KR102241185B1

KR102241185B1 - 근골격계 줄기세포의 선택적 분화 조절방법

Info

Publication number: KR102241185B1
Application number: KR1020200049098A
Authority: KR
Inventors: 한명관
Original assignee: (주)셀라토즈테라퓨틱스
Priority date: 2019-04-23
Filing date: 2020-04-23
Publication date: 2021-04-16
Also published as: CA3137836A1; KR20200124177A; EP3960848A1; CN114127266A; AU2020261541A1; CA3137836C; EP3960848A4; AU2020261541B2

Abstract

본 발명은 ESC(embryonic stem cell) 또는 iPSC(induced pluripotent stem cell)로부터 분화된 신규한 근골격계 줄기세포(MSSC, musculoskeletal stem cell) 및 상기 근골격계 줄기세포로부터 골, 치아, 연골, 인대 및 근육으로 선택적으로 분화시킬 수 있는 분화유도용 배지 조성물과 이에 대한 분화유도 방법에 대한 것이다.

Description

근골격계 줄기세포의 선택적 분화 조절방법{Method for Controlling Selective Differentiation of Musculoskeletal Stem Cell}

본 발명은 여러 근골격 조직으로 분화능을 갖는 근골격계 줄기세포와 이를 근육, 인대, 연골, 골 또는 치아조직으로 선택적으로 분화되도록 조절하는 방법에 관한 것이다.

근골격계 질환은 근육과 골격계에서 발생하는 질환으로 치아, 근육, 연골, 건, 인대, 신경, 관절과 다른 결합조직 부위에서 발생하는 세부질환들로 분류할 수 있으며 무리한 힘의 사용, 반복적인 동작, 부적절한 작업 자세, 날카로운 면과의 신체접촉, 진동 및 온도 등의 요인으로 인해 나타나는 건강장애를 총칭한다(Buckwalter et al., 1993). 노인이 되면 근골격계에도 변화를 초래한다. 근육은 양적으로 감소하고, 기능이 저하되고, 관절의 연골에도 퇴행성 변화를 일으켜 관절염으로 인한 통증 또는 운동제한을 초래한다. 그리고 골조직은 골흡수에 비하여 골형성이 저하되어 골다공증을 초래하여 골절이 쉽게 발생할 수 있다(장재석, 2009).

1988년 Owen 등의 연구에서 골수유래 중간엽 줄기세포는 특정 조건하의 시험관 배양을 통해 골세포, 연골세포, 근육세포, 지방세포, 섬유세포 및 인대, 건으로 분화할 수 있음이 최초로 밝혀짐으로써 재생의료에 이용될 가능성을 제시하였다 (Owen M. J. Cell Sci. Suppl 1988;10:63-76). 그러나 수많은 임상적 시도에도 불구하고 중간엽 줄기세포가 직접 근골격 조직으로 재생되는 치료는 성공한 적이 없다(ClinicalTrials.Gov.).

골격근 손상(skeletal muscle damage)에 대한 줄기세포 치료는 근섬유로 직접 분화하는 위성세포(satellite cells)와 같은 골격근 유래 줄기세포를 이식하거나 세포와 지지체를 이용한 조직 공학적인 방법이 시도되고 있으나 위성세포는 생체 외에서 증식이 가능하지만 배양기간이 짧아서 근육 내로 주입했을 때 증식, 분화 및 재생능력이 낮은 것으로 보고되고 있다(NA Dumont et al. compr. physiol. 5(30);1027-1059;2015).

최근 중간엽 줄기세포와 세포 특성이 전혀 다른 골격 줄기세포(skeletal stem cells)가 마우스 및 인간 체내에서 발견되어 골 및 연골 재생에 관여함이 밝혀져 이를 이용하여 골격을 재생할 수 있음을 증명하였다(Chan CKF et al., Cell 175(1);43-56;2018).

본 발명자는 이전의 발명에서(대한민국 특허출원번호 제10-2018-0127501호) 배아줄기세포와 유도만능줄기세포와 같은 전분화능 줄기세포로부터 골, 근육, 연골, 건, 인대, 지방 등으로 분화할 수 있는 근골격계 줄기세포(Musculoskeletal stem cell)로의 유도법을 개발하였다. 이 근골격계 줄기세포는 무한 증식이 가능한 배아줄기세포나 유도만능줄기세포로부터 유도 가능하고 또한 그 세포도 10 계대 이상 증식배양이 가능하기 때문에 근골격계 질환 환자의 근골격 조직재생에 적합한 세포이다. 이 근골격계 줄기세포를 효과적으로 근골격 질환 치료에 이용하기 위해서는 골, 치아, 근육, 연골, 건 또는 인대 등으로 선택적으로 분화를 유도할 수 있는 방법의 개발이 필요하다.

상기한 배경기술로서 설명된 사항들은 본 발명의 배경에 대한 이해 증진을 위한 것일 뿐, 이 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 이미 알려진 종래기술에 해당함을 인정하는 것으로 받아들여져서는 안 될 것이다.

본 발명자들은 인간배아줄기세포(hESC) 또는 인간유도만능줄기세포(hiPSC)로부터 근골격계 줄기세포(hMSSC)를 유도할 수 있으며, 상기 근골격계 줄기세포가 연골내골화를 통해 골로 분화될 수 있고, 골 뿐만 아니라 치아, 연골, 건 또는 인대, 근육 등 근골격 조직으로 선택적으로 분화될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 근골격계 줄기세포로의 분화 유도용 배지 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 배지에서 ESC 또는 iPSC를 배양하는 단계를 포함하는 근골격계 줄기세포의 제조방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 ESC 또는 iPSC로부터 분화된 근골격계 줄기세포를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 근골격계 줄기세포를 포함하는 근골격계 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 근골격계 줄기세포의 스크리닝 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 근골격계 줄기세포로부터 근육, 연골, 건 또는 인대, 골 또는 치아로 선택적으로 분화를 유도하는 분화 유도용 배지 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 근골격계 줄기세포로부터 근육, 연골, 건 또는 인대, 골 또는 치아로 선택적으로 분화를 유도하는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 근골격계 줄기세포를 대상의 손상된 건 또는 인대 부위에 투여하는 단계를 포함하는 손상된 건 또는 인대의 치료방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 근골격계 줄기세포를 대상의 관절강 내에 투여하는 단계를 포함하는 관절염의 치료방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 노긴(noggin), LIF(leukemia inhibitory factor), bFGF(basic Fibroblast growth factor), Wnt 신호 활성화제, ERK(extracellular signal-regulated kinase) 신호 억제제 및 TGF-β/엑티빈/노달(TGF-β/activin/nodal) 신호전달 억제제를 포함하는 근골격계 줄기세포(MSSC, musculoskeletal stem cell)로의 분화 유도용 배지 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 인간배아줄기세포 또는 인간유도만능줄기세포로부터 근골격계 줄기세포를 유도할 수 있는 최적의 배지 조성을 찾아내었으며, 상기 근골격계 줄기세포가 연골내골화를 통해 골로 분화될 수 있고, 골 뿐만 아니라 치아, 연골, 건 또는 인대, 근육 등으로 분화될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 명세서에서 용어 "줄기세포"는 다양한 신체 조직으로 분화할 수 있는 능력을 갖는 미분화 세포로서, 이는 만능 줄기 세포(totipotent stem cell), 전분화능 줄기세포 (pluripotent stem cell), 다분화능 줄기세포(multipotent stem cell) 등으로 분류될 수 있다. 상기 줄기세포는 줄기체 세포(precursor cell), 전구세포(progenitor cells) 등의 용어와 혼용될 수 있다. 본 발명에서 줄기세포는 배아줄기세포(embryonic stem cell, ESC), 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell, iPSC) 또는 중간엽줄기세포(Mesenchymal stem cells, MSC)일 수 있다. 따라서, 본 발명의 배지 조성물을 이용하면 배아줄기세포, 유도만능줄기세포 등을 이용하여 근골격계 줄기세포의 분화를 유도할 수 있다.

상기 배아줄기세포는 전분화성을 가지는 세포를 의미하며, 형질전환 없는 증식, 무한증식, 자가-재생산 및 3종류의 모든 배아 층으로부터 유래된 어떠한 세포로 발달할 수 있는 능력을 포함하는 배아줄기세포의 특성을 의미하나, 이에 제한되지는 않는다.

본 명세서에서 용어 "근골격계 줄기세포"는 골, 연골, 건 또는 인대, 치아, 지방 및/또는 근육으로 분화될 수 있는 세포를 제한없이 지칭한다.

상기 "분화"는 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 서로 구조나 기능이 특수화되는 현상, 즉 생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어진 일을 수행하기 위하여 형태나 기능이 변해가는 것을 말한다. 일반적으로 비교적 단순한 계(系)가 둘 이상의 질적으로 다른 부분계(部分系)로 분리되는 현상이다. 예를 들면, 개체발생에서 처음에 동질적이었던 알 부분 사이에 머리나 몸통 등의 구별이 생기거나 세포에도 근세포라든가 신경세포 등의 구별이 생기는 것과 같이 처음에 거의 동질이었던 어떤 생물계의 부분 사이에 질적인 차이가 생기는 것, 또는 그 결과로서 질적으로 구별할 수 있는 부분 또는 부분계로 나누어져 있는 상태를 분화라고 한다.

본 명세서에서 이용되는 배아줄기세포 또는 유도만능줄기세포는 인간, 소, 말, 염소, 양, 개, 고양이, 마우스, 래트 또는 조류 등으로부터 유래된 것이고, 바람직하게는 인간 유래이다.

본 명세서에서 용어 "대상" 또는 "subject"는 본 발명의 근골격계 줄기세포 또는 이로부터 분화된 세포를 투여받고자 하는 대상을 의미하며, 인간; 소, 말, 염소, 양, 개, 고양이, 마우스, 래트 등의 포유류; 조류; 파충류; 양서류; 및 어류를 포함한다.

본 발명의 Wnt 신호 활성화제는 제한되지 않으나, 바람직하게는 SB216763(3-(2,4-디클로로페닐)-4-(1-메틸-1H-인돌-3-일)-1H-피롤-2,5-디온), SB415286(3-[(3-클로로-4-히드록시페닐)아미노]-4-(2-니트로페닐)-1H-피롤-2,5-디온), 켄파울론 (Kenpaullone; 9-브로모-7,12-디히드로-인돌로[3,2-d]-[1]벤즈아제핀-6(5H)-온), CHIR99021(9-브로모-7,12-디히드로-피리도[3',2':2,3]아제피노[4,5-b]인돌-6(5H)-온), CP21R7(3-(3-아미노-페닐)-4-(1-메틸-1H-인돌-3-일)-피롤-2,5-디온), SB203580(4-(4-플루오로페닐)-2-(4-메틸술피닐페닐)-5-(4-피리딜)-1H-이미다졸), H-89(5-이소퀴놀린술폰아미드), 퍼모프아민(Purmorphamine; 2-(1-나프톡시)-6-(4-모르폴리노아닐리노)-9-싸이클로헥실퓨린) 또는 IQ-1(2-(4-아세틸-페닐아조)-2-[3,3-디메틸-3,4-디히드로-2H-이소퀴놀린-(1E)-일리덴]-아세트아미드)인 것이다.

본 발명의 ERK 신호 억제제는 제한되지 않으나, 바람직하게는 AS703026(N-[(2S)-2,3-디히드록시프로필]-3-[(2-플루오로-4-요오도페닐)아미노]-이소니코틴아미드), AZD6244(6-(4-브로모-2-클로로아닐리노)-7-플루오로-N-(2-하이드록시에톡시)-3-메틸벤즈이미다졸-5-카르복사미드), PD0325901(N-[(2R)-2,3-디히드록시프로폭시]-3,4-다이플루오로-2-[(2-플루오로-4-요오도페닐)아미노]-벤즈아미드), ARRY-438162(5-[(4-브로모-2-플루오로페닐)아미노]-4-플루오로-N-(2-히드록시에톡시)-1-메틸-1H-벤지이미다졸-6-카르복사미드), RDEA119((S)-N-(3,4-디플루오로-2-((2-플루오로-4-요오도페닐)아미노)-6-메톡시페닐)-1-(2,3-디히드록시프로필)시클로프로판-1-설폰아미드), GDC0973([3,4-다이플루오로-2-(2-플루오로-4-요오도아밀리노)페닐] 3-히드록시-3-[(2S)-피페리딘-2-일]-아제티딘-1-일-메타논), TAK-733((R)-3-(2,3-디히트록시프로필)-6-플루오로-5-(2- 플루오로-4-요오도페닐아미노)-8-메틸피리도[2,3-d]피리미딘-4,7(3H,8H)-디온), RO5126766(3-[[3-플루오로-2-(메틸설파모일아미노)-4-피리딜]메틸]-4-메틸-7-피리미딘-2-일옥시크로멘-2-온) 또는 XL-518([3,4-디플루오로-2-[(2-플루오로-4-요오도페닐)아미노]페닐][3-하이드록시-3-[(2S)-2-피페리디닐]-1-아제티디닐]메타논)인 것이다.

