CN112119154A - 褐色脂肪细胞的产生 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了转化生长因子β(TGF‑β)信号传导抑制剂用于在体外产生褐色脂肪细胞群的用途。

Description

褐色脂肪细胞的产生
技术领域
本发明涉及褐色脂肪细胞的产生。更具体地讲，本发明涉及用于使细胞诸如人多能干细胞分化成褐色脂肪细胞的改良方法。
背景技术
多尿症(通常称为糖尿病)是一组代谢疾病，其特征在于患者的血糖水平长期过高。糖尿病的全球患病率已达到38700万，并且预计到2030年会上升至43500万。事实上，65％的全球人口生活在肥胖比营养不良造成更多死亡的国家(WHO-2010)。
有两种主要类型的糖尿病(1型和2型)，其具有不同的原因和治疗方法。1型糖尿病是由胰腺中的胰岛素分泌β细胞遭到破坏(通常是自身免疫机制所致)引起的。2型糖尿病由外周组织中的胰岛素抗性引起，胰岛素抗性可与胰腺β细胞功能障碍、超重、不良身体活动和遗传组分相结合。约10％的糖尿病病例符合1型。然而，大多数患者(85％-90％)表现出2型糖尿病。2012年美国诊断出的糖尿病的估计总经济成本与之前2007年的估计值相比已增加41％，并且已达到2450亿美元。这突出了糖尿病对社会造成的重大负担。
管理1型糖尿病需要为患者终身定期注射胰岛素。相比之下，2型糖尿病可通过管理饮食、体重和体育锻炼来控制，但长期治疗可能需要药物(例如，二甲双胍或磺酰脲)，可能需要结合胰岛素注射。
虽然患者可能能够用现有治疗方法来管理1型糖尿病和2型糖尿病，但目前还没有治愈的方法，并且糖尿病导致死亡的风险在显著增加。
预防肥胖症发展的能量平衡取决于能量消耗。虽然身体活动是耗散过量能量的主要机制，但能量也可通过产热系统而耗散，产热系统演化为保护身体免于体温过低。这基于褐色脂肪细胞中通过线粒体解偶联蛋白(UCP1)进行的氧化磷酸化的解偶联。褐色脂肪组织(BAT)是介导能量耗散和葡萄糖处置的高度代谢器官，因此有助于维持足够的能量平衡和碳水化合物稳态。
已证实，通过遗传操纵或药理学药剂上调UCP1可减少肥胖症并改善胰岛素敏感性。相反，在啮齿动物中存在BAT功能障碍会促进肥胖症并损害碳水化合物代谢的证据，最终导致对β细胞的功能需求增加。自从在成人中发现功能性BAT以来，已经报道了衰老、2型糖尿病与BAT贮库的量和活性之间的负相关性。在活化时，BAT通过UCP1将游离脂肪酸和葡萄糖氧化的能量转化成热。最近已证明BAT会增加甘油三酯摄取和胰岛素敏感性。
关于人褐色脂肪组织的特征和功能的研究因获得褐色脂肪细胞本身的途径而受到阻碍。
过去，已使用多种技术来开发源自人胚胎干细胞或间充质干细胞以及人诱导多能干细胞的褐色脂肪细胞模型。一种此类方案应用遗传工程强制特定褐色转录因子诸如PPARg和PGC1a的表达(Ahfeldt,T.等人(2012)Nat.Cell Biol.14:209-219)。然而，此类技术具有以下缺点：它们可能产生可潜在地影响所产生的褐色脂肪细胞的功能的遗传改变。替代方案使用细胞因子混合物强制hiPSC向褐色脂肪细胞样细胞分化(Nishio,M.(2012)Cell Metab.16:394-406)。然而，这种方法似乎既不具有充分特异性，也不稳健，因此不能用于产生人褐色脂肪组织的来源。
因此，本领域仍然非常需要提供获得褐色脂肪细胞的途径，以便能够在实验室中可靠地研究这些细胞，而且还能够进一步应用这些细胞，诸如为了医学和美容目的而移植(例如重建或美容整形外科)。
发明内容
本发明人已开发出重现褐色脂肪细胞的定向分化和靶向分化的发育途径的方案，该方案以受控方式使用特定生长因子。
通过应用他们的方案，发明人已能够高效(例如80％)获得高度富集的人褐色脂肪细胞群。
因此，本发明的一个方面提供了一种转化生长因子β(TGF-β)抑制剂用于在体外产生褐色脂肪细胞群的用途。
在一个实施方案中，TGF-β抑制剂是SMAD2和SMAD3抑制剂。在一个实施方案中，TGF-β抑制剂是激活素A抑制剂。
在一个实施方案中，TGF-β抑制剂是：
Figure BDA0002764621490000031
或其盐或衍生物。
在一个实施方案中，褐色脂肪细胞群是由干细胞群和/或中胚层细胞群在体外产生的。在一个优选的实施方案中，干细胞是诱导多能干细胞。在一个优选的实施方案中，中胚层细胞是近轴中胚层细胞。
在一个实施方案中，褐色脂肪细胞群是由表达以下中的任一种的细胞群在体外产生的：FOXC1、FOXC2、MRF4、MSGN1、MYF5、PAX3、PAX7、PRRX1、SIX1和/或TBX6。
在一个优选的实施方案中，褐色脂肪细胞群至少到分化的第6天表达FOXC1、FOXC2、MRF4、MSGN1、MYF5、PAX3、PAX7、PRRX1、SIX1和/或TBX6中的任一种。
在一个实施方案中，褐色脂肪细胞表达UCP1并且有利地表达PGC1-α、PPARγ、ADIPOQ、PRDM16、ENDRB、CIDEA、DIO2和/或EBF2。
在一个优选的实施方案中，褐色脂肪细胞表达UCP1。在另一个优选的实施方案中，可将毛喉素(forskolin)添加到褐色脂肪细胞中以增加UCP1的表达。
在又一个优选的实施方案中，褐色脂肪细胞群表达这些标志物中的任何一种：UCP1、PGC1-α、PPARγ、ADIPOQ、PRDM16、ENDRB、CIDEA、DIO2和/或EBF2。
在一个实施方案中，褐色脂肪细胞群至少到分化的第36天表达这些标志物中的任一种：UCP1、PGC1-α、PPARγ、ADIPOQ、PRDM16、ENDRB、CIDEA、DIO2和/或EBF2。
在一个实施方案中，细胞群中的至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％表达UCP1。
在另一个实施方案中，与白色脂肪细胞和/或近轴中胚层细胞相比，褐色脂肪细胞表现出更强的解偶联呼吸和/或最大呼吸。
在另一个实施方案中，褐色脂肪细胞在用毛喉素刺激时表现出更强的解偶联呼吸和/或最大呼吸。
在一个实施方案中，褐色脂肪细胞含有2个或更多个脂质小滴，例如至少3、4、5、10、15、20或25个脂质小滴。
在另一方面，本发明提供了一种用于产生褐色脂肪细胞群的方法，所述方法包括使细胞群与转化生长因子β(TGF-β)抑制剂接触的步骤。
在一个实施方案中，所述方法为体外方法。
在一个实施方案中，TGF-β抑制剂是SMAD2和SMAD3抑制剂。在一个实施方案中，TGF-β信号传导抑制剂是激活素A信号传导抑制剂。
在一个实施方案中，TGF-β抑制剂是：
Figure BDA0002764621490000041
或其盐或衍生物。
在一个实施方案中，与TGF-β信号传导抑制剂接触的细胞群是中胚层细胞群。在一个优选的实施方案中，中胚层细胞是近轴中胚层细胞。
在一个实施方案中，与TGF-β信号传导抑制剂接触的细胞群是表达以下中的任一种的细胞群：FOXC1、FOXC2、MRF4、MSGN1、MYF5、PAX3、PAX7、PRRX1、SIX1和/或TBX6。在一个优选的实施方案中，褐色脂肪细胞群至少到分化的第6天表达FOXC1、FOXC2、MRF4、MSGN1、MYF5、PAX3、PAX7、PRRX1、SIX1和/或TBX6中的任一种。
在一个实施方案中，与TGF-β信号传导抑制剂接触的细胞群优选地由干细胞群在体外产生。在一个优选的实施方案中，与TGF-β信号传导抑制剂接触的细胞群是使用3D细胞培养产生的。在一个优选的实施方案中，干细胞是诱导多能干细胞。
在一个实施方案中，添加UCP-1活化剂以增加褐色脂肪细胞标志物UCP-1的表达。
在一个实施方案中，UCP-1活化剂为毛喉素(FSK)：
Figure BDA0002764621490000051
或其盐或衍生物。
在一个实施方案中，添加毛喉素(FSK)以刺激细胞增加UCP1表达并评估细胞的功能。在一个优选的实施方案中，添加1μM-50μM毛喉素(FSK)持续1至24小时。
在一个优选的实施方案中，该方法包括以下步骤：
(a)在TGF-β信号传导抑制剂的存在下，培养细胞群，优选中胚层细胞群，持续第一时间段；以及
(b)在TGF-β信号传导抑制剂不存在的情况下，培养步骤(a)提供的细胞群，持续第二时间段。
在一个实施方案中，第一时间段为约1-15天、2-15天、3-15天、4-15天、5-15天、6-15天、7-15天、8-15天、1-14天、2-14天、3-14天、4-14天、5-14天、6-14天、7-14天、8-14天、1-13天、2-13天、3-13天、4-13天、5-13天、6-13天、7-13天、8-13天、1-12天、2-12天、3-12天、4-12天、5-12天、6-12天、7-12天、8-12天、1-11天、2-11天、3-11天、4-11天、5-11天、6-11天、7-11天、8-11天、1-10天、2-10天、3-10天、4-10天、5-10天、6-10天、7-10天或8-10天，优选约6-10天。
