KR101705245B1

KR101705245B1 - 마트리겔이 코팅된 신경줄기세포 배양용 플레이트

Info

Publication number: KR101705245B1
Application number: KR1020150071552A
Authority: KR
Inventors: 고기남; 이승원
Original assignee: 건국대학교 글로컬산학협력단
Priority date: 2015-05-22
Filing date: 2015-05-22
Publication date: 2017-02-09
Also published as: KR20160137039A

Abstract

본 발명은 줄기세포 배양용 플레이트 및 이를 이용한 신경줄기세포 배양방법에 관한 것이다.
상기와 같은 본 발명에 따르면, 세포배양시 플레이트를 코팅하기 위한 재료로써 주로 사용되고 있는 라미닌(laminin)을 대체할 수 있는 매트릭스(marix) 및 최적화된 농도를 제공함으로써, 신경줄기세포의 다분화능을 유지시키면서 경제적인 방법으로 체외에서 대량배양 및 장기배양을 가능하게 할 수 있는 효과가 있다.

Description

마트리겔이 코팅된 신경줄기세포 배양용 플레이트{MATRIGEL COATING PLATE FOR NEURAL STEM CELL CULTURE}

본 발명은 신경줄기세포(neural stem cell) 배양용 플레이트 및 이를 이용한 신경줄기세포 배양방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 피더세포(feeder cell)를 포함하지 않는 마트리겔(matrigel)이 코팅된 플레이트 및 이를 이용한 신경줄기세포 배양방법에 관한 것이다.

신경줄기세포(neural stem cell)는 뉴런(neurons)과 신경교세포(glial cell)와 같은 신경세포(neural cell)로 분화할 수 있는 능력을 가지고 있기 때문에 신경계질환(neurological disorders)의 치료에 있어서 중요한 의미가 있는 줄기세포(stem cell type)이다.

신경줄기세포는 태아 또는 성인의 뇌에서 얻을 수 있고, 신경줄기세포의 체외 증식은 신경발생에 있어서 신경줄기세포의 속성을 연구하는데 도움이 될 수 있을 뿐만 아니라 임상적 이식 실험에서 요구되는 세포의 수를 얻을 수 있다는 점에서도 중요하다.

뉴로스피어(neurosphere)는 신경줄기세포의 단일세포 서스펜션(single-cell suspension)을 형성한다. 체외에서 신경줄기세포를 증식시키기 위한 방법으로 뉴로스피어의 배양이 자주 사용된다. 그러나 뉴로스피어 배양방법(neurosphere culture method)에는 몇 가지 한계점이 있다.

뉴로스피어는 다양한 분화단계의 신경세포를 포함하는 헤테로제너스(heterogeneous)이다(뉴로스피어의 중앙부에 위치한 세포들의 분화가 표면에 위치한 세포들 보다 분화가 더 진행된 상태이다). 또한, 분화단계가 다른 종류의 세포로 인한 증식 및 분화능에 영향을 미칠 수 있기 때문에 각각의 뉴로스피어에서 세포 밀도(cell density)의 변화에 대한 데이터를 통합하는데 어려움이 발생한다.

반면, 2-dimensional adherent monolayer culture system(2D 단일층 접착 배양 시스템)은 신경줄기세포의 호모제너스(homogenou) 배양이 가능하고, 뉴로스피어 배양 시스템(neurosphere culture system)과 비교하여 단기간에 대량의 세포(larger cell population)를 발생시키는데 적합하다.

호모제너스(homogenous) 줄기세포 파퓰레이션(population)은 분화를 조절하거나 분화 메커니즘을 연구하는데 유용하게 활용될 수 있다.

한편, 신경줄기세포의 증식을 위한 단일층(monolayer) 배양에 있어서, 배양 플레이트(culture surface)의 코팅을 위해서 적절한 ECM(extracellular matrix) 분자(molecules)의 사용이 필요하며, 일반적으로 사용되는 ECM은 라미닌(laminin)이다.

그러나 대량으로 신경줄기세포를 배양할 때 필요로 하는 라미닌은 상당히 고가인 문제점이 있다.

