CN104540936A - 干细胞培养基和使用它培养干细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种干细胞培养基，其能够取代含有异源蛋白质胎牛血清的常规的干细胞培养基，更特定而言，涉及一种含有基础培养基和敲除血清替代物的干细胞培养基，以及一种使用它培养干细胞的方法。根据本发明，能够获得具有降低的自发分化能力的高纯度的干细胞而不必使用异源蛋白质胎牛血清和昂贵的生长因子(EGF和bFGF)，因而能够显著地提高干细胞治疗的效力。

Description

干细胞培养基和使用它培养干细胞的方法
技术领域
本发明涉及一种用于培养干细胞的培养基，更特定而言，涉及一种含有敲除血清替代物(KoSR)的干细胞培养基，以及使用它培养干细胞的方法。
根据本发明，即使以低成本也能够获得治疗所需的高纯度干细胞，而没有被异源蛋白质污染的风险，因而能够有效地用于干细胞治疗。
背景技术
21世纪生物技术展现了对食品、环境和健康问题的新解决方案的可能性，其终极目标是促进人类福利。近年来，使用干细胞的技术被认为是治疗不可治愈疾病的新途径。以前，曾提出器官移植、基因疗法等用于不可治愈的人类疾病的治疗，但由于免疫排斥、器官供应短缺、载体发育不足以及疾病基因的知识不足，这些还没有被有效地使用。
为此，随着对干细胞研究日益增加的兴趣，已经认识到通过增殖和分化而具有形成所有器官能力的全能干细胞不仅能够治疗大多数的疾病，也能够根本地治愈器官损伤。干细胞是指不仅具有自我复制能力还具有分化成至少两种类型的细胞的能力的细胞，且其自身分为全能干细胞、亚全能干细胞(pluripotent stem cell)和多能干细胞(multipotent stem cell)。此外，许多科学家建议了干细胞在所有器官的再生和不可治愈疾病的治疗方面的应用性，包括帕金森病、各种癌症、糖尿病和脊柱损伤。
特定而言，神经干细胞具有自我复制并分化成组成中枢神经系统的神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力。因而，对用于干细胞的增殖和分化以及中枢神经系统的发育的这种神经干细胞的使用的研究在增加，并且在一旦损害就不再生的中枢系统疾病中，对使用神经干细胞的生物学特性来进行细胞和基因治疗的新可能性也在增加。此外，通过培养人成体脑组织来建立自体同源的成体神经干细胞的方法与使用胚胎干细胞或胎儿脑组织的其他方法相比，能够解除伦理学的担忧。并且，这些方法能够实现患者定制的细胞治疗，从而能够作为克服常规细胞治疗的局限性的一种选择。
为利用这些优点，许多研究者已经尝试培养人成体神经干细胞，但关于它们的研究由于人成体神经干细胞难以体外培养并且其增殖能力也有限而正停滞不前。在干细胞生物学中有已建立的理论，即这些干细胞在其培养中需要特定的细胞微环境或巢(niche)。所报道的用于选择性地培养神经干细胞的培养技术包括神经球形成法、低密度培养法、高密度培养法等等。此外，已知的方法包括在生长因子存在下培养胚胎干细胞来源、胎儿脑组织来源或人成体脑组织来源的成体神经干细胞。本发明者之前提交了涉及使用低浓度胎牛血清(FBS)来培养人成体神经干细胞的方法的发明专利(参见韩国专利申请第2010-0010116号和第2010-0010117号)。然而，尚不知道能够培养人成体神经干细胞而无需昂贵的生长因子和胎牛血清的培养基或培养方法。
本发明者建立了一种用于原代培养成体神经干细胞的技术和一种用于大量培养成体神经干细胞的技术(参见韩国专利申请第2010-0010116号和第2010-0010117号以及PCT国际专利申请第PCT/KR2011/000730号)。基于这些技术，本发明者研究了一种细胞培养基，其不含昂贵的生长因子同时使得避免由异源蛋白质造成的污染成为可能，因而能够被临床应用。
据此，本发明者已在含敲除血清替代物(KoSR)的培养基中培养了干细胞，结果发现KoSR能够用作血清的取代物，从而完成了本发明。
发明内容
本发明的一个目标是提供一种干细胞培养基，其即使以低成本也可以获得高纯度的干细胞而不暴露于异源蛋白质。
本发明的另一个目标是提供一种使用上述培养基培养干细胞的方法。
附图说明
图1A示出用于标记物表达的流式细胞仪(FACS)结果，所述标记物特异于成体神经干细胞中的神经干细胞特异性标记物(Nestin、Sox1和Sox2)、巨细胞特异性标记物(CD44)、星形胶质细胞特异性标记物(GFAP)和神经元特异性标记物(Boublecortin；DCX)，所述成体神经干细胞是通过来自人颞叶脑组织的成体神经干细胞的原代培养获得的。
图1B示出特异于来自人颞叶脑组织的成体神经干细胞的标记物蛋白(Nestin、Sox2、CD133和Hes3)的表达的免疫细胞化学结果。
图2A示意性地示出了使用敲除血清替代物(KoSR)来培养人颞叶脑组织来源的成体神经干细胞的过程。
图2B示出了在含有FBS(胎牛血清)和生长因子的神经干细胞培养基(a)和含有敲除血清替代物(KoSR)的本发明的培养基(b)每种中培养的人成体神经干细胞的照片。
图3A示出在含有各种浓度(1％、10％和20％)的敲除血清替代物的本发明的培养基中，细胞(#1)中的神经干细胞特异性标记物蛋白(Nestin)、星形胶质细胞特异性标记物蛋白(GFAP)、少突胶质细胞特异性标记物(O4)和神经元特异性标记物(Tuj-1)的表达模式的免疫细胞化学结果。作为对照，使用含有0.5％FBS而不含敲除血清替代物(KoSR)的培养基。
图3B示出在图3A中示出的细胞(#1)中，神经元特异性标记物Tuj-1的表达的流式细胞仪(FACS)结果。
图3C示出在图3B中示出的FACS分析结果的定量结果。
图4A示出在含有各种浓度(0％：对照，1％、10％和20％)的敲除血清替代物(KoSR)的本发明的培养基中，细胞(#2)中的神经干细胞特异性标记物蛋白(Nestin)、星形胶质细胞特异性标记物蛋白(GFAP)、少突胶质细胞特异性标记物(O4)和神经元特异性标记物(Tuj-1)的表达模式的免疫细胞化学结果。
图4B示出在图4A中示出的细胞(#2)中，神经元特异性标记物Tuj-1的表达的流式细胞仪(FACS)结果。
图4C示出在图4B中示出的FACS分析结果的定量结果。
具体实施方式
一方面，本发明涉及一种含有基础培养基和敲除血清替代物(KoSR)的干细胞培养基。
如本文所使用，表达“含有敲除血清替代物的培养基”是指在基础培养基中含有敲除血清替代物(KoSR)的培养基。根据本发明的培养基不含已经在干细胞培养中使用的生长因子，如胎牛血清(FBS)、bFGF或EGF。
已知经常用在细胞和组织培养中的胎牛血清是一种除激素、生长因子和维生素之外还含有许多任意未知因子的复杂基质，有报道称胎牛血清可能是在胚胎移植后胎牛发育期间和刚出生后出现在牛犊中的一些异常现象的成因(参见Sang-Ki Lee et al.,“Effects of Fetal Bovine Serum and Its Replacements(BSA and PVA)on Development of Cloned Embryos”)。因此，当使用含FBS的培养基来培养人成体或胚胎干细胞时，干细胞暴露于异源蛋白质，因而在这种培养基中培养的干细胞的临床应用存在安全性问题。此外，干细胞的分化、表达等能够依赖于所用培养基的成分，因而并不优选使用含许多未知因子的FBS作为培养基的成分。进一步，诸如EGF和bFGF的生长因子昂贵，因而干细胞的大量培养在成本方面有困难。
尽管根据本发明的培养基不含FBS和生长因子(EGF、bFGF等)，但在该培养基中培养的人成体干细胞也以类似于在常规培养基中培养的方式进行培养(参见图2B)。因而，根据本发明的培养基能够取代含有FBS和高浓度昂贵生长因子的常规培养基。
用于本发明的敲除血清替代物(KoSR)的培养基可包含氨基酸(甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-羟脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸)、维生素/抗氧化剂(硫胺、还原谷胱甘肽、抗坏血酸2-PO4)、微量元素(Ag+、Al3+、Ba2+、Cd2+、Co2+、Cr3+、Ge4+、Se4+、Br-、I-、F-、Mn2+、Si4+、V5+、Mo6+、Ni2+、Rb+、Sn2+、Zr4+)、蛋白质(转铁蛋白(铁饱和的))、胰岛素和富脂白蛋白(AlbuMAX)(Albumin-associated lipids regulate human embryonic stem cell self-renewal,Francesc R.etc.,PLoS ONE 3(1):e1384)。用于本发明的敲除血清替代物是可从Invitrogen购买的(目录号：10828-028)。该敲除血清替代物可以以1-20％的量包含在本发明的培养基中。
用于本发明的基础培养基是在干细胞培养中使用的常规的基础培养基，并且本领域已知适合于干细胞的培养。本发明中使用的基础培养基的实例包括DMEM、MEM、K-SFM等等。优选地，可用无血清培养基作为基础培养基，最优选地，可使用DMEM：F12培养基、B27补充剂和抗生素的混合物。在本发明中，使用青霉素和链霉素(Invitrogen)作为抗生素，但不限于此，本发明中可使用任何抗生素而没有限制，只要其在本领域通用。
此外，基础培养基中可以补充促进人神经干细胞的未分化表型的增殖同时抑制细胞分化的已知添加剂。此外，培养基可包含在等渗溶液中的中性缓冲液(如磷酸盐和/或高浓度碳酸氢盐)；蛋白质营养剂(例如必需和非必需氨基酸，如谷酰胺)。而且，其可以包含脂类(脂肪酸、胆固醇、血清的HDL或LDL提取物)以及存在于大多数这类储备培养基中的其它成分(如胰岛素或转铁蛋白、核苷或核苷酸、丙酮酸盐、诸如葡萄糖的糖源、以任何离子化形式或盐存在的硒、诸如皮质醇的糖皮质激素和/或诸如β-巯基乙醇的还原剂)。此外，其可含有抗凝聚剂，如可从Invitrogen购买的市售产品(Cat#0010057AE)，以防止细胞彼此粘附、粘附于容器壁或形成太大的团簇。
如本文所使用，术语“干细胞”是指能够分化成构成组织的细胞的未分化细胞和在特定分化刺激(环境)下分化成特定细胞的未分化细胞。与细胞分裂受抑制的已分化细胞不同，干细胞保留了通过细胞分裂而自我更新的能力，因而能够增殖(扩增)。而且，当向其施加分化刺激时，干细胞分化成特定细胞，并且在不同的环境或分化刺激下它们还能够分化成不同的细胞，表明干细胞在分化方面具有可塑性。根据其发育来源，这种干细胞可分为胚胎干细胞和成体干细胞。在本发明中，优选使用成体干细胞而不是引起严重的生物学、伦理学和法律问题的胚胎干细胞，所述生物学、伦理学和法律问题限制了胚胎干细胞的临床应用。
如本文所使用，术语“成体干细胞”是指从成体组织中提取的、正要分化成特定器官的细胞之前的干细胞。成体干细胞难以增殖并具有容易分化的强烈趋势，但能够在人体内分化成组织特异性的祖细胞。成体干细胞能够分化成具有各种特征的细胞，并且具有针对各种组织和器官产生替代细胞的能力，所述各种组织和器官包括心脏、胰腺、神经组织、肌肉和软骨。用于从各种人体组织中分离成体干细胞的方法可以使用适用于各组织的、本领域已知的常规方法进行。例如，可使用包括以下步骤的方法：用酪蛋白溶液和/或胶原蛋白酶处理采集的特定组织以分离单个细胞，将单个细胞在补充了量生长因子(例如bFGF、EGF等)的培养基中培养，并通过FACS或根据生长速率从培养物中分离成体干细胞。优选地，本发明中可使用成体神经干细胞或神经嵴干细胞(NCSC)。
如本文所使用，术语“神经干细胞”是指能够经受大于20-30次细胞分裂并保持生成神经元和神经胶质二者的潜能的细胞。优选地，这种细胞能够经受大于40次，更优选大于50次，最优选无限次的细胞分裂。神经干细胞根据定义是多能的，即它们能够分化成许多种神经细胞类型(例如神经元/神经胶质)。神经干细胞能够通过中枢神经系统(CNS)和外周神经系统(PNS)的组织的原代培养而获得，并在特定条件下能分化成神经胶质谱系和神经谱系(Sally Temple et al.2001)。如本文所使用，术语“神经嵴干细胞(NCSC)”是指在早期胚胎发育过程中暂时出现的干细胞，这些细胞也是多能干细胞。
可以从各种来源获得神经干细胞。例如，神经干细胞可以源自人成体脑组织，其中脑可以是选自以下任一种：大脑、间脑、中脑、小脑、延髓、桥脑和脊髓。优选地，神经干细胞可以源自大脑组织，如颞叶组织或海马体组织。人神经干细胞可以从市售来源购得，优选地，其可以通过在含有神经干细胞生长因子的培养基中培养获自人成体脑组织的细胞而产生(参见实施例1)。
在本发明的一个实施例中，通过颞叶的原代培养物获得细胞，所述颞叶是通过外科手术操作获自癫痫症患者。然而，对于本领域技术人员而言，显然本发明中可使用获得自海马体组织的细胞。
本发明还提供了一种具有降低的自发分化能力的人成体干细胞。在本发明培养基中培养的神经干细胞具有降低的自发分化的能力，因而根据本发明培养基的使用使获得高纯度的人成体神经干细胞成为可能(参见图3和4)。因而，本发明提供了具有降低的自发分化能力的干细胞，优选成体神经干细胞。当神经干细胞在体外长期培养时，无论这些细胞源自何种组织或细胞，大多数神经干细胞都自发分化。如本文所使用，术语“自发分化”区别于引导分化，是指即使在通过外源分化诱导物质(生长因子、激素、化学物质等)处理的人工分化并未诱导的状态也发生的分化现象。如本文所使用，表达“高纯度的干细胞”是指具有低自发分化能力的干细胞。
下面，将参照实施例进一步详细描述本发明。对本领域普通技术人员而言显然这些实施例仅是说明目的而不构成对本发明范围的限制。
以下实施例仅说明的使用本发明的培养基对人神经干细胞的培养，但对本领域技术人员而言显然的是，源自其他来源的成体干细胞的培养也能够提供与在人神经干细胞的培养物中的效果相同的效果。
实施例
实施例1：人成体干细胞的制备
1-1：人神经干细胞的分离和培养
通过外科手术从癫痫症患者(Department of Neurosurgery,SamsungMedical Center，首尔，韩国)获得颞叶组织(从患者1获得的细胞称为细胞#1，从患者2获得的细胞称为细胞#2)。在外科手术后的3小时内，用PBS洗涤各组织，然后用手术剪或刀片机械切割。在37℃下将切割的组织用酶溶液处理1小时或不到1小时，所述酶溶液是通过混合胶原蛋白酶(0.4mg/ml，Gibco)、DnaseI(0.01-1mg/ml，Roche)、木瓜蛋白酶(10单位/ml，Sigma)、D-L-半胱氨酸(400ng/ml，Sigma)和DNaseI(0.01-1mg/ml，Roche)而制备。使用血清移液管然后通过尼龙筛，将经处理的组织离解为单个细胞，从而获得单个细胞。
将单个细胞悬液进行梯度离心(Percoll，Sigma)，以离心去除红细胞和死细胞。将得到的细胞悬浮在含1％FBS、1X B27(50X浓度的稀释液(Invitrogen))、N2补充剂(Gibco)、50ng/ml bFGF(R&D)和50ng/ml EGF(R&D)的DMEM：F12(Gibco)培养基或Neurobasal-A(Gibco)培养基中。然后，将细胞在用聚-L-鸟氨酸(Sigma)预处理过的细胞培养板中培养，从而获得原代培养的神经干细胞。
1-2：人神经干细胞的特征分析
<免疫细胞化学染色>
将实施例1-1中获得的神经干细胞用4％的多聚甲醛(PFA，Sigma)或丙酮/甲醇固定，然后用含0.05％Triton X-100(Sigma)的PBS渗透15分钟。然后，在室温下将组织用5％正常马血清/1％正常羊血清(Vector Lab.)封闭1小时。
接下来，用含0.01％Triton X-100(Sigma)的PBS洗涤数次，并用抗CD133(Abcam)、抗Nestin(Abcam或Millipore)、抗Sox2(R&D)、抗Hes3(Santa Cruz)、抗GFAP(Sigma or Abcam)、抗Olig2(Millipore)、抗O4(Chemicon)和抗Tuj-I(Millipore)的组合处理。然后，将细胞在4℃孵育过夜。
接下来，用含0.01％Triton X-100(Sigma)的PBS洗涤细胞数次，并用对应于上述初级抗体的抗小鼠488(BD)、抗小鼠594(BD)、抗兔488(BD)、抗兔594(BD)、抗大鼠488(BD)和抗大鼠594(BD)的二抗处理。最后，将细胞用DAPI(Sigma)核染色，并用荧光显微镜(Axiovert，Zeiss)观察最终荧光性的表达。
结果，能够观察到已知作为特异于神经干细胞的标记物的Nestin、Sox2、CD133和Hes3(图1B)。
<流式细胞计数分析>
通过FACS分析神经干细胞特异性标记物(Nestin、Sox1和Sox2)、巨细胞特异性标记物(CD44)、星形胶质细胞特异性标记物(GFAP)、神经元特异性标记物(DCX)和细胞增殖标记物(Ki-67)的表达。
将实施例1-1获得的成体神经干细胞通过贴壁培养法培养，然后使用购自BD Biosceinces的人神经谱系分析试剂盒(目录号：561526)、按照生产商提供的标准实验方法分析神经干细胞的特征。
具体而言，将经培养的细胞用PBS洗涤一次，之后将细胞通过用Accutase(Innovative Cell Technologies，Inc.)离解成单个细胞，接着离心。然后，将细胞悬浮在含2％FBS的FACS缓冲液中，并用BD Cytofix固定缓冲液(目录号：554655)和BD Phos Flow Perm缓冲液III(目录号：558050)处理，接着用CD44-FITC(目录号：555478)、Ki67-AlexaFluor 488(目录号：561165)、Doublecortin-PE(目录号：561505)、Sox1-PerCP-Cy5.5(目录号：561549)、Sox2-PerCP-Cy5.5(目录号：561506)、GFAP AlexaFluor(目录号：561470)和Nestin-AlexaFluor(目录号：561126)抗体的组合处理。
接下来，将细胞用PBS洗涤一次，然后通过流式细胞仪(BDFACSCalibur)分析细胞的特征。
结果，可以看出已知作为神经干细胞特异性标记物蛋白的Nestin和已知作为巨细胞特异性标记物蛋白的CD44以99％的水平表达，而作为特异于神经干细胞的其它标记物的Sox1和Sox2也以大约2-50％的水平表达。此外，显示出星形胶质细胞特异性标记物蛋白GFAP和神经元特异性标记物蛋白DCX以相对较低的水平表达(图1A)。
实施例2：在含有敲除血清替代物的培养基中的细胞培养
通过将实施例1-1中获得的人成体神经细胞悬浮在包含B27补充剂(Gibco)和N2补充剂(Gibco)的DMEM：F12(Gibco)培养基或Neurobasal-A(Gibco)，然后在用聚-L-鸟氨酸(Sigma)预处理的细胞培养板中培养细胞，来测试在含有FBS和生长因子的培养基(常规培养基)中培养的细胞是否能够应用于本发明的培养基。
具体而言，将实施例1-1中获得的人成体干细胞在常规培养基中培养，并将经培养的细胞用PBS洗涤一次，然后通过用Accutase(Innovative CellTechnologies,Inc.)处理而离解成单个细胞，接着离心。将得到的细胞在包含1％FBS和生长因子的常规培养基和包含10％敲除血清替代物的培养基每种中培养(参见图2A)。
结果，可以看出即使当人成体神经干细胞在不含生长因子和FBS的本发明培养基中培养时(图2B的右边照片)，这些细胞也以与在常规培养基中的培养模式(图2B的左边照片)类似的方式被培养。这表明在常规培养基中培养的细胞也在本发明培养基中以类似的方式被培养。从此结果可见，含有敲除血清替代物(KoSR)的本发明培养基的使用能够有效地培养人成体神经干细胞，即使当培养基不含昂贵的生长因子和异源蛋白质胎牛血清。
实施例3：人成体神经干细胞在含有各种浓度的敲除血清替代物的培养基中的培养
实施例3-1：人成体神经干细胞在用各种浓度的敲除血清替代物处理的 培养基中的培养
将敲除血清替代物以各种浓度(1％、10％和20％)悬浮在含B27补充剂(Gibco)或N2补充剂(Gibco)的DMEM：F12(Gibco)培养基或Neurobasal-A(Gibco)培养基中，然后将实施例1-1中获得的成体神经干细胞(#1和#2)在培养基中培养，从而获得经培养的神经干细胞。作为对照，使用含0.5％FBS的培养基(不含KoSR)。
实施例3-2：在含有敲除血清替代物的培养基中培养的人成体神经干细 胞的特征
<免疫细胞化学染色>
将在含有各种浓度的敲除血清替代物的本发明培养基中培养的神经干细胞进行免疫细胞化学染色。具体而言，将实施例3-1中获得的神经干细胞用4％的多聚甲醛(Paraformaldehyde，PFA，Sigma)或丙酮/甲醇固定，然后用含0.05％Triton X-100(Sigma)的PBS渗透15分钟。然后，在室温下将组织用5％正常马血清/1％正常羊血清(Vector lab.)封闭1小时。
接下来，用含0.01％Triton X-100(Sigma)的PBS洗涤数次，并用抗Nestin(Abcam或Millipore)、抗GFAP(Sigma or Abcam)、抗O4(Chemicon)和抗Tuj-I(Millipore)的组合处理。然后，将细胞在4℃孵育过夜。
接下来，用含0.01％Triton X-100(Sigma)的PBS洗涤细胞数次，并用对应于上述初级抗体的抗小鼠488(BD)、抗小鼠594(BD)、抗兔488(BD)、抗兔594(BD)、抗大鼠488(BD)和抗大鼠594(BD)的二抗处理。最后，将细胞用DAPI(Sigma)核染色，并用荧光显微镜(Axiovert，Zeiss)观察最终荧光性的表达。
结果，可以看出已知作为神经干细胞特异性标记物蛋白的Nestin强烈地表达(图3A和图4A)。
<流式细胞仪分析>
通过FACS分析神经干细胞特异性标记物蛋白(Nestin)、星形胶质细胞特异性标记物蛋白(GFAP)、少突胶质细胞特异性标记物蛋白(O4)和神经元特异性标记物蛋白(Tuj-1)的表达。
使用购自BD Biosceinces的人神经谱系分析试剂盒(目录号：561526)、按照生产商提供的标准试验方法分析神经干细胞的特征。
具体而言，用PBS洗涤实施例3-1中获得的成体干细胞一次，之后通过用Accutase(Innovative Cell Technologies，Inc.)处理将细胞离解成单个细胞，接着离心。将得到的细胞悬浮在含2％FBS的FACS缓冲液中。然后，用BDCytofix固定缓冲液(目录号：554655)和BD Phos flow Perm缓冲液III(目录号：558050)处理，然后处理结合于Tuj1(Millipore，目录号：MAB1637)的PerCP-Cy5.5荧光染料的抗体。接下来，用FACS缓冲液洗涤细胞一次，然后通过流式细胞仪(BD FACSCalibur)分析。
结果，可以看出已知作为下游神经细胞特异性标记物蛋白的Tuj1的表达在敲除血清替代物的存在下，在测试细胞组中以低水平表达(图3B和4B)。
尽管本发明已经基于其具体特征详细地进行了描述，但对本领域技术人员显然的是，该描述仅仅是优选的实施方式，而不限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围将由所附权利要求书及其等同方式所限定。
工业实用性
根据本发明，能够培养高纯度的干细胞而不必使用异源蛋白质胎牛血清或昂贵的生长因子(bFGF和EFG)。因此，即使以低成本也能够进行干细胞治疗而没有被异源蛋白质污染的风险。

Claims (10)

1.一种干细胞培养基，含有基础培养基和敲除血清替代物(KoSR)。
2.权利要求1所述的干细胞培养基，其中所述基础培养基包括：培养基DMEM：F21、B27补充剂和抗生素。
3.权利要求1所述的干细胞培养基，其中基于所述干细胞培养基，所述敲除血清替代物(KoSR)以1-20％的浓度被包含。
4.权利要求1所述的干细胞培养基，其中所述干细胞为成体干细胞。
5.权利要求4所述的干细胞培养基，其中所述干细胞为源自人成体脑组织的神经干细胞或神经嵴干细胞(NCSC)。
6.权利要求5所述的干细胞培养基，其中所述脑组织为颞叶组织或海马体组织。
7.一种培养具有降低的自发分化能力的干细胞的方法，所述方法包括在权利要求1到6任一项所述的培养基中培养干细胞。
8.权利要求7所述的方法，其中所述干细胞为成体干细胞。
9.权利要求8所述的方法，其中所述干细胞为源自人成体脑组织的神经干细胞或神经嵴干细胞(NCSC)。
10.权利要求9所述的方法，其中所述脑组织为颞叶组织或海马体组织。
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