CN111643684B - 一种具有肿瘤靶向性的钆基磁共振成像造影剂及制备方法 - Google Patents

一种具有肿瘤靶向性的钆基磁共振成像造影剂及制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种具有肿瘤靶向性的钆基磁共振成像造影剂制备方法及其生物医学应用。所述的造影剂能够特异性地结合肿瘤细胞表面高表达的转铁蛋白受体1，由基因工程重组蛋白质和钆螯合物组成，具有比商用造影剂马根维显(Gd‑DTPA)更高的纵向弛豫率。本发明提供了与马根维显进行的动物肿瘤模型成像效果对比，指示本发明中的造影剂在更低的注射剂量下就能实现肿瘤特异识别与较长时间磁共振成像，无需重复注射。本发明中的造影剂可静脉给药，应用于癌症的早期诊断，肿瘤转移的进一步鉴别及术后可疑复发的诊断。

Description

一种具有肿瘤靶向性的钆基磁共振成像造影剂及制备方法
技术领域
本发明涉及造影剂技术领域，具体而言，本发明公开了一种具有肿瘤靶向性的钆基磁共振成像造影剂及其制备方法。
背景技术
据世界卫生组织报道，癌症为全球第二大死因，2015年就导致了880 万人死亡，恶性肿瘤严重威胁着人类的健康和生命。世界癌症基金会数据显示，2018年，全世界估计有1800万癌症病例，其中950万例是男性，850 万例是女性，预防癌症已成为21世纪最重大的公共卫生挑战之一。在中国，全国肿瘤登记中心发布的《2019年全国癌症报告》显示，平均每天超过1 万人被确诊为癌症，每分钟有7.5个人被确诊为癌症，恶性肿瘤的防控形势依然严峻。当病人被诊断出癌症时，超过60％的病人癌细胞都已经有隐藏或已知的转移，对这些病人来说，诊断过晚导致了当前可用的临床手段无法对癌症进行有效的治疗。因此，早发现，早治疗是提高癌症病人存活率的最有力手段。
核磁共振成像(Magnetic resonance imaging，MRI)技术具有无辐射，无损伤，高分辨等优势，是一种非侵入式影像学诊断方法，是临床医学中疾病诊疗最为成熟，也是最为有效的方法之一。其原理是当机体组织的质子处在外加磁场下，经过特定频率的射频脉冲发射后，质子会因能量共振吸收而被激发沿磁场排布，射频脉冲停止后，被激发的原子核要回到基态，释放出能量而产生弛豫过程，在这个过程中，机体组织质子密度的局部变化信号，可以被采集到并经过处理、重建，从而实现机体组织的成像。但某些组织和肿瘤的弛豫时间相互重叠，导致诊断困难，因此往往需要MRI增强剂(造影剂)来提高肿瘤组织和生理组织的对比成像效果，改善成像质量，降低误诊。目前，临床上使用的MRI造影剂主要是小分子的钆类螯合物，如Gd-DTPA， Gd-TOPA等。但是这类造影剂在体内滞留时间短，为了更好的成像效果，临床医生不得不加大注射剂量，这就增大了机体游离的Gd离子对肾脏造成纤维化的毒副风险，严重影响其临床应用。
如何构建具有肿瘤特异性靶向能力的新一代高效、且低毒的钆基MRI 造影剂是造影剂技术亟待解决的问题。
发明内容
为了解决现有技术存在的问题，本发明提供了一种新型具有肿瘤靶向特异性的钆基磁共振造影剂制备方法及其磁共振诊断用途。
一方面，本发明提供了一种连接钆基的蛋白复合物，所述复合物包括能够靶向肿瘤的蛋白质以及连接在蛋白质表面的钆螯合物。
在一个实施方式中，所述钆螯合物由钆元素和带有羧基的螯合剂形成的钆螯合物，所述螯合剂的羧基和所述蛋白质的氨基通过酰胺缩合将所述钆螯合物连接在所述蛋白质的表面。
在一个实施方式中，所述蛋白质通过结合肿瘤细胞表面的受体从而靶向肿瘤；优选的，所述受体选自转铁蛋白受体1(transferrin receptor 1，TfR1)。
在优选的实施方式中，所述蛋白质为铁蛋白，优选人源铁蛋白；所述铁蛋白包括H亚基(重链)铁蛋白，或者，重链和轻链以任意比例自组装的铁蛋白。所述铁蛋白可以为天然来源或者重组表达。在一个实施方式中，所述铁蛋白为重组表达的铁蛋白。