반면, 마트리겔은 EHS(Engelbreth-Holm-Swarm) 마우스의 육종세포에서 추출된 단백질 복합체로서(BD Bioscience사의 제품명), 라미닌(lamonin), 콜라겐(collagen), 헤파란 설페이트 프로테오글리칸(heparan sulfate proteoglycan)과 같은 세포외 매트릭스(extracellular matrix, ECM)와 섬유아세포 성장인자(fibroblast growth factor, FGF), 상피세포 성장인자(epiderma growth factor, EFG), 인슐린 성장인자(insulin-like growth factor, IGF), 형질전환 성장인자-베타(transforming growth factor-beta, TGF-β), 혈소판 유래 성장인자(platelet-derived growth factor, PDGF)와 같은 성장인자를 함유한다.

마트리겔을 이루고 있는 복합체는 많은 조직에서 발견되는 복잡한 세포외 환경을 제공함으로써 세포 배양을 위한 기질로서 이용되고 있다.

마트리겔은 허혈성 동물 모델(ischemic animal model)에서 이식된 심근세포(cardiomyocytes cell)와 내피세포(endothelial cells)의 생존을 강화하기 위해 사용된바 있고, 배아줄기세포는 자기재생능(self-renewability)과 다분화능(pluripotency)이 있기 때문에 마우스와 인간의 배아줄기세포(embryoni stem cell, ESC)를 체외배양 함에 있어서 마트리겔이 사용되어 왔다.

그러나 배아줄기세포와 처리하여야 할 Growth factor, cytokine 등이 전혀 상이할 뿐만 아니라 배양조건이 전혀 다른 신경줄기세포의 체외배양을 위해서 마트리겔이 활용된 바는 없으며, 다분화능을 유지시키면서 경제적인 비용으로 신경줄기세포를 장기 및 대량배양할 수 있는 최적화된 마트리겔의 농도에 관하여도 개시하고 있는 선행문헌은 없다.

참고적으로, 본 발명자들은 최근에 정원줄기세포(spermatogonial stem cell, SSC)를 마트리겔을 이용하여 피더세포(feeder cell) 없이 장기간 성공적으로 체외에서 안정적으로 배양할 수 있다는 사실을 실험적으로 확인한 바 있다(한국특허출원 제10-2014-0034632호).

한편, 본 발명과 관련된 선행기술로는 한국등록특허 제10-0386880호(세포배양용 배지), 한국등록특허 제10-1389851호(신경능선줄기세포의 배양방법 및 그 용도) 등이 있다.

본 발명은 체외에서 경제적인 비용으로 다분화능을 유지시키면서 대량의 신경줄기세포(neural stem cell)를 배양할 수 있는 신경줄기세포 배양용 플레이트를 제공하는 것을 일 목적으로 한다.

또한 본 발명은 체외에서 경제적인 비용으로 다분화능을 유지시키면서 대량의 신경줄기세포(neural stem cell)를 배양할 수 있는 신경줄기세포 배양 방법을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.

본 발명의 목적들은 이상에서 언급한 목적으로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 본 발명의 다른 목적 및 장점들은 하기의 설명에 의해서 이해될 수 있으며, 본 발명의 실시예에 의해 보다 분명하게 알게 될 것이다. 또한, 본 발명의 목적 및 장점들은 청구범위에 나타낸 수단 및 조합에 의해 실현될 수 있음을 쉽게 알 수 있을 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 신경줄기세포 배양용 플레이트는 피더세포(feeder cell)를 포함하지 않고, 마트리겔(matrigel)이 코팅된 것을 일 특징으로 한다.

상기 플레이트를 코팅하는 마트리겔은 다양한 농도의 마트리겔을 사용할 수 있고, 바람직하게는 0.02 내지 0.5% 농도의 마트리겔을 사용하여 플레이트를 코팅하는 것이고, 더욱 바람직하게는 0.02% 농도의 마트리겔을 사용하는 것이다. 상기 마트리겔은 1%의 마트리겔 용액을 DPBS로 희석하여 농도를 조절할 수 있다.

한편, 본 발명에 의한 마트리겔이 코팅된 플레이트는 마트리겔의 농도에 따라 신경줄기세포 뿐만 아니라 다양한 줄기세포의 체외배양을 위해서 사용될 수 있고, 신경줄기세포에 한정하여서만 사용될 수 있는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 신경줄기세포 배양방법은 피더세포(feeder cell)를 포함하지 않고, 마트리겔(matrigel)이 코팅된 플레이트를 이용하여 배양하는 것을 일 특징으로 한다.

