JP5131927B2 - Ｒｐｎ２遺伝子発現抑制剤の用途 - Google Patents

Description

本発明は、ＲＰＮ２遺伝子発現抑制剤の用途、すなわちガン細胞増殖抑制剤、このガン細胞増殖抑制剤を含む抗ガン剤、およびＲＰＮ２遺伝子発現抑制剤の使用方法に関する。

タキサン類（ドセタキセル、パクリタキセル）は乳ガン、肺ガン、胃ガンなどの治療に用いられる抗ガン剤の一つであり、例えばドセタキセルはガン、特に乳ガンの治療のために最も有効な抗ガン剤の一つである（非特許文献１、非特許文献２）。外科手術前にドセタキセルを投与することで、腫瘍サイズを縮小させ、手術の成功率を高めることができることから、ネオアジュバント（neoadjuvant）として使用されている。

ドセタキセル等のタキサン類（タキサン系化合物）は微小管の動態を阻害することによって作用し、それによって細胞を細胞分裂のＭ期に停止させ、続いてアポトーシスのプログラムを活性化することが報告されている（非特許文献２〜５）。
Heys, S.D.ら, Clinical breast cancer, 2002, Suppl 2, p.S69-74 Jordan, M.A.ら, Current medicinal chemistry. Anti-cancer agents, 2002, 第２巻, p.1-17 Rao, S.ら, Journal of the National Cancer Institute, 1992, 第８４巻, p.785-788 Schiff, P.B.ら, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1980, 第７７巻, p.1561-1565 Stein, C.A., Seminars in oncology, 1999, 第２６巻, p.3-7

ところで、タキサン類は非常に有効な抗ガン剤でありながら、乳ガン患者の約半分はタキサン類による化学療法に応答せず、投与による副作用を生じるのみであることが知られている。

そこで、本発明者等は、治療に対する応答性を示す（タキサン類による化学的治療が有効である）乳ガン由来のサンプル（以下、「応答性サンプル」という）および応答性を示さない（タキサン類による化学的治療が無効である）乳ガン由来のサンプル（以下、「非応答性サンプル」という）にて、遺伝子発現プロファイル解析を行い、特定の遺伝子の発現が非応答性サンプルにて共通して高いことを見出し、およびこの知見に基づき当該特定の遺伝子の発現と化学的治療の有効性との関係について鋭意研究した結果、本発明を完成させるに至った。

すなわち、本発明は、以下の（１）〜（７）を提供する。
（１）ＲＰＮ２遺伝子発現抑制剤を含むガン細胞増殖抑制剤であって、前記ＲＰＮ２遺伝子発現抑制剤が、ＲＰＮ２遺伝子の所定の配列に対応する配列を有するｓｉＲＮＡである、ガン細胞増殖抑制剤；
（２）ＲＰＮ２遺伝子発現抑制剤および抗ガン作用を示す薬剤を含むガン細胞増殖抑制剤であって、前記ＲＰＮ２遺伝子発現抑制剤が、ＲＰＮ２遺伝子の所定の配列に対応する配列を有するｓｉＲＮＡである、ガン細胞増殖抑制剤；
（３）（１）項または（２）項に記載のガン細胞増殖抑制剤において、アテロコラーゲンをさらに含むことを特徴とするガン細胞増殖抑制剤；
（４）（２）項または（３）項に記載のガン細胞増殖抑制剤において、抗ガン作用を示す薬剤が、タキサン類から選ばれる少なくとも一つであるガン細胞増殖抑制剤；
（５）（２）項または（３）項に記載のガン細胞増殖抑制剤において、抗ガン作用を示す薬剤が、白金製剤から選ばれる少なくとも一つであるガン細胞増殖抑制剤；
（６）（１）項から（５）項のいずれか一項に記載のガン細胞増殖抑制剤において、ガン細胞増殖抑制剤は、ガン化した細胞のアポトーシスを促進することを特徴とするガン細胞増殖抑制剤；
（７）（１）項から（６）項のいずれか一項に記載のガン細胞増殖抑制剤を含む抗ガン剤。

