WO2024070494A1 - 膵内胚葉細胞の製造方法 - Google Patents

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WO2024070494A1
WO2024070494A1 PCT/JP2023/031987 JP2023031987W WO2024070494A1 WO 2024070494 A1 WO2024070494 A1 WO 2024070494A1 JP 2023031987 W JP2023031987 W JP 2023031987W WO 2024070494 A1 WO2024070494 A1 WO 2024070494A1
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WO
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cells
pancreatic endoderm
medium
culture
endoderm cells
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PCT/JP2023/031987
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健二 長船
悠 畑野
東 木村
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国立大学法人京都大学
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/37—Digestive system
    • A61K35/39—Pancreas; Islets of Langerhans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing pancreatic endoderm cells. More specifically, the present invention relates to a method for producing pancreatic endoderm cells, which includes a step of culturing pancreatic endoderm cells in the presence of a ROCK inhibitor, and to pancreatic endoderm cells produced by the method.
  • pancreas functions as an exocrine gland that secretes digestive enzymes such as pancreatic lipase, trypsin, elastase, and pancreatic amylase, and as an endocrine gland that secretes pancreatic hormones such as glucagon, insulin, somatostatin, and pancreatic polypeptide (PP).
  • pancreatic hormones such as glucagon, insulin, somatostatin, and pancreatic polypeptide (PP).
  • ghrelin a gastric secretion hormone
  • pancreatic hormone is produced by cell clusters called pancreatic islets, which are mainly composed of four types of cells in the pancreas: ⁇ cells, ⁇ cells, ⁇ cells, and PP cells.
  • Diabetes is a disease that develops due to a lack of insulin or the loss of its function, and once it develops, it is difficult to cure. Diabetes can be broadly classified into two types: type 1 diabetes (insulin-dependent diabetes mellitus) and type 2 diabetes (non-insulin-dependent diabetes mellitus).
  • Type 2 diabetes is a chronic disease that develops when insulin resistance is acquired in addition to a decrease in insulin secretion ability, and is thought to be caused by lifestyle habits such as obesity caused by overeating and lack of exercise, and stress.
  • type 1 diabetes is a disease that occurs when beta cells (insulin-producing cells) are destroyed by autoimmune disease or viral infection, preventing insulin from being secreted into the body.
  • Symptomatic treatment is mainly by administering insulin.
  • Another treatment for type 1 diabetes that is being considered is inducing insulin-producing cells from patient-derived cells outside the body, and then transplanting the induced insulin-producing cells into the patient's body. Insulin-producing cells can be obtained, for example, by taking cells derived from the patient's pancreatic duct epithelium outside the body and allowing them to differentiate.
  • Non-Patent Document 1 a method for expanding and culturing posterior foregut cells derived from human pluripotent stem cells has also been developed (e.g., Non-Patent Document 1, Non-Patent Document 2).
  • Non-Patent Document 1 and Non-Patent Document 2 report a method for expanding and culturing PDX1 + /SOX9 + /NKX6.1 - pancreatic progenitor cells (pancreatic progenitor cells or pancreatic progenitors), which correspond to the posterior foregut cells in Figure 1.
  • the objective of the present invention is to develop a method for proliferating (i.e., expanding) pancreatic endoderm cells, which are cells at a stage of differentiation more advanced than posterior foregut cells, while maintaining their differentiation potential.
  • pancreatic endoderm cells can be expanded by adding Y-27632 to the culture medium at a concentration of 10 ⁇ M or 50 ⁇ M.
  • a low concentration (e.g., 10 ⁇ M) of Y-27632 is sometimes used only on the first day of reseeding in order to suppress apoptosis.
  • ROCK inhibitors such as Y-27632 changes the differentiation state of cells (Maldonado M. et al., Stem Cell Res 17; 222-227; 2016), and the use of ROCK inhibitors for more than one day has been avoided.
  • pancreatic endoderm cells can be efficiently expanded for a long period of time while maintaining their differentiation potential (in one embodiment, they can be expanded to 1 ⁇ 10 5 times or more in culture for 60 days or more) even when Y-27632 is used at a high concentration of 10 ⁇ M or more and further for a long period of time during culture.
  • the inventors further verified the mechanism of the proliferation effect of ROCK inhibitors on pancreatic endoderm cells. It was suggested that the main mechanism of this effect is not anti-apoptosis, but the inhibition of cell aging and the associated inhibition of fibrosis or epithelial-mesenchymal transition. Based on these findings, further research led to the completion of the present invention.
  • the present invention is as follows.
  • [1-1] A method for producing pancreatic endoderm cells, comprising the step of culturing pancreatic endoderm cells in a medium containing a ROCK inhibitor, and KGF and/or EGF.
  • [1-2] The method according to [1-1], wherein the medium contains both KGF and EGF.
  • [1-3] The method according to [1-1] or [1-2], wherein the medium contains nicotinamide.
  • [10-1] The method according to any one of [1-1] to [9], wherein the culture is under feeder-free conditions.
  • [10-2] The method according to any one of [1-1] to [10-1], wherein the culture is under xeno-free conditions.
  • [11] A pancreatic endoderm cell produced by the method according to any one of [1-1] to [10-2].
  • [12-1] A kit for expanding pancreatic endoderm cells, comprising a ROCK inhibitor and KGF and/or EGF.
  • the kit according to [12-1] comprising both KGF and EGF.
  • [12-3] The kit according to [12-1] or [12-2], which contains nicotinamide.
  • [13-1] The kit according to any one of [12-1] to [12-3], comprising a TGF ⁇ inhibitor and/or a retinoic acid receptor agonist.
  • [13-2] The kit described in [13-1], which contains both a TGF ⁇ inhibitor and a retinoic acid receptor agonist.
  • [13-3] The kit according to [13-1] or [13-2], wherein the TGF ⁇ inhibitor is 2-[3-[6-methylpyridin-2-yl]-1H-pyrazol-4-yl]-1,5-naphthyridine.
  • the retinoic acid receptor agonist is retinoic acid.
  • [14-1] A method for producing ⁇ -like cells or precursor cells thereof, comprising a step of inducing differentiation of the pancreatic endoderm cells according to [11] into ⁇ -like cells or precursor cells thereof.
  • [14-2] A cell produced by the method according to [14-1].
  • [15] A cell transplantation therapeutic agent comprising the cells according to [11] or [14-2].
  • [16] The agent according to [15] for treating diabetes.
  • [17-1] A method for treating a pancreatic disease in a mammal, comprising administering to the mammal an effective amount of the cell according to [11] or [14-2] or the agent according to [15] or [16].
  • [17-2] The method according to [17-1], wherein the pancreatic disease is diabetes.
  • [18-1] The cell according to [11] or [14-2] or the agent according to [15] or [16] for use in treating a pancreatic disease.
  • [18-2] The cell or agent according to [18-1], wherein the pancreatic disease is diabetes.
  • [19-2] The cell or agent according to [19-1], wherein the pancreatic disease is diabetes.
  • pancreatic endoderm cells to be proliferated with high efficiency.
  • these cells are useful in regenerative medicine and drug discovery screening for pancreatic diseases, as an alternative to human pancreatic islets and exocrine cells and tissues, which are difficult to obtain as research samples.
  • FIG. 1 Schematic diagram of the stepwise differentiation induction method for ⁇ -like cells.
  • the present invention provides a method for producing pancreatic endoderm cells using a medium containing a ROCK inhibitor. Specifically, the present invention provides a method for producing pancreatic endoderm cells (hereinafter, sometimes referred to as the "production method of the present invention"), which comprises a step of culturing pancreatic endoderm cells in a medium containing a ROCK inhibitor and KGF and/or EGF. The production method of the present invention may also include a step of isolating the produced pancreatic endoderm cells.
  • the method of the present invention allows pancreatic endoderm cells to self-multiply, producing homogeneous cells.
  • the method of the present invention can also be interpreted as a method for multiplying pancreatic endoderm cells or a method for expanding and culturing pancreatic endoderm cells, which includes a step of culturing pancreatic endoderm cells in a medium containing a ROCK inhibitor and KGF and/or EGF.
  • pancreatic endoderm cells refers to cells that have the ability to differentiate into at least ⁇ -like cells and express at least PDX1 and NKX6.1. Pancreatic endoderm cells may further express one or more gene markers such as SOX9 and GATA4.
  • ⁇ -like cells refers to cells that have been induced to differentiate in vitro from endocrine precursor cells or immature ⁇ cells, have properties identical to or similar to those of in vivo pancreatic ⁇ cells, and express and/or secrete insulin.
  • cells includes “cell populations.”
  • a cell population may be composed of one type of cell, or may be composed of two or more types of cells.
  • expansion culture refers to culturing for the purpose of proliferating a desired cell population and increasing the number of cells.
  • the increase in cell number need only be achieved when the increase in cell number due to cell proliferation exceeds the decrease in cell number due to cell death, and it is not necessary for all cells in the cell population to proliferate.
  • the increase in cell number can be 1.1-fold, 1.2-fold, 1.5-fold, 2-fold, 3-fold, 4-fold, 5-fold, 6-fold, 7-fold, 8-fold, 9-fold, 10-fold, 15-fold, 20-fold, 30-fold, 40-fold, 50-fold, 100-fold, 300-fold, 500-fold, 1000-fold, 3000-fold, 5000-fold, 10000-fold, 100000-fold, or 1000000-fold or more compared to before the start of expansion culture.
  • the basal medium used in the production method of the present invention is not particularly limited, but includes StemFit (registered trademark) AK02 medium (Ajinomoto Co., Ltd.), StemFit (registered trademark) AK03 medium (Ajinomoto Co., Ltd.), StemFit (registered trademark) Basic03 medium, CTS (registered trademark) KnockOut SR XenoFree Medium (Gibco), mTeSR1 medium, TeSR1 medium (Stem Cell Technologies), Iscove's modified Dulbecco's medium (GE Healthcare), Improved MEM (Thermo Fisher Scientific), etc. Among them, Improved MEM medium is preferable.
  • basal media include RPMI-1640 medium, EagleMEM (EMEM), Dulbecco's modified MEM, Glasgow's MEM (GMEM), ⁇ -MEM, 199 medium, IMDM, DMEM, Hybridoma Serum free medium, KnockOut TM DMEM, Advanced TM medium (e.g., Advanced MEM, Advanced RPMI, Advanced DMEM/F-12), Ham's Medium F-12, Ham's Medium F-10, Ham's Medium F12K, DMEM/F-12, ATCC-CRCM30, DM-160, DM-201, BME, Fischer, McCoy's 5A, Leibovitz's L-15, RITC80-7, MCDB105, MCDB107, MCDB131, MCDB153, MCDB201, NCTC109, NCTC135, Waymouth's Medium (e.g., Waymouth's Examples of suitable medium include, but are
  • ROCK inhibitors As shown in the examples below, various types of ROCK inhibitors were found to have a proliferative effect on pancreatic endoderm cells. In other words, suppressing the function of Rho-kinase (ROCK) is important for the proliferation of pancreatic endoderm cells, and any ROCK inhibitor can be applied to the manufacturing method of the present invention as long as it can suppress said function.
  • ROCK inhibitors include Y-27632 (see, e.g., Ishizaki et al., Mol. Pharmacol. 57, 976-983 (2000); Narumiya et al., Methods Enzymol.
  • fasudil/HA1077 see, e.g., Uenata et al., Nature 389: 990-994 (1997)
  • SR3677 see, e.g., Feng Y et al., J Med Chem. 51: 6642-6645 (2008)
  • GSK 269962 see, e.g., Stavenger RA et al., J Med Chem. 50: 2-5 (2007) or WO2005/037197
  • GSK429286A, H1152 see, e.g., Sasaki et al., Pharmacol. Ther.
  • ROCK inhibitors include antisense nucleic acids against ROCK, RNA interference-inducing nucleic acids (e.g., siRNAs), dominant-negative mutants, and expression vectors thereof.
  • RNA interference-inducing nucleic acids e.g., siRNAs
  • Y-27632 GSK269962, GSK429286A, fasudil hydrochloride, H1152 and thiazovivin are preferred, and Y-27632 is particularly preferred.
  • only one type of ROCK inhibitor may be used, or two or more types may be used.
  • Salts of compounds include inorganic base salts such as alkali metal salts (sodium salt, potassium salt, etc.), alkaline earth metal salts (calcium salt, magnesium salt, etc.), aluminum salts, and ammonium salts, as well as base addition salts such as organic base salts such as trimethylamine, triethylamine, pyridine, picoline, ethanolamine, diethanolamine, triethanolamine, dicyclohexylamine, and N,N'-dibenzylethylenediamine, and acid addition salts such as inorganic acid salts such as hydrochloride, hydrobromide, sulfate, hydroiodide, nitrate, and phosphate, and organic acid salts such as citrate, oxalate, acetate, formate, propionate, benzoate, trifluoroacetate, maleate, tartrate, methanesulfonate, benzenesulfonate, and paratoluenesulfonate.
  • the concentration in the medium is usually 1 ⁇ M or more (e.g., 5 ⁇ M, 10 ⁇ M, 15 ⁇ M, 20 ⁇ M, 25 ⁇ M, 30 ⁇ M, 35 ⁇ M, 40 ⁇ M, 45 ⁇ M, 50 ⁇ M or more) and 500 ⁇ M or less (400 ⁇ M, 300 ⁇ M, 200 ⁇ M, 150 ⁇ M, 100 ⁇ M or less).
  • the concentration in the medium may be 0.1 ⁇ M to 1000 ⁇ M, 1 ⁇ M to 300 ⁇ M, or 10 ⁇ M to 100 ⁇ M. In one embodiment, it is 50 ⁇ M.
  • the concentration in the medium is usually 0.02 ⁇ M to 100 ⁇ M, preferably 0.2 ⁇ M to 50 ⁇ M, and more preferably 2 ⁇ M to 10 ⁇ M. In one embodiment, it is 2 ⁇ M.
  • the concentration in the medium is usually 0.02 ⁇ M to 100 ⁇ M, preferably 0.2 ⁇ M to 50 ⁇ M, and more preferably 2 ⁇ M to 10 ⁇ M. In one embodiment, it is 2 ⁇ M.
  • the concentration in the medium is usually 0.1 ⁇ M to 500 ⁇ M, preferably 1 ⁇ M to 200 ⁇ M, and more preferably 10 ⁇ M to 50 ⁇ M. In one embodiment, it is 50 ⁇ M.
  • the concentration in the medium is usually 0.02 ⁇ M to 100 ⁇ M, preferably 0.2 ⁇ M to 50 ⁇ M, and more preferably 2 ⁇ M to 10 ⁇ M. In one embodiment, it is 2 ⁇ M.
  • the concentration in the medium is usually 0.02 ⁇ M to 100 ⁇ M, preferably 0.2 ⁇ M to 50 ⁇ M, and more preferably 2 ⁇ M to 10 ⁇ M. In one embodiment, it is 2 ⁇ M or 10 ⁇ M.
  • KGF is a protein known as Keratinocyte Growth Factor, and is sometimes called FGF-7. KGF may be commercially available from, for example, R&D Systems.
  • the concentration of KGF in the culture medium is usually 1 ng/ml to 1 ⁇ g/ml, preferably 5 ng/ml to 500 ng/ml, and more preferably 10 ng/ml to 200 ng/ml (e.g., 100 ng/ml).
  • EGF is a protein known as epidermal growth factor. Commercially available EGF from, for example, R&D systems, can be used.
  • the concentration of EGF in the culture medium is usually 1 ng/ml to 1 ⁇ g/ml, preferably 5 ng/ml to 500 ng/ml, and more preferably 10 ng/ml to 100 ng/ml (e.g., 50 ng/ml).
  • the medium may contain nicotinamide.
  • concentration of nicotinamide in the medium is typically 0.1 mM to 200 mM, preferably 1 mM to 100 mM, more preferably 5 mM to 50 mM (e.g., 10 mM).
  • the medium may contain media additives other than those mentioned above, for example, serum such as fetal bovine serum (FBS), horse serum, one or more serum substitutes such as Knockout Serum Replacement (KSR), N2 supplement (Invitrogen), B27 supplement (Invitrogen), albumin, transferrin, apotransferrin, fatty acids, insulin, collagen precursors, trace elements, 2-mercaptoethanol, 3'-thiolglycerol, and may also contain one or more substances such as lipids, amino acids, L-glutamine, Glutamax (Invitrogen), non-essential amino acids, vitamins, growth factors, small molecules, antibiotics, antioxidants, pyruvate, buffers, inorganic salts, selenate, progesterone, and putrescine.
  • serum substitutes such as Knockout Serum Replacement (KSR), N2 supplement (Invitrogen), B27 supplement (Invitrogen), albumin, transferrin, apotransferrin, fatty acids, insulin, collagen precursors
  • the culture in the method of the present invention may be performed under feeder-free and/or xeno-free conditions for all or part of the period. From the viewpoint of clinical use, it is preferable that the method of the present invention is performed under feeder-free and xeno-free conditions for the entire period.
  • feeder-free means a medium or culture conditions that do not contain other cell types (i.e., feeder cells) that play a supporting role and are used to prepare the culture conditions for the cells to be cultured.
  • xeno-free means a medium or culture conditions that do not contain components derived from organisms other than the organism species of the cells to be cultured.
  • the culture in the method of the present invention may be either suspension culture or adhesion culture as long as the desired cells can grow, but adhesion culture is preferred.
  • suspension culture refers to culture carried out under conditions that maintain the state in which cells or cell aggregates are suspended in the culture medium, that is, culture under conditions that do not allow the formation of strong cell-substratum junctions between the cells or cell aggregates and the culture vessel.
  • adheresion culture refers to culture under conditions that allow the formation of strong cell-substratum junctions between the cells or cell aggregates and the culture equipment, etc.
  • Culture vessels used for adhesion culture include those whose surfaces have been artificially treated to improve adhesion to cells (e.g., coating with basement membrane preparations, extracellular matrices such as fibronectin, laminin or fragments thereof, entactin, collagen, gelatin, synthemax, vitronectin, etc., or polymers such as polylysine and polyornithine, or surface treatments such as positive charge treatment).
