KR20230146946A - 줄기세포의 신경외배엽으로의 분화 유도용 조성물 - Google Patents
줄기세포의 신경외배엽으로의 분화 유도용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 TGF-β(transforming growth factor-beta) 수용체 ALK(activin receptor-like kinase) 5 억제제, BMP(bone morphogenetic protein) 억제제 및 MMP(Matrix metalloproteinase) 억제제를 포함하는, 줄기세포의 신경외배엽으로의 분화 유도용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따르면 TGF-β 수용체 ALK5 억제제, BMP 억제제 및 MMP 억제제를 인간 배아줄기세포 또는 인간 유도만능줄기세포에 처리하는 경우, 신경외배엽으로의 분화가 촉진됨을 확인한 바, 이를 인간 배아줄기세포 및 인간 유도만능줄기세포를 포함하는 줄기세포의 신경외배엽으로의 분화 유도용 조성물 또는 키트로 제공할 수 있다.
Description
본 발명은 인간 배아줄기세포 또는 인간 유도만능줄기세포를 신경외배엽으로 분화시킬 수 있는 조성물에 관한 것이다.
줄기세포(stem cell)는 생물 조직을 구성하는 다양한 세포들로 분화할 수 있는 세포로서 배아, 태아 및 성체의 각 조직에서 얻을 수 있는 분화되기 전 단계의 미분화 세포들을 총칭한다. 줄기세포는 분화 자극(환경)에 의하여 특정 세포로 분화가 진행되고, 세포분열에 의해 자신과 동일한 세포를 생산(self-renewal)할 수 있는 특성이 있으며, 분화 자극에 따라 상이한 세포로도 분화될 수 있는 유연성(plasticity)을 가지고 있는 것이 특징이다.
줄기세포는 그 분화능에 따라 만능(pluripotency), 다분화능(multipotency) 및 단분화능(unipotency) 줄기세포로 나눌 수 있다. 만능줄기세포(pluripotent stem cells)는 모든 세포로 분화될 수 있는 잠재력을 지닌 만능분화능(pluripotency)의 세포이며, 일부 줄기세포는 다분화능 또는 단분화능의 잠재력을 지닌다.
현재 줄기세포는 세포치료제로서 각광을 받고 있는데, 신경세포의 손상에 의해 유발되는 다양한 신경 질환(neurological diseases)의 세포치료제로서도 많은 연구가 이루어지고 있다. 특히 뇌신경계 질환은 다른 어느 질병보다 세포 이식치료에 가장 합당한 대상이라 여겨지는데, 이는 뇌신경계 조직이 다른 조직과는 달리 면역거부 반응이 거의 없어, 외부로부터 세포를 이식하였을 때 이식된 세포의 장기간 생존을 기대할 수 있기 때문이다.
한편, 세포치료제로서의 줄기세포의 유용성을 높이기 위해서는 줄기세포를 효율적으로 특정세포로 분화시키는 기술이 필요하다. 이에 따라 다양한 분화 방법이 개발되었으며, 신경세포로 분화를 유도하는 방법에 대해서도 다양한 기술이 공개되었다.
그 예로서 (a) 단계: 줄기세포를 염기성 섬유아세포 성장인자로 배양하는 단계; (b) 단계: (a)의 세포를 섬유아세포 성장인자 8과 Sonic hedgehog로 배양하는 단계; (c) 단계: (b)의 세포를 뇌-유래 신경영양 인자로 배양하는 단계; 및 (d) 단계: (c)의 세포를 신경교 성상세포와 공동배양하는 단계를 포함하는 방법이 개발된 바 있다(국제공개특허 WO 2005/003320 참고). 또는 배아줄기세포가 신경세포로 분화하는 데 유도제로 작용할 수 있는 특정 화학 구조식을 갖는 화합물이 공개된 바 있다(국제공개특허 WO 2004/093812 참고).
그러나, 세포주 고유의 특성 때문에 분화 효율이 일정하지 않은 바, 신경세포로 분화를 유도할 수 있는 방법의 개발은 계속적으로 요구되고 있다.
본 발명자들은 인간 배아줄기세포(human embryonic stem cell) 또는 인간 유도만능줄기세포(human induced pluripotent stem cell)를 신경외배엽(neuroectoderm)으로 효율적으로 분화시킬 수 있는 물질의 조합을 개발하여 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 줄기세포의 신경외배엽으로의 분화 유도용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 줄기세포의 신경외배엽으로의 분화 유도용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 줄기세포의 신경외배엽으로의 분화 유도 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 TGF-β(transforming growth factor-beta) 수용체 ALK(activin receptor-like kinase) 5 억제제, BMP(bone morphogenetic protein) 억제제 및 MMP(Matrix metalloproteinase) 억제제를 포함하는, 줄기세포의 신경외배엽으로의 분화 유도용 조성물을 제공한다.
