CN104388429B

CN104388429B - 一种基于小rna干扰原理的新型核酸

Info

Publication number: CN104388429B
Application number: CN201410575778.5A
Authority: CN
Inventors: 段为钢; 侯肖霖
Original assignee: Yunnan University of Traditional Chinese Medicine TCM
Current assignee: Yunnan University of Traditional Chinese Medicine TCM
Priority date: 2014-10-25
Filing date: 2014-10-25
Publication date: 2020-02-21
Anticipated expiration: 2034-10-25
Also published as: CN104388429A

Abstract

一种基于RNA干扰原理的交替核酸双链，其序列的碱基由腺嘌呤A、鸟嘌呤G、胸腺嘧啶T、尿嘧啶U、和胞嘧啶C组成，各碱基通过磷酸核糖和磷酸脱氧核糖交替连接而成。该双链可以形成完全配对或大部分配对，各链的长度为18‑30碱基。第一链的碱基最佳顺序是5`‑GAUUUAGCCAAGAAGUUCAGU‑3`，第二链的最佳碱基顺序是5`‑UGAACUUCUUGGCUAAAUCGC‑3`，能干扰核苷酸还原酶而起到抗肿瘤效应，其中碱基U和T可以替换。

Description

一种基于小RNA干扰原理的新型核酸

技术领域

本发明涉及一种基于RNA干扰原理的新型核酸：交替核酸双链。其序列的碱基由腺嘌呤A、鸟嘌呤G、胸腺嘧啶T、尿嘧啶U、和胞嘧啶C组成，各碱基通过磷酸核糖和磷酸脱氧核糖交替连接而成。

背景技术

小RNA干扰是生物学中常见现象，通过干扰可以在翻译水平降低某些蛋白质的表达水平从而影响生物功能。生物可以通过多种方式产生约21碱基对（bp）的双链小RNA，小RNA通过碱基配对识别特异RNA，然后通过特异机制将识别的RNA进行降解破坏，最终阻止或减少功能蛋白的翻译。

如果以外源方式模拟体内形成的小RNA，也能有目的地破坏细胞内的特异RNA序列从而减少甚至终止其蛋白质翻译，最终实现编码该蛋白基因的功能下调或缺失（沉默），从而可以治疗因某些基因表达上调所致的疾病。

目前实现RNA干扰的策略有两种，一种是构建一种特殊载体（质粒或病毒），感染宿主细胞后能转录出特异的RNA双链，通过该双链RNA实现RNA干扰，从而沉默某个基因功能。另一种方式是通过化学合成方法直接合成特异的双链RNA，通过阳离子脂质体、纳米粒等方式将该双链RNA转化到宿主细胞从而沉默基因功能。

以上第一种方式已广泛用于实验研究，其优点是效率高且经济，转染一次可以实现长效沉默。但该方法很难应用于临床，因为该方法的安全性很难通过。由于转染的是具有微生物性质的载体（病毒和质粒均能在宿主细胞内复制），其所携带的核酸有可能长期存在宿主细胞内甚至整合到基因组。外源核酸长期存在细胞内甚至整合到染色体所带来的长期安全性短时间内很难评估，也不可控。因此，第一种方法一直不能用于临床的原因主要是安全性问题。

以上提及的第二种方法在实验研究中也有所应用，但成本较高。主要原因是RNA不稳定，很难合成，且在存放、应用过程中容易发生降解而失效；即使进入体内，但在进入细胞之前也容易被体内的RNA酶降解。为了保证疗效，可能要使用更高剂量的双链RNA。与第一种方法相比，该方法的生物安全性较低，但成本较高，现在也已经用于临床研究。像国外的Calando Pharmaceuticals, Inc.公司已经合成针对核苷酸还原酶RRM2亚基的RNA干扰序列，已完成临床前研究并进入临床研究。其优化序列是5`-GAUUUAGCCAAGAAGUUCAGU-3`和5`-UGAACUUCUUGGCUAAAUCGC-3`。核苷酸还原酶是合成脱氧核糖核苷酸的关键酶，肿瘤细胞常处于高表达状态，此酶的表达沉默后，导致脱氧核糖核苷酸合成减少甚至无法合成，从而很难合成DNA，导致细胞无法增值，最终产生抗肿瘤作用。

通过外源双链RNA进行RNA干扰实现抗肿瘤的最大优势抗肿瘤的针对性很强。但外源合成双链RNA稳定性较差，成本较高，导致使用该类药物的经济负担很重。本发明试图在保持较好干扰作用的基础上，将双链RNA改变成交替核酸双链，以降低其合成成本，并增加其稳定性。

