CN101011575A

CN101011575A - 预防和治疗动脉粥样硬化病的rna干扰药物

Info

Publication number: CN101011575A
Application number: CN 200610025485
Authority: CN
Inventors: 王长谦; 何清; 吕宝经
Original assignee: XinHua Hospital Affiliated To Shanghai JiaoTong University School of Medicine
Current assignee: XinHua Hospital Affiliated To Shanghai JiaoTong University School of Medicine
Priority date: 2006-04-06
Filing date: 2006-04-06
Publication date: 2007-08-08
Anticipated expiration: 2026-04-06
Also published as: CN101011575B

Abstract

本发明公开了一种预防和治疗动脉粥样硬化病的药物，该药物含有适于通过RNA干扰抑制胞外基质金属蛋白酶诱导因子(EMMPRIN)基因表达的双链核糖核酸(dsRNA)，所述药物中的dsRNA能有效抑制单核/巨噬细胞中EMMPRIN基因的表达，为动脉粥样硬化病的治疗及急性冠脉事件的防治提供新的治疗靶点和有效新药。

Description

预防和治疗动脉粥样硬化病的RNA干扰药物

技术领域

本发明涉及预防和治疗动脉粥样硬化病的药物，尤其涉及一种治疗动脉粥样硬化病的RNA干扰药物。

背景技术

动脉粥样硬化及其所致冠状动脉粥样硬化性心脏病(冠心病)是心血管最常见疾病，是人类致死的主要原因。近年研究表明，动脉粥样硬化斑块的稳定性很重要。不稳定冠状动脉粥样硬化斑块易发生破裂或破溃，表面血栓形成，是造成急性冠脉综合征(acute coronary syndromes，ACS，包括不稳定性心绞痛、急性心肌梗死、猝死)的主要机制，而急性冠脉综合征则是冠心病致死致残的主要原因。不稳定动脉粥样硬化斑块相对稳定斑块而言有以下特点：第一，斑块内部含有较大的脂质核心(≥40％斑块体积)；第二，斑块的纤维帽较薄；第三，斑块内有较多单核/巨噬细胞浸润。研究表明，存在于粥样硬化斑块局部的基质金属蛋白酶类(Matrix metalloproteinase，MMPs)与动脉粥样硬化斑块的稳定性密切相关。因此，抑制MMPs的表达和活性，稳定动脉粥样硬化斑块，很可能是防治ACS的一种有效途径。MMPs是一个内源性锌依赖性酶家族，可降解多糖以外的所有细胞外基质成分，在转录水平，多种炎症因子如IL-6、TNF-α可诱导MMPs表达，基质金属蛋白酶诱导因子(extracel lular matrixmetalloproteinase inducer，EMMPRIN)也具有诱导MMPs表达的作用。

EMMPRIN属于免疫球蛋白超家族，是高度糖基化的跨膜蛋白质，首次在人类肿瘤细胞表面被发现，接着又在人单核细胞表面被发现，而且在单核细胞向巨噬细胞转化过程中，GM-CSF的刺激使EMMPRIN基因表达增加5～8倍；另一方面，在人类动脉粥样硬化斑块中巨噬细胞富集区EMMPRIN基因的表达也显著增加，且其表达量的增加与局部MMP-9活性的增强一致，提示EMMPRIN可能通过调节斑块局部MMPs的分泌和活性，进而影响动脉粥样硬化斑块的稳定性。在富含单核细胞源性巨噬细胞的不稳定斑块中，巨噬细胞表达的大量EMMPRIN，刺激周围细胞表达更多的MMPs，从而降低斑块稳定性，且增加斑块破裂及其所致急性冠脉事件的发生概率。

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是新近发展起来的一种封闭基因表达的有效方法。它采用与目的基因同源的短片段双链干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)转染至靶细胞，siRNA双螺旋解开双链产生的单链siRNA结合到RNA诱导的基因沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)中，形成RISC复合物，RISC以siRNA为模板特异地识别其同源基因mRNA并对其进行递进式剪切，形成强有效的瀑布效应，诱导序列特异性的mRNA降解，细胞表现特定基因的缺陷表型。该策略可以将动脉粥样硬化病相关的基因关闭，而仅有一个碱基突变则丧失RNA干扰作用，对正常细胞影响甚微，特异性强。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种预防和治疗动脉粥样硬化病的RNA干扰药物，通过RNA干扰技术，针对EMMPRIN的mRNA序列构建的siRNA，能有效抑制单核/巨噬细胞中EMMPRIN基因的蛋白表达。

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：

预防和治疗动脉粥样硬化病的药物，该药物含有适于通过RNA干扰抑制胞外基质金属蛋白酶诱导因子(EMMPRIN)基因表达的双链核糖核酸(dsRNA)。

优选的，dsRNA的S1链显示出一个能至少部分地与少于25个连续核苷酸构成的EMMPRIN基因互补的的区域。

dsRNA的互补区域可按照递升的优选顺序，具有19～24个，20～23个，20或21个核苷酸，且特别优选具有20或21个核苷酸，拥有此结构的dsRNA在抑制EMMPRIN基因时尤其有效。dsRNA的S1链可按照递升的优选顺序，具有少于30个，少于25个，19～23个，特别优选21个核苷酸。

当dsRNA的至少一个末端具有一个由1～4个，特别是2或3个核苷酸构成的单链突出端时是非常有利的。除S1链外，dsRNA优选地还具有S2链，当本发明的dsRNA的S1链和S2链都具有21个核苷酸，且该两条链的3’末端都具有一个由2个核苷酸组成的单链突出端时，包含该dsRNA的药物是特别有效的。S1链可与基因的初级或加工的RNA转录本互补。最佳地，本发明的dsRNA由具有SEQID NO.1序列的S1链和具有SEQ ID NO.2序列的S2链构成，或由具有SEQ ID NO.3序列的S1链和具有SEQID NO.4序列的S2链构成，或由具有SEQ ID NO.5序列的S1链和具有SEQ ID NO.6序列的S2链构成。

本发明的药物施用方式可以是口服、全身施用(例如，透过皮肤、鼻吸入或者用栓剂)或肠胃外施用(例如，肌肉内、静脉内或皮下)。

本发明的药物也可被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物，可通过常规方法进行制备。针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。此外，本发明的预防和治疗动脉粥样硬化病的药物还可与其他治疗剂一起使用。

本发明的预防和治疗动脉粥样硬化病的RNA干扰药物能有效抑制单核/巨噬细胞中EMMPRIN基因的表达，且在巨噬源性泡沫细胞中EMMPRIN表达被抑制后细胞内MMP-9的蛋白表达明显减少，这些实验证据为动脉粥样硬化病的治疗及急性冠脉事件的防治提供新的治疗靶点和有效新药。

附图说明

图1是本发明的EMMPRIN-siRNA电转染人单核细胞THP-1细胞株24h后10倍光镜下观察转染效率图；

图2是本发明的EMMPRIN-siRNA电转染人单核细胞THP-1细胞株24h后10倍荧光显微镜下观察转染效率图；

图3是Real-time PCR检测本发明的EMMPRIN-siRNA抑制THP-1细胞中EMMPRIN基因表达柱状图；

图4是Western Blot检测本发明的EMMPRIN-siRNA抑制THP-1细胞中EMMPRIN蛋白的Western Blot结果图；

图5是图4的柱状统计图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进-步详细的说明。

实施例1 细胞培养和电转染

针对EMMPRIN基因mRNA的siRNA的设计合成过程是，在GenBank中查出人源EMMPRIN mRNA的序列(NM_001728、NM_198589、NM_198590、NM_198591)，分析其共同编码区序列，由Ambion公司在线siRNA设计并化学合成三对siRNA序列，分别是siRNA-A、siRNA-B、siRNA-C，siRNA-A由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2序列构成，siRNA-B由SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4序列构成，siRNA-C由SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6序列构成。另设随机序列作为阴性对照(对照-siRNA)。

THP-1人单核细胞株(购自中科院上海细胞所)，采用含10％小牛血清(PAA，Labs，奥地利)，2％Hepes，1％双抗的RPMI 1640培养基(PAA，Labs，奥地利)培养，调整细胞数至1×10⁶/ml，按照Ambion公司电转染protocol(siPORT^TM siRNAElectroporation Kit)将siRNA-A，siRNA-B，siRNA-C及对照-siRNA电转染至THP-1单核细胞，转染后的细胞移入60mm培养皿，加入无双抗含10％小牛血清RPMI 1640培养基继续培养，24小时后分别于10倍光镜(图1)和10倍荧光显微镜(图2)下观察转染效率，结果显示转染效率高达90％以上。

实施例2 mRNA水平检测RNAi对EMMPRIN基因表达的影响

采用实时定量(Real time)PCR进行检测，具体步骤如下：

1)siRNA转染THP-1细胞24小时后，TRIzol法抽提总RNA。抽提时，培养细胞吸到离心管内600gx5min离心，PBS吹洗一次，再600gx5min离心，加1ml TRIzol(购自Invitrogen公司)，在旋涡震荡器上混匀。再加入大约1/5体积的氯仿，上下颠倒充分混匀30秒左右，室温下静置3分钟。然后，4℃，12000g离心15分钟后小心将上清液转入新的1.5ml离心管，加入等体积的异丙醇，轻轻颠倒混匀，室温静置10分钟。再4℃，12000g离心10分钟后，去上清，向沉淀中加入2/5体积的70％乙醇，4℃，7500g离心5分钟。去上清，沉淀室温晾干后加入适量无RNA酶的水充分溶解，测定A260和A280值。

2)取总RNA 1μg，加入20μL逆转录反应体系，用Omniscript逆转录试剂盒(Qiagen公司)进行逆转录反应，所有操作在冰浴下进行，待彻底混合后，37℃孵育60分钟，4℃终止反应。

3)根据Oligo引物软件合成人EMMPRIN、PBGD(胆色素原脱氨酶)寡核苷酸引物，由北京奥科生物技术公司合成，EMMPRIN引物扩增产物为164bp，PBGD引物扩增产物为200bp。

EMMPRIN(F)：上游引物为5’-tcc tgg gca tcg tgg ct -3’(SEQ ID NO：7)；

EMMPRIN(R)：下游引物为5’-cct ctg gcg gac gtt ctt -3’(SEQ ID NO：8)。

PBGD(F)：5’-atc gtg cgt gac att aag g -3’(SEQ ID NO：9)；

PBGD(R)：5’-aca gga ctc cat gcc cag g -3’(SEQ ID NO：10)。

使用TAKARA公司SYBRPremix Ex Taq^TM(Perfect Real Time)Kit进行Real-timePCR，以PBGD作内对照，反应混合物中各成分为：PBGD(F)、PBGD(R)、EMMPRIN(F)、EMMPRIN(R)、SYBRPremix Ex Taq^TM(2×Conc.)、ROX Reference Dye(50×Conc.)和1μLcDNA模板稀释液，最后补充ddH₂O使反应体系为10μL。10μl反应体系包括：

冰浴条件下操作，彻底混合后放入ABI Prism^7900HT型荧光定量PCR仪，反应程序如下：(1)50℃2min，(2)95℃10min，(3)95℃15s，60℃60s，40个循环，(4)95℃15s，60℃15s，95℃15s。反应结束后确认Real Time PCR的扩增曲线和融解曲线，以目的基因与PBGD拷贝数比值做相对定量分析进行。

4)Real-time PCR结果显示，THP-1细胞经siRNA转染24小时后，三条siRNA与对照-siRNA相比，EMMPRIN mRNA表达均被抑制大于70％(图3)，在图中，“*”指P＜0.01，统计数据见下表，所有数据是每个实验重复3次取的均值，用均数±标准差表示，并用SIGMAPLOT统计软件对数据进行单因素方差分析(ANOVA)、t检验(t-test)处理，其中，P＜0.05为有显著性差异，P＜0.01为有高度显著性差异。

	ctrl-siRNA	siRNA-A	siRNA-B	siRNA-C
	ctrl-siRNA	siRNA-A	siRNA-B	siRNA-C	EMMPRIN拷贝数/PBGD拷贝数	1.00±0	0.19432±0.055757	0.15216±0.04391	0.19731±0.04143