  • culture vessels coated with laminin or fragments thereof are preferred.
  • the laminins or fragments thereof used in the present invention include laminin-111 and fragments thereof containing the E8 region, laminin-211 and fragments thereof containing the E8 region (e.g., iMatrix-211), laminin-121 and fragments thereof containing the E8 region, laminin-221 and fragments thereof containing the E8 region, laminin-332 and fragments thereof containing the E8 region, laminin-3A11 and fragments thereof containing the E8 region, laminin-411 and fragments thereof containing the E8 region (e.g., iMatrix-411), laminin-4 21 or a fragment thereof containing its E8 region, laminin-511 or a fragment thereof containing its E8 region (e.g., iMatrix-511, iMatrix-511 silk), laminin-521 or a fragment thereof containing its E8 region, laminin-213 or a fragment thereof containing its E8 region, laminin-423 or
  • the culture vessel used for suspension culture is not particularly limited as long as it is capable of "suspension culture", and a person skilled in the art can appropriately determine the type.
  • Examples of such culture vessels include flasks, flasks for tissue culture, dishes, Petri dishes, dishes for tissue culture, multi-dishes, microplates, microwell plates, micropores, multi-plates, multi-well plates, chamber slides, petri dishes, tubes, trays, culture bags, and roller bottles.
  • a bioreactor is an example of a vessel for suspension culture.
  • These culture vessels are preferably non-adhesive to cells in order to enable suspension culture.
  • Examples of non-adhesive culture vessels include those whose surfaces have not been artificially treated (e.g., coated with an extracellular matrix, etc.) to improve adhesion to cells.
  • the culture temperature is not particularly limited, but is about 30 to 40°C, preferably about 37°C, and culture is performed in an atmosphere of CO2 -containing air, with the CO2 concentration being preferably about 2 to 5%.
  • the method of the present invention allows the production of target cells over a long period of time, so the culture period is not particularly limited, but is usually 2 days or more (e.g., 3 days, 4 days, 5 days, 6 days, 7 days, 8 days, 9 days, 10 days, 20 days or more) and 100 days or less (e.g., 90 days, 80 days, 70 days, 60 days or less).
  • the method of the present invention allows the proliferation of pancreatic endoderm cells for more than 100 days, so the culture period may be longer than 100 days (e.g., 110 days, 120 days or more).
  • the cell culture density is not particularly limited as long as the cells can grow, and is usually 1.0 ⁇ 10 2 to 1.0 ⁇ 10 7 cells/cm 2 , preferably 1.0 ⁇ 10 3 to 1.0 ⁇ 10 6 cells/cm 2 , and more preferably 1.0 ⁇ 10 4 to 1.0 ⁇ 10 5 cells/cm 2 .
  • the pancreatic endoderm cells used in the method of the present invention may be cells isolated from a living body or commercially available cell lines, but are preferably cells derived from pluripotent stem cells.
  • the pancreatic endoderm cells used as starting cells in the method of the present invention are cells derived from a patient with a hereditary pancreatic disease.
  • pancreatic diseases include acute pancreatitis, chronic pancreatitis, type 1 diabetes, type 2 diabetes, pancreatic tumors, and Langerhans islet tumors, and among pancreatic diseases, diseases caused by genetic abnormalities are hereditary pancreatic diseases.
  • hereditary pancreatic diseases include, but are not limited to, hereditary pancreatitis, familial pancreatic tumors, and cystic fibrosis.
  • the pancreatic endoderm cells derived from a patient with a hereditary pancreatic disease may be isolated from the patient, but are preferably pancreatic endoderm cells prepared by initializing somatic cells derived from the patient to establish iPS cells and inducing differentiation from the iPS cells by a method known per se.
  • Pancreatic endoderm cells derived from patients with hereditary pancreatic diseases, and cells induced to differentiate from these cells, such as ⁇ -like cells, can be used as pancreatic disease models that reflect the pathology of the disease, and are therefore suitable for, for example, screening of therapeutic or preventive drugs for pancreatic diseases.
  • pluripotent stem cells refer to stem cells that can differentiate into tissues and cells with various different morphologies and functions in the body, and have the ability to differentiate into cells of any lineage of the three germ layers (endoderm, mesoderm, and ectoderm).
  • pluripotent stem cells used in the present invention include induced pluripotent stem cells (iPS cells), embryonic stem cells (ES cells), embryonic stem cells derived from cloned embryos obtained by nuclear transfer (ntES cells), multipotent germline stem cells (mGS cells), and embryonic germline stem cells (EG cells), but preferably iPS cells (more preferably human iPS cells).
  • the pluripotent stem cells are ES cells or any cells derived from human embryos, the cells may be cells produced by destroying the embryo or cells produced without destroying the embryo, but preferably cells produced without destroying the embryo.
  • ES cells are stem cells that are pluripotent and have the ability to proliferate through self-renewal and are established from the inner cell mass of early mammalian embryos (e.g. blastocysts) such as humans and mice.
  • ES cells were discovered in mice in 1981 (M.J. Evans and M.H. Kaufman (1981), Nature 292:154-156), and subsequently ES cell lines were established in humans, monkeys, and other primates (J.A. Thomson et al. (1998), Science 282:1145-1147; J.A. Thomson et al. (1999), Science 282:1145-1147). (1995), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:7844-7848; J.A.
  • ES cells can be established by extracting the inner cell mass from the blastocyst of a fertilized egg of a target animal and culturing the inner cell mass on fibroblast feeders.
  • ES cells can be established using only a single blastomere from an embryo at the cleavage stage prior to the blastocyst stage (Chung Y. et al. (2008), Cell Stem Cell 2: 113-117) or from developmentally arrested embryos (Zhang X. et al. (2006), Stem Cells 24: 2669-2676.).
  • nt ES cells are ES cells derived from cloned embryos produced by nuclear transfer technology and have almost the same properties as ES cells derived from fertilized eggs (Wakayama T. et al. (2001), Science, 292:740-743; S. Wakayama et al. (2005), Biol. Reprod., 72:932-936; Byrne J. et al. (2007), Nature, 450:497-502).
  • nt ES (nuclear transfer ES) cells are ES cells established from the inner cell mass of blastocysts derived from cloned embryos obtained by replacing the nucleus of an unfertilized egg with that of a somatic cell.
  • nt ES cells To generate nt ES cells, a combination of nuclear transfer technology (Cibelli J.B. et al. (1998), Nature Biotechnol., 16:642-646) and ES cell generation technology (mentioned above) is used (Wakayama Sayaka et al. (2008), Experimental Medicine, Vol. 26, No. 5 (special issue), pp. 47-52).
  • nuclear transfer the nucleus of a somatic cell is injected into an enucleated unfertilized mammalian egg, which can then be initialized by culturing for several hours.
  • ES cell lines used in the present invention for example, various mouse ES cell lines established by inGenious targeting laboratory, RIKEN (Riken) and the like can be used for mouse ES cells, and for human ES cell lines, for example, various human ES cell lines established by University of Wisconsin, NIH, RIKEN, Kyoto University, National Center for Child Health and Development, Cellartis and the like can be used.
  • human ES cell lines include CHB-1 to CHB-12 strains, RUES1 strain, RUES2 strain, HUES1 to HUES28 strains, etc. distributed by ESI Bio, H1 strain, H9 strain, etc. distributed by WiCell Research, and KhES-1 strain, KhES-2 strain, KhES-3 strain, KhES-4 strain, KhES-5 strain, SSES1 strain, SSES2 strain, SSES3 strain, etc. distributed by RIKEN.
  • iPS cells are cells obtained by reprogramming mammalian somatic cells or undifferentiated stem cells by introducing specific factors (nuclear reprogramming factors).
  • iPSCs established by Yamanaka et al. by introducing four factors, Oct3/4, Sox2, Klf4, and c-Myc, into mouse fibroblasts (Takahashi K, Yamanaka S., Cell, (2006) 126: 663-676); human cell-derived iPSCs established by introducing the same four factors into human fibroblasts (Takahashi K, Yamanaka S., et al.
  • Nanog-iPSCs established by selecting using the expression of Nanog as an indicator after introducing the above four factors (Okita, K., Ichisaka, T., and Yamanaka, S. (2007). Nature 448, 313-317.); and iPSCs created by a method that does not include c-Myc (Nakagawa M, Yamanaka S., et al. Nature Biotechnology, (2008) 26, 101-106), iPSCs established by introducing six factors using a virus-free method (Okita K et al. Nat. Methods 2011 May;8(5):409-12, Okita K et al. Stem Cells. 31(3):458-66.), etc.
  • induced pluripotent stem cells established by introducing four factors, OCT3/4, SOX2, NANOG, and LIN28, produced by Thomson et al. (Yu J., Thomson JA. et al., Science (2007) 318: 1917-1920.), induced pluripotent stem cells produced by Daley et al. (Park IH, Daley GQ. et al., Nature (2007) 451: 141-146), induced pluripotent stem cells produced by Sakurada et al. (JP Patent Publication No. 2008-307007), etc. can also be used.
  • iPSC lines As induced pluripotent stem cell lines, various iPSC lines established by NIH, RIKEN, Kyoto University, etc. can be used.
  • human iPSC lines include RIKEN's HiPS-RIKEN-1A line, HiPS-RIKEN-2A line, HiPS-RIKEN-12A line, Nips-B2 line, etc., and Kyoto University's 253G1 line, 253G4 line, 1201C1 line, 1205D1 line, 1210B2 line, 1383D2 line, 1383D6 line, 201B7 line, 409B2 line, 454E2 line, 585A1 line, 606A1 line, 610B1 line, 648A1 line, 1231A3 line, FfI-01s04 line, etc., with the 585A1 line being preferred.
  • mGS cells are pluripotent stem cells derived from the testis and are the source of spermatogenesis. Like ES cells, these cells can be induced to differentiate into cells of various lineages, and have the property that, for example, when transplanted into mouse blastocysts, chimeric mice can be produced (Kanatsu-Shinohara M. et al. (2003) Biol. Reprod., 69:612-616; Shinohara K. et al. (2004), Cell, 119:1001-1012).
  • GDNF glial cell line-derived neurotrophic factor
  • EG cells are established from primordial germ cells during the fetal period and have pluripotency similar to that of ES cells. They can be established by culturing primordial germ cells in the presence of substances such as LIF, bFGF, and stem cell factor (Matsui Y. et al. (1992), Cell, 70:841-847; J.L. Resnick et al. (1992), Nature, 359:550-551).
  • the species from which the pluripotent stem cells are derived is not particularly limited, and may be, for example, cells from rodents such as rats, mice, hamsters, and guinea pigs; lagomorphs such as rabbits; ungulates such as pigs, cows, goats, and sheep; felines such as dogs and cats; and primates such as humans, monkeys, rhesus monkeys, marmosets, orangutans, and chimpanzees.
  • the preferred species is human.
  • Differentiation of pluripotent stem cells into pancreatic endoderm cells can be induced by known methods such as those described in Toyoda T, et al. Stem Cell Reports 2017, Patent Document 1, Non-Patent Document 1, Non-Patent Document 2, and International Publication No. 2017/047797. Specifically, for example, A) inducing differentiation of pluripotent stem cells into definitive endoderm cells; B) inducing differentiation of definitive endoderm cells into primitive intestinal cells; C) inducing differentiation of primitive intestinal cells into posterior foregut cells; D) Differentiation can be induced by a method including a step of inducing differentiation from posterior foregut cells to pancreatic endoderm cells.
  • the basal medium and medium additives used in steps A) to D) may be the same as those used in the production method of the present invention.
  • the culture temperature in steps A) to D) is usually about 30 to 40°C, preferably about 37°C, and the culture is performed in an atmosphere of CO2- containing air, with the CO2 concentration being preferably about 2 to 5%.
  • Steps A) to D) are preferably performed by adhesion culture.
  • the definition and method of adhesion culture are as described above.
  • the differentiation into definitive endoderm cells in step A) can be carried out, for example, by culturing pluripotent stem cells in a medium containing a low dose of activin A.
  • the medium may further contain a ROCK inhibitor and a GSK3 ⁇ inhibitor.
  • the culture period is usually 2 to 8 days.
  • the concentration of activin A in the medium used in step A) is, for example, 5 to 1000 ng/mL, preferably 20 to 500 ng/mL, and more preferably 50 to 150 ng/mL.
  • GSK3 ⁇ inhibitors used in step A) include, for example, CHIR98014, CHIR99021, TDZD-8, SB216763, TWS-119, kenpaullone, 1-azakempaullone, SB216763, SB415286, AR-AO144-18, CT99021, and CT20026.
  • CHIR99021 is preferred.
  • the concentration in the medium is usually 0.5 to 5 ⁇ M, preferably 1 to 4 ⁇ M.
  • the ROCK inhibitor used in step A) may be the same as the ROCK inhibitor used in the production method of the present invention.
  • the concentration in the medium is usually 1 to 20 ⁇ M, preferably 5 to 15 ⁇ M.
  • Insulin can be further added to the medium.
  • the concentration of insulin in the medium is usually 0.01 to 20 ⁇ M, preferably 0.1 to 10 ⁇ M, and more preferably 0.5 to 5 ⁇ M.
  • the concentration of insulin in the medium may be the concentration of insulin contained in the added B-27 supplement, but is not limited to this.
  • the differentiation into primitive intestinal cells in step B) can be carried out, for example, by culturing the definitive endoderm cells obtained in step A) in a medium containing a growth factor.
  • the culture period is usually 2 to 8 days.
  • EGF EGF, KGF, and FGF10 are preferred, EGF and/or KGF are more preferred, and KGF is even more preferred.
  • the concentration of the growth factor in the medium is appropriately set depending on the type of growth factor used, but is usually about 0.1 nM to 1000 ⁇ M, preferably about 0.1 nM to 100 ⁇ M. In the case of EGF, the concentration is about 5 to 2000 ng/ml (i.e., about 0.8 to 320 nM), preferably about 5 to 1000 ng/ml (i.e., about 0.8 to 160 nM), more preferably about 10 to 1000 ng/ml (i.e., about 1.6 to 160 nM).
  • the concentration is about 5 to 2000 ng/ml (i.e., about 0.3 to 116 nM), preferably about 10 to 1000 ng/ml (i.e., about 0.6 to 58 nM), more preferably about 10 to 1000 ng/ml (i.e., about 0.6 to 58 nM).
  • the concentration is usually 5 to 150 ng/mL, preferably 30 to 100 ng/mL, and particularly preferably about 50 ng/mL.
  • the differentiation into posterior foregut cells in step C) can be carried out, for example, by culturing the primitive intestinal cells obtained in step B) in a medium containing a growth factor, a retinoic acid receptor agonist such as a retinoic acid derivative, a Hedgehog signal inhibitor, and a BMP inhibitor.
  • the culture period is usually 1 to 5 days.
  • step C The types and concentrations of growth factors used in step C) are as described in step B).
  • retinoic acid receptor agonist examples include retinoic acid (all-trans-3,7-dimethyl-9-(2,6,6-trimethyl-1-cyclohexen-1-yl)-2,4,6,8-nonatetraenoic acid (Cas No: 302-79-4)), retinoic acid salts, retinoic acid precursors, and retinoic acid derivatives.
  • retinoic acid salts include sodium retinoic acid, potassium retinoic acid, and calcium retinoic acid.
  • retinoic acid precursors include ⁇ -carotene, retinol esters, retinol, and retinal.
  • Retinoic acid derivatives refer to artificially modified retinoic acids that retain the functions of natural retinoic acid, such as 4-[[(5,6,7,8-tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)carbonyl]amino]-benzoic acid (AM580) (Tamura K, et al., Cell Differ. Dev. 32: 17-26 (1990)), 4-[(1E)-2-( Examples include 5,6,7,8-tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propen-1-yl]-benzoic acid (TTNPB) (Strickland S, et al., Cancer Res.
  • TTNPB 5,6,7,8-tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propen-1-yl
  • TTNPB retinol palmitate, retinol, retinal, 3-dehydroretinoic acid, 3-dehydroretinol, and 3-dehydroretinal.
  • TTNPB is preferred.
  • the concentration in the medium is usually 1 to 50 nM, preferably 5 to 15 nM.
  • Hedgehog pathway inhibitors used in step C) include, for example, cyclopamine, jervine, 3-Keto-N-(aminoethyl-aminocaproyl-dihydro-cinnamoyl) (KAAD)-cyclopamine, CUR-61414, SANT-1, SANT-2, SANT-3, SANT-4, IPI-926, IPI-269609, GDC-0449 and NVP-LDE-225.
  • SANT-1 is preferred.
  • concentration in the medium is usually 100 to 500 nM, preferably 50 to 150 nM.
  • BMP inhibitors used in step C include protein inhibitors such as Chordin, Noggin, and Follistatin, Dorsomorphin (i.e., 6-[4-(2-piperidin-1-yl-ethoxy)phenyl]-3-pyridin-4-yl-pyrazolo[1,5-a]pyrimidine) and its derivatives (P. B. Yu et al. (2007), Circulation, 116:II_60; P. B. Yu et al. (2008), Nat. Chem. Biol., 4:33-41; J. Hao et al. (2008), PLoS ONE, 3(8):e2904) and LDN-193189.
  • LDN-193189 is preferred.
  • the concentration in the medium is usually 10 to 1000 nM, preferably 100 to 300 nM.
  • the differentiation into pancreatic endoderm cells in step D) can be carried out, for example, by culturing the posterior foregut cells obtained in step C) in a medium containing a growth factor and a BMP inhibitor.
  • the medium may also contain a non-muscle myosin II inhibitor, a TGF ⁇ inhibitor, nicotinamide, etc.
  • the culture period is usually 2 to 10 days.
  • the posterior foregut cells obtained in step C) may be treated with 0.25% trypsin-EDTA, dispersed by pipetting, and then suspended by centrifuging the 0.25% trypsin-EDTA, as previously reported (Toyoda et al., Stem Cell Research (2015) 14, 185-197).