发明内容

发明一种交替核酸双链，即每条链的碱基A、T、C、G、U按照一定顺序通过磷酸核糖和磷酸脱氧核糖交替连接，其中T和U可以相互替换，各链的长度为18-30碱基。较佳方式是将四种之一的核糖核苷酸（A、U、C或G）和四种之一的脱氧核糖核苷酸（dA、dT、dC或dG）按照一定的顺序形成两条交替核酸链。这两条链能按照碱基互补原理（A:T/U；C:G）形成完全双链或大部分双链以干扰或沉默相应的基因。对于用于沉默人核苷酸还原酶的交替核酸双链来说，第一链较佳序列是5`-dG-A-dT-U-dT-A-dG-C-dC-A-dA-G-dA-A-dG-U-dT-C-dA-G-dT-3`（d表示脱氧）或5`-G-dA-U-dT-U-dA-G-dC-C-dA-A-dG-A-dA-G-dT-U-dC-A-dG-U-3`；第二链的较佳序列是5`-dT-G-dA-A-dC-U-dT-C-dT-U-dG-G-dC-U-dA-A-dA-U-dC-G-dC-3`或5`-U-dG-A-dA-C-dT-U-dC-U-dT-G-dG-C-dT-A-dA-A-dT-C-dG-C-3`。第一链的任意一条和第二链的任意一条可以进行组合形成具有抗肿瘤效应的双链，用于干扰核苷酸还原酶。第一链和第二链的碱基配对示意图参见图1-4。

该发明的优势是，该双链既不是DNA也不是RNA，但能够保证碱基配对。由于各碱基通过磷酸核糖和磷酸脱氧核糖逐一交替连接，这种结构既不能被体内的DNA酶降解，也不能被RNA酶降解，因此在体内的稳定性较高。而且这种核算单元未进行化学修饰，是体内能正常形成的，故推断其自然降解后的安全性较高。

附图说明

图1-4是第一链和第二链的碱基配对四种方式示意图，两条链碱基之间的圆点表示存在碱基配对。

图5是DNA和RNA双链，DNA和交替核酸双链对人肺癌A549细胞的影响作用：18#表示DNA（5`-GATTTAGCCAAGAAGTTCAGT-3`）和RNA（5`-UGAACUUCUUGGCUAAAUCGC-3`）双链对A549细胞的影响；19#表示DNA（5`-GATTTAGCCAAGAAGTTCAGT-3`）和交替核酸（5`-dT-G-dA-A-dC-U-dT-C-dT-U-dG-G-dC-U-dA-A-dA-U-dC-G-dC-3`，d特指脱氧）双链对A549细胞存活的影响。

图6是RNA双链和交替核酸双链对人肺癌A549细胞的影响作用：38#表示RNA双链（5`-GAUUUAGCCAAGAAGUUCAGU-3`和5`-UGAACUUCUUGGCUAAAUCGC-3`）对A549细胞存活的影响；59#表示交替核酸双链（5`-dG-A-dT-U-dT-A-dG-C-dC-A-dA-G-dA-A-dG-U-dT-C-dA-G-dT-3`和5`-dT-G-dA-A-dC-U-dT-C-dT-U-dG-G-dC-U-dA-A-dA-U-dC-G-dC-3`，d特指脱氧）对A549细胞存活的影响。

图7是正常培养48小时后的A549细胞（放大300倍）。

图8是加入6μg/ml双链RNA（5`-GAUUUAGCCAAGAAGUUCAGU-3`和5`-UGAACUUCUUGGCUAAAUCGC-3`）培养48小时后的A549细胞（放大300倍）。

图9是加入6μg/ml交替核酸双链（5`-dG-A-dT-U-dT-A-dG-C-dC-A-dA-G-dA-A-dG-U-dT-C-dA-G-dT-3`和5`-dT-G-dA-A-dC-U-dT-C-dT-U-dG-G-dC-U-dA-A-dA-U-dC-G-dC-3`，d特指脱氧）培养48小时后的A549细胞（放大300倍）。

具体实施方式

实施示例1。

将1mg/ml的单链核酸（DNA：5`-GATTTAGCCAAGAAGTTCAGT-3`、RNA: 5`-GAUUUAGCCAAGAAGUUCAGU-3`和交替核酸dG-A-dT-U-dT-A-dG-C-dC-A-dA-G-dA-A-dG-U-dT-C-dA-G-dT，d特指脱氧）置于80℃热处理，冷却到室温后加入Invitrogen公司生产的脂质体2000进行等体积混合，混合后用无菌三蒸水配制成系列浓度备用。将人肺癌A549细胞用含10%胎牛血清的F12K培养液在37℃、5%二氧化碳条件下进行培养。随后将细胞用0.25%的胰酶消化后用培养液调成1×10⁵浓度，每孔100μl加入到96孔板中，随后每孔加入2μl的系列浓度单链核苷酸使其终浓度为0.91-6000 ng/ml。培养48小时后加入10 μl的CCK-8试液，此时各孔细胞的生长状态与正常培养48小时的A549细胞无异（见图7）。活细胞中的琥珀酸脱氢酶会将浅黄色的CCK-8试液还原成可溶的棕黄色物质，在450 nm处有最大吸收。加入CCK-8试液后再于37℃温孵3小时，在检测波长450nm和参比波长600nm处用多功能酶标仪检测光密度（OD）。OD值越大表明活细胞数越多或细胞生长状态越好。检测结果表明，0.91-6000ng/ml的三条单链核酸对人肺癌A2549细胞均无明显影响，表明这三条单链核酸无抗肿瘤作用。

