KR101534111B1 - 인간각막내피세포 배양용 배지 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인간각막내피세포의 증식을 위한 배지를 제공하고, 인간각막내피세포가 고유의 모자이크 패턴을 잃지 않도록 배양할 수 있는 배지도 제공한다.

Description

인간각막내피세포 배양용 배지{Medium for Cultivation of Human Corneal Endothelial Cell}

본 발명은 인간각막내피세포 배양용 배지에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 인간각막내피세포의 증식을 위한 배지 또는 인간각막내피세포가 고유의 모자이크 패턴을 잃지 않도록 배양할 수 있게 하는 배지에 관한 것이다.

인간각막내피세포(Human corneal endothelial cell)는 일반적으로 증식 능력이 제한되어 있는 것으로 알려져 있다(Engelmann K, Bednarz J, Bohnke M. Endothelial cell transplantation and growth behavior of the human corneal endothelium. Ophthalmologe. 1999;96:555-62).

그런데, 최근 인간각막내피세포가 시험관 내(in vitro)에서 분리되고 배양될 수 있음이 보고된바 있다(Joyce NC. Proliferative capacity of the corneal endothelium. Prog Retin Eye Res. 2003;22:359-89).

하지만, 인간각막내피세포의 증식을 위한 배지의 개발 필요성은 여전하고, 특히 생체 내(in vivo) 배양을 가능하게 하는 배지의 개발은 더욱 절실하다 할 것이다.

지금까지 여러 가지 배지들이 생체 내(in vivo) 인간각막내피세포 배양에 이용되어 왔는데, 신경줄기세포를 배양하기 위해 사용되는 스피어 포밍 어세이(Sphere forming assay)가 각막내피세포를 분리하고 배양하는데 유용한 것으로 제시되기도 하였다(Hulspas R, Quesenberry PJ. Characterization of neurosphere cell phenotypes by flow cytometry. Cytometry. 2000;40:245-50; Yokoo S, Yamagami S, Yanagi Y, Uchida S, Mimura T, Usui T, Amano S. Human corneal endothelial cell precursors isolated by sphere-forming assay. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2005;46:1626-31).

하지만, 이들 배지들은 생체 내(in vivo) 각막내피세포배양에서 그리 유효한 효과를 주지는 못하였는데, 각막내피세포배양의 주요 문제가 배양과정을 거쳐감에 따라 배양 세포의 모양이 섬유아세포의 모양을 띄는 것이기 때문이다. 여러 세포 계대를 거치면서 인간각막내피세포는 원래의 모자이크 패턴을 잃고 세포질 돌기가 늘어나는 특성을 보인다. 비록 세포 모양의 변화가 세포 기능의 변화를 항상 의미하는 것은 아니지만, 세포 모양은 중요한 세포 특성의 하나가 될 수 있기 때문에 중요한 요소라 할 수 있다. 따라서, 고유의 모자이크 패턴을 잃지 않도록 배양할 수 있는 배지의 개발은 대단히 중요하다.

본 발명과 일부 유사한 발명으로서, 대한민국 특허공개번호 제10-2007-0053152호(공개일자 2007년 05월 23일)에는, 인간의 각막 내피세포 및 각막세포 이식을 위한 세포배양 및 수득방법이 기재되어 있다.

본 발명에서는 인간각막내피세포의 증식을 위한 배지 또는 인간각막내피세포가 고유의 모자이크 형태를 유지하면서 배양할 수 있는 배지를 개발하여 제공하고자 한다.

본 발명은 본 발명의 제1형태로, Opti-MEM-I에 FBS, 콘드로이친 설페이트(chondroitin sulfate), 아스코르브산(ascorbic acid), CaCl₂, EGF, NGF, 페니실린, 스트렙토마이신을 첨가하여 제조된 것을 특징으로 하는 인간각막내피세포 배양용 배지를 제공한다. 이때, 상기 본 발명의 제1형태에 따른 배지는, 바람직하게 Opti-MEM-I에 FBS을 8%(w/v), 콘드로이친 설페이트 0.08% (w/v)의 농도로, 아스코르브산을 20㎍/ml의 농도로, CaCl₂을 200mg/L의 농도로, EGF를 5ng/ml의 농도로, NGF를 20ng/ml의 농도로, 페니실린, 스트렙토마이신을 각각 1:100의 농도로 첨가하여 제조된 것이 좋다.

