JP6161603B2 - 膵臓ホルモン産生細胞の生産方法及び膵臓ホルモン産生細胞、並びに分化誘導促進剤 - Google Patents
膵臓ホルモン産生細胞の生産方法及び膵臓ホルモン産生細胞、並びに分化誘導促進剤 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6161603B2 JP6161603B2 JP2014516862A JP2014516862A JP6161603B2 JP 6161603 B2 JP6161603 B2 JP 6161603B2 JP 2014516862 A JP2014516862 A JP 2014516862A JP 2014516862 A JP2014516862 A JP 2014516862A JP 6161603 B2 JP6161603 B2 JP 6161603B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- medium
- producing
- fgf
- differentiation
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0676—Pancreatic cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/105—Insulin-like growth factors [IGF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/119—Other fibroblast growth factors, e.g. FGF-4, FGF-8, FGF-10
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/12—Hepatocyte growth factor [HGF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/15—Transforming growth factor beta (TGF-β)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/16—Activin; Inhibin; Mullerian inhibiting substance
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/30—Hormones
- C12N2501/335—Glucagon; Glucagon-like peptide [GLP]; Exendin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/30—Hormones
- C12N2501/38—Hormones with nuclear receptors
- C12N2501/385—Hormones with nuclear receptors of the family of the retinoic acid recptor, e.g. RAR, RXR; Peroxisome proliferator-activated receptor [PPAR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/40—Regulators of development
- C12N2501/415—Wnt; Frizzeled
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
- C12N2506/22—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from pancreatic cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
- C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells
Landscapes
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
多能性幹細胞又は膵臓組織幹/前駆細胞から膵臓ホルモン産生細胞を生産する膵臓ホルモン産生細胞の生産方法であって、
多能性幹細胞又は膵臓組織幹/前駆細胞から膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導過程で、下記(1)〜(3)から選ばれる少なくとも1種の分化誘導促進剤を培地中に添加することを特徴とする膵臓ホルモン産生細胞の生産方法、
(1)配列番号1に記載の塩基配列からなるDNAによりコードされるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(2)配列番号1に記載の塩基配列からなるDNAによりコードされるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導促進作用を持つポリペプチド、
(3)配列番号1に記載の塩基配列からなるDNA、又はこのDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAを外来遺伝子として組み込んだ細胞の培養上清。
(A1)TGF−β(トランスフォーミング増殖因子β)スーパーファミリーに属する増殖因子の存在下で多能性幹細胞を培養する工程、
(B1)上記工程(A1)で得られた細胞をFGF(線維芽細胞増殖因子)の存在下で培養する工程、
(C1)上記工程(B1)で得られた細胞をレチノイドの存在下で培養する工程、
(D1)上記工程(C1)で得られた細胞をγ−セクレターゼ阻害剤の存在下で培養する工程、及び
(E1)上記工程(D1)で得られた細胞を、エキセンジン−4、HGF(肝細胞増殖因子)、IGF−1(インスリン様増殖因子−1)、及びニコチンアミドからなる群から選択される少なくとも1種の因子の存在下で培養する工程、を含み、
上記工程(A1)〜(E1)の少なくとも1つの工程で上記分化誘導促進剤を培地中に添加する上記[1]記載の膵臓ホルモン産生細胞の生産方法。
(A2)TGF−βスーパーファミリーに属する増殖因子と、Wnt(ウィングレス型MMTV組み込み部位)ファミリーに属する増殖因子及びGSK−3(グリコーゲン合成酵素キナーゼ−3)阻害剤からなる群から選択される少なくとも1種の因子との存在下で多能性幹細胞を培養する工程、
(B2)上記工程(A2)で得られた細胞をTGF−βスーパーファミリーに属する増殖因子の存在下で培養する工程、
(C2)上記工程(B2)で得られた細胞をレチノイドの存在下で培養する工程、
(D2)上記工程(C2)で得られた細胞を、cAMP(環状アデノシン一リン酸)増加剤、デキサメタゾン、TGF−β1型受容体阻害剤、及びニコチンアミドからなる群から選択される少なくとも1種の因子の存在下で培養する工程、を含み、
上記工程(A2)〜(D2)の少なくとも1つの工程で上記分化誘導促進剤を培地中に添加する上記[1]記載の膵臓ホルモン産生細胞の生産方法。
(A3)TGF−βスーパーファミリーに属する増殖因子、レチノイド、FGF、及びニコチンアミドの非存在下で膵臓組織幹/前駆細胞を培養する工程、