进一步的，所述连接在蛋白质表面的钆螯合物与所述蛋白质的摩尔比例为100-500:1，优选，300:1。
在优选的实施方式中，所述铁蛋白可以通过如下方式制备得到：
(1)将人H亚基铁蛋白的全长cDNA进行PCR扩增，构建到表达载体，优选的，所述表达载体为pET-11b质粒上；(2)将含有人H亚基铁蛋白基因的重组质粒转化至表达菌株，优选的，所述表达菌株为大肠杆菌BL21中，诱导表达HFn；(3)表达结束后，获取上清液，在优选的实施方式中，所述全菌液在75℃下加热15分钟，沉淀杂蛋白，离心去除，获得上清液；(4) 上清液经脱盐柱洗涤后，再经排阻层析柱分离纯化，优选的，所述层析柱为 TOYOPEARL HW-55F，得到精提的高纯度HFn。
本发明的带有羧基的螯合剂，包括二乙烯三胺五乙酸(DTPA)；1，4，7， 10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸(DOTA)；1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-三乙酸(DO3A)；以及4-羧基-5，8，11-三(羧甲基)-1-苯基 -2-氧杂-5，8，11-三氮杂十三烷-13-酸(BOPTA)。
另一方面，本发明还提供了上述连接钆基的蛋白复合物的制备方法，所述方法包括如下步骤：提供能够靶向肿瘤的蛋白质和钆螯合物，利用所述螯合剂的羧基和所述蛋白质的氨基通过酰胺缩合反应将所述钆螯合物连接在所述蛋白质的表面即可以得到所述连接钆基的蛋白复合物。
在一个实施方式中，添加缩合剂促进所述酰胺缩合反应，所述缩合剂选自EDC和/或NHS，所述酰胺缩合反应时间为3-12小时。
在优选的实施方式中，所述钆螯合物与蛋白质混匀、进行酰胺缩合反应，最后将溶液进行除盐和浓缩无菌过滤得到所述连接钆基的蛋白复合物。
进一步的，所述钆螯合物由钆元素和带有羧基的螯合剂制备而成；优选的，采用相同摩尔数的螯合剂和钆离子溶液制备所述钆螯合物。在一个实施方式中，钆离子溶液可以为Gd(NO3)3·6H2O或GdCl3·6H2O。
在一个实施方式中，所述钆螯合物与蛋白质的用量摩尔比例为100-500:1，优选，300:1。
另一方面，本发明还提供了一种造影剂，所述造影剂包括上述连接钆基的蛋白复合物。优选的，所述造影剂为用于核磁共振的造影剂，更优选的，为用于肿瘤诊断或筛查的核磁共振造影剂。所述的肿瘤选自乳腺癌、胰腺癌、肝癌、神经胶质瘤、肺癌、结肠癌、或白血癌。
另一方面，本发明还提供了上述连接钆基的蛋白复合物在制备造影剂中的应用。
在优选的实施方式中，所述造影剂为用于核磁共振的造影剂，更优选的，为用于肿瘤诊断或筛查的核磁共振造影剂。所述的肿瘤选自乳腺癌、胰腺癌、肝癌、神经胶质瘤、肺癌、结肠癌、或白血癌。
上述造影剂与商用的造影剂马根维显比较，所述的造影剂具有更高的纵向弛豫率，进行成像仅需更低的注射剂量；在一个实施方式中，所述造影剂的注射剂量为马根维显临床使用剂量的1/10到1/5，在优选的实施方式中，所述造影剂的注射剂量为马根维显临床使用剂量的1/6。
另一方面，本发明还提供了上述连接钆基的蛋白复合物作为造影剂在肿瘤诊断或筛查中的用途。
另一方面，本发明还提供了所述连接钆基的蛋白复合物在制备用于诊断或筛查肿瘤的试剂中的用途；优选的，所述试剂为造影剂；更优选的，所述造影剂为用于核磁共振的造影剂。
铁蛋白在机体内广泛存在，具有良好的生物相容性、低毒性和稳定性等生物学特性，被认为在纳米技术和生物医学领域具有潜在的应用前景。特别是其12纳米的球形外壳提供了大量的表面修饰位点，在其多肽链上连接上某些分子，赋予铁蛋白新的功能。除此之外，细胞表面的转铁蛋白受体1 (transferrin receptor 1，TfR1)能够结合H亚基铁蛋白，作为其受体介导铁蛋白与细胞的相互作用。TfR1在细胞的铁元素转运上起重要作用，是肿瘤细胞生长所必需的，它在许多肿瘤细胞表面都高表达，因此可以作为识别肿瘤的特异标志物，铁蛋白能够结合TfR1，也就为其特异性靶向肿瘤提供了基础。铁蛋白表面有大量的氨基酸修饰位点，可以连接Gd形成新的，高r1的钆基造影剂，且其自身所具有的肿瘤靶向特异性，可以降低造影剂的使用剂量，大大降低Gd(钆)的毒副作用。
