WO2019107487A1 - マイクロｒｎａ及びその誘導体を有効成分とする医薬組成物 - Google Patents

マイクロｒｎａ及びその誘導体を有効成分とする医薬組成物 Download PDF

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稲澤　譲治
泰行 玄
智輝 村松
えり奈 外内
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Definitions

  • FIG. 1-1 is a drawing showing the results of the screening in FIG. 1-1 in a pancreatic cancer cell line Panc1. It is the figure which showed the result of the screening of FIG. 1-2 with the Venn diagram. It is the microscope picture which showed the state of the said cancer cell line in, when introduce
  • the content of each component in the composition is the total amount of the plurality of substances present in the composition unless otherwise specified. means.
  • the microRNA includes a polynucleotide (oligonucleotide) consisting of ribonucleotide and modified nucleotide.
  • the microRNA may be single stranded or double stranded.
  • BET inhibitors that inhibit BRD4 are currently being developed.
  • the BRD4 bromo domain has an inhibitory effect on the region bound to acetylated lysine (see, for example, Wang CY ET AL., TRENDS BIOCHEM SCI, 2015, vol 40, pages 468-79.) .
  • the polynucleotide included in the pharmaceutical composition may be at least one selected from the group consisting of miR-3140, miR-766 and derivatives thereof.
  • miR-3140 may be hsa-miR-3140 and miR-766 may be hsa-miR-766-5p.
  • the derivatives also include those in which at least a part of the nucleotides of these natural microRNAs are modified, and those in which one or two bases are substituted, deleted or added in the base sequence of the natural microRNAs. .
  • the first double stranded polynucleotide can be obtained as a synthetic product, for example, from Ambion Inc. (USA).
  • the following 4 aspects are mentioned as a suitable other aspect of a 1st double stranded polynucleotide.
  • modified nucleotides for example, JP-A-10-304889, WO2005 / 021570, JP-A-10-195098, JP-A-2002-521310, WO2007 / 143315, International See, for example, Publication No. 2008/043753, WO 2008/029619, WO 2008/049085 and the like.
  • the polynucleotide according to the present embodiment can be synthesized using a known polynucleotide synthesis method or the like.
  • the method for synthesizing a polynucleotide includes the phosphoroamidite method and its modified method, the H-phosphonate method and its modified method, enzyme synthesis (in vitro transcription method) and the like.
  • lung cancer is known to be strongly promoted by EGFR
  • the medicament of the embodiment comprising the first double-stranded polynucleotide or the first double-stranded RNA
  • the pharmaceutical composition of this aspect is also effective against lung cancer that has acquired resistance to an EGFR inhibitor.
  • Tumors that exhibit the above-mentioned genetic characteristics are suitable subjects for treatment of the pharmaceutical composition.
  • tumors targeted for treatment in outline, in addition to the above-mentioned NUT midline cancer, esophagus cancer, lung cancer, oral cancer, gastric cancer, colon cancer, uterine cancer, skin cancer, brain tumor, Neuroblastoma, glioblastoma, breast cancer, pancreatic cancer, ovarian cancer, prostate cancer, bladder cancer, esophageal cancer, liver cancer, solid cancer such as kidney cancer, and hematologic malignancy, blood Blood tumors including cancer and the like are exemplified.
  • the objects to be treated are not limited to the external form of these cancers, and preferably, the selection of the objects to be treated based on the above-mentioned genetic characteristics is performed.
  • a local administration that is, a tumor which can directly contact the pharmaceutical composition with the tumor is suitable as a treatment target.
  • CDK2 gene and the CDK6 gene include advanced colorectal cancer, primary / recurrent colorectal cancer, colon cancer, pancreatic cancer, non-small cell lung cancer (NSCLC), endometrial cancer, head and neck Head squamous cell carcinoma, multiple myeloma, breast cancer, colorectal cancer, ovarian cancer, uterine serous cancer, chronic lymphoblastic leukemia, various malignant lymphomas, esophageal squamous cell carcinoma, hepatocellular carcinoma , Benign / malignant thyroid tumor, endometrial adenocarcinoma, soft tissue sarcoma, gastric cancer, esophagus cancer, acute lymphoblastic leukemia, Hodgkin's lymphoma, early NSCLC, malignant pleural mesothelioma, melanoma, retinoblastoma, bone Sarcoma, gastric cancer, Barrett's esophagus cancer,
  • the method of treating a tumor is a method of treating a tumor comprising administering an effective amount of the pharmaceutical composition to a subject.
  • the tumor to be treated is as described above, and is, for example, a tumor expressing at least one selected from the group consisting of BRD4, CDK2, BRD3, EGFR, and CDK6. Also, the details and method of administration of the pharmaceutical composition are as described above.
  • the subject of treatment is, for example, a mammal, which includes humans. The subject of treatment may also be a non-human animal.
  • KYSE150 cells The esophageal cancer cell line (KYSE150 cells) was donated by Dr. Yu Kuwata (Toyama University), and the KYSE150 cisplatin resistant strain was the one established previously (Fujiwara N ET AL., CANCER RES, 2015, vol 75 , pages 3890-3901).
  • Example group A shows the results of studies on miR-X and variants thereof as an active ingredient of a pharmaceutical composition.
  • hsa-miR-3140 was identified as a miRNA that has not been reported as a tumor suppressor miRNA.
  • Target cancer cell lines include pancreatic cancer cell lines [Panc1, MIAPaCa2, CFPAC1 cells, SW1990 cells], and breast cancer cell lines [MDA-MB-231 cells (triple negative breast cancer cell lines: triple negative breast cancer, estrogen receptor, Breast cancer that does not express either progesterone receptor or HER2 in tumor cells, and the effectiveness of hormonal therapy and molecular targeting drugs focusing on these receptors has not been recognized, and it is known as a cancer with a poor prognosis ), SK-BR3 cells, T-47D cells, CRL1500 cells, YMB-1-E cells], lung cancer cell lines [NCI-H1650 cells, NCI-H1975 cells, A549 cells (non-small cell lung cancer cell lines) , HUT29 cells (non-small cell lung cancer cell line), 11-18 cells], hepatoma cell line [Sk Hep1 cells, Hep3B cells, HepG2 cells, Huh7 cells, PLC / PRF / 5 cells, and the