本発明によれば、ＲＰＮ２遺伝子発現抑制剤の新規用途が提供される。

上述した目的、およびその他の目的、特徴および利点は、以下に述べる好適な実施の形態、およびそれに付随する以下の図面によってさらに明らかになる。

薬剤非応答性細胞における表１に示す各遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡの導入による対応遺伝子の細胞増殖抑制率を示すグラフである。 薬剤非応答性細胞における表１に示す各遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ導入による対応遺伝子のアポトーシス誘導率を示すグラフである。 ｓｉＲＮＡにより誘導されたアポトーシス細胞の割合を示すグラフである。 細胞核ヘキスト染色により、アポトーシス細胞を観察した図である。 ｓｉＲＮＡにより抑制されたＲＰＮ２遺伝子の発現量を示すグラフである。 ヌードマウスにおける腫瘍増殖試験のプロトコールを示す図である。 図６にて行った試験の結果を示すグラフである。 ヌードマウスにおけるＲＰＮ２遺伝子発現抑制試験の結果を示すグラフである。 ヌードマウスにおけるＲＰＮ２遺伝子発現抑制試験の結果を示すグラフである。 ヌードマウスにおけるアポトーシス誘導試験の結果を示す図である。 薬剤の非存在下におけるＲＰＮ２遺伝子発現抑制試験の結果を示すグラフである。 他の薬剤に対して非応答性を示すガン細胞におけるＲＰＮ２遺伝子発現抑制試験の結果を示すグラフである。 ヒト肝臓ガン細胞におけるＲＰＮ２遺伝子発現抑制試験の結果を示すグラフである。５回試験を行って、平均をとった。 様々な配列のｄｓＲＮＡを用いたヒト大腸ガン細胞におけるＲＰＮ２遺伝子発現抑制試験の結果を示すグラフである。

以下、本発明の実施形態について説明する。
本発明者らにより、ガン患者から採取したガン化された細胞に抗ガン作用を示す薬剤、例えばタキサン類から選ばれる少なくとも一つ、例えばドセタキセル、パクリタキセルなどを作用させると、薬剤に対して応答性を示すガン化細胞と、示さないガン化細胞とに分かれることが、確認されている。また、この薬剤に対して応答性を示さないガン化細胞において、遺伝子発現変動を調べたところ、ＲＰＮ２遺伝子をはじめとする種々の遺伝子発現レベルの上昇が見られた。

そこで、発現レベルの上昇が見られた遺伝子のサイレンシング実験を行うことによりガン化細胞の薬剤応答性についてスクリーニングしたところ、薬剤応答性を示さないガン化細胞においてＲＰＮ２遺伝子発現を抑制したときに、これらガン化細胞において薬剤応答性が観察される、すなわちガン化細胞に抗ガン作用を示す薬剤によるアポトーシスが促進されるという知見を得た。

一方、ガン化細胞に抗ガン作用を示す薬剤を併用しなくても、ＲＰＮ２遺伝子発現を抑制させるだけで、このガン化細胞のアポトーシスが促進されるという知見も得られた。

そこで一つの側面から見ると、本発明は、ＲＰＮ２遺伝子発現抑制剤を含み、あるいはＲＰＮ２遺伝子発現抑制剤および前述したような抗ガン作用を示す薬剤を含むガン細胞増殖抑制剤を提供するものである。

ここで、抗ガン作用を示す薬剤としては、タキサン類等の微小管作用薬だけでなく、代謝拮抗剤、ＤＮＡアルキル化剤、ＤＮＡ結合剤（白金製剤）、抗ガン性抗生物質などが挙げられる。具体的には、塩酸アムルビシン、塩酸イリノテカン、イホスファミド、エトポシド、ゲフィニチブ、シクロフォスファミド、シスプラチン、トラスツズマブ、５−フルオロウラシル、マイトマイシンＣ、メシル酸イマチニブ、メソトレキサート、リツキシマブ、アドリアマイシンなどが挙げられる。また、これら抗ガン性を示す薬剤を、単独で用いてもよいし、２種以上併用して用いてもよい。

また、適用可能なガン細胞としては、乳ガン細胞、胃ガン細胞、大腸ガン細胞、肺ガン細胞、前立腺ガン細胞、血球系ガン細胞などの多種多様なガン細胞が挙げられる。

ここで、ＲＰＮ２（ribophorin II）は、細胞内小胞に存在し、たんぱく質の糖鎖付加に関与する糖転移化酵素複合体の構成分子（サブユニット）の一つである。この酵素の活性には、ＳＴＴ３からなるサブユニットが必須であることが知られているが、ＲＰＮ２に関しては機能が明らかにされていない。また、ＲＰＮ２遺伝子とは、このＲＰＮ２サブユニットをコードする遺伝子であり、配列番号１に示した塩基配列を有するものである。

また、ＲＰＮ２遺伝子発現抑制剤とは、ＲＰＮ２遺伝子の発現を抑制する薬剤であって、低分子化合物、例えばＲＮＡ干渉によりＲＰＮ２遺伝子の発現を抑制する低分子化合物である。

ここで、ＲＮＡ干渉とは、低分子のnon-coding二重鎖（ｄｓ）ＲＮＡ分子により配列特異的に遺伝子発現を抑制する現象をいい、例えばｓｉ（small interfering）ＲＮＡによる標的ｍＲＮＡの切断、ｓｉＲＮＡによる標的ＤＮＡ領域のヘテロクロマチン化を介した遺伝子サイレンシング、ｍｉ（micro）ＲＮＡによる翻訳抑制、転写抑制、ｍＲＮＡの分解等を指す。

ｓｉＲＮＡは、対象遺伝子であるＲＰＮ２遺伝子の配列に基づいて配列設計をすることができ、人工合成可能であるという観点から、本発明の実施形態において好ましく用いられる。

