CN114127266A - 肌肉骨骼系统干细胞的选择性分化调节方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及从胚胎干细胞(ESC，embryonic stem cell)或者诱导性多能干细胞(iPSC，induced pluripotent stem cell)分化的新型肌肉骨骼系统干细胞(MSSC，musculoskeletal stem cell)、从上述肌肉骨骼系统干细胞能够选择性地分化为骨、牙齿、软骨、韧带及肌肉的用于诱导分化的培养基组合物及与其相关的诱导分化的方法。

Description

肌肉骨骼系统干细胞的选择性分化调节方法

技术领域

本发明涉及具有分化为肌肉骨骼组织的能力的肌肉骨骼系统干细胞以及使其选择性地分化为肌肉、韧带、软骨、骨或牙齿组织的调节方法。

背景技术

肌肉骨骼系统疾病为发生于肌肉与骨骼系统的疾病，可以细分为发生于骨、牙齿、肌肉、肌腱、神经、关节及其他结缔组织部位的疾病，是由于过度用力、反复的动作、不适当的工作姿势、身体与尖锐面的接触、振动及温度等因素表现出的健康障碍的统称(Buckwalter e t al.,1993)。成为老人后也引起肌肉骨骼系统的变化。肌肉的量减少，功能下降，关节的软骨也发生退行性变化，从而因关节炎引起疼痛及运动受限。而且，相比于骨吸收，骨组织的骨形成降低，引起骨质疏松症而易于发生骨折(张在石，2009)。

1988年，欧文(Owen)等人在研究中首次发现骨髓源性间充质干细胞可以在特定条件下通过体外培养分化为骨细胞、软骨细胞、肌肉细胞、脂肪细胞、纤维细胞、韧带及肌腱，从而提出了应用于再生医学的可能性(Owen M.J.Cell Sci.Suppl 1988；10:63-76)。然而，尽管进行了多次的临床尝试，但至今仍未获得将间充质干细胞直接再生为肌肉骨骼组织的治疗的成功(ClinicalTrials.Gov.)。

有关骨骼肌损伤的(skeletal muscle damage)干细胞治疗虽然尝试了移植直接分化为肌纤维的卫星细胞(satellite cells)之类的骨骼肌源性干细胞或者利用细胞和支撑体的组织工程学方法，但据报告，卫星细胞虽能够在体外增殖，但由于培养时间短，当注入肌肉内时，分化及再生的能力低(NA Dumont et al.compr.physiol.5(30)；1027 -1059；2015)。

近来，在小鼠及人类体内发现了细胞特性与间充质干细胞的细胞完全不同的骨骼干细胞(skeletal stem cells)，查明其与骨及软骨的再生相关，证明利用其可以再生骨骼(Chan CKF et al.,Cell 175(1)； 43-56；2018)。

本发明人在之前的发明(韩国专利申请第10-2018-0127501号)中开发了能够从胚胎干细胞和诱导性多能干细胞之类的多能干细胞分化为骨、肌肉、软骨、脂肪、肌腱或韧带等的肌肉骨骼系统干细胞(Mu sculoskeletal stem cell)的诱导方法。该肌肉骨骼系统干细胞可以从能够无限增殖的胚胎干细胞或者诱导性多能干细胞诱导，并且细胞还能够继代增殖培养10代以上，因此，是适于肌肉骨骼系统疾病患者肌肉骨骼组织再生的细胞。为了将该肌肉骨骼系统干细胞有效用于治疗肌肉骨骼疾病，需要开发能够诱导选择性地分化为骨、牙齿、肌肉、软骨、肌腱或韧带等的方法。

通过上述背景技术说明的事项仅用于增进对本发明的背景的理解，但不应视为将其认定为本发明所属技术领域的普通技术人员已知的现有技术。

发明内容

技术问题

本发明人确认到可以从人类胚胎干细胞(hESC)或者人类诱导性多能干细胞(hiPSC)诱导肌肉骨骼系统干细胞(hMSSC)，并且上述肌肉骨骼系统干细胞可以通过软骨内骨化分化为骨，不仅如此，还可以选择性地分化为牙齿、软骨、肌腱、韧带或肌肉等肌肉骨骼组织，从而完成本发明。

因此，本发明的目的在于，提供用于诱导分化为肌肉骨骼系统干细胞的培养基组合物。

本发明的再一目的在于，提供制备肌肉骨骼系统干细胞的方法，包括在上述培养基中培养胚胎干细胞(ESC)或者诱导性多能干细胞(i PSC)的步骤。

本发明的另一目的在于，提供从胚胎干细胞或者诱导性多能干细胞分化的肌肉骨骼系统干细胞。

本发明的还有一目的在于，提供包含上述肌肉骨骼系统干细胞的用于预防或治疗肌肉骨骼系统疾病的药剂学组合物。

本发明的又一目的在于，提供筛选上述肌肉骨骼系统干细胞的方法。

本发明的又一目的在于，提供诱导从上述肌肉骨骼系统干细胞选择性地分化为肌肉、软骨、肌腱、韧带、骨或牙齿的用于诱导分化的培养基组合物。

本发明的又一目的在于，提供诱导从上述肌肉骨骼系统干细胞选择性地分化为肌肉、软骨、肌腱、韧带、骨或牙齿的方法。

本发明的又一目的在于，提供治疗损伤的肌腱或韧带的方法，包括向对象的受损伤的肌腱或韧带部位施用上述肌肉骨骼系统干细胞的步骤。

本发明的又一目的在于，提供治疗关节炎的方法，包括向对象的关节腔内施用上述肌肉骨骼系统干细胞的步骤。

本发明的其他目的及优点将通过下述发明的详细说明、发明要求保护范围及附图进一步明确。

解决问题的方案

根据本发明的一实施方式，本发明提供用于诱导分化为肌肉骨骼系统干细胞(MSSC，musculoskeletal stem cell)的培养基组合物，包含头蛋白(noggin)、白血病抑制因子(LIF，leukemia inhibitory facto r)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF，basicFibroblast growth factor)、 Wnt信号激活剂、细胞外信号调节激酶(EKR，extracellularsignal-reg ulated kinase)信号抑制剂以及转化生长因子-β/激活素/nodal(TGF-β/activin/nodal)信号传导抑制剂。

本发明人找出了能够从人类胚胎干细胞或者人类诱导性多能干细胞诱导肌肉骨骼系统干细胞的最佳的培养基组合，确认到上述肌肉骨骼系统干细胞可以通过软骨内骨化分化为骨，不仅如此，还可以选择性地分化为牙齿、软骨、肌腱、韧带或肌肉等肌肉骨骼组织，从而完成本发明。

在本说明书中，术语“干细胞”是指具有能够分化为多种身体组织的能力的未分化细胞，可以分为全能干细胞(totipotent stem cel l)、多能干细胞(pluripotent stemcell)、专能干细胞(multipotent ste m cell)等。上述干细胞可以与前体细胞(precursorcell)、祖细胞(p rogenitor cells)等术语互换使用。在本发明中，干细胞可以为胚胎干细胞、诱导性多能干细胞或间充质干细胞(Mesenchymal stem cells， MSC)。因此，使用本发明的培养基组合物可以利用胚胎干细胞、诱导性多能干细胞诱导肌肉骨骼系统干细胞的分化。

上述胚胎干细胞是指具有多能性的细胞，是指包括在不转化的情况下增殖、无限增殖、自体再生及可以发育为包括源自三种胚层中任意细胞的能力的胚胎干细胞的特性，但不限定于此。

在本说明书中，术语“肌肉骨骼系统干细胞”是指可以不受限制地分化为骨、软骨、肌腱、韧带、牙齿、脂肪和/或肌肉的细胞。

上述“分化”是指细胞在分裂增殖并生长的过程中相互间的结构或功能被特殊化的现象，即，为了执行分别赋予生物的细胞、组织等的功能而使形态或功能发生变化的现象。通常是从比较单纯的系统向两个以上的性质不同的部分系统分离的现象。在个体发育中，最初几乎同质的生物系统部分之间出现性质上的差异，例如，从最初为同质的卵部分之间出现的头或躯干等的差异或者在细胞中肌细胞或神经细胞等的差异，或者其结果为被分为能够在性质上区分的部分或者部分系统的状态，这种现象称之为分化。

本说明书所使用的胚胎干细胞或者诱导性多能干细胞源自人类、牛、马、山羊、绵羊、狗、猫、小鼠、大鼠或者鸟类等，优选地，源自人类。

在本说明书中，术语“对象”或者“subject”是指需得到施用本发明的肌肉骨骼系统干细胞或者由其分化的细胞的对象，包括：人类；牛、马、山羊、绵羊、狗、猫、小鼠、大鼠等哺乳类动物；鸟类；爬虫类；两栖类；以及鱼类。

优选地，本发明的Wnt信号激活剂为SB216763(3-(2,4-二氯苯基) -4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-1H-吡咯-2,5-二酮)、SB415286(3-[(3-氯-4- 羟苯基)氨基]-4-(2-硝苯基)-1H-吡咯-2,5-二酮)、肯帕罗酮(Kenpaullon e；9-溴-7,12-二氢-吲哚并[3,2-d][1]苯并氮杂卓-6(5H)-酮)、CHIR99021 (9-溴-7,12-二氢-吡啶并[3',2':2,3]氮杂卓并[4,5-b]吲哚-6(5H)-酮)、C P21R7(3-(3-氨基-苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)吡咯-2,5-二酮)、SB2 03580(4-(4-氟苯基)-2-(4-甲基亚磺酰基苯基)-5-(4-吡啶基)-1H-咪唑)、 H-89(5-异喹啉磺酰胺)、嘌呤胺(Purmorphamine；9-环己基-N-[4-(4- 吗啉基)苯基]-2-(1-萘氧基)-9H-嘌呤-6-胺)或者IQ-1(2-(4-乙酰基-苯基偶氮)-2-[3,3-二甲基-3,4-二氢-2H-异喹啉-(1E)-亚基]-乙酰胺)，但不限定于此。

优选地，本发明的细胞外信号调节激酶(EKR)信号抑制剂为AS 703026(N-[(2S)-2,3-二羟基丙基]-3-[(2-氟-4-碘苯基)氨基]-4-吡啶甲酰胺)、AZD6244(6-(4-溴-2-氯苯基)-7-氟-N-(2-羟基乙氧基)-3-甲基苯并咪唑-5-甲酰胺)、PD0325901(N-[(2R)-2,3-二羟基丙氧基]-3,4-二氟-2-[(2 -氟-4-碘苯)氨基]苯甲酰胺)、ARRY-438162(5-[(4-溴-2-氟苯基)氨基]- 4-氟-N-(2-羟基乙氧基)-1-甲基-1H-苯并咪唑-6-甲酰胺)、RDEA119((S) -N-(3,4-二氟-2-((2-氟-4-碘苯基)氨基)-6-甲氧基苯基)-1-(2,3-二羟基丙基)环丙烷-1-磺酰胺)、GDC0973([3,4-二氟-2-[(2-氟-4-碘苯基)氨基]苯基][3-羟基-3-(2S)-2-哌啶基-1-氮杂环丁基]甲酮)、TAK-733((R)-3-(2,3 -二羟丙基)-6-氟-5-(2-氟-4-碘苯氨基)-8-甲基吡啶[2,3-d]嘧啶-4,7(3H,8H) -二酮)、RO5126766(3-[2-[(甲氨基磺酰基)氨基]-3-氟吡啶-4-基]甲基]- 4-甲基-7-[(嘧啶-2-基)氧]-2H-1-苯并吡喃-2-酮)或者XL-518([3,4-二氟 -2-[(2-氟-4-碘苯基)氨基]苯基][3-羟基-3-[(2S)-2-哌啶基]-1-氮杂环丁基] 甲酮)，但不限定于此。

优选地，本发明的转化生长因子-β/激活素/nodal信号传导抑制剂为E-616452(2-[3-(6-甲基-2-吡啶基)-1H-吡唑-4-基]-1,5-萘啶)、A-83- 01(3-(6-甲基-2-吡啶基)-N-苯基-4-(4-喹啉基)-1H-吡唑-1-硫代甲酰胺) 或者SB431542(4-[4-(1,3-苯并二唑-5-基)-5-(2-吡啶基)-1H-咪唑-2-基]- 苯酰胺)，但不限定于此。

根据本发明的一实施例，将分别不包含作为上述培养基的组分的头蛋白(noggin)、白血病抑制因子、碱性成纤维细胞生长因子、Wnt 信号激活剂、细胞外信号调节激酶信号抑制剂转化生长因子-β/激活素/ nodal信号传导抑制剂中的一种的情况与包含上述全部组分的情况的分化能力相比较的结果，确认到在缺乏上述成分中的任一种的情况下，无法正常分化为软骨(阿尔新蓝(Alcian blue))或骨(血清碱性磷酸酶(ALP)及茜素红S(SAlizarin red S))(图7，表3)。