  • step D The types and concentrations of the growth factors and BMP inhibitors used in step D) are as described in steps B) and C).
  • non-muscle myosin II inhibitors used in step D) include blebbistatin A3, Calphostin C, Goe6976, Goe7874, Fasudil/HA1077, Hypericin, K-252a, KT5823, ML-7, ML-9, piceatannol, Staurosporine, W-5, W-7, W-12, W-13, and Wortmannin.
  • blebbistatin is preferred.
  • the concentration in the medium is 1 ⁇ M to 200 ⁇ M, preferably 10 ⁇ M to 100 ⁇ M.
  • the TGF ⁇ inhibitor used in step D) is a substance that inhibits signal transduction from the binding of TGF ⁇ to the receptor to SMAD, and is not particularly limited as long as it is a substance that inhibits binding to the ALK family receptor, or a substance that inhibits phosphorylation of SMAD by the ALK family.
  • ALK5 inhibitor II (2-[3-[6-Methylpyridine-2-yl]-1H-pyrazole-4-yl]-1,5-naphthyridine; CAS: 446859-33-2), TGF ⁇ RI kinase inhibitor VIII (6-[2-tert-butyl-5-[6-methyl-pyridine-2-yl]-1H-imidazol-4-yl]-quinoxaline), DMH1 and derivatives thereof.
  • ALK5 inhibitor II may be preferred.
  • the concentration in the medium is usually 0.1 ⁇ M to 50 ⁇ M, more preferably 1 ⁇ M to 20 ⁇ M.
  • the concentration of nicotinamide in the medium used in step D) is usually 1 mM to 100 mM, preferably 5 mM to 50 mM.
  • the first day of culture in step D) may be performed in the presence of a ROCK inhibitor, and thereafter culture may be performed in a medium that does not contain a ROCK inhibitor.
  • the ROCK inhibitor may be the same as that used in the production method of the present invention.
  • the concentration in the medium is usually 1 to 20 ⁇ M, preferably 5 to 15 ⁇ M.
  • the method of the present invention may include a step of culturing pancreatic endoderm cells in a medium containing an expansion culture promoting factor.
  • expansion culture promoting factors include TGF ⁇ inhibitors, retinoic acid receptor agonists, growth factors (e.g., NGF, ⁇ cellurin, TGF ⁇ , PDGFAA, LIF, IGF-1, FGF9, FGF10, etc.), bone morphogenetic proteins (BMPs) (e.g., BMP4, BMP7, etc.), etc., among which TGF ⁇ inhibitors and retinoic acid receptor agonists are preferred. More specific examples of expansion culture promoting factors include those shown in Figure 7. Only one type of expansion culture promoting factor may be used, or two or more types may be used.
  • the medium in the production method of the present invention contains a TGF ⁇ inhibitor and/or a retinoic acid receptor agonist, but preferably contains both a TGF ⁇ inhibitor and a retinoic acid receptor agonist.
  • the same TGF ⁇ inhibitor as used in step D) can be used.
  • the TGF ⁇ inhibitor among others, ALK5 inhibitor II, SB431542, A-83-01, LY2109761, and DMH1 are preferred, and ALK5 inhibitor II is more preferred.
  • the concentration in the medium is usually 0.1 ⁇ M to 50 ⁇ M, more preferably 1 ⁇ M to 20 ⁇ M. In one embodiment, it is 10 ⁇ M.
  • the same retinoic acid receptor agonist as that used in step C) can be used.
  • the retinoic acid receptor agonist among others, retinoic acid and TTNPB are preferred, and retinoic acid is more preferred.
  • the concentration in the medium is usually 100 nM to 10 ⁇ M, more preferably 500 nM to 5 ⁇ M. In one embodiment, it is 1 ⁇ M.
  • pancreatic endoderm cells obtained by the method of the present invention are also provided.
  • pancreatic endoderm cells have the ability to differentiate at least into ⁇ -like cells, and express at least PDX1 and NKX6.1.
  • the pancreatic endoderm cells may further express one or more gene markers such as SOX9 and GATA4.
  • expressing various gene markers such as PDX1 or being “positive” for said markers is used to mean at least "production of mRNA encoded by the gene," but preferably also means “production of protein encoded by the mRNA.” Therefore, when production of mRNA encoded by the gene is detected at least by quantitative RT-PCR, it can be said that the gene is expressed. On the other hand, when production of mRNA encoded by the gene is not detected by quantitative RT-PCR (i.e., below the detection limit) or is at background levels, it can be said that the gene is not expressed or is negative.
  • pancreatic endoderm cell expansion culture kit The present invention further provides a pancreatic endoderm cell expansion culture kit (hereinafter, sometimes referred to as the "expansion culture kit of the present invention") that contains a ROCK inhibitor and KGF and/or EGF.
  • the "pancreatic endoderm cell expansion culture kit” can also be read as a “pancreatic endoderm cell proliferation kit” or a “pancreatic endoderm cell production kit.”
  • the expansion culture kit of the present invention preferably contains nicotinamide.
  • the expansion culture kit of the present invention preferably contains a TGF ⁇ inhibitor and/or a retinoic acid receptor agonist.
  • the expansion culture kit of the present invention may also contain at least one of a basal medium, a medium additive, a culture vessel, pancreatic endoderm cells and their precursor cells (e.g., pluripotent stem cells, definitive endoderm cells, primitive gut cells, posterior foregut cells, etc.).
  • a basal medium e.g., a basal medium
  • pancreatic endoderm cells and their precursor cells e.g., pluripotent stem cells, definitive endoderm cells, primitive gut cells, posterior foregut cells, etc.
  • precursor cells e.g., pluripotent stem cells, definitive endoderm cells, primitive gut cells, posterior foregut cells, etc.
  • ROCK inhibitors retinoic acid receptor agonists
  • the pancreatic endoderm cells of the present invention have at least the ability to differentiate into ⁇ -like cells. Therefore, in another embodiment, a method for producing ⁇ -like cells or precursor cells thereof (hereinafter, sometimes referred to as the "method for producing ⁇ -like cells of the present invention"), which includes a step of inducing differentiation of the pancreatic endoderm cells of the present invention into ⁇ -like cells or precursor cells thereof, and a ⁇ -like cell or precursor cell obtained by the method (hereinafter, also referred to as the " ⁇ -like cell of the present invention”) are provided.
  • a method for producing ⁇ -like cells or precursor cells thereof which includes a step of inducing differentiation of the pancreatic endoderm cells of the present invention into ⁇ -like cells or precursor cells thereof, and a ⁇ -like cell or precursor cell obtained by the method.
  • precursor cells of ⁇ -like cells include endocrine cells expressing NGN3, immature ⁇ cells expressing insulin and NKX6.1, etc. From the viewpoint of clinical use, it is preferable that all steps of the method for producing ⁇ -like cells of the present invention are carried out under feeder-free and xeno-free conditions.
  • Step E) a step of inducing differentiation from the pancreatic endoderm cells of the present invention into endocrine precursor cells; and Step F) a step of inducing differentiation from the endocrine precursor cells into ⁇ -like cells.
  • Differentiation can be induced by a method including the steps of:
  • the basal medium and medium additives used in steps E) and F) may be the same as those used in the production method of the present invention.
  • the culture temperature in steps E) and F) is usually about 30 to 40°C, preferably about 37°C, and the culture is performed in an atmosphere of CO2- containing air, with a CO2 concentration of preferably about 2 to 5%.
  • Steps E) and F) are preferably performed by suspension culture.
  • the definition and method of suspension culture are as described in "1. Method for producing pancreatic endoderm cells" above.
  • the differentiation into endocrine precursor cells in step E) can be carried out, for example, by culturing the pancreatic endoderm cells of the present invention in a medium containing a ⁇ -secretase inhibitor and a TGF ⁇ inhibitor.
  • the medium may contain thyroid hormone, growth factors, hedgehog pathway inhibitors, retinoic acid derivatives, BMP inhibitors, etc.
  • the culture period is usually 1 to 5 days.
  • TGF ⁇ inhibitors The types and concentrations of the TGF ⁇ inhibitors, growth factors, hedgehog pathway inhibitors, retinoic acid derivatives, and BMP inhibitors used in step E) are as described in steps C) and D) above.
  • ⁇ -secretase inhibitors used in step E) include RO4929097, DAPT (GSI-IX), Semagacestat (LY450139), and Dibenzazepine (YO-01027).
  • RO4929097 is preferred.
  • the concentration in the medium is usually 0.1 to 10 ⁇ M, preferably 0.5 to 5 ⁇ M.
  • Thyroid hormones used in step E) include, for example, triiodothyronine (T3) and thyroxine (T4). Of these, triiodothyronine is preferred. When triiodothyronine is used, the concentration in the medium is usually 0.1 to 10 ⁇ M, preferably 0.5 to 5 ⁇ M.
  • the differentiation into ⁇ -like cells in step F) can be carried out, for example, by culturing the endocrine precursor cells obtained in step E) in a medium used in step E) from which a ⁇ -secretase inhibitor has been removed.
  • the culture period is usually 4 to 10 days.
  • pancreatic exocrine cells can be produced from the pancreatic endoderm cells of the present invention by a method known per se.
  • the method described in WO 2014/104403 can be mentioned as such a method.
  • the pancreatic endoderm cells of the present invention can be produced by culturing the pancreatic endoderm cells in a culture medium to which a histone deacetylase inhibitor and/or a ligand protein for Notch signaling, and a protein kinase C activator have been added.
  • the contents of WO 2014/104403 are fully incorporated by reference with respect to the specific types and production methods of histone deacetylase inhibitors, ligand proteins for Notch signaling, and protein kinase C activators.
  • the pancreatic endoderm cells of the present invention and the ⁇ -like cells of the present invention may be induced to differentiate into pancreatic islet-like cells by transplanting them into a mammalian living body. Therefore, the cells of the present invention can be suitably used in cell transplantation therapy, and therefore, in another aspect of the present invention, a cell transplantation therapeutic agent (hereinafter, sometimes referred to as the "cell transplantation therapeutic agent of the present invention") containing the cells of the present invention is provided.
  • the present invention also includes a method for treating pancreatic diseases in which an effective amount of the cells of the present invention is administered or transplanted into a mammalian subject (e.g., human, mouse, rat, monkey, cow, horse, pig, dog, etc.).
  • pancreatic diseases to be treated include acute pancreatitis, chronic pancreatitis, type 1 diabetes, type 2 diabetes, pancreatic tumors, and Langerhans islet tumors.
  • the cells or cell transplantation therapeutic agent of the present invention can be transplanted into the living body of a patient who needs it.
  • the transplantation is preferably performed in an area of the living body where the cells can be fixed at a certain position, for example, subcutaneously, intraperitoneally, in the peritoneal epithelium, omentum, adipose tissue, muscle tissue, or under the capsule of each organ such as the pancreas or kidney.
  • Subcutaneous transplantation which is less invasive, is preferable.
  • the cells to be transplanted should be administered in a therapeutically effective amount, which may vary depending on factors such as the age, weight, size of the transplantation site, and severity of the disease of the transplantation subject, and is not particularly limited, and can be, for example, about 10 x 104 cells to 10 x 1011 cells.
  • the cells of the present invention are used in cell transplantation therapy, it is desirable to use cells derived from iPS cells established from somatic cells with the same or substantially the same HLA genotype of the recipient individual, from the viewpoint of preventing rejection reactions.
  • substantially the same means that the HLA genotype matches the transplanted cells to such an extent that immune reactions can be suppressed with immunosuppressants, for example, somatic cells with an HLA type that matches the three loci HLA-A, HLA-B, and HLA-DR, or four loci including HLA-C. If sufficient cells cannot be obtained due to age, constitution, or other reasons, they can be transplanted in a state in which they are embedded in capsules such as polyethylene glycol or silicone, or in porous containers, to avoid rejection reactions.
  • the cells of the present invention are manufactured into parenteral formulations such as injections, suspensions, and drips by mixing with a medicamentically acceptable carrier according to conventional methods.
  • a method for manufacturing a cell transplantation therapy which includes a step of formulating the cells of the present invention.
  • Such a manufacturing method may include a step of preparing the cells of the present invention. It may further include a step of preserving the cells of the present invention.
  • medicamentously acceptable carriers examples include aqueous solutions for injection, such as physiological saline, isotonic solutions containing glucose and other adjuvants (e.g., D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.).
  • aqueous solutions for injection such as physiological saline, isotonic solutions containing glucose and other adjuvants (e.g., D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.).
  • the cell transplantation therapy of the present invention may be compounded with, for example, buffers (e.g., phosphate buffer, sodium acetate buffer), soothing agents (e.g., benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.), stabilizers (e.g., human serum albumin, polyethylene glycol, etc.), preservatives, antioxidants, etc.
  • buffers e.g., phosphate buffer, sodium acetate buffer
  • soothing agents e.g., benzalkon
  • the cell transplantation therapeutic agent of the present invention is provided in a frozen state under conditions normally used for cryopreservation of cells, and can be thawed when in use.
  • it may further contain serum or a substitute thereof, an organic solvent (e.g., DMSO), etc.
  • an organic solvent e.g., DMSO
  • the concentration of serum or a substitute thereof is not particularly limited, but may be about 1 to about 30% (v/v), preferably about 5 to about 20% (v/v).
  • the concentration of the organic solvent is not particularly limited, but may be 0 to about 50% (v/v), preferably about 5 to about 20% (v/v).
  • the cells were replated at 2 ⁇ 10 5 /well in a 24-well plate.
  • the following medium was added to the cultured cells and cultured for one week.
  • the medium for the control group was improved MEM supplemented with 0.5 ⁇ B-27 Supplement, 100 U/ml Penicillin/Streptomycin, 100 ng/ml KGF/FGF7, 50 ng/ml EGF and 10 mM Nicotinamide.
  • the medium for the intervention group was the above medium supplemented with Y-27632, Terreic acid, Daidzein, PD98059, Metformin, BPTES, ABT263, ARV825 or 17-DMAG, and cultured for one week in the same manner.
  • ⁇ -gal staining and NKX6.1 antibody immunostaining were performed, and fluorescent staining images were obtained using BZ-800 (Keyence).
  • the number of NKX6.1 positive cells, the NKX6.1 positive rate, and the ⁇ -gal positive rate were calculated using the BZ-H4CM/macro cell count function of the same microscope. The outline of this procedure is shown in Figures 2-A and 3-A.
  • Expansion culture promotion reagent screening Cells on the 21st day of expansion culture were cultured for 6 days using a medium containing Y-27632 plus various growth factors and small molecule compounds. The rest of the procedure was the same as for the senescence-related reagent screening.
  • Expansion culture of PDX1 + /NKX6.1 + pancreatic endoderm cells 1.
  • Preparation of PDX1 + /NKX6.1 + pancreatic endoderm cells Using the method of Toyoda et al. (Toyoda T, et al. Stem Cell Reports 2017), PDX1 + /NKX6.1 + pancreatic endoderm cells were prepared from iPS cells (585A1 line) or ES cells (KhES-3 line) in a 6-well plate. Briefly, the above undifferentiated cells were seeded at 1 x 10 6 /well in a 6-well plate coated with iMatrix-511 silk.
  • the cells were cultured in S1 medium (RPMI supplemented with 1x B-27 supplement, 100 U/ml penicillin/streptomycin, 100 ng/ml activin A, and CHIR99021 (day 1: 3 ⁇ M, days 2-3: 1 ⁇ M, day 4: 0 ⁇ M)) for 4 days, in S2 medium (improved MEM supplemented with 0.5x B-27 supplement, 100 U/ml penicillin/streptomycin, and 50 ng/ml KGF/FGF7) for 5 days, and in S3 medium (improved MEM supplemented with 0.5x B-27 supplement, 100 U/ml penicillin/streptomycin, 50 ng/ml KGF/FGF7, 0.2 ⁇ M LDN-193189, 0.1 ⁇ M SANT-1, and 10 nM TTNPB) for 2 days.
  • S1 medium RPMI supplemented with 1x B-27 supplement, 100 U/ml penicillin/streptomycin, 100
  • the cells were detached from the 6-well plate using trypsin and replated at 1.5 ⁇ 106 /well on a 6-well plate coated with iMatrix-511 silk in S3 medium. The next day, the medium was changed to S4 medium (improved MEM supplemented with 0.5 ⁇ B-27 Supplement, 100 U/ml Penicillin/Streptomycin, 100 ng/ml KGF/FGF7, 50 ng/ml EGF, 10 mM Nicotinamide, and 50 ⁇ M Y-27632) and cultured for 4 days.
  • S4 medium improved MEM supplemented with 0.5 ⁇ B-27 Supplement, 100 U/ml Penicillin/Streptomycin, 100 ng/ml KGF/FGF7, 50 ng/ml EGF, 10 mM Nicotinamide, and 50 ⁇ M Y-27632
  • the cells were suspended in Improved MEM (containing 10 ⁇ M Y-27632, 0.5 ⁇ B-27 Supplement and 100 U/ml penicillin/streptomycin) and the number of cells was counted.
  • Improved MEM containing 10 ⁇ M Y-27632, 0.5 ⁇ B-27 Supplement and 100 U/ml penicillin/streptomycin
  • the necessary amount of suspension was collected to obtain 1 ⁇ 10 6 cells/well and centrifuged at 400G for 3 minutes (when seeding in a 24-well plate, 2 ⁇ 10 5 cells/well).
  • the cells were resuspended in improved MEM (containing 100 ng/ml KGF, 50 ng/ml EGF, 10 mM Nicotinamide, 50 ⁇ M Y-27632, 0.5 ⁇ B-27 Supplement, and 100 U/ml penicillin/streptomycin) to obtain a suspension of 2 ml/well, and the cells were seeded.
  • improved MEM containing 100 ng/ml KGF, 50 ng/ml EGF, 10 mM Nicotinamide, 50 ⁇ M Y-27632, 0.5 ⁇ B-27 Supplement, and 100 U/ml penicillin/streptomycin
  • the 6-well plate to be seeded with cells was coated with a mixture of 10 ⁇ l of iMatrix-511 silk and 1.5 ml of PBS(-) per well one hour before seeding, and incubated at 37°C, 5% CO 2 for one hour.