(B3)上記工程(A3)で得られた細胞をTGF−βスーパーファミリーに属する増殖因子の存在下で培養する工程、
(C3)上記工程(B3)で得られた細胞をレチノイドの存在下で培養する工程、
(D3)上記工程(C3)で得られた細胞をFGFの存在下で培養する工程、及び
(E3)上記工程(D3)で得られた細胞をニコチンアミドの存在下で培養する工程
を含み、
上記工程(A3)〜(E3)の少なくとも1つの工程で上記分化誘導促進剤を培地中に添加する上記[1]記載の膵臓ホルモン産生細胞の生産方法。
上記[1]〜[4]のいずれか1項記載の膵臓ホルモン産生細胞の生産方法によって人工的に生産された膵臓ホルモン産生細胞。
次の(1)〜(3)の少なくとも1種を含み、多能性幹細胞又は膵臓組織幹/前駆細胞から膵臓ホルモン産生細胞への分化を誘導する分化誘導促進剤;
(1)配列番号1に記載の塩基配列からなるDNAによりコードされるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(2)配列番号1に記載の塩基配列からなるDNAによりコードされるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導促進作用を持つポリペプチド、
(3)配列番号1に記載の塩基配列からなるDNA、又はこのDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAを外来遺伝子として組み込んだ細胞の培養上清。
多能性幹細胞とは、少なくとも一種類ずつの三胚葉(外胚葉、中胚葉、内胚葉)に属する分化細胞に分化する能力(多分化能)のある自己複製可能な幹細胞のことをいい、例えば、誘導多能性幹細胞(iPS細胞)、胚性幹細胞(ES細胞)、胚性生殖細胞(EG細胞)、胚性癌細胞(EC細胞)、成体多能性幹細胞(APS細胞)等が包含される。本発明に係る生産方法では、その中でも、誘導多能性幹細胞(iPS細胞)又は胚性幹細胞(ES細胞)を用いることが好ましい。
(i)OCT遺伝子、KLF遺伝子、SOX遺伝子、MYC遺伝子
(ii)OCT遺伝子、SOX遺伝子、NANOG遺伝子、LIN28遺伝子
(iii)OCT遺伝子、KLF遺伝子、SOX遺伝子、MYC遺伝子、hTERT遺伝子、SV40 large T遺伝子
(iv)OCT遺伝子、KLF遺伝子、SOX遺伝子
膵臓組織幹/前駆細胞とは、動物の膵臓に存在する、多分化能、自己複製能を有する組織幹/前駆細胞である。膵臓組織幹/前駆細胞の由来は、特に限定されないが、哺乳動物が好ましく、ヒト又はマウスが特に好ましい。膵臓から組織幹/前駆細胞を分離する方法としては、従来公知の方法を任意に採用することができ、特に限定されない。例えば、胎児膵臓では、PDX1が膵臓組織幹/前駆細胞のマーカー分子として既知である(Jonsson,J. et al., Nature, 371, pp.606−609(1994);Offield,M.F. et al., Development, 22, pp.983−995(1996))。胎児のPDX1発現細胞は、内分泌細胞、外分泌細胞、及び膵管細胞に分化し、成体膵に存在するあらゆる種類の細胞を生じる。そこで、PDX1をマーカー分子として、膵臓組織幹/前駆細胞を分離することができる。
なお、この膵臓組織幹/前駆細胞は、株化されていないものであってもよく、株化されたものであってもよい。
本発明に係る膵臓ホルモン産生細胞の生産方法で用いられる分化誘導促進剤は、下記(1)〜(3)から選ばれる少なくとも1種である。
(1)配列番号1に記載の塩基配列からなるDNAによりコードされるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(2)配列番号1に記載の塩基配列からなるDNAによりコードされるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導促進作用を持つポリペプチド。
(3)配列番号1に記載の塩基配列からなるDNA、又はこのDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAを外来遺伝子として組み込んだ細胞の培養上清。
また、改変ポリペプチドと元のポリペプチドとの相同性は、80%以上が好ましく、90%以上がより好ましく、93%以上がさらに好ましく、95%以上が特に好ましく、98%以上が最も好ましい。
宿主細胞としては、細菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞等の公知の細胞を適宜使用することができる。動物細胞としては、HEK293細胞、HEK293T細胞、CHO−K1細胞、COS細胞等が挙げられる。
本発明に係る膵臓ホルモン産生細胞の生産方法では、多能性幹細胞から膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導過程で、上述した分化誘導促進剤を培地中に添加する。多能性幹細胞から膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導方法としては、従来公知の方法を任意に採用することができ、特に限定されない。分化誘導促進剤としてポリペプチド又は改変ポリペプチドを添加する場合、その濃度は、10〜200ng/mLが好ましく、50〜180ng/mLがより好ましく、60〜150ng/mLがさらに好ましい。また、分化誘導促進剤として培養上清を添加する場合、その濃度は、0.5〜20%(v/v)が好ましく、1〜10%(v/v)がより好ましく、1.5〜5%(v/v)がさらに好ましい。
第1の分化誘導方法は、非特許文献1に記載の方法に準じたものである。この文献は参照により本願に援用する。
第1の分化誘導方法は、下記の工程(A1)〜(E1)を含む。このうち少なくとも1つの工程で、上述した分化誘導促進剤が培地中に添加される。分化誘導促進剤を添加する工程は、工程(A1)〜(C1)の少なくとも1つの工程であることが好ましく、工程(B1)〜(C1)の少なくとも1つの工程であることがより好ましい。なお、ある工程に分化誘導促進剤を添加する場合、その工程の最初から添加してもよく、工程の途中から添加してもよい。
(A1)TGF−βスーパーファミリーに属する増殖因子の存在下で多能性幹細胞を培養する工程。
(B1)上記工程(A1)で得られた細胞をFGFの存在下で培養する工程。
(C1)上記工程(B1)で得られた細胞をレチノイドの存在下で培養する工程。
(D1)上記工程(C1)で得られた細胞をγ−セクレターゼ阻害剤の存在下で培養する工程。
(E1)上記工程(D1)で得られた細胞を、エキセンジン−4、HGF、IGF−1、及びニコチンアミドからなる群から選択される少なくとも1種の因子の存在下で培養する工程。
工程(A1)では、TGF−βスーパーファミリーに属する増殖因子の存在下で多能性幹細胞を培養する。
TGF−βスーパーファミリーに属する増殖因子の濃度は、5〜250ng/mLが好ましく、10〜200ng/mLがより好ましく、50〜150ng/mLがさらに好ましい。
Wntファミリーに属する増殖因子としては、Wnt1、Wnt3a、Wnt5a、Wnt7a等が挙げられ、Wnt1、Wnt3aが好ましく、Wnt3aがより好ましい。