또한 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 TGF-β (transforming growth factor-beta) 수용체 ALK(activin receptor-like kinase) 5 억제제, BMP(bone morphogenetic protein) 억제제 및 MMP(Matrix metalloproteinase) 억제제를 포함하는, 줄기세포의 신경외배엽으로의 분화 유도용 키트를 제공한다.
또한 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 줄기세포에 TGF-β 수용체 ALK5 억제제, BMP 억제제 및 MMP 억제제를 처리하는 단계; 및 상기 줄기세포를 배양하는 단계;를 포함하는, 줄기세포의 신경외배엽으로의 분화 유도 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면 TGF-β 수용체 ALK5 억제제, BMP 억제제 및 MMP 억제제를 인간 배아줄기세포 또는 인간 유도만능줄기세포에 처리하는 경우, 신경외배엽으로 분화가 현저히 촉진됨을 확인한 바, 이를 줄기세포의 신경외배엽으로의 분화 유도용 조성물 또는 키트로 제공할 수 있다.
도 1은 TGF-β 수용체 ALK5 억제제, BMP 억제제 및 MMP 억제제를 처리한 인간 배아줄기세포의 신경외배엽으로의 분화 여부를 확인하고(도 1 중 Neuroectoderm 결과 참고), 인간 배아줄기세포의 중내배엽 분화에 있어서 MMP 억제제 처리에 따른 영향을 확인한 결과이다(도 1 중 Mesendoderm 결과 참고.). 상기 도 1에 있어서, 하얀색 바는 50 μm의 길이를 갖는다.
도 2는 TGF-β 수용체 ALK5 억제제, BMP 억제제 및 MMP 억제제를 처리한 인간 유도만능줄기세포의 신경외배엽으로의 분화 여부를 확인하고(도 2 중 Neuroectoderm 결과 참고), 인간 유도만능줄기세포의 중내배엽 분화에 있어서, MMP 억제제 처리에 따른 영향을 확인한 결과이다(도 2 중 Mesendoderm 결과 참고.). 상기 도 2에 있어서, 하얀색 바는 25 μm의 길이를 갖는다.
도 3은 세포외기질 분해효소인 인간 MMP14 과발현을 통한 신경외배엽 분화 억제를 확인한 결과이다. 상기 도 3에 있어서, 하얀색 바는 50 μm의 길이를 가지며, 하얀색 화살표는 인간 MMP14가 과발현된 세포를 표시한다.
도 2는 TGF-β 수용체 ALK5 억제제, BMP 억제제 및 MMP 억제제를 처리한 인간 유도만능줄기세포의 신경외배엽으로의 분화 여부를 확인하고(도 2 중 Neuroectoderm 결과 참고), 인간 유도만능줄기세포의 중내배엽 분화에 있어서, MMP 억제제 처리에 따른 영향을 확인한 결과이다(도 2 중 Mesendoderm 결과 참고.). 상기 도 2에 있어서, 하얀색 바는 25 μm의 길이를 갖는다.
도 3은 세포외기질 분해효소인 인간 MMP14 과발현을 통한 신경외배엽 분화 억제를 확인한 결과이다. 상기 도 3에 있어서, 하얀색 바는 50 μm의 길이를 가지며, 하얀색 화살표는 인간 MMP14가 과발현된 세포를 표시한다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명은 TGF-β(transforming growth factor-beta) 수용체 ALK(activin receptor-like kinase) 5 억제제, BMP(bone morphogenetic protein) 억제제 및 MMP(Matrix metalloproteinase) 억제제를 포함하는, 줄기세포의 신경외배엽(neuroectoderm)으로의 분화 유도용 조성물을 제공한다.
본 발명의 실시예에 따르면, 인간 배아줄기세포 또는 인간 유도만능줄기세포에 TGF-β 수용체 ALK 5 억제제, BMP 억제제 및 MMP 억제제를 처리한 경우, TGF-β 수용체 ALK 5 억제제 및 BMP 억제제만 처리한 경우보다 신경외배엽 관련 유전자의 발현이 현저히 증가함을 확인하였다.