상기 Opti-MEM-I는 공지의 세포배양용 배지로, 일 예로, Invitrogen 사에서 구입가능하다. 또한, 상기 FBS는 'Fetal Bovine Serum'이고, 상기 EGF는 'Epidermal Growth Factor'이며, 상기 NGF는 'nerve growth factor'이다.

한편, 본 발명은 본 발명의 제2형태로, DMEM/F12에 B27, 페니실린, 스트렙토마이신을 첨가하여 제조된 것을 특징으로 하는 인간각막내피세포 배양용 배지를 제공한다. 이때, 상기 본 발명의 제2형태에 따른 배지는, DMEM/F12에, 바람직하게 B27을 1:50의 농도로, 페니실린, 스트렙토마이신을 각각 1:100의 농도로 첨가하여 제조된 것이 좋다.

상기 DMEM/F12는 공지의 세포배양용 배지로서 상업적으로 판매되는 배지이다. 또한, 상기 B27은 무혈청배지에서 혈청대신 사용되는 물질이다(Brewer GJ, Torricelli JR, Evege EK, Price PJ. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 1993 Aug 1;35(5):567-76.).

한편, 본 발명은 본 발명의 제3형태로, DMEM/F12에 B27, EGF, 페니실린, 스트렙토마이신을 첨가하여 제조하는 것을 특징으로 하는 인간각막내피세포 배양용 배지를 제공한다. 이때, 상기 본 발명의 제3형태에 따른 배지는, 바람직하게 DMEM/F12에 B27을 1:50의 농도로, EGF을 20 ng/mL의 농도로, 페니실린, 스트렙토마이신을 각각 1:100의 농도로 첨가하여 제조되는 것이 좋다.

본 발명의 제1형태에 따른 배지(배지A)를 이용할 경우, 인간각막내피세포를 생체 내(in vivo)에서 효율적으로 증식시킬 수 있다.

또한, 본 발명의 제2형태에 따른 배지(배지B) 또는 제3형태에 따른 배지(배지BE)를 이용할 경우, 인간각막내피세포가 고유의 모자이크 형태를 유지하면서 배양되게 할 수 있다.

도 1은 각각의 배지에서 배양된 인간각막내피세포의 모양을 도립 위상차 현미경 사진으로 보여준다. 배지A에서 배양된 세포는 섬유모세포같이 세포질 돌기의 연장이 관찰된다. 하지만, 배지B, 배지 BE에서 배양된 세포는 인간각막내피세포 고유의 모자이크 패턴을 보인다.
도 2는 배지 종류에 의한 신경줄기세포의 표지자인 네스틴(nestin)의 발현 여부(도면에서 녹색으로 표시)를 보여준다.
도 3은 배지 종류에 의한 줄기세포에서 발현되는 OCT-3/4의 발현 여부(도면에서 녹색으로 표시)를 보여준다.
도 4는 배지 종류에 의한 신경줄기세포 표지자인 GFAP의 발현 여부(도면에서 녹색으로 표시)를 보여준다.
도 5는 배지의 종류에 의한 밀착연접(tight junction) 단백질인 ZO-1의 발현 여부(도면에서 녹색으로 표시)를 보여준다.
도 6은 배지의 종류에 의한 Na⁺-K⁺ ATPase 발현 여부(도면에서 녹색으로 표시)를 보여준다.
도 7은 ZO-1, Na⁺-K⁺ ATPase, GFAP, OCT 3/4, 네스틴(nestin) 및 베타-카테닌(β-catenin)의 발현 여부를 보여주는 웨스턴 블랏 사진도이다.
도 8은 배지의 종류에 의한 인간각막내피세포의 증식 결과를 보여주는 그래프이다.

본 발명에서는 다양한 배지를 조성한 후, 인간각막내피세포의 배양시 이들 배지가 세포의 형태, 증식 정도 및 세포 내 단백질 발현에 미치는 영향을 확인하였다. 실험 결과, 배지B, 배지BE는 세포 모양이 모자이크 패턴이 되도록 한다는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 배지A는 인간각막내피세포의 증식을 강화하는 것으로 확인할 수 있었다.

한편, 배지A에서 배양한 세포는 ZO-1, NA+-K+ ATPase, GFAP, OCT3/4, 네스틴(nestin)의 발현 양상이 높게 나타남을 확인할 수 있었다.

ZO-1 및 NA+-K+ ATPase의 발현은 본 발명에서 인간각막내피세포의 분화를 알기 위해 사용되었는데, ZO-1은 밀착연접(tight juction)의 표지자로(Petroll WM, Barry-Lane PA, Cavanagh HD, Jester JV. ZO-1 reorganization and myofibroblast transformation of corneal endothelial cells after freeze injury in the cat. Exp Eye Res. 1997;64(2):257-67), 내피분화에 대한 표지자로서의 역할을 수행한다.

NA+-K+ ATPases는 인간각막내피세포에 풍부히 존재하고, 각막 기질을 탈수시키는데, 인간각막내피세포의 기능에 중요한 역할을 한다(Hatou S,　Higa K,　Inagaki E,　Yoshida S,　Kimura E,　Hayashi R,　Tsujikawa M,　Tsubota K,　Nishida K,　Shimmura S. Validation of Na,K-ATPase　 Pump Function of　Corneal　Endothelial Cells　for　Corneal Regenerative Medicine. Tissue Eng Part C Methods.　2013 May 14; Hatou S. Hormonal regulation of Na+/K+-dependent　ATPase　activity and pump function in　cornealendothelial cells. Cornea.　2011;30 Suppl 1:S60-6).

신경교세포(Glial cell)의 표지자인 GFAP와 배아줄기세포의 발현 수준을 지배하는 중요 전사인자인 OCT-3/4의 발현은 인간각막내피세포가 신경능선(neural crest)에서 유래하였다는 것을 반영한다. GFAP는 신경줄기세포에 풍부하며, 분화와 연관되어있는 것으로 보고되어 왔다 (Hainfellner JA,　Voigtlander T,　Strobel T,　Mazal PR,　Maddalena AS,　Aguzzi A,　Budka H. Fibroblasts can express　glial　fibrillary acidic protein (GFAP) in vivo. J Neuropathol Exp Neurol.　2001;60:449-61; Triolo D,　Dina G,　Lorenzetti I,　Malaguti M,　Morana P,　Del Carro U,　Comi G,　Messing A,　Quattrini A,　Previtali SC. Loss of glial fibrillary acidic protein (GFAP) impairs Schwann cell　proliferation　and delays nerve regeneration after damage. J Cell Sci.　2006;119(Pt 19):3981-93). OCT-3/4는 배아줄기세포의 발현 수준을 지배하는 중요 전사인자로 OCT-3/4의 다운레귤레이션(downregulation)은 생체 내(in vivo) 신경줄기세포의 분화를 촉진하고, OCT-3/4는 신경줄기세포 분화에 필수적인 조절자인 것으로 알려져 있다 (Okumura-Nakanishi S, Saito M, Niwa H, Ishikawa F. Oct-3/4 and Sox2 regulate Oct-3/4 gene in embryonic stem cells. J Biol Chem. 2005;280:5307-17; Okuda T,　Tagawa K,　Qi ML,　Hoshio M,　Ueda H,　Kawano H,　Kanazawa I,　Muramatsu M,　Okazawa H. Oct-3/4 repression accelerates differentiation of neural progenitor cells in vitro and in vivo. Brain Res Mol Brain Res.　2004;132:18-30). 본 발명에서 GFAP의 발현은 다른 배지에 비해 배지A에서 더 높았고, OCT-3/4의 발현도 다른 배지에 비해 배지A에서 높았다.

네스틴(Nestin)은 신경줄기세포의 표지자이다 (Park D,　Xiang AP,　Mao FF,　Zhang L,　Di CG,　Liu XM,　Shao Y,　Ma BF,　Lee JH,　Ha KS,　Walton N,　Lahn BT.Nestin is required for the proper self-renewal of neural stem cells. Stem Cells.　2010;28:2162-71). 네스틴의 발현은 배지A에서 배양된 세포에서 가장 높았다.