Wntファミリーに属する増殖因子の濃度は、1〜1000ng/mLが好ましく、10〜100ng/mLがより好ましく、10〜50ng/mLがさらに好ましい。
胚体内胚葉細胞への分化誘導の進行は、形態学的観察によるほか、RT−PCRにより遺伝子発現を確認することによっても評価することができる。多能性幹細胞から胚体内胚葉細胞への分化が進行するに従って、幹細胞のマーカー遺伝子であるOCT4、NANOG、SOX2、ECAD等の発現が減少し、胚体内胚葉細胞のマーカー遺伝子であるSOX17、CER、FOXA2、CXCR4等の発現が亢進する。
そこで、工程(A1)を、無血清の第1の培地で培養する工程(A1−1)と、低血清の第2の培地で培養する工程(A1−2)とに分けることが好ましい。
中内胚葉細胞への分化誘導の進行は、形態学的観察によるほか、RT−PCRにより遺伝子発現を確認することによっても評価することができる。多能性幹細胞から中内胚葉細胞への分化が進行するに従って、幹細胞のマーカー遺伝子であるOCT4、NANOG、SOX2、ECAD等の発現が減少し、中内胚葉細胞のマーカー遺伝子であるBRA、FGF4、WNT3、NCAD等の発現が亢進する。
上述したとおり、胚体内胚葉細胞への分化誘導の進行は、形態学的観察によるほか、RT−PCRにより遺伝子発現を確認することによっても評価することができる。
工程(B1)では、工程(A1)で得られた細胞をFGFの存在下で培養する。
FGFの濃度は、5〜150ng/mLが好ましく、10〜100ng/mLがより好ましく、20〜80ng/mLがさらに好ましい。
ヘッジホッグ経路阻害剤としては、KAAD−シクロパミン(28−[2−[[6−[(3−フェニルプロパノイル)アミノ]ヘキサノイル]アミノ]エチル]−17β,23β−エポキシベラトラマン−3−オン)、KAAD−シクロパミンの類似体、ジェルビン(17,23β−エポキシ−3β−ヒドロキシベラトラマン−11−オン)、ジェルビンの類似体、ヘッジホッグ経路遮断抗体等が挙げられ、その中でもKAAD−シクロパミンが好ましい。
ヘッジホッグ経路阻害剤の濃度は、0.01〜5μMが好ましく、0.02〜2μMがより好ましく、0.1〜0.5μmがさらに好ましい。
なお、工程(A1)で低血清培地が用いられる場合、工程(B1)では、工程(A1)よりも高い血清濃度の培地を用いることが好ましい。
分化誘導の進行は、形態学的観察によるほか、RT−PCRにより遺伝子発現を確認することによっても評価することができる。分化が進行するに従って、HNF1B、HNF4A等の遺伝子の発現が亢進する。
工程(C1)では、工程(B1)で得られた細胞をレチノイドの存在下で培養する。
レチノイドの濃度は、0.2〜10μMが好ましく、0.4〜8μMがより好ましく、1〜4μMがさらに好ましい。
ヘッジホッグ経路阻害剤としては、KAAD−シクロパミン、KAAD−シクロパミンの類似体、ジェルビン、ジェルビンの類似体、ヘッジホッグ経路遮断抗体等が挙げられ、その中でもKAAD−シクロパミンが好ましい。
ヘッジホッグ経路阻害剤の濃度は、0.01〜5μMが好ましく、0.02〜2μMがより好ましく、0.1〜0.5μMがさらに好ましい。
FGFとしては、FGF−1、FGF−2(bFGF)、FGF−3、FGF−4、FGF−5、FGF−6、FGF−7、FGF−8、FGF−9、FGF−10、FGF−11、FGF−12、FGF−13、FGF−14、FGF−15、FGF−16、FGF−17、FGF−18、FGF−19、FGF−20、FGF−21、FGF−22、FGF−23等が挙げられ、FGF−2(bFGF)、FGF−5、FGF−7、FGF−10が好ましい。
FGFの濃度は、0.5〜50ng/mLが好ましく、1〜25ng/mLがより好ましく、2〜10ng/mLがさらに好ましい。
TGF−βスーパーファミリーに属する増殖因子の濃度は、5〜250ng/mLが好ましく、10〜200ng/mLがより好ましく、20〜150ng/mLがさらに好ましい。
B−27TMサプリメントの濃度は、0.1〜10%(v/v)が好ましく、0.2〜5%(v/v)がより好ましく、0.4〜2.5%(v/v)がさらに好ましい。なお、このB−27TMサプリメントは、50倍ストック溶液として市販されているため、B−27TMサプリメントの濃度を0.1〜10%(v/v)とするには、5〜500倍希釈されるように培地中に添加すればよい。
分化誘導の進行は、形態学的観察によるほか、RT−PCRにより遺伝子発現を確認することによっても評価することができる。分化が進行するに従って、PDX1、HNF6、HLXB9等の遺伝子の発現が亢進する。
工程(D1)では、工程(C1)で得られた細胞をγ−セクレターゼ阻害剤の存在下で培養する。
γ−セクレターゼ阻害剤の濃度は、1〜50μMが好ましく、2〜40μMがより好ましく、5〜20μMがさらに好ましい。
エキセンジン−4の濃度は、5〜150ng/mLが好ましく、10〜100ng/mLがより好ましく、20〜80ng/mLがさらに好ましい。
分化誘導の進行は、形態学的観察によるほか、RT−PCRにより遺伝子発現を確認することによっても評価することができる。分化が進行するに従って、NKX6−1、NGN3、PAX4、NKX2−2等の遺伝子の発現が亢進する。
工程(E1)では、工程(D1)で得られた細胞を、エキセンジン−4、HGF、IGF−1、及びニコチンアミドからなる群から選択される少なくとも1種の因子の存在下で培養する。
エキセンジン−4の濃度は、5〜150nMが好ましく、10〜100nMがより好ましく、20〜80nMがさらに好ましい。
HGFの濃度は、5〜150ng/mLが好ましく、10〜100ng/mLがより好ましく、20〜80ng/mLがさらに好ましい。
IGF−1の濃度は、5〜150ng/mLが好ましく、10〜100ng/mLがより好ましく、20〜80ng/mLがさらに好ましい。
ニコチンアミドの濃度は、1〜30mMが好ましく、3〜20mMがより好ましく、5〜15mMがさらに好ましい。
この工程(E1)により、膵臓ホルモン産生細胞が得られる。
膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導の進行は、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン等の膵臓ホルモンの産生を確認するほか、RT−PCRにより遺伝子発現を確認することによっても評価することができる。分化が進行するに従って、INS、GCG、GHRL、SST、PPY等のうち、少なくとも1つの遺伝子の発現が亢進する。
第2の分化誘導方法は、非特許文献4に記載の方法に準じたものである。この文献は参照により本願に援用する。
第2の分化誘導方法は、下記の工程(A2)〜(D2)を含む。このうち少なくとも1つの工程で、上述した分化誘導促進剤が培地中に添加される。分化誘導促進剤を添加する工程は、工程(C2)〜(D2)の少なくとも1つの工程であることが好ましく、工程(D2)であることが特に好ましい。なお、ある工程に分化誘導促進剤を添加する場合、その工程の最初から添加してもよく、工程の途中から添加してもよい。
(A2)TGF−βスーパーファミリーに属する増殖因子と、Wntファミリーに属する増殖因子及びGSK−3阻害剤からなる群から選択される少なくとも1種の因子との存在下で多能性幹細胞を培養する工程。
(B2)上記工程(A2)で得られた細胞をTGF−βスーパーファミリーに属する増殖因子の存在下で培養する工程。
