KR20190141218A - 사용 준비된 냉동보존 세포 - Google Patents

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KR20190141218A
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마크 도미시마
카렌 웡
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메모리얼 슬로안 케터링 캔서 센터
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Abstract

본 개시된 보호대상은 해동 후 증폭 및/또는 계대배양 없이 다운스트림 적용을 위해 직접 사용될 수 있는 해리된 세포의 사용 준비된 냉동보존 집단의 조성물에 관한 것이다. 본 개시된 보호대상은 이러한 조성물을 제조하는 방법, 및 이러한 조성물을 사용하는 시험관내 방법도 제공한다.

Description

사용 준비된 냉동보존 세포
관련 출원의 교차참조
본원은 2017년 4월 26일에 출원된 미국 가출원 제62/490,432호, 2017년 6월 13일에 출원된 미국 가출원 제62/518,891호, 및 2017년 6월 13일에 출원된 미국 가출원 제62/519,006호의 우선권을 주장한다(이들 각각의 내용은 전체로서 본원에 참고로 도입되고, 이들 각각의 우선권이 주장됨).
도입
본 개시된 보호대상은 해동 후 증폭 및/또는 계대배양 없이 다운스트림 적용을 위해 직접 사용될 수 있는 사용 준비된 냉동보존 세포의 조성물, 및 상기 조성물을 제조하는 방법, 전구체 조성물, 및 상기 조성물 중의 세포의 시험관내 배양 방법에 관한 것이다.
인간 분화다능 줄기 세포(hPSC)는 혁신적인 질환 모델링 및 세포 대체 요법이다. 현재 PSC는 (예를 들면, 유도된 PSC 또는 iPSC로서) 환자로부터 통상적으로 만들어지고, 질환을 야기하는 것으로 의심되는 유전적 변경을 마음대로 바꾸어 유전형-표현형 관계를 조사할 수 있다. 이 기술은 게놈 전체 연관성을 원인과 결부시키고, 질환 관련 환경을 제공하기 위해 필요한 단계인 PSC 분화를 유도하는 점차 정교해진 능력과 조합될 때 질환 기작에 대한 전례 없는 고찰을 제공한다. 질환 모델링과 별개로, PSC는 임상적으로 관련된 유형의 세포로 유도되어, 세포 대체 요법을 위한 제한 없는 자원을 제공할 수 있다. 상기 두 PSC 적용이 강력할지라도, 개선될 수 있는, hPSC 유지 및 분화의 많은 현실적 양태들이 있다.
질환 모델링 실험에서의 한 현실적 문제점은 hPSC 세포주의 분화를 동시에 유도하면서 이 세포주를 유지하는 것이다. iPSC 질환 모델링 연구에서, "최선의 실시"는 본원에서 "연속 계대배양"으로서 정의된 과정인, 많은 iPSC 세포주들을 동시에 반복적으로 증폭하고 분화시키는 과정을 요구한다. 상이한 세포주들은 종종 상이한 속도로 증폭하기 때문에, PSC의 동시화는 어렵다. 또 다른 문제점은 각각의 PSC 세포주가 연속 계대배양 동안 표류할 수 있으므로, 좋지 않은 분화가 질환 상태 또는 최적이 아닌 PSC 배양을 반영할 것이라는 점이다. 연속 계대배양은 다른 세포주 또는 미생물에 의한 오염의 위험을 증가시키고 실험의 과정 동안 유전적 불안정성을 촉진할 수 있다. 다수의 iPS 세포주들의 연속 계대배양 및 동시적 분화와 관련된 작업량도 인간 오류의 기회를 증가시킨다. 연속 방법은 증폭 및 분화 작업량을 분리할 수 있고 실험이 수행되기 전에 적절한 품질 관리를 수행할 시간을 제공할 수 있다.
연속 계대배양은 세포 요법에 대한 훨씬 더 큰 문제점을 생성할 수 있다. 분화다능 줄기 세포는 세포 보관물의 온전함 및 멸균성을 검증하는 수많은 비싼 시험들 전에 cGMP 조건 하에서 보관된다. 검증 후, 보관된 PSC는 보관물을 임상적으로 관련된 유형의 세포로 변환시키기 위한 분화를 시작하기 전에 해동되고 증폭된다. 해동, 증폭 및 PSC 계대배양은 제조 동안 주요 변수를 생성하고 복잡성을 증가시킨다. 이 단계는 분화 과정으로 들어가는 PSC의 시기, 수율 및 품질을 변화시킬 수 있다.
따라서, 시험관내 배양을 위해 세포를 준비하는 전통적인 방법과 관련된 문제점을 제거하고 고품질의 고도로 일관된 PSC를 생성하는 방법 및 조성물에 대한 필요성이 본 기술분야에 존재한다.
본 개시된 보호대상은 해동 후 증폭 및/또는 계대배양 없이 다운스트림 적용을 위해 직접 사용될 수 있는 사용 준비된 냉동보존 세포의 조성물, 이러한 조성물을 제조하는 방법, 전구체 조성물, 및 상기 조성물 중의 세포의 시험관내 배양 또는 다른 사용 방법에 관한 것이다.
본 개시된 보호대상은 실험에서 사용될, 품질 관리된 분화다능 줄기 세포(PSC), 및 사용 준비된 분취물로서 냉동보존되기 때문에 상이한 시간 및 장소에서 반복적으로 사용될 수 있는 큰 회분(batch)의 생성을 통한 회분-대-회분 가변성의 제거를 제공한다.
개시된 보호대상의 한 양태에 따르면, 세포의 냉동 집단 및 냉동보존 배지를 포함하는 조성물이 제공된다. 또 다른 양태에서, 본 개시는 세포의 냉동 집단을 해동시킴으로써 수득된 세포를 형질감염시킴으로써 제조된, 이종 핵산으로 형질감염된 세포, 및 냉동보존 배지를 포함하는 조성을 제공한다.
일부 실시양태에서, 냉동 세포의 집단은 세포의 해리된 집단이다. 일부 실시양태에서, 냉동 세포의 집단은 적어도 약 5십만, 1백만, 5백만, 1천만, 2천만, 3천만, 4천만, 5천만, 6천만, 7천만, 8천만, 9천만 또는 1억 개 세포/㎖의 농도로 존재한다. 일부 실시양태에서, 냉동 집단 중의 세포의 농도는 적어도 약 1백만 개 세포/㎖이다. 일부 실시양태에서, 냉동 집단 중의 세포의 농도는 적어도 약 5백만 개 세포/㎖이다. 일부 실시양태에서, 냉동 집단 중의 세포의 농도는 적어도 약 3천만 개 세포/㎖이다. 일부 실시양태에서, 냉동 집단 중의 세포의 농도는 적어도 약 5천만 개 세포/㎖이다.
일부 실시양태에서, 세포는 포유동물 세포이다. 일부 실시양태에서, 포유동물 세포는 분화다능 줄기 세포(PSC)이다. 일부 실시양태에서, 분화다능 줄기 세포는 유도된 분화다능 줄기 세포(iPSC)이거나 배아 줄기 세포(ESC)로부터 제조된다.
나아가, 본 개시된 보호대상은 냉동 세포를 포함하는 조성물을 제조하는 방법으로서, 배양 배지에서 배양된 세포의 집단을 해리시키는 단계; 해리된 세포를 냉동보존 배지에 현탁하여 세포 현탁액을 형성하는 단계; 및 세포 현탁액을 냉동시켜 냉동 세포의 조성물을 형성하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 추가로, 본 개시는 (i) 배양 배지에서 배양된 세포의 집단을 해리시키는 단계; 해리된 세포를 냉동보존 배지에 현탁하여 세포 현탁액을 형성하는 단계; 및 세포 현탁액을 냉동시켜 냉동 세포의 조성물을 형성하는 단계를 포함하는 방법에 의해 냉동된 세포를 포함하는 조성물을 제조하는 단계; 및 (ii) (i)의 조성물의 세포를 이종 핵산으로 형질감염시키는 단계를 포함하는, 형질감염된 세포를 제조하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 냉동 세포의 조성물은 적어도 약 5십만, 1백만, 5백만, 1천만, 2천만, 3천만, 4천만, 5천만, 6천만, 7천만, 8천만, 9천만 또는 1억 개 세포/㎖의 농도를 가진다.
일부 실시양태에서, 세포의 집단을 해리시키는 단계는 세포의 집단을 유효량의 세포 해리 용액에 노출시키는 단계도 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포 해리 용액은 효소 무함유 세포 해리 용액 및 효소 함유 용액으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 효소 함유 세포 해리 용액은 하나 이상의 효소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 효소는 아큐타제(Accutase)™, 콜라게나제(collagenase), 프로테아제(protease), 트립신 및 유도체, 파파인(papain), 히알루로니다제(hyaluronidase) 및 DNase로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 효소 무함유 세포 해리 용액은 킬레이팅제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 킬레이팅제는 세포와 기질의 상호작용을 제거하는 데 사용되는 EDTA 또는 다른 Ca++/Mg++ 무함유 물질이다. 일부 실시양태에서, 배양 배지는 피더(feeder) 무함유 배지이다.
개시된 보호대상의 또 다른 양태에 따르면, 본 개시된 보호대상은 해리된 냉동 세포의 집단 및 냉동보존 배지를 포함하는 조성물을 해동시키는 단계; 및 세포를 다운스트림 처리로 처리하는 단계를 포함하는 세포의 시험관내 배양 방법으로서, 상기 세포가 다운스트림 처리 전에 본질적으로 증폭되지 않고/않거나 계대배양되지 않는 것인 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 냉동 세포의 조성물은 적어도 약 5십만, 1백만, 5백만, 1천만, 2천만, 3천만, 4천만, 5천만, 6천만, 7천만, 8천만, 9천만 또는 1억 개 세포/㎖의 농도를 가진다.
일부 실시양태에서, 세포의 집단은 해동 후 증폭된다. 일부 실시양태에서, 세포의 집단은 이 집단 내의 세포가 최대 1회, 2회, 3회, 4회 또는 5회 세포 분열을 겪도록 일정 시간 동안 증폭된다.
일부 실시양태에서, 세포의 집단은 세포가 세포 분열을 겪도록 일정 시간 동안 증폭되고, 상기 증폭은 기하급수적 증폭이 아니다. 일부 실시양태에서, 세포의 집단은 해동 후 계대배양된다. 일부 실시양태에서, 세포의 집단은 최대 1회, 2회, 3회, 4회 또는 5회 계대배양된다. 일부 실시양태에서, 세포는 포유동물 세포이다. 일부 실시양태에서, 포유동물 세포는 분화다능 줄기 세포(PSC)이다. 일부 실시양태에서, 분화다능 줄기 세포는 유도된 분화다능 줄기 세포(iPSC)이거나 배아 줄기 세포(ESC)로부터 제조된다.
일부 실시양태에서, 다운스트림 처리는 냉동보존 세포를 분화시키는 시험관내 방법을 포함한다. 일부 실시양태에서, 냉동보존 세포는 복수의 체세포들, 예를 들면, 뉴런 세포 또는 이의 전구체로 분화되고, 이때 상기 분화된 세포는 상기 세포의 검출가능한 수준의 하나 이상의 마커를 발현한다. 일부 실시양태에서, 냉동보존 세포는 신경능 또는 신경능 유래 세포로 분화된다. 일부 실시양태에서, 냉동보존 세포는 도파민 생성 세포, 예컨대, 중뇌 도파민 세포 또는 이의 전구체로 분화된다. 일부 실시양태에서, 도파민 전구체 세포는 검출가능한 수준의 포크헤드 박스(forkhead box) 단백질 A2(FOXA2), LIM 호메오박스(homeobox) 전사 인자 1 알파(LMX1A) 및/또는 티로신 하이드록실라제(TH)를 발현한다.
일부 실시양태에서, iPSC는 질환 또는 장애, 예를 들면, 신경퇴행성 질환으로 진단받은 대상체로부터 유래한다. 일부 실시양태에서, 신경퇴행성 질환은 파킨슨병이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 세포는 냉동보존 전, 또는 냉동보존에 이은 해동 후 핵산으로 형질감염된다. 일부 실시양태에서, 핵산은 형질감염 또는 핵감염에 의해 도입된다. 일부 실시양태에서, 세포는 냉동보존되지 않은 세포에 비해 핵산의 증가된 흡수 및/또는 발현을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 해리된 세포의 집단의 발현 수준은 냉동되지 않은 세포의 집단의 발현 수준보다 적어도 약 2배 더 크다. 일부 실시양태에서, 해리된 세포의 집단의 발현 수준은 냉동되지 않은 세포의 집단의 발현 수준보다 적어도 약 5% 더 크다.
따라서, 다양한 실시양태는 해리된 냉동 세포의 집단 및 냉동보존 배지를 포함하는 조성물을 해동시키는 단계; 및 상기 세포를 관심 있는 핵산으로 형질감염시키는 단계를 포함하는, 형질감염된 세포를 제조하는 방법으로서, 상기 세포가 형질감염 전에 본질적으로 증폭되지 않고/않거나 본질적으로 계대배양되지 않고, 형질감염 효율이 형질감염 전에 냉동보존되지 않은 대조군 세포의 형질감염 효율에 비해 실질적으로 증가되고/되거나, 형질감염된 핵산의 발현이 형질감염 전에 냉동보존되지 않은 대조군 세포에서의 형질감염된 핵산의 발현에 비해 실질적으로 증가된 것인 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법에 의해 제조된 형질감염된 세포의 조성물이 제공되고, 이때 상기 세포는 형질감염된 핵산, 예를 들면, 삽입, 결실, 치환 또는 재배열에 의해 변경된 서열을 포함하는 핵산 서열(이의 적어도 일부는 형질감염 전에 세포에서 발견되지 않음)을 포함하는 이종 핵산을 함유한다.