すなわち、ＲＰＮ２遺伝子発現抑制剤として用いられる低分子化合物が、ＲＰＮ２遺伝子の所定の配列に対応する配列、すなわち標的となるｍＲＮＡの一部の配列に対応する配列を有するｓｉＲＮＡであることが好ましい。この配列の一具体例としては、配列番号１に示したＲＰＮ２遺伝子配列の中の１１９４番目から１２１２番目までの配列（配列番号２）に対して、センス鎖となる配列番号３のＲＮＡおよびアンチセンス鎖となる配列番号４のＲＮＡからなるｄｓＲＮＡが挙げられる。このｄｓＲＮＡにおいて、各鎖の３'末端には、２塩基のオーバーハングが存在するため、二重鎖部分は１９塩基長となる。

このようなｓｉＲＮＡは、化学的に合成され、例えばＤＮＡ化学合成でも使用されるホスホアミダイト法により、３'末端から５'末端に向かって一塩基ずつ順番に縮合反応させることにより得られる。ただし、合成過程でＲＮａｓｅによる分解を防ぐために、個々のリボヌクレオチドの２'末端の水酸基を保護して行う。この保護基としては、2'-O-t-butyldimethylsilyl（2'-tBDMS）基、2'-O-triisopropylsilyloxymethyl（2'-TOM）基、5'-silyl-2'-acetoxyethoxy（2'-ACE）基などが挙げられる。

ここで、ｓｉＲＮＡによる標的ｍＲＮＡの切断は、以下の反応機構で進むことが考えられる。
ｓｉＲＮＡ二本鎖が、細胞内のたんぱく質複合体ＲＩＳＣ（RNA-induced Silencing Complex）に取り込まれて結合し、センス鎖が脱離する。続いて、標的ｍＲＮＡがＲＩＳＣに取り込まれ、ＲＩＳＣに結合したアンチセンス鎖が、当該ｍＲＮＡの相補的配列を認識して結合する。さらに、アンチセンス鎖と結合したｍＲＮＡが、特異的に切断される。

例えば、ｍＲＮＡに作用し、遺伝子発現を抑制する方法として、ｍＲＮＡに相補的なアンチセンス鎖を結合させ、タンパク質への翻訳を阻害するアンチセンス法が知られているが、人工アンチセンス核酸は、ｍＲＮＡの高次構造の影響により標的部位に有効に結合できない場合があるため活性が弱いという問題点があった。

一方、ｓｉＲＮＡを用いたＲＮＡ干渉の場合には、ｍＲＮＡの高次構造に無関係に作用することで、ｍＲＮＡの局所的な構造に依存して活性が弱くなるという問題が低減される。

また、ｍｉＲＮＡは、タンパク質をコードしない低分子ＲＮＡであり、ゲノム上に数百種類存在することが知られている。ｍｉＲＮＡは、数百から数千塩基のヌクレオチドとして転写された後にプロセシングを受け、最終的には１９〜２４塩基の２量体ヌクレオチドとなり、このｍｉＲＮＡと相補的な塩基配列を持つｍＲＮＡの翻訳抑制や、ｍＲＮＡの分解、転写の制御等により遺伝子発現を抑制する。ＲＰＮ２も複数のｍｉＲＮＡによって発現が制御されることが知られていることから、このようなｍｉＲＮＡを人工的に合成し、使用することによりＲＰＮ２遺伝子発現を抑制することが可能となる。ＲＰＮ２遺伝子の発現を抑制する可能性のある既知のｍｉＲＮＡの配列は公開データベース（ＴａｒｇｅｔＳｃａｎ Ｒｅｌｅａｓｅ３．１など）により検索することができる。

また、もう一つの観点から、本発明は、ガン細胞増殖抑制剤のドラッグデリバリーシステムを提供する。すなわち、前述したガン細胞増殖抑制剤において、アテロコラーゲンをさらに含む。

ここで、アテロコラーゲンとは、酵素可溶化コラーゲンおよびその修飾物のことをいう。修飾物としては、側鎖アミノ基、カルボキシル基の化学修飾、あるいは化学的・物理的架橋物を用いることができる。また、ウシ、ブタ、ウマ、ヒトなどの哺乳動物、鳥、魚類を由来とするいずれのコラーゲンも用いることが可能であるが、使用される環境の温度で変化しない熱安定性を持つことが望ましい。具体的には、哺乳動物、鳥由来のコラーゲン、もしくは培養細胞からの産生、またはそれらの遺伝子組み換えにより得られたコラーゲンを用いることができる。コラーゲンの型については、特に制限はないが、入手の容易さよりＩ、ＩＩ、ＩＩＩ型などを使用することができる。