本发明的连接钆基的蛋白复合物，制备方法简单，作为造影剂时，生物相容性良好，具有较高弛豫效率；另外，本造影剂能够特异靶向肿瘤细胞，具有r1弛豫效率高于商用造影剂马根维显的特点，只需按照马根维显临床使用剂量的1/6进行注射，就能有效的对肿瘤区域进行显影诊断(同等剂量的马根维显不能使肿瘤区域显影)。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1：其中，a：HFn-Gd的概念示意图；b：HFn-Gd的透射电子显微镜图；c：HFn-Gd的傅里叶变换红外光谱鉴定图；d:HFn-Gd的X射线光电子能谱分析图。
图2：HFn-Gd的稳定性检验。
图3：a:HFn-Gd的弛豫率；b:HFn-Gd溶液不同浓度下的T1成像图；c：商用Gd-DTPA的弛豫率。
图4：FITC标记的TfR1抗体和Cy5.5标记的HFn-Gd用于荧光示踪共定位分析HFn-Gd能够靶向肿瘤细胞的机理是通过结合肿瘤细胞表面高表达的TfR1。其中a为胰腺癌CFPAC-1细胞，b为乳腺癌MDA-MB-231细胞。
图5：a：荷CFPAC-1癌灶裸鼠经Gd-DTPA注射后的T1磁共振成像图，剂量为0.016mMGd/kg体重；b：荷CFPAC-1癌灶裸鼠经HFn-Gd注射后的T1磁共振成像图，剂量为0.016mM Gd/kg体重；c：注射HFn-Gd后的裸鼠肿瘤区域的T1时间值随时间变化；d：注射Gd-DTPA后的裸鼠肿瘤区域的T1时间值随时间变化；e：CFPAC-1肿瘤组织经FITC标记的TfR1抗体和Cy5.5标记的HFn-Gd处理后用于荧光示踪共定位分析HFn-Gd靶向TfR1。
图6：a：荷MDA-MB-231微小癌灶裸鼠经HFn-Gd注射后的T1磁共振成像图，剂量为0.016mM Gd/kg体重；b：荷MDA-MB-231微小癌灶裸鼠经Gd-DTPA注射后的T1磁共振成像图，剂量为0.016mM Gd/kg体重；c：注射HFn-Gd后的裸鼠肿瘤区域的T1时间值随时间变化；d：注射Gd-DTPA 后的裸鼠肿瘤区域的T1时间值随时间变化；e：MDA-MB-231肿瘤组织经 FITC标记的TfR1抗体和Cy5.5标记的HFn-Gd处理后用于荧光示踪共定位分析HFn-Gd靶向TfR1；f：组织免疫荧光实验验证HFn-Gd通过TfR1靶向微小肿瘤。
图7：裸鼠经HFn-Gd注射后，肾脏的T1磁共振成像图。
图8：裸鼠经HFn-Gd注射后，膀胱的T1磁共振成像图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下文将结合实施例对本发明作更全面细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体的实施例。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
实施例1、HFn-Gd的制备
以人H亚基铁蛋白(HFn)全长cDNA为扩增模板，通过聚合酶链式反应得到HFn基因，并构建到pET11b质粒上，之后将构建好的完整质粒转化至大肠杆菌工程菌BL21中，通过培养细菌，诱导表达，破碎细菌，分离纯化得到重组的HFn蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