더불어 본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 인간 배아줄기세포 또는 인간 유도만능줄기세포를 중내배엽성 세포로 분화시켰을 때, MMP 억제제를 처리하는 경우, 중내배엽 관련 유전자의 발현이 현저히 감소함을 확인하였다.
따라서 본 발명에 있어서, 상기 줄기세포는 인간 배아줄기세포(human embryonic stem cell) 및 인간 유도만능줄기세포(human induced pluripotent stem cell)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 한다.
상기 인간 배아줄기세포(human embryonic stem cell) 또는 인간 유도만능줄기세포(human induced pluripotent stem cell)는 동물, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간 유래의 세포일 수 있으며, 이는 당업계에 잘 알려져 있는 방법으로 배양 및 분리할 수 있다.
본 발명의 TGF-β 수용체 ALK5 억제제는, TGF-β 수용체 ALK5를 억제할 수 있는 물질을 제한없이 포함할 수 있으며, 바람직하게는 SB431542일 수 있다.
상기 “SB431542”은 TGF-β 수용체 Alk5(Activin Receptor-Like Kinase-5)의 억제제이며, C22H16N4O3의 화학식 및 384.4의 분자량을 갖는 물질을 의미하고, 본원 발명에서 목적하는 TGF-β 수용체 ALK5 억제를 통해 인간 배아줄기세포 또는 인간 유도만능줄기세포를 신경외배엽으로 분화를 유도하는 물질이라면 SB431542의 유도체 역시 본 발명의 범주에 포함될 수 있다.
본 발명의 TGF-β 수용체 ALK5 억제제는 0.1 내지 20 μM의 농도로 처리될 수 있으며, 바람직하게는 1 내지 20 μM의 농도로 처리될 수 있고, 보다 바람직하게는 10 내지 20 μM의 농도로 처리될 수 있으며, 보다 더 바람직하게는 10 μM로 줄기세포에 처리될 수 있다.
본 발명의 BMP 억제제는, BMP를 억제할 수 있는 물질을 제한없이 포함할 수 있으며, 바람직하게는 도르소모르핀(Dorsomorphin)일 수 있다.
상기 “도르소모르핀(Dorsomorphin)"은 C24H25N5O의 화학식 및 399.49의 분자량을 갖는 물질을 의미하고, 본원 발명에서 목적하는 BMP 억제를 통해 인간 배아줄기세포 또는 인간 유도만능줄기세포를 신경외배엽으로 분화를 유도하는 물질이라면 도르소모르핀의 유도체 역시 본 발명의 범주에 포함될 수 있다.
본 발명의 BMP 억제제는 0.1 내지 10 μM의 농도로 처리될 수 있으며, 바람직하게는 1 내지 10 μM의 농도로 처리될 수 있고, 보다 바람직하게는 1 내지 5 μM의 농도로 처리될 수 있으며, 보다 더 바람직하게는 2 μM로 줄기세포에 처리될 수 있다.
본 발명의 MMP 억제제는, MMP를 억제할 수 있는 물질을 제한없이 포함할 수 있으며, 바람직하게는 MMP1, MMP2, MMP3, MMP7, MMP9, MMP12, MMP14 및 MMP26으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 억제하는 것일 수 있고, 보다 바람직하게는 바티마스타트(Batimastat, BB-94), GM6001, 수라민(suramin), 퓨마길린(fumagillin) 및 마리마스타트(marimastat)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다. 보다 더 바람직하게는 바티마스타트(Batimastat, BB-94) 및 GM6001로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
상기 “BB-94"는 바티마스타트(Batimastat)로 불리며, C23H31N3O4S2의 화학식 및 477.64의 분자량을 갖는 물질을 의미하고, 본원 발명에서 목적하는 MMP 억제를 통해 인간 배아줄기세포 또는 인간 유도만능줄기세포를 신경외배엽으로 분화를 유도하는 물질이라면 BB-94의 유도체 역시 본 발명의 범주에 포함될 수 있다.
상기 “GM6001"는 갈라딘(Galardin) 또는 일로마스타트(Ilomastat)로 불리며, C20H28N4O4의 화학식 및 388.46의 분자량을 갖는 물질을 의미하고, 본원 발명에서 목적하는 MMP 억제를 통해 인간 배아줄기세포 또는 인간 유도만능줄기세포를 신경외배엽으로 분화를 유도하는 물질이라면 GM6001의 유도체 역시 본 발명의 범주에 포함될 수 있다.