도 1a 내지 1l은 냉동휴면 세포의 생존율, 보관 일관성 및 PSC 마커 발현을 보여준다. (1a, 1f) 신선한(대조군) WA09 세포 및 냉동휴면 WA09 세포의 해동 후 퍼센트 생존율. 아크리딘 오랜지(생존) 및 요오드화프로피듐 형광(사멸) 형광을 이용하여 넥스셀롬(Nexcelom) 자동화된 세포 카운터에서 생존율을 측정하였다(CP의 경우 n=15, 및 대조군의 경우 n=28). (1b) 13개의 독립적인 냉동휴면 PSC 세포 보관물에 대한 냉동 전(적색 삼각형) 및 해동 후(흑색 원) 세포의 생존율. (1c 내지 1e) 유세포분석에 의해 측정된, 대조군 또는 냉동휴면 세포에서의 줄기 세포 마커 발현(또는 자연발생적 분화, SSEA-1)(1c), 평균 ± SD로서 표시된 독립적인 생물학적 복제물에 대한 값(1d, n=3), 또는 면역형광(1e, 축적 막대 = 100 ㎛). (1g) 대조군 및 냉동휴면 세포의 분화다능성을 평가하기 위한 PluriTest 어세이. 대조군(n=2) 또는 냉동휴면(n=2) WA09 배양물을 사용하여, 마이크로어레이에의 하이브리드화 전에 RNA를 수득하였다. PluriTest 알고리즘을 이용하여 어레이 데이터를 프로세싱하였고, 각각의 샘플을 2종의 관련된 파라미터인 분화다능성 점수 및 신규성 점수로서 작도한다. 모든 4개의 샘플들은 분화다능성의 PluriTest 평가를 통과하였다. 적색 구름은 PluriTest를 통과한 샘플을 표시하는 반면, 청색 구름은 PluriTest를 통과하지 못한 샘플이다. (1h) 대조군 및 냉동휴면 세포의 메틸화를 평가하는 MA 도표. 상보적 CpG 부위들(대향하는 가닥들에서 1개의 염기에 의해 분리됨)에 대한 메틸화 값들을 조합하여 CpG 유닛 메틸화를 생성하였다. 10개의 판독정보의 최소 역치 커버리지를 이용하여 CpG 유닛을 여과함으로써, 대조군 및 냉동휴면 샘플에 대한 각각 3,714,418개 및 3,408,158개의 CpG 유닛을 생성하였다. 상기 두 샘플들에 의해 커버된 3,155,482개의 공통 CpG 유닛의 메틸화 수준에서 통계학적 분산을 추정하는, 이상치에 민감하지 않은 강력한 가변성 척도인 중간 절대 편차(MAD)로 메틸화 수준의 일치를 평가하였다. (1i) 냉동휴면 세포는 기형종을 생성하는 능력이 있다. 모든 패널들의 경우, 적색 화살표는 외배엽을 표시하고, 녹색 및 청색 별표는 중배엽을 표시하고, 흑색 화살표는 내배엽을 표시한다. (위) 냉동휴면 WA09 hESC로부터 유래한 헤마톡실린 및 에오신-염색된 기형종 박편을 보여주는 저배율 영상. 축적 막대 = 1 mm. (중간) 내배엽(배상 세포, 흑색 화살표) 및 중배엽(녹색 별표)을 함유하는 영역을 보여주는 고배율 영상, 축적 막대 = 200 ㎛. (아래) 외배엽(멜라닌 신경외배엽, 적색 화살표) 및 중배엽(지방세포, 청색 별표)을 보여주는 고배율 영상, 축적 막대 = 200 ㎛. (1j) 오퍼레타(Operetta) 고성능 영상화기에서 γH2AX 발현에 의해 측정될 때 대조군 및 냉동휴면 세포에서의 DNA 손상의 정량(좌측), 및 어세이에 대한 양성 대조군으로서 DNA 손상에 대한 취약성을 시험하기 위해 1시간 동안 0.5 μM 캄프토테신으로 처리한 후 대조군 및 냉동휴면 세포에서의 DNA 손상의 정량(우측, n=3; 평균 ± SD로서 표시된 독립적인 생물학적 복제물에 대한 값). (1k) 1시간 동안 0.5 μM 캄프토테신으로 처리하거나 처리하지 않은 대조군 및 냉동휴면 세포에서의 γH2AX 발현의 대표적인 면역형광. (1l) 전체적으로 핵형분석된 20개의 DAPI-밴드 중기(metaphase)에 대한 염색체 분석을 수행하였다. 대조군(20/20) 및 냉동휴면 세포(20/20) 둘 다가 정상적인 46, XX 핵형을 가졌다. (1a), (1c) 및 (1j)에서, 적어도 3회의 독립적인 실험으로 윌콕신(Wilcoxin) 부호 순위 검정을 수행하였고, 대조군과 냉동휴면 사이에 통계학적 차이가 없다는 것을 발견하였다(p>0.05). 도 5a도 참조한다.
도 2a 내지 2m은 냉동휴면 세포의 유도된 분화의 동력학 및 정도를 보여준다. (2a 및 2l) 신경 유도 동안 유세포분석에 의해 정량된 OCT4 및 PAX6 발현(n=5; 평균 ± SD로서 표시된 독립적인 생물학적 복제물에 대한 값). (2b 및 2c) 신경 유도 후 0일째 날, 3일째 날, 6일째 날 및 9일째 날 대표적인 유세포분석(2b) 및 면역형광(2c). (2d) 중내배엽 유도 동안 유세포분석에 의해 정량된 OCT4 및 Brachyury 발현(n=3; 평균 ± SD로서 표시된 독립적인 생물학적 복제물에 대한 값). 중내배엽 유도 후 0일째 날, 1일째 날, 2일째 날 및 4일째 날 대표적인 유세포분석(2e, 2k) 및 면역형광(2f). (2g) 1백만, 5백만, 1천만, 2천만 및 3천만 개 세포/㎖로 냉동될 때 해동 후 냉동휴면 세포의 생존율. 아크리딘 오랜지(생존) 및 요오드화프로피듐(사멸) 형광을 이용하여 자동화된 세포 카운터에서 생존 세포의 퍼센트를 측정하였다(n=3; 평균 ± SD로서 표시된 독립적인 생물학적 복제물에 대한 값). (2h, 2m) 셀 팩토리(Cell Factory)에서 증폭된 대조군 및 냉동휴면 세포에서 유세포분석에 의해 측정된 줄기 세포 마커 발현(또는 자연발생적 분화, SSEA-1)(n=3; 2h에서 평균 ± SD로서 표시된 독립적인 생물학적 복제물에 대한 값, 2m에서 대표적인 예). (2i) 냉동휴면 세포의 중뇌 도파민 뉴런 분화 후 21일째 날 FOXA2(적색) 및 TH(녹색) 발현. 축적 막대 = 100 ㎛. (2j) 대조군 및 냉동휴면 WA09 hESC의 유전자 발현 및 중뇌 도파민 뉴런. 샘플을 WA09 hES 대조군 세포로 표준화하였고, 발현의 배수 변화를 색채로 코딩하였다. 대조군 hES에 비해 더 높은 발현 수준은 적색으로 표시되어 있고, 더 낮은 수준은 청색으로 표시되어 있다. (2a), (2d), (2g) 및 (2h)에서, 적어도 3회의 독립적인 실험을 이용하여 윌콕신 부호 순위 검정을 수행하였고, 대조군과 냉동휴면 사이에 통계학적 차이는 발견되지 않았다(p>0.05).
도 3a 내지 3e. 냉동휴면 세포의 유전적 변형. (a 및 b) GFP 플라스미드로 핵감염시킨 지 24시간 후 대조군 및 냉동휴면 세포에서 GFP 발현의 대표적인 면역형광(a) 및 유세포분석(b). (c) GFP 플라스미드로 핵감염시킨 지 24시간 후 대조군 및 냉동휴면 세포에서 유세포분석에 의해 정량된 GFP 발현(n=3; 평균 ± SD로서 표시된 독립적인 생물학적 복제물에 대한 값). (d) EmGFP를 함유하는 센다이(Sendai) 바이러스 벡터를 사용한 형질도입 후 냉동휴면 세포에서 GFP 발현의 대표적인 면역형광. 초기 형질도입으로부터의 개별 서브클론은 적어도 10회 계대배양 동안 GFP+ 콜로니로서 유지될 수 있다. (e) 냉동휴면 WA01 iCRISPR 세포에서 HPRT 가이드 RNA와 함께 게놈 절단 검출 키트를 사용한 후 절단 생성물의 아가로스 겔 분석. + 또는 -는 (+) 검출 효소의 존재 및 부재(-)를 표시한다. (1) 양성 대조군; (2) 가이드 RNA 없이 냉동휴면 전에 유도된 Cas9를 가진 iCRISPR 세포; (3) Cas9 유도를 갖지 않되 HPRT 가이드 RNA를 가진 iCRISPR 세포; (4) Cas9 유도 및 HPRT 가이드 RNA를 가진 iCRISPR 세포; (5) Cas9 유도 및 HPRT 가이드 RNA를 가진 iCRISPR 세포(냉동휴면 없음). (c)에서, 3회의 독립적인 실험을 이용하여 윌콕신 부호 순위 검정을 수행하였고, 대조군과 냉동휴면 사이에 통계학적 차이는 발견되지 않았다(p>0.05).
도 4a 내지 4c는 냉동휴면 세포의 유전적 변형을 보여준다. 대조군 및 냉동휴면 세포에서 GFP 플라스미드로 핵감염시킨 지 24시간 및 48시간 후 유세포분석(4a) 또는 형광 현미경관찰(4b)에 의한 GFP 발현. (4c) 효소의 존재(레인 1) 및 부재(레인 2) 하에서 진아트(GeneArt) 게놈 절단 검출 키트 양성 대조군. 효소의 존재(레인 3) 및 부재(레인 4) 하에서 핵감염 동안 가이드 RNA 없이 Dox를 냉동휴면 전 세포에 첨가하였다. 효소의 존재(레인 5) 및 부재(레인 6) 하에서 핵감염 동안 Dox를 냉동휴면 전 세포에 첨가하지 않았으나, HPRT 가이드 RNA를 제공하였다. 세포는 효소의 존재(레인 7) 및 부재(레인 8) 하에서 냉동휴면 전에 Dox를 제공받았고 해동 후 HPRT 가이드 RNA를 제공받았다. 효소의 존재(레인 9) 및 부재(레인 10) 하에서 Dox 및 HPRT 가이드 RNA를 제공받은(그러나, 결코 냉동되지 않은) 신선한 대조군 세포.
도 5a 내지 5f는 냉동보존 조건이 변경된 냉동휴면 세포의 생존율을 보여준다. 도 1과 관련된다. 아크리딘 오랜지(생존) 및 요오드화프로피듐(사멸) 형광을 이용하여 자동화된 세포 카운터에서 생존율을 측정하였다. (5a) WA09, 960.1B, 153.3A 및 WA01 iCRISPR 세포주에서 냉동휴면 세포 및 대조군 세포의 퍼센트 생존율. (5b) FreSR-S 또는 PSC 냉동보존 키트에서 제어된 속도 냉동기 또는 보편적인 냉동을 이용할 때 냉동휴면 WA09 세포의 해동 후 생존율. (5c) 제어된 속도 냉동기 또는 보편적인 냉동을 이용할 때 냉동휴면 WA09 세포의 해동 후 생존율(방법 참조). (5d) 피더 부재(Geltrex™) 또는 피더 기반 조건에서 생장된 냉동휴면 WA09 세포의 해동 후 생존율. "CRF"는 제어된 속도 냉동기의 이용을 표시하는 반면, "-80"은 액체 질소 탱크로 옮기기 전에 24시간 동안 -80℃에서 세포 냉동 용기에서 바이알을 저장하였다는 것을 표시한다. DMSO는 냉동매질로서 10% DMSO를 사용하였다는 것을 표시한다. 세포는 제어된 속도 냉동기 또는 보편적인 냉동을 이용함으로써 냉동휴면된다. (5e) 대조군 또는 1년에 걸쳐 냉동된 냉동휴면 세포에서 유세포분석에 의한 줄기 세포 마커 발현(또는 자연발생적 분화, SSEA-1). (5f) 대조군 및 냉동휴면 WA09 hESC를 사용하였을 때 기형종 성장률.
도 6은 냉동보존 세포를 제조하고 사용하는 데 있어서 전통적인 방법 및 냉동휴면 방법의 계략적 예시이다.
도 7은 보편적인 PSC 배양에 비해 냉동휴면 방법의 상이한 계략적 예시이다. (위) 보편적인 (대조군) 워크플로우(workflow)는 냉동보존으로부터 콜로니를 회수하고, 특정 적용, 예컨대, 관심 있는 유형의 세포로의 유도된 분화를 위해 배양물의 일부를 주기적으로 사용하여 상기 콜로니를 장시간에 걸쳐 증폭한다. 시간의 경과에 따라, PSC는 유전적 변화, 오염, 또는 자연발생적 분화의 양의 변화를 획득할 것이고, 이들 모두가 결과에 영향을 미칠 수 있다. (아래) 냉동휴면은 가능한 최소한의 수의 계대배양에 걸쳐 PSC의 큰 풀을 증폭한다. 그 다음, 냉동보존 전에 큰 회분을 단일 세포 현탁액으로 해리시킨다. 냉동 과정은 PSC의 생성을 그의 사용으로부터 분리함으로써, 각각의 보존물의 적절한 품질 관리 및 특징규명을 수행할 시간을 허용한다. 상기 과정은 다수의 실험들에서 동일한 세포의 사용도 허용하고, 다른 실험실이 PSC의 정확히 동일한 출발 집단으로 독립적인 실험을 시작할 수 있도록 전 세계 어디로든 운반될 수 있게 한다.
도 8a 내지 8c는 신선한 비냉동 대조군 WA09 세포에 비해 유전적으로 변형된 냉동휴면 WA09 인간 배아 줄기 세포의 집단에 의해 발현된 구축물의 발현 수준 분포를 보여준다. (8a) 유세포분석에 의해 측정될 때, 냉동휴면되고 해동시 3.4 kb GFP 플라스미드로 핵감염된 WA09 줄기 세포(청색 그래프, a), GFP 벡터로 핵감염된 신선한 비냉동 대조군 WA09 세포(적색 그래프, b) 및 핵감염되지 않은 WA09 세포(녹색 그래프, c)의 집단에서 GFP 발현 수준의 분포. (8b) 유세포분석에 의해 측정될 때, 냉동휴면되고 해동시 mCherry를 발현하는 9.3 kb CRISPR/CAS9 플라스미드로 핵감염된 WA09 줄기 세포, 및 mCherry CRISPR/CAS9 플라스미드로 핵감염된 신선한 비냉동 대조군 WA09 세포의 집단에서 mCherry 발현 수준의 분포. 세포를 2.5 ㎍, 5 ㎍, 7.5 ㎍, 10 ㎍ 또는 12.5 ㎍의 플라스미드로 핵감염시켰다. (8c) 2.5 ㎍, 5 ㎍, 7.5 ㎍, 10 ㎍ 또는 12.5 ㎍의 플라스미드를 사용한 핵감염 후 mCherry를 발현하는 냉동휴면 세포 및 신선한 비냉동 대조군 세포의 퍼센트. 제2 핵감염 용액인 HSC2도 냉동휴면 조건 및 신선한 비냉동 조건 하에서 2.5 ㎍의 플라스미드로 시험하였고 mCherry 발현에 대해 분석하였다.