(C2)上記工程(B2)で得られた細胞をレチノイドの存在下で培養する工程。
(D2)上記工程(C2)で得られた細胞を、cAMP増加剤、デキサメタゾン、TGF−β1型受容体阻害剤、及びニコチンアミドからなる群から選択される少なくとも1種の因子の存在下で培養する工程。
工程(A2)では、TGF−βスーパーファミリーに属する増殖因子と、Wntファミリーに属する増殖因子及びGSK−3阻害剤からなる群から選択される少なくとも1種の因子との存在下で多能性幹細胞を培養する。
TGF−βスーパーファミリーに属する増殖因子の濃度は、5〜250ng/mLが好ましく、10〜200ng/mLがより好ましく、50〜150ng/mLがさらに好ましい。
Wntファミリーに属する増殖因子の濃度は、1〜1000ng/mLが好ましく、10〜100ng/mLがより好ましく、10〜50ng/mLがさらに好ましい。
GSK−3阻害剤の濃度は、0.01〜20μMが好ましく、0.1〜20μMがより好ましく、1〜5μMがさらに好ましい。
工程(A2)の培養期間は例えば1〜3日であり、1〜2日が好ましい。
工程(B2)では、工程(A2)で得られた細胞をTGF−βスーパーファミリーに属する増殖因子の存在下で培養する。
TGF−βスーパーファミリーに属する増殖因子の濃度は、5〜250ng/mLが好ましく、10〜200ng/mLがより好ましく、50〜150ng/mLがさらに好ましい。
工程(B2)の培養期間は例えば1〜4日であり、1〜3日が好ましい。
工程(C2)では、工程(B2)で得られた細胞をレチノイドの存在下で培養する。
レチノイドの濃度は、0.2〜10μMが好ましく、0.4〜8μMがより好ましく、1〜4μMがさらに好ましい。
BMP受容体阻害剤としては、ドルソモルフィン(6−[4−[2−(1−ピペリジニル)エトキシ]フェニル]−3−(4−ピリジル)ピラゾロ[1,5−a]ピリミジン)、LDN−193189(4−(6−(4−(ピペラジン−1−イル)フェニル)ピラゾロ[1,5−a]ピリミジン−3−イル)キノリン)等が挙げられ、その中でもドルソモルフィンが好ましい。
BMP受容体阻害剤の濃度は、0.2〜5μMが好ましく、0.3〜3μMがより好ましく、0.5〜2μMがさらに好ましい。
TGF−β1型受容体阻害剤としては、SB431542(4−[4−(1,3−ベンゾジオキソル−5−イル)−5−(2−ピリジニル)−1H−イミダゾール−2−イル]ベンズアミド)、SB525334(6−[2−(1,1−ジメチルエチル)−5−(6−メチル−1,2−ピリジニル)−1H−イミダゾール−4−イル]キノキサリン)、LY364947(4−[3−(2−ピリジニル)−1H−ピラゾール−4−イル]キノリン)等が挙げられ、その中でもSB431542が好ましい。また、TGF−β1型受容体阻害剤としては、Calbiochem製のAlk5インヒビターIIを用いることも可能である。
TGF−β1型受容体阻害剤の濃度は、1〜50μMが好ましく、2〜30μMがより好ましく、5〜20μMがさらに好ましい。
B−27TMサプリメントの濃度は、0.1〜10%(v/v)が好ましく、0.2〜5%(v/v)がより好ましく、0.4〜2.5%(v/v)がさらに好ましい。なお、このB−27TMサプリメントは、50倍ストック溶液として市販されているため、B−27TMサプリメントの濃度を0.1〜10%(v/v)とするには、5〜500倍希釈されるように培地中に添加すればよい。
工程(C2)の培養期間は例えば5〜9日であり、6〜8日が好ましい。
工程(D2)では、工程(C2)で得られた細胞を、cAMP増加剤、デキサメタゾン、TGF−β1型受容体阻害剤、及びニコチンアミドからなる群から選択される少なくとも1種の因子の存在下で培養する。
cAMP増加剤の濃度は、1〜50μMが好ましく、2〜30μMがより好ましく、5〜20μMがさらに好ましい。
TGF−β1型受容体阻害剤の濃度は、1〜50μMが好ましく、2〜30μMがより好ましく、5〜20μMがさらに好ましい。
工程(D2)の培養期間は例えば9〜13日であり、10〜12日が好ましい。
膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導の進行は、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン等の膵臓ホルモンの産生を確認するほか、RT−PCRにより遺伝子発現を確認することによっても評価することができる。多能性幹細胞から膵臓ホルモン産生細胞への分化が進行するに従って、膵臓ホルモン産生細胞のマーカー遺伝子であるINS、GCG、GHRL、SST、PPY等のうち、少なくとも1つの遺伝子の発現が亢進する。
本発明に係る膵臓ホルモン産生細胞の生産方法では、膵臓組織幹/前駆細胞から膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導過程で、上述した分化誘導促進剤を培地中に添加する。膵臓組織幹/前駆細胞から膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導方法としては、従来公知の方法を任意に採用することができ、特に限定されない。分化誘導促進剤としてポリペプチド又は改変ポリペプチドを添加する場合、その濃度は、10〜200ng/mLが好ましく、50〜150ng/mLがより好ましく、60〜120ng/mLがさらに好ましい。また、分化誘導促進剤として培養上清を添加する場合、その濃度は、0.5〜20%(v/v)が好ましく、1〜10%(v/v)がより好ましく、1.5〜5%(v/v)がさらに好ましい。
この分化誘導方法は、下記の工程(A3)〜(E3)を含む。このうち少なくとも1つの工程で、上述した分化誘導促進剤が培地中に添加される。分化誘導促進剤を添加する工程は、工程(D3)〜(E3)の少なくとも1つの工程であることが好ましく、工程(E3)であることが特に好ましい。なお、ある工程に分化誘導促進剤を添加する場合、その工程の最初から添加してもよく、工程の途中から添加してもよい。
(A3)TGF−βスーパーファミリーに属する増殖因子、レチノイド、FGF、及びニコチンアミドの非存在下で膵臓組織幹/前駆細胞を培養する工程。
(B3)上記工程(A3)で得られた細胞をTGF−βスーパーファミリーに属する増殖因子の存在下で培養する工程。
(C3)上記工程(B3)で得られた細胞をレチノイドの存在下で培養する工程。
(D3)上記工程(C3)で得られた細胞をFGFの存在下で培養する工程。
(E3)上記工程(D3)で得られた細胞をニコチンアミドの存在下で培養する工程。
工程(A3)では、TGF−βスーパーファミリーに属する増殖因子、レチノイド、FGF、ニコチンアミドの非存在下で膵臓組織幹/前駆細胞を培養する。
インスリンの濃度は、2〜30μg/mLが好ましく、5〜20μg/mLがより好ましい。トランスフェリンの濃度は、1〜20μg/mLが好ましく、3〜10μg/mLがより好ましい。亜セレン酸の濃度は、1〜20ng/mLが好ましく、5〜20ng/mLがより好ましい。2−メルカプトエタノールの濃度は、50〜200μMが好ましく、50〜100μMがより好ましい。アルブミンの濃度は、1〜10ng/mLが好ましく、2〜5ng/mLがより好ましい。