  • Non-Patent Document 1 After the expansion culture, the method of Kimura et al. (Non-Patent Document 1) was modified to induce differentiation into ⁇ -like cells . Briefly, pancreatic endoderm cells were detached from a 6-well plate using trypsin and then suspended in S4 medium at 3 ⁇ 10 5 cells/ml. The cells were seeded in a v-bottom 96-well plate at 3 ⁇ 10 4 cells/100 ⁇ l/well.
  • the medium was changed to S5 medium (improved MEM supplemented with 0.5 ⁇ B-27 Supplement, 100 U/ml Penicillin/Streptomycin, 10 ⁇ M ALK5 inhibitor II (CAS:446859-33-2), 1 ⁇ M triiodothyronine (T3), 1 ⁇ M RO4929097, and 20 ng/ml Betacellulin) and cultured for 1 week. Thereafter, the medium was replaced with S6 medium (improved MEM supplemented with 0.5 ⁇ B-27 supplement, 100 U/ml penicillin/streptomycin, 10 ⁇ M ALK5 inhibitor II, and 1 ⁇ M T3) and cultured for another week.
  • S5 medium improved MEM supplemented with 0.5 ⁇ B-27 Supplement, 100 U/ml Penicillin/Streptomycin, 10 ⁇ M ALK5 inhibitor II (CAS:446859-33-2), 1 ⁇ M triiodothyronine (T3), 1 ⁇ M RO4929097, and 20 ng/m
  • Evaluation method 1 Immunostaining The expanded cultured cells were washed twice with PBS(-) and fixed with 4% PFA for 20 minutes at 4°C. Blocking was performed for 30 minutes at room temperature using blocking solution (PBS(-) containing 5% donkey serum and 0.4% Triton X-100). Incubation was performed overnight at 4°C using primary antibody solution diluted with blocking solution. After washing the primary antibody solution, incubation was performed for one hour at room temperature using fluorescent secondary antibody solution diluted with blocking solution. Immunofluorescent staining images were obtained using BZ-710 or BZ-800 (Keyence).
  • the expanded cells were dissociated with 0.25% trypsin-EDTA and fixed using the Cytofix/Cytoperm Kit (BD Biosciences) according to the protocol. Blocking was performed with permeabilization solution containing 2% donkey serum. The cells were incubated overnight at 4°C using a primary antibody solution diluted in blocking solution. After washing the primary antibody solution, the cells were incubated for one hour at room temperature using a fluorescent secondary antibody solution diluted in blocking solution. The stained cells were analyzed using a FACSAriaII (BD Biosciences).
  • Example 1 Search for a reagent capable of proliferating pancreatic endoderm cells Among senescence-related reagents, a search was conducted for a reagent capable of proliferating pancreatic endoderm cells derived from human iPS cells.
  • senescence-related reagents Y-27632, Terreic Acid, Daidzein, PD98059, Metformin, BPTES, BPTES, ABT263, ARV825, and 17-DMAG were selected, and S4d4 cells containing NKX6.1 + pancreatic endoderm cells were cultured in a medium containing each senescence-related reagent, and (1) the number of NKX6.1 positive cells, or (2) the proportion of NKX6.1 positive cells and the proportion of ⁇ gal positive cells after culture were measured. The results are shown in Figures 2-B to 2-D.
  • Figure 2-B shows that while other senescence-related reagents do not significantly increase pancreatic endoderm cells, Y-27632 significantly increases the target cells, and that 50 ⁇ M is the most suitable concentration of Y-27632 for proliferation.
  • Figure 2-C shows that, as in Figure 2-B, Y-27632 50 ⁇ M was the most effective when the percentage of pancreatic endoderm cells was used as the outcome.
  • Figure 2-D also shows that the use of Y-27632 was effective in reducing the percentage of ⁇ -gal positive cells (senescent cells).
  • Example 2 Verification of the proliferation effect of ROCK inhibitors other than Y-27632 on pancreatic endoderm cells Since the proliferation effect of ROCK inhibitor Y-27632 on pancreatic endoderm cells was confirmed in Example 1, it was verified whether other ROCK inhibitors could also be used to proliferate human iPS cell-derived PDX1 + /NKX6.1 + pancreatic endoderm cells. The experiment was performed in the same manner as in Example 1. The results are shown in Figures 3-B and 3-C.
  • ROCK inhibitors other than Y-27632 also had the same proliferation effect on pancreatic endoderm cells as Y-27632.
  • ROCK inhibitors exert a broad effect on pancreatic endoderm cell proliferation, regardless of the type of cell.
  • Example 3 Verification of expansion culture of pancreatic endoderm cells using Y-27632 (50 ⁇ M) It was verified whether or not pancreatic endoderm cells derived from human iPS cells can be expanded by using Y-27632. The results are shown in Figures 4-B to 4-H. From Figure 4-B, it was confirmed that the total number of cells increased by 1 x 10 5 times or more in 60 days by performing expansion culture using Y-27632 (50 ⁇ M). From Figure 4-C, it was confirmed that the number of PDX1 + /NKX6.1 + pancreatic endoderm cells increased by 1 x 10 5 times or more in 60 days by performing expansion culture using Y-27632 (50 ⁇ M).
  • pancreatic endoderm cells can be expanded very efficiently for at least 60 days using Y-27632 (50 ⁇ M), and that the pancreatic endoderm cells maintain their ability to differentiate into ⁇ -like cells after expansion.
  • Example 4 Verification of expansion culture of pancreatic endoderm cells by Y-27632 when the concentration was changed
  • Example 3 it was demonstrated that expansion culture of pancreatic endoderm cells was possible by using 50 ⁇ M Y-27632, so the effect on expansion culture was verified when the concentration was reduced to 10 ⁇ M.
  • the results are shown in Figures 5-A to 5-C.
  • Figure 5-A when Y-27632 (10 ⁇ M) was used, it was confirmed that the number of PDX1 + /NKX6.1 + pancreatic endoderm cells and the total number of cells increased to about 1 ⁇ 10 4 times in 40 days, as in the case of using Y-27632 (50 ⁇ M).
  • Example 5 Verification of the mechanism by which Y-27632 enables the expansion of pancreatic endoderm cells The mechanism by which Y-27632 enables the expansion of pancreatic endoderm cells was verified.
  • the group not administered Y-27632 showed an increase in ⁇ -SMA positive cells compared to the group administered Y-27632 at a concentration of 50 ⁇ M ( Figure 6).
  • administration of Y-27632 to cells suppressed fibrosis or epithelial-mesenchymal transition.
  • Example 6 Search for a reagent that promotes the proliferation of pancreatic endoderm cells.
  • the expansion culture medium using Y-27632 the NKX6.1 positive rate and the induction efficiency into ⁇ -like cells tended to gradually decrease with repeated induction. Therefore, we performed screening using proteins such as growth factors and low molecular weight compounds to try to improve the expansion culture method.
  • Pancreatic endoderm cells were passaged three times using medium containing Y-27632 (50 ⁇ M), and then seeded at 2.0 ⁇ 105 cells/well on a 24-well plate coated with iMatrix. Each screening reagent was added to the medium containing Y-27632 (50 ⁇ M) and cultured. After 6 days, the percentage of NKX6.1-positive cells was examined by cell immunostaining. As a result, ALK5 inhibitors (ALK5i) and retinoic acid receptor agonists were identified as candidate factors for improving expansion culture (Figure 7).
  • Example 7 Verification of ALK5 inhibitors (ALK5i) and retinoic acid receptor agonists We attempted to determine whether long-term expansion culture was possible while maintaining the NKX6.1 positive rate by adding the two candidate factors to the expansion culture method using Y-27632 (50 ⁇ M).
  • Pancreatic endoderm cells were passaged once a week and the number of cells was counted. At the same time, immunostaining was performed each time to examine the NKX6.1 positive rate, and the cumulative NKX6.1 increase rate was calculated from these values. This calculation method was performed under two conditions: the "DMSO group (Y-27632 + DMSO)" and the “ALK5i + RA group (Y-27632 + ALK5i + RA)". As a result, the addition of ALK5i and RA improved proliferation efficiency while maintaining the NKX6.1 positive rate compared to the Y-27632 alone group ( Figure 8).
  • Example 8 Verification of ⁇ -like cell induction efficiency In order to confirm the function of the expanded pancreatic endoderm cells, the ⁇ -like cell induction efficiency after expansion was examined.
  • the expansion culture method using "Y-27632+DMSO” or "Y-27632+ALK5i+RA” was used to induce differentiation into ⁇ -like cells from pancreatic endoderm cells that had been passaged five times.
  • the induction efficiency into ⁇ -like cells was then compared with cell masses induced into ⁇ -like cells from pancreatic endoderm cells that had not been passaged.
  • the improved expansion culture method (“Y-27632+ALK5i+RA”) showed a higher induction efficiency into ⁇ -like cells than the unimproved expansion culture method (“Y-27632+DMSO”), and the induction efficiency was equivalent to that of pancreatic endoderm cells before expansion culture was performed (Figure 9).
  • pancreatic endoderm cells produced by the present invention or pancreatic endocrine cells and exocrine pancreatic cells, including ⁇ -like cells derived from those cells can be used in the development of cell therapy for pancreatic diseases (particularly type 1 and type 2 diabetes), in drug discovery screening systems for pancreatic diseases, and in the creation of pancreatic disease models using iPS cells derived from patients with hereditary pancreatic diseases.

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Abstract