본 개시된 보호대상은 해동 후 증폭 및/또는 계대배양 없이 다운스트림 적용을 위해 직접 사용될 수 있음으로써, 연속 계대배양과 관련된 다수의 문제점들, 예컨대, 오염 및 세포 품질의 비일관성을 제거할 수 있는, 사용 준비된 냉동보존 세포의 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 개시된 보호대상은 이러한 조성물의 제조 방법, 전구체 조성물, 다운스트림 적용, 예컨대, 세포 분화, 세포 요법 및 질환 모델링을 위해 상기 조성물 중의 세포를 사용하는 시험관내 방법에 관한 것이다.
한정을 위한 것이 아니라 개시의 명료성을 위해, 상세한 설명은 하기 하위단락으로 나누어진다:
1. 정의;
2. 사용 준비된 냉동보존 세포의 조성물;
3. 사용 준비된 냉동보존 세포의 제조 방법; 및
4. 사용 준비된 냉동보존 세포의 사용 방법.
1. 정의
본 명세서에서 사용된 용어는 일반적으로 본 발명의 문맥 및 각각의 용어가 사용되는 특정 문맥 내에서 본 기술분야에서의 그의 통상의 의미를 가진다. 일부 용어들은 본 발명의 조성물 및 방법, 및 이들을 만들고 사용하는 방법을 기술함에 있어서 추가 지침을 숙련된 자에게 제공하기 위해 이하에서 또는 본 명세서의 다른 곳에서 논의되어 있다.
용어 "약" 또는 "대략"은 값이 어떻게 측정되거나 결정되는 지에 부분적으로 의존할, 본 기술분야에서 통상의 기술을 가진 자에 의해 결정된 특정 값에 대한 허용가능한 오차 범위, 즉 측정 시스템의 한계 내에 있다는 것을 의미한다. 예를 들면, "약"은 본 기술분야의 관행에 따라 3 또는 3 초과의 표준 편차 이내에 있다는 것을 의미할 수 있다. 대안적으로, "약"은 소정의 값의 최대 20%, 예를 들면, 최대 10%, 최대 5% 또는 최대 1%의 범위를 의미할 수 있다. 대안적으로, 특히 생물학적 시스템 또는 과정과 관련하여, 상기 용어는 값의 한 자릿수 이내, 예를 들면, 5배 이내 또는 2배 이내에 있다는 것을 의미할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "분취물"은 용액, 예를 들면, 세포 현탁 용액의 총량의 일부를 의미한다. "세포의 분취물"은 세포 현탁액으로부터 나누어져 별도의 용기 내에 저장된, 세포 현탁액의 총량의 일부를 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "세포 배양"은 연구 또는 의학적 치료를 위해 시험관내 인공 배지에서 세포를 생장시키는 것을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "부착 세포 배양"은 세포가 조직 배양 플라스크 또는 플레이트의 바닥에 부착되어 있는 동안 세포 배양 배지에서 생장되는 세포 배양 방법을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "배양 배지"는 배양 용기, 예컨대, 페트리 플레이트, 다중-웰 플레이트 등에서 세포를 덮고 세포에게 영양분을 공급하고 세포를 지지하기 위해 영양분을 함유하는 액체를 지칭한다. 배양 배지는 세포에서 원하는 변화를 생성하기 위해 첨가된 성장 인자도 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "세포 현탁액"은 단일 세포 또는 세포의 작은 응집체가 용기의 벽에 부착하지 않으면서 액체 매질에 현탁되어 있는 용액을 지칭한다. "단일 세포 현탁액"은 단일 세포가 액체 매질에 현탁되어 있는 세포 현탁액을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "냉동보존한다" 또는 "냉동보존"은 매우 낮은 온도까지 냉각시킴으로써 세포를 보존하는 과정이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "냉동보존 배지"는 냉동보존 세포와 혼합되고 저장되는 액체를 지칭한다. 냉동보존 배지는 얼음 형성으로 인한 냉동 손상으로부터 세포를 보호하기 위해 사용되는 유효량의 물질을 함유할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "증폭" 또는 "증폭한다"는 세포 수의 증가를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "계대배양"은 배양 용기로부터 배양 배지를 제거하고 배양 용기에서 배양된 세포를 새로운 배양 배지로 옮기는 과정을 지칭한다. 계대배양 과정은 배양된 세포의 추가 증폭을 가능하게 한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "시험관내"는 인공 환경, 및 인공 환경 내에서 일어나는 과정 또는 반응을 지칭한다. 시험관내 환경은 페트리 디쉬, 원뿔형 튜브 및 세포 배양물로 예시되나 이들로 한정되지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "생체내"는 천연 환경(예를 들면, 동물 또는 세포), 및 천연 환경 내에서 일어나는 과정 또는 반응, 예컨대, 배아 발생, 세포 분화, 신경관 형성 등을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "분화"는 비전문화된 세포, 예를 들면, 분화다능 줄기 세포, 예컨대, 배아 줄기 세포(ESC) 및/또는 유도된 분화다능 줄기 세포(iPSC)가 전문화된 세포, 예컨대, 심장, 간, 뉴런 또는 근육 세포, 또는 이들의 전구체의 특징을 획득하는 과정을 지칭한다. 분화는 세포가 예를 들면, 유전자 발현을 직접적으로 또는 간접적으로 조절하는, 세포 표면에 매립된 단백질을 이용하는 신호전달 경로를 통해 세포 외부의 물리적 조건 및 화학적 조건과 상호작용함으로써 제어된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "세포의 집단" 또는 "세포 집단"은 세포의 군을 지칭한다. 비한정적 예에서, 세포 집단은 적어도 약 1십만, 적어도 약 5십만, 적어도 약 1백만, 적어도 약 2백만, 적어도 약 3백만, 적어도 약 4백만, 적어도 약 5백만, 적어도 약 1천만, 적어도 약 2천만, 적어도 약 3천만, 적어도 약 4천만, 적어도 약 5천만, 적어도 약 6천만, 적어도 약 7천만, 적어도 약 8천만, 적어도 약 9천만, 적어도 약 1억 개의 세포, 적어도 약 2억 개의 세포, 적어도 약 5억 개의 세포, 적어도 약 10억 개의 세포, 적어도 약 15억 개의 세포, 적어도 약 20억 개의 세포, 적어도 약 25억 개의 세포, 적어도 약 30억 개의 세포, 또는 이들 사이의 값을 포함할 수 있다. 상기 집단은 한 유형의 세포를 포함하는 순수한 집단일 수 있다. 대안적으로, 상기 집단은 하나 초과의 유형의 세포, 예를 들면, 혼합된 세포 집단을 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "줄기 세포"는 배양물에서 무한한 기간 동안 분열하고 전문화된 세포를 발생시킬 능력을 가진 세포를 지칭한다. 인간 줄기 세포는 인간으로부터 유래한 줄기 세포를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "배아 줄기 세포"는 배양물에서 연장된 기간 동안 분화하지 않으면서 분열할 수 있는, 착상 전 단계 배아로부터 유래한 원시(미분화된) 세포를 지칭하고, 3개의 주요 배엽의 세포 및 조직을 발생시키는 것으로 공지되어 있다. 인간 배아 줄기 세포는 인간으로부터 유래한 배아 줄기 세포를 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "인간 배아 줄기 세포" 또는 "hESC"는 배양물에서 연장된 기간 동안 분화하지 않으면서 분열할 수 있는, 배반세포 단계까지 포함하는 초기 단계 인간 배아로부터 유래한 분화다능 줄기 세포의 일종을 지칭하고, 3개의 주요 배엽의 세포 및 조직을 발생시키는 것으로 공지되어 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "분화다능"은 내배엽, 중배엽 및 외배엽을 포함하는 유기체의 3개 발생 배엽을 발생시키는 능력을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "유도된 분화다능 줄기 세포" 또는 "iPSC"는 체세포, 예를 들면, CI 4, C72 등 내로의 일부 배아 유전자들(예컨대, OCT4, SOX2 및 KLF4 형질전이유전자)(예를 들면, 본원에 참고로 도입된 문헌(Takahashi and Yamanaka Cell 126, 663-676 (2006)) 참조)의 도입에 의해 형성된, 배아 줄기 세포와 유사한 분화다능 줄기 세포(PSC)의 일종을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "분화다능 줄기 세포주" 또는 "PSC 세포주"는 수일, 수개월 또는 수년까지 분화 없는 증식을 가능하게 하는 시험관내 조건 하에서 배양된 분화다능 줄기 세포의 집단을 지칭한다.
유효량은 원하는 효과를 생성하는 양이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 세포와 관련하여 용어 "분화를 유도하는"은 디폴트 세포 유형(유전형 및/또는 표현형)을 비-디폴트 세포 유형(유전형 및/또는 표현형)으로 바꾸는 것을 지칭한다. 따라서, "줄기 세포의 분화를 유도하는"은 줄기 세포와 상이한 특성, 예컨대, 유전형(예를 들면, 유전적 분석, 예컨대, 마이크로어레이에 의해 확인된 유전자 발현의 변화) 및/또는 표현형(예를 들면, 단백질, 예컨대, TUJI, DCX, TBR1, REELIN 및 FOXG1의 발현의 변화)을 가진 자손 세포로 분열하도록 줄기 세포(예를 들면, 인간 줄기 세포)를 유도하는 것을 의미한다. 본원에서 "개체" 또는 "대상체"는 척추동물, 예컨대, 인간 또는 비-인간 동물, 예를 들면, 포유동물이다. 포유동물은 인간, 영장류, 농장 동물, 스포츠 동물, 설치류 및 애완동물을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 비-인간 동물 대상체의 비한정적 예로는 설치류, 예컨대, 마우스, 래트, 햄스터 및 기니 피그; 토끼; 개; 고양이; 양; 돼지; 염소; 소; 말; 및 비-인간 영장류, 예컨대, 유인원 및 원숭이가 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "질환"은 세포, 조직 또는 장기의 정상적인 기능을 손상시키거나 방해하는 임의의 상태 또는 장애를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "치료하는" 또는 "치료"는 치료되는 개체 또는 세포의 질환 과정을 변경시키기 위한 임상적 중재를 지칭하고, 예방을 위해 수행될 수 있거나 임상적 병리학의 과정 동안 수행될 수 있다. 치료의 치료 효과는 질환의 발생 또는 재발의 예방, 증상의 완화, 질환의 임의의 직접적인 또는 간접적인 병리학적 결과의 감소, 전이의 예방, 질환 진행 속도의 감소, 질환 상태의 호전 및 경감, 및 관해 또는 개선된 예후를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 치료는 질환 또는 장애의 진행을 예방함으로써, 영향을 받거나 진단을 받은 대상체, 또는 장애를 가진 것으로 의심되는 대상체에서 장애로 인한 악화를 예방할 수 있을 뿐만 아니라, 치료는 장애의 위험에 있거나 장애를 가진 것으로 의심되는 대상체에서 장애 또는 장애의 증상의 발병을 예방할 수 있다.
2. 사용 준비된 냉동보존 세포의 조성물
본 개시된 보호대상은 해리된 세포의 냉동 집단 및 냉동보존 배지를 포함하는 조성물을 제공한다. 세포의 냉동 집단은 사용 준비된 상태이고, 이때 상기 세포는 해동 후 증폭 및/또는 계대배양 없이 또는 거의 없이 다운스트림 적용을 위해 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 해리된 세포의 집단은 이 집단 내의 각각의 세포가 해리되지 않은 세포의 집단에 비해 다른 세포에의 감소된 수준의 부착을 나타내도록 단일 세포 현탁액을 포함한다. 일부 실시양태에서, 해리된 세포의 집단은 해리되지 않은 세포의 집단에 비해 감소된 수준 또는 양의 세포 응집체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 해리된 세포의 집단은 해리되지 않은 세포의 집단에 비해 더 작은 크기의 세포 응집체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 해리된 세포의 집단은 단일 세포 현탁액을 포함하고, 이때 상기 집단 내의 각각의 세포는 상기 집단 내의 다른 세포에 부착되지 않으므로, 상기 집단은 세포 응집체를 포함하지 않는다.
냉동 세포는 고농도로 냉동보존 배지에서 저장될 수 있으므로, 조성물의 단일 분취물은 해동 후 증폭 없이 또는 거의 없이 다운스트림 적용을 위해 충분한 수의 세포를 제공할 수 있다. 한정이 아닌 예로써, 분취물 중의 세포의 농도는 1백만 개 세포/㎖ 초과, 5백만 개 세포/㎖ 초과, 1천만 개 세포/㎖ 초과 또는 2천만 개 세포/㎖ 초과일 수 있다.
일부 실시양태에서, 조성물의 단일 분취물은 해동 후 증폭 없이 다운스트림 적용을 위해 충분한 수의 세포를 제공한다.
일부 실시양태에서, 조성물의 단일 분취물은 해동 후 계대배양 없이 다운스트림 적용을 위해 충분한 수의 세포를 제공한다.
일부 실시양태에서, 조성물의 단일 분취물은 해동 후 증폭 및 계대배양 없이 다운스트림 적용을 위해 충분한 수의 세포를 제공한다.
일부 실시양태에서, 조성물의 단일 분취물은 다운스트림 적용을 위한 충분한 수의 세포를 제공하거나, 해동 후, 세포의 집단은 이 집단 내의 세포가 제한된 양의 세포 분열, 예를 들면, 최대 0.5회, 최대 1회, 최대 2회, 최대 3회, 최대 4회 또는 최대 5회의 세포 분열(0.5회의 세포 분열은 세포 집단의 배가 시간의 절반인 시간 동안 배양하는 것을 의미함)을 겪도록 일정 시간 동안 증폭된다.
일부 실시양태에서, 세포의 집단은 해동 후 이 집단 내의 세포가 세포 분열을 겪도록 일정 시간 동안 증폭되고, 이때 상기 증폭은 기하급수적 증폭이 아니다.
일부 실시양태에서, 세포의 집단은 해동 후 계대배양된다. 일부 실시양태에서, 세포의 집단은 최대 1회, 최대 2회, 최대 3회, 최대 4회 또는 최대 5회 계대배양된다.
일부 실시양태에서, 냉동보존 배지 중의 세포의 농도는 적어도 약 1십만 개 세포/㎖, 적어도 약 5십만 개 세포/㎖, 적어도 약 1백만 개 세포/㎖, 적어도 약 5백만 개 세포/㎖, 적어도 약 1천만 개 세포/㎖, 적어도 약 1천5백만 개 세포/㎖, 적어도 약 2천만 개 세포/㎖, 적어도 약 2천5백만 개 세포/㎖, 적어도 약 3천만 개 세포/㎖, 적어도 약 3천5백만 개 세포/㎖, 적어도 약 4천만 개 세포/㎖, 적어도 약 4천5백만 개 세포/㎖, 적어도 5천만 개 세포/㎖, 적어도 약 5천5백만 개 세포/㎖, 적어도 약 6천만 개 세포/㎖, 적어도 약 6천5백만 개 세포/㎖, 적어도 약 7천만 개 세포/㎖, 적어도 약 7천5백만 개 세포/㎖, 적어도 약 8천만 개 세포/㎖, 적어도 약 8천5백만 개 세포/㎖, 적어도 약 9천만 개 세포/㎖, 적어도 약 9천5백만 개 세포/㎖, 적어도 약 1억 개 세포/㎖, 적어도 약 1억5천만 개 세포/㎖, 적어도 약 2억 개 세포/㎖, 적어도 약 2억5천만 개 세포/㎖, 적어도 약 3억 개 세포/㎖, 적어도 약 3억5천만 개 세포/㎖, 적어도 약 4억 개 세포/㎖, 적어도 약 4억5천 개 세포/㎖, 적어도 약 5억 개 세포/㎖이다.