このようなアテロコラーゲンの併用により、標的となる細胞にガン細胞増殖抑制剤を効率よく送達し、当該細胞に効率よく取り込ませることができる。

別の観点から、本発明は、前述したＲＰＮ２遺伝子発現抑制剤の用途を提供する。
例えば、ＲＰＮ２遺伝子発現抑制剤は、必要に応じてアテロコラーゲンとともに、ガン患者に投与され、ガン化された細胞のアポトーシスを促進させる抗ガン剤として用いることができる。あるいは、ガン患者に抗ガン作用を示す薬剤および必要に応じてアテロコラーゲンとともに投与され、ガン化された細胞のアポトーシスを促進する抗ガン剤として用いることができる。なお、ＲＰＮ２遺伝子発現抑制剤の細胞への作用はアポトーシスの促進に限られるものではなく、最終的に細胞死を誘発したり、細胞増殖を抑制することができれば、ガン細胞増殖抑制剤として有用である。

すなわち、本発明は、ＲＰＮ２遺伝子発現抑制剤の抗ガン剤としての使用方法、およびＲＰＮ２遺伝子発現抑制剤の抗ガン作用を示す薬剤を併用した抗ガン剤としての使用方法を提供する。また、さらなる観点から、本発明は、前述したガン細胞増殖抑制剤を含む抗ガン剤を提供する。

このような用途において、ＲＰＮ２遺伝子発現抑制剤、薬剤、アテロコラーゲンの使用量は、投与方法、腫瘍の種類、大きさによって異なるが、例えばＲＰＮ２遺伝子発現抑制剤については局所投与では１ｎｍｏｌ／ｋｇ以上１０ｎｍｏｌ／ｋｇ以下、全身投与では２ｎｍｏｌ／ｋｇ以上５０ｎｍｏｌ／ｋｇ以下が望ましい。また、薬剤を用いる場合には、薬剤の使用量はそれぞれ薬剤単独で用いた場合の使用量を前提に定めることが望ましい。アテロコラーゲンと併用する場合には、このアテロコラーゲンの濃度は例えば局所投与では１ｍｇ／ｍｌ（ｗ／ｖｏｌ）以上５０ｍｇ／ｍｌ（ｗ／ｖｏｌ）以下、全身投与では０．１ｍｇ／ｍｌ（ｗ／ｖｏｌ）以上３０ｍｇ／ｍｌ（ｗ／ｖｏｌ）以下が望ましく、その使用量はＲＰＮ２遺伝子発現抑制剤との混合後、局所投与で５ｍｌ以上１００ｍｌ以下、全身投与で１０ｍｌ以上５００ｍｌ以下が望ましい。

このような用途によれば、ＲＰＮ２遺伝子発現抑制剤を、必要に応じて抗ガン作用を示す薬剤と併用して、ガン化細胞のアポトーシスを促進させる等の機序で細胞死を誘発させ、又は細胞増殖を抑制させることにより、結果としてガンの治療を行うことが可能になる。
本発明は、以下の態様も含む。
（１）ＲＰＮ２遺伝子発現抑制剤を含むガン細胞増殖抑制剤。
（２）ＲＰＮ２遺伝子発現抑制剤および抗ガン作用を示す薬剤を含むガン細胞増殖抑制剤。
（３）（１）または（２）に記載のガン細胞増殖抑制剤において、アテロコラーゲンをさらに含むことを特徴とするガン細胞増殖抑制剤。
（４）（１）または（２）に記載のガン細胞増殖抑制剤において、前記ＲＰＮ２遺伝子発現抑制剤が、低分子化合物であるガン細胞増殖抑制剤。
（５）（４）に記載のガン細胞増殖抑制剤において、前記ＲＰＮ２遺伝子発現抑制剤が、ＲＮＡ干渉によりＲＰＮ２遺伝子の発現を抑制する低分子化合物であるガン細胞増殖抑制剤。
（６）（５）に記載のガン細胞増殖抑制剤において、前記低分子化合物が、ＲＰＮ２遺伝子の所定の配列に対応する配列を有するｓｉＲＮＡであるガン細胞増殖抑制剤。
（７）（２）に記載のガン細胞増殖抑制剤において、前記抗ガン作用を示す薬剤が、タキサン類から選ばれる少なくとも一つであるガン細胞増殖抑制剤。
（８）（２）に記載のガン細胞増殖抑制剤において、前記抗ガン作用を示す薬剤が、白金製剤から選ばれる少なくとも一つであるガン細胞増殖抑制剤。
（９）（１）から（８）のいずれか一項に記載のガン細胞増殖抑制剤において、当該ガン細胞増殖抑制剤は、ガン化した細胞のアポトーシスを促進することを特徴とするガン細胞増殖抑制剤。
（１０）（１）から（９）のいずれか一項に記載のガン細胞増殖抑制剤を含む抗ガン剤。
（１１）ＲＰＮ２遺伝子発現抑制剤の抗ガン剤としての使用方法。
（１２）ＲＰＮ２遺伝子発現抑制剤の抗ガン作用を示す薬剤を併用した抗ガン剤としての使用方法。
（１３）（１１）または（１２）に記載の使用方法において、アテロコラーゲンをさらに併用することを特徴とするＲＰＮ２遺伝子発現抑制剤の使用方法。