본 발명의 MMP 억제제는 0.1 내지 10 μM의 농도로 처리될 수 있으며, 바람직하게는 1 내지 10 μM의 농도로 처리될 수 있고, 보다 바람직하게는 1 내지 5 μM의 농도로 처리될 수 있다. 보다 더 바람직하게는 BB-94의 경우 2 μM로 처리될 수 있고, GM6001의 경우 5 μM로 처리될 수 있다.
본 발명에 따라 분화 유도된 신경외배엽 세포는 신경외배엽 마커의 발현이 증가한 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 신경외배엽 마커인 PAX6(Paired Box 6)의 발현이 증대된 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 조성물은 배지 조성물, 시약 조성물과 같은 인비트로(in vitro) 조성물을 포함할 수 있으므로, 본 발명은 TGF-β (transforming growth factor-beta) 수용체 ALK(activin receptor-like kinase) 5 억제제, BMP(bone morphogenetic protein) 억제제 및 MMP(Matrix metalloproteinase) 억제제를 포함하는 줄기세포의 신경외배엽으로의 분화 유도용 배지 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 “배지”는 생체 외에서 세포의 배양에 적절한 당 분야에서 사용되는 통상의 배지를 모두 포함한다. 세포의 종류에 따라 배지와 배양 조건을 선택할 수 있다. 배양에 사용되는 배지는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI1640, F-10, F-12, α-MEM(α-Minimal essential Medium), GMEM(Glasgow's Minimal essential Medium), Iscove's Modified Dulbecco's Medium 배지 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 TGF-β 수용체 ALK5 억제제, BMP 억제제 및 MMP 억제제 외에도 줄기세포를 신경외배엽으로 분화 유도할 수 있는 성분을 추가적으로 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 TGF-β 수용체 ALK5 억제제, BMP 억제제 및 MMP 억제제를 포함하는, 줄기세포의 신경외배엽으로의 분화 유도용 키트를 제공한다.
상기 키트는 상기한 것에 한정되는 것은 아니며, 다른 시약이나 기구를 포함할 수 있다. 예를 들면, 대상 세포를 배양하기 위한 배양 플레이트나 신경외배엽 세포로의 분화 상태를 평가 가능한 시약(예를 들면, 알리자린 레드 등)을 포함할 수 있고, 배양하는 대상이 되는 줄기세포, 바람직하게는 인간 배아줄기세포 및/또는 인간 유도만능줄기세포를 구비하고 있을 수도 있다.
본 발명에 따른 키트의 제공형태는 분화 유도 배지용 첨가제, 또는 TGF-β 수용체 ALK5 억제제; 예컨대 SB431542, BMP 억제제; 예컨대 도르소모르핀 및 바티마스타트(Batimastat, BB-94), GM6001, 수라민(suramin), 퓨마길린(fumagillin) 및 마리마스타트(marimastat)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 MMP 억제제 또는 사이토카인, 인지질, 또는 기초 배지와 그 외의 시약 모두를 적절한 용량 및/또는 형태로 함유한 하나의 용기일 수 있거나, 각각 다른 용기에 의해 제공할 수 있다.
본 발명에 따른 키트는 상술한 본 발명에 따른 방법을 실시하기 위한 순서 등을 기재한 설명서를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 줄기세포에 TGF-β 수용체 ALK5 억제제, BMP 억제제 및 MMP 억제제를 처리하는 단계; 및 상기 줄기세포를 배양하는 단계;를 포함하는, 줄기세포의 신경외배엽으로의 분화 유도 방법을 제공한다.
상기 분화 유도 방법에 있어서, 배양은 2일 내지 10일동안 수행될 수 있으며, 바람직하게는 5일동안 수행될 수 있다.
상기 TGF-β 수용체 ALK5 억제제는 SB431542일 수 있다. 상기 TGF-β 수용체 ALK5 억제제는 0.1 내지 20 μM의 농도로 처리될 수 있으며, 바람직하게는 1 내지 20 μM의 농도로 처리될 수 있고, 보다 바람직하게는 10 내지 20 μM의 농도로 처리될 수 있으며, 보다 더 바람직하게는 10 μM로 줄기세포에 처리될 수 있다.
본 발명의 BMP 억제제는 “도르소모르핀(Dorsomorphin)"일 수 있다. 상기 BMP 억제제는 0.1 내지 10 μM의 농도로 처리될 수 있으며, 바람직하게는 1 내지 10 μM의 농도로 처리될 수 있고, 보다 바람직하게는 1 내지 5 μM의 농도로 처리될 수 있으며, 보다 더 바람직하게는 2 μM로 줄기세포에 처리될 수 있다.