일부 실시양태에서, 조성물의 단일 분취물은 적어도 약 1 ㎖, 적어도 약 2 ㎖, 적어도 약 3 ㎖, 적어도 약 4 ㎖, 적어도 약 5 ㎖, 적어도 약 6 ㎖, 적어도 약 7 ㎖, 적어도 약 8 ㎖, 적어도 약 9 ㎖, 적어도 약 10 ㎖, 적어도 약 15 ㎖, 적어도 약 20 ㎖, 적어도 약 25 ㎖, 적어도 약 30 ㎖, 적어도 약 35 ㎖, 적어도 약 40 ㎖, 적어도 약 45 ㎖, 적어도 약 50 ㎖, 적어도 약 55 ㎖, 적어도 약 60 ㎖, 적어도 약 65 ㎖, 적어도 약 70 ㎖, 적어도 약 75 ㎖, 적어도 약 80 ㎖, 적어도 약 85 ㎖, 적어도 약 90 ㎖, 적어도 약 95 ㎖, 적어도 약 100 ㎖, 적어도 약 150 ㎖, 적어도 약 200 ㎖, 적어도 약 250 ㎖, 적어도 약 300 ㎖, 적어도 약 350 ㎖, 적어도 약 400 ㎖, 적어도 약 450 ㎖, 적어도 약 500 ㎖, 적어도 약 1000 ㎖의 부피를 가진다.
일부 실시양태에서, 세포는 줄기 세포, 예를 들면, 분화다능 줄기 세포(예를 들면, 인간 분화다능 줄기 세포)이다. 인간 줄기 세포의 비한정적 예로는 인간 배아 줄기 세포(hESC), 인간 분화다능 줄기 세포(hPSC), 인간 유도된 분화다능 줄기 세포(hiPSC), 인간 단위생식 줄기 세포, 원시 생식 세포 유사 분화다능 줄기 세포, 배반엽상층 줄기 세포, F-클래스 분화다능 줄기 세포, 체세포 줄기 세포, 암 줄기 세포, 또는 계통 특이적 분화를 겪을 수 있는 임의의 다른 세포가 있다. 일부 실시양태에서, 인간 줄기 세포는 인간 배아 줄기 세포(hESC)이다. 일부 실시양태에서, 인간 줄기 세포는 인간 유도된 분화다능 줄기 세포(hiPSC)이다. 일부 실시양태에서, 인간 줄기 세포는 인간 분화다능 줄기 세포주이다. 인간 분화다능 줄기 세포주의 비한정적 예로는 WA09(H9), 960.1B, 15.3A 및 WA01 iCRISPR 세포주가 있다. 일부 실시양태에서, 줄기 세포는 비-인간 줄기 세포이다. 비-인간 줄기 세포의 비한정적 예로는 비-인간 영장류 줄기 세포, 설치류 줄기 세포, 개 줄기 세포, 고양이 줄기 세포가 있다. 일부 실시양태에서, 줄기 세포는 분화다능 줄기 세포이다. 일부 실시양태에서, 줄기 세포는 배아 줄기 세포이다. 일부 실시양태에서, 줄기 세포는 유도된 분화다능 줄기 세포이다.
부착 세포 배양물에서 생장할 수 있는 임의의 유형의 세포가 본 개시된 보호대상을 위해 적합하다. 이러한 세포의 비한정적 예로는 동물 세포, 곤충 세포 및 식물 세포가 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 CHO 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 COS 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 HEK 세포, 예를 들면, HEK293 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 HeLa 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 망막 세포이다.
본 기술분야에서 공지되어 있는 임의의 유형의 냉동보존 배지가 본 개시된 보호대상과 함께 사용될 수 있다. 냉동보존 배지는 물질, 예를 들면, 얼음 형성으로 인한 냉동 손상으로부터 세포를 보호할 수 있는 냉동보호제를 함유할 수 있다. 냉동보호제의 비한정적 예로는 글리콜, 예컨대, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 및 글리세롤, 디메틸 설폭사이드(DMSO) 및 트레할로스가 있다. 냉동보존 배지의 비한정적 예로는 FreSR™-S, PSC 냉동보존 배지(ThermoFisher Scientific), 스템-셀뱅커(Stem-CellBanker) GMP, 10% DMSO를 가진 필수 8™(ThermoFisher Scientific), 크리오스토르(CryoStor)® 냉동 배지(Biolife), 및 크리오스템(CryoStem) 냉동보존 배지(Stemgent)가 있다. 일부 실시양태에서, 냉동보존 배지는 FreSR™-S이다.
세포 및 냉동보존 배지를 포함하는 조성물은 분취될 수 있고, 냉동보존에 적합한, 본 기술분야에서 공지되어 있는 임의의 유형의 저장 용기 또는 관에 저장될 수 있다. 냉동보존 용기의 비한정적 예로는 바이알, 플라스틱 백, 튜브 및 박스, 예를 들면, 유리 바이알(예를 들면, 플린트 유리 바이알(그러나, 이것으로 한정되지 않음)), 앰플, 플라스틱 유연성 용기, 예를 들면, PVC(염화폴리비닐) 용기, CZ 수지 용기, 폴리프로필렌 용기 및 주사기(그러나, 이들로 한정되지 않음), 및 유리 주사기가 있다.
3. 사용 준비된 냉동보존된 세포의 제조 방법
본 개시된 보호대상은 냉동 해리된 세포의 집단을 포함하는 조성물을 제조하는 방법을 제공한다. 상기 조성물은 해동 후 증폭 및/또는 계대배양 없이 또는 거의 없이 다운스트림 적용을 위해 직접 사용될 수 있다.
일부 비한정적 실시양태에서, 냉동 해리된 세포의 집단을 제조하는 방법은 배양 배지에서 배양된 세포의 집단을 해리시키는 단계; 해리된 세포를 냉동보존 배지에 현탁하여 세포 현탁액을 형성하는 단계; 및 세포 현탁액을 냉동시켜 냉동 세포의 조성물을 형성하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포는 냉동 전에 증폭된다.
일부 실시양태에서, 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%의 세포가 해동 후 생존한다.
일부 실시양태에서, 냉동 해리된 세포의 조성물은 적어도 약 1십만 개 세포/㎖, 적어도 약 5십만 개 세포/㎖, 적어도 약 1백만 개 세포/㎖, 적어도 약 5백만 개 세포/㎖, 적어도 약 1천만 개 세포/㎖, 적어도 약 1천5백만 개 세포/㎖, 적어도 약 2천만 개 세포/㎖, 적어도 약 2천5백만 개 세포/㎖, 적어도 약 3천만 개 세포/㎖, 적어도 약 3천5백만 개 세포/㎖, 적어도 약 4천만 개 세포/㎖, 적어도 약 4천5백만 개 세포/㎖, 적어도 5천만 개 세포/㎖, 적어도 약 5천5백만 개 세포/㎖, 적어도 약 6천만 개 세포/㎖, 적어도 약 6천5백만 개 세포/㎖, 적어도 약 7천만 개 세포/㎖, 적어도 약 7천5백만 개 세포/㎖, 적어도 약 8천만 개 세포/㎖, 적어도 약 8천5백만 개 세포/㎖, 적어도 약 9천만 개 세포/㎖, 적어도 약 9천5백만 개 세포/㎖, 적어도 약 1억 개 세포/㎖, 적어도 약 1억5천만 개 세포/㎖, 적어도 약 2억 개 세포/㎖, 적어도 약 2억5천만 개 세포/㎖, 적어도 약 3억 개 세포/㎖, 적어도 약 3억5천만 개 세포/㎖, 적어도 약 4억 개 세포/㎖, 적어도 약 4억5천만 개 세포/㎖, 적어도 약 5억 개 세포/㎖의 농도를 가진다.
일부 실시양태에서, 조성물의 단일 분취물은 적어도 약 1 ㎖, 적어도 약 2 ㎖, 적어도 약 3 ㎖, 적어도 약 4 ㎖, 적어도 약 5 ㎖, 적어도 약 6 ㎖, 적어도 약 7 ㎖, 적어도 약 8 ㎖, 적어도 약 9 ㎖, 적어도 약 10 ㎖, 적어도 약 15 ㎖, 적어도 약 20 ㎖, 적어도 약 25 ㎖, 적어도 약 30 ㎖, 적어도 약 35 ㎖, 적어도 약 40 ㎖, 적어도 약 45 ㎖, 적어도 약 50 ㎖, 적어도 약 55 ㎖, 적어도 약 60 ㎖, 적어도 약 65 ㎖, 적어도 약 70 ㎖, 적어도 약 75 ㎖, 적어도 약 80 ㎖, 적어도 약 85 ㎖, 적어도 약 90 ㎖, 적어도 약 95 ㎖, 적어도 약 100 ㎖, 적어도 약 150 ㎖, 적어도 약 200 ㎖, 적어도 약 250 ㎖, 적어도 약 300 ㎖, 적어도 약 350 ㎖, 적어도 약 400 ㎖, 적어도 약 450 ㎖, 적어도 약 500 ㎖, 적어도 약 1000 ㎖의 부피를 가진다.
일부 실시양태에서, 세포는 해리되기 전에 배양 배지에서 배양된다. 세포를 배양하는 데 적합한 임의의 유형의 배양 배지가 본 개시된 보호대상과 함께 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 배양 배지는 피더 무함유 배양 배지이다. 일부 실시양태에서, 배양 배지는 피더 배지이다. 일부 실시양태에서, 배지는 필수 8™ 배지이다.
배양 배지에서 배양된 세포는 세포 해리 용액을 사용함으로써 배양 표면, 예컨대, 배양 플레이트 또는 플라스크로부터 해리된다. 해리는 세포를 서로 분리하여 단일 세포 현탁액을 형성하는 데 도움이 될 수도 있다. 세포 부착으로부터 세포를 해리시키는 데 적합한, 본 기술분야에서 공지되어 있는 임의의 유형의 물질 또는 용액이 세포 해리 용액으로서 본 개시된 보호대상과 함께 사용될 수 있다. 세포 해리 용액은 단백질분해 및/또는 콜라겐분해 기능을 가진 효소를 함유할 수 있다. 이러한 효소의 비한정적 예로는 아큐타제™, 콜라게나제, 프로테아제, 트립신 및 유도체, 파파인이 있다. 세포 해리 용액은 다른 효소, 예컨대, 히알루로니다제 및 DNase도 함유할 수 있다. 히알루로니다제는 히알루론산의 분해를 촉진할 수 있는 효소의 패밀리이다. DNase는 해리 배지 내로 누출되는 핵산을 분해할 수 있는 효소의 패밀리이다. 이러한 효소 함유 용액의 비한정적 예로는 트립신 완충제, 트립신-EDTA 완충제, 아큐타제, 디태친(Detachin)™ 세포 탈착 용액(겔란티스(Genlantis)) 및 아큐맥스(Accumax)가 있다. 세포 해리 용액은 효소를 함유하지 않을 수 있다. 일부 실시양태에서, 효소 무함유 세포 해리 용액은 용액 중의 유리 칼슘 및 마그네슘 이온을 킬레이팅하기 위한 킬레이팅제를 함유할 수 있으므로, 세포를 해리시킬 수 있다. 킬레이팅제의 비한정적 예는 세포와 기질인 1,1-비스(디페닐포스피노)에틸렌의 상호작용을 제거하는 데 사용되는 EDTA 또는 다른 Ca++/Mg++ 무함유 물질이다. 이러한 효소 무함유 용액의 비한정적 예로는 온화한 세포 해리 시약(Gentle Cell Dissociation Reagent)(GCDR, STEMCELL Technologies); 세포 해리 완충제, 효소 무함유, 행크의 균형 잡힌 염 용액(ThermoFisher); 및 세포 해리 완충제, 효소 무함유, PBS(ThermoFisher); 또는 EDTA가 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 아큐타제를 사용함으로써 해리된다.
일부 실시양태에서, 세포의 해리된 집단은 냉동보존 배지에 현탁되기 전에 세척된다. 세포의 해리된 집단은 세포를 세척하는 데 적합한, 본 기술분야에서 공지되어 있는 임의의 용액에 의해 세척될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포의 해리된 집단은 필수 8™ 배지에 의해 세척된다.
세포 현탁액은 분취될 수 있고, 냉동보존에 적합한, 본 기술분야에서 공지되어 있는 임의의 유형의 저장 용기에 저장될 수 있다. 냉동보존 용기 및 관의 비한정적 예는 앞에 기재되어 있다.
세포를 냉동보존하기 위해 세포 현탁액을 냉동시키는 데 적합한, 본 기술분야에서 공지되어 있는 임의의 냉동 방법, 예를 들면, 제어된 속도 냉동기 프로그램이 본 개시된 보호대상과 함께 이용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 냉동 방법은 하기 프로그램으로 프로그래밍된 제어된 속도 냉동기를 이용하는 단계를 포함한다:
단계 1: 4℃에서 대기;
단계 2: -4℃까지 1.2℃/분(샘플);
단계 3: -40℃까지 25℃/분(챔버);
단계 4: -12℃까지 10℃/분(챔버);
단계 5: -40℃까지 1.0℃/분(챔버);
단계 6: -90℃까지 10℃/분(챔버); 및
단계 7: -90℃에서 대기.
일부 실시양태에서, 세포의 냉동 분취물은 제어된 속도 냉동기가 -90℃에 도달한 후 액체 질소 탱크로 옮겨질 수 있다.
일부 실시양태에서, 냉동 방법은 통상적인 느린 속도 냉각 방법이다.
4. 사용 준비된 냉동보존 세포의 사용 방법
본 개시된 보호대상은 냉동 해리된 세포의 집단 및 냉동보존 배지를 포함하는 조성물을 배양하거나 다른 방식으로 사용하는 시험관내 방법도 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 시험관내 방법은 상기 조성물을 다운스트림 처리로 처리하는 단계를 포함하고, 이때 상기 세포는 다운스트림 처리 전에 증폭되지 않고/않거나 계대배양되지 않는다.