以下に、本発明を試験例に基づいて説明するが、本発明はこれら試験例に限定されることはない。

（試験例１）細胞増殖抑制試験
（１）アテロコラーゲンセルトランスフェクションアレイの作製
抗ガン作用を示す薬剤としてドセタキセルを作用させて薬剤非応答性を示した患者のガン組織において、ＡＴＡＣ−ＰＣＲ解析（国際公開第２００５／００３３５２号パンフレット）を行った結果、発現上昇が認められた以下の３６遺伝子についてｓｉＲＮＡを合成した。

続いて、特開２００６−６２６２号公報に記載の方法に基づいて、アテロコラーゲン（（株）高研製）および各遺伝子に対応するｓｉＲＮＡの混合物を、９６穴マイクロプレートにコーティングし、ｓｉＲＮＡをリバーストランスフェクションできるアテロコラーゲンセルトランスフェクションアレイを作製した。

（２）細胞の樹立
乳ガン細胞ＭＣＦ７を親株とする多剤耐性乳ガン細胞株であるMCF7-ADRに、ルシフェラーゼ遺伝子（ＧＬ３）を導入し、安定形質発現させた細胞株MCF7-ADR-LUCを得た。

（３）細胞増殖抑制率およびｓｉＲＮＡの導入効率の測定
（１）で作製したアレイに、（２）で得たMCF7-ADR-LUC細胞を、４×１０³細胞数／ウェルにて播種し、１ｎＭドセタキセル（ＤＯＣ）存在下で３日間培養した。生細胞にルシフェリンを添加しその発光値から、細胞の増殖抑制率およびルシフェラーゼｓｉＲＮＡの導入効率を測定した。

細胞の増殖抑制率は、コントロールｓｉＲＮＡ（配列番号５のセンス鎖および配列番号６のアンチセンス鎖からなるｄｓＲＮＡ）を１００％として算出した。結果を図１に示す。なお、図１において横軸は、表１に示した遺伝子番号（Ｎｏ．）に対応する。図１によれば、ＲＰＮ２遺伝子（Ｎｏ．１２）のほかにもいくつかの遺伝子において、各遺伝子に対応するｓｉＲＮＡの導入により細胞増幅が抑制された。

また、ｓｉＲＮＡ導入効率は、各遺伝子に対応するｓｉＲＮＡとは別にルシフェラーゼｓｉＲＮＡ（ＧＬ３ｓｉＲＮＡ：配列番号７のセンス鎖および配列番号８のアンチセンス鎖からなるｄｓＲＮＡ）の導入によるルシフェラーゼ活性の抑制率で評価した。なお、ルシフェラーゼ活性は、ルシフェリン（最終濃度０．５ｍＭ：プロメガ社）を培地に添加して、その直後に発光プレートリーダ（ＡＲＶＯ：パーキンエルマー社）により測定した。ＧＬ３ｓｉＲＮＡの導入により、ルシフェラーゼ活性は、前記コントロールｓｉＲＮＡと比較して、８０％抑制されていた。

（試験例２）アポトーシス誘導試験
試験例１にてルシフェラーゼ活性を測定した後のプレートに対して、アポトーシス測定用の試薬を添加して、Caspase活性を測定した。すなわち、プロメガ社推奨のプロトコール（Apo-ONE Homogeneous Caspase-3/7 Assay）にしたがってアッセイし、試薬を添加して９０分後に蛍光プレートリーダ（ＡＲＶＯ：パーキンエルマー社）により測定した。Caspase活性化率は、前記コントロールｓｉＲＮＡを０％として算出した。

また、Caspase活性のほかに、ヘキスト染色による観察（細胞をPBS(-)で洗浄後、4% PFA - 0.1% Triton X-100 - 1 mg/ml Hoechst 33342 / in PBS(-)を添加し、室温で２０分間固定、染色。PBS(-)で洗浄後、蛍光顕微鏡下で観察。）によりアポトーシス誘導を調べた。

結果を図２に示す。図２によれば、ＲＰＮ２遺伝子に対するｓｉＲＮＡ（ＲＰＮ２ｓｉＲＮＡ）の導入によりCaspase活性が強く誘導された。また、ヘキスト染色により、ＲＰＮ２ｓｉＲＮＡを導入した細胞とコントロールｓｉＲＮＡを導入した細胞におけるアポトーシス細胞の割合（Apoptotic cells(%)）を比較したところ、図３に示したように、有意な差異が見られた。すなわち、ＲＰＮ２ｓｉＲＮＡの導入により、アポトーシスが誘導されることが示唆された。
図４には、ヘキスト染色による核形態の観察結果を示す。図４（ａ）にはＲＰＮ２ｓｉＲＮＡを導入した系での結果を示し、図４（ｂ）にはどの遺伝子の発現をも抑制しないコントロールｓｉＲＮＡを導入した系での結果を示す。図４によれば、その核形態の変化（凝縮、断片化）から、ＲＰＮ２ｓｉＲＮＡを導入したときにアポトーシスが誘導されることが示唆された。