이상의 결과를 종합하면, 배지A가 인간각막내피세포의 배양에 가장 적합한 것으로 결론내릴 수 있었다. 하지만, 배지A에서 배양된 세포의 모양은 섬유모세포같은 모양이었다. 따라서, 인간각막내피세포 고유의 모자이크 패턴을 잃지 않도록 배양하기를 의도한다면, 배지B, 배지BE가 배지A에 비해 더 유용할 수 있다.

결론적으로, 인간각막내피세포의 증식을 우선시 한다면, 배지A가 바람직할 것이고, 인간각막내피세포가 고유의 모자이크 패턴을 잃지 않고 배양되기를 원한다면, 배지B, 배지BE가 유용할 것이다.

이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예 및 실험예를 통해 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예 및 실험예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.

[ 실시예 1~4: 인간각막내피세포의 배양을 위한 배지의 제조]

인간각막내피세포세포는 하기에서 준비된 실시예1~4의 다양한 배지에서 이전에 알려진 방법에 따라 배양되었다(Yokoo S, Yamagami S, Yanagi Y, Uchida S, Mimura T, Usui T, Amano S. Human corneal endothelial cell precursors isolated by sphere-forming assay. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2005;46:1626-31; Yoon JJ, Wang EF, Ismail S, McGhee JJ, Sherwin T. Sphere-forming cells from peripheral cornea demonstrate polarity and directed cell migration. Cell Biol Int. 2013 Apr 25).

·실시예 1 배지 제조 - 본 발명에서 배지A로 명명된 실시예 1의 배지는, Opti-MEM-I에 FBS 8%(w/v), 콘드로이친 설페이트(chondroitin sulfate) 0.08%(w/v), 아스코르브산(ascorbic acid) 20㎍/ml, CaCl₂ 200mg/L, EGF 5ng/ml, NGF 20ng/ml, 페니실린, 스트렙토마이신을 각각 1:100의 농도로 첨가하여 제조하였다.

·실시예 2 배지 제조 - 본 발명에서 배지B로 명명된 실시예 2의 배지는, DMEM/F12에 B27을 1:50의 농도로, 페니실린, 스트렙토마이신을 각각 1:100의 농도로 첨가하여 제조하였다.

·실시예 3 배지 제조 - 본 발명에서 배지E로 명명된 실시예 3의 배지는 DMEM/F12에 EGF (20 ng/mL), 페니실린, 스트렙토마이신을 각각 1:100의 농도로 첨가하여 제조하였다.

·실시예 4 배지 제조 - 본 발명에서 배지BE로 명명된 실시예 3의 배지는, DMEM/F12에 B27을 1:50의 농도로, EGF 20 ng/mL, 페니실린, 스트렙토마이신을 각각 1:100의 농도로 첨가하여 제조하였다.

[ 실험예 1: 상기 실시예 1~4의 배지를 이용하여 인간각막내피세포를 배양한 후, 세포 형태 관찰]

인간각막내피세포 (5×10⁴세포/mL)를 1 주일 동안 상기 실시예 1~4에서 제조한 배지에서 배양하였고, 세포의 형태는 위상차 현미경을 사용하여 관찰했다.

실험 결과, 배양이 진행됨에 따라 세포의 외형이 인간각막내피세포로 만들어짐을 확인할 수 있었다. 세포의 형태는 위상차 도립 현미경법에 의해 평가했는데, 사용한 배지(실시예 1~4)에 따라 세포가 서로 다른 모양을 나타내었다 (도 1). 도 1은 도립 위상차 현미경에 의한 세포의 모양을 보여준다.

도 1에서 보는 바와 같이 배지A에서 배양된 세포는 섬유모세포같은 모양인 세포질 돌기의 연장이 관찰되었다. 하지만, 배지 B, 배지 BE에서 배양된 세포는 인간각막내피세포 고유의 모자이크 패턴을 보였다.

[ 실험예 2: 상기 실시예 1~4의 배지를 이용하여 인간각막내피세포를 배양한 후, 인간각막내피세포 내 여러 단백질의 발현 여부 조사]

상기 실시예 1~4에서 제조한 배지에 인간각막내피세포를 각각 배양하였다. 신경줄기세포의 표지자인 네스틴(nestin)의 발현은 도 2에 나타내었다. 배지A에서 배양된 세포에서 상대적으로 높게 발현됨(도면에서 녹색으로 표시)을 확인할 수 있었다.