일부 실시양태에서, 냉동 해리된 세포의 집단을 포함하는 조성물은 다운스트림 처리를 위해 적절한 수의 세포를 함유한다. 예를 들면, 조성물의 단일 분취물은 다운스트림 처리를 위해 충분한 수의 세포를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 조성물의 단일 분취물은 다운스트림 적용을 위해 충분한 수의 세포를 제공하고, 이때 해동 후 세포의 집단은 이 집단 내의 세포가 세포 분열, 예를 들면, 적어도 1회, 2회, 3회, 4회 또는 5회의 세포 분열을 겪도록 일정 시간 동안 증폭된다. 일부 비한정적 실시양태에서, 세포의 집단은 사용 전에 최대 2회의 세포 분열에 충분한 시간 동안, 또는 최대 5회의 세포 분열에 충분한 시간 동안 (임의적으로 세포 배양 배지가 첨가된) 배양물에서 유지된다.
일부 비한정적 실시양태에서, 세포의 집단은 사용 전에, 예를 들면, 세포의 집단이 해동된 후 최대 약 1시간, 5시간, 10시간, 15시간, 20시간, 25시간 또는 30시간 동안 (임의적으로 세포 배양 배지가 첨가된) 배양물에서 유지된다.
일부 비한정적 실시양태에서, 세포의 집단은 사용 전에, 예를 들면, 세포의 집단이 해동된 후 최대 약 24시간 동안 (임의적으로 세포 배양 배지가 첨가된) 배양물에서 유지된다.
일부 실시양태에서, 세포의 집단은 이 집단 내의 세포가 세포 분열을 겪도록 일정 시간 동안 해동 후 증폭되고, 이때 상기 증폭은 기하급수적 증폭이 아니다.
일부 실시양태에서, 세포의 집단은 해동 후 계대배양되지 않는다. 일부 실시양태에서, 세포의 집단은 최대 1회, 2회, 3회, 4회 또는 5회 계대배양된다.
일부 실시양태에서, 냉동 해리된 세포의 집단은 인간 iPSC 또는 인간 ESC를 포함한다. 일부 실시양태에서, 다운스트림 처리는 세포의 집단을 복수의 체세포, 예를 들면, 뉴런 또는 이의 전구세포로 분화시키는 방법을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 분화된 세포는 치료적 용도를 위해 치료 조성물, 예를 들면, 약학 조성물에 포함될 수 있다. 일부 실시양태에서, 분화된 세포는 시험관내에서 질환을 모델링하는 데 사용될 수 있다. 예를 들면, 분화다능 줄기 세포를 분화시키는 방법은 국제 특허출원 공보 제WO/2010/096496호, 제WO/2011/149762호, 제WO/2013/067362호, 제WO/2016/19666호, 제WO/2014/176606호 및 제WO/2015/077648호, 및 2016년 12월 22일에 출원된 국제 특허출원 제PCT/US16/068430호, 2017년 2월 6일에 출원된 제PCT/US17/016723호 및 2017년 1월 27일에 출원된 제PCT/US17/015480호(이들 각각의 내용은 모든 목적을 위해 전체로서 본원에 참고로 도입됨)에 개시되어 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 세포의 집단은 복수의 도파민 세포, 예를 들면, 중뇌 도파민 세포 또는 이의 전구체로 분화된다. 일부 실시양태에서, 도파민 전구체 세포는 검출가능한 수준의 포크헤드 박스 단백질 A2(FOXA2), LIM 호메오박스 전사 인자 1 알파(LMX1A) 및/또는 티로신 하이드록실라제(TH)를 발현한다. 일부 실시양태에서, 냉동 해리된 세포의 집단은 신경퇴행성 질환, 예를 들면, 파킨슨병을 진단받거나 앓을 위험을 가진 대상체로부터 유래한 iPSC를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 세포는 외생성 핵산으로 형질감염되고, 예를 들면, 핵감염, 전기천공, 지질/리포좀 기반 방법, 인산칼슘 유도 방법, 또는 외생성 유전 물질을 포유동물 세포 내로 이동시키는 다른 방법으로 처리된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 세포는 냉동되지 않은 대조군 세포에 비해 형질감염 후 증가된 핵산 흡수 및/또는 핵산 발현 수준을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 세포에 의한 증가된 발현 수준은 냉동되지 않은 대조군 세포에 의한 발현 수준보다 적어도 약 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 15배, 20배 또는 25배 더 크다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 세포에 의한 증가된 발현 수준은 냉동되지 않은 대조군 세포에 의한 발현 수준보다 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% 또는 75% 더 크다.
일부 실시양태에서, 증가된 발현 수준은 핵산을 발현하는 집단 내의 세포의 양을 지칭한다.
일부 실시양태에서, 증가된 발현 수준은 하나 이상의 세포 또는 세포의 집단에 의해 발현된 mRNA 또는 단백질의 강도 또는 양을 지칭한다.
일부 실시양태에서, 세포는 냉동보존 전에 핵산으로 형질감염된다.
일부 실시양태에서, 세포는 냉동보존 후, 예를 들면, 해동 후 핵산으로 형질감염된다. 일부 실시양태에서, 세포는 냉동보존 후 해동시킨 지 적어도 약 0.1시간, 0.2시간, 0.5시간, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 13시간, 14시간, 15시간, 16시간, 17시간, 18시간, 19시간, 20시간, 21시간, 22시간, 23시간 또는 24시간 후 형질감염된다.
일부 실시양태에서, 핵산은 CRISPR 유전자 편집에 사용할 핵산 분자, 예를 들면, Cas9 단백질, CPF1 단백질, 및/또는 소정의 표적에 대한 가이드 RNA를 코딩하는 핵산을 포함한다(예를 들면, 각각의 내용이 전체로서 참고로 도입된 문헌(Cong et al., Science Feb 15;339(6121):819-23 (2013); Hsu et al., Cell. 2014 Jun 5;157(6):1262-78; Ran et al., Nature Protocols Nov;8(11):2281-308. (2013); Gilbert et al., Cell 2013 Jul 18;154(2):442-51; Staahl et al., Nat Biotechnol. 2017 May;35(5):431-434; and Mali et al., Science. 2013 Feb 15;339(6121):823-6) 참조).
일부 실시양태에서, 형질감염된 세포의 조성물이 제공된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법들 중 하나 이상의 방법을 실시하기 위한 물질을 포함하는 키트가 제공된다. 이러한 키트는 예를 들면, 냉동보존된 세포, 및 CRISP 유전자 편집을 위한 분자를 코딩하는 핵산, 또는 프로모터 서열 등을 포함하는 발현 카세트를 포함할 수 있다.
실시예
본 개시된 보호대상은 본 개시된 보호대상의 예시로서 제공되고 한정하기 위한 것이 아닌 하기 실시예를 참조함으로써 더 잘 이해될 것이다.
실시예 1: 해동 후 계대배양 없이 사용할 냉동보존 해리된 분화다능 줄기 세포
요약
인간 분화다능 줄기 세포(PSC)는 세포 대체 요법 및 질환 모델링을 위한 무한한 세포 공급원을 제공한다. 기술적 양태는 그의 엄청난 힘에도 불구하고 제한된 재현성을 가진다. 본원에 기재된 것은 거의 모든 PSC 실험들에 대한 주요 변수인 PSC 출발 물질의 품질 및 양을 제거하는 PSC 워크플로우의 단순한 변형이다. 대부분의 실험실들은 PSC를 연속적으로 계대배양하고 증폭 후 소량을 사용하나, 이 실험들의 "적기 공급 생산(just in time)" 성질은 품질 관리가 사용 전에 거의 수행되지 않는다는 것을 의미한다. 품질 관리의 결여는 PSC 품질, 멸균성 및 유전적 온전함이 손상될 수 있고, 이것이 수득된 결과의 교란 요인을 생성한다는 것을 의미한다. 냉동휴면(도 7 참조)으로서 지칭된, 본원에 개시된 방법은 PSC의 배양물을 단일 세포로 해리시키고, 해동된 후 실험, 예컨대, 분화에 즉시 사용될 수 있는 일회용 냉동보존 바이알로서 PSC를 보관한다.
본원에서, 냉동휴면을 이용함으로써 냉동보존된 세포를 전통적인 방법으로 배양한 세포와 대비하여 시험하였다. 단기간 생존율 또는 분화다능성의 차이가 없다는 것이 본원에서 확인된다. 추가로, 냉동휴면은 중배엽 및 신경 분화의 분화 효율의 손실을 보이지 않았다. 해동 후 생존율은 통상적으로 90% 초과의 수준이었고, 해동 후 줄기 세포 마커 발현의 유의미한 차이는 발견되지 않았다. 냉동휴면 세포는 해동될 수 있고 증폭 없이 직접 분화될 수 있거나 유전적으로 변형될 수 있다는 것을 확인하였다. 본 데이터는, 재현성을 증가시키고 분화 전에 상이한 PSC 세포주들을 동시화하는 것을 돕고 세포 요법 및 질환 모델링 적용을 위한 PSC의 증폭 동안 유전적 불안정성 및 오염의 가능성을 제거할 단순한 신규 PSC 사용 방식을 임의의 실험실에게 제공한다.
냉동휴면은 다수의 실험들이 동일한 품질 관리된 PSC로부터 반복될 수 있게 하고, 세포 요법 및 질환 모델링 적용을 위한 PSC의 증폭 동안 유전적 불안정성 및 오염의 가능성을 제거한다. 또한, 냉동휴면은 동일한 출발 PSC 집단으로부터 상이한 시점에서 다수의 분화 또는 유전자 변형 실험들을 수행할 수 있게 한다. 냉동휴면은 지리적으로 분리된 실험실들이 동일한 출발 PSC 집단에 대한 실험을 수행할 수 있게 한다. 일관성과 별개로, 각각의 보관물은 높은 수준의 자연발생적 분화, 오염 또는 유전적 온전함이 실험을 손상시킬 가능성을 감소시키기 위해 사용 전에 미리 검증될 수 있다. 임의의 실험실은 질환 모델링 및 세포 요법 적용 둘 다에 있어서 재현성을 증가시키기 위해 냉동휴면을 실시할 수 있다.
결과
본 연구는 생존율, 분화다능성 및 분화 능력의 차이가 없다는 것을 보여주나, 플레이팅 효율의 약간의 감소가 관찰되었다. 냉동휴면은 규모 확장될 수 있다. 예를 들면, 4-단 셀 팩토리로부터 2억8천만 개의 세포 보관물을 구축할 수 있다. 본 실시예에서, 해동 후 생존율의 유의미한 감소 없이 세포를 바이알당 3천만 개의 세포만큼 높은 농도로 냉동시켰다.
냉동 휴면 조건의 개발
해동 후 증폭을 제거하여 줄기 세포 실험의 재현성을 개선할 수 있는 지를 확인하였다. 회수 및 증폭을 거치지 않는 것은 해동 후 높은 생존율이 실현될 것을 요구할 것이다. 필수 8™ 배지(E8; Chen et al. 2011)에서 WA09(H9) 피더 부재 배양을 이용하는 임상적 패러다임을 이용하였다. 단분산된 인간 분화다능 줄기 세포 냉동보존을 위해 디자인된 시판되는 배지인 FreSR™-S로 세척하고 재현탁하기 전에 WA09 세포를 아큐타제로 처리하여 단일 세포 현탁액을 생성하였다. "사용 준비된" 분취물로서 액체 질소에 장기간 저장하기 전에 표준 프로그램을 이용하여 제어된 속도 냉동기에서 세포를 냉동보존하였다(재료 및 방법 참조). 초기 실험은 놀랍게도 해동 후 높은 생존율을 입증하였다. 해동 후 생존율에 대한 세포주, 냉동보존 배지 및 제어된 속도 냉동기의 기여의 효과를 조사하였고, E8 배지에서 피더 부재 배양을 이용할 때 이 변수들 중 임의의 변수에의 명확한 의존은 발견되지 않았다. 상이한 PSC 세포주(도 5a), 상이한 냉동보존 배지(도 5b) 및 보편적인 느린 속도 냉각(도 5c)은 효율의 인식가능한 차이를 갖지 않았다. 이 생존율 감소가 FreSR™-S에서 완화될지라도, 전통적인 피더 기반 방법을 이용함으로써 증폭된 WA09 세포가 더 낮은 생존율을 가졌기 때문에, 주요 요인은 초기 배양 조건인 듯하였다(도 5d).
실험의 균형을 위해, 달리 언급되지 않은 한, 기준 조건은 제어된 속도 냉동기 내의 FreSR™-S에 냉동휴면된 WA09이었다. 이 조건은 아크리딘 오랜지/요오드화프로피듐(AOPI)을 사용하여 비편향 자동화된 세포 카운터로 측정하였을 때, 냉동되지 않은 대조군 WA09 세포보다 단지 몇 퍼센트 더 낮은 해동 후 생존율을 통상적으로 제공하였다(도 1a 및 1f). 다수의 보관물들의 생성 후, 해동 후 생존율이 투입 배양물의 생존율 냉동휴면에 의해서만 제한된다는 것을 알게 되었다(도 1b). 현재까지 시험된 가장 긴 시점인 최대 1년 동안 액체 질소에서 저장하였을 때 생존율 또는 분화다능성의 손실은 관찰되지 않았다(도 5e). 이례적인 해동 후 생존율에도 불구하고, 24시간의 배양 후 플레이팅 효율의 감소가 있었으므로(데이터는 제시되지 않았음), 플레이팅 효율의 이 차이를 상쇄하기 위해 더 많은 냉동휴면 세포를 플레이팅하였다(냉동휴면 세포의 경우 400,000개 세포/cm2 대 신선한 대조군의 경우 200,000개 세포/cm2).
냉동휴면 세포의 검증
냉동휴면 세포의 건강을 평가하기 위해, 분화가 정상적으로 유도되었을 때 플레이팅 다음날 PSC 마커를 조사하였다. 냉동휴면 세포와 신선한 대조군 세포 사이에 분화다능 줄기 세포 마커 SSEA3, SSEA4, OCT4, SOX2 및 NANOG의 분명한 차이는 유세포분석에 의해 측정될 수 없었다(도 1c 및 1d). 자연발생적 분화 마커 SSEA1의 증가는 없었다(도 1c 및 1d). 면역형광 분석은 상기 두 집단들 사이의 식별가능한 차이를 갖지 않는 유동 결과를 독립적으로 확인시켜주었다(도 1e).