상기 마트리겔이 코팅된 플레이트는 다양한 농도의 마트리겔이 코팅된 것을 사용할 수 있고, 바람직하게는 0.02 내지 0.5% 농도의 마트리겔이 코팅된 플레이트를 사용하는 것이고, 더욱 바람직하게는 0.02% 농도의 마트리겔이 코팅된 플레이트를 사용하는 것이다. 상기 마트리겔은 1%의 마트리겔 용액을 DPBS로 희석하여 농도를 조절할 수 있다.

한편, 본 발명의 신경줄기세포 배양방법은 배양대상이 되는 줄기세포의 종류에 따라 다양한 농도의 마트리겔이 코팅된 플레이트를 사용할 수 있고, 신경줄기세포에 한정하여서만 사용될 수 있는 배양방법은 아니다.

상기와 같은 본 발명은 세포배양시 플레이트를 코팅하기 위한 재료로써 주로 사용되고 있는 라미닌(laminin)을 대체할 수 있는 매트릭스(marix) 및 최적화된 농도를 제공함으로써, 신경줄기세포의 다분화능을 유지시키면서 경제적인 방법으로 체외에서 대량배양 및 장기배양을 가능하게 할 수 있는 효과가 있다.

도 1 은 0.1% 젤라틴, 라미닌, 0.01-1.0% 마트리겔이 코팅된 플레이트에 펼쳐진(expanded) 신경줄기세포의 형태를 나타낸 것이다(배양접시 표면의 신경줄기세포를 위상차 현미경(phase contrast microscope)를 이용하여 관찰한 것이다, 0.01% 젤라틴과 0.01% 마트리겔은 신경줄기세포의 부착을 유지시킬 수 없었기 때문에 신경줄기세포의 부착을 유지시킬 수 있는 최소한의 마트리겔 농도는 0.02%이다).(scale bars : 100㎛)
도 2 는 신경줄기세포의 증식을 나타낸 그래프이다(총 세포 수(A)와 생존 세포 수(B)는 6번째 계대까지 각 계대마다 세포수를 센 것이다. 0.02% 마트리겔(M)은 라미닌과 유사하게 신경줄기세포를 증식시킬 수 있음을 나타낸다).
도 3 은 신경줄기세포의 세포 및 분자적 특성을 나타낸 것이다((a)신경줄기세포 특이적 유전자 발현을 확인한 RT-PCR 분석결과이다. Line 1 : murine embryonic fibroblasts(MEF), Line 2 : laminin, Line 3-9 : Matrigel, (b)신경줄기세포 특이적 마커인 Sox2(green), Nestin(red), DAPI(blue)의 면역세포화학 분석 결과를 나타낸 것이다).(scale bars : 50㎛).
도 4 는 0.02% 마트리겔에서 배양된 신경줄기세포의 다분화능을 나타낸 것이다(뉴런(neurons) 특이적 마커 Tuj1(red), Map2(red), 성상교세포(astrocytes) 특이적 마터 GFAP(green), 희돌기교세포(oligodendrocytes) 특이적 마커 O4(red)) (뉴런, 성상교세포, scale bars : 100㎛; 희돌기교세포, scale bars : 50㎛).

상술한 목적, 특징 및 장점은 첨부된 도면을 참조하여 후술되어 있는 상세한 설명을 통하여 보다 명확해질 것이며, 그에 따라 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 본 발명의 기술적 사상을 용이하게 실시할 수 있을 것이다. 또한, 본 발명을 설명함에 있어서 본 발명과 관련된 공지기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에 그 상세한 설명을 생략하기고 한다. 이하, 첨부된 도면들을 함께 참조하여 본 발명에 따른 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다.

실시예 1. 매트릭스 준비(matrix preparation)

마트리겔(matrigel, BD Biosciences) 또는 라미닌(laminin, Sigma-Aldrich)으로 플레이트를 코팅하였으며, 코팅시 사용된 마트리겔의 제조과정과 플레이트 코팅과정을 구체적으로 살펴보면 아래와 같다.

(1) 마트리겔 코팅

마트리겔 병을 4℃ 냉장고에서 액체가 될 때까지 하룻밤 동안 해동시키고, 마트리겔을 300㎕로 나누어 -20℃에서 보관하였다.

마트리겔이 코팅된 플레이트를 준비하기 위해 마트리겔 300㎕를 29㎖의 DMEM/F12 배지(Invitrogen)에 희석하여 1% 마트리겔 용액을 준비하였고, 1% 마트리겔 용액을 DPBS(dulbecco's phosphate-buffered saline, Hyclone)으로 희석하여 0.5, 0.25, 0.1, 0.02, 0.01%의 마트리겔 용액을 준비하였다.

상기 마트리겔 용액을 12-웰 플레이트(웰당 1㎖) 또는 24-웰 플레이트(웰당 0.5㎖)에 가하여 웰 전체 표면을 커버한 후, 15분간 37℃의 세포 배양 인큐베이터(cell culture incubator)에서 보관하였다.

이후, 애스퍼레이션(asperation)을 통해 초과된 잔여 마트리겔 용액을 제거하고 DMEM/F12로 플레이트를 한 번 세척하였다.

(2) 라미닌 코팅

라미닌 저장용액(1㎎/㎖)을 50㎕로 나누어 -20℃에서 보관하였다.

DPBS가 함유된 저장용액으로 희석한 라미닌 워킹 용액(20㎍/㎖)을 12-웰 플레이트(웰당 1㎖) 또는 24-웰 플레이트(웰당 ㎖)로 가하여 준비한 후 2시간 동안 37℃의 세포 배양 인큐베이터(cell culture incubator)에서 보관하였다.

이후, 초과된 잔여 라미닌 용액을 제거한 후 DPBS로 플레이트를 두 번 세척하였다.

실시예 2. 세포배양(cell culture)

신경줄기세포는 C57BL6/N(KoaTech)의 fetus(embryonic day 14.5일) 전뇌(forebrain)로부터 얻었고, 상기 실시예 1에 의해 준비된 마트리겔 또는 라미닌 이 코팅된 12-웰 플레이트(웰당 1.5×10⁵ cells) 또는 24-웰 플레이트(0.75×10⁵ cells)에서 배양하였다.

배지는 DMEM/F12 배지를 사용하였으며, 1×N2 supplement(Invitrogen), 1×비필수 아미노산(Invitrogen), 0.1% 메르캅토에탄올(Invitrogen), 1×페니실린/스트렙토마이신(Welgene), 10ng/㎖ 인간 bFGF(human basic fibroblast growth factor)(Peprotech), 10ng/㎖ 마우스 EFG(mouse epidermal growth factor)(Peprotech)를 supplement로 공급하였다.

5% CO₂ 및 37℃의 온도조건에서 세포를 배양하였으며, 배지는 2일 마다 교체해 주었다.

한편, 신경줄기세포의 증식여부는 6번째 계대까지 각 계대마다 생존 세포(viale cell)의 수를 확인하여 결정하였다.

실험예 1. 신경줄기세포의 부착 및 증식에 있어서 마트리겔의 영향

상기 실시예 1에 의해 준비된 다양한 농도(0.5%, 0.25%, 0.1%, 0.02%, 0.01%)의 마트리겔로 코팅된 12-웰 플레이트에 신경줄기세포를 접종하여 신경줄기세포의 부착 및 증식에 있어서 마트리겔의 영향을 평가하였다.

그 결과 신경줄기세포의 부착(attachment)을 위상차 현미경(phase contrast microscope)으로 확인한 도 1에 나타낸 바와 같이, 0.01% 마트리겔과 0.01% 젤라틴을 제외하고 모든 실험조건에서 신경줄기세포의 2D 증식(2-dimensional expansion))이 가능한 세포형태를 나타내었다. 즉, 0.01% 젤라틴 또는 0.01% 마트리겔이 코팅된 플레이트에서 신경줄기세포의 부착 및 증식이 이루어지지 않았다.

또한, 신경줄기세포의 증식에 대한 실험결과는 도 2에 나타낸 바와 같이 0.02-1.0%의 라미닌과 마트리겔에서 각 계대에서 얻을 수 있는 신경줄기세포의 수는 바로 직전 계대에서의 신경줄기세포 수에 비하여 약 10배가 증가되었다.

0.01% 젤라틴과 0.01% 마트리겔에서는 신경줄기세포의 증식이 불가능했던 것에 비하여(도 2A) 0.02-1.0% 마트리겔에서의 계대배양시 모든 계대에서 86-96%의 세포가 생존가능한 세포로 남아있었다(도 2B).

한편, 0.02% 마트리겔을 사용한 경우와 비교하여 0.05-1.0%의 마트리겔(또는 라미닌)을 사용한 경우에 세포 2D 증식 및 성장의 측면에서 주목할 만한 현저한 차이를 보이지 않았다.

실험예 2. RT-PCR 분석(RT-PCR analysis) 및 면역 세포 화학 분석(immunocytochemistry analysis)

(1) RT-PCR 분석

총 RNA를 RNeasy Mini Kit(Qiagen)을 이용하여 분리하고, 총 RNA 500ng을 전체 부피 20㎕에서 Omniscript RT Kit(Qiagen)를 사용하여 cDNA(complementary DNA)로 역전사 시켰고, PCR 증폭은 유전자 특이적 프라이머(표 1)와 Takara Ex Taq DNA 중합효소를 이용하여 수행하였다.

PCR은 94℃에서 30초 동안, 50-65℃에서 30초 동안, 72℃에서 30초 동안 32사이클로 실시하였고, RT-PCR에 의한 결과물은 1% 아가로스 겔(agarose gel)에서 전기영동으로 분석하였고, GelRed(Komabiotech) DNA 염색으로 시각화 하였다.

(2) 면역 세포 화학 분석

세포를 실온에서 15분 동안 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)(Sigma-Aldrich)에서 고정시킨 후에 DPBS로 3번 세척하였다.

그 다음 0.5% Triton X-100(Sigma-Aldrich), 1% 소혈청알부민(bovine serum albumin, BSA) fraction Ⅴ(Sigma-Aldrich), 10% 소태아혈정(fetal bovine serum)를 포함하는 DPBS를 이용하여 실온에서 10분 동안 배양하였다.

상기 배양한 세포를 DPBS로 세척한 후 1차 항체(primary antibodies)를 처리한 다음에 4℃의 온도조건에서 하룻밤 동안 또는 실온에서 1시간 동안 배양하였다.

상기 1차 항체는 mouse monoclonal anti-Nestin(R&D Systems, 1:500), rabbit polyclinal anti-Sox2(Millipore, 1:500), mouse monoclonal anti-Tuj1(Chemicon, 1:200), mouse monoclonal anti-Map2(Signa, 1:200), mouse monoclonal anti-GFAP(Santa Cruz Biotechnology, 1:200), mouse monoclonal anti-O4(R&D Systems, 1:200)를 사용하였다.

배양을 한 후 세포를 PBS에서 0.5% BSA로 세척한 다음 2차 항체를 처리하고 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 상기 2차 항체는 anti-mouse IgG(Cell signaling Technologies, 1:200) 또는 anti-rabbit IgG(Cell signaling Technologies, 1:200)를 사용하였다.

(3) 실험결과

마트리겔 및 라미닌에서의 신경줄세포 배양은 RT-PCR 분석 및 면역세포화학분석(Immunocytochemistry)에 의해 특징지어 진다.

RT-PCR 분석결과는 도 3a에 나타낸 바와 같이, 0.02% 마트리겔에서의 신경줄기세포 성장은 고농도의 마트리겔 및 라미닌에서 배양한 경우와 비교하여 신경줄기세포 특이적 유전자인 Sox2, Pax6, Nestin, Olig2, Fabp, Glast의 발현에 있어서 차이가 전혀 없음을 보여준다.

또한, 도 3b에서 알 수 있듯이 면역세포화학(Immunocytochemical) 염색은 0.02% 마트리겔에서 신경줄기포의 성장을 나타내는 마커 단백질(marker protein)인 Sox2와 Nestin의 균일한 발현을 보여주고 있으며, 라미닌에서 배양한 경우와 차이점이 전혀 나타나지 않았다.

상기와 같은 결과는 0.02% 마트리겔은 신경줄기세포의 증식에 충분히 활용할 수 있고, 이러한 측면에서 라미닌과 유사한 역할을 수행함을 나타낸다.

실험예 3. 신경줄기세포의 체외 분화(in vitro differentiation of neural stem cell)

신경줄기세포는 뉴런(neurons), 성상교세포(astrocytes) 및 희돌기교세포(oligodendrocytes)와 같은 3가지 신경세포 타입으로 분화된다. 본 발명에서 0.02% 마트리겔에서 증식시킨 신경줄기세포의 분화능력을 평가하기 위해 신경줄기세포를 3개의 다른 타입의 신경세포인 뉴런(neurons), 성상교세포(astrocytes) 및 희돌기교세포(oligodendrocytes)로 분화시켰고, 구체적은 과정은 다음과 같다.

(1) 라미닌 또는 0.02% 마트리겔이 코팅된 4-웰 플레이트에 웰당 40,000 cells 밀도로 신경줄기세포를 접종하였다.