在一个实施方案中，第二时间段为约15-30天、16-30天、17-30天、18-30天、19-30天、20-30天、15-29天、16-29天、17-29天、18-29天、19-29天、20-29天、15-28天、16-28天、17-28天、18-28天、19-28天、20-28天、15-27天、16-27天、17-27天、18-27天、19-27天、20-27天、15-26天、16-26天、17-26天、18-26天、19-26天、20-26天、15-25天、16-25天、17-25天、18-25天、19-25天、20-25天、15-24天、16-24天、17-24天、18-24天、19-24天或20-24天，优选约15-30天。
在一个特别优选的实施方案中，所述方法包括以下步骤：
(a)在TGF-β信号传导抑制剂的存在下，将细胞群，优选中胚层细胞群培养约1-15天，优选约6-10天；以及
(b)在TGF-β信号传导抑制剂不存在的情况下，将步骤(a)提供的细胞群培养约20-50天，优选约15-30天。
在一个特别优选的实施方案中，所述方法包括以下步骤：
(a)在TGF-β信号传导抑制剂的存在下，将细胞群，优选中胚层细胞群培养约1-15天，优选约6-10天；以及
(b)在TGF-β信号传导抑制剂不存在的情况下，将步骤(a)提供的细胞群培养约20-50天，优选约15-30天。
在一个实施方案中，步骤(a)和(b)的培养是贴壁培养。
在一个实施方案中，所述方法包括以下另外的步骤：
(c)在适合于形成聚集的褐色脂肪细胞的条件下培养步骤(b)提供的细胞群，优选地其中所述培养是旋转悬浮培养。
优选地，本发明的细胞是哺乳动物细胞，优选人细胞。
在另一方面，本发明提供了一种分析褐色脂肪细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)使用本发明的方法提供褐色脂肪细胞群；以及
(b)体外分析所述褐色脂肪细胞群或将所述褐色脂肪细胞群植入动物模型中。
在另一方面，本发明提供了一种使用转化生长因子β(TGF-β)信号传导抑制剂在体外可获得的褐色脂肪细胞群。
在另一方面，本发明提供了一种褐色脂肪细胞群，所述褐色脂肪细胞群是通过本发明的方法产生的。
在另一方面，本发明提供了一种用于外科手术和/或治疗的褐色脂肪细胞群，其中所述褐色脂肪细胞群是通过本发明的方法产生的。
在一个实施方案中，所述用途是用于治疗或预防糖尿病。
在另一方面，本发明提供了本发明的褐色脂肪细胞群用于制造治疗或预防糖尿病的药物的用途。
在另一方面，本发明提供了一种将褐色脂肪细胞植入个体体内的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)使用本发明的方法提供褐色脂肪细胞群；以及
(b)将所述褐色脂肪细胞群植入所述个体体内。
在一个实施方案中，所述方法是美容外科手术的方法。
在另一个实施方案中，所述方法为重建整形外科手术的方法。
在另一方面，本发明提供了本发明的褐色脂肪细胞群用于产生脂肪因子或分泌因子的用途。优选地，所述产生是在体外。
在另一方面，本发明提供了一种治疗或预防糖尿病的方法，所述方法包括将本发明的褐色脂肪细胞群植入到对其有需要的个体体内的步骤。
在另一方面，本发明提供了一种筛选治疗剂的方法，所述方法包括使本发明的褐色脂肪细胞群与候选试剂接触的步骤。优选地，该候选药剂被包括在候选药剂库中。所述筛选方法可以例如在体外或体内进行(例如，使用已经移植了本发明的褐色脂肪细胞群的模型动物)。优选地，筛选方法在体外进行。
附图说明
图1：方法的示意图
从多能干细胞(PSC)单层到球形培养物(Sph)，到原条(PS)，再到近轴中胚层(PM)。然后将细胞进行解离并在含有TGFβ信号传导抑制剂SB431542(其为激活素抑制剂)的特定BAD1培养基中进行2D培养。在该阶段包含SB431542减少了血管内皮的出现和来自污染侧板中胚层的心肌细胞发育。在第二步中，将细胞在BAD2培养基中培养，从而允许TGFβ信号传导在去除SB431542时是活跃的。SB431542的持续使用阻碍了适当的动力学并且扰乱了适当的UCP1诱导和表达。
图2和图3：从hiPSC到近轴中胚层(PM)分化细胞的基因表达分析
PM分化的qPCR时间进程：第-2天＝iPSC培养基+ROCK抑制剂，第0天＝分化的开始。X轴为天数，第0天是分化的开始。
图4和图5：褐色脂肪细胞的选定基因的时间进程基因表达分析。
选定基因从近轴中胚层(PM)直到第36天分化成褐色脂肪细胞(BA)的qPCR数据。“+”表示暴露于10μM毛喉素4小时。所有样品均相对于PM 18S rRNA表达而言。
图6：TGFβ抑制和TGFβ信号传导恢复对于BA分化的影响。
长期(+SB)或短期(-SB)SB431542暴露之间的UCP1表达分析。长期SB暴露在紧接于接种解离的近轴中胚层细胞之后开始的整个BA分化期间，在培养基中包括SB431542。短期SB暴露仅在紧接于接种解离的近轴中胚层细胞之后开始的前8天期间，在培养基中包括SB431542。标记为“+FSK”的那些样品接受10μM毛喉素4小时。天数是近轴中胚层分化后的天数。所有样品均相对于iPSC而言，使用18S rRNA作为内源性对照。
图7：脂解功能。
该测定法测量由细胞通过脂解作用释放到培养基中的游离甘油。具有活化脂解作用的细胞将更大量的游离甘油释放到培养基中。这种游离甘油的量通过与已知标准(在540nm下的吸光度)游离甘油试剂#F6428(Sigma)；甘油标准品#G7793(Sigma)的比色比较来定量。
图8：褐色脂肪细胞和白色脂肪细胞的耗氧量曲线。
使分化的褐色脂肪细胞和白色脂肪细胞在XF24板中生长3周至融合，并且在存在(+)或不存在(-)过夜毛喉素(FSK)的情况下培养。图8(A)示出了经刺激的BA(黑色线-圆形)、未刺激的BA(黑色线-圆形)、经刺激的WA(灰色线-三角形)和未刺激的WA(灰色线-正方形)的曲线图。柱状图表示图8(B)每个样品的平均基础呼吸和图8(C)每个样品的解偶联能力。
图9：BA细胞的电子显微镜成像
在分化的第60天对人iPSC来源的BA细胞进行扫描电子显微镜成像，其呈现堆积在囊中的多囊泡脂肪滴。在Zeiss 1450EP SEM上进行成像。(A)比例尺：20μm；(B)比例尺：10μm。
图10：在NE刺激后植入人BA细胞后的体内量热/呼吸测量
植入了用去甲肾上腺素(NE)处理1小时的人BA细胞(IBAT)或空装置(空)的小鼠的呼吸商(ΔVO2)的测量。通过手术清除小鼠的内源鼠BA组织(BATr)或在热力中性条件下处理以使内源鼠BA组织失活(Therm)。
具体实施方式
本文中所用，术语“包含”和“由…构成”与“包括”或“含有”同义，并且包括端值在内或是开放式的，并且不排除另外的未列举的成员、要素或步骤。术语“包含”和“由…构成”也包括术语“由…组成”。
褐色脂肪细胞群的“产生”是指由较不成熟的前体细胞例如干细胞或干细胞与褐色脂肪细胞之间的分化途径上的细胞类型(例如，中胚层细胞，优选近轴中胚层细胞)通过控制该前体细胞的分化而产生。提供本发明的褐色脂肪细胞群的分化可通过在合适的条件下培养前体细胞群而进行，所述条件指导那些细胞以期望的方式，即朝向成为褐色脂肪细胞的方式分化。
褐色脂肪细胞
褐色脂肪组织(BAT)，也称为褐色脂肪，与白色脂肪组织(白色脂肪)组合形成脂肪器官。BAT在新生儿和冬眠的哺乳动物中尤其普遍。它也存在于成人中并且具有代谢活性，但其普遍率随着人年龄的增长而降低。
BAT的主要功能是热调节。与颤抖性肌肉产生的热量相比，BAT通过非颤抖性产热而产生热量。
褐色脂肪细胞的特征可在于UCP1、PGC1-α、PPARγ、ADIPOQ、PRDM16、ENDRB、CIDEA、DIO2和/或EBF2的表达。
在一个优选的实施方案中，褐色脂肪细胞表达UCP1。
在另一个优选的实施方案中，褐色脂肪细胞至少到分化的第36天表达UCP1、PGC1-α、PPARγ、ADIPOQ、PRDM16、ENDRB、CIDEA、DIO2和/或EBF2。
在另一个实施方案中，与白色脂肪细胞和/或近轴中胚层细胞相比，褐色脂肪细胞表现出更强的解偶联呼吸和/或最大呼吸。
在另一个实施方案中，褐色脂肪细胞在用FSK刺激时表现出更强的解偶联呼吸和/或最大呼吸。
褐色脂肪细胞的特征还可在于含有许多(例如，2个或更多个)脂质小滴的细胞。这可区分褐色脂肪细胞与含单个脂质小滴的白色脂肪细胞。
线粒体解偶联蛋白(UCP1)
线粒体解偶联蛋白(UCP1)，也称为产热素，是在BAT的线粒体中发现的解偶联蛋白。
UCP1起到解偶联褐色脂肪细胞中的氧化磷酸化的作用，并且使得能够通过非颤抖性产热而产生热量。
UCP1是褐色脂肪细胞的标志物。
人UCP1的示例性氨基酸序列是以NCBI登录号NP_068605.1保藏的序列。
人UCP1的示例性氨基酸序列为：
MGGLTASDVHPTLGVQLFSAGIAACLADVITFPLDTAKVRLQVQGECPTSSVIRYKGVLGTITAVVKTEGRMKLYSGLPAGLQRQISSASLRIGLYDTVQEFLTAGKETAPSLGSKILAGLTTGGVAVFIGQPTEVVKVRLQAQSHLHGIKPRYTGTYNAYRIIATTEGLTGLWKGTTPNLMRSVIINCTELVTYDLMKEAFVKNNILADDVPCHLVSALIAGFCATAMSSPVDVVKTRFINSPPGQYKSVPNCAMKVFTNEGPTAFFKGLVPSFLRLGSWNVIMFVCFEQLKRELSKSRQTMDCAT