（試験例３）ＲＰＮ２遺伝子発現抑制試験
試験例１（１）にて作製したアテロコラーゲンセルトランスフェクションアレイに、MCF7-ADR-Luc細胞を播種して３日後に、細胞溶解物から直接ｃＤＮＡを合成し、リアルタイムＰＣＲを行って、ＲＰＮ２遺伝子発現量を調べた（SuperScript III Platinum CellsDirect Two-Step qRT-PCR: invitrogen)。
結果を図５に示す。図５によれば、ＲＰＮ２ｓｉＲＮＡ（配列番号３のセンス鎖および配列番号４のアンチセンス鎖からなるｄｓＲＮＡ）の導入により、ＲＰＮ２遺伝子の発現が約２５％に抑制されたことが認められた。

（試験例４）ヌードマウスにおける腫瘍増殖試験
図６に示したプロトコールにしたがって、ヌードマウス（４週齢、メス）の乳腺脂肪体（fat pad）に１００μｌのPBS(-)にけん濁した１×１０⁷個のMCF7-ADR-Luc細胞を移植した。腫瘍径が約５ｍｍに達した７日後に、ｓｉＲＮＡおよびＤＯＣを投与した。ここで、アテロコラーゲンは最終濃度５ｍｇ／ｍｌ（ｗ／ｖｏｌ）、ｓｉＲＮＡは腫瘍あたり１ｎｍｏｌとして混合後、アテロコラーゲン（（株）高研製）／ｓｉＲＮＡの２００μｌを腫瘍内投与した。同時にドセタキセル２０ｍｇ／ｋｇを腹腔内投与した。７日後に腫瘍径を測定し、腫瘍体積を比較した。

結果を図７に示す。図７によれば、ＲＰＮ２ｓｉＲＮＡおよびＤＯＣを投与した結果、コントロールｓｉＲＮＡに比べ有意に腫瘍の縮小が認められた。ＤＯＣに対して非応答性を示した細胞においても、ＲＰＮ２ｓｉＲＮＡの投与により、ＤＯＣへの応答性が獲得されたと考察される。

（試験例５）ヌードマウスにおけるＲＰＮ２遺伝子発現抑制試験
ヌードマウス（４週齢、メス）の乳腺脂肪体（fat pad）に１００μｌのPBS(-)にけん濁した１×１０⁷個のMCF7-ADR-Luc細胞を移植し、７日後にＲＰＮ２ｓｉＲＮＡおよびＤＯＣを投与した。ここで、アテロコラーゲンは最終濃度５ｍｇ／ｍｌ（ｗ／ｖｏｌ）、ＲＰＮ２ｓｉＲＮＡは腫瘍あたり１ｎｍｏｌとして混合後、アテロコラーゲン/ｓｉＲＮＡの２００μｌを腫瘍内投与した。同時にドセタキセル２０ｍｇ／ｋｇを腹腔内投与した。１日後に腫瘍を採取してトータルＲＮＡを単離し、real-time RT-PCR（SYBR ExScript RT-PCR Kit: TaKaRa, LightCycler Real-Time PCR System: Roche社）でＲＰＮ２遺伝子の発現量を測定した。

結果を図８に示す。図８によれば、ＲＰＮ２ｓｉＲＮＡ投与群は、コントロールｓｉＲＮＡ投与群と比べ、ＲＰＮ２遺伝子の発現が約２０％抑制されていた。なお、標準偏差は非常に小さいため、グラフ上に表現されていない。

（試験例６）ヌードマウスにおけるＲＰＮ２遺伝子発現抑制試験
試験例５において、ヌードマウス（４週齢、メス）の乳腺脂肪体（fat pad）にMCF7-ADR-Luc細胞を移植して、６週間後にＲＰＮ２ｓｉＲＮＡおよびＤＯＣを投与した以外は、試験例５と同様の方法で、ＲＰＮ２遺伝子の発現量を測定した。

結果を図９に示す。図９によれば、ＲＰＮ２ｓｉＲＮＡ投与群は、コントロールｓｉＲＮＡ投与群と比べ、ＲＰＮ２遺伝子の発現が約４０％抑制されていた。

（試験例７）ヌードマウスにおけるアポトーシス誘導試験
ヌードマウス（４週齢、メス）の乳腺脂肪体（fat pad）に１００μｌのPBS(-)にけん濁した １×１０⁷個のMCF7-ADR-Luc細胞を移植し、６週間後にｓｉＲＮＡおよびＤＯＣ、あるいはｓｉＲＮＡのみを投与した。アテロコラーゲンは最終濃度５ｍｇ／ｍｌ（ｗ／ｖｏｌ）、ｓｉＲＮＡは腫瘍あたり１ｎｍｏｌとして混合後、 アテロコラーゲン／ｓｉＲＮＡの２００μｌを腫瘍内投与した。同時にドセタキセル２０ｍｇ／ｋｇを腹腔内投与した。４日後に腫瘍を採取し、ＴＵＮＥＬ染色（In Situ Cell Death Detection Kit: Roche社）した。核をＤＡＰＩ（4',6-diamidino-2-phenylindole）で対比染色した。

