JP7139951B2 - インスリン産生細胞分化誘導促進剤 - Google Patents
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Description
即ち、本発明は以下の通りである。
[1]ABL1チロシンキナーゼ阻害作用を有する化合物を含む、多能性幹細胞からインスリン産生細胞への分化誘導促進剤。
[2]該化合物が、イマチニブ、ニロチニブ及びダサチニブからなる群より選択される少なくとも1種である、上記[1]記載の剤。
[3]多能性幹細胞がiPS細胞である、上記[1]又は[2]記載の剤。
[1-1]多能性幹細胞からインスリン産生細胞への分化誘導に使用するためのABL1チロシンキナーゼ阻害作用を有する化合物。
[1-2]イマチニブ、ニロチニブ及びダサチニブからなる群より選択される少なくとも1種である、上記[1-1]記載の化合物。
[1-3]多能性幹細胞がiPS細胞である、上記[1-1]又は[1-2]記載の化合物。
[4]多能性幹細胞からインスリン産生細胞への分化誘導を促進するための方法であって、分化誘導開始後、原腸管細胞マーカーの発現が確認された細胞をABL1チロシンキナーゼ阻害作用を有する化合物で処理することを含む、方法。
[5]該化合物が、イマチニブ、ニロチニブ及びダサチニブからなる群より選択される少なくとも1種である、上記[4]記載の方法。
[6]多能性幹細胞がiPS細胞である、上記[4]又は[5]記載の方法。
[7]原腸管細胞マーカーが、FOXA2、HNF1b及びHNF4aからなる群より選択される少なくとも1種である、上記[4]~[6]のいずれかに記載の方法。
[8]ABL1チロシンキナーゼ阻害作用を有する化合物を含む、多能性幹細胞からインスリン産生細胞への分化誘導用の培地添加剤。
[9]該化合物が、イマチニブ、ニロチニブ及びダサチニブからなる群より選択される少なくとも1種である、上記[8]記載の添加剤。
[10]多能性幹細胞がiPS細胞である、上記[8]又は[9]記載の添加剤。
[8-1]多能性幹細胞からインスリン産生細胞への分化誘導用の培地に添加するためのABL1チロシンキナーゼ阻害作用を有する化合物。
[8-2]イマチニブ、ニロチニブ及びダサチニブからなる群より選択される少なくとも1種である、上記[8-1]記載の化合物。
[8-3]多能性幹細胞がiPS細胞である、上記[8-1]又は[8-2]記載の化合物。
[11]上記[8]~[10]のいずれかに記載の培地添加剤を添加してなる、インスリン産生細胞への分化誘導用の培地。
Abelson murine leukemia viral oncogene homolog 1(以下、ABL1とも称する)は、タンパク質のチロシン残基を特異的にリン酸化する酵素であるチロシンキナーゼの1種である。慢性骨髄性白血病(CML)の多くの場合、9番染色体と22番染色体が相互転座を起こすことによってBCR遺伝子とABL1遺伝子が結合し、BCR-ABLという融合遺伝子が形成される。ABL1タンパクのチロシンキナーゼ活性は、恒常的に活性化されて造血細胞の腫瘍化を惹起する。従って、ABL1阻害作用を有する化合物は、CMLの有効な治療薬となる。
本発明はABL1チロシンキナーゼ阻害作用を有する化合物(以下、ABL1阻害剤とも称する)を含む、多能性幹細胞からインスリン産生細胞への分化誘導促進剤(以下、本発明の分化誘導促進剤とも称する)を提供する。
本発明において用いられるABL1阻害剤としてはABL1阻害作用を有していれば特に限定されないが、イマチニブ、ニロチニブ、ダサチニブ、ボスチニブ等が挙げられる。好ましくは下記構造で示されるイマチニブ、ニロチニブ及びダサチニブである(Henkes, M., H. et al., Ther Clin Risk Manag, 2008. 4(1): p. 163-87.)。
本発明はABL1阻害剤で多能性幹細胞を処理する工程を含む、多能性幹細胞からインスリン産生細胞への分化誘導を促進する方法(以下、本発明の分化誘導促進方法とも称する)を提供する。