본 발명의 TGF-β/엑티빈/노달(TGF-β/activin/nodal) 신호전달 억제제는 제한되지 않으나, 바람직하게는 E-616452(2-[3-(6-메틸-2-피리디닐)-1H-피라졸-4-일]-1,5-나프티리딘), A-83-01(3-(6-메틸-2-피리디닐)-N-페닐-4-(4-퀴놀리닐)-1H-피라졸-1-카보티오아미드) 또는 SB431542(4-[4-(1,3-벤조디옥솔-5-일)-5-(2-피리디닐)-1H-이미다졸-2-일]벤즈아미드)인 것이다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 배지의 구성요소인 노긴(noggin), LIF(leukemia inhibitory factor), bFGF(basic Fibroblast growth factor), Wnt 신호 활성화제, ERK(extracellular signal-regulated kinase) 신호 억제제 및 TGF-β/엑티빈/노달(TGF-β/activin/nodal) 신호전달 억제제 중 1가지씩을 포함하지 않을 경우의 분화능을, 모두 포함한 경우와 비교한 결과, 상기 성분 중 어느 하나의 구성요소가 결핍할 경우 연골(Alcian blue)이나 골(ALP 및 Alizarin red S)로의 분화가 제대로 이루어지지 않음을 확인하였다(도 7, 표 3).

또한, 상기 노긴(noggin) 대신 Conditioned Media(완전배지에서 DMEM/F12를 Knockout DMEM로 치환한 배지(20% Knockout Serum Replacement (Invitrogen, USA), 1 mM glutamine, 1% 비필수 아미노산 (Invitrogen, USA), 0.1 mM β-메르캅토에탄올, 0.1%페니실린-스트렙토마이신, 5 mg/ml bovine serum albumin으로 보충된 Knockout DMEM)를 이용하여 CF1 mouse embryonic fibroblasts를 24시간 배양하고 난 후 취득한 배양 상청액)를 추가한 배지로 대체하여 분화능을 비교한 결과, 노긴(noggin)을 이용한 본 발명의 배지 조성물이 상기 Conditioned Media를 이용한 경우와 비교하여 골분화의 경향성을 10배 이상 증가시켰으며, 분화속도가 1-2주 이상 빨라짐을 확인하였다(표 1 및 2).

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 근골격계 줄기세포로의 분화 유도용 배지 조성물에서 ESC(embryonic stem cell) 또는 iPS(induced pluripotent stem cell)를 배양하는 단계를 포함하는 근골격계 줄기세포의 제조방법을 제공한다.

상기 배양은 배지 조성의 변화 없이 5계대 이상 배양하는 것이며, 바람직하게는 5계대 내지 25계대, 보다 바람직하게는 7계대 내지 18계대를 배양하는 것이다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 방법으로 배양하여 분화된 근골격계 줄기세포는 인간배아줄기세포 또는 인간유도만능줄기세포로부터 시작하여 7계대 이상 근골격줄기세포 유도배지로 계대 배양하여 얻어지는 안정적으로 동일한 형질을 갖는 세포임을 확인하였으며, 7계대에서 17계대 까지 10계대 이상 유사한 모양으로 성장하다가, 19계대 이후에는 노화마커 β-galactosidase를 염색한 결과 양성반응으로 나타난 것으로 보아 노화가 진행됨을 확인하였다(도 1a).

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 근골격계 줄기세포로의 분화 유도용 배지 조성물을 이용하여 제조된 근골격계 줄기세포를 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 ESC(embryonic stem cell) 또는 iPSC(induced pluripotent stem cell)로부터 분화된 근골격계 줄기세포(MSSC, musculoskeletal stem cell)를 제공한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 근골격계 줄기세포는 하기의 특징을 갖는다:

a) 외배엽 마커인 네스틴(Nestin, NES)에 대해 양성;

b) 근원성 위성 마커(myogenic satellite marker)인 Pax7에 대해 양성;

c)중배엽 마커인 α-SMA에 대해 양성; 및

d) 전분화능 마커인 LIN28에 대해 음성.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 근골격계 줄기세포는 하기의 특징을 추가적으로 갖는다:

중간엽줄기세포 마커인 CD90에 대해 음성.

중간엽 줄기세포 마커인 CD271에 대해 음성.

전분화능 마커인 DPPA4에 대해 양성.

중배엽 마커인 T 및 노달(Nodal)에 대해 음성.

신경외배엽(neuroectoderm) 마커인 Pax6에 대해 양성.

장 줄기세포(intestinal stem cell) 마커인 LGR5에 대해 양성.

연골세포(chondrocyte) 마커인 SOX9에 대해 음성.

근육세포(myoblast) 마커인 MyoD에 대해 음성.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 근골격계 줄기세포는 CD10, CD44, CD105, CD146 및/또는 CD166에 대해 양성을 나타낸다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 근골격계 줄기세포는 대부분의 전분화능 마커의 발현은 관찰되지 않았으나 DPPA4 발현은 관찰되었으며, 외배엽 마커인 NES가 양성을 보였다. 또한, DES 및 초기 중배엽 마커인 T 및 Nodal을 제외한 대부분의 중배엽 마커에 양성을 나타내었고, 대부분의 내배엽 마커에 대해 음성을 나타냄을 확인하였다(도 1c). 또한, hMSSC의 특성을 조사하기 위해서, 중간엽 줄기세포 특이 세포 표면 항원의 발현을 조사한 결과, 중간엽 줄기세포 마커 중 CD44, CD51, CD73, CD105, CD146, CD166은 hMSSC에서 발현되는 반면, 중간엽줄기세포 마커 중 CD90 및 CD271은 hMSSC에서는 발현되지 않음을 확인하였다. 또한, 혈액 계통 세포표면 표지자인 CD2, CD3, CD7, CD8, CD11b, CD14, CD19, CD20, CD31, CD34, CD56은 발현되지 않은 반면 pre-B 세포 마커인 CD10이 발현되어 있었다(도 1d). 추가적으로, 여러 계통의 조직 특이 마커 발현을 분석한 결과, 중배엽 마커인 alpha smooth muscle actin (α-SMA), neuroectoderm marker인 Pax6, myogenic satellite marker인 Pax7 및 intestinal stem cell marker인 LGR5 등이 발현되고 있고, chondrocyte marker인 SOX9 및 myoblast marker인 MyoD 등은 발현되어 있지 않았다(도 1e).

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 근골격계 줄기세포는 중배엽으로 분화되나 외배엽 또는 내배엽으로는 분화되지 않는 것이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 근골격계 줄기세포는 근육, 골, 연골, 건 또는 인대로 분화되는 특성을 갖는 것이다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 근골격계 줄기세포를 중간엽 줄기세포 배양 배지(예를 들어, MSCGM, MSCGM-CD 등)에서 배양하고 신장내(kidney capsule) 또는 피하에 이식한 경우 신장내 또는 피하에서 전형적인 근육, 지방, 건 또는 인대, 골, 연골이 형성하였음을 확인하였다(도 3). 상기 분화된 근육조직을 확인한 결과 모두 골격근으로 분화가 되었고, 평활근으로는 분화가 되지 않은 것을 확인하였으며, 시험관내(in-vitro) 시험에서 지방으로 분화되지 않았던 결과와는 달리 생체내(in-vivo) 시험에서는 지방으로도 분화될 수 있음을 확인하였다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 근골격계 줄기세포는 신경으로는 분화되지 않는 특성을 갖는 것이다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 근골격계 줄기세포를 신경 분화 배지에서 신경세포로 분화시키고, 신경세포 마커를 이용하여 확인한 결과 상기 근골격계 줄기세포는 신경세포로 분화하는 잠재력이 없음을 확인하였다(도 2e).

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 근골격계 줄기세포는 내피세포로는 분화되지 않는 특성을 갖는 것이다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 근골격계 줄기세포를 EC 분화 배지(endothelial growth medium)에서 내피세포로 분화시키고, 내피세포 마커를 이용하여 확인한 결과 상기 근골격계 줄기세포는 내피 세포로 분화하는 잠재력이 없음을 확인하였다(도 2c 및 2d).

상기 근골격계 줄기세포는 2018년 10월 10일 한국세포주은행에 기탁번호 제KCLRF-BP-00460호로 기탁되었다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 근골격계 줄기세포를 포함하는 근골격계 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 근골격계 줄기세포를 포함하는 세포치료제를 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 근골격계 줄기세포를 포함하는 근골격계 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물의 용도를 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 근골격계 줄기세포를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 근골격계 질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.

본 명세서에서 용어 “근골격계 질환”은 골, 연골, 치아, 근육, 인대 또는 건, 신경 등의 부위에 나타나는 질환을 의미하며, 이에 제한되지 않으나 바람직하게는 골다공증, 골연화증, 골형성 부전증(osteogenesis imperfecta), 골화석증(osteopetrosis), 골경화증(osteosclerosis), 파제트병(Paget's disease), 골암, 관절염, 류머티스성 관절염, 구루병, 골절, 치주 질환, 치아우식증, 치은염, 치주염, 치조골 소실, 치아의 손상 또는 소실, 분절성 골결손, 골용해성 골질환, 원발성 및 속발성 부갑상선기능항진증, 과골증, 퇴행성 관절염, 변형성슬관절증, 변형성고관절증, 변형성족관절증, 변형성수관절증, 변형성견관절증, 변형성주관절증, 슬개연골연화증, 단순성슬관절염, 이단성골연골염, 상완골외측상과염, 상완골내측상과염, 헤바딘 결절, 부샤르 결절, 변형성모지 CM관절증, 반월판 손상, 추간판 디스크 변성, 십자인대 상완 이두박근기시건, 십자인대 파열, 인대손상, 건 손상 오십견, 류마티스성열, 전신경화증, 전신홍반성낭창, 엘로스-달로스증후군, 마판증후군, 괴혈병, 대퇴사두근 파열, 슬관절 인대 파열, 비골 건 질환, 아킬레스 건 질환, 족저 근막염, 회전근개 파열, 석회화 건염, 어깨 충동 증후군, 재발성 탈구, 습관성 탈구, 노화성 근소모증, 중증근무력증, 근경직증, 근위축성 측색 경화증, 루게릭병, 염증성 근병변, 샤르코-마리-투스병 및 근이양증으로 구성된 군으로부터 선택되는 1 또는 그 이상의 질환인 것이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 상기 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있다. 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 관절강내 주입, 골내 주입, 건 또는 인대에 주입, 잇몸에 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장내 투여 등으로 투여할 수 있다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 상기 조성물의 바람직한 투여량은 성인 기준으로 10²-10¹⁰ 세포/kg 범위 내이다. 용어 약제학적 유효량은 근골격계 질환을 예방 또는 치료하는 데 충분한 양을 의미한다.

본 발명의 조성물은 당해 당업자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다. 또한, 상기 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 또한 단회 또는 필요시 추가 투여될 수 있다.

본 명세서에서 용어 “세포치료제”는 사람으로부터 분리, 배양 및 특수한 조작을 통해 제조된 세포 및 조직으로 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품(미국 FDA규정)이며, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가, 동종 또는 이종 세포를 체외에서 증식, 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 말한다.

본 명세서에서 용어 “예방”은 본 발명의 조성물 또는 세포치료제의 투여로 근골격계 질환을 억제시키거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “치료”는 본 발명의 조성물 또는 세포치료제의 투여로 근골격계 질환이 호전 또는 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 약제학적 조성물 또는 세포치료제는 인간용 또는 동물용으로 사용될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물 또는 세포치료제는 근골격 질환의 예방 및 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료, 생물학적 반응 조절제, 임플란트, 인공관절 또는 인공연골 등의 삽입, 기타 다른 재생 치료 등의 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 근골격계 줄기세포의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 하기의 특징을 갖는 세포를 선별하는 단계를 포함한다:

a) 외배엽 마커인 네스틴(Nestin, NES)에 대해 양성;

b) 근원성 위성 마커(myogenic satellite marker)인 Pax7에 대해 양성;

c)중배엽 마커인 α-SMA에 대해 양성; 및

d) 전분화능 마커인 LIN28에 대해 음성.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 하기의 특징을 갖는 세포를 선별하는 단계를 추가적으로 포함한다:

중간엽 줄기세포 마커인 CD90에 대해 음성.

중간엽 줄기세포 마커인 CD271에 대해 음성.

전분화능 마커인 DPPA4에 대해 양성.

중배엽 마커인 T 및 노달(Nodal)에 대해 음성.

신경외배엽(neuroectoderm) 마커인 Pax6에 대해 양성.

장 줄기세포(intestinal stem cell) 마커인 LGR5에 대해 양성.

연골세포(chondrocyte) 마커인 SOX9에 대해 음성.

근육세포(myoblast) 마커인 MyoD에 대해 음성.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 CD10, CD44, CD105, CD146 및/또는 CD166에 대해 양성을 나타내는 세포를 선별하는 단계를 추가적으로 포함한다.