結果を図１０に示す。図１０によれば、ＤＯＣおよびＲＰＮ２ｓｉＲＮＡの両方を投与した群については、多くのアポトーシス細胞が認められた。

（試験例８）
試験例１（１）にて作製したアテロコラーゲンセルトランスフェクションアレイに、抗ガン性を示す薬剤の存在下あるいは非存在下でMCF7-ADR-Luc細胞を播種して３日後に、試験例２に記載の要領でCaspase活性を測定した。
結果を図１１に示す。図１１によれば、ＤＯＣの非存在下であっても、ＲＰＮ２ｓｉＲＮＡを投与した群について、アポトーシスが誘導されることが示唆された。

（試験例９）
ヒト肺ガン（小細胞ガン、分化型腺ガン）の細胞株であり、抗ガン性を示す薬剤であるシスプラチン耐性のPC-9/CDDP細胞について、ＲＰＮ２ｓｉＲＮＡを投与してＲＰＮ２遺伝子発現を抑制した後、シスプラチン（０．３μＭ）の存在下あるいは非存在下で３日間培養した。その後、試験例２に記載の要領でCaspase活性を測定した。なお、比較するために、どの遺伝子の発現をも抑制しないコントロールｓｉＲＮＡを導入した系でも同様の試験をした。
結果を図１２に示す。図１２によれば、コントロールの系では、シスプラチン（Cis）の非投与（Cis−）、投与（Cis＋）の両方でCaspase活性に差異は見られなかったが、ＲＰＮ２ｓｉＲＮＡを導入した系では、シスプラチンの投与、非投与にかかわらず、アポトーシスが誘導されることが示唆された。ＲＰＮ２ｓｉＲＮＡを導入した系ではシスプラチンの投与群において有意にアポトーシスが誘導され、細胞死が確認された。シスプラチン非投与群においてもアポトーシスの上昇は認められたが、シスプラチン投与群に比して軽微であった。また、白金製剤としてシスプラチンを用いた例を示したが、シスプラチンよりも毒性を低減させた他の白金製剤、例えばカルボプラチンなどにおいても同じような傾向を示すと考えられる。

なお、各試験例においては、乳ガン細胞のMCF7-ADRのＲＰＮ２遺伝子をサイレンシングしてガン化された細胞のアポトーシスの誘導が見られた例を挙げたが、他のＲＰＮ２遺伝子が高発現している細胞、例えば大腸ガン、食道ガン、卵巣ガン、乳ガン、肺ガンの細胞および組織においても、ＲＰＮ２遺伝子をサイレンシングすることにより、抗ガン剤（ドセタキセルなどに）耐性となったガン化された細胞のアポトーシス誘導が見られる可能性がある。

また、抗ガン剤耐性を示す細胞株として、シスプラチン耐性を示すヒト肺ガン細胞のPC-9/CDDP細胞のＲＰＮ２遺伝子をサイレンシングしてガン化された細胞のアポトーシスの誘導が見られた例を挙げたが、その他にはPC-14細胞、SBC-3細胞、H69細胞などのヒト肺ガン細胞株、K562細胞（ヒト白血病細胞株）またはp388細胞（マウスリンパ球様細胞株）などを親株とする抗ガン剤耐性株、例えばPC-14/CDDP、SBC-3/CDDP、SBC-3/ADM、H69/CDDP、K562/ADM、p388/MMCなども知られている（ここで、CDDPはシスプラチン耐性、ADMはアドリアマイシン耐性、MMCはマイトマイシンＣ耐性を意味する）。これら抗ガン剤耐性細胞においても、ＲＰＮ２遺伝子をサイレンシングすることによりアポトーシスが誘導される可能性がある。