(SEQ ID NO:1)
中胚层细胞
中胚层是在所有两侧对称动物的早期胚胎中发现的三原胚层之一(除外胚层和内胚层以外)。中胚层是在外胚层和内胚层之间形成的中间层。
中胚层形成间充质、间皮、非上皮血细胞和腔胞。中胚层还形成肌肉和性腺的一部分。
近轴中胚层，也称为前体节中胚层或体节中胚层，是神经形成胚中与神经管同时形成的中胚层部分。该区域的细胞产生体节(在神经管两侧周围发现的组织区域)，并且形成肌肉和背部组织。
近轴中胚层细胞的特征可在于以下中的任一种的表达：FOXC1、FOXC2、MRF4、MSGN1、MYF5、PAX3、PAX7、PRRX1、SIX1和/或TBX6。
转化生长因子β(TGF-β)
转化生长因子β1(TGF-β1)是转化生长因子β细胞因子超家族的成员，并且是执行多种功能(包括控制细胞生长、细胞增殖、细胞分化和凋亡)的分泌蛋白。
在一个实施方案中，TGF-β信号传导抑制剂是SMAD2和SMAD3抑制剂。
在一个实施方案中，TGF-β信号传导抑制剂是激活素A抑制剂。
在一个优选的实施方案中，TGF-β信号传导抑制剂是SB-431542。
在一个优选的实施方案中，TGF-β信号传导抑制剂是：
Figure BDA0002764621490000111
或其盐或衍生物。
本发明的用途和方法也可使用化合物(I)的衍生物，所述衍生物在由前体细胞产生褐色脂肪细胞期间提供基本等同的功能。
本发明的用途和方法也可使用其他TGF-β信号传导抑制剂，所述抑制剂在由前体细胞产生褐色脂肪细胞期间提供基本等同的功能。例如，提供基本等同的功能的其他TGF-β信号传导抑制剂包括：SB525334、Galunisertib(LY2157299)、GW788388、LY2109761、RepSox、LY364947和SD208。
在一个实施方案中，所述抑制剂在本发明中以约1μM-50μM、1μM-40μM、1μM-30μM或1μM-20μM的浓度使用。优选地，所述抑制剂在本发明中以约1μM-20μM的浓度使用。
在另一个实施方案中，所述抑制剂在本发明中以约5μM-15μM、6μM-14μM、7μM-13μM、8μM-12μM或9μM-11μM的浓度使用。在另一个实施方案中，所述抑制剂在本发明中以约5μM-10μM的浓度使用。
在另一个实施方案中，所述抑制剂在本发明中以约1μM-5μM、6μM-10μM、11μM-15μM、16μM-20μM、21μM-25μM、26μM-30μM、31μM-35μM、36μM-40μM、41μM-45μM或46μM-50μM的浓度使用。优选地，所述抑制剂在本发明中以约1μM-50μM的浓度，最优选以约10μM使用。
UCP-1活化剂
UCP-1活化剂可用于测试褐色脂肪细胞的功能。
在一个实施方案中，添加UCP-1活化剂以增加褐色脂肪细胞标志物UCP-1的表达。
在一个实施方案中，UCP-1活化剂为毛喉素(FSK)：
Figure BDA0002764621490000121
或其盐或衍生物。
在一个实施方案中，添加毛喉素(FSK)以刺激细胞增加UCP1表达。在一个优选的实施方案中，添加1μM-50μM毛喉素(FSK)持续6至24小时。
盐
本发明的试剂可作为盐，尤其是药学上可接受的盐或酯存在。
本发明的试剂的药学上可接受的盐包括其合适的酸加成盐或碱式盐。合适的药物盐的综述可见于Berge.等人(1977)J.Pharm.Sci.66:1-19。例如与以下酸形成盐：强无机酸，诸如矿物酸，例如硫酸、磷酸或氢卤酸；强有机羧酸，例如未取代的或取代的(例如被卤素取代的)1至4个碳原子的链烷羧酸，诸如乙酸；饱和或不饱和二羧酸，例如草酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、邻苯二甲酸或对苯二甲酸；羟基羧酸，例如抗坏血酸、乙醇酸、乳酸、苹果酸、酒石酸或柠檬酸；氨基酸，例如天冬氨酸或谷氨酸；苯甲酸；或有机磺酸，诸如未取代的或取代的(例如被卤素取代的)(C1-C4)-烷基磺酸或芳基磺酸，诸如甲磺酸或对甲苯磺酸。
对映异构体/互变异构体
在适当的情况下，本发明还包括试剂的所有对映异构体和互变异构体。相应的对映异构体和/或互变异构体可通过本领域已知的方法分离/制备。
立体异构体和几何异构体
本发明的一些试剂可作为立体异构体和/或几何异构体存在。例如，它们可具有一个或多个不对称中心和/或几何中心，因此可以呈两种或更多种立体异构形式和/或几何形式存在。本发明考虑使用那些试剂的所有单独立体异构体和几何异构体以及它们的混合物。权利要求中使用的术语涵盖这些形式，条件是所述形式保持适当的功能活性(但不一定达到相同的程度)。
本发明还包括试剂或其药学上可接受的盐的所有合适的同位素变型。本发明的试剂或其药学上可接受的盐的同位素变型定义为其中至少一个原子被具有相同原子序数但原子质量不同于通常存在于自然界中的原子质量的原子置换的变型。可掺入试剂及其药学上可接受的盐中的同位素的示例包括氢、碳、氮、氧、磷、硫、氟和氯的同位素，诸如分别为2H、3H、13C、14C、15N、17O、18O、31P、32P、35S、18F和36Cl。试剂及其药学上可接受的盐的某些同位素变型，例如其中掺入了放射性同位素诸如3H或14C的那些同位素变型，可用于药物和/或底物的组织分布研究。氚(即3H)和碳-14(即14C)同位素因其易于制备和可检测性而特别优选。此外，用同位素诸如氘(即2H)取代，可提供由更大的代谢稳定性所带来的某些治疗优势，例如体内半衰期增加或剂量需求减少，因此在一些情形下可能是优选的。本发明的试剂及本发明的试剂的药学上可接受的盐的同位素变型通常可使用合适的试剂的适当同位素变型通过常规方法制备。
溶剂化物
本发明还包括本发明试剂的溶剂化物形式。权利要求中使用的术语涵盖这些形式。
多晶型物
本发明还涉及各种结晶形式、多晶型形式和(无水)含水形式的本发明试剂。制药业中公认的是，可通过略微改变从用于合成制备此类化合物的溶剂中纯化和或分离的方法而分离出任何此类形式的化学化合物。
产生方法
本发明的褐色脂肪细胞可从前体细胞诸如干细胞和/或中胚层细胞产生。
在一个方面，本发明提供了一种转化生长因子β(TGF-β)信号传导抑制剂用于在体外产生褐色脂肪细胞群的用途。
在另一方面，本发明提供了一种用于产生褐色脂肪细胞群的方法，所述方法包括使细胞群与转化生长因子β(TGF-β)信号传导抑制剂接触的步骤。
与转化生长因子β(TGF-β)信号传导抑制剂接触的细胞群是在合适的条件下培养时具有分化成褐色脂肪细胞的能力的前体细胞群。
在一个实施方案中，与TGF-β信号传导抑制剂接触的细胞群优选地由干细胞群在体外产生。在一个优选的实施方案中，与TGF-β信号传导抑制剂接触的细胞群是使用3D细胞培养产生的。在一个优选的实施方案中，干细胞是诱导多能干细胞。
3D细胞培养是人工形成的环境，其使细胞能够在三个维度上生长或与其周围环境相互作用。在这种培养中，细胞通常形成可被称为“球体”的3D群落。3D培养方法可更准确地模拟细胞的体内生长和行为。
技术人员能够容易地执行施3D细胞培养，例如通过利用多种可商购获得的培养工具中的任一种。例如，可使用支架或无支架技术来执行3D培养。
基于支架的技术使用支持件诸如固体支架和水凝胶使细胞能够形成3D培养物。此类支架可旨在模拟体内存在的天然细胞外基质(ECM)。
无支架技术则无需使用在其上生长细胞的支架。而是可通过使用例如低粘附板、悬挂滴板、微图案化表面、旋转生物反应器、磁悬浮和磁性3D生物打印来建立3D球体。
可例如通过在超低附着板上培养和/或使用振荡器平台(以约80RPM-120RPM或90RPM-110RPM，优选约100RPM)来实现建立例如干细胞共聚集体3D球体。初始共聚集体的建立可在温育例如约6至18小时或9至15小时、优选约12小时之后实现。
在一个优选的实施方案中，该方法包括以下步骤：
(a)在TGF-β信号传导抑制剂的存在下，培养细胞群，优选中胚层细胞群，持续第一时间段；以及
(b)在TGF-β信号传导抑制剂不存在的情况下，培养步骤(a)提供的细胞群，持续第二时间段。
在一个实施方案中，第一时间段为约1-15天、2-15天、3-15天、4-15天、5-15天、6-15天、7-15天、8-15天、1-14天、2-14天、3-14天、4-14天、5-14天、6-14天、7-14天、8-14天、1-13天、2-13天、3-13天、4-13天、5-13天、6-13天、7-13天、8-13天、1-12天、2-12天、3-12天、4-12天、5-12天、6-12天、7-12天、8-12天、1-11天、2-11天、3-11天、4-11天、5-11天、6-11天、7-11天、8-11天、1-10天、2-10天、3-10天、4-10天、5-10天、6-10天、7-10天或8-10天，优选约6-10天。