本発明は、膵内胚葉細胞を、ROCK阻害剤と、KGFおよび／またはEGFとを含む培地で培養する工程を含む、膵内胚葉細胞の製造方法、ならびに該方法により製造された膵内胚葉細胞を提供する。

Description

膵内胚葉細胞の製造方法
　本発明は、膵内胚葉細胞の製造方法に関する。より詳細には、膵内胚葉細胞をROCK阻害剤存在下で培養する工程を含む、膵内胚葉細胞の製造方法、該方法により製造された膵内胚葉細胞などに関する。
　膵臓は、膵リパーゼ、トリプシン、エラスターゼ、膵アミラーゼなどの消化酵素を分泌する外分泌腺および、グルカゴン、インスリン、ソマトスタチン、膵ポリペプチド（PP）などの膵ホルモンを分泌する内分泌腺として機能している。近年、胃分泌ホルモンであるグレリンが膵臓の内分泌細胞からも分泌されることが報告されている。この膵ホルモンは、膵臓の中の主にα細胞、β細胞、δ細胞およびPP細胞の4種の細胞からなる膵島と呼ばれる細胞塊により産生されている。糖尿病は、インスリンが不足したりその働きが失われたりすることによって発症する疾患であり、一度発症すると根治させることが難しい疾患である。糖尿病は、1型糖尿病（インスリン依存性糖尿病）と2型糖尿病（インスリン非依存性糖尿病）の大きく２つのタイプに分類することができる。
　2型糖尿病は、インスリン分泌能の低下に加え、インスリンに対する抵抗性を獲得することで発症する慢性疾患であり、食べ過ぎや運動不足によっておこる肥満やストレス等、生活習慣が発症メカニズムと考えられている糖尿病である。一方、1型糖尿病は、自己免疫疾患やウイルス感染等によってβ細胞（インスリン産生細胞）が破壊され、インスリンが体内に分泌されないことによっておこる疾患である。インスリンの投与による対症療法が主に行われている。また、1型糖尿病の治療法として、体外で患者由来の細胞からインスリン産生細胞自体を誘導し、誘導したインスリン産生細胞を患者の生体内に移植することが検討されている。インスリン産生細胞は例えば、患者の膵管上皮由来細胞を体外に取り出して分化させる等により得ることができる。
　しかしながら、患者から細胞を取り出す際には侵襲が伴い、また得られる細胞の数も十分とはいえない。そこで、人工多能性幹細胞（iPS細胞）などの多能性幹細胞から、糖尿病に対する細胞療法に必要なβ様細胞を分化誘導する方法の開発が進められており、実際にβ様細胞を分化誘導する方法も報告されている（例えば、特許文献１、非特許文献１）。しかしながら、これらの方法では、多能性幹細胞からβ様細胞を作製するには、図１に示されるように、6～7段階のステップ（約4～5週間）が必要とされている（段階的分化誘導法）。
　また、ヒト多能性幹細胞由来の後方前腸細胞の拡大培養法も開発されている（例えば、非特許文献１、非特許文献２）。非特許文献１および非特許文献２では、図１の後方前腸細胞に相当する、PDX1+/SOX9+/NKX6.1-の膵前駆細胞（pancreatic progenitor cellまたはpancreatic progenitor）を拡大培養する方法が報告されている。しかしながら、これらの方法では、PDX1+/SOX9+/NKX6.1-の膵前駆細胞の増殖効率は高いとはいえず、また膵前駆細胞をNKX6.1陽性膵内胚葉細胞へと分化誘導する際に、誘導効率が落ちることが知られている。
国際公開第2020/059892号
Kimura et al., Cell Chemical Biology 2020 Dec 17;27(12):1561-1572.e7 Konagaya et al., Scientific Reports. 2019 Jan 24;9(1):640
　従って、本発明では、後方前腸細胞よりもさらに分化が進んだステージの細胞である膵内胚葉細胞を、分化能を維持したまま増殖できる（すなわち、拡大培養できる）方法を開発することを課題とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するために、老化関連試薬に着目し、老化関連試薬の中から、膵内胚葉細胞を拡大培養できる可能性のある試薬のスクリーニングを行った。その結果、ROCK阻害剤であるY-27632が、膵内胚葉細胞数を有意に増加させること、さらには、Y-27632以外のROCK阻害剤においても、同様の膵内胚葉細胞増殖効果を発揮することを見出した。かかる知見に基づきさらに検証を進めたところ、Y-27632を、培地中の濃度が10 μMまたは50 μMとなるように添加することで、膵内胚葉細胞を拡大培養できることが実証された。
　細胞の培養において、アポトーシスを抑制する観点から、専ら再播種の１日目のみに、低濃度（例えば、10 μM）のY-27632を用いることはある。しかしながら、Y-27632などのROCK阻害剤の長期間の使用は、細胞の分化状態などが変化することが知られており（Maldonado M. et al., Stem Cell Res 17; 222-227; 2016）、ROCK阻害剤の１日を超えての使用は避けられていた。そのため、10 μM以上の高濃度のY-27632を使用し、さらに培養中長期間に亘ってY-27632を使用しても、分化能を維持したまま膵内胚葉細胞を長期間に亘って、効率よく拡大培養できる（一態様において、60日以上の培養で１×105倍以上に増殖できる）ことは非常に驚くべきことであった。
　本発明者らは、さらにROCK阻害剤による膵内胚葉細胞の増殖効果についてのメカニズムを検証した。かかる効果の主なメカニズムは、抗アポトーシスによるものではなく、細胞の老化抑制と、それに伴う線維化または上皮間葉転換の抑制によるものであることが示唆された。これらの知見に基づいてさらに研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下の通りのものである。
［１－１］
　膵内胚葉細胞を、ROCK阻害剤と、KGFおよび／またはEGFとを含む培地で培養する工程を含む、膵内胚葉細胞の製造方法。
［１－２］
　前記培地がKGFおよびEGFの両方を含む、［１－１］に記載の方法。
［１－３］
　前記培地がニコチンアミドを含む、［１－１］または［１－２］に記載の方法。
［２］
　培養を２日間以上行う、［１－１］～［１－３］のいずれか１つに記載の方法。
［３］
　前記ROCK阻害剤がY-27632、GSK269962、GSK429286A、ファスジル塩酸塩、H1152およびチアゾビビンからなる群から選択される、［１－１］～［２］のいずれか１つに記載の方法。
［４］
　前記ROCK阻害剤がY-27632である、［１－１］～［２］のいずれか１つに記載の方法。
［５］
　培地がTGFβ阻害剤および／またはレチノイン酸受容体アゴニストを含む、［１－１］～［４］のいずれか１つに記載の方法。
［６］
　前記TGFβ阻害剤が2-[3-[6-メチルピリジン-2-イル]-1H-ピラゾール-4-イル]-1,5-ナフチリジンである、［５］に記載の方法。
［７］
　前記レチノイン酸受容体アゴニストがレチノイン酸である、［５］または［６］に記載の方法。
［８］
　前記膵内胚葉細胞が多能性幹細胞に由来する、［１－１］～［７］のいずれか１つに記載の方法。
［９］
　前記膵内胚葉細胞が遺伝性膵疾患の患者由来の細胞である、［１－１］～［８］のいずれか１つに記載の方法。
［１０－１］
　前記培養がフィーダーフリー条件下での培養である、［１－１］～［９］のいずれか１つに記載の方法。
［１０－２］
　前記培養がゼノフリー条件下での培養である、［１－１］～［１０－１］のいずれか１つに記載の方法。
［１１］
　［１－１］～［１０－２］のいずれか１つに記載の方法により製造された膵内胚葉細胞。
［１２－１］
　ROCK阻害剤と、KGFおよび／またはEGFとを含む、膵内胚葉細胞拡大培養用キット。
［１２－２］
　KGFおよびEGFの両方を含む、［１２－１］に記載のキット。
［１２－３］
　ニコチンアミドを含む、［１２－１］または［１２－２］に記載のキット。
［１３－１］
　TGFβ阻害剤および／またはレチノイン酸受容体アゴニストを含む、［１２－１］～［１２－３］のいずれか１つに記載のキット。
［１３－２］
　TGFβ阻害剤およびレチノイン酸受容体アゴニストの両方を含む、［１３－１］に記載のキット。
［１３－３］
　前記TGFβ阻害剤が2-[3-[6-メチルピリジン-2-イル]-1H-ピラゾール-4-イル]-1,5-ナフチリジンである、［１３－１］または［１３－２］に記載のキット。
［１３－４］
　前記レチノイン酸受容体アゴニストがレチノイン酸である、［１３－１］～［１３－３］のいずれか１つに記載のキット。
［１４－１］
　［１１］に記載の膵内胚葉細胞をβ様細胞またはその前駆細胞へと分化誘導させる工程を含む、β様細胞またはその前駆細胞の製造方法。
［１４－２］
　［１４－１］に記載の方法により製造された細胞。
［１５］
　［１１］または［１４－２］に記載の細胞を含む、細胞移植療法剤。
［１６］
　糖尿病治療のための、［１５］に記載の剤。
［１７－１］
　哺乳動物に対して、［１１］もしくは［１４－２］に記載の細胞または［１５］もしくは［１６］に記載の剤の有効量を投与することを特徴とする、該哺乳動物における膵疾患の治療方法。
［１７－２］
　膵疾患が糖尿病である、［１７－１］に記載の方法。
［１８－１］
　膵疾患の治療における使用のための、［１１］もしくは［１４－２］に記載の細胞または［１５］もしくは［１６］に記載の剤。
［１８－２］
　膵疾患が糖尿病である、［１８－１］に記載の細胞または剤。
［１９－１］
　膵疾患の治療薬の製造のための、［１１］もしくは［１４－２］に記載の細胞または［１５］もしくは［１６］に記載の剤の使用。
［１９－２］
　膵疾患が糖尿病である、［１９－１］に記載の細胞または剤。
　本発明により、膵内胚葉細胞を高い効率で増殖できる。このようにして増殖させた細胞や、該細胞から分化誘導させて得られた膵β細胞をはじめとする膵内分泌細胞や膵外分泌細胞は、臨床用途としても重要である。また、これらの細胞は、研究試料として入手困難なヒト膵島や外分泌細胞および組織に代わり、膵疾患に対する再生医療および創薬スクリーニングなどに有用である。
β様細胞の段階的分化誘導法の概要図。 老化関連試薬スクリーニングの模式図。NKX6.1陽性膵内胚葉細胞を24well plateに播種して、従来のステージ4培地に各種老化関連試薬を加えてスクリーニングを行った。その１週間後に蛍光顕微鏡にて各細胞数をカウントした。 各種老化関連試薬と共に培養した場合のNKX6.1陽性細胞数。反復実験数 = 3、細胞数 = 3回の結果の平均値、ダネット検定を使用。エラーバーは標準誤差を示す。 各種老化関連試薬と共に培養した場合のNKX6.1陽性細胞割合。反復実験数 = 3、割合(Fraction) = 3回の結果の平均割合、ダネット検定を使用。エラーバーは標準誤差を示す。 各種老化関連試薬によるβ gal陽性細胞割合。反復実験数 = 3、割合(Fraction) = 3回の結果の平均割合、ダネット検定を使用。エラーバーは標準誤差を示す。 その他のROCK阻害剤についての検討実験の模式図。NKX6.1陽性膵内胚葉細胞を24well plateに播種して、従来のステージ4培地に各種ROCK阻害剤を加えて実験を行った。その１週間後に蛍光顕微鏡にて各細胞数をカウントした。 各ROCK阻害剤と共に培養した場合の総細胞数。反復実験数 = 3、一元配置分散分析（One-way ANOVA）を使用。エラーバーは標準誤差を示す。 各ROCK阻害剤と共に培養した場合のNKX6.1陽性細胞数とNKX6.1陽性細胞割合。反復実験数 = 3、一元配置分散分析を使用。エラーバーは標準誤差を示す。 Y-27632 (50 μM)を用いた、膵内胚葉細胞の拡大培養の模式図。NKX6.1陽性膵内胚葉細胞をplateに播種して、Y-27632(50 μM)を含む培地にて１週間培養する。１週間後再播種して継代および拡大培養を繰り返す。 Y-27632 (50 μM)を用いた拡大培養による総細胞数の推移。n=3。 Y-27632 (50 μM)を用いた拡大培養による膵内胚葉細胞数の推移。n=3。 Y-27632 (50 μM)を用いた拡大培養後の膵内胚葉細胞の免疫染色像。 Y-27632 (50 μM)を用いた拡大培養後の細胞におけるNKX6.1発現とKi67発現についてのフローサイトメトリー散布図。 Y-27632 (50 μM)を用いた拡大培養によるKi67陽性割合の推移。反復実験数 = 3、エラーバーは標準偏差を示す。 拡大培養を２回行った後の膵内胚葉細胞から分化誘導した膵島様細胞塊の免疫染色像。 ES細胞(KhES-3株)由来の膵内胚葉細胞における拡大培養による細胞数の推移。 Y-27632 (0、10または50μM)を用いた拡大培養によるPDX1+/NKX6.1+膵内胚葉細胞数および総細胞数の推移。 Y-27632 (10または50 μM)を用いて、KhES-3株由来の膵内胚葉細胞を５回（５週間）継代して培養した後の膵内胚葉細胞の免疫染色像。 図５－ＢのNKX6.1免疫染色における全細胞の核形態定量評価結果(n=616細胞 (10 μM Y-27632); n=519細胞 (50 μM Y-27632); biological replicate=1)。Mann-Whitney U testを使用して両群間のeccentricity(真円度)を比較した。 膵内胚葉細胞継代3回目において、Y-27632 (50 μM)投与有りと無しにおける、膵内胚葉細胞のα-SMAに対する免疫染色像。 各スクリーニング試薬と共に培養した場合のNKX6.1陽性細胞割合。 DMSO群（Y-27632+DMSO）またはALK5阻害剤（ALK5i）＋レチノイン酸（RA）群(Y-27632+ALK5i+RA)を用いた拡大培養による累計NKX6.1+膵内胚葉細胞数の推移。反復実験数 = 4。 DMSO群（Y-27632+DMSO）またはALK5i＋RA群（Y-27632+ALK5i+RA）を用いて拡大培養を５回行った後の膵内胚葉細胞から分化誘導したβ様細胞数の割合。継代を行っていない（P0）膵内胚葉細胞からβ様細胞へ誘導したコントロール群と比較した。反復実験数 = 3、エラーバーは標準偏差を示す。
１．膵内胚葉細胞の製法
　本発明は、ROCK阻害剤を含む培地を用いて、膵内胚葉細胞を製造する方法を提供する。具体的には、本発明は、膵内胚葉細胞を、ROCK阻害剤と、KGFおよび／またはEGFとを含む培地で培養する工程を含む、膵内胚葉細胞を製造する方法（以下、「本発明の製法」と称することがある。）を提供する。本発明の製法には、製造された膵内胚葉細胞を単離する工程が含まれていてもよい。
　本発明の製法により、膵内胚葉細胞が自己増殖し、同種の細胞が製造されることとなる。すなわち、本発明の製法は、膵内胚葉細胞を、ROCK阻害剤と、KGFおよび／またはEGFとを含む培地で培養する工程を含む、膵内胚葉細胞の増殖方法または膵内胚葉細胞の拡大培養方法と読み替えることもできる。
　本明細書において、「膵内胚葉細胞」とは、少なくともβ様細胞への分化能を有し、少なくともPDX1およびNKX6.1を発現する細胞を意味する。膵内胚葉細胞は、さらに、SOX9、GATA4などの１種以上の遺伝子マーカーを発現する細胞であってもよい。また、本明細書において、「β様細胞」とは、内分泌前駆細胞または未熟なβ細胞からインビトロで分化誘導された、生体内の膵β細胞と同一または近似した性質を有する細胞であり、インスリンを発現および／または分泌する細胞を意味する。
　本明細書において、特に断りのない限り、「細胞」には、「細胞集団」が含まれるものとする。細胞集団は、１種類の細胞から構成されていてもよく、２種類以上の細胞から構成されていてもよい。
　本明細書において、「拡大培養」とは、所望の細胞集団を増殖させ、細胞数を増加させることを目的として培養することを意味する。細胞数の増加は、細胞の増殖による増数が死滅による減数を超えることによって達成されるものであればよく、細胞集団の全ての細胞が増殖することを要さない。細胞数の増加は、拡大培養の開始前に比して1.1倍、1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、100倍、300倍、500倍、1000倍、3000倍、5000倍、10000倍、100000倍、1000000倍以上であり得る。
　本発明の製法で用いる基礎培地としては、特に限定されないが、StemFit（登録商標） AK02培地（味の素株式会社）、StemFit（登録商標） AK03培地（味の素株式会社）、StemFit（登録商標） Basic03培地、CTS（登録商標） KnockOut SR XenoFree Medium(Gibco)、mTeSR1培地、TeSR1培地（Stem Cell Technologies）、Iscove’s modified Dulbecco’s medium（GEヘルスケア社）、Improved MEM（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）などが挙げられる。中でも、Improved MEM培地が好ましい。これらの培地は、フィーダーフリーかつゼノフリー条件下での培養に用いることもできる。また、他の基礎培地としては、RPMI-1640培地、EagleMEM(EMEM)、ダルベッコ改変MEM、Glasgow’s MEM（GMEM）、α-MEM、199培地、IMDM、DMEM、Hybridoma Serum free培地、KnockOutTM DMEM、Advanced TM培地（例：Advanced MEM、Advanced RPMI、Advanced DMEM/F-12）、Ham’s Medium F-12、Ham’s Medium F-10、Ham’s Medium F12K、DMEM/F-12、ATCC-CRCM30、DM-160、DM-201、BME、Fischer、McCoy’s 5A、Leibovitz’s L-15、RITC80-7、MCDB105、MCDB107、MCDB131、MCDB153、MCDB201、NCTC109、NCTC135、Waymouth’s Medium（例：Waymouth’s MB752/1）、CMRL培地（例：CMRL-1066）、Williams’ medium E、Brinster’s BMOC-3 Medium、E8 Medium、StemPro 34、MesenPRO RS（以上サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、ReproFF2、Primate ES Cell Medium、ReproStem（以上リプロセル株式会社）、ProculAD（ロート製薬株式会社）、MSCBM-CD、MSCGM-CD（以上Lonza社）、EX-CELL302培地（SAFC社）またはEX-CELL-CD-CHO（SAFC社）、ReproMedTM iPSC Medium（リプロセル株式会社）およびこれらの混合物などが挙げられるが、これらに限定されない。
　下述の実施例で示されるとおり、様々な種類のROCK阻害剤において、膵内胚葉細胞の増殖効果が認められた。すなわち、膵内胚葉細胞の増殖には、Rho-キナーゼ(ROCK)の機能を抑制することが重要であり、該機能を抑制できる限り、いかなるROCK阻害剤も本発明の製法に適用できる。ROCK阻害剤としては、例えば、Y-27632（例、Ishizaki et al., Mol. Pharmacol. 57, 976-983 (2000)；Narumiya et al., Methods Enzymol. 325,273-284 (2000)参照）、ファスジル/HA1077（例、Uenata et al., Nature 389: 990-994 (1997)参照）、SR3677（例、Feng Y et al., J Med Chem. 51: 6642-6645(2008)参照）、GSK269962（例、Stavenger RA et al., J Med Chem. 50: 2-5 (2007)またはWO2005/037197参照）、GSK429286A、H1152（例、Sasaki et al., Pharmacol. Ther. 93: 225-232 (2002)参照）、Wf-536（例、Nakajima et al., Cancer Chemother Pharmacol. 52(4): 319-324 (2003)参照）、チアゾビビンおよびそれらの塩または誘導体などが挙げられる。他のROCK阻害剤としては、ROCKに対するアンチセンス核酸、RNA干渉誘導性核酸（例、siRNA）、ドミナントネガティブ変異体、およびそれらの発現ベクターなども挙げられる。また、ROCK阻害剤としては他の公知の低分子化合物およびその塩または誘導体も使用できる（例えば、米国特許出願公開第2005/0209261号、同第2005/0192304号、同第2004/0014755号、同第2004/0002508号、同第2004/0002507号、同第2003/0125344号、同第2003/0087919号、及び国際公開第2003/062227号、同第2003/059913号、同第2003/062225号、同第2002/076976号、同第2004/039796号参照）。中でも、Y-27632、GSK269962、GSK429286A、ファスジル塩酸塩、H1152およびチアゾビビンが好ましく、特にY-27632が好ましい。本発明の製法において、ROCK阻害剤は、１種のみ用いてもよく、２種以上用いてもよい。