多能性幹細胞からインスリン産生細胞への分化の過程については種々の報告が為されているが、一般的に、幾つかの分化段階(ステージ)で構成される。各ステージにおける分化誘導は、所望される分化細胞が得られる限り特に限定されず、既報に従って行うことができる。例えば、iPS細胞からインスリン産生細胞への分化誘導系としては、実施例にて後述するように、iPS細胞→胚体内内胚葉細胞(DE cell:S1)→原腸管細胞(PG cell:S2)→膵前駆細胞(PP cell:S3)→内分泌前駆細胞(EP cell:S4)→インスリン産生細胞(S5)という5段階の発生過程を模倣した系が知られている。主な分化誘導法としては、WO 2011/081222 A1;WO 2015/020113 Α1;Russ HA, et al., The EMBO Journal (2015) 34: 1759-1772;Nostro MC, et al., Stem Cell Reports 2015, 4: 591-604;Hannan NR, et al., Stem Cell Reports. 2013 1:293-306 ;Takeuchi H, et al., SCIENTIFIC REPORTS 2014 4: 4488;Pagliuca FW, et al., Cell. 2014; 159(2):428-39等に記載される方法も挙げられる。以下、かかる分化誘導系を用いて本発明の分化誘導促進方法を説明するが、他の分化誘導系に対しても本発明の分化誘導促進方法を用いることができる。
本発明において、ABL1阻害剤はインスリン産生細胞への分化誘導が促進される限りどの段階で用いてもよいが、好ましくはステージ3~5の間、より好ましくはステージ3~4の間、特に好ましくは少なくともステージ3の間で用いる。すなわち、ステージ2を経て原腸管細胞へと分化した細胞に対してABL1阻害剤を適用することが好ましい。iPS細胞が内胚葉細胞を経て原腸管細胞へと分化したか否かの確認は、原腸管細胞マーカーの発現を指標にして行うことができる。原腸管細胞マーカーとは、原腸管細胞特異的に発現するタンパク質や遺伝子であり、それらの発現の変動を、遺伝子レベルあるいはタンパク質レベルで評価する。上記細胞マーカーとして、FOXA2、HNF1b、HNF4a等が挙げられる。
ABL1阻害剤はステージ3を経て膵前駆細胞へと分化した細胞に対しても適用することができる。膵前駆細胞へと分化したか否かの確認は、膵前駆細胞マーカーの発現を指標にして行うことができる。膵前駆細胞マーカーとは、膵前駆細胞特異的に発現するタンパク質や遺伝子であり、それらの発現の変動を、遺伝子レベルあるいはタンパク質レベルで評価する。上記細胞マーカーとして、PDX1、HNF6、SOX9等が挙げられる。
ABL1阻害剤はステージ4を経て内分泌前駆細胞へと分化した細胞に対しても適用することができる。内分泌前駆細胞へと分化したか否かの確認は、内分泌前駆細胞マーカーの発現を指標にして行うことができる。内分泌前駆細胞マーカーとは、内分泌前駆細胞特異的に発現するタンパク質や遺伝子であり、それらの発現の変動を遺伝子レベルあるいはタンパク質レベルで評価する。上記細胞マーカーとして、NGN3、PAX4、NEUROD1等が挙げられる。
S1:アクチビン受容体様キナーゼ-4,7の活性化剤(例、アクチビン、Nodal、Myostatin、好ましくはアクチビンA)及びGSK3阻害剤(例、CHIR99021、SB216763、SB415286、CHIR99021)、その後アクチビン受容体様キナーゼ-4,7の活性化剤のみ(S1(-C))
S2:ヘッジホッグシグナル伝達阻害剤(例、シクロパミン、ジェルビン、SANT-1、ヘッジホッグ経路遮断抗体、好ましくはSANT-1)及びFGF(例、FGF-1、FGF-2(bFGF)、FGF-3、FGF-4、FGF-5、FGF-6、FGF-7、FGF-8、FGF-9、FGF-10、FGF-11、FGF-12、FGF-13、FGF-14、FGF-15、FGF-16、FGF-17、FGF-18、FGF-19、FGF-20、FGF-21、FGF-22、FGF-23、好ましくは、FGF-10)
S3:レチノイン酸受容体アゴニスト(例、レチノイン酸、Am80、AM580、TTNPB、AC55649、好ましくはレチノイン酸)、ヘッジホッグシグナル伝達阻害剤(例、S2と同様、好ましくはSANT-1)及びBMPシグナル伝達阻害剤(例、Noggin、Chordin、Follistatin、Cerberus、Gremlin、Dorsomorphin、LDN-193189、好ましくはLDN-193189)(好ましくはさらにTGF-βI型アクチビン受容体様キナーゼ-4,5,7阻害剤(例、SB-431542、SB-505124、SB-525334、A-83-01、GW6604、LY580276、ALK5阻害剤、TGFβRIキナーゼ阻害剤VIII、SD-208、好ましくはSB-431542)を用いる)
