JP5823925B2 - 神経細胞への分化誘導培地、および、神経細胞への分化誘導方法 - Google Patents
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Description
上記第一神経細胞への分化誘導培地は、Wntシグナルアゴニスト(Wnt−signal agonist)、形質転換因子βシグナル阻害剤(TGFβ−signal inhibitor)及び線維芽細胞増殖因子シグナルアゴニスト(FGF−signal agonist)を含むことを特徴とする。
上記方法において、該多能性幹細胞は、ヒト胚性幹細胞株及び誘導多能性幹細胞から選ばれるものである。
本発明の構成により、多能性幹細胞から神経上皮細胞への分化時間を有効的に短縮することができ、純度の高い神経上皮細胞を得ることができる。
以下、本発明の一実施例による多能性幹細胞を神経上皮細胞に分化させる神経細胞への分化誘導方法を説明する。多能性幹細胞を凝集させて胚様体を形成した後、Wntシグナルアゴニスト(Wnt−signal agonist)、形質転換因子βシグナル阻害剤(TGFβ−signal inhibitor)及び線維芽細胞増殖因子シグナルアゴニスト(FGF−signal agonist)を含む神経細胞への分化誘導培地を用いて該多能性幹細胞に作用させ、該多能性幹細胞を分化させて神経上皮細胞を形成させる。
多能性幹細胞とは、哺乳類動物の胚性幹細胞、外来の遺伝子またはタンパク質の発現によって形成する誘導多能性幹細胞、またはその他のすべての体細胞に分化できる特性を有する多能性細胞である。下記の実施例で使用される多能性幹細胞は、ヒト胚性幹細胞TW1であり、図1のA〜Cに示すとおりである。図1のA〜Cは、該ヒト胚性幹細胞がフィーダー細胞のない(non−feeder cells)環境下で、mTESR1培地中での成長形態を示す。
ヒト胚性幹細胞TW1を37℃、5%CO2下で培養し、培養した胚性幹細胞の小さな細胞塊を、20%血清替代品(knock−out replacement serum,KSR、Invitrogen(登録商標),USA)を含むDMEM−F12培地中で懸濁培養し、37℃、5%CO2条件下で2日間培養し、該胚性幹細胞を凝集させ胚様体(embryoid bodies)の細胞塊を形成させる。
実施手順1中の該胚様体細胞塊を15mLの遠心用チューブに入れ、室温下で細胞を沈降させ、上澄み液を除去する。神経細胞への分化誘導に用いられる第一培地500mLを調製し、その組成は表1に示すとおりである。さらに、濃度0.5μMの薬品BIO、濃度10μMの薬品SB431542及び濃度10ng/mLの線維芽細胞増殖因子2を加える。なお、該第一培地の組成成分のそれぞれの濃度は、上記説明に限定されるものではなく、具体的には、該薬品BIOの濃度範囲は0.05μM〜50μMの範囲内、該薬品SB431542の濃度範囲は1μM〜100μMの範囲内、該線維芽細胞増殖因子2の濃度範囲は1ng/mL〜100ng/mLの範囲内とすることができる。
神経上皮細胞を形成させる。図2に示すように、その細胞は球状構造であって、辺縁は徐
々に管状になって規則的かつ密な構造となる。
第一培地の組成は表1に示すとおりである。
実施手順2の神経上皮細胞を採取し、第一培地を第二培地に変更する。さらに濃度10ng/mLの線維芽細胞増殖因子2を加える。2日間ごとに第二培地を新しくし、該神経上皮細胞の分化を続けさせる。ここにおいて、該第二培地の成分は表2に示すとおりである。
まず、予めカバーガラスが設置されてある4ウェルプレートを、1%基底膜マトリックス(matrigel(登録商標),Becton−Dickinson)で覆い、約6時間後に基底膜マトリックスを除去して、リン酸塩バッファーで一回洗浄する。次に、実施例3中の分化した神経上皮細胞を機械処理で小さな細胞塊にし、上記のように処理された4ウェルプレート上に接種し、37℃、5%CO2下で一日間培養して、該神経上皮細胞を貼り付けして且つ外に向かって伸展するバラ環状の類神経管細胞形態となるようにする。
培養によって分化した細胞が神経上皮細胞であることをさらに検証するために、それぞれ異なる一次抗体及び二次抗体を利用して、免疫細胞染色法で観察を行う。