工程(A3)の培養期間は例えば1〜3日であり、1〜2日が好ましい。
工程(B3)では、工程(A3)で得られた細胞をTGF−βスーパーファミリーに属する増殖因子の存在下で培養する。
TGF−βスーパーファミリーに属する増殖因子の濃度は、5〜250ng/mLが好ましく、10〜200ng/mLがより好ましく、50〜150ng/mLがさらに好ましい。
工程(B3)の培養期間は例えば2〜6日であり、3〜5日が好ましい。
工程(C3)では、工程(B3)で得られた細胞をレチノイドの存在下で培養する。
レチノイドの濃度は、0.2〜10μMが好ましく、0.4〜8μMがより好ましく、1〜4μMがさらに好ましい。
好適な実施形態では、全トランス型レチノイン酸、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質、インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸、2−メルカプトエタノール、アルブミンを添加した、無血清のDMEM/ハムF12が用いられる。
工程(C3)の培養期間は例えば2〜6日であり、3〜5日が好ましい。
工程(D3)では、工程(C3)で得られた細胞をFGFの存在下で培養する。
FGFの濃度は、1〜30ng/mLが好ましく、2〜20ng/mLがより好ましく、5〜15ng/mLがさらに好ましい。
好適な実施形態では、FGF−2(bFGF)、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質、インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸、アルブミンを添加した、無血清のDMEM/ハムF12が用いられる。
工程(D3)の培養期間は例えば1〜5日であり、2〜4日が好ましい。
工程(E3)では、工程(D3)で得られた細胞をニコチンアミドの存在下で培養する。
ニコチンアミドの濃度は、1〜30mMが好ましく、3〜20mMがより好ましく、5〜15mMがさらに好ましい。
FGFとしては、FGF−1、FGF−2(bFGF)、FGF−3、FGF−4、FGF−5、FGF−6、FGF−7、FGF−8、FGF−9、FGF−10、FGF−11、FGF−12、FGF−13、FGF−14、FGF−15、FGF−16、FGF−17、FGF−18、FGF−19、FGF−20、FGF−21、FGF−22、FGF−23等が挙げられ、FGF−2(bFGF)、FGF−5、FGF−7、FGF−10が好ましい。
FGFの濃度は、1〜30ng/mLが好ましく、2〜20ng/mLがより好ましく、5〜15ng/mLがさらに好ましい。
好適な実施形態では、ニコチンアミド、FGF−2(bFGF)、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質、インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸、アルブミンを添加した、無血清のDMEM/ハムF12が用いられる。
工程(E3)の培養期間は例えば3〜20日であり、3〜10日が好ましい。
膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導の進行は、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン等の膵臓ホルモンの産生を確認するほか、RT−PCRにより遺伝子発現を確認することによっても評価することができる。膵臓組織幹/前駆細胞から膵臓ホルモン産生細胞への分化が進行するに従って、膵臓ホルモン産生細胞のマーカー遺伝子であるINS、GCG、GHRL、SST、PPY等のうち、少なくとも1つの遺伝子の発現が亢進する。
上述のようにして得られた膵臓ホルモン産生細胞は、糖尿病等の治療薬に応用することができる。例えば、膵臓ホルモン産生細胞がインスリンを産生・分泌する場合には、そのインスリン産生細胞をそのまま、あるいはフィルター濾過により濃縮したペレット等の細胞塊を糖尿病治療薬として用いることができる。この糖尿病治療薬は、DMSO等の保護剤を加え、凍結保存することもできる。なお、より安全に利用するためには、加熱処理、放射線処理、マイトマイシンC処理など、糖尿病治療薬としての機能を残しつつ、病原体のタンパク質が変性する程度の条件下で処理をすることが好ましい。
(1)分化誘導促進剤の調製
分化誘導促進剤は以下のようにして調製した。10% FBS(ウシ胎児血清)(ニチレイ、171012)、1% ペニシリン/ストレプトマイシン(Life Technologies Japan、15140−122)を添加したハムF12培地(Sigma、N6658)で継代培養したCHO−K1細胞を10cmディッシュに5×105個プレーティングした。その翌日、FuGENE6(Roche)を使用して、配列番号1に記載の塩基配列からなるDNAによりコードされるポリペプチド(以下、「IBCAP」という。)の発現ベクター(pCAGGS−IBCAP)をCHO−K1細胞にトランスフェクトし、IBCAPを強制発現させた。その48時間後に細胞を1/20濃度に希釈し、10cmディッシュに再度プレーティングした。その翌日、最終濃度400μg/mLのG418(ナカライテスク、09380−44)を添加し、以後、3〜5日おきに培地交換を行い、コロニー形成させた。限界希釈法でクローン化したコロニーを単離し、増殖後、サザンブロット法及びノザンブロット法で遺伝子発現を確認し、安定型IBCAP発現CHO−K1細胞株(以下、「IBCAP発現Stable CHO細胞」という。)を作製した。
ヒトiPS細胞としては、埼玉医科大学のDr.Mitaniから供与されたTIG3/KOSM細胞を用いた。この細胞は、センダイウイルスを用いてTIG−3細胞に4因子(OCT遺伝子、KLF遺伝子、SOX遺伝子、MYC遺伝子)を導入することにより、産業技術総合研究所にて樹立されたものである(Nishimura,K. et al., J. Biol. Chem., 286, pp.4760−4771(2011))。TIG3/KOSM細胞は、1%(v/v) ペニシリン/ストレプトマイシン(Gibco)、20%(v/v) KnockoutTM血清代替物(Gibco)、1% (v/v) 非必須アミノ酸(Gibco)、2.5mM L−グルタミン、0.1mM 2−メルカプトエタノール(Gibco)、5ng/mL FGF−2(R&D Systems)、5mM 塩化ナトリウムを添加したDMEM/ハムF12培地中で維持した。
分化誘導前のTIG3/KOSM細胞、及び工程(E1)を経て得られた細胞について、グルカゴン(GCG)及びソマトスタチン(SST)の遺伝子発現を定量的RT−PCRで確認した。具体的には、まず、NucleoSpinTM RNA II(タカラバイオ)を用いて細胞からRNAを抽出し、Fast SYBRTM Green PCR Master Mix(Applied Biosystems)を用いて定量的RT−PCR分析を行った。プライマー配列を以下に示す。
HsGCG_264F:GCATTTACTTTGTGGCTGGA(配列番号4)
HsGCG_368R:CCTGGGAAGCTGAGAATGAT(配列番号5)
HsSST_206F:CCCCAGACTCCGTCAGTTTC(配列番号6)
