KR101636966B1 - 배아줄기세포로부터 신경교전구세포, 성상세포 및 희소돌기 아교세포로의 분화방법 - Google Patents
배아줄기세포로부터 신경교전구세포, 성상세포 및 희소돌기 아교세포로의 분화방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 배아줄기세포로부터 신경교전구세포, 성상세포 및 희소돌기아교세포로의 분화방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 배아줄기세포로부터 신경교전구세포, 성상세포 및 희소돌기아교세포로의 분화방법을 이용할 경우, 수득된 신경교전구세포의 지속적인 배양이 가능하며, 상기 신경교전구세포는 성상세포 및 희소돌기 아교세포로의 분화가 가능하여 이와 관련된 독성물질의 스크리닝 및 독성평가에 유용하게 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 배아줄기세포로부터 신경교전구세포, 성상세포 및 희소돌기 아교세포로의 분화방법에 관한 것이다.
줄기세포(stem cell)는 생물 조직을 구성하는 생물을 다양한 세포들로 분화할 수 있는 세포로서 배아, 태아 및 성체의 각 조직에서 얻을 수 있는 분화(differentiation)되기 전 단계의 미분화 세포들을 총칭한다. 줄기세포는 분화 자극(환경)에 의하여 특정 세포로 분화가 진행되며, 세포분열이 정지된 분화된 세포와는 달리 세포분열에 의해 자신과 동일한 세포를 생산(self-renewal)할 수 있어 증식(proliferation; expansion)하는 특성이 있으며, 다른 환경 또는 다른 분화 자극에 의해 다른 세포로도 분화될 수 있어 분화에 유연성(plasticity)을 가지고 있는 것이 특징이다.
줄기세포는 크게 배아(embryo)에서 얻어지고 모든 세포로 분화될 수 있는 잠재력(totipotent)을 지닌 전분화능(pluripotency)의 배아줄기세포(embryonic stem cell, ES cell)와 각 조직에서 얻어지는 다분화능(multipotency)의 성체줄기세포(adult stem cell)로 구분된다. 배아발생 초기인 포배기(blastocyte)의 세포내괴(inner cell mass)는 장차 태아를 형성할 부분으로서 이 세포내괴로부터 형성된 배아줄기세포는 이론적으로 한 개체를 구성하는 모든 조직의 세포로 분화될 수 있는 잠재력을 지닌 줄기세포이다. 즉, 배아줄기세포는 무제한적으로 증식이 가능한 미분화 세포이고, 모든 세포로 분화할 수 있으며, 성체줄기세포와 달리 배(germ) 세포도 만들 수 있어 다음세대로 유전될 수 있다. 이에 반하여, 태아 발생과정이 진행되어 각 조직이 형성되는 과정에서 도입되면 각각의 조직에는 그 조직에 특이적인 줄기세포(tissue specific stem cells; primary stem cells)가 존재하여 각 조직을 형성하는 분화 과정에 참여하게 된다. 이와 같이 조직 특이적 줄기세포는 일반적으로 분화할 수 있는 그 분화능력이 그 조직을 구성하는 세포로만 한정되게 되며(multipotent or unipotent), 성인이 된 후에도 대부분의 조직에는 각 조직에 특이적인 줄기세포가 남아 있게 되어 정상적 또는 병리적으로 발생하는 세포의 손실을 보충하게 된다.
따라서, 배아줄기세포로부터 신경교전구세포, 성상세포 및 희소돌기 아교세포로의 분화방법은 여러 연구에 이용될 수 있어 그 중요성이 매우 크며, 본 발명자들은 지속적인 배양이 가능한 신경교전구세포를 확립하는 방법을 개발함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 배아줄기세포로부터 신경교전구세포, 성상세포 및 희소돌기 아교세포로의 분화방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 과제를 해결하기 위해, 본 발명은
1) 배아줄기세포를 배양하여 배상체를 형성하는 단계;
2) 상기 1)단계의 배상체를 단일 세포로 분리한 후, 분리된 단일 세포를배양하여 신경전구세포의 생성을 유도하는 단계;
3) 상기 2)단계의 신경전구세포를 추가 배양한 후 단일 세포로 분리하고 이를 5 내지 40회 계대 배양하는 단계;를 포함하는 배아줄기세포로부터 신경전구세포로의 분화방법을 제공한다.
또한 본 발명은, 상기 방법으로 분화된 신경교전구세포를 제공한다.
또한 본 발명은, 상기 신경교전구세포를 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS), 글루타멕스-1(glutamax-1) 첨가제 및 N2를 포함하는 DMEM 배지에서 8 내지 12일 동안 배양하는 단계를 포함하는, 신경교전구세포로부터 성상세포로의 분화방법을 제공한다.
또한 본 발명은, 상기 신경교전구세포를 T3, 글루타멕스-1 첨가제 및 B27을 포함하는 신경 기저 배지(neurobasal medium)에서 8 내지 12일 동안 배양하는 단계를 포함하는, 신경교전구세포로부터 희소돌기 아교세포로의 분화방법을 제공한다.