よって、使用する一次抗体を3%馬血清中において4℃で保存し、反応時間は24時間である。一次抗体に対応する二次抗体をリン酸塩バッファー中で調製し、濃度を1:500となるようにする。室温で光を避けた環境下で1時間反応させる。ここにおいて、使用する一次抗体、調製濃度及びそれに対応する二次抗体は表3に示すとおりである。
実施手順4中の処理済細胞を採取し、細胞培地を除去し、リン酸塩バッファーで洗浄する。4%のトリオキサン200μlを細胞に加え、4℃で5分間作用させ細胞を固定した後、除去してリン酸塩バッファーで洗浄する。さらに0.3%抽出剤(Triton)のリン酸塩バッファー200μlを加え、4℃下で5〜10分間作用させる。細胞膜に穴を空け、リン酸塩バッファーを除去した後に3回洗浄し、各回は5分間とする。5%馬血清を加え、室温下で1時間作用させブロッキング(blocking)を行い、その後除去する。それぞれ実施手順5中で調製した一次抗体を加え、その後除去して洗浄を行った後、対応する二次抗体を加え、除去してから洗浄する。
各遺伝子の発現量
本発明は、多能性幹細胞を純度の高い神経上皮細胞に分化させることに好適に応用することができる。
Claims (10)
- Wntシグナルアゴニスト、形質転換因子βシグナル阻害剤、及び線維芽細胞増殖因子シグナルアゴニストを含み、多能性幹細胞を神経上皮細胞に分化させることに用いられることを特徴とする神経細胞への分化誘導培地。
- 前記Wntシグナルアゴニストは、Wntリガンドおよびグリコーゲン合成酵素キナーゼ−3β阻害剤からなる群から選ばれるものであることを特徴とする請求項1に記載の神経細胞への分化誘導培地。
- 前記Wntシグナルアゴニストは、濃度が0.05μM〜50μMの前記グリコーゲン合成酵素キナーゼ−3β阻害剤を含み、
前記グリコーゲン合成酵素キナーゼ−3β阻害剤は構造式1で表されるものであることを特徴とする請求項1または2に記載の神経細胞への分化誘導培地。
- 前記形質転換因子βシグナル阻害剤は、骨形成タンパク質阻害剤、コーディンタンパク質、ノギンタンパク質、ドルソモルフィンタンパク質、Smad1阻害剤、Activin/Nodal受容体阻害剤、及びSmad2/3阻害剤からなる群から選ばれるものであることを特徴とする請求項1に記載の神経細胞への分化誘導培地。
- 前記形質転換因子βシグナル阻害剤は、濃度が1μM〜100μMの前記Activin/Nodal受容体阻害剤を含み、
前記Activin/Nodal受容体阻害剤は、構造式2で表されるものであることを特徴とする請求項4に記載の神経細胞への分化誘導培地。
- 前記線維芽細胞増殖因子シグナルアゴニストは、線維芽細胞増殖因子2、線維芽細胞増殖因子受容体のリガンド、活性化細胞外シグナル調節キナーゼアゴニスト、活性化c−jun N端タンパク質キナーゼアゴニスト、及び活性化ホスホイノシチド3キナーゼアゴニストからなる群から選ばれるものであることを特徴とする請求項1に記載の神経細胞への分化誘導培地。
- 前記線維芽細胞増殖因子シグナルアゴニストは、濃度が1ng/mL〜100ng/mLである前記線維芽細胞増殖因子2であることを特徴とする請求項6に記載の神経細胞への分化誘導培地。
- 多能性幹細胞を懸濁培養して胚様体を形成するステップaと、
当該胚様体を神経細胞への分化誘導に用いられる第一培地中で培養して神経上皮細胞に分化するステップbとを含む、多能性幹細胞を神経上皮細胞に分化させる方法であって、
前記第一培地は、請求項1〜7に記載の神経細胞への分化誘導培地からなる群から選ばれるものであることを特徴とする神経細胞への分化誘導方法。 - 前記第一培地を神経細胞への分化誘導に用いられる第二培地に変更し、さらに神経上皮細胞に分化させるステップcを、さらに含むことを特徴とする、請求項8に記載の神経細胞への分化誘導方法。
- 前記ステップaにおける多能性幹細胞は、ヒト胚性幹細胞株及び誘導多能性幹細胞からなる群から選ばれるものであることを特徴とする請求項8または9に記載の神経細胞への分化誘導方法。
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