TWI493034B - Neuronal epithelial cells differentiated by universal stem cells and the medium used and their differentiation methods - Google Patents

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Description

由萬能幹細胞所分化之神經上皮細胞及其所使用之培養基與其分化方法
本發明係有關於一種神經上皮細胞之分化方法及其使用之培養基，特別係指一種由萬能幹細胞所分化之神經上皮細胞及其所使用之培養基與其分化方法。
幹細胞係指尚未完全分化，而具有自我更新能力，並可分化成兩種以上成熟細胞之原始細胞。以分化能力將幹細胞分類，可分為全能幹細胞(totipotent stem cell)、萬能幹細胞(pluripotent stem cell)、多能幹細胞(multipotent stem cell)及雙能細胞(bipotent stem cell)；另依幹細胞來源區分，則可分為胚胎幹細胞(embryonic stem cell)、成體幹細胞(somatic stem cell)及誘導型萬能幹細胞(induced pluripotent stem cell；iPSC)。其中，人類胚胎幹細胞係屬於萬能幹細胞，來自於未著床前囊胚時期之內細胞團塊，具有萬能性而可分化為各種成體細胞；另者，誘導型萬能幹細胞則係以強迫表現(enforced expression)操作之方式，將特定基因或蛋白質導入已分化之體細胞，使該體細胞被重新程式化(reprogrammed)而成為類似胚胎幹細胞者。
由於幹細胞具有細胞分裂、再生更新之能力，亦可被誘導分化成為特定組織，因此，目前許多研究學者致力於幹細胞分化之研究，希望幹細胞分化成為特定細胞或是組織器官後，能夠具有用於人類疾病治療或再生醫學等之用途，例如：可將分化培養之多巴胺神經元用以治療帕金森氏症、分化後之器官用於器官損傷之病人。尤其係針對神經發育、神經損傷及神經退化性疾病、或是相關藥物篩檢等生物醫學研究，更是需要藉由經幹細胞分化後之神經細胞來進行。
然而成熟之神經細胞來自於神經上皮細胞，是以，如何獲得大量且高純度之神經上皮細胞就顯得非常重要。許多研究學者於胚胎幹細胞分化初期利用加入纖維細胞生長因子-2(FGF2)(Li,X. J.et al .,2005；Timothyet al .,2009；Xuet al .,2005；Vallier,L.et al .,2005)，以懸浮培養方式進行誘導神經分化，該種分化方法雖可獲得具有類神經管表現之神經上皮細胞，然所需分化時間約需十四天以上，分化出來之細胞於貼附過程亦夾雜有眾多非神經細胞，需以酵素及人力操作於顯微鏡下將神經上皮細胞挑出，才可獲得高純度之神經細胞。另有學者於幹細胞分化過程加入兩種smad抑制劑(smad inhibitors)(Elkabetzet al .,2008；Leeet al .,2007；Chamberset al .,2009)，包括Noggin和SB431542，用以縮短神經分化時間；亦有學者利用基因操作誘導分化或是利用其他細胞共同培養誘導分化等(Pankratzet al .,2007；Chamberset al .,2009)，惟上述方法雖可得到神經上皮細胞，但仍無法使大部分之胚胎幹細胞分化成為神經細胞，並且具有生產成本昂貴、利用病毒進行基因操作之安全疑慮及與其他細胞共同培養之不確定因子等缺點。此外，倘若所生產之神經上皮細胞夾雜有其他非神經細胞或未分化細胞等，可能會影響後續神經之分化，且此未分化萬能幹細胞移植入動物體內也可能變成畸胎瘤。因此，有效率分化出高純度並表現大部分神經標記之神經上皮細胞，未來將有助於成熟神經細胞之分化，而提升臨床運用之可靠性及減少使用之危險。