본 발명에 따른 배아줄기세포로부터 신경교전구세포, 성상세포 및 희소돌기아교세포로의 분화방법을 이용할 경우, 수득된 신경교전구세포의 지속적인 배양이 가능하며, 상기 신경교전구세포는 성상세포 및 희소돌기 아교세포로의 분화가 가능하여 이와 관련된 독성물질의 스크리닝 및 독성평가에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 마우스 배아줄기세포로부터 신경교전구세포로의 분화 유도과정을 간략히 나타낸 도이다.
도 2는 신경줄기세포의 신경 특이 마커 발현 양상을 확인하기 위해 면역 화학 분석하여 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 도이다(마커: 녹색, 핵염색: 파란색).
도 3은 신경교전구세포의 계대배양 가능 여부 및 형태학적 특징을 확인하기 위해 면역 화학 분석하여 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 신경교전구세포의 특이적 olig2 발현 양상을 확인하기 위해 면역 화학 분석하여 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 도이다(면역 형광 사진, olig2: 녹색, 핵염색: 파란색).
도 5는 신경교전구세포의 LIF 의존적 세포증식 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 신경교전구세포를 계대 수에 따라 면역 화학 분석하여 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 계대에 따른 신경교전구세포의 변화를 RT-PCR을 이용하여 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 신경교전구세포로부터 성상세포(astrocyte)로의 분화에 따른 분화지표 유전자 변화를 RT-PCR로 확인하고 그 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 신경교전구세포로부터 희소돌기 아교세포로의 분화에 따른 분화지표 유전자 변화를 RT-PCR로 확인하고 그 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 신경줄기세포의 신경 특이 마커 발현 양상을 확인하기 위해 면역 화학 분석하여 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 도이다(마커: 녹색, 핵염색: 파란색).
도 3은 신경교전구세포의 계대배양 가능 여부 및 형태학적 특징을 확인하기 위해 면역 화학 분석하여 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 신경교전구세포의 특이적 olig2 발현 양상을 확인하기 위해 면역 화학 분석하여 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 도이다(면역 형광 사진, olig2: 녹색, 핵염색: 파란색).
도 5는 신경교전구세포의 LIF 의존적 세포증식 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 신경교전구세포를 계대 수에 따라 면역 화학 분석하여 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 계대에 따른 신경교전구세포의 변화를 RT-PCR을 이용하여 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 신경교전구세포로부터 성상세포(astrocyte)로의 분화에 따른 분화지표 유전자 변화를 RT-PCR로 확인하고 그 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 신경교전구세포로부터 희소돌기 아교세포로의 분화에 따른 분화지표 유전자 변화를 RT-PCR로 확인하고 그 결과를 나타낸 도이다.
본 발명은,
1) 배아줄기세포를 배양하여 배상체를 형성하는 단계;
2) 상기 1)단계의 배상체를 단일 세포로 분리한 후, 분리된 단일 세포를배양하여 신경줄기세포의 생성을 유도하는 단계;
3) 상기 2)단계의 신경줄기세포를 추가 배양한 후 단일 세포로 분리하고 이를 5 내지 40회 계대 배양하는 단계를 포함하는 배아줄기세포로부터 신경교전구세포로의 분화방법을 제공한다.
또한 본 발명은, 상기 방법으로 분화된 신경교전구세포를 제공한다.
상기 배아줄기세포는 인간, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 개, 고양이, 마우스 및 토끼로 이루어진 군으로 선택된 1종 이상으로부터 유래하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 배아줄기세포로부터 신경교전구세포로의 분화방법에 대해 단계별로 상세히 설명하면 다음과 같다.
상기 1) 단계는 배아줄기세포로부터 배상체를 형성하는 단계로, 배아줄기세포를 소태아혈청 (fetal calf serum), 2-머캅토에탄올 (2-mercaptoethanol), L-글루타민, 비필수 아미노산, 페니실린, 스트렙토마이신 및 레티노 산을 포함하는 DMEM(Dulbeco's modified eagle's medium) 배지에서 4 내지 7일 동안 배양함으로서 배상체를 형성할 수 있다.
상기 2) 단계는 배상체로부터 신경줄기세포로의 생성을 유도하는 단계로, 상기 1) 단계에서 수득한 배상체를 단일 세포로 분리한 후, 분리된 단일 세포를 N2이 첨가된 DMEM/F12 배지 및 B27이 첨가된 신경 기저 배지(neurobasal medium supplemented with B27)를 포함하는 N2/B27 배지에서 5 내지 9일 동안 배양함으로서 신경줄기세포의 생성을 유도할 수 있다.
상기 3) 단계는 신경줄기세포를 추가 배양한 후 단일 세포로 분리하여 5 내지 40회 계대배양하여 신경교전구세포를 얻는 단계로, 상기 계대배양은 29회 실시하는 것이 바람직하다. 상기 추가 배양은 5 내지 9일 배양한 후 단일 세포로 분리한다. 상기 추가배양은 1 내지 3회 실시할 수 있다. 또한, 계대 배양은 FGF-2(Fibroblast growth factor), EGF (Epidermal growth factor) 및 LIF(leukemia inhibitory factor)를 포함하는 N2/B27 배지에서 배양하는 것이 바람직하다.
또한 본 발명은, 상기 신경교전구세포를 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS), 글루타맥스-1 첨가제 및 N2를 포함하는 DMEM 배지에서 8 내지 12일 동안 배양하는 단계를 포함하는, 신경교전구세포로부터 성상세포로의 분화방법을 제공한다.
상기 성상 세포는 신경교전구세포에 비해 GFAP(glial fibrillary acidic protein), galC(Galactocerebrosidase) 및 olig2(oligodendrocyte lineage transcription factor 2)의 발현은 증가하고, Tuj1(neuronal class III beta tubulin)의 발현은 감소한다.
또한 본 발명은, 상기 신경교전구세포를 T3, 글루타멕스-1 첨가제 및 B27를 포함하는 신경 기저 배지(neurobasal medium)에서 8 내지 12일 동안 배양하는 단계를 포함하는, 신경교전구세포로부터 희소돌기 아교세포로의 분화방법을 제공한다.
상기 희소돌기 아교세포는 GFAP, galC 및 olig2의 발현은 증가하고, Tuj1의 발현은 감소한다.
이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 마우스 배아줄기세포로부터 신경전구세포로의 분화 유도
마우스 배아줄기세포로부터 신경교전구세포로의 분화유도 과정을 간략히 도 1에 나타내었다.
실시예 1-1. 배상체 형성
마우스 배아줄기세포를 배상체 분화배지에서 배양하여 배상체로의 분화를 유도하였다.
보다 구체적으로, 마우스 배아줄기세포(NVRQS 11F)를 2×104개/ml 농도로 배상체(embryoid body, EB) 분화 배지에 넣어 5~6일 동안 37℃, 5%의 CO2가 유지되는 배양기에서 배양하였다. 상기 배상체 분화 배지는 20% 소태아혈청(fetal calf serum), 0.1mM 2-머캅토에탄올(2-mercaptoethanol), 2 mM L-글루타민, 0.1 mM MEM 비필수아미노산(mininal essential medium nonessential amino acid), 엠브리오맥스 뉴클레오시드(EmbryoMax nucleosides) 및 50 U/ml 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 DMEM(Dulbeco's modified eagle's medium)이며, 10-8M의 레티노 산(retinoic acid)을 첨가하였다.
실시예 1-2. 배상체에서 신경줄기세포로의 분화 유도
상기 실시예 1-1에서 분화된 배상체를 단일 세포로 분리(single cell dissociation) 시킨 후 7일 동안 신경줄기세포 유도 분화 배지에 추가 배양하여, 신경줄기세포로의 분화를 유도시켰다. 상기 신경줄기세포 유도 분화 배지는 N2 (Gibco 17502-048)이 첨가된 DMEM/F12 기반 배지 50% 및 B27(Gibco 17504-044)이 첨가된 신경 기저 배지(neurobasal medium supplemented with B27) 50%를 포함하는 N2/B27 배지이다. 상기 신경줄기세포 유도 분화 배지에 배상체를 접종하고, 37℃, 5%의 CO2가 유지되는 배양기에서 배양하여 신경줄기세포를 수득하였다.
실시예 1-3. 신경줄기세포의 면역 화학 분석
상기 실시예 1-2에서 수득한 신경줄기세포가 정상적으로 분화되었는지 확인하기 위하여, 면역 화학 분석을 실시하였다. 이때 신경줄기세포는 상기 실시예 1-1의 배상체 분화배지로 5 내지 6일 분화를 유도하고 이를 단일 세포로 분리한 후 다시 7일간 분화하여, 총 12~13일 배양한 신경줄기세포를 이용하였다.
보다 구체적으로, 배양액을 걷어내고 신경줄기세포를 PBS 완충액으로 세척한 후 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)에 25분간 고정하였다. 이를 세척 완충액 (rinse buffer)(0.04% 트윈 20(tween 20)이 첨가된 트리스 완충액(Tris buffer))으로 세척하고 0.1% 트리톤(Triton)-X-100/PBS로 투과(permeabilization)한 후 세척 완충액으로 다시 세척하였다. 4% 정상 산양 혈청(normal goat serum)이 포함된 블로킹 완충액(blocking buffer)으로 실온에서 30분간 반응시킨 후 하기 표 1에 나타낸 1차 항체를 1시간 동안 실온에서 반응시켰다. 세척 완충액으로 3회 세척 후 하기 표 1에 나타낸 2차 항체를 실온에서 1시간 동안 반응시키고 세척 완충액으로 3회 세척한 후 염색 시약(Hoechst33342, invitrogen)을 이용하여 1:10000으로 핵을 염색하였다. 형광현미경 (Axiovert 200M, Carl Zeiss)으로 염색을 확인하고 사진을 찍어 관찰하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.
| 항체 | 항체명 | Origin | 분화사 |
| 1차 항체 | 항-GFAP | rabbit poly igG | abcam |
| 항-Olig2 | rabbit poly igG | abcam | |
| 항-네스틴(Nestin) | rabbit poly igG | abcam | |
| 항-Choline Acetyltransferase | goat poly igG | abcam | |
| 항-lslet 1 | rabbit poly igG | abcam | |
| 항-HB9/HLX9 | sheep poly igG | abcam | |
| 항-Tyrosine Hydroxylas(TH) | rabbit poly | millipore | |
| 항-무사시(Musashi) | rabbit mono igG | millipore | |
| 항- PCNA | mouse mono igG2a | abcam | |
| 항-Sox2 | rabbit poly | millipore | |
| 항-Oct4 | mouse mono igG1 | millipore | |
| 항-β-Ⅲ Tubulin (Tuj1) | mouse mono igG2a | R&D system | |
| 2차 항체 |
항-Rabbit IgG - H&L (TRITC) | Chicken polyclonal | abcam |
| 항-Mouse IgG H&L (TRITC) | Goat polyclonal | abcam | |
| 항-Rabbit IgG - H&L (FITC) | Goat polyclonal | abcam |
배아줄기세포의 전분화능(pluripotency)을 나타내는 마커로는 Oct4, Sox2를, 신경줄기세포 마커로는 네스틴(Nestin) 및 무사시(musashi)를, 신경세포 마커로는 Tuj1(neuronal class III tubulin)을, 콜린성 신경세포 마커로는 HB9 및 Islet1을, 도파민성 신경세포 마커로는 TH를, 증식하는 세포의 마커로는 PCNA(proliferating cell nuclear antigen)를, 신경교세포 마커로는 olig2(oligodendrocyte lineage transcription factor 2)를, 성상세포 마커로는 GFAP(glial fibrillary acidic protein)를 이용하였다.
도 2에 나타난 바와 같이, 신경줄기세포 마커인 네스틴, 무사시 및 Sox2가 강하게 발현되고, 배아줄기세포 마커인 oct4의 발현은 분리된 세포에 따라 발현도가 다르게 나타나 배상체에서 신경줄기세포로의 분화가 정상적으로 이루어졌음을 확인하였다.
실시예 1-4. 신경줄기세포의 추가배양
상기 실시예 1-2에서 수득한 신경전구세포를 세포 배양 플라스크에 하나씩 옮겨 37℃, 5%의 CO2가 유지되는 배양기에서 7일간 추가적으로 배양하였다. 상기 배양 과정을 2회 반복한 후 단일세포로 분리시켜 배양하여 신경교전구세포를 유지 배양하였다.
보다 구체적으로, 상기 실시예 1-1에서 분화된 배상체를 단일세포로 분리한 후 이를 7일간 배양하여 신경줄기세포(neural stem cell)를 다수 포함하는 콜로니를 형성했으며, 상기 콜로니를 떼내어 배양하면 신경줄기세포에서 신경전구세포 (progenitor cell)로 분화되며, 그 후 신경으로 분화하는 전구세포 (neuronal progenitor cell)와 신경교세포로 분화하는 전구세포 (glial progenitor cell)로 분화됨을 확인하였다. 이 중 신경교전구세포를 수득하기 위하여 콜로니를 다른 배양 플레이트에 옮겨 7일간 추가적으로 배양하는 것으로 2회 반복 배양하였다.
또한, 단일층으로 자라는 세포가 배양 플레이트의 60~70%로 자랐을 때, accutase 혹은 trypsin/EDTA로 세포를 떼내고 적절한 세포 농도로 배양 플레이트에 다시 추가배양하였다.
그 결과, 단일층 (monolayer) 상태의 부착 세포 (adherent cell)로 증식함을 확인하였다. 또한, 지속적으로 추가 배양하여 4계대까지는 동일한 성상을 유지하는 것이 관찰되어 신경교전구세포의 계대배양이 가능함을 확인하였다.
실시예 2. 신경교전구세포의 계대배양 및 특징 확인
실시예 2-1. 신경교전구세포의 계대배양 및 면역 화학 분석
상기 실시예 1에서 확립된 신경교전구세포를 지속적으로 계대배양하여, 지속적인 계대배양의 가능 여부와 형태학적 특징 변화, 신경교전구세포로의 분화여부를 확인하기 위하여, 면역 화학 분석을 수행하였다.
보다 구체적으로, 상기 실시예 1에서 확립된 신경교전구세포를 N2/B27, 20ng/ml FGF-2(Fibroblast growth factor), 20ng/ml의 EGF (Epidermal growth factor) 및 1% LIF (Leukemia Inhibitory factor)를 포함하는 배지에 넣어 37℃, 5%의 CO2가 유지되는 배양기에서 배양하였다. 배지는 2일마다 0.25% 트립신(trypsin)-EDTA(Gibco)으로 세포를 부유시켜 계대배양 하였다.
상기 확립된 신경교전구세포의 특성 및 계대 후 형태학적 변화 여부를 확인하기 위하여, 2계대 배양한 신경전구세포를 상기 실시예 1-3과 같은 방법으로 면역 화학 분석을 실시하였다. 1차 항체로서 항-Oct4, 항-Sox2, 항-네스틴, 항-무사시 및 항-olig2를 이용하고 녹색으로 염색하였다. 2차 항체로는 상기 표 1에 기재되어 있는 것으로 사용하였다. 핵은 염색 시약(hoechst33342)을 이용하여 파란색으로 염색하였으며, 형광현미경으로 염색을 확인하였다. 그 결과를 도 3 및 4에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 신경줄기세포 마커인 네스틴 및 무사시가 현저히 발현됨을 확인하였고, 배아줄기세포 마커인 Oct4가 적게 발현됨을 확인하였다.
또한, 도 4에 나타낸 바와 같이, 신경교전구세포에서 희소돌기 아교세포 (oligodendrocyte)의 마커인 olig2가 현저하게 발현됨을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 신경교전구세포는 지속적인 계대배양이 가능하며 신경교전구세포로의 분화가 진행 된 세포주임을 확인하였다.
실시예 2-2. 신경전구세포의 LIF 성장인자 의존성 확인
상기 실시예 2-1 신경교전구세포의 LIF(Leukemia inhibitory factor) 성장인자 의존성을 확인하기 위하여, 신경교전구세포를 계대배양 시 1%의 LIF 성장인자를 추가하는 그룹과, 또는 추가하지 않은 그룹으로 나누었다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타난 바와 같이, LIF 성장인자를 제거하여 배양한 그룹에서 배양 후 4일부터 세포의 부착능이 현저히 감소하여 사멸됨을 확인하였다.
실시예 3. 신경교전구세포의 계대에 따른 신경교세포 계통(glial lineage) 양상 확인
실시예 3-1. 신경교전구세포의 계대 수에 따른 면역 화학 분석
상기 실시예 2-1의 계대배양 방법을 이용하여, 신경교전구세포의 계대에 따른 분화지표 단백질 마커 발현 및 변화를 확인하기 위한 면역 화학 분석을 실시하였다.
상기 실시예 1-3의 면역 화학 분석방법과 동일하게 수행하였으며, 1차 항체로 항-네스틴, 항-무사시, 항-Sox2, 항-Oct4를 사용하였고 2차 항체로 항-마우스 및 래빗 IgG FITC, TRITC 등을 사용하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다. 첫째줄은 17계대, 둘째줄은 20계대, 셋째줄은 23계대, 넷째줄은 26계대, 다섯째줄은 29계대한 것을 나타낸 것이다.
도 6에 나타난 바와 같이, 20계대 이후부터는 배아줄기세포 마커인 Oct4의 발현이 미약함을 확인하였고, 신경교전구세포 마커인 네스틴 및 무사시가 현저하게 발현됨을 확인하였다. 또한, 29계대까지 안정적으로 신경교전구세포 마커를 발현하는 신경교전구세포임을 확인하였다.
실시예 3-2. RT-PCR을 이용한 신경교전구세포 계대에 따른 유전자 발현 및 변화 확인
상기 실시예 2-1의 계대배양 방법을 이용하여, 신경교전구세포의 계대에 따른 분화지표 단백질 마커 발현 및 변화를 확인하기 위한 RT-PCR을 수행하였다.
보다 구체적으로, 신경교전구세포 유전자의 발현 여부를 확인하기 위하여, 각 계대 수 별 세포로부터 분리해 낸 전체 RNA 500 ng을 주형으로 사용하여 2단계 RT-PCR을 실시하였다. Accupower cycleScript RT premix 키트 (bioneer)를 사용하여 역전사(reverse transcription)를 실시하였고, 이를 이용하여 iQ SYBR Green supermix (Biorad) 로 real-time PCR을 수행하였다. PCR 반응에 사용한 프라이머 세트의 염기서열은 oct4 유전자 증폭의 경우 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머를, sox2 유전자 증폭의 경우 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머를, 네스틴 유전자 증폭의 경우 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 프라이머를, 무사시 유전자 증폭의 경우 서열번호 7 및 서열번호 8로 표시되는 프라이머를, TB3(Tuj1) 유전자 증폭의 경우 서열번호 9 및 서열번호 10으로 표시되는 프라이머를, GFAP 유전자 증폭의 경우 서열번호 11 및 서열번호 12로 표시되는 프라이머를, olig2 유전자 증폭의 경우 서열번호 15 및 서열번호 16으로 표시되는 프라이머를 이용하였다. 반응에 사용한 프라이머 세트의 염기서열은 하기 표 2에 나타내었다. PCR 기기는 iCycler thermal cycler (Biorad)를 이용하였으며 PCR 반응조건은 95℃에서 3분간 변성(denaturation)을 한 뒤 95℃에서 10초, 60℃에서 10초, 72℃에서 20초의 PCR 반응을 45번 반복하고, 95℃에서 1분간 중합(polymerization) 반응을 수행하였다. 대조군으로서 β-액틴의 발현 여부와 비교하였으며, 그 결과를 도 7에 나타내었다.
| 유전자명 | 유전자 방향 |
염기서열 | 서열번호 |
| oct4 | Forward | 5'-GAGAAGAGTATGAGGCT-3’ | 서열번호 1 |
| Backward | 5'-GAAGCCGACAACAATGA-3’ | 서열번호 2 | |
| sox2 | Forward | 5'-AAGGGTTCTTGCTGGGTTTT-3’ | 서열번호 3 |
| Backward | 5'-AGACCACGAAAACGGTCTTG-3’ | 서열번호 4 | |
| 네스틴 | Forward | 5'-CCAGAGCTGGACTGGAACTC-3’ | 서열번호 5 |
| Backward | 5'-ACCTGCCTCTTTTGGTTCCT-3’ | 서열번호 6 | |
| 무사시 | Forward | 5'-TAGTTCGAGGGACAGGCTCT-3’ | 서열번호 7 |
| Backward | 5'-GTTGAGGGACAGGCAGTAGC-3’ | 서열번호 8 | |
| TB3(tuj1) | Forward | 5'-GCCTTTGGACACCTATTCA-3’ | 서열번호 9 |
| Backward | 5'-AGTCACAATTCTCACACTCTT-3’ | 서열번호 10 | |
| GFAP | Forward | 5'-CTCCAAGATGAAACCAACCT-3’ | 서열번호 11 |
| Backward | 5'-CTCCTCCTCCAGCGATTC-3’ | 서열번호 12 | |
| Galc | Forward | 5'-CCAACCAACTACAAGGATGAT-3’ | 서열번호 13 |
| Backward | 5'-CAAACACGCCAGTCTGAT-3’ | 서열번호 14 | |
| olig2 | Forward | 5'-CTGCTGGCGCGAAACTACAT-3’ | 서열번호 15 |
| Backward | 5'-CGCTCACCAGTCGCTTCAT-3’ | 서열번호 16 |
도 7에 나타낸 바와 같이, 배아줄기세포 마커인 Oct4의 경우, 20계대 이후 급격히 감소함을 확인하였고, 신경전구세포 마커인 네스틴 및 무사시는 배아줄기세포에 비해 약간 증가된 양상을 보임을 확인하였다. 또한, 신경세포 마커인 TB3, 성상세포 마커인 GFAP 및 희소돌기 아교세포 마커인 Olig2은 현저히 높은 발현율을 나타냄을 확인하였다. 또한, 선발된 20 계대 이후의 세포는 신경교세포에 가까운 전구세포, 즉 신경교전구세포로 확인되었다.
실시예 4. 신경교전구세포의 신경교세포 계통으로의 분화능 확인
실시예 4-1. 성상세포(astrocyte)로의 분화
상기 실시예 2에서 확립된 신경교전구세포를 폴리-L-오르니틴으로 코팅된 플레이트에서 DMEM 배지, 글루타멕스-1 첨가물, N2 첨가물 및 FBS를 가하여 10일간 분화를 유도하고 상기 실시예 3과 같이 RT-PCR을 수행하였다. PCR 반응에 사용한 프라이머 세트의 염기서열은 네스틴 유전자 증폭의 경우 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 프라이머를, TB3 유전자 증폭의 경우 서열번호 9 및 서열번호 10으로 표시되는 프라이머를, GFAP 유전자 증폭의 경우 서열번호 11 및 서열번호 12로 표시되는 프라이머를, Galc 유전자 증폭의 경우 서열번호 13 및 서열번호 14으로 표시되는 프라이머를, olig2 유전자 증폭의 경우 서열번호 15 및 서열번호 16으로 표시되는 프라이머를 이용하였다. 반응에 사용한 프라이머 세트의 염기서열은 상기 표 2에 나타내었다. 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타낸 바와 같이, 성상세포로의 분화 시, 신경세포 마커인 TB3(Tuj1)의 발현은 감소함을 확인하였고, 신경전구세포 마커인 네스틴의 발현이 약간 증가하는 양상을 보임을 확인하였고, 신경교세포 계통 마커인 GFAP, galC 및 olig2의 발현이 현저히 증가함을 확인하였다.
실시예 4-2. 희소돌기 아교세포로 분화
상기 실시예 2에서 확립된 신경교전구세포를 폴리-L-오르니틴/라미닌으로 코팅된 플레이트에 신경 기질 배지(nerobasal medium), 글루타멕스-1 첨가물, B27 첨가물 및 T3을 첨가하여 10일간 분화를 유도하고 상기 실시예 3과 같은 조건으로 RT-PCR을 수행하였다. PCR 반응에 사용한 프라이머 세트의 염기서열은 네스틴 유전자 증폭의 경우 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 프라이머를, TB3 유전자 증폭의 경우 서열번호 9 및 서열번호 10으로 표시되는 프라이머를, GFAP 유전자 증폭의 경우 서열번호 11 및 서열번호 12로 표시되는 프라이머를, Galc 유전자 증폭의 경우 서열번호 13 및 서열번호 14으로 표시되는 프라이머를, olig2 유전자 증폭의 경우 서열번호 15 및 서열번호 16으로 표시되는 프라이머를 이용하였다. 반응에 사용한 프라이머 세트의 염기서열은 상기 표 2에 나타내었다. 그 결과를 도 9 에 나타내었다.
도 9 에 나타낸 바와 같이, 희소돌기 아교세포로 분화 시, 신경세포 마커인 TB3(Tuj1)의 발현이 감소함을 확인하였고, 신경전구세포 마커인 네스틴의 발현이 증가하고, 신경교세포 계통 마커인 GFAP, galC 및 olig2의 발현은 현저히 증가함을 확인하였다.
<110> Animal and plant quaratine agency
<120> Method for differentiating glial progenitor cell, astrocyte and
oligodendrocyte from embryonic stem cell
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<150> KR 10-2013-0131627
<151> 2013-10-31
<160> 16
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer of oct4
<400> 1
gagaagagta tgaggct 17
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Backward primer of oct4
<400> 2
gaagccgaca acaatga 17
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer of sox2
<400> 3
aagggttctt gctgggtttt 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Backward primer of sox2
<400> 4
agaccacgaa aacggtcttg 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer of nestin
<400> 5
ccagagctgg actggaactc 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Backward primer of nestin
<400> 6
acctgcctct tttggttcct 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer of Musashi
<400> 7
tagttcgagg gacaggctct 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Backward primer of Musashi
<400> 8
gttgagggac aggcagtagc 20
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer of tb3(tuj1)
<400> 9
gcctttggac acctattca 19
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Backward primer of tb3(tuj1)
<400> 10
agtcacaatt ctcacactct t 21
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer of GFAB
<400> 11
ctccaagatg aaaccaacct 20
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Backward primer of GFAB
<400> 12
ctcctcctcc agcgattc 18
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer of Galc
<400> 13
ccaaccaact acaaggatga t 21
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Backward primer of Galc
<400> 14
caaacacgcc agtctgat 18
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer of olig2
<400> 15
ctgctggcgc gaaactacat 20
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Backward primer of olig2
<400> 16
cgctcaccag tcgcttcat 19
Claims (9)
1) 소태아혈청 (fetal calf serum), 2-머캅토에탄올 (2-mercaptoethanol), L-글루타민, 비필수 아미노산, 페니실린, 스트렙토마이신 및 레티노 산을 포함하는 DMEM(Dulbeco's modified eagle's medium) 배지에 배아줄기세포를 배양하여 배상체를 형성하는 단계;
2) 상기 1) 단계의 배상체를 단일 세포로 분리한 후, 분리된 단일 세포를 N2가 첨가된 DMEM/F12 배지 및 B27이 첨가된 신경 기저 배지(neurobasal medium supplemented with B27)를 포함하는 N2/B27 배지에 배양하여 신경줄기세포의 생성을 유도하는 단계;
3) 상기 2) 단계의 신경줄기세포를 FGF-2(Fibroblast growth factor), EGF (Epidermal growth factor) 및 LIF(leukemia inhibitory factor)를 포함하는 N2/B27 배지에 추가 배양한 후, 단일 세포로 분리하고 이를 20 내지 29회 계대 배양하는 단계를 포함하는 배아줄기세포로부터 신경교전구세포로의 분화방법.
2) 상기 1) 단계의 배상체를 단일 세포로 분리한 후, 분리된 단일 세포를 N2가 첨가된 DMEM/F12 배지 및 B27이 첨가된 신경 기저 배지(neurobasal medium supplemented with B27)를 포함하는 N2/B27 배지에 배양하여 신경줄기세포의 생성을 유도하는 단계;
3) 상기 2) 단계의 신경줄기세포를 FGF-2(Fibroblast growth factor), EGF (Epidermal growth factor) 및 LIF(leukemia inhibitory factor)를 포함하는 N2/B27 배지에 추가 배양한 후, 단일 세포로 분리하고 이를 20 내지 29회 계대 배양하는 단계를 포함하는 배아줄기세포로부터 신경교전구세포로의 분화방법.
제1항에 있어서,
상기 배아줄기세포는 인간, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 개, 고양이, 마우스 및 토끼로 이루어진 군으로 선택된 1종 이상으로부터 유래한 것을 특징으로 하는, 배아줄기세포로부터 신경교전구세포로의 분화방법.
상기 배아줄기세포는 인간, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 개, 고양이, 마우스 및 토끼로 이루어진 군으로 선택된 1종 이상으로부터 유래한 것을 특징으로 하는, 배아줄기세포로부터 신경교전구세포로의 분화방법.
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1) 소태아혈청 (fetal calf serum), 2-머캅토에탄올 (2-mercaptoethanol), L-글루타민, 비필수 아미노산, 페니실린, 스트렙토마이신 및 레티노 산을 포함하는 DMEM(Dulbeco's modified eagle's medium) 배지에 배아줄기세포를 배양하여 배상체를 형성하는 단계;
2) 상기 1) 단계의 배상체를 단일 세포로 분리한 후, 분리된 단일 세포를 N2가 첨가된 DMEM/F12 배지 및 B27이 첨가된 신경 기저 배지(neurobasal medium supplemented with B27)를 포함하는 N2/B27 배지에 배양하여 신경줄기세포의 생성을 유도하는 단계;
3) 상기 2) 단계의 신경줄기세포를 FGF-2(Fibroblast growth factor), EGF (Epidermal growth factor) 및 LIF(leukemia inhibitory factor)를 포함하는 N2/B27 배지에 추가 배양한 후, 단일 세포로 분리하고 이를 20 내지 29회 계대 배양하여 신경교전구세포로 분화시키는 단계; 및
4) 상기 3) 단계의 신경교전구세포를 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS), 글루타멕스-1(glutamax-1) 첨가제 및 N2를 포함하는 DMEM 배지에서 10일 동안 배양하는 단계;를 포함하는, 배아줄기세포를 신경교전구세포로 분화 유도한 후 신경교전구세포로부터 성상세포로의 분화방법.
2) 상기 1) 단계의 배상체를 단일 세포로 분리한 후, 분리된 단일 세포를 N2가 첨가된 DMEM/F12 배지 및 B27이 첨가된 신경 기저 배지(neurobasal medium supplemented with B27)를 포함하는 N2/B27 배지에 배양하여 신경줄기세포의 생성을 유도하는 단계;
3) 상기 2) 단계의 신경줄기세포를 FGF-2(Fibroblast growth factor), EGF (Epidermal growth factor) 및 LIF(leukemia inhibitory factor)를 포함하는 N2/B27 배지에 추가 배양한 후, 단일 세포로 분리하고 이를 20 내지 29회 계대 배양하여 신경교전구세포로 분화시키는 단계; 및
4) 상기 3) 단계의 신경교전구세포를 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS), 글루타멕스-1(glutamax-1) 첨가제 및 N2를 포함하는 DMEM 배지에서 10일 동안 배양하는 단계;를 포함하는, 배아줄기세포를 신경교전구세포로 분화 유도한 후 신경교전구세포로부터 성상세포로의 분화방법.
1) 소태아혈청 (fetal calf serum), 2-머캅토에탄올 (2-mercaptoethanol), L-글루타민, 비필수 아미노산, 페니실린, 스트렙토마이신 및 레티노 산을 포함하는 DMEM(Dulbeco's modified eagle's medium) 배지에 배아줄기세포를 배양하여 배상체를 형성하는 단계;
2) 상기 1) 단계의 배상체를 단일 세포로 분리한 후, 분리된 단일 세포를 N2가 첨가된 DMEM/F12 배지 및 B27이 첨가된 신경 기저 배지(neurobasal medium supplemented with B27)를 포함하는 N2/B27 배지에 배양하여 신경줄기세포의 생성을 유도하는 단계;
3) 상기 2) 단계의 신경줄기세포를 FGF-2(Fibroblast growth factor), EGF (Epidermal growth factor) 및 LIF(leukemia inhibitory factor)를 포함하는 N2/B27 배지에 추가 배양한 후, 단일 세포로 분리하고 이를 20 내지 29회 계대 배양하여 신경교전구세포로 분화시키는 단계; 및
4) 상기 3) 단계의 신경교전구세포를 T3, 글루타멕스-1 첨가제 및 B27을 포함하는 신경 기저 배지(neurobasal medium)에 10일 동안 배양하는 단계;를 포함하는, 배아줄기세포를 신경교전구세포로 분화 유도한 후 신경교전구세포로부터 희소돌기 아교세포로의 분화방법.
2) 상기 1) 단계의 배상체를 단일 세포로 분리한 후, 분리된 단일 세포를 N2가 첨가된 DMEM/F12 배지 및 B27이 첨가된 신경 기저 배지(neurobasal medium supplemented with B27)를 포함하는 N2/B27 배지에 배양하여 신경줄기세포의 생성을 유도하는 단계;
3) 상기 2) 단계의 신경줄기세포를 FGF-2(Fibroblast growth factor), EGF (Epidermal growth factor) 및 LIF(leukemia inhibitory factor)를 포함하는 N2/B27 배지에 추가 배양한 후, 단일 세포로 분리하고 이를 20 내지 29회 계대 배양하여 신경교전구세포로 분화시키는 단계; 및
4) 상기 3) 단계의 신경교전구세포를 T3, 글루타멕스-1 첨가제 및 B27을 포함하는 신경 기저 배지(neurobasal medium)에 10일 동안 배양하는 단계;를 포함하는, 배아줄기세포를 신경교전구세포로 분화 유도한 후 신경교전구세포로부터 희소돌기 아교세포로의 분화방법.
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Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| US20120009157A1 (en) | 2009-02-03 | 2012-01-12 | Hideyuki Okano | Culture method of embryoid bodies and/or neural stem cells derived from human differentiated cell-derived pluripotent stem cells |
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2014
- 2014-02-28 KR KR1020140024179A patent/KR101636966B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20120009157A1 (en) | 2009-02-03 | 2012-01-12 | Hideyuki Okano | Culture method of embryoid bodies and/or neural stem cells derived from human differentiated cell-derived pluripotent stem cells |
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|---|---|
| KR20150051122A (ko) | 2015-05-11 |
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