　化合物の塩としては、アルカリ金属塩（ナトリウム塩、カリウム塩等）、アルカリ土類金属塩（カルシウム塩、マグネシウム塩等）、アルミニウム塩、アンモニウム塩等の無機塩基塩、並びにトリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ’－ジベンジルエチレンジアミン等の有機塩基塩などの塩基付加塩、あるいは塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の無機酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩、酢酸塩、ギ酸塩、プロピオン酸塩、安息香酸塩、トリフルオロ酢酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩等の有機酸塩などの酸付加塩が挙げられる。
　ROCK阻害剤としてY-27632またはその塩（例：Y-27632二塩酸塩等）を用いる場合の培地中の濃度は、通常1 μM以上(例:5 μM、10 μM、15 μM、20 μM、25 μM、30 μM、35 μM、40 μM、45 μM、50 μMまたはそれ以上)であり、500 μM以下（400 μM、300 μM、200 μM、150 μM、100 μMまたはそれ以下）である。また、Y-27632を用いる場合の培地中の濃度は、0.1 μM～1000 μM、1 μM～300μM、10 μM～100 μMであってもよい。一態様において、50 μMである。
　ROCK阻害剤としてGSK269962またはその塩（例：GSK269962塩酸塩等）を用いる場合の培地中の濃度は、通常0.02 μM～100 μM、好ましくは、0.2 μM～50 μM、さらに好ましくは、2 μM～10 μMである。一態様において、2 μMである。
　ROCK阻害剤としてGSK429286Aまたはその塩を用いる場合の培地中の濃度は、通常0.02 μM～100 μM、好ましくは、0.2 μM～50 μM、さらに好ましくは、2 μM～10 μMである。一態様において、2 μMである。
　ROCK阻害剤としてファスジルまたはその塩（例：ファスジル塩酸塩等）を用いる場合の培地中の濃度は、通常0.1 μM～500μM、好ましくは、1 μM～200 μMより好ましくは、10 μM～50 μMである。一態様において、50 μMである。
　ROCK阻害剤としてH1152またはその塩（例：H1152二塩酸塩等）を用いる場合の培地中の濃度は、通常0.02 μM～100 μM、好ましくは、0.2 μM～50 μM、さらに好ましくは、2 μM～10 μMである。一態様において、2 μMである。
　ROCK阻害剤としてチアゾビビンまたはその塩を用いる場合の培地中の濃度は、通常0.02 μM～100 μM、好ましくは、0.2 μM～50 μM、さらに好ましくは、2 μM～10 μMである。一態様において、2 μMまたは10 μMである。
　KGFは、Keratinocyte Growth Factorと呼ばれるタンパク質であり、FGF-7と呼ばれることもある。KGFは、例えば、R&D systems社等の市販されているものを使用することができる。KGFの培地中の濃度は、通常１ ng/ml～1 μg/ml、好ましくは、5 ng/ml～500 ng/ml、より好ましくは、10 ng/ml～200 ng/ml（例えば、100 ng/ml）である。
　EGFは、上皮成長因子またはEpidermal Growth Factorと呼ばれるタンパク質である。EGFは、例えば、R&D systems社等の市販されているものを使用することができる。EGFの培地中の濃度は、通常1 ng/ml～1 μg/ml、好ましくは、5 ng/ml～500 ng/ml、より好ましくは、10 ng/ml～100 ng/ml（例えば、50 ng/ml）である。
　培地には、ニコチンアミドが含まれていてもよい。ニコチンアミドの培地中の濃度は、通常0.1 mM～200 mM、好ましくは、1 mM～100 mM、より好ましくは、5 mM～50 mM（例えば、10 mM）である。
　必要に応じて、培地は、上記以外の培地添加物、例えば、ウシ胎児血清（FBS）、ウマ血清などの血清、Knockout Serum Replacement(KSR)、N2サプリメント（Invitrogen）、B27サプリメント（Invitrogen）、アルブミン、トランスフェリン、アポトランスフェリン、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、2-メルカプトエタノール、3'-チオールグリセロールなどの1つ以上の血清代替物を含んでもよく、また、脂質、アミノ酸、L-グルタミン、Glutamax（Invitrogen）、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子（成長因子）、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、セレン酸、プロゲステロンおよびプトレシンなどの1つ以上の物質も含有してもよい。
　本発明の製法における培養は、全部または一部の期間、フィーダーフリー条件下および／またはゼノフリー条件下での培養であってもよい。臨床での使用の観点からは、本発明の製法は、全期間がフィーダーフリーかつゼノフリー条件下で行われることが好ましい。本明細書において、「フィーダーフリー」とは、培養対象の細胞の培養条件を整えるために用いる、補助役を果たす他の細胞種（即ち、フィーダー細胞）を含まない培地または培養条件を意味する。また、「ゼノフリー」とは、培養対象の細胞の生物種とは異なる生物由来の成分を含まない培地または培養条件を意味する。
　本発明の製法における培養は、所望する細胞が増殖し得る限り、浮遊培養、接着培養のいずれであってもよいが、好ましくは接着培養である。本明細書において、「浮遊培養」とは、細胞または細胞の凝集体が培養液に浮遊して存在する状態を維持する条件で行われる培養、即ち細胞または細胞の凝集体と培養容器との間に強固な細胞－基質間結合（cell-substratum junction）を作らせない条件での培養を意味する。また、本明細書において、「接着培養」とは、細胞または細胞の凝集体と培養器材等との間に強固な細胞-基質間結合を作らせる条件での培養をいう。
　接着培養を行う際に用いられる培養器としては、培養器の表面が、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理（例：基底膜調製物、フィブロネクチン、ラミニンまたはその断片、エンタクチン、コラーゲン、ゼラチン、シンセマックス、ビトロネクチン等の細胞外マトリクス等、または、ポリリジン、ポリオルニチン等の高分子等によるコーティング処理、または、正電荷処理等の表面加工）されたものが挙げられる。中でも、ラミニンまたはその断片でコーティングした培養器が好ましい。
　本発明で用いるラミニンまたはその断片としては、ラミニン-111およびそのE8領域を含む断片、ラミニン-211およびそのE8領域を含む断片（例：iMatrix-211）、ラミニン-121またはそのE8領域を含む断片、ラミニン-221またはそのE8領域を含む断片、ラミニン-332またはそのE8領域を含む断片、ラミニン-3A11またはそのE8領域を含む断片、ラミニン-411またはそのE8領域を含む断片（例：iMatrix-411）、ラミニン-421またはそのE8領域を含む断片、ラミニン-511またはそのE8領域を含む断片（例：iMatrix-511、iMatrix-511 silk）、ラミニン-521またはそのE8領域を含む断片、ラミニン-213またはそのE8領域を含む断片、ラミニン-423またはそのE8領域を含む断片、ラミニン-523またはそのE8領域を含む断片、ラミニン-212/222またはそのE8領域を含む断片、ラミニン-522またはそのE8領域を含む断片などが挙げられる。
　浮遊培養を行う際に用いられる培養容器は、「浮遊培養する」ことが可能なものであれば特に限定されず、当業者であれば適宜決定することが可能である。このような培養容器としては、例えば、フラスコ、組織培養用フラスコ、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マイクロポア、マルチプレート、マルチウェルプレート、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、ローラーボトルが挙げられる。さらに、浮遊培養用の容器としてバイオリアクターが例示される。これらの培養容器は、浮遊培養を可能とするために、細胞非接着性であることが好ましい。細胞非接着性の培養容器としては、培養容器の表面が、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理（例：細胞外マトリクス等によるコーティング処理）されていないものなどを使用できる。
　培養温度は、特に制限されないが、約30～40℃、好ましくは約37℃であり、CO2含有空気の雰囲気下で培養が行われ、CO2濃度は、好ましくは約2～5％である。
　本発明の製法では、長期間に亘り目的の細胞が得られるため、培養期間は特に限定されないが、通常2日間以上（例：3日間、4日間、5日間、6日間、7日間、8日間、9日間、10日間、20日間またはそれ以上）であり、100日間以下（例：90日間、80日間、70日間、60日間またはそれ以下）である。一態様において、本発明の製法では、100日間を超えて膵内胚葉細胞を増殖させることも可能であるため、培養期間は、100日間を超えてもよい（例えば、110日間、120日間またはそれ以上）。
　細胞の培養密度は、細胞が増殖できる限り特に限定されない。通常1.0×102～1.0×107細胞/cm2、好ましくは1.0×103～1.0×106細胞/cm2、より好ましくは1.0×104～1.0×105細胞/cm2である。
　本発明の製法で用いる膵内胚葉細胞は、生体から単離したものや、市販の細胞株などを用いることができるが、好ましくは、多能性幹細胞（pluripotent stem cell）に由来する細胞である。また、一態様において、本発明の製法で出発細胞として用いる膵内胚葉細胞は、遺伝性膵疾患の患者由来の細胞である。膵疾患には、急性膵炎、慢性膵炎、1型糖尿病、2型糖尿病、膵腫瘍、ランゲルハンス島腫瘍などが例示されるが、膵疾患の内、遺伝子の異常に起因する疾患が遺伝性膵疾患である。遺伝性膵疾患として、具体的には、遺伝性膵炎、家族性膵腫瘍、嚢胞性線維症などが挙げられるが、これらに限定されない。遺伝性膵疾患の患者由来の膵内胚葉細胞は、患者から単離したものを用いてもよいが、好ましくは、患者由来の体細胞を初期化してiPS細胞を樹立し、該iPS細胞から自体公知の方法により分化誘導して作製した膵内胚葉細胞である。遺伝性膵疾患の患者由来の膵内胚葉細胞や、該細胞から分化誘導したβ様細胞などの細胞は、該疾患の病態を反映する膵疾患モデルとして用いることができるため、例えば、膵疾患の治療または予防薬のスクリーニングなどに適している。
　「多能性幹細胞」とは、生体の種々の異なった形態や機能を持つ組織や細胞に分化でき、三胚葉（内胚葉、中胚葉、外胚葉）のどの系統の細胞にも分化し得る能力を有する幹細胞を指す。本発明に用いる多能性幹細胞としては、例えば、人工多能性幹細胞（induced pluripotent stem cell：iPS細胞）、胚性幹細胞（embryonic stem cell：ES細胞）、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹細胞（nuclear transfer embryonic stem cell：ntES細胞）、多能性生殖幹細胞（multipotent germline stem cell）（「mGS細胞」）、胚性生殖幹細胞（EG細胞）などが挙げられるが、好ましくはiPS細胞(より好ましくはヒトiPS細胞)である。上記多能性幹細胞がES細胞またはヒト胚に由来する任意の細胞である場合、その細胞は胚を破壊して作製された細胞であっても、胚を破壊することなく作製された細胞であってもよいが、好ましくは、胚を破壊することなく作製された細胞である。
　ES細胞は、ヒトやマウスなどの哺乳動物の初期胚（例えば胚盤胞）の内部細胞塊から樹立された、多能性と自己複製による増殖能を有する幹細胞である。ES細胞は、マウスで1981年に発見され（M.J. Evans and M.H. Kaufman（1981）, Nature 292:154-156）、その後、ヒト、サルなどの霊長類でもES細胞株が樹立された（J.A. Thomson et al.（1998）, Science 282:1145-1147; J.A. Thomson et al.（1995）, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:7844-7848; J.A. Thomson et al.（1996）, Biol. Reprod., 55:254-259; J.A. Thomson and V.S. Marshall（1998）, Curr. Top. Dev. Biol., 38:133-165）。ES細胞は、対象動物の受精卵の胚盤胞から内部細胞塊を取出し、内部細胞塊を線維芽細胞のフィーダー上で培養することによって樹立することができる。あるいは、ES細胞は、胚盤胞期以前の卵割期の胚の単一割球のみを用いて樹立することもできるし（Chung Y. et al. (2008), Cell Stem Cell 2: 113-117）、発生停止した胚を用いて樹立することもできる（Zhang X. et al. (2006), Stem Cells 24: 2669-2676.）。
　nt ES細胞は、核移植技術によって作製されたクローン胚由来のES細胞であり、受精卵由来のES細胞とほぼ同じ特性を有している（Wakayama T. et al.（2001）, Science, 292:740-743; S. Wakayama et al.（2005）, Biol. Reprod., 72:932-936; Byrne J. et al.（2007）, Nature, 450:497-502）。即ち、未受精卵の核を体細胞の核と置換することによって得られたクローン胚由来の胚盤胞の内部細胞塊から樹立されたES細胞がnt ES（nuclear transfer ES）細胞である。nt ES細胞の作製のためには、核移植技術（Cibelli J.B. et al.（1998）, Nature Biotechnol., 16:642-646）とES細胞作製技術（上記）との組み合わせが利用される（若山清香ら（2008）, 実験医学, 26巻, 5号（増刊）, 47～52頁）。核移植においては、哺乳動物の除核した未受精卵に、体細胞の核を注入し、数時間培養することで初期化することができる。
　本発明で用いるES細胞株としては、マウスES細胞であれば、例えば、inGenious targeting laboratory社、理研（理化学研究所）等が樹立した各種マウスES細胞株が利用可能であり、ヒトES細胞株であれば、例えば、ウィスコンシン大学、NIH、理研、京都大学、国立成育医療研究センターおよびCellartis社などが樹立した各種ヒトES細胞株が利用可能である。具体的には、例えば、ヒトES細胞株としては、ESI Bio社が分譲するCHB-1～CHB-12株、RUES1株、RUES2株、HUES1～HUES28株等、WiCell Researchが分譲するH1株、H9株等、理研が分譲するKhES-1株、KhES-2株、KhES-3株、KhES-4株、KhES-5株、SSES1株、SSES2株、SSES3株などが挙げられる。
　iPS細胞は、哺乳動物体細胞または未分化幹細胞に、特定の因子（核初期化因子）を導入して再プログラミングすることにより得られる細胞である。現在、iPS細胞にはさまざまなものがあり、山中らにより、マウス線維芽細胞にOct3/4・Sox2・Klf4・c-Mycの４因子を導入することにより、樹立されたiPSC（Takahashi K, Yamanaka S., Cell, (2006) 126: 663-676）のほか、同様の４因子をヒト線維芽細胞に導入して樹立されたヒト細胞由来のiPSC（Takahashi K, Yamanaka S., et al. Cell, (2007) 131: 861-872.）、上記４因子導入後、Nanogの発現を指標として選別し、樹立したNanog-iPSC（Okita, K., Ichisaka, T., and Yamanaka, S. (2007). Nature 448, 313-317.）、c-Mycを含まない方法で作製されたiPSC（Nakagawa M, Yamanaka S., et al. Nature Biotechnology, (2008) 26, 101 - 106）、ウイルスフリー法で6因子を導入して樹立されたiPSC（Okita K et al. Nat. Methods 2011 May;8(5):409-12, Okita K et al. Stem Cells. 31(3):458-66.）等も用いることができる。また、Thomsonらにより作製されたOCT3/4・SOX2・NANOG・LIN28の４因子を導入して樹立された人工多能性幹細胞（Yu J., Thomson JA. et al., Science (2007) 318: 1917-1920.）、Daleyらにより作製された人工多能性幹細胞（Park IH, Daley GQ. et al., Nature (2007) 451: 141-146）、桜田らにより作製された人工多能性幹細胞（特開2008-307007号）等も用いることができる。
　このほか、公開されているすべての論文（例えば、Shi Y., Ding S., et al., Cell Stem Cell, (2008) Vol3, Issue 5,568-574；、Kim JB., Scholer HR., et al., Nature, (2008) 454, 646-650；Huangfu D., Melton, DA., et al., Nature Biotechnology, (2008) 26, No 7, 795-797）、あるいは特許公報（例えば、特開2008-307007号、特開2008-283972号、US2008-2336610、US2009-047263、WO2007-069666、WO2008-118220、WO2008-124133、WO2008-151058、WO2009-006930、WO2009-006997、WO2009-007852）に記載されている当該分野で公知の人工多能性幹細胞のいずれも用いることができる。
　人工多能性幹細胞株としては、NIH、理研、京都大学等が樹立した各種iPSC株が利用可能である。例えば、ヒトiPSC株であれば、理研のHiPS-RIKEN-1A株、HiPS-RIKEN-2A株、HiPS-RIKEN-12A株、Nips-B2株等、京都大学の253G1株、253G4株、1201C1株、1205D1株、1210B2株、1383D2株、1383D6株、201B7株、409B2株、454E2株、585A1株、606A1株、610B1株、648A1株、1231A3株、FfI-01s04株等が挙げられ、585A1株が好ましい。
　mGS細胞は、精巣由来の多能性幹細胞であり、精子形成のための起源となる細胞である。この細胞は、ES細胞と同様に、種々の系列の細胞に分化誘導可能であり、例えばマウス胚盤胞に移植するとキメラマウスを作出できるなどの性質をもつ（Kanatsu-Shinohara M. et al.（2003）Biol. Reprod., 69:612-616; Shinohara K. et al.（2004）, Cell, 119:1001-1012）。神経膠細胞系由来神経栄養因子（glial cell line-derived neurotrophic factor（GDNF））を含む培養液で自己複製可能であるし、またES細胞と同様の培養条件下で継代を繰り返すことによって、生殖幹細胞を得ることができる（竹林正則ら（2008）, 実験医学, 26巻, 5号（増刊）, 41～46頁, 羊土社（東京、日本））。
　EG細胞は、胎生期の始原生殖細胞から樹立される、ES細胞と同様な多能性をもつ細胞である。LIF、bFGF、幹細胞因子（stem cell factor）などの物質の存在下で始原生殖細胞を培養することによって樹立し得る（Matsui Y. et al.（1992）, Cell, 70:841-847; J.L. Resnick et al.（1992）, Nature, 359:550-551）。
　多能性幹細胞の由来種も特に限定されず、例えば、ラット、マウス、ハムスター、モルモット等のげっ歯類、ウサギ等のウサギ目、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ等の有蹄目、イヌ、ネコ等のネコ目、ヒト、サル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類などの細胞であってよい。好ましい由来種は、ヒトである。
　多能性幹細胞から膵内胚葉細胞への分化誘導は、Toyoda T, et al. Stem Cell Reports 2017、特許文献１、非特許文献１、非特許文献２、国際公開第2017/047797号に記載の方法などの公知の方法により行うことができる。具体的には、例えば、
　Ａ）多能性幹細胞から胚体内胚葉細胞へと分化誘導する工程、
　Ｂ）胚体内胚葉細胞から原始腸管細胞へと分化誘導する工程、
　Ｃ）原始腸管細胞から後方前腸細胞へと分化誘導する工程、
　Ｄ）後方前腸細胞から膵内胚葉細胞へと分化誘導する工程
を含む方法などにより、分化誘導することができる。