S4:TGF-βI型アクチビン受容体様キナーゼ-4,5,7阻害剤(例、S3と同様、好ましくはALK5阻害剤)及びBMPシグナル伝達阻害剤(例、S3と同様、好ましくはLDN-193189)(好ましくはさらにプロテインキナーゼC活性化因子(例、ILV、(2S,5S)-(E,E)-8-(5-(4-(トリフルオロメチル)フェニル)-2,4-ペンタジエノイルアミノ)ベンゾラクタム、ホルボール-12-ミリステート-13-アセテート、ホルボール-12,13-ジブチレート、好ましくはILV)を用いる)
S5:ホスホジエステラーゼ阻害剤(例、IBMX、ジブチルcAMP、好ましくはIBMX)(好ましくはさらに、GLP-1受容体アゴニスト(例、GLP-1、GLP-1MR剤、NN-2211、AC-2993(エキセンジン-4)、BIM-51077、Aib(8,35)hGLP-1(7,37)NH2、CJC-1131、好ましくはエキセンジン-4)、ニコチンアミド及びアデニル酸シクラーゼ活性化因子(例、ファルスコリン)のいずれか1以上、より好ましくは2以上、特に好ましくは全てを用いる)
本発明はABL1阻害剤を含む多能性幹細胞からインスリン産生細胞への分化誘導用の培地添加剤(以下、本発明の培地添加剤とも称する)を提供する。本発明の培地添加剤は、培地への添加用であるが、簡便には、上記1.分化誘導促進剤を用いることができる。
本発明の培地添加剤は、多能性幹細胞からインスリン産生細胞への分化誘導の系において、その培地中に添加して用いることができる。あるいは本発明の培地添加剤を添加してなる分化誘導用の培地を調製し、該培地を用いて培地交換することによって多能性幹細胞からインスリン産生細胞への分化誘導を促進する。
本発明の培地添加剤の培地中への添加は、用いるABL1阻害剤の種類によっても異なり、適宜設定されるが、通常、培地中のABL1阻害剤の最終濃度が0.01~10000nM、好ましくは0.05~5000nM、より好ましくは0.1~3000nMとなるように行われる。該濃度は、ABL1阻害剤がイマチニブの場合、300nM以上、好ましくは1000nM以上、より好ましくは3000nM程度であり、ダサチニブの場合、0.1nM以上、好ましくは0.5nM以上、より好ましくは1nM程度であり、ニロチニブの場合、10nM以上、好ましくは30nM以上、より好ましくは100nM程度である。
本発明の培地添加剤は、有効成分としてABL1阻害剤を含んでいれば、その他の成分を含んでいても含んでいなくてもよい。取扱いのし易さ、保存安定性等の観点から、加えて培地に添加して用いる点において各種添加剤が含まれていてもよい。各種添加剤としては自体公知のものが用いられるが培地構成成分の1乃至2種以上とともに製剤化することもできる。
本発明の培地添加剤の剤型は特に限定されず、溶液状(懸濁液、乳液等の剤型を含む)、固形状(粉末状等の剤型を含む)、半固形状(ゲル状等の剤型を含む)であり得る。溶液状の本発明の培地添加剤は、液体培地への添加が容易であり好ましい。固形状、半固形状の本発明の培地添加剤は取扱いのし易さ、保存安定性等の観点から好ましい。固形状、半固形状の本発明の培地添加剤はそのまま培地に添加しても、必要に応じ培地への添加前に溶解してから用いることもできる。
本発明はABL1阻害剤を含む多能性幹細胞からインスリン産生細胞への分化誘導用の培地(以下、本発明の分化誘導用培地とも称する)を提供する。
本発明の分化誘導用培地の形状は特に限定されず、溶液状(懸濁液状、乳液状等を含む)、固形状(粉末状等を含む)、半固形状(ゲル状等を含む)であり得る。溶液状の本発明の分化誘導用培地は、ABL1阻害剤に加え、所望される培地構成成分を添加してなる溶液状の培地であり、そのまま細胞の培養に用いることができる。固形状あるいは半固形状の本発明の分化誘導培地は、ABL1阻害剤に加え、所望される培地構成成分(1乃至2以上、好ましくは全て)を含み、用時精製水等に溶解し、必要に応じてpH調整を行って細胞の培養に用いることができる。いずれの態様も本発明の分化誘導用培地の範疇である。