HsSST_313R:TCCGTCTGGTTGGGTTCAG(配列番号7)
また、図1(b)に示すように、無添加の場合にはソマトスタチン(SST)の誘導倍率がほぼ0倍であったのに対し、工程(D1)、(E1)でMock培養上清を添加した場合には約0.4倍であり、IBCAP培養上清を添加した場合には約9.5倍であった。
この結果から、工程(D1)、(E1)でIBCAP培養上清を添加することにより、ヒトiPS細胞から膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導効率が向上することが分かる。
IBCAP培養上清又はMock培養上清を工程(A1−1)、(A1−1)、あるいは工程(B1)、(C1)で添加するとともに、工程(E1)の培養期間を3日間とするほかは、実施例1と同様にしてTIG3/KOSM細胞を培養し、グルカゴン(GCG)及びソマトスタチン(SST)の遺伝子発現を定量的RT−PCRで確認した。
また、図2(b)に示すように、無添加の場合にはソマトスタチン(SST)の誘導倍率が約117.6倍であったのに対し、工程(A1−1)、(A1−2)でMock培養上清を添加した場合には約16.6倍であり、工程(A1−1)、(A1−2)でIBCAP培養上清を添加した場合には約65.2倍であった。また、工程(B1)、(C1)でMock培養上清を添加した場合には約8.8倍であり、IBCAP培養上清を添加した場合には約164.1倍であった。
この結果から、工程(A1−1)、(A1−2)でIBCAP培養上清を添加する場合と、工程(B1)、(C1)でIBCAP培養上清を添加する場合とのいずれも、ヒトiPS細胞から膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導効率が向上することが分かる。
(1)マウス膵臓組織幹/前駆細胞から膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導
マウス膵臓組織幹/前駆細胞としては、埼玉医科大学のDr.Matsumotoから供与されたTec3DR細胞を用いた。この細胞は、マウス胎児期の膵臓から分離された組織幹/前駆細胞をクローン化することにより樹立されたものである。Tec3DR細胞は、1%(v/v) ペニシリン/ストレプトマイシン(Gibco)、15%(v/v) FBS、50μM 2−メルカプトエタノール(Gibco)を添加したDMEM培地中で維持した。
分化誘導前のTec3DR細胞、及び工程(E3)を経て得られた細胞について、マウスインスリン−1(Ins1)の遺伝子発現を定量的RT−PCRで確認した。具体的には、まず、NucleoSpinTM RNA II(タカラバイオ)を用いて細胞からRNAを抽出し、Power SYBRTM Green PCR Master Mix(Applied Biosystems)を用いて定量的RT−PCR分析を行った。プライマー配列を以下に示す。
MnIns1_qPCR_Fw:CACTTCCTACCCCTGCTGG(配列番号8)
MnIns1_qPCR_Rv:ACGCCAAGGTCTGAAGGTC(配列番号9)
この結果から、工程(E3)でIBCAP培養上清を添加することにより、マウス膵臓組織幹/前駆細胞から膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導効率が向上することが分かる。
Claims (5)
- 多能性幹細胞又は膵臓組織幹/前駆細胞から膵臓ホルモン産生細胞を生産する膵臓ホルモン産生細胞の生産方法であって、
多能性幹細胞又は膵臓組織幹/前駆細胞から膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導過程で、分化誘導因子による分化効率を高めるために、下記(1)〜(3)から選ばれる少なくとも1種の分化誘導促進剤を培地中に添加することを特徴とする膵臓ホルモン産生細胞の生産方法、
(1)配列番号1に記載の塩基配列からなるDNAによりコードされるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(2)配列番号1に記載の塩基配列からなるDNAによりコードされるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導促進作用を持つポリペプチド、
(3)配列番号1に記載の塩基配列からなるDNA、又はこのDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとの相同性が90%以上であり、前記相補的な塩基配列からなる前記DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導促進作用を持つポリペプチドをコードするDNAを外来遺伝子として組み込んだ細胞の培養上清。 - (A1)TGF−β(トランスフォーミング増殖因子β)スーパーファミリーに属する増殖因子の存在下で多能性幹細胞を培養する工程、
(B1)前記工程(A1)で得られた細胞をFGF(線維芽細胞増殖因子)の存在下で培養する工程、
(C1)前記工程(B1)で得られた細胞をレチノイドの存在下で培養する工程、
(D1)前記工程(C1)で得られた細胞をγ−セクレターゼ阻害剤の存在下で培養する工程、及び
(E1)前記工程(D1)で得られた細胞を、エキセンジン−4、HGF(肝細胞増殖因子)、IGF−1(インスリン様増殖因子−1)、及びニコチンアミドからなる群から選択される少なくとも1種の因子の存在下で培養する工程、を含み、
前記工程(A1)〜(E1)の少なくとも1つの工程で前記分化誘導促進剤を培地中に添加する請求項1記載の膵臓ホルモン産生細胞の生産方法。 - (A2)TGF−β(トランスフォーミング増殖因子β)スーパーファミリーに属する増殖因子と、Wnt(ウィングレス型MMTV組み込み部位)ファミリーに属する増殖因子及びGSK−3(グリコーゲン合成酵素キナーゼ−3)阻害剤からなる群から選択される少なくとも1種の因子との存在下で多能性幹細胞を培養する工程、
(B2)前記工程(A2)で得られた細胞をTGF−βスーパーファミリーに属する増殖因子の存在下で培養する工程、
(C2)前記工程(B2)で得られた細胞をレチノイドの存在下で培養する工程、
(D2)前記工程(C2)で得られた細胞を、cAMP(環状アデノシン一リン酸)増加剤、デキサメタゾン、TGF−β1型受容体阻害剤、及びニコチンアミドからなる群から選択される少なくとも1種の因子の存在下で培養する工程、を含み、
前記工程(A2)〜(D2)の少なくとも1つの工程で前記分化誘導促進剤を培地中に添加する請求項1記載の膵臓ホルモン産生細胞の生産方法。 - (A3)TGF−β(トランスフォーミング増殖因子β)スーパーファミリーに属する増殖因子、レチノイド、FGF(線維芽細胞増殖因子)、及びニコチンアミドの非存在下で膵臓組織幹/前駆細胞を培養する工程、
(B3)前記工程(A3)で得られた細胞をTGF−βスーパーファミリーに属する増殖因子の存在下で培養する工程、
(C3)前記工程(B3)で得られた細胞をレチノイドの存在下で培養する工程、
(D3)前記工程(C3)で得られた細胞をFGFの存在下で培養する工程、及び
(E3)前記工程(D3)で得られた細胞をニコチンアミドの存在下で培養する工程
を含み、
