JP2023011959A - 医薬組成物 - Google Patents

Abstract

【課題】ブロモドメインタンパク質（ＢＲＤ４）遺伝子の発現を抑制し、腫瘍の処置に用いることができる医薬組成物を提供する。【解決手段】医薬組成物は、ｍｉＲ－１２９３、ｍｉＲ－８７６－３ｐ、ｍｉＲ－４４３８、ｍｉＲ－６７５１、ｍｉＲ－６３４及びｍｉＲ－９２ａ－２－５ｐからなる群から選択されるマイクロＲＮＡをコードする遺伝子の転写産物又はそのプロセッシング産物と同一の塩基配列、又はその塩基配列において１から５塩基が置換、欠損又は付加された塩基配列を有するポリヌクレオチドを含み、腫瘍の処置に用いられる。【選択図】図２－１

Description

本発明は、医薬組成物に関する。

日本人の死因の第一位はがんであり、国立がんセンターの統計（２０１２年）によると生涯においてがんに罹患する確率は日本人男性６３％、女性４７％と高い。また厚生労働省の統計（２０１５年）によると、日本人の死亡原因に占めるがんの割合は、男性３２％、女性２４％、全人口の約３分の１ががんで亡くなっている。がんによる死亡は増加し続け、２０３０年には世界で年間１１４０万人ががんで死亡すると予測されている。

２００３年に終了したヒトゲノム計画により、遺伝子レベル、タンパク質分子レベルでがんを理解し、それを診断及び治療に応用しようとする動きは加速し、その結果、がんの診断及び治療の進歩は目覚ましい。特に、治療面では、従来の抗がん剤とは異なる機序として、がん細胞において活性化している遺伝子やタンパク質を標的としたいわゆる分子標的治療薬の進歩、開発も進んでいる。診断時にがんで活性化している分子を同定することでこのような分子標的治療薬が臨床応用されている。

上記に関連して、例えば、特許文献１にはブロモドメインタンパク質（ＢＲＤ４）とがんとの関係に着目し、特定のマイクロＲＮＡを含み、腫瘍の処置に用いられる医薬組成物が提案されている。

国際公開第２０１９／１０７４８７号

本発明は、ブロモドメインタンパク質（ＢＲＤ４）遺伝子の発現を抑制し、腫瘍の処置に用いることができる医薬組成物を提供することを目的とする。

前記課題を解決するための具体的手段は以下の通りであり、本発明は以下の態様を包含する。第一態様は、ｍｉＲ－１２９３、ｍｉＲ－８７６－３ｐ、ｍｉＲ－４４３８、ｍｉＲ－６７５１、ｍｉＲ－６３４及びｍｉＲ－９２ａ－２－５ｐからなる群から選択されるマイクロＲＮＡをコードする遺伝子の転写産物又はそのプロセッシング産物と同一の塩基配列、又はその塩基配列において１から５塩基が置換、欠損又は付加された塩基配列を有するポリヌクレオチドを含み、腫瘍の処置に用いられる医薬組成物である。第二態様は、前記医薬組成物を対象に投与することを含む腫瘍の処置方法である。

本発明によれば、ＢＲＤ４遺伝子の発現を抑制し、腫瘍の処置に用いることができる医薬組成物を提供することができる。

大腸がん細胞株を用いた抗腫瘍性マイクロＲＮＡの１次スクリーニング結果を示す図である。 がん細胞株におけるＢＲＤ４の発現抑制を示すウエスタンブロットの結果を示す図である。 ＢＲＤ４遺伝子の３'ＵＴＲ領域を組み込んだコンストラクトを用いたルシフェラーゼレポーターアッセイの結果を示す図である。 大腸がん細胞株に対してｓｉＲＮＡを用いて、ＢＲＤ４遺伝子をノックダウンした場合の細胞増殖に対する影響を示す図である。 がん細胞株に対して、ｍｉＲ－８７６－３ｐあるいはｍｉＲ－１２９３を導入した場合における細胞増殖曲線を示した図である。 大腸がん細胞株に対して、ｍｉＲ－８７６－３ｐあるいはｍｉＲ－１２９３を導入した場合における細胞の状態を示した図である。 がん細胞株に対して、ｍｉＲ－８７６－３ｐあるいはｍｉＲ－１２９３を導入した場合におけるアポトーシスの割合を示す図である。 がん細胞株に対して、ｍｉＲ－８７６－３ｐあるいはｍｉＲ－１２９３を導入した場合におけるアポトーシスマーカーの発現状態を示すウエスタンブロットである。 ｍｉＲ－８７６－３ｐをがん細胞株に導入した後に行った発現アレイ解析において発現が１．５倍以上低下した遺伝子数を示すベン図である。 ｍｉＲ－８７６－３ｐを導入した口腔がん細胞株における、ＲＳＫ１遺伝子、ｐ－ｐ７０Ｓ６Ｋ及びｐＳ６の発現状態を示すウエスタンブロットの結果を示す図である。 ＲＳＫ１遺伝子の３'ＵＴＲ領域を組み込んだコンストラクトを用いたｍｉＲ－８７６－３ｐのルシフェラーゼレポーターアッセイの結果を示す図である。 口腔がん細胞株に対してｓｉＲＮＡを用いて、ＲＳＫ１遺伝子及びＢＲＤ４遺伝子をノックダウンした場合の細胞増殖に対する影響を示す図である。 ｍｉＲ－８７６－３ｐによる腫瘍増殖抑制の推定機序を示す概念図である。 ｍｉＲ－１２９３をがん細胞株に導入した後に行った発現アレイ解析において発現が１．５倍以上低下した遺伝子数を示すベン図である。 ｍｉＲ－１２９３を導入したがん細胞株における、ＡＰＥＸ１遺伝子、ＲＰＡ１遺伝子、ＰＯＬＤ４遺伝子の発現状態を示すウエスタンブロットの結果を示す図である。 ＡＰＥＸ１遺伝子、ＲＰＡ１遺伝子又はＰＯＬＤ４遺伝子の３'ＵＴＲ領域を組み込んだコンストラクトを用いたｍｉＲ－１２９３のルシフェラーゼレポーターアッセイの結果を示す図である。 大腸癌がん細胞株に対してｓｉＲＮＡを用いて、ＡＰＥＸ１遺伝子、ＰＲＡ１遺伝子、ＰＯＬＤ４遺伝子をノックダウンした場合の細胞増殖に対する影響を示す図である。 ｍｉＲ－１２９３を導入したがん細胞株に対してＮＣＳを加えた後のＤＮＡ修復に対する影響を示す免疫蛍光染色の図である。 ｍｉＲ－１２９３を導入したがん細胞株に対してＮＣＳを加えた後のＤＮＡ修復に対する影響を示す図である。 ｍｉＲ－１２９３又はＢＲＤ４に対するｓｉＲＮＡを導入した大腸がん細胞株における相同組み換え修復を評価した結果を示す図である。 ｍｉＲ－１２９３による腫瘍増殖抑制の推定機序を示す概念図である。 マウスを用いたｉｎ ｖｉｖｏ試験におけるｍｉＲ－８７６－３ｐあるいはｍｉＲ－１２９３の投与スケジュールを示した図である。 大腸がん細胞株の皮下注射から１９日後のマウスの皮下腫瘍の外観及び摘出された腫瘍を示した図である。 上記ｉｎ ｖｉｖｏ試験における、摘出された腫瘍の体積の測定結果を示す図である。 上記ｉｎ ｖｉｖｏ試験における、摘出された腫瘍の重量の測定結果を示す図である。 上記ｉｎ ｖｉｖｏ試験において摘出された腫瘍における、ｍｉＲ－８７６－３ｐ及びｍｉＲ－１２９３の発現解析の結果を示す図である。 上記ｉｎ ｖｉｖｏ試験において摘出された腫瘍におけるＢＲＤ４遺伝子の発現状態を免疫染色により示した図である。 上記ｉｎ ｖｉｖｏ試験において摘出された腫瘍におけるＲＳＫ１遺伝子の発現状態を免疫染色により示した図である。 上記ｉｎ ｖｉｖｏ試験において摘出された腫瘍におけるＡＰＥＸ１遺伝子、ＲＰＡ１遺伝子、ＰＯＬＤ４遺伝子の発現状態を免疫染色により示した図である。

本明細書において組成物中の各成分の含有量は、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。また、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）には、リボヌクレオチドからなるポリヌクレオチド（オリゴヌクレオチド）に加えて、リボヌクレオチドと修飾ヌクレオチドとからなるポリヌクレオチド（オリゴヌクレオチド）が含まれる。更にマイクロＲＮＡは１本鎖であっても、２本鎖であってもよい。以下、本発明の実施形態を詳細に説明する。ただし、以下に示す実施形態は、本発明の技術思想を具体化するための、医薬組成物を例示するものであって、本発明は、以下に示す医薬組成物に限定されない。

医薬組成物
医薬組成物は、ｍｉＲ－１２９３、ｍｉＲ－８７６－３ｐ、ｍｉＲ－４４３８、ｍｉＲ－６７５１、ｍｉＲ－６３４及びｍｉＲ－９２ａ－２－５ｐからなる群から選択されるマイクロＲＮＡ（以下、併せて特定マイクロＲＮＡともいう）をコードする遺伝子の転写産物又はそのプロセッシング産物と同一の塩基配列を有するポリヌクレオチド、又はその塩基配列において１から５塩基が置換、欠損又は付加された塩基配列を有するポリヌクレオチド（以下、併せて特定マイクロＲＮＡに由来するポリヌクレオチドともいう）を含み、腫瘍の処置に用いられる。医薬組成物はＢＲＤ４遺伝子の発現抑制剤であってよい。

特定マイクロＲＮＡに由来するポリヌクレオチドは、ＢＲＤ４遺伝子の発現を抑制することができる。これにより、腫瘍細胞における過剰な転写活性を抑制し、抗腫瘍性を示すことができる。ＢＲＤ４は、アセチル化修飾されたリジンに結合するブロモドメインを２つ有し、Ｃ末端側にはｐ－ＴＥＦｂ（positive transcription elongation factor b）と結合する領域を有しているタンパク質である。ヒストンのアセチル化修飾は転写活性と正の相関を認め、ｐ－ＴＥＦｂは転写を行うＲＮＡポリメラーゼIIを抑制するタンパク質を不活性化することで転写を活性化する。ＢＲＤ４はアセチル化修飾されたヒストンのリジンに結合することで、そこにｐ－ＴＥＦｂを動員し、転写を促進する働きがあるとされている。血液腫瘍がん、膵がん、乳がんを含む多くのがん種において、ＢＲＤ４遺伝子の発現の異常な活性化が腫瘍細胞の増殖に寄与すると考えられている。したがって、ＢＲＤ４遺伝子の発現を抑制することが、がん治療において有効である可能性がある。

マイクロＲＮＡは標的転写産物（ｍＲＮＡ）のコーディング（ＣＤＳ）領域あるいは３'非翻訳領域（３'ＵＴＲ）への結合を通じて、その翻訳あるいは安定化を妨害することにより遺伝子発現を抑制する、内因性の小分子のノンコーディングＲＮＡである。１つのｍＲＮＡは複数のマイクロＲＮＡによって標的にされる一方、１つのマイクロＲＮＡは複数のｍＲＮＡを標的にすることができる。複数の発がん経路に寄与する複数の遺伝子を標的にすることができるマイクロＲＮＡの投与は、がん治療において効果的であると考えられる。

ｍｉＲ－１２９３、ｍｉＲ－８７６－３ｐ、ｍｉＲ－４４３８、ｍｉＲ－６７５１、ｍｉＲ－６３４及びｍｉＲ－９２ａ－２－５ｐは、ＢＲＤ４遺伝子の発現を抑制してＢＲＤ４遺伝子の発現が認められる腫瘍細胞に対する優れた増殖抑制効果を有する。さらに少なくともｍｉＲ－８７６－３ｐは、ＲＳＫ１遺伝子の発現を抑制し、ＲＳＫ１遺伝子を発現が認められる腫瘍細胞に対して優れた増殖抑制効果を有する。また少なくともｍｉＲ－１２９３は、ＡＰＥＸ１、ＲＰＡ１及びＰＯＬＤ４からなる群から選択される少なくとも１種の発現が認められる腫瘍細胞に対して優れた増殖抑制効果を有する。特定マイクロＲＮＡが、ＢＲＤ４遺伝子のみならず、他の腫瘍関連遺伝子の発現を抑制することで腫瘍細胞に対してより優れた抑制効果を示すことができる。

医薬組成物が含むポリヌクレオチドは、ｍｉＲ－１２９３、ｍｉＲ－８７６－３ｐ、ｍｉＲ－４４３８、ｍｉＲ－６７５１、ｍｉＲ－６３４及びｍｉＲ－９２ａ－２－５ｐからなる群から選択されるマイクロＲＮＡをコードする遺伝子の転写産物又はそのプロセッシング産物と同一の塩基配列を有していてよい。マイクロＲＮＡをコードする遺伝子の一次転写産物は初期転写産物（ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ）と呼ばれ、一般にステムループのヘアピン構造を有する。ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡはＲＮａｓｅＩＩＩ様のＤｒｏｓｈａと呼ばれる酵素によってステムループ構造をもつ成熟したｍｉＲＮＡの前駆体（ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ）に変換される。ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは細胞核の外に輸送され、Ｄｉｃｅｒと呼ばれる酵素のスプライシングによって、２０から２５塩基長の２本鎖の成熟ｍｉＲＮＡとなる。したがって、マイクロＲＮＡをコードする遺伝子の転写産物又はそのプロセッシング産物は、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ及び成熟ｍｉＲＮＡを包含する。なお、２本鎖の成熟ｍｉＲＮＡにおいては、一方の鎖のみが所望の効果を奏する場合、それぞれの鎖が所望の効果を奏する場合、及び２本鎖の状態で所望の効果を奏する場合の３態様がある。したがって、本明細書におけるｍｉＲＮＡに由来するポリヌクレオチドは、１本鎖及び２本鎖のいずれであってもよく、好ましくは２本鎖である。

また、医薬組成物が含むポリヌクレオチドは、ｍｉＲ－１２９３、ｍｉＲ－８７６－３ｐ、ｍｉＲ－４４３８、ｍｉＲ－６７５１、ｍｉＲ－６３４及びｍｉＲ－９２ａ－２－５ｐからなる群から選択されるマイクロＲＮＡをコードする遺伝子の転写産物又はそのプロセッシング産物の機能を保持する変異体と同一の塩基配列を有していてもよい。変異体は、マイクロＲＮＡをコードする遺伝子の転写産物又はそのプロセッシング産物の塩基配列において１から５塩基が置換、欠損又は付加された塩基配列を有していてもよい。置換、欠損又は付加される塩基数は、好ましくは１から３であってよく、１又は２であってよい。また、変異体は元の塩基配列に対して、例えば８０％以上、好ましくは８５％以上、９０％以上又は９５％以上の配列相同性を有していてよい。配列相同性は、例えばＢＬＡＳＴを用いて算出される。

ここで、特定マイクロＲＮＡが１本鎖である場合、ｍｉＲ－１２９３は、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９３であってよく、配列番号１の塩基配列を有していてよい。ｍｉＲ－８７６－３ｐは、ｈｓａ－ｍｉＲ－８７６－３ｐであってよく、配列番号２の塩基配列を有していてよい。ｍｉＲ－４４３８は、ｈｓａ－ｍｉＲ－４４３８であってよく、配列番号３の塩基配列を有していてよい。ｍｉＲ－６７５１は、ｈｓａ－ｍｉＲ－６７５１であってよく、ｈｓａ－ｍｉＲ－６７５１－５ｐであってよく、配列番号４の塩基配列を有していてよい。ｍｉＲ－６３４は、ｈｓａ－ｍｉＲ－６３４であってよく、配列番号５の塩基配列を有していてよい。ｍｉＲ－９２ａ－２－５ｐは、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ－２－５ｐであってよく、配列番号６の塩基配列を有していてよい。

医薬組成物は、ポリヌクレオチドを１本鎖として含んでいてもよく、２本鎖として含んでいてもよい。ポリヌクレオチドを２本鎖として含む場合、少なくとも部分的に２本鎖を形成していればよく、２本鎖の末端の少なくとも一方に１本鎖部分を有していてもよく、２本鎖部分に少なくとも１対のミスマッチ塩基対又は塩基欠損を有していてもよい。２本鎖の末端に１本鎖部分を有する場合、１本鎖部分を少なくとも３’側に有することが好ましい。また、１本鎖部分その鎖長は、例えば、２残基以上２０残基以下、好ましくは２残基以上１２残基以下、又は２残基以上５残基以下である。一方、２本鎖部分にミスマッチ塩基対を有する場合、ミスマッチ塩基対は連続して配置されてもよく、不連続に配置されてもよい、また、ミスマッチ塩基対の総数は例えば、１０塩基対以下、好ましくは６塩基対以下、又は４塩基対以下であり、また例えば、１塩基対以上、２塩基対以上、又は３塩基対以上であってよい。なお、相補的な塩基対には、熱力学的に安定な非ワトソンクリック型のゆらぎ塩基対（例えば、Ｇ－Ｕ）が含まれる。

医薬組成物が含む２本鎖のポリヌクレオチドは、下記（１）から（６）のいずれかの塩基配列又はその変異体の塩基配列を有していてよい。また、医薬組成物は、下記（１）から（６）のいずれかの塩基配列又はその変異体の塩基配列を有する２本鎖ポリヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも１種を含んでいてよい。

（１）第１の２本鎖ポリヌクレオチドは、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９３をコードする遺伝子に由来する。第１の２本鎖ポリヌクレオチドは、塩基配列「ＵＧＧＧＵＧＧＵＣＵＧＧＡＧＡＵＵＵＧＵＧＣ」（配列番号１）の１本鎖ポリヌクレオチド及び塩基配列「ＧＣＡＣＡＡＡＵＣＵＣＣＧＧＡＣＣＡＣＵＵＡ」（配列番号７）の１本鎖ポリヌクレオチドからなる相補的な２本鎖ポリヌクレオチドである。配列番号１は、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９３（成熟ｍｉＲＮＡ）の塩基配列であり、以下に示す相補的構造を形成し得る。天然型の成熟ｍｉＲＮＡでは、配列番号１の塩基配列を有する５’側のＲＮＡがガイド鎖として、配列番号７の塩基配列を有する３’側のＲＮＡがパッセンジャー鎖として位置付けられている。

（２）第２の２本鎖ポリヌクレオチドは、ｈｓａ－ｍｉＲ－８７６－３ｐをコードする遺伝子に由来する。第２の２本鎖ポリヌクレオチドは、塩基配列「ＵＧＧＵＧＧＵＵＵＡＣＡＡＡＧＵＡＡＵＵＣＡ」（配列番号２）の１本鎖ポリヌクレオチド及び塩基配列「ＵＧＧＡＵＵＵＣＵＵＵＧＵＧＡＡＵＣＡＣＣＡ」（配列番号８）の１本鎖ポリヌクレオチドからなる略相補的な２本鎖ポリヌクレオチドである。配列番号２は、ｈｓａ－ｍｉＲ－８７６－３ｐ（成熟ｍｉＲＮＡ）の塩基配列であり、以下に示す略相補的構造を形成し得る。天然型の成熟ｍｉＲＮＡでは、配列番号２の塩基配列を有する３’側のＲＮＡがガイド鎖として、配列番号８の塩基配列を有する５’側のＲＮＡがパッセンジャー鎖として位置付けられている。ここで「略相補的」とは、下記式のように、２本鎖ポリヌクレオチドの一部が１本鎖である部分、及び／又は、塩基対の一部が水素結合で結合していない部分（ミスマッチ）を含みつつ、全体としては２本鎖ポリヌクレオチドを構成している状態である。

（３）第３の２本鎖ポリヌクレオチドは、ｈｓａ－ｍｉＲ－４４３８をコードする遺伝子に由来する。第３の２本鎖ポリヌクレオチドは、塩基配列「ＣＡＣＡＧＧＣＵＵＡＧＡＡＡＡＧＡＣＡＧＵ」（配列番号３）の１本鎖ポリヌクレオチド及び塩基配列「ＡＣＵＧＵＣＵＵＵＵＣＵＡＡＧＣＣＵＧＵＧ」（配列番号９）の１本鎖ポリヌクレオチドからなる相補的な２本鎖ポリヌクレオチドである。配列番号３は、ｈｓａ－ｍｉＲ－４４３８（成熟ｍｉＲＮＡ）の塩基配列であり、以下に示す相補的構造を形成し得る。天然型の成熟ｍｉＲＮＡでは、配列番号３の塩基配列を有する３’側のＲＮＡがガイド鎖として、配列番号９の塩基配列を有する５’側のＲＮＡがパッセンジャー鎖として位置付けられている。

（４）第４の２本鎖ポリヌクレオチドは、ｈｓａ－ｍｉＲ－６７５１－５ｐをコードする遺伝子に由来する。第４の２本鎖ポリヌクレオチドは、塩基配列「ＵＵＧＧＧＧＧＵＧＡＧＧＵＵＧＧＵＧＵＣＵＧＧ」（配列番号４）の１本鎖ポリヌクレオチド及び塩基配列「ACUGAGCCUCUCUCUCUCCAG」（配列番号１０）の１本鎖ポリヌクレオチドからなる略相補的な２本鎖ポリヌクレオチドである。配列番号４は、ｈｓａ－ｍｉＲ－６７５１－５ｐ（成熟ｍｉＲＮＡ）の塩基配列であり、以下に示す略相補的構造を形成し得る。天然型の成熟ｍｉＲＮＡでは、配列番号４の塩基配列を有する５’側のＲＮＡがガイド鎖として、配列番号１０の塩基配列を有する３’側のＲＮＡがパッセンジャー鎖として位置付けられている。

（５）第５の２本鎖ポリヌクレオチドは、ｈｓａ－ｍｉＲ－６３４をコードする遺伝子に由来する。第５の２本鎖ポリヌクレオチドは、塩基配列「ＡＡＣＣＡＧＣＡＣＣＣＣＡＡＣＵＵＵＧＧＡＣ」（配列番号５）の１本鎖ポリヌクレオチド及び塩基配列「ＡＵＣＧＡＧＧＧＵＵＧＧＧＧＣＵＵＧＧＵ」（配列番号１１）の１本鎖ポリヌクレオチドからなる略相補的な２本鎖ポリヌクレオチドである。配列番号５は、ｈｓａ－ｍｉＲ－６３４（成熟ｍｉＲＮＡ）の塩基配列であり、以下に示す略相補的構造を形成し得る。天然型の成熟ｍｉＲＮＡでは、配列番号５の塩基配列を有する３’側のＲＮＡがガイド鎖として、配列番号１１の塩基配列を有する５’側のＲＮＡがパッセンジャー鎖として位置付けられている。

（６）第６の２本鎖ポリヌクレオチドは、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ－２をコードする遺伝子に由来する。第６の２本鎖ポリヌクレオチドは、塩基配列「ＧＧＧＵＧＧＧＧＡＵＵＵＧＵＵＧＣＡＵＵＡＣ」（配列番号６）の１本鎖ポリヌクレオチド及び塩基配列「ＵＡＵＵＧＣＡＣＵＵＧＵＣＣＣＧＧＣＣＵＧＵ」（配列番号１２）の１本鎖ポリヌクレオチドからなる略相補的な２本鎖ポリヌクレオチドである。配列番号６は、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ－２（成熟ｍｉＲＮＡ）の塩基配列であり、以下に示す略相補的構造を形成し得る。天然型の成熟ｍｉＲＮＡでは、配列番号６の塩基配列を有する５’側のＲＮＡがガイド鎖として、配列番号１２の塩基配列を有する３’側のＲＮＡがパッセンジャー鎖として位置付けられている。

ポリヌクレオチドを構成するヌクレオチドは、少なくとも１個のリボヌクレオチドを含んでいればよく、リボヌクレオチドに代えて対応するデオキシリボヌクレオチド及び修飾されたヌクレオチドの少なくとも１種を含んでいてもよい。修飾されたヌクレオチドには、リン酸部分が修飾されたヌクレオチド、糖部分が修飾されたヌクレオチド、塩基部分が修飾されたヌクレオチド等が含まれる。修飾されたヌクレオチドは、リン酸部分、糖部分及び塩基部分のいずれかが修飾されたものであってもよく、２種以上の修飾が組み合わされたものであってもよい。修飾されたヌクレオチドについては、例えば、特開平１０－３０４８８９号公報、国際公開第２００５／０２１５７０号、特開平１０－１９５０９８号公報、特表２００２－５２１３１０号公報、国際公開第２００７／１４３３１５号、国際公開第２００８／０４３７５３号、国際公開第２００８／０２９６１９号、国際公開第２００８／０４９０８５号等を参照することができる。

リン酸部分の修飾としては、酸素原子を硫黄原子に置換した「ホスホロチオエート修飾」（Ｓ化）等が知られている。糖部分の修飾としては、非架橋化型修飾と、架橋型修飾が知られている。非架橋型修飾としては、２'位のフッ素（Ｆ）化、Ｏ－メチル化、ＭＯＥ化等の２'位水酸基の修飾、モルフォリノ核酸化等が挙げられる。また、架橋化型修飾としては、ＬＮＡ（２’，４’－ＢＮＡ）化、ＥＮＡ化等が挙げられる。

本実施形態に係るポリヌクレオチドは、公知ポリヌクレオチドの合成法等を用いて合成することが可能である。ポリヌクレオチドの合成法としては、ホスホロアミダイド法及びその改良法、Ｈ－ホスホネート法及びその改良法、酵素合成法（ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写法）等が挙げられる。また、市販品の当該核酸、委託製造された当該核酸を適応することも可能である。

医薬組成物は、有効成分として、ポリヌクレオチドに加えて、他の抗腫瘍性化合物を更に含んでいてもよい。他の抗腫瘍性化合物としては、例えば、代謝拮抗剤、分子標的薬、アルキル化剤、植物アルカロイド剤、抗がん性抗生物質、プラチナ製剤、ホルモン剤、生物学的応答調節剤、免疫チェックポイント阻害剤などが挙げられる。

医薬組成物は、上記の有効成分としての核酸（ポリヌクレオチド）とともに適切な医薬製剤担体を含んで、製剤組成物の形態に調製されてもよい。当該製剤担体としては、使用形態に応じた担体を選択することが可能であり、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、界面活性剤等の賦形剤、希釈剤等を使用することができる。また、上記の有効成分としての核酸に対して適切な担体を添加することで使用時に液状となしうる乾燥剤とすることも可能である。

医薬組成物は、有効成分であるポリヌクレオチドを薬学的に許容される担体に内包、又は結合した状態で含んでいてもよい。例えば、高分子ミセル、シクロデキストリン含有ポリマーで構成されたナノ粒子、安定核酸脂質粒子、多機能エンベローブ型ナノ構造体等のドラッグデリバリーシステムを活用して、医薬組成物の効果をより向上させることが可能である。

医薬組成物の形態は、上記の有効成分としての核酸を効果的に含有可能な形態であれば、特に限定されるものではなく、錠剤、粉末剤、顆粒剤、丸剤等の固剤、軟膏剤、ハップ剤であってもよい。また、液剤、懸濁剤、乳剤等の注射剤形態とするのも好適である。現状において医薬組成物は、局所への投与が効果的である。この投与形式に適した剤型は、通常は注射剤、軟膏剤、又はハップ剤の形態である。注射剤を用いる局所への投与は、腫瘍に対して、静脈内、皮下、皮内、筋肉内注射等の体外からの注射により、直接有効成分を注入し、さらに、内視鏡を用いて体内（消化管内、子宮内、膀胱内等）の腫瘍に対して、直接有効成分を注入する、等の態様で行われる。軟膏剤又はハップ剤を用いる局所への投与は、皮膚がんに対して直接有効成分を浸潤させる等の態様で行われる。

上記の有効成分としての核酸の人体に対する投与量は、一日成人１人あたり、例えば、０．０１μｇ以上１０００ｍｇ以下程度である。この投与は１日１回、又は２回以上５回以下であってよく、さらに連日又は数日おきに行うことも可能である。

医薬組成物は、腫瘍の処置に用いられる。ここで腫瘍の処置とは、腫瘍について施される何らかの処置であればよく、例えば、腫瘍の治療、改善、進行の抑制（悪化の防止）、予防、腫瘍に起因する症状の緩和等が挙げられる。医薬組成物は、ＢＲＤ４遺伝子の発現を抑制するポリヌクレオチドを含むことから、処置の対象となる腫瘍は、ＢＲＤ４遺伝子を発現している腫瘍細胞を含むことが好ましい。処置の対象となる腫瘍としては、食道がん、肺がん、口腔がん、胃がん、大腸がん、子宮がん、皮膚がん、脳腫瘍、神経芽腫、膠芽腫、乳がん、膵がん、卵巣がん、前立腺がん、膀胱がん、食道がん、肝がん、腎がん等の固形がん、及び血液腫瘍等が例示される。処置の対象となる腫瘍は、好ましくは、大腸がん、膵がん、口腔がん、肺がん、食道がん、胃がん、子宮がん、皮膚がん、血液腫瘍、脳腫瘍、神経芽腫、膠芽腫、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、膀胱がん、食道がん、肝がん及び腎がんからなる群から選ばれる少なくとも１種であってよい。また、有効成分であるポリヌクレオチドが確実に腫瘍に到達可能であることから、局所投与、すなわち、医薬組成物を直接腫瘍に接触させることが可能な腫瘍が、処置対象として好適である。

医薬組成物は、ＲＳＫ１遺伝子を発現している腫瘍の処置に用いられてもよい。医薬組成物が有効成分として、例えばｍｉＲ－８７６－３ｐをコードする遺伝子に由来するポリヌクレオチドを含む場合に特に好適である。

ＲＳＫ１は、ＲＳＫ(リボソームＳ６キナーゼ)ファミリーメンバーであり、増殖因子制御型セリンスレオニンキナーゼである。ＲＳＫ１は分裂促進因子活性化キナーゼ（ＭＡＰＫ）カスケード活性化に関与し、細胞増殖や分化を刺激する。また、ＭＡＰＫカスケードによって活性化されたＲＳＫ１は、Ｓ６キナーゼを活性化することが知られており、その結果、ｍＴＯＲ経路が活性化され、細胞増殖や生存を促進する。なお、このｍＴＯＲ経路の阻害剤はすでに癌の治療においても臨床応用されている。

医薬組成物は、ＡＰＥＸ１、ＲＰＡ１及びＰＯＬＤ４からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子を発現している腫瘍の処置に用いられてもよい。医薬組成物が有効成分として、例えばｍｉＲ－１２９３をコードする遺伝子に由来するポリヌクレオチドを含む場合に特に好適である。

ＡＰＥＸ１、ＲＰＡ１及びＰＯＬＤ４は、いずれもＤＮＡの修復に関わる遺伝子である。癌においては遺伝子の変異、構造異常が蓄積されていることから複製ストレスがかかっていると考えられており、ＤＮＡ修復経路を阻害する治療薬としてＰＡＲＰ阻害剤が臨床応用されている。

さらに「がんとの共存」を目指す場合も医薬組成物の適応対象となりうる。すなわち、がんにおけるＢＲＤ４遺伝子の発現をはじめ、ＲＳＫ１、ＡＰＥＸ１、ＲＰＡ１、ＰＯＬＤ４等の遺伝子の発現を抑制することにより、がんの悪性化を防ぎ、天寿を全うすることを目指す場合にも医薬組成物は適していると考えられる。

なお、上記の遺伝子発現の定量は、常法に従って行うことが可能である。例えば、ＢＲＤ４遺伝子、ＲＳＫ１遺伝子、ＡＰＥＸ１遺伝子、ＲＰＡ１遺伝子、ＰＯＬＤ４遺伝子等の発現の定量方法としては、ノーザンブロッティング法、ウェスタンブロティング法、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法（ＩＳＨ法）、定量的ＲＴ－ＰＣＲ法（リアルタイムＰＣＲ法を含む）、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写法、発現アレイ解析法、免疫組織化学染色法等、又はこれらの方法の変法が挙げられる。

処置の対象となる腫瘍におけるＢＲＤ４、ＲＳＫ１、ＡＰＥＸ１、ＲＰＡ１、ＰＯＬＤ４等の遺伝子の発現は、過剰発現であってもよい。所定の遺伝子の過剰発現の有無は、以下のようにして特定することができる。それぞれの遺伝子の正常な発現量を基にして適切なカットオフ値を包括的に又は腫瘍個別的に設定する。上述した遺伝子発現の定量法を、処置対象の腫瘍に対して適用して求められる当該腫瘍における所定の遺伝子の発現定量値に対して、前記カットオフ値を当て嵌めることで、所定の遺伝子の過剰発現の有無を特定することができる。このような所定の遺伝子の過剰発現が認められるがんを、医薬組成物の適切な適用対象として特定することができる。

医薬組成物の処置の対象は、腫瘍に限られず、上述した遺伝子的特徴を示す疾患であってよい。遺伝子的特徴に基づいた処置対象となる疾患としては、例えば、ＢＲＤ４遺伝子に関連する疾患として、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、混合系統白血病（ＭＬＬ）、バーキットリンパ腫、小児期に最も一般的な脳腫瘍である髄芽腫、ＭＹＣＮ増幅神経芽細胞腫、去勢抵抗性前立腺がん、転移性去勢抵抗性前立腺がん（ＣＲＰＣ）、ユーイング肉腫、結腸直腸がん、ミエローマ、リンパ腫、白血病、多発性骨髄腫、固形腫瘍（例えば、膵臓及び前立腺のがん）、乳がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、骨髄増殖性新生物、分類できない葉状線維腫瘍、び漫性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、トリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）、膵管腺がん、多形性神経膠芽腫、２型真性糖尿病、冠状動脈疾患、心血管疾患（例えば、Int. J. Mol. Sci. 2016, 17,_1849；Cold Spring Harb Perspect Med. 2017; 7:a026674 参照）等が挙げられる。

腫瘍の処置方法
腫瘍の処置方法は、有効量の前記医薬組成物を、対象に投与することを含む腫瘍を処置する方法である。処置の対象となる腫瘍は既述の通りであり、例えば、ＢＲＤ４、ＲＳＫ１、ＡＰＥＸ１、ＲＰＡ１及びＰＯＬＤ４からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子を発現している腫瘍である。また、医薬組成物の詳細及び投与方法は既述の通りである。処置の対象は、例えば、哺乳動物であり、哺乳動物はヒトを含む。また、処置の対象は、非ヒト動物であってもよい。

本発明は、別の態様として、腫瘍の処置に用いられる医薬組成物の製造における前記ポリヌクレオチドの使用、腫瘍の処置における前記ポリヌクレオチドの使用、腫瘍の処置に使用される前記ポリヌクレオチドをも包含する。

以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

１．材料と方法
（１）マイクロＲＮＡ及びｓｉＲＮＡ
ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９３（成熟ｍｉＲＮＡ）をガイド鎖（配列番号１）とする２本鎖マイクロＲＮＡの合成品を、アンビオン社（Ａｍｂｉｏｎ、Ｉｎｃ．：米国）より入手した（商品名：ＭＣ１３６９８）。当該マイクロＲＮＡは、下記の天然型と同一の塩基配列の２本鎖ＲＮＡであり、修飾ヌクレオチドを含んでいる。以下、本実施例では、この２本鎖ＲＮＡを、特に断らない限り「ｍｉＲ－１２９３」と記載する。

ｈｓａ－ｍｉＲ－８７６－３ｐ（成熟ｍｉＲＮＡ）をガイド鎖（配列番号２）とする２本鎖マイクロＲＮＡの合成品を、アンビオン社より入手した（商品名：ＭＣ１２８８６）。当該マイクロＲＮＡは、下記の天然型と同一の塩基配列の２本鎖ＲＮＡであり、修飾ヌクレオチドを含んでいる。以下、本実施例では、この２本鎖ＲＮＡを、特に断らない限り「ｍｉＲ－８７６－３ｐ」と記載する。

ｈｓａ－ｍｉＲ－４４３８（成熟ｍｉＲＮＡ）をガイド鎖（配列番号３）とする２本鎖マイクロＲＮＡの合成品を、アンビオン社より入手した（商品名：ＭＣ２２６３４）。当該マイクロＲＮＡは、下記の天然型と同一の塩基配列の２本鎖ＲＮＡであり、修飾ヌクレオチドを含んでいる。以下、本実施例では、この２本鎖ＲＮＡを、特に断らない限り「ｍｉＲ－４４３８」と記載する。

ｈｓａ－ｍｉＲ－６７５１－５ｐ（成熟ｍｉＲＮＡ）をガイド鎖（配列番号４）とする２本鎖マイクロＲＮＡの合成品を、アンビオン社より入手した（商品名：ＭＣ２７１９４）。当該マイクロＲＮＡは、下記の天然型と同一の塩基配列の２本鎖ＲＮＡであり、修飾ヌクレオチドを含んでいる。以下、本実施例では、この２本鎖ＲＮＡを、特に断らない限り「ｍｉＲ－６７５１」と記載する。

ｈｓａ－ｍｉＲ－６３４（成熟ｍｉＲＮＡ）をガイド鎖（配列番号５）とする２本鎖マイクロＲＮＡの合成品を、アンビオン社より入手した（商品名：ＭＣ１１５３８）。当該マイクロＲＮＡは、下記の天然型と同一の塩基配列の２本鎖ＲＮＡであり、修飾ヌクレオチドを含んでいる。以下、本実施例では、この２本鎖ＲＮＡを、特に断らない限り「ｍｉＲ－６３４」と記載する。

ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ－２（成熟ｍｉＲＮＡ）をガイド鎖（配列番号６）とする２本鎖マイクロＲＮＡの合成品を、アンビオン社より入手した（商品名：ＭＣ１２５２４）。当該マイクロＲＮＡは、下記の天然型と同一の塩基配列の２本鎖ＲＮＡであり、修飾ヌクレオチドを含んでいる。以下、本実施例では、この２本鎖ＲＮＡを、特に断らない限り「ｍｉＲ－９２ａ－２」と記載する。

対照のマイクロＲＮＡには、コントロールｍｉＲＮＡ(ネガティブコントロール＃１；ｍｉＲ－ＮＣ)（アンビオン社）を用いた。

ＲＳＫ１（ｓｉＧＥＮＯＭＥ ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ：Ｍ－００３０２５－０４）、ＡＰＥＸ１（ｓｉＧＥＮＯＭＥ ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ：Ｍ－０１０２３７－０１）、ＢＲＤ４（ｓｉＧＥＮＯＭＥ ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ：Ｍ－００４９３７－０２－０００５）、ＲＰＡ１（ｓｉＧＥＮＯＭＥ ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ：Ｍ－０１５７４９－０１）、ＰＯＬＤ４（ｓｉＧＥＮＯＭＥ ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ：Ｍ－０１４０１３－０１）に対するｓｉＲＮＡは、各々ダーマコン社から入手した。

（２）がん細胞株
膵がん細胞株（ＭＩＡＰａＣａ２細胞）、口腔がん細胞株（ＨＯＣ３１３細胞、ＨＳＣ２細胞）、肺がん細胞株（Ａ５４９細胞）、大腸がん細胞株（ＨＣＴ１１６＋／＋細胞、ＳＷ４８細胞、ＨＴ２９細胞）、胃がん細胞株（ＡＧＳ細胞）はアメリカンカルチャーコレクション（米国）から購入した。大腸がん細胞株ＨＣＴ１１６＋／＋細胞及びＨＣＴ１１６－／－細胞はＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎ研究室より供与を受けた。食道がん細胞株（ＫＹＳＥ１５０細胞）は嶋田裕博士（富山大学）より供与を受けた。

ＨＣＴ１１６＋／＋、ＨＣＴ１１６－／－、ＭＩＡＰａＣａ２、ＫＹＳＥ１５０、ＨＴ２９、ＳＷ４８、ＨＯＣ３１３、ＨＳＣ２細胞はダルベッコ改変イーグル培地に、Ａ５４９、ＡＧＳ細胞はＲＰＭＩ１６４０培地に、それぞれ１０％ウシ胎児血清を添加して、５％ＣＯ_２・３７℃で培養した。

（３）抗体
ウエスタンブロット用の抗体として、抗ＢＲＤ４抗体（ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社）、抗ｃｌｅａｖｅｄ ＰＡＲＰ抗体（ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社）、抗ＲＳＫ１抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）、抗ＡＰＥＸ１抗体（ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ社）、抗リン酸化ＲＳＫ１抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）、抗リン酸化Ｐ７０Ｓ６Ｋ抗体（ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社）、抗リン酸化S6抗体（ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社）、抗ＭＹＣ抗体（ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社）、抗ＰＯＬＤ４抗体（ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ社）、抗γＨ２ＡＸ抗体（ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社）、抗βアクチン抗体（シグマ社）を用いた。免疫組織染色用の抗ＢＲＤ４抗体（Ａｔｌａｓ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ社）、抗ＲＳＫ1抗体（Ａｔｌａｓ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ社）、抗ＡＰＥＸ１抗体（ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ社）、抗ＲＰＡ１抗体（ａｂｃａｍ社）、及び抗ＰＯＬＤ４抗体（ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ社）を用いた。

（４）統計解析
サブグループ間の差はＡＮＯＶＡ、Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ－ｔｅｓｔ及びＭａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ’ｓ Ｕ ｔｅｓｔ（下記のｉｎ ｖｉｖｏ試験におけるマウスの腫瘍の重量の解析において用いた）で解析した。計算されたＰ値が０．０５未満の場合、統計学的な有意差ありと判断した。

＜実施例Ａ１＞ 細胞増殖を抑制するｍｉＲＮＡの１次スクリーニング
ＨＣＴ１１６＋／＋細胞及びＨＣＴ１１６－／－細胞（６０００個／ｗｅｌｌ）に、ｍｉＲＮＡライブラリー［ｍｉＲＶａｎａ ｍｉＲＮＡ ｍｉｍｉｃ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｖ２１（アンビオン社）］に含まれる２５６５種類のｍｉＲＮＡ又はコントロールｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ－ＮＣ）の１０ｎｍｏｌ／Ｌを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸ（インビトロゲン社）を用い、添付の手順書に従って導入した。導入から３日後に細胞生存数をクリスタルバイオレット（ＣＶ）染色アッセイで評価した。なお、ＣＶ染色アッセイは以下のように実施した。細胞をＰＢＳで洗浄し、０．２％ＣＶ含有１０％ホルムアルデヒドＰＢＳで５分間固定した。過剰なＣＶ溶液は除去し、完全に空気乾燥した後、染色細胞に２％ＳＤＳ溶液を加えて、プレートを１時間振盪することで溶解した。吸光度をマイクロプレートリーダー（ＡＲＶＯｍｘ；パーキンエルマー社）を用いてウェル毎に５６０ｎｍで計測した。細胞にコントロールｍｉＲＮＡを導入したコントロールウェルにおける吸光度を１００％に設定した場合の各ウェルにおける吸光度から、生存細胞数の比を決定した。

図１に、上記のＨＣＴ１１６＋／＋、ＨＣＴ１１６－／－細胞における１次スクリーニングの結果を示す。２５６５種のｍｉＲＮＡをそれぞれ導入したときの、コントロールｍｉＲＮＡと比べた時の細胞生存数の比を示している。横軸がＨＣＴ１１６＋／＋細胞の結果、縦軸がＨＣＴ１１６－／－細胞の結果を示す。コントロールｍｉＲＮＡをトランスフェクションした場合の生存細胞数を１としたときの相対的な生存細胞数を示す。なお、細胞増殖抑制効果の基準としてコントロールとの比を０．３未満とした。

１次スクリーニングにおいてＨＣＴ１１６＋／＋、ＨＣＴ１１６－／－細胞とも増殖抑制効果を認めたのは１３８種類のｍｉＲＮＡであった。なお、ＨＣＴ１１６＋／＋において細胞増殖抑制効果を認めたのは６３０種類であり、ＨＣＴ１１６－／－において増殖抑制効果を認めたのは１４１種類であり、両方に共通するｍｉＲＮＡが１３８種類であった。

２次スクリーニングとして、１次スクリーニングにおいてＨＣＴ１１６＋／＋、ＨＣＴ１１６－／－細胞とも増殖抑制をみとめた１３８種類のｍｉＲＮＡ又はコントロールｍｉＲＮＡの１０ｎｍｏｌ／Ｌを、ＨＣＴ１１６＋／＋、ＨＣＴ１１６－／－、ＭＩＡＰａＣａ２、ＨＯＣ３１３、ＨＳＣ２、ＳＷ４８、ＨＴ２９、ＡＧＳ、Ａ５４９、及びＫＹＳＥ１５０のそれぞれの細胞にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸを用いて、添付の手順書に従って導入した。導入から３日後に細胞生存数をクリスタルバイオレット（ＣＶ）染色アッセイで上記と同様にして評価した。

表１４は、２次スクリーニングの結果を表している。１次スクリーニングで抽出した１３８種のｍｉＲＮＡをそれぞれ導入したときの、コントロールｍｉＲＮＡと比べた時の細胞生存数の比を示している。コントロールｍｉＲＮＡをトランスフェクションした場合の生存細胞数を１としたときの相対的な生存細胞数を示す。なお、増殖抑制効果の基準としてコントロールとの比で０．６未満とした。ここでは１０種類の癌細胞すべてにおいて増殖抑制効果を認めた７種類のｍｉＲＮＡを示している。

＜実施例Ａ２＞
（ウエスタンブロット）
ｍｉＲ－ＮＣ、ｍｉＲ－８７６－３ｐ、ｍｉＲ－１２９３、ｍｉＲ－４４３８、ｍｉＲ－６７５１－５ｐ、ｍｉＲ－９２ａ－５ｐ、ｍｉＲ－６３４、又はｍｉＲ－３１４０－３ｐを導入した、ＨＣＴ１１６＋／＋細胞、ＨＣＴ１１６－／－細胞、及びＨＯＣ３１３細胞から得られた試料に対して、ウエスタンブロットを行い、ＢＲＤ４の発現量を調べた。ウエスタンブロットは以下のようにして行った。全細胞の溶解物に対してＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、タンパクをＰＶＤＦ膜（ＧＥヘルスケア社）に転写した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０と５％スキムミルクを含有するＴＢＳを用いて室温で１時間ブロッキングを行った後、当該膜を抗体と共に４℃で一晩反応させた。１次抗体の希釈倍率は、抗ＢＲＤ４抗体（１／１０００）、抗β－アクチン抗体（１／５０００）であった。当該膜を洗浄後、ＨＲＰ結合抗マウス又は抗ウサギＩｇＧ抗体（ともに１／５０００）に室温１時間暴露した。結合した抗体を、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｆｅｍｔｏ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて視覚化した。結果を図２－１に示す。

図２－１に示すように、これら３種類のがん細胞株において、ｍｉＲ－８７６－３ｐ、ｍｉＲ－１２９３、ｍｉＲ－４４３８、ｍｉＲ－６７５１－５ｐ、ｍｉＲ－９２ａ－５ｐ、ｍｉＲ－６３４、又はｍｉＲ－３１４０－３ｐを導入することによるＢＲＤ４遺伝子の発現の抑制が認められた。

＜実施例Ａ３＞
（ルシフェラーゼレポーターアッセイ）
ＢＲＤ４遺伝子の３’ＵＴＲ領域をルシフェラーゼベクターに組み込んだコンストラクトを用いるルシフェラーゼレポーターアッセイによって、ｍｉＲＮＡとＢＲＤ４遺伝子の相互作用を評価した。

図２－２（Ａ）は、ｍｉＲ－１２９３のルシフェラーゼレポーターアッセイによる検証の結果を示している。ｍｉＲ－１２９３のガイド鎖の塩基配列と相同する領域は、ＢＲＤ４遺伝子に５つ存在し（Ｒ１からＲ５）、当該アッセイに用いるルシフェラーゼレポータープラスミドは、ｐｍｉＲＧｌｏ Ｄｕａｌ－Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｍｉＲＮＡ Ｔａｒｇｅｔ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社）のルシフェラーゼ遺伝子の下流に、当該相同領域を含むＢＲＤ４遺伝子の３’ＵＴＲ領域に対応するオリゴヌクレオチド（Ｗｔ）、あるいは、この領域の塩基配列に変異を入れたオリゴヌクレオチド（Ｍｔ）を挿入することで作製した。全ての部位特異的変異は、ＫＯＤ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋｉｔ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて作製した。ルシフェラーゼレポータープラスミドを、ＨＯＣ３１３細胞に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（インビトロゲン社）を用いて添付の手順文書に沿って導入し、次の日にｍｉＲ－１２９３又はコントロールｍｉＲＮＡを導入した。２日後に、ホタルルシフェラーゼ活性とウミシイタケルシフェラーゼ活性を、Ｄｕａｌ－Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社）を用いて測定した。相対的ルシフェラーゼ活性は、対応する内部標準コントロールのウミシイタケルシフェラーゼ活性で補正することで、ホタルルシフェラーゼ活性を標準化して算出した。

ｍｉＲ－１２９３の導入により、ＢＲＤ４の３’ＵＴＲ領域のＲ１とＲ４の２か所において、野生型の３’ＵＴＲ領域に対応するルシフェラーゼ活性の低下を認め、ｍｉＲ－１２９３のガイド鎖の塩基配列とマッチする領域に変異を入れたベクターではルシフェラーゼ活性は回復した。これらの結果から、ｍｉＲ－１２９３は、ＢＲＤ４遺伝子のＲ１とＲ４の２か所の３’ＵＴＲ領域への作用により、直接ＢＲＤ４遺伝子の発現を有意に抑制していることが示された。

図２－２（Ｂ）は、ｍｉＲ－８７６－３ｐのルシフェラーゼレポーターアッセイによる検証の結果を示している。ｍｉＲ－８７６－３ｐのガイド鎖の塩基配列と相同する領域は、ＢＲＤ４遺伝子に１つ存在する。その領域の配列に変異を入れたこと以外は上記と同様にしてアッセイを行った。

ｍｉＲ－８７６－３ｐの導入により、野生型の３’ＵＴＲ領域に対応するルシフェラーゼ活性の低下を認め、ｍｉＲ－８７６－３ｐのガイド鎖の塩基配列とマッチする領域に変異を入れたベクターではルシフェラーゼ活性は回復した。これらの結果から、ｍｉＲ－８７６－３ｐは、ＢＲＤ４遺伝子の３’ＵＴＲ領域への作用により、直接ＢＲＤ４遺伝子の発現を有意に抑制していることが示された。

図２－２（Ｃ）は、ｍｉＲ－６７５１－５ｐのルシフェラーゼレポーターアッセイによる検証の結果を示している。ｍｉＲ－６７５１－５ｐのガイド鎖の塩基配列と相同する領域は、ＢＲＤ４遺伝子に１つ存在する。その領域の配列に変異を入れたこと以外は上記と同様にしてアッセイを行った。

ｍｉＲ－６７５１－５ｐの導入により、野生型の３’ＵＴＲ領域に対応するルシフェラーゼ活性の低下を認め、ｍｉＲ－６７５１－５ｐのガイド鎖の塩基配列とマッチする領域に変異を入れたベクターではルシフェラーゼ活性は回復した。これらの結果から、ｍｉＲ－６７５１－５ｐは、ＢＲＤ４遺伝子の３’ＵＴＲ領域への作用により、直接ＢＲＤ４遺伝子の発現を有意に抑制していることが示された。

＜比較例１＞
大腸がん細胞株（ＨＣＴ１１６－／－細胞）にＢＲＤ４遺伝子に対するｓｉＲＮＡを作用させて、ＢＲＤ４遺伝子をノックダウンしたときの細胞増殖に対する効果を図２－３（Ａ）に示す。比較としてコントロールｓｉＲＮＡ（ｓｉ－ＮＣ）を導入した場合の細胞増殖に対する効果を併せて示す。また、実施例Ａ２と同様にしてウエスタンブロットを行った結果を図２－３（Ｂ）に示す。

ウエスタンブロットの結果から、ｓｉ－ＢＲＤ４を導入することでＢＲＤ４遺伝子の発現が抑制されていることが示された。また、ＨＣＴ１１６－／－細胞においては、ＢＲＤ４遺伝子のノックダウンに伴い、細胞増殖が抑制されることが示された。これにより、ＢＲＤ４遺伝子の発現が実際にこれらの大腸がん細胞株の増殖に寄与していることが確認された。また、ｓｉ－ＢＲＤ４を作用させた場合の細胞増殖抑制効果は、本実施形態に係るｍｉＲＮＡを作用させた場合よりも小さいことが分かる。

＜実施例Ａ４＞
（細胞増殖抑制能の評価）
標的がん細胞株として、大腸がん細胞株（ＨＣＴ１１６＋／＋細胞、ＨＣＴ１１６－／－細胞）、口腔がん細胞株（ＨＯＣ３１３細胞、ＨＳＣ２細胞）、肺がん細胞株（Ａ５４９細胞（非小細胞性肺がん細胞株））及び食道がん細胞株（ＫＹＳＥ１５０細胞）を用いて、ｍｉＲＮＡの導入による細胞増殖抑制効果を評価した。ｍｉＲ－８７６－３ｐ、ｍｉＲ－１２９３又は対照であるコントロールｍｉＲＮＡ(ｍｉＲ－ＮＣ)の１０ｎｍｏｌ／Ｌを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸを用い、添付文書の手順書に従って、それぞれの標的がん細胞株に導入した。導入から２日後及び４日後に生存細胞数を評価した。細胞増殖曲線を図３－１に示す。また、導入７２時間後の大腸がん細胞株（ＨＣＴ１１６－／－細胞）の顕微鏡写真を図３－２に示す。

図３－１に示すように、いずれの細胞株においても、ｍｉＲ－８７６－３ｐ又はｍｉＲ－１２９３の導入により、有意に細胞増殖が抑制され、顕著な増殖抑制効果が認められた。また、図３－２に示すように、大腸がん細胞株において、ｍｉＲ－８７６－３ｐ又はｍｉＲ－１２９３を導入することで死細胞が多数確認され、生存細胞が対照と比べて少ない。

＜実施例Ａ５＞
（アポトーシス評価１）
大腸がん細胞株（ＨＣＴ１１６＋／＋、ＨＣＴ１１６－／－細胞）、口腔がん細胞株（ＨＯＣ３１３細胞）に対して、ｍｉＲ－ＮＣ、ｍｉＲ－８７６－３ｐ又はｍｉＲ－１２９３の１０ｎｍｏｌ／Ｌを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸを用い、添付文書の手順書に従って、それぞれのがん細胞株に導入した。導入から７２時間後のアポトーシス細胞の割合をアネキシンＶ／ＰＩ染色で評価した。アネキシンＶ／ＰＩ陽性細胞の割合はＡｃｃｕｒｉ Ｃ６ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて評価した。結果を図３－３に示す。

図３－３に示すように、ｍｉＲ－８７６－３ｐ又はｍｉＲ－１２９３の導入により、それぞれの細胞において、コントロール（ｍｉＲ－ＮＣ）と比較してアポトーシス細胞の割合が増加している。

（アポトーシス評価２）
大腸がん細胞株（ＨＣＴ１１６＋／＋、ＨＣＴ１１６－／－細胞）又は口腔がん細胞株（ＨＯＣ３１３細胞）に対して、ｍｉＲ－ＮＣ、ｍｉＲ－８７６－３ｐ又はｍｉＲ－１２９３の１０ｎｍｏｌ／Ｌを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸを用い、添付文書の手順書に従って、それぞれのがん細胞株に導入した。導入から７２時間後の細胞についてウエスタンブロットにより、アポトーシスのマーカーであるｃｌｅａｖｅｄ ＰＡＲＰの発現量を評価した。なお、ウエスタンブロットは、上記と同様の手順で実施した。結果を図３－４に示す。

図３－４に示すように、ｍｉＲ－８７６－３ｐ又はｍｉＲ－１２９３の導入により、それぞれの細胞において、コントロール（ｍｉＲ－ＮＣ）と比較して、ｃｌｅａｖｅｄ ＰＡＲＰの発現量が増加していることが示された。

以上の結果から、ｍｉＲ－８７６－３ｐ及びｍｉＲ－１２９３は、難治性のがんを含めて様々ながん種において、アポトーシスを誘導し、著明に増殖抑制効果を示すことが示された。

＜実施例Ａ５＞
大腸がん細胞株（ＨＣＴ１１６－／－細胞）、口腔がん細胞株（ＨＳＣ２、ＨＯＣ３１３細胞）、肺がん細胞株（Ａ５４９細胞）、食道がん細胞株（ＫＹＳＥ１５０細胞）に対して、実施例Ａ１に記した要領でｍｉＲ－ＮＣ又はｍｉＲ－８７６－３ｐを導入した。導入から４８時間後に、以下のようにして遺伝子発現アレイ解析を行った。遺伝子発現アレイ解析は、Ａｇｉｌｅｎｔ ４ｘ４４Ｋ遺伝子発現アレイ（アジレントテクノロジー社）を用いて、その操作マニュアルに従って行った。遺伝子発現アレイ解析のデータはＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇソフト（アジレントテクノロジー社）を用いて解析した。

図４－１には、これらのｍｉＲ導入細胞に対して行った発現アレイの結果、遺伝子発現が１．５倍を超えて低下した遺伝子の数をベン図で示している。ｍｉＲ－ＮＣ導入群と比較して１．５倍を超えて発現が抑制されている遺伝子のうち、当該５種類のがん細胞株のうち、４種類以上で共通していた遺伝子は１２２３個であった。この共通遺伝子１２２３個について、ＤＡＶＩＤ ｓｏｆｔｗａｒｅ（https://david.ncifcrf.gov）を用いてパスウェイ解析を行ったところ、下表に示すｍＴＯＲ経路に関わる複数の遺伝子が有意に抑制され、その結果としてｍＴＯＲ経路が抑制されていることが示された。

＜実施例Ａ６＞
（ウエスタンブロット）
大腸がん細胞株（ＨＣＴ１１６－／－細胞）又は口腔がん細胞株（ＨＯＣ３１３細胞、ＫＯＳＣ３細胞）に対して、実施例Ａ１に記した要領でｍｉＲ－ＮＣ又はｍｉＲ－８７６－３ｐを導入した。導入から４８時間後に、ＲＳＫ１、リン酸化ＲＳＫ１（ｐ－ＲＳＫ１）、ｍＴＯＲシグナル経路の活性化の指標であるリン酸化ｐ７０Ｓ６Ｋ（ｐ－ｐ７０Ｓ６Ｋ）及びｐＳ６（ｐ－Ｓ６）の発現量を上記と同様にしてβ－ａｃｔｉｎタンパクの発現をポジティブコントロールとしたウエスタンブロットを行うことにより評価した。結果を図４－２に示す。

図４－２に示すように、ＨＣＴ１１６－／－細胞とＨＯＣ３１３細胞、ＫＯＳＣ３細胞において、ｍｉＲ－８７６－３ｐの導入によるＲＳＫ１の発現抑制が顕著に認められ、さらに、ｍＴＯＲシグナル経路のｐ－ｐ７０Ｓ６Ｋ、ｐ－Ｓ６タンパクの発現抑制が認められ、ｍｉＲ－８７６－３ｐの導入により、ＲＳＫ１ならびにｍＴＯＲシグナル経路の抑制が確認できた。

＜実施例Ａ７＞
（ルシフェラーゼレポーターアッセイ）
ＲＳＫ１遺伝子の３’ＵＴＲ領域をルシフェラーゼベクターに組み込んだコンストラクトを用いるルシフェラーゼレポーターアッセイによって、ｍｉＲ－８７６－３ｐとＲＳＫ１遺伝子の相互作用を評価した。ｍｉＲ－８７６－３ｐのガイド鎖の塩基配列と相同する領域は、ＲＳＫ１遺伝子に１つ存在する。その領域に変異を入れたこと以外は上記と同様にしてルシフェラーゼレポーターアッセイを実施した。結果を図４－３に示す。

図４－３に示すように、ｍｉＲ－８７６－３ｐの導入により、野生型の３’ＵＴＲ領域に対応するルシフェラーゼ活性の低下を認め、ｍｉＲ－８７６－３ｐのガイド鎖の塩基配列とマッチする領域に変異を入れたベクターではルシフェラーゼ活性は回復した。これらの結果から、ｍｉＲ－８７６－３ｐは、ＲＳＫ１遺伝子の３’ＵＴＲ領域への作用により、直接ＲＳＫ１遺伝子の発現を抑制していることが示された。

＜参考例１＞
口腔がん細胞株（ＫＯＳＣ３）に、ＢＲＤ４遺伝子に対するｓｉＲＮＡ及びＲＳＫ１に対するｓｉ－ＲＮＡを作用させて、ＢＲＤ４遺伝子及びＲＳＫ１遺伝子の少なくとも一方をノックダウンしたときの遺伝子発現と細胞増殖に対する効果を、コントロールｓｉＲＮＡ（ｓｉ－ＮＣ）を用いた場合と比較して評価した。遺伝子発現は上記と同様にしてウエスタンブロットによって評価した。結果を図４－４（Ａ）示す。また、細胞増殖に対する効果を図４－４（Ｂ）に示す。

図４－４（Ａ）に示すようにＢＲＤ４遺伝子及びＲＳＫ１遺伝子の少なくとも一方をノックダウンすることでノックダウンした遺伝子の発現が抑制される。また、ＢＲＤ４遺伝子及びＲＳＫ１遺伝子の両方を同時にノックダウンすることで、アポトーシスの指標であるｃｌｅａｖｅｄ ＰＡＲＰの発現量が相乗的に増加した。図４－４（Ｂ）に示すように細胞増殖が、ＢＲＤ４遺伝子及びＲＳＫ１遺伝子の少なくとも一方をノックダウンすることで抑制され、両方をノックダウンしたときに相乗的に抑制された。

