる。本明細書に記載した複数のリボザイムを用いることにより、ＲＮＡ の構造および機能にとって重要なヌクレオチドの変化を、インビトロでも、細胞 および組織内でもマッピングできる。遺伝子の発現を阻止して、疾病の進行中に おけるその遺伝子の産物が（本質的に）もつ役割を特定するために、リボザイム によるターゲットＲＮＡ開裂を利用できる。こうして、その疾病の重要な仲介物 質としての他の遺伝子ターゲットを特定できる。これらの実験から、併用療法の 可能性が提供され（たとえば異なる遺伝子をターゲットとする複数のリボザイム 、既知の小分子型阻害薬と結合したリボザイム、あるいはリボザイムおよび／ま たは他の化学的もしくは生物学的分子を併用した断続的処置）、疾病進行に対す るより良い治療方法が得られるであろう。インビトロでの本発明のリボザイムの 他 の用途は当技術分野で周知であり、たとえばｃ−ｒａｆ関連状態に伴うｍＲＮＡ の存在を検出することがこれに含まれる。そのようなＲＮＡは、標準法でリボザ イムにより処置した後、開裂生成物の存在を調べることにより検出される。 具体例において、野生型または変異型のターゲットＲＮＡのみを開裂しうるリ ボザイム類をアッセイに使用する。第１リボザイムを用いて試料中に存在する野 生型ＲＮＡを同定し、そして第２リボザイムを用いて試料中の変異ＲＮＡを同定 する。反応の対照として、野生型および変異型両方のＲＮＡの合成基質を両リボ ザイムで開裂させて、反応の相対リボザイム効率および“非ターゲット”ＲＮＡ 種の開裂がないことを証明する。合成基質からの開裂生成物は、試料集団中の野 生型および変異型ＲＮＡの分析のためのサイズマーカーを得るのにも役立つであ ろう。したがって各分析には２種類のリボザイム、２種類の基質、および１種類 の未知試料が必要であり、これを組合わせて６つの反応にする。開裂生成物の存 在は、各ＲＮＡの全長および開裂フラグメントを１列のポリアクリルアミドゲル で分析できるようなＲＮアーゼ保護アッセイにより測定する。ターゲット細胞に おける変異ＲＮＡの発現および目標とする表現型変化の推定リスクを洞察するた めに、結果を定量するのが必ず必要というわけではない。それのタンパク質産物 がその表現型の発症に関連するとされるｍＲＮＡ（すなわちｃ−ｒａｆ）の発現 は、リスクの判定に適している。両転写体に匹敵する特異的活性をもつプローブ を用いる場合、ＲＮＡレベルの定性比較が適切であり、初期診断の経費が少なく なるであろう。ＲＮＡレベルを定性的または定量的のいずれで比較するにしても 、変異体と野生型の比率の高さはリスクの高さと相関するであろう。他の用途 潜在的有用性をもつ本発明の配列特異性核酸触媒は、ＤＮＡ制限エンドヌクレ アーゼがＤＮＡの研究に対してもつのと同じ多くの用途を、ＲＮＡの研究に対し てもつであろう（Ｎａｔｈａｎｓ ｅｔ ａｌ．，１９７５，Ａｎｎ．Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．４４：２７３）。たとえばその制限フラグメントパターンを利 用して２種類の関連ＲＮＡ間の配列関係を判定することができ、また大型ＲＮＡ を研究にさらに有用なサイズのフラグメントに開裂することができる。リボザイ ムの配列特異性を工学的に操作できるのは、未知配列のＲＮＡを開裂するのに理 想的である。 本明細書に記載するＮＴＰの使用は、研究および商業において幾つかの用途を もつ。これらの修飾ヌクレオシド三リン酸を用いて、新規機能をもつオリゴヌク レオチドをインビトロ選択（進化）することができる。インビトロ選択プロトコ ールの例を本明細書に援用する（Ｊｏｙｃｅ，１９８９，Ｇｅｎｅ，８２，８３ −８７；Ｂｅａｕｄｒｙ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５７， ６３５−６４１；Ｊｏｙｃｅ，１９９２，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃ ａｎ，２６７，９０−９７；Ｂｒｅａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９４，ＴＩＢ ＴＥＣＨ，１２，２６８；Ｂａｒｔｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｓｃｉｅｎ ｃｅ，２６１：１４１１−１４１８；Ｓｚｏｓｔａｋ，１９９３，ＴＩＢＳ，１ ７，８９−９３；Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．，１９９５，ＦＡＳＥＢ Ｊ．，９ ，１１８３；Ｂｒｅａｋｅｒ，１９９６，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．， ７，４４２）。 さらに、これらの修飾ヌクレオシド三リン酸を用いて、修飾オリゴヌクレオチ ドのコンビナトリアルケミストリーライブラリーを作成することができる。この 技術に関する幾つかの参考文献がある（Ｂｒｅｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９ ２，ＰＮＡＳ，８９，５２８１−５２８３；Ｅａｔｏｎ，１９９７，Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，１，１０−１６）。これらをすべて本明細書 に援用する。 本発明の核酸分子は、ＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼがＤＮＡの研究に対して もつのと同じ多くの用途を、ＲＮＡの研究に対してもつであろう（Ｎａｔｈａｎ ｓ ｅｔ ａｌ．，１９７５，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４４：２７３ ）。たとえばその制限フラグメントパターンを利用して２種類の関連ＲＮＡ間の 配列関係を判定することができ、また大型ＲＮＡを研究にさらに有用なサイズの フラグメントに開裂することができる。リボザイムの配列特異性を工学的に操作 できるのは、未知配列のＲＮＡを開裂するのに理想的である。本発明の核酸分子 （たとえばリボザイム）は、たとえば実質的にいかなるＲＮＡ転写体の開裂をも ターゲティングすることができる（Ｚａｕｇ ｅｔ ａｌ．，３２４，Ｎａｔｕ ｒｅ，４２９，１９８６；Ｃｅｃｈ，２６０，ＪＡＭＡ，３０３０，１９８８； および Ｊｅｆｆｅｒｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａ ｒｃｈ，１３７１，１９８９）。そのような核酸を療法に、または療法遺伝子タ ーゲットの評価に、および／または生物学的系における遺伝子の機能を判定する ために使用できる（Ｃｈｒｉｓｔｏｆｆｅｒｓｅｎ，１９９７，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１５，４８３）。 細胞送達、ヌクレアーゼ抵抗性、細胞の転送および局在化、オリゴヌクレオチ ドフラグメントの化学的リゲーションのために、ｚｙｌｏ修飾を含む化合物を用 いて種々のリガンドをオリゴヌクレオチドに結合させることができる。式ＩＩの 化合物１種類またはそれ以上をリボザイムに取り込ませることにより、その有効 性を高めることができる。式ＩＩの化合物を有効な抗ウイルス薬として使用でき る。 以下の請求の範囲には他の態様も含まれる。 表１ 天然に存在するリボザイムの特徴 グループＩイントロン ・サイズ：約１５０〜１０００以上のヌクレオチド。 ・標的配列中の切断部位の５’側に隣接してＵを必要とする。 ・切断部位の５’側で４〜６のヌクレオチドと結合する。 ・反応メカニズム：グアノシンの３’−ＯＨによって攻撃し、３’−ＯＨ及び５ ’グアノシンを有する切断産物を生成する。 ・活性構造の折り畳み及び維持を助けるために、ある場合には、蛋白質の補因子 がさらに必要とされる。 ・このクラスには３００以上の種類が知られている。テトラヒメナ・サーモフィ ラのｒＲＮＡ、真菌ミトコンドリア、葉緑体、ファージＴ４、らん藻類、その 他において、介在配列として見出されている。 ・主要な構造上の特徴は、系統発生比較、突然変異原性及び生化学的研究によっ てほぼ確立されている［１，２］。 ・１つのリボザイムに対して完全な力学的フレームワークが立証されている[３ ，４，５，６]。 ・リボザイムのフォルディング及び基質ドッキングに関する研究が進行中［７， ８，９］。 ・重要な残基の化学修飾検討は十分確立されている［１０，１１］。 ・このリボザイムは、結合部位が小さい（４〜６ヌクレオチド）ため、標的ＲＮ Ａ切断に対して非常に非特異的になる場合があるが、テトラヒメナのグループＩ イントロンは、「欠損」β−ガラクトシダーゼのメッセージに新たなβ−ガラク シダーゼ配列を結合することによってこのメッセージを修復するのに利用されて いる［１２］。 ＲＮａｓｅＰ ＲＮＡ（Ｍ１ＲＮＡ） ・サイズ：約２９０〜４００のヌクレオチド。 ・偏在するリボ核蛋白質酵素のＲＮＡ部分。 ・ｔＲＮＡ前駆体を切断し、成熟ｔＲＮＡを形成する［１３］。 ・反応メカニズム：恐らくはＭ2+−ＯＨによって攻撃し、３’−ＯＨ及び５’リ ン酸を有する切断産物を生成する。 ・ＲＮａｓｅＰは原核生物及び真核生物全体に見出されている。このＲＮＡサブ ユニットは、細菌、酵母、げっ歯類及び霊長類から配列決定されている。 ・内因性ＲＮａｓｅＰを治療応用に活用することは、外部ガイド配列（ＥＧＳ） と標的ＲＮＡのハイブリダイゼーションによって可能である［１４，１５］。 ・リン酸と２’ＯＨとの接触の重要性が最近判明した［１６，１７］。 グループＩＩイントロン ・サイズ：１０００以上のヌクレオチド。 ・標的ＲＮＡのトランス切断であることが最近実証された［１８，１９］。 ・配列要求性は完全には決定されていない。 ・反応メカニズム：内部アデノシンの２’−ＯＨが３’−ＯＨ、及び３’−５’ 及び２’−５’分岐点を含む「ラリアット（ｌａｒｉａｔ）」ＲＮＡを有する 切断産物を生成する。 ・ＲＮＡの切断及び結合だけでなくＤＮＡ切断との関わりが実証された［２０， ２１］唯一の天然リボザイム。 ・主要な構造上の特徴は、系統発生比較によってほぼ確立されている［２２］。 ・２’ＯＨ接触の重要性が判明しはじめている［２３］。 ・力学的フレームワークは検討中である［２４］。 ＶＳ ＲＮＡ ・サイズ：約１４４ヌクレオチド。 ・ヘアピン標的ＲＮＡのトランス切断であることが最近実証された［２５］。 ・配列要求性は完全には決定されていない。 ・反応メカニズム：２’−○Ｈが切れやすい結合の５’側を攻撃し、２’，３’ −サイクリックリン酸及び５’−ＯＨ末端を有する切断産物を生成する。 ・結合部位及び構造上の要求性は完全には決定されていない。 ・このクラスは１種しか知られていない。Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ＶＳ ＲＮＡ に見出されている。 ハンマーヘッド・リボザイム（本文を参照のこと） ・サイズ：約１３〜４０ヌクレオチド。 ・切断部位の５’に隣接した標的配列ＵＨを必要とする。 ・切断部位の両側で可変数のヌクレオチドと結合する。 ・反応メカニズム：２’−ＯＨによって切れやすい結合の５’側を攻撃し、２’ ，３’−サイクリックリン酸及び５’−ＯＨ末端を有する切断産物を生成する 。 ・このクラスには１４種が知られている。ＲＮＡを感染体として利用する植物病 原体（ウィルソイド）に見出されている。 ・２つの結晶構造を含め、本質的な構造上の特徴がほぼ明確にされている。［２ ６，２７］ ・（インビトロ選択による工学的処理に対し）ごくわずかなライゲーション活性 が実証された。［２８］ ・２つ又はそれ以上のリボザイムに対して完全な力学的フレームワークが確立さ れている。［２９］ ・重要な残基の化学修飾検討は十分確立されている。［３０］ ヘアピンリボザイム ・サイズ：約５０ヌクレオチド。 ・切断部位の３’に隣接した標的配列ＧＵＣを必要とする。 ・切断部位の５’側で４〜６のヌクレオチドと、切断部位の３’側で可変数のヌ クレオチドと結合する。 ・反応メカニズム：２’−ＯＨによって切れやすい結合の５’側を攻撃し、２’ ，３’−サイクリックリン酸及び５’−ＯＨ末端を有する切断産物を生成する 。 ・このクラスには３種が知られている。ＲＮＡを感染体として利用する３種の植 物病原体（タバコ・リングスポット・ウィルス，アラビス・モザイク・ウィル ス及びチコリー黄色斑ウィルスのサテライトＲＮＡ）に見出されている。 ・本質的な構造上の特徴がほぼ明確にされている［３１，３２，３３，３４］。 ・（切断活性に加えて）ライゲーション活性があるためにこのリボザイムはイン ビトロ選択による工学処理が可能である［３５］。 ・１つのリボザイムに対して完全な力学的フレームワークが確立されている［３ ６］。 ・重要な残基の化学修飾検討が着手された［３７，３８］。 デルタ肝炎ウィルス（ＨＤＶ）リボザイム ・サイズ：約６０ヌクレオチド。 ・標的ＲＮＡのトランス切断であることが実証されている［３９］。 ・結合部位及び構造上の要求性は完全には決定されていないが、切断部位の５’ 側の配列は要求されない。折りたたまれたリボザイムはシュードノット構造を 含む［４０］。 ・反応メカニズム：２’−ＯＨによって切れやすい結合の５’側を攻撃し、２’ ，３’−サイクリックリン酸及び５’−ＯＨ末端を有する切断産物を生成する 。 ・このクラスは２種しか知られていない。ヒトＨＤＶに見出されている。 ・環状のＨＤＶは活性があり、ヌクレアーゼ安定性が増加している［４１］。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｚ 9/12 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｑ 1/68 5/00 Ｂ (31)優先権主張番号 ６０／０５１，７１８ (32)優先日 平成９年７月３日(1997．7．3) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／０５６，８０８ (32)優先日 平成９年８月22日(1997．8．22) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／０６１，３２１ (32)優先日 平成９年10月２日(1997．10．2) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／０６１，３２４ (32)優先日 平成９年10月２日(1997．10．2) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／０６４，８６６ (32)優先日 平成９年11月５日(1997．11．5) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／０６８，２１２ (32)優先日 平成９年12月19日(1997．12．19) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ， ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，Ｌ Ｓ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ， ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，Ｅ Ｅ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，Ｍ Ｄ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ， ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，Ｕ Ｚ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 レイノルズ，マーク アメリカ合衆国コロラド州80026，ラファ イエット，ノース・ラークスパット・コー ト 4184 (72)発明者 キシチ，ケヴィン アメリカ合衆国コロラド州80026，ラファ イエット，ジャンクイル・サークル 2451 (72)発明者 ベロン，ローレント アメリカ合衆国コロラド州80301，ボール ダー，グレンウッド・ドライブ 2946 (72)発明者 パリー，トム アメリカ合衆国コロラド州80020，ブルー ムフィールド，ユーティカ・ストリート 12610 (72)発明者 ベイジェルマン，レオニド アメリカ合衆国コロラド州80503，ロング モント，コルト・ドライブ 5530 (72)発明者 マクスウィゲン，ジェームズ・エイ アメリカ合衆国コロラド州80301，ボール ダー，フランクリン・ドライブ 4866 (72)発明者 カーペイスキー，アレグザンダー アメリカ合衆国コロラド州80024，ラファ イエット，ヴァーニアー・アベニュー 420 (72)発明者 バーギン，アレックス アメリカ合衆国カリフォルニア州91910, チュラ・ヴィスタ，カミニト・エストレラ 832 (72)発明者 トンプソン，ジェームズ アメリカ合衆国コロラド州80301，ボール ダー，グレンウッド・ドライブ 2925，ナ ンバー 103 (72)発明者 ワークマン，クリストファー・ティー アメリカ合衆国コロラド州80303，ボール ダー，ロングウッド 3910 (72)発明者 ビュードリー，アンバー アメリカ合衆国コロラド州80026，ラファ イエット，イースト・ジェネシオ・ストリ ート 711 (72)発明者 スウィードラー，デーヴィッド アメリカ合衆国コロラド州80027，ルイス ヴィル，セント・アンドリュース・レイン 956

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １． 生物学的システムにおけるプロセスを調節しうる核酸分子を同定する方法 であって、 ａ） 基質結合ドメインおよび触媒ドメインを有する核酸触媒のランダムライブ ラリを、前記プロセスを調節するのに適した条件下で前記生物学的システム中に 導入し、ここで前記基質結合ドメインはランダム配列を含み；そして ｂ） プロセスが調節された前記生物学的システムからの前記核酸触媒の基質結 合ドメインの少なくとも一部のヌクレオチド配列を決定する、 の各工程を含む方法。 ２． 生物学的システムにおけるプロセスに関与する１またはそれ以上の核酸分 子を同定する方法であって、 ａ） 基質結合ドメインおよび触媒ドメインを有する核酸触媒のライブラリを、 前記プロセスを変化させるのに適した条件下で前記生物学的システムに与え、こ こで前記基質結合ドメインはランダム配列を含み； ｂ） 前記核酸触媒のいずれかにより前記プロセスが変化した前記生物学的シス テム中に存在する前記いずれかの前記核酸触媒を同定し；そして ｃ） 前記いずれかの前記核酸触媒の結合アームの少なくとも一部のヌクレオチ ド配列を決定して、前記生物学的システムにおける前記プロセスに関与する前記 核酸分子の前記同定を行う、 の各工程を含む方法。 ３． 生物学的システムにおけるプロセスを調節しうる核酸触媒を同定する方法 であって、 ａ） 基質結合ドメインおよび触媒ドメインを有する核酸触媒のランダムライブ ラリを、前記プロセスを調節するのに適した条件下で前記生物学的システムに導 入し、ここで前記基質結合ドメインはランダム配列を含み；そして ｂ） プロセスが調節された前記生物学的システムからの前記核酸触媒を同定す る、 の各工程を含む方法。 ４． 前記生物学的システムが細菌細胞である、請求項１−３のいずれかに記載 の方法。 ５． 前記生物学的システムが植物起源のものである、請求項１−３のいずれか に記載の方法。 ６． 前記生物学的システムが哺乳動物起源のものである、請求項１−３のいず れかに記載の方法。 ７． 前記生物学的システムが酵母起源のものである、請求項１−３のいずれか に記載の方法。 ８． 前記生物学的システムがショウジョウバエ起源のものである、請求項１− ３のいずれかに記載の方法。 ９． 前記核酸触媒がハンマーヘッドモチーフのものである、請求項１−３のい ずれかに記載の方法。 １０． 前記核酸触媒がヘアピンモチーフのものである、請求項１−３のいずれ かに記載の方法。 １１． 前記核酸触媒がデルタ肝炎ウイルスリボザイムモチーフのものである、 請求項１−３のいずれかに記載の方法。 １２． 前記核酸触媒が、グループＩイントロン、グループＩＩイントロン、Ｖ ＳリボザイムまたはＲＮａｓｅＰリボザイムモチーフのものである、請求項１− ３のいずれかに記載の方法。 １３． 前記プロセスが、成長、増殖、アポトーシス、形態学、脈管形成、分化 、移動、ウイルス増殖、薬剤耐性、シグナル伝達、細胞サイクル制御、温度感受 性および化学物質感受性からなる群より選択される、請求項１−３のいずれかに 記載の方法。 １４． 核酸触媒の前記ランダムライブラリが、前記核酸触媒の発現を可能とす る様式で発現ベクターにコードされている、請求項１−３のいずれかに記載の方 法。 １５． 前記発現ベクターが、 ａ） 転写開始領域； ｂ） 転写終結領域； ｃ） 少なくとも１つの前記核酸触媒をコードする遺伝子； を含み、 ここで、前記遺伝子は、前記核酸触媒の発現および／または輸送を可能とする様 式で前記開始領域および前記終結領域に動作可能なように連結されている、請求 項１４記載の方法。 １６． 前記発現ベクターが、 ａ） 転写開始領域； ｂ） 転写終結領域； ｃ） オープンリーディングフレーム； ｄ） 少なくとも１つの前記核酸触媒をコードする遺伝子を含み、 ここで、前記遺伝子は前記オープンリーディングフレームの３’−末端に動作可 能なように連結されており、かつ 前記遺伝子は、前記核酸触媒の発現および／または輸送を可能とする様式で前記 開始領域、前記オープンリーディングフレームおよび前記終結領域に動作可能な ように連結されている、請求項１４記載の方法。 １７． 前記発現ベクターが、 ａ） 転写開始領域； ｂ） 転写終結領域； ｃ） イントロン； ｄ） 少なくとも１つの前記核酸触媒をコードする遺伝子を含み、 ここで、前記遺伝子は、前記核酸触媒の発現および／または輸送を可能とする様 式で、前記開始領域、前記イントロンおよび前記終結領域に動作可能なように連 結されている、請求項１４記載の方法。 １８． 前記発現ベクターが、 ａ） 転写開始領域； ｂ） 転写終結領域； ｃ） イントロン； ｄ） オープンリーディングフレーム； ｅ） 少なくとも１つの前記核酸触媒をコードする遺伝子を含み、 ここで、前記遺伝子は、前記オープンリーディングフレームの３’−末端に動作 可能なように連結されており、かつ 前記遺伝子は、前記核酸触媒の発現および／または輸送を可能とする様式で、前 記開始領域、前記イントロン、前記オープンリーディングフレームおよび前記終 結領域に動作可能なように連結されている、請求項１４記載の方法。 １９． 前記発現ベクターがレトロウイルス由来のものである、請求項１４記載 の方法。 ２０． 前記発現ベクターがアデノウイルス由来のものである、請求項１４記載 の方法。 ２１． 前記発現ベクターがアデノ関連ウイルス由来のものである、請求項１４ 記載の方法。 ２２． 前記発現ベクターがアルファウイルス由来のものである、請求項１４記 載の方法。 ２３． 前記発現ベクターが細菌プラスミド由来のものである、請求項１４記載 の方法。 ２４． 前記発現ベクターがＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター要素に動作可 能なように連結されている、請求項１４記載の方法。 ２５． 前記発現ベクターがＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター要素に動作 可能なように連結されている、請求項１４記載の方法。 ２６． 前記ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターが転移ＲＮＡ遺伝子由来の ものである、請求項２５記載の方法。 ２７． 前記ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターがＵ６小核ＲＮＡ遺伝子由 来のものである、請求項２５記載の方法。 ２８． 核酸触媒が、前記Ｕ６小核ＲＮＡ遺伝子によりコードされる配列の末端 ２７ヌクレオチドに相同な配列をその５’−末端に含む、請求項２５記載の方法 。 ２９． 前記ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターがＴＲＺ ＲＮＡ遺伝子由 来のものである、請求項２８記載の方法。 ３０． 前記生物学的システムが真核生物起源のものである、請求項１−３のい ずれかに記載の方法。 ３１． 前記生物学的システムが原核生物起源のものである、請求項１−３のい ずれかに記載の方法。 ３２． 前記生物学的システムが始原細菌起源のものである、請求項１−３のい ずれかに記載の方法。 ３３． 核酸触媒の前記基質結合ドメインが、標的配列と安定な相互作用を形成 するのに十分な長さのものである、請求項１−３のいずれかに記載の方法。 ３４．前記基質結合ドメインが１２−１００ヌクレオチドの長さのものである、 請求項３３記載の方法。 ３５． 前記基質結合ドメインが１４−２４ヌクレオチドの長さのものである、 請求項３３記載の方法。 ３６． 前記核酸触媒が１つの基質結合アームを含む、請求項１−３のいずれか に記載の方法。 ３７． 前記核酸触媒が２つの基質結合アームを含む、請求項１−３のいずれか に記載の方法。 ３８． 前記基質結合アームが同様の長さのものである、請求項３７記載の方法 。 ３９． 前記基質結合アームが異なる長さのものである、請求項３７記載の方法 。 ４０． 式ＩＩＩ： ［式中、 Ｎは、独立して、ヌクレオチドまたは非ヌクレオチドリンカーであり、これは同 一でも異なっていてもよく；ＭおよびＱは、独立して、標的核酸分子と安定に相 互作用するのに十分な長さのオリゴヌクレオチドであり；ｏおよびｎは、１また はそれより大きい整数であり、ここで、（Ｎ）ｏおよび（Ｎ）ｎがヌクレオチド である場合、（Ｎ）ｏおよび（Ｎ）ｎは場合により水素結合相互作用により相互 作用してもよく；Ｌはリンカーであり、これは存在してもしなくてもよいが、存 在する場合にはヌクレオチドおよび／または非ヌクレオチドリンカーであり、こ れは一本鎖および／または二本鎖領域であることができ；＿は化学結合を表し； およびＡ、Ｃ、ＵおよびＧはそれぞれアデノシン、シチジン、ウリジンおよびグ アノシンヌクレオチドを表す］ を有する、エンドヌクレアーゼ活性を有する核酸分子。 ４１． 式ＩＶ： ［式中、 Ｎは、独立して、ヌクレオチドまたは非ヌクレオチドリンカーであり、これは同 一でも異なっていてもよく；ＭおよびＱは、独立して、標的核酸分子と安定に相 互作用するのに十分な長さのオリゴヌクレオチドであり；ｏおよびｎは１または それより大きい整数であり、ここで、（Ｎ）ｏおよび（Ｎ）ｎがヌクレオチドで ある場合、（Ｎ）ｏおよび（Ｎ）ｎは場合により水素結合相互作用により相互作 用してもよく；Ｌはリンカーであり、これは存在してもしなくてもよいが、存在 する場合にはヌクレオチドおよび／または非ヌクレオチドリンカーであり、これ は一本鎖および／または二本鎖領域であることができ；Ｚ３は２’−メチルチオ メチルウリジンであり；Ｚ４は２’−Ｃ−アリルウリジンであり；Ｚ７は６−メ チルウリジンであり；＿は化学結合を表し；およびＡ、およびＧはそれぞれアデ ノシンおよびグアノシンヌクレオチドを表す］ を有する、触媒活性を有する核酸分子。 ４２． 式Ｖ： ［式中、 Ｎは、独立して、ヌクレオチドまたは非ヌクレオチドリンカーであり、これは同 一でも異なっていてもよく；ＭおよびＱは、独立して、標的核酸分子と安定に相 互作用するのに十分な長さのオリゴヌクレオチドであり；ｏ、およびｎは１また はそれより大きい整数であり、ここで、（Ｎ）ｏおよび（Ｎ）ｎがヌクレオチド である場合、（Ｎ）ｏおよび（Ｎ）ｎは場合により水素結合相互作用により相互 作用してもよく；Ｌはリンカーであり、これは存在してもしなくてもよいが、存 在する場合にはヌクレオチドおよび／または非ヌクレオチドリンカーであり、こ れは一本鎖および／または二本鎖領域であることができ；Ｚ３は２’−メチルチ オメチルウリジンであり；Ｚ４は２’−メチルチオメチルシチジンであり；Ｚ７ は６−メチルウリジンであり；−は化学結合を表し、およびＡ、およびＧはそれ ぞれアデノシンおよびグアノシンヌクレオチドを表す］ を有する、触媒活性を有する核酸分子。 ４３． 式ＶＩ：［式中、 Ｎは、独立して、ヌクレオチドまたは非ヌクレオチドリンカーであり、これは同 一でも異なっていてもよく；ＭおよびＱは、独立して、標的核酸分子と安定に相 互作用するのに十分な長さのオリゴヌクレオチドであり；ｏおよびｎは１または それより大きい整数であり、ここで、（Ｎ）ｏおよび（Ｎ）ｎがヌクレオチドで ある場合、（Ｎ）ｏおよび（Ｎ）ｎは場合により水素結合相互作用により相互作 用してもよく；Ｌはリンカーであり、これは存在してもしなくてもよいが、存在 する場合には、ヌクレオチドおよび／または非ヌクレオチドリンカーであり、こ れは一本鎖および／または二本鎖領域であることができ；Ｚ３は２’−メチルチ オメチルウリジンであり；Ｚ４は２’−メチルチオメチルシチジンであり；Ｚ７ は２’−Ｃ−アリルウリジンであり；−は化学結合を表し；およびＡ、およびＧ はそれぞれアデノシンおよびグアノシンヌクレオチドを表す］ を有する、触媒活性を有する核酸分子。 ４４． 式ＶＩＩ［式中、 Ｎは、独立して、ヌクレオチドまたは非ヌクレオチドリンカーであり、これは同 一でも異なっていてもよく；ＭおよびＱは、独立して、標的核酸分子と安定に相 互作用するのに十分な長さのオリゴヌクレオチドであり；ｏおよびｎは１または それより大きい整数であり、ここで、（Ｎ）ｏおよび（Ｎ）ｎがヌクレオチドで ある場合、（Ｎ）ｏおよび（Ｎ）ｎは場合により水素結合相互作用により相互作 用してもよく；Ｌはリンカーであり、これは存在してもしなくてもよいが、存在 する場合にはヌクレオチドおよび／または非ヌクレオチドリンカーであり、これ は一本鎖および／または二本鎖領域であることができ；Ｚ３は２’−メチルチオ メチルウリジンであり；Ｚ４は２’−メチルチオメチルシチジンであり；Ｚ７は ピリジン−４−オンであり；および＿は化学結合を表し；およびＡ、およびＧは それぞれアデノシンおよびグアノシンヌクレオチドを表す］ を有する、触媒活性を有する核酸分子。 ４５． 前記（Ｎ）ｏおよび（Ｎ）ｎがヌクレオチドであり、前記ｏおよびｎが ３またはそれより大きい整数である、請求項４０−４４のいずれかに記載の核酸 分子。 ４６． 前記Ｌがヌクレオチドリンカーである、請求項４０−４４のいずれかに 記載の核酸分子。 ４７． 前記核酸が別個の核酸分子を切断する、請求項４０−４４のいずれかに 記載の核酸分子。 ４８． 前記別個の核酸分子がＲＮＡである、請求項４７記載の核酸分子。 ４９． 前記核酸が前記別個の核酸分子に相補的な１２−１００塩基を含む、請 求項４７記載の核酸分子。 ５０． 前記核酸が前記別個の核酸分子に相補的な１４−２４塩基を含む、請求 項４７記載の核酸分子。 ５１． 請求項４０−４４のいずれかに記載の核酸分子を含む細胞。 ５２． 前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項１７記載の細胞。 ５３． 前記細胞がヒト細胞である、請求項１８記載の細胞。 ５４． 請求項４０−４４のいずれかに記載の核酸分子の少なくとも１つをコー ドする核酸配列を、その核酸分子の発現を可能とする様式で含む発現ベクター。 ５５． 請求項５４記載の発現ベクターを含む細胞。 ５６． 前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項５５記載の細胞。 ５７． 前記細胞がヒト細胞である、請求項５５記載の細胞。 ５８． 請求項４０−４４のいずれかに記載の核酸分子を含む医薬組成物。 ５９． 請求項４０−４４のいずれかに記載の核酸分子を植物細胞に投与するこ とにより、植物細胞において遺伝子の発現を調節する方法。 ６０． 請求項４０−４４のいずれかに記載の核酸分子を哺乳動物細胞に投与す ることにより、哺乳動物細胞において遺伝子の発現を調節する方法。 ６１． 別個の核酸を切断する方法であって、請求項４０−４４のいずれかに記 載の核酸分子を、前記別個の核酸分子を切断するのに適した条件下で前記別個の 核酸分子と接触させることを含む方法。 ６２． 前記切断が２価カチオンの存在下で実施される、請求項６１記載の方法 。 ６３． 前記２価カチオンがＭｇ2+である、請求項６２記載の方法。 ６４． 前記核酸が化学的に合成される、請求項４０−４４のいずれかに記載の 核酸分子。 ６５． 前記ベクターが、 ａ） 転写開始領域； ｂ） 転写終結領域； ｃ） 少なくとも１つの前記核酸分子をコードする遺伝子； を含み、 ここで、前記遺伝子は、前記核酸分子の発現および／または輸送を可能とする様 式で、前記開始領域および前記終結領域に動作可能なように連結されている、請 求項５４記載の発現ベクター。 ６６． 前記ベクターが、 ａ） 転写開始領域； ｂ） 転写終結領域； ｃ） オープンリーディングフレーム； ｄ） 少なくとも１つの前記核酸分子をコードする遺伝子を含み、 ここで、前記遺伝子は、前記オープンリーディングフレームの３’−末端に動作 可能なように連結されて、おり、かつ 前記遺伝子は、前記核酸分子の発現および／または輸送を可能とする様式で、前 記開始領域、前記オープンリーディングフレームおよび前記終結領域に動作可能 なように連結されている、請求項５４記載の発現ベクター。 ６７． 前記ベクターが、 ａ） 転写開始領域； ｂ） 転写終結領域； ｃ） イントロン； ｄ） 少なくとも１つの前記核酸分子をコードする遺伝子を含み、 ここで、前記遺伝子は、前記核酸分子の発現および／または輸送を可能とする様 式で、前記開始領域、前記イントロンおよび前記終結領域に動作可能なように連 結されている、請求項５９記載の発現ベクター。 ６８． 前記ベクターが、 ａ） 転写開始領域； ｂ） 転写終結領域； ｃ） イントロン； ｄ） オープンリーディングフレーム； ｅ） 少なくとも１つの前記核酸分子をコードする遺伝子を含み、 ここで、前記遺伝子は、前記オープンリーディングフレームの３’−末端に動作 可能なように連結されており、かつ 前記遺伝子は、前記核酸分子の発現および／または輸送を可能とする様式で、前 記開始領域、前記イントロン、前記オープンリーディングフレームおよび前記終 結領域に動作可能なように連結されている、請求項５９記載の発現ベクター。 ６９． 核酸触媒の変異体を同定する方法であって、 ａ） 前記核酸触媒中の、異なるヌクレオチドのあらかじめ決定された群で変化 させるべき少なくとも３つの位置を選択し； ｂ） 前記核酸触媒の異なるプールの第１のクラスを合成し、ここで、合成され るプールの数は、異なるヌクレオチドのあらかじめ決定された群の中のヌクレオ チドの数と等しく、ここで、各プール中において変化させるべき位置の少なくと も１つは異なるヌクレオチドのあらかじめ決定された群から選択される画定され たヌクレオチドを含み、かつ変化させるべき残りの位置は異なるヌクレオチドの あらかじめ決定された群から選択されるヌクレオチドのランダム混合物を含み； ｃ） 前記プールが所望の特性を示すのに適した条件下で前記核酸触媒の異なる プールを試験し、そして前記所望の特性を有するプールを同定し、ここで、所望 の特性を有するプール中で画定されたヌクレオチドを有する位置を続く工程にお いて不変とし； ｄ） 核酸触媒の異なるプールの第２のクラスを合成し、ここで、異なるプール の第２のクラスのそれぞれにおいて変化させるべき位置の少なくとも１つは、異 なるヌクレオチドのあらかじめ決定された群から選択される画定されたヌクレオ チドを含み、および変化させるべき残りの位置は異なるヌクレオチドのあらかじ め決定された群から選択されるヌクレオチドのランダム混合物を含み； ｃ） 前記核酸触媒の異なるプールの第２のクラスを所望の特性を示すのに適し た条件下で試験し、そして前記所望の特性を有するプールを同定し、ここで、所 望の特性を有するプール中の画定されたヌクレオチドを有する位置を続く工程に おいて不変とし；そして ｆ） 工程ｄおよびｅに類似するプロセスを、前記核酸触媒中で変化させるべく 選択されたすべての位置が不変とされるまで繰り返す、 の各工程を含む方法。 ７０． 生物学的システム中の新規核酸分子を同定する方法であって、 ａ）基質結合ドメインおよび触媒ドメインを有する核酸触媒のプールを合成し、 ここで前記基質結合ドメインはランダム配列を含み； ｂ） 核酸触媒のプールを、前記生物学的システムにおいて所望の効果を示すの に適した条件下で試験し、そして前記所望の効果を示す触媒を同定し； ｃ） 前記所望の活性を示す核酸触媒の基質結合ドメインの配列を含むオリゴヌ クレオチドをプローブとして用いて、前記プローブに相補的な核酸分子について 前記生物学的システムをスクリーニングし；そして ｄ） 前記相補的核酸分子を単離し、配列決定する、 の各工程を含む方法。 ７１． 式Ｉ： ［式中、 Ｒは、独立して、２’−Ｏ−メチル−２、６−ジアミノプリンリボシド；２’− デオキシ−２’−アミノ−２、６−ジアミノプリンリボシド；２’−（Ｎ−アラ ニル）アミノ−２’−デオキシ−ウリジン；２’−（Ｎ−フェニルアラニル）ア ミノ−２’−デオキシ−ウリジン；２’−デオキシ−２−（Ｎ−β−アラニル） アミノ；２’−デオキシ−２’−（リシル）アミノウリジン；２’−Ｃ−アリル ウリジン；２’−Ｏ−アミノ−ウリジン；２’−Ｏ−メチルチオメチルアデノシ ン；２’−Ｏ−メチルチオメチルシチジン；２’−Ｏ−メチルチオメチルグアノ シン；２’−Ｏ−メチルチオメチル−ウリジン；２’−デオキシ−２’−（Ｎ− ヒスチジル）アミノウリジン；２’−デオキシ−２’−アミノ−５−メチルシチ ジン；２’−（Ｎ−β−カルボキシアミジン−β−アラニル）アミノ−２’−デ オキシ−ウリジン；２’−デオキシ−２’−（Ｎ−β−アラニル）−グアノシン ；および２’−Ｏ−アミノアデノシンからなる群より選択されるヌクレオシドで ある］ を有する化合物。 ７２． 請求項７１記載の化合物をオリゴヌクレオチド中に取り込ませる方法で あって、前記化合物を、前記化合物を前記オリゴヌクレオチド中に取り込ませる のに適した条件下で、核酸テンプレート、ＲＮＡポリメラーゼ酵素、および修飾 ヌクレオチド三リン酸の取り込みの増強剤を含む混合物と接触させる工程を含む 方法。 ７３． 前記ＲＮＡポリメラーゼがＴ７ ＲＮＡポリメラーゼである、請求項７ ２記載の方法。 ７４． 前記ＲＮＡポリメラーゼが変異体Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼである、請 求項７２記載の方法。 ７５． 前記ＲＮＡポリメラーゼがＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼである、請求項 ７２記載の方法。 ７６． 前記ＲＮＡポリメラーゼが変異体ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼである、 請求項７２記載の方法。 ７７． 前記ＲＮＡポリメラーゼがＴ３ ＲＮＡポリメラーゼである、請求項７ ２記載の方法。 ７８． 前記ＲＮＡポリメラーゼが変異体Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼである、請 求項７２記載の方法。 ７９． 修飾ヌクレオチド三リン酸取り込みの前記増強剤が、ＬｉＣｌ、メタノ ール、ポリエチレングリコール、ジエチルエーテル、プロパノール、メチルアミ ン、およびエタノールからなる群より選択される、請求項７２記載の方法。 ８０． ピリミジンヌクレオチド三リン酸を合成する方法であって、 （ａ）モノホスホリル化、ここでピリミジンヌクレオシドを、ホスホリル化試薬 、トリアルキルリン酸およびジメチルアミノピリジンを含む混合物と、ピリミジ ンヌクレオチド−リン酸の形成に適した条件下で接触させ；そして （ｂ）ピロホスホリル化、ここで工程（ａ）からの前記ピリミジン−リン酸を、 前記ピリミジンヌクレオシド三リン酸の形成に適した条件下でピロホスホリル化 試薬と接触させる、 の各工程を含む方法。 ８１． 前記ピリミジンヌクレオシド三リン酸がウリジン三リン酸である、請求 項８０記載の方法。 ８２． 前記ウリジン三リン酸が２’−糖修飾を有する、請求項８０記載の方法 。 ８３． 前記ウリジン三リン酸が２’−Ｏ−メチルチオメチルウリジン三リン酸 である、請求項８２記載の方法。 ８４． 前記ホスホリル化試薬が、オキシ塩化リン、ホスホ−トリス−トリアゾ リドおよびホスホ−トリス−トリイミダゾリドからなる群より選択される、請求 項８０記載の方法。 ８５． 前記トリアルキルリン酸がトリエチルリン酸である、請求項８０記載の 方法。 ８６． 前記ピロホスホリル化試薬がトリブチルアンモニウムピロリン酸である 、請求項８０記載の方法。 ８７． 前記オリゴヌクレオチドがＲＮＡである、請求項７２記載の方法。 ８８． 前記オリゴヌクレオチドが核酸触媒である、請求項７２記載の方法。 ８９． 前記オリゴヌクレオチドがアプタマーである、請求項７２記載の方法。 ９０． オリゴヌクレオチドを合成するためのキットであって、ＲＮＡポリメラ ーゼ、修飾ヌクレオチド三リン酸取り込みの増強剤および少なくとも１つの請求 項７１記載の化合物を含むキット。 ９１． オリゴヌクレオチドを合成するためのキットであって、ＤＮＡポリメラ ーゼ、修飾ヌクレオチド三リン酸取り込みの増強剤および少なくとも１つの請求 項７１記載の化合物を含むキット。 ９２． 前記ＲＮＡポリメラーゼがバクテリオファージＴ７ ＲＮＡポリメラー ゼである、請求項９０記載のキット。 ９３． 前記ＲＮＡポリメラーゼがバクテリオファージＳＰ６ ＲＮＡポリメラ ーゼである、請求項９０記載のキット。 ９４． 前記ＲＮＡポリメラーゼがバクテリオファージＴ３ ＲＮＡポリメラー ゼである、請求項９０記載のキット。 ９５． 前記ＲＮＡポリメラーゼが変異体Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼである、請 求項９０記載のキット。 ９６． 前記キットが少なくとも２つの請求項７１記載の化合物を含む、請求項 ９０または９１に記載のキット。 ９７． 式ＩＩ： ［式中、 Ｒ1は、ＯＨ、Ｏ−Ｒ3（Ｒ3は、独立して、アルキル、アルケニル、アルキニル 、アリール、アルキルアリール、炭素環式アリール、複素環式アリール、アミド およびエステルからなる群より選択される基である）、Ｃ−Ｒ3（Ｒ3は、独立し て、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、炭素環 式アリール、複素環式アリール、アミドおよびエステルからなる群より選択され る基である）、ハロ、ＮＨＲ4（Ｒ4は、独立して、アルキル（Ｃ１−２２）、ア シル（Ｃ１−２２）、置換または非置換アリール、またはＯＣＨ2ＳＣＨ3（メチ ルチオメチル）からなる群より選択される基である）、ＯＮＨＲ5（Ｒ5は、独立 して、Ｈ、アミノアシル基、ペプチジル基、ビオチニル基、コレステリル基、リ ポ酸残基、レチノイン酸残基、葉酸残基、アスコルビン酸残基、ニコチン酸残基 、６−アミノペニシリラン酸残基、７−アミノセファロスポラン酸残基、アルキ ル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、炭素環式アリール 、複素環式アリール、アミドまたはエステルからなる群より選択される基である ）、ＯＮ＝Ｒ6（Ｒ6は、独立して、ピリドキサール残基、ピリドキサール−５− リン酸残基、１３−ｃｉｓ−レチナール残基、９−ｃｉｓ−レチナール残基、ア ルキル、アルケニル、アルキニル、アルキルアリール、炭素環式アルキルアリー ル、または複素環式アルキルアリールである）であり； Ｂは、独立して、ヌクレオチド塩基またはその類似体または水素であり； Ｘは、独立して、リン含有基であり；および Ｒ2は、独立して、ブロッキング基またはリン含有基である］ を有する化合物。 ９８． 前記化合物がヌクレオチドである、請求項９７記載の化合物。 ９９． 前記化合物がヌクレオチド三リン酸である、請求項９７記載の化合物。 １００． 請求項９７記載の化合物を１またはそれ以上の位置に含むポリヌクレ オチド。 １０１． 前記ポリヌクレオチドが酵素的核酸である、請求項１００記載のポリ ヌクレオチド。 １０２． 前記核酸がハンマーヘッドコンフィギュレーションのものである、請 求項１０１記載の酵素的核酸。 １０３． 前記核酸がヘアピンコンフィギュレーションのものである、請求項１ ０２記載の酵素的核酸。 １０４． 前記核酸が、デルタ肝炎ウイルス、グループＩイントロン、ＶＳ Ｒ ＮＡ、グループＩＩイントロンまたはＲＮａｓｅＰ ＲＮＡコンフィギュレーシ ョンのものである、請求項１０２記載の酵素的核酸。 １０５． 前記化合物がキシロリボアデノシンである、請求項９７記載の化合物 。 １０６． 前記化合物がキシロリボグアノシンである、請求項９７記載の化合物 。 １０７． 前記化合物がキシロリボヌクレオシドホスホルアミダイトである、請 求項９７記載の化合物。 １０８． 