상기 MMP 억제제는 바티마스타트(Batimastat, BB-94), GM6001, 수라민(suramin), 퓨마길린(fumagillin) 및 마리마스타트(marimastat)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있으며, 바람직하게는 BB-94 및 GM6001으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 MMP 억제제는 0.1 내지 10 μM의 농도로 처리될 수 있으며, 바람직하게는 1 내지 10 μM의 농도로 처리될 수 있고, 보다 바람직하게는 1 내지 5 μM의 농도로 처리될 수 있다. 보다 더 바람직하게는 BB-94의 경우 2 μM로 처리될 수 있고, GM6001의 경우 5 μM로 처리될 수 있다.
본 발명의 분화방법에 따라 인비트로(Invitro)에서 분화된 신경외배엽 세포는 그 자체로 사용되거나 또는 유세포분석기 등을 이용한 분리방법을 통해 분리된 후, 알츠하이머병, 치매, 근위축성 측색 경화증 등의 퇴행성 뇌신경질환과 척수손상과 같은 물리적 자극에 의한 신경손상과 같은 뇌신경계 질환 치료용 세포치료제, 또는 약학적 조성물의 유효성분으로 사용될 수 있다.
상기 “세포치료제” 란 세포와 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가(autologous), 동종(allogenic), 이종(xenogenic) 세포를 체외에서 증식 또는 선별하거나 기타 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 방법을 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 말한다.
상술한 본 발명의 내용은 상호 모순되지 않는 한, 서로 동일하게 적용되며, 당해 기술분야의 통상의 기술자가 적절한 변경을 가해 실시하는 것 또한 본 발명의 범주에 포함된다.
이하 본 발명을 실시예를 통해 상세하게 설명하나 본 발명의 범위가 하기 실시예로만 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 줄기세포의 신경외배엽(neuroectoderm) 또는 중내배엽(Mesendoderm)으로의 분화 촉진
1-1. 인간 배아줄기세포 또는 인간 유도만능줄기세포의 배양
지지세포가 없는 배양을 위해 DMEM(Gibco)에 희석된 매트리겔(Matrigel(Corning))을 6웰 플레이트(6 well plate(SPL))에 1ml/well의 농도로 분주한 뒤 4℃에서 24시간 동안 코팅 처리하였다. 남아 있는 매트리겔을 완전히 제거한 뒤 인간 배아줄기세포 배양액 mTeSR1(Stem Cell Technologies)을 1.5ml/well의 농도로 넣어준 뒤 인간 배아줄기세포 H9(WiCell) 또는 인간 유도만능줄기세포 IMR-90 iPSC (WiCell)를 분주하고 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 매일 1.5ml/well mTeSR1 배양액으로 배지를 교체하였다. 인간 배아줄기세포 H9(WiCell) 또는 인간 유도만능줄기세포 IMR-90 iPSC가 약 70%의 군집밀도로 배양되면 기존의 배양액 mTeSR1을 완전히 제거한 뒤 무효소 계대 시약 ReLeSR (Stem Cell Technologies)을 700 μl/well의 농도로 처리하여 상온에서 10초, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 1분 배양하였다. 이후 상온에서 1ml/well의 mTeSR1을 분주하고 피펫팅하여 작은 군집체들로 조각낸 뒤 1.5ml/well mTeSR1 배양액이 담긴 매트리겔이 코팅된 배양 용기에 300 μl/well의 농도로 분주하였다.
1-2. 신경외배엽 세포로의 분화 유도
상기 실시예 1-1을 통해 준비한 인간 배아줄기세포 또는 인간 유도만능줄기세포를 신경외배엽 세포로 분화시키기 위하여, TGF-β 수용체 ALK5 억제제인 SB431542, BMP 억제제인 도르소모르핀(Dorsomorphin)과 MMP 억제제인 BB-94 또는 GM6001을 처리하였다. 보다 구체적으로, 인간 배아줄기세포 또는 인간 유도만능줄기세포에 DMEM/F12(Welgene), 5% KSR(KnockOut Serum Replacement (Gibco)), 1% 비필수아미노산(Non-Essential Amino Acid (Thermo)), 0.1mM β-멜캅토에탄올(β-mercaptoethanol (Gibco)), 1% 페니실린-스트렙토마이신(Penicillin-streptomycin (Welgene)), 10μM SB431542(Peprotech), 2μM 도르소모르핀(Tocris)과 2μM BB-94(Selleck Chemicals)을 포함하거나, 10μM SB431542, 2μM 도르소모르핀과 5μM GM6001(Tocris)을 포함하는 신경외배엽 분화 유도액을 각각 처리하였다. 5일 동안 배양하여 신경외배엽 세포로의 분화를 유도하였으며, 2일마다(0일, 2일, 4일) 4ml/well의 신경외배엽 분화 유도액으로 배양액을 교체해주었다.