本発明の分化誘導用培地は、通常の分化誘導用培地にABL1阻害剤を添加してなる培地である。また、上記3.分化誘導用培地添加剤を添加してなる培地であってもよい。
ここで「通常の分化誘導用培地」とは、多能性幹細胞からインスリン産生細胞への分化誘導に使用し得る培地を意味し、当分野で通常用いられるものを利用することができる。多能性幹細胞からインスリン産生細胞への分化誘導は、幾つかのステージからなり、通常、そのステージごとに使用する培地が異なる。本発明の分化誘導用の培地はいずれのステージにおいても使用することができるが、好ましくは一定の段階まで分化誘導されたステージの細胞の分化誘導用の培地として用いる。「一定の段階まで分化誘導されたステージの細胞」としては、上記「2.多能性幹細胞からインスリン産生細胞への分化誘導を促進する方法」で示した分化誘導系であれば、ステージ2を経て得られた細胞、即ち原腸管細胞マーカー(FOXA2、HNF1b、HNF4a等)の発現が確認された細胞が挙げられる。該細胞は、ステージ3、ステージ4及びステージ5を経てインスリン産生細胞へと分化誘導される。
ステージ3で用いられる培地の一例として、基礎培地に上記「2.多能性幹細胞からインスリン産生細胞への分化誘導を促進する方法」のS3で用いた分化誘導因子を添加した培地が挙げられる。
ステージ4で用いられる培地の一例として、基礎培地に上記「2.多能性幹細胞からインスリン産生細胞への分化誘導を促進する方法」のS4で用いた分化誘導因子を添加した培地が挙げられる。
ステージ5で用いられる培地の一例として、基礎培地に上記「2.多能性幹細胞からインスリン産生細胞への分化誘導を促進する方法」のS5で用いた分化誘導因子を添加した培地が挙げられる。
基礎培地としては、上記「2.多能性幹細胞からインスリン産生細胞への分化誘導を促進する方法」で例示したものを好適に用いることができる。
iPS細胞は1231A3株を用いた。培養は37℃、5%CO2条件下で行った。維持培養にはStemFit(登録商標) AK培地(味の素)を用いた。細胞の剥離にはAccutase(ナカライテスク)を用い、Laminine-511 E8(ニッピ)をコートした6ウェルプレートに13,000細胞/ウェルの濃度で細胞を播種し、7日毎に継代した。
iPS細胞からのインスリン産生細胞誘導方法は、Arakawaら(Arakawa A, et al., Journal of Analytical & Bioanalytical Techniques. 2016;7(1).)のプロトコルを用いて実施した。Laminin-511 E8でコートした24ウェルプレートに1.5×105細胞/ウェルの濃度で細胞を播種し、翌日から下記の分化誘導培地で括弧内の日数ずつステージ(S1-S5)毎に異なる培地で培養することにより、細胞の分化誘導を行った。培地交換の頻度は2日に1度以上となるようにした。
S1(1日間):RPMI 1640 (Life Technologies), Penicillin/Streptomycin (P/S)(ナカライテスク), 2% B-27 (Thermo Fisher Scientific), 100 ng/mL Activin A (R&D Systems), 3 μM CHIR99021 (Stemgent)
S1(-C)(4日間):RPMI 1640, P/S, 2% B-27, 100 ng/mL Activin A
S2(2日間):RPMI 1640, P/S, 1% B-27, 0.25 μM SANT-1 (Wako), 50 ng/mL FGF10 (R&D Systems)
S3(6日間):DMEM HG (Life Technologies), P/S, 1% B-27, 2 μM Retinoic acid, 0.25 μM SANT-1, 10 μM SB431542 (Stemgent), 0.1 μM LDN193189 (Wako)
S4(2日間):DMEM HG, P/S, 1% B-27, 5 μM ALK5 inhibitor (Calbiochem), 300 nM (-) indolactam V (Sigma), 0.1 μM LDN193189
S5(8日間):DMEM/F12 (Life Technologies), P/S, 1% B-27, 50 ng/mL exendin-4 (Sigma), 10 mM nicotinamide (Sigma), 100 μM 3-Isobutyl-1-methylxanthine (Wako)