前記工程(A3)〜(E3)の少なくとも1つの工程で前記分化誘導促進剤を培地中に添加する請求項1記載の膵臓ホルモン産生細胞の生産方法。 - 次の(1)〜(3)の少なくとも1種を含み、多能性幹細胞又は膵臓組織幹/前駆細胞から膵臓ホルモン産生細胞への分化を誘導する過程で、分化誘導因子による分化効率を高めるための、分化誘導促進剤;
(1)配列番号1に記載の塩基配列からなるDNAによりコードされるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(2)配列番号1に記載の塩基配列からなるDNAによりコードされるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導促進作用を持つポリペプチド、
(3)配列番号1に記載の塩基配列からなるDNA、又はこのDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとの相同性が90%以上であり、前記相補的な塩基配列からなる前記DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導促進作用を持つポリペプチドをコードするDNAを外来遺伝子として組み込んだ細胞の培養上清。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2014516862A JP6161603B2 (ja) | 2012-05-25 | 2013-05-24 | 膵臓ホルモン産生細胞の生産方法及び膵臓ホルモン産生細胞、並びに分化誘導促進剤 |
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2012120281 | 2012-05-25 | ||
JP2012120281 | 2012-05-25 | ||
JP2014516862A JP6161603B2 (ja) | 2012-05-25 | 2013-05-24 | 膵臓ホルモン産生細胞の生産方法及び膵臓ホルモン産生細胞、並びに分化誘導促進剤 |
PCT/JP2013/064469 WO2013176249A1 (ja) | 2012-05-25 | 2013-05-24 | 膵臓ホルモン産生細胞の生産方法及び膵臓ホルモン産生細胞、並びに分化誘導促進剤 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2013176249A1 JPWO2013176249A1 (ja) | 2016-01-14 |
JP6161603B2 true JP6161603B2 (ja) | 2017-07-12 |
Family
ID=49623929
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2014516862A Active JP6161603B2 (ja) | 2012-05-25 | 2013-05-24 | 膵臓ホルモン産生細胞の生産方法及び膵臓ホルモン産生細胞、並びに分化誘導促進剤 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20150140661A1 (ja) |
EP (1) | EP2857500B1 (ja) |
JP (1) | JP6161603B2 (ja) |
CN (1) | CN104428410B (ja) |
WO (1) | WO2013176249A1 (ja) |
Families Citing this family (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP6596708B2 (ja) * | 2014-05-20 | 2019-10-30 | 国立大学法人東京工業大学 | インスリン産生細胞の分化誘導方法 |
CN104911141A (zh) * | 2015-06-02 | 2015-09-16 | 深圳市第二人民医院 | 一种诱导iPSCs分化为胰岛β细胞的方法 |
CN104988110A (zh) * | 2015-07-08 | 2015-10-21 | 深圳爱生再生医学科技有限公司 | 脐带间充质干细胞转化为胰岛细胞的方法 |
CN104988111A (zh) * | 2015-07-08 | 2015-10-21 | 深圳爱生再生医学科技有限公司 | 用于将uc-msc转化为胰岛细胞的诱导液及其应用 |
US20190136197A1 (en) * | 2016-04-28 | 2019-05-09 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Purification method for pancreatic precursor cells derived from pluripotent stem cells and amplification method therefor |
US11352605B2 (en) * | 2016-05-12 | 2022-06-07 | Erasmus University Medical Center Rotterdam | Method for culturing myogenic cells, cultures obtained therefrom, screening methods, and cell culture medium |
JP7174426B2 (ja) * | 2017-05-09 | 2022-11-17 | 公立大学法人名古屋市立大学 | 多能性幹細胞由来腸管オルガノイドの作製法 |
CN113015792A (zh) * | 2018-11-14 | 2021-06-22 | 株式会社片冈制作所 | 胰岛素产生细胞的制造方法 |
WO2020100788A1 (ja) * | 2018-11-14 | 2020-05-22 | 株式会社片岡製作所 | インスリン産生細胞の製造方法、及び組成物 |
CN111607556B (zh) * | 2019-01-25 | 2022-06-07 | 中国科学院广州生物医药与健康研究院 | 一种培养扩增人肝祖细胞的培养基及其应用 |
CN113736725B (zh) * | 2020-05-29 | 2024-04-16 | 国玺干细胞应用技术股份有限公司 | 细胞分化培养基组合物、高分泌量胰岛素产生细胞及制备 |
Family Cites Families (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
MXPA06007252A (es) | 2003-12-23 | 2007-01-23 | Cythera Inc | Endodermo definitivo. |
CA2576872C (en) | 2004-08-13 | 2013-11-12 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Compositions and methods for self-renewal and differentiation in human embryonic stem cells |
CN100425694C (zh) | 2005-04-15 | 2008-10-15 | 北京大学 | 诱导胚胎干细胞向胰腺细胞分化的方法 |