더불어 대조군(Negative contorl, NC)으로 DMEM/F12(Welgene), 5% KSR(Gibco), 1% 비필수아미노산(Thermo), 0.1mM β-멜캅토에탄올(Gibco), 1% 페니실린-스트렙토마이신(Welgene)과 10μM SB431542(Peprotech), 2μM 도르소모르핀(Tocris)을 포함하는 신경외배엽 분화 유도액을 처리하였다. 상기 대조군 또한 5일동안 배양하여 신경외배엽 세포로의 분화를 유도하였으며, 2일마다(0일, 2일, 4일) 4ml/well의 신경외배엽 분화 유도액으로 배양액을 교체해주었다.
1-3. 중내배엽 세포로의 분화 유도
상기 실시예 1-1을 통해 준비한 인간 배아줄기세포 또는 인간 유도만능줄기세포를 중내배엽 세포로 분화시키기 위해 BMP4(Bone morphogenetic protein-4)를 BB-94 또는 GM6601과 함께 처리하였다. 보다 구체적으로 mTeSR 배양액에 5ng/ml BMP4(R&D Systems), 2μM BB-94(Selleck Chemicals) 또는 5μM GM6001(Tocris)를 첨가한 중내배엽 분화 유도액을 준비하고 이를 인간 배아줄기세포 또는 인간 유도만능줄기세포에 처리하였다. 3일동안 배양하여 중내배엽 세포로의 분화를 유도하였으며, 2일마다(0일, 2일) 4ml/well의 중내배엽 분화 유도액으로 배양액을 교체해주었다.
더불어 대조군(Negative contorl, NC)으로 mTeSR 배양액, 5 ng/ml BMP4(R&D Systems)을 포함하는 중내배엽 분화 유도액을 제조하여, 상기 실시예 1-1을 통해 준비한 인간 배아줄기세포 또는 인간 유도만능줄기세포에 처리하였다. 3일 동안 배양하여 중내배엽 세포로의 분화를 유도하였으며, 2일마다(0일, 2일) 4ml/well의 중내배엽 분화 유도액으로 배양액을 교체해주었다.
실시예 2. 신경외배엽 또는 중내배엽 세포로의 분화에 미치는 영향 확인
2-1. 인간 배아줄기세포에서의 영향 확인
상기 실시예 1의 신경외배엽 또는 중내배엽 세포로 분화를 유도한 각 실험군 및 대조군에 대해 면역세포화학 기법(Immunocytochemistry)을 수행하여 신경외배엽 또는 중내배엽에서 특이적으로 발현되는 유전자의 발현을 확인하였다. 먼저 각 실험군 및 대조군으로부터 수득한 인간 배아줄기세포 또는 인간 유도만능줄기세포를 4% 포름알데히드(Methanol-free formaldehyde (Thermo))로 상온(25 ℃)에서 15분간 고정시켰다. 이후 고정된 세포를 PBS를 이용해 3회 세척한 후 세포 외막의 천공을 위해 PBS에 희석한 0.25% 트리톤 X-100 (Triton X-100 (Sigma))을 상온 (25 ℃)에서 10분간 처리하였다. PBS에 희석한 10% FBS(Fetal bovine serum (Life technology))을 이용해 세포를 1시간동안 상온에서 블로킹(blocking)한 뒤 블로킹 용액에 1:200의 비율로 희석된 신경외배엽 유전자 PAX6에 대한 1차 항체(Santa Cruz Biotechnology) 또는 중내배엽 유전자 브라큐리(Brachyury)에 대한 1차 항체(R&D Systems)를 4 ℃에서 밤새 처리해주었다. PBS로 3회 세척한 후 적절한 이차 항체(Alexa Fluor® dye conjugated secondary antibody)를 세포에 상온(25 ℃)에서 1시간 동안 처리하였고 Hoechst 33342(Thermo)를 사용하여 상온 (25 ℃)에서 2분 동안 세포핵 염색을 수행하였다. 이를 통해 인간 배아줄기세포를 신경외배엽 세포로 분화를 유도한 실험군(GM6001 또는 BB-94 추가 처리) 및 대조군(SB431541과 도르소모르핀만 처리)에 있어서, 신경외배엽 발생 과정에서 발현되는 것으로 알려진 PAX6의 발현을 확인하였다. 더불어 인간 배아줄기세포를 중내배엽 세포로 분화를 유도한 실험군(GM6001 또는 BB-94 추가 처리) 및 대조군(BMP4만 처리)에 있어서, 중내배엽 관련 유전자인 브라큐리의 발현을 확인하였다.
그 결과 도 1에 나타낸 바와 같이, SB431541와 도르소모르핀만으로 인간 배아줄기세포의 분화를 유도한 대조군(NC)에서는 낮은 밀집도를 나타내었으며, 신경외배엽 관련 유전자인 PAX6 또한 낮은 발현을 나타내었다. 반면, SB431541와 도르소모르핀에 MMP억제제(GM6001 또는 BB-94)를 추가하여 분화를 유도한 실험군의 경우에는 PAX6의 발현이 현저히 증가되었음을 확인하였다(도 1 중 Neuroectoderm 결과 참고).
더불어 중내배엽 분화 유도에 있어서, 배양액에 BMP4만 처리하여 중내배엽 분화를 유도한 대조군(NC)의 경우, 중내배엽 관련 유전자인 브라큐리는 높은 발현을 나타내었다. 반면 본 발명과 같이, GM6001 또는 BB-94를 처리한 실험군에서는 브라큐리의 발현이 현저히 감소된 것을 확인하였다(도 1 중 Mesendoderm 결과 참고).
2-2. 인간 유도만능줄기세포에서의 영향 확인
더불어 인간 유도 만능줄기세포의 신경외배엽 또는 중내배엽 분화 여부에 대해서도 상기 실시예 2-1과 동일한 방법으로 면역세포 화학 기법을 수행하여 확인하였다. 그 결과 도 2에 나타낸 바와 같이, SB431541와 도르소모르핀만으로 인간 유도만능줄기세포의 분화를 유도한 대조군(NC)은 낮은 밀집도를 보였고, PAX6도 낮은 발현을 나타내었다. 반면, SB431541와 도르소모르핀에 MMP억제제(GM6001 또는 BB-94)를 같이 처리하여 분화를 유도한 실험군의 경우에는 밀집도 및 PAX6의 발현이 현저히 증가되었음을 확인하였다(도 2 중 Neuroectoderm 결과 참고).
더불어 중내배엽 분화 유도에 있어서, 배양액에 BMP4만 처리하여 인간 유도만능줄기세포를 중내배엽 세포로 분화 유도한 NC 대조군의 경우, 브라큐리의 높은 발현이 확인되었다. 반면 본 발명과 같이 GM6001 또는 BB-94를 같이 처리한 실험군에서는 브라큐리의 발현이 현저히 감소되었음을 확인하였다(도 2 중 Mesendoderm 결과 참고).
따라서 MMP 억제제인 GM6001 또는 BB-94 처리에 의하여 인간 배아줄기세포 및 인간 유도만능줄기세포의 신경외배엽 세포로의 분화는 촉진되는 반면, 중내배엽 분화는 억제되었음을 확인하였다.
실시예 3. 세포외기질 분해효소(human MMP14) 과발현을 통한 신경외배엽 분화 억제 확인
상기 실시예 1-1과 같이 배양된 인간 배아줄기세포에 렌티바이러스 벡터 (Lentiviral vector)를 이용해 녹색형광(GFP)만을 과발현시킨 대조군(Negative control, NC)과 녹색형광(GFP)으로 표지된 MMP14를 과발현시킨 실험군을 각각 실시예 1-2와 동일한 방법으로 신경외배엽으로 분화시켰다. 이후 상기 실시예 2-1과 동일한 방법으로 면역세포화학 기법을 수행하여 GFP로 표지된, MMP14가 과발현된 인간 배아줄기세포의 신경외배엽으로의 분화정도를 NC 대조군의 신경외배엽 분화정도와 비교하였다.
그 결과 도 3에 나타낸 바와 같이, NC 대조군의 경우, 높은 밀집도를 보였으며, 신경외배엽 관련 유전자인 PAX6도 높은 발현을 나타내었다. 반면 MMP14가 과발현된 실험군의 경우 PAX6의 발현이 현저히 감소되었다. 따라서 MMP14의 과발현이 만능줄기세포의 신경외배엽으로의 분화를 억제함을 확인하였다.