　工程Ａ）～Ｄ）で用いる基礎培地や培地添加物は、本発明の製法で用いる基礎培地や培地添加物と同様のものを用いることができる。また、工程Ａ）～Ｄ）における培養温度は、通常約30～40℃、好ましくは約37℃であり、CO2含有空気の雰囲気下で培養が行われ、CO2濃度は、好ましくは約2～5％である。また、工程Ａ）～Ｄ）は、接着培養により行うことが好ましい。接着培養の定義や方法などは、前述の通りである。
　工程Ａ）の胚体内胚葉細胞への分化は、例えば、多能性幹細胞を、低用量のアクチビンAを含む培地中で培養することなどにより行うことができる。培地にはさらに、ROCK阻害剤、GSK3β阻害剤が含まれていてもよい。培養期間は、通常２日間～８日間である。
　工程Ａ）で用いるアクチビンAの培地中での濃度は、例えば、5～1000ng/mL、好ましくは20～500ng/mL、より好ましくは、50～150ng/mLである。
　工程Ａ）で用いるGSK3β阻害剤としては、例えば、CHIR98014、CHIR99021、TDZD-8、SB216763、TWS-119、ケンパウロン、1-アザケンパウロン、SB216763、SB415286、AR-AO144-18、CT99021、CT20026などが挙げられる。中でも、CHIR99021が好ましい。CHIR99021を使用する場合の培地中での濃度は、通常0.5～5μM、好ましくは1～4μMである。
　工程Ａ）で用いるROCK阻害剤は、本発明の製法で用いるROCK阻害剤と同様のものを用いることができる。ROCK阻害剤としてY-27632を用いる場合の培地中の濃度は、通常1～20μM、好ましくは5～15μMである。
　培地にはさらに、インスリンを添加することができる。インスリンの培地中の濃度は、通常0.01～20μM、好ましくは0.1～10μM、より好ましくは0.5～5μMである。培地中のインスリンの濃度は、添加したB-27サプリメントに含まれるインスリンの濃度であってもよいが、これに限定されない。
　工程Ｂ）の原始腸管細胞への分化は、例えば、工程Ａ）で得られた胚体内胚葉細胞を、増殖因子を含む培地で培養することなどにより行うことができる。培養期間は、通常２日間～８日間である。
　工程Ｂ）で用いる増殖因子としては、EGF、KGF、FGF10が好ましく、EGF及び/又はKGFがより好ましく、KGFがさらに好ましい。増殖因子の培地中の濃度は、用いる増殖因子の種類によって適宜設定されるが、通常約0.1nM～1000μM、好ましくは約0.1nM～100μMである。EGFの場合、その濃度は、約5～2000ng/ml(すなわち、約0.8～320nM)、好ましくは約5～1000ng/ml(すなわち、約0.8～160nM)、より好ましくは約10～1000ng/ml(すなわち、約1.6～160nM)である。FGF10の場合、その濃度は、約5～2000ng/ml(すなわち、約0.3～116nM)、好ましくは約10～1000ng/ml(すなわち、約0.6～58nM)、より好ましくは約10～1000ng/ml(すなわち、約0.6～58nM)である。例えば増殖因子としてKGFを使用する場合の濃度は、通常5～150ng/mL、好ましくは30～100ng/mL、特に好ましくは約50ng/mLである。
　工程Ｃ）の後方前腸細胞への分化は、例えば、工程Ｂ）で得られた原始腸管細胞を、増殖因子、レチノイン酸誘導体などのレチノイン酸受容体アゴニスト、Hedgehogシグナル阻害剤、BMP阻害剤を含む培地で培養することなどにより行うことができる。培養期間は、通常１日間～５日間である。
　工程Ｃ）で用いる増殖因子の種類や濃度は、工程Ｂ）で記載した内容が援用される。
　工程Ｃ）で用いるレチノイン酸受容体アゴニストとしては、例えば、レチノイン酸（all-trans-3,7-ジメチル-9-(2,6,6-トリメチル-1-シクロヘキセン-1-イル)-2,4,6,8-ノナテトラエン酸（Cas No：302-79-4））、レチノイン酸塩、レチノイン酸前駆体、レチノイン酸誘導体などが挙げられる。レチノイン酸塩の例としては、レチノイン酸ナトリウム、レチノイン酸カリウム、レチノイン酸カルシウムなどが挙げられる。レチノイン酸前駆体の例としては、β－カロテン、レチノールエステル、レチノール、レチナールなどが挙げられる。レチノイン酸誘導体は、天然のレチノイン酸が有する機能を保持する人工的に修飾されたレチノイン酸を意味し、例えば、4-[[(5,6,7,8-tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)carbonyl]amino]-Benzoic acid（AM580）（Tamura K,et al., Cell Differ. Dev. 32: 17-26 (1990)）、4-[(1E)-2-(5,6,7,8-tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propen-1-yl]-Benzoic acid（TTNPB）（Strickland S, et al., Cancer Res. 43: 5268-5272 (1983))、パルミチン酸レチノール、レチノール、レチナール、３－デヒドロレチノイン酸、３－デヒドロレチノール、３－デヒドロレチナールなどが挙げられる。中でも、TTNPBが好ましい。TTNPBを用いる場合、培地中での濃度は、通常1～50nM、好ましくは5～15nMである。
　工程Ｃ）で用いるヘッジホッグ経路阻害剤としては、例えば、シクロパミン、ジェルビン、3-Keto-N-(aminoethyl-aminocaproyl- dihydro-cinnamoyl)（KAAD）-シクロパミン、CUR-61414、SANT-1、SANT-2、SANT-3、SANT-4、IPI-926、IPI-269609、GDC-0449およびNVP-LDE-225などが挙げられる。中でも、SANT-1が好ましい。SANT-1を用いる場合、培地中での濃度は、通常100～500 nM、好ましくは、50～150 nMである。
　工程Ｃ）で用いるBMP阻害剤としては、例えば、Chordin、ノギン、Follistatinなどのタンパク質性阻害剤、Dorsomorphin (すなわち、6-[4-(2-piperidin-1-yl-ethoxy)phenyl]-3-pyridin-4-yl-pyrazolo[1,5-a]pyrimidine)、その誘導体 (P. B. Yu et al. (2007), Circulation, 116:II_60; P.B. Yu et al. (2008), Nat. Chem. Biol., 4:33-41; J. Hao et al. (2008), PLoS ONE, 3(8):e2904)およびLDN-193189などが挙げられる。中でも、LDN-193189が好ましい。LDN-193189を用いる場合、培地中での濃度は、通常10～1000 nM、好ましくは100～300 nMである。
　工程Ｄ）の膵内胚葉細胞への分化は、例えば、工程Ｃ）で得られた後方前腸細胞を、増殖因子、BMP阻害剤を含む培地で培養することにより行うことができる。培地には、非筋ミオシンII阻害剤、TGFβ阻害剤、ニコチンアミドなどが含まれていてもよい。培養期間は通常２日間～１０日間である。
　工程Ｄ）を行うに際して、工程Ｃ）で得られた後方前腸細胞を、既報(Toyoda et al., Stem Cell Research(2015)14, 185-197)に従い、0.25％トリプシン-EDTAで処理後にピペッティングすることにより分散し、0.25％トリプシン-EDTAを遠心分離して懸濁してもよい。
　工程Ｄ）で用いる増殖因子およびBMP阻害剤の種類や濃度は、工程Ｂ）および工程Ｃ）で記載の内容が援用される。
　工程Ｄ）で用いる非筋ミオシンII阻害剤としては、例えば、ブレビスタチン（Blebbistatin）A3、Calphostin C、Goe6976、Goe7874、Fasudil/HA1077、Hypericin、K-252a、KT5823、ML-7、ML-9、Piceatannol、Staurosporine、W-5、W-7、W-12、W-13、Wortmanninなどが挙げられる。中でも、ブレビスタチンが好ましい。非筋ミオシンII阻害剤としてブレビスタチンを用いる場合の培地中の濃度は、1μM～200μM、好ましくは、10μM～100μMである。
　工程Ｄ）で用いるTGFβ阻害剤としては、TGFβの受容体への結合からSMADへと続くシグナル伝達を阻害する物質であり、受容体であるALKファミリーへの結合を阻害する物質、またはALKファミリーによるSMADのリン酸化を阻害する物質である限り特に限定されず、例えば、Lefty-1、SB431542、SB202190、SB505124、NPC30345、SD093、SD908、SD208(Scios)、LY2109761、LY364947、LY580276、A-83-01(WO 2009146408)、ALK5阻害剤II（ALK5 inhibitor II）（2-[3-[6-メチルピリジン-2-イル]-1H-ピラゾール-4-イル]-1,5-ナフチリジン（2-[3-(6-Methylpyridine-2-yl)-1H-pyrazole-4-yl]-1,5-naphthyridine）；CAS:446859-33-2）、TGFβRIキナーゼ阻害剤VIII（6-[2-tert-ブチル-5-[6-メチル-ピリジン-2-イル]-1H-イミダゾル-4-イル]-キノキサリン）、DMH1およびこれらの誘導体などが例示される。好ましくは、ALK5阻害剤IIであり得る。TGFβ阻害剤としてALK5阻害剤IIを用いる場合の培地中の濃度は、通常0.1μM～50μM、さらに好ましくは、1μM～20μMである。
　工程Ｄ）で用いるニコチンアミドの培地中の濃度は、通常1 mM～100 mM、好ましくは、5 mM～50 mMである。
　工程Ｄ）における培養の最初の１日はROCK阻害剤の存在下で行い、以後はROCK阻害剤を含まない培地で培養してもよい。ROCK阻害剤は、本発明の製法で用いるROCK阻害剤と同様のものを用いることができる。ROCK阻害剤としてY-27632を用いる場合の培地中の濃度は、通常1～20μM、好ましくは5～15μMである。
　下述の実施例で示されるとおり、特定の低分子化合物またはタンパク質（以下、「拡大培養促進因子」と称することがある）の存在下で膵内胚葉細胞を培養することで、該細胞の増殖効率が向上することが示された。よって、本発明の製法は、拡大培養促進因子を含む培地中で膵内胚葉細胞を培養する工程を含んでいてもよい。かかる拡大培養促進因子としては、例えば、TGFβ阻害剤、レチノイン酸受容体アゴニスト、増殖因子（例：NGF、βcellurin、TGFα、PDGFAA、LIF、IGF-1、FGF9、FGF10等）、骨形成タンパク質(BMP)（例：BMP4、BMP7等）などが挙げられるが、中でも、TGFβ阻害剤、レチノイン酸受容体アゴニストが好ましい。より具体的な拡大培養促進因子として、図７に記載のものを挙げることができる。拡大培養促進因子は、１種のみ用いてもよく、２種以上用いてもよい。本発明の一態様において、本発明の製法における培地は、TGFβ阻害剤および／またはレチノイン酸受容体アゴニストを含むが、TGFβ阻害剤およびレチノイン酸受容体アゴニストの両方を含むことが好ましい。
　TGFβ阻害剤としては、工程Ｄ）で用いるTGFβ阻害剤と同様のものを用いることができる。TGFβ阻害剤として、中でも、ALK5阻害剤II、SB431542、A-83-01、LY2109761、DMH1が好ましく、ALK5阻害剤IIがより好ましい。TGFβ阻害剤としてALK5阻害剤IIを用いる場合の培地中の濃度は、通常0.1μM～50μM、さらに好ましくは、1μM～20μMである。一態様において、10μMである。
　レチノイン酸受容体アゴニストとしては、工程Ｃ）で用いるレチノイン酸受容体アゴニストと同様のものを用いることができる。レチノイン酸受容体アゴニストとして、中でも、レチノイン酸、TTNPBが好ましく、レチノイン酸がより好ましい。レチノイン酸受容体アゴニストとしてレチノイン酸またはその塩を用いる場合の培地中の濃度は、通常100nM～10μM、さらに好ましくは、500nM～5μMである。一態様において、1μMである。
　本発明の別の態様において、本発明の製法で得られた膵内胚葉細胞（以下、「本発明の膵内胚葉細胞」ともいう。）も提供される。かかる膵内胚葉細胞は、少なくともβ様細胞への分化能を有し、少なくともPDX1およびNKX6.1が発現する。膵内胚葉細胞は、さらに、SOX9、GATA4などの１種以上の遺伝子マーカーが発現していてもよい。
　本明細書において、PDX1などの各種遺伝子マーカーを「発現する」または該マーカーが「陽性」とは、特に断らない限り、少なくとも「遺伝子にコードされたmRNAの産生」を含む意味で用いられるが、好ましくは、さらに「mRNAにコードされたタンパク質の産生」を含む意味で用いられる。したがって、遺伝子にコードされたmRNAの産生が、少なくとも定量RT-PCRで検出された場合には、遺伝子が発現しているといえる。一方で、遺伝子にコードされたmRNAの産生が定量RT-PCRで検出されない（即ち、検出限界未満）場合、あるいはバックグラウンドレベルの場合には、遺伝子が発現していないあるいは陰性といえる。
２．膵内胚葉細胞拡大培養用キット
　さらに本発明は、ROCK阻害剤と、KGFおよび／またはEGFとを含む、膵内胚葉細胞拡大培養用キット（以下、「本発明の拡大培養用キット」と称することがある。）を提供する。「膵内胚葉細胞拡大培養用キット」は、「膵内胚葉細胞増殖用キット」あるいは「膵内胚葉細胞製造用キット」とも読み替えることができる。本発明の拡大培養用キットには、ニコチンアミドが含まれていることが好ましい。また、本発明の拡大培養用キットには、TGFβ阻害剤および／またはレチノイン酸受容体アゴニストが含まれていることも好ましい。
　また、本発明の拡大培養用キットには、基礎培地、培地添加物、培養容器、膵内胚葉細胞およびその前駆細胞（例えば、多能性幹細胞、胚体内胚葉細胞、原始腸管細胞、後方前腸細胞等）のうちの少なくとも１種が含まれていてもよい。本発明の拡大培養用キットに含まれる、ROCK阻害剤、TGFβ阻害剤、レチノイン酸受容体アゴニストなどの各構成物質の定義や具体例等は、上記「１．膵内胚葉細胞の製法」で記載した内容がすべて援用される。
３．β様細胞の製法
　上述のとおり、本発明の膵内胚葉細胞は、少なくともβ様細胞への分化能を有する。従って、別の態様において、本発明の膵内胚葉細胞を、β様細胞またはその前駆細胞へと分化誘導させる工程を含む、β様細胞またはその前駆細胞の製造方法（以下、「本発明のβ様細胞の製法」と称する場合がある。）、並びに該方法で得られたβ様細胞またはその前駆細胞（以下、「本発明のβ様細胞」ともいう。）が提供される。β様細胞の前駆細胞としては、例えば、NGN3を発現する内分泌細胞、インスリンおよびNKX6.1を発現する未熟なβ細胞などが挙げられる。臨床での使用の観点から、本発明のβ様細胞の製法は、全行程をフィーダーフリーかつゼノフリー条件下で行うことが好ましい。
　膵内胚葉細胞からβ様細胞またはその前駆細胞への分化誘導は、特許文献１、非特許文献１および２に記載の方法などの公知の方法により行うことができる。具体的には、例えば、
　工程Ｅ）本発明の膵内胚葉細胞から内分泌前駆細胞へと分化誘導する工程、および
　工程Ｆ）内分泌前駆細胞からβ様細胞へと分化誘導する工程、
を含む方法などにより、分化誘導することができる。
　工程Ｅ）およびＦ）で用いる基礎培地や培地添加物は、本発明の製法で用いる基礎培地や培地添加物と同様のものを用いることができる。また、工程Ｅ）およびＦ）における培養温度は、通常約30～40℃、好ましくは約37℃であり、CO2含有空気の雰囲気下で培養が行われ、CO2濃度は、好ましくは約2～5％である。また、工程Ｅ）およびＦ）は、浮遊培養により行うことが好ましい。浮遊培養の定義や方法などは、上記「１．膵内胚葉細胞の製法」で記載した内容が援用される。
　工程Ｅ）の内分泌前駆細胞への分化は、例えば、本発明の膵内胚葉細胞を、γ-secretase阻害剤およびTGFβ阻害剤を含む培地で培養することなどにより行うことができる。培地には、甲状腺ホルモン、増殖因子、ヘッジホッグ経路阻害剤、レチノイン酸誘導体、BMP阻害剤などが含まれていてもよい。培養期間は、通常１日間～５日間である。
　工程Ｅ）で用いるTGFβ阻害剤、増殖因子、ヘッジホッグ経路阻害剤、レチノイン酸誘導体およびBMP阻害剤の種類や濃度は、上記工程Ｃ）およびＤ）で記載した内容が援用される。
　工程Ｅ）で用いるγ-セクレターゼ阻害剤としては、例えば、RO4929097、DAPT(GSI-IX)、Semagacestat(LY450139)、Dibenzazepine(YO-01027)などが挙げられる。中でも、RO4929097が好ましい。RO4929097を用いる場合の培地中の濃度は、通常通常0.1～10μM、好ましくは0.5～5μMである。
　工程Ｅ）で用いる甲状腺ホルモンとしては、例えば、トリヨードチロニン（T3）、チロキシン（T4）などが挙げられる。中でも、トリヨードチロニンが好ましい。トリヨードチロニンを用いる場合の培地中の濃度は、通常0.1～10μM、好ましくは0.5～5μMである。
　工程Ｆ）のβ様細胞への分化は、例えば、工程Ｅ）で得られた内分泌前駆細胞を、工程Ｅ）で用いた培地からγ-セクレターゼ阻害剤を除いた培地中で培養することなどにより行うことができる。培養期間は、通常４日間～１０日間である。
　その他の培養条件や培養方法、培地への添加物、培養器の具体例、培養器の表面の加工などは、上記「１．膵内胚葉細胞の製法」で記載した内容が援用される。
　また、本発明の膵内胚葉細胞から、自体公知の方法により、膵外分泌細胞を製造することもできる。かかる方法として、例えば、国際公開2014/104403に記載の方法が挙げられ、具体的には、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤および/またはNotchシグナルのリガンドタンパク質、ならびにプロテインキナーゼC活性化剤を添加した培養液中で、本発明の膵内胚葉細胞を培養する工程により、製造することもできる。具体的なヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、Notchシグナルのリガンドタンパク質、プロテインキナーゼC活性化剤の種類や製造方法は、国際公開2014/104403の内容が全て援用される。
４．細胞移植療法剤
　本発明の膵内胚葉細胞および本発明のβ様細胞（これらの総称として「本発明の細胞」という用語を用いることがある。）は、哺乳動物生体内に移植することによって膵島様細胞に分化誘導し得る。よって、本発明の細胞は、細胞移植療法に好適に用いることができるため、本発明の別の態様において、本発明の細胞を含有してなる、細胞移植療法剤（以下、「本発明の細胞移植療法剤」と称することがある。）が提供される。また、本発明の細胞の有効量を、治療の対象とする哺乳動物（例：ヒト、マウス、ラット、サル、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ等）に投与または移植する、膵疾患の治療方法も、本発明に包含される。治療の対象となる膵疾患としては、例えば、急性膵炎、慢性膵炎、1型糖尿病、2型糖尿病、膵腫瘍、ランゲルハンス島腫瘍などが例示される。
　本発明の細胞または細胞移植療法剤は、それを必要とする患者の生体内に移植して用いることができる。移植は、細胞を一定の位置で固定できる生体内領域に行うことが好ましく、例えば、皮下、腹腔内、腹膜上皮、大網、脂肪組織、筋肉組織や膵臓、腎臓等の各臓器の被膜下などに行うことできる。好ましくは、侵襲度の低い皮下移植である。移植される細胞は、治療上有効量を投与すればよく、移植対象の、年齢、体重、移植部位の大きさ、疾患の重篤度等の要因により変化し得、特に限定されないが、例えば、10×104細胞～10×1011細胞程度とすることができる。
　本発明の細胞を、細胞移植療法に用いる場合、拒絶反応が起こらないという観点から、移植先の個体のHLA遺伝子型が同一若しくは実質的に同一である体細胞から樹立したiPS細胞に由来する細胞を用いることが望ましい。ここで、「実質的に同一」とは、移植した細胞に対して免疫抑制剤により免疫反応が抑制できる程度にHLA遺伝子型が一致していることであり、例えば、HLA-A、HLA-BおよびHLA-DRの3遺伝子座或いはHLA-Cを加えた4遺伝子座が一致するHLA型を有する体細胞である。年齢や体質などの理由から充分な細胞が得られない場合には、ポリエチレングリコールやシリコーンのようなカプセル、多孔性の容器などに包埋して拒絶反応を回避した状態で移植することも可能である。
　本発明の細胞は、常套手段にしたがって医薬上許容される担体と混合するなどして、注射剤、懸濁剤、点滴剤等の非経口製剤として製造される。従って、一態様において、本発明の細胞を製剤化する工程を含む、細胞移植療法剤の製法も提供される。かかる製法は、本発明の細胞を準備する工程を含んでいてもよい。さらに、本発明の細胞を保存する工程を含むこともできる。
　当該非経口製剤に含まれ得る医薬上許容される担体としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、D-ソルビトール、D-マンニトール、塩化ナトリウムなど）などの注射用の水性液を挙げることができる。本発明の細胞移植療法剤は、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤、酸化防止剤などと配合してもよい。
　本発明の細胞移植療法剤は、細胞の凍結保存に通常使用される条件で凍結保存された状態で提供され、用時融解して用いることもできる。その場合、血清若しくはその代替物、有機溶剤（例、DMSO）等をさらに含んでいてもよい。この場合、血清若しくはその代替物の濃度は、特に限定されるものではないが約1～約30%(v/v)、好ましくは約5～約20%(v/v)であり得る。有機溶剤の濃度は、特に限定されるものではないが0～約50%(v/v)、好ましくは約5～約20%(v/v)であり得る。
　以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
＜材料および方法＞
老化関連試薬スクリーニング
　段階的分化誘導法により膵内胚葉細胞レベルまで分化させた後に、24 well plateに2×105/wellで再播種した。それらの培養細胞に下記の培地を添加して１週間培養した。Control群の培地は、0.5×B-27 Supplement、100 U/ml Penicillin/Streptomycin、100 ng/ml KGF/FGF7、 50 ng/ml EGFおよび10 mM Nicotinamideを添加したimproved MEMであった。Intervention群には、上記培地にY-27632、Terreic acid、Daidzein、PD98059、Metformin、BPTES、ABT263、ARV825または17-DMAGをそれぞれ加えて同様に１週間培養した。4%PFAにて固定後、β-gal染色とNKX6.1抗体免疫染色を行い、BZ-800（Keyence）を用いて蛍光染色画像を取得した。同顕微鏡のBZ-H4CM/マクロセルカウント機能を用いて、NKX6.1陽性細胞数、NKX6.1陽性割合、β-gal陽性割合を算出した。本手順の概要を図２－Ａおよび３－Ａに示す。
拡大培養促進試薬スクリーニング
　Y-27632を含む拡大培養培地に各種成長因子や小分子化合物を加えた培地を使用して、拡大培養２１日目の細胞を６日間培養施行した。その他は、老化関連試薬スクリーニングと同様である。
PDX1 + /NKX6.1 + 膵内胚葉細胞拡大培養
１．PDX1+/NKX6.1+膵内胚葉細胞の作製
　豊田らの方法(Toyoda T, et al. Stem Cell Reports 2017)を用いて、6 well plate に、iPS細胞(585A1株)またはES細胞(KhES-3株)からPDX1+/NKX6.1+膵内胚葉細胞を作製した。簡潔に説明すれば、iMatrix-511 silkでコーティングした6 well plateに、上記未分化細胞を１×106/wellにて播種した。S1培地（1×B-27 Supplement、100 U/ml Penicillin/Streptomycin、100 ng/ml activin AおよびCHIR99021(1日目：3 μM, ２～３日目：1 μM，４日目：0 μM)）を添加したRPMIにて4日間、S2培地（0.5×B-27 Supplement、100 U/ml Penicillin/Streptomycinおよび50 ng/ml KGF/FGF7を添加したimproved MEM）にて5日間、S3培地（ 0.5×B-27 Supplement、100 U/ml Penicillin/Streptomycin、50ng/ml KGF/FGF7、 0.2 μM LDN-193189、0.1 μM SANT-1および10 nM TTNPBを添加したimproved MEM）にて２日間培養を行った。6 well plateからトリプシンを用いて細胞を剥離し、再度S3培地を用いてiMatrix-511 silkでコーティングした6 well plateに1.5×106/wellで再播種した。その翌日に、S4培地（0.5×B-27 Supplement、100 U/ml Penicillin/Streptomycin、100 ng/ml KGF/FGF7、50 ng/ml EGF、10 mM Nicotinamideおよび50 μM Y-27632を添加したimproved MEM）に培地変更して４日間培養した。
２．PDX1+/NKX6.1+膵内胚葉細胞拡大培養
　(1)上記１で作製した細胞をPBS(-)にて洗浄後、1 mlの0.25%トリプシン-EDTAを加え、5分間37℃ 5%CO2インキュベートした。(2)ピペッティングにて接着細胞を解離させて、50 mlの遠沈管に加えた。(3)遠沈管にDMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)/10%FBS/PS(Penicillin-Streptomycin)を4 ml加えた。(4)400G 3分間遠心して、上清除去した。(5)Improved MEM (10 μM Y-27632、0.5×B-27 Supplementおよび100 U/ml penicillin/streptomycinを含む)に懸濁させて細胞数をカウントした。(6)6 well plateに播種する場合は、1×106 cells/wellとなるように必要量の懸濁液を回収して400G 3分間遠心した（24 well plateに播種する場合は2×105 cells/well）。(7)上清除去後、improved MEM（100 ng/ml KGF、50 ng/ml EGF、10 mM Nicotinamide、50 μM Y-27632、0.5×B-27 Supplement、および100 U/ml penicillin/streptomycinを含む）に再懸濁し、2 ml/wellの懸濁液となるように調整して細胞を播種した。細胞播種する6 well plateは、播種１時間前に1wellあたり、iMatrix-511 silk 10 μlとPBS(-) 1.5 mlを混濁した溶液を加え、1時間37℃ 5%CO2インキュベートして、コーティングしておいた。
　(8)翌日（1日目）、improved MEMにて洗浄後、100 ng/ml KGF、50 ng/ml EGF、10 mM Nicotinamide、50 μM Y-27632、0.5× B-27 Supplementおよび100 U/ml penicillin/streptomycinを含むimproved MEMに交換した（5 ml/well）。(9)その3日後（4日目）に、improved MEMで洗浄後、工程(7)と同様の培地に交換した（5 ml/well）。(10)その3日後（7日目）に、上記工程(1)～(7)を行い、次の継代（拡大培養）を行った。その翌日から工程(8)、(9)および(10)を繰り返すことで、拡大および継代培養を繰り返した。１回の継代（拡大培養）が、7日間（上記の作業）に該当する。本手順の概要を図４－Ａに示す。ALK5阻害剤（Fujifilm Wako Chemicals；018-23023；ALK5 inhibitor II（CAS:446859-33-2））(培地中での濃度：10 μM)およびレチノイン酸（Sigma；R2625；CAS: 302-79-4））（培地中での濃度：1 μM）を用いる場合には、ALK阻害剤およびRA、またはDMSO（培地中での濃度：0.1%（v/v））は、上記工程(7)～(9)の培地中に添加しておいた。
β様細胞への分化誘導
　拡大培養後、木村らの方法（非特許文献１）を一部改変して、β様細胞へと分化誘導させた。簡潔に説明すれば、膵内胚葉細胞を6 well plateからトリプシンを用いて剥離した後に、S4培地にて3×105細胞数/mlで懸濁した。v bottom 96 well plateに、3×104細胞数/100 μl/wellで播種した。1日間、37℃ 5%CO2でインキュベートした後に、S5培地（0.5×B-27 Supplement、100 U/ml Penicillin/Streptomycin、10 μM ALK5 inhibitor II（CAS:446859-33-2）、1 μM トリヨードチロニン（T3）、1 μM RO4929097および20 ng/ml Betacellulinを添加したimproved MEM）に変更して１週間培養した。その後、S6培地（0.5×B-27 Supplement、100 U/ml Penicillin/Streptomycin、10 μM ALK5 inhibitor IIおよび1 μM T3を添加したimproved MEM）に培地交換して更に１週間培養した。
評価方法
１．免疫染色
　拡大培養された細胞をPBS(-)にて２回洗浄し、4％PFAにて4℃２０分間固定した。Blocking solution（5％ロバ血清と0.4%Triton X-100含有PBS(-)）を用いて、３０分間室温でブロッキングした。Blocking solutionにより希釈された一次抗体液を用いて、４℃一晩インキュベーションを行った。一次抗体液を洗浄後、blocking solutionにより希釈された蛍光二次抗体液を用いて、室温一時間インキュベーションを行った。BZ-710 or BZ-800（Keyence）を使用して、免疫蛍光染色画像を取得した。
２．フローサイトメトリー分析
　拡大培養された細胞を0.25%トリプシン-EDTAにて解離させ、Cytofix/Cytoperm Kit (BD Biosciences)を用いてプロトコール通りに固定した。2％ロバ血清含有permeabilization solutionにてブロッキングを行った。ブロッキング液に希釈された一次抗体液を用いて、4℃一晩インキュベーションを行った。一次抗体液を洗浄後、blocking solutionに希釈された蛍光二次抗体液を用いて、室温一時間インキュベーションを行った。染色された細胞を、FACSAriaII(BD Biosciences)を用いて解析した。
３．細胞核形態定量評価
　4％PFAにて固定されたplastic bottom plate上の細胞を、Hoechstを用いて核染色を行った。BZ-800（Keyence）を使用して取得した蛍光染色画像を、CellProfillerソフトのMeasureObjectSizeShape機能を使用して、eccentricity(真円度)を含む細胞形態評価値を取得した。
統計解析
　ノンパラメトリックな２群間の比較手法として、Mann-Whitney U testを使用した。３群以上の比較解析には、一元配置分散分析(one way ANOVA)を用いた。ANOVAにて有意な場合は、１つのcontrol群と他のtreatment群を多重比較するためにDunnet法を使用した。P値0.05未満を有意差ありとした。
　実施例で用いた試薬等の情報は以下の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
実施例１：膵内胚葉細胞を増殖できる試薬の探索
　老化関連試薬の中から、ヒトiPS細胞由来の膵内胚葉細胞を増殖できる試薬の探索を行った。老化関連試薬として、Y-27632、Terreic Acid、Daidzein、PD98059、Metformin、BPTES、BPTES、ABT263、ARV825、17-DMAGを選択し、各老化関連試薬を含む培地中で、NKX6.1+膵内胚葉細胞含むS4d4細胞を培養し、培養後の(1) NKX6.1陽性細胞数、または(2) NKX6.1陽性細胞割合およびβgal陽性細胞割合を測定した。結果を図２－Ｂ～２－Ｄに示す。図２－Ｂより、他の老化関連試薬は膵内胚葉細胞を有意に増加させない一方で、Y-27632は目的細胞を有意に増加させること、およびY-27632の濃度としては50 μMが最も増殖に適していることが示された。図２－Ｃより、膵内胚葉細胞の割合をアウトカムとした場合でも、図２－Ｂと同様にY-27632 50 μMが最も効果を認めることが示された。また、図２－Ｄより、Y-27632を使用すると、β gal陽性細胞（老化細胞）割合に関しても減少効果を発揮することが示された。一方で、その他の老化関連試薬でもβ gal陽性細胞割合が減少しているが、図２－Ｂと合わせて考えると、BPTESやABT263などによるβ gal陽性細胞割合の減少は、毒性による結果と推測される。
実施例２：Y-27632以外のROCK阻害剤による膵内胚葉細胞の増殖効果の検証
　実施例１より、ROCK阻害剤であるY-27632による膵内胚葉細胞の増殖効果が認められたため、他のROCK阻害剤でも同様にヒトiPS細胞由来PDX1+/NKX6.1+膵内胚葉細胞の増殖効果が認められるか否かを検証した。実験は、実施例１と同様に行った。結果を図３－Ｂおよび３－Ｃに示す。図３－Ｂおよび３－Ｃより、Y-27632以外のROCK阻害剤（GSK269962、GSK429286A、ファスジル塩酸塩、H1152およびチアゾビビン）においても、Y-27632と同様に膵内胚葉細胞増殖効果が認められた。
　以上より、ROCK阻害剤は、種類に依らず広く膵内胚葉細胞増殖効果を発揮することが強く示唆される。
実施例３：Y-27632（50 μM）による膵内胚葉細胞の拡大培養の検証
　Y-27632を用いることで、ヒトiPS細胞由来の膵内胚葉細胞を拡大培養できるか否かについて検証した。結果を図４－Ｂ～４－Ｈに示す。図４－Ｂより、Y-27632 (50 μM)を用いた拡大培養を行うことにより、60日間で１×105倍以上まで総細胞数が増えることが確認された。図４－Ｃより、Y-27632 (50 μM)を用いた拡大培養を行うことにより、60日間で１×105倍以上までPDX1+/NKX6.1+膵内胚葉細胞数が増えることが確認された。図４－Ｄより、Y-27632 (50 μM)を用いた拡大培養後の細胞の免疫染色像により、細胞がPDX1およびNKX6.1の発現を維持していること、またKi67の発現も維持していることが確認された。図４－Ｅより、Y-27632 (50 μM)を用いた拡大培養により、膵内胚葉細胞の割合やKi67陽性割合が維持されていることが確認された。図４－Ｆより、Y-27632 (50 μM)を用いた拡大培養により、膵内胚葉細胞の増殖能（=Ki67陽性の割合）も維持されていることが確認された。図４－Ｇより、拡大培養を２回行った膵内胚葉細胞でもβ様細胞への分化能を有していることが確認された。図４－Ｈより、ES細胞(KhES-3株)由来の膵内胚葉細胞を用いても、同様に膵内胚葉細胞の拡大培養が可能であるが、一方で、Y-27632を使用しないと拡大培養は困難であることが確認された。
　以上より、Y-27632（50 μM）を用いることで、少なくとも60日間に亘り膵内胚葉細胞を非常に効率よく拡大培養でき、また拡大培養後の膵内胚葉細胞は、β様細胞への分化能を維持していることが示された。
実施例４：濃度を変更した場合のY-27632による膵内胚葉細胞の拡大培養の検証
　実施例３では、50 μMのY-27632を用いることで、膵内胚葉細胞の拡大培養が可能であることが実証されたため、濃度を10 μMに減らした場合における、拡大培養への影響を検証した。結果を図５－Ａ～５－Ｃに示す。図５－Ａより、Y-27632 (10 μM)を用いた場合も、Y-27632 (50 μM)を用いた場合と同様に、40日間で１×104倍程度にまでPDX1+/NKX6.1+膵内胚葉細胞数および総細胞数が増えることが確認された。一方で、図５－Ｂおよび図５－Ｃより、Y-27632 (10 μM)を用いた場合では、KhES-3株由来の膵内胚葉細胞を５回（５週間）継代した細胞において、細胞の形態が変化（細長く楕円形になる）することが示された。
　以上より、Y-27632は、培地中の濃度が少なくとも10 μMでも拡大培養は可能であるが、細胞の品質の観点から、50 μMで用いることが好ましいことが示された。
実施例５：Y-27632による膵内胚葉細胞の拡大培養が可能となったメカニズムの検証
　Y-27632により、膵内胚葉細胞の拡大培養が可能となったメカニズムを検証した。拡大培養の継代３回目において、Y-27632を投与しなかった群では、50 μMの濃度でY-27632を投与した群に比べて、α-SMA陽性細胞が増加することが示された（図６）。すなわち、Y-27632を細胞に投与にすることで、線維化または上皮間葉転換の抑制が認められた。
　以上より、Y-27632により、膵内胚葉細胞の拡大培養が可能となった主なメカニズムは、抗アポトーシスによるものではなく、細胞の老化抑制と、それに伴う線維化または上皮間葉転換の抑制によるものであることが示唆された。
実施例６：膵内胚葉細胞の増殖を促進する試薬の探索
　Y-27632を使用した拡大培養培地では、誘導を繰り返すことにより徐々にNKX6.1陽性割合やβ様細胞への誘導効率が低下している傾向が認められた。そのため増殖因子などのタンパク質と低分子化合物を用いたスクリーニングを施行し拡大培養法の改善を試みた。
　Y-27632 (50 μM)を添加した培地を使用して、膵内胚葉細胞の継代を3回行った後に、iMatrixでコーティングした24well plateに同細胞を2.0×105細胞数/wellで播種した。Y-27632 (50 μM)を含む培地に各スクリーニング試薬を付加して培養を行った。6日後に細胞免疫染色にてNKX6.1陽性細胞の割合を調べた。その結果、ALK5阻害剤（ALK5i）とレチノイン酸受容体アゴニストを拡大培養改善候補因子として同定した（図７）。
実施例７：ALK5阻害剤（ALK5i）とレチノイン酸受容体アゴニストの検証
　Y-27632(50 μM)を用いた拡大培養法に前記候補因子二つを追加することにより、NKX6.1陽性割合を維持したまま拡大培養が長期間可能かどうかを試行した。
　膵内胚葉細胞を1週間ごとに継代を繰り返して細胞数をカウントした。同時に、その都度免疫染色を行い、NKX6.1陽性割合を調べ、それらの値から累積NKX6.1増加割合を算出した。この算出方法を、“DMSO群（Y-27632+DMSO）”と“ALK5i+RA群(Y-27632+ALK5i+RA)”の2条件で行った。その結果、ALK5iとRAを加えることにより、Y-27632単独群に比べてNKX6.1陽性割合を維持しながら増殖効率が改善した（図８）。
実施例８：β様細胞誘導効率の検証
　拡大培養された膵内胚葉細胞の機能を確認するため、拡大培養後のβ様細胞誘導効率を調べた。
　“Y-27632+DMSO”または“Y-27632+ALK5i+RA”を用いた拡大培養法にて継代を5回繰り返した膵内胚葉細胞からβ様細胞へ分化誘導を促した。そのうえで、継代を行っていない膵内胚葉細胞からβ様細胞へ誘導した細胞塊とβ様細胞への誘導効率を比較した。その結果、改善拡大培養法（“Y-27632+ALK5i+RA”）では改善前拡大培養法（“Y-27632+DMSO”）に比べて、β様細胞への誘導効率が高く、また拡大培養施行前の膵内胚葉細胞と誘導効率は同等であった（図９）。
　本発明の方法や、本発明により製造された膵内胚葉細胞またはその細胞から派生するβ様細胞をはじめとする膵内分泌細胞や膵外分泌細胞は、膵疾患（特に、1型および2型糖尿病）に対する細胞療法開発への応用、膵疾患に対する創薬スクリーニング系への応用、遺伝性膵疾患の患者由来iPS細胞を用いた膵疾患モデル作製などに応用できる。
　本出願は、日本で出願された特願２０２２－１５３０１３（出願日：２０２２年９月２６日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims (16)

  1. 　膵内胚葉細胞を、ROCK阻害剤と、KGFおよび／またはEGFとを含む培地で培養する工程を含む、膵内胚葉細胞の製造方法。
  2. 　培養を２日間以上行う、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記ROCK阻害剤がY-27632、GSK269962、GSK429286A、ファスジル塩酸塩、H1152およびチアゾビビンからなる群から選択される、請求項１または２に記載の方法。
  4. 　前記ROCK阻害剤がY-27632である、請求項１または２に記載の方法。
  5. 　培地がTGFβ阻害剤および／またはレチノイン酸受容体アゴニストを含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 　前記TGFβ阻害剤が2-[3-[6-メチルピリジン-2-イル]-1H-ピラゾール-4-イル]-1,5-ナフチリジンである、請求項５に記載の方法。
  7. 　前記レチノイン酸受容体アゴニストがレチノイン酸である、請求項５または６に記載の方法。
  8. 　前記膵内胚葉細胞が多能性幹細胞に由来する、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 　前記膵内胚葉細胞が遺伝性膵疾患の患者由来の細胞である、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 　前記培養がフィーダーフリー条件下での培養である、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 　請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法により製造された膵内胚葉細胞。
  12. 　ROCK阻害剤と、KGFおよび／またはEGFとを含む、膵内胚葉細胞拡大培養用キット。
  13. 　TGFβ阻害剤および／またはレチノイン酸受容体アゴニストを含む、請求項１２に記載のキット。
  14. 　請求項１１に記載の膵内胚葉細胞をβ様細胞またはその前駆細胞へと分化誘導させる工程を含む、β様細胞またはその前駆細胞の製造方法。
  15. 　請求項１１に記載の膵内胚葉細胞、または請求項１４に記載の方法により製造された細胞を含む、細胞移植療法剤。
  16. 　糖尿病治療のための、請求項１５に記載の剤。
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