实施示例2。

将1mg/ml的DNA、RNA双链核酸（DNA：5`-GATTTAGCCAAGAAGTTCAGT-3`；RNA: 5`-UGAACUUCUUGGCUAAAUCGC-3`）和DNA、交替核酸双链（DNA：5`-GATTTAGCCAAGAAGTTCAGT-3`；交替核酸5`-dT-G-dA-A-dC-U-dT-C-dT-U-dG-G-dC-U-dA-A-dA-U-dC-G-dC-3`）置于80℃变性处理，冷却到室温复性后加入Invitrogen公司生产的脂质体2000进行等体积混合，混合后用无菌三蒸水配制成系列浓度备用。将人肺癌A549细胞用含10%胎牛血清的F12K培养液在37℃、5%二氧化碳条件下进行培养。随后将细胞用0.25%的胰酶消化后用培养液调成1×10⁵浓度，每孔100μl加入到96孔板中，随后每孔加入2μl的系列浓度双链核苷酸使其终浓度为0.91-6000 ng/ml。培养48小时后加入10 μl的CCK-8试液，此时各孔细胞的生长状态与正常培养48小时的A549细胞无异（见图7）。活细胞中的琥珀酸脱氢酶会将浅黄色的CCK-8试液还原成可溶的棕黄色物质，在450 nm处有最大吸收。加入CCK-8试液后再于37℃温孵3小时，在检测波长450nm和参比波长600nm处用多功能酶标仪检测光密度（OD）。OD值越大表明活细胞数越多或细胞生长状态越好。检测结果表明，0.91-6000 ng/ml的两条双链核酸对人肺癌A2549细胞均无明显影响，结果参见图5。表明这两条双链核酸无抗肿瘤作用。

实施示例3。

将1mg/ml的RNA双链核酸（RNA：5`- GAUUUAGCCAAGAAGUUCAGU-3`；RNA: 5`-UGAACUUCUUGGCUAAAUCGC-3`）和交替核酸双链（5`- dG-A-dT-U-dT-A-dG-C-dC-A-dA-G-dA-A-dG-U-dT-C-dA-G-dT-3`；5`-dT-G-dA-A-dC-U-dT-C-dT-U-dG-G-dC-U-dA-A-dA-U-dC-G-dC-3`）置于80℃变性处理，冷却到室温复性后加入Invitrogen公司生产的脂质体2000进行等体积混合，混合后用无菌三蒸水配制成系列浓度备用。将人肺癌A549细胞用含10%胎牛血清的F12K培养液在37℃、5%二氧化碳条件下进行培养。随后将细胞用0.25%的胰酶消化后用培养液调成1×10⁵浓度，每孔100μl加入到96孔板中，随后每孔加入2μl的系列浓度双链核苷酸使其终浓度为0.91-6000 ng/ml。培养48小时后加入10 μl的CCK-8试液，RNA双链和交替核酸双链均出现浓度依赖性的抑制作用，其中以6μg/ml的双链核酸作用最强，RNA双链和交替核酸双链的典型抑制效果分别参见图8和图9。活细胞中的琥珀酸脱氢酶会将浅黄色的CCK-8试液还原成可溶的棕黄色物质，在450 nm处有最大吸收。加入CCK-8试液后再于37℃温孵3小时，在检测波长450nm和参比波长600nm处用多功能酶标仪检测光密度（OD）。OD值越大表明活细胞数越多或细胞生长状态越好。检测结果表明，0.91-6000 ng/ml的两条双链核酸对人肺癌A2549细胞能产生剂量依赖性的抑制作用，6000ng/ml的抑制率在50%左右，且这两条双链的抑制强度基本相当，结果参见图6。表明本发明的交替核酸双链与双链RNA有同等的抗肿瘤作用。

本发明干扰人核苷酸还原酶所用的交替核酸第一链序列为：

5`-dG-A-dT-U-dT-A-dG-C-dC-A-dA-G-dA-A-dG-U-dT-C-dA-G-dT-3`或

5`-G-dA-U-dT-U-dA-G-dC-C-dA-A-dG-A-dA-G-dT-U-dC-A-dG-U-3`（d表示脱氧）；

本发明干扰人核苷酸还原酶所用的交替核酸第二链序列为：

5`-dT-G-dA-A-dC-U-dT-C-dT-U-dG-G-dC-U-dA-A-dA-U-dC-G-dC-3`或

5`-U-dG-A-dA-C-dT-U-dC-U-dT-G-dG-C-dT-A-dA-A-dT-C-dG-C-3`（d表示脱氧）。

Claims

1.一种基于小RNA干扰原理的核酸，其特征在于所述核酸为交替核酸双链，其序列的碱基由腺嘌呤A、鸟嘌呤G、胸腺嘧啶T、尿嘧啶U、和胞嘧啶C 组成，各碱基通过磷酸核糖和磷酸脱氧核糖交替连接而成；

第一链的碱基顺序是5`-GAUUUAGCCAAGAAGUUCAGU-3`，第二链的碱基顺序是5`-UGAACUUCUUGGCUAAAUCGC-3`，能干扰核苷酸还原酶而具有抗肿瘤效应；

所述第一链和第二链的碱基顺序，其中碱基U和T可以相互替换。