본 발명의 스크리닝 방법을 이용하면, 골, 연골, 건, 인대, 근육 등으로 효과적으로 분화될 수 있는 근골격계 줄기세포를 손쉽게 선별할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 골, 치아, 연골, 건, 인대, 근육 및 지방으로 분화될 수 있는 근골격계 줄기세포(MSSC, musculoskeletal stem cell)로부터 근육으로만 선택적으로 분화를 유도하기 위한 분화 유도용 배지 조성물을 제공한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 배지 조성물은 헤파린(heparin)을 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 근골격계 줄기세포는 하기의 특징을 갖는다:

a) 외배엽 마커인 네스틴(Nestin, NES)에 대해 양성;

b) 근원성 위성 마커(myogenic satellite marker)인 Pax7에 대해 양성;

c) 중배엽 마커인 α-SMA에 대해 양성; 및

d) 전분화능 마커인 LIN28에 대해 음성.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 분화 유도용 배지 조성물 및 근골격계 줄기세포를 유효성분으로 포함하는, 근골격계 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 골, 치아, 연골, 건, 인대, 근육 및 지방으로 분화될 수 있는 근골격계 줄기세포에 헤파린(heparin)을 처리하는 단계를 포함하는 근골격계 줄기세포로부터 근육으로만 선택적 분화를 유도하는 방법을 제공한다.

a) 외배엽 마커인 네스틴(Nestin, NES)에 대해 양성;

b) 근원성 위성 마커(myogenic satellite marker)인 Pax7에 대해 양성;

c) 중배엽 마커인 α-SMA에 대해 양성; 및

d) 전분화능 마커인 LIN28에 대해 음성.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 근골격계 줄기세포에 헤파린을 혼합하여 마우스의 피하에 이식시, 근육으로만 선택적으로 분화함을 확인하였다(도 8).

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 골, 치아, 연골, 건, 인대, 근육 및 지방으로 분화될 수 있는 근골격계 줄기세포(MSSC, musculoskeletal stem cell)로부터 건 또는 인대로만 선택적으로 분화를 유도하기 위한 분화 유도용 배지 조성물을 제공한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 배지 조성물은 CTGF(connective tissue growth factor) 및 아스코브산(ascorbic acid)을 포함한다.

a) 외배엽 마커인 네스틴(Nestin, NES)에 대해 양성;

b) 근원성 위성 마커(myogenic satellite marker)인 Pax7에 대해 양성;

c) 중배엽 마커인 α-SMA에 대해 양성; 및

d) 전분화능 마커인 LIN28에 대해 음성.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 분화 유도용 배지 조성물로 전처리한 근골격계 줄기세포를 유효성분으로 포함하는, 근골격계 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 골, 치아, 연골, 건, 인대, 근육 및 지방으로 분화될 수 있는 근골격계 줄기세포에 CTGF(connective tissue growth factor) 및 아스코브산(ascorbic acid)을 처리하는 단계를 포함하는 근골격계 줄기세포로부터 건 또는 인대로만 선택적 분화를 유도하는 방법을 제공한다.

a) 외배엽 마커인 네스틴(Nestin, NES)에 대해 양성;

b) 근원성 위성 마커(myogenic satellite marker)인 Pax7에 대해 양성;

c) 중배엽 마커인 α-SMA에 대해 양성; 및

d) 전분화능 마커인 LIN28에 대해 음성.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 근골격계 줄기세포에 CTGF 및 아스코브산을 전처리한 후, 전처리된 세포를 마우스의 피하에 이식시, 건 또는 인대로만 선택적으로 분화함을 확인하였다(도 9).

상기 근골격계 줄기세포와 CTGF 및 아스코브산의 혼합비율은 제한되지 않으나, 근골격계 줄기세포 1 x 10⁵ 내지 1 x 10⁷ 세포당 CTGF는 5 내지 500 ng/ml로, 아스코브산은 2.5 내지 250 ㎍/ml로 1 내지 7일간 전처리하는 것이 바람직하다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 골, 치아, 연골, 건, 인대, 근육 및 지방으로 분화될 수 있는 근골격계 줄기세포(MSSC, musculoskeletal stem cell)로부터 골로만 선택적으로 분화를 유도하기 위한 분화 유도용 배지 조성물을 제공한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 배지 조성물은 인슐린(insulin), 히알루론산(hyaluronic acid) 및 아스코브산(ascorbic acid)을 포함한다.

a) 외배엽 마커인 네스틴(Nestin, NES)에 대해 양성;

b) 근원성 위성 마커(myogenic satellite marker)인 Pax7에 대해 양성;

c) 중배엽 마커인 α-SMA에 대해 양성; 및

d) 전분화능 마커인 LIN28에 대해 음성.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 골, 치아, 연골, 건, 인대, 근육 및 지방으로 분화될 수 있는 근골격계 줄기세포에 인슐린(insulin), 히알루론산(hyaluronic acid) 및 아스코브산(ascorbic acid)을 처리하는 단계를 포함하는 근골격계 줄기세포로부터 골로만 선택적 분화를 유도하는 방법을 제공한다.

a) 외배엽 마커인 네스틴(Nestin, NES)에 대해 양성;

b) 근원성 위성 마커(myogenic satellite marker)인 Pax7에 대해 양성;

c) 중배엽 마커인 α-SMA에 대해 양성; 및

d) 전분화능 마커인 LIN28에 대해 음성.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 근골격계 줄기세포에 인슐린, 아스코브산 및 히알루론산을 전처리한 후, 전처리된 세포를 마우스의 신장 내에 이식시, 골로만 선택적으로 분화함을 확인하였다(도 10).

상기 근골격계 줄기세포와 인슐린, 아스코브산 및 히알루론산의 혼합비율은 제한되지 않으나, 근골격계 줄기세포 1 x 10⁵ 내지 1 x 10⁷ 세포당 인슐린은 0.5 내지 50 ㎍/ml로, 아스코브산은 2.5 내지 250 ㎍/ml로, 히알루론산은 0.1 내지 10 ㎍/ml로 1 내지 7일간 전처리하는 것이 바람직하다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 골, 치아, 연골, 건, 인대, 근육 및 지방으로 분화될 수 있는 근골격계 줄기세포(MSSC, musculoskeletal stem cell)로부터 치아로만 선택적으로 분화를 유도하기 위한 분화 유도용 배지 조성물을 제공한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 배지 조성물은 치아 상피세포(dental epithelial cell)를 포함한다.

a) 외배엽 마커인 네스틴(Nestin, NES)에 대해 양성;

b) 근원성 위성 마커(myogenic satellite marker)인 Pax7에 대해 양성;

c) 중배엽 마커인 α-SMA에 대해 양성; 및

d) 전분화능 마커인 LIN28에 대해 음성.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 골, 치아, 연골, 건, 인대, 근육 및 지방으로 분화될 수 있는 근골격계 줄기세포에 치아 상피세포(dental epithelial cell)를 코팅하는 단계를 포함하는 근골격계 줄기세포로부터 치아로만 선택적으로 분화를 유도하는 방법을 제공한다.

a) 외배엽 마커인 네스틴(Nestin, NES)에 대해 양성;

b) 근원성 위성 마커(myogenic satellite marker)인 Pax7에 대해 양성;

c) 중배엽 마커인 α-SMA에 대해 양성; 및

d) 전분화능 마커인 LIN28에 대해 음성.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 근골격계 줄기세포에 치아 상피세포를 코팅한 후 마우스의 신장 내에 이식시, 치아로만 선택적으로 분화함을 확인하였다(도 11).

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 골, 치아, 연골, 건, 인대, 근육 및 지방으로 분화될 수 있는 근골격계 줄기세포(MSSC, musculoskeletal stem cell)를 대상의 손상된 건 또는 인대 부위에 투여하는 단계를 포함하는 손상된 건 또는 인대의 치료방법을 제공한다.

a) 외배엽 마커인 네스틴(Nestin, NES)에 대해 양성;

b) 근원성 위성 마커(myogenic satellite marker)인 Pax7에 대해 양성;

c) 중배엽 마커인 α-SMA에 대해 양성; 및

d) 전분화능 마커인 LIN28에 대해 음성.

상기 근골격계 줄기세포는 손상된 건 또는 인대부위에 직접 주입을 하거나, 건 또는 인대 부위로의 점착성을 향상시키기 위해 피브린 글루계, 시아노아크릴레이트계, 젤라틴 글루계, 폴리우레탄계 등 점착제를 혼합하여 사용할 수 있으며, 예를 들어, 근골격계 줄기세포 1 x 10⁵ 내지 1 x 10⁷ 세포당 피브린 글루 1 내지 100 ㎕를 혼합하여 세포응집체를 제조하여 이식할 수 있다(도 12).

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 골, 치아, 연골, 건, 인대, 근육 및 지방으로 분화될 수 있는 근골격계 줄기세포(MSSC, musculoskeletal stem cell)를 대상의 관절강 내에 투여하는 단계를 포함하는 관절염의 치료방법을 제공한다.

a) 외배엽 마커인 네스틴(Nestin, NES)에 대해 양성;

b) 근원성 위성 마커(myogenic satellite marker)인 Pax7에 대해 양성;

c) 중배엽 마커인 α-SMA에 대해 양성; 및

d) 전분화능 마커인 LIN28에 대해 음성.

상기 근골격계 줄기세포는 손상된 연골부위(예를 들어, 관절강)에 그대로 직접 주입을 하거나, 이를 PBS에 재현탁(resuspension) 하여 주입하거나, 동결건조하여 보관하다가 필요시 해당하여 바로 주입하는 방식 등으로 다양하게 주입할 수 있다(도 13).

본 발명에서 기술하는 상기 근골격계 줄기세포는 하기의 특징을 추가적으로 포함할 수 있다:

e) 중간엽줄기세포 마커인 CD90에 대해 음성;

f) 중간엽 줄기세포 마커인 CD271에 대해 음성;

g) 전분화능 마커인 DPPA4에 대해 양성;

h) 중배엽 마커인 T 및 노달(Nodal)에 대해 음성;

i) 신경외배엽(neuroectoderm) 마커인 Pax6에 대해 양성;

j) 장 줄기세포(intestinal stem cell) 마커인 LGR5에 대해 양성;

k) 연골세포(chondrocyte) 마커인 SOX9에 대해 음성; 또는

l) 근육세포(myoblast) 마커인 MyoD에 대해 음성.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(ⅰ) 본 발명은 ESC 또는 iPSC로부터 유래된 근골격계 줄기세포를 제공한다.

(ⅱ) 또한, 본 발명은 상기 근골격계 줄기세포로부터 근육, 연골, 건 또는 인대, 골 또는 치아로 분화를 유도하는 분화 유도용 배지 조성물 및 이의 분화유도 방법을 제공한다.

(ⅲ) 본 발명의 근골격계 줄기세포는 간편한 조작을 통하여 원하는 조직만으로 방향성을 갖고 분화될 수 있어, 다양한 근골격계 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용할 수 있다.