종합적으로 본 발명은 인간 배아줄기세포 또는 인간 유도만능줄기세포를 신경외배엽 세포로 분화할 수 있는 조성물에 대한 것으로, 인간 배아줄기세포 또는 인간 유도만능줄기세포에 TGF-β 수용체 ALK5 억제제, BMP 억제제 및 MMP 억제제를 처리하여 배양한 경우 신경외배엽으로 분화 유도가 촉진됨을 확인한 바, 이를 이용하여 인간 배아줄기세포 또는 인간 유도만능줄기세포를 신경외배엽으로 효율적으로 분화시킬 수 있다.
Claims (15)
- TGF-β (transforming growth factor-beta) 수용체 ALK (activin receptor-like kinase) 5 억제제, BMP(bone morphogenetic protein) 억제제 및 MMP(Matrix metalloproteinase) 억제제를 포함하는, 줄기세포의 신경외배엽으로의 분화 유도용 조성물.
- 제 1항에 있어서,
상기 줄기세포는 인간 배아줄기세포(human embryonic stem cell) 및 인간 유도만능줄기세포(human induced pluripotent stem cell)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 분화 유도용 조성물.
- 제 1항에 있어서,
상기 TGF-β 수용체 ALK5 억제제는 SB431542인 것을 특징으로 하는, 줄기세포의 신경외배엽으로의 분화 유도용 조성물.
- 제 1항에 있어서,
상기 TGF-β 수용체 ALK5 억제제는 0.1 내지 20 μM 로 포함되는 것을 특징으로 하는, 줄기세포의 신경외배엽으로의 분화 유도용 조성물.
- 제 1항에 있어서,
상기 BMP 억제제는 도르소모르핀(Dorsomorphin)인 것을 특징으로 하는, 줄기세포의 신경외배엽으로의 분화 유도용 조성물.
- 제 1항에 있어서,
상기 BMP 억제제는 0.1 내지 10 μM 로 포함되는 것을 특징으로 하는, 줄기세포의 신경외배엽으로의 분화 유도용 조성물.
- 제 1항에 있어서,
상기 MMP 억제제는 MMP1, MMP2, MMP3, MMP7, MMP9, MMP12, MMP14 및 MMP26으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 억제하는 것을 특징으로 하는, 줄기세포의 신경외배엽으로의 분화 유도용 조성물.
- 제 1항에 있어서,
상기 MMP 억제제는 바티마스타트(Batimastat, BB-94), GM6001, 수라민(suramin), 퓨마길린(fumagillin) 및 마리마스타트(marimastat)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 줄기세포의 신경외배엽으로의 분화 유도용 조성물.
- 제 1항에 있어서,
상기 MMP 억제제는 0.1 내지 10 μM 로 포함되는 것을 특징으로 하는, 줄기세포의 신경외배엽으로의 분화 유도용 조성물.
- TGF-β (transforming growth factor-beta) 수용체 ALK(activin receptor-like kinase) 5 억제제, BMP(bone morphogenetic protein) 억제제 및 MMP(Matrix metalloproteinase) 억제제를 포함하는, 줄기세포의 신경외배엽으로의 분화 유도용 키트.
- 줄기세포에 TGF-β 수용체 ALK5 억제제, BMP 억제제 및 MMP 억제제를 처리하는 단계; 및
상기 줄기세포를 배양하는 단계;를 포함하는, 줄기세포의 신경외배엽으로의 분화 유도 방법.
- 제 11항에 있어서,
상기 TGF-β 수용체 ALK5 억제제는 SB431542인 것을 특징으로 하는, 줄기세포의 신경외배엽으로의 분화 유도 방법.
- 제 11항에 있어서,
상기 BMP 억제제는 도르소모르핀(Dorsomorphin)인 것을 특징으로 하는, 줄기세포의 신경외배엽으로의 분화 유도 방법.
- 제 11항에 있어서,
상기 MMP 억제제는 바티마스타트(Batimastat, BB-94), GM6001, 수라민(suramin), 퓨마길린(fumagillin) 및 마리마스타트(marimastat)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 줄기세포의 신경외배엽으로의 분화 유도 방법.
- 제 11항에 있어서,
상기 배양은 2일 내지 10일동안 수행되는 것을 특징으로 하는, 줄기세포의 신경외배엽으로의 분화 유도 방법.
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2022
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