并且，对使用添加条件培养基(Conditioned Media)(利用在完全培养基中使用Knockout DMEM替换DMEM/F12的培养基(使用20％ Knockout血清替代品(SerumReplacement)(Invitrogen公司，美国)、 1mM的谷氨酰胺(glutamine)、1％的非必需氨基酸(Invitrogen公司，美国)、0.1mM的β-巯基乙醇、0.1％的青霉素-链霉素、5mg/ml的牛血清白蛋白(bovine serum albumin)补充的Knockout DMEM)培养CF 1小鼠胚胎成纤维细胞(CF1mouse embryonic fibroblasts)24小时后获得的培养上清液)替换上述头蛋白的培养基的分化能力进行比较的结果，确认到利用头蛋白的本发明的培养基组合物与利用上述条件培养基的情况相比，骨分化的倾向性增加10倍以上，分化速度加快1周～ 2周以上(表1及表2)。

根据本发明的再一实施方式，本发明提供制备肌肉骨骼系统干细胞的方法，包括在上述用于诱导分化为肌肉骨骼系统干细胞的培养基组合物中培养胚胎干细胞或者诱导性多能干细胞的步骤。

上述培养为在不改变培养基组合的情况下继代培养5代以上，优选地，继代培养5代至25代，更优选地，继代培养7代至18代。

根据本发明的一实施例，确认到通过上述方法培养并分化的肌肉骨骼系统干细胞为使用肌肉骨骼细胞诱导培养基从人类胚胎干细胞或者人类诱导性多能干细胞开始继代培养7代以上而获得的稳定地具有相同形态性质的细胞，从第7代到第17代的十个以上继代中以相似的形态生长，第19代以后，染色作为老化标志物的β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)的结果表现出阳性反应，从而确认到已经开始老化(图1a)。

根据本发明的另一实施方式，本发明提供利用上述用于诱导分化为肌肉骨骼系统干细胞的培养基组合物制备的肌肉骨骼系统干细胞。

根据本发明的还有一实施方式，本发明提供从胚胎干细胞或者诱导性多能干细胞分化的肌肉骨骼系统干细胞。

根据本发明的优选实例，本发明的肌肉骨骼系统干细胞具有如下特征：a)作为外胚层标志物的巢蛋白(Nestin，NES)呈阳性；b)作为肌卫星细胞标志物(myogenicsatellite marker)的Pax7呈阳性；c) 作为中胚层标志物的α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)呈阳性；以及d)作为多能性标志物的LIN28呈阴性。

根据本发明的优选实例，本发明的肌肉骨骼系统干细胞还具有如下特征：作为间充质干细胞标志物的CD90呈阴性。

根据本发明的优选实例，本发明的肌肉骨骼系统干细胞还具有如下特征：作为间充质干细胞标志物的CD271呈阴性。

根据本发明的优选实例，本发明的肌肉骨骼系统干细胞还具有如下特征：作为多能性标志物的DPPA4呈阳性。

根据本发明的优选实例，本发明的肌肉骨骼系统干细胞还具有如下特征：作为中胚层标志物的T及Nodal呈阴性。

根据本发明的优选实例，本发明的肌肉骨骼系统干细胞还具有如下特征：作为神经外胚层(neuroectoderm)标志物的Pax6呈阳性。

根据本发明的优选实例，本发明的肌肉骨骼系统干细胞还具有如下特征：作为肠干细胞(intestinal stem cell)标志物的LGR5呈阳性。

根据本发明的优选实例，本发明的肌肉骨骼系统干细胞还具有如下特征：作为软骨细胞(chondrocyte)标志物的SOX9呈阴性。

根据本发明的优选实例，本发明的肌肉骨骼系统干细胞还具有如下特征：作为肌肉细胞(myoblast)标志物的MyoD呈阴性。

根据本发明的优选实例，本发明的肌肉骨骼系统干细胞的CD10、 CD44、CD105、CD146和/或CD166呈阳性。

根据本发明的一实施例，本发明的肌肉骨骼系统干细胞虽未观察到大部分的多能性标志物的表达，但却观察到DPPA4的表达，作为外胚层标志物的NES呈阳性。并且，确认到DES及除作为初始中胚层标志物的T及Nodal以外的大部分中胚层标志物呈阳性，大部分内胚层标志物呈阴性(图1c)。并且，为了查明肌肉骨骼系统干细胞的特性而调查间充质干细胞特异性细胞表面抗原的表达的结果，确认到在肌肉骨骼系统干细胞中表达了间充质干细胞标志物中的CD44、CD51、CD 73、CD105、CD146、CD166，相反，在肌肉骨骼系统干细胞中没有表达间充质干细胞标志物中的CD90及CD271。并且，没有表达作为血液系统细胞表面标志物的CD2、CD3、CD7、CD8、CD11b、CD14、C D19、CD20、CD31、CD34、CD56，相反，表达了作为前B(pre-B) 细胞标志物的CD10(图1d)。进一步地，分析多个系统组织特异性标志物的表达的结果，表达了作为中胚层标志物的α-平滑肌肌动蛋白(al pha smooth muscle actin，α-SMA)、作为神经外胚层标志物(neuroec toderm marker)的Pax6、作为肌卫星细胞标志物(myogenic satellite marker)的Pax7及作为肠干细胞标志物(intestinal stem cellmarker) 的LGR5等，没有表达作为软骨细胞标志物(chondrocyte marker)的 SOX9及作为成肌细胞标志物(myoblast marker)的MyoD等(图1e)。

根据本发明的优选实例，上述肌肉骨骼系统干细胞虽然分化为中胚层，但不分化为外胚层或者内胚层。

根据本发明的优选实例，上述肌肉骨骼系统干细胞具有分化为肌肉、骨、软骨、肌腱或韧带的特性。

根据本发明的一实施例，确认到在将本发明的肌肉骨骼系统干细胞在间充质干细胞培养基(例如MSCGM、MSCGM-CD等)中培养后移植到肾脏内(kidney capsule)或者皮下的情况下，在肾脏内或者皮下完全地形成肌肉、脂肪、肌腱、骨、软骨(图3)。确认上述分化的肌肉组织的结果，确认到全部分化为骨骼肌而未分化为平滑肌，确认到与在体外(in-vitro)试验中不分化为脂肪的结果不同，在体内(in- vivo)试验中也可以分化为脂肪。

根据本发明的优选实例，上述肌肉骨骼系统干细胞具有不分化为神经的特性。

根据本发明的一实施例，将上述肌肉骨骼系统干细胞在神经分化培养基中分化为神经细胞并利用神经细胞标志物进行确认的结果，确认到上述肌肉骨骼系统干细胞不具有分化为神经细胞的潜力(图2e)。

根据本发明的优选实例，上述肌肉骨骼系统干细胞具有不分化为内皮细胞的特性。

根据本发明的一实施例，将上述肌肉骨骼系统干细胞在内皮细胞 (EC)分化培养基(endothelial growth medium)中分化为内皮细胞并利用内皮细胞标志物进行确认的结果，确认到上述肌肉骨骼系统干细胞不具有分化为内皮细胞的潜力(图2c及图2d)。

上述肌肉骨骼系统干细胞于2018年09月28日以第KCLRF-BP-0 0460号的保藏编号保藏于韩国细胞系库。

根据本发明的又一实施方式，本发明提供包含上述肌肉骨骼系统干细胞用于预防或治疗肌肉骨骼系统疾病的药剂学组合物。

根据本发明的又一实施方式，本发明提供包含上述肌肉骨骼系统干细胞的细胞治疗剂。

根据本发明的又一实施方式，本发明提供包含上述肌肉骨骼系统干细胞的用于预防或治疗肌肉骨骼系统疾病的药剂学组合物的用途。

根据本发明的又一实施方式，本发明提供预防或治疗肌肉骨骼疾病的方法，包括向患者施用上述肌肉骨骼系统干细胞的步骤。

在本说明书中，术语“肌肉骨骼系统疾病”是指出现在骨、软骨、牙齿、肌肉、韧带、肌腱、神经等部位的疾病，优选地，为选自由骨质疏松症、骨软化症、成骨不全症(osteogenesis imperfecta)、骨硬化病(osteopetrosis)、骨质硬化(osteosclerosis)、佩吉特病(Paget's dis ease)、骨癌、关节炎、类风湿关节炎、佝偻病、骨折、牙周疾病、龋齿、牙龈炎、牙周炎、牙槽骨萎缩、牙齿的损伤或者缺损、阶段性骨缺损、骨溶解性骨疾病、原发性及继发性甲状旁腺功能亢进、骨肥厚症、退行性关节炎、变形性膝关节病、变形性髋关节病、变形性踝关节病、变形行腕关节病、变形性肩关节病、变形性肘关节病、膝关节软骨软化病、单纯性膝关节炎、剥脱性骨软骨炎、肱骨外上髁炎、肱骨内上髁炎、赫伯登结节、布夏尔结节、变形性拇指CM关节病、半月板损伤、腰椎间盘退变、十字韧带肱二头肌、十字韧带破裂、韧带损伤、肌腱损伤肩周炎、类风湿热、系统性硬化症、系统性红斑狼疮、埃勒斯-当洛综合征、马方综合征、坏血病、股四头肌破裂、膝关节韧带破裂、腓骨肌腱疾病、跟腱疾病、足底筋膜炎、肩袖撕裂、钙化性肌腱炎、肩峰撞击综合征、再发性脱臼、习惯性脱臼、老年性肌肉萎缩、重症肌无力、肌强直、肌萎缩性侧索硬化症、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、炎症性肌肉病变、腓骨肌萎缩及肌营养不良症组成的组中的一种以上，但不限定于此。

本发明的药剂学组合物可以包含药剂学上可接受的载体。上述组合物中包含的药剂学上可接受的载体为制剂时通常使用的，包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、海藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁及矿物油等，但不限定于此。除上述成分外，上述药剂学组合物还可以包含润滑剂、湿润剂、甜味剂、香味剂、乳化剂、悬浮剂、保存剂等。

本发明的药剂学组合物口服或者胃肠外给药。在胃肠外给药的情况下，可以通过静脉内注射、皮下注射、肌肉注射、关节腔内注射、骨内注射、向肌腱或韧带注射、向牙床注射、腹腔注射、内皮给药、局部给药、鼻内给药、肺内给药及直肠内给药等方式给药。并且，上述组合物可以通过能够使活性物质向目标细胞移动的装置给药。

本发明的药剂学组合物的适当给药量可以因配制方法、给药方式、患者的年龄、体重、性别、疾病状态、给药时间、给药途径、代谢速度及反应敏感性之类的因素而给出多种处方。以成人为基准，上述组合物的优选给药量为10²细胞/kg～10¹⁰细胞/kg的范围内。术语“药剂学有效量”是指预防或治疗肌肉骨骼系统疾病的充分的量。

根据本发明所属技术领域的普通技术人员易于实施的方法，本发明的组合物可以利用药学上可接受的载体和/或赋形剂来配制，可以制备为单位用量的形式或者内置于多用量容器内制备。在此情况下，剂型可以为油剂或者水性介质中的溶液、悬浮液、糖浆剂或者乳化液的形式，或者还可以为提取剂、散剂、粉末剂、颗粒剂、片剂或者胶囊剂的形式，还可以包含分散剂或者稳定剂等。并且，上述组合物能够以单独的治疗剂来给药，或者与其他治疗剂联合给药，可以与现有的治疗剂依次给药或者同时给药。并且，可以单次给药或者根据需要多次给药。

在本发明中，术语“细胞治疗剂”为将从人类分离、培养及通过特殊的操作制备的细胞及组织以治疗、诊断及预防为目的使用的药品 (美国食品药品监督管理局(FDA)规定)，是指为了恢复细胞或组织的功能而将活的自身、同种或者异种的细胞在体外增殖、筛选，或者使用其他方法通过改变细胞的生物学特性等一系列行为以治疗、诊断及预防为目的使用的药品。

在本发明中，术语“预防”是指通过给药本发明的组合物或者细胞治疗剂的给药来抑制肌肉骨骼系统疾病或者延迟其病程的所有行为。

在本发明中，使用的术语“治疗”是指通过给药本发明的组合物或者细胞治疗剂来使肌肉骨骼系统疾病好转或者治愈的所有行为。

本发明的药剂学组合物或者细胞治疗剂可以用作人类用或者动物用。

本发明的药剂学组合物或者细胞治疗剂可以单独用于预防及治疗肌肉骨骼疾病，或者与手术、放射治疗、激素治疗、化疗、生物学反应调节剂、移植、插入人造关节或者人造软骨等、其他再生治疗等方法联合来使用。