도 1은 hESC로부터 분화된 hMSSC의 특징에 대한 것이다. 도 1a는 hESC를 근골격줄기세포 유도배지로 계대배양하여 7계대부터 19계대까지 세포 모양의 변화를 나타낸 사진이다. 도 1b는 hMSSC에서 전분화능 마커 OCT4, NANOG, SOX2, LIN28의 발현을 세포면역형광법에 의해 관찰한 결과를 나타낸다. 도 1c는 hESC, hMSC 및 7, 17계대에서의 hMSSC에서 전분화능, 외배엽, 중배엽 및 내배엽 마커들의 발현을 RNA-sequencing을 통해 각각 2번씩 확인한 결과이다. 도 1d는 hMSSC의 특성을 조사하기 위해서, 세포 표면 항원의 발현을 유식세포분석기로 측정한 결과를 나타낸다. 도 1e는 hMSSC의 특성을 조사하기 위해서, 여러 계통의 세포 특이 마커 발현을 세포면역형광법으로 분석한 결과를 나타낸다. 도면에서 DAPI는 핵을 염색한 것이다. 도면에서 파란색 삼각형 표시는 β-galactosidase positive cell을 의미한다.
도 2는 hMSSC의 실험관내 분화능을 다른 종류의 세포들과 비교한 데이터를 나타낸다. 도 2a는 hMSC 및 hMSSC의 실험관내 골, 연골, 지방 분화능을 비교한 결과를 나타낸다. 도 2b는 hMSSC가 골격근으로 분화하는 잠재력이 있음을 골격근세포 특이 마커인 MYH9에 대한 세포면역형광법으로 확인한 결과를 나타낸다. C2C12는 골격근세포 양성대조군으로 사용되었다. 도 2c 및 2d는 hMSSC가 내피 세포로 분화하는 잠재력이 없음을 내피세포 특이 마커 CD31과 VE-cadherin에 대한 세포면역형광법으로 확인한 결과를 나타낸다. 도 2e는 hMSSC가 신경 세포로 분화하는 잠재력이 없음을 신경세포 특이 마커 MAP2에 대한 세포면역형광법으로 확인한 결과를 나타낸다. 양성대조군으로 H9 hESC에서 분화된 neural stem cells을 이용하였다.
도 3은 hMSSC의 분화 가능성을 in vivo에서 측정한 결과를 나타낸다. 도 3a-a는 hMSSC를 신장내에 이식한 경우 H&E 염색상에서 전형적인 근육, 지방, 건이 형성되었음을 확인한 결과를 나타낸다. 도 3a-b는 hMSSC를 신장내에 이식할 경우 근육, 지방, 건 세포로 분화됨을 근육특이 마커인 pMLC, 지방특이마커인 PPARgamma (PPAr), 건 또는 인대특이마커인 Scx에 대한 조직면역형광법으로 확인한 결과를 나타낸다. hLA는 인간세포특이 마커로서 인간유래세포임을 보이기 위해서 염색한 결과이다. 도 3b-a는 hMSSC의 신장내 이식 부위에서 골이 형성되었음을 Micro CT로 스캔한 결과를 나타낸다. 도 3b-b 및 3b-c는 H&E 및 펜타크롬 조직화학염색을 통해 골이 형성되었음을 확인한 결과를 나타낸다. 도 3b-d는 골형성 조직 내부의 세포에서 인간 세포 마커인 hLA(human leukocyte antigen), 골 마커인 Osx(osterix), Runx2, DMP1, OCN(osteocalin), 혈관마커인 vWF의 발현양상을 조직면역형광법으로 확인한 결과이다. 도 3c는 hMSSC를 피하에 이식한 경우 연골세포로 분화된 결과로, H&E 및 톨루이딘 블루 조직화학염색을 통해 연골이 형성되었음을 확인한 결과를 나타낸다. 또한 연골마커인 ColII (collagen II)의 발현도 조직면역형광법으로 확인하였다.
도 4는 hMSSC의 골절 회복에 대한 효과를 확인한 결과이다. 도 4a는 골절부위에 hMSC를 이식한 경우 hMSC에 의한 것이 아닌, 마우스 자체내의 세포가 골을 형성했음을 나타내는 결과이다. 도 4a-a는 골절부위에 hMSC를 이식한 후 2, 4, 6주 후에 찍은 MicroCT결과이다. 도 4a-b는 hMSC가 이식된 골절부위를 포함한 대퇴골의 H&E 조직화학염색결과이다. 도 4a-c는 4a-b의 빨간색 네모부위를 확대한 결과이다. 도 4a-d는 이식된 hMSC가 골세포로 분화되지 않았음을 골세포마커인 Runx2 및 인간세포마커인 hLA에 대한 조직면역형광법으로 확인한 결과이다. 도 4b는 상기 hMSC 경우와 달리, hMSSC를 이식한 경우 hMSSC의 분화에 의해 골이 형성되었음을 나타내는 결과이다. 도 4b-a는 골절부위에 hMSSC를 이식한 후 2, 4, 6주 후에 찍은 MicroCT결과이다. 도 4b-b는 hMSSC가 이식된 골절부위를 포함한 대퇴골의 H&E 조직화학염색결과이다. 도 4b-c는 4b-b의 빨간색 네모부위를 확대한 결과이다. 도 4b-d는 이식된 hMSSC가 골세포로 분화되었음을 골세포마커인 Runx2 및 인간세포마커인 hLA에 대한 조직면역형광법으로 확인한 결과이다.
도 5는 hESC와 동일하게 hiPSC도 상기 hMSSC로 분화하는지를 확인한 결과이다. 도 5a는 hiPS로부터 분화된 hMSSC에서 전분화능 마커인 Oct4, Nanog, Sox2, 및 Lin28의 발현 수준을 세포면역형광법으로 확인한 결과이다. 도 5b는 hiPS로부터 분화된 hMSSC에서 특이 세포 표면 항원의 발현을 유식세포분석기로 조사한 결과이다. 도 5c는 hiPS로부터 분화된 hMSSC의 실험관내 골, 연골, 지방으로의 분화능을 확인한 결과이다. 도 5d는 hiPS로부터 분화된 hMSSC를 골격근 분화 배지에서 배양함으로써 골격근으로 분화한 후 골격근의 마커인 MYH9에 대하여 세포면역형광법을 수행한 결과를 나타낸다.
도 6은 CM 배지와 hMSSC 유도배지로 유도된 hMSSC에서 CD44의 발현량을 유식세포분석기로 비교한 결과를 나타낸다.
도 7은 hMSSC 배지의 성분 중 일부 성분이 결핍될 경우 연골이나 골 분화의 경향성 변화 결과를 통해 연골분화여부를 확인할 수 있는 Alcian blue 염색 및 골분화여부를 확인할 수 있는 ALP 및 Alizarin red S의 염색결과로 확인한 것을 나타낸다.
도 8은 hESC로부터 분화된 hMSSC의 근육으로의 선택적 분화를 나타낸 것이다. hESC로부터 분화된 hMSSC(1 x 10⁶ cells)를 fibrin glue와 섞어 balb/c nude 마우스의 피하에 이식한 후 7 주 후에 이식 부위를 제거한 후 hematoxylin & eosin을 염색한 것이다.
도 9는 hESC로부터 분화된 hMSSC의 건 또는 인대로의 선택적 분화를 나타낸 것이다. hMSSC를 50 ng/ml connective tissue growth factor와 25 ㎍/ml ascorbic acid로 2일간 전처리한 후 전처리 세포(1 x 10⁶ cells)를 fibrin glue 100 ㎕와 섞어 balb/c nude 마우스의 피하에 이식한 후 5 주 후에 이식 부위를 제거한 후 hematoxylin & eosin을 염색한 결과 및 인간세포 핵 마커와 결합하는 hLA에 대한 항체로 염색하여 분화된 조직이 hMSSC에서 유래된 것인지를 확인 및 건 또는 인대 마커인 scx에 대한 항체를 이용하여 형광 염색하여 분화된 조직이 건 또는 인대임을 확인한 결과를 나타낸다.
도 10은 hESC로부터 분화된 hMSSC의 골로의 선택적 분화를 나타낸 것이다. hESC로부터 분화된 hMSSC를 10 ㎍/ml hyaluronic acid, 5 ㎍/ml insulin, 25 ㎍/ml ascorbic acid가 첨가된 N2B27 배양액에 hanging drop 방식으로 세포집합체를 만들어 3 일간 배양한 후 balb/c nude 마우스 신장 내에 이식하였다. 5주 후에 이식 부위를 제거한 후 hematoxylin & eosin 염색, microCT 및 면역염색을 실시하였다. 도 10a는 hMSSC 세포집합체를 이식한 후 5주 후에 적출한 신장 사진을 나타낸 것이다. 도 10b는 도 10a의 신장을 촬영한 microCT사진을 나타낸 것이다. 도 10c는 hMSSC 세포집합체를 신장 내에 이식한 후 4 주 후 microCT상 hard tissue가 보이는 부분의 H&E 염색상에서 전형적인 골이 형성되었음을 확인한 결과를 나타낸다. 도 10d는 골형성 조직 내부의 세포에서 인간 세포 마커인 hLA(human leukocyte antigen), 연골 마커인 ColII (collagen II)의 발현양상을 조직면역형광법으로 확인한 결과이다. 도 10e는 골형성 조직 내부의 세포에서 인간 세포 마커인 hLA(human leukocyte antigen), 골 마커인 Osx(osterix)의 발현양상을 조직면역형광법으로 확인한 결과이다.
도 11은 hESC로부터 분화된 hMSSC의 치아로의 선택적 분화를 나타낸 것이다. 도 11a는 hMSSC의 세포응집체를 mouse dental epithelial cell로 coating하여 마우스 신장내에 이식한 후 6주 후에 적출한 신장 사진을 나타낸 것이다. K는 신장, B는 골, T는 치아를 나타낸 것이다. 도 11b는 도 11a의 신장을 microCT로 촬영한 사진을 나타낸 것이다. 도 11c는 도 11a의 치아에 대한 Hematoxylin & eosin 염색사진을 나타낸 것이다. 도 11d는 도 11a의 치아에 대한 인간 세포 마커인 hLA의 발현을 조직면역형광법으로 확인한 결과이다. To-PRO-3은 핵을 염색한 결과이다.
도 12는 hESC로부터 분화된 hMSSC의 손상된 인대의 치료 가능성을 in vivo에서 측정한 결과를 나타낸 것이다. H&E 염색 및 인간세포 특이 마커인 hLA와 건 또는 인대 특이 마커인 scx에 대한 면역형광염색 측정을 통해 hMSSC가 분화되어 결절된 인대를 연결하였음을 확인한 결과이다.
도 13은 hESC로부터 분화된 hMSSC의 손상된 연골의 치료 가능성을 in vivo에서 측정한 결과를 나타낸 것이다. hMSSC 주입한 그룹 모두(PBS 군 및 Sol 군)에서 관절염 중증도가 절반 이상으로 낮아진 것을 확인한 결과이다.

이하, 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1. 실험 동물

Balb/c-nude 백그라운드의 7 내지 10주령의 모든 마우스(20 내지 24 g)는 Orient bio(seongnam, Korea)에서 구매하였다. 모든 동물 관련 실험은 전북대학교 동물 관리 및 사용 위원회의 가이드라인에 따라서 실시하였다. 동물은 조정된 온도 (21 내지 24℃) 및 12:12시간의 명암 사이클 환경에서 유지되며, 물과 음식에 자유롭게 접근하도록 하였다.

실시예 2.1. hESC로부터 hMSSC로의 분화 유도

H9 hESC(human embryonic stem cells)를 WiCell(Madison, MI, USA)에서 구입하였다. hESC는 미토마이신 C 처리로 세포 분열이 정지된 CF1 mouse embryonic fibroblast(MEF)의 바탕 영양 세포 위에서 배양하였다. hESC 배양 배지는 20% KnockOut Serum Replacement(이하 KSR로 표기, Invitrogen, USA), 1 mM 글루타민(Invitrogen, USA), 1% 비필수 아미노산(Invitrogen, USA), 0.1 mM β-머캅토에탄올(Invitrogen, USA), 및 0.1% 페니실린/스트렙토마이신(Invitrogen, USA), 및 15 ng/ml bFGF (R&D Systems, USA)가 첨가된 DMEM/F12(Invitrogen, USA)로 제조하였다.

hESC를 hMSSC(human muscloskeletal stem cells)로 분화를 유도하기 위한 배지로는 다음의 조성을 포함하는 배지(이하, “MSSC 배지”라 함)를 이용하여 분화를 유도하였다:

1) 250 ng/ml 인간 noggin(KOMA Biotech, Korea),

2) 20 ng/ml 인간 LIF(KOMA Biotech, Korea),

3) 15 ng/ml basic Fibroblast growth factor(FGF)(R&D Systems, USA)(FGF2 신호전달 활성화제),

4) 3 μM CHIR99021(Cayman, USA)(Wnt 신호 활성화제),

5) 1 μM PD0325901(Cayman, USA)(ERK (extracellular signal-regulated kinase) 신호 억제제),

6) 10 μM SB431542(Tocris, United Kingdom)(TGF-β/엑티빈/노달 (TGF-β/activin/nodal) 신호 억제제),

7) 기타: 10% knockout serum replacement(Invitrogen, USA), 1% N2 supplement(Gibco, USA), 2% B27 supplements(Gibco, USA), 1% 비필수 아미노산(Gibco, USA), 43% DMEM/F12(Gibco, USA), 43% Neurobasal(Gibco, USA), 1 mM glutamine, 0.1 mM β-머캅토에탄올, 0.1% 페니실린-스트렙토마이신 및 5 mg/ml 소혈청알부민 (Gibco, USA) 등으로 구성.

상기 hESC의 생존력을 높이기 위하여, ROCK(Rho-associated coiled-coil kinase) 억제제(Y-27632, 10 μM, Calbiochem, Germany) 및 PKC(protein kinase C) 억제제(Go6983, 2.5 μM, Sigma, USA)를 24시간 동안 처리한 후, TrypLE(Life technology, USA)로 처리해 트립신화(trypsinized)된 hESC를 비트로넥틴+젤라틴(1 ng/ml, Sigma, USA)이 도포된 배양접시에서 상기 MSSC 배지를 이용하여 7계대까지 배양함으로써 hMSSC로의 세포 분화를 유도하였다. 상기 분화된 MSSC 세포주는 5계대 이상부터 안정적으로 동일한 형질을 갖고 있음을 확인하여, 10 계대 배양한 것을 2018년 10월 10일자로 한국세포주은행에 기탁을 하고 기탁번호 제KCLRF-BP-00460호를 부여받았다.