또한, 줄기세포에서 발현되는 OCT-3/4의 발현은 도 3에 나타내었다. 다른 배지에 비해 배지A에서 배양한 세포에서 높게 나타남을 확인할 수 있었다.

또한, 신경줄기세포 표지자인 GFAP의 발현은 도 4에 나타내었다. 배지A에서 배양된 세포가 높은 신호의 GFAP을 발현했다.

또한, 밀착연접(tight junction) 단백질인 ZO-1의 발현은 도 5에 나타내었다. 배지B, 배지BE에서 배양한 세포에서 ZO-1이 강양성으로 염색(녹색)되었다.

또한, Na⁺-K⁺ ATPase 발현은 도 6에 나타내었다. 배지A에서 배양한 세포에서 높게 나타났다.

한편, Zo-1, Na⁺-K⁺ ATPase, GFAP, OCT 3/4, 네스틴(nestin) 및 베타-카테닌(β-catenin)의 발현은 웨스턴 블랏에 의해서도 평가되었다 (도 7). 배지A, 배지B에서 배양된 세포는 ZO-1의 높은 발현을 보임이 확인되었다. 또한, 배지A에서 배양된 세포는 Na⁺-K⁺ ATPase, GFAP, 네스틴(nestin)의 높은 발현을 보였다. 또한, 배지A, 배지B에서 배양된 세포는 OCT3/4에 대해 높은 발현 정도를 보였다.

[ 실험예 3: 상기 실시예 1~4의 배지를 이용하여 인간각막내피세포를 배양한 후, 증식 여부 평가]

인간각막내피세포의 증식은 프로토콜에 따라 CCK-8 assay (Dojindo, Kumamoto, Japan)를 이용하여 측정하였다. 인간각막내피세포(웰 당 10³ 세포)를 96-웰 플레이트에 넣고, 5% CO₂를 포함한 습한 분위기에서 2일간 배양하였다. 세포는 5% CO₂ 하 37℃에서 1일, 4일, 7일 동안 다양한 배지(배지A, 배지B, 배지BE, 배지E)에서 배양되었다. CCK-8 용액을 첨가하지 않은 100ul의 배지를 대조군으로 사용했다. 광학 밀도를 ELISA 리더 (SpectraMax 384 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 450nm에서 측정한 결과를 평균하여 표시했다. 증식 속도는 일치하는 블랭크를 뺀 후 대조군의 백분율로 표현하였다. 배지E에서 세포의 증식 속도가 최소이기 때문에, E배지의 세포 증식 속도를 대조군으로 하여 비율로 표시하였다.

실험결과, 도 8에서 보는 바와 같이 4일째와 7일째, 배지B, 배지BE의 세포가 배지E에 비해 상대적으로 높은 성장 속도를 보여 주었고, 배지A는 배지B 및 배지BE에 비해 월등히 높게 나타났다.

Claims (6)

1. Opti-MEM-I에 FBS, 콘드로이친 설페이트(chondroitin sulfate), 아스코르브산(ascorbic acid), CaCl₂, EGF, NGF, 페니실린 및 스트렙토마이신을 첨가하여 제조된 인간각막내피세포 배양용 배지에서 인간각막내피세포를 배양하여 증식을 유도하고,
   DMEM/F12에 B27, 페니실린 및 스트렙토마이신을 첨가하여 제조된 인간각막내피세포 배양용 배지에서 인간각막내피세포를 배양하여 인간각막내피세포의 모자이크 패턴을 유지하는 것을 특징으로 하는 인간각막내피세포의 배양방법.
   
2. Opti-MEM-I에 FBS, 콘드로이친 설페이트(chondroitin sulfate), 아스코르브산(ascorbic acid), CaCl₂, EGF, NGF, 페니실린 및 스트렙토마이신을 첨가하여 제조된 인간각막내피세포 배양용 배지에서 인간각막내피세포를 배양하여 증식을 유도하고,
   DMEM/F12에 B27, EGF, 페니실린 및 스트렙토마이신을 첨가하여 제조된 인간각막내피세포 배양용 배지에서 인간각막내피세포를 배양하여 인간각막내피세포의 모자이크 패턴을 유지하는 것을 특징으로 하는 인간각막내피세포의 배양방법.
   
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