在一个实施方案中，第二时间段为约15-30天、16-30天、17-30天、18-30天、19-30天、20-30天、15-29天、16-29天、17-29天、18-29天、19-29天、20-29天、15-28天、16-28天、17-28天、18-28天、19-28天、20-28天、15-27天、16-27天、17-27天、18-27天、19-27天、20-27天、15-26天、16-26天、17-26天、18-26天、19-26天、20-26天、15-25天、16-25天、17-25天、18-25天、19-25天、20-25天、15-24天、16-24天、17-24天、18-24天、19-24天或20-24天，优选约15-30天。
在一个特别优选的实施方案中，所述方法包括以下步骤：
(a)在TGF-β信号传导抑制剂的存在下，将细胞群，优选中胚层细胞群培养约1-15天，优选约6-10天；以及
(b)在TGF-β信号传导抑制剂不存在的情况下，将步骤(a)提供的细胞群培养约20-50天，优选约15-30天。
在一个实施方案中，步骤(a)和(b)的培养是贴壁培养。
在一个实施方案中，所述方法包括以下另外的步骤：
(c)在适合于形成聚集的褐色脂肪细胞的条件下培养步骤(b)提供的细胞群，优选地其中所述培养是旋转悬浮培养。
在本发明的方法期间的细胞培养可使用任何合适的细胞培养基执行。
例如，培养可在由DMEM/F-12组成的不含谷氨酰胺的化学成分确定的基础培养基(DBM)中进行，该基础培养基补充有2％的Probumin(例如，来自EMD Milipore,Billerica,MA)、1x抗生物素-抗真菌剂(例如，来自Corning,Corning,NY)、1x MEM非必需氨基酸(例如，来自Corning,Corning,NY)、1x微量元素A(例如，来自Corning,Corning,NY)、1x微量元素B(例如，来自Corning,Corning,NY)、1x微量元素C(例如，来自Corning,Corning,NY)、50μg/mL抗坏血酸(例如，来自Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)、10μg/mL转铁蛋白(例如，来自Athens Research and Technology,Athens,GA)、0.1mM 2-巯基乙醇(例如，来自Thermo-Fisher,Waltham,MA)和1x Glutagro(例如，来自Corning,Corning,NY)。该培养基可进一步补充有下述最终浓度的以下因子：8ng/mL bFGF(例如，来自R&D Systems,Minneapolis,MN)、100ng/mL BMP7(例如，来自R&D Systems,Minneapolis,MN)、200ng/mL
Figure BDA0002764621490000161
R3IGF-I(例如，来自Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)、10μM Y-27632二盐酸盐(例如，来自Tocris,Minneapolis,MN)、2μM罗格列酮(Rosiglitazone)(例如，来自Tocris,Minneapolis,MN)、1μM地塞米松(例如，来自Tocris,Minneapolis,MN)、1nM LT-3(3,3′,5-三碘-L-甲状腺原氨酸钠盐)(例如，来自Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)和500μM IBMX(3-异丁基-1-甲基黄嘌呤)(例如，来自Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)。
培养基可补充有合适的浓度的TGF-β信号传导抑制剂。对于在TGF-β信号传导抑制剂不存在的情况下的培养，培养基可补充有例如1:500化学成分确定的脂质浓缩物(例如，来自ThermoFisher,Waltham,MA)。
在本发明的方法中使用的合适的培养条件包括例如：
(a)在约36至38℃或36.5至37.5℃、优选约37℃下培养；
(b)在约4至6％或4.5至5.5％的CO2、优选约5％的CO2下培养；和/或
(c)在至少约95％、96％、97％、98％或99％的湿度，优选约100％的湿度下培养。
干细胞
本发明的褐色脂肪细胞可由干细胞(例如在体外)产生。
干细胞是具有分化成更多特化细胞的能力并且还可分裂以制备更多干细胞的细胞。
本发明的方法可包括使前体细胞群(例如，中胚层细胞群，优选近轴中胚层细胞群)与转化生长因子β(TGF-β)信号传导抑制剂接触，其中前体细胞群本身已通过干细胞群的分化而产生(例如，在体外)。
因此，本发明的方法可包括由干细胞群产生细胞群(例如，在体外)的步骤。
优选地，本发明的干细胞为多能干细胞。
多能干细胞是可无限增殖并分化成人类身体的所有细胞类型的干细胞。这些干细胞有希望提供可替代受损伤或疾病影响的细胞的单细胞来源。
多能干细胞可通过多种技术产生。优选，本发明的干细胞是诱导多能干细胞(iPSC)。
iPSC是一种可直接由成体细胞形成的多能干细胞。技术人员能够容易地制备iPSC，例如通过将具体转录因子引入成体细胞中或使成体细胞与具体蛋白质组合接触。
iPSC优于胚胎干细胞，因为它们克服了使用胚胎材料的需要，并且可由它们(或由它们制备的细胞)随后被重新引入的个体制备。这种自体细胞移植可克服移植材料免疫排斥的风险。
本发明的干细胞尤其可以是那些在不破坏胚胎的情况下产生的细胞。
本领域已知用于在不破坏胚胎的情况下产生多能干细胞的方法。特别地，已证实小鼠和人类胚胎干细胞可由单分裂球制备，同时使胚胎完整。例如，Chung,Y.等人((2006)Nature 439:216-219(2006年，“自然”，第439卷，第216-219页))描述了使单分裂球生成小鼠胚胎干细胞的方法。该程序的后续进展提供了无需将分裂球细胞系与其他ESC共培养的方法(Chung,Y.等人，(2008)Cell Stem Cell 2:113-117(2008年，“细胞·干细胞”，第2卷，第113-117页))。
优选本发明的干细胞为哺乳动物干细胞，优选人干细胞。
疾病
本发明的褐色脂肪细胞可用于治疗或预防有长期高血糖水平特征的疾病。这种病症包括胰岛素抗性、前驱糖尿病、1型或2型糖尿病，代谢综合征和肥胖相关病症。
胰岛素抗性是身体产生胰岛素但不能有效利用胰岛素的病症。当个体患有胰岛素抗性时，葡萄糖积聚在血液中而不是被细胞吸收，从而导致2型糖尿病或前驱糖尿病。可将胰岛素抗性定义为靶细胞或整个生物体对其所暴露的胰岛素浓度的响应性减弱。这一定义通常用来指对胰岛素介导的葡萄糖处置的敏感性受损。
前驱糖尿病是并非存在诊断一个人为糖尿病患者所需的所有症状但其血糖异常高的医学阶段。前驱糖尿病通常发生在已经患有胰岛素抗性的个体中。虽然仅胰岛素抗性不会导致2型糖尿病，但它通常通过对胰岛素分泌β细胞提出高需求来为疾病作出铺垫。前驱糖尿病患者的β细胞不能再产生足够的胰岛素来克服胰岛素抗性，导致血糖水平升高至正常范围以上。
多尿症(通常称为糖尿病)是一组代谢疾病，其特征在于患者的血糖水平长期过高。这两种主要类型的糖尿病(1型和2型)具有不同的原因和治疗方法。
1型糖尿病是由胰腺中的胰岛素分泌β细胞遭到破坏(通常是自身免疫机制所致)引起的。
2型糖尿病可由外周组织中的胰岛素抗性结合胰腺β细胞功能障碍引起。
2型糖尿病是一种全球发病率日益增加的慢性代谢障碍。由于老龄人口增加，在世界上一些国家中受影响的个体数目预期在未来十年会加倍。
2型糖尿病的特征为胰岛素抗性导致的胰岛素不敏感、胰岛素产量下降以及最终胰腺β细胞衰竭。这会导致运送到肝脏、肌肉细胞和脂肪细胞中的葡萄糖减少。与高血糖相关的脂肪分解增强。
由于这种功能紊乱，空腹期间升高的胰高血糖素和肝葡萄糖水平无法通过进餐抑制。在胰岛素水平不足和胰岛素抗性增大的情况下，导致高血糖。
患有2型糖尿病的个体更容易出现各种短期和长期并发症，包括糖尿病酮症酸中毒(DKA)、高血糖高渗状态(HHS)、视网膜病变、心脏病、肾病和神经病。这些并发症可能导致过早死亡。
代谢综合征是以下五种医学病症中至少三种的聚类：腹部(向心性)肥胖、血压升高、空腹血糖升高、血清甘油三酯升高和高密度脂蛋白(HDL)水平低。代谢综合症与患心血管疾病和糖尿病的风险相关。
肥胖症是一种医学病症，一般通过BMI超过30kg/m2来测量，BMI通过将人的体重除以人身高的平方来计算。肥胖症增加了各种疾病或病症的可能性，尤其是心血管疾病、2型糖尿病、某些类型的癌症、骨关节炎和抑郁症。
分析方法
在一个方面，本发明提供了分析褐色脂肪细胞的方法。
本发明提供了先前不可能的获得褐色脂肪细胞群的途径，从而使得能够对这些群进行研究以进一步表征这些细胞的功能和行为。
优选地，所述分析方法在体外进行。然而，也可通过将褐色脂肪细胞群植入动物模型(例如小鼠模型)中来分析本发明的褐色脂肪细胞。
合适的分析方法包括但不限于流式细胞术、免疫测定法和基于细胞成像的研究(例如，荧光显微镜术)，这些方法是本领域熟知的技术。
治疗方法
在一个方面，本发明提供了用于外科手术和/或治疗，例如治疗或预防糖尿病的本发明的褐色脂肪细胞群。
治疗或预防可包括将本发明的褐色脂肪细胞群移植到对其有需要的个体体内。因此，本发明提供了治疗或预防糖尿病的方法，该方法包括将本发明的褐色脂肪细胞群移植到对其有需要的个体体内的步骤。
待治疗或预防的糖尿病可例如为1型或2型糖尿病。
应认识到，本文对治疗的所有提及包括治愈性、姑息性和预防性治疗；但在本发明的上下文中，对预防的提及更常与预防性治疗相关。优选哺乳动物，特别是人类的治疗。人类和兽医治疗均在本发明的范围之内。
移植
术语“移植”和“植入”在本文中可互换使用。
例如，本发明的褐色脂肪细胞群可作为自体细胞移植程序的一部分或作为异体细胞移植程序的一部分施用于个体。
术语“自体细胞移植程序”是指从与施用本发明的褐色脂肪细胞群的个体相同的个体中获得前体细胞(从其产生本发明的褐色脂肪细胞群)的程序。
自体移植程序是有利的，因为它们避免了与免疫学不相容性相关联的问题，并且无论基因匹配供体的可用性如何，个体都可进行自体移植程序。
术语“异体细胞移植程序”是指从与施用本发明的褐色脂肪细胞群的个体不同的个体中获得前体细胞(从其产生本发明的褐色脂肪细胞群)的程序。优选地，供体将与施用褐色脂肪细胞群的个体基因匹配以最小化免疫学组织不相容性的风险。
本发明的褐色脂肪细胞群的合适的剂量诸如具有治疗和/或预防有效性。待施用的剂量可取决于待治疗的个体和病症，并且可由技术人员容易地确定。
褐色脂肪细胞群可作为美容外科手术的一部分植入个体体内。
褐色脂肪细胞群可作为整形外科手术(例如，重建整形外科手术，诸如可在意外损伤或烧伤之后进行的整形外科手术)的一部分植入个体体内。
药物组合物
可配制本发明的细胞，用于与药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂一起向个体施用。合适的载体和稀释剂包括等渗盐水溶液，例如磷酸盐缓冲盐水，并且可能含有人类血清白蛋白。
技术人员将理解，在不脱离所公开的本发明范围的前提下，他们可以组合本文所公开的本发明的所有特征。
现将通过非限制性实施例来描述本发明的优选特征和实施方案。
除非另外指明，本发明的实践将采用常规化学、生物化学、分子生物学、微生物学和免疫学技术，这些技术均在本领域普通技术人员的能力范围内。此类技术在文献中有所阐述。参见：例如Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis,T.，1989年，“MolecularCloning：A Laboratory Manual”，第二版，冷泉港实验室出版社；Ausubel,F.M.等人，(1995年和定期补充)，“Current Protocols in Molecular Biology”，第9、13和16章，JohnWiley&Sons；Roe,B.、Crabtree,J.和Kahn,A.，1996年，“DNA Isolation and Sequencing:Essential Techniques”，John Wiley&Sons；Polak,J.M.和McGee,J.O’D.，1990年，“InSitu Hybridization:Principles and Practice”，牛津大学出版社；Gait,M.J.，1984年，“Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach”，IRL出版社；以及Lilley,D.M.AndDahlberg,J.E.，1992年，“Methods in Enzymology:DNA Structures Part A:Synthesisand Physical Analysis of DNA”，学术出版社。这些一般性文本中的每一个以引用的方式并入本文。
实施例
实施例1
材料和方法
细胞培养和分化
将人多能干细胞(PSC)以50,000个细胞/cm2接种于涂有Geltrex LDEV-Free hESC合格的低生长因子基底膜基质(Thermo-Fisher,Waltham,MA)的聚苯乙烯培养板(Thermo-Fisher,Waltham,MA)上，所述人多能干细胞在不含谷氨酰胺的DMEM/F-12(Corning,Corning,NY)中的稀释度为1:200。使用补充有特定因子的化学成分确定的基础培养基(DBM)实现用于PSC维持、球体形成、近轴中胚层和褐色脂肪细胞分化的培养基。DBM由不含谷氨酰胺的DMEM/F-12组成，补充有2％的Probumin(EMD Milipore,Billerica,MA)、1x抗生物素-抗真菌剂(Corning,Corning,NY)、1x MEM非必需氨基酸(Corning,Corning,NY)、1x微量元素A(Corning,Corning,NY)、1x微量元素B(Corning,Corning,NY)、1x微量元素C(Corning,Corning,NY)、50μg/mL抗坏血酸(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)、10μg/mL转铁蛋白(Athens Research and Technology,Athens,GA)、0.1mM 2-巯基乙醇(Thermo-Fisher,Waltham,MA)和1x Glutagro(Corning,Corning,NY)。PSC维持培养基(MM)由DBM组成，补充有8ng/mL人碱性FGF(R&D Systems,Minneapolis,MN)、200ng/mL
Figure BDA0002764621490000211
R3人IGF-I(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)、10ng/mL激活素A(R&D Systems,Minneapolis,MN)和10ng/mL人调节蛋白(Heregulin)β-1(Peprotech，Rocky Hill，NJ)，以包含完全确定的培养基(CDM)。将人PSC在CDM中于37℃培养箱中用5％CO2培养至90％融合，每24小时更换一次培养基，或培养4天。将人PSC从培养板上移除以使用
Figure BDA0002764621490000212
(Innovative CellTechnologies,San Diego,CA)在室温(RT)下传代5-10分钟。在室温以1000rpm离心4分钟后，吸出Accutase，并将细胞团块重悬于CDM中，然后使用血球计对细胞数量进行定量。如上所述将细胞重新接种到涂有geltrex的板上。通过定量聚合酶链反应(qPCR)确定的OCT3/4、SOX2和NANOG阳性表达以及免疫荧光确认了细胞特性。
近轴中胚层(PM)分化
使用旋转悬浮培养以三步法生成近轴中胚层(PM)细胞。首先，将含有1×106个细胞/mL的hPSC单细胞悬浮液以5.5mL体积接种在6孔悬浮板(Greiner Bio-One,Monroe,NC)的球体形成培养基(SFM)中。然后将板置于97RPM的Innova 2000平台振荡器(NewBrunswick Scientific,Edison,NJ)上的5％CO2、37℃培养箱中。球体形成培养基由hPSCMM组成，补充有10μM Y-27632二盐酸盐(Tocris,Minneapolis,MN)，培养24小时。通过经由移液管将球体和培养基转移到锥形管中来更换用过的培养基，并且使球体重力沉淀长达10分钟。小心地，在不搅乱沉淀球体的情况下抽吸用过的培养基。在SFM中24小时后，仅用hPSCMM替换培养基，再保持24小时，并将球体返回到悬浮板并返回到定轨振荡器。在MM中24小时后，通过上述培养基更换法将培养基更换为近轴中胚层培养基1(PMM1)。PMM1由DBM组成，补充有下述最终浓度的以下因子：10ng/mL BMP4(R&D Systems,Minneapolis,MN)、20ng/mLbFGF(R&D Systems,Minneapolis,MN)、200ng/mL
Figure BDA0002764621490000221
R3IGF-I(Sigma-Aldrich,St.Louis MO)和250nM雷帕霉素(Tocris,Minneapolis,MN)。24小时后，用新鲜PMM1更换用过的PMM1，再保持24小时。在PMM1中总共48小时后，将培养基更换为DBM以洗涤细胞。使细胞再沉淀，吸出DBM并将球体在PMM2中再重悬96小时，如上所述每24小时更换一次培养基。如前所述，将球体保持在平台振荡器上的悬浮板中。PMM2由补充有下述最终浓度的以下因子的DBM组成：20ng/mL bFGF(R&D Systems,Minneapolis,MN)、200ng/mL
Figure BDA0002764621490000222
R3IGF-I(Sigma,Sigma-Aldrich,St.Louis MO)、250nM雷帕霉素(Tocris,Minneapolis,MN)、25ng/mL Wnt3a、50ng/mL头蛋白(Noggin)(R&D Systems,Minneapolis,MN)(R&D Systems,Minneapolis,MN)、2μM Bio(Tocris,Minneapolis,MN)和5μM毛喉素(Tocris,Minneapolis,MN)。