실시예 2.2. iPSC로부터 hMSSC로의 분화 유도

hiPSC(human induced pluripotent stem cells)은 Hasegawa 등이 개발한 방식으로 sendai virus를 매개로 한 OCT4, KLF4, SOX2 및 cMYC 유전자를 BJ fibroblast(ATCC®CRL2522™)에 도입시켜 생성하였다(Fusaki et al., 2009, PNAS 85, 348-362). hiPSC는 미토마이신 C 처리로 세포 분열이 정지된 CF1 mouse embryonic fibroblast(MEF)의 바탕 영양 세포 위에서 배양하였다. hiPSC 배양 배지는 20% KnockOut Serum Replacement(이하 KSR로 표기, Invitrogen, USA), 1 mM 글루타민(Invitrogen, USA), 1% 비필수 아미노산(Invitrogen, USA), 0.1 mM β-머캅토에탄올(Invitrogen, USA), 0.1% 페니실린/스트렙토마이신(Invitrogen, USA), 및 15 ng/ml bFGF (R&D Systems, USA)가 첨가된 DMEM/F12(Invitrogen, USA)로 제조하였다.

hiPSC를 hMSSC(human muscloskeletal stem cells)로 분화를 유도하기 위한 배지로는 다음의 조성을 포함하는 배지(이하, “MSSC 배지”라 함)를 이용하여 분화를 유도하였다:

1) 250 ng/ml 인간 noggin(KOMA Biotech, Korea),

2) 20 ng/ml 인간 LIF(KOMA Biotech, Korea),

4) 3 μM CHIR99021(Cayman, USA)(Wnt 신호 활성화제),

상기 hiPSC의 생존력을 높이기 위하여, ROCK(Rho-associated coiled-coil kinase) 억제제(Y-27632, 10 μM, Calbiochem, Germany) 및 PKC(protein kinase C) 억제제(Go6983, 2.5 μM, Sigma, USA)를 24시간 동안 처리한 후, TrypLE(Life technology, USA)로 처리해 트립신화(trypsinized)된 hiPSC를 비트로넥틴+젤라틴(1 ng/ml, Sigma, USA)이 도포된 배양접시에서 상기 MSSC 배지를 이용하여 7계대까지 배양함으로써 hMSSC로의 세포 분화를 유도하였다. 상기 분화된 MSSC 세포주는 5계대 이상부터 안정적으로 동일한 형질을 갖고 있음을 확인하였다.

실시예 3. 조직화학적 분석

실시예 2에서 분화된 hMSSC를 Balb/c-nude의 피하 및 신장 내에 주입하여 분화시킨 시료를 2% 파라포름알데히드(PFA)(Wako, Japan)에 4℃에서 밤새도록 고정하였다. 뼈로의 분화여부를 알기 위한 시료는 4℃에서 2주 동안 PBS(pH 7.2) 내 0.4 M EDTA로 석회를 제거하였다. 이후 시료를 에탄올과 자일렌을 순차적으로 사용하여 탈수시킨 후, 파라핀에 임베딩하거나 또는 수크로오스 내에서 동결보호에 의해 OCT에 임베딩하고 5 μm 두께로 절단하였다. 절단면을 H&E(Cosmobio, Japan)로 염색하였다.

실시예 4. 면역형광분석

본 명세서 설명하고 있는 “조직면역형광염색”은 다음과 같은 방법을 따라 수행하였다.

hMSSC를 Balb/c-nude의 피하 및 신장 내에 주입하여 분화시킨 시료를 PBS 내 4% PFA(Wako, Janpan)로 4℃에서 밤새 고정하였다. Morse’용액으로 모든 시료에서 석회를 제거하였다. 파라핀으로 임베딩(Leica Biosystems, Germany) 후, 시료를 5 μm 두께로 절단하였다. 조직 절단면을 3% 과산화수소에서 15분 동안 차단한 후, 일차 항체와 함께 4℃에서 밤새 배양하였다. 절단면에 처리된 일차 항체는 다음과 같다: HLA class I에 대한 마우스 모노클로날 항체(Abcam, United Kingdom), Collagen Type II에 대한 염소 폴리클로날 항체(Santacruz, USA), Osterix에 대한 항체(Abcam, USA). 사용된 이차 항체는 Alexa 555(Invitrogen, USA) 및 Alexa 488(Invitrogen, USA) IgG이다. 핵을 강조하기 위해 면역염색된 절단면을 TO-PRO3(Invitrogen, USA)로 대조 염색하였다. Leica DM 5000 현미경(Leica Microsystems, Germany) 또는 공초점 현미경(LSM510; Carl Zeiss, Germany)으로 형광으로 표지된 조직 절단면을 포착하고 Zen 소프트웨어로 확인하였다.

실시예 5. 유세포분석

실시예 2.1 및 2.2의 hMSSC에 트립신/EDTA를 처리하여 단일 세포 현탁액으로 분리시킨 후, PBS 내 2% BSA에 의해 비특이적 결합을 차단한 후 완충 용액[1XPBS, 1% BSA, 및 0.01% 소듐 아자이드] 내에서 Sca, CD2, CD3, CD4, CD7, CD8, CD10, CD11b, CD14, CD19, CD20, CD31, CD34, CD44, CD45, CD51, CD56, CD73, CD90, CD105, CD146, CD166, CD235a, CD271에 대한 모노클로날 항체(BD Biosciences, USA)와 반응시키고 세척한 후 세포를 Alexa Fluor 488 secondary mouse-IgGs(Invitrogen, 미국)로 반응시키고 세척한 후 유세포분석기(FACStar Plus Flowcytometer, BD Biosciences, USA)를 이용해서 분석하였다. 정상 마우스 IgGs(BD Biosciences, USA)를 음성 대조군으로 사용하였다.

실시예 6.1. in vitro 에서 인간중간엽줄기세포(Human Mesenchymal Stem Cells; hMSCs) 및 hMSSC의 골아세포로의 분화

실시예 2.1 및 2.2의 hMSSC를 골아세포로 분화시키기 위해서, 세포를 골형성분화배지(StemPro® Osteogenesis Differentiation Kit, Life technology, USA) 내 37℃, 5% CO₂의 조건에서 14일 동안 배양하였다. 골생성 관찰을 위해 알칼리 포스페타아제 염색(alkaline phosphatase staining) (Roche, Switzerland) 및 알리자린 레드 S(alizarin red S) (Sigma, USA) 염색을 실시 하였다. hMSC (Lonza, Switzerland)도 상기의 방식으로 동일하게 골아세포로 분화시켜 비교하였다.

실시예 6.2. in vitro 에서 인간중간엽줄기세포(Human Mesenchymal Stem Cells; hMSCs) 및 hMSSC의 지방세포로의 분화

실시예 2.1 및 2.2의 hMSSC를 지방세포로 분화시키기 위해서, 세포를 지방 형성 분화 배지(StemPro®adipogenesis Differentiation Kit, Life technology, USA)내 37℃, 5% CO₂의 조건에서 14일 동안 배양하였다. 지방생성 관찰을 위해 오일 레드 O(oil red O) (Sigma, USA) 염색을 하였다. hMSC (Lonza, Switzerland)도 상기의 방식으로 동일하게 지방세포로 분화시켜 비교하였다.

실시예 6.3. in vitro 에서 인간중간엽줄기세포(Human Mesenchymal Stem Cells; hMSCs) 및 hMSSC의 연골세포로의 분화

실시예 2.1 및 2.2의 hMSSC를 연골세포로 분화시키기 위해서, 세포를 연골형성 배지(StemPro® chondrogenesis Differentiation Kit, Life technology, USA)로 재현탁한 뒤, 다시 원심분리하였다. 마이크로매스(micromass)의 형성을 위하여, 펠렛을 분화 배지에 1 × 10⁵ 생균/㎕로 재현탁하고, 비부착된 96-웰 플레이트의 중앙에 세포 용액 5㎕를 점적하여 접종했다. 고습의 조건 하에서 2시간 동안 마이크로매스를 배양한 후, 배양용기에 데워진 연골형성 배지를 첨가하였으며, 5% CO_2,37℃ 조건의 배양기 내에서 배양하였다. 배양물은 매 3-4일마다 재-공급(re-feeded)되었다. 배양하고 14일 후, 연골생성 펠렛을 알시안 블루(Alcian blue)로 염색 하였다. hMSC (Lonza, Switzerland)도 상기의 방식으로 동일하게 연골세포로 분화시켜 비교하였다.

실시예 7.1. in vitro 에서 hMSSC의 내피세포로의 분화능

실시예 2.1의 hMSSC가 내피세포(endothelial cells, ECs)로 분화하는지 확인하였다. hMSSC를 EC 분화 배지(endothelial growth medium(EGM)-2 (Lonza, Walkersville, MD, USA) 내의 50 ng/ml VEGF(vascular endothelial growth factor: ProSpec, Rehovot, Israel) 및 10 ng/ml bFGF(basic fibroblast growth factor; ProSpec, Rehovot, Israel)로 6 일 동안 배양하여 분화하였다. 세포면역형광염색을 실시하여 분화여부를 확인하였다.

실시예 7.2. in vitro 에서 hMSSC의 골격근 세포로의 분화능

실시예 2.1 및 2.2의 hMSSC가 골격근세포(skeletal muscle cells)로 분화하는지 확인하였다. hMSSC를 matrigel로 coating된 coverslips 위에서 골격근분화배지(2% B27이 함유된 DMEM)로 2주 동안 배양함으로써 분화하였다. 세포면역형광염색을 실시하여 분화여부를 확인하였다.

실시예 8. in vitro 에서 hMSSC의 신경 세포로의 분화 유도

신경 세포로 분화시키기 위해서, 실시예 2.1의 hMSSC를 폴리오르니틴 및 라미닌-코팅된 배양 디쉬에 플레이팅하였다. 2일 후, 배지를 신경 분화 배지(2% B27, 2 mM GlutaMAX 및 항생제를 포함하는 Neurobasal medium)로 교환하였다. 분화 7일차에, 0.5 mM 디부틸 cAMP(Sigma, USA)를 3일 동안 매일 첨가하였다. 대조군으로 이용하기 위하여 H9 hESC로부터 분화된 human neural stem cells (Gibco, USA)을 상기와 동일한 방식으로 신경세포로 분화하였다. 세포면역형광염색을 실시하여 분화여부를 확인하였다.

실시예 9.1. 마우스 신장내에서 hMSSC의 분화능

실시예 2.1의 hMSSC의 마우스 신장내 분화능을 측정하기 위해서, hMSSC를 MSCGM-CD(Lonza, Switzerland) 배지로 2-5 계대 배양하여 단일세포로 수집한 후 hMSSC (2 x 10⁵ cells)를 agarose gel well에서 DMEM+20%FBS로 2일간 배양하여 세포 응집체를 만들어 Balb/c 누드 마우스의 신장내(kidney capsule)에 이식하였다. 이식 4주 후에 조직화학염색과 조직면역형광염색을 실시하였다.

실시예 9.2. 마우스 피하에서 hMSSC의 분화능

실시예 2.1의 hMSSC의 마우스 피하에서 분화능을 측정하기 위해서, hMSSC를 MSCGM-CD(Lonza, Switzerland) 배지로 2-5 계대 배양하여 단일세포로 수집한 후 hMSSC (2 x 10⁵ cells)를 1 μg/ml의 hyaluronic acid (Sigma, USA)가 첨가된 피부린 글루 (greenplast®, 녹십자, 한국)에 탑재하여 Balb/c 누드 마우스의 피하에 이식하였다. 이식 4주 후에 조직화학염색과 조직면역형광염색을 실시하였다.

실시예 10.1. hMSC를 이용한 골형성 시험

대퇴골 골절 모델에서 hMSC의 골형성을 분석하기 위해서, hMSC(Lonza, Switzerland)를 MSCGM-CD(Lonza, Switzerland) 배지로 7 계대 배양하여 단일세포로 수집한 후 l mm x l mm로 절단한 콜라겐 멤브레인(SK bioland, Korea)에 세포를 흡수시켰다. 6주령의 Balb/c- 누드마우스에서 한쪽의 경골을 1 mm 정도 드릴(Bosch professional, Germany)로 구멍을 낸 후 콜라겐 멤브레인이 함유하고 있는 hMSC를 마우스의 골절부위에 삽입하였다. 매 2 주마다 마우스를 마취한 후 골절부위에 대해 Micro-CT(Skyscan 1076, Antwerp, Belgium)를 사용해서 이미지를 얻었다. 6주 후에 조직화학염색과 조직면역형광염색을 실시하였다.

실시예 10.2. hMSSC를 이용한 골형성 시험

대퇴골 골절 모델에서 hMSSC의 골형성을 분석하기 위해서, 실시예 2.1의 hMSSC를 MSCGM-CD(Lonza, Switzerland) 배지로 2-5 계대 배양하여 단일세포로 수집한 후 l mm x l mm로 절단한 콜라겐 멤브레인 (SK bioland, Korea)에 세포를 흡수시켰다. 6주령의 Balb/c- 누드 마우스에서 한쪽의 경골을 1 mm 정도 드릴(Bosch professional, Germany)로 구멍을 낸 후 콜라겐 멤브레인이 함유하고 있는 hMSSC를 마우스의 골절 부위에 삽입하였다. 매2주 마다 마우스를 마취한 후 골절 부위에 대해 Micro-CT(Skyscan 1076, Antwerp, Belgium)를 사용해서 이미지를 얻었다. 6주 후에 조직화학염색과 조직면역형광염색을 실시하였다.

실시예 11. 마이크로 CT(micro CT)

Micro-CT(Skyscan 1076, Antwerp, Belgium)를 사용해서, 실시예 10.1에서 실시한 hMSSC의 신장내 이식부위에 생성된 골 부위를 스캐닝함으로써 3차원의 재구조화된 CT(computed tomography) 이미지를 얻었다. 이후 프레임 그래버를 이용해서 데이터를 디지털화 하였고, 그 결과로 얻은 이미지를 Comprehensive TeX Archive Network (CTAN) topographic reconstruction software를 이용해서 컴퓨터로 옮겼다.