实施例3 蛋白质水平检测RNAi对EMMPRIN基因表达的影响

THP-1细胞转染siRNA后培养至72小时提取总蛋白，再采用Western Blot进行检测，具体步骤是：用4℃预冷裂解液裂解细胞，蛋白浓度用BCA法测定，取30ug总蛋白样品与上样缓冲液变性后经10％SDS-PAGE行垂直电泳，室温200V×60min，4℃100V×120min转膜，5％牛奶封闭，室温1h，结合一抗(兔抗人EMMPRIN单克隆抗体，购自Zymed公司，用封闭液1∶1000稀释)，温和振荡4℃过夜，结合二抗(驴抗兔多克隆抗体，购自Amersham公司，用封闭液1∶4000稀释)，室温1h。感光、洗片，蛋白条带扫描后进行光密度分析，图4为Western Blot结果图，其中，β-actin为对照内参，EMMPRIN蛋白的分子量大小约为50～70KD，光密度分析的数据是由每个实验重复3次取得的均值，并用均数±标准差表示，且用SIGMAPLOT统计软件进行单因素方差分析(ANOVA)、t检验( t-test)处理，P＜0.05为有显著性差异，P＜0.01为有高度显著性差异。Western Blot结果经统计分析得：与对照-siRNA相比，siRNA-A的P值大于0.05，没有显著性差异，而siRNA-B和siRNA-C都是P＜0.05(见图5)，说明siRNA-B和siRNA-C能有效抑制THP-1细胞中EMMPRIN蛋白表达，尤其是siRNA-B，它的抑制效果最显著。在图5中，“*”指P＜0.05，“**”指P＜0.01。

序列表

<110>上海交通大学医学院附属新华医院

<120>预防和治疗动脉粥样硬化病的RNA干扰药物

<130>NP-10421

<160>10

<210>1

<211>21

<212>RNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>1

gccaaugcug ucugguugct t 21

<210>2

<211>21

<212>RNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>2

gcaaccagac agcauuggct t 21

<210>3

<211>21

<212>RNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>3

gguucuucgu gaguuccuct t 21

<210>4

<211>21

<212>RNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>4

gaggaacuca cgaagaacct g 21

<210>5

<211>21

<212>RNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>5

agccaaugcu gucugguugt t 21

<210>6

<211>21

<212>RNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>6

caaccagaca gcauuggcut c 21

<210>7

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc feature

<223>引物

<400>7

tcc tgg gca tcg tgg ct 17

<210>8

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>8

cct ctg gcg gac gtt ctt g 19

<210>9

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc feature

<223>引物

<400>9

atc gtg cgt gac att aag g 19

<210>10

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>10

aca gga ctc cat gcc cag g 19

Claims

1.预防和治疗动脉粥样硬化病的药物，其特征在于，该药物含有适于通过RNA干扰抑制胞外基质金属蛋白酶诱导因子(EMMPRIN)基因表达的双链核糖核酸(dsRNA)。

2.如权利要求1所述的药物，其特征在于，所述dsRNA的S1链具有一个能至少部分地与所述EMMPRIN基因互补的少于25个连续核苷酸的区域。

3.如权利要求2所述的药物，其特征在于，所述的互补区域具有19～24个，优选20～23个，特别是20或21个核苷酸。

4.如权利要求2或3所述的药物，其特征在于，所述的S1链具有少于30个，优选少于25个，尤其优选19～23个，特别是21个核苷酸。

5.如权利要求1所述的药物，其特征在于，所述dsRNA除S1链外，还具有S2链。

6.如权利要求1所述的药物，其特征在于，所述dsRNA的至少一个末端具有一个由1～4个，特别是2或3个核苷酸构成的单链突出端。

7.如权利要求2至6中任一项所述的药物，其特征在于，所述dsRNA的S1链和S2链都具有21个核苷酸，且该两条链的3’末端都具有一个由2个核苷酸组成的单链突出端。

8.如权利要求2至7中任一项所述的药物，其特征在于，所述S1链与基因的初级或加工的RNA转录本互补。

9.如权利要求1至8中任一项所述的药物，其特征在于，所述dsRNA由具有SEQID NO.1序列的S1链和具有SEQ ID NO.2序列的S2链构成，或由具有SEQ ID NO.3序列的S1链和具有SEQ ID NO.4序列的S2链构成，或由具有SEQ ID NO.5序列的S1链和具有SEQ ID NO.6序列的S2链构成。