褐色脂肪细胞(BA)分化
使用命名为BAD1和BAD2的两种连序培养基制剂完成褐色脂肪细胞(BA)分化。通过首先将PM球体解离成单细胞悬浮液而得到BA。简言之，将PM球体从悬浮板上移除，并使其在锥形管中重力沉淀。小心地吸出培养基，用过量的不含钙或镁的DPBS轻轻地洗涤球体一次。使球体沉降并吸出DPBS。将球体重悬于5mL的RT
Figure BDA0002764621490000223
(Innovative CellTechnologies,San Diego,CA)中并置于单速旋转混合器上20-30分钟直至获得单细胞悬浮液。随后通过100μm过滤器(ThermoFisher,Waltham,MA)将细胞过滤到50mL锥形管中，用DPBS洗涤，并且在室温以200g离心4分钟；吸出所得上清液，并将细胞重悬于BAD1培养基中以便使用血球计进行计数。BAD1由补充有下述最终浓度的以下因子的DBM组成：8ng/mLbFGF(R&D Systems,Minneapolis,MN)、100ng/mL BMP7(R&D Systems,Minneapolis,MN)、200ng/mL
Figure BDA0002764621490000231
R3IGF-I(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)、10μM Y-27632二盐酸盐(Tocris,Minneapolis,MN)、2μM罗格列酮(Tocris,Minneapolis,MN)、1μM地塞米松(Tocris,Minneapolis,MN)、1nM LT-3(3,3′,5-三碘-L-甲状腺原氨酸钠盐)(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)、500μM IBMX(3-异丁基-1-甲基黄嘌呤)(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)和10μM SB 431542(Tocris,Minneapolis,MN)。然后将细胞(PSC)以90,000个细胞/cm2的密度接种于涂有Geltrex LDEV-Free hESC合格的低生长因子基底膜基质(Thermo-Fisher,Waltham,MA)的聚苯乙烯培养板(Thermo-Fisher,Waltham,MA)上，所述细胞在不含谷氨酰胺的DMEM/F-12(Corning,Corning,NY)中的稀释度为1:200。将细胞在BAD1中培养直至100％融合(8-10天)，每24小时更换一次培养基。8-10天后，将BAD1换成BAD2。BAD2的配制与BAD1相同，不包括SB 431542而补充有1:500化学成分确定的脂质浓缩物(ThermoFisher,Waltham,MA)。细胞会留在BAD2中，直到对它们进行测定或再聚集以供进一步使用(例如移植或进一步体外分析)。每天更换BAD2培养基。通过先吸出用过的BAD2培养基并用DBPS洗涤BA板来实现再聚集；使用含有各400单位的稀释于不含钙和镁的HBSS(Corning,Corning NY)中的胶原酶I、II和IV(ThermoFisher,Waltham,MA)的胶原酶混合物解离细胞。胶原酶混合物补充有0.5mM CaCl2 +(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)以增加酶活性。在37℃将BA细胞在胶原酶混合物中温育，直到细胞从板上松开(约20-30分钟)，此时细胞主要呈片状。用等体积的EDTA解离溶液冲洗含细胞和胶原酶的板(Beers等人，2012)，转移到锥形管中并在室温以200g离心4分钟。去除上清液，然后将细胞重悬于5mL的
Figure BDA0002764621490000232
(Innovative Cell Technologies,San Diego,CA)中并置于单速下垂混合器上20-30分钟直至获得单细胞悬浮液。随后通过100μm过滤器(ThermoFisher,Waltham,MA)将细胞过滤到50mL锥形管中，用DPBS洗涤，并且在室温以200g离心4分钟；吸出所得上清液，将细胞重悬于BAD2培养基中并以5.5mL/孔的体积置于6孔悬浮板(Greiner Bio-One,Monroe,NC)中。一般来讲，对于6孔板的两个孔而言，一张10cm的BA板将产生足够的细胞用于再聚集，因为在解离、过滤、洗涤和细胞死亡之间存在损失。将悬浮板置于97RPM的Innova 2000平台振荡器(New Brunswick Scientific,Edison,NJ)上的5％CO2、37℃培养箱中，并且每隔一天用上述重力沉淀培养基更换方法替换BAD2。
从Thermofisher购得脂肪细胞来源的干细胞(ADSC)并在MesenPROTMRS培养基(ThermoFisher,Waltham,MA)中以5,000个细胞/cm2的密度培养直至达到70％融合。用1xTrypLe(ThermoFisher,Waltham,MA)解离细胞，并以10,000个细胞/cm2的密度接种在MesenPROTMRS培养基中四天。四天后，细胞融合并将培养基换成
Figure BDA0002764621490000241
脂肪形成分化培养基(ThermoFisher,Waltham,MA)，以使细胞走向白色脂肪细胞命运。测定之前将细胞培养21天。
qRT-PCR
在DBPS洗涤之后，直接在培养皿中使用补充有2-巯基乙醇的TRK裂解缓冲液(Omega Bio-Tek,Norcross,GA)裂解细胞，并在冰上收获。使用E.Z.N.A RNA分离试剂盒(Omega Bio-Tek,Norcross,GA)按照制造商的方案分离RNA，并用Biotek Synergy 2酶标仪进行RNA定量。使用1μg RNA，经由Iscript cDNA合成试剂盒(Bio-Rad,Hercules,CA)按照制造商的方案合成cDNA。然后用分子级水将cDNA稀释至500μL的最终体积。使用ViiA7实时PCR系统(Life Technologies,Carlsbad,California)在384孔板中，使用5μL TaqManUniversal PCR Master Mix No AmpErase UNG(appliedbiosystems)、0.5μL TaqMan引物(Life Technologies)、0.5μL分子级水和4μL用于
Figure BDA0002764621490000242
探针的cDNA的反应物进行ΔΔCt qRT-PCR分析。将每种转录物的表达归一化为18S核糖体，一式三份进行，并绘制平均值±标准误差。
免疫荧光显微镜检查
将人多能干细胞以50,000/cm2的密度在Labtek 4孔室载玻片(ThermoFisher,Waltham,MA)中培养。以10,000个细胞/cm2接种脂肪细胞来源的干细胞。将褐色脂肪细胞作为再聚集体以15个再聚集体/cm2接种，或大致将6孔悬浮板的一个孔接种至八张Labtek载玻片。使用重力沉淀(10分钟)将近轴中胚层球体收集在15mL falcon管中，吸出用过的培养基，用过量的不含Ca2+或Mg2+的1x DPBS洗涤球体一次，并使其再次沉淀，吸出上清液，然后固定。
Figure BDA0002764621490000251
染料的包含需要具有适当线粒体膜电位的活细胞。因此，如果包含，则在固定之前向生长培养基中添加200nM的MitoTracker Deep Red染料，保持30-45分钟。将所有细胞用4％多聚甲醛(Electron Microscopy Sciences,Hatfield,PA)在室温固定30分钟。用过量的不含Ca2+或Mg2+的1x DPBS洗涤固定的球体一次，并使其沉淀。去除洗涤液，并添加15％蔗糖溶液至足以覆盖球体的体积。然后将该整个体积的蔗糖和球体覆盖到2mL体积的30％蔗糖溶液的表面上，该蔗糖溶液在4℃作为冷冻保护剂过夜。在蔗糖中过夜脱水后，通过200μL的大口径移液管头移出球体并转移到填充有
Figure BDA0002764621490000252
O.C.T.化合物(Sakura Finetek,USA)的低温模具(cryomold)中。然后将低温模具转移到液氮气相中快速冷冻5分钟。将冷冻的低温模具于-80℃保存，随后使用Leica CM3050S低温恒温器(LeicaBiosystems,Buffalo Grove,IL)以7μm的厚度切片到显微镜载玻片上并于-80℃保存。
在固定之前，将人PSC培养至80％融合。将人ADSC在
Figure BDA0002764621490000253