(2) 다음날 뉴런(neurons)으로 분화시키기 위해서,

배지를 1×B27 supplement(Invitrogen), 0.5×N2 supplement, 20ng/㎖ 인간 bFGF(human basic fibroblast growth factor)를 포함하는 DMEM/F12 배지로 바꾸었고, 배지는 2일 마다 교체해 주었다.

4일 후, 1×B27 supplement(Invitrogen), 0.5×N2 supplement를 포함하는 DMEM/F12 배지로 바꾸어 일주일간 배양하였다.

(3) 한편, 성상교세포(astrocytes)로 분화시키기 위해서,

배지를 10% 소태아혈정(fetal bovine serum)(Invitrogen), 1×비필수아미노산 솔루션, 20ng/㎖ 인간 bFGF(human basic fibroblast growth factor), 20ng/㎖ 마우스 EFG(mouse epidermal growth factor), 1×페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 DMEM/F12 배지로 바꾸어 4일 동안 배양하였고, 배지는 2일 마다 교체해 주었다.

(4) 또한, 희돌기교세포(oligodendrocytes)로 분화시키기 위해서,

배지를 2% B27 supplement, 1×L-글루타민(L-glutamine)(Gibco), 30ng/㎖ 트리아이오딘티로닌(triiodothyronine, T3)(Sigma-Aldrich)을 포함하는 Neurobasal 배지로 바꾸어 일주일 동안 배양하였고, 배지는 2일 마다 교체해 주었다.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이 뉴런으로 분화된 경우 뉴런의 마커인 MAP2와 Tuj1의 발현을 확인할 수 있었고, 성상교세포(astrocytes) 및 희돌기교세포(oligodendrocytes)로의 분화는 각각의 마커인 GFAP와 O4의 발현을 확인하였다.

상기와 같은 결과를 통해 0.02% 마트리겔에서 배양된 신경줄기세포의 분화능력이 라미닌에서 배양된 신경줄기세포와 비교하여 아무런 차이가 없음을 알 수 있었다.

상기의 실험결과 통해 0.02% 마트리겔에서 배양된 신경줄기세포는 체외에서(in vitro) 3가지 타입의 주요 신경세포로 분화할 수 있음을 알 수 있었고, 이는 신경줄기세포의 다분화능(multipotency)를 나타낸다.

모든 데이터는 평균±SEM으로 표시하였고, GraphPad Prism software, version 5.00(GraphPad software Inc., La Jolla, CA)을 사용하여 분석하였다.

실시예 3. 고찰

신경줄기세포는 퇴행성 신경질환의 세포치료(cell replacement therapies) 및 신경질환 치료를 위한 약물 스크리닝에 활용될 수 있는 잠재적인 가능성이 있다. 이러한 신경줄기세포의 응용을 위해서는 안정적이고 대량의 세포배양이 요구되는데, 신경줄기세포의 증식을 위해서는 세포를 쉽게 모니터링 할 수 있고 호모제너스 파퓰레이션(homogenous population)을 유지할 수 있는 2D-부착배양(adherent 2-dimentional culture)이 뉴로스피어(neurosphere) 배양보다 적절한 방법이다.

한편, 신경줄기세포의 2D-부착배양을 위해서 ECM, protein, 라미닌이 플레이트를 코팅하기 위한 재료로 주로 사용되고 있으나, 라미닌은 고가일 뿐만 아니라 코팅시간이 최소 1시간 이상이 요구된다. 이에 비용을 절감하고 코팅시간을 단축시키기 위해서 신경줄기세포를 2D-부착배양하기 위한 효율적인 대체 매트릭스(matrix)을 제공하고자 하는 것이 본원발명의 목적이다. 즉, 본 발명에 의한 마트리겔이 코팅된 플레이트를 이용하여 신경줄기세포를 배양할 경우 플레이트를 코팅하기 위한 시간이 10 내지 20분 내외로 소요되기 때문에 신경줄기세포의 체외배양 및 분화에 있어서 라미닌과 동일 또는 유사한 환경을 제공함에도 코팅시간을 최대 1/6 내지 최소 1/3로 단축시킬 수 있어, 결론적으로 세포배양을 위한 전체적인 공정시간을 현저하게 단축시킬 수 있는 장점이 있다.

마트리겔은 인간 배아줄기세포(human embryonic stem cell)와 인간으로부터 유래한 다분화능(pluripotent) 줄기세포와 같은 다분화능 줄기세포의 부착배양에 사용되어 오고 있었고, 최근 본 발명자들은 마트리겔을 이용하여 마우스 정원줄기세포(mouse spermatogonial stem cell)를 증식 및 장기배양 할 수 있음을 확인한 바 있다(한국특허출원 제10-2014-0034632호).

한편, 마트리겔은 인간 ESC, iPSC 및 마우스 SSC의 유지(maintenance)를 위해서 사용될 수 있다고 알려져 있으나, 상기의 세포들을 저장하기 위해서는 10% 농도의 마트리겔이 사용되었다. 고농도의 마트리겔을 사용함으로써 비용적인 측면에서 라미닌과 비교하여 경제적인 이점이 전혀 없었다.

이에, 본 발명자들은 종래 신경줄기세포의 체외 배양에 전혀 사용된바 없는 마트리겔을 사용하였을 뿐만 아니라 다양한 농도의 마트리겔을 평가하여 신경줄기세포의 부착 및 증식을 위해서 가장 최적화된 마트리겔의 농도를 실험적으로 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

그 결과 0.02% 마트리겔이 비용 대비 최적의 농도인 것으로 나타났으며, 마트리겔을 이용하여 배양된 신경줄기세포는 라미닌에서 배양된 신경줄기세포와 유사하게 일반적인 신경줄기세포에서 발현되는 유전자, 단백질, 마커가 나타나고, 증식비율도 유사하였다.

또한 0.02% 마트리겔이 신경줄기세포가 3가지 타입의 신경세포로 분화할 수 있는 환경을 제공해줄 수 있음을 실험적으로 확인하였다. 0.02% 마트리겔은 뉴런(neurons)과 신경교세포(glial cell)로의 분화에 있어서 라미닌과 동일한 효율을 보였을 뿐만 아니라 비용 및 코팅시간의 측면에서는 그 효율이 라미닌보다 우수함을 알 수 있었다.

마트리겔을 이용한 신경줄기세포의 배양은 라미닌을 이용한 경우와 비교하여 비용적으로 매우 경제적이며, 0.02% 마트리겔을 사용할 경우 마트리겔 스탁(matrigel stock) 1㎖는 플레이트를 40회 코팅하기에 충분하다. 동일한 양의 신경줄기세포 체외배양 및 분화를 위해서 요구되는 라미닌과 비용을 비교하였을 때 본 발명에 의한 0.02% 마트리겔이 코팅된 플레이트를 사용할 경우 라미닌 사용시 소요되는 비용대비 1/50 정도만이 소요되기 때문에 경제적으로 매우 유리한 측면이 있다. 더욱이, 간단한 배지의 교체만으로 0.02% 마트리겔에서 신경줄기세포의 분화가 가능하기 때문에 분화를 유도하기 위해서 플레이트를 변경할 필요가 없다.

결론적으로, 본 발명은 라미닌 코팅과 비교하여 비용을 현저하게 줄일 수 있는 0.02% 마트리겔을 사용하여 ECM 물질(material)을 코팅한 플레이트에서 신경줄기세포의 2D-증식 시킬 수 있는 최적화된 방법을 제공한다.

0.02% 마트리겔에서 배양된 신경줄기세포는 세포 및 분자 특성과 다분화능을 유지하고 있었다.

따라서 마트리겔을 이용한 신경줄기세포의 배양 및 분화는 경제적으로 매우 유용할 뿐만 아니라 대규모 배양에도 매우 적합하다는 것을 알 수 있었다.

이상에서 설명한 본 발명은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 여러 가지 치환, 변형 및 변경이 가능하므로 전술한 실시예 및 첨부된 도면에 의해 한정되는 것은 아니다.

Claims

피더세포(feeder cell)를 포함하지 않고, 0.02% 내지 0.5% 마트리겔(matrigel)이 코팅된 것을 특징으로 하는 신경줄기세포(neural stem cell) 배양용 플레이트.
삭제
제 1 항에 있어서,
0.02% 마트리겔이 코팅된 것을 특징으로 하는 신경줄기세포 배양용 플레이트.
피더세포(feeder cell)를 포함하지 않고, 0.02% 내지 0.5% 마트리겔(matrigel)이 코팅된 플레이트를 이용하여 신경줄기세포를 배양하는 방법.
삭제
제 4 항에 있어서,
0.02% 마트리겔이 코팅된 것을 특징으로 하는 신경줄기세포 배양 방법.