本發明之主要目的即在於提供一種將萬能幹細胞分化成神經上皮細胞之分化方法，主要包含有下列步驟：
步驟a：取萬能幹細胞懸浮培養形成一類胚體(embryoid body)。
步驟b：將該類胚體培養於一第一神經誘導培養基中，而形成神經上皮細胞。
其特徵係在於該第一神經誘導培養基含有Wnt訊息促效劑(Wnt-signal agonist)、轉化因子β訊息抑制劑(TGFβ-signal inhibitor)及纖維母細胞生長因子訊息促效劑(FGF-signal agonist)。
更進一步地，該分化方法係於該步驟b後，更包含有一步驟c，其係將該b步驟中所使用之第一神經誘導培養基更換為一第二神經誘導培養基，並使所培養之細胞繼續分化為神經上皮細胞。
而上該方法中：
該萬能幹細胞係選自人類之胚胎幹細胞株或誘導型萬能幹細胞。
該Wnt訊息促效劑係可為Wnt1、Wnt3a、肝醣合成酶激酶-3β抑制劑(glycogen synthase kinase 3β inhibitor)如藥物Bio(6-bromoindirubin-3' -oxime)。
該轉化因子β訊息抑制劑係選自骨型態發生蛋白質抑制劑(bone morphogenetic protein inhibitor)、chordin蛋白質、noggin蛋白質、dorsomorphin蛋白質、Smad1抑制劑(Smad1 inhibitor)、Activin/Nodal受體抑制劑如藥物SB431542，或Smad2/3抑制劑(Smad2/3-inhibitor)。
該纖維母細胞生長因子訊息促效劑係選自纖維母細胞生長因子2、纖維母細胞生長因子受體之配體(ligand)、活化胞外訊息調控激酶(extracellular signal-related kinases；ERK)、活化c-jun N端蛋白質激酶(c-jun N-terminal kinase kinase；JNK)之促進劑及活化磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinosital-3 kinase；PI3K)之促進劑。
藉由上述之分化方法，係可有效地縮短萬能幹細胞分化成為神經上皮細胞之時間，並且獲得更高純度之神經上皮細胞。
本發明之另一目的係在於提供一種神經誘導培養基，其係含有Wnt訊息促效劑(Wnt-signal agonist)、轉化因子β訊息抑制劑(TGFβ-signal inhibitor)及纖維母細胞生長因子訊息促效劑(FGF-signal agonist)，用以使幹細胞得以分化出高純度之神經上皮細胞。
本發明之再一目的係在於提供一種神經上皮細胞，其係寄存於新竹食品工業發展研究所，寄存日期：2011年12月5日，寄存編號：BCRC960434，其乃得以表現神經標記，如：Nestin、Sox1、Pax6、Zic-1和N-cadherin，以及前腦之標記分子，如：BF1者。
本發明所揭一種將萬能幹細胞分化成神經上皮細胞之分化方法，乃係取一萬能幹細胞而將之聚集成為類胚體，再利用包含有Wnt訊息促效劑、轉化生長因子β訊息抑制劑及纖維母細胞生長因子訊息促效劑之一神經誘導培養基，作用於該萬能幹細胞，使該萬能幹細胞分化形成神經上皮細胞。
茲並將由本發明所揭分化方法而得之該神經上皮細胞寄存於新竹食品工業發展研究所，寄存日期：2011年12月5日，寄存編號：BCRC960434。
藉由本發明所提供將萬能幹細胞分化成神經上皮細胞之分化方法及所使用之神經誘導培養基，係可使超過90%之未分化萬能幹細胞於一週內成功地分化形成神經上皮細胞，並可高度表現神經標記與前腦標記分子者。
關於本案所使用之名詞，其文義之核心乃如后所陳者，惟其文義之範圍並不以之為限：
萬能幹細胞：包含有哺乳類動物之胚胎幹細胞、經由基因或蛋白質的外來表現而形成之誘導性萬能幹細胞或是其他具有分化為所有體細胞特性之萬能型細胞。於以下實例中所使用之萬能幹細胞係為人類胚胎幹細胞TW1，如第一圖A至C所示，其係該人類胚胎幹細胞培養於無餵養細胞(non-feeder cells)環境下mTESR1培養基中之生長型態圖。
神經標記：如Nestin、Sox1、Pax6、Zic-1和N-cadherin等基因，乃係神經上皮細胞內所表現者，因此，藉由分析該神經標記即可鑑定萬能幹細胞是否已經分化形成神經上皮細胞。
前腦標記分子：如腦因子1(brain factor 1;BF1)，係表現於神經前腦細胞之轉錄因子，因此，藉由分析該前腦標記分子是否表現，用以鑑定萬能幹細胞是否以分化形成神經上皮細胞。
胚胎幹細胞標記分子：如Oct4及nanog等轉錄因子，係於胚胎幹細胞中大量表現，因此，藉由分析胚胎幹細胞標記分子之表現，可用以鑑定萬能幹細胞分化為神經上皮細胞之效率。
神經上皮細胞：其細胞係呈球型結構，而邊緣逐漸成管狀緊密規則排列結構，排列如花瓣狀，又稱neural rossettes。
Wnt訊息促效劑：可為一種肝醣合成酶激酶-3β之抑制劑，穩定β-連結蛋白質(β-catenin)，包含有Wnt1、Wnt3a、肝醣合成酶激酶-3β抑制劑如藥物Bio。其中，下列實例中所使用之Wnt訊息促效劑係為藥物Bio，其化學式為C16H10BrN3O2，結構式為
轉化因子β訊息抑制劑：係使胚胎幹細胞減少自我更新之能力，使Oct4表現量降低，包含有骨型態發生蛋白質抑制劑(bone morphogenetic protein inhibitor)、chordin蛋白質、noggin蛋白質、dorsomorphin蛋白質、Smad1抑制劑(Smad1 inhibitor)、Activin/Nodal受體抑制劑藥物如SB431542，或Smad2/3抑制劑(Smad2/3-inhibitor)。其中，下列實例中所使用之轉化因子β訊息抑制劑係為藥物SB431542，化學式為：C22-H16-N4-O3，結構式為
纖維母細胞生長因子訊息促效劑：包含有纖維母細胞生長因子2(FGF2)、纖維母細胞生長因子受體之配體(ligand)、活化胞外訊息調控激酶(extracellular signal-related kinases；ERK)、活化c-jun N端蛋白質激酶(c-jun N-terminal kinase kinase；JNK)之促進劑及活化磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinosital-3 kinase；PI3K)之促進劑，其中，下列實例中所使用之纖維母細胞生長因子訊息促效劑係為纖維母細胞生長因子2，可活化細胞內Ras/Erk訊息。
為了更進一步驗證本發明，以下將藉由若干實例，並配合圖式為詳細之說明。
實例一：使胚胎幹細胞成為類胚體
取人類胚幹細胞TW1培養於37℃、5% CO2 之條件下，而後將所培養之該胚幹細胞以小細胞團塊，懸浮培養於含有20%血清替代品(knock-out replacement serum；KSR；Invitrogen，USA)的DMEM-F12培養基中，並以37℃，5% CO2 之條件，培養2天，使該胚幹細胞聚結成為類胚體(embryoid bodies)之細胞團塊。
實例二：神經上皮細胞誘導分化期
將實例一中該類胚體之細胞團塊移至15毫升之離心管中，於室溫下讓細胞沉降後吸除上清液。製備第一神經誘導培養基500 ml，組成如下表一所示，並添加濃度為0.5 μM之藥物BIO、濃度為10 μM之藥物SB431542及濃度為10 ng/ml之纖維母細胞生長因子2；惟需特別指出者係，該第一神經誘導培養基組成成分之個別濃度並不以上開說明者為限，具體而言者即該藥物BIO濃度範圍係可介於0.05 μM至50 μM間，該藥物SB431542之濃度範圍則得介於1 μM至100 μM間，而該纖維母細胞生長因子2之濃度範圍則得介於1ng/ml至100ng/ml間。
將細胞加入該第一神經誘導培養基中進行懸浮培養2天，使細胞分化形成神經上皮細胞，如第二圖所示，可知細胞係呈球型結構，且邊緣漸成管柱緊密規則結構。
表一：第一神經誘導培養基之組成如下：
實例三：神經上皮細胞誘導分化期
取實例二中之神經上皮細胞，而將第一神經誘導培養基更換為第二神經誘導培養基，並再添加濃度為10 ng/ml之纖維母細胞生長因子2，且於每2天更新該第二神經誘導培養基，使該神經上皮細胞繼續分化，其中，該第二神經誘導培養基之成份如下表二所示。
將培養分化完成之細胞置於顯微鏡倍率為100、200及400倍之顯微鏡下觀察，結果如第三圖及第四圖所示，其中，由第三圖A可知細胞之均一型態及球型結構周圍係呈緊密管柱狀型態；由第三圖B可知細胞之球型結構，且其周圍係為緊密管柱狀型態及其中心部分有玫瑰環狀之類神經管細胞形成；由第三圖C可知細胞之球型結構中心部分係為玫瑰環狀之類神經管細胞；第四圖A係為神經上皮細胞貼附後神經管狀細胞呈現之型態；第四圖B係為第四圖A培養兩天後細胞伸展之型態圖。因此，可由細胞型態觀察分析，而可確認由實例一至實例三所所分化培養而成者係為神經上皮細胞。
表二：第二神經誘導培養基
實例四：處理神經上皮細胞
首先，以1%基底膜基質(matrigel，Becton-Dickinson)覆蓋於預先放有蓋玻片之4孔盤約6小時後，移除基底膜基質，再以磷酸鹽緩衝液清洗一次。而後，將實例三中所分化之神經上皮細胞以機械力處理為較小團塊細胞，接種於經上述處理之4孔盤上，於37℃、5%CO2 培養一天，使該神經上皮細胞貼附並向外伸展而呈玫瑰環狀之類神經管細胞型態。
實例五：配製一級抗體及二級抗體
為了進一步驗證所培養分化出之細胞為神經上皮細胞，需分別利用不同之一級抗體及二級抗體，以免疫細胞染色法進行觀察。
因此，將欲使用之一級抗體配製於3%馬血清並儲存於4℃，反應時間為24小時；而相對應於一級抗體之二級抗體係配製於磷酸鹽緩衝液，濃度為1：500，於室溫避光環境下作用1小時，其中，於所使用之一級抗體、配置濃度及其相對應之二級抗體如下表三所示。
表三：抗體
實例六；以免疫細胞染色法鑑定神經上皮細胞
取實例四中經處理之細胞，並移除細胞培養基，以磷酸鹽緩衝液清洗。用4%三聚甲醛200 μl加於細胞上，4℃作用5分鐘進行細胞固定後移除，以磷酸鹽緩衝液清洗。再加入0.3%萃取劑(Triton)之磷酸鹽緩衝液200μl於4℃作用5~10分鐘，進行細胞膜打洞後移除磷酸鹽緩衝液清洗3次，每次5分鐘。加入5%馬血清，室溫下作用1小時進行填充(blocking)，而後移除。分別加入實例五中所配置之一級抗體，而後移除並清洗，再加入相對應之二級抗體，而後移除並清洗。
再取濃度為1 μg/ml之DAPI螢光染色劑200 μl加入細胞，室溫避光反應10分鐘，移除後進行清洗，加入磷酸鹽緩衝液，進行封片。於正立式螢光顯微鏡下觀察並以AlphaEaseFC軟體計算表現量。
以顯微鏡觀察結果如第五圖所示，其中，第五圖A係為分化第10天之神經上皮細胞分別以一級抗體Oct4、Nestin、Sox2、Nanog、Zo-1表現之免疫螢光表現圖；第五圖B係為分化第10天之神經上皮細胞以一級抗體Sox1、Pax6、Zic1、N-cadherin表現之免疫螢光表現圖；第五圖C係為係為分化第10天之神經上皮細胞以一級抗體BF1表現之免疫螢光表現圖；第五圖D係為神經上皮細胞經貼附後以一級抗體Tuj1表現神經軸突之免疫螢光表現圖。而經軟體分析後各基因之表現量如下表四所示可知，經培養分化10天之細胞皆能高度表現神經標記與前腦標記因子。
表四：各基因之表現量
因此，由第五圖A~D及表四之結果可知，由實例一至三所培養分化之細胞中確實可以表現神經標記以及前腦標記因子，而降低胚胎幹細胞標記分子之表現量，且確實具有神經軸突之表現，因此，由實例一至三所培養分化之細胞的確為神經上皮細胞，並且藉由該實例一至三之培養分化方法確可獲得高純度之神經上皮細胞。
由上述各該實例可知本發明所揭一種將萬能幹細胞分化成神經上皮細胞之分化方法，係使用添加有Wnt訊息促效劑、轉化因子β訊息抑制劑及纖維母細胞生長因子訊息促效劑之該第一神經誘導培養基，不僅可縮短萬能幹細胞分化為神經上皮細胞之分化時間，並可獲得高純度之神經上皮細胞而可高度表現神經標記，藉此，可將該神經上皮細胞於臨床上進一步分化為成熟神經細胞而應用於再生醫學、篩選神經疾病藥物等。
以上僅是藉由較佳實例詳細說明本發明，對於各該實施例所做的任何簡單修改或是變化，均應為本案申請專利範圍所得涵攝者。
第一圖係為人類胚幹細胞培養於無飼養層細胞環境下mTESR1培養液中之生長型態圖。
第二圖係為分化過程中加入藥物Bio、藥物SB431542及纖維母細胞生長因子2之第一神經誘導培養液懸浮培養之細胞型態圖。
第三圖A係以顯微鏡倍率100倍顯微鏡下觀察之細胞型態圖。
第三圖B係以顯微鏡倍率200倍顯微鏡下觀察之細胞型態圖。
第三圖C係以顯微鏡倍率400倍顯微鏡下觀察之細胞型態圖。
第四圖A係為將分化後之神經上皮細胞貼附後神經管狀細胞呈現之細胞型態圖。
第四圖B係為第四圖A培養兩天後細胞伸展之型態圖。
第五圖A係為神經上皮細胞以一級抗體Oct4,Nestin,Sox2,Nanog,Zo-1表現之免疫螢光表現圖。
第五圖B係為神經上皮細胞以一級抗體Sox1,Pax6,Zic1,N-cadherin表現之免疫螢光表現圖。
第五圖C係為神經上皮細胞以一級抗體BF1表現之免疫螢光表現圖。
第五圖D係為神經上皮細胞經貼附後以一級抗體Tuj1表現神經軸突之免疫螢光表現圖。

Claims (3)

  1. 一種用以誘導神經分化之組合物，其係由濃度為.0.1~0.5μM之藥物Bio(6-bromoindirubin-3' oxime)、濃度為1~20μM之藥物SB431542以及濃度為0.1~100ng/ml之纖維母細胞生長因子2(FGF2)所組成。
  2. 一種將萬能幹細胞分化成神經上皮細胞之分化方法，主要包含有下列步驟：步驟a：將一人類胚胎幹細胞懸浮培養形成一類胚體(embryoid body)；步驟b：將該類胚體培養於添加如申請專利範圍第1項所述用以誘導神經分化之組合物之DMEM/F12培養基中，培養約2天，而使該類胚體分化形成神經上皮細胞。
  3. 依據申請專利範圍第2項所述將萬能幹細胞分化成神經上皮細胞之分化方法，其係更包含有一步驟c，係將步驟b中所使用之該培養基更換為神經幹細胞培養基(Neurobasal medium)，而用以使該培養之細胞繼續分化為神經上皮細胞。
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