脂肪形成分化培养基中培养21天。在接种再聚集体后14天至30天培养褐色脂肪细胞。用不含Ca2+或Mg2+的1xDPBS洗涤所有样品、固定细胞和切片5分钟。对于hPSC和PM，去除洗涤液并更换为含有PBST(1x PBS和0.2％Triton X-100)(ThermoFisher,Waltham,MA)、10％驴血清(Equitech-Bio)、0.3M甘氨酸(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)的透化和封闭缓冲液，在室温保持1小时。对于BA细胞，去除洗涤液并更换为含有PBSS(1x PBS和0.1％皂苷)(Millipore,Billerica,MA)、10％驴血清、0.3M甘氨酸的透化和封闭缓冲液，在室温保持1小时。对于所有细胞，去除透化和封闭缓冲液，并用含有PBST或PBSS和10％驴血清的一抗温育缓冲液冲洗载玻片一次。在去除洗涤液后，在一抗温育缓冲液中制备一抗(参见表1)，添加到样品中并在4℃温育过夜。在用一抗温育过夜后，将样品用单独的温育缓冲液洗涤3次。将二抗在2.5％驴血清、0.2M PBST/S溶液中稀释并且在室温于黑暗中温育1小时。在去除二抗后，将细胞用DPBS洗涤两次，每次5分钟。如果包含，则以在DPBS中1:200的稀释度添加LipidTox绿/红染料，保持30分钟。在LipidTox染料之后，将DPBS中的1μg/mL 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)添加到细胞中，保持5分钟。在DPBS中洗涤3次后，将盖玻片固定到具有ProLong Gold Antifade(ThermoFisher,Waltham,MA)的载玻片上。使用LeicaDM6000B显微镜和Zeiss LSM 710共聚焦显微镜获得图像。用Slidebook 6(IntelligentImaging Solutions,Edmonton,Alberta)处理图像。
流式细胞分析
使用上文列出的用于每种细胞类型的正常解离的方法解离细胞，用无菌DPBS洗涤并以200g团块化4分钟。将细胞重悬于0.5mL流式细胞术固定缓冲液(R&D Systems,Minneapolis MN)中并在室温温育15分钟。固定后，将细胞用DPBS洗涤两次，团块化并重悬于200μL流式细胞术透化/洗涤缓冲液I(R&D Systems,Minneapolis,MN)中。将一抗(表2)与固定细胞在4℃温育一小时。然后洗涤细胞，并且如果需要，与二抗一起在4℃温育30分钟。如果包含，则在添加二抗之后以在DPBS中1:200的稀释度添加LipidTox绿/红染料，保持30分钟。在Beckman Coulter CyAn上进行分析，并使用FlowJo v10对结果进行分析和绘图。
海马细胞外通量分析
将近轴中胚层、BA和白色脂肪(WA)细胞接种在处于它们的正常培养条件下的Seahorse XFe24细胞培养微型板(Agilent,Santa Clara,CA)上。简言之，将PM细胞以120,000/cm2的密度接种于补充有Y-27632二盐酸盐(Tocris,Minneapolis,MN)的PMM2培养基中24小时，然后在通量分析之前换成单独的PMM2，再保持48小时。将褐色脂肪细胞作为再聚集体以15个聚集体/cm2的密度接种，并且在BAD2中培养21天。对于白色脂肪细胞通量分析，将hADSC以10,000个细胞/cm2的密度接种于MesenPROTMRS(ThermoFisher,Waltham,MA)培养基中四天，然后换成
Figure BDA0002764621490000261
脂肪形成分化培养基(ThermoFisher,Waltham,MA)，保持21天。对于BA细胞，每隔一天更换培养基。对于hADSC，在初始接种当天添加新鲜的MesenPRO而不更换。在WA分化期间，每三天更换
Figure BDA0002764621490000262
脂肪形成分化培养基。
利用Mito应力测试试剂盒(Agilent,Santa Clara,CA)分析线粒体功能。在确定PM和WA细胞的通量分析方案之前，滴定药物、寡霉素、FCCP和鱼藤酮(rotenone)/抗霉素A对褐色脂肪细胞的最大作用。药物浓度在所有细胞外通量测定中均未改变：寡霉素以2μM使用，FCCP以2μM使用，并且鱼藤酮/抗霉素A以5μM使用。
对于去甲肾上腺素刺激分析，将细胞保持在它们各自的分化培养基中直到紧接在测定之前。对于异丙肾上腺素刺激测定，在测定前18小时向PM细胞给予不含毛喉素而含100μM异丙肾上腺素的PMM2培养基。在测定前，向BA细胞给予不含IBMX而含100μM异丙肾上腺素的BAD2培养基18小时。由于白色脂肪细胞在基于血清的培养基中分化，所以我们试图通过将两种细胞都暴露于相同培养基48小时以进行毛喉素刺激测定来归一化血清对BA细胞的任何影响。向BA和WA细胞两者给予由不含谷氨酰胺的DMEM/F-12(Corning,Corning,NY)、2％ESC合格FBS(Atlanta Biological,Flowery Branch,GA)、2mM glutagroTM(Corning,Corning,NY)、1x MEM非必需氨基酸(Corning,Corning,NY)、200ng/mL
Figure BDA0002764621490000272
R3 IGF-I(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)和1μM地塞米松(Tocris,Minneapolis,MN)组成的最小培养基。在测定前二十四小时，为该最小培养基补充10μM毛喉素。对于脂肪酸氧化测定，在通量测定之前，向BA和WA细胞两者给予底物限制培养基24小时。该底物限制培养基由不含葡萄糖、谷氨酰胺或丙酮酸钠的DMEM(Corning,Corning,NY)组成，补充有0.5mM葡萄糖(Corning,Corning,NY)、1mM glutagroTM(Corning,Corning,NY)、0.5mM肉毒碱(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)和2％ESC合格FBS(Atlanta Biological,Flowery Branch,GA)。
在测定之前，向细胞给予新鲜制备的XF测定培养基。该培养基由XF基础培养基(Agilent,Santa Clara,CA)和所需浓度的底物组成：葡萄糖、谷氨酰胺和丙酮酸钠。对于刺激测定，XF测定培养基含有补充有25mM葡萄糖(Corning,Corning,NY)、2mM glutagroTM(Corning,Corning,NY)和1mM丙酮酸钠的基础培养基。将培养基升温至37℃，并使用氢氧化钠将pH调节至7.4，并通过0.2μm
Figure BDA0002764621490000271
过滤器(Millipore,Billerica,MA)过滤。在通量测定开始之前至少一小时，将生长培养基从XF24板移除，并且根据制造商的方案用XF测定培养基洗涤细胞三次，并将细胞置于37℃的非CO2培养箱中。在通量分析期间利用的所有药物也在上样到测定盒端口中之前由原液稀释到XF测定培养基中。对于脂肪酸氧化测定，XF测定培养基含有补充有5.5mM葡萄糖和0.5mM肉毒碱的XF基础培养基。
以两步法依序制备1.5mM缀合的棕榈酸-BSA溶液。首先制备在150mM NaCl溶液中的1mM棕榈酸钠(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)，然后制备在150mM NaCl溶液中的0.34mM无脂肪酸BSA(Santa Cruz Biotechnology,Dallas,TX)。在加热的搅拌板上的水浴中将棕榈酸钠溶液加热到37℃至70℃，直至溶液澄清。同时，将BSA溶液在37℃在加热的搅拌板上的水浴中加热直至其完全溶解，然后用0.2μm
Figure BDA0002764621490000281
过滤器(Millipore,Billerica,MA)无菌过滤。一经过滤，就将BSA溶液转移至锥形管中并保持在37℃水浴中直至准备混合。对于仅BSA的对照，将一半的0.34mM的BSA NaCl溶液用等体积的150mM NaCl溶液进一步稀释至0.17mM BSA的最终浓度。将该溶液等分并于-20℃储存。为了完成棕榈酸酯缀合，以5mL增量向剩余温热的0.34mM BSA溶液中添加等体积的热棕榈酸酯(棕榈酸酯与BSA之间的摩尔比＝6:1)。将该溶液在37℃搅拌一小时。将pH调节至7.4，并且将最终溶液等分到4mL玻璃小瓶中，并且于-20℃储存。
在通量分析后，裂解细胞并通过Bradford测定法测量蛋白质含量。简言之，在通量测定完成时，将板移除，吸出培养基并用冰冷的DPBS轻轻冲洗各孔。吸出洗涤液，然后将板置于液氮气相中，同时制备新鲜的裂解缓冲液。裂解缓冲液由含0.1％Triton X-100的10mMTris(pH 7.4)组成。移除冷冻板并立即添加室温裂解缓冲液。冷冻并添加相对温热的裂解缓冲液有助于脂肪细胞的裂解。向裂解的细胞中，每孔添加450μL的Bradford试剂(Bio-Rad,Hercules,CA)。在Biotek Synergy 2上，在595nm下使用100μL裂解的细胞Bradford试剂混合物测定蛋白质浓度。将通量数据经由Wave软件(Agilent,Santa Clara,CA)处理并标准化为蛋白质含量。