냉동휴면 PSC에서 분화다능 특징의 더 포괄적인 조사를 수행하기 위해, PluriTest를 이용하여 대조군과 냉동휴면 배양물을 비교하였다(Muller et al. 2011; Williams et al. 2011; Muller et al. 2012). PluriTest는 전체 게놈 전사 프로파일에 기반을 두고, 미분화된 줄기 세포 배양물에서 분화다능성의 신뢰가능한 평가를 허용한다. 요약하건대, PluriTest는 "분화다능성 점수"로 큰 수의 분화다능성 관련 전사체들의 발현을 분석하고, 시험된 샘플이 유전적으로 및 후성적으로 정상적인 인간 분화다능 줄기 세포에서 전형적으로 관찰된 전체 전사 패턴과 일치하는 지를 "신규성 점수"로서 지칭되는 제2 측정치(metric)로 시험한다. PluriTest를 이용하여, 대조군 및 냉동휴면 WA09 샘플 둘 다가 실험적으로 정의된 분화다능성 및 신규성 점수 역치를 통과하고 신규성 1-클래스 분류자 모델에 잘 맞는다는 것을 입증한다는 것을 발견하였는데, 이것은 두 샘플 군들이 잘 특징규명된 hESC 및 hiPSC 세포주에서 관찰된 유전자 발현 패턴과 매우 유사한 유전자 발현 패턴을 보인다는 것을 시사한다(도 1g). 환원된 표시 비설파이드 시퀀싱(RRBS)을 통해 냉동휴면 세포의 후성적 전망도 조사하였고, 기술적 복제물들 사이에 관찰된 일치하는 메틸화 수준에 필적할 만한(Kacmarczyk et al. 2016), 공통된 CpG 유닛의 메틸화 수준의 강한 일치가 대조군과 냉동휴면 세포 사이에 발견되었다(도 1h; MAD=0.122).
분화다능성의 또 다른 척도는 기형종의 생성이다. 대조군 및 냉동휴면 배양물은 거의 동일한 크기 및 동력학으로 기형종을 생성하였다(도 5f). 헤마톡실린 및 에오신으로 염색된 냉동휴면 기형종 박편은 모든 3개의 배엽들의 유도체를 보였다(도 1i: 내배엽[흑색 화살표], 중배엽[녹색 및 청색 별표] 및 외배엽[적색 화살표]). 종합하건대, 이 데이터는 냉동휴면 세포를 해동 후 직접 사용할 때 유세포분석에 의한 핵심 분화다능성 마커의 발현, PluriTest, CpG 메틸화 및 기형종 형성의 차이가 없다는 것을 입증한다.
세포의 게놈에서 이중 가닥 DNA 절단을 가진 세포의 비율을 추정하기 위해, 고성능 현미경에서 핵 gH2AX의 정량적 면역형광을 수행하였다(도 1j 및 1k; 검토를 위해 문헌(Redon et al. 2002) 참조). gH2AX를 발현하는 세포의 퍼센트의 통계학적 차이는 없었다. 어세이를 검증하고 냉동휴면 세포가 DNA 손상제에 더 민감한 지를 알아보기 위해, 세포독성 퀴놀론 알칼로이드인 캄프토테신을 첨가하였다. 캄프토테신 노출 후 γH2AX를 발현하는 세포의 퍼센트의 통계학적 차이는 없었다. 마지막으로, 본 발명자들은 전반적인 유전적 비정상에 대해 시험하기 위해 해동 후 냉동휴면 세포의 핵형을 분석하였다. 대조군(20/20 중기 스프레드) 및 냉동휴면 배양물(20/20 중기 스프레드; 도 1l)에서 정상적인 핵형이 발견되었다.
유도된 분화 및 세포 요법
냉동휴면 세포와 대조군 세포 사이의 차이가 거의 없다는 것이 발견될 수 있었기 때문에, 냉동휴면 세포의 시험관내 분화 능력을 평가하였다. 대조군 및 냉동휴면 세포를 이중 SMAD 억제에 노출시켜, WA09 hESC가 신경으로 분화하도록 유도하였다(Chambers et al. 2009). OCT4 및 PAX6을 시간의 경과에 따라 측정하여, 신경 분화의 효율 및 동력학을 평가하였고; 신경 유도의 시기 및 정도의 차이는 없었다(도 2a 내지 2c, 및 2k). 중내배엽으로 분화하도록 유도된 냉동휴면 세포도 분화의 정도 및 동력학 면에서 구별될 수 없었다(도 2d 내지 2f, 및 2l). 이 세포 운명 둘 다가 상대적으로 미성숙하여 만들기 더 용이하므로, 냉동휴면 세포로부터 중뇌 도파민 뉴런을 제조하고자 시도하였다(Barker et. al., 2015). WA09 냉동휴면 세포는 임상적으로 적합한 "표준 작업 절차"로부터 FOXA2/TH 이중 양성 유사분열 후 중뇌 도파민 뉴런을 효율적으로 생성하였고, 대조군 세포로부터 유래한 뉴런과 유사한 유전자 발현 프로파일을 표시한다(도 2i 및 2j).
제조자는 FreSR™-S로 냉동보존할 때 1백만 개 세포/㎖의 세포 밀도를 특정한다. 이 밀도는 더 작은 규모의 실험에 적절하나, 큰 세포 수를 요구하는 적용, 예컨대, 실험당 수십억 개의 세포들이 필요한 세포 요법의 경우에는 제한적 요인이 된다. 따라서, 냉동보존 동안 세포 밀도의 증가가 생존율 또는 플레이팅 효율에 악영향을 미칠 지를 시험하였다. 시험된 가장 높은 밀도인 3천만 개/㎖의 밀도까지 세포를 냉동시킬 때 생존율(도 2g) 또는 플레이팅 효율(데이터는 제시되어 있지 않음)의 분명한 차이는 발견되지 않았다. 고밀도 제제는 제조 전에 통상적으로 수십억 개의 투입 PSC를 요구하는 대부분의 치료 적용을 위한 합리적인 워크플로우를 제공할 것이다.
냉동휴면의 장점은 큰 특징규명된 사용 준비된 세포 보관물의 생성이다. 이 전략의 많은 장점들이 있지만, 단점은 이 전략이 냉동보존 및 품질 관리 전에 모든 PSC 증폭을 동시에 수행할 것을 요구한다는 점이다. 규모를 확장하고자 하는 시도로, "셀 팩토리", 즉 자동화된 폐쇄된 시스템이 되도록 용이하게 개조될 수 있는, 한 번에 모든 층들의 용이한 공급을 가능하게 하는 연결된 플라스크들을 사용하였다. 4-층 플라스크 크기(2528 cm2, 또는 대략 44 x 6-웰 플레이트)를 이용하여 PSC를 증폭하였고, 이 PSC는 팩토리당 약 2억5천만 개의 세포의 평균 수율을 가졌다(n=3). 이러한 "팩토리"에서의 생장의 문제점은 층진 플라스크들이 직접적인 현미경 관찰을 허용하지 않기 때문에 증폭 동안 형태를 모니터링하기 어렵다는 것이다. 냉동휴면 보관물이 정확히 증폭되었는지를 검증하기 위해, PSC 마커를 시험하였고, 팩토리에 의해 증폭된 세포가 동등한 마커 발현을 가졌고(도 2h 및 2m) 분화할 수 있었다(데이터는 제시되어 있지 않음)는 것을 발견하였다.
유전적 변형
냉동휴면 세포가 정상적으로 해동된 지 24시간 후에 거동하기 때문에, 상기 세포가 유전적으로 조작될 수 있는 지를 해동 직후에 조사하였다. 해동 직후 냉동휴면 WA09 세포의 핵감염 효율을 신선한 대조군 세포와 비교하였다. GFP 플라스미드로 핵감염시킨 지 24시간 후, 형광 현미경관찰은 두 조건들에서 GFP+ 세포를 보여주었고, 유세포분석 정량은 85% 초과의 세포가 GFP를 발현한다는 것을 보여주었다(도 3a 내지 3c, 및 도 4a 및 4b). 형질도입한 지 24시간 후 형광 현미경관찰에 의해 확인되었을 때, 즉시 해동된 냉동휴면 세포는 EmGFP를 발현하는 센다이 바이러스 벡터에 의해 성공적으로 형질도입될 수 있었다(도 3d). CP 유래 센다이 형질도입된 서브클론을 시험된 가장 긴 시간인 적어도 15회 계대배양 동안 증식시킬 수 있었다.
핵감염 성공은 해동시 게놈 변형이 일어날 수 있음을 암시하였다. 표적화된 게놈 변형을 시험하기 위해, AAVS1 좌위 내로 조작된 유도성 Cas9를 함유하는 PSC인 iCRISPR 시스템을 이용하였다(Gonzalez et al. 2014). WA01(H1) iCRISPR 세포를 증폭한 후, 냉동휴면 24시간 전에 독시사이클린으로 처리하였다: 이것은 냉동 전에 Cas9를 미리 발현한 냉동휴면 세포를 생성하였다. 일단 해동되면, HPRT 가이드 RNA를 게놈 분석 전에 이 세포 내로 핵감염시켰다. 발현된 Cas9를 가진 냉동휴면된 iCRISPR 세포를 해동시키고 해동 직후에 HPRT 가이드 RNA로 핵감염시켰다. 냉동휴면 iCRISPR WA01(H1) 세포와 대조군 iCRISPR WA01(H1) 세포 사이에 HPRT 표적화된 돌연변이의 효율의 분명한 차이는 없었다(도 3e 및 4c).
논의
대부분의 분화다능 줄기 세포 기반 적용에 대한 중요한 변수, 즉 분화 또는 게놈 변형 전 분화다능 세포의 성질을 제거하는 신규 방법(냉동휴면)이 기재되어 있다. 냉동보존 hPSC가 사용 전에 회수, 증폭 및 계대배양을 요구한다는 것은 통상적으로 인정된다. 본 실험은 해리된 인간 분화다능 줄기 세포가 냉동휴면되지 않은 유사한 "신선한" 세포와 비교될 때 해동 후 생존율의 손실을 거의 갖지 않고 플레이팅 효율의 약간의 감소를 가진 단일 세포 현탁액으로서 냉동보존될 수 있다는 것을 입증하였다. 본 데이터는 이 패러다임 변화를 가능하게 하는 기술적 유발제가 배양 시스템이라는 것을 시사하고, 이때 다수의 냉동보존 패러다임들(Liu and Chen, 2014)을 이용하여 E8 증폭된 세포로 증가된 회수를 관찰하였다.
냉동휴면은 통상적인 PSC 배양에 비해 다수의 장점들을 제공한다. 냉동휴면은 분화할 준비가 된 세포의 큰 보관물이 한정된 상태에 갇혀있을 수 있게 함으로써, 재현성을 향상시킨다. 품질 시험, 예컨대, 오염(세포주, 마이코플라스마, 세균), 유전적 불안정성, 다수의 iPS 세포주들의 동시화 및 배양의 순도의 측정은 지속적인 감시 대신에 전체 보관물을 검증할 수 있다.
질환 모델링 연구는 많은 건강한 개체들 및 병든 개체들로부터 유래한 다수의 iPSC 클론들의 사용시 가장 잘 수행된다. 통상적인 병렬식 배양 방법은 실험을 위한 신선한 출발 물질의 연속적인 공급원을 제공하기 위해 다수의 세포주들의 유지가 유도된 분화와 동시에 반드시 수행되어야 하기 때문에 노동 집약적이고 시간 소모적이다. 상이한 속도로 증폭하는 iPS 세포주들은 분화의 동시적 시작 및 병렬식 계대배양을 어렵게 하여, 통상적으로 한 시점에서 준비된 배양물의 수를 최대화하는 절충안을 야기한다: 나머지는 종종 과소증폭되거나 과다증폭된다. 연속식 배양은 세포주의 교차오염, 실험 동안 미생물의 우발적 도입, 또는 연장된 배양 동안 게놈 비정상을 획득하는 세포의 사용 위험도 증가시킨다. 냉동휴면은 PSC 증폭의 작업을 분화 실험으로부터 분리한다. 냉동휴면은 PSC의 동일한 풀로부터의 반복된 분화를 허용하여, PSC 제제의 가변성을 완전히 제거한다. 완전한 일군의 품질 관리 기준, 예컨대, PSC 마커 상태, 유전적 온전함, 멸균성 및 세포주 인증이 사용 전에 각각의 보관물을 검증할 수 있다. 현재 대부분의 실험실들은 사용 동안 또는 아마도 심지어 연속식 계대배양이 시작되기 전에 "스폿 체크(spot check)"를 수행한다. "적기 공급 생산" PSC 워크플로우의 변수는 거의 모든 PSC 적용의 강력함 및 재현성을 거의 확실히 감소시킨다. 이 변수는 분화가 PSC 증폭율의 불확실성으로 인해 시작될 수 있을 때 복잡하게 만들기 때문에 불편할 수도 있다.
냉동휴면의 장점은 세포 요법 제조의 경우 훨씬 더 엄청날 수 있었다. 전형적인 세포 요법 워크플로우에서, hPSC는 세포 보관물을 검증하기 위해 비싼 시간 소모적 시험을 받기 전에 증폭되고 GMP 시설에서 보관된다. 이 PSC 보관물을 치료적으로 유용한 유형의 세포로 전환시키는 것은 통상적으로 치료적으로 유용한 유형의 세포로의 분화를 시작하기 전에 냉동보존된 상태로부터의 회수 및 제한된 수의 세포 계대배양을 요구한다. 이것은 최적이 아닌 상태의 PSC를 가진 세포 보관물의 분화를 시작할 가능성을 생성하여, 재현성 및 생성물 수율을 잠재적으로 감소시킨다. 제조 실시는 시간 및 비용 면에서 엄청나게 비싸고 환자에서 잠재적으로 불리한 사건을 야기할 수 있다. 제조의 재현성은 인간 사용을 위해 세포 생성물을 평가할 때 규제 관청이 조사하는 핵심 특징들 중 하나이기도 하다. PSC 증폭의 시간, 수율 및 품질은 냉동휴면이 이러한 적용을 위해 검증될 수 있는 경우 세포 요법에 대한 변수로서 완전히 제거될 수 있다. 임상적으로 적합한 SOP를 사용하여 냉동휴면 WA09 세포를 중뇌 도파민 뉴런으로 유도할 수 있다는 것이 본원에서 확인된다.
일부 세포 대체 요법들에서 PSC 유도체를 사용할 경우 하나의 큰 문제점은 세포의 HLA 상태를 환자에 일치시키는 것이다. 자가 iPSC는 환자-일치된 세포를 생성하고 면역 불일치를 피하는 한 전략이다. 그러나, 상기 자가 전략의 이용시 상당한 현실적 및 잠재적 안전성 문제점이 있다. 이것은 큰 수의 PSC 세포주들을 보관하기 위한 다수의 대규모 노력으로 이어짐으로써, 이 세포주가 임상적 사용 전에 조심스럽게 품질 관리될 수 있으면서, 여전히 동종이계 이식을 위해 특정 환자에의 아주 흡사한 HLA 일치를 제공할 수 있다. 이 시나리오에서, 냉동휴면의 이용은 많은 상이한 PSC들을 임상적으로 유용한 세포로 전환시키는 데 이용되는 절차를 단순화할 수 있었다.