실시예 12. scx, Runx2, MYH9에 대한 mRNA 발현양 측정

실시예 2.1의 hMSSC의 신장내 이식물을 500 μL Trizol (Life Technologies, USA) 을 이용하여 제조자의 프로토콜에 따라 RNA를 추출하였다. hMSSC의 신장내 이식물에 DNAse (RQ1 DNase, Promega,USA)를 처리한 후, 500 ng RNA를 Superscript III RT (Life Technologies, USA) 제1가닥 cDNA 합성 프로토콜에 의해 올리고-d(T) 및 랜덤 헥사머를 이용하여 cDNA로 역전사하였다. qRT-PCR은 StepOne Plus PCR 사이클러 (Applied Biosystems)상에서 Sybr 그린 (Applied Biosystems, Foster City, CA)을 이용하여 수행하였다. mRNA 발현 데이터는 △△CT 방법을 이용하여 분석하였고 유전자 검출을 위하여 글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소효소 (GAPDH)로 정규화하였다. qRT-PCR에 필요한 검증된 primer는 Quagen (USA)에서 구입하였다. 대조군으로 이용하기 위하여 hMSSC도 동일한 방법으로 RNA를 추출하고 qRT-PCR을 실시하였다.

실시예 13. hESC로부터 유래한 hMSSC의 분화 유도 확인

노화 마커

상기 실시예 2에 나타낸 바와 같이 hESC로부터 hMSSC의 분화를 유도하였고, 유도된 hMSSC의 형태적 변화를 관찰한 결과를 도 1a에 나타내었다. 도 1a에 나타낸 바와 같이, 단일 세포화한 미분화된 H9 hESC가 7계대 이내에 섬유아 세포 모양으로 단일한 집단으로 분화함을 확인하였다. 7계대에서 17계대 까지 10계대 이상 유사한 모양으로 성장하다가, 19계대 이후에는 노화마커 β-galactosidase를 염색한 결과 양성반응으로 나타난 것으로 보아 노화가 진행됨을 관찰하였다.

면역형광법을 통한 전분화능 마커 확인

hESC로부터 유도된 후 7계대 이상이 지난 hMSSC에서 전분화능 마커의 발현을 면역형광법에 의해 관찰하고, 관찰 결과를 도 1b에 나타내었다. 비교할 수 있도록 H9 hESC의 전분화능 마커의 발현을 면역형광법으로 확인한 결과를 함께 나타내었다.

도 1b를 보면, H9 hESC는 OCT4, NANOG, SOX2, LIN28 모두에 대해 양성을 나타내어 전분화능이 있음을 확인하였다. 반면, H9 hESC로부터 유도된 hMSSC는 OCT4, NANOG, SOX2 및 LIN28에 대해서는 음성을 나타냄을 확인하였다.

RNA-sequencing을 통한 전분화능 마커, 외배엽, 중배엽, 내배엽 마커 확인

hESC, hMSC 및 7, 17계대의 hMSSC에서 전분화능, 외배엽, 중배엽 및 내배엽 마커들의 발현을 RNA-sequencing을 통해 확인한 결과를 도 1c에 나타내었다. H9 hESC(hESC-1, hESC-2)에서는 TDGF, NANOG, POU5F1, SOX2, DPPA4, LEFTY1 및 GDF3등의 전분화능 마커의 mRNA 발현이 확인되었다. 한편, H9 hESC로부터 유도된 hMSSC에서는 전분화능 마커인 DPPA4 발현은 관찰되었으나, 전분화능 마커 TDGF, NANOG, POU5F1, LEFTY1 및 GDF3의 발현은 관찰되지 않았다. DPPA4 발현은 H9 hESC와 비슷한 수준임을 확인하였다.

DPPA4는 인간중간엽줄기세포에서는 발현되지 않음을 알 수 있다. 또한, hMSSC에서 외배엽 마커인 NES가 양성을 보인 반면, DES와 초기 중배엽 마커인 T 및 Nodal을 제외한 대부분의 중배엽 마커에 양성을 나타내었고, 또한 대부분의 내배엽 마커에 대해 음성을 나타냄을 확인하였다. 특히 NES는 중간엽 줄기세포에서는 발현되지 않았다.

세포표면항원발현을 통한 중간엽 줄기세포 마커 확인

도 1d에 나타낸 바와 같이, hMSSC의 표면 항원 발현을 측정하였다. 중간엽 줄기세포 특이 세포 표면 항원의 발현을 조사한 결과, 중간엽 줄기세포 마커 중 CD44, CD51, CD73, CD105, CD146, CD166은 hMSSC에서 발현되는 반면, 중간엽줄기세포 마커 중 CD90 및 CD271은 hMSSC에서는 발현되지 않음을 확인하였다. 또한, 혈액 계통 세포표면 표지자인 CD2, CD3, CD7, CD8, CD11b, CD14, CD19, CD20, CD31, CD34, CD56은 발현되지 않은 반면 pre-B 세포 마커인 CD10이 발현되어 있었다.

다른 계통세포특이 마커 확인

도 1e에 나타낸 바와 같이, hMSSC의 특성을 조사하기 위해서, 여러 계통의 조직 특이 마커 발현을 분석한 결과, 중배엽 마커인 alpha smooth muscle actin (a-SMA), neuroectoderm marker인 Pax6, myogenic satellite marker인 Pax7 및 intestinal stem cell marker인 LGR5등이 발현되고 있고, chondrocyte marker인 SOX9 및 myoblast marker인 MyoD등은 발현되어 있지 않았다. 이는 hMSSC가 연골세포 및 근육세포까지 분화되기 전 전구세포임을 의미한다.

실시예 14. in vitro 에서 hMSSC의 분화능

hMSC와 실시예 2.1의 hMSSC에 대하여 시험관내 골형성, 연골 형성, 지방 형성을 실험하고(실시예 6) 그 결과를 도 2a에 나타내었다. 도 2a에서는 hMSC가 시험관내에서 골, 연골, 지방으로 분화됨을 확인할 수 있다. 그러나, hMSC에 적용한 것과 동일한 조건의 시험관내 유도환경에서 hMSSC는 골, 연골로는 분화되지만 지방으로는 분화가 거의 되어 있지 않음을 확인하였다. 즉, 중간엽줄기세포와는 기능적으로 차이가 존재함을 확인하였다.

골격근으로의 분화능

상기 실시예 13의 hMSSC가 골격근으로 분화될 수 있는 능력이 있는지를 평가하였다.

hMSSC를 matrigel이 coating된 coverslip위에서 골격근 분화 배지(2% B27이 함유된 DMEM)에서 2주 동안 배양한 다음, 골격근의 마커인 MYH9에 대하여 면역형광법을 수행하였다. 그 결과를 도 2b에 나타내었다. C2C12를 양성 대조군으로 사용하였다. 도 2b에 나타낸 바와 같이, hMSSC를 골격근 분화배지에 배양할 경우 골격근 특이마커인 MYH9이 발현되는 것을 확인함으로서 hMSSC가 골격근으로 분화하는 잠재력이 있음을 확인하였다.

내피세포로의 분화능

상기 실시예 13의 hMSSC가 내피세포로 분화될 수 있는 능력이 있는지를 평가하였다.

hMSSC를 EC 분화 배지(endothelial growth medium (EGM)-2 (Lonza, Walkersville, MD) 내의 50 ng/ml VEGF(vascular endothelial growth factor: ProSpec, Rehovot, Israel) 및 10 ng/ml bFGF(basic fibroblast growth factor; ProSpec)에서 6일 동안 배양한 다음 내피세포 마커인 CD31, VE-cadherin에 대하여 면역형광법을 수행하였다. 그 결과를 도 2c 및 2d에 나타내었다. HUVEC을 내피세포 분화의 양성 대조군으로 사용하였다. 도 2c 및 도 2d에 나타낸 바와 같이, hMSSC에서 CD31, VE-cadherin의 발현이 관찰되지 않았고, 이는 hMSSC가 내피 세포로 분화하는 잠재력이 없음을 의미한다. 반면, 대조군인 HUVEC은 상기 마커를 발현함을 확인하였다.

신경세포로의 분화능

hMSSC를 신경 분화 배지(2% B27, 2 mM GlutaMAX 및 항생제를 포함하는 Neurobasal medium)에서 7일 동안 incubation시키고 그 후 0.5 mM 디부틸 cAMP(Sigma)를 3일 동안 매일 첨가하면서 배양하였다. 그 뒤, 신경 세포로의 분화 마커인 MAP2에 대하여 세포면역형광법을 수행하였고, 그 결과를 도 2e에 나타내었다. NSC(neuronal stem cells)를 신경세포 분화의 양성 대조군으로 사용하였다. 도 2e에 나타낸 바와 같이, NSC는 세포 모양이 신경세포 모양으로 변하고 신경세포 특이 마커인 MAP2가 발현되는 것으로 보아 신경세포로 분화하는 반면 hMSSC의 경우 세포모양에 변화가 없고 MAP2도 발현되지 않는 것으로 보아 신경 세포로 분화하는 잠재력이 없음을 확인하였다.

상기 실시예 13에서 확인한 바와 같이 hMSSC가 외배엽 마커인 NES에 양성을 보였음에도 불구하고, 신경 세포로는 분화되지 않음을 확인하였다. hMSSC는 중배엽, 더욱 구체적으로는 골, 연골, 근육으로 분화할 수 있음을 알 수 있다.

실시예 15. in vivo 에서 hMSSC의 골, 연골, 근육, 지방 및 건으로의 분화 확인

실시예 2와 동일하게 유도된 hMSSC의 분화 가능성을 in vivo에서 측정하기 위해서, hMSSC를 면역결핍 마우스의 신장내(실시예 9.1) 및 피하(실시예 9.2)에 이식하였다. 마우스 신장내에 hMSSC를 이식하고 3-4주 후, 조직을 H&E으로 염색하고, 또한 골, 근육, 지방, 건 또는 인대의 특이 마커에 대한 면역형광염색결과 및 TO-PRO3으로 핵을 대조 염색한 결과를 도 3a 및 도 3b에 나타내었다.

도 3a는 hMSSC를 MSCGM-CD(Lonza, Switzerland) 배지에서 2-5계대 동안 배양하고 신장내에 이식한 후 4주후의 결과를 보여주는데, H&E 염색상에서 신장내에서 전형적인 근육, 지방, 건 또는 인대가 형성되었음을 확인할 수 있었다(도 3a-a). 상기 분화된 근육조직을 확인한 결과 모두 골격근으로 분화가 되었고, 평활근으로는 분화가 되지 않은 것을 확인하였다. 반면 동일한 조건으로 인간 MSC를 이식한 경우 근육, 지방, 건 등이 전혀 형성되지 않았다(data not shown). 이식부위의 면역조직화학 분석 결과, 각 분화조직에서, 근육 마커인 phospho-myosin light chain (pMLC), 지방 마커인 PPARgamma(PPAr), 건 또는 인대 마커인 sleraxis (Scx)등이 양성이고, 이들 모두 인간 세포 마커인 hLA(human leukocyte antigen)에 대해서도 양성임을 확인하였다. 이로써, 이식한 hMSSC가 근육, 지방, 건(또는 인대) 세포로 분화하였음을 알 수 있다(이는 시험관내 시험에서 지방으로 분화되지 않았던 결과와는 상반되었다.) (도 3a-b).

도 3b의 a는, 신장내 hMSSC의 이식부위를 Micro CT로 스캔한 결과인데, 단단한 조직, 즉 골이 형성되었음을 볼 수 있다.

도 3b의 b 및 c는 H&E 염색 및 펜타크롬 염색을 통해 골이 형성되었음을 보여준다. 따라서 이식한 hMSSC가 신장 캡슐 아래에서 골로 모두 분화하였음을 알 수 있다.

도 3b의 d는 이식부위의 면역조직화학 분석 결과를 나타낸다. 조직 내부의 세포에서 인간 세포 마커인 hLA(human leukocyte antigen), 골 마커인 Osx(osterix), Runx2, DMP1, OCN(osteocalin)등이 양성임을 확인하였고 혈관마커인 vWF도 골조직내로 침투하고 있어 전신순환계와 연결되어 있는 골이 형성되어 있음을 알 수 있어, 이식한 hMSSC가 골로 분화하였음을 알 수 있다.

도 3c는 hMSSC를 hyaluronic acid가 첨가된 피브린글루에 탑재하여 마우스의 피하에 이식한 경우 연골세포로 분화된 결과를 나타낸다. H&E 염색 및 톨루이딘 블루 염색을 통해 연골이 형성되었음을 확인하였다

상기 결과를 종합해보면, 본 발명의 hMSSC는 이식 부위에 의존해서 연골, 근육, 건(또는 인대) 및 골로 분화될 수 있으며 분화능이 우수함을 확인하였다.

실시예 16. hMSSC의 골절 회복에 대한 효과 확인

실시예 2와 동일하게 유도된 hMSSC의 골절 회복에 대한 효과를 확인하기 위해서, 상기 실시예 10과 같이 골절 연구를 수행하고 그 결과를 도 4a 내지 도 4b에 나타내었다.

대퇴골 골절 모델에서 골절부위에 hMSC를 이식한 경우 약 6주후에 골절 부위에 골이 형성되었음을 확인하였다. 그러나 골형성 부위가 골마커인 Runx2에 대해 양성이지만 인간세포 마커인 hLA에 대해 음성인 것으로 나와, 골형성이 hMSC에 의한 것이 아니고 마우스 자체내의 세포가 골을 형성한 것으로 평가되었다 (도 4a). 반면 동일한 조건으로 hMSSC를 이식한 경우 약 6주후에 골절 부위에 골이 형성되었고, 골형성 부위가 Runx2에 양성이고 인간세포 마커인 hLA에 대해 양성인 것으로 확인 되었다. 이는 hMSSC의 분화에 의해 골이 형성된 것으로 평가되었다(도 4b).

실시예 17. hiPSC로부터 hMSSC의 분화 유도 및 유도된 hiPSC의 특성 확인

hiPSC(human induced pluripotent stem cells)는 Hasegawa 등(Fusaki et al., 2009)에 의해 개발된 프로토콜에 따라 sendai 바이러스-매개된 OCT4, KLF4, SOX2, 및 MYC의 과발현에 의해서 IMR90 태아 섬유아세포를 리프로그래밍함으로써 제조하였다.

실시예 2와 동일하게 hiPSC로부터 hMSSC를 유도하여 hMSSC(이하 iPS-hMSSC)를 얻었다. iPS-hMSSC에서 전분화능 마커인 Oct4, Nanog, Sox2, 및 Lin28의 발현 수준을 면역형광법 및 RT-PCR에 의해 확인한 결과를 각각 도 5a에 나타내었다.

도 5a에서, iPS 세포는 OCT4, NANOG, SOX2, LIN28 모두에 대해 양성을 나타내어 전분화능이 있음을 확인하였다. 반면, iPS-hMSSC는 전분화능 마커인 OCT4, NANOG, SOX2 및 LIN28에 대해서는 모두 음성을 나타냄을 확인하였다.

도 5b는 iPS-hMSSC에 대하여 표면 항원의 발현을 측정한 결과이다. 중간엽 줄기세포 특이 세포 표면 항원의 발현을 조사한 결과, 중간엽 줄기세포 마커 중 CD44, CD51, CD73, CD105, CD146, CD166은 iPS-hMSSC에서 발현되는 반면, 중간엽줄기세포 마커 중 CD90 및 CD271은 iPS-hMSSC에서는 발현되지 않음을 확인하였다. 또한, 혈액 계통 세포표면 표지자인 CD2, CD3, CD7, CD8, CD14, CD20, CD56은 발현되지 않은 반면 pre-B 세포 마커인 CD10이 발현되어 있었다.

또한, 실시예 14에서와 동일한 방법으로 iPS-hMSSC의 골형성, 연골형성, 지방형성을 평가하였고, 그 결과를 도 5c에 나타내었다. 도 5c에 나타낸 바와 같이, hiPSC로부터 유도된 hMSSC는 시험관내에서 골, 연골로는 분화되지만 지방으로 거의 분화되지 않음을 확인하였다.

또한, iPS-hMSSC를 matrigel이 coating된 coverslip위에서 골격근 분화 배지(2% B27이 함유된 DMEM)로 2주 동안 배양한 다음, 골격근의 마커인 MYH9에 대하여 면역형광법을 수행한 결과를 도 5d에 나타내었다. C2C12를 양성 대조군으로 사용하였다. 도 5d에 나타낸 바와 같이, hiPSC로부터 유도된 hMSSC가 골격근으로 분화하는 잠재력이 있음을 확인하였다.

상기 결과를 종합하면, hiPSC로부터 유도된 hMSSC가 hECS로부터 유도된 hMSSC와 동일한 특성을 가지는 것을 확인할 수 있으며, hECS의 대안으로 hiPSC를 사용하여 hMSSC를 수득할 수 있음을 확인하였다.

실시예 18. in vivo 에서 hiPSC로부터 유도된 hMSSC의 분화능

신장내 이식

마우스 신장내에 상기 실시예 17의 hMSSC를 이식하고 3-4주 후, 조직을 H&E 염색 시, 신장내에서 전형적인 근육, 지방, 건(또는 인대)이 형성됨을 확인할 수 있다. 이식부위의 면역조직화학 분석을 수행하면, 근육 마커인 phospho-myosin light chain (pMLC), 지방 마커인 PPARgamma(PPAr), 건 또는 인대 마커인 sleraxis (Scx)등이 양성이고, 이들 모두 인간 세포 마커인 hLA(human leukocyte antigen)에 대해서도 양성임을 확인할 수 있다. 또한, 골 마커인 Osx(osterix), Runx2, DMP1, OCN(osteocalin)등이 양성임을 확인할 수 있다. 상기 방법을 통하여, iPSC로부터 유도된 hMSSC가 근육, 지방, 건(또는 인대) 및 골로 분화될 수 있음을 확인할 수 있다

피하 이식

상기 실시예 17의 hMSSC를 hyaluronic acid가 첨가된 피브린글루에 탑재하여 마우스의 피하에 이식한 후, H&E 염색 및 톨루이딘 블루 염색을 통해 상기 hMSSC가 연골로 분화될 수 있음을 확인할 수 있다.

실시예 19. noggin이 들어간 MSSC 배지와 Conditioned Media가 들어간 CM 배지의 분화능 비교

상기 실시예 2의 MSSC 배지의 7가지 구성요소 중 구성요소 1)의 인간 noggin(Life technology) 대신에 Conditioned Media(완전배지에서 DMEM/F12를 Knockout DMEM로 치환한 배지(20% Knockout Serum Replacement (Invitrogen, USA), 1 mM glutamine, 1% 비필수 아미노산 (Invitrogen, USA), 0.1 mM β-메르캅토에탄올, 0.1%페니실린-스트렙토마이신, 5 mg/ml bovine serum albumin으로 보충된 Knockout DMEM)를 이용하여 CF1 세포를 24시간 배양하고 난 후 취득한 배양 상청액)를 추가한 배지(나머지 구성요소 2)-7)는 같음)(이하 “CM 배지”라 함)를 이용하여, MSSC 배지와 CM 배지의 분화능을 비교하였다.

이 경우 noggin은 일반적으로 hESC 배양시 이의 특성을 유지하는 용도로 사용이 되는데(Chaturvedi G, Simone PD, Ain R, Soares MJ, Wolfe MW. Noggin maintains pluripotency of human embryonic stem cells grown on Matrigel. Cell Prolif. 2009 Aug;42(4):425-33), 기존에 알려진 기전과 반대로 중배엽으로의 경향성을 크게 증가시켰으며, 하기 표 1에서 볼 수 있는 바와 같이 CM 배지를 이용한 경우와 비교하여 noggin을 이용한 경우 골분화의 경향성을 10배 이상 증가시켰다.

MSSC 배지 vs. CM 배지의 분화 경향성 비교 (20회 중 분화가 발견된 회수)

유도배지	골	근육	건	지방
CM 배지	1/20	20/20	2/20	2/20
Noggin 함유배지	15/20	20/20	10/20	12/20

또한, 각각의 배지를 사용한 경우의 CD44 발현량을 비교하였다. CM 함유배지(CM 배지)와 noggin 함유배지(MSSC 배지)로 분화유도 후 CD44의 발현양을 실시예 6에서 같은 방식으로 측정하였다. 실험결과 CM 배지를 사용한 경우와 비교하여 noggin을 함유한 MSSC 배지를 사용하는 경우 CD44의 발현량이 큰 폭으로 증가되는 것을 확인하였다(도 6).

골분화시 반드시 chondrogenesis 일어난 후 endochondral bone 형태로 골형성이 진행되는 데 CD44는 chondrogenesis 매우 필수적인 역할을 하는 것으로 알려져 있다(Wu SC, Chen CH, Chang JK, Fu YC, Wang CK, Eswaramoorthy R, Lin YS, Wang YH, Lin SY, Wang GJ, Ho ML: Hyaluronan initiates chondrogenesis mainly via cd44 in human adipose-derived stem cells. J Appl Physiol (1985) 2013;114:1610-1618). 상기 결과를 종합하여 볼 때, CM 배지를 사용하는 것보다 MSSC 배지를 사용하는 것이 골분화와 관련하여 적합함을 알 수 있다.

hMSSC를 신장내 이식하였을 경우 hMMSC 배지에 의해 분화된 세포는 CM 배지에 의해 분화된 세포와 비교하여, 분화속도가 1-2주 빨라짐을 확인 하였다. CM 배지를 이용한 경우와 hMMSC 배지를 이용한 경우의 분화속도의 차이는 아래의 표 2와 같다.

MSSC 배지 vs. CM 배지의 분화 속도 비교 (이식되기 전 hMSSC에 대한 mRNA 양을 기준으로 그에 대한 증가율)

mRNA week		1주	2주	3주	4주
MYH9	CM	1.3 ± 0.1	2.1 ± 0.1	5.1 ± 0.3	12.5 ± 3.1
MYH9	MSSC	2.2 ± 0.3	4.4 ± 0.4	20.1 ± 3.1	23.1 ± 3.4
Runx2	CM	1.2 ± 0.3	1.8 ± 0.3	3.6 ± 0.3	6.5 ±3.1
Runx2	MSSC	2.1 ± 0.2	4.3 ± 0.3	7.1 ± 0.3	13.3 ± 3.1
scx	CM	1.3 ± 0.2	2.3 ± 1.2	5.2 ± 1.3	10.7 ± 2.2
scx	MSSC	2.1 ± 0.2	4.7 ± 1.5	12.1 ± 0.3	16.5 ± 2.9

실시예 20. MSSC 배지의 구성요소 간 조합에 의한 상승효과 비교

이번에는 상기 실시예 2의 MSSC 배지의 구성요소 중 1) 내지 6)의 성분 중 1가지씩을 포함하지 않을 경우의 분화능을, 모두 포함한 경우와 비교하였다. 실험결과, 상기 1) 내지 6)의 성분 중 어느 하나의 구성요소를 결핍할 경우 연골(Alcian blue)이나 골(ALP 및 Alizarin red S)로의 분화가 제대로 이루어지지 않음을 확인하였다(도 7, 표 3).

MSSC 배지 vs. 1가지 구성요소를 결핍한 배지의 분화능 비교

MSSC 배지의 구성요소	6 Factor	TGF-β/엑티빈/노달 신호억제제(-)	hLIF(-)	ERK 신호 억제제(-)	Wnt 신호 활성화제(-)	Noggin(-)	FGF-2 신호전달 활성화제(-)
1) noggin	○	○	○	○	○	×	○
2) LIF	○	○	×	○	○	○	○
3) FGF-2 신호전달 활성화제	○	○	○	○	○	○	×
4) Wnt 신호 활성화제	○	○	○	○	×	○	○
5) ERK 신호 억제제	○	○	○	×	○	○	○
6) TGF-β/엑티빈/노달 신호억제제	○	×	○	○	○	○	○
비고	근육(지방조직포함), 연골 및 골분화가 제대로 이루어짐	근육,연골분화가 이루어지지 않음	연골분화가 이루어지지 않음	연골 및 골분화가 저해됨	골분화가 저해됨	MSSC 유도 자체가 되지 않음	MSSC 유도 자체가 되지 않음

실시예 21. in vivo 에서 hMSSC의 근육, 인대, 연골 및 골로의 선택 분화 유도

hMSSC의 선택적 분화 가능성을 측정하기 위해서, hMSSC를 connective tissue growth factor, Transforming growth factor, insulin, fibroblast growth factor등 여러 growth factor로 전처리 한 후 세포응집체(4 x 10⁵)를 만들거나 또는 세포 담체와 섞어서 Balb/c 누드 마우스의 신장내(kidney capsule) 또는 피하에 이식하였다. 이식 3-6 주 후, 이식한 세포를 제거하고 조직을 분석하였다.

실시예 22. hMSSC의 근육으로의 분화 유도 확인

실시예 2와 동일하게 유도된 hMSSC가 근육으로의 선택적인 분화 가능성을 in vivo에서 측정하기 위해서, hMSSC를 heparin이 첨가된 fibrin glue와 섞은 후 면역결핍 마우스의 피하에 이식하였다. 상기 부위에 hMSSC를 이식하고 7주 후, 조직을 H&E으로 염색하고 또한 인간세포 핵 마커와 결합하는 STEM101항체 (Takara, Japan)로 염색하여 분화된 조직이 hMSSC에서 유래된 것인지를 확인하였고 근육 마커인 MyoD에 대한 항체(Thermo Fisher Scientic Inc, 미국)를 이용하여 형광 염색함으로써 분화된 조직이 근육세포임을 확인하였다. 핵은 DAPI로 대조 염색하였다. 그 염색한 결과를 도 8에 나타내었다. 도 8에 나타낸 바와 같이 hMSSC는 근육으로만 분화됨을 확인하였다.