脂解作用
将人多能干细胞(PSC)、褐色脂肪(BA)细胞和多潜能人脂肪来源的基质细胞/干细胞(hADSC)接种在12孔falcon板(Fisher Scientific,Hampton,NH)中。将人PSC以50,000个细胞/cm2接种并培养四天直至在MM中融合。将人ADSC以10,000个细胞/cm2接种并且先在MesenPROTMRS(ThermoFisher,Waltham,MA)中培养四天直至融合。然后将培养基换成
Figure BDA0002764621490000282
脂肪形成分化培养基(ThermoFisher,Waltham,MA)，保持21天。将褐色脂肪细胞聚集体以15个聚集体/cm2接种于12孔falcon板(Fisher Scientific,Hampton,NH)中并且在BAD2培养基中培养21天。使用游离甘油试剂(Sigma Aldrich,St.Louis,MO)根据制造商的说明书通过甘油向细胞培养基中的释放量来度量脂解作用。在测定之前，从每种细胞类型中去除生长培养基并用补充有2％无FA的BSA(Santa Cruz Biotechnology,Dallas,TX)的脂解基础培养基[DMEM(Corning,Corning,NY)洗涤细胞三次以从孔中去除任何残留脂肪酸。通过在时间“0”时向脂解基础培养基中添加10μM毛喉素(Tocris,Minneapolis,MN)来刺激脂解，并在4小时和8小时时间点取样。将三氮菌素C(Triacsin C)(5μM)添加到基础培养基中以抑制酰基-CoA合成酶，随后甘油和释放的脂肪酸进行再酯化。将脂解数据归一化为蛋白质含量。
表1：抗体和染料的综合列表
Figure BDA0002764621490000291
Figure BDA0002764621490000301
实施例2–小鼠中的人iPSC-BA植入
向两组小鼠植入通过本发明的方法产生的人褐色脂肪细胞(hiPSC来源的BA细胞)，并皮下包封在装置中。在一个组中，为小鼠注射毛喉素(FSK)以刺激褐色脂肪细胞。在另一组中，植入了褐色脂肪细胞的小鼠未用FSK进行刺激。为对照组的小鼠植入空装置。在植入后三周，评估所有组的移植装置的PET-SCAN体内成像以及离体PET-SCAN成像。如通过PET-SCAN离体成像所分析的，与植入未经FSK刺激的褐色脂肪细胞的组相比，植入经FSK刺激的褐色脂肪细胞的组显示出标记葡萄糖的信号增加。植入空装置的小鼠未显示出信号。
对植入了包封的人褐色脂肪细胞或空装置的小鼠的组进行量热分析。通过外科手术清除一组小鼠的内源鼠BA组织，并将另一组维持在热力中性条件下，以使内源鼠BA组织失活。为两个组植入人BA细胞(hiPSC来源的褐色脂肪细胞)或空装置。植入后一周，用去甲肾上腺素(NE)刺激每组小鼠(BA刺激)，以评估解偶联呼吸的增加。分析四个亚组的量热测量值，作为人褐色脂肪细胞诱导的呼吸指数的读数。与植入空装置的小鼠相比，在通过外科手术清除了内源鼠BA细胞的小鼠中，NE诱导呼吸指数显著增加。在热力中性条件下处理的一组小鼠中，与植入空装置的组相比，在植入人BA细胞的一组小鼠中呼吸指数的NE-依赖性诱导略有改善，但没有显著改善。
在上述说明书中提到的所有出版物均以引用方式并入本文。本发明所公开的细胞群、用途和方法的各种修改和变型在不脱离本发明的范围和实质的情况下对技术人员将是显而易见的。虽然已结合具体优选的实施方案对本发明进行了公开，但是应当理解，受权利要求书保护的本发明不应不当地受限于此类具体实施方案。实际上，对技术人员显而易见的对用于实践本发明所公开的模式的各种修改旨在落在以下权利要求书的范围内。
Figure IDA0002764621530000011

Claims (22)

1.转化生长因子β(TGF-β)抑制剂用于在体外产生褐色脂肪细胞群的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其中TGF-β信号传导抑制剂是SMAD2和SMAD3抑制剂和/或激活素信号传导抑制剂。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述TGF-β抑制剂是：
Figure FDA0002764621480000011
或其盐或衍生物。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的用途，其中所述褐色脂肪细胞群是由干细胞群和/或中胚层细胞群在体外产生的，优选地其中所述干细胞为诱导多能干细胞，和/或优选地其中所述中胚层细胞为近轴中胚层细胞。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的用途，其中所述褐色脂肪细胞群是由表达FOXC1、FOXC2、MRF4、MSGN1、MYF5、PAX3、PAX7、PRRX1、SIX1和/或TBX6的细胞群在体外产生的。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的用途，其中所述褐色脂肪细胞表达PGC1-α、PPARγ、ADIPOQ、PRDM16、ENDRB、CIDEA、DIO2和/或EBF2。
7.根据权利要求6所述的用途，其中所述褐色脂肪细胞表达UCP1。
8.用于产生褐色脂肪细胞群的方法，所述方法包括使细胞群与转化生长因子β(TGF-β)抑制剂接触的步骤。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述TGF-β抑制剂是SMAD2和SMAD3抑制剂和/或激活素抑制剂。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其中所述TGF-β抑制剂是：
Figure FDA0002764621480000021
或其盐或衍生物。
11.根据权利要求8至10中任一项所述的方法，其中与所述TGF-β抑制剂接触的所述细胞群是中胚层细胞群，优选地其中所述中胚层细胞是近轴中胚层细胞。
12.根据权利要求8至11中任一项所述的方法，其中与所述TGF-β抑制剂接触的所述细胞群是表达FOXC1、FOXC2、MRF4、MSGN1、MYF5、PAX3、PAX7、PRRX1、SIX1和/或TBX6的细胞群。
13.根据权利要求8至12中任一项所述的方法，其中与所述TGF-β抑制剂接触的所述细胞群优选使用3D细胞培养由干细胞群产生，和/或优选地其中所述干细胞是诱导多能干细胞。
14.根据权利要求8至13中任一项所述的方法，其中所述方法包括以下步骤：
在所述TGF-β抑制剂的存在下，将中胚层细胞群培养约1至15天，优选约6至10天；以及
在所述TGF-β抑制剂不存在的情况下，将步骤(a)提供的所述细胞群培养约20至50天，优选约15至30天。
15.根据权利要求14所述的方法，其中步骤(a)和步骤(b)的培养是贴壁培养。
16.根据权利要求14或15所述的方法，其中所述方法包括以下另外的步骤：
在适合于形成聚集的褐色脂肪细胞的条件下培养步骤(b)提供的所述细胞群，优选地其中所述培养是旋转悬浮培养。
17.分析褐色脂肪细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
使用根据权利要求8至16中任一项所述的方法提供褐色脂肪细胞群；以及
体外分析所述褐色脂肪细胞群或将所述褐色脂肪细胞群植入动物模型中。
18.使用转化生长因子β(TGF-β)抑制剂在体外可获得的褐色脂肪细胞群。
19.褐色脂肪细胞群，所述褐色脂肪细胞群是通过根据权利要求8至17中任一项所述的方法产生的。
20.用于在外科手术和/或治疗中使用的褐色脂肪细胞群，其中所述褐色脂肪细胞群是通过根据权利要求8至17中任一项所述的方法产生的。
21.根据权利要求20所述的用于所述用途的褐色脂肪细胞群，其中所述用途是用于治疗或预防糖尿病。
22.将褐色脂肪细胞植入个体体内的方法，所述方法包括以下步骤：
使用根据权利要求8至17中任一项所述的方法提供褐色脂肪细胞群；以及
将所述褐色脂肪细胞群植入所述个体体内。
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NADER ZAMANI 等: "Emerging Roles for the Transforming Growth Factor-β Superfamily in Regulating Adiposity and Energy Expenditure", ENDOCRINE REVIEWS, vol. 32, no. 3, pages 387, XP055513856, DOI: 10.1210/er.2010-0018 *

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