방법 및 재료
인간 분화다능 줄기 세포 유지
WA09(H9) 및 960.1B iPSC 세포주를 DMEM/F12(Thermo Fisher, #11330032)로 1:50 희석된 겔트렉스(Geltrex)(Thermo Fisher, #A1413202) 위의 필수 8™(E8, Thermo Fisher, #A1517001) 배지에서 초기에 유지하였고, (콜로니 구조를 유지하기 위해) 스크랩핑 전 짧은(3분) 0.05% 트립신-EDTA(Thermo Fisher, #25300054) 처리 및 새로운 E8 배지를 사용한 2회 세척을 이용하여 3일 또는 4일마다 클러스터로서 계대배양하였다. 세포를 24시간 동안 10 μM Y-27632로 재플레이팅하였다. 계대배양 30과 55 사이의 세포를 사용하였고, 비정상적인 핵형은 발견되지 않았다.
도 5d는 사용된 로트에 따라 10,500개 세포/cm2의 밀도로 플레이팅된, MEF에서 유지된 WA09 세포를 사용하였다(Applied StemCell, Inc.). 일주 동안 hPSC 배지[DMEM/F12, 20% 넉아웃 혈청 대체물(Thermo Fisher, #10828028), 3.5 mM L-글루타민(Thermo Fisher, #25030081), 0.1 mM MEM NEAA(Thermo Fisher, #11140050), 55 μM 2-머캡토에탄올(Thermo Fisher, #21985023), 및 6 ng/㎖ rhFGF 염기성(R&D Systems, #233-FB)으로 구성됨]를 PSC에게 매일 공급하였다. 금요일에, 배양물이 월요일 공급까지 정적 상태로 유지될 수 있게 하는 시간-방출 FGF2인 스템비즈( StemBeads)(StemCultures, Inc., SB500)로 보충된 배지를 세포에게 종종 공급하였다. hPSC 피더 기반 배양을 위한 작업 프로토콜은 웹사이트(http://stemcells.mskcc.org)에서 입수될 수 있다.
냉동휴면 세포의 생성
냉동휴면 세포 보관물을 생성하기 위해, E8 배지에서 생장된 PSC를 37℃ 항온처리기 내에서 30분 동안 아큐타제(Innovative Cell Technologies, #AT-104)로 해리시켰다. 세포를 (세포:아큐타제에 비해) 2 부피의 E8로 세척하였고, 원심분리하여(200 xg, 5분 동안 실온) 세포를 펠렛화하였다. 상청액을 흡입하였고, 세척을 반복하였다. 달리 표시되어 있지 않은 한, 마지막으로 세포를 1천만 개 세포/㎖의 농도로 FreSR-S™(Stem Cell Technologies, #05859)에 재현탁하였다. 하기 프로그램을 이용하여 제어된 속도 냉동기에서 냉동시키기 전에 FreSR-S:세포 혼합물을 미리 냉각된 크리오튜브에 첨가하였다:
단계 1: 4℃에서 대기; 단계 2: -4℃까지 1.2℃/분(샘플); 단계 3: -40℃까지 25℃/분(챔버); 단계 4: -12℃까지 10℃/분(챔버); 단계 5: -40℃까지 1.0℃/분(챔버); 단계 6: -90℃까지 10℃/분(챔버); 단계 7: -90℃에서 대기. 일단 제어된 속도 냉동기가 -90℃에 도달하면 크리오튜브를 액체 질소 탱크로 신속히 옮겼다.
도 5b 및 5c에서 사용된 다른 냉동보존 배지는 PSC 냉동보존 키트(Thermo Fisher, #A2644601), 스템-셀뱅커(Stem-CellBanker) GMP(AMSBIO, #11890), 및 E8 배지 중의 10% DMSO(Sigma Aldrich, #2650)이다. 도 5c에서 이용된 통상적인 냉동은 액체 질소 탱크로 옮기기 전에 24시간 동안 -80℃에서 세포 냉동 용기 내에 바이알을 저장하는 것으로서 정의된다.
줄기 세포 마커에 대한 유세포분석 및 면역형광 분석
인간 분화다능 줄기 세포 분류 및 분석 키트(BD Biosciences, #560461) 및 인간 분화다능 전사 인자 분석 키트(BD Biosciences, #560589)를 제조자의 프로토콜에 따라 사용하여, BD FACS Aria III에서 줄기 세포 마커를 정량하였다. 면역형광 염색을 위해, 하기 일차 항체들을 사용하였다: NANOG(1:200, BD Biosciences, #560482); OCT4(1:200, Santa Cruz Biotechnology, #sc-9081); SOX2(1:100, R&D Systems, #AF2018). 적절한 알렉사 플루오르(Alexa Fluor)-접합된 이차 항체를 1:400으로 사용하였다(Thermo Fisher).
PluriTest 어세이
PluriTest는 전체 게놈 전사체 마이크로어레이 데이터 분석에 기반을 둔다. 요약하건대, 이전에 기재된 절차(Muller et al. 2011; Williams et al. 2011; Muller et al. 2012)와 동일한 절차를 이용하였다. 퀴아젠(Qiagen) RNeasy 단리 키트를 제조자(Qiagen, 독일 힐덴 소재)의 설명서에 따라 사용하여 배양 조건(대조군 및 냉동휴면, 샘플당 1x106개의 세포)당 2개의 생물학적 복제물로부터 RNA를 단리하였다. 일루미나(Illumina) HT12v4 마이크로어레이를 제조자의 지시에 따라 하이브리드화하였다(Muller et al. 2011; Williams et al. 2011; Muller et al. 2012). 수득된 원데이터를 R/바이오컨덕터 루미-팩키지(Bioconductor lumi-package)로 프로세싱하였다(Du et al. 2008; Lin et al. 2008; Muller et al. 2011). 스캐너 기술의 변화 및 일루미나를 통한 하이브리드화 프로토콜의 변형으로 인해, 최근 PluriTest 결과는 보다 낮은 분화다능성 및 보다 높은 신규성 점수를 보이는 경향을 나타낸다(Bernhard Schuldt, University Hospital Schleswig-Holstein, Kiel, Germany, personal communication). 이 기술적 편향을 고려함에도 불구하고, 대조군 샘플 및 냉동휴면 샘플은 상기 두 생물학적 복제물의 사용시 실험적 분화다능성 및 보다 높은 신규성 점수 역치를 통과한다.
환원된 표시 비설파이트 시퀀싱
라이브러리 제제를 시퀀싱하기 위해, 제조자의 설명서에 따라 NEXTFlex 비설파이트-Seq 키트(Bioo, #5119-01)와 함께 1 ㎍의 고품질 게놈 DNA를 사용하였다. 메틸화되지 않은 람다 DNA를 1%의 양으로 첨가하여 비설페이트 전환의 수준을 평가하였다. 12 주기의 PCR을 수행하였다. Hiseq 2500 래피드 모드 페어드 엔드(Rapid mode Paired End) 125에서 샘플을 실행하였고, 샘플당 평균 1억4천만 개의 판독정보를 생성하였다.
RRBS DNA 메틸화 분석
FASTQ 파일을 bcl2fastq(V2.17)로 생성하였고 일루미나의 채스티(chastity) 필터를 기반으로 통과 필터 판독정보에 대해 여과하였다. 시퀀싱 어댑터를 FLEXBAR(V2.4)(Dodt et al. 2012), 비스마크(Bismark)(V0.14.4)를 사용한 게놈 정렬(Krueger et al. 2011) 및 Bowtie2(V2.2.5)(Langmead et al. 2012)로 기준 인간 게놈 hg19까지 잘라내었고, 주문제작 PERL 스크립트로 염기당 CpG 메틸화 측정치를 계산하였다(Garrett-Bakelmann et al. 2015).
γH2AX 정량 면역형광
10 μM Y-27632를 가진 E8 배지 중의 단일 PSC를 100,000개 세포/cm2의 밀도로 겔트렉스-코팅된 디쉬에 플레이팅하였다. 24시간 후, 세포를 37℃에서 1시간 동안 E8 중의 0.5 μM 캄프토테신(Sigma, #C9911)으로 처리하였다. 그 다음, 세포를 인-히스톤 H2A.X(1:300, Millipore, #05-636)에 대해 염색하였고, 적절한 알렉사 플루오르-접합된 이차 항체를 1:400으로 사용하였다. 영상을 획득하였고 이하모니(eHarmony) 소프트웨어를 이용하여 퍼킨-엘머 오퍼레타(Perkin-Elmer Operetta)에서 분석하였다.
신경 유도
문헌(Chambers et al. 2009)의 유도체를 사용하였다. 10 μM Y-27632를 가진 E8 배지 중의 단일 PSC를 신경 유도 전에 200,000개(신선한 대조군) 또는 400,000개(냉동휴면) 세포/cm2의 밀도로 겔트렉스-코팅된 디쉬(1:30)에 플레이팅하였다. 24시간 후, 배지를 제거하였고, 100 nM LDN189193 및 10 μM SB431542(LSB)를 가진 필수 6™(E6) 배지(Thermo Fisher, #A1516401)를 첨가하였다. N2 배지(하기 참조)로의 전이 전에 E6 배지 + LSB를 3회 공급 과정에 걸쳐 단계적으로 3일 동안 세포에게 공급하고 이틀마다 새로운 배지로 교체하였다. 신경 전환의 효율을 OCT4(BD Biosciences, #560186) 및 PAX6(BD Biosciences, #562249)에 대한 유세포분석으로 정량하였다. 또한, OCT4 및 PAX6에 대한 항체(1:200, BD Biosciences, #561462)를 사용하여 배양물을 염색하였다. 문헌(Kriks et al. 2011)의 변형을 이용하여 중뇌 도파민 뉴런을 만들었다. 요약하건대, 최종 회수 전에 SHH 및 WNT 신호를 사용한 이중 SMAD 억제를, 전술된 바와 같이 겔트렉스에서 생장된 WA09 세포에 대해 수행하였다. 회수 후, 문헌(Kriks et al. 2011(manuscript in preparation))에서 발견되는 성장 인자 및 소분자와 동일한 성장 인자 및 소분자를 함유하는 중뇌 도파민 지지 배지를 첨가하였다. 티로신 하이드록실라제(1:1000, Thermo Fisher, #P21962) 및 FOXA2(1:200, R&D Systems, #AF2400)에 대한 항체를 사용하여 배양물을 염색하였다. 적절한 알렉사 플루오르-접합된 이차 항체를 1:400으로 사용하였다.경숙
0일째 날: E6 +100 nM LDN189193 및 10 μM SB431542
1일째 날: E6 +100 nM LDN189193 및 10 μM SB431542
2일째 날: E6 +100 nM LDN189193 및 10 μM SB431542
4일째 날: 3:1 E6에서 N2 +100 nM LDN189193 및 10 μM SB431542로의 전이
6일째 날: 1:1 E6에서 N2 +100 nM LDN189193 및 10 μM SB431542로의 전이
8일째 날: 1:3 E6에서 N2 +100 nM LDN189193 및 10 μM SB431542로의 전이
10일째 날: N2 +100 nM LDN189193 및 10 μM SB431542
N2 배지는 1 g의 중탄산나트륨(Sigma-Aldrich, #S5761), 0.78 g의 글루코스(Sigma-Aldrich, #G7021) 및 0.5 ㎖의 2-머캡토에탄올(Thermo Fisher, #21985023)과 함께 500 ㎖의 DMEM/F12를 함유한다. 5 ㎖의 N2 보충 B(Stem Cell Technologies, #07156) 및 0.02 nM 프로게스테론(100% 에탄올에 용해된 1 mM 원액으로부터의 10 ㎕, Sigma-Aldrich, #P8783)을 첨가하기 전에 상기 배지를 멸균 여과하였다(22 ㎛).
중내배엽 유도
단일 PSC를 전술된 바와 같이 플레이팅하였다. 24시간 후, 배지를 제거하였고 5 μM CHIR99021(Stemgent #04-0004-10)를 가진 E6 배지를 첨가하여 중내배엽을 생성하였다(Lam et al. 2014). 5 μM CHIR99021을 가진 E6을 최대 4일 동안 24시간마다 교체하였다. 전환의 효율을 OCT4(BD Biosciences, #560186) 및 Brachyury(R&D Systems, #IC2085A)에 대한 유세포분석으로 정량하였다. OCT4 및 Brachyury에 대한 항체(1:40, R&D Systems, #AF2085)를 사용하여 배양물을 염색하였고, 적절한 알렉사 플루오르-접합된 이차 항체를 1:400으로 사용하였다.
정량적 RT-PCR
RNase 무함유 DNase 세트(Qiagen, #79254) 및 RNeasy 미니 키트(Qiagen, #74106)를 사용하여 세포 펠렛으로부터 RNA를 단리하였다. RT2 제1 가닥 키트(Qiagen, #330404) 및 에펜도르프 마스터사이클러(Eppendorf Mastercycler) PCR 기계를 이용하여 RNA 샘플의 역전사 및 cDNA 합성을 수행하였다. RT2 SYBR 그린 마스터믹스(Green Mastermix)(Qiagen, #330503)를 사용하여 qPCR 분석을 위해 cDNA 샘플을 제조하였다. 하기 퀴아젠 프라이머들을 함유하는 주문제작 RT2 프로파일러 PCR 어레이에서 샘플을 실행하였다: OTX2(PPH16151), FOXA2(PPH00976), CORIN(PPH58029), SHH(PPH02405), LMX1A(PPH22219), LMX1B(PPH12240), EN1(PPH00986), NR4A2(PPH02082), NEUROG2(PPH11564), ASCL1(PPH07090), TH(PPH02062), CHRNB3(PPH01891), DDC(PPH19374), CCK(PPH22272), DRD2(PPH01876), PITX3(PPH12380), SLC18A(PPH01437), KCNJ6(PPH01415), SLC17A6(PPH14888), POU4F1(PPH14485), NKX6-1(PPH17340), SIM1(PPH11011), NKX2-1(PPH00246), FEV(PPH02033), NKX2-2(PPH01574), GBX2(PPH13900), DBH(PPH02066), ISL1(PPH02461), FOXG1(PPH01973), HOXB2(PPH05804), DLX2(PPH01943), GATA3(PPH02143), PHOX2A(PPH15630), PHOX2B(PPH10361), PAX6(PPH02598), FABP7(PPH02438), MAP2(PPH02419), POU5F1(PPH02394), PRR16(PPH13057), KRT19(PPH01004), MKI67(PPH01024), TOP2A(PPH01520), GFAP(PPH02408), ACTB(PPH00073), TBP(PPH01091), HGDC(PPH65835), RTC(PPX63340) 및 PPC(PPX63339). 바이오-라드(Bio-Rad) c1000 접촉 열 순환기 CFX96 실시간 시스템(Bio-Rad, #1855195)을 이용하여 분석을 수행하였다.
기형종
생체내 연구를 위해 NSG 마우스(Jackson Laboratories)를 사용하였고 MSKCC 보호시설 동물 관리 및 사용 위원회 및 연구 동물 자원 센터(Institutional Animal Care and Use Committee and Research Animal Resource Center)에 의해 승인받은 지침에 따라 관리하였다. HEPES 완충된 HBSS에서 1:2로 혼합된 매트리겔(Matrigel)™(BD Biosciences)을 사용하여 3백만 개의 H9 세포를 8주령 암컷 마우스의 옆구리에 피하 주사하였다. 이환/사망의 징후에 대해 마우스를 매일 관찰하였고, 매주 적어도 2회 체중을 평가하였다. 칼리퍼를 이용하여 매주 2회 종양을 측정하였고, 식 길이 X 폭2 X 0.52를 이용하여 부피를 계산하였다. 연구의 말기에, 종양을 10% 포르말린으로 고정시키고 프로세싱하고 파라핀에 매립하고 박편화하고 헤마톡실린 및 에오신(H&E)으로 염색하였다. 병리학자가 현미경 슬라이드를 정밀하게 살펴보았다.
셀 팩토리의 사용
4개의 트레이 층인 넌크(Nunc)™ 셀 팩토리(Cell Factory)™ 시스템(Thermo Fisher, #140004)을 사용하여 냉동휴면 전에 큰 보관물을 증폭하였다. 계대배양 후 처음 2일 동안 500 ㎖의 E8 배지를 세포에게 공급하였고 세 번째 날에 600 ㎖의 E8 배지를 세포에게 공급하였다. 단일 세포 현탁액을 생성하기 위해, 140 ㎖의 아큐타제를 37℃에서 30분 동안 첨가한 후, 트레이를 100 ㎖의 배지로 세척하였다.
핵감염/iCRISPR
냉동휴면 세포를 핵감염시키기 위해, 아막사(Amaxa)™ 세포주 뉴클레오펙터(Nucleofector)™ 키트 V(Lonza, #VCA-1003)를 사용하였다. WA09 냉동휴면 세포를 해동시키고 세척하였다. 100 ㎕의 용액 V를 22.2 ㎕의 보충제 1과 혼합하였고, 5백만 개의 냉동휴면 세포를 100 ㎕의 이 혼합물에 첨가하였다. 10 ㎕의 GFP 대조군 플라스미드를 프로그램 B-016(Lonza Nucleofector™ 2b device)으로 핵감염시키기 전에 반응물에 첨가하였다. 핵감염된 세포를 전술된 바와 같이 겔트렉스에서 10 μM Y-27632를 가진 E8에 첨가하였다. 생존 세포를 영상화하였고(도 3a 및 4b), BD FACS Aria III에서 형광을 측정하기 전에 배양물을 아큐타제로 처리하고 세척하고 0.1% BSA를 가진 PBS에 재현탁함으로써 형광 세포의 수를 측정하였다. 유동 데이터를 플로우조(FlowJo)로 분석하였고, 면역형광 영상을 어도비 포토샵(Adobe Photoshop)으로 조절하였다.
냉동휴면 iCRISPR 유전자 변형을 수행하기 위해, Cas9를 유도하기 위한 24시간 Dox 처리 전에 WA01(H1) iCRISPR 세포를 전술된 바와 같이 증폭하였다(Gonzalez et al. 2014). Cas9 유도된 세포를 수거하고 냉동휴면 전에 전술된 바와 같이 세척하였다. 냉동휴면 세포를 해동시키고 진아트(GeneArt)(Thermo Fisher)로부터 구입된 200 ng의 HPRT 가이드 RNA를 사용한 핵감염 전에 세척하였다. 가이드 서열은 CATTTCTCAGTCCTAAACA이다.
센다이 형질도입
냉동휴면 WA09 세포를 해동시키고 세척하고, 10 μM Y-27632로 보충된 E8 배지에 재현탁하였고, EmGFP를 발현하는 센다이 바이러스 벡터(CytoTune™ EmGFP, ThermoFisher Scientific, #A16519)를 5의 감염 다중도로 첨가하였다. 형질도입된 CP 세포를 재플레이팅하고 E8에서 증폭하였다. 형질도입된 세포를 적어도 15회 계대배양 동안 증폭할 수 있었다.
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실시예 2: 냉동보존 해리된 분화다능 줄기 세포는 냉동보존되지 않은 세포보다 더 큰 수준으로 외생성 핵산을 발현한다 .
WA09 인간 배아 줄기 세포를 실시예 1에 기재된 바와 같이 냉동보존하고 해동시키고 해동 후 3.4 kb GFP 플라스미드로 즉시 핵감염시켰다. 냉동보존되지 않은 신선한 비냉동 대조군 WA09 세포를 유사하게 핵감염시켰고, 핵감염시킨 지 24시간 후 유세포분석을 이용하여 GFP 발현을 분석하였다. 형질감염되지 않은 WA09 세포도 음성 대조군으로서 사용하였다. 도 8a로 나타낸 바와 같이, 냉동휴면 세포는 작은 DNA 흡수의 상이한 패턴을 나타내었다: 전체적으로, 약간 더 적은 세포가 작은 플라스미드로부터 GFP를 발현하였으나, 발현한 세포들은 더 밝았는데, 이것은 냉동휴면이 세포로 하여금 다량의 DNA를 더 잘 흡수할 수 있게 만든다는 것을 암시한다. 세포의 전체 풀에서 구축물의 크기가 작을수록 더 낮은 백분율은 DNA의 적정의 결과일 것이다: 즉, 다량의 플라스미드를 흡수하는 세포는 정상적으로 더 적은 DNA를 흡수할 세포를 집단 내에 거의 남겨두지 않을 것이다.
WA09 냉동휴면 세포 및 신선한 비냉동 세포를, mCherry를 발현하는 더 큰 9.3 kb CRISPR/Cas9 플라스미드로도 핵감염시켰다. 세포를 2.5 ㎍, 5 ㎍, 7.5 ㎍, 10 ㎍ 및 12.5 ㎍의 플라스미드로 세포를 핵감염시켰다. 제2 핵감염 용액인 HSC2도 냉동휴면 조건 및 신선한 비냉동 조건 하에서 2.5 ㎍의 플라스미드로 시험하였다. 도 8b 및 8c로 나타낸 바와 같이, HSC-완충제 냉동휴면 WA09 세포는 신선한 비냉동 세포에 비해 모든 농도에서 더 높은 발현 수준을 나타내었다.
본 개시된 보호대상 및 이의 장점이 상세히 기재되어 있지만, 첨부된 청구범위에 의해 정의된 본 발명의 사상 및 범위로부터 벗어나지 않으면서 본원의 다양한 변화, 치환 및 변경을 만들 수 있다는 것을 이해해야 한다. 나아가, 본원의 범위는 본 명세서에 기재된 과정, 기계, 제조, 물질 조성물, 수단, 방법 및 단계의 특정 실시양태로 한정되기 위한 것이 아니다. 본 기술분야에서 통상의 기술을 가진 자는 본원에 기재된 상응하는 실시양태와 실질적으로 동일한 기능을 수행하거나 실질적으로 동일한 결과를 달성하는, 이미 존재하거나 추후 개발된 과정, 기계, 제조, 물질 조성물, 수단, 방법 또는 단계가 본 개시된 보호대상에 따라 이용될 수 있다는 것을 본 개시된 보호대상의 개시로부터 용이하게 인식할 것이다. 따라서, 첨부된 청구범위는 이러한 과정, 기계, 제조, 물질 조성물, 수단, 방법 또는 단계를 그의 범위 내에 포함하기 위한 것이다.
특허, 특허출원, 공개문헌, 제품 설명서 및 프로토콜이 본원 전체에 걸쳐 인용되어 있고, 이들의 개시는 모든 목적을 위해 전체로서 본원에 참고로 도입된다.

Claims (39)

  1. 해리된 세포의 냉동 집단 및 냉동보존 배지를 포함하는 조성물로서,
    상기 냉동 집단 중의 세포의 농도는 적어도 약 1백만 개 세포/㎖인 조성물.
  2. 해리된 세포의 냉동 집단 및 냉동보존 배지를 해동시킴으로써 수득된 세포를 형질감염시킴으로써 제조된, 이종 핵산으로 형질감염된 세포를 포함하는 조성물로서,
    상기 냉동 집단 중의 세포의 농도는 적어도 약 1백만 개 세포/㎖인 조성물.
  3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    상기 냉동 집단 중의 세포의 농도는 적어도 약 5백만 개 세포/㎖인 조성물.
  4. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 냉동 집단 중의 세포의 농도는 적어도 약 3천만 개 세포/㎖인 조성물.
  5. 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 냉동 집단 중의 세포의 농도는 적어도 약 5천만 개 세포/㎖인 조성물.
  6. 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포는 포유동물 세포인 조성물.
  7. 청구항 6에 있어서,
    상기 포유동물 세포는 분화다능 줄기 세포(PSC)인 조성물.
  8. 청구항 7에 있어서,
    상기 분화다능 줄기 세포는 유도된 분화다능 줄기 세포(iPSC) 또는 배아 줄기 세포(ESC)인 조성물.
  9. 배양 배지에서 배양된 세포의 집단을 해리시키는 단계;
    상기 해리된 세포를 냉동보존 배지에 현탁하여 세포 현탁액을 형성하는 단계; 및
    상기 세포 현탁액을 냉동시켜 냉동된 세포의 조성물을 형성하는 단계;를 포함하는 냉동 세포를 포함하는 조성물의 제조 방법으로서,
    상기 냉동 세포의 조성물은 적어도 약 1백만 개 세포/㎖의 농도를 갖는 것인 방법.
  10. (i) 배양 배지에서 배양된 세포의 집단을 해리시키는 단계; 상기 해리된 세포를 냉동보존 배지에 현탁하여 세포 현탁액을 형성하는 단계; 및 상기 세포 현탁액을 냉동시켜 냉동 세포의 조성물을 형성하는 단계;를 포함하는 방법에 의해 냉동 세포를 포함하는 조성물을 제조하는 단계로서, 상기 냉동 세포의 조성물은 적어도 약 1백만 개 세포/㎖의 농도를 갖는 것인 단계; 및
    (ii) (i)의 조성물로부터의 세포를 이종 핵산으로 형질감염시키는 단계;를 포함하는 형질감염된 세포의 제조 방법.
  11. 청구항 9 또는 청구항 10에 있어서,
    세포의 집단을 해리시키는 단계는 상기 세포의 집단을 유효량의 세포 해리 용액에 노출시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  12. 청구항 11에 있어서,
    상기 세포 해리 용액은 효소 무함유 세포 해리 용액 및 효소 함유 용액으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  13. 청구항 12에 있어서,
    상기 효소 함유 세포 해리 용액은 하나 이상의 효소를 포함하는 방법.
  14. 청구항 13에 있어서,
    상기 효소는 콜라게나제, 프로테아제, 트립신, 파파인, 히알루로니다제 및 DNase로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  15. 청구항 12에 있어서,
    상기 효소 무함유 세포 해리 용액은 하나 이상의 킬레이팅제를 포함하는 방법.
  16. 청구항 15에 있어서,
    상기 킬레이팅제는 EDTA인 방법.
  17. 청구항 9 내지 청구항 16 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 배양 배지는 피더(feeder) 무함유 배지인 방법.
  18. 청구항 9 내지 청구항 17 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물 중의 냉동 세포의 농도는 적어도 약 5백만 개 세포/㎖인 방법.
  19. 청구항 9 내지 청구항 18 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물 중의 냉동 세포의 농도는 적어도 약 3천만 개 세포/㎖인 방법.
  20. 청구항 9 내지 청구항 19 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포는 포유동물 세포인 방법.
  21. 청구항 20에 있어서,
    상기 포유동물 세포는 PSC 또는 ESC인 방법.
  22. 청구항 21에 있어서,
    상기 PSC는 iPSC인 방법.
  23. 해리된 세포의 집단 및 냉동보존 배지를 포함하는 냉동 세포의 조성물을 해동시키는 단계; 및
    상기 세포를 다운스트림 처리로 처리하는 단계;를 포함하는 시험관내에서 세포를 배양하는 방법으로서,
    상기 세포는 다운스트림 처리 전에 기하급수적으로 증폭되지 않는 것인 방법.
  24. 청구항 23에 있어서,
    상기 냉동 세포의 조성물은 적어도 약 1백만 개 세포/㎖의 농도를 갖는 방법.
  25. 청구항 23 또는 청구항 24에 있어서,
    상기 냉동 세포의 조성물은 적어도 약 5백만 개 세포/㎖의 농도를 갖는 방법.
  26. 청구항 23 내지 청구항 25 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 냉동 세포의 조성물은 적어도 약 3천만 개 세포/㎖의 농도를 갖는 방법.
  27. 청구항 23 내지 청구항 26 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포는 포유동물 세포인 방법.
  28. 청구항 27에 있어서,
    상기 포유동물 세포는 PSC 또는 ESC인 방법.
  29. 청구항 28에 있어서,
    상기 PSC는 iPSC인 방법.
  30. 청구항 23 내지 청구항 29 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 다운스트림 처리는 상기 세포를 시험관내에서 분화시키는 방법을 포함하는 방법.
  31. 청구항 30에 있어서,
    상기 세포는 복수의 도파민 생성 전구체 세포로 분화되는 방법.
  32. 청구항 31에 있어서,
    상기 도파민 생성 전구체 세포는 검출가능한 수준의 포크헤드 박스 단백질 A2(FOXA2), LIM 호메오박스 전사 인자 1 알파(LMX1A), 티로신 하이드록실라제(TH) 또는 이들의 조합을 발현하는 방법.
  33. 청구항 29 내지 청구항 32 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 iPSC는 신경퇴행성 질환으로 진단받은 대상체로부터 유래되는 방법.
  34. 청구항 33에 있어서,
    상기 신경퇴행성 질환은 파킨슨병인 방법.
  35. 청구항 1 내지 청구항 8 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 해리된 세포의 집단은 외생성 핵산을 발현하고, 상기 발현의 수준은 냉동되지 않은 세포의 집단에 의한 외생성 핵산의 발현 수준보다 더 큰 것인 조성물.
  36. 청구항 35에 있어서,
    상기 해리된 세포의 집단의 발현 수준은 냉동되지 않은 세포의 집단의 발현 수준보다 적어도 약 2배 더 큰 것인 조성물.
  37. 청구항 35 또는 청구항 36에 있어서,
    상기 해리된 세포의 집단의 발현 수준은 냉동되지 않은 세포의 집단의 발현 수준보다 적어도 약 5% 더 큰 것인 조성물.
  38. 청구항 9 내지 청구항 34 중 어느 한 항에 있어서,
    핵산을 냉동된 세포의 집단 내로 도입하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  39. 청구항 38에 있어서,
    상기 핵산은 형질감염 또는 핵감염에 의해 도입되는 방법.
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