WO2007051038A2 (en) | 2005-10-27 | 2007-05-03 | Cythera, Inc. | Pdx1-expressing dorsal and ventral foregut endoderm |
JP4520951B2 (ja) * | 2006-02-07 | 2010-08-11 | リッチランド・バイオ・メディカル株式会社 | インスリン分泌誘導剤及びインスリン分泌誘導組成物 |
EP2650359B1 (en) | 2006-03-02 | 2022-05-04 | Viacyte, Inc. | Endocrine precursor cells, pancreatic hormone-expressing cells and methods of production |
JP5135577B2 (ja) | 2006-12-01 | 2013-02-06 | 国立大学法人 岡山大学 | 胚性幹細胞のインスリン分泌細胞への分化誘導方法、該方法により誘導されるインスリン分泌細胞およびその用途 |
DK2168589T3 (da) * | 2007-07-20 | 2013-06-10 | Univ Saitama Medical | Insulinsekretion-inducer og accelerator til forhøjelse af antallet af pankreas-beta-celler |
KR101592180B1 (ko) * | 2007-07-31 | 2016-02-05 | 라이프스캔, 인코포레이티드 | 인간 영양 세포를 이용한 만능 줄기 세포 분화 |
-
2013
- 2013-05-24 EP EP13793805.6A patent/EP2857500B1/en active Active
- 2013-05-24 JP JP2014516862A patent/JP6161603B2/ja active Active
- 2013-05-24 CN CN201380027230.0A patent/CN104428410B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2013-05-24 US US14/403,026 patent/US20150140661A1/en not_active Abandoned
- 2013-05-24 WO PCT/JP2013/064469 patent/WO2013176249A1/ja active Application Filing
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPWO2013176249A1 (ja) | 2016-01-14 |
CN104428410B (zh) | 2016-08-31 |
US20150140661A1 (en) | 2015-05-21 |
EP2857500B1 (en) | 2018-01-31 |
EP2857500A1 (en) | 2015-04-08 |
WO2013176249A1 (ja) | 2013-11-28 |
EP2857500A4 (en) | 2015-11-11 |
CN104428410A (zh) | 2015-03-18 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6161603B2 (ja) | 膵臓ホルモン産生細胞の生産方法及び膵臓ホルモン産生細胞、並びに分化誘導促進剤 | |
Sun et al. | Stem cell-based therapies for Duchenne muscular dystrophy | |
CN102159703B (zh) | 多能干细胞的分化 | |
Rak-Raszewska et al. | Organ in vitro culture: what have we learned about early kidney development? | |
KR20160033703A (ko) | 체세포로부터 신경 능선 세포로의 소분자 기반 전환 | |
US20220220444A1 (en) | Methods of generating and expanding hematopoietic stem cells | |
EP2882848A1 (en) | Method, combination and/or composition for inducing cardiomyocyte differentation | |
Edamura et al. | Recombinant canine basic fibroblast growth factor-induced differentiation of canine bone marrow mesenchymal stem cells into voltage-and glutamate-responsive neuron-like cells | |
JP7139951B2 (ja) | インスリン産生細胞分化誘導促進剤 | |
KR102281535B1 (ko) | 줄기세포 유래 간오가노이드의 제작 및 제1형 혈우병 세포치료제로서의 용도 | |
Sadiq et al. | Stem cells in modern medicine: Reality or myth? | |
JP6352908B2 (ja) | 新規ペプチド及びその用途 | |
CN115044534B (zh) | 一种利用BMP7因子在体外生产胰岛β细胞的方法和获得的胰岛β细胞以及应用 | |
CN117957309A (zh) | 血管化类器官 | |
US20230365941A1 (en) | Organoid recombination | |
CA3229048A1 (en) | Vascularized organoids | |
WO2023205460A1 (en) | Vascularized brain organoids and methods of making and use | |
EP4217467A1 (en) | Raft cultures and methods of making thereof |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20160428 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20170221 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20170420 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20170523 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20170613 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6161603 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |