WO2017026462A1 - 褐色脂肪細胞の調製方法 - Google Patents

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岸田　綱郎
山本　俊郎
松田　修
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    • C12N2506/1307—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from adult fibroblasts

Definitions

  • the present invention relates to brown adipocytes and a method for preparing the same.
  • the present invention also provides an agent for preventing or treating obesity, diabetes, impaired glucose tolerance, lipid metabolism, arteriosclerotic disease, hypertension, hyperuricemia, gout, nonalcoholic fatty liver disease, metabolic syndrome and use thereof About.
  • Obesity and related metabolic diseases are extremely important medical and social problems in industrialized countries.
  • white adipocytes not only store surplus energy derived from food as fatty acids, but also produce various hormones and cytokines, causing abnormal glucose tolerance and abnormal lipid metabolism, type II diabetes, arteriosclerosis Causes sexually transmitted diseases, hypertension, hyperuricemia / gout, non-alcoholic fatty liver disease, etc.
  • brown fat (Brown Adipose; ⁇ ⁇ BA) cells contrary to white fat cells, are cells that oxidatively degrade fatty acids and release their energy as heat. This is because UCP1 (Uncoupling protein 1), which is specifically expressed by BA cells, uncouples oxidative phosphorylation. In rodents such as mice, BA cells are present between the scapulae, posterior cervix, mediastinum, and renal pelvis. Moreover, BA cells are known to suppress obesity and impaired glucose tolerance from analysis of UCP1 knockout mice.
  • Brown adipocytes existed only in infancy in humans and were thought not to exist in adults. However, in 2009, brown adipocytes exist in the subcutaneous tissue of the upper clavicle and around the aorta in adults. Was clarified (Non-Patent Documents 1 to 3). There are significant individual differences in the number and function of brown adipocytes, which are inversely related to BMI (physique index) and fasting blood glucose. It is often found in lean humans, and is extremely low in patients with obesity, diabetes, and hyperlipidemia.
  • BMI biosique index
  • Brown adipocytes have important significance. Brown adipocytes are also believed to be extremely beneficial in the development of new therapeutics for these diseases. Furthermore, if patients with obesity, diabetes, hyperlipidemia, metabolic syndrome and the like can be supplemented with brown adipocytes, this may be a new therapeutic means for these diseases.
  • Non-patent Documents 4 and 5 Methods for obtaining mesenchymal stem cells and then brown adipocytes from human iPS cells are known (Non-patent Documents 4 and 5). When brown adipocytes are induced from fibroblasts via iPS cells, the final adipocytes are obtained. It takes a long time to obtain, and it is difficult to deny the risk of canceration when the obtained cells are transplanted.
  • Mouse fibroblast ⁇ chondrocytes (introduced SOX9 + Klf4 + c-Myc gene) Mouse fibroblasts ⁇ cardiomyocytes (GATA4 + Mef2c + Tbx5 gene introduced) Mouse fibroblast ⁇ hepatocyte (Hnf4 ⁇ + (Foxa1 or Foxa2 or Foxa3) gene introduced) Mouse fibroblast ⁇ neural stem cell (introduced Sox2 + FoxG1 gene, etc.), Mouse, human cell ⁇ hematopoietic stem cell.
  • PRDM16 and C / EBP ⁇ are introduced into myoblasts and fibroblasts and induced into “brown adipocyte-like cells” (Patent Document 2 and Non-Patent Document 6).
  • cells induced with PRDM16 and C / EBP ⁇ have only insufficient properties as brown adipocytes, such as very low expression levels of UCP1.
  • Patent Document 3 discloses a technique for introducing highly functional brown adipocytes by introducing C / EBP- ⁇ and c-Myc genes into human fibroblasts (Patent Document 3).
  • Patent Document 3 when brown adipocytes were induced from mouse fibroblasts and transplanted into diabetic mice, abnormal glucose tolerance, insulin resistance, dyslipidemia, and weight gain were all significantly suppressed.
  • brown fat cells derived from mouse fibroblasts and transplanted into syngeneic mice, followed by a high-fat diet almost completely eliminated diet-induced obesity, impaired glucose tolerance, insulin resistance, and dyslipidemia. (To the same level as that of a mouse fed a normal diet) could be suppressed (Patent Document 3).
  • brown adipocytes If it is possible to provide a technology to convert differentiated somatic cells into brown adipocytes without introducing genes, it is possible to provide safer, cheaper and more useful regenerative medicine for diabetes, obesity, metabolic syndrome, etc. There is sex. In addition, using the obtained brown adipocytes, it can be expected to develop drug discovery based on a new mechanism of action for these diseases.
  • the present invention provides brown adipocytes and preparation methods thereof, transplant materials containing brown adipocytes, various diseases and conditions containing brown adipocytes, and preventive or therapeutic agents for use.
  • the present invention relates to a prophylactic or therapeutic agent for obesity, diabetes, glucose tolerance abnormality, lipid metabolism abnormality, arteriosclerotic disease, hypertension, hyperuricemia, gout, nonalcoholic fatty liver disease, metabolic syndrome, prevention or treatment method It can also be said that the object is to provide a transplant material effective for the prevention or treatment of the disease or condition and a method for preparing the same.
  • an object is to provide a technique for converting somatic cells into brown adipocytes without introducing a gene.
  • the present inventor used mammalian somatic cells in a medium to (1) a TGF ⁇ / SMAD pathway inhibitor, (2) a casein kinase 1 inhibitor, (3) a cAMP inducer, and (4) a MEK / ERK pathway. It has been found that the somatic cells can be converted into brown adipocytes by culturing in the presence of at least one compound selected from the group consisting of inhibitors.
  • the present invention includes the following inventions: Item 1: Differentiated mammalian somatic cells in a medium, (1) TGF ⁇ / SMAD pathway inhibitor, (2) casein kinase 1 inhibitor, (3) culturing in the presence of at least one compound selected from the group consisting of a cAMP inducer and (4) a MEK / ERK pathway inhibitor to convert the somatic cells into brown adipocytes.
  • Item 1 Differentiated mammalian somatic cells in a medium, (1) TGF ⁇ / SMAD pathway inhibitor, (2) casein kinase 1 inhibitor, (3) culturing in the presence of at least one compound selected from the group consisting of a cAMP inducer and (4) a MEK / ERK pathway inhibitor to convert the somatic cells into brown adipocytes.
  • a method for preparing brown adipocytes A method for preparing brown adipocytes.
  • Item 2 The method according to Item 1, wherein the somatic cell is a fibroblast.
  • Item 3 The method according to Item 1 or 2, wherein the medium is an adipocyte induction medium supplemented with thyroid hormone and a PPAR ⁇ agonist.
  • TGF ⁇ / SMAD pathway inhibitor (2) casein kinase 1 inhibitor
  • An inducer for converting differentiated somatic cells into brown adipocytes comprising (3) a cAMP inducer and (4) at least one compound selected from the group consisting of MEK / ERK pathway inhibitors.
  • TGF ⁇ / SMAD pathway inhibitor (2) casein kinase 1 inhibitor
  • a kit for converting differentiated somatic cells into brown adipocytes comprising (3) a cAMP inducer, and (4) at least one compound selected from the group consisting of MEK / ERK pathway inhibitors, and a medium.
  • Item 6 The kit according to Item 5, wherein the medium is an adipocyte induction medium supplemented with thyroid hormone and a PPAR ⁇ agonist.
  • Item 7 preventive or therapeutic agent for obesity, diabetes, impaired glucose tolerance, lipid metabolism abnormality, arteriosclerotic disease, hypertension, hyperuricemia, gout, nonalcoholic fatty liver disease, metabolic syndrome,
  • a preventive or therapeutic agent comprising brown adipocytes prepared by the method according to any one of 3 to 3 as an active ingredient.
  • Item 8 Obesity, Diabetes, Glucose Tolerance, Abnormal Lipid Metabolism, Arteriosclerotic Disease, Hypertension, Hyperuricemia, Gout Using Brown Adipocytes Prepared by the Method of any of Items 1 to 3 , Use for the prevention or treatment of non-alcoholic fatty liver disease, metabolic syndrome.
  • Item 9 A transplant material comprising brown adipocytes prepared by the method according to any one of Items 1 to 8.
  • brown adipocytes can be provided in a short period from somatic cells differentiated by the action of a low molecular compound. Since these brown adipocytes can be easily derived from the somatic cells of the individual to be transplanted, problems such as immunological rejection response do not occur even when the brown adipocytes themselves or bone tissue prepared therefrom are transplanted. Moreover, since brown adipocytes can be induced directly from somatic cells without going through iPS cells or ES cells, problems caused by pluripotent stem cells such as canceration can be avoided. On the other hand, it is possible to make a bank in advance and use it for allo-transplantation and xenotransplantation to patients.
  • Magnification x200 It is a graph of the fluorescence intensity of BODIPY staining of FIG. 7A. It is a black-and-white reversal view of the BODIPY-stained image of FIG. 7A. It is a fluorescence-microscope image of the cell which immunostained UCP1. Magnification x200 It is a graph of the fluorescence intensity of UCP-1 staining in FIG. 8A. It is a black-and-white inversion figure of the UCP-1 dyeing
  • FIG. 10B is a black and white inversion diagram of the stained image of FIG. 10A.
  • Magnification x100 It is a black-and-white reversal view of the UCP-1 stained image of FIG. 14A. It is the graph which extracted RNA from the cell and quantified mRNA expression of UCP-1 gene by real-time RT-PCR. It is a fluorescence-microscope image of the cell which immunostained UCP1. Magnification x100 It is a black-and-white inversion figure of the UCP-1 dyeing
  • the present invention relates to a method for converting differentiated somatic cells of mammals into brown adipocytes.
  • brown adipocytes are prepared using somatic cells as raw materials.
  • Convert means the conversion of somatic cells into the desired brown adipocytes.
  • One of the preferred embodiments of the method of the present invention is that the somatic cells are treated with brown fat without going through the cell initialization process represented by the production of iPS cells, which is also called “direct reprogramming” or “direct conversion”. It is a method of converting into cells.
  • Brown adipocytes are one of two types of adipocytes present in mammals along with white adipocytes. As cells having similar morphology and function as brown adipocytes, cells called beige cells and brite cells are also known, and these cells are also included in “brown adipocytes” in this specification.
  • brown adipocytes As cells having similar morphology and function as brown adipocytes, cells called beige cells and brite cells are also known, and these cells are also included in “brown adipocytes” in this specification.
  • brown adipocytes can be confirmed by a known method. For example, staining with a fluorescent dye capable of detecting lipid droplets in cells and detection of a gene product (mRNA or protein) expressed in brown adipocytes can be mentioned. Examples of fluorescent dyes that can detect lipid droplets in cells include Oil Red O and BODIPY. Examples of gene products expressed in brown adipocytes include UCP-1, CIDEA, PCG-1 ⁇ , DIO2, Cox8b, Otop, and AdipoQ.
  • UCP-1 Uncoupling protein 1
  • brown adipocytes a gene that is specifically expressed in brown adipocytes, and encodes a mitochondrial inner membrane protein that uncouples oxidative phosphorylation and plays a fundamental role in brown adipocyte function. Therefore, it is one of the particularly preferable indices for brown adipocytes.
  • Somatic cells Differentiated somatic cells of the mammal to be subjected to the method of the present invention include, unless they are derived from mammals and have the ability to differentiate into brown adipocytes themselves in vivo. It is not limited.
  • somatic cells examples include fibroblasts, epithelial cells (skin epidermal cells, oral mucosal epithelial cells, airway mucosal epithelial cells, intestinal mucosal epithelial cells, etc.), epidermal cells, gingival cells (gingival fibroblasts, gingival epithelium) Cell), dental pulp cell, white fat cell, subcutaneous fat, visceral fat, muscle, blood cell, etc., preferably fibroblast, gingival cell, oral mucosal epithelial cell, pulp cell, fat cell, epidermal cell (keratinocyte) And blood cells.
  • epithelial cells skin epidermal cells, oral mucosal epithelial cells, airway mucosal epithelial cells, intestinal mucosal epithelial cells, etc.
  • epidermal cells examples include fibroblasts, epidermal cells (skin epidermal cells, oral mucosal epithelial cells, airway mucosal epithelial cells,
  • somatic stem cells such as mesenchymal stem cells (Mesenchymal stem cells: MSC), neural stem cells (Neural stem cells), hepatic stem cells (hepatic stem cells), intestinal stem cells, skin stem cells, hair follicle stem cells, pigment cell stem cells
  • MSC mesenchymal stem cells
  • neural stem cells neural stem cells
  • Neuronal stem cells hepatic stem cells
  • intestinal stem cells skin stem cells
  • pigment cell stem cells examples also include somatic cells produced by induction, dedifferentiation, or reprogramming.
  • derived to another somatic cell is also mentioned.
  • somatic cells derived from germline cells by differentiation induction, dedifferentiation, or reprogramming are also included.
  • somatic cells derived from embryonic stem cells (ES cells) or induced pluripotent stem cells (iPS cells) or induced by reprogramming are also included.
  • ES cells Although not strictly somatic cells, ES cells, iPS cells, or germline cells are also encompassed by the “somatic cells” of the present invention (in this case, “somatic cells” are referred to as “ES cells”, “IPS cells” or “germline cells”.
  • cultured cells are exemplified, and somatic cells derived from cultured cells by differentiation induction, dedifferentiation, or reprogramming are also included.
  • Mammals include mice, rats, hamsters, humans, dogs, cats, monkeys, rabbits, cows, horses, pigs, and the like.
  • the somatic cell is particularly preferably derived from a human.
  • the age of an individual from which a somatic cell is derived is not limited, and may be an adult, a child, or a fetus.
  • cells derived from fetuses and cells derived from placenta, amniotic membrane, umbilical cord and the like are also included in “somatic cells”.
  • brown adipocytes When transplanting the prepared brown adipocytes into a living body, it is preferable to use somatic cells (autologous cells) derived from the transplanted subject in order to reduce the risk of infection, rejection response, and the like.
  • brown adipocytes made from somatic cells of other people or other animals can be used for transplantation instead of autologous cells.
  • brown adipocytes can be produced from somatic cells of other persons or other animals prepared in advance and used for transplantation.
  • brown adipocytes prepared in advance from somatic cells of other people or other animals can be used for transplantation. That is, a brown adipocyte bank or a brown adipocyte precursor cell bank can be prepared and used for transplantation purposes.
  • the blood group and MHC can be typed in advance.
  • the brown adipocyte character and tumorigenicity can be confirmed in advance.
  • the medium used in the method of the present invention is not particularly limited.
  • a normal liquid medium such as DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) or EMEM (Eagle's minimal essential medium) can be used.
  • serum components Fetal Bovine Serum (FBS), Human Serum (Serum)
  • antibiotics such as streptomycin, penicillin, and components such as Non-Essential Amino Acid can be added.
  • the “differentiation induction medium for differentiating adipocytes” refers to a medium containing a component capable of differentiating pluripotent stem cells (ES cells, iPS cells, etc.) into adipocytes.
  • Examples of the differentiation-inducing medium include those obtained by adding the following components (one or two or more) to the above-described normal liquid medium (additional components may be added as necessary): Insulin (for example, a concentration of about 0.01 to 100 ⁇ g / mL, more preferably about 0.1 to 10 ⁇ g / mL); 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) (for example, a concentration of 0.01 Dexamethasone (for example, a concentration of about 0.01 to 100 ⁇ M, more preferably about 0.1 to 10 ⁇ M). Indometacin (for example, a concentration of about 0.001 to 10 mM, more preferably about 0.01 to 1 mM) may be added.
  • Insulin for example, a concentration of about 0.01 to 100 ⁇ g / mL, more preferably about 0.1 to 10 ⁇ g / mL
  • IBMX 3-isobutyl-1-methylxanthine
  • DMEM + MDI medium supplemented with 10% FBS 10% FBS-added DMEM supplemented with 0.5 m isobutylmethylxanthine (IBMX), 0.5 ⁇ dexametazone, and 1 ⁇ g / mL Insulin
  • IBMX isobutylmethylxanthine
  • 0.5 ⁇ dexametazone 0.5 ⁇ dexametazone
  • 1 ⁇ g / mL Insulin can be used as the adipocyte induction medium.
  • the present invention is not limited to this.
  • Thyroid hormones such as triiodothyronine (Triiodothyronine, T3) and thyroxine (Thyroxine, T4) from the viewpoint of high efficiency in converting adipocyte induction medium into brown adipocytes (for example, a concentration of about 0.01-100 nM, More preferably, about 0.1 to 10 nM) or Peroxisome Proliferator-Activated Receptor- ⁇ (PPAR- ⁇ ) agonist (for example, a concentration of about 0.01 to 100 ⁇ M, more preferably about 0.1 to 10 ⁇ M) is preferably added. Is more preferable.
  • PPAR- ⁇ agonists examples include thiazolidinedione compounds such as Rosiglitazone, Ciglitazone, GW1929, nTZDpa, Pioglitazone Hydrochloride, Troglitazone and the like.
  • Preferred embodiments of the medium for inducing brown adipocytes include [1] FBS 10%, 0.5 mM IBMX, 125 nM Indomethacin, 1 microM Dexamethasone, 850 nM insulin, triiodothyronine (T3), thyroxine ( Thyroxine, T4) and other thyroid hormones (eg, concentrations of about 0.01-100 nM, more preferably about 0.1-10 nM) in DMEM medium supplemented with 1 ⁇ Rosiglitazone, [2] 10% FBS, 850 nM insulin, 1 nM T3, Peroxisome A DMEM medium supplemented with a Proliferator-Activated Receptor- ⁇ (PPAR- ⁇ ) agonist (for example, a concentration of about 0.01 to 100 ⁇ M, more preferably about 0.1 to 10 ⁇ M) is exemplified. It is particularly desirable to use [1] on the first and second days and [2] on and after the third day
  • TGF- ⁇ / SMAD pathway inhibitor refers to a compound that can inhibit the activity of a protein belonging to the TGF- ⁇ / SMAD pathway.
  • the TGF- ⁇ / SMAD pathway is a signal pathway known to those skilled in the art, schematically shown in FIG.
  • TGF- ⁇ / SMAD pathway is a ligand composed of proteins belonging to the TGF- ⁇ superfamily (TGF- ⁇ 1, TGF- ⁇ 2, TGF- ⁇ 3, Activin- ⁇ A, Activin- ⁇ B, Activin- ⁇ C, Activin- ⁇ , nodal, BMP2, BMP3, BMP4, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8A, BMP8B, BMP10, BMP15, GDF1, GDF2, GDF3, GDF5, GDF6, GDF7, GDF8, GDF9, GDF10, GDF11, GDF15, AMH (MIS), etc.
  • TGF- ⁇ superfamily TGF- ⁇ 1, TGF- ⁇ 2, TGF- ⁇ 3, Activin- ⁇ A, Activin- ⁇ B, Activin- ⁇ C, Activin- ⁇ , nodal, BMP2, BMP3, BMP4, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8A, BMP8B, BMP10, BMP15, GDF1, GDF2,
  • Proteins belonging to the TGF- ⁇ type I receptor family that constitute heterodimeric receptors, proteins belonging to the TGF- ⁇ type ⁇ ⁇ II receptor family, and proteins belonging to the SMAD family of intracellular signal molecules (effectors) Especially SMAD2, SMAD3, SMAD4, SMAD1, SMAD5, or SMAD8.
  • TGF- ⁇ / SMAD pathway when a ligand binds to a dimeric receptor, the kinase-type receptor TGF- ⁇ type I receptor protein phosphorylates SMAD protein and transmits a signal downstream . Therefore, in this specification, any of TGF- ⁇ superfamily cytokine, TGF- ⁇ type I receptor family, TGF- ⁇ type II receptor family, SMAD family protein (especially SMAD2, SMAD3, SMAD4, SMAD1, SMAD5, or SMAD8) Molecules that suppress this are called TGF- ⁇ / SMAD pathway inhibitors.
  • TGF- ⁇ / SMAD pathway inhibitors are not limited to low-molecular compounds, which are inhibitors in the narrow sense, but are receptors antagonists, soluble receptors, antibodies and aptamers that have the activity of binding to and inhibiting the action of pathway proteins. , Peptides, mutant proteins that act as dominant negatives, peptides and analogs thereof, siRNAs, shRNAs, microRNAs, etc. that suppress the expression of pathway proteins.
  • ALK proteins (ALK1, ALK2, ALK3, ALK4, ALK5, ALK6 belonging to the TGF- ⁇ -type I receptor family (also called the ActivinActivreceptor like kinase (ALK) family) , ALK7) inhibitors (ALK inhibitors).
  • ALK inhibitors inhibitors of proteins belonging to the TGF- ⁇ type II receptor family (TGF- ⁇ RII (AAT3), ACTRII, ACTRIIB, BMPRII, AMHRII) are exemplified.
  • ALK5 inhibitor D4476 (4- [4- (2,3-dihydro-1,4-benzodioxin-6-yl) -5- (2-pyridinyl) 1H-imidazol-2-yl ] -benzamide), ALK5 Inhibitor II (2- (3- (6-Methylpyridin-2-yl) -1H-pyrazol-4-yl) -1,5-naphthyridine; also known as RepSox), GW788388, SD-208; ALK5 And LY2109761, LY2157299 (Galunisertiv, 4- [5,6-dihydro-2- (6-methyl-2-pyridinyl) -4H-pyrrolo [1,2-b] pyrazol, which are inhibitors of TGF- ⁇ RII (AAT3) -3-yl] -6-quinolinecarboxamide), LY364947; an inhibitor of ALK4 and ALK5, SM16 [(4- (5- (benzod
  • ALK inhibitor those having at least an inhibitory activity against ALK5 (ALK5 inhibitor) are preferable from the viewpoint of high effect. From the viewpoint that the effect is particularly high, ALK4 and ALK5, or those having specific inhibitory activity against ALK5 (among ALK proteins, those having a markedly high inhibitory activity on the protein) are preferred.
  • TGF- ⁇ / SMAD pathway inhibitor an inhibitor of SMAD protein is exemplified.
  • SMAD2 and SMAD3 located downstream of ALK5, and further inhibitors of SMAD4 are preferable.
  • the TGF- ⁇ / SMAD pathway inhibitor includes derivatives of the above compounds.
  • a derivative thereof can be used instead of D4476.
  • the derivative does not necessarily have an activity of inhibiting ALK5.
  • a derivative of D4476 represented by the following formula (I) described in WO00 / 61576 can be used:
  • R 1 is halogen, C 1-6 alkoxy (—O—C 1-6 alkyl), C 1-6 alkylthio (—S—C 1-6 alkyl), C 1-6 alkyl, —O — (CH 2 ) n —Ph, —S— (CH 2 ) n —Ph, cyano, phenyl (Ph), and CO 2 R, where R is hydrogen or C 1-6 alkyl, and n is , 0, 1, 2 or 3), which is optionally substituted with one or more substituents selected from the group consisting of naphthyl, anthracenyl, or phenyl; or R 1 is N, Phenyl fused to a 5 to 7 membered aromatic or non-aromatic ring optionally containing up to 2 heteroatoms independently selected from O and S; R 2 is H, NH (CH 2 ) n —Ph or NH—C 1-6 alkyl (where n is 0, 1, 2 or 3); R 3 is
  • C 1-6 alkyl is linear or branched alkyl having 1 to 6 carbon atoms, specifically, methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, sec-butyl, Mention may be made of tert-butyl, n-pentyl, isopentyl, n-hexyl and isohexyl.
  • C 3-7 cycloalkyl examples include cyclopropyl having 3 to 7 carbon atoms, specifically, cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl, and cycloheptyl.
  • R 1 is phenyl fused to a 5-7 membered aromatic or non-aromatic ring optionally containing up to 2 heteroatoms independently selected from N, O and S
  • Examples of such derivatives of D4476 include the following compounds: 4- [4- (4-fluorophenyl) -5- (2-pyridyl) -1-hydroxy-1H-imidazol-2-yl] benzonitrile; 4- [4- (4-fluorophenyl) -5- (2-pyridyl) -1H-imidazol-2-yl] benzonitrile; 4- [4- (4-fluorophenyl) -5- (2-pyridyl) -1H-imidazol-2-yl] benzoic acid; Methyl 4- [4- (4-fluorophenyl) -5- (2-pyridyl) -1H-imidazol-2-yl] benzoate; 4- [4- (4-fluorophenyl) -5- (2-pyridyl) -1H-imidazol-2-yl] ethyl benzoate; 4- (4-Benzo [1,3] dioxol-5-yl
  • Casein kinase inhibitors broadly encompass inhibitors for casein kinase in which subtypes such as casein kinase 1 and casein kinase 2 exist. Casein kinase inhibitors are not limited to low-molecular compounds that are inhibitors in the narrow sense, but antibodies, aptamers, peptides, mutant proteins that act as dominant negatives and their analogs, and caseins that bind to casein kinase and inhibit its action. It includes siRNA, shRNA, microRNA, etc. that suppress kinase expression.
  • a casein kinase 1 inhibitor may be mentioned as a preferred embodiment.
  • Casein kinase 1 inhibitors include compounds such as D4476, IC261, CK1-7, A3, SB-431542, DRB, hymenardicin, mataleidinol, 5-iodotuberucine, meridienine, SB-203580, and the like (casein kinase). A compound that specifically inhibits 1).).
  • casein kinase 2 inhibitors examples include CX-4945.
  • Casein kinase inhibitors also include derivatives of the above compounds.
  • cAMP inducer As a cAMP inducer (also referred to as an adenylate cyclase activator), a wide range of compounds that increase intracellular cAMP (cyclic AMP) levels through the activation of adenylate cyclase, Examples include forskolin (FSK), isoproterenol, NKH 477, PACAP 1-27, PACAP 1-38, and the like.
  • a cAMP inducer also referred to as an adenylate cyclase activator
  • cyclic AMP a wide range of compounds that increase intracellular cAMP (cyclic AMP) levels through the activation of adenylate cyclase
  • examples include forskolin (FSK), isoproterenol, NKH 477, PACAP 1-27, PACAP 1-38, and the like.
  • the cAMP inducer also includes derivatives of the above compounds.
  • MEK / ERK pathway inhibitor means a compound capable of inhibiting the functional expression of a protein belonging to the MEK / ERK pathway.
  • the MEK / ERK pathway is a signal pathway known in the art as shown in FIG.
  • MEK / ERK pathways are receptors activated by the binding of cytokines and growth factors such as EGF receptor, HER2, IGF1 receptor, VEGF receptor, Flt-3, c-kit, PDGF-R, etc.
  • Receptors Ras activated by these receptors; A-Raf, B-Raf, c-Raf, Mos, Tpl, which are activated by receiving a Ras signal;
  • Downstream transcription factors such as Elk-1, Est2, RSK, MNK, MSK, cPLA2 , CREB, Fos, globin transcription factor 1 etc.
  • MEK / ERK pathway inhibitors inhibit any of the above molecules (e.g., cytokines upstream of MEK and growth factors and their receptors, Ras, Raf, MEK1 / 2, ERK1 / 2, factors downstream of ERK, etc.) Things are included.
  • compounds (inhibitors) that inhibit the functional expression of MAPKK proteins MEK1 and MEK2 and MAPK proteins ERK1 and ERK2 are preferred, and inhibitors against MEK1 and MEK2 are particularly preferred.
  • MEK / ERK pathway inhibitors include PD0325901 (N-[(2R) -2,3-dihydroxypropoxy-3,4-difluoro-2-[(2-fluoro-4-iodophenyl) amino] -benzamide; MEK1 / 2 AS703026, AZD8330, BIX02188, BIX02189, CI-1040, Cobimetinib, GDC-0623, MEK162, PD318088, PD98059, Refametinib, RO4987655, SCH772984, Selumetinib, SL327, Trametinib, ARRY-142886, XL518, RDEA119 Etc. are exemplified.
  • MEK / ERK pathway inhibitors also include derivatives of the above compounds.
  • MEK / ERK pathway inhibitors are not limited to low-molecular compounds, which are inhibitors in the narrow sense, but are antibodies and aptamers that bind to MEK / ERK pathway proteins (eg, MEK1, MEK2, ERK1, ERK2) and inhibit their action. , Peptides, mutant proteins acting as dominant negatives and analogs thereof, siRNAs, shRNAs, microRNAs, etc. that suppress the expression of MEK / ERK pathway proteins (eg, MEK1, MEK2, ERK1, ERK2).
  • the concentration of the compound selected from the group consisting of the above (1) to (4) in the medium can be appropriately set by those skilled in the art. Usually, it is about 0.01 to 100 ⁇ M, particularly about 0.1 to 10 ⁇ M.
  • differentiated somatic cells of a mammal are cultured in a medium in the presence of at least one compound selected from the group consisting of (1) to (4).
  • Culturing can be performed in a suitable container for storing cells and media.
  • suitable culture techniques include a technique of culturing under conditions of about 37 ° C. and a carbon dioxide concentration of about 5%, but is not limited thereto. Cultivation under the above conditions can be performed using, for example, a known CO 2 incubator.
  • the at least one compound selected from the group consisting of the above (1) to (4) may be added only during a part of the whole culture period.
  • Mammalian differentiated somatic cells may be cultured in the presence of the above compound in a normal medium, and then cultured in the absence of the above compound in an induction medium.
  • the culture may be performed in the absence of the above compound in a normal medium, and then cultured in the absence of the above compound in an induction medium.
  • after culturing in the presence of the above compound in a normal medium it may be cultured in the presence of the above compound in an induction medium, and then cultured in the absence of the above compound in the induction medium.
  • it includes both the process of culturing in the presence of the above compound and culturing in an induction medium they may not be simultaneous, each of which is part of the entire culture period. It may be only.
  • the culture period is not particularly limited as long as the effects of the present invention are not impaired.
  • it may be about 24 hours to 60 days, preferably 3 to 30 days, more preferably about 10 to 20 days, and particularly preferably about 14 days.
  • the cells are cultured in the induction medium in the presence of the above compound during the whole culture period (for example, about 6 to 10 days, particularly about 8 days), and then in the absence of the above compound in the induction medium.
  • the culture medium can be used as the culture medium.
  • the culture in the presence of the compound may be from the start of the culture during the whole culture period or after the culture in the absence of the compound for a predetermined period.
  • subculture In culture, subculture can be performed as necessary. When subculture is performed, the cells are collected before or immediately after reaching the confluent state, and the cells are seeded in a new medium. In the culture of the present invention, the medium can be changed as appropriate.
  • somatic cells are converted to brown fat cells, and brown fat cells are prepared.
  • brown adipocytes were obtained can be confirmed by staining with a fluorescent dye capable of detecting the lipid droplets in the aforementioned cells and detection of gene products expressed in the brown adipocytes.
  • the brown adipocytes were obtained by staining with Oil ⁇ Red ⁇ O staining or Bodipy staining, a unique morphology with multilocular lipid droplets, UCP-1, CIDEA, KCNK3, PCG-1 ⁇ , It can be detected by expression of Cox8b, Otop, ELOVL3 gene and the like.
  • UCP-1 Uncoupling protein 1
  • UCP-1 is a gene that is specifically expressed in brown adipocytes, and encodes a mitochondrial inner membrane protein that uncouples oxidative phosphorylation and plays a fundamental role in brown adipocyte function. Therefore, it is one of the particularly preferable indices for brown adipocytes.
  • transplant material Brown adipocytes prepared by the method of the present invention can be used for the prevention or treatment of obesity, metabolic syndrome, or a disease or condition related thereto by transplanting to a living body. .
  • Target diseases include type I diabetes, type II diabetes, diabetic complications (retinopathy, peripheral neuropathy, nephropathy, macrovascular disorder, diabetic gangrene, osteoporosis, diabetic coma, etc.), impaired glucose tolerance, Insulin resistance, acidosis, ketosis, ketoacidosis, obesity, central obesity and its complications, visceral obesity syndrome, hypertension, postprandial hyperlipidemia, cerebrovascular disorder, arteriosclerosis, atherosclerosis, metabolic syndrome Dyslipidemia, hypertriglyceridemia, hypercholesterolemia, hypoHDLemia, kidney disease (diabetic nephropathy, nephrotic syndrome, etc.), arteriosclerosis, thrombotic disease, myocardial infarction, ischemic heart disease, angina Disease, heart failure, cerebrovascular disorder (cerebral infarction, stroke, etc.), peripheral blood flow disorder, sensory disturbance, hyperuricemia, gout, infection (respiratory infection, urinary tract infection, gastrointestinal infection, Skin infection
  • Brown adipocytes can also be used for cosmetic purposes to remove fat such as around the abdomen, jaw, and thighs. Brown adipocytes can also be used as a transplant material for cosmetic treatments introduced into the breast or the like.
  • brown adipocytes reduces fat mass, especially white fat cells such as visceral fat and subcutaneous fat, and also suppresses weight gain when a high-calorie diet is consumed, so obesity, metabolic syndrome, or these It is useful in both prevention and treatment of related diseases or conditions.
  • the present invention is not limited to prevention or treatment of diseases, but can also be used for purposes such as health promotion and beauty (for example, removal of visceral fat and subcutaneous fat such as abdomen, jaw, arm, and thigh).
  • treatment for humans is also referred to as treatment in this specification for convenience, and “patient” can be read as “healthy person” or “human”, and “disease” can be read as “health promotion” or “beauty”.
  • the present invention can also be used for treating diseases of domestic animals such as pets such as dogs and cats and cattle, horses, pigs, sheep and chickens as well as humans.
  • pets such as dogs and cats and cattle, horses, pigs, sheep and chickens
  • patient or “human” is read as “patient” or “animal”.
  • Transplant material refers to a material for introducing brown adipocytes into a living body. Brown adipocytes can also be used as a transplant material for cosmetic treatments introduced into the breast or the like.
  • the transplant material includes a material that is converted from somatic cells to brown adipocytes in vitro and then transplanted to the same or another individual.
  • brown adipocytes using the obtained brown adipocytes, diabetes (particularly type II diabetes), impaired glucose tolerance, abnormal lipid metabolism, arteriosclerotic disease, hypertension, hyperuricemia, gout, non-alcoholic fatty liver disease, etc.
  • Drug development based on a new mechanism of action can be performed.
  • ALK5 Inhibitor II may be described as “ALK5 Inhibitor”, “ALK5IH”, or “ALK5i” in the present specification and drawings.
  • Example 1 Human dermal fibroblasts (HDFs) were suspended in a normal medium (Dulbecco's modified minimum essential medium (DMEM) supplemented with 10% FBS). This was seeded on a 24-well plate at a concentration of 1 ⁇ 10 4 cells / well (day 0), and culture was started at 37 ° C. with 5% CO 2 /95% humidified air. On the next day, the culture supernatant was removed by aspiration, and 500 ⁇ L / well of a normal medium, an adipocyte induction medium, or an adipocyte induction medium supplemented with a compound or the like was added as shown in the figure.
  • DMEM Dulbecco's modified minimum essential medium
  • the adipocyte induction medium is 10% FBS-added DMEM + MDI medium (0.5% mM Isobutylmethylxanthine (IBMX), 0.5 ⁇ M dexamethason, and 1% ⁇ g / mL Insulin added 10% FBS-added DMEM).
  • the additive concentrations are as follows: T3: 1 nM Rosiglitazone: 1 ⁇ M D4476: 2 ⁇ M Pifithrin alpha [p53 inhibitor]: 5 ⁇ M SB431542: 2 ⁇ M ALK5 Inhibitor II: 2 ⁇ M.
  • Example 2 Human dermal fibroblasts (HDFs) were suspended in a normal medium (Dulbecco's modified minimum essential medium (DMEM) supplemented with 10% FBS). This was seeded on a 24-well plate at a concentration of 1 ⁇ 10 4 cells / well (day 0), and culture was started at 37 ° C. with 5% CO 2 /95% humid air. On the next day, the culture supernatant was removed by aspiration, and 500 ⁇ L / well of a normal medium, an adipocyte induction medium, or an adipocyte induction medium supplemented with each small molecule compound or the like was added as shown in the figure.
  • DMEM Dulbecco's modified minimum essential medium
  • the adipocyte induction medium is 10% FBS-added DMEM + MDI medium (0.5% mM Isobutylmethylxanthine (IBMX), 0.5 ⁇ M dexamethason, and 1% ⁇ g / mL Insulin added 10% FBS-added DMEM).
  • the additive concentrations are as follows: T3: 1 nM Rosiglitazone: 1 ⁇ M D4476: 2 ⁇ M Pifithrin alpha [p53 inhibitor]: 5 ⁇ M Forskolin (FSK): 2 ⁇ M PD0325901: 1 ⁇ M SB431542: 2 ⁇ M.
  • RNA was extracted from the cells using ISOGEN II. From this RNA, cDNA was synthesized using Rever Tra Ace qPCR RT Master Mix. Real-time PCR Master Mix, primers specific to the UCP1 gene or ⁇ -actin gene, and Taqman probe were mixed with this cDNA. QRT-PCR (quantitative RT-PCR) was performed using AB7300 Real-time PCR system. The mRNA level of UCP1 gene was quantified as a ratio to ⁇ -actin gene mRNA, and the value of fibroblasts cultured in a normal medium was calculated as 1.
  • FIG. In addition to T3 and Rosiglitazone, it can be seen that fibroblasts were induced in brown adipocytes expressing the mRNA of the UCP1 gene by adding and culturing any of D4476, FSK, PD0325901 or SB431542. Furthermore, it can be seen that the co-addition of D4476 and FSK resulted in the conversion to cells that most strongly express UCP1.
  • Example 3 The same experiment as in Example 2 was performed. Cells cultured in a normal medium, cells cultured in an adipocyte induction medium supplemented with T3 and Rosiglitazone for 14 days, and adipocyte induction medium supplemented with T3, Rosiglitazone and D4476 for 14 days. Cultured cells were prepared. To these cells, 10 ⁇ M Isoproterenol or FSK was added as described in the figure. A group without addition as a control was also made. After 5 hours, the culture medium was aspirated and removed from each well, washed with PBS ( ⁇ ), and total RNA was extracted from the cells with ISOGEN II. QRT-PCR was performed in the same manner as in Example 2. The mRNA level of UCP1 gene was quantified as a ratio to ⁇ -actin gene mRNA, and the value of fibroblasts cultured in a normal medium was calculated as 1.
  • Example 4 Human dermal fibroblasts (HDFs) were suspended in a normal medium (Dulbecco's modified minimum essential medium (DMEM) supplemented with 10% FBS). This was seeded on a 24-well plate at a concentration of 1 ⁇ 10 4 cells / well (day 0), and culture was started at 37 ° C. with 5% CO 2 /95% humid air. On the next day, the culture supernatant was removed by aspiration, and 500 ⁇ L / well of a normal medium, an adipocyte induction medium, or an adipocyte induction medium to which each compound was added as shown in the figure.
  • DMEM Dulbecco's modified minimum essential medium
  • the adipocyte induction medium is 10% FBS-added DMEM + MDI medium (0.5% mM Isobutylmethylxanthine (IBMX), 0.5 ⁇ M dexamethason, and 1% ⁇ g / mL Insulin added 10% FBS-added DMEM).
  • the additive concentrations are as follows: T3: 1 nM Rosiglitazone: 1 ⁇ M D4476: 2 ⁇ M Pifithrin alpha [p53 inhibitor]: 5 ⁇ M SB431542: 2 ⁇ M ALK5 Inhibitor II: 2 ⁇ M.
  • RNA was extracted from the cells with ISOGEN II. From this RNA, cDNA was synthesized using Rever Tra Ace qPCR RT Master Mix. Real-time PCR Master Mix, primers specific to CIDEA gene or ⁇ -actin gene, and Taqman probe were mixed with this cDNA. QRT-PCR was performed using AB7300 Real-time PCR system. The mRNA level of CIDEA gene was quantified as a ratio to ⁇ -actin gene mRNA, and the value of fibroblasts cultured in a normal medium was calculated as 1.
  • Example 5 Human dermal fibroblasts (HDFs) were suspended in a normal medium (Dulbecco's modified minimum essential medium (DMEM) supplemented with 10% FBS). This was seeded on a 24-well plate at a concentration of 1 ⁇ 10 4 cells / well (day 0), and culture was started at 37 ° C. with 5% CO 2 /95% humid air. On the next day, the culture supernatant was removed by aspiration, and 500 ⁇ L / well of a normal medium, an adipocyte induction medium, or an adipocyte induction medium supplemented with each compound and the like was added as shown in the figure.
  • DMEM Dulbecco's modified minimum essential medium
  • the adipocyte induction medium is 10% FBS-added DMEM + MDI medium (0.5% mM Isobutylmethylxanthine (IBMX), 0.5 ⁇ M dexamethason, and 1% ⁇ g / mL Insulin added 10% FBS-added DMEM).
  • the additive concentrations are as follows: T3: 1 nM Rosiglitazone: 1 ⁇ M Pifithrin alpha [p53 inhibitor]: 5 ⁇ M Forskolin (FSK): 2 ⁇ M PD0325901: 1 ⁇ M.
  • RNA was extracted from the cells using ISOGEN II. From this RNA, cDNA was synthesized using Rever Tra Ace qPCR RT Master Mix. Real-time PCR Master Mix, and primer specific to PGC-1alpha or ⁇ -actin gene and Taqman pobe were mixed with this cDNA. QRT-PCR was performed using AB7300 Real-time PCR system. The mRNA level of the PGC-1alpha gene was quantified as a ratio to ⁇ -actin gene mRNA, and the value of fibroblasts cultured in a normal medium was calculated as 1.
  • Example 6 Human dermal fibroblasts (HDFs) were suspended in a normal medium (Dulbecco's modified minimum essential medium (DMEM) supplemented with 10% FBS). This was seeded on a 24-well plate at a concentration of 1 ⁇ 10 4 cells / well (day 0), and culture was started at 37 ° C. with 5% CO 2 /95% humid air. On the next day, the culture supernatant was removed by aspiration, and 500 ⁇ L / well of a normal medium, an adipocyte induction medium, or an adipocyte induction medium supplemented with each small molecule compound or the like was added as shown in the figure.
  • DMEM Dulbecco's modified minimum essential medium
  • the adipocyte induction medium is 10% FBS-added DMEM + MDI medium (0.5% mM Isobutylmethylxanthine (IBMX), 0.5 ⁇ M dexamethason, and 1% ⁇ g / mL Insulin added 10% FBS-added DMEM).
  • the additive concentrations are as follows: T3: 1 nM Rosiglitazone: 1 ⁇ M D4476: 2 ⁇ M.
  • RNA was extracted from the cells using ISOGEN II. From this RNA, cDNA was synthesized using Rever Tra Ace qPCR RT Master Mix. Real-time PCR Master Mix and primers specific to AdipoQ or ⁇ -actin gene and Taqman pobe were mixed with this cDNA. QRT-PCR was performed using AB7300 Real-time PCR system. The mRNA level of AdipoQ gene was quantified as a ratio to ⁇ -actin gene mRNA, and the value of fibroblasts cultured in a normal medium was calculated as 1.
  • fibroblasts were converted to brown adipocytes expressing the mRNA of the AdipoQ gene by adding and culturing either D4476, PD0325901, SB431542 or ALK5KInhibitor II.
  • Example 7 Human dermal fibroblasts (HDFs) were suspended in a normal medium (Dulbecco's modified minimum essential medium (DMEM) supplemented with 10% FBS). This was seeded on a 24-well plate at a concentration of 1 ⁇ 10 4 cells / well (day 0), and culture was started at 37 ° C. with 5% CO 2 /95% humidified air. On the next day, the culture supernatant was removed by aspiration, and 500 ⁇ L / well of a normal medium, an adipocyte induction medium, or an adipocyte induction medium supplemented with each small molecule compound or the like was added as shown in the figure.
  • DMEM Dulbecco's modified minimum essential medium
  • the adipocyte induction medium is 10% FBS-added DMEM + MDI medium (0.5% mM Isobutylmethylxanthine (IBMX), 0.5 ⁇ M dexamethason, and 1% ⁇ g / mL Insulin added 10% FBS-added DMEM).
  • the additive concentrations are as follows: T3: 1 nM Rosiglitazone: 1 ⁇ M D4476: 2 ⁇ M SB431541: 2 ⁇ M ALK5 inhibitor II: 2 ⁇ M.
  • the culture solution was aspirated and removed from each well and washed with PBS ( ⁇ ). Thereafter, the cells were fixed with 4% paraformaldehyde, washed with PBS ( ⁇ ), reacted with BODIPY 493/503 (Invitrogen) / PBS solution at room temperature for 5 minutes, and washed with PBS three times. Photographs were taken at a magnification of 200 times using a fluorescence microscope, and the fluorescence intensity was measured.
  • FIG. 7A fluorescence microscope image
  • FIG. 7B fluorescence intensity
  • Example 8 Human dermal fibroblasts (HDFs) were suspended in a normal medium (Dulbecco's modified minimum essential medium (DMEM) supplemented with 10% FBS). This was seeded on a 24-well plate at a concentration of 1 ⁇ 10 4 cells / well (day 0), and culture was started at 37 ° C. with 5% CO 2 /95% humidified air. On the next day, the culture supernatant was removed by aspiration, and 500 ⁇ L / well of a normal medium, an adipocyte induction medium, or an adipocyte induction medium supplemented with each compound and the like was added as shown in the figure.
  • DMEM Dulbecco's modified minimum essential medium
  • the adipocyte induction medium is 10% FBS-added DMEM + MDI medium (0.5% mM Isobutylmethylxanthine (IBMX), 0.5 ⁇ M dexamethason, and 1% ⁇ g / mL Insulin added 10% FBS-added DMEM).
  • the additive concentrations are as follows: T3: 1 nM Rosiglitazone: 1 ⁇ M D4476: 2 ⁇ M SB431541: 2 ⁇ M ALK5 inhibitor II: 2 ⁇ M PD0325901: 1 ⁇ M Forskolin (FSK): 2 ⁇ M.
  • Anti-USP-1 antibody was added and reacted at room temperature for 2 hours, followed by washing 3 times with Wash buffer.
  • Alexa 546-conjugated anti-mouse Ig antibody was added and reacted at room temperature for 1 hour, followed by washing 5 times with Wash ⁇ ⁇ buffer.
  • Photographs were taken at a magnification of 200 times using a fluorescence microscope, and the fluorescence intensity was measured.
  • FIGS. 8A and 8C fluorescence microscope image
  • FIG. 8B fluorescence intensity
  • fibroblasts were induced in brown adipocytes expressing UCP1 protein by culturing with either D4476, SB431541, ALK5 inhibitor II, PD0325901, or Forskolin (FSK). Recognize. It can also be seen that the expression of UCP-1 protein is increased by culture with addition of PD0325901 or Forskolin.
  • D4476 and Forskolin were co-added, and it was found that fibroblasts were converted to brown adipocytes that expressed UCP1 protein more strongly.
  • Example 9 Human dermal fibroblasts (HDFs) were suspended in a normal medium (Dulbecco's modified minimum essential medium (DMEM) supplemented with 10% FBS). This was seeded on a 24-well plate at a concentration of 1 ⁇ 10 4 cells / well (day 0), and culture was started at 37 ° C. with 5% CO 2 /95% humidified air. On the next day, the culture supernatant was removed by aspiration, and 500 ⁇ L / well of a normal medium, an adipocyte induction medium, or an adipocyte induction medium supplemented with each small molecule compound or the like was added as shown in the figure.
  • DMEM Dulbecco's modified minimum essential medium
  • the adipocyte induction medium is 10% FBS-added DMEM + MDI medium (0.5% mM Isobutylmethylxanthine (IBMX), 0.5 ⁇ M dexamethason, and 1% ⁇ g / mL Insulin added 10% FBS-added DMEM).
  • the additive concentrations are as follows: T3: 1 nM Rosiglitazone: 1 ⁇ M D4476: 2 ⁇ M.
  • Example 10 Human dermal fibroblasts (HDFs) were suspended in a normal medium (Dulbecco's modified minimum essential medium (DMEM) supplemented with 10% FBS). This was seeded on a 24-well plate at a concentration of 1 ⁇ 10 ⁇ 4 cells / well (day 0), and cultivation was started at 37 ° C. with 5% CO 2/95% humidified air. On the next day, the culture supernatant was removed by aspiration, and 500 ⁇ L / well of a normal medium, an adipocyte induction medium, or an adipocyte induction medium supplemented with each small molecule compound or the like was added as shown in the figure.
  • DMEM Dulbecco's modified minimum essential medium
  • the adipocyte induction medium is 10% FBS-added DMEM + MDI medium (0.5% mM Isobutylmethylxanthine (IBMX), 0.5 ⁇ M dexamethason, and 1% ⁇ g / mL Insulin added 10% FBS-added DMEM).
  • the additive concentrations are as follows: T3: 1 nM Rosiglitazone: 1 ⁇ M D4476: 2 ⁇ M.
  • Anti-USP-1 antibody was added and reacted at room temperature for 2 hours, followed by washing 3 times with Wash buffer.
  • Alexa 546-conjugated anti-mouse Ig antibody was added and reacted at room temperature for 1 hour, followed by washing 5 times with Wash ⁇ ⁇ buffer. Thereafter, the reaction was carried out at room temperature for 5 minutes with a BODIPY 493/503 (Invitrogen) / PBS solution, washed 3 times with PBS, and stained with DAPI. Photographs were taken at a magnification of 200 using a fluorescence microscope.
  • FIGS. 10A and 10B The results are shown in FIGS. 10A and 10B.
  • fibroblasts were converted to lipid droplets stained with Bodipy and brown adipocytes expressing UCP1 protein by culturing with addition of D4476.
  • Example 13 Human normal dermal fibroblasts (HDFs) were suspended in a normal medium (Dulbecco's modified minimum essential medium (DMEM) supplemented with 10% FBS). This was seeded on a 12-well plate at a concentration of 3 ⁇ 10 4 cells / well, and culture was started at 37 ° C. with 5% CO 2/95% humidified air. The next day (Day 0), the culture supernatant is aspirated and removed, and normal medium (Group 1), adipocyte induction medium (Group 2), or adipocyte induction medium (Group 3) supplemented with ALK5 inhibitor II at a concentration of 4 ⁇ M. ⁇ 8) was added at 1 mL / well.
  • DMEM Dulbecco's modified minimum essential medium
  • the adipocyte induction medium is DMEM supplemented with 1 nM T3, 1 ⁇ M Rosiglitazone, 0.5 mM Misobutylmethylxanthine (IBMX), 0.5 ⁇ M dexamethason, 1 ⁇ g / mL Insulin and 10% FBS.
  • the medium was replaced with fresh one once every 2 days.
  • Groups 3-7 were cultured in adipocyte induction medium supplemented with ALK5 inhibitor II only during Days 0-2, Days 0-4, Days 0-6, Days 0-8, Days 0-10, respectively.
  • the cells were cultured in an adipocyte induction medium without adding ALK5 inhibitor II.
  • Group 8 was cultured in an adipocyte induction medium supplemented with ALK5 inhibitor II during the entire period from Days 0 to 14. On Day 14, the medium was aspirated and removed from each well, washed with PBS ( ⁇ ), and total RNA was extracted from the cells using Qiagen RNA-easy Mini Kit.
  • RNA was synthesized using Rever, Tra, Ace, qPCR, RT, Master, and Mix. Real-time PCR Master Mix, and primers specific to UCP-1 gene or ⁇ -actin gene and Taqman probe were mixed with this cDNA. QRT-PCR was performed using AB7300 Real-time PCR system. The mRNA U level of the UCP1 gene was quantified as a ratio to the ⁇ actin gene mRNA level, and the value of fibroblasts cultured in a normal medium was calculated as 1.
  • fibroblasts were induced into brown adipocytes that strongly expressed the UCP1 gene by culturing with addition of ALK5 inhibitor II in an adipocyte induction medium.
  • the expression of the UCP1 gene was the highest in the group (group 6) that was added with ALK5 inhibitor II for 0-8 days and then cultured for 6 days in adipocyte induction medium without ALK5 inhibitor II. It turns out that it induces in brown fat cells.
  • High expression of the UCP1 gene was also induced under other conditions (groups 3 to 5, 7, and 8) in which culture was performed in the presence of ALK5 inhibitor II.
  • Example 14 Human normal dermal fibroblasts (HDFs) were suspended in a normal medium (Dulbecco's modified minimum essential medium (DMEM) supplemented with 10% FBS). This was seeded on a 12-well plate at a concentration of 3 ⁇ 10 4 cells / well, and culture was started at 37 ° C. with 5% CO 2/95% humidified air. On the next day (Day 0), the culture supernatant is removed by aspiration, and normal medium (Group 1), adipocyte induction medium (Group 2), or adipocyte induction medium (Group 3 to 3) supplemented with ALK5 inhibitor II at a concentration of 4 ⁇ M 8) was added at 1 mL / well.
  • DMEM Dulbecco's modified minimum essential medium
  • the adipocyte induction medium is DMEM supplemented with 1 nM T3, 1 ⁇ M Rosiglitazone, 0.5 mM Misobutylmethylxanthine (IBMX), 0.5 ⁇ M dexamethason, 1 ⁇ g / mL Insulin and 10% FBS.
  • the medium was replaced with fresh one once every 2 days.
  • Groups 3-7 were cultured in adipocyte induction medium supplemented with ALK5 inhibitor II only during Days 0-2, Days 0-4, Days 0-6, Days 0-8, Days 0-10, respectively.
  • Group 8 was cultured in an adipocyte induction medium supplemented with ALK5 inhibitor II during the entire period from Days 0 to 14. The culture medium was aspirated and removed from each well on day 14 and washed with PBS ( ⁇ ), and then the culture medium was aspirated and removed from each well on day 14 and washed with PBS ( ⁇ ).
  • FIGS. 14A and 14B fluorescence microscope images.
  • ALK5 ⁇ inhibitor ⁇ II was added for 0-8 days and then cultured in an adipocyte induction medium not containing ALK5 inhibitor II
  • # UCP1 protein staining intensity was high and staining positive
  • fibroblasts are most strongly induced in brown adipocytes. High expression of UCP1 protein was also detected under other conditions (# 2 to 5, 7, and 8 in the figure) in which culture was performed in the presence of ALK5 inhibitor II.
  • Example 15 Human dermal fibroblasts (HDFs) were suspended in normal medium (Dulbecco's modified minimum essential medium (DMEM) supplemented with 10% FBS). This was seeded on a 12-well plate at a concentration of 3 ⁇ 10 4 cells / well, and culture was started at 37 ° C. with 5% CO 2/95% humidified air (Day -1). In the control (Ctrl) group, the culture supernatant was aspirated and removed on the next day (Day 0), and the culture medium was cultured in a normal medium until Day 14 while replacing the medium with a fresh one every two days.
  • DMEM Dulbecco's modified minimum essential medium
  • the culture supernatant was aspirated and removed on Day 0, and either 4 ⁇ M, 8 ⁇ M, or 12 of the adipocyte induction medium or any of the compounds of ALK5 inhibitor II, SB431542, LY2157299, and D4476 was used. 1 mL / well of adipocyte induction medium added at a concentration of ⁇ M or 16 ⁇ M was added.
  • the adipocyte induction medium is DMEM supplemented with 1 nM T3, 1 ⁇ M Rosiglitazone, 0.5 mM Misobutylmethylxanthine (IBMX), 0.5 ⁇ M dexamethason, 1 ⁇ g / mL Insulin and 10% FBS.
  • the culture medium was replaced with fresh one once every 2 days and cultured until Day 9. Thereafter, Day 9 to Day 14 were cultured in an adipocyte induction medium not containing any of ALK5 inhibitor II, SB431542, LY215799, and D4476. On Day 14, the medium was aspirated and removed from all groups of wells, washed with PBS ( ⁇ ), and total RNA was extracted from the cells using Qiagen RNAase Easy Mini Kit. From this RNA, cDNA was synthesized using Rever, Tra, Ace, qPCR, RT, Master, and Mix. Real-time PCR Master Mix, and primers specific to UCP-1 gene or ⁇ -actin gene and Taqman probe were mixed with this cDNA.
  • QRT-PCR was performed using AB7300 Real-time PCR system.
  • the mRNA U level of the UCP1 gene was quantified as a ratio to the ⁇ actin gene mRNA level, and the value of fibroblasts cultured in a normal medium was calculated as 1.
  • Example 16 Human dermal fibroblasts (HDFs) were suspended in normal medium (Dulbecco's modified minimum essential medium (DMEM) supplemented with 10% FBS). This was seeded on a 12-well plate at a concentration of 3 ⁇ 10 4 cells / well, and culture was started at 37 ° C. with 5% CO 2/95% humidified air. The next day (Day 0), the culture supernatant is aspirated and adipocyte induction is added with any of the compounds ALK5 inhibitor II (4 ⁇ M), LY2157299 (8 ⁇ M), SB431542 (4 ⁇ M) and D4476 (4 ⁇ M) The medium was added at 1 mL / well.
  • DMEM Dulbecco's modified minimum essential medium
  • the adipocyte induction medium is DMEM supplemented with 1 nM T3, 1 ⁇ M Rosiglitazone, 0.5 mM isobutylmethylxanthine (IBMX), 0.5 ⁇ M dexamethason, 1 ⁇ g / mL Insulin and 10% FBS.
  • IBMX isobutylmethylxanthine
  • dexamethason 1 ⁇ g / mL Insulin
  • FBS fetal bovine serum
  • FIGS. 16A and 16B fluorescence microscope images. It can be seen that by adding and culturing any one of ALK5 inhibitor II, LY2157299, SB431541, and D4476, the fibroblasts were induced into brown adipocytes expressing UCP1 protein. In particular, AKL5 inhibitor II induces UCP1 gene expression most strongly, followed by LY2157299.
  • Example 17 Human dermal fibroblasts (HDFs) were suspended in normal medium (Dulbecco's modified minimum essential medium (DMEM) supplemented with 10% FBS). This was seeded on a 12-well plate at a concentration of 3 ⁇ 10 4 cells / well, and culture was started at 37 ° C. with 5% CO 2/95% humidified air (Day -1). In the control (Ctrl) group, the culture supernatant was aspirated and removed on the next day (Day 0), and the culture medium was cultured in a normal medium until Day 14 while replacing the medium with a fresh one every two days.
  • DMEM Dulbecco's modified minimum essential medium
  • the adipocyte induction medium is DMEM supplemented with 1 nM T3, 1 ⁇ M Rosiglitazone, 0.5 mM isobutylmethylxanthine (IBMX), 0.5 ⁇ M dexamethason, 1 ⁇ g / mL Insulin and 10% FBS.
  • IBMX isobutylmethylxanthine
  • dexamethason 1 ⁇ g / mL Insulin
  • FBS fetal bovine serum
  • RNA was synthesized using Rever Tra Ace qPCR RT Master Mix. This cDNA was mixed with Real-time PCR Master Mix, primers specific to UCP-1 gene, CIDEA gene, KCNK3 gene or ⁇ -actin gene and Taqman probe. QRT-PCR was performed using AB7300 Real-time PCR system. The mRNA level of UCP1 gene was quantified as a ratio to ⁇ -actin gene mRNA, and the value of fibroblasts cultured in a normal medium was calculated as 1.
  • fibroblasts were induced in brown adipocytes expressing UCP1 gene, CIDEA gene and KCNK3 gene by adding and culturing either ALK5LKinhibitor II or LY2157299 for 8 days.
  • AKL5 inhibitor II more strongly induced the expression of UCP1 gene.

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Abstract

本発明は、褐色脂肪細胞及びその調製方法、褐色脂肪細胞を含む移植材料、褐色脂肪細胞を含む各種疾患、状態の予防剤又は治療剤、使用を提供することを課題とする。斯かる課題を解決する手段として、哺乳動物の分化した体細胞を培地中、（１）TGFβ/SMADパスウェイ阻害剤、（２）カゼインキナーゼ１阻害剤、（３）cAMP誘導剤、及び（４）MEK/ERKパスウェイ阻害剤からなる群から選択される少なくとも１種の化合物の存在下に培養して前記体細胞を褐色脂肪細胞に変換することを特徴とする、褐色脂肪細胞を調製する方法を提供する。

Description

褐色脂肪細胞の調製方法
　［関連出願の相互参照］
　本出願は、２０１５年８月７日に出願された、日本国特許出願第2015-157697号明細書（その開示全体が参照により本明細書中に援用される）に基づく優先権を主張する。
　本発明は、褐色脂肪細胞及びその調製方法に関する。また、本発明は、肥満、糖尿病、耐糖能異常、脂質代謝異常、動脈硬化性疾患、高血圧、高尿酸血症、痛風、非アルコール性脂肪性肝疾患、メタボリックシンドロームの予防又は治療剤およびその使用に関する。
　肥満とこれに関連する代謝疾患、例えば糖尿病、メタボリックシンドロームなどは、先進工業国において、極めて大きな医療、社会上の問題になっている。肥満症においては、白色脂肪細胞が、食物由来の余剰エネルギーを脂肪酸として貯蔵するのみならず、さまざまなホルモンやサイトカインを産生して耐糖能異常、脂質代謝異常を惹起し、II型糖尿病、動脈硬化性疾患、高血圧、高尿酸血症・痛風、非アルコール性脂肪性肝疾患等をもたらす。
　一方、褐色脂肪（Brown Adipose; BA）細胞は、白色脂肪細胞とは逆に、脂肪酸を酸化分解してそのエネルギーを熱として放出する細胞である。これは、BA細胞が特異的に発現するミトコンドリア内膜蛋白、UCP1（Uncoupling protein 1）が、酸化的リン酸化を脱共役させるためである。マウスなどげっ歯類では、BA細胞は肩甲骨間、後頚部、縦隔, 腎周囲等に存在する。また、UCP1ノックアウトマウスの解析等から、BA細胞は肥満と耐糖能異常を抑制することが知られている。
　褐色脂肪細胞は、ヒトでは乳児期にのみ存在し、成人では存在しないと考えられてきたが、2009年になって、成人でも鎖骨上部の皮下組織、大動脈周囲等に褐色脂肪細胞が存在することが明らかにされた（非特許文献１～３）。褐色脂肪細胞の数と機能には大きな個人差があり、BMI（体格指数）と空腹時血糖に逆相関する。やせ型のヒトでは多く、肥満、糖尿病、高脂血症の患者では極端に低下している。したがって、肥満、糖尿病、高脂血症等の疾患の遺伝的素因を解析し、環境要因を探索し、病態を解明し、あるいは新しい診断法や治療効果の判定等の技術を開発する上で、褐色脂肪細胞は重要な意義を持つ。褐色脂肪細胞はまた、これら疾患に対する新しい治療薬の開発にも極めて有益であると考えられる。さらに肥満、糖尿病、高脂血症、メタボリック症候群等の患者に褐色脂肪細胞を補充することができれば、これら疾患に対する新しい治療手段となる可能性がある。
　ヒトiPS細胞から間葉系幹細胞、次いで褐色脂肪細胞を得る方法は知られているが(非特許文献４、５)、線維芽細胞からiPS細胞を経て褐色脂肪細胞を誘導すると、最終の脂肪細胞を得るまでに時間がかかり、また得られた細胞を移植した際に、癌化する危険性を否定しにくい。
　体細胞のダイレクト・コンヴァージョンに関し、例えば以下の報告がある：
マウス線維芽細胞→軟骨細胞（SOX9 ＋ Klf4 ＋c-Myc遺伝子を導入）
マウス線維芽細胞→心筋細胞（GATA4 ＋ Mef2c ＋Tbx5遺伝子を導入）
マウス線維芽細胞→肝細胞（Hnf4α＋（Foxa1またはFoxa2またはFoxa3）遺伝子を導入）
マウス線維芽細胞→神経幹細胞（Sox2 ＋ FoxG1遺伝子を導入など）、
マウス、ヒト細胞→造血幹細胞。
　これまで、PRDM16とC/EBPβを筋芽細胞や線維芽細胞に遺伝子導入し、「褐色脂肪細胞様の細胞」に誘導することは知られている（特許文献２および非特許文献６）。しかし、PRDM16とC/EBPβで誘導した細胞は、UCP1の発現レベルが非常に低いなど、褐色脂肪細胞としての性質は不十分にしか有さない。
　特許文献３には、ヒト線維芽細胞にC/EBP-βとc-Myc遺伝子を導入して、高機能な褐色脂肪細胞を誘導する技術が開示されている（特許文献３）。特許文献３において、褐色脂肪細胞をマウスの線維芽細胞から誘導して糖尿病マウスに移植したところ、耐糖能異常、インスリン抵抗性、脂質異常症、体重増加がいずれも顕著に抑制できた。さらに、褐色脂肪細胞をマウスの線維芽細胞から誘導して同系マウスに移植した後、高脂肪食を与えると、食餌誘導性の肥満、耐糖能異常、インスリン抵抗性、脂質異常症がほぼ完全に（通常食を与えたマウスと同レベルまで）抑制できた（特許文献３）。
　しかし、これらのように遺伝子を導入して褐色脂肪細胞を誘導する技術では、得られた褐色脂肪細胞を移植した後に移植した細胞が癌化する等の危険性を否定しにくかった。また誘導技術が煩雑であり、安全性の確保と検証のために高い経費を要した。
　もし、遺伝子導入を行うことなく、分化した体細胞を褐色脂肪細胞にコンヴァージョンする技術を提供できれば、より安全で安価で有用性の高い、糖尿病、肥満、メタボリック症候群等に対する再生医療を提供できる可能性がある。また、得られた褐色脂肪細胞を用いれば、これら疾患に対する新しい作用機序に基づく創薬開発等を行うことが期待できる。
WO2010/071210 WO2010/080985A8 WO2014010746 A1
Saito M. et al., Diabetes 58:1526, 2009 Cypess A. M. et al., N Eng J Med 360: 1509, 2009 Van Merken Lichtenbelt W. D. et al., N Engl J Med 360: 1500, 2009 Tim Ahfeldt et al., Nature Cell Biology Vol.14, No.2, 2012 Nishio et al., Cell Metabolism, 16, 394, 2012 Kajimura S, et al. Nature 460: 1154, 2009 Callahan JF, et al., J Med Chem 45: 999, 2002
　本発明は、褐色脂肪細胞及びその調製方法、褐色脂肪細胞を含む移植材料、褐色脂肪細胞を含む各種疾患、状態の予防剤又は治療剤、使用を提供するものである。
　本発明は、肥満、糖尿病、耐糖能異常、脂質代謝異常、動脈硬化性疾患、高血圧、高尿酸血症、痛風、非アルコール性脂肪性肝疾患、メタボリックシンドロームの予防又は治療剤、予防又は治療方法、該疾患又は状態の予防又は治療に有効な移植材料及びその調製方法を提供することを目的とするとも言える。
　具体的には、遺伝子導入を行うことなく、体細胞を褐色脂肪細胞にコンヴァージョンする技術を提供することを目的とする。
　本発明者は、哺乳動物の分化した体細胞を培地中、（１）TGFβ/SMADパスウェイ阻害剤、（２）カゼインキナーゼ１阻害剤、（３）cAMP誘導剤、及び（４）MEK/ERKパスウェイ阻害剤からなる群から選択される少なくとも１種の化合物の存在下に培養して前記体細胞を褐色脂肪細胞に変換できることを見出した。
　これらの化合物を用いて、体細胞を褐色脂肪細胞に誘導したという報告はない。
　本発明は、以下の発明を包含する：
　項１、　哺乳動物の分化した体細胞を培地中、
（１）TGFβ/SMADパスウェイ阻害剤、
（２）カゼインキナーゼ１阻害剤、
（３）cAMP誘導剤、及び
（４）MEK/ERKパスウェイ阻害剤
からなる群から選択される少なくとも１種の化合物の存在下に培養して前記体細胞を褐色脂肪細胞にコンヴァートさせることを特徴とする、褐色脂肪細胞を調製する方法。
　項２、　前記体細胞が線維芽細胞である、項１に記載の方法。
　項３、　前記培地が、甲状腺ホルモン及びPPARγアゴニストを添加した脂肪細胞誘導培地である、項１または２に記載の方法。
　項４、（１）TGFβ/SMADパスウェイ阻害剤、
（２）カゼインキナーゼ１阻害剤、
（３）cAMP誘導剤、及び
（４）MEK/ERKパスウェイ阻害剤
からなる群から選択される少なくとも１種の化合物のを含む、分化した体細胞を褐色脂肪細胞にコンヴァートするための誘導剤。
　項５、（１）TGFβ/SMADパスウェイ阻害剤、
（２）カゼインキナーゼ１阻害剤、
（３）cAMP誘導剤、及び
（４）MEK/ERKパスウェイ阻害剤
からなる群から選択される少なくとも１種の化合物、並びに、培地を含む分化した体細胞を褐色脂肪細胞にコンヴァートするためのキット。
　項６、　前記培地が、甲状腺ホルモン及びPPARγアゴニストを添加した脂肪細胞誘導培地である、項５に記載のキット。
　項７、　肥満、糖尿病、耐糖能異常、脂質代謝異常、動脈硬化性疾患、高血圧、高尿酸血症、痛風、非アルコール性脂肪性肝疾患、メタボリックシンドロームの予防又は治療剤であって、項１～３のいずれかに記載の方法により調製された褐色脂肪細胞を有効成分とする、予防又は治療剤。
　項８、　項１～３のいずれかに記載の方法により調製された褐色脂肪細胞を用いた、肥満、糖尿病、耐糖能異常、脂質代謝異常、動脈硬化性疾患、高血圧、高尿酸血症、痛風、非アルコール性脂肪性肝疾患、メタボリックシンドロームの予防又は治療のための使用。
　項９、　項１～８のいずれかに記載の方法により調製された褐色脂肪細胞を含む、移植材料。
　本発明では、低分子化合物の作用により分化した体細胞から短期間で褐色脂肪細胞を提供できる。この褐色脂肪細胞は、移植する本人の体細胞から容易に誘導できるので、褐色脂肪細胞自体又はそれから作製した骨組織を移植した場合にも免疫学的な拒絶応答などの問題は生じない。また、iPS細胞やES細胞を経由することなく直接体細胞から褐色脂肪細胞を誘導できるため、癌化などの多能性幹細胞に起因する問題を回避できる。一方で、あらかじめ作製してバンク化しておき、そこから患者へのアロ移植や異種移植に使うことも可能である。
Oil Red O染色した細胞の位相差顕微鏡像である。倍率ｘ１００ 細胞よりRNAを抽出し、real time RT-PCRでUCP-1遺伝子のmRNA発現を定量したグラフである。 細胞よりRNAを抽出し、real time RT-PCRでUCP-1遺伝子のmRNA発現を定量したグラフである。 細胞よりRNAを抽出し、real time RT-PCRでCIDEA遺伝子のmRNA発現を定量したグラフである。 細胞よりRNAを抽出し、real time RT-PCRでPGC-1α遺伝子のmRNA発現を定量したグラフである。 細胞よりRNAを抽出し、real time RT-PCRでAdipoQ遺伝子のmRNA発現を定量したグラフである。 脂肪滴をBODIPYで染色した細胞の、蛍光顕微鏡像である。倍率ｘ２００ 図７ＡのBODIPY染色の蛍光強度のグラフである。 図７ＡのBODIPY染色像の白黒反転図である。 UCP1を免疫染色した細胞の、蛍光顕微鏡像である。倍率ｘ２００ 図８ＡのUCP-1染色の蛍光強度のグラフである。 図８ＡのUCP-1染色像の白黒反転図である。 Oil Red O染色した細胞の顕微鏡像である。倍率ｘ１００ 脂肪滴をBODIPYで染色し、またUCP1を免疫染色し、また核をDAPIで染色した細胞の、蛍光顕微鏡像である。倍率ｘ２００ 図１０Ａの染色像の白黒反転図である。 TGFβ/SMADパスウェイの概要を模式的に表したものである。 MEK/ERKパスウェイの概要を模式的に表したものである。 細胞よりRNAを抽出し、real time RT-PCRでUCP-1遺伝子のmRNA発現を定量したグラフである。 UCP1を免疫染色した細胞の、蛍光顕微鏡像である。倍率ｘ１００ 図１４ＡのUCP-1染色像の白黒反転図である。 細胞よりRNAを抽出し、real time RT-PCRでUCP-1遺伝子のmRNA発現を定量したグラフである。 UCP1を免疫染色した細胞の、蛍光顕微鏡像である。倍率ｘ１００ 図１６ＡのUCP-1染色像の白黒反転図である。 細胞よりRNAを抽出し、real time RT-PCRでUCP-1遺伝子、CIDEA遺伝子及びKCNK3遺伝子のmRNA発現を定量したグラフである。
　本発明は、哺乳動物の分化した体細胞を褐色脂肪細胞にコンヴァートする方法に関する。当該方法により、体細胞を原材料として褐色脂肪細胞が調製される。「コンヴァート」とは、体細胞を目的の褐色脂肪細胞へと変換することを意味する。本発明の方法の好ましい態様の１つは、「ダイレクトリプログラミング」、「ダイレクトコンヴァージョン」ともよばれる、iPS細胞の作製に代表される細胞の初期化の工程を経ることなく、体細胞を褐色脂肪細胞にコンヴァートする方法である。
　褐色脂肪細胞
　本発明は、褐色脂肪細胞の調整方法を提供する。褐色脂肪細胞とは、白色脂肪細胞とともに、ほ乳類に存在する脂肪細胞の２つのタイプの1つである。褐色脂肪細胞と類似の形態と機能をもつ細胞として、ベージュ（Beige）細胞やブライト（Brite）細胞と呼ばれる細胞も知られており、本明細書においてこれらの細胞も「褐色脂肪細胞」に包含される。
　褐色脂肪細胞の存在は、公知の手法で確認をすることができる。例えば、細胞中の脂肪滴を検出できる蛍光色素での染色、褐色脂肪細胞において発現する遺伝子産物（mRNA又はタンパク質）の検出が挙げられる。細胞中の脂肪滴を検出できる蛍光色素としては、Oil Red O、BODIPYなどが挙げられる。褐色脂肪細胞において発現する遺伝子産物としては、UCP-1、CIDEA、PCG-1α、DIO2、Cox8b、Otop、AdipoQなどが挙げられる。中でも、UCP-1（Uncoupling protein 1）は、褐色脂肪細胞に特異的に発現する遺伝子であり、酸化的リン酸化を脱共役させるミトコンドリア内膜タンパク質をコードし、褐色脂肪細胞の機能の根幹を担うと考えられるため、褐色脂肪細胞の指標として特に好ましいものの1つである。
　体細胞
　本発明の方法の対象となる哺乳動物の分化した体細胞としては、哺乳動物由来であって、褐色脂肪細胞そのもの及び生体内で褐色脂肪細胞へと分化する能力を有する細胞でない限り、特に限定されない。
　体細胞の種類としては、例えば、線維芽細胞、上皮細胞（皮膚表皮細胞、口腔粘膜上皮細胞、気道粘膜上皮細胞、腸管粘膜上皮細胞など）、表皮細胞、歯肉細胞（歯肉線維芽細胞、歯肉上皮細胞）、歯髄細胞、白色脂肪細胞、皮下脂肪、内臓脂肪、筋肉、血液細胞などが挙げられ、好ましくは線維芽細胞、歯肉細胞、口腔粘膜上皮細胞、歯髄細胞、脂肪細胞、表皮細胞（ケラチノサイト）、血液細胞などが挙げられる。
　また、間葉系幹細胞（Mesenchymal stem cell: MSC）、神経幹細胞（Neural stem cell）、肝幹細胞（hepatic stem cell）、腸幹細胞、皮膚幹細胞、毛包幹細胞、色素細胞幹細胞などの体性幹細胞から分化誘導し、あるいは脱分化させ、あるいはリプログラミングさせて作製した体細胞も挙げられる。また、さまざまな体細胞から分化誘導し、あるいは脱分化させ、あるいはリプログラミングさせて別の体細胞に誘導した細胞も挙げられる。また、生殖系列の細胞から分化誘導し、あるいは脱分化させ、あるいはリプログラミングさせて誘導した体細胞も挙げられる。
　また、胎性幹細胞（Embryonic stem cell：ES細胞）や人工多能性幹細胞（induced pluripotent stem cell：iPS細胞）から分化誘導し、あるいはリプログラミングさせて誘導した体細胞も挙げられる。
　また、厳密には体細胞ではないが、ES細胞、iPS細胞、あるいは生殖系列の細胞も本発明の「体細胞」に包含される（その際には、「体細胞」を「ES細胞」、「iPS細胞」あるいは「生殖系列の細胞」と読み替えるものとする）。
　また、培養細胞も挙げられ、培養細胞から分化誘導し、あるいは脱分化させ、あるいはリプログラミングさせて誘導した体細胞も挙げられる。
　哺乳動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ヒト、イヌ、ネコ、サル、ウサギ、ウシ、ウマ、ブタなどが挙げられる。体細胞は、ヒト由来であることが特に好ましい。体細胞が由来する個体の年齢は限定されず、成人であっても小児であっても胎児であってもよい。なお、本明細書において、胎児由来の細胞、並びに、胎盤、羊膜、臍帯等由来の細胞も「体細胞」に包含される。 
　調製した褐色脂肪細胞を生体に移植する場合には、移植される被験体由来の体細胞(自家細胞)を用いることが、感染や拒絶応答等の危険を低減させるために好ましい。しかしながら、自家細胞でなく、他人や他の動物の体細胞から作った褐色脂肪細胞を移植に用いることができる。またはあらかじめ準備しておいた他人や他の動物の体細胞から褐色脂肪細胞を作り、移植に用いることができる。または他人や他の動物の体細胞からあらかじめ作っておいた褐色脂肪細胞を、移植に用いることができる。すなわち、褐色脂肪細胞バンク、または褐色脂肪細胞前駆細胞のバンクを作っておき移植目的に供することができる。このような場合、拒絶応答等の危険を低減させるために、あらかじめ血液型とMHCをタイピングしておくことができる。また、あらかじめ褐色脂肪細胞のキャラクターや造腫瘍性などを確認しておくことができる。
　培地
　本発明の方法で用いる培地は、特に限定されない。DMEM（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）、EMEM（Eagle's minimal essential medium）などの通常の液体培地を用いることができる。必要に応じて、血清成分（Fetal Bovine Serum（FBS）、Human Serum（Serum））、ストレプトマイシン、ペニシリンなどの抗生剤、Non-Essential Amino Acid等の成分を添加することができる。
　褐色脂肪細胞を調製できる効率が高いとの観点から、培地として脂肪細胞を分化させるための分化誘導培地を用いることが好ましい。「脂肪細胞を分化させるための分化誘導培地」とは、多能性幹細胞（ES細胞、iPS細胞など）を脂肪細胞へと分化させることができる成分を含む培地を指す。分化誘導培地は、上記の通常の液体培地（必要に応じて加える成分を加えてもよい）に、下記の成分（１種又は２種以上）を添加したものが挙げられる：
インスリン（Insulin）（例えば濃度0.01～100μg/mL程度、より好ましくは0. 1～10μg/mL程度）;3-イソブチル-1-メチルキサンチン（3-isobutyl-1-methylxanthine；IBMX)（例えば濃度0.01～100 mM程度、より好ましくは0.1～10ｍM程度）; デキサメタゾン（Dexametazone）（例えば濃度0.01～100 μM程度、より好ましくは0.1～10 μM程度）。また、インドメタシン（Indometacin）（例えば濃度0.001～10 mM程度、より好ましくは0.01～1 ｍM程度） を添加しても良い。
　具体例として、10% FBS添加DMEM＋MDI培地（0.5 mM isobutylmethylxanthine（IBMX）、0.5 μM dexametazone、および1 μg/mL Insulinを添加した、10% FBS添加DMEM）を、脂肪細胞誘導培地として用いることができるが、これに限定されない。
　脂肪細胞誘導培地に、褐色脂肪細胞にコンヴァートさせる効率が高いとの観点から、さらにトリヨードサイロニン（Triiodothyronine, T3）、サイロキシン（Thyroxine, T4）などの甲状腺ホルモン（例えば濃度0.01～100 nM程度、より好ましくは0.1～10nM程度）またはPeroxisome Proliferator-Activated Receptor-γ (PPAR-γ)アゴニスト（例えば濃度0.01～100 μM程度、より好ましくは0.1～10 μM程度）を加えることが好ましく、両者を加えることがさらに好ましい。
　PPAR-γアゴニストとしては、Rosiglitazone、Ciglitazone、GW1929、nTZDpa、Pioglitazone Hydrochloride、Troglitazoneなどのチアゾリジンジオン化合物が例示される。
　褐色脂肪細胞を誘導するための培地の好ましい態様としては、[1] FBS 10%, 0.5 mM IBMX, 125 nM Indomethacin, 1 microM Dexamethasone, 850 nM insulin 、トリヨードサイロニン（Triiodothyronine, T3）、サイロキシン（Thyroxine, T4）などの甲状腺ホルモン（例えば濃度0.01～100 nM程度、より好ましくは0.1～10nM程度）1 μM Rosiglitazoneを添加したDMEM培地、[2] 10% FBS, 850 nM insulin, 1 nM T3, Peroxisome Proliferator-Activated Receptor-γ （PPAR-γ）アゴニスト（例えば濃度0.01～100 μM程度、より好ましくは0.1～10 μM程度）を添加したDMEM培地が例示される。第１～２日に[1]を、第3日以降に[2]を用いることが特に望ましい。しかしこれらに限定されない。
　化合物
　本発明の方法において、哺乳動物の分化した体細胞を培地中、
（１）TGFβ/SMADパスウェイ阻害剤、
（２）カゼインキナーゼ１阻害剤、
（３）cAMP誘導剤、及び
（４）MEK/ERKパスウェイ阻害剤
からなる群から選択される少なくとも１種の化合物の存在下に培養する。以下、各化合物について説明する。
　TGF-β/SMADパスウェイ阻害剤
　TGF-β/SMADパスウェイ阻害剤は、TGF-β/SMADパスウェイに属するタンパク質の活性を阻害できる化合物を意味する。TGF-β/SMADパスウェイは図１１に模式的に示す、当業者に公知のシグナル経路である。
　TGF-β/SMADパスウェイは、TGF-βスーパーファミリーに属するタンパク質から構成されるリガンド（TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、アクチビン-βA、アクチビン-βB、アクチビン-βC、アクチビン-βε、nodal、BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8A、BMP8B、BMP10, BMP15、GDF1、GDF2、GDF3、GDF5、GDF6、GDF7、GDF8、GDF9、GDF10、GDF11、GDF15、AMH (MIS)など）、ヘテロ二量体型の受容体を構成するTGF-β type I receptorファミリーに属するタンパク質及びTGF-β type II receptorファミリーに属するタンパク質、並びに、細胞内のシグナル分子（エフェクター）であるSMADファミリーに属するタンパク質（とくにSMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD1、SMAD5、またはSMAD8） が主に構成する。
　TGF-β/SMADパスウェイにおいては、リガンドが二量体型の受容体に結合すると、キナーゼ型受容体であるTGF-β type I receptorタンパク質が、SMADタンパク質をリン酸化して、下流にシグナルを伝達する。したがって本明細書では、TGF-βスーパーファミリーのサイトカイン、TGF-β type I receptorファミリー、TGF-β type II receptorファミリー、SMADファミリータンパク（とくにSMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD1、SMAD5、またはSMAD8）のいずれかを抑制する分子を、TGF-β/SMADパスウェイ阻害剤と呼ぶ。
　「TGF-β/SMADパスウェイ阻害剤」は狭義の阻害剤である低分子化合物に止まらず、受容体のアンタゴニスト、可溶性受容体、パスウェイのタンパク質に結合しその作用を阻害する活性を有する抗体、アプタマー、ペプチド、ドミナントネガティブとして働く変異体タンパク質やペプチドやその類似体、パスウェイのタンパク質の発現を抑制するsiRNA、shRNA、マイクロRNAなどを包含する。
　TGF-β/SMADパスウェイ阻害剤の態様の1つとして、TGF-β type I receptorファミリー（Activin receptor like kinase（ALK）ファミリーともいう）に属するALKタンパク質（ALK1、ALK2、ALK3、ALK4、ALK5、ALK6、ALK7）の阻害剤（ALK阻害剤）が例示される。また、TGF-β type II receptorファミリーに属するタンパク質（TGF-βRII（AAT3）、ACTRII、ACTRIIB、BMPRII、AMHRII）の阻害剤が例示される。 
　具体的には、ALK5の阻害剤であるD4476（4-[4-(2,3-dihydro-1,4-benzodioxin-6-yl)-5-(2-pyridinyl)1H-imidazol-2-yl]-benzamide）、ALK5 Inhibitor II（2-(3-(6-Methylpyridin-2-yl)-1H-pyrazol-4-yl)-1,5-naphthyridine；別名RepSox）、GW788388、SD-208；ALK5とTGF-βRII（AAT3）の阻害剤であるLY2109761、LY2157299（Galunisertiv, 4-[5,6-dihydro-2-(6-methyl-2-pyridinyl)-4H-pyrrolo[1,2-b]pyrazol-3-yl]-6-quinolinecarboxamide）、LY364947；ALK4及びALK5の阻害剤であるSM16 (4-(5-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-4-(6-methylpyridin-2-yl)-1H-imidazol-2-yl)bicyclo[2.2.2]octane-1-carboxamide)、EW-7197、SB525334；ALK4、ALK5及びALK7阻害剤であるSB431542（4-[4-(1,3-Benzodioxol-5-yl)-5-(pyridin-2-yl)-1H-imidazol-2-yl]benzamide）、SB505124、A83-01；ALK2及びALK3の阻害剤であるLDN-193189、Apigenin、DMH1、ML347；ALK１及びALK2の阻害剤であるLDN-214117；ALK1、ALK2及びALK3の阻害剤であるLDN-212854；ALK1、ALK2、ALK3及びALK6の阻害剤であるK02288が例示される。
　ALK阻害剤としては、効果が高いとの観点から、少なくともALK5に対する阻害活性を有するもの（ALK5阻害剤）が好ましい。効果が特に高いとの観点から、ALK4及びALK5、又はALK5に対する特異的な阻害活性を有するもの（ALKタンパク質のうち、当該タンパク質への阻害活性が顕著に高いもの）が好ましい。
　TGF-β/SMADパスウェイ阻害剤の別の態様として、SMADタンパク質の阻害剤が例示される。
　中でも、ALK5の下流に位置するSMAD2及びSMAD3、さらにはSMAD4の阻害剤が好ましい。
　TGF-β/SMADパスウェイ阻害剤は、上記の化合物の誘導体も包含する。例えば、D4476に替えてその誘導体を使用することもできる。誘導体は、必ずしも、ALK5を阻害する活性を有さなくてもよい。例えば、WO00/61576号に記載の下記式（Ｉ）で表されるD4476の誘導体を使用することができる：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
［式中、Ｒ1は、ハロゲン、Ｃ1-6アルコキシ（－Ｏ－Ｃ1-6アルキル）、Ｃ1-6アルキルチオ（－Ｓ－Ｃ1-6アルキル）、Ｃ1-6アルキル、－Ｏ－(ＣＨ2)n－Ｐh、－Ｓ－(ＣＨ2)n－Ｐh、シアノ、フェニル（Ｐｈ）、およびＣＯ2Ｒ（ここで、Ｒは、水素またはＣ1-6アルキルであり、ｎは、０、１、２または３である）からなる群から選択される１個またはそれ以上の置換基で置換されていてもよいナフチル、アントラセニル、またはフェニルであるか；またはＲ1は、Ｎ、ＯおよびＳから独立して選択される２個までのヘテロ原子を含有していてもよい５～７員の芳香環または非芳香環と縮合したフェニルであり；
　Ｒ2は、Ｈ、ＮＨ(ＣＨ2)n－ＰhまたはＮＨ－Ｃ1-6アルキルであり（ここで、ｎは、０、１、２または３である）；
　Ｒ3は、ＣＯ2Ｈ、ＣＯＮＨ2、ＣＮ、ＮＯ2、Ｃ1-6アルキルチオ、－ＳＯ2－Ｃ1-6アルキル、Ｃ1-6アルコキシ、ＳＯＮＨ2、ＣＯＮＨＯＨ、ＮＨ2、ＣＨＯ、ＣＨ2ＯＨ、ＣＨ2ＮＨ2、またはＣＯ2Ｒであり（ここで、Ｒは、水素またはＣ1-6アルキルである）；　Ｘ1およびＸ2のうち一方は、ＮまたはＣＲ'であり、他方は、ＮＲ'またはＣＨＲ'である（ここで、Ｒ'は、水素、ＯＨ、Ｃ1-6アルキル、またはＣ3-7シクロアルキルである）か；またはＸ1およびＸ2のうち一方がＮまたはＣＲ'である場合、他方は、ＳまたはＯであってもよい］。
　Ｃ1-6アルキルとしては、直鎖状又は分枝鎖状の炭素数１～６のアルキル、具体的には、メチル、エチル、n－プロピル、イソプロピル、n－ブチル、イソブチル、sec－ブチル、tert－ブチル、n－ペンチル、イソペンチル、n－ヘキシル、イソヘキシルを挙げることができる。
　Ｃ3-7シクロアルキルとしては、炭素数３～７のシクロプロピル、具体的には、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチルが挙げられる。
　Ｒ1が、Ｎ、ＯおよびＳから独立して選択される２個までのヘテロ原子を含有していてもよい５～７員の芳香環または非芳香環と縮合したフェニルである場合、具体例としては、ベンゾ[１,３]ジオキソリル、２,３－ジヒドロベンゾ[１,４]ジオキシニル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾ[１,２,５]オキサジアゾリル、ベンゾ[１,２,５]チアジアゾリル、ジヒドロベンゾフラニルが挙げられる。
　このようなD4476の誘導体として、下記の化合物が例示される：
　４－[４－(４－フルオロフェニル)－５－(２－ピリジル)－１－ヒドロキシ－１Ｈ－イミダゾール－２－イル]ベンゾニトリル；
　４－[４－(４－フルオロフェニル)－５－(２－ピリジル)－１Ｈ－イミダゾール－２－イル]ベンゾニトリル；
　４－[４－(４－フルオロフェニル)－５－(２－ピリジル)－１Ｈ－イミダゾール－２－イル]安息香酸；
　４－[４－(４－フルオロフェニル)－５－(２－ピリジル)－１Ｈ－イミダゾール－２－イル]安息香酸メチル；
　４－[４－(４－フルオロフェニル)－５－(２－ピリジル)－１Ｈ－イミダゾール－２－イル]安息香酸エチル；
　４－(４－ベンゾ[１,３]ジオキソール－５－イル－１－ヒドロキシ－５－ピリジン－２－イル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル)ベンゾニトリル；
　４－(４－ベンゾ[１,３]ジオキソール－５－イル－５－ピリジン－２－イル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル)ベンゾニトリル；
　４－(４－ベンゾ[１,３]ジオキソール－５－イル－５－ピリジン－２－イル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル)安息香酸；
　２－[４－ベンゾ[１,３]ジオキソール－５－イル－２－(４－ニトロフェニル)－１Ｈ－イミダゾール－５－イル]ピリジン；
　３－(４－ベンゾ[１,３]ジオキソール－５－イル－５－ピリジン－２－イル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル)フェニルアミン；
　４－[４－(４－フルオロフェニル)－２－(４－ニトロフェニル)－１Ｈ－イミダゾール－５－イル]ピリジン；
　４－[４－(４－フルオロフェニル)－５－ピリジン－２－イル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル)フェニルアミン；
　４－(４－ベンゾ[１,３]ジオキソール－５－イル－５－ピリジン－２－イル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル)フェニル]メタノール；
　４－(４－ベンゾ[１,３]ジオキソール－５－イル－５－ピリジン－２－イル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル)ベンズアミド；
　４－[４－(２,３－ジヒドロ－ベンゾ[１,４]ジオキシン－６－イル)－５－ピリジン－２－イル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル]－ベンゾニトリル；
　４－[４－(２,３－ジヒドロ－ベンゾフラン－５－イル)－５－ピリジン－２－イル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル]ベンズアミド；
　３－[４－ベンゾ[１,３]ジオキソール－５－イル－５－ピリジン－２－イル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル)ベンゾニトリル；
　４－[４－(２,３－ジヒドロ－ベンゾフラン－６－イル)－５－ピリジン－２－イル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル]ベンゾニトリル；
　４－[４－(２,３－ジヒドロ－ベンゾフラン－６－イル)－５－ピリジン－２－イル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル]ベンズアミド；
　３－(４－ベンゾ[１,３]ジオキソール－５－イル－５－ピリジン－２－イル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル)安息香酸；
　４－[４－(４－メトキシフェニル)－５－(２－ピリジル)－１Ｈ－イミダゾール－２－イル]ベンゾニトリル；
　４－[４－(２,２－ジフルオロ－ベンゾ[１,３]ジオキソール－５－イル)－５－ピリジン－２－イル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル]ベンズアミド；
　４－[４－(２,３－ジヒドロ－ベンゾ[１,４]ジオキシン－６－イル)－１－メチル－５－ピリジン－２－イル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル]ベンズアミド；
　４－[５－(２,３－ジヒドロ－ベンゾ[１,４]ジオキシン－６－イル)－１－メチル－４－ピリジン－２－イル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル]ベンズアミド；
　４－(５－ベンゾ[１,３]ジオキソール－５－イル－４－ピリジン－２－イル－オキサゾール－２－イル)ベンゾニトリル；
　４－(５－ベンゾ[１,３]ジオキソール－５－イル－４－ピリジン－２－イル－オキサゾール－２－イル)ベンズアミド；および ４－(４－ベンゾ[１,３]ジオキソール－５－イル－５－ピリジン－２－イル－１Ｈ－ピロール－２－イル)ベンズアミド。
　カゼインキナーゼ阻害剤
　カゼインキナーゼ阻害剤は、カゼインキナーゼ１、カゼインキナーゼ２などのサブタイプが存在するカゼインキナーゼに対する阻害剤を広く包含する。カゼインキナーゼ阻害剤は狭義の阻害剤である低分子化合物に止まらず、カゼインキナーゼに結合しその作用を阻害する活性を有する抗体、アプタマー、ペプチド、ドミナントネガティブとして働く変異体タンパク質やその類似体、カゼインキナーゼの発現を抑制するsiRNA、shRNA、マイクロRNAなどを包含する。
　褐色脂肪細胞を誘導する効果が高いとの観点から、カゼインキナーゼ１阻害剤が好ましい態様として挙げられる。
　カゼインキナーゼ１阻害剤としては、D4476、IC261、CK1-7、A3、SB-431542、DRB、ハイメニアルディシン、マタイレジノール、5-ヨードツベルジシン、メリジアニン、SB-203580などの化合物（カゼインキナーゼ１を特異的に阻害する化合物を含む。）が、好適な例として挙げられる。
　その他、ファスジル、ヒドロキシファスジル、フェンレチニド、PKZ-ζペプチド偽基質、ジメチルスフィンゴシン、CVS-3989、AG1024、648450、K252a、C3トランスフェラーゼ、553502、LY333531、ルボキシスタウリン、Go-6976、IWR-1-endo（IWR1e）、IWP-2などのカゼインキナーゼ１を阻害する活性を有する化合物も挙げられる。
　カゼインキナーゼ２阻害剤としては、CX-4945が例示される。
　また、カゼインキナーゼ阻害剤は上記の化合物の誘導体も包含する。
　cAMP誘導剤
　cAMP誘導剤（アデニル酸シクラーゼ活性化剤と換言することもできる）としては、アデニル酸シクラーゼの活性化作用により細胞内のcAMP（サイクリックAMP）レベルを上昇させる化合物を広く包含し、例えば、フォルスコリン（FSK）、イソプロテレノール、NKH 477、PACAP 1-27、PACAP 1-38などが挙げられる。
　また、cAMP誘導剤は上記の化合物の誘導体も包含する。
　MEK/ERKパスウェイ阻害剤
　MEK/ERKパスウェイ阻害剤は、MEK/ERKパスウェイに属するタンパク質の機能発現を阻害できる化合物を意味する。MEK/ERKパスウェイは図１２に示す、当業者に公知のシグナル経路である。
　MEK/ERKパスウェイは、サイトカインや成長因子（Growth factors）が結合することによって活性化するレセプターである、EGFレセプター、HER2、IGF1レセプター、VEGFレセプター、Flt-3、c-kit、PDGF-R等のレセプター；これらレセプターによって活性化するRas；Rasシグナルを受けて活性化するMAPKKKタンパク質であるA-Raf、B-Raf、ｃ-Raf、Mos、Tpl；MAPKKKによってリン酸化（活性化）されるMAPKKタンパク質であるMEK1、MEK2（MEK1/2）、MAPKKによってリン酸化されるMAPKタンパク質であるERK1、ERK2（ERK1/2）；下流の転写因子等であるElk-1、Est2、RSK、MNK、MSK、cPLA2、CREB、Fos、 globin transcription factor 1等が主に構成する。
　MEK/ERKパスウェイ阻害剤としては、上記の分子のいずれか（MEKの上流のサイトカインや成長因子とそのレセプター、Ras、Raf、MEK1/2、ERK1/2、ERKの下流の因子等）を阻害するものが含まれる。中でも、MAPKKタンパク質のMEK1、MEK2及び、MAPKタンパク質のERK1、ERK2の機能発現を阻害する化合物（阻害剤）が好ましく、MEK1、MEK2に対する阻害剤が特に好ましい。
　MEK/ERKパスウェイ阻害剤としては、PD0325901（N-[(2R)-2,3-dihydroxypropoxy-3,4-difluoro-2-[(2-fluoro-4-iodophenyl)amino]-benzamide；MEK1/2に対する阻害剤である）、AS703026、AZD8330、BIX02188、BIX02189、CI-1040、Cobimetinib、GDC-0623、MEK162、PD318088、PD98059、Refametinib、RO4987655、SCH772984、Selumetinib、SL327、Trametinib、ARRY-142886 、XL518,RDEA119などが例示される。
　また、MEK/ERKパスウェイ阻害剤は上記の化合物の誘導体も包含する。MEK/ERKパスウェイ阻害剤は狭義の阻害剤である低分子化合物に止まらず、MEK/ERKパスウェイのたんぱく（たとえばMEK1,MEK2,ERK1,ERK2）に結合しその作用を阻害する活性を有する抗体、アプタマー、ペプチド、ドミナントネガティブとして働く変異体たんぱくやその類似体、MEK/ERKパスウェイのたんぱく（たとえばMEK1,MEK2,ERK1,ERK2）の発現を抑制するsiRNA、shRNA、マイクロRNAなどを包含する。
　上記（１）～（４）からなる群から選択される化合物の培地中の濃度は、当業者が適宜設定することができる。通常は、0.01 μＭ～100μＭ程度、特に0.1 μＭ～10 μＭ程度である。
　培養
　本発明の方法において、哺乳動物の分化した体細胞を培地中、上記（１）～（４）からなる群から選択される少なくとも１種の化合物の存在下に培養する。
　培養は、細胞及び培地を格納するための適切な容器中で行なうことができる。好適な培養を行なう手法として、約37℃程度および二酸化炭素濃度約5％程度の条件下で培養する手法が例示されるが、これに限定されるものではない。上記条件での培養は、例えば公知のCO2インキュベータを用いて行なうことができる。
　上記（１）～（４）からなる群から選択される少なくとも１種の化合物は、全培養期間の内の一部の期間のみで添加してもよい。哺乳動物の分化した体細胞を、通常培地中上記化合物の存在下に培養した後で、誘導培地中上記化合物の非存在下に培養してもよい。また、通常培地中上記化合物の存在下に培養した後で、通常培地中上記化合物の非存在下に培養し、その後誘導培地中上記化合物の非存在下に培養してもよい。また、通常培地中上記化合物の存在下に培養した後で、誘導培地中上記化合物の存在下に培養し、その後誘導培地中上記化合物の非存在下に培養してもよい。このように、上記化合物の存在下で培養することと、誘導培地で培養することの両方の過程を含んでさえいれば、それらは同時でなくてもよいし、それぞれは全培養期間の一部だけであってもよい。 
　培養を行う期間は、本発明の効果を損なわない範囲で、特に限定されるものではない。例えば、24時間から60日間程度、好ましくは3～30日、より好ましくは10～20日程度、特に好ましくは14日程度とすることができる。
　効果が高いとの観点から、全培養期間中、（例えば６～１０日程度、特に８日程度）誘導培地中上記化合物の存在下での培養をし、その後誘導培地中上記化合物の非存在下での培養とすることができる。この場合の上記化合物の存在下での培養は、全培養期間中、培養開始からであっても、所定期間上記化合物の非存在下で培養した後であってもよい。
　培養において、必要において継代を行うことができる。継代を行う場合は、コンフルエント状態に到達する前または直後に細胞を回収し、細胞を新しい培地に播種する。また、本発明の培養において、培地を適宜交換することもできる。
　かくして、体細胞が褐色脂肪細胞にコンヴァートし、褐色脂肪細胞が調製される。
　褐色脂肪細胞が得られたことは、前述の細胞中の脂肪滴を検出できる蛍光色素での染色、褐色脂肪細胞において発現する遺伝子産物の検出により確認することができる。
　具体的には、褐色脂肪細胞が得られたことは、Oil Red O染色やBodipy染色で染められる、多房性脂肪滴を有する特有の形態や、UCP-1、CIDEA、KCNK3、PCG-1α、Cox8b、Otop、ELOVL3遺伝子などの発現によって検出することができる。中でも、UCP-1（Uncoupling protein 1）は、褐色脂肪細胞に特異的に発現する遺伝子であり、酸化的リン酸化を脱共役させるミトコンドリア内膜タンパク質をコードし、褐色脂肪細胞の機能の根幹を担うと考えられるため、褐色脂肪細胞の指標として特に好ましいものの1つである。
　治療又は予防剤；移植材
　本発明の方法により調製される褐色脂肪細胞は、生体に移植することで、肥満、メタボリックシンドローム、或いはこれらに関連する疾患又は状態の予防又は治療に使用することができる。
　対象とする疾患には、Ｉ型糖尿病、II型糖尿病、糖尿病性合併症（網膜症、末梢神経症、腎症、大血管障害、糖尿病性壊疽、骨粗鬆症、糖尿病性昏睡等）、耐糖能異常、インスリン抵抗性、アシドーシス、ケトーシス、ケトアシドーシス、肥満、中枢性肥満とその合併症、内臓肥満症候群、高血圧、食後高脂血症、脳血管障害、動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症、メタボリック・シンドローム、脂質異常症、高トリグリセリド血症、高コレステロール血症、低HDL血症、腎臓疾患 （糖尿病性ネフロパシー、ネフローゼ症候群等）、動脈硬化症、血栓性疾患、心筋梗塞、虚血性心疾患、狭心症、心不全、脳血管障害（脳梗塞、脳卒中等）、末梢血行障害、知覚障害、高尿酸血症、痛風、感染症（呼吸器感染症、尿路感染症、消化管感染症、皮膚感染症、軟部組織感染症等）、悪性腫瘍、白内障、脂肪肝、非アルコール性脂肪性肝炎、骨粗鬆症が含まれる。褐色脂肪細胞による脂質の燃焼と糖・脂質代謝異常の改善によって、これら疾患に対する予防と治療効果が得られると考えられる。
　また、褐色脂肪細胞は、腹部や顎の周り、太ももなどの脂肪を除去する美容的な用途にも使用できる。褐色脂肪細胞は、乳房などに導入する美容的処置の移植材料として使用することもできる。
　褐色脂肪細胞を投与すると、脂肪量、特に内臓脂肪、皮下脂肪などの白色脂肪細胞が減少し、また高カロリー食を摂取した場合にも体重増加が抑制されるため、肥満、メタボリックシンドローム、或いはこれらの関連する疾患又は状態の予防と治療の両方に有用である。本発明はまた、疾患の予防又は治療に限らず、健康増進や美容（例えば腹部、顎、腕、太ももなどの内臓脂肪、皮下脂肪の除去）等の目的で用いることもできる。その際、ヒトに対する処置も、本明細書では便宜上治療と呼び、「患者」は「健常者」あるいは「ヒト」、「疾患」は「健康増進」や「美容」等と読み替えることができる。
　本発明はまた、ヒトだけでなく、イヌ、ネコ等の愛玩動物やウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ニワトリ等の家畜の疾患の治療にも用いることが可能である。その場合、「患者」あるいは「ヒト」を「患畜」あるいは「動物」と読み替えることとする。
　移植材料とは、褐色脂肪細胞を生体内に導入する材料をいう。褐色脂肪細胞は、乳房などに導入する美容的処置の移植材料として使用することもできる。移植材料は、インビトロで体細胞から褐色脂肪細胞に変換した後、同一または別の個体に移植する材料を包含する。
　また、得られた褐色脂肪細胞を用いれば、糖尿病（特にII型糖尿病）、耐糖能異常、脂質代謝異常、動脈硬化性疾患、高血圧、高尿酸血症、痛風、非アルコール性脂肪性肝疾患などに対する新しい作用機序に基づく創薬開発等を行うことができる。
　以下に実施例を示すが、本発明はこの実施例だけに限定されるものではない。
　以下に、実施例で用いた化合物の構造を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
　以下、本明細書中及び図中において、「ALK5 Inhibitor II」を「ALK5 Inhibitor」、「ALK5IH」または「ALK5i」と記載する場合がある。
　実施例１
　ヒト正常皮膚由来線維芽細胞（human dermal fibroblasts; HDFs）を通常培地（10% FBSを添加したDulbecco’s modified minimum essential medium; DMEM）に縣濁した。これを1×104cells/wellの濃度で24-well plateに播種し（day 0）、5% CO2/95% humidified air、37℃で培養を開始した。翌日、培養上清を吸引除去し、図中に記載のとおり、通常培地、脂肪細胞誘導培地、または化合物等を加えた脂肪細胞誘導培地を、500 μL/well加えた。
　脂肪細胞誘導培地は、10% FBS添加DMEM＋MDI培地（0.5 mM isobutylmethylxanthine（IBMX）、0.5 μM dexamethason、および1 μg/mL Insulinを添加した、10% FBS添加DMEM）である。
　添加物の濃度は以下のとおりである：
T3: 1 nM 
Rosiglitazone: 1 μM 
D4476: 2 μM 
Pifithrin alpha［p53阻害剤］: 5 μM 
SB431542: 2 μM 
ALK5 Inhibitor II: 2 μM。
　3～4日に1度、培養液をフレッシュなものに置換し、day 14まで培養した。
　Day 14に、各wellから培養液を吸引除去し、PBS（－）で洗浄後、10%ホルマリンにて固定した。滅菌蒸留水で3回洗浄した後、Oil Red O染色液を加え、室温で15分間インキュベートした。その後滅菌蒸留水にて洗浄し、位相差顕微鏡で100倍の倍率で撮影した。
　結果を図１に示す。脂肪細胞誘導培地にT3およびRosiglitazoneに加えて、D4476、SB431542、ALK5 Inhibitor IIのいずれかを添加培養した場合に、顕著なOil Red O染色が観察された（図中、＃４、＃６、＃７）。一方、通常培地、T3およびRosiglitazoneを添加しない脂肪細胞誘導培地、並びに、p53阻害剤であるPifithrin alphaを添加した脂肪細胞誘導培地の場合には、殆どOil Red O染色が観察できなかった。また、T3およびRosiglitazoneのみを添加した脂肪細胞誘導培地ではOil Red O染色の程度が低かった。以上のことから、T3およびRosiglitazoneに加えて、D4476、SB431542、ALK5 Inhibitor IIのいずれかを添加培養することにより、線維芽細胞が褐色脂肪細胞にコンヴァートしたことがわかる。
　実施例２
　ヒト正常皮膚由来線維芽細胞（human dermal fibroblasts; HDFs）を通常培地（10% FBSを添加したDulbecco’s modified minimum essential medium; DMEM）に縣濁した。これを1×104 cells/wellの濃度で24-well plateに播種し（day 0）、5% CO2 /95% humid air 37℃で培養を開始した。翌日、培養上清を吸引除去し、図中に記載のとおり、通常培地、脂肪細胞誘導培地、または各小分子化合物等を加えた脂肪細胞誘導培地を、500 μL/well加えた。
　脂肪細胞誘導培地は、10% FBS添加DMEM＋MDI培地（0.5 mM isobutylmethylxanthine（IBMX）、0.5 μM dexamethason、および1 μg/mL Insulinを添加した、10% FBS添加DMEM）である。
　添加物の濃度は以下のとおりである：
T3: 1 nM 
Rosiglitazone: 1 μM 
D4476: 2 μM
Pifithrin alpha［p53阻害剤］: 5 μM 
Forskolin（FSK）: 2 μM 
PD0325901: 1 μM
SB431542: 2 μM。
　3～4日に1度、培養液をフレッシュなものに置換し、day 14まで培養した。
　Day 14に、各wellから培養液を吸引除去し、PBS（－）で洗浄後、細胞からISOGEN IIにてtotal RNAを抽出した。このRNAから、Rever Tra Ace qPCR RT Master Mixを用いてcDNAを合成した。このcDNAにReal-time PCR Master Mixと、UCP1遺伝子またはβアクチン遺伝子に特異的なprimersとTaqman probeを混和した。AB7300 Real-time PCR systemを用いてqRT-PCR（定量的RT-PCR）を行った。UCP1遺伝子のmRNAレベルをβアクチン遺伝子ｍRNAに対する比として定量し、通常培地で培養した線維芽細胞の値を１として算出した。
　その結果を図２に示す。T3およびRosiglitazoneに加えて、D4476、FSK、PD0325901またはSB431542のいずれかを添加培養することにより、線維芽細胞がUCP1遺伝子のmRNAを発現する褐色脂肪細胞に誘導されたことがわかる。さらに、D4476とFSKの共添加により、もっともUCP1を強く発現する細胞にコンヴァートしたことがわかる。
　実施例３
　実施例２と同様の実験を行い、通常培地で培養した細胞、T3とRosiglitazoneを添加した脂肪細胞誘導培地で14日間培養した細胞と、T3、RosiglitazoneとD4476 を添加した脂肪細胞誘導培地で14日間培養した細胞を準備した。これら細胞に、図中に記載のように１０ μMのIsoproterenol、またはFSKを添加した。コントロールとして添加しない群も作った。5時間後に各wellから培養液を吸引除去し、PBS（－）で洗浄後、細胞からISOGEN IIにてtotal RNAを抽出した。実施例２と同様にqRT-PCRを行った。UCP1遺伝子のmRNAレベルをβアクチン遺伝子ｍRNAに対する比として定量し、通常培地で培養した線維芽細胞の値を１として算出した。
　その結果を図３に示す。T3およびRosiglitazoneに加えて、D4476 を添加した脂肪細胞誘導培地で14日間培養した細胞は、Isoproterenol、またはFSKの刺激によりUCP1のmRNAをさらに強く発現することがわかり、これら刺激に対して褐色脂肪細胞様の応答能を有することがわかる。
　実施例４
　ヒト正常皮膚由来線維芽細胞（human dermal fibroblasts; HDFs）を通常培地（10% FBSを添加したDulbecco’s modified minimum essential medium; DMEM）に縣濁した。これを1×104cells/wellの濃度で24-well plateに播種し（day 0）、5% CO2 /95% humid air 37℃で培養を開始した。翌日、培養上清を吸引除去し、図中に記載のとおり、通常培地、脂肪細胞誘導培地、または各化合物等を加えた脂肪細胞誘導培地を、500 μL/well加えた。
　脂肪細胞誘導培地は、10% FBS添加DMEM＋MDI培地（0.5 mM isobutylmethylxanthine（IBMX）、0.5 μM dexamethason、および1 μg/mL Insulinを添加した、10% FBS添加DMEM）である。
　添加物の濃度は以下のとおりである：
T3: 1 nM 
Rosiglitazone: 1 μM 
D4476: 2 μM
Pifithrin alpha［p53阻害剤］: 5 μM 
SB431542: 2 μM 
ALK5 Inhibitor II: 2 μM。
　3～4日に1度、培養液をフレッシュなものに置換し、day 14まで培養した。
Day 14に、各wellから培養液を吸引除去し、PBS（－）で洗浄後、細胞からISOGEN IIにてtotal RNAを抽出した。このRNAから、Rever Tra Ace qPCR RT Master Mixを用いてcDNAを合成した。このcDNAにReal-time PCR Master Mixと、CIDEA遺伝子またはβアクチン遺伝子に特異的なprimersとTaqman probeを混和した。AB7300 Real-time PCR systemを用いてqRT-PCRを行った。CIDEA遺伝子のmRNAレベルをβアクチン遺伝子ｍRNAに対する比として定量し、通常培地で培養した線維芽細胞の値を１として算出した。
　その結果を図４に示す。T3およびRosiglitazoneに加えて、D4476、SB431542、またはALK5 Inhibitor のいずれかを添加培養することにより、線維芽細胞がCIDEA遺伝子のmRNAを発現する褐色脂肪細胞にコンヴァートしたことがわかる。
　実施例５
　ヒト正常皮膚由来線維芽細胞（human dermal fibroblasts; HDFs）を通常培地（10% FBSを添加したDulbecco's modified minimum essential medium; DMEM）に縣濁した。これを1×104cells/wellの濃度で24-well plateに播種し（day 0）、5% CO2 /95% humid air 37℃で培養を開始した。翌日、培養上清を吸引除去し、図中に記載のとおり、通常培地、脂肪細胞誘導培地、または各化合物等を加えた脂肪細胞誘導培地を、500 μL/well加えた。
　脂肪細胞誘導培地は、10% FBS添加DMEM＋MDI培地（0.5 mM isobutylmethylxanthine（IBMX）、0.5 μM dexamethason、および1 μg/mL Insulinを添加した、10% FBS添加DMEM）である。
　添加物の濃度は以下のとおりである：
T3: 1 nM 
Rosiglitazone: 1 μM 
Pifithrin alpha［p53阻害剤］: 5 μM 
Forskolin（FSK）: 2 μM 
PD0325901: 1 μM。
　3～4日に1度、培養液をフレッシュなものに置換し、day 14まで培養した。
　Day 14に、各wellから培養液を吸引除去し、PBS（－）で洗浄後、細胞からISOGEN IIにてtotal RNAを抽出した。このRNAから、Rever Tra Ace qPCR RT Master Mixを用いてcDNAを合成した。このcDNAにReal-time PCR Master Mix、および、PGC-1alphaまたはβアクチン遺伝子に特異的なprimersとTaqman pobeを混和した。AB7300 Real-time PCR systemを用いてqRT-PCRを行った。PGC-1alpha遺伝子のmRNAレベルをβアクチン遺伝子ｍRNAに対する比として定量し、通常培地で培養した線維芽細胞の値を１として算出した。
　その結果を図５に示す。T3およびRosiglitazoneに加えて、Forskolin（FSK）またはPD0325901のいずれかを添加培養することにより、線維芽細胞がPGC-1alpha遺伝子のmRNAを発現する褐色脂肪細胞にコンヴァートしたことがわかる。
　実施例６
　ヒト正常皮膚由来線維芽細胞（human dermal fibroblasts; HDFs）を通常培地（10% FBSを添加したDulbecco's modified minimum essential medium; DMEM）に縣濁した。これを1×104cells/wellの濃度で24-well plateに播種し（day 0）、5% CO2 /95% humid air 37℃で培養を開始した。翌日、培養上清を吸引除去し、図中に記載のとおり、通常培地、脂肪細胞誘導培地、または各小分子化合物等を加えた脂肪細胞誘導培地を、500 μL/well加えた。
　脂肪細胞誘導培地は、10% FBS添加DMEM＋MDI培地（0.5 mM isobutylmethylxanthine（IBMX）、0.5 μM dexamethason、および1 μg/mL Insulinを添加した、10% FBS添加DMEM）である。
　添加物の濃度は以下のとおりである：
T3: 1 nM 
Rosiglitazone: 1 μM 
D4476: 2 μM。
Pifithrin alpha［p53阻害剤］: 5 μM 
PD0325901: 1 μM
SB431542: 2 μM 
ALK5 Inhibitor II: 2 μM。
　3～4日に1度、培養液をフレッシュなものに置換し、day 14まで培養した。
　Day 14に、各wellから培養液を吸引除去し、PBS（－）で洗浄後、細胞からISOGEN IIにてtotal RNAを抽出した。このRNAから、Rever Tra Ace qPCR RT Master Mixを用いてcDNAを合成した。このcDNAにReal-time PCR Master Mix、および、AdipoQまたはβアクチン遺伝子に特異的なprimersとTaqman pobeを混和した。AB7300 Real-time PCR systemを用いてqRT-PCRを行った。AdipoQ遺伝子のmRNAレベルをβアクチン遺伝子ｍRNAに対する比として定量し、通常培地で培養した線維芽細胞の値を１として算出した。
　その結果を図６に示す。T3およびRosiglitazoneに加えて、D4476、PD0325901、SB431542またはALK5 Inhibitor IIのいずれかを添加培養することにより、線維芽細胞がAdipoQ遺伝子のmRNAを発現する褐色脂肪細胞にコンヴァートしたことがわかる。
　実施例７
　ヒト正常皮膚由来線維芽細胞（human dermal fibroblasts; HDFs）を通常培地（10% FBSを添加したDulbecco's modified minimum essential medium; DMEM）に縣濁した。これを1×104cells/wellの濃度で24-well plateに播種し（day 0）、5% CO2/95% humidified air、37℃で培養を開始した。翌日、培養上清を吸引除去し、図中に記載のとおり、通常培地、脂肪細胞誘導培地、または各小分子化合物等を加えた脂肪細胞誘導培地を、500 μL/well加えた。
　脂肪細胞誘導培地は、10% FBS添加DMEM＋MDI培地（0.5 mM isobutylmethylxanthine（IBMX）、0.5 μM dexamethason、および1 μg/mL Insulinを添加した、10% FBS添加DMEM）である。
　添加物の濃度は以下のとおりである：
T3: 1 nM 
Rosiglitazone: 1 μM 
D4476: 2 μM
SB431541: 2 μM
ALK5 inhibitor II: 2 μM。
　3～4日に1度、培養液をフレッシュなものに置換し、day 14まで培養した。
　Day 14に、各wellから培養液を吸引除去し、PBS（－）で洗浄した。その後、4%パラホルムアルデヒドで固定し、PBS（－）にて洗浄した後、BODIPY 493/503 (Invitrogen）/PBS溶液にて室温で5分間反応させ、PBSで3回Washした。蛍光顕微鏡を用いて倍率200倍で写真撮影を行い、また蛍光強度を計測した。
　その結果を図７Ａ（蛍光顕微鏡像）と図７Ｂ（蛍光強度）に示す。T3およびRosiglitazoneに加えて、D4476、SB431541、またはALK5 inhibitor IIのいずれかを添加培養することにより、線維芽細胞がBODIPYで染色される脂肪滴を有する褐色脂肪細胞にコンヴァートしたことがわかる。 
　実施例８
　ヒト正常皮膚由来線維芽細胞（human dermal fibroblasts; HDFs）を通常培地（10% FBSを添加したDulbecco's modified minimum essential medium; DMEM）に縣濁した。これを1×104cells/wellの濃度で24-well plateに播種し（day 0）、5% CO2/95% humidified air、37℃で培養を開始した。翌日、培養上清を吸引除去し、図中に記載のとおり、通常培地、脂肪細胞誘導培地、または各化合物等を加えた脂肪細胞誘導培地を、500 μL/well加えた。
　脂肪細胞誘導培地は、10% FBS添加DMEM＋MDI培地（0.5 mM isobutylmethylxanthine（IBMX）、0.5 μM dexamethason、および1 μg/mL Insulinを添加した、10% FBS添加DMEM）である。
　添加物の濃度は以下のとおりである：
T3: 1 nM 
Rosiglitazone: 1 μM 
D4476: 2 μM
SB431541: 2 μM
ALK5 inhibitor II: 2 μM
PD0325901: 1 μM
Forskolin（FSK）: 2 μM。
　3～4日に1度、培養液をフレッシュなものに置換し、day 14まで培養した。
　Day 14に、各wellから培養液を吸引除去し、PBS（－）で洗浄した。4%パラホルムアルデヒドで固定後、PBS（－）にて洗浄し、Perm Buffer（0.2% Triton-X添加PBS）を加えて15分間インキュベートした。PBS（－）にて3回洗浄した後、Blocking Oneを加えて、室温で60分間インキュベートした。
　抗USP-1抗体を加えて室温で2時間反応させた後、Wash bufferにて3回washした。Alexa 546-conjugated anti-mouse Ig抗体を加えて室温で1時間反応させた後、Wash bufferにて5回washした。蛍光顕微鏡を用いて倍率200倍で写真撮影を行い、また蛍光強度を計測した。
　その結果を図８Ａ及び図８Ｃ（蛍光顕微鏡像）と図８Ｂ（蛍光強度）に示す。T3およびRosiglitazoneに加えて、D4476、SB431541、ALK5 inhibitor II、PD0325901、またはForskolin（FSK）のいずれかを添加培養することにより、線維芽細胞がUCP1たんぱくを発現する褐色脂肪細胞に誘導されたことがわかる。またPD0325901またはForskolinを添加培養することにより、UCP-1たんぱく発現が増加することが分かる。さらに、T3およびRosiglitazoneに加えて、D4476とForskolinを共添加して培養することにより、線維芽細胞がよりUCP1たんぱくを強く発現する褐色脂肪細胞にコンヴァートしたことがわかる。 
　実施例９
　ヒト正常皮膚由来線維芽細胞（human dermal fibroblasts; HDFs）を通常培地（10% FBSを添加したDulbecco’s modified minimum essential medium; DMEM）に縣濁した。これを1×104 cells/wellの濃度で24-well plateに播種し（day 0）、5% CO2/95% humidified air、37℃で培養を開始した。翌日、培養上清を吸引除去し、図中に記載のとおり、通常培地、脂肪細胞誘導培地、または各小分子化合物等を加えた脂肪細胞誘導培地を、500 μL/well加えた。
　脂肪細胞誘導培地は、10% FBS添加DMEM＋MDI培地（0.5 mM isobutylmethylxanthine（IBMX）、0.5 μM dexamethason、および1 μg/mL Insulinを添加した、10% FBS添加DMEM）である。
　添加物の濃度は以下のとおりである：
T3: 1 nM 
Rosiglitazone: 1 μM 
D4476: 2 μM。
　3～4日に1度、培養液をフレッシュなものに置換し、day 14まで培養した。
　Day 14に、各wellから培養液を吸引除去し、PBS（－）で洗浄後、10%ホルマリンにて固定した。滅菌蒸留水で3回洗浄した後、Oil Red O染色液を加え、室温で15分間インキュベートした。その後滅菌蒸留水にて洗浄し、顕微鏡で100倍の倍率で撮影した。
　結果を図９に示す。RosiglitazoneおよびT3に加えてD4476を添加培養することにより、線維芽細胞が対照と比べて顕著なOil Red O染色が観察される褐色脂肪細胞にコンヴァートしたことがわかる。
　実施例１０
　ヒト正常皮膚由来線維芽細胞（human dermal fibroblasts; HDFs）を通常培地（10% FBSを添加したDulbecco’s modified minimum essential medium; DMEM）に縣濁した。これを1×10^4 cells/wellの濃度で24-well plateに播種し（day 0）、5% CO2/95% humidified air、37℃で培養を開始した。翌日、培養上清を吸引除去し、図中に記載のとおり、通常培地、脂肪細胞誘導培地、または各小分子化合物等を加えた脂肪細胞誘導培地を、500 μL/well加えた。
　脂肪細胞誘導培地は、10% FBS添加DMEM＋MDI培地（0.5 mM isobutylmethylxanthine（IBMX）、0.5 μM dexamethason、および1 μg/mL Insulinを添加した、10% FBS添加DMEM）である。
　添加物の濃度は以下のとおりである：
T3: 1 nM 
Rosiglitazone: 1 μM 
D4476: 2 μM。
　3～4日に1度、培養液をフレッシュなものに置換し、day 14まで培養した。
　Day 14に、各wellから培養液を吸引除去し、PBS（－）で洗浄した。4%パラホルムアルデヒドで固定後、PBS（－）にて洗浄し、Perm Buffer（0.2% Triton-X添加PBS）を加えて15分間インキュベートした。PBS（－）にて3回洗浄した後、Blocking Oneを加えて、室温で60分間インキュベートした。
　抗USP-1抗体を加えて室温で2時間反応させた後、Wash bufferにて3回washした。Alexa 546-conjugated anti-mouse Ig抗体を加えて室温で1時間反応させた後、Wash bufferにて5回washした。その後、BODIPY 493/503 (Invitrogen）/PBS溶液にて室温で5分間反応させ、PBSで3回Washし、DAPIで染色した。蛍光顕微鏡を用いて倍率200倍で写真撮影を行った。
　その結果を図１０Ａ及び図１０Ｂに示す。T3およびRosiglitazoneに加えて、D4476を添加培養することにより、線維芽細胞がBodipyで染色される脂肪滴とUCP1たんぱくを発現する褐色脂肪細胞にコンヴァートしたことがわかる。
　実施例１３(図13）
　ヒト正常皮膚由来線維芽細胞（human dermal fibroblasts; HDFs）を通常培地（10% FBS を添加したDulbecco's modified minimum essential medium（DMEM））に縣濁した。これを 3×104 cells/well の濃度で12-well plate に播種し、5% CO2/95% humidified air、37℃で培養を開始した。翌日（Day 0）、培養上清を吸引除去し、通常培地（群１）、、脂肪細胞誘導培地（群２）、またはALK5 inhibitor IIを4 μMの濃度で添加した脂肪細胞誘導培地(群３～８)を、1 mL/well 加えた。
　脂肪細胞誘導培地は、1 nM T3, 1 μM Rosiglitazone, 0.5 mM isobutylmethylxanthine（IBMX）、0.5 μM dexamethason、1 μg/mL Insulin および10% FBSを添加したDMEMである。
　2 日に1 度、培地をフレッシュなものに置換した。群３～７は、それぞれDays 0～2、Days 0～4、Days 0～6、Days 0～8、Days 0～10の期間のみALK5 inhibitor IIを添加した脂肪細胞誘導培地で培養し、その後はALK5 inhibitor IIを添加しない脂肪細胞誘導培地で培養した。群８は、Days 0～14の全期間、ALK5 inhibitor IIを添加した脂肪細胞誘導培地で培養した。Day 14 に、各well から培地を吸引除去し、PBS（－）で洗浄後、細胞からQiagen社製 RNA easy Mini Kitを用いてtotal RNA を抽出した。このRNA から、Rever Tra Ace qPCR RT Master Mix を用いてcDNA を合成した。このcDNA にReal-time PCR Master Mix と、UCP-1遺伝子またはβ アクチン遺伝子に特異的なprimers とTaqman probe を、混和した。AB7300 Real-time PCR system を用いてqRT-PCR を行った。UCP1 遺伝子のmRNA レベルをβ アクチン遺伝子ｍRNAレベルに対する比として定量し、通常培地で培養した線維芽細胞の値を１として算出した。
　結果を図１３に示す。脂肪細胞誘導培地中で、ALK5 inhibitor IIを添加培養することにより、線維芽細胞がUCP1 遺伝子を強発現する褐色脂肪細胞に誘導されたことがわかる。とくにALK5 inhibitor IIを0-8日間加え、その後、ALK5 inhibitor IIを含まない脂肪細胞誘導培地で６日間培養した群（群６）において最も高くUCP1 遺伝子の発現が誘導され、もっとも強く線維芽細胞を褐色脂肪細胞に誘導することがわかる。ALK5 inhibitor IIの存在下で培養を行った他の条件（群３～５、７、８）においてもUCP1遺伝子の高い発現が誘導された。
　実施例１４(図14)
　ヒト正常皮膚由来線維芽細胞（human dermal fibroblasts; HDFs）を通常培地（10% FBS を添加したDulbecco's modified minimum essential medium（DMEM））に縣濁した。これを 3×104 cells/well の濃度で12-well plate に播種し、5% CO2/95% humidified air、37℃で培養を開始した。翌日（Day 0）、培養上清を吸引除去し、通常培地（群１）、脂肪細胞誘導培地（群２）、またはALK5 inhibitor IIを4 μMの濃度で添加した脂肪細胞誘導培地(群３～８)を、1 mL/well 加えた。
　脂肪細胞誘導培地は、1 nM T3, 1 μM Rosiglitazone, 0.5 mM isobutylmethylxanthine（IBMX）、0.5 μM dexamethason、1 μg/mL Insulin および10% FBSを添加したDMEMである。
　2 日に1 度、培地をフレッシュなものに置換した。群３～７については、それぞれDays 0～2、Days 0～4、Days 0～6、Days 0～8、Days 0～10の期間のみALK5 inhibitor IIを添加した脂肪細胞誘導培地で培養し、その後はALK5 inhibitor IIを添加しない脂肪細胞誘導培地で培養した。群8は、Days 0～14の全期間、ALK5 inhibitor IIを添加した脂肪細胞誘導培地で培養した。Day 14 に、各well から培養液を吸引除去し、PBS（－）で洗浄後、Day 14 に、各well から培養液を吸引除去し、PBS（－）で洗浄した。4%パラホルムアルデヒドで固定後、PBS（－）にて洗浄し、Perm Buffer（0.2% Triton-X 添加PBS）を加えて15 分間インキュベートした。PBS（－）にて3 回洗浄した後、Blocking One を加えて、室温で60 分間インキュベートした。抗UCP-1 抗体(RD MAB6158)を加えて室温で2 時間反応させた後、Wash buffer にて3 回wash した。CF488-conjugated anti-mouse Ig 抗体(Biotum 20014)を加えて室温で2 時間反応させた後、PBS(-) にて3 回wash した。Lifetechnology社製SlowFade Gold antifade reagent with DAPIで核染色したのち蛍光顕微鏡を用いて倍率100 倍で写真撮影を行った。
　結果を図１４Ａ及び１４Ｂ（蛍光顕微鏡像）に示す。ALK5 inhibitor IIを加えた群では、線維芽細胞がUCP1タンパク質を高発現する褐色脂肪細胞に誘導されたことがわかる。とくにALK5 inhibitor IIを0-8日間加え、その後、ALK5 inhibitor IIを含まない脂肪細胞誘導培地で６日間培養した群（図中、＃６）においてUCP1タンパク質の染色強度が高くかつ染色陽性の細胞が多く、もっとも強く線維芽細胞を褐色脂肪細胞に誘導することがわかる。ALK5 inhibitor IIの存在下で培養を行った他の条件（図中、＃２～５、７、８）においてもUCP1タンパク質の高発現が検出された。
　実施例１５(図15）
　ヒト正常皮膚由来線維芽細胞（human dermal fibroblasts; HDFs）を通常培地（10% FBS を添加したDulbecco's modified minimum essential medium; DMEM）に縣濁した。これを 3×104 cells/well の濃度で12-well plate に播種し、5% CO2/95% humidified air、37℃で培養を開始した（Day -1）。コントロール（Ctrl）群は、翌日（Day 0）培養上清を吸引除去し、2 日に1 度培地をフレッシュなものに置換しながら、Day 14まで通常培地で培養した。コントロール（Ctrl）群以外の群は、Day 0に培養上清を吸引除去し、脂肪細胞誘導培地、またはALK5 inhibitor II、SB431542、LY2157299及びD4476のいずれかの化合物をそれぞれ4 μM、8 μM、12 μM、16 μMの濃度で添加した脂肪細胞誘導培地を、1mL/well 加えた。
　脂肪細胞誘導培地は、1 nM T3, 1 μM Rosiglitazone, 0.5 mM isobutylmethylxanthine（IBMX）、0.5 μM dexamethason、1 μg/mL Insulin および10% FBSを添加したDMEMである。
　2 日に1 度、培地をフレッシュなものに置換してDay 9まで培養した。その後、Day 9 － Day 14は、ALK5 inhibitor II、SB431542、LY215799及びD4476のいずれの化合物も含まない脂肪細胞誘導培地で培養した。Day 14 に、すべての群のwell から培地を吸引除去し、PBS（－）で洗浄後、細胞からQiagen社製 RNA easy Mini Kitを用いてtotal RNA を抽出した。このRNA から、Rever Tra Ace qPCR RT Master Mix を用いてcDNA を合成した。このcDNA にReal-time PCR Master Mix と、UCP-1遺伝子またはβ アクチン遺伝子に特異的なprimers とTaqman probe を、混和した。AB7300 Real-time PCR system を用いてqRT-PCR を行った。UCP1 遺伝子のmRNA レベルをβ アクチン遺伝子ｍRNAレベルに対する比として定量し、通常培地で培養した線維芽細胞の値を１として算出した。
　結果を図１５に示す。ALK5 inhibitor II、SB431541、LY2157299及びD4476のいずれかを添加して培養することにより、線維芽細胞がUCP1 遺伝子を強発現する褐色脂肪細胞に誘導されたことがわかる。とくにALK5 inhibitor IIがもっとも強く線維芽細胞を褐色脂肪細胞に誘導し、LY2157299がそれに次ぐことがわかる。本実施例においては、褐色脂肪細胞への誘導効率はALK5 inhibitor II＞LY2157299＞SB431541＞D4476の順であった。
　実施例１６(図16)
　ヒト正常皮膚由来線維芽細胞（human dermal fibroblasts; HDFs）を通常培地（10% FBS を添加したDulbecco's modified minimum essential medium; DMEM）に縣濁した。これを 3×104 cells/well の濃度で12-well plate に播種し、5% CO2/95% humidified air、37℃で培養を開始した。翌日（Day 0）、培養上清を吸引除去し、ALK5 inhibitor II (4 μM)、LY2157299 (8 μM)、SB431542 (4 μM)及びD4476 (4 μM)のいずれかの化合物を加えた脂肪細胞誘導培地を、1mL/well 加えた。
　脂肪細胞誘導培地は、1 nM T3, 1 μM Rosiglitazone, 0.5 mM isobutylmethylxanthine（IBMX）、0.5 μM dexamethason、1 μg/mL Insulin および10% FBSを添加したDMEMである。
　2 日に1 度、培地をフレッシュなものに置換してDay 9まで培養した。その後、Day 9からDay 14は、ALK5 inhibitor II、SB431542、LY215799及びD4476のいずれの化合物も含まない脂肪細胞誘導培地で培養した。Day 14 に、各well から培地を吸引除去し、PBS（－）で洗浄した。4%パラホルムアルデヒドで固定後、PBS（－）にて洗浄し、Perm Buffer（0.2% Triton-X 添加PBS）を加えて15 分間インキュベートした。PBS（－）にて3 回洗浄した後、Blocking One を加えて、室温で60 分間インキュベートした。抗UCP-1 抗体(RD MAB6158)を加えて室温で2 時間反応させた後、Wash buffer にて3 回wash した。CF488-conjugated anti-mouse Ig 抗体(Biotum 20014)を加えて室温で2 時間反応させた後、PBS (-) にて3 回wash した。Lifetechnology社製SlowFade Gold antifade reagent with DAPIで核染色したのち蛍光顕微鏡を用いて倍率100 倍で写真撮影を行った。
　その結果を図１６Ａ及び図１６Ｂ（蛍光顕微鏡像）に示す。ALK5 inhibitor II、LY2157299、SB431541、D4476、のいずれかを添加培養することにより、線維芽細胞がUCP1 たんぱくを発現する褐色脂肪細胞に誘導されたことがわかる。とくに、AKL5 inhibitor IIがもっとも強くUCP1遺伝子の発現を誘導し、LY2157299がそれに次ぐことがわかる。
　実施例１７(図17）
　ヒト正常皮膚由来線維芽細胞（human dermal fibroblasts; HDFs）を通常培地（10% FBS を添加したDulbecco's modified minimum essential medium; DMEM）に縣濁した。これを 3×104 cells/well の濃度で12-well plate に播種し、5% CO2/95% humidified air、37℃で培養を開始した（Day -1）。コントロール（Ctrl）群は、翌日（Day 0）培養上清を吸引除去し、2 日に1 度培地をフレッシュなものに置換しながら、Day 14まで通常培地で培養した。コントロール（Ctrl）群以外の群は、Day 0に培養上清を吸引除去し、ALK5 inhibitor II（4μM）及びLY2157299（8μM）のいずれかの化合物を添加した脂肪細胞誘導培地を、1 mL/well 加えた。
　脂肪細胞誘導培地は、1 nM T3, 1 μM Rosiglitazone, 0.5 mM isobutylmethylxanthine（IBMX）、0.5 μM dexamethason、1 μg/mL Insulin および 10% FBSを添加したDMEMである。
　2 日に1 度、培地をフレッシュなものに置換してDay 9まで培養した。その後、Day 9 － Day 14は、ALK5 inhibitor IIとLY215799のいずれの化合物も含まない脂肪細胞誘導培地で培養した。Day 14 に、すべての群のwellから培地を吸引除去し、PBS（－）で洗浄後、細胞からQiagen社製 RNA easy Mini Kitを用いてtotal RNA を抽出した。このRNA から、Rever Tra Ace qPCR RT Master Mix を用いてcDNA を合成した。このcDNA にReal-time PCR Master Mix と、UCP-1遺伝子、CIDEA遺伝子、KCNK3遺伝子またはβ アクチン遺伝子に特異的なprimers とTaqman probe を混和した。AB7300 Real-time PCR system を用いてqRT-PCR を行った。UCP1 遺伝子のmRNA レベルをβアクチン遺伝子ｍRNAに対する比として定量し、通常培地で培養した線維芽細胞の値を１として算出した。
　結果を図17に示す。ALK5 inhibitor II、LY2157299、のいずれかを8日間添加して培養することにより、線維芽細胞がUCP1遺伝子、CIDEA遺伝子及びKCNK3遺伝子発現がする褐色脂肪細胞に誘導されたことがわかる。とくに、AKL5 inhibitor IIがより強くUCP1遺伝子の発現を誘導したことがわかる。

Claims (9)

  1. 　哺乳動物の分化した体細胞を培地中、
    （１）TGFβ/SMADパスウェイ阻害剤、
    （２）カゼインキナーゼ１阻害剤、
    （３）cAMP誘導剤、及び
    （４）MEK/ERKパスウェイ阻害剤
    からなる群から選択される少なくとも１種の化合物の存在下に培養して前記体細胞を褐色脂肪細胞にコンヴァートさせることを特徴とする、褐色脂肪細胞を調製する方法。
  2. 　前記体細胞が線維芽細胞である、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記培地が、甲状腺ホルモン及びPPARγアゴニストを添加した脂肪細胞誘導培地である、請求項１または２に記載の方法。
  4. （１）TGFβ/SMADパスウェイ阻害剤、
    （２）カゼインキナーゼ１阻害剤、
    （３）cAMP誘導剤、及び
    （４）MEK/ERKパスウェイ阻害剤
    からなる群から選択される少なくとも１種の化合物を含む、分化した体細胞を褐色脂肪細胞にコンヴァートさせるための誘導剤。
  5. （１）TGFβ/SMADパスウェイ阻害剤、
    （２）カゼインキナーゼ１阻害剤、
    （３）cAMP誘導剤、及び
    （４）MEK/ERKパスウェイ阻害剤
    からなる群から選択される少なくとも１種の化合物、並びに、培地を含む分化した体細胞を褐色脂肪細胞にコンヴァートするためのキット。
  6. 　前記培地が、甲状腺ホルモン及びPPARγアゴニストを添加した脂肪細胞誘導培地である、請求項５に記載のキット。
  7. 　肥満、糖尿病、耐糖能異常、脂質代謝異常、動脈硬化性疾患、高血圧、高尿酸血症、痛風、非アルコール性脂肪性肝疾患、メタボリックシンドロームの予防又は治療剤であって、請求項１～３のいずれかに記載の方法により調製された褐色脂肪細胞を有効成分とする、予防又は治療剤。
  8. 　請求項１～３のいずれかに記載の方法により調製された褐色脂肪細胞を用いた、肥満、糖尿病、耐糖能異常、脂質代謝異常、動脈硬化性疾患、高血圧、高尿酸血症、痛風、非アルコール性脂肪性肝疾患、メタボリックシンドロームの予防又は治療のための使用。
  9. 　請求項１～８のいずれかに記載の方法により調製された褐色脂肪細胞を含む、移植材料。
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