イマチニブ(imatinib)(Wako)、ダサチニブ(dasatinib)(BioVision)、ニロチニブ(nilotinib)(Chemscene)、ソラフェニブ(sorafenib)(Cayman Chemical)はDMSO(ナカライテスク)に溶解し、S3~5の培地に添加した。対照群(control)には化合物の代わりに媒体であるDMSOを添加した。
得られた細胞からRNAを抽出し、抽出したRNAからSuperScript VILO Master Mix (Thermo Fisher Scientific)を用いてcDNAを逆転写し、インスリン遺伝子の発現をリアルタイムPCRで評価した。リアルタイムPCRにはTaqMan Gene Expression Assays (Applied Biosystems)を用いた。
イマチニブの結果を図1に、ダサチニブの結果を図2に、ニロチニブの結果を図3に、ソラフェニブの結果を図4に示す。遺伝子の発現量はGAPDH遺伝子の発現量で補正し、ヒト膵島における発現量を1として相対値で表した。培地中にイマチニブ、ダサチニブ又はニロチニブを添加して分化誘導を実施すると、インスリン遺伝子の発現上昇が認められた。ソラフェニブでは、インスリン遺伝子の発現上昇は認められず、高濃度では逆に低下した。
以上の結果から、チロシンキナーゼ阻害剤のうち、イマチニブ、ダサチニブ及びニロチニブでは分化促進効果が認められ、ソラフェニブでは認められなかった。3倍以上のインスリン遺伝子発現亢進が認められた化合物添加濃度は、イマチニブ、ダサチニブ及びニロチニブでそれぞれ300nM、1nM、100nMであった。また、ソラフェニブでは100nMの濃度で添加してもインスリン遺伝子発現に変化が見られず、1000nMでは逆に低下した。
これらの阻害剤は、Davis M.I.ら(Davis MI, et al., Nature biotechnology. 2011;29(11):1046-1051.)によると、複数のキナーゼに対して様々なKd値を取ることが報告されている。表1にニロチニブがKd値100nM以下を示すキナーゼに対する各化合物のKd値を示す(Davis M.I.らのsupplementary table 4を改変)。空欄は10μMで酵素への結合が認められていないことを示す。
表2に、3倍以上のインスリン遺伝子発現亢進が認められた化合物濃度のKd値に対する倍率を示した。表1より計算した。また、ソラフェニブについては、インスリン遺伝子発現が低下していない100nMのKd値に対する割合を示した。化合物添加濃度がKd値の7倍以上となる組み合わせを網掛けで示した。空欄は10μMで酵素への結合が認められていないことを示す。
ABL1阻害剤としてニロチニブを用いて、分化誘導促進効果が発揮される添加ステージを検討した。96ウェルプレートに4×104細胞/ウェルの濃度でiPS細胞を播種し、実施例1の方法で細胞の分化誘導を行った。ニロチニブをS3、S4、S5の各段階において、組み合わせを変えて添加し、対照群(control)にはDMSOを添加した。
分化後の細胞の培養上清を回収し、上清中のC-ペプチドをC-peptide ELISA kit (ALPCO)で定量した。なお、培養上清中のC-ペプチド量はインスリン遺伝子発現と相関することを確認している。
図5に添加タイミングの検討結果を示す。S3、S4、S3/S4、S3/S4/S5への添加時に分化誘導促進効果が認められた。特にS3への添加時に最も強い効果が認められた。
Claims (4)
- 多能性幹細胞からインスリン産生細胞への分化誘導を促進するための方法であって、分化誘導開始後、原腸管細胞マーカーの発現が確認された細胞をABL1チロシンキナーゼ阻害作用を有する化合物で処理することを含む、方法。
- 該化合物が、イマチニブ、ニロチニブ及びダサチニブからなる群より選択される少なくとも1種である、請求項1記載の方法。
- 多能性幹細胞がiPS細胞である、請求項1又は2記載の方法。
- 原腸管細胞マーカーが、FOXA2、HNF1b及びHNF4aからなる群より選択される少なくとも1種である、請求項1~3のいずれか1項に記載の方法。
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