  • Figure 1-5 shows pancreatic cancer cell lines (Pancl (A), MIAPaCa2 (B)), triple negative breast cancer cell line (MDA-MB-231 (C)), esophageal cancer cell line (KYSE150 (D) , Its cisplatin (CDDP) resistant strain KYSE150 CDDP-R (E), hepatoma cell line (Sk-Hep1 (F)), non-small cell lung cancer cell line (HUT29 (G), A549 cells (H)) Shows cell growth curves upon miR-NC or miR-X administration. In all cell lines, miR-X administration showed a remarkable growth inhibitory effect.
  • FIG. 2-2 shows the results of Western blotting in Panc1 cells (A) and MIAPaCa2 cells (B), which are pancreatic cancer cell lines into which miR-X was introduced as described in Example A1. It is a photograph drawing. Western blot performed SDS-PAGE on lysates of whole cells, transferred proteins to PVDF membrane (GE Healthcare), and 1 hour at room temperature using TBS containing 0.05% Tween 20 and 5% skimmed milk After blocking, the membrane was reacted with the antibody overnight at 4 ° C.
  • Fig. 2-3 shows the results of verification by the miR-X luciferase reporter assay using a construct in which the 3 'UTR region of the CDK2 gene (A) and the EGFR gene (B) is incorporated into a luciferase vector.
  • miR-X suppresses the expression of these genes by directly binding to the CDK2 gene and the 3'UTR region of the EGFR gene, and further contributes to a marked suppression of cell proliferation. It shows.
  • Example A4 Identification of BRD4-NUT fusion gene as a functional target of miR-X
  • a rare but extremely high grade NUT midline cancer main pathogenesis is translocation of chromosome 15 and chromosome 19 It is known to be a BRD4-NUT fusion gene produced by FIG. 4-1 shows the relationship between mRNA of BRD4-NUT fusion gene and miR-X. Since miR-X targets the CDS of the BRD4 gene as described above, this BRD4-NUT fusion gene was also predicted to be a target.
  • Example C1 MYCN suppressive effect and proliferation suppressive effect on neuroblastoma cells
  • the cell growth suppressive effect of miR-3410 on these cells was evaluated using cells with and without MYCN gene amplification as neuroblastoma cells.
  • GOTO purchased from the American Culture Collection (ATCC)
  • IMR-32 purchased from the ATCC
  • RT-BMV-C6 provided by the Department of Pediatrics, Kyoto Prefectural University of Medicine
  • SK-N-AS and SH-SY5Y both purchased from ATCC
  • MYCN gene amplification of MYCN is a biomarker of poor prognosis.
  • MiR-3140 showed a better growth inhibitory effect compared to siRNA (si-BRD4) and BET inhibitors (JQ1 and OTX015) against BRD4 in cells with and without MYCN amplification (Fig. 9- 1, Figure 9-2).
  • siRNA si-BRD4
  • BET inhibitors JQ1 and OTX015
  • glioblastoma cell lines include A172, AM-36, Becker, GB-1, KALS-1, KINGS-1, KNS-42, KNS-60, KNS-81, KNS-89, KNS-1, Marcus, NMC-G1, no. 10, No. 11, SF126, T98G (all purchased from JCRB cell bank), U-87 MG (purchased from ATCC), U-251-MG (purchased from JCRB cell bank), U373-MG (purchased from ATCC), YH-13 (purchased from JCRB cell bank) and YKG-1 (purchased from JCRB cell bank) were prepared.
  • cell proliferation is 60 by introduction of miR-X (denoted as miR-3140 in FIG. 10). It was suppressed to less than%.

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Abstract

がんとＢＲＤ４の関係を出発点とする新たな概念に基づく、腫瘍の処置に用いられる医薬組成物が提供される。医薬組成物は、配列番号１、配列番号２、配列番号４又は配列番号５で表される塩基配列を有するポリヌクレオチドを含み、腫瘍の処置に用いられる。

Description

マイクロＲＮＡ及びその誘導体を有効成分とする医薬組成物
　本発明は、マイクロＲＮＡ及びその誘導体を有効成分とする医薬組成物に関する。
　がんは日本人の死因のトップであり、２０１２年の国立がんセンターの統計によると生涯においてがんに罹患する確率は日本人男性６３％、女性４７％と高い。また２０１５年の厚生労働省の統計によると、死亡原因に占めるがんの割合は、日本人男性３２％、女性２４％、全人口の約３分の１ががんで亡くなっている。がんによる死亡は増加し続け、２０３０年には世界で年間１１４０万人ががんで死亡すると予測されている。
　２００３年に終了したヒトゲノム計画により、がんを遺伝子レベル、タンパク質分子レベルで理解し、それをがんの診断、治療に応用しようとする動きは加速され、その結果、がんをめぐる診断および治療の進歩は目覚ましい。特に、治療面においては従来の抗がん剤とは異なる機序として、がん細胞において活性化している遺伝子やタンパク質を標的としたいわゆる分子標的治療薬の進歩、開発も進んでいる。診断時にがんで活性化している分子を同定することでこのような分子標的治療薬が臨床応用されている。
　がんをめぐる上記の状況のもと、本発明者らは、がんとＢＲＤ４の関係に着目して、これを出発点とする新たな概念に基づく、腫瘍の処置に用いられる医薬組成物を提供することを課題とした。
　前記課題を解決するための具体的手段は以下の通りであり、本発明は以下の態様を包含する。第一態様は配列番号１、配列番号２、配列番号４又は配列番号５で表される塩基配列を有するポリヌクレオチドを含む、腫瘍の処置に用いられる医薬組成物である。第二態様は、ｍｉＲ－３１４０、ｍｉＲ－７６６及びこれらの誘導体からなる群から選択される少なくとも１種を含み、ＢＲＤ４、ＣＤＫ２、ＢＲＤ３、ＥＧＦＲ、及びＣＤＫ６からなる群から選択される少なくとも１種を発現している腫瘍を処置するための医薬組成物である。第三態様は、前記医薬組成物を対象に投与することを含む腫瘍の処置方法である。
　本発明によれば、がんとＢＲＤ４の関係を出発点とする新たな概念に基づく、腫瘍の処置に用いられる医薬組成物を提供することができる。
細胞増殖を抑制するマイクロＲＮＡのスクリーニングの手順を示す図面である。 膵がん細胞株Ｐａｎｃ１における、図１－１におけるスクリーニングの結果を示す図面である。 図１－２のスクリーニングの結果をベン図で示した図面である。 ２種類の膵がん細胞株に対して、有効成分の一つである第一の二本鎖ｍｉＲＮＡを導入した場合における当該がん細胞株の状態を示した顕微鏡写真である。 種々のがん細胞株に対して、有効成分の一つである第一の二本鎖ｍｉＲＮＡを導入した場合における細胞増殖曲線を示した図面である。 図１－５に引き続き、種々のがん細胞株に対して、有効成分の一つである第一の二本鎖ｍｉＲＮＡを導入した場合における細胞増殖曲線を示した図面である。 有効成分の一つである第一の二本鎖ｍｉＲＮＡをがん細胞株に導入した後に行った発現アレイ解析の結果と、予測される当該有効成分が３'ＵＴＲ領域に作用する標的遺伝子候補の数を、それぞれベン図で示した図面である。 有効成分の一つである第一の二本鎖ｍｉＲＮＡを導入した２種類の膵がん細胞株における、ＣＤＫ２遺伝子とＣＤＫ６遺伝子の発現抑制について検討したウエスタンブロットの結果を示す図面である。 ＣＤＫ２遺伝子とＥＧＦＲ遺伝子の３'ＵＴＲ領域をルシフェラーゼベクターに組み込んだコンストラクトを用いた、有効成分の一つである第一の二本鎖ｍｉＲＮＡのルシフェラーゼレポーターアッセイの結果を示す図面である。 ２種類の膵がん細胞株に対してｓｉＲＮＡを用いて、ＣＤＫ２遺伝子をノックダウンした場合の細胞増殖に対する影響を示す図面である。 膵がん細胞株と、ＥＧＦＲがドライバーとなってがんの増殖を促進する肺がん細胞株に対してｓｉＲＮＡを用いて、ＥＧＦＲ遺伝子をノックダウンした場合の細胞増殖に対する影響を示す図面である。 ＥＧＦＲがドライバーとなってがんの増殖を促進する肺がん細胞株に対して、有効成分の一つである第一の二本鎖ｍｉＲＮＡを導入した場合の細胞増殖に対する影響を示す図面である。 有効成分の一つである第一の二本鎖ｍｉＲＮＡをがん細胞株に導入した後に行った発現アレイ解析の結果から予測される当該有効成分がコーディング領域に作用する標的遺伝子候補の数を、それぞれベン図で示した図面である。 ２種類の膵がん細胞株に対して有効成分の一つである第一の二本鎖ｍｉＲＮＡを導入した場合の、ＢＲＤ２遺伝子、ＢＲＤ３遺伝子、ＢＲＤ４遺伝子等の発現に対する影響を示すウエスタンブロットの結果を示す図面である。 膵がん細胞株に対してｓｉＲＮＡを用いて、ＢＲＤ２遺伝子、ＢＲＤ３遺伝子、ＢＲＤ４遺伝子をノックダウンした場合の細胞増殖に対する影響を示す図面である。 膵がん細胞にＢＲＤ４遺伝子発現ベクターを導入し、ＢＲＤ４を過剰発現させたときの細胞増殖に対する影響を示す図面である。 ＢＲＤ４遺伝子のコーディング領域のうち、有効成分の一つである第一の二本鎖ｍｉＲＮＡのガイド配列と相同する領域の塩基配列、作製した変異の配列、及び、当該有効成分の導入によるルシフェラーゼレポーターアッセイの結果を示す図面である。 ＢＲＤ３遺伝子のコーディング領域のうち、有効成分の一つである第一の二本鎖ｍｉＲＮＡのガイド配列と相同する領域の塩基配列、作製した変異の配列、及び、当該有効成分の導入によるルシフェラーゼレポーターアッセイの結果を示す図面である。 ＢＲＤ３遺伝子の３'ＵＴＲ領域のうち、有効成分の一つである第一の二本鎖ｍｉＲＮＡのガイド配列と相同する領域の塩基配列、及び、当該有効成分の導入によるルシフェラーゼレポーターアッセイの結果を示す図面である。 膵がん細胞におけるＢＲＤ４の発現に対する、有効成分の一つである第一の二本鎖ｍｉＲＮＡ導入の影響を示すウエスタンブロットの結果を示す図面である。 膵がん細胞におけるＢＲＤ３の発現に対する、有効成分の一つである第一の二本鎖ｍｉＲＮＡ導入の影響を示すウエスタンブロットの結果を示す図面である。 ＢＲＤ４－ＮＵＴ融合遺伝子のｍＲＮＡと、有効成分の一つである第一の二本鎖ｍｉＲＮＡのガイド配列の関係を示している。 ＮＵＴ正中線がんの細胞株に、有効成分の一つである第一の二本鎖ｍｉＲＮＡを導入した結果を、細胞増殖とウエスタンブロットで示した図面である。 ＮＵＴ正中線がんの細胞株に対するＢＥＴ阻害剤の効果を、細胞増殖とウエスタンブロットで示した図面である。 ＮＵＴ正中線がんの細胞株と、そのＢＥＴ阻害剤耐性株の用量反応曲線とＩＣ５０を示した図面である。 ＮＵＴ正中線がんのＢＥＴ阻害剤耐性細胞株に、有効成分の一つである第一の二本鎖ｍｉＲＮＡを導入した結果を、細胞増殖とウエスタンブロットで示した図面である。 マウスを用いたｉｎ　ｖｉｖｏ試験における、有効成分の一つである第一の二本鎖ｍｉＲＮＡの投与スケジュールを示した図面である。 膵がん細胞株の皮下注射から２３日後のマウスの皮下腫瘍の外観を示した写真図面である。 図５－２のマウスから摘出された腫瘍の写真図面である。 上記ｉｎ　ｖｉｖｏ試験における、有効成分の一つである第一の二本鎖ｍｉＲＮＡの投与の効果を、摘出された腫瘍の体積により検討した結果を示す図面である。 上記ｉｎ　ｖｉｖｏ試験において摘出された腫瘍における、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１４０の発現解析を行った結果を示す図面である。 上記ｉｎ　ｖｉｖｏ試験において摘出された腫瘍における、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１４０の発現増加に伴う、ＢＲＤ４遺伝子、ＢＲＤ３遺伝子、ＥＧＦＲ遺伝子、ＣＤＫ２遺伝子の発現の低下を、摘出腫瘍の免疫染色により示した写真図面である。 有効成分である４種類の第一の二本鎖ｍｉＲＮＡ（塩基配列改変型を含む）導入による腫瘍抑制効果を検討した結果を示す図面である。 有効成分である第一の二本鎖ｍｉＲＮＡによる腫瘍増殖抑制の機序のまとめを示した図面である。 有効成分である第二の二本鎖ｍｉＲＮＡ（ｈｓａ－ｍｉＲ－７６６－５ｐ）のがん抑制効果をウエスタンブロットにより検討した結果を示す図面である。 ＢＲＤ４遺伝子と有効成分である第二の二本鎖ｍｉＲＮＡ（ｈｓａ－ｍｉＲ－７６６－５ｐ）の相同領域を、コーディング領域と３'ＵＴＲ領域において示した図面である。 ＢＲＤ４遺伝子の第１と第２のコーディング領域における、有効成分である第二の二本鎖ｍｉＲＮＡ（ｈｓａ－ｍｉＲ－７６６－５ｐ）との相同領域について行ったルシフェラーゼレポーターアッセイの結果を示した図面である。 ＢＲＤ４遺伝子の第３のコーディング領域における、有効成分である第二の二本鎖ｍｉＲＮＡ（ｈｓａ－ｍｉＲ－７６６－５ｐ）との相同領域について行ったルシフェラーゼレポーターアッセイの結果を示した図面である。 ＢＲＤ４遺伝子の第４のコーディング領域における、有効成分である第二の二本鎖ｍｉＲＮＡ（ｈｓａ－ｍｉＲ－７６６－５ｐ）との相同領域について行ったルシフェラーゼレポーターアッセイの結果を示した図面である。 ＢＲＤ４遺伝子の第５のコーディング領域における、有効成分である第二の二本鎖ｍｉＲＮＡ（ｈｓａ－ｍｉＲ－７６６－５ｐ）との相同領域について行ったルシフェラーゼレポーターアッセイの結果を示した図面である。 ＢＲＤ４遺伝子の３'ＵＴＲ領域における、有効成分である第二の二本鎖ｍｉＲＮＡ（ｈｓａ－ｍｉＲ－７６６－５ｐ）との相同領域について行ったルシフェラーゼレポーターアッセイの結果を示した図面である。 ＭＹＣＮ遺伝子の増幅のある神経芽腫細胞株に対して、有効成分の一つである第一の二本鎖ｍｉＲＮＡを導入した場合の細胞増殖に対する影響を示す図面である。 ＭＹＣＮ遺伝子の増幅のない神経芽腫細胞株に対して、有効成分の一つである第一の二本鎖ｍｉＲＮＡを導入した場合の細胞増殖に対する影響を示す図面である。 神経芽腫細胞におけるＢＲＤ４及びＭＹＣＮの発現に対する、有効成分の一つである第一の二本鎖ｍｉＲＮＡ導入の影響を示すウエスタンブロットの結果を示す図面である。 神経芽腫細胞におけるＭＹＣＮの発現に対する、有効成分の一つである第一の二本鎖ｍｉＲＮＡ導入の影響を示す図面である。 膠芽腫細胞株に対して、有効成分の一つである第一の二本鎖ｍｉＲＮＡを導入した場合の細胞増殖に対する影響を示す図面である。
　本明細書において組成物中の各成分の含有量は、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。また、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）には、リボヌクレオチドからなるポリヌクレオチド（オリゴヌクレオチド）に加えて、リボヌクレオチドと修飾ヌクレオチドとからなるポリヌクレオチド（オリゴヌクレオチド）が含まれる。更にマイクロＲＮＡは一本鎖であっても、二本鎖であってもよい。更に、マイクロＲＮＡの改変体には、塩基配列が変更された誘導体、修飾されたヌクレオチドを含む誘導体、修飾されたヌクレオチドを含み、塩基配列が変更された誘導体等が含まれる。以下、本発明の実施形態を詳細に説明する。ただし、以下に示す実施形態は、本発明の技術思想を具体化するための、医薬組成物等を例示するものであって、本発明は、以下に示す医薬組成物等に限定されない。
　ＢＲＤ４は構造上、アセチル化修飾されたリジンに結合するブロモドメインを２つもち、Ｃ末端側にはｐ－ＴＥＦｂ（positive transcription elongation factor b）と結合する領域を有しているタンパク質である（例えば、Jang, M. K., ET AL., MOL. CELL, vol 19, 2005, pages 523-534．参照）。ヒストンのアセチル化修飾は転写活性と正の相関を認め、ｐ－ＴＥＦｂは転写を行うＲＮＡポリメラーゼIIを抑制するタンパク質を不活性化することで転写を活性化する。ＢＲＤ４はアセチル化修飾されたヒストンのリジンに結合することで、そこにｐ－ＴＥＦｂを動員し、転写を促進する働きがある。血液腫瘍、膵がん、乳がんなどいくつかのがん種において、ＢＲＤ４発現の異常な活性化ががん細胞の増殖に寄与し、ＢＲＤ４の発現を抑制することが、がん治療において有効である可能性が報告されている（例えば、Filippakopoulos, P., ET AL., NATURE, vol 468, 2010, pages 1067-1073；Delmore, J. E., ET AL., CELL, 2011, vol 146, 2011, pages 904-917；Dawson, M. A., ET AL., NATURE, 2011, vol 478, pages 529-533；Chapuy, B., ET AL., CANCER CELL, 2013, vol 24, pages 777-790；Shu S, ET AL., NATURE, 2016, vol 529, pages 413-417；Sahai V ET AL., MOL CANCER THER, 2014, vol 13, pages 1907-1917．参照）。そこで、現在、ＢＲＤ４を阻害するＢＥＴ阻害剤が開発されつつある。多くのＢＥＴ阻害剤は、ＢＲＤ４のブロモドメインが、アセチル化リジンと結合する領域の阻害作用を持つ（例えば、Wang CY ET AL., TRENDS BIOCHEM SCI, 2015, vol 40, pages 468-79．参照）。
　本発明者らはこのＢＲＤ４に対するマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の役割に着目した。ｍｉＲＮＡは標的転写産物（ｍＲＮＡ）のコーディング（ＣＤＳ）領域あるいは３'－非翻訳領域（３'ＵＴＲ）への結合を通じて、その翻訳あるいは安定化を妨害することにより、遺伝子発現を調整する、内因性の小分子の非コーディングＲＮＡである（例えば、Bartel DP, CELL, 2004, vol 116, pages 281-297；Ambros V, NATURE 2004, vol 431, pages 350-355．参照）。いくつかのｍｉＲＮＡは腫瘍遺伝子を抑制的に調節することが可能であり、腫瘍抑制型のｍｉＲＮＡの不活化は発がん経路の活性化につながる（例えば、Zhang BH ET AL., DEV BIOL, 2007, vol 302, pages 1-12．参照）。重要なこととして、１つのｍＲＮＡは複数のｍｉＲＮＡによって標的にされる一方、１つのｍｉＲＮＡは複数のｍＲＮＡを標的にすることができる（例えば、Lewis BP ET AL., CELL, 2005, vol 120, pages 15-20．参照）。すなわち、複数の発がん経路に寄与する複数の遺伝子を標的にすることができるｍｉＲＮＡの投与は、がん治療において効果的であると考えられる。
　その結果、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１４０とｈｓａ－ｍｉＲ－７６６－５ｐが、がん抑制効果を有し、特に、ＢＲＤ４の発現が認められるがんとＢＲＤ４－ＮＵＴ融合遺伝子の遺伝子産物の発現が認められるがんに対する優れた抑制効果が認められることを見出すと共に、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１４０は、ＢＲＤ４遺伝子に関連する、ＣＤＫ２、ＣＤＫ６、ＢＲＤ３、及びＥＧＦＲからなる群から選択される少なくとも１種の発現が認められるがんに対しても優れた抑制効果が認められることを見出した。
　本発明の第一態様である医薬組成物は、配列番号１、配列番号２、配列番号４又は配列番号５で表される塩基配列を有するポリヌクレオチドの少なくとも１種を有効成分として含み、腫瘍の処置に用いられる。また、第二態様である医薬組成物は、ｍｉＲ－３１４０、ｍｉＲ－７６６及びこれらの誘導体からなる群から選択される少なくとも１種を含み、腫瘍の処置に用いられる。ここで腫瘍の処置とは、腫瘍について施される何らかの処置であればよく、例えば、腫瘍の治療、改善、進行の抑制（悪化の防止）、予防、腫瘍に起因する症状の緩和等が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　医薬組成物は、腫瘍の処置に用いられ、例えば、幅広いがん種、薬剤耐性がん、難治性がんに対して治療効果を有する医薬組成物が提供される。特に、医薬組成物は、ＢＲＤ４の発現が認められるがん、さらに、ＢＲＤ４－ＮＵＴ融合遺伝子の遺伝子産物の発現が認められる難治性のがんであるＮＵＴ正中線がんに対する処置の効果が認められる。さらに、実施態様の一つである「ｈｓａ－ｍｉＲ－３１４０（成熟ｍｉＲＮＡ）を基礎とする二本鎖ポリヌクレオチド（ＲＮＡであってもよい）」を有効成分として含む医薬組成物は、上記に加えて、ＣＤＫ２、ＣＤＫ６、ＢＲＤ３、及びＥＧＦＲからなる群から選択される少なくとも１種を発現している腫瘍に対して処置の効果が認められる。
　医薬組成物に含まれるポリヌクレオチドは、５’末端又は３’末端に１個以上の任意のヌクレオチドを更に有していてもよい。５’末端又は３’末端に任意のヌクレオチドを有する場合、その残基数は、例えば、１０残基以下であり、好ましくは５残基以下、より好ましくは２残基以下である。また、ポリヌクレオチドは、配列番号１で表される塩基配列を有し、３’末端に２個の任意のヌクレオチドを有していてもよい。ポリヌクレオチドの鎖長は、例えば、２０残基以上３５残基以下、好ましくは２０残基以上３０残基以下である。
　医薬組成物は、ポリヌクレオチドを一本鎖として含んでいてもよく、二本鎖として含んでいてもよい。ポリヌクレオチドを二本鎖として含む場合、少なくとも部分的に二本鎖を形成していればよく、二本鎖の末端の少なくとも一方に一本鎖部分を有していてもよく、二本鎖部分に少なくとも１対のミスマッチ塩基対を有していてもよい。二本鎖の末端に一本鎖部分を有する場合、一本鎖部分を少なくとも３’側に有することが好ましい。また、一本鎖部分の鎖長は、例えば、２残基以上２０残基以下、好ましくは２残基以上１２残基以下、又は２残基以上５残基以下である。一方、二本鎖部分にミスマッチ塩基対を有する場合、ミスマッチ塩基対は連続して配置されてもよく、不連続に配置されてもよい、また、ミスマッチ塩基対の総数は例えば、１０塩基対以下、好ましくは６塩基対以下、又は４塩基対以下であり、また例えば、１塩基対以上、２塩基対以上、又は３塩基対以上である。
　医薬組成物に含まれるポリヌクレオチドは、ｍｉＲ－３１４０、ｍｉＲ－７６６及びこれらの誘導体からなる群から選択される少なくとも１種であってよい。ｍｉＲ－３１４０は、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１４０であってよく、ｍｉＲ－７６６は、ｈｓａ－ｍｉＲ－７６６－５ｐであってよい。また、誘導体には、これらの天然型マイクロＲＮＡの少なくとも一部のヌクレオチドが修飾されたもの、天然型マイクロＲＮＡの塩基配列において、１または２塩基が置換、欠損または付加されているものが含まれる。
　二本鎖のポリヌクレオチドは、下記（１）の二本鎖ポリヌクレオチド（以下、第一の二本鎖ポリヌクレオチドともいう）、及び下記（２）の二本鎖ポリヌクレオチド（以下、第二の二本鎖ポリヌクレオチドともいう）の少なくとも一方であってもよい。更に、第一の二本鎖ポリヌクレオチドは、第一の二本鎖ＲＮＡであってよく、第二の二本鎖ポリヌクレオチドは、第二の二本鎖ＲＮＡであってよい。
（１）第一の二本鎖ポリヌクレオチドは、塩基配列「ＡＧＣＵＵＵＵＧＧＧＡＡＵＵＣＡＧＧＵＡｋ１ｋ２」［Ｇはグアニン、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｔはチミン、及び、Ｕはウラシルを表し、ｋ１とｋ２はそれぞれ独立して任意のヌクレオチドであり、Ｇ、Ｔ又はＵであってもよい：配列番号３］の一本鎖ポリヌクレオチド、並びに、塩基配列「ＵＡＣＣＵＧＡＡＵＵｈＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＵ」［ｈは任意のヌクレオチドであり、Ａ、Ｕ又はＣであってもよい：配列番号４］の一本鎖ポリヌクレオチドからなる、略相補的な二本鎖ポリヌクレオチドである。略相補的な二本鎖ポリヌクレオチドを構成する場合には、ヘアピン構造の形態をとることも可能である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　第一の二本鎖ポリヌクレオチドは、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１４０（成熟ｍｉＲＮＡ）を基礎とするものである。当該ｈｓａ－ｍｉＲ－３１４０（天然型）のガイド鎖は、「ｋ１ｋ２」が「ＧＵ」である塩基配列を有する一本鎖ＲＮＡであり、パッセンジャー鎖は、「ｈ」が「Ａ」である塩基配列を有する一本鎖ＲＮＡである。これらの一本鎖ＲＮＡが相互に略相補的に結合して、例えば、下記式の二本鎖ＲＮＡを構成している。下記式において、塩基間の太線は塩基間の水素結合を示し、当該部分の塩基対が相補的であることを示している。「略相補的」とは、下記式のように、二本鎖ポリヌクレオチドの一部が一本鎖である部分、及び／又は、塩基対の一部が水素結合で結合していない部分（ミスマッチ）、を含みつつ、全体としては二本鎖ポリヌクレオチドを構成している状態であり、二本鎖ポリヌクレオチドの対となっている一本鎖ポリヌクレオチドの構成塩基同士の全てが水素結合した「完全に相補的」な場合を含んでいる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
　第一の二本鎖ポリヌクレオチドは、合成品として例えば、アンビオン社（Ａｍｂｉｏｎ　Ｉｎｃ．：米国）から入手できる。第一の二本鎖ポリヌクレオチドの好適な他の態様として、下記の４態様が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
　これらの二本鎖ポリヌクレオチドは、例えば、株式会社ジーンデザインから入手可能であり、少なくとも１種の修飾ヌクレオチドを含んでいてもよい。
　（２）第二の二本鎖ポリヌクレオチドは、塩基配列「ＡＧＧＡＧＧＡＡＵＵＧＧＵＧＣＵＧＧＵＣＵＵ」（配列番号２）の一本鎖ポリヌクレオチド、並びに、塩基配列「ＡＣＵＣＣＡＧＣＣＣＣＡＣＡＧＣＣＵＣＡＧＣ」（配列番号５）の一本鎖ポリヌクレオチドからなる、略相補的な二本鎖ポリヌクレオチドである。配列番号２は、ｈｓａ－ｍｉＲ－７６６－５ｐ（成熟ｍｉＲＮＡ）の塩基配列であり、配列番号５は、ｈｓａ－ｍｉＲ－７６６－３ｐ（成熟ｍｉＲＮＡ）の塩基配列であり、下記の略相補的構造を有している。天然型の成熟ｍｉＲＮＡでは、配列番号２の塩基配列を有するＲＮＡがガイド鎖として、配列番号５の塩基配列を有するＲＮＡがパッセンジャー鎖として位置付けられている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
　ポリヌクレオチドを構成するヌクレオチドは、少なくとも１個のリボヌクレオチドを含んでいればよく、リボヌクレオチドに代えて対応するデオキシリボヌクレオチド、及び修飾されたヌクレオチドの少なくとも１種を含んでいてもよい。修飾されたヌクレオチドには、リン酸部分が修飾されたヌクレオチド、糖部分が修飾されたヌクレオチド、塩基部分が修飾されたヌクレオチド等が含まれる。修飾されたヌクレオチドは、リン酸部分、糖部分及び塩基部分のいずれかが修飾されたものであってもよく、２種以上の修飾が組み合わされたものであってもよい。修飾されたヌクレオチドについては、例えば、特開平１０－３０４８８９号公報、国際公開第２００５／０２１５７０号、特開平１０－１９５０９８号公報、特表２００２－５２１３１０号公報、国際公開第２００７／１４３３１５号、国際公開第２００８／０４３７５３号、国際公開第２００８／０２９６１９号、国際公開第２００８／０４９０８５号等を参照することができる。
　リン酸部分の修飾としては、酸素原子を硫黄原子に置換した「ホスホロチオエート修飾」（Ｓ化）等が知られている。
　糖部分の修飾としては、非架橋化型修飾と、架橋型修飾が知られている。非架橋型修飾としては、２'位のフッ素（Ｆ）化、Ｏ－メチル化、ＭＯＥ化等の２'位水酸基の修飾、モルフォリノ核酸化による修飾等が挙げられる。また、架橋化型修飾としては、ＬＮＡ（２’，４’－ＢＮＡ）化、ＥＮＡ化等が挙げられる。
　医薬組成物に含まれるポリヌクレオチドは、上述したポリヌクレオチドの塩基配列における１又は２塩基が置換又は欠損したものであってもよく、上述したポリヌクレオチドの任意の位置に１又は２塩基が付加したものであってもよい。
　本実施形態に係るポリヌクレオチドは、公知ポリヌクレオチドの合成法等を用いて合成することが可能である。ポリヌクレオチドの合成法としては、ホスホロアミダイド法及びその改良法、Ｈ－ホスホネート法及びその改良法、酵素合成法（in vitro転写法）等が挙げられる。また、市販品の当該核酸、委託製造された当該核酸を適応することも可能である。
　医薬組成物は、有効成分として、ポリヌクレオチドに加えて、他の抗腫瘍性化合物を更に含んでいてもよい。他の抗腫瘍性化合物としては、例えば、代謝拮抗剤、分子標的薬、アルキル化剤、植物アルカロイド剤、抗がん性抗生物質、プラチナ製剤、ホルモン剤、生物学的応答調節剤、免疫チェックポイント阻害剤などが挙げられる。
　医薬組成物は、上記の有効成分としての核酸（ポリヌクレオチド）とともに適切な医薬製剤担体を含んで、製剤組成物の形態に調製されてもよい。当該製剤担体としては、使用形態に応じた担体を選択することが可能であり、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、界面活性剤等の賦形剤、希釈剤等を使用することができる。また、上記の有効成分としての核酸に対して適切な担体を添加することで使用時に液状となしうる乾燥剤とすることも可能である。
　医薬組成物は、有効成分であるポリヌクレオチドを薬学的に許容される担体に内包、又は結合した状態で含んでいてもよい。例えば、高分子ミセル、シクロデキストリン含有ポリマーで構成されたナノ粒子、安定核酸脂質粒子、多機能エンベローブ型ナノ構造体等のドラッグデリバリーシステムを活用して、医薬組成物の効果をより向上させることが可能である。
　医薬組成物の形態は、上記の有効成分としての核酸を効果的に含有可能な形態であれば、特に限定されるものではなく、錠剤、粉末剤、顆粒剤、丸剤等の固剤、軟膏剤、ハップ剤であってもよい。また、液剤、懸濁剤、乳剤等の注射剤形態とするのも好適である。現状において医薬組成物は、局所への投与が効果的である。この投与形式に適した剤型は、通常は注射剤、軟膏剤、又はハップ剤の形態である。注射剤を用いる局所への投与は、腫瘍に対して、静脈内、皮下、皮内、筋肉内注射等の体外からの注射により、直接有効成分を注入し、さらに、内視鏡を用いて体内（消化管内、子宮内、膀胱内等）の腫瘍に対して、直接有効成分を注入する、等の態様で行われる。軟膏剤又はハップ剤を用いる局所への投与は、皮膚がんに対して直接有効成分を浸潤させる、等の態様で行われる。
　上記の有効成分としての核酸の人体に対する投与量は、一日成人１人あたり、例えば、０．０１μｇ以上１００ｍｇ以下程度である。この投与は１日１回、又は２回以上５回以下であってよく、さらに連日又は数日おきに行うことも可能である。
　医薬品組成物は、例えば、がん治療剤として用いられる。医薬組成物は、その形態に応じた適切な投与経路により、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、皮膚上、消化管内、子宮内、膀胱内、血管内、腹腔内等への投与形態で、投与される。医薬品組成物中の上記の有効成分としての核酸の含有量は当該組成物の投与方法、投与形態、使用目的、患者の症状等に応じて適宜選択され、一定ではないが、通常、有効成分の核酸を０．１質量％以上９５質量％以下程度含有する組成物形態に調製して、上述した有効成分の投与量と投与頻度で投与を行うことが望ましい。
　医薬組成物による処置の対象となる腫瘍は、特に限定されない。例えば、少なくともＢＲＤ４を発現している腫瘍、ＢＲＤ４－ＮＵＴ融合遺伝子の遺伝子産物が発現している腫瘍は好適な処置の対象となる。ＢＲＤ４－ＮＵＴ融合遺伝子は、主に上部消化管気道に発生する難治性のがんであるＮＵＴ正中線がん（ｍｉｄｌｉｎｅ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ）における、１５番染色体と１９番染色体の転座により認められる融合遺伝子である。
　さらに、ＣＤＫ２、ＣＤＫ６、ＢＲＤ３、及びＥＧＦＲからなる群から選択される少なくとも１種を発現している腫瘍もまた好適な処置の対象となる。例えば、医薬組成物が有効成分として第一の二本鎖ポリヌクレオチドを含む場合に好適である。
　ＣＤＫ２とＣＤＫ６について、ＣＤＫは「サイクリン依存性キナーゼ（ｃｙｃｌｉｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｋｉｎａｓｅ）」の略称であり、ＣＤＫ２は、ＣｙｃｌｉｎＥと、ＣＤＫ２－ＣｙｃｌｉｎＥ複合体を形成し、細胞周期をＧ１期からＳ期へ移行させる。当該複合体にＣＤＫインヒビターであるｐ２１が結合すると、細胞周期はＳ期に移行しなくなる（Ｇ１／Ｓ期チェックポイント）。これはＤＮＡに傷害を受けた細胞のがん化を妨げる、重要な機能であることが知られており（例えば、O’Connor P.M, Cancer Surv., 1997, vol 29, pages 82-151．参照）、がん細胞におけるＣＤＫ２の過剰発現は、がんの促進作用として捉えられる。ＣＤＫ６も、細胞周期をＧ１期からＳ期への以降を制御する役割を持つ遺伝子であり、がん細胞におけるＣＤＫ６遺伝子の過剰発現はがんにおける増殖促進作用として捉えられ、ＣＤＫ６を標的とする低分子化合物が開発され、さまざまながんにおいて臨床試験がおこなわれている。当該ＣＤＫ２又はＣＤＫ６が過剰発現しているがんは、第一の二本鎖ポリヌクレオチド、又は第一の二本鎖ＲＮＡを含む態様の医薬組成物の好適な処置対象である。
　ＢＲＤ３は、上述したＢＲＤ４と同じく、ヒストンのアセチル化リジンを認識し，制御タンパク質を集めてクロマチン構造や遺伝子発現を制御する機能を有するタンパク質ドメインである「ブロモドメイン」の一つである。ブロモドメイン繰り返し配列及び特異的末端配列を持つＢＥＴ（ｂｒｏｍｏｄｏｍａｉｎ　ａｎｄ　ｅｘｔｒａ－ｔｅｒｍｉｎａｌ）ファミリータンパク質の一つとして知られており、これをコードする遺伝子は、抗がん剤であるＢＥＴ阻害薬の標的の一つとなっている。ＢＲＤ３が過剰発現しているがんは、第一の二本鎖ポリヌクレオチド、又は第一の二本鎖ＲＮＡを含む態様の医薬組成物の好適な処置対象である。
　ＥＧＦＲは、「上皮成長因子受容体（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）は、細胞の増殖や成長を制御する上皮成長因子（ＥＧＦ）を認識し、シグナル伝達を行う受容体である。多くのがんにおいてＥＦＧＲの過剰発現が認められ（例えば、Normanno N ET AL., Journal of Cellular Physiology,2003, vol.194, No.1, pages 13-19．参照）、がんにおけるＥＧＦＲの過剰発現は予後不良因子である（例えば、Selvaggi G ET AL.,Annals of Oncology,2004,vol.15,No.1,2004,pages 28-32；Hirsch FR,　ET AL., Journal of Clinical Oncology,2003, vol.21, No.20, pages 3798-3807．参照）。特に、肺がんはＥＧＦＲによって強く促進されることが知られており、第一の二本鎖ポリヌクレオチド、又は第一の二本鎖ＲＮＡを含む態様の医薬組成物の好適な処置対象となる。当該態様の医薬組成物は、ＥＧＦＲ阻害剤に対する抵抗性を獲得した肺がんに対しても有効である。
　さらに「がんとの共存」を目指す場合も医薬組成物の適応対象となりうる。すなわち、がんにおけるＢＲＤ４の発現をはじめ、ＢＲＤ３、ＥＧＦＲ、ＣＤＫ２、ＣＤＫ６の発現を抑制することにより、がんの悪性化または進展を防ぎ、天寿を全うすることを目指す場合にも医薬組成物は適していると考えられる。
　上記の遺伝子発現の定量は、常法に従って行うことが可能である。例えば、ＢＲＤ４遺伝子、ＣＤＫ２遺伝子、ＣＤＫ６遺伝子、ＢＲＤ３遺伝子、ＥＧＦＲ遺伝子等の発現の定量方法としては、ノーザンブロッティング法、ウェスタンブロティング法、ｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法（ＩＳＨ法）、定量的ＲＴ－ＰＣＲ法（リアルタイムＰＣＲ法を含む）、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写法、発現アレイ解析法、免疫組織化学染色法等、又はこれらの方法の変法が挙げられる。また、ＮＵＴ正中線がんの診断は、フランキングＮＵＴプローブを用いるｓｐｌｉｔａｐａｒｔ　ＦＩＳＨ法、ＲＴ－ＰＣＲ法、ウェスタンブロティング法、免疫組織化学染色法等に基づく診断が一般的である。
　処置の対象となる腫瘍におけるＢＲＤ４、ＢＲＤ３、ＥＧＦＲ、ＣＤＫ２、ＣＤＫ６等の発現は、過剰発現であってもよい。所定の遺伝子の過剰発現の有無は、以下のようにして特定することができる。それぞれの遺伝子の正常な発現量を基にして適切なカットオフ値を包括的に又は腫瘍個別的に設定する。上述した遺伝子発現の定量法を、処置対象の腫瘍に対して適用して求められる当該腫瘍における所定の遺伝子の発現定量値に対して、前記カットオフ値を当て嵌めることで、所定の遺伝子の過剰発現の有無を特定することができる。このような所定の遺伝子の過剰発現が認められるがんを、医薬組成物の適切な適用対象として特定することができる。
　上述した遺伝子的特徴を示す腫瘍が、医薬組成物の好適な処置対象である。処置の対象となる腫瘍としては、外形的には、上記のＮＵＴ正中線がんの他、食道がん、肺がん、口腔がん、胃がん、大腸がん、子宮がん、皮膚がん、脳腫瘍、神経芽腫、膠芽腫、乳がん、膵がん、卵巣がん、前立腺がん、膀胱がん、食道がん、肝がん、腎がん等の固形がん、及び造血器腫瘍、血液がん等を含む血液腫瘍等が例示される。無論、これらのがんの外形に処置対象が限定されるものではなく、好適には、上記の遺伝子的特徴に基づいた処置対象の選択が行われる。また、有効成分である核酸が確実に腫瘍に到達可能であることから、局所投与、すなわち、医薬組成物を直接腫瘍に接触させることが可能な腫瘍が、処置対象として好適である。
　遺伝子的特徴に基づいた処置対象となる疾患としては、例えば、ＢＲＤ４遺伝子及びＢＲＤ３遺伝子に関連する疾患として、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、混合系統白血病（ＭＬＬ）、バーキットリンパ腫、小児期に最も一般的な脳腫瘍である髄芽腫、ＭＹＣＮ増幅神経芽細胞腫、去勢抵抗性前立腺がん、転移性去勢抵抗性前立腺がん（ＣＲＰＣ）、ユーイング肉腫、結腸直腸がんミエローマ、リンパ腫、白血病、多発性骨髄腫、固形腫瘍（例えば、膵臓および前立腺のがん）、乳がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、髄様偽造／骨髄増殖性新生物、分類できない葉状線維腫瘍、ＮＵＴ正中線がん（ＮＭＣ）、拡散する大型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、トリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）、膵管腺がん、多形性神経膠芽腫、２型真性糖尿病、冠状動脈疾患、心血管疾患（例えば、Int. J. Mol. Sci. 2016, 17,_1849；Cold Spring Harb Perspect Med. 2017; 7:a026674 参照）等が挙げられる。
　ＣＤＫ２遺伝子及びＣＤＫ６遺伝子に関連する疾患として、進行結腸直腸がん、原発性/再発性結腸直腸がん、結腸がん、膵がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、子宮内膜がん、頭頸部扁平上皮がん、多発性骨髄腫、乳がん、結腸直腸がん、卵巣がん、子宮漿液性がん、慢性リンパ芽球性白血病、様々な悪性リンパ腫、食道扁平上皮がん、肝細胞がん、良性/悪性甲状腺腫瘍、子宮内膜腺がん、軟部肉腫、胃がん、食道がん、急性リンパ芽球性白血病、ホジキンリンパ腫、早期ＮＳＣＬＣ、悪性胸膜中皮腫、メラノーマ、網膜芽細胞腫、骨肉腫、胃がん、バレット食道がん、前立腺がん、再発/非再発性前立腺がん、膵・消化管神経内分泌腫瘍、膀胱がん、卵巣がん、小児急性リンパ芽球性白血病、成人急性リンパ芽球性白血病、拡散する大型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、原発性結腸直腸がん、神経膠芽細胞腫、子宮頚部がん、神経膠芽腫/未分化腺星細胞腫、脂肪肉腫、横紋筋肉腫、原発性膵臓がん、神経膠腫、髄芽腫、Ｔ細胞リンパ腫／白血病、ＰＮＥＴ／神経芽腫、肺がん、胸腺がん、リンパ腫、腎がん、肝がん、皮膚がん、神経芽細胞腫、尿路上皮がん、頭頸部がん（例えば、Pharmacological Research 2016, 107, 249-275; European Journal of Medicinal Chemistry, 2017, 142, 424-458．参照）等が挙げられる。
　ＥＧＦＲ遺伝子に関連する疾患として、肺がん、乳がん、胃がん、結腸がん、前立腺がん、腎がん、卵巣がん、頭頸部がん（例えば、Journal of Cellular Physiology, 2002, 194, 13-19.参照）等が挙げられる。
腫瘍の処置方法
　腫瘍の処置方法は、有効量の前記医薬組成物を、対象に投与することを含む腫瘍を処置する方法である。処置の対象となる腫瘍は既述の通りであり、例えば、ＢＲＤ４、ＣＤＫ２、ＢＲＤ３、ＥＧＦＲ、及びＣＤＫ６からなる群から選択される少なくとも１種を発現している腫瘍である。また、医薬組成物の詳細および投与方法は既述の通りである。処置の対象は、例えば、哺乳動物であり、哺乳動物はヒトを含む。また、処置の対象は、非ヒト動物であってもよい。
　本発明は、別の態様として、腫瘍の処置に用いられる医薬組成物の製造における前記ポリヌクレオチドの使用、腫瘍の処置における前記ポリヌクレオチドの使用、腫瘍の処置に使用される前記ポリヌクレオチドをも包含する。　
　以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
１．材料と方法
　実施例の結果の開示に先立ち、それに用いられた材料と試験方法について説明する。
（１）マイクロＲＮＡ（医薬組成物の有効成分の有用性の検証用途）
　（ａ）第一の二本鎖ＲＮＡ（ｈｓａ－ｍｉＲ－３１４０（成熟ｍｉＲＮＡ））
　（ａ）－１：二本鎖ＲＮＡ
　「ｈｓａ－ｍｉＲ－３１４０（成熟ｍｉＲＮＡ）」として、当該マイクロＲＮＡの合成品を、アンビオン社（Ａｍｂｉｏｎ、Ｉｎｃ．：米国）より入手した（アンビオン社の商品名：ＭＣ１７４９６）。当該マイクロＲＮＡは、下記の塩基配列を有する二本鎖ＲＮＡである。以下、この実施例においては、特に断らない限り、この二本鎖ＲＮＡを「ｍｉＲ－Ｘ」と記載する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
　（ａ）－２：改変体
　ｈｓａ－ｍｉＲ－３１４０（成熟ｍｉＲＮＡ）の二本鎖ＲＮＡの改変体の合成を、株式会社ジーンデザインに依頼した。当該改変体は、下記の４種類であり、それぞれは修飾ヌクレオチドを含んでいる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
　以下、本実施例では、この改変体を、特に断らない限り「ｇｅｎｅ　ｄｅｓｉｇｎ－１」と記載する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
　以下、本実施例では、この改変体を、特に断らない限り「ｇｅｎｅ　ｄｅｓｉｇｎ－２」と記載する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
　以下、本実施例では、この改変体を、特に断らない限り「ｇｅｎｅ　ｄｅｓｉｇｎ－３」と記載する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
　以下、本実施例では、この改変体を、特に断らない限り「ｇｅｎｅ　ｄｅｓｉｇｎ－４」と記載する。
　（ｂ）第二の二本鎖ＲＮＡ（ｍｉＲ－７６６）
　ｈｓａ－ｍｉＲ－７６６－５ｐ（成熟ｍｉＲＮＡ）をガイド鎖とする二本鎖ｍｉＲＮＡの合成品を、アンビオン社（Ａｍｂｉｏｎ、Ｉｎｃ．：米国）より入手した（アンビオン社の商品名：ＭＣ２３８４７）。当該二本鎖ｍｉＲＮＡは、ｈｓａ－ｍｉＲ－７６６－５ｐ（成熟ｍｉＲＮＡ）とｈｓａ－ｍｉＲ－７６６－３ｐ（成熟ｍｉＲＮＡ）からなる天然型の略相補鎖として、下記の構造を取ることが知られている。以下、本実施例では、この二本鎖ＲＮＡを、特に断らない限り「ｍｉＲ－７６６－５ｐ」と記載する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
　（ｃ）対照ｍｉＲＮＡとｓｉＲＮＡ
　対照のｍｉＲＮＡには、コントロールｍｉＲＮＡ(ネガティブコントロール＃１；ｍｉＲ－ＮＣ)（アンビオン社）を用いた。
　ＢＲＤ２（ｓｉＧＥＮＯＭＥ　ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ：Ｍ－００４９３５－０２－０００５）、ＢＲＤ３（ｓｉＧＥＮＯＭＥ　ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ：Ｍ－００４９３６－０１－０００５）、ＢＲＤ４（ｓｉＧＥＮＯＭＥ　ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ：Ｍ－００４９３７－０２－０００５）、ＥＧＦＲ（ｓｉＧＥＮＯＭＥ　ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ：Ｍ－００３１１４－０３－０００５）、ＣＤＫ２（ｓｉＧＥＮＯＭＥ　ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ：Ｍ－００３２３６－０４－０００５）に対するｓｉＲＮＡは、各々ダーマコン社から入手した。
（２）がん細胞株
　膵がん細胞株（Ｐａｎｃ１、ＭＩＡＰａＣａ２細胞、ＣＦＰＡＣ１細胞、ＳＷ１９９０細胞）、乳がん細胞株（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞、ＳＫ－ＢＲ３細胞、Ｔ－４７Ｄ細胞、ＣＲＬ１５００細胞、ＹＭＢ－１－Ｅ細胞）、肺がん細胞株（ＮＣＩ－Ｈ１６５０細胞、ＮＣＩ－Ｈ１９７５細胞、Ａ５４９細胞、ＨＵＴ２９細胞、１１－１８細胞）、肝がん細胞株（Ｓｋ－Ｈｅｐ１細胞、Ｈｅｐ３Ｂ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｈｕｈ７細胞、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞）はアメリカンカルチャーコレクション（米国）から購入した。ＮＵＴ正中線がん細胞株（Ｔｙ－８２細胞）はＪＣＲＢ細胞バンクより購入した。食道がん細胞株（ＫＹＳＥ１５０細胞）は嶋田裕博士（富山大学）より供与を受け、ＫＹＳＥ１５０シスプラチン耐性株は以前に樹立されたものを用いた（Fujiwara N ET AL., CANCER RES, 2015, vol 75, pages 3890-3901）。
　Ｐａｎｃ１、ＭＩＡＰａＣａ２、ＫＹＳＥ１５０、ＫＹＳＥ１５０シスプラチン耐性株、ＣＦＰＡＣ１、ＳＷ１９９０、ＨｅｐＧ２、Ｈｕｈ７、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５、ＳＫ－ＢＲ３、Ｔ－４７Ｄ、ＣＲＬ１５００、ＹＭＢ－１－Ｅ細胞はダルベッコ改変イーグル培地に、Ａ５４９、ＨＵＴ２９、ＮＣＩ－Ｈ１９７５、Ｔｙ－８２、ＮＣＩ－Ｈ１６５０、１１－１８細胞はＲＰＭＩ１６４０培地に、Ｓｋ－Ｈｅｐ１、Ｈｅｐ３Ｂ細胞はウイリアムＥ培地に、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞はＬ１５培地に１０％ウシ胎児血清を添加して、５％ＣＯ２・３７℃で培養した。
　大腸がん細胞株ＨＣＴ１１６＋／＋細胞及びＨＣＴ１１６－／－細胞はＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎ研究室より供与を受け、ダルベッコ改変イーグル培地に１０％ウシ胎児血清を添加して５％ＣＯ２・３７℃で培養した。
（３）抗体とＢＥＴ阻害剤
　ウェスタンブロッティング用の抗体として、抗ＢＲＤ４抗体（ｃｅｌｌ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社）、抗ＢＲＤ３抗体（Ｂｅｔｈｙｌ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）、抗ＢＲＤ２抗体（ｃｅｌｌ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社）、抗ＭＹＣ抗体（ｃｅｌｌ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社、抗ＮＵＴ抗体（ｃｅｌｌ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社）、抗ＣＣＮＤ２抗体（ｃｅｌｌ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社）、抗ＥＧＦＲ抗体（サンタクルズバイオテクノロジー社）、抗ＣＤＫ２抗体（サンタクルズバイオテクノロジー社）、抗ＣＤＫ６抗体（ｃｅｌｌ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社）、抗Ｖｉｎｃｕｌｉｎ抗体（シグマ社）、抗βアクチン抗体（シグマ社）を用いた。免疫組織染色用の抗ＢＲＤ４抗体（Ａｔｌａｓ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ社）、抗ＢＲＤ３抗体（Ｂｅｔｈｙｌ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）、抗ＣＤＫ２抗体（Ｂｅｔｈｙｌ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）、抗ＥＧＦＲ抗体（サンタクルズバイオテクノロジー社）を用いた。ＢＥＴ阻害剤は、ＪＱ１（ＡｐＥｘＢＩＯ社）を用いた。
（４）統計解析
　サブグループ間の差はＳｔｕｄｅｎｔ　ｔ－ｔｅｓｔおよびＰａｉｒｅｄ ｔ－ｔｅｓｔ（下記のｉｎ　ｖｉｖｏ試験におけるマウスの腫瘍の重量の解析において用いた）で解析した。計算されたＰ値が０．０５未満の場合、統計学的な有意差ありと判断した。
２．実施例の開示
［実施例群Ａ］
　実施例群Ａ（実施例Ａ１－Ａ５）は、ｍｉＲ－Ｘとその改変体について、医薬組成物の有効成分としての検討を行った結果を示している。
＜実施例Ａ１＞　細胞増殖を抑制するｍｉＲＮＡのスクリーニング
　図１－１は細胞増殖を抑制するｍｉＲＮＡのスクリーニングの手順を示している。
　Ｐａｎｃ１由来細胞＃１、＃２（３０００個／ｗｅｌｌ又は５０００個／ｗｅｌｌ）に、１０９０種類の前駆体ｍｉＲライブラリー［Ｐｒｅ－ｍｉＲ－ｍｉＲＮＡ　Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ　Ｌｉｂｒａｒｙ－Ｈｕｍａｎ　Ｖ１５（アンビオン社）］またはコントロールｍｉＲＮＡの１０ｎｍｏｌ／Ｌを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　ＲＮＡｉＭＡＸ（インビトロゲン社)を用い、添付の手順書に従って導入し、３日後に細胞生存数をクリスタルバイオレット（ＣＶ）染色アッセイで評価した。細胞はＰＢＳで洗浄し、０．２％ＣＶ含有１０％ホルムアルデヒドＰＢＳで５分間固定した。過剰なＣＶ溶液は除去し、完全に空気乾燥された後、染色細胞は２％ＳＤＳ溶液を加えて、プレートを１時間振盪することで溶解した。光学密度（ＯＤ）吸光度はマイクロプレートリーダー（ＡＲＶＯｍｘ；ペルキンエルマー社）を用いて５６０ｎｍで計測し、吸光度百分率をウェル毎に算出した。コントロールウェルにおけるコントロールｍｉＲＮＡを導入した細胞のＯＤ吸光度値は、生存細胞の百分率を決定するため、任意に１００％に設定した。
　図１－２は、上記のＰａｎｃ１＃１（３０００個／ｗｅｌｌ）とＰａｎｃ１＃２（５０００個／ｗｅｌｌ）におけるスクリーニングの結果を表している。１０９０種の前駆体ｍｉＲＮＡを導入したときの、コントロールｍｉＲＮＡと比べた時の細胞生存の比を示している。左がＰａｎｃ１＃１細胞の結果（Ａ）、右がＰａｎｃ１＃２細胞の結果（Ｂ）を示す。コントロールｍｉＲＮＡをトランスフェクションした場合の生存細胞数を１としたときの相対的な生存細胞数を示す。なお、増殖抑制効果の基準としてコントロールとの比で０．６未満とした。
　細胞増殖抑制のカットオフ値を０．６未満としたとき、Ｐａｎｃ１＃１、Ｐａｎｃ１＃２とも増殖抑制をみとめたのは１２種類のｍｉＲＮＡであった。図１－３は、この結果をベン図で表したものである。Ｐａｎｃ１＃１において細胞増殖抑制効果を認めたのは２９種類、Ｐａｎｃ１＃２において増殖抑制効果を認めたのは６５種類認め、両方に共通するものとして１２種類存在することを示している。
　そのうち、ｍｉＲＢａｓｅのデータベース解析でその存在が確からしい（Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ　ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ：ｈｉｇｈ）ｍｉＲＮＡは４種類であった。その４種類のうち、腫瘍抑制ｍｉＲＮＡとして報告が認められないｍｉＲＮＡとして、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１４０が特定された。
　次に、１０ｎｍｏｌ／ＬのｍｉＲ－Ｘ（対照は、コントロールｍｉＲＮＡ(ネガティブコントロール＃１（アンビオン社）：ｍｉＲ－ＮＣ)を、それぞれにＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　ＲＮＡｉＭＡＸを用いて、標的がん細胞株に、添付の手順書に従って導入した。
　標的がん細胞株は、膵がん細胞株［Ｐａｎｃ１、ＭＩＡＰａＣａ２、ＣＦＰＡＣ１細胞、ＳＷ１９９０細胞］、乳がん細胞株［ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞（トリプルネガティブ乳がん細胞株：トリプルネガティブ乳がんは、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、ＨＥＲ２のいずれも腫瘍細胞に発現していない乳がんであって、これらの受容体等に着目したホルモン療法や分子標的薬の有効性が認められず、予後が悪いがんとして知られている）、ＳＫ－ＢＲ３細胞、Ｔ－４７Ｄ細胞、ＣＲＬ１５００細胞、ＹＭＢ－１－Ｅ細胞］、肺がん細胞株［ＮＣＩ－Ｈ１６５０細胞、ＮＣＩ－Ｈ１９７５細胞、Ａ５４９細胞（非小細胞性肺がん細胞株）、ＨＵＴ２９細胞（非小細胞性肺がん細胞株）、１１－１８細胞］、肝がん細胞株［Ｓｋ－Ｈｅｐ１細胞、Ｈｅｐ３Ｂ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｈｕｈ７細胞、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞］、及び食道がん細胞株［ＫＹＳＥ１５０と、そのシスプラチン（ＣＤＤＰ）耐性株ＫＹＳＥ１５０　ＣＤＤＰ－Ｒ］であった。
　図１－４に、上記導入７２時間後の、上記の２種類の膵がん細胞株（Ｐａｎｃ１（Ａ、Ｂ）、ＭＩＡＰａＣａ２（Ｃ、Ｄ））の顕微鏡写真である。それぞれの膵がん細胞株において、ｍｉＲ－Ｘ導入群（Ｂ、Ｄ）で死細胞を多数認め、生存細胞が対照（Ａ、Ｃ）と比べて少ないことが示されている。
　図１－５は、膵がん細胞株（Ｐａｎｃ１（Ａ）、　ＭＩＡＰａＣａ２（Ｂ））、　トリプルネガティブ乳がん細胞株（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（Ｃ））、食道がん細胞株（ＫＹＳＥ１５０（Ｄ）と、そのシスプラチン（ＣＤＤＰ）耐性株ＫＹＳＥ１５０　ＣＤＤＰ－Ｒ（Ｅ））、肝がん細胞株（Ｓｋ－Ｈｅｐ１（Ｆ））、非小細胞性肺がん細胞株（ＨＵＴ２９（Ｇ）、Ａ５４９細胞（Ｈ））における、ｍｉＲ－ＮＣ又はｍｉＲ－Ｘ投与時の細胞増殖曲線を示している。いずれの細胞株においても、ｍｉＲ－Ｘ投与により、顕著な増殖抑制効果が認められた。
　さらに、図１－５に図示したがん細胞株以外の、標的がん細胞株、すなわち、膵がん細胞株［ＣＦＰＡＣ１細胞（Ａ）、ＳＷ１９９０細胞（Ｂ）］、乳がん細胞株［ＳＫ－ＢＲ３細胞（Ｅ）、Ｔ－４７Ｄ細胞（Ｆ）、ＣＲＬ１５００細胞（Ｇ）、ＹＭＢ－１－Ｅ細胞（Ｈ）］、肺がん細胞株［ＮＣＩ－Ｈ１６５０細胞（Ｃ）、１１－１８細胞（Ｄ）］、肝がん細胞株［Ｈｅｐ３Ｂ細胞（Ｉ）、ＨｅｐＧ２細胞（Ｊ）、Ｈｕｈ７細胞（Ｋ）、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞（Ｌ）］、においても、ｍｉＲ－Ｘ投与により、顕著な増殖抑制効果が認められた（図１－６）。
　以上の結果から、ｍｉＲ－Ｘは、難治性のがんを含めて様々ながん種において、著明に増殖抑制効果を示すことが示された。
＜実施例Ａ２＞　ｍｉＲ－Ｘの機能的標的としてのＥＧＦＲ遺伝子、ＣＤＫファミリー遺伝子の同定
　上記のｍｉＲ－ＮＣ又はｍｉＲ－Ｘを導入した、Ｐａｎｃ１細胞、ＭＩＡＰａＣａ２細胞、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞に対して、遺伝子発現のアレイ解析を行った。当該遺伝子発現アレイ解析は、Ａｇｉｌｅｎｔ　４ｘ４４Ｋ遺伝子発現アレイ（アジレントテクノロジー社）を用いて、その操作マニュアルに従って行った。遺伝子発現アレイ解析は、それぞれのｍiＲ導入がん細胞に対して２回ずつ行い、データはＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇソフト（アジレントテクノロジー社）を用いて解析した。
　図２－１は、上記遺伝子発現アレイ解析の結果と、Ｔａｒｇｅｔ　Ｓｃａｎデータベースから予測される、ｍｉＲ－Ｘが３’ＵＴＲ領域に作用する標的遺伝子候補の数をベン図で示している。ｍｉＲ－ＮＣ導入群と比較して２倍を超えて発現が抑制されている遺伝子のうち、当該３種類のがん細胞株に共通する遺伝子は２２８個存在した。この共通遺伝子２２８個のうち、Ｔａｒｇｅｔ　Ｓｃａｎデータベースで、ｍｉＲ－Ｘの３’ＵＴＲ領域の標的遺伝子候補として挙げられている遺伝子は９９個存在した。
　これらの結果から、ｍｉＲ－Ｘの標的候補として、細胞増殖に関連する遺伝子であるＥＧＦＲ遺伝子、ＣＤＫ２遺伝子、ＣＤＫ６遺伝子に着目した。図２－２は、実施例Ａ１において記した要領でｍｉＲ－Ｘを導入した、膵がん細胞株である、Ｐａｎｃ１細胞（Ａ）とＭＩＡＰａＣａ２細胞（Ｂ）において、ウエスタンブロットを行った結果を示す写真図面である。ウエスタンブロットは、全細胞の溶解物でＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、タンパクをＰＶＤＦ膜（ＧＥヘルスケア社）に転写し、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０と５％スキムミルクを含有するＴＢＳを用いて室温で１時間ブロッキングを行った後、当該膜を抗体と共に４℃で一晩反応させた。２次抗体の希釈倍率は、抗ＥＧＦＲ抗体(１／２００)、抗ＣＤＫ２抗体(１／２００)、抗ＣＤＫ６抗体(１／１０００)、抗β－アクチン抗体(１／５０００)であった。当該膜を洗浄後、ＨＲＰ結合抗マウスまたは抗ウサギＩｇＧ抗体（ともに１／５０００）で室温１時間暴露した。結合した抗体は、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ　Ｗｅｓｔ　Ｆｅｍｔｏ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて視覚化した。その結果、これらの膵がん細胞にｍｉＲ－Ｘを導入することによる、ＣＤＫ２遺伝子、ＣＤＫ６遺伝子、及び、ＥＧＦＲ遺伝子の発現の抑制が認められた。
　図２－３は、ＣＤＫ２遺伝子（Ａ）、ＥＧＦＲ遺伝子（Ｂ）の３’ＵＴＲ領域をルシフェラーゼベクターに組み込んだコンストラクトを用いた、ｍｉＲ－Ｘのルシフェラーゼレポーターアッセイによる検証の結果を示している。ｍｉＲ－Ｘのガイド鎖の塩基配列と相同する領域は、ＥＧＦＲ遺伝子、ＣＤＫ２遺伝子共に一つずつ存在し、当該アッセイに用いるルシフェラーゼレポータープラスミドは、ｐｍｉＲＧｌｏ　Ｄｕａｌ－Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ　ｍｉＲＮＡ Ｔａｒｇｅｔ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｖｅｃｔｏｒ(プロメガ社)のルシフェラーゼ遺伝子の下流に、当該相同領域を含むＣＤＫ２遺伝子又はＥＧＦＲ遺伝子の３'ＵＴＲ領域、あるいは、この領域に変異を入れた配列を挿入することで作製した。全ての部位特異的変異は、ＫＯＤ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　ｋｉｔ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて作製した。ルシフェラーゼレポータープラスミドを、Ｐａｎｃ１細胞又はＭＩＡＰａＣａ２細胞に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（インビトロゲン社）を用いて添付の手順書に沿って導入し、次の日にｍｉＲ－Ｘ又はコントロールｍｉＲＮＡを導入した。２日後に、ホタルルシフェラーゼ活性とウミシイタケルシフェラーゼ活性を、Ｄｕａｌ－Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ　Ｒｅｐｏｒｔｅｒ　Ａｓｓａｙ　Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社）を用いて測定し、相対的ルシフェラーゼ活性は対応する内部標準コントロールのウミシイタケルシフェラーゼ活性で補正することで、ホタルルシフェラーゼ活性を標準化し、算出した。
　ＣＤＫ２遺伝子、ＥＧＦＲ遺伝子共、ｍｉＲ－Ｘ導入により、野生型の３’ＵＴＲ領域に対応するルシフェラーゼ活性の低下を認め、ｍｉＲ－Ｘのガイド鎖の塩基配列とマッチする領域に変異を入れたベクターではルシフェラーゼ活性は回復した。これらの結果から、ｍｉＲ－Ｘは、ＣＤＫ２遺伝子とＥＧＦＲ遺伝子の３’ＵＴＲ領域への作用により、直接ＣＤＫ２遺伝子とＥＧＦＲ遺伝子の発現を抑制していることが示された。
　図２－４は、膵がん細胞株であるＰａｎｃ１細胞（Ａ、Ｂ）とＭＩＡＰａＣａ２細胞（Ｃ、Ｄ）にｓｉＲＮＡを作用させて、ＣＤＫ２遺伝子をノックダウンしたときの細胞増殖に対する効果を示している。ＣＤＫ２遺伝子に対するｓｉＲＮＡの作用により、コントロールｓｉＲＮＡ（ｓｉ－ＮＣ）を導入したときと比較した。ウエスタンブロットを実施例Ａ２に記した要領に従って行うことにより、ＣＤＫ２遺伝子の発現が抑制されていることが示された（Ａ、Ｂ）。また、ＭＩＡＰａＣａ２細胞においては、ＣＤＫ２遺伝子のノックダウンに伴い、細胞増殖が抑制されていた（Ｄ）。これにより、ＣＤＫ２遺伝子の発現が実際にこれらの膵がん細胞株の増殖に寄与していることが確認された。また、本実施形態の医薬組成物の有効成分を作用させた場合よりも、細胞増殖の抑制度合いは僅かであることから、医薬組成物の有効性が明らかになっている。
　図２－５は、膵がん細胞株であるＰａｎｃ１細胞（Ａ、Ｂ）と、肺がん細胞株であり、ＥＧＦＲがドライバーとなってがんの増殖を促進しているＮＣＩ－Ｈ１９７５細胞（Ｃ、Ｄ）にｓｉＲＮＡを作用させて、ＥＧＦＲ遺伝子をノックダウンしたときの細胞増殖に対する効果を示す。ＥＧＦＲ遺伝子に対するｓｉＲＮＡの作用により、コントロールｓｉＲＮＡ（ｓｉ－ＮＣ）を導入したときと比較した。ウエスタンブロットを行うことにより、ＥＧＦＲ遺伝子の発現は抑制されていることが示された（Ａ、Ｂ）。また、これらの細胞においては、ＥＧＦＲ遺伝子のノックダウンに伴い、細胞増殖が抑制されていた（Ｃ、Ｄ）。これにより、ＥＧＦＲ遺伝子の発現が実際にこれらのがん細胞株の増殖に寄与していることが確認された。また、本実施形態の医薬組成物の有効成分を作用させた場合よりも、細胞増殖の抑制度合いは僅かであることから、医薬組成物の有効性が明らかになっている。
　図２－６は、肺がん細胞株であるＮＣＩ－Ｈ１９７５細胞に対して、ｍｉＲ－Ｘを導入したときの細胞増殖に対する効果を示している。上記のように、ＮＣＩ－Ｈ１９７５細胞はＥＧＦＲがドライバーとなってがんの増殖を促進している肺がん細胞であり、ＥＧＦＲ阻害剤に対して抵抗性の変異を有することが知られている。このようなＥＧＦＲ阻害剤抵抗性の肺がん細胞に対しても、ｍｉＲ－Ｘを導入すると、ＥＧＦＲの発現が減少し、さらにＣＤＫ２の発現も低下することがウエスタンブロットにより示され（Ａ）、さらに、細胞増殖も著明に抑制されることが明らかになった（Ｂ）。
　これらの結果は、ｍｉＲ－Ｘが、ＣＤＫ２遺伝子と、ＥＧＦＲ遺伝子の３’ＵＴＲ領域に直接結合することで、これらの遺伝子発現を抑制し、さらに、細胞増殖の著しい抑制に寄与していることを示している。
＜実施例Ａ３＞　ｍｉＲ－Ｘの機能的標的としてのＢＲＤ４遺伝子とＢＲＤ３遺伝子の同定
　膵がん細胞株であるＰａｎｃ１細胞とＭＩＡＰａＣａ２細胞、及び、トリプルネガティブ乳がん細胞株であるＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞に、実施例Ａ１に記した要領でｍｉＲ－ＮＣ又はｍｉＲ－Ｘを導入して、これらに上記の発現アレイ解析を行った。図３－１は、これらのｍｉＲ導入細胞に対して行った発現アレイの結果とＳｔａｒＭｉｒＤＢデータベースから予測されるｍｉＲ－Ｘのコーディング領域（ＣＤＳ）の標的遺伝子候補の数を、ベン図で示している。
　ｍｉＲ－ＮＣ導入群と比較して発現が１／２未満に抑制されている遺伝子のうち、上記３種類のがん細胞株に共通する遺伝子は２２８個存在し、このうち、ＳｔａｒＭｉｒＤＢデータベースでｍｉＲ－ＸのＣＤＳの標的遺伝子候補として挙げられている遺伝子は１０３個存在した。
　これらの結果から、ｍｉＲ－Ｘの標的候補として、細胞増殖に関連するＢＲＤ４遺伝子に着目した。
　上記した要領により、ｍｉＲ－Ｘを導入した膵がん細胞株Ｐａｎｃ１細胞とＭＩＡＰａＣａ２細胞におけるＢＲＤ２、ＢＲＤ３、ＢＲＤ４、ＣｙｃｌｉｎＤ２、ＭＹＣ、リン酸化ＳＴＡＴ３（ｐ－ＳＴＡＴ３（Ｔｙｒ７０５））、ＳＴＡＴ３タンパクの発現を、β－ａｃｔｉｎタンパクの発現をポジティブコントロールとしたウエスタンブロットを行うことにより検討した。結果を図３－２の写真図面に示す。図３－２に示すように、Ｐａｎｃ１細胞（Ａ）とＭＩＡＰａＣａ２細胞（Ｂ）において、ｍｉＲ－Ｘの導入によるＢＲＤ４の発現抑制が顕著に認められ、さらに、ＢＥＴファミリーであるＢＲＤ２、ＢＲＤ３タンパクの発現抑制が認められた。ＢＲＤ４の下流のターゲットであるＭＹＣ、ｐ－ＳＴＡＴ３、ＣＣＮＤ２（ＣｙｃｌｉｎＤ２）の発現低下も認められた。
　図３－３は、膵がん細胞株Ｐａｎｃ１にｓｉＲＮＡを用いて、ＢＲＤ２遺伝子、ＢＲＤ３遺伝子、ＢＲＤ４遺伝子をそれぞれノックダウンしたときの、遺伝子発現と細胞増殖に対する効果を、コントロールｓｉＲＮＡ（ｓｉ－ＮＣ）を用いた場合と比較して示している。ウエスタンブロットにより、これらの遺伝子の発現が抑制されていることが示され（Ａ）、細胞増殖も抑制されていた（Ｂ）。
　図３－４は、Ｐａｎｃ１細胞にＢＲＤ４発現ベクターを導入し、ＢＲＤ４遺伝子を過剰発現させたときの細胞増殖に対する影響を示す。ＢＲＤ４発現ベクターはＢＲＤ４のｃＤＮＡをカズサＤＮＡ研究所より購入し、プロメガ社より購入したｐＦＮ２８Ａ　Ｈａｌｏｔａｇ　ＣＭＶ－ｎｅｏ　Ｆｌｅｘｉ　ｖｅｃｔｏｒに組み込んで作製した。ＢＲＤ４遺伝子には、Ｈａｌｏｔａｇというタグをつけることで、外因性（ｅｘｏ）に導入したＢＲＤ４と内因性（ｅｎｄｏ）に発現しているＢＲＤ４を区別できるようにした。ＢＲＤ４発現ベクターの導入により、コントロールであるＥｍｐｔｙ　ｖｅｃｔｏｒを導入した細胞と比べ、外因性に導入されたＢＲＤ４の発現を認め、さらに、ＢＲＤ４の下流のターゲットであるＭＹＣの発現も上昇していることが、ウエスタンブロットの写真図面により示されている（Ａ）。そして、ＢＲＤ４遺伝子の導入によるＢＲＤ４の過剰発現により、細胞増殖が促進していることが分かった（Ｂ）。
　これらの結果から、ｍｉＲ－ＸはＢＲＤ４遺伝子を含むＢＥＴファミリー遺伝子の発現を抑制し、がん細胞の増殖を抑制していることが示された。
　次に、ｍｉＲ－ＸがＢＲＤ４遺伝子、及びＢＲＤ３遺伝子を直接制御しているかどうかを調べるために、ＢＲＤ４遺伝子とＢＲＤ３遺伝子のＣＤＳ領域を、ルシフェラーゼベクターに組み込んだコンストラクトを用いた、ｍｉＲ－Ｘのルシフェラーゼレポーターアッセイによる検証を、概ね実施例Ａ２に記した要領で行った。ｍｉＲ－Ｘのガイド鎖の塩基配列と相同する領域は、ＢＲＤ４遺伝子のＣＤＳには近接して２ヶ所存在し、ＢＲＤ３遺伝子のＣＤＳに１カ所存在する。この領域を含む野生型のＣＤＳ領域、又は、この領域に変異を入れた配列をルシフェラーゼレポーターベクターに組み込み、膵がん細胞株であるＭＩＡＰａＣａ２細胞に導入後、ｍｉＲ－Ｘを導入した。図３－５（Ａ）、図３－６（Ａ）はそれぞれＢＲＤ４遺伝子とＢＲＤ３遺伝子のＣＤＳ配列のうち、ｍｉＲ－Ｘのガイド鎖の塩基配列と本来相同する領域の遺伝子配列と、上記の変異の導入配列を示す。図３－５（Ｂ）は変異体における変異状態を示す。図３－５（Ｃ）、図３－６（Ｂ）に示すように、ＢＲＤ４遺伝子、ＢＲＤ３遺伝子共、ｍｉＲ－Ｘ導入により、野生型のＣＤＳではルシフェラーゼ活性の低下を認め、ｍｉＲ－Ｘのガイド鎖の塩基配列と相同する領域に変異を入れたベクターでは、ルシフェラーゼ活性は回復した。
　また図３－７に示すように、ＢＲＤ３遺伝子の３’ＵＴＲ領域に存在するｍｉＲ－Ｘのガイド鎖の塩基配列と相同する領域（Ａ）で、上記と同様のルシフェラーゼレポーターアッセイを行ったが、ｍｉＲ－Ｘの導入によるルシフェラーゼ活性の低下は認められず（Ｂ）、ｍｉＲ－Ｘは、ＢＲＤ３遺伝子の３’ＵＴＲ領域は標的にしていないことが示された。
　さらにＢＲＤ４遺伝子とＢＲＤ３遺伝子の発現ベクター、及び、これらの遺伝子のＣＤＳにおけるｍｉＲ－Ｘのガイド鎖の塩基配列と相同する領域に、アミノ酸配列を変えないように変異を導入したコンストラクトを用いて、ｍｉＲ－Ｘが実際に、ＢＲＤ３遺伝子とＢＲＤ４遺伝子のＣＤＳを介して遺伝子発現が制御されているか否かを検証した。図３－８、図３－９は、それぞれＢＲＤ４遺伝子、ＢＲＤ３遺伝子の発現が、ｍｉＲ－ＸによりそれぞれのＣＤＳを介して抑制されていることを、ウエスタンブロットの写真図面で示している。これらの図面には、膵がん細胞株であるＭＩＡＰａＣａ２細胞に、ＢＲＤ４遺伝子又はＢＲＤ３遺伝子の発現ベクターと、これらの遺伝子変異ベクターを導入後、ｍｉＲ－Ｘを導入すると、野生型のＢＲＤ４遺伝子又はＢＲＤ３遺伝子を導入した細胞では、その発現がｍｉＲ－Ｘにより抑制されている一方、変異型のＢＲＤ４遺伝子又はＢＲＤ３遺伝子を導入した場合には、ｍｉＲ－Ｘによるこれらの遺伝子の発現抑制が解除されていることが示されている。
　これらの結果から、ｍｉＲ－Ｘは、ＢＲＤ４遺伝子とＢＲＤ３遺伝子のＣＤＳ領域に直接結合することで、これらの遺伝子の発現を抑制していることが明らかになった。
＜実施例Ａ４＞　ｍｉＲ－Ｘの機能的標的としてのＢＲＤ４－ＮＵＴ融合遺伝子の同定
　稀ではあるが、極めて悪性度の高いＮＵＴ正中線がんの主病因は１５番染色体と１９番染色体の転座によってできるＢＲＤ４－ＮＵＴ融合遺伝子であることが知られている。図４－１は、ＢＲＤ４－ＮＵＴ融合遺伝子のｍＲＮＡとｍｉＲ－Ｘの関係を示している。ｍｉＲ－Ｘは、前記のようにＢＲＤ４遺伝子のＣＤＳを標的とするため、このＢＲＤ４－ＮＵＴ融合遺伝子もまた標的であると予測した。
　図４－２にＮＵＴ正中線がんの細胞株Ｔｙ－８２細胞にｍｉＲ－Ｘ導入した結果を、細胞増殖曲線（Ａ）とウエスタンブロットの写真図面（Ｂ）にて示す。Ｔｙ－８２は、ＢＲＤ４－ＮＵＴ融合遺伝子を発現しているが、ｍｉＲ－Ｘの導入により、ＢＲＤ４－ＮＵＴ融合遺伝子の遺伝子産物の発現が抑制され、その下流であるＭＹＣも抑制され、その結果、細胞増殖は著明に抑制されたことが示されている。
　また、ＮＵＴ正中線がんに対して、臨床試験においてＢＥＴ阻害剤が有効とされており、図４－３にＴｙ－８２に対するＢＥＴ阻害剤ＪＱ１の効果を示す。ＪＱ１濃度５００ｎＭで、ＢＲＤ４－ＮＵＴ融合遺伝子の下流であるＭＹＣは抑制され（Ｂ）、細胞増殖は著明に抑制された（Ａ）。
　次に、ｍｉＲ－ＸがＢＥＴ阻害剤の抵抗性を克服できるかどうかを検証するために、Ｔｙ－８２細胞を用いてＪＱ１耐性株を樹立した。すなわち、Ｔｙ－８２細胞に対してＪＱ１を低濃度加えた培養液で培養し、生き残った細胞をＪＱ１が含まれていない培養液で増殖させた後、これをＪＱ１の濃度を前回よりも増加させた培養液で培養し、再び生き残った細胞をＪＱ１が含まれていない培養液で増殖させた後、これをＪＱ１の濃度を前回よりも増加させた培養液で培養した。このＪＱ１の濃度を漸増させて生き残りの細胞を培養確保する工程を１ヶ月以上繰り返し、最終的にＪＱ１の濃度が２．５μＭの培養液でも生存できる細胞を確保し、これを樹立されたＪＱ１耐性株として用いた。
　図４－４は、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ　システムを用いて測定した、Ｔｙ－８２細胞（Ａ）と新たに樹立したＴｙ－８２ＪＱ１耐性株（Ｂ）の、ＪＱ１の用量反応曲線とＩＣ５０を示す。Ｔｙ－８２ＪＱ１耐性細胞はＴｙ－８２細胞と比べＩＣ５０が３倍程度高く、ＪＱ１抵抗性であることが示されている。
　図４－５に、このＴｙ－８２ＪＱ１耐性細胞に対して、ｍｉＲ－Ｘを導入した結果を、細胞増殖曲線（Ａ）とウエスタンブロットの写真図面（Ｂ）にて示す。ｍｉＲ－Ｘの導入により、Ｔｙ－８２ＪＱ１耐性細胞においても、ＢＲＤ４－ＮＵＴ融合遺伝子の発現と、下流のＭＹＣ遺伝子の発現が著明に抑制され、細胞増殖も著明に抑制されることが明らかになった。
これらの結果から、ｍｉＲ－ＸはＢＲＤ４－ＮＵＴ融合遺伝子の発現を抑制することで、ＮＵＴ正中線がんの増殖を抑制し、さらにＢＥＴ阻害剤ＪＱ１抵抗性をも克服することができることが示された。
＜実施例Ａ５＞　ｍｉＲ－Ｘの投与によるｉｎ　ｖｉｖｏでの腫瘍細胞の増殖抑制効果
　７週齢のＢａｌｂ／ｃヌードマウスをオリエンタルバイオサービス社から購入し、無菌状態で飼育した。５×１０６個の膵がん細胞株であるＭＩＡＰａＣａ２細胞を含むＰＢＳ１００μｌをマウスの背側横腹に皮下注射した。図５－１は、この皮下注射以降のｉｎ　ｖｉｖｏ試験のスケジュールである。１ｎｍｏｌのｍｉＲ－Ｘ、又は、コントロールｍｉＲＮＡと、２００μｌのＡｔｅｒｏＧｅｎｅ（ＫＯＫＥＮ社）の混合物を、腫瘍と皮膚の間の隙間に、計５回投与した（ＭＩＡＰａＣａ２細胞の注射から７、１１、１５、１８、２１日後）。細胞投与後２３日後、マウスを安楽死させ、腫瘍を摘出した。すべてのマウスに対して行った実験手順は東京医科歯科大学の動物実験委員会の承認を受けた。
　図５－２は、ＭＩＡＰａＣａ２細胞の注射から２３日後の代表的なマウスの皮下腫瘍の外観を示す。
　図５－３は摘出された腫瘍の写真（Ａ）を示す。各マウス毎に摘出した腫瘍の重量を計量したところ、ｍｉＲ－Ｘの投与群の腫瘍の重量は、コントロールｍｉＲＮＡの投与群に比べて、有意に軽い結果であった（Ｂ）。
　腫瘍の体積は、ｍｉＲ－Ｘの投与により、コントロールｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ－ＮＣ）の投与と比較し、有意に減少した（図５－４）。腫瘍の体積は（長径）×（短径）２×０．５で計算した。
　図５－５は摘出された腫瘍におけるｍｉＲ－３１４０の発現解析を示している。ｍｉＲ－３１４０の発現レベルは定量ＲＴ－ＰＣＲによって算出した結果を示している。
　この定量ＲＴ－ＰＣＲにおいては、腫瘍組織より全ＲＮＡを、ＴＲＩｓｕｒｅ試薬（バイオライン社）を用いて標準的方法で分離し、当該全ＲＮＡから調整された一本鎖ＲＮＡはｍｉＲ－３１４０に特異的なプライマーで増幅された。ｍｉＲ－３１４０に対するリアルタイムＲＴ－ＰＣＲは、ＡＢＩ　Ｐｒｉｓｍ　７５００　Ｆａｓｔ　Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　ｓｙｓｔｅｍ（アプライドバイオシステム社）、Ｔａｑｍａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ　（アプライドバイオシステム社）、Ｔａｑｍａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（アプライドバイオシステム社）、Ｔａｑｍａｎ　ｍｉｃｒｏＲＮＡ　Ａｓｓａｙｓ（アプライドバイオシステム社）を用いて、これらの操作マニュアルに従って行った。ｍｉＲ－３１４０の発現レベルは、全ＲＮＡの初期量の標準化コントロールとしてＲＮＵ６Ｂの発現量により補正することで標準化した。
　この定量ＲＴ－ＰＣＲによる検討の結果、腫瘍細胞におけるｍｉＲ－３１４０の発現は、ｍｉＲ－Ｘ投与群において著明に増加していることが確認できた。
　図５－６には、上記のｍｉＲ－３１４０の発現増加に伴う、ＢＲＤ４遺伝子、ＢＲＤ３遺伝子、ＥＧＦＲ遺伝子、及び、ＣＤＫ２遺伝子の発現の低下を、摘出腫瘍の免疫染色で示した。
　免疫染色において、腫瘍サンプルは１０％ホルムアルデヒド含有ＰＢＳで固定し、パラフィン包埋を行い、４μｍ厚の切片に薄切し、アビジン－ビオチン－ペルオキシダーゼ法でＢＲＤ４、ＢＲＤ３、ＥＧＦＲ、ＣＤＫ２の免疫組織化学染色を行った。パラフィンで包埋された腫瘍切片は、キシレンで脱パラフィン後、エタノールで再水和をおこなった。１０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で煮沸することで抗原の賦活化を行い、当該切片は内因性ペルオキシダーゼを不活性化するために０．３％過酸化水素含有メタノールで処理した。その後、当該切片は、抗ＢＲＤ４抗体（１／５００希釈）、抗ＢＲＤ３抗体（１／５００希釈）、抗ＥＧＦＲ抗体（１／２００希釈）又は抗ＣＤＫ２抗体（１／５００希釈）で、４℃で一晩反応させた。結合した抗体は色抗原としてジアミノベンジジン（ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ－ＥｌｕｔｅＡＢＣｋｉｔ：ベクターラボラトリー社）を用いて可視化し、その後、当該切片はヘマトキシリンで対比染色した。
　これらの結果からｍｉＲ－Ｘの投与により、インビボの腫瘍組織において、ＢＲＤ４遺伝子、ＢＲＤ３遺伝子、ＥＧＦＲ遺伝子及びＣＤＫ２遺伝子の発現が抑制され、腫瘍増殖が抑制されたことが示された。すなわち、ｍｉＲ－３１４０を含む医薬組成物は、ＢＲＤ４、ＢＲＤ３、ＥＧＦＲ、ＣＤＫ２、及びＣＤＫ６からなる群から選択される少なくとも１種の発現に起因する種々の腫瘍に対して効果を有することが期待される。
＜実施例Ａ６＞　改変体のがん細胞に対する抑制効果の検討
　図６は、医薬組成物の有効成分の一部である４種類の第一の二本鎖ｍｉＲＮＡ（塩基配列改変型を含む）導入による腫瘍抑制効果を、ｍｉＲ－Ｘとの比較において検討した結果を示す図面である。すなわち、膵臓がん細胞株であるＭＩＡＰａＣａ２細胞に対して、実施例Ａ１に記した要領で、ｍｉＲ－ＮＣ（図中、ＮＣ）、ｍｉＲ－Ｘ（図中、ｍｉＲＶａｎａ）、ｇｅｎｅ　ｄｅｓｉｇｎ－１、ｇｅｎｅ　ｄｅｓｉｇｎ－２、ｇｅｎｅ　ｄｅｓｉｇｎ－３、及び、ｇｅｎｅ　ｄｅｓｉｇｎ－４を導入し、これらの導入細胞に対してウエスタンブロットの写真図面（Ａ）と、がん細胞の増殖を経時的に追って、これに基づく細胞増殖曲線（Ｂ）を示した。
　この結果により、上記４種の改変体にもｈｓａ－ｍｉＲ－３１４０と同等のがん抑制効果が認められることが明らかになった。
＜実施例Ａ群のまとめ＞
　図７は、上記の実施例Ａ群の結果から導かれる、ｍｉＲ－Ｘが腫瘍増殖を抑制する機序のまとめの図である。
　上記の実施例Ａ群の結果から、ｍｉＲ－Ｘは、直接ＢＲＤ４遺伝子の転写産物ｍＲＮＡのコーディング領域を標的とすることでＢＲＤ４遺伝子のタンパク質レベルの発現を抑制し、さまざまながんにおいて抗がん効果を発揮することを見出した。さらに、ＢＲＤ４－ＮＵＴ融合遺伝子の転写産物ｍＲＮＡを直接標的とすること、ＥＧＦＲ遺伝子とＣＤＫ２遺伝子の転写産物ｍＲＮＡの３’ＵＴＲ領域を標的とすることも明らかになった。また、ＣＤＫ６遺伝子の発現を抑制することも明らかになった。
　がんの治療においてはしばしば、薬剤抵抗性が問題となる。肺がんにおいてはＥＧＦＲ阻害剤が臨床応用され、実際に使用され、有効性も確認されているが、その一方でＥＧＦＲ阻害剤に対する抵抗性が問題となっている。この点上記実施例Ａ群に示したように、ｍｉＲ－Ｘの導入により、ＥＧＦＲ阻害剤抵抗性の肺がん細胞においてもＥＧＦＲそのものを減少させることで当該肺がん細胞の増殖を抑制できることが明らかになり、ｍｉＲ－Ｘが、ＥＧＦＲ抵抗性肺がんの薬剤抵抗性を克服できることを示している。
　また、ＮＵＴ正中線がんは稀な悪性度の極めて高い予後不良のがんであり、その主病因はＢＲＤ４－ＮＵＴ融合遺伝子であることもわかっているが、これまで治療方法はなく、臨床研究レベルでＢＥＴ阻害剤が用いられている（例えば、Stathis A ET AL., CANCER DIS, 2016, vol 6, pages 492-500．参照）。この点上記実施例Ａ群に示したように、ｍｉＲ－ＸがＢＲＤ４－ＮＵＴ融合遺伝子を直接抑制することで、ＮＵＴ正中線がん細胞においても高い抗がん効果を発揮することを見出した。さらにはＢＥＴ阻害剤抵抗性のＮＵＴ正中線がん細胞に対してさえも、増殖を抑制できることを見出した。このことは、ｍｉＲ－Ｘが、難治性のＮＵＴ正中線がんに対して極めて有効であることを示している。
　さらに、ｍｉＲ－Ｘを一部改変した二本鎖ＲＮＡ（ｇｅｎｅ　ｄｅｓｉｇｎ－１、ｇｅｎｅ　ｄｅｓｉｇｎ－２、ｇｅｎｅ　ｄｅｓｉｇｎ－３、及びｇｅｎｅ　ｄｅｓｉｇｎ－４）においても、ｍｉＲ－Ｘと同等のがん抑制効果が認められ、マイクロＲＮＡの構造的なアプローチによる改変により、有効成分の多様化を行うことも可能であることが明らかになった。
　従来の研究によっても、１つのｍｉＲＮＡは各々の遺伝子のコーディング領域あるいは３'ＵＴＲ領域に直接結合することにより、複数の標的の発現を阻害することができることが示されており、このことはがんの活性化に関与する複数の経路を１つのｍｉＲＮＡが標的とすることを示している。例えば、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４ａは、ＣＣＮＤ１遺伝子、ＣＤＫ６遺伝子、ＭＹＣ遺伝子、ｃ－ＭＥＴ遺伝子、ＮＯＴＣＨ遺伝子といった複数の標的を介して、腫瘍増殖を抑制することが知られている（例えば、Sun F ET AL., FEBS LETT, 2008, vol 582, pages 1564-1568；Li Y ET AL., CANCER RES, 2009, vol 69, pages 7569-7576．参照）。上記実施例Ａ群においては、ｍｉＲ－Ｘ及びその改変体が、ＢＲＤ４遺伝子、ＢＲＤ３遺伝子、ＥＧＦＲ遺伝子、ＣＤＫ２遺伝子、及び、ＣＤＫ６遺伝子を標的とすることで、ヌードマウスの皮下に形成された膵がん細胞株であるＭＩＡＰａＣａ２細胞由来の腫瘍の増大を抑制する効果が認められた。
　このように本実施形態は、特に、ＢＲＤ４遺伝子、ＢＲＤ３遺伝子、ＥＧＦＲ遺伝子、ＣＤＫ２遺伝子、又は、ＣＤＫ６遺伝子が活性化した腫瘍、さらに、ＢＲＤ４－ＮＵＴ融合遺伝子を発現している腫瘍に対する有効性が認められる医薬組成物を提供するものである。
［実施例Ｂ］　ｍｉＲ－７６６－５ｐのがん抑制効果の検討
　大腸がん細胞株であるＨＣＴ１１６＋／＋（ｐ５３遺伝子が野生型の細胞株）、ＨＣＴ１１６－／－（野生型のｐ５３遺伝子を欠失させた細胞株）、食道がん細胞株であるＫＹＳＥ１５０、及び、膵がん細胞株であるＭＩＡＰａＣａ２に対して、１０ｎｍｏｌ／ＬのｍｉＲ－７６６－５ｐをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　ＲＮＡｉＭＡＸ（インビトロゲン社)を用いて、標的がん細胞株に、添付の手順書に従って導入し、導入後７２時間後の各導入細胞に対し、実施例Ａ２に記した要領で、ウエスタンブロットを、ＢＲＤ４とＭＹＣに対して行った。その結果を、図８－１に示す。
　図８－１に示すように、ｍｉＲ－７６６－５ｐの導入により、上記のがん細胞のＢＲＤ４遺伝子と、その下流のＭＹＣ遺伝子の発現が抑制されていることが明らかになった。
　次に、ＢＲＤ４遺伝子のＣＤＳ領域と３’ＵＴＲ領域をルシフェラーゼベクターに組み込んだコンストラクトを用いた、ｍｉＲ－７６６－５ｐのルシフェラーゼレポーターアッセイによる検証を行った。ｍｉＲ－７６６－５ｐの塩基配列と相同する領域は、ＣＤＳ領域に５カ所（Ｒ１－５）、３’ＵＴＲ領域に１カ所（Ｒ６）存在する（図８－２）。
　当該アッセイに用いるルシフェラーゼレポータープラスミドは、ｐｍｉＲＧｌｏ　Ｄｕａｌ－Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ　ｍｉＲＮＡ Ｔａｒｇｅｔ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｖｅｃｔｏｒ(プロメガ社)のルシフェラーゼ遺伝子の下流に、当該相同領域を含むＢＲＤ４遺伝子のＣＤＳ領域又は３'ＵＴＲ領域を挿入することで作製した。ルシフェラーゼレポータープラスミドを、大腸がん細胞株であるＨＣＴ１１６－／－細胞に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（インビトロゲン社）を用いて添付の手順書に沿って導入し、次の日にｍｉＲ－７６６－５ｐ又はコントロールｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ－ＮＣ）を導入した。２日後に、ホタルルシフェラーゼ活性とウミシイタケルシフェラーゼ活性を、Ｄｕａｌ－Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ　Ｒｅｐｏｒｔｅｒ　Ａｓｓａｙ　Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社）を用いて測定し、相対的ルシフェラーゼ活性は対応する内部標準コントロールのウミシイタケルシフェラーゼ活性で補正することで、ホタルルシフェラーゼ活性を標準化し、算出した。
　図８－３は、ＢＲＤ４遺伝子のＣＤＳ領域の相同部分のＲ１とＲ２を標的とした場合の上記ルシフェラーゼレポーターアッセイの結果（Ｃ）を示している。なお、図８－３（Ａ）及び（Ｂ）は標的配列の位置関係を示す。このことより、ｍｉＲ－７６６－５ｐはＢＲＤ４のＣＤＳ領域のＲ１とＲ２を標的としていると考えられる。
　図８－４は、ＢＲＤ４遺伝子のＣＤＳ領域の相同部分のＲ３を標的とした場合の上記ルシフェラーゼレポーターアッセイの結果（Ｃ）を示している。なお、図８－４（Ａ）及び（Ｂ）は標的配列の位置関係を示す。このことより、ｍｉＲ－７６６－５ｐはＢＲＤ４のＣＤＳ領域のＲ３を標的としていると考えられる。
　図８－５は、ＢＲＤ４遺伝子のＣＤＳ領域の相同部分のＲ４を標的とした場合の上記ルシフェラーゼレポーターアッセイの結果（Ｃ）を示している。なお、図８－５（Ａ）及び（Ｂ）は標的配列の位置関係を示す。このことより、ｍｉＲ－７６６－５ｐはＢＲＤ４のＣＤＳ領域のＲ４を標的としていないと考えられる。
　図８－６は、ＢＲＤ４遺伝子のＣＤＳ領域の相同部分のＲ５を標的とした場合の上記ルシフェラーゼレポーターアッセイの結果（Ｃ）を示している。なお、図８－６（Ａ）及び（Ｂ）は標的配列の位置関係を示す。このことより、ｍｉＲ－７６６－５ｐはＢＲＤ４のＣＤＳ領域のＲ５を標的としていると考えられる。
　図８－７は、ＢＲＤ４遺伝子の３'ＵＴＲ領域の相同部分のＲ６を標的とした場合の上記ルシフェラーゼレポーターアッセイの結果（Ｃ）を示している。なお、図８－７（Ａ）及び（Ｂ）は標的配列の位置関係を示す。このことよりｍｉＲ-７６６-５ｐはＢＲＤ４遺伝子の３'ＵＴＲ領域を標的にしていないことが示された。
　以上の結果からｍｉＲ－７６６－５ｐはＢＲＤ４遺伝子のＣＤＳ領域のＲ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ５を少なくとも標的とし、ＢＲＤ４の発現を抑制しており、ＢＲＤ４遺伝子を過剰発現しているがんに対して抑制作用があることが示された。
［実施例Ｃ１］　神経芽腫細胞に対するＭＹＣＮ抑制効果と増殖抑制効果
　神経芽腫細胞として、ＭＹＣＮ遺伝子の増幅がある細胞とない細胞を用いて、これらに対するｍｉＲ－３４１０の細胞増殖抑制効果を評価した。ＭＹＣＮ遺伝子の増幅がある細胞株としては、ＧＯＴＯ（アメリカンカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）から購入）、ＩＭＲ－３２（ＡＴＣＣから購入）及びＲＴ－ＢＭＶ－Ｃ６（京都府立医科大学小児科学教室より供与）を準備し、ＭＹＣＮ遺伝子の増幅がない細胞株として、ＳＫ－Ｎ－ＡＳ及びＳＨ－ＳＹ５Ｙ（いずれもＡＴＣＣから購入）を準備した。実施例Ａ１と同様にして、１０ｎｍｏｌ／ＬのｍｉＲ－Ｘ（対照は、コントロールｍｉＲＮＡ(ネガティブコントロール＃１（アンビオン社）：ｍｉＲ－ＮＣ)を、それぞれにＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　ＲＮＡｉＭＡＸ（インビトロゲン社)を用いて、標的がん細胞株に、添付の手順書に従って導入した。また、併せてｓｉ－ＢＲＤ４（２０ｎＭ；対照はｓｉＮＣ）、ＪＱ１（５００ｎＭ；対照はＤＭＳＯ）、及びＯＴＸ０１５（５００ｎＭ；対照はＤＭＳＯ）についても、細胞増殖抑制効果を評価した。結果を図９－１、９－２に示す。
　図９－１は、ＭＹＣＮ遺伝子の増幅があるそれぞれの細胞株におけるｍｉＲ－ＮＣ又はｍｉＲ－Ｘ（図９－１では、ｍｉＲ－３１４０と標記した）導入後の細胞増殖曲線（ＧＯＴＯ細胞株（Ａ）、ＩＭＲ－３２細胞株（Ｂ）、ＲＴ－ＢＭＶ－Ｃ６（Ｃ））、ｓｉ－ＢＲＤ４又はｓｉＮＣ導入後の細胞増殖曲線（ＧＯＴＯ細胞株（Ｄ）、ＩＭＲ－３２細胞株（Ｅ）、ＲＴ－ＢＭＶ－Ｃ６（Ｆ））、ＪＱ１又はＤＭＳＯ添加後の細胞増殖曲線（ＧＯＴＯ細胞株（Ｇ）、ＩＭＲ－３２細胞株（Ｈ）、ＲＴ－ＢＭＶ－Ｃ６（Ｉ））、及びＯＴＸ０１５又はＤＭＳＯ添加後の細胞増殖曲線（ＧＯＴＯ細胞株（Ｊ）、ＩＭＲ－３２細胞株（Ｋ）、ＲＴ－ＢＭＶ－Ｃ６（Ｌ））を示している。いずれの細胞株においても、ｍｉＲ－Ｘ投与により、顕著な増殖抑制効果が認められた。
　図９－２は、ＭＹＣＮ遺伝子の増幅がないそれぞれの細胞株におけるｍｉＲ－ＮＣ又はｍｉＲ－Ｘ（図９－２では、ｍｉＲ－３１４０と標記した）導入後の細胞増殖曲線（ＳＫ－Ｎ－ＡＳ細胞株（Ａ）、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞株（Ｂ））、ｓｉ－ＢＲＤ４又はｓｉＮＣ導入後の細胞増殖曲線（ＳＫ－Ｎ－ＡＳ細胞株（Ｃ）、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞株（Ｄ））、ＪＱ１又はＤＭＳＯ添加後の細胞増殖曲線（ＳＫ－Ｎ－ＡＳ細胞株（Ｅ）、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞株（Ｆ））、及びＯＴＸ０１５又はＤＭＳＯ添加後の細胞増殖曲線（ＳＫ－Ｎ－ＡＳ細胞株（Ｇ）、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞株（Ｈ））を示している。いずれの細胞株においても、ｍｉＲ－Ｘ投与により、顕著な増殖抑制効果が認められた。
［実施例Ｃ２］
　ｍｉＲ－ＮＣ又はｍｉＲ－Ｘを導入した、ＭＹＣＮの増幅がある神経芽腫細胞株におけるＢＲＤ４及びＭＹＣＮの発現、並びにＭＹＣＮの増幅がない神経芽腫細胞株におけるＢＲＤ４及びＭＹＣの発現について、実施例Ａ２に準じて、ウエスタンブロットにより評価した。結果を図９－３に示す。図９－３（Ａ）は、ＭＹＣＮの増幅がある神経芽腫細胞株におけるＢＲＤ４及びＭＹＣＮの発現量を示し、図９－３（Ｂ）は、ＭＹＣＮの増幅がない神経芽腫細胞株におけるＢＲＤ４及びＭＹＣＮの発現量を示す。
［実施例Ｃ３］
　ｍｉＲ－ＮＣ又はｍｉＲ－Ｘ（図９－４では、ｍｉＲ－３１４０と標記した）を導入した神経芽腫細胞株（ＩＭＲ－３２及びＲＴ－ＢＭＶ－Ｃ６）におけるＭＹＣＮ遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを、ＧＡＰＤＨ遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを基準として、定量ＲＴ－ＰＣＲにより評価した。結果を図９－４に示す。図９－４（Ａ）は、ＩＭＲ－３２細胞株におけるＭＹＣＮの発現量を示し、図９－４（Ｂ）は、ＲＴ－ＢＭＶ－Ｃ６細胞株におけるＭＹＣＮの発現量を示す。
　神経芽腫において、ＭＹＣＮの遺伝子増幅は予後不良のバイオマーカーである。ＭＹＣＮ増幅のある細胞、及び増幅のない細胞のいずれもＢＲＤ４に対するｓｉＲＮＡ（ｓｉ－ＢＲＤ４）やＢＥＴ阻害剤（ＪＱ１およびＯＴＸ０１５）と比べ、ｍｉＲ－３１４０は良好な増殖抑制効果を示した（図９－１、図９－２）。ＭＹＣＮ増幅のある細胞において、ｍｉＲ－３１４０の導入（１０ｎＭ）はＢＲＤ４の抑制を認め、さらにＭＹＣＮのｍＲＮＡおよびタンパクレベルの発現低下を認めた。一方、ＭＹＣＮの増幅のない細胞ではＭＹＣの発現低下を認めた（図９－３、図９－４）。
［実施例Ｄ１］
　２２種類の膠芽腫細胞株において、ｍｉＲ－Ｘによる細胞増殖抑制効果を評価した。実施例Ａ１に準じて、ｍｉＲ－Ｘを２０ｎＭの濃度でｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ後、７２時間後にクリスタルバイオレット染色により、細胞増殖を評価した。
　膠芽腫細胞株としては、Ａ１７２、ＡＭ－３６、Ｂｅｃｋｅｒ、ＧＢ－１、ＫＡＬＳ－１、ＫＩＮＧＳ－１、ＫＮＳ－４２、ＫＮＳ－６０、ＫＮＳ－８１、ＫＮＳ－８９、ＫＳ－１、Ｍａｒｃｕｓ、ＮＭＣ－Ｇ１、Ｎｏ．１０、Ｎｏ１１、ＳＦ１２６、Ｔ９８Ｇ（以上、いずれもＪＣＲＢ細胞バンクより購入）、Ｕ－８７ＭＧ（ＡＴＣＣから購入）、Ｕ－２５１－ＭＧ（ＪＣＲＢ細胞バンクより購入）、Ｕ３７３－ＭＧ（ＡＴＣＣから購入）、ＹＨ－１３（ＪＣＲＢ細胞バンクより購入）及びＹＫＧ－１（ＪＣＲＢ細胞バンクより購入）を準備した。
　図１０（Ａ）から（Ｖ）に示すように、２２種類中、１９種類の膠芽腫細胞において、ｍｉＲ－Ｘ（図１０では、ｍｉＲ－３１４０と標記した）の導入により、細胞増殖は６０％以下に抑えられた。
　日本国特許出願２０１７－２２９０４６７号（出願日：２０１７年１１月２９日）の開示はその全体が参照により本明細書に取り込まれる。本明細書に記載された全ての文献、特許出願、及び技術規格は、個々の文献、特許出願、及び技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書に参照により取り込まれる。

Claims (14)

  1. 　配列番号１、配列番号２、配列番号４、又は配列番号５で表される塩基配列を有するポリヌクレオチドを含む、腫瘍の処置に用いられる医薬組成物。
  2. 　前記ポリヌクレオチドは、５’末端又は３’末端に１個以上の任意のヌクレオチドを更に有する請求項１に記載の医薬組成物。
  3. 　前記ポリヌクレオチドは、配列番号１で表される塩基配列を有し、３’末端に２個の任意のヌクレオチドを有する請求項１又は２に記載の医薬組成物。
  4. 　前記ポリヌクレオチドを二本鎖として含む請求項１から３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  5. 　前記ポリヌクレオチドが、下記（１）の二本鎖ポリヌクレオチド、及び下記（２）の二本鎖ポリヌクレオチドの少なくとも一方である請求項１から４のいずれか１項に記載の医薬組成物：
    （１）塩基配列「ＡＧＣＵＵＵＵＧＧＧＡＡＵＵＣＡＧＧＵＡｋ１ｋ２」［ｋ１とｋ２はそれぞれ独立して、任意のヌクレオチドである］の一本鎖ポリヌクレオチド、並びに、塩基配列「ＵＡＣＣＵＧＡＡＵＵｈＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＵ」［ｈは、任意のヌクレオチドである］の一本鎖ポリヌクレオチドからなる、略相補的な二本鎖ポリヌクレオチド；
    （２）塩基配列「ＡＧＧＡＧＧＡＡＵＵＧＧＵＧＣＵＧＧＵＣＵＵ」の一本鎖ポリヌクレオチド、並びに、塩基配列「ＡＣＵＣＣＡＧＣＣＣＣＡＣＡＧＣＣＵＣＡＧＣ」の一本鎖ポリヌクレオチドからなる、略相補的な二本鎖ポリヌクレオチド。
  6. 　前記ポリヌクレオチドは、少なくとも１種の修飾ヌクレオチドを含む請求項１から５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  7. 　前記ポリヌクレオチド中、１または２塩基が置換、欠損または付加されている請求項１から６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  8. 　前記ポリヌクレオチドが、薬学的に許容される担体に内包、又は結合している請求項１から７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  9. 　処置の対象となる腫瘍は、ＢＲＤ４を発現している腫瘍細胞を含む、請求項１から８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  10. 　処置の対象となる腫瘍は、ＢＲＤ４－ＮＵＴ融合遺伝子の遺伝子産物を発現している腫瘍細胞を含む、請求項１から９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  11. 　処置の対象となる腫瘍は、ＣＤＫ２、ＢＲＤ３、ＥＧＦＲ、及びＣＤＫ６からなる群から選択される少なくとも１種を発現している腫瘍細胞を含む請求項１から１０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  12. 　処置の対象となる腫瘍は、食道がん、肺がん、口腔がん、胃がん、大腸がん、子宮がん、皮膚がん、血液腫瘍、脳腫瘍、神経芽腫、膠芽腫、乳がん、膵がん、卵巣がん、前立腺がん、膀胱がん、食道がん、肝がん、腎がん及びＮＵＴ正中線がんからなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項１から１１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  13. 　処置の対象となる腫瘍は、前記医薬組成物の局所への投与が可能な腫瘍である、請求項１から１２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  14. 　ｈｓａ－ｍｉＲ－３１４０、ｈｓａ－ｍｉＲ－７６６、及びこれらの誘導体からなる群から選択される少なくとも１種を含む、ＢＲＤ４、ＣＤＫ２、ＢＲＤ３、ＥＧＦＲ、及びＣＤＫ６からなる群から選択される少なくとも１種を発現している腫瘍を処置するための医薬組成物。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO2021132309A1 (ja) * 2019-12-24 2021-07-01 国立大学法人 東京医科歯科大学 医薬組成物

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