図４－５は、上記の実施例の結果から導かれるｍｉＲ－８７６－３ｐが腫瘍細胞の増殖を抑制する推定機序を模式的に示す概念図である。

＜実施例Ａ８＞
大腸がん細胞株（ＨＣＴ１１６－／－細胞）、口腔がん細胞株（ＨＳＣ２、ＨＯＣ３１３細胞）、肺がん細胞株（Ａ５４９細胞）、食道がん細胞株（ＫＹＳＥ１５０細胞）に、実施例Ａ１に記した要領でｍｉＲ－ＮＣ又はｍｉＲ－１２９３を導入した。導入から４８時間後に、上記と同様にして遺伝子発現アレイ解析を行った。

図５－１には、これらのｍｉＲ導入細胞に対して行った発現アレイの結果、遺伝子発現が１．５倍を超えて低下した遺伝子の数をベン図で示している。ｍｉＲ－ＮＣ導入群と比較して１．５倍を超えて発現が抑制されている遺伝子のうち、当該５種類のがん細胞株のうち、４種類以上で共通していた遺伝子は１２４８個であった。この共通遺伝子１２４８個について、ＤＡＶＩＤ ｓｏｆｔｗａｒｅを用いてパスウェイ解析を行ったところ、ＤＮＡ修復に関わる複数の経路、すなわち、Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ（相同組み換え修復）、ｂａｓｅ ｅｘｃｉｓｉｏｎ ｒｅｐａｉｒ（塩基除去修復）、Ｍｉｓｍａｔｃｈ ｒｅｐａｉｒ、ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｅｘｃｉｓｉｏｎ ｒｅｐａｉｒが抑制されていることが示された。下表に各経路とその経路に関わる遺伝子を示す。

＜実施例Ａ９＞
（ウエスタンブロット）
ｍｉＲ－１２９３を導入した大腸がん細胞株（ＨＣＴ１１６－／－細胞）又は口腔がん細胞株（ＨＯＣ３１３細胞）に対して、実施例Ａ１に記した要領でｍｉＲ－ＮＣ又はｍｉＲ－１２９３を導入した。導入から４８時間後に、ＡＰＥＸ１、ＲＰＡ１及びＰＯＬＤ４タンパクの発現量を上記と同様にしてβ－ａｃｔｉｎタンパクの発現をポジティブコントロールとしたウエスタンブロットを行うことにより評価した。結果を図５－２に示す。

図５－２において示すように、ＨＣＴ１１６－／－細胞とＨＯＣ３１３細胞において、ｍｉＲ－１２９３の導入によるＡＰＥＸ１、ＲＰＡ１及びＰＯＬＤ４の発現抑制が顕著に認められた。

＜実施例Ａ１０＞
（ルシフェラーゼレポーターアッセイ）
ＡＰＥＸ１遺伝子、ＲＰＡ１遺伝子又はＰＯＬＤ４遺伝子の３’ＵＴＲ領域をルシフェラーゼベクターに組み込んだコンストラクトを用いるルシフェラーゼレポーターアッセイによって、ｍｉＲ－１２９３と、ＡＰＥＸ１遺伝子、ＲＰＡ１遺伝子又はＰＯＬＤ４遺伝子の相互作用を評価した。ｍｉＲ－１２９３のガイド鎖の塩基配列と相同する領域は、ＡＰＥＸ１、ＲＰＡ１及びＰＯＬＤ４遺伝子のそれぞれに１つずつ存在する。その領域にそれぞれ変異を入れたこと以外は上記と同様にしてルシフェラーゼレポーターアッセイを実施した。結果を図５－３に示す。

図５－３に示すように、ｍｉＲ－１２９３導入により、ＡＰＥＸ１、ＲＰＡ１及びＰＯＬＤ４遺伝子のいずれにおいても野生型の３’ＵＴＲ領域に対応するルシフェラーゼ活性の有意な低下を認め、ｍｉＲ－１２９３のガイド鎖の塩基配列とマッチする領域に変異を入れたベクターではルシフェラーゼ活性は有意に回復した。これらの結果から、ｍｉＲ－１２９３は、ＡＰＥＸ１、ＲＰＡ１及びＰＯＬＤ４遺伝子の３’ＵＴＲ領域への作用により、直接ＡＰＥＸ１、ＲＰＡ１及びＰＯＬＤ４遺伝子の発現を抑制していることが示された。

＜参考例２＞
大腸がん細胞株（ＨＣＴ１１６－／－細胞）にｓｉＲＮＡを作用させて、ＢＲＤ４遺伝子、ＡＰＥＸ１遺伝子又はＢＲＤ４遺伝子とＡＰＥＸ１遺伝子の両方を同時にノックダウンしたとき（Ａ）、ＢＲＤ４遺伝子、ＲＰＡ１遺伝子又はＢＲＤ４遺伝子とＲＰＡ１遺伝子の両方を同時にノックダウンしたとき（Ｂ）、ＢＲＤ４遺伝子、ＰＯＬＤ４遺伝子又はＢＲＤ４遺伝子とＰＯＬＤ４遺伝子の両方を同時にノックダウンしたときの（Ｃ）、遺伝子発現と細胞増殖に対する効果を、コントロールｓｉＲＮＡ（ｓｉ－ＮＣ）を用いた場合と比較して評価した。遺伝子発現は上記と同様にしてウエスタンブロットによって評価した。ウエスタンブロットの結果を図５－４（Ａ）から（Ｃ）を示す。また細胞増殖に対する効果を図５－４（Ｄ）に示す。

図５－４（Ａ）から（Ｃ）のウエスタンブロットの結果に示されるように、ｓｉＲＮＡに対応する遺伝子の発現が抑制されている。また、ＢＲＤ４遺伝子とＡＰＥＸ１遺伝子、ＢＲＤ４遺伝子とＲＰＡ１遺伝子、又はＢＲＤ４遺伝子とＰＯＬＤ４遺伝子の両方を同時にノックダウンしたときに、アポトーシスの指標であるｃｌｅａｖｅｄ ＰＡＲＰの相乗的な増加が認められた。図５－４（Ｄ）の細胞増殖の結果に示されるように、それぞれの遺伝子をノックダウンしたときに細胞増殖が抑制され、両方をノックダウンしたときに相乗的に細胞増殖が抑制された。

＜実施例Ａ１１＞
大腸がん細胞株（ＨＣＴ１１６－／－細胞）に対して、実施例Ａ１に記した要領でｍｉＲ－ＮＣ又はｍｉＲ－１２９３を導入した。その後ネオカルチノスタチン（ＮＣＳ）を２００ｎｇ／ｍＬ添加して、ＤＮＡ切断を行った。２４時間後に以下のようにして免疫蛍光染色でＤＮＡ障害のマーカーであるγＨ２ＡＸの染色を行った。細胞を３．７％ホルムアルデヒド含有ＰＢＳで固定し、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００含有ＰＢＳで処理した。３％ウシ血清含有ＰＢＳでブロッキングを行い、その後、抗γＨ２ＡＸ抗体（１／４００希釈）を１時間室温で反応させた。結合した抗体をＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５５５ ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ抗体（１／５００希釈、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて可視化した。その後、当該切片をＶＥＣＴＡＳＨＩＬＤ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）で対比染色し、Ｎｉｋｏｎ社の蛍光顕微鏡で観察撮影した。結果を図５－５に示す。また、蛍光顕微鏡観察におけるランダムに抽出した３視野におけるγＨ２ＡＸ陽性細胞の割合を測定した。結果を図５－６に示す。

図５－５及び図５－６に示されるように、ｍｉＲ－１２９３導入細胞において、γＨ２ＡＸが多く認められた。すなわち、ｍｉＲ－１２９３導入により、ネオカルチノスタチンによるＤＮＡ障害からのＤＮＡ修復が抑制されたことを示す結果である。また、図５－５及び図５－６に示すようにｍｉＲ－１２９３のターゲットであるＡＰＥＸ１、ＲＰＡ１、ＰＯＬＤ４およびＢＲＤ４を抑制するとｍｉＲ－１２９３同様、ＤＮＡ修復が抑制される結果であった。これらの結果からｍｉＲ－１２９３によるＤＮＡ修復抑制効果がＡＰＥＸ１、ＲＰＡ１、ＰＯＬＤ４およびＢＲＤ４の抑制を介したものであることが示された。

＜実施例Ａ１２＞
大腸がん細胞株（ＨＣＴ１１６－／－細胞）に対して、ｓｉＲＮＡを用いてＢＲＤ４遺伝子のノックダウンした場合と、ｍｉＲ－１２９３を導入した場合とにおける相同組み換え修復を評価した。相同組み換え修復の評価は、ＤＲ－ＧＦＰベクターを用いて、公知の方法（Genes Dev. 2001 Dec 15. 15(24):3237-42.）に従っておこなった。ここでＤＲ－ＧＦＰベクターは蛍光色素ＧＦＰの配列にエンドヌクレアーゼＳｃｅｌで切断される配列を組み込んだベクターであり、Ｓｃｅｌで切断されたのち、相同組み換え修復により切断されたベクターのＤＮＡが修復されるとＧＦＰを発現するベクターである。ＨＣＴ１１６－／－細胞に対してＤＲ－ＧＦＰベクターを導入し、ネオマイシンによってＤＲ－ＧＦＰベクターが安定的に発現している細胞を樹立した。ＤＲ－ＧＦＰベクターにはネオマイシン耐性遺伝子が組み込まれており、ＤＲ－ＧＦＰベクターを発現する細胞はネオマイシンに対して耐性を持つことで生存できるが、逆にＤＲ－ＧＦＰベクターを発現していない細胞はネオマイシン耐性がないため、生存できない。このＤＲ－ＧＦＰ発現ＨＣＴ１１６－／－細胞に対してｍｉＲ－１２９３あるいはコントロールとしてｍｉＲ－ＮＣを導入し、その後、エンドヌクレアーゼＳｃｅｌで処理して２４時間後にＤＲ－ＧＦＰを発色している細胞数をフローサイトメトリーで解析し、ｍｉＲ－ＮＣ投与群の細胞数を１とした時の相対的な細胞数を計算した。また、同様にＤＲ－ＧＦＰ発現ＨＣＴ１１６－／－細胞に対してｓｉ－ＢＲＤ４あるいはコントロールとしてｓｉ－ＮＣを導入し、その後、エンドヌクレアーゼＳｃｅｌで処理して２４時間後にＤＲ－ＧＦＰを発色している細胞数をフローサイトメトリーで解析し、ｍｉＲ－ＮＣ投与群の細胞数を１とした時の相対的な細胞数を計算した。結果を図５－７に示す。