根据本发明的又一实施方式，本发明提供筛选肌肉骨骼系统干细胞的方法。

根据本发明的优选实例，本发明包括筛选具有下述特征的细胞的步骤：a)作为外胚层标志物的巢蛋白呈阳性；b)作为肌卫星细胞标志物的Pax7呈阳性；c)作为中胚层标志物的α-平滑肌肌动蛋白呈阳性；以及d)作为多能性标志物的LIN28呈阴性。

根据本发明的优选实例，本发明还包括筛选具有下述特征的细胞的步骤：作为间充质干细胞标志物的CD90呈阴性。

根据本发明的优选实例，本发明还包括筛选具有下述特征的细胞的步骤：作为间充质干细胞标志物的CD271呈阴性。

根据本发明的优选实例，本发明还包括筛选具有下述特征的细胞的步骤：作为多能性标志物的DPPA4呈阳性。

根据本发明的优选实例，本发明还包括筛选具有下述特征的细胞的步骤：作为中胚层标志物的T及Nodal呈阴性。

根据本发明的优选实例，本发明还包括筛选具有下述特征的细胞的步骤：作为神经外胚层标志物的Pax6呈阳性。

根据本发明的优选实例，本发明还包括筛选具有下述特征的细胞的步骤：作为肠干细胞标志物的LGR5呈阳性。

根据本发明的优选实例，本发明还包括筛选具有下述特征的细胞的步骤：作为软骨细胞标志物的SOX9呈阴性。

根据本发明的优选实例，本发明还包括筛选具有下述特征的细胞的步骤：作为肌肉细胞标志物的MyoD呈阴性。

根据本发明的优选实例，本发明还包括筛选CD10、CD44、CD10 5、CD146和/或CD166呈阳性的细胞的步骤。

利用本发明的筛选方法可以便利地筛选能够有效分化为骨、牙齿、软骨、肌腱、韧带、肌肉等的肌肉骨骼系统干细胞。

根据本发明的又一实施方式，本发明提供用于诱导从能够分化为骨、牙齿、软骨、肌腱、韧带、肌肉及脂肪的肌肉骨骼系统干细胞仅选择性地分化为肌肉的诱导分化的培养基组合物。

根据本发明的优选实例，本发明的培养基组合物包含肝素(hepar in)。

根据本发明的优选实例，上述肌肉骨骼系统干细胞具有如下特征： a)作为外胚层标志物的巢蛋白呈阳性；b)作为肌卫星细胞标志物的P ax7呈阳性；c)作为中胚层标志物的α-平滑肌肌动蛋白呈阳性；以及d) 作为多能性标志物的LIN28呈阴性。

根据本发明的又一实施方式，本发明提供包含上述用于诱导分化的培养基组合物及肌肉骨骼系统干细胞作为有效成分的用于预防或治疗肌肉骨骼系统疾病的药剂学组合物。

根据本发明的又一实施方式，本发明提供诱导从肌肉骨骼系统干细胞仅选择性地分化为肌肉的方法，包括使用肝素处理能够分化为骨、牙齿、软骨、肌腱、韧带、肌肉及脂肪的肌肉骨骼系统干细胞的步骤。

根据本发明的优选实例，上述肌肉骨骼系统干细胞具有如下特征： a)作为外胚层标志物的巢蛋白呈阳性；b)作为肌卫星细胞标志物的P ax7呈阳性；c)作为中胚层标志物的α-平滑肌肌动蛋白呈阳性；以及d) 作为多能性标志物的LIN28呈阴性。

根据本发明的一实施例，确认到将本发明的肌肉骨骼系统干细胞与肝素混合后移植到小鼠皮下时，仅选择性地分化为肌肉(图8)。

根据本发明的又一实施方式，本发明提供用于诱导从能够分化为骨、牙齿、软骨、肌腱、韧带、肌肉及脂肪的肌肉骨骼系统干细胞仅选择性地分化为肌腱或韧带的诱导分化的培养基组合物。

根据本发明的优选实例，本发明的培养基组合物包含结缔组织生长因子(CTGF，connective tissue growth factor)及抗坏血酸(ascorb ic acid)。

根据本发明的优选实例，上述肌肉骨骼系统干细胞具有如下特征： a)作为外胚层标志物的巢蛋白呈阳性；b)作为肌卫星细胞标志物的P ax7呈阳性；c)作为中胚层标志物的α-平滑肌肌动蛋白呈阳性；以及d) 作为多能性标志物的LIN28呈阴性。

根据本发明的又一实施方式，本发明提供包含使用上述用于诱导分化的培养基组合物进行预处理的肌肉骨骼系统干细胞作为有效成分的用于预防或治疗肌肉骨骼系统疾病的药剂学组合物。

根据本发明的又一实施方式，本发明提供诱导从肌肉骨骼系统干细胞仅选择性地分化为肌腱或韧带的方法，包括使用结缔组织生长因子及抗坏血酸处理能够分化为骨、牙齿、软骨、肌腱、韧带、肌肉及脂肪的肌肉骨骼系统干细胞的步骤。

根据本发明的优选实例，上述肌肉骨骼系统干细胞具有如下特征： a)作为外胚层标志物的巢蛋白呈阳性；b)作为肌卫星细胞标志物的P ax7呈阳性；c)作为中胚层标志物的α-平滑肌肌动蛋白呈阳性；以及d) 作为多能性标志物的LIN28呈阴性。

根据本发明的一实施例，确认到在使用结缔组织生长因子及抗坏血酸预处理本发明的肌肉骨骼系统干细胞后，将预处理的细胞移植到小鼠皮下时，仅选择性地分化为肌腱或韧带(图9)。

上述肌肉骨骼系统干细胞与结缔组织生长因子及抗坏血酸的混合比例不受限制，优选地，每1×10⁵至1×10⁷个细胞的肌肉骨骼系统干细胞使用5ng/ml至500ng/ml的结缔组织生长因子、2.5μg/ml至250μg/ ml的抗坏血酸预处理1天至7天。

根据本发明的又一实施方式，本发明提供用于诱导从能够分化为骨、牙齿、软骨、肌腱、韧带、肌肉及脂肪的肌肉骨骼系统干细胞仅选择性地分化为骨的诱导分化的培养基组合物。

根据本发明的优选实例，本发明的培养基组合物包含胰岛素(ins ulin)、透明质酸(hyaluronic acid)及抗坏血酸。

根据本发明的优选实例，上述肌肉骨骼系统干细胞上述肌肉骨骼系统干细胞具有如下特征：a)作为外胚层标志物的巢蛋白呈阳性；b) 作为肌卫星细胞标志物的Pax7呈阳性；c)作为中胚层标志物的α-平滑肌肌动蛋白呈阳性；以及d)作为多能性标志物的LIN28呈阴性。

根据本发明的又一实施方式，本发明提供包含使用上述用于诱导分化的培养基组合物预处理的肌肉骨骼系统干细胞作为有效成分的用于预防或治疗肌肉骨骼系统疾病的药剂学组合物。

根据本发明的又一实施方式，本发明提供诱导从肌肉骨骼系统干细胞仅选择性地分化为骨的方法，包括使用胰岛素、透明质酸及抗坏血酸处理能够分化为骨、牙齿、软骨、肌腱、韧带、肌肉及脂肪的肌肉骨骼系统干细胞的步骤。

根据本发明的优选实例，上述肌肉骨骼系统干细胞上述肌肉骨骼系统干细胞具有如下特征：a)作为外胚层标志物的巢蛋白呈阳性；b) 作为肌卫星细胞标志物的Pax7呈阳性；c)作为中胚层标志物的α-平滑肌肌动蛋白呈阳性；以及d)作为多能性标志物的LIN28呈阴性。

根据本发明的一实施例，确认到在使用胰岛素、抗坏血酸及透明质酸预处理本发明的肌肉骨骼系统干细胞后，将预处理的细胞移植到小鼠的肾脏内时，仅选择性地分化为骨(图10)。

上述肌肉骨骼系统干细胞与胰岛素、抗坏血酸及透明质酸的混合比例不受限制，优选地，每1×10⁵至1×10⁷个细胞的肌肉骨骼系统干细胞使用0.5μg/ml至50μg/ml的胰岛素、2.5μg/ml至250μg/ml的抗坏血酸、0.1μg/ml至10μg/ml的透明质酸预处理1天至7天。

根据本发明的又一实施方式，本发明提供用于诱导从能够分化为骨、牙齿、软骨、肌腱、韧带、肌肉及脂肪的肌肉骨骼系统干细胞仅选择性地分化为牙齿的诱导分化的培养基组合物。

根据本发明的优选实例，本发明的培养基组合物包含牙源性上皮细胞(dentalepithelial cell)。

根据本发明的优选实例，上述肌肉骨骼系统干细胞具有如下特征： a)作为外胚层标志物的巢蛋白呈阳性；b)作为肌卫星细胞标志物的P ax7呈阳性；c)作为中胚层标志物的α-平滑肌肌动蛋白呈阳性；以及d) 作为多能性标志物的LIN28呈阴性。

根据本发明的又一实施方式，本发明提供包含使用上述用于诱导分化的培养基组合物预处理的肌肉骨骼系统干细胞作为有效成分的用于预防或治疗肌肉骨骼系统疾病的药剂学组合物。

根据本发明的又一实施方式，本发明提供诱导从肌肉骨骼系统干细胞仅选择性地分化为牙齿的方法，包括在能够分化为骨、牙齿、软骨、肌腱、韧带、肌肉及脂肪的肌肉骨骼系统干细胞包覆牙源性上皮细胞的步骤。

根据本发明的优选实例，上述肌肉骨骼系统干细胞具有如下特征： a)作为外胚层标志物的巢蛋白呈阳性；b)作为肌卫星细胞标志物的P ax7呈阳性；c)作为中胚层标志物的α-平滑肌肌动蛋白呈阳性；以及d) 作为多能性标志物的LIN28呈阴性。

根据本发明的一实施例，确认到在本发明的肌肉骨骼系统干细胞包覆牙源性上皮细胞后移植到小鼠的肾脏内时，仅选择性地分化为牙齿(图11)。

根据本发明的又一实施方式，本发明提供治疗损伤的肌腱或韧带的方法，包括向对象的受损伤的肌腱或韧带部位施用能够分化为骨、牙齿、软骨、肌腱、韧带、肌肉及脂肪的肌肉骨骼系统干细胞的步骤。

根据本发明的优选实例，上述肌肉骨骼系统干细胞具有如下特征： a)作为外胚层标志物的巢蛋白呈阳性；b)作为肌卫星细胞标志物的P ax7呈阳性；c)作为中胚层标志物的α-平滑肌肌动蛋白呈阳性；以及d) 作为多能性标志物的LIN28呈阴性。

上述肌肉骨骼系统干细胞可以直接注入损伤的肌腱或韧带部位，或者为了提高与肌腱或韧带部位的粘合性，混合纤维蛋白胶类、腈基丙烯酸酯类、明胶胶类、聚氨酯类等粘合剂来使用，例如，每1×10⁵至1×10⁷个细胞的肌肉骨骼系统干细胞可以混合1μl至100μl的纤维蛋白胶制备为细胞聚集体来使用(图12)。

根据本发明的又一实施方式，本发明提供治疗关节炎的方法，包括向对象的关节腔内施用能够分化为骨、牙齿、软骨、肌腱、韧带、肌肉及脂肪的肌肉骨骼系统干细胞的步骤。

根据本发明的优选实例，上述肌肉骨骼系统干细胞具有如下特征： a)作为外胚层标志物的巢蛋白呈阳性；b)作为肌卫星细胞标志物的P ax7呈阳性；c)作为中胚层标志物的α-平滑肌肌动蛋白呈阳性；以及d) 作为多能性标志物的LIN28呈阴性。

上述肌肉骨骼系统干细胞可以通过直接注入损伤的软骨部位(例如关节腔)，或者将其在磷酸盐缓冲溶液(PBS)中再悬浮(resuspensi on)后注入，或者冷冻干燥并保管后根据需要马上解冻注入等方式多种多样地注入(图13)。

在本发明中，所描述的上述肌肉骨骼系统干细胞还可以包括如下特征：e)作为间充质干细胞标志物的CD90呈阴性；f)作为间充质干细胞标志物的CD271呈阴性；g)作为多能性标志物的DPPA4呈阳性； h)作为中胚层标志物的T及Nodal呈阴性；i)作为神经外胚层标志物的Pax6呈阳性；j)作为肠干细胞标志物的LGR5呈阳性；k)作为软骨细胞标志物的SOX9呈阴性；或者l)作为肌肉细胞标志物的MyoD 呈阴性。

发明的效果

本发明的特征及优点概括如下：(i)本发明提供源自胚胎干细胞或者诱导性多能干细胞的肌肉骨骼系统干细胞；(ii)并且，本发明提供诱导从上述肌肉骨骼系统干细胞分化为肌肉、软骨、肌腱、韧带、骨或牙齿的用于诱导分化的培养基组合物及其诱导分化的方法；(iii) 本发明的肌肉骨骼系统干细胞可以通过简便的操作指向性地仅分化为所需的组织，因此可以有用地用于预防或治疗多种肌肉骨骼系统疾病。

附图说明

图1a、图1b、图1c、图1d、图1e有关从人类胚胎干细胞分化的肌肉骨骼系统干细胞的特征。图1a为使用肌肉骨骼干细胞诱导培养基继代培养人类胚胎干细胞后，示出从第7代到第19代的细胞形态变化的照片。图1b示出通过细胞免疫荧光法在肌肉骨骼系统干细胞中观察多能性标志物OCT4、NANOG、SOX2、LIN28的表达的结果。图1c 为在人类胚胎干细胞、人类间充质干细胞(hMSC)及第7代、第17 代的肌肉骨骼系统干细胞中通过脱氧核糖核酸测序(RNA-sequencing) 分别两次确认多能性、外胚层、中胚层及内胚层标志物的表达的结果。图1d示出为了查明肌肉骨骼系统干细胞的特性，使用流式细胞仪检测细胞表面抗原的表达的结果。图1e示出为了查明肌肉骨骼系统干细胞的特性，使用细胞免疫荧光法分析多个系统的细胞特异性标志物的表达的结果。在附图中，DAPI表示细胞核染色的。在附图中，蓝色三角形标记表示β-半乳糖苷酶阳性细胞(β-galactosidase positive cell)。

图2a、图2b、图2c、图2d、图2e示出将肌肉骨骼系统干细胞在体外的分化能力与其他种类的细胞进行比较的数据。图2a示出比较人类间充质干细胞及肌肉骨骼系统干细胞在体外分化为骨、软骨、脂肪的能力的结果。图2b为通过有关作为骨骼肌细胞特异性标志物的MY H9的细胞免疫荧光法来确认肌肉骨骼系统干细胞具有分化为骨骼肌的潜力的结果。C2C12用作骨骼肌细胞阳性对照组。图2c及图2d为通过有关作为内皮细胞特异性标志物的CD31和VE-cadherin的细胞免疫荧光法来确认肌肉骨骼系统干细胞不具有分化为内皮细胞的潜力的结果。图2e为通过有关作为神经细胞特异性标志物的MAP2的细胞免疫荧光法来确认肌肉骨骼系统干细胞不具有分化为神经细胞的潜力的结果。将从H9人类胚胎干细胞分化的神经干细胞(neural stem cells) 用作阳性对照组。

图3a、图3b、图3c示出在体内(in vivo)检测肌肉骨骼系统干细胞的分化可能性的结果。图3a的a部分为在将肌肉骨骼系统干细胞移植到肾脏内的情况下通过苏木精伊红(H&E)染色来确认其形成典型的肌肉、脂肪、肌腱的结果。图3a的b部分示出在将肌肉骨骼系统干细胞移植到肾脏内的情况下通过有关作为肌肉特异性标志物的pML C、作为脂肪特异性标志物的PPARgamma(PPAγ)、作为肌腱或韧带特异性标志物的Scx的组织免疫荧光法确认分化为肌肉、脂肪、肌腱细胞的结果。人类白细胞抗原(hLA)作为人类细胞特异性标志物，是为示出其为源自人类的细胞而染色的结果。图3b的a部分示出在肾脏内移植肌肉骨骼系统干细胞的部位通过微型电子计算机断层扫描(Mi cro CT)来扫描骨的形成的结果。图3b的b部分及图3b的c部分示出通过苏木精伊红染色及五色组织化学染色确认骨的形成的结果。图3 b的d部分为在骨形成组织内部的细胞中通过组织免疫荧光法确认作为人类细胞标志物的人类白细胞抗原(hLA，human leukocyte antigen)、作为骨标志物的成骨相关转录因子(Osx，osterix)、Runx2、DMP1、骨钙素(OCN，osteocalin)、作为血管标志物的vWF的表达形态的结果。图3c为将肌肉骨骼系统干细胞移植到皮下的情况下分化为软骨细胞的结果，示出通过苏木精伊红染色及甲苯胺蓝组织化学染色确认软骨形成的结果。并且，还通过组织免疫荧光法确认作为软骨标志物的C olII(collagen II)的表达。

图4a、图4b为确认肌肉骨骼系统干细胞对骨折恢复效果的结果。图4a为示出在将人类间充质干细胞移植到骨折部位的情况下，不是由人类间充质干细胞，而是由小鼠自身内的细胞形成骨的结果。图4a的 a部分为在将人类间充质干细胞移植到骨折部位后经过2周、4周、6 周后拍摄的微型计算机断层扫描的结果。图4a的b部分为通过苏木精伊红组织化学染色包括移植人类间充质干细胞的骨折部位在内的股骨的结果。图4a的c部分为放大4a的b部分红色方块部位的结果。图4 a的d部分为通过有关作为骨细胞标志物的Runx2及作为人类细胞标志物的人类白细胞抗原的组织免疫荧光法确认移植的人类间充质干细胞不分化为骨细胞的结果。图4b为示出与上述人类间充质干细胞的情况不同地，在移植肌肉骨骼系统干细胞的情况下通过肌肉骨骼系统干细胞的分化形成骨的结果。图4b的a部分为在将肌肉骨骼系统干细胞移植到骨折部位后经过2周、4周、6周后拍摄的微型计算机断层扫描的结果。图4b的b部分为通过苏木精伊红组织化学染色包括移植肌肉骨骼系统干细胞的骨折部位在内的股骨的结果。图4b的c部分为放大4 b的b部分红色方块部位的结果。图4b的d部分为通过有关作为骨细胞标志物的Runx2及作为人类细胞标志物的人类白细胞抗原的组织免疫荧光法确认移植的肌肉骨骼系统干细胞分化为骨细胞的结果。

图5a、图5b、图5c、图5d为确认人类诱导性多能干细胞是否与人类胚胎干细胞一样也能够分化为上述肌肉骨骼系统干细胞的结果。图5a为通过细胞免疫荧光法在从人类诱导性多能干细胞分化的肌肉骨骼系统干细胞中确认作为多能性标志物的Oct4、Nanog、Sox2以及Li n28的表达水平的结果。图5b为使用流式细胞仪在从人类诱导性多能干细胞分化的肌肉骨骼系统干细胞中查明特异性细胞表面抗原的表达的结果。图5c为确认从人类诱导性多能干细胞分化的肌肉骨骼系统干细胞在体外分化为骨、软骨、脂肪的能力的结果。图5d示出将从人类诱导性多能干细胞分化的肌肉骨骼系统干细胞在骨骼肌分化培养基中培养来分化为骨骼肌后进行有关作为骨骼肌标志物的MYH9的细胞免疫荧光法的结果。

图6示出使用流式细胞仪比较由CM培养基和肌肉骨骼系统干细胞诱导培养基诱导的肌肉骨骼系统干细胞中CD44的表达量的结果。

图7示出能够通过在肌肉骨骼系统干细胞培养基的成分中的一部分成分缺失的情况下分化为软骨或骨的倾向性变化的结果来确认是否分化为软骨的阿尔新蓝染色及能够确认是否分化为骨的血清碱性磷酸酶及茜素红S的染色结果。

图8示出从人类胚胎干细胞分化的肌肉骨骼系统干细胞选择性地分化为肌肉。为将从人类胚胎干细胞分化的肌肉骨骼系统干细胞(1× 10⁶cells)与纤维蛋白胶(fibringlue)混合并移植到balb/c nude小鼠的皮下后经过7周后去除移植部位后进行苏木精伊红(hematoxylin& eosin)染色的。

图9示出从人类胚胎干细胞分化的肌肉骨骼系统干细胞选择性地分化为肌腱或韧带。示出使用50ng/ml的结缔组织生长因子和25μg/ml 的抗坏血酸预处理肌肉骨骼系统干细胞2天后，将预处理的细胞(1× 10⁶cells)与100μl的纤维蛋白胶混合并移植到balb/cnude小鼠皮下后经过5周后去除移植部位后的苏木精伊红染色的结果、在使用对与人类细胞核标志物结合的人类白细胞抗原的抗体进行染色来确认分化的组织是否源自肌肉骨骼系统干细胞的结果以及利用对作为肌腱或韧带标志物的scx的抗体进行染色来确认分化的组织是否为肌腱或韧带的结果。

图10示出从人类胚胎干细胞分化的肌肉骨骼系统干细胞选择性地分化为骨。以悬滴(hanging drop)的方式在添加10μg/ml的透明质酸、5μg/ml的胰岛素、25μg/ml的抗坏血酸的N2B27培养液中将从人类胚胎干细胞分化的肌肉骨骼系统干细胞制备为细胞聚集体并培养3 天后移植到balb/c nude小鼠肾脏内。5周后去除移植部位后实施苏木精伊红染色、微型计算机断层扫描及免疫染色。图10的a部分示出移植肌肉骨骼系统干细胞的细胞聚集体后经过5周后摘出的肾脏照片。图10的b部分示出拍摄图10的a部分的肾脏的微型计算机断层扫描照片。图10的c部分示出在将肌肉骨骼系统干细胞的细胞聚集体移植到肾脏内4周后通过对微型计算机断层扫描上看到硬组织(hard tissue) 的部分进行苏木精伊红染色来确认形成典型的骨的结果。图10的d部分为通过组织免疫荧光法在骨形成组织内部的细胞中确认作为人类细胞标志物的人类白细胞抗原、作为软骨标志物的II型胶原(ColII，collagen II)的表达形态的结果。图10的e部分为通过组织免疫荧光法在骨形成组织内部的细胞中确认作为人类细胞标志物的人类白细胞抗原、作为骨标志物的Osx的表达形态的结果。

图11示出从人类胚胎干细胞分化的肌肉骨骼系统干细胞选择性地分化为牙齿。图11的a部分示出使用小鼠牙源性上皮细胞(mouse de ntal epithelial cell)包覆(coating)肌肉骨骼系统干细胞的细胞聚集体并移植到小鼠肾脏内6周后摘出的肾脏照片。K表示肾脏、B表示骨、 T表示牙齿。图11的b部分示出通过微型计算机断层扫描拍摄图11的a部分的肾脏的照片。图11的c部分示出对图11的a部分的牙齿进行苏木精伊红染色的照片。图11的d部分为通过组织免疫荧光法确认图 11的a部分的牙齿的作为人类细胞标志物的人类白细胞抗原的表达的结果。To-PRO-3为染色细胞核的结果。

图12示出在体内检测的从人类胚胎干细胞分化的肌肉骨骼系统干细胞治疗损伤的韧带的可能性的结果。通过苏木精伊红染色及对作为人细胞特异性标志物的人类白细胞抗原和作为肌腱或韧带特异性标志物的scx免疫荧光染色检测来确认肌肉骨骼系统干细胞分化而使断裂的韧带连接起来。

图13示出在体内检测的从人类胚胎干细胞分化的肌肉骨骼系统干细胞治疗损伤的软骨的可能性的结果。在所有注入肌肉骨骼系统干细胞的组(PBS组及Sol组)中都确认到关节炎的疾病严重程度好转一半以上的结果。

具体实施方式

以下，通过实施例更为详细地说明本发明。这些实施例仅用于更为具体地说明本发明，本发明所属技术领域的普通技术人员应该明白的是，根据本发明的主旨，本发明的范围不受这些实施例的限制。

实施例

实施例1.实验动物

Balb/c-nude背景的7周龄至10周龄的所有小鼠(20g至24g)均购自Orient bio公司(城南，韩国)。所有的动物相关实验都根据全北大学动物管理及使用委员会的指南来实施。动物待在调节的温度(21 ℃至24℃)及12:12小时明暗循环的环境中，可以自由饮水和摄取食物。

实施例2.1.诱导从人类胚胎干细胞分化为肌肉骨骼系统干细胞

从WiCell公司(麦迪逊，密歇根州，美国)购入H9人类胚胎干细胞。人类胚胎干细胞是在通过丝裂霉素C处理使细胞分裂停止的CF 1小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonicfibroblast，MEF)的基础营养细胞上培养的。人类胚胎干细胞培养基是由添加20％的KnockOut 血清替代品(以下用KSR表示，Invitrogen公司，美国)、1mM的谷氨酰胺(Invitrogen公司，美国)、1％的非必需氨基酸(Invitrogen公司，美国)、0.1mM的β-巯基乙醇(Invitrogen公司，美国)、0.1％的青霉素-链霉素(Invitrogen公司，美国)以及15ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子(R&D Systems公司，美国)的DMEM/F12(Invitrogen 公司，美国)制备。

将包含如下组合的培养基(以下称“MSSC培养基”)用作用于诱导从人类胚胎干细胞分化为肌肉骨骼系统干细胞的培养基来诱导分化：1)250ng/ml的人类头蛋白(KOMABiotech公司，韩国)；2)2 0ng/ml的人类白血病抑制因子(KOMA Biotech公司，韩国)；3)15ng/ml的基础成纤维细胞生长因子(basic Fibroblast growth factor(F GF))(R&DSystems公司，美国)(FGF2信号传导激活剂)；4) 3μM的CHIR99021(Cayman公司，美国)(Wnt信号激活剂)；5)1 μM的PD0325901(Cayman公司，美国)(细胞外信号调节激酶信号抑制剂)；6)10μM的SB431542(Tocris公司，英国)(转化生长因子-β/激活素/nodal信号抑制剂)；7)其他：10％的knockout血清替代品(Invitrogen公司，美国)、1％的N2 supplement(Gibco公司，US A)、2％的B27 supplements(Gibco公司，美国)、1％的非必需氨基酸(Gibco公司，USA)、43％的DMEM/F12(Gibco公司，美国)、 43％的Neurobasal(Gibco公司，美国)、1mM的谷氨酰胺、0.1mM 的β-巯基乙醇、0.1％的青霉素-链霉素以及5mg/ml的牛血清白蛋白(G ibco公司，美国)等。

为了提高上述人类胚胎干细胞的生存力，使用ROCK(Rho-assoc iated coiled-coil kinase)抑制剂(Y-27632，10μM，Calbiochem公司，德国)及蛋白激酶C(PKC，proteinkinase C)抑制剂(Go6983，2.5 μM，Sigma公司，USA)处理24小时后，将使用TrypLE(Lifetechn ology公司，美国)处理而被胰蛋白酶化(trypsinized)的人类胚胎干细胞在包覆有玻连蛋白+明胶(1ng/ml，Sigma公司，USA)的培养皿中利用上述MSSC培养基继代培养至第7代来诱导向肌肉骨骼系统干细胞的细胞分化。确认到上述分化的MSSC细胞株从第5代以上开始具有稳定的相同形质，于2018年09月28日将继代培养10代的细胞株保藏于韩国细胞系库，并得到保藏编号KCLRF-BP-00460。

实施例2.2.诱导从诱导性多能干细胞分化为肌肉骨骼系统干细胞

人类诱导性多能干细胞是使用长谷川(Hasegawa)等开发的方式将由仙台病毒(sendai virus)介导的OCT4、KLF4、SOX2及cMYC 基因导入BJ成纤维细胞(fibroblast)(

CRL2522^TM)来生成的 (Fusaki et al.，2009，PNAS 85，348-362)。人类诱导性多能干细胞是在通过丝裂霉素C处理使细胞分裂停止的CF1小鼠胚胎成纤维细胞的基础营养细胞上培养的。人类诱导性多能干细胞培养基是由添加20 ％的KnockOut血清替代品(以下用KSR表示，Invitrogen公司，美国)、 1mM的谷氨酰胺(Invitrogen公司，美国)、1％的非必需氨基酸(Inv itrogen公司，美国)、0.1mM的β-巯基乙醇(Invitrogen公司，美国)、 0.1％的青霉素-链霉素(Invitrogen公司，美国)以及15ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子(R&DSystems公司，美国)的DMEM/F12(Invit rogen公司，美国)制备。

将包含如下组合的培养基(以下称“MSSC培养基”)用作用于诱导从人类诱导性多能干细胞分化为肌肉骨骼系统干细胞的培养基来诱导分化：1)250ng/ml的人类头蛋白(KOMA Biotech公司，韩国)；

2)20ng/ml的人类白血病抑制因子(KOMA Biotech公司，韩国)；3) 15ng/ml的基础成纤维细胞生长因子(R&D Systems公司，美国)(F GF2信号传导激活剂)；4)3μM的CHIR99021(Cayman公司，美国) (Wnt信号激活剂)；5)1μM的PD0325901(Cayman公司，美国)(细胞外信号调节激酶信号抑制剂)；6)10μM的SB431542(Tocris 公司，英国)(转化生长因子-β/激活素/nodal信号抑制剂)；7)其他： 10％的knockout血清替代品(Invitrogen公司，美国)、1％的N2 sup plement(Gibco公司，USA)、2％的B27 supplements(Gibco公司，美国)、1％的非必需氨基酸(Gibco公司，USA)、43％的DMEM/F 12(Gibco公司，美国)、43％的Neurobasal(Gibco公司，美国)、1 mM的谷氨酰胺、0.1mM的β-巯基乙醇、0.1％的青霉素-链霉素以及5 mg/ml的牛血清白蛋白(Gibco公司，美国)等。

为了提高上述人类诱导性多能干细胞的生存力，使用ROCK抑制剂(Y-27632，10μM，Calbiochem公司，德国)及蛋白激酶C抑制剂 (Go6983，2.5μM，Sigma公司，USA)处理24小时后，将使用Tryp LE(Life technology公司，美国)处理而被胰蛋白酶化的人类诱导性多能干细胞在包覆有玻连蛋白+明胶(1ng/ml，Sigma公司，USA)的培养皿中利用上述MSSC培养基继代培养至第7代来诱导向肌肉骨骼系统干细胞的细胞分化。确认到上述分化的MSSC细胞株从第5代以上开始具有稳定的相同形质。

实施例3.组织化学分析

在4℃的温度下，将在实施例2中分化的肌肉骨骼系统干细胞注入Balb/c-nude的皮下及肾脏内并分化的试样在2％的多聚甲醛(PFA) (Wako公司，日本)中固定过夜。为了知道是否分化为骨，在4℃的温度下用2周的时间将试样在磷酸盐缓冲溶液(PBS)(pH 7.2)中用 0.4M的乙二胺四乙酸(EDTA)去除石灰。之后，依次使用乙醇和二甲苯使试样脱水后，包埋入石蜡或者在蔗糖中通过冷冻保护包埋入OC T中，并切成5μm的厚度。使用苏木精伊红(Cosmobio公司，日本) 染色切片面。

实施例4.免疫荧光分析

本说明书所说明的“组织免疫荧光染色”按照下述方法进行。

在4℃的温度下，将肌肉骨骼系统干细胞注入Balb/c-nude的皮下及肾脏内并分化的试样在磷酸盐缓冲溶液中使用4％的多聚甲醛(Wak o公司，日本)固定过夜。使用Morse’溶液从所有试样中去除石灰。使用石蜡包埋(Leica Biosystems公司，德国)后，将试样切成5μm的厚度。在3％的过氧化氢中封闭组织切片面15分钟后，在4℃的温度下与一抗一起培养过夜。处理切片面的一抗如下：对人类白细胞抗原- I类(HLA class I)的小鼠单克隆抗体(Abcam公司，英国)、对II 型胶原(Collagen Type II)的山羊多克隆抗体(Santacruz公司，美国)、对Osterix的抗体(Abcam公司，美国)。使用的二抗为Alexa 555(I nvitrogen公司，美国)及Alexa 488(Invitrogen公司，美国)免疫球蛋白G(IgG)。为了凸显细胞核，使用TO-PRO3(Invitrogen公司，美国)对免疫染色的切片面进行对照染色。使用Leica DM 5000显微镜(Leica Microsystems公司，德国)或者共聚焦显微镜(LSM510；C arl Zeiss公司，德国)捕获由荧光标记的组织切片面并使用Zen软件进行确认。

实施例5.流式细胞分析

使用胰蛋白酶/乙二胺四乙酸处理实施例2.1及2.2的肌肉骨骼系统干细胞来分离为单细胞悬浮液后，在磷酸盐缓冲溶液(PBS)中通过 2％的牛血清白蛋白封闭非特异性结合后的缓冲溶液(1×磷酸盐缓冲溶液、1％的牛血清白蛋白以及0.01％的叠氮化钠)中与对Sca、CD2、 CD3、CD4、CD7、CD8、CD10、CD11b、CD14、CD19、CD20、CD3 1、CD34、CD44、CD45、CD51、CD56、CD73、CD90、CD105、CD 146、CD166、CD235a、CD271的单克隆抗体(BD Biosciences，USA) 反应并洗涤后，使用Alexa Fluor 488secondary mouse-IgGs(Invitrog en公司，美国)使细胞反应并洗涤后，使用流式细胞仪(FACStar Pl us Flowcytometer，BDBiosciences公司，美国)进行分析。将正常小鼠IgGs(BD Biosciences公司，美国)用作阴性对照组。

实施例6.1.在体外(in vitro)将人类间充质干细胞(Human Me senchymal StemCells；hMSCs)及肌肉骨骼系统干细胞分化为骨细胞

为了将实施例2.1及2.2的肌肉骨骼系统干细胞分化为骨细胞，在骨形成分化培养基(

Osteogenesis Differentiation Kit，Life technology公司，美国)中以37℃、5％CO₂的条件培养细胞14天。为了观察骨的生成，实施了碱性磷酸酶染色(alkalinephosphatase staini ng)(Roche公司，瑞士)及茜素红S(Sigma公司，美国)染色。以与上述方式相同的方式将人类间充质干细胞(Lonza公司，瑞士)分化为骨细胞来进行比较。

实施例6.2.在体外将人类间充质干细胞及肌肉骨骼系统干细胞分化为脂肪细胞

为了将实施例2.1及2.2的肌肉骨骼系统干细胞分化为脂肪细胞，在脂肪形成分化培养基(

Osteogenesis Differentiation Kit， Life technology公司，美国)中以37℃、5％CO₂的条件培养细胞14 天。为了观察脂肪的生成，实施了油红O(oil red O)(Sigma公司，美国)染色。以与上述方式相同的方式将人类间充质干细胞(Lonza公司，瑞士)分化为脂肪细胞来进行比较。

实施例6.3.在体外将人类间充质干细胞及肌肉骨骼系统干细胞分化为软骨细胞

为了将实施例2.1及2.2的肌肉骨骼系统干细胞分化为软骨细胞细胞，使用软骨形成分化培养基(

Osteogenesis Differentiation Kit，Life technology公司，美国)将细胞再悬浮后，再次进行离心分离。为了形成微团(micromass)，将颗粒以1×10⁵活菌/μl再悬浮于分化培养基，将5μl的细胞溶液以点滴的方式接种于未附着的96孔培养板的中央。在高湿的条件下培养微团2小时后，向培养容器中添加加热的软骨形成培养基，以37℃、5％CO₂的条件在培养箱内培养。每隔3天～4天再供应(re-feeded)培养物。培养14天后，对软骨生成颗粒进行阿尔新蓝染色。以与上述方式相同的方式将人类间充质干细胞(Lonza公司，瑞士)分化为软骨细胞来进行比较。

实施例7.1.在体外从肌肉骨骼系统干细胞分化为内皮细胞的能力

确认了实施例2.1的肌肉骨骼系统干细胞是否分化为内皮细胞(e ndothelialcells，ECs)。使用内皮细胞分化培养基(endothelial growt h medium(EGM)-2(Lonza公司，沃克斯维尔，马里兰州，美国) 中的50ng/ml的血管内皮细胞生长因子(VEGF，vascularendothelial growth factor；ProSpec公司，雷霍沃特，以色列)及10ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF，basic fibroblast growth factor；ProSpec 公司，雷霍沃特，以色列)培养肌肉骨骼系统干细胞6天来分化。实施细胞免疫荧光染色来确认是否分化。

实施例7.2.在体外从肌肉骨骼系统干细胞分化为骨骼肌细胞的能力

确认了实施例2.1及2.2的肌肉骨骼系统干细胞是否分化为骨骼肌细胞(skeletalmuscle cells)。在包覆有基底胶(matrigel)的盖玻片 (coverslips)上使用骨骼肌分化培养基(包含2％的B27的DMEM) 培养肌肉骨骼系统干细胞2周来分化。实施细胞免疫荧光染色来确认是否分化。

实施例8.在体外诱导从肌肉骨骼系统干细胞分化为神经细胞

为了分化为神经细胞，将实施例2.1的肌肉骨骼系统干细胞放置于包覆有聚鸟氨酸及层粘连蛋白的培养皿。2天后，将培养基更换为神经分化培养基(包含2％的B27、2mM的GlutaMAX及抗生素的神经基础培养基(Neurobasal medium))。从分化的第7天开始的三天内每天添加0.5mM的二丁基环磷酸腺苷(cAMP)(Sigma公司，USA)。以与上述方式相同的方式将从H9人类胚胎干细胞分化的人类(human) 神经干细胞(Gibco公司，美国)分化为神经细胞来用作对照组。实施细胞免疫荧光染色来确认是否分化。

实施例9.1.肌肉骨骼系统干细胞在小鼠肾脏内的分化能力

为了检测实施例2.1的肌肉骨骼系统干细胞在小鼠肾脏内的分化能力，使用MSCGM-CD(Lonza公司，瑞士)培养基将肌肉骨骼系统干细胞继代培养2代～5代来收集单细胞后，在琼脂糖凝胶孔(agaros e gel well)中使用DMEM+20％的胎牛血清(FBS)培养肌肉骨骼系统干细胞(2×10⁵cells)2天来制备为细胞聚集体后移植到Balb/c裸小鼠的肾脏内。移植4周后实施组织化学染色和组织免疫荧光染色。

实施例9.2.肌肉骨骼系统干细胞在小鼠皮下的分化能力

为了检测实施例2.1的肌肉骨骼系统干细胞在小鼠皮下的分化能力，使用MSCGM-CD(Lonza公司，瑞士)培养基将肌肉骨骼系统干细胞继代培养2代～5代来收集单细胞后，将肌肉骨骼系统干细胞(2 ×10⁵cells)搭载于添加有1μg/ml的透明质酸(Sigma公司，美国)的纤维蛋白胶(

绿十字公司，韩国)后移植到Balb/c裸小鼠的皮下。移植4周后实施组织化学染色和组织免疫荧光染色。

实施例10.1.利用人类间充质干细胞的骨形成试验

为了在股骨骨折模型中分析人类间充质干细胞的骨形成，使用M SCGM-CD(Lonza公司，瑞士)培养基将人类间充质干细胞(Lonza 公司，瑞士)继代培养7代来收集单细胞后，使用切成lmm×lmm大小的胶原膜(SK bioland公司，韩国)吸收细胞。使用钻头(Bosch professional公司，德国)在6周龄的Balb/c-裸小鼠的一侧胫骨钻开1m m左右的孔后，将包含着人类间充质干细胞的胶原膜插入小鼠的骨折部位。每两周将小鼠麻醉后，使用微型计算机断层扫描仪(Skyscan 1 076，Antwerp公司，比利时)获得骨折部位的图像。6周后实施组织化学染色和组织免疫荧光染色。

实施例10.2.利用肌肉骨骼系统干细胞的骨形成试验

为了在股骨骨折模型中分析肌肉骨骼系统干细胞的骨形成，使用 MSCGM-CD(Lonza公司，瑞士)培养基将实施例2.1的肌肉骨骼系统干细胞继代培养2代～5代来收集单细胞后，使用切成lmm×lmm大小的胶原膜(SK bioland公司，韩国)吸收细胞。使用钻头(Bosch pro fessional公司，德国)在6周龄的Balb/c-裸小鼠的一侧胫骨钻开1mm 左右的孔后，将包含着肌肉骨骼系统干细胞的胶原膜插入小鼠的骨折部位。每两周将小鼠麻醉后，使用微型计算机断层扫描仪(Skyscan 1 076，Antwerp公司，比利时)获得骨折部位的图像。6周后实施组织化学染色和组织免疫荧光染色。

实施例11.微型计算机断层扫描

通过使用微型计算机断层扫描仪(Skyscan 1076，Antwerp公司，比利时)扫描在实施例10.1中实施的将肌肉骨骼系统干细胞移植到肾脏内后生成的骨部位，获得三维重构的计算机断层(CT，computed to mography)图像。之后，利用帧抓取器将数据数字化，使用Comprehe nsive TeX Archive Network(CTAN)topographic reconstruction soft ware将由其结果获得的图像移到计算机上。

实施例12.检测对scx、Runx2、MYH9的信使核糖核酸(mRNA) 的表达量

使用500μL的Trizol(Life Technologies公司，美国)按照制造商的说明书从实施例2.1的肌肉骨骼系统干细胞的肾脏内移植物提取核糖核酸(RNA)。使用脱氧核糖核酸酶(DNAse)(RQ1 DNase，Pro mega公司，美国)处理肌肉骨骼系统干细胞的肾脏内移植物后，利用寡聚-d(T)及随机六聚体按照Superscript III RT(Life Technologies 公司，美国)的第一股互补脱氧核糖核酸(cDNA)合成说明书将500 ng的核糖核酸(RNA)逆转录为互补DNA。定量逆转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)是在StepOne Plus PCR循环仪(AppliedBiosystems 公司)上使用Sybr green(Applied Biosystems公司，福斯特城，加拿大)进行的。利用△△CT方法分析信使RNA表达数据，并且，为了检测出基因，使用甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)进行归一化。定量逆转录聚合酶链式反应所需的炎症的引物(primer)购自Quagen公司 (美国)。以相同的方法从肌肉骨骼系统干细胞提取RNA实施定量逆转录聚合酶链式反应以用作对照组。

实施例13.确认源自人类胚胎干细胞的肌肉骨骼系统干细胞的诱导分化

老化标志物

如上述实施例2所示，从人类胚胎干细胞诱导了肌肉骨骼系统干细胞的分化，观察诱导的肌肉骨骼系统干细胞的形态变化的结果如图1 a所示。如图1a所示，确认单细胞化的未分化的H9人类胚胎干细胞在 7代以内分化为成纤维细胞形态的单一集团。从第7代到第17代的十个以上继代中以相似的形态生长，第19代以后，染色作为老化标志物的β-半乳糖苷酶的结果表现出阳性反应，观察已经开始老化。

通过免疫荧光法确认多能性标志物

通过免疫荧光法在从人类胚胎干细胞诱导后经过继代7代以上的肌肉骨骼系统干细胞中观察多能性标志物的表达，观察结果如图1b所示。同时示出通过免疫荧光法确认H9人类胚胎干细胞的多能性标志物的表达的结果以用于比较。

观察图1b，H9人类胚胎干细胞对OCT4、NANOG、SOX2、LIN 28均呈阳性，从而确认其具有多能性。相反，确认到从H9人类胚胎干细胞诱导的肌肉骨骼系统干细胞对OCT4、NANOG、SOX2及LIN2 8呈阴性。

通过RNA测序(RNA-sequencing)确认多能性标志物、外胚层、中胚层、内胚层标志物

通过RNA测序在人类胚胎干细胞、人类间充质干细胞及继代7代、 17代的肌肉骨骼系统干细胞中确认多能性、外胚层、中胚层及内胚层标志物的表达的结果如图1c所示。在H9人类胚胎干细胞(hESC-1、h ESC-2)中确认到TDGF、NANOG、POU5F1、SOX2、DPPA4、LEFT Y1及GDF3等多能性标志物的信使RNA的表达。另一方面，虽然在从H9人类胚胎干细胞诱导的肌肉骨骼系统干细胞中观察到作为多能性标志物的DPPA4的表达，但未观察到多能性标志物TDGF、NANO G、POU5F1、LEFTY1及GDF3的表达。确认到DPPA4的表达与H9 人类胚胎干细胞的水平相似。

可以知道DPPA4不在人类间充质干细胞中表达。并且，在肌肉骨骼系统干细胞中作为外胚层标志物的NES呈阳性，相反，确认到对除 DES和作为初期中胚层标志物的T及Nodal以外的大部分中胚层标志物呈阳性，并且，对大部分内胚层标志物呈阴性。尤其，NES不在间充质干细胞中表达。

通过细胞表面抗原的表达确认间充质干细胞标志物

如图1d所示，检测了肌肉骨骼系统干细胞的表面抗原的表达。调查间充质干细胞特异性细胞表面抗原的表达的结果，确认到间充质干细胞标志物中的CD44、CD51、CD73、CD105、CD146、CD166在肌肉骨骼系统干细胞中有表达，相反，间充质干细胞标志物中的CD90及CD271在肌肉骨骼系统干细胞中没有表达。并且，作为血液系统细胞表面标志物的CD2、CD3、CD7、CD8、CD11b、CD14、CD19、CD 20、CD31、CD34、CD56没有表达，相反，作为前B细胞标志物的C D10有表达。

确认其他系统细胞特异性标志物

如图1e所示，为了查明肌肉骨骼系统干细胞的特性而分析多个系统的组织特异性标志物的表达的结果，作为中胚层标志物的α-平滑肌肌动蛋白、作为神经外胚层标志物的Pax6、作为肌卫星细胞标志物的Pa x7以及及肠干细胞标志物的LGR5等有表达，作为软骨细胞标志物的 SOX9及作为成肌细胞标志物的MyoD等没有表达。这说明肌肉骨骼系统干细胞在分化为软骨细胞及肌肉细胞之前是祖细胞。

实施例14.肌肉骨骼系统干细胞在体外的分化能力

对人类间充质干细胞与实施例2.1的肌肉骨骼系统干细胞进行了体外骨形成、软骨形成、脂肪形成的实验(实施例6)，其结果如图2 a所示。在图2a中可以确认人类间充质干细胞在体外分化为骨、软骨、脂肪。但确认到在与人类间充质干细胞采用的条件相同的体外诱导环境中，肌肉骨骼系统干细胞虽分化为骨、软骨，但不分化为脂肪。即，确认与间充质干细胞在功能上有差异。

分化为骨骼肌的能力

评估上述实施例13的肌肉骨骼系统干细胞是否具有能够分化为骨骼肌的能力。

在包覆有基底胶的盖玻片上使用骨骼肌分化培养基(包含2％的B 27的DMEM)培养肌肉骨骼系统干细胞2周后，对作为骨骼肌标志物的MYH9进行免疫荧光染色。其结果如图2b所示。将C2C12用作阳性对照组。如图2b所示，确认到在使用骨骼肌培养基培养肌肉骨骼系统干细胞的情况下，作为骨骼肌特异性标志物的MYH9有表达，从而确认肌肉骨骼系统干细胞具有分化为骨骼肌的潜力。

分化为内皮细胞的能力

评估上述实施例13的肌肉骨骼系统干细胞是否具有能够分化为内皮细胞的能力。

使用内皮细胞分化培养基(Lonza公司，沃克斯维尔，马里兰州，美国)中的50ng/ml的血管内皮细胞生长因子(ProSpec公司，雷霍沃特，以色列)及10ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子(ProSpec公司) 培养肌肉骨骼系统干细胞6天后，对作为内皮细胞标志物的CD31、V E-cadherin进行免疫荧光法。其结果如图2c及图2d所示。将HUVEC 用作内皮细胞分化的阳性对照组。如图2c及图2d所示，在肌肉骨骼系统干细胞中未观察到CD31、VE-cadherin的表达，这说明肌肉骨骼系统干细胞不具有转化为内皮细胞的潜力。相反，在作为对照组的HUVEC中确认到上述标志物的表达。

分化为神经细胞的能力

在神经分化培养基(包含2％的B27、2mM的GlutaMAX及抗生素的神经基础培养基)中培养(incubation)肌肉骨骼系统干细胞7天后，以三天内每天添加0.5mM的二丁基环磷酸腺苷(cAMP)(Sigma 公司，USA)的方式进行培养。然后，对作为分化为神经细胞的标志物的MAP2进行细胞免疫荧光法，其结果如图2e所示。将神经干细胞 (NSC，neuronal stemcells)用作神经细胞分化的阳性对照组。如图 2e所示，神经干细胞的细胞形态变为神经细胞的形态，作为神经细胞特异性标志物的MAP2有表达，从而确认分化为神经细胞，相反，在肌肉骨骼系统干细胞的情况下，细胞形态没有变化，MAP2也没有表达，从而确认不具有分化为神经细胞的潜力。

如在上述实施例13中确认的，虽然肌肉骨骼系统干细胞对作为外胚层标志物的NES呈阳性，但确认其不分化为神经细胞。从而可知肌肉骨骼系统干细胞可以分化为中胚层，更具体地，可以分化为骨、软骨、肌肉。

实施例15.在体内确认从肌肉骨骼系统干细胞分化为骨、软骨、肌肉、脂肪及肌腱

为了在体内检测以与实施例2相同的方式诱导的肌肉骨骼系统干细胞的分化可能性，将肌肉骨骼系统干细胞移植到免疫缺陷小鼠的肾脏内(实施例9.1)及皮下(实施例9.2)。将肌肉骨骼系统干细胞移植到小鼠肾脏内3周～4周后，使用苏木精伊红染色组织，并且对骨、肌肉、脂肪、肌腱或韧带的特异性标志物进行免疫荧光染色，以及使用TO-PRO3对照染色细胞核，其结果如图3a及图3b所示。

图3a示出将肌肉骨骼系统干细胞在MSCGM-CD(Lonza公司，瑞士)培养基中继代培养2代～5代后移植到肾脏内4周后的结果，可以通过苏木精伊红染色确认在肾脏内形成了典型的肌肉、脂肪、肌腱或韧带(图3a的a部分)。确认上述分化的肌肉组织的结果表明全部分化为骨骼肌，而没有分化为平滑肌。相反，在以相同的条件移植人类间充质干细胞的情况下，完全没有形成肌肉、脂肪、肌腱等(未显示数据(data not shown))。移植部位的免疫组织化学分析结果，确认到在各分化组织中，作为肌肉标志物的磷酸化肌球蛋白轻链(phospho-myosin light chain，pMLC)、作为脂肪标志物的过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARgamma，PPAr)、作为肌腱或韧带标志物的sle raxis(Scx)等呈阳性，而且它们对作为人类细胞标志物的人类白细胞抗原均呈阳性。由此可知，肌肉骨骼系统干细胞已分化为肌肉、脂肪、肌腱(或者韧带)细胞(该结果与在体外试验时不分化为脂肪的结果相反)(图3a的b部分)。

图3b的a部分为通过微型计算机断层扫描仪扫描肾脏内的肌肉骨骼系统干细胞的移植部位的结果，可以看到形成了坚硬的组织，即，骨组织。

图3b的b部分及c部分通过苏木精伊红染色及五色染色示出骨的形成。由此可知，移植的肌肉骨骼系统干细胞在肾脏被膜下全部分化为骨。

图3b的d部分示出移植部位的免疫组织化学分析结果。确认到在组织内部的细胞中，作为人类细胞标志物的人类白细胞抗原、作为骨标志物的Osx(osterix)、Runx2、DMP1、OCN(osteocalin)等呈阳性，并且确认到作为血管标志物的vWF也渗透到骨组织内，可知形成了与全身血液循环系统连接的骨，由此可知，移植的肌肉骨骼系统干细胞已分化为骨。

图3c示出在将肌肉骨骼系统干细胞搭载于添加有透明质酸的纤维蛋白胶后移植到小鼠皮下时分化为软骨细胞的结果。通过苏木精伊红染色及甲苯胺蓝染色确认是否形成软骨。

综合上述结果可以确认，本发明的肌肉骨骼系统干细胞能够依赖移植部位分化为软骨、肌肉、肌腱(或者韧带)及骨且分化能力优秀。

实施例16.确认肌肉骨骼系统干细胞对骨折恢复的效果

为了确认以与实施例2相同的方式诱导的肌肉骨骼系统干细胞对骨折恢复的效果，以与上述实施例10相同的方式进行骨折研究，其结果如图4a至图4b所示。

在将人类间充质干细胞移植到股骨骨折模型中的骨折部位的情况下，约6周后确认到骨折部位形成了骨。但是，骨形成部位对作为股标志物的Runx2虽然呈阳性，但对作为人类细胞标志物的人类白细胞抗原却呈阴性，因此评估骨不是由人类间充质干细胞形成，而是由小鼠自身的细胞形成(图4a)。相反，在以相同的条件移植肌肉骨骼系统干细胞的情况下，确认到约6周后在骨折部位形成了骨，骨形成部位对Runx2呈阳性，并且对作为人类细胞标志物的人类白细胞抗原(h LA)呈阳性。上述内容评估为骨的形成是由肌肉骨骼系统干细胞的分化形成的(图4b)。

实施例17.诱导从人类诱导性多能干细胞分化为肌肉骨骼系统干细胞以及确认诱导的人类诱导性多能干细胞的特性

人类诱导性多能干细胞是根据长谷川等(Fusaki et al.，2009)开发的方案通过由仙台病毒(sendai virus)介导的OCT4、KLF4、SOX2 及MYC的过度表达重新编程IMR90胚胎成纤维细胞来制备的。

以与实施例2相同的方式从人类诱导性多能干细胞诱导肌肉骨骼系统干细胞而获得肌肉骨骼系统干细胞(以下称iPS-hMSSC)。通过免疫荧光法及逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)在iPS-hMSSC中确认作为多能性标志物的Oct4、Nanog、Sox2及Lin28的表达水平的结果分别在图5a的各部分中示出。

在图5a中，诱导性多能干细胞对OCT4、NANOG、SOX2、LIN2 8均呈阳性，确认具有多能性。相反，确认到iPS-hMSSC对作为多能性标志物的OCT4、NANOG、SOX2及LIN28均呈阴性。

图5b为对iPS-hMSSC的表面抗原的表达进行检测的结果。调查间充质干细胞特异性细胞表面抗原的表达的结果，确认到间充质干细胞标志物中的CD44、CD51、CD73、CD105、CD146、CD166在iPS- hMSSC中有表达，相反，间充质干细胞标志物中的CD90及CD271在 iPS-hMSSC中没有表达。并且，作为血液系统细胞表面标志物的CD2、 CD3、CD7、CD8、CD14、CD20、CD56没有表达，相反，作为前B 细胞标志物的CD10有表达。

并且，以与实施例14相同的方法评估了iPS-hMSSC的骨形成、软骨形成、脂肪形成，其结果如图5c所示。如图5c所示，确认从人类诱导性多能干细胞诱导的肌肉骨骼系统干细胞在体外分化为骨、软骨，但几乎不分化为脂肪。

并且在包覆有基底胶的盖玻片(coverslips)上使用骨骼肌分化培养基(包含2％的B27的DMEM)培养肌肉骨骼系统干细胞2周后，对作为骨骼肌标志物的MYH9进行免疫荧光染色，其结果如图5d所示。将C2C12用作阳性对照组。如图5d所示，确认到从人类诱导性多能干细胞诱导的肌肉骨骼系统干细胞具有分化为骨骼肌的潜力。

综合上述结果，可以确认从人类诱导性多能干细胞诱导的肌肉骨骼系统干细胞具有与从人类内皮细胞(hECS)诱导的肌肉骨骼系统干细胞相同的特性，确认可以使用人类诱导性多能干细胞替换人类内皮细胞来获取肌肉骨骼系统干细胞。

实施例18.从人类诱导性多能干细胞诱导的肌肉骨骼系统干细胞在体内的分化能力

肾脏内移植

将上述实施例17的肌肉骨骼系统干细胞移植到小鼠肾脏内3周～ 4周后，使用苏木精伊红染色组织时，可以确认在肾脏内形成了典型的肌肉、脂肪、肌腱(或者韧带)。当进行移植部位的免疫组织化学分析时，可以确认磷酸化肌球蛋白轻链、作为脂肪标志物的过氧化物酶体增殖物激活受体γ、作为肌腱或韧带标志物的sleraxis(Scx)等呈阳性，而且它们对作为人类细胞标志物的人类白细胞抗原均呈阳性。并且，可以确认作为骨标志物的Osx、Runx2、DMP1、OCN等呈阳性。通过上述方法可以确认从人类诱导性多能干细胞诱导的肌肉骨骼系统干细胞可以分化为肌肉、脂肪、肌腱(或者韧带)及骨。

皮下移植

将上述实施例17的肌肉骨骼系统干细胞搭载于添加有透明质酸的纤维蛋白胶移植到小鼠皮下后，可以通过苏木精伊红染色及甲苯胺蓝染色确认上述肌肉骨骼系统干细胞能够分化为软骨。

实施例19.比较包含头蛋白的MSSC培养基与包含条件培养基的完全培养基(CM)的分化能力

利用使用添加条件培养基(利用在完全培养基中使用Knockout D MEM替换DMEM/F12的培养基(使用20％的Knockout血清替代品(I nvitrogen公司，美国)、1mM的谷氨酰胺、1％的非必需氨基酸(Invi trogen公司，美国)、0.1mM的β-巯基乙醇、0.1％的青霉素-链霉素、5 mg/ml的牛血清白蛋白补充的Knockout DMEM)培养CF1细胞24小时后获得的培养上清液)替换上述实施例2的MSSC培养基的7种组分中的组分1)的人头蛋白(Life technology公司)的培养基(剩余的组分2)～组分7)都相同)(以下称“CM培养基”)，比较MSSC 培养基与CM培养基的分化能力。

在此情况下，头蛋白通常用于在培养人类胚胎干细胞时保持特性的用途(Chaturvedi G，Simone PD，Ain R，Soares MJ，Wolfe MW. Noggin maintainspluripotency of human embryonic stem cells grow n on Matrigel.CellProlif.2009Aug；42(4)：425-33)，与以往已知的机制相反，大大增加向中胚层的倾向性，如下述表1所示，与利用CM培养基的情况相比，在利用头蛋白的情况下增加了10倍以上的骨份化的倾向性。

表1

诱导培养基	骨	肌肉	肌腱	脂肪
					CM培养基	1/20	20/20	2/20	2/20
含有头蛋白的培养基	15/20	20/20	10/20	12/20

比较MSSC培养基与CM培养基的分化倾向性(20次中发现分化的次数)

并且，比较了使用各种培养基时的CD44的表达量。分别使用含有CM的培养基(CM培养基)与含有头蛋白的培养基(MSSC培养基) 诱导分化后，以与实施例6相同的方式检测CD44的表达量。实验结果确认，与使用CM培养基的情况相比，使用含有头蛋白的MSSC培养基时CD44的表达量大幅增加(图6)。

在骨分化时，必须发生软骨形成(chondrogenesis)后进行软骨内成骨(endochondral bone)形式的骨形成，已知CD44在软骨形成中起到非常必要的作用(Wu SC，Chen CH，Chang JK，Fu YC，Wang CK，Eswaramoorthy R，Lin YS，Wang YH，Lin SY，Wang GJ，Ho ML：Hyaluronan initiates chondrogenesis mainly via cd44 in human adipose-derived stem cells.J Appl Physiol(1985)2013；114：1610 -1618)。综合上述结果可知，比起使用CM培养基，使用MSSC培养基更适于骨分化。

经确认，在将肌肉骨骼系统干细胞移植到肾脏内的情况下，通过 MSSC培养基分化的细胞与通过CM培养基分化的细胞相比，分化速度快1周～2周。比较使用CM培养基时与使用MSSC培养基时的分化速度的差异如下述表2所示。

表2

比较MSSC培养基与CM培养基的分化速度(以移植前对肌肉骨骼系统干细胞的信使RNA的量为基准的相对增加率)

实施例20.比较由MSSC培养基的组分之间的组合引起的上升效果

这次，将不包含上述实施例2的MSSC培养基的组分中的1)至6) 的成分中的1种的情况下的分化能力与包含所有组分的情况下的分化能力进行比较。实验结果确认，在缺少上述1)至6)成分中的任何一种组分的情况下，向软骨(阿尔新蓝)或者骨(血清碱性磷酸酶及茜素红S)的分化未能很好地实现(图7、表3)。

表3

比较MSSC培养基与缺少1种组分的培养基的分化能力

实施例21.在体内诱导从肌肉骨骼系统干细胞选择性地分化为肌肉、韧带、软骨及骨

为了检测肌肉骨骼系统干细胞的选择性分化可能性，使用结缔组织生长因子、转化生长因子(Transforming growth factor)、胰岛素、成纤维细胞生长因子(fibroblastgrowth factor)等多种生长因子(gro wth factor)预处理肌肉骨骼系统干细胞后，制备为细胞聚集体(4×10 ⁵)或者与细胞载体混合后移植到Balb/c裸小鼠的肾脏内或者皮下。移植3周～6周后，去除移植的细胞后进行组织分析。

实施例22.确认诱导从肌肉骨骼系统干细胞分化为肌肉

为了在体内检测以与实施例2相同的方式诱导的肌肉骨骼系统干细胞选择性地分化为肌肉的可能性，将肌肉骨骼系统干细胞与添加有肝素的纤维蛋白胶混合后移植到免疫缺陷小鼠的皮下。将肌肉骨骼系统干细胞移植到上述部位7周后，使用苏木精伊红染色组织，并且使用与人类细胞核标志物结合的STEM101抗体(宝日公司，日本)进行染色来确认分化的组织是否源自肌肉骨骼系统干细胞，利用对作为肌肉标志物的MyoD的抗体(赛默飞世尔公司，美国)通过荧光染色确认到分化的组织为肌肉细胞。细胞核使用DAPI做对照染色。其染色的结果如图8所示。如图8所示，确认到肌肉骨骼系统干细胞仅分化为肌肉。

实施例23.确认诱导从肌肉骨骼系统干细胞分化为肌腱或韧带

为了在体内检测以与实施例2相同的方式诱导的肌肉骨骼系统干细胞选择性地分化为肌腱或韧带的可能性，在MSCGM-CD(Lonza公司，瑞士)培养基上使用50ng/ml的结缔组织生长因子和25μg/ml的抗坏血酸预处理肌肉骨骼系统干细胞两天后，将预处理细胞(1×10⁶cell s)与100μl的基底胶(BD sciences公司，美国)混合后移植到免疫缺陷小鼠皮下。将肌肉骨骼系统干细胞移植到上述部位5周后，使用苏木精伊红染色组织并使用对与人类细胞核标志物结合的人类白细胞抗原的抗体(Abcam公司，英国)染色来确认分化的组织是否源自肌肉骨骼系统干细胞，使用对作为肌腱或韧带标志物的scx的抗体(Antibo dies-online公司，美国)通过荧光染色确认到分化的组织为肌腱或韧带。其染色结果如图9所示。如图9所示，确认到肌肉骨骼系统干细胞仅分化为肌腱或韧带。

实施例24.确认诱导从肌肉骨骼系统干细胞分化为骨(bone)

为了在体内检测以与实施例2相同的方式诱导的肌肉骨骼系统干细胞选择性地分化为骨的可能性，在由10％的knockout血清替代品(I nvitrogen公司，美国)、1％的N2supplement(Gibco公司，USA)、 2％的B27 supplements(Gibco公司，美国)、43％的DMEM/F12(G ibco公司，美国)、43％的Neurobasal(Gibco公司，美国)组成的培养基上使用5μg/ml的胰岛素、25μg/ml抗坏血酸、1μg/ml透明质酸预处理肌肉骨骼系统干细胞2天并制备为细胞聚集体后移植到免疫缺陷小鼠的肾脏内。将肌肉骨骼系统干细胞移植到上述部位5周后，使用苏木精伊红染色组织并且对作为软骨及骨的特异性标志物的collage II (col2)和osterix(osx)进行免疫荧光染色的结果及使用DAPI对细胞核进行对照染色的结果如图10所示。如图10所示，确认到肌肉骨骼系统干细胞仅分化为经过软骨内骨化过程的骨。

实施例25.确认诱导从肌肉骨骼系统干细胞分化为牙齿

为了在体内检测以与实施例2相同的方式诱导的肌肉骨骼系统干细胞选择性地分化为牙齿的可能性，制备肌肉骨骼系统干细胞的细胞聚集体后用小鼠牙源性上皮细胞包覆后移植到免疫缺陷小鼠的肾脏内。将肌肉骨骼系统干细胞移植到上述部位6周后，使用苏木精伊红染色组织并且对作为人细胞特异性标志物的人类白细胞抗原进行免疫荧光染色的结果及使用To-PRO-3对细胞核进行对照染色的结果如图1 1所示。如图11所示，确认到肌肉骨骼系统干细胞仅分化为牙齿。在图11的a部分中，K表示肾脏组织，T表示牙齿组织，B表示骨组织。图11的b部分为通过微型计算机断层扫描拍摄图11的a部分的T的照片。图11的c部分为用苏木精伊红染色组织的照片。图11的d部分为使用对人类白细胞抗原的抗体染色的荧光照片。To-PRO-3为对细胞核进行对照染色的结果。

实施例25.肌肉骨骼系统干细胞对韧带损伤的治疗效果

为了在体内检测以与实施例2相同的方式诱导的肌肉骨骼系统干细胞治疗损伤的韧带的可能性，将免疫缺陷小鼠背部的胸腰椎韧带以与行进的方向呈直角的方向切断使其损伤后，将混合肌肉骨骼系统干细胞(2×10⁶cells)与10μl的纤维蛋白胶制备的细胞聚集体移植到损伤部位。将肌肉骨骼系统干细胞移植到上述部位6周后，使用苏木精伊红染色组织并且对作为人类细胞特异性标志物的人类白细胞抗原及作为肌腱或韧带特异性标志物的scx实施免疫荧光染色的结果如图12 所示。使用To-PRO-3对细胞核进行对照染色。如图12所示，确认到肌肉骨骼系统干细胞分化并使断裂的韧带连接上了。

实施例26.肌肉骨骼系统干细胞对的关节炎的治疗效果

为了在体内检测以与实施例2相同的方式诱导的肌肉骨骼系统干细胞治疗损伤的软骨的可能性，在10周龄的C57BL/6小鼠的左侧关节实施内侧半月板失稳(DMM，Destabilization of medial meniscus)手术，4周至6周后，向关节腔内注射肌肉骨骼系统干细胞(3×10⁵)。分为假手术对照组(Sham)、DMM组、将细胞溶化并自旋向下(spi n-down)后在磷酸盐缓冲溶液(PBS)中再悬浮后注射的组(hMSSC- PBS)以及将置于冷冻液(Freezing solution)直接注射(Injection)的组(hMSSC-Sol)。第8周取样(Sampling)并固定(Fixation)后，在10％的乙二胺四乙酸溶液中脱钙(Decalcification)4周后，进行切片(Section)(5μm)并使用番红O(Safranin O)染色。关节炎程度的评估使用国际骨关节炎学会(OARSI)提出的方法施行。如图13所示，相比于Sham组，DMM组的关节炎分数(OA score)增加，表明骨关节炎诱导得好。在注射肌肉骨骼系统干细胞的组中，关节炎疾病严重程度降低了一半以上，PBS组与Sol组之间未显出差异。与4周时相比，6周时注射肌肉骨骼系统干细胞的关节炎疾病严重程度虽然表现出下降的倾向，但在统计学上没有显著性差异。这确认将肌肉骨骼系统干细胞冷冻干燥后保管并在需要时直接给药仍有效果(图13)。

以上，详细描述了本发明的特定部分，但对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说显而易见的是，这些具体的描述仅为优选的实例，而本发明的范围并不限定与此。因此，本发明实质上的范围应由随附的发明要求保护范围及其等同物定义。

保藏编号

保藏机构：韩国细胞系研究财团

保藏编号：KCLRFBP00460

保藏日期：20180928

Claims (15)

1.一种用于诱导分化的培养基组合物，用于诱导从能够分化为骨、牙齿、软骨、肌腱、韧带、肌肉及脂肪的肌肉骨骼系统干细胞仅选择性地分化为肌肉，其特征在于，

上述培养基组合物包含肝素，

上述肌肉骨骼系统干细胞具有下述特征：

a)作为外胚层标志物的巢蛋白呈阳性；

b)作为肌卫星细胞标志物的Pax7呈阳性；

c)作为中胚层标志物的α-平滑肌肌动蛋白呈阳性；以及

d)作为多能性标志物的LIN28呈阴性。

2.一种用于预防或治疗肌肉骨骼系统疾病的药剂学组合物，其特征在于，包含权利要求1所述的用于诱导分化的培养基组合物以及肌肉骨骼系统干细胞作为有效成分。

3.一种诱导从肌肉骨骼系统干细胞仅选择性地分化为肌肉的方法，包括使用肝素处理能够分化为骨、牙齿、软骨、肌腱、韧带、肌肉及脂肪的肌肉骨骼系统干细胞的步骤，其特征在于，上述肌肉骨骼系统干细胞具有如下特征：

a)作为外胚层标志物的巢蛋白呈阳性；

b)作为肌卫星细胞标志物的Pax7呈阳性；

c)作为中胚层标志物的α-平滑肌肌动蛋白呈阳性；以及

d)作为多能性标志物的LIN28呈阴性。

4.一种用于诱导分化的培养基组合物，用于诱导从能够分化为骨、牙齿、软骨、肌腱、韧带、肌肉及脂肪的肌肉骨骼系统干细胞仅选择性地分化为肌腱或韧带的培养基组合物，其特征在于，

上述培养基组合物包含结缔组织生长因子及抗坏血酸，

上述肌肉骨骼系统干细胞具有如下特征：

a)作为外胚层标志物的巢蛋白呈阳性；

b)作为肌卫星细胞标志物的Pax7呈阳性；

c)作为中胚层标志物的α-平滑肌肌动蛋白呈阳性；以及

d)作为多能性标志物的LIN28呈阴性。

5.一种用于预防或治疗肌肉骨骼系统疾病的药剂学组合物，其特征在于，包含使用权利要求4所述的用于诱导分化的培养基组合物进行预处理的肌肉骨骼系统干细胞作为有效成分。

6.一种诱导从肌肉骨骼系统干细胞仅选择性地分化为肌腱或韧带的方法，包括使用结缔组织生长因子及抗坏血酸处理能够分化为骨、牙齿、软骨、肌腱、韧带、肌肉及脂肪的肌肉骨骼系统干细胞的步骤，其特征在于，上述肌肉骨骼系统干细胞具有如下特征：

a)作为外胚层标志物的巢蛋白呈阳性；

b)作为肌卫星细胞标志物的Pax7呈阳性；

c)作为中胚层标志物的α-平滑肌肌动蛋白呈阳性；以及

d)作为多能性标志物的LIN28呈阴性。

7.一种用于诱导分化的培养基组合物，用于诱导从能够分化为骨、牙齿、软骨、肌腱、韧带、肌肉及脂肪的肌肉骨骼系统干细胞仅选择性地分化为骨的培养基组合物，其特征在于，

上述培养基组合物包含胰岛素、透明质酸及抗坏血酸，

上述肌肉骨骼系统干细胞具有如下特征：

a)作为外胚层标志物的巢蛋白呈阳性；

b)作为肌卫星细胞标志物的Pax7呈阳性；

c)作为中胚层标志物的α-平滑肌肌动蛋白呈阳性；以及

d)作为多能性标志物的LIN28呈阴性。

8.一种用于预防或治疗肌肉骨骼系统疾病的药剂学组合物，其特征在于，包含使用权利要求7所述的用于诱导分化的培养基组合物进行预处理的肌肉骨骼系统干细胞作为有效成分。

9.一种诱导从肌肉骨骼系统干细胞仅选择性地分化为骨的方法，包括使用胰岛素、透明质酸及抗坏血酸处理能够分化为骨、牙齿、软骨、肌腱、韧带、肌肉及脂肪的肌肉骨骼系统干细胞的步骤，其特征在于，上述肌肉骨骼系统干细胞具有如下特征：

a)作为外胚层标志物的巢蛋白呈阳性；

b)作为肌卫星细胞标志物的Pax7呈阳性；

c)作为中胚层标志物的α-平滑肌肌动蛋白呈阳性；以及

d)作为多能性标志物的LIN28呈阴性。

10.一种用于诱导分化的培养基组合物，用于诱导从能够分化为骨、牙齿、软骨、肌腱、韧带、肌肉及脂肪的肌肉骨骼系统干细胞仅选择性地分化为牙齿的培养基组合物，其特征在于，

上述培养基组合物包含牙源性上皮细胞，

上述肌肉骨骼系统干细胞具有如下特征：

a)作为外胚层标志物的巢蛋白呈阳性；

b)作为肌卫星细胞标志物的Pax7呈阳性；

c)作为中胚层标志物的α-平滑肌肌动蛋白呈阳性；以及

d)作为多能性标志物的LIN28呈阴性。

11.一种诱导从肌肉骨骼系统干细胞仅选择性地分化为牙齿的方法，包括在能够分化为骨、牙齿、软骨、肌腱、韧带、肌肉及脂肪的肌肉骨骼系统干细胞包覆牙源性上皮细胞的步骤，其特征在于，上述肌肉骨骼系统干细胞具有如下特征：

a)作为外胚层标志物的巢蛋白呈阳性；

b)作为肌卫星细胞标志物的Pax7呈阳性；

c)作为中胚层标志物的α-平滑肌肌动蛋白呈阳性；以及

d)作为多能性标志物的LIN28呈阴性。

12.根据权利要求1、4、7或10所述的培养基组合物，其特征在于，上述肌肉骨骼系统干细胞还包括如下特征：

e)作为间充质干细胞标志物的CD90呈阴性；

f)作为间充质干细胞标志物的CD271呈阴性；

g)作为多能性标志物的DPPA4呈阳性；

h)作为中胚层标志物的T及Nodal呈阴性；

i)作为神经外胚层标志物的Pax6呈阳性；

j)作为肠干细胞标志物的LGR5呈阳性；

k)作为软骨细胞标志物的SOX9呈阴性；或者

l)作为肌肉细胞标志物的MyoD呈阴性。

13.一种治疗损伤的肌腱或韧带的方法，包括向对象的受损伤的肌腱或韧带部位施用能够分化为骨、牙齿、软骨、肌腱、韧带、肌肉及脂肪的肌肉骨骼系统干细胞的步骤，其特征在于，上述肌肉骨骼系统干细胞具有如下特征：

a)作为外胚层标志物的巢蛋白呈阳性；

b)作为肌卫星细胞标志物的Pax7呈阳性；

c)作为中胚层标志物的α-平滑肌肌动蛋白呈阳性；以及

d)作为多能性标志物的LIN28呈阴性。

14.一种治疗关节炎的方法，包括向对象的关节腔内施用能够分化为骨、牙齿、软骨、肌腱、韧带、肌肉及脂肪的肌肉骨骼系统干细胞的步骤，其特征在于，上述肌肉骨骼系统干细胞具有如下特征：

a)作为外胚层标志物的巢蛋白呈阳性；

b)作为肌卫星细胞标志物的Pax7呈阳性；

c)作为中胚层标志物的α-平滑肌肌动蛋白呈阳性；以及

d)作为多能性标志物的LIN28呈阴性。

15.根据权利要求3、6、9、11、13或14所述的方法，其特征在于，上述肌肉骨骼系统干细胞还包括如下特征：

e)作为间充质干细胞标志物的CD90呈阴性；

f)作为间充质干细胞标志物的CD271呈阴性；

g)作为多能性标志物的DPPA4呈阳性；

h)作为中胚层标志物的T及Nodal呈阴性；

i)作为神经外胚层标志物的Pax6呈阳性；

j)作为肠干细胞标志物的LGR5呈阳性；

k)作为软骨细胞标志物的SOX9呈阴性；或者

l)作为肌肉细胞标志物的MyoD呈阴性。

Images