以下に、ｓｉＲＮＡによるヒト肝臓ガン、ヒト大腸ガンにおいて、ＲＰＮ２遺伝子発現抑制の例を示す。
（試験例１０）
ヒト肝臓ガンの細胞株であるHepG2を5000個/well、９６ウェルプレートに播種した翌日、遺伝子導入試薬（Lipofectamine 2000：Invitrogen）を用いて、Invitrogen社推奨のプロトコールに従ってRPN2 siRNA（配列番号３のセンス鎖及び配列番号４のアンチセンス鎖からなるdsRNA）を導入し、RPN2遺伝子発現を抑制した。陰性対照としてコントロールsiRNA（配列番号5のセンス鎖及び配列番号6のアンチセンス鎖からなるdsRNA）を導入した。上記siRNAと同時にDOCを最終濃度１ｎＭで添加した。３日間培養後、各wellの細胞の生存率を確認するために、生細胞の定量試薬（CellTiter-Glo substrate: Promega）を添加して、2分間撹拌し、10分静置後、発光プレートリーダー（ARVO: PerkinElmer）により発光を測定した。
結果は、無細胞ウェルの発光強度を除いた発光強度(RLU)として図１３に示す。図１３によれば、DOCに感受性を示すHepG2細胞においてRPN2 siRNAは単独でガン細胞の増殖抑制効果を示すとともに、DOCのガン細胞増殖抑制効果を増強する作用を示した。

（試験例１１）
ヒト大腸ガンの細胞株であるHT29を500個/well、９６ウェルプレートに播種した翌日、遺伝子導入試薬（Dermafect：Dermacon）を用いて、Dermacon社推奨のプロトコールに従って複数の配列のRPN2 siRNAを導入し、RPN2遺伝子発現を抑制した。陰性対照としてコントロールsiRNA（配列番号5のセンス鎖及び配列番号6のアンチセンス鎖からなるdsRNA）を導入した。３日間培養後、各wellの細胞の生存率を確認するために、生細胞の定量試薬（テトラカラーワン：生化学工業）を10μＬずつ添加して、更に２〜３時間培養し、490nmにおける各ウェルの吸光度を測定した。
結果は、無細胞ウェルの吸光度を除いた、ΔOD₄₉₀として図１４に示す。試験で使用された複数のRPN2 siRNA（配列A〜L）はそれぞれ以下で示す配列を有する。なお、配列Ａ〜Ｌは、表２に示したセンス鎖およびアンチセンス鎖からなるｄｓＲＮＡである。

配列A（配列番号３のセンス鎖及び配列番号４のアンチセンス鎖からなるdsRNA）；
配列B（配列番号９のセンス鎖及び配列番号１０のアンチセンス鎖からなるdsRNA）；
配列C（配列番号１１のセンス鎖及び配列番号１２のアンチセンス鎖からなるdsRNA）；
配列D（配列番号１３のセンス鎖及び配列番号１４のアンチセンス鎖からなるdsRNA）；
配列E（配列番号１５のセンス鎖及び配列番号１６のアンチセンス鎖からなるdsRNA）；
配列F（配列番号１７のセンス鎖及び配列番号１８のアンチセンス鎖からなるdsRNA）；
配列G（配列番号１９のセンス鎖及び配列番号２０のアンチセンス鎖からなるdsRNA）；
配列H（配列番号２１のセンス鎖及び配列番号２２のアンチセンス鎖からなるdsRNA）；
配列I（配列番号２３のセンス鎖及び配列番号２４のアンチセンス鎖からなるdsRNA）；
配列J（配列番号２５のセンス鎖及び配列番号２６のアンチセンス鎖からなるdsRNA）；
配列K（配列番号２７のセンス鎖及び配列番号２８のアンチセンス鎖からなるdsRNA）；
配列L（配列番号２９のセンス鎖及び配列番号３０のアンチセンス鎖からなるdsRNA）
いずれの配列も単独でHT29細胞の増殖を抑制する作用を示した。

Claims (7)

1. ＲＰＮ２遺伝子発現抑制剤を含むガン細胞増殖抑制剤であって、前記ＲＰＮ２遺伝子発現抑制剤が、ＲＰＮ２遺伝子の所定の配列に対応する配列を有するｓｉＲＮＡである、ガン細胞増殖抑制剤。
2. ＲＰＮ２遺伝子発現抑制剤および抗ガン作用を示す薬剤を含むガン細胞増殖抑制剤であって、前記ＲＰＮ２遺伝子発現抑制剤が、ＲＰＮ２遺伝子の所定の配列に対応する配列を有するｓｉＲＮＡである、ガン細胞増殖抑制剤。
3. 請求項１または２に記載のガン細胞増殖抑制剤において、
   アテロコラーゲンをさらに含むことを特徴とするガン細胞増殖抑制剤。
4. 請求項２または３に記載のガン細胞増殖抑制剤において、
   前記抗ガン作用を示す薬剤が、タキサン類から選ばれる少なくとも一つであるガン細胞増殖抑制剤。
5. 請求項２または３に記載のガン細胞増殖抑制剤において、
   前記抗ガン作用を示す薬剤が、白金製剤から選ばれる少なくとも一つであるガン細胞増殖抑制剤。
6. 請求項１から５のいずれか一項に記載のガン細胞増殖抑制剤において、
   当該ガン細胞増殖抑制剤は、ガン化した細胞のアポトーシスを促進することを特徴とするガン細胞増殖抑制剤。
7. 請求項１から６のいずれか一項に記載のガン細胞増殖抑制剤を含む抗ガン剤。