前記化合物がキシロリボグアノシンホスホルアミダイトである、請求 項１０７記載の化合物。 １０９． 前記化合物がキシロリボアデノシンホスホルアミダイトである、請求 項１０７記載の化合物。 １１０． 請求項９７記載の化合物を含む哺乳動物細胞。 １１１． 前記細胞がヒト細胞である、請求項１４記載の哺乳動物細胞。 １１２． 請求項１０１記載の化合物を含む哺乳動物細胞。 １１３． 前記細胞がヒト細胞である、請求項１１２記載の哺乳動物細胞。 １１４． 請求項１００記載のポリヌクレオチドを製造する方法。 １１５． 請求項１００記載のポリヌクレオチドを用いて遺伝子発現を調節する 方法。 １１６． 請求項９７記載の化合物を含む医薬組成物。 １１７． 請求項１０１記載のポリヌクレオチドを含む医薬組成物。 １１８． 前記化合物が抗ウイルス剤として用いられる、請求項９７記載の化合 物。 １１９． キシロリボヌクレオシドホスホルアミダイトを合成する方法であって 、 ａ） ２’および５’−保護リボヌクレオシドを酸化剤を用いて酸化し、次に２ ’および５’−保護キシロフラノシルヌクレオシドの形成に適した条件下で還元 剤を用いて還元し；そして ｂ） キシロフラノシルヌクレオシドホスホルアミダイトの形成に適した条件下 でホスフィチル化する、 の各工程を含む方法。 １２０． 前記酸化が酸化クロム、ピリジン、および無水酢酸の存在下で実施さ れる、請求項１１９記載の方法。 １２１． 前記酸化がジメチルスルホキシドおよび無水酢酸の存在下で実施され る、請求項１１９記載の方法。 １２２． 前記酸化がＤｅｓｓ−Ｍａｒｔｉｎ試薬（ペリオジナン）の存在下で 実施される、請求項１１９記載の方法。 １２３． 前記還元がトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウムの存在下で実施さ れる、請求項１１９記載の方法。 １２４． 前記還元が水素化ホウ素ナトリウムの存在下で実施される、請求項１ １９記載の方法。 １２５． 前記還元が水素化ホウ素リチウムの存在下で実施される、請求項１１ ９記載の方法。 １２６． 保護基を含むＲＮＡの１ポット脱保護の方法であって、 ａ） 前記ＲＮＡを、前記ＲＮＡからの核酸塩基およびリン酸保護基の除去に適 した条件下で、あらかじめ決定された比率の無水アルキルアミン、トリアルキル アミンおよび極性有機試薬の混合物と、室温で約３０−１００分間接触させ；そ して ｂ） 工程ａから得られたＲＮＡを、２’−ＯＨ保護基の除去に適した条件下で 、無水トリエチルアミン・フッ化水素と、約５０℃−７０℃で接触させる、 の各工程を含む方法。 １２７． 前記ＲＮＡが酵素的ＲＮＡ分子である、請求項１２６記載の方法。 １２８． 前記酵素的ＲＮＡ分子がハンマーヘッドモチーフのものである、請求 項１２８記載の方法。 １２９． 前記極性有機試薬がジメチルスルホキシドである、請求項１２６記載 の方法。 １３０． 前記無水アルキルアミンが無水メチルアミンである、請求項１２６記 載の方法。 １３１． 前記無水アルキルアミンが無水エチルアミンである、請求項１２６記 載の方法。 １３２． 前記トリアルキルアミンがトリエチルアミンである、請求項１２６記 載の方法。 １３３． 前記混合物中の無水アルキルアミン、トリアルキルアミンおよびジメ チルスルホキシドのあらかじめ決定された比率が、それぞれ１０、３および１３ である、請求項１２９記載の方法。 １３４． 保護基を含むＲＮＡの１ポット脱保護の方法であって、 ａ） 前記ＲＮＡを、前記ＲＮＡからの核酸塩基およびリン酸保護基の除去に適 した条件下で、無水メチルアミン、トリエチルアミンおよびジメチルスルホキシ ドの、それぞれ１０、３および１３の比率の混合物と、室温で約９０分間接触さ せ；そして ｂ） 工程ａから得られたＲＮＡを、２’−ＯＨ保護基の除去に適した条件下で 、無水トリエチルアミン・フッ化水素と約６５℃で接触させる、 の各工程を含む方法。 １３５． 前記ＲＮＡが酵素的ＲＮＡ分子である、請求項１３４記載の方法。 １３６． 前記酵素的ＲＮＡ分子がハンマーヘッドモチーフのものである、請求 項１３５記載の方法。 １３７． 保護基を含むＲＮＡの１ポット脱保護の方法であって、 ａ） 前記ＲＮＡを、前記ＲＮＡからの核酸塩基およびリン酸保護基の除去に適 した条件下で、無水アルキルアミンおよび極性有機試薬のあらかじめ決定された 比率の混合物と、室温で約３０−１００分間接触させ；そして ｂ） 得られたＲＮＡを、２’−ＯＨ保護基の除去に適した条件下で、無水トリ エチルアミン・フッ化水素と約５０℃−７０℃で接触させる、 の各工程を含む方法。 １３８． 前記ＲＮＡが酵素的ＲＮＡ分子である、請求項１３７記載の方法。 １３９． 前記酵素的ＲＮＡ分子がハンマーヘッドモチーフのものである、請求 項１３８記載の方法。 １４０． 前記極性有機試薬がジメチルスルホキシドである、請求項１３７記載 の方法。 １４１． 前記無水アルキルアミンが無水メチルアミンである、請求項１３７記 載の方法。 １４２． 前記無水アルキルアミンが無水エチルアミンである、請求項１３７記 載の方法。 １４３． ＲＮＡ切断活性を有する核酸触媒であって、前記核酸触媒はＲａｆ遺 伝子の発現を調節することを特徴とする核酸触媒。 １４４． 前記核酸触媒がハンマーヘッドコンフィギュレーションものもである 、請求項１４３記載の核酸触媒。 １４５． 前記核酸触媒が、２塩基対またはそれより大きい長さのステムＩＩ領 域を含む、請求項１４４記載の核酸触媒。 １４６． 前記核酸触媒がヘアピンコンフィギュレーションのものである、請求 項１４３記載の核酸触媒。 １４７． 前記酵素的核酸が、デルタ肝炎ウイルス、グループＩイントロン、グ ループＩＩイントロン、ＶＳ核酸またはＲＮａｓｅＰ核酸コンフィギュレーショ ンのものである、請求項１４３記載の核酸触媒。 １４８． 前記核酸触媒が３−７塩基対の長さのステムＩＩ領域を含む、請求項 １４６記載の酵素的核酸。 １４９． 前記核酸が、前記ＲＮＡに相補的な１２−１００塩基を含む、請求項 １４３記載の核酸触媒。 １５０． 前記核酸が、前記ｍＲＮＡに相補的な１４−２４塩基を含む、請求項 １４３記載の核酸触媒。 １５１． 前記核酸触媒が、配列番号５０２−１１０２、１１５３−１４６０お よび１９１３−２３５３として規定される配列のいずれかから本質的になる、請 求項１４４記載の核酸触媒。 １５２． 請求項１４３記載のいずれかの核酸触媒を含む哺乳動物細胞。 １５３． 前記哺乳動物細胞がヒト細胞である、請求項１５２記載の哺乳動物細 胞。 １５４． 少なくとも１つの請求項１４３記載の核酸触媒をコードする核酸配列 を、その核酸触媒の発現を可能とする様式で含む発現ベクター。 １５５． 請求項１５４記載の発現ベクターを含む哺乳動物細胞。 １５６． 前記哺乳動物細胞がヒト細胞である、請求項１５５記載の哺乳動物細 胞。 １５７． 癌、再狭窄、乾癬および慢性関節リウマチを治療する方法であって、 患者に請求項１４３記載の核酸触媒を投与する工程を含む方法。 １５８． 癌、再狭窄、乾癬および慢性関節リウマチを治療する方法であって、 患者に請求項１５４記載の発現ベクターを投与する工程を含む方法。 １５９． 癌の治療方法であって、 ａ） 患者から細胞を単離し； ｂ） 前記細胞に請求項１４３記載の核酸触媒を投与し；そして ｃ） 前記細胞を前記患者に導入する、 の各工程を含む方法。 １６０． 請求項１４３記載の核酸触媒を含む医薬組成物。 １６１． ｃ−ｒａｆのレベルに関連した状態を有する患者を治療する方法であ って、前記患者に請求項１４３記載の核酸触媒を投与することを含む方法。 １６２． ｃ−ｒａｆのレベルに関連した状態を有する患者を治療する方法であ って、前記患者の細胞を請求項１４３記載の核酸分子と接触させることを含み、 さらに１またはそれ以上の薬剤療法の使用を含むことを特徴とする方法。 １６３． 前記核酸分子が少なくとも５つのリボース残基を含み、および前記核 酸が５’末端ヌクレオチドの少なくとも３つでホスホロチオエート結合を含み、 および前記核酸が前記核酸の４位において２’−Ｃ−アリル修飾を含み、および 前記核酸が少なくとも１０個の２’−Ｏ−メチル修飾を含み、および前記核酸が ３’−末端修飾を含む、請求項１４４記載の核酸触媒。 １６４． 前記核酸が、前記３’末端において３’−３’結合反転リボース部分 を含む、請求項１６３記載の酵素的核酸。 １６５． 前記核酸分子が少なくとも５つのリボース残基を含み、および前記核 酸分子が５’末端ヌクレオチドの少なくとも３つでホスホロチオエート結合を含 み、および前記核酸が前記核酸分子の４位および／または７位において２’−ア ミノ修飾を含み、前記核酸分子が少なくとも１０個の２’−Ｏ−メチル修飾を含 み、および前記核酸が３’−末端修飾を含む、請求項１４４記載の核酸触媒。 １６６． 前記核酸分子が少なくとも５つのリボース残基を含み、および前記核 酸分子が５’末端ヌクレオチドの少なくとも３つでホスホロチオエート結合を含 み、および前記核酸分子が前記核酸分子の４位および／または７位において脱塩 基置換を含み、前記核酸が少なくとも１０個の２’−Ｏ−メチル修飾を含み、お よび前記核酸分子が３’−末端修飾を含む、請求項１４４記載の核酸触媒。 １６７． 前記核酸分子が少なくとも５つのリボース残基を含み、および前記核 酸が５’末端ヌクレオチドの少なくとも３つでホスホロチオエート結合を含み、 および前記核酸分子が前記核酸分子の４位および／または７位に６−メチルウリ ジン置換を含み、前記核酸分子が少なくとも１０個の２’−Ｏ−メチル修飾を含 み、および前記核酸分子が３’末端修飾を含む、請求項１４４記載の核酸触媒。 １６８． 細胞に請求項１４３記載の核酸触媒を投与することにより、哺乳動物 細胞におけるｃ−ｒａｆ遺伝子の発現を調節する方法。 １６９． 別個のＲＮＡ分子を切断する方法であって、請求項１４３記載の核酸 触媒を、前記別個のＲＮＡ分子の切断に適した条件下で前記別個のＲＮＡ分子と 接触させることを含む方法。 １７０． 前記切断が２価カチオンの存在下で実施される、請求項１６９記載の 方法。 １７１． 前記２価カチオンがＭｇ2+である、請求項１７０記載の方法。 １７２． 前記核酸が化学的に合成される、請求項１４３記載の核酸分子。 １７３． 前記ベクターが、 ａ） 転写開始領域； ｂ） 転写終結領域； ｃ） 少なくとも１つの前記核酸分子をコードする遺伝子を含み、 ここで、前記遺伝子は、前記核酸分子の発現および／または輸送を可能とする様 式で、前記開始領域および前記終結領域に動作可能なように連結されている、請 求項１５４記載の発現ベクター。 １７４． 前記ベクターが、 ａ） 転写開始領域； ｂ） 転写終結領域； ｃ） オープンリーディングフレーム； ｄ） 少なくとも１つの前記核酸分子をコードする遺伝子を含み、 ここで、前記遺伝子は、前記オープンリーディングフレームの３’−末端に動作 可能なように連結されており、かつ 前記遺伝子は、前記核酸分子の発現および／または輸送を可能とする様式で、前 記開始領域、前記オープンリーディングフレームおよび前記終結領域に動作可能 なように連結されている、請求項１５４記載の発現ベクター。 １７５． 前記ベクターが、 ａ） 転写開始領域； ｂ） 転写終結領域； ｃ） イントロン； ｄ） 少なくとも１つの前記核酸分子をコードする遺伝子を含み、 ここで、前記遺伝子は、前記核酸分子の発現および／または輸送を可能とする様 式で、前記開始領域、前記イントロンおよび前記終結領域に動作可能なように連 結されている、請求項１５４記載の発現ベクター。 １７６． 前記ベクターが、 ａ） 転写開始領域； ｂ） 転写終結領域； ｃ） イントロン； ｄ） オープンリーディングフレーム； ｅ） 少なくとも１つの前記核酸分子をコードする遺伝子を含み、 ここで、前記遺伝子は、前記オープンリーディングフレームの３’−末端に動作 可能なように連結されており、かつ 前記遺伝子は、前記核酸分子の発現および／または輸送を可能とする様式で、前 記開始領域、前記イントロン、前記オープンリーディングフレームおよび前記終 結領域に動作可能なように連結されている、請求項１５４記載の発現ベクター。 １７７． 前記酵素的核酸が、配列番号１−５０１、１４６１−１７６８および ２３５４−２７９４に規定されるいずれかの配列に相補的な配列を含む請求項１ ４４記載の核酸触媒。 １７８． 前記核酸触媒が、配列番号１００３−１０７７、１７６９−１８４０ および２７９５−２８４５に規定されるいずれかの配列から本質的になる、請求 項１４６記載の核酸触媒。 １７９． 前記酵素的核酸が、配列番号１０７８−１１５２、１８４１−１９１ ２および２８４６−２８９６に規定されるいずれかの配列に相補的な配列を含む 、請求項１４６記載の核酸触媒。 １８０． 前記酵素的核酸が、配列番号２８９７−２９５６に規定されるいずれ かの配列に相補的な配列を含む、請求項１４４記載の核酸触媒。 １８１． 前記Ｒａｆ遺伝子がｃ−Ｒａｆ−１遺伝子である、請求項１４３記載 の核酸触媒。 １８２． 前記Ｒａｆ遺伝子がＡ−Ｒａｆ遺伝子である、請求項１４３記載の核 酸触媒。 １８３． 前記Ｒａｆ遺伝子がＢ−Ｒａｆ遺伝子である、請求項１４３記載の核 酸触媒。 １８４． 前記酵素的核酸がＤＮＡ酵素である、請求項１４３記載の核酸触媒。 １８５． 前記酵素的核酸が少なくとも１つの２’−糖修飾を含む、請求項１４ ３記載の核酸触媒。 １８６． 前記酵素的核酸が少なくとも１つの核酸塩基修飾を含む、請求項１４ ３記載の核酸触媒。 １８７． 前記酵素的核酸が少なくとも１つのホスホロチオエート修飾を含む、 請求項１４３記載の核酸触媒。 １８８． 患者における全身疾患を治療する方法であって、前記患者に、前記疾 患に関連するＲＮＡを特異的に切断する核酸触媒を、前記患者中の前記ＲＮＡが 切断されかつ治療効果が得られる条件下で全身投与する工程を含む方法。 １８９． 前記疾患が、癌、炎症、乾癬、非肝臓性腹水および感染性疾患からな る群より選択される、請求項１８８記載の方法。 １９０． 前記癌の前記治療が、腫瘍転移の減少により特徴づけられる、請求項 １８９記載の方法。 １９１． 前記癌の前記治療が、腫瘍体積の減少により特徴づけられる、請求項 １８９記載の方法。 １９２． 前記癌の前記治療が、原発性腫瘍の進行の減少により特徴づけられる 、請求項１８９記載の方法。 １９３． 前記核酸触媒が化学的に修飾されている、請求項１８８記載の方法。 １９４． 前記核酸触媒がハンマーヘッドモチーフのものである、請求項１８８ 記載の方法。 １９５． 前記ハンマーヘッド核酸触媒が、４位に２’−Ｃ−アリル修飾、４つ の５’−末端位置にホスホロチオエート結合、および前記核酸分子の３’−末端 に反転脱塩基ヌクレオチドを含む、請求項１９４記載の方法。 １９６． 前記全身投与が、前記核酸触媒を前記患者に静脈内投与することによ り行われる、請求項１８８記載の方法。 １９７． 前記全身投与が、前記核酸触媒を前記患者にボーラス投与することに より行われる、請求項１８８記載の方法。 １９８． 前記全身投与が、前記核酸触媒を前記患者に連続的に注入することに より行われる、請求項１８８記載の方法。
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