配制相同摩尔质量的DTPA与Gd离子溶液，搅拌混匀，形成钆螯合物Gd-DTPA之后，利用HFn与钆螯合物通过螯合剂的羧基和蛋白的氨基的酰胺缩合反应将钆螯合物连接在HFn的表面，在缩合剂EDC和NHS存在的情况下，将钆螯合物与与HFn混匀，使得DTPA与HFn进行酰胺缩合反应得到稳定的HFn-Gd；最后将溶液进行除盐和浓缩无菌过滤保存。图1a为HFn-Gd的概念示意图，HFn呈球形，Gd结合在HFn的表面；图1b为HFn-Gd 的透射电子显微镜照片，形状均一，单分散较好，粒径均匀；图1c为HFn 及HFn-Gd的傅里叶红外光谱分析图，HFn(橙色线)与HFn-Gd(绿色线) 在1650及1550波长处都有肽段的酰胺键1(amide 1)及酰胺键II(amideII) 代表性的峰，但在HFn-Gd的1600波长处有新的峰(放大图)，表明DTPA 与HFn之间新的酰胺键的形成，指示DTPA螯合的Gd连接在了HFn上；图 1d为HFn-Gd X射线光电子能谱分析图，Gd4d信号峰的出现表面HFn的表明连接有Gd。
实施例2、HFn-Gd稳定性的检验
为了检验HFn-Gd的稳定性，确定在溶液及血清中无游离Gd离子的存在，将样品与arsenazoШ溶液加在一起，游离的金属离子会与该溶液结合并在650纳米处形成吸收峰，通过判断arsenazoIII溶液在650纳米有无吸收峰说明样品中有无游离的Gd。图2a展示的是arsenazoIII溶液(黑色线)， arsenazoIII加入了商用的Gd-DTPA(蓝色线)，新制备的HFn-Gd(绿色线) 及保存了两月的HFn-Gd(红色线)四种样品的UV/Vis光谱吸收图，所有的样品在650纳米处无吸收峰，表明了HFn-Gd制剂的稳定性。图2b展示的是arsenazoIII溶液(黑色线)，arsenazoIII加入了胎牛血清(FBS，蓝色线)，提前孵育了FBS和商用Gd-DTPA(红色线)及提前孵育了FBS和HFn-Gd (绿色线)四种样品的UV/Vis光谱吸收图，所有含FBS的样品在650纳米处有吸收峰，但是无差别，表明了该吸收峰可能由于FBS中其他金属离子造成，而HFn-Gd和商用Gd-DTPA在血清中是无游离的Gd的。
实施例3、HFn-Gd及商用Gd-DTPA的纵向弛豫率(r1)的测定
首先将HFn-Gd材料稀释至Gd终浓度为0-1mM，然后在MRI系统 (Bruker，BioSpec70/20USR)中进行测定。材料T1值的测定采用 multi-slice-multi-echo序列进行T1加权成像，具体参数为field of view(FOV)＝ 4cm×4cm,matrix＝256×256,repetitiontime(TR)＝150ms,and TE＝1.21 ms(T1)。将不同浓度的HFn-Gd的T1值的倒数与其浓度值进行线性拟合得到材料的r1值。图3a是不同批次HFn-Gd材料在场强为7T的磁共振仪下测得的r1值，平均为4.78mM-1s-1，图3b为其T1磁共振成像图，浓度越大，信号值越低，成像越亮。图3c为商用Gd-DTPA在场强为7T的磁共振仪下测得的r1值，平均为3.97mM-1s-1。HFn-Gd的r1值高于商用Gd-DTPA，指示采用更少剂量的HFn-Gd进行目标区域成像存在可能。
实施例4、HFn-Gd与体外表达TfR1的肿瘤细胞靶向的验证
为了验证HFn-Gd依然能够与肿瘤细胞表面的TfR1靶向结合。选取细胞表面高表达TfR1的胰腺癌细胞CFPAC-1和乳腺癌MDA-MB-231细胞进行验证。当细胞生长至80％时，弃去培养基，用PBS洗涤细胞，再用4％多聚甲醛溶液在室温下固定细胞30分钟，用PBS洗涤细胞。最后加入标记了 Cy5.5的HFn-Gd及FITC标记鼠抗TfR1抗体(购自Biolegend)共同在4℃下过夜孵育细胞，接着加入含DAPI的抗荧光淬灭封片剂(购自Beyotime) 几分钟后在激光共聚焦显微镜下观察。图4a和b分别为CFPAC-1细胞和 MDA-MB-231细胞免疫荧光的染色结果，表明HFn-Gd依然能依靠TfR1靶向肿瘤细胞。
实施例5、低剂量HFn-Gd用于胰腺癌的磁共振成像诊断
选用CFPAC-1细胞在裸鼠左腹股沟处进行接种，制备荷胰腺癌鼠模型。通过尾静脉注射的方式进行HFn-Gd和商用Gd-DTPA(马根维显)给药并进行MRI扫描，比较结果。(HFn-Gd和商用Gd-DTPA注射剂量都为0.016mM Gd/kg体重，约为临床Gd-DTPA使用剂量0.1mM Gd/kg体重的1/6)。采用 multi-slice-multi-echo序列进行T1加权成像，具体参数为field ofview(FOV)＝3.5cm×3.5cm,matrix＝200×200,repetition time(TR)＝3000ms,echotime(TE)＝49.1ms，19层，层厚为1mm，MRI的T1值采集用机器自带的软件进行。图5a为CFPAC-1荷瘤裸鼠注射商用Gd-DTPA的T1成像代表图，红色箭头表示肿瘤区域，通过对3只荷瘤鼠采集肿瘤区域的T1值分析发现，如图5d所示，低剂量注射商用Gd-DTPA后，仅在注射10分钟后，信号值有所降低，有一定的与周围正常组织进行对比诊断的作用；图5b为CFPAC-1荷瘤裸鼠注射HFn-Gd的T1成像代表图，红色箭头表示肿瘤区域，通过对3 只荷瘤鼠采集肿瘤区域的T1值分析发现，如图5c所示，低剂量注射HFn-Gd 后，一直到注射30分钟后，依然能检测到肿瘤区域信号值降低，不需要重复注射，且有足够的时间的与周围正常组织进行对比诊断分析。图5d为组织免疫荧光实验验证HFn-Gd通过TfR1靶向肿瘤。首先对结束了MRI扫描的荷瘤鼠进行心脏灌注，取出癌灶组织，经4％多聚甲醛固定后，分别经 10％-30％的蔗糖溶液进行脱水，之后将肿瘤组织进行OCT(optimum cutting temperature compound,Sakura)包埋，在Leica冰冻切片机上进行切片(厚度为7μ冻)，使用经多聚赖氨酸包被的载玻片进行贴片，置于-20℃保存。在进行切片染色时，首先在低温下取出切片，置于室温下30分钟，然后进行 PBS洗涤三次，再用1％triton X-100处理20分钟，并用PBS洗涤三次，再用10％山羊血清封闭30分钟，经PBS洗涤后，加入Cy5.5标记的HFn-Gd 与FITC标记的TfR1抗体，4℃下共同孵育切片过夜，之后经PBS洗涤后，加入含DAPI的抗荧光淬灭封片剂，盖上盖玻片，在激光共聚焦显微镜下进行观察。结果表明，HFn-Gd的红色荧光和TfR1抗体的绿色荧光很好的重叠在一起，表明HFn-Gd能够依靠肿瘤表面的TfR1进行靶向，致使HFn-Gd 相当于商用Gd-DTPA能够更多的聚集在肿瘤，因此以低剂量进行注射时， HFn-Gd相比较于Gd-DTPA更能增强肿瘤的T1成像。
实施例6、HFn-Gd用于微小乳腺癌的早期磁共振诊断
选用MDA-MB-231细胞制备荷乳腺癌鼠模型，待MDA-MB-231肿瘤经皮测量长至约1mm时，通过尾静脉注射的方式进行HFn-Gd和商用Gd-DTPA 给药并进行MRI扫描，比较结果。(HFn-Gd和商用Gd-DTPA注射剂量依然为0.016mM Gd/kg体重)。采用multi-slice-multi-echo序列进行T1加权成像，具体参数为field of view(FOV)＝3.2cm×3.2cm,matrix＝180×180, repetition time(TR)＝5000ms,echo time(TE)＝49.1ms，32层，层厚为0.5mm，图6a为注射了HFn-Gd的T1成像代表图，红色箭头表示微小MDA-MB-231 的肿瘤区域。由于肿瘤很小，在注射HFn-Gd之前(pre)，很难像大肿瘤那样，经过MRI成像后通过形态观察到肿瘤所在的位置，因此注射完HFn-Gd 后，如果HFn-Gd能够通过靶向聚集在肿瘤部位，(而非是利用血管增强渗透效应)，使得肿瘤区域信号降低，成像变亮，就能进一步说明HFn-Gd真正意义上在荷瘤鼠模型上实现了对微小肿瘤的早期诊断，而图6a很好的呈现了这一结果，图6c的T1值统计分析也证明了这一效果可达至1小时。为了再证明HFn-Gd所诊断的区域是肿瘤所在的位置，在同一只荷 MDA-MB-231肿瘤鼠注射完3小时后，紧接着注射相同低剂量的商用Gd-DTPA，分析其是否能实现对微小肿瘤的诊断。结果如图6b和d所示，低剂量商用Gd-DTPA并不能在荷瘤鼠模型上实现对微小肿瘤的早期诊断。图6e为MDA-MB-231微小肿瘤的解剖示意图，肿瘤区域无血管生成，表明非靶向的分子不能通过增强血管渗透效应到达肿瘤实现肿瘤，而具有靶向肿瘤的分子可以通过受体结合的方式实现其在肿瘤部位聚集。图6f为组织免疫荧光实验验证HFn-Gd通过TfR1靶向微小肿瘤，结果与实施例5图5d一致。
实施例7、HFn-Gd通过泌尿系统排出体外
通过对注射完HFn-Gd 75分钟内裸鼠的肾脏和膀胱进行成像分析，图7 显示肾脏信号从降低到增强，成像逐渐变亮到变暗，图8显示膀胱信号逐渐降低，成像逐渐变亮，表明HFn-Gd经肾脏随产生的尿液流入膀胱暂时贮存，当尿液达到一定数量时，HFn-Gd会随尿液一起排出体外。其代谢途径与商用Gd-DTPA类似，指示更低剂量的使用HFn-Gd既能实现肿瘤的T1磁共振成像，又能适时的排出体外，不具有潜在的毒性。
以上所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种连接钆基的蛋白复合物，其特征在于，
所述复合物包括能够靶向肿瘤的蛋白质以及连接在蛋白质表面的钆螯合物；所述钆螯合物是由钆元素和带有羧基的螯合剂形成的钆螯合物；所述螯合剂的羧基和所述蛋白质的氨基通过酰胺缩合将所述钆螯合物连接在所述蛋白质的表面；所述蛋白质为人源铁蛋白。
2.根据权利要求1所述的连接钆基的蛋白复合物，其特征在于，
所述带有羧基的螯合剂选自二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸(DOTA)、1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-三乙酸(DO3A)、或者4-羧基-5，8，11-三(羧甲基)-1-苯基-2-氧杂-5，8，11-三氮杂十三烷-13-酸(BOPTA)中的一种或任意几种。
3.一种制备权利要求1或2所述的连接钆基的蛋白复合物的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
提供能够靶向肿瘤的蛋白质和钆螯合物，利用所述螯合剂的羧基和所述蛋白质的氨基通过酰胺缩合反应将所述钆螯合物连接在所述蛋白质的表面即可以得到所述连接钆基的蛋白复合物。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，添加缩合剂促进所述酰胺缩合反应。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述缩合剂选自EDC和/或NHS。
6.权利要求1或2所述的连接钆基的蛋白复合物在制备造影剂中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述造影剂为用于核磁共振的造影剂。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述造影剂为用于肿瘤诊断或筛查的核磁共振造影剂。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述肿瘤选自乳腺癌、胰腺癌、肝癌、神经胶质瘤、肺癌、结肠癌、或白血癌。
10.一种造影剂，所述造影剂包括权利要求1或2所述的连接钆基的蛋白复合物。
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