図５－７に示されるように、ＢＲＤ４遺伝子のノックダウン、又はｍｉＲ－１２９３の導入により、ＧＦＰ発現細胞の数はコントロールよりも低くなった。すなわち、ｍｉＲ－１２９３の導入により、相同組み換え修復が抑制されることが示された。

図５－８は、上記の実施例の結果から導かれるｍｉＲ－１２９３が腫瘍細胞の増殖を抑制する推定機序を模式的に示す概念図である。

＜実施例Ｂ１＞
ｍｉＲ－８７６－３ｐ、ｍｉＲ－１２９３の投与によるｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍細胞の増殖抑制効果
７週齢のＢａｌｂ／ｃヌードマウスをオリエンタルバイオサービス社から購入し、無菌状態で飼育した。１０×１０^６個の大腸がん細胞株（ＨＣＴ１１６－／－細胞）を含むＰＢＳ１００μｌをマウスの背側横腹に皮下注射した。この皮下注射以降のｉｎ ｖｉｖｏ試験のスケジュールを図６－１に示す。１ｎｍｏｌのｍｉＲ－８７６－３ｐ、ｍｉＲ－１２９３又はコントロールｍｉＲＮＡと、２００μｌのＡｔｅｒｏＧｅｎｅ（ＫＯＫＥＮ社）の混合物を、腫瘍と皮膚の間の隙間に、計５回投与した（ＨＣＴ１１６－／－細胞の注射から３、７、１０、１４、１７日後）。細胞投与後１９日後、マウスを安楽死させ、腫瘍を摘出した。なお、すべてのマウスに対して行った実験手順は東京医科歯科大学の動物実験委員会の承認を受けた。

図６－２に、ＨＣＴ１１６－／－細胞の注射から１９日後の代表的なマウスの皮下腫瘍の外観及び摘出された腫瘍の写真を示す。

図６－３に、腫瘍体積の推移を示す。腫瘍の体積は、（長径）×（短径）^２×０．５で計算した。図６－３に示されるように、腫瘍の体積は、ｍｉＲ－８７６－３ｐ、ｍｉＲ－１２９３の投与により、コントロールｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ－ＮＣ）の投与と比較して、有意に減少した。

マウス毎に摘出した腫瘍の重量を計量した。結果を図６－４に示す。図６－４に示されるように、ｍｉＲ－８７６－３ｐ又はｍｉＲ－１２９３の投与群の腫瘍の重量は、コントロールｍｉＲＮＡの投与群に比べて、有意に軽い結果であった。

＜実施例Ｂ２＞
ｍｉＲ－８７６－３ｐ及びｍｉＲ－１２９３の発現解析
定量ＲＴ－ＰＣＲを用いて、摘出された腫瘍組織におけるｍｉＲ－８７６－３ｐ及びｍｉＲ－１２９３の発現解析を実施した。腫瘍組織より全ＲＮＡを、ＴＲＩｓｕｒｅ試薬（バイオライン社）を用いて標準的方法で分離した。当該全ＲＮＡから調製された１本鎖ＲＮＡをｍｉＲ－８７６－３ｐ又はｍｉＲ－１２９３に特異的なプライマーを用いて増幅した。ｍｉＲ－８７６－３ｐ及びｍｉＲ－１２９３に対するリアルタイムＲＴ－ＰＣＲは、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７５００ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ（アプライドバイオシステム社）、Ｔａｑｍａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ （アプライドバイオシステム社）、Ｔａｑｍａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（アプライドバイオシステム社）、Ｔａｑｍａｎ ｍｉｃｒｏＲＮＡ Ａｓｓａｙｓ（アプライドバイオシステム社）を用いて、これらの操作マニュアルに従って行った。ｍｉＲ－８７６－３ｐ及びｍｉＲ－１２９３の発現レベルは、全ＲＮＡの初期量の標準化コントロールとしてＲＮＵ６Ｂの発現量により補正することで標準化した。結果を図６－５に示す。

図６－５に示されるように、定量ＲＴ－ＰＣＲによる検討の結果、腫瘍細胞におけるｍｉＲ－８７６－３ｐ又はｍｉＲ－１２９３の発現量は、それぞれのｍｉＲＮＡ投与群において顕著に増加していることが確認できた。

＜実施例Ｂ３＞
免疫染色によって、摘出された腫瘍組織におけるＢＲＤ４遺伝子、ＲＳＫ１遺伝子、ＡＰＥＸ１遺伝子、ＲＰＡ１遺伝子及びＰＯＬＤ４遺伝子の発現量を評価した。腫瘍組織を１０％ホルムアルデヒド含有ＰＢＳで固定し、パラフィン包埋を行い、４μｍ厚の切片に薄切した。腫瘍切片を以下に示すように、アビジン－ビオチン－ペルオキシダーゼ法を用いて、ＢＲＤ４、ＲＳＫ１、ＡＰＥＸ１、ＲＰＡ１、ＰＯＬＤ４に対して免疫組織化学染色を行った。パラフィンで包埋された腫瘍切片について、キシレンで脱パラフィン後、エタノールで再水和をおこなった。１０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で煮沸することで抗原の賦活化を行い、内因性ペルオキシダーゼを不活性化するために０．３％過酸化水素含有メタノールで処理した。その後、当該切片について、抗ＢＲＤ４抗体（１／５００希釈）、抗ＲＳＫ１抗体（１／１００希釈）、抗ＡＰＥＸ１抗体（１／２００希釈）、ＲＰＡ１抗体（１／１００希釈）又は抗ＰＯＬＤ４抗体（１／１００希釈）を用いて、４℃で一晩反応させた。結合した抗体をジアミノベンジジン（ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ－ＥｌｕｔｅＡＢＣｋｉｔ：ベクターラボラトリー社）を用いて可視化した。その後、当該切片をヘマトキシリンで対比染色した。

抗ＢＲＤ４抗体を用いた免疫染色の結果を図６－６に示す。抗ＲＳＫ１抗体を用いた免疫染色の結果を図６－７に示す。抗ＡＰＥＸ１抗体、ＲＰＡ１抗体又は抗ＰＯＬＤ４抗体を用いた免疫染色の結果を図６－８に示す。

図６－６及び図６－７に示す結果から、ｍｉＲ－８７６－３ｐの投与により、インビボの腫瘍組織において、ＢＲＤ４遺伝子及びＲＳＫ１遺伝子の発現が抑制され、腫瘍増殖が抑制されたことが示された。すなわち、ｍｉＲ－８７６－３ｐを含む医薬組成物は、ＢＲＤ４及びＲＳＫ１からなる群から選択される少なくとも１種の発現に起因する種々の腫瘍に対して効果を有することが期待される。

図６－６及び図６－８に示す結果から、ｍｉＲ－１２９３の投与により、インビボの腫瘍組織において、ＢＲＤ４遺伝子、ＡＰＥＸ１遺伝子、ＲＰＡ１遺伝子、及びＰＯＬＤ４遺伝子の発現が抑制され、腫瘍増殖が抑制されたことが示された。すなわち、ｍｉＲ－１２９３を含む医薬組成物は、ＢＲＤ４、ＡＰＥＸ１、ＲＰＡ１、及びＰＯＬＤ４からなる群から選択される少なくとも１種の発現に起因する種々の腫瘍に対して効果を有することが期待される。

従来の研究においても、１つのｍｉＲＮＡは各々の遺伝子のコーディング領域あるいは３'ＵＴＲ領域に直接結合することにより、複数の標的の発現を阻害することができることが示されている。このことは、がんの活性化に関与する複数の経路を１つのｍｉＲＮＡが標的とすることができることを示している。例えば、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４ａは、ＣＣＮＤ１遺伝子、ＣＤＫ６遺伝子、ＭＹＣ遺伝子、ｃ－ＭＥＴ遺伝子、ＮＯＴＣＨ遺伝子といった複数の標的を介して、腫瘍増殖を抑制することが知られている。上記の実施例に示されるように、ｍｉＲ－８７６－３ｐは、ＢＲＤ４遺伝子及びＲＳＫ１遺伝子を標的とすることができる。また、ｍｉＲ－１２９３はＢＲＤ４遺伝子、ＡＰＥＸ１遺伝子、ＲＰＡ１遺伝子及びＰＯＬＤ４遺伝子を標的とすることができる。これらのｍｉＲＮＡの導入により、ヌードマウスの皮下に形成された大腸がん細胞株であるＨＣＴ１１６－／－細胞由来の腫瘍の増大を抑制する効果が認められた。

したがって本実施形態は、ｍｉＲ－８７６－３ｐに由来するポリヌクレオチドを含み、ＢＲＤ４遺伝子及びＲＳＫ１遺伝子が活性化した腫瘍に対する有効性が認められる医薬組成物を提供するものである。また、ｍｉＲ－１２９３に由来するポリヌクレオチドを含み、ＢＲＤ４遺伝子、ＡＰＥＸ１遺伝子、ＲＰＡ１遺伝子及びＰＯＬＤ４遺伝子が活性化した腫瘍に対する有効性が認められる医薬組成物を提供するものである。

Claims (5)

1. ｍｉＲ－１２９３、ｍｉＲ－８７６－３ｐ、ｍｉＲ－４４３８、ｍｉＲ－６７５１、ｍｉＲ－６３４及びｍｉＲ－９２ａ－２－５ｐからなる群から選択されるマイクロＲＮＡをコードする遺伝子の転写産物又はそのプロセッシング産物と同一の塩基配列、又はその塩基配列において１から５塩基が置換、欠損又は付加された塩基配列を有するポリヌクレオチドを含む、腫瘍の処置に用いられる医薬組成物。
2. 処置の対象となる腫瘍は、ＢＲＤ４遺伝子を発現している腫瘍細胞を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
3. 処置の対象となる腫瘍は、大腸がん、膵がん、口腔がん、肺がん、食道がん、胃がん、子宮がん、皮膚がん、血液腫瘍、脳腫瘍、神経芽腫、膠芽腫、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、膀胱がん、食道がん、肝がん及び腎がんからなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項１又は２に記載の医薬組成物。
4. 前記ポリヌクレオチドは、少なくとも１種の修飾ヌクレオチドを含む請求項１から３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
5. 前記ポリヌクレオチドを２本鎖として含む請求項１から４のいずれか１項に記載の医薬組成物。

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