실시예 23. hMSSC의 건 또는 인대로의 분화 유도 확인

실시예 2와 동일하게 유도된 hMSSC의 건 또는 인대로의 선택적인 분화 가능성을 in vivo에서 측정하기 위해서, hMSSC를 hMSSC를 MSCGM-CD(Lonza, 스위스) 배지 상에서 50 ng/ml connective tissue growth factor와 25 ㎍/ml ascorbic acid로 2일간 전처리한 후 전처리 세포(1 x 10⁶ cells)를 matrigel (BD sciences, 미국) 100 ㎕와 섞어 면역결핍 마우스의 피하에 이식하였다. 상기 부위에 hMSSC를 이식하고 5주 후, H&E로 조직염색하고 또한 인간세포 핵 마커와 결합하는 hLA에 대한 항체(Abcam, 영국)로 염색하여 분화된 조직이 hMSSC에서 유래된 것인지를 확인하였고, 건 또는 인대 마커인 scx에 대한 항체(Antibodies-online, 미국)를 이용하여 형광 염색함으로써 분화된 조직이 건 또는 인대임을 확인하였다. 그 염색한 결과를 도 9에 나타내었다. 도 9에 나타낸 바와 같이 hMSSC는 건 또는 인대로만 분화됨을 확인하였다.

실시예 24. hMSSC의 골(bone)로의 분화 유도 확인

실시예 2와 동일하게 유도된 hMSSC의 골로의 선택적인 분화 가능성을 in vivo에서 측정하기 위해서, hMSSC를 10% knockout serum replacement(Invitrogen, 미국), 1% N2 supplement(Gibco, 미국), 2% B27 supplements(Gibco, 미국), 43% DMEM/F12(Gibco, 미국), 43% Neurobasal(Gibco, 미국)로 구성된 배지 상에서 5 ㎍/ml insulin, 25 ㎍/ml ascorbic acid, 1 ㎍/ml hyaluronic acid를 2일간 전처리하고 세포응집체를 만든 후 면역결핍 마우스의 신장내에 이식하였다. 상기 부위에 hMSSC를 이식하고 5주 후, 조직을 H&E으로 염색하고 또한 연골 및 골 특이 마커인 collage II (col2)와 osterix (osx)에 대한 면역형광염색결과 및 DAPI로 핵을 대조 염색한 결과를 도 10에 나타내었다. 도 10에 나타낸 바와 같이 hMSSC는 연골내 골화 과정을 거친 골로만 분화됨을 확인하였다.

실시예 25. hMSSC의 치아로의 분화 유도 확인

실시예 2와 동일하게 유도된 hMSSC의 치아로의 선택적인 분화 가능성을 in vivo에서 측정하기 위해서, hMSSC의 세포응집체를 만든 후 mouse dental epithelial cell로 코팅한 후 면역결핍 마우스의 신장내에 이식하였다. 상기 부위에 hMSSC를 이식하고 6주 후, 조직을 H&E으로 염색하고 또한 인간세포 특이 마커인 hLA에 대한 면역형광염색결과 및 To-PRO-3로 핵을 대조 염색한 결과를 도 11에 나타내었다. 도 11에 나타낸 바와 같이 hMSSC는 치아로만 분화됨을 확인하였다. 도 11a에서 K는 신장조직, T는 치아조직 B는 뼈조직을 나타낸다. 도 11b는 도 11a에서 T를 microCT로 찍은 사진이다. 도 11c는 H&E 조직염색사진이고 도 11d는 인간백혈구 항원 (hLA)에 대한 항체로 염색한 형광사진이다. To-PRO-3는 핵을 대조염색한 것이다.

실시예 25. hMSSC의 인대손상에 대한 치료효과

실시예 2와 동일하게 유도된 hMSSC의 손상된 인대의 치료 가능성을 in vivo에서 측정하기 위해서, 면역결핍마우스 등에 있는 흉요추 인대를 진행방향 직각으로 잘라 손상시킨 후 hMSSC (2x10⁶ cells)를 fibrin glue 10 ㎕와 섞어 만든 세포응집체를 손상부위에 이식하였다. 상기 부위에 hMSSC를 이식하고 6주 후, 조직을 H&E으로 염색하고 또한 인간세포 특이 마커인 hLA 및 건 또는 인대 특이 마커인 scx에 대한 면역형광염색을 실시한 결과를 도 12에 나타내었다. To-PRO-3로 핵을 대조 염색하였다. 도 12에 나타낸 바와 같이 hMSSC는 분화되어 결절된 인대를 연결하였음을 확인하였다.

실시예 26. hMSSC의 관절염에 대한 치료효과

실시예 2와 동일하게 유도된 hMSSC의 손상된 연골의 치료 가능성을 in vivo에서 측정하기 위해서, 10주령의 C57BL/6 마우스의 좌측 관절에 내측 반월상 연골 불안정화 (DMM, Destabilization of medial meniscus)수술을 하고 4주 내지 6주 후에 hMSSC (3x10⁵)를 관절강 내에 주사하였다. 그룹은 가짜대조군 (Sham), DMM 그리고 cell을 녹여 spin-down 후 PBS에 resuspension 해서 Injection한 그룹 (hMSSC-PBS)과 Freezing solution에 들어있는 것을 바로 Injection한 그룹 (hMSSC-Sol)으로 나누었다. 8주차에 Sampling하여 Fixation하고 4주 동안 10% EDTA용액에서 Decalcification 후 Section(5μm)하여 Safranin O로 염색하였다. 관절염 정도 평가는 국제골관절염학회 (OARSI)에서 제시한 방법으로 시행하였다. 도 13에 나타낸 바와 같이 Sham 그룹에 비해 DMM 그룹에서 관절염 지수 (OA score)가 증가한 것으로 보아 골관절염 유도는 잘 되었다. hMSSC 주입한 그룹에서 관절염 중증도가 절반 이상으로 낮아졌으며 PBS와 Sol 그룹 간의 차이는 보이지 않았다. 4주에 비해 6주에 hMSSC 주입 시 관절염 중증도가 낮아지는 경향은 보이나 통계적인 차이는 없었다. 이는 hMSSC를 동결건조한 후 보관하다가 필요시 해동하여 바로 투여하여도 효과가 있음을 확인하였다(도 13).

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

한국세포주연구재단

KCLRFBP00460

20181010

Claims

골, 치아, 연골, 건, 인대, 근육 및 지방으로 분화될 수 있는 근골격계 줄기세포(MSSC, musculoskeletal stem cell)로부터 근육으로만 선택적으로 분화를 유도하기 위한 분화 유도용 배지 조성물로서, 상기 배지 조성물은 헤파린(heparin)을 포함하며, 상기 근골격계 줄기세포는 하기의 특징을 갖는 것을 특징으로 하는 배지 조성물:
a) 외배엽 마커인 네스틴(Nestin, NES)에 대해 양성;
b) 근원성 위성 마커(myogenic satellite marker)인 Pax7에 대해 양성;
c) 중배엽 마커인 α-SMA에 대해 양성; 및
d) 전분화능 마커인 LIN28에 대해 음성.
제 1 항의 분화 유도용 배지 조성물 및 근골격계 줄기세포(MSSC, musculoskeletal stem cell)를 유효성분으로 포함하는, 근골격계 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
골, 치아, 연골, 건, 인대, 근육 및 지방으로 분화될 수 있는 근골격계 줄기세포(MSSC, musculoskeletal stem cell)에 시험관내(in-vitro)에서 헤파린(heparin)을 처리하는 단계를 포함하는 근골격계 줄기세포로부터 근육으로만 선택적 분화를 유도하는 방법으로서, 상기 근골격계 줄기세포는 하기의 특징을 갖는 것을 특징으로 하는 방법:
a) 외배엽 마커인 네스틴(Nestin, NES)에 대해 양성;
b) 근원성 위성 마커(myogenic satellite marker)인 Pax7에 대해 양성;
c) 중배엽 마커인 α-SMA에 대해 양성; 및
d) 전분화능 마커인 LIN28에 대해 음성.
골, 치아, 연골, 건, 인대, 근육 및 지방으로 분화될 수 있는 근골격계 줄기세포(MSSC, musculoskeletal stem cell)로부터 건 또는 인대로만 선택적으로 분화를 유도하기 위한 분화 유도용 배지 조성물로서, 상기 배지 조성물은 CTGF(connective tissue growth factor) 및 아스코브산(ascorbic acid)을 포함하며, 상기 근골격계 줄기세포는 하기의 특징을 갖는 것을 특징으로 하는 배지 조성물:
a) 외배엽 마커인 네스틴(Nestin, NES)에 대해 양성;
b) 근원성 위성 마커(myogenic satellite marker)인 Pax7에 대해 양성;
c) 중배엽 마커인 α-SMA에 대해 양성; 및
d) 전분화능 마커인 LIN28에 대해 음성.
제 4 항의 분화 유도용 배지 조성물로 전처리한 근골격계 줄기세포(MSSC, musculoskeletal stem cell)를 유효성분으로 포함하는, 근골격계 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
골, 치아, 연골, 건, 인대, 근육 및 지방으로 분화될 수 있는 근골격계 줄기세포(MSSC, musculoskeletal stem cell)에 시험관내(in-vitro)에서 CTGF(connective tissue growth factor) 및 아스코브산(ascorbic acid)을 처리하는 단계를 포함하는 근골격계 줄기세포로부터 건 또는 인대로만 선택적으로 분화를 유도하는 방법으로서, 상기 근골격계 줄기세포는 하기의 특징을 갖는 것을 특징으로 하는 방법:
a) 외배엽 마커인 네스틴(Nestin, NES)에 대해 양성;
b) 근원성 위성 마커(myogenic satellite marker)인 Pax7에 대해 양성;
c) 중배엽 마커인 α-SMA에 대해 양성; 및
d) 전분화능 마커인 LIN28에 대해 음성.
골, 치아, 연골, 건, 인대, 근육 및 지방으로 분화될 수 있는 근골격계 줄기세포(MSSC, musculoskeletal stem cell)로부터 골로만 선택적으로 분화를 유도하기 위한 분화 유도용 배지 조성물로서, 상기 배지 조성물은 인슐린(insulin), 히알루론산(hyaluronic acid) 및 아스코브산(ascorbic acid)을 포함하며, 상기 근골격계 줄기세포는 하기의 특징을 갖는 것을 특징으로 하는 배지 조성물:
a) 외배엽 마커인 네스틴(Nestin, NES)에 대해 양성;
b) 근원성 위성 마커(myogenic satellite marker)인 Pax7에 대해 양성;
c) 중배엽 마커인 α-SMA에 대해 양성; 및
d) 전분화능 마커인 LIN28에 대해 음성.
제 7 항의 분화 유도용 배지 조성물로 전처리한 근골격계 줄기세포(MSSC, musculoskeletal stem cell)를 유효성분으로 포함하는, 근골격계 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
골, 치아, 연골, 건, 인대, 근육 및 지방으로 분화될 수 있는 근골격계 줄기세포(MSSC, musculoskeletal stem cell)에 시험관내(in-vitro)에서 인슐린(insulin), 히알루론산(hyaluronic acid) 및 아스코브산(ascorbic acid)을 처리하는 단계를 포함하는 근골격계 줄기세포로부터 골로만 선택적으로 분화를 유도하는 방법으로서, 상기 근골격계 줄기세포는 하기의 특징을 갖는 것을 특징으로 하는 방법:
a) 외배엽 마커인 네스틴(Nestin, NES)에 대해 양성;
b) 근원성 위성 마커(myogenic satellite marker)인 Pax7에 대해 양성;
c) 중배엽 마커인 α-SMA에 대해 양성; 및
d) 전분화능 마커인 LIN28에 대해 음성.
골, 치아, 연골, 건, 인대, 근육 및 지방으로 분화될 수 있는 근골격계 줄기세포(MSSC, musculoskeletal stem cell)로부터 치아로만 선택적으로 분화를 유도하기 위한 분화 유도용 배지 조성물로서, 상기 배지 조성물은 치아 상피세포(dental epithelial cell)를 포함하는 것을 특징으로 하며, 상기 근골격계 줄기세포는 하기의 특징을 갖는 것을 특징으로 하는 배지 조성물:
a) 외배엽 마커인 네스틴(Nestin, NES)에 대해 양성;
b) 근원성 위성 마커(myogenic satellite marker)인 Pax7에 대해 양성;
c) 중배엽 마커인 α-SMA에 대해 양성; 및
d) 전분화능 마커인 LIN28에 대해 음성.
골, 치아, 연골, 건, 인대, 근육 및 지방으로 분화될 수 있는 근골격계 줄기세포(MSSC, musculoskeletal stem cell)에 시험관내(in-vitro)에서 치아 상피세포(dental epithelial cell)를 코팅하는 단계를 포함하는 근골격계 줄기세포로부터 치아로만 선택적으로 분화를 유도하는 방법으로서, 상기 근골격계 줄기세포는 하기의 특징을 갖는 것을 특징으로 하는 방법:
a) 외배엽 마커인 네스틴(Nestin, NES)에 대해 양성;
b) 근원성 위성 마커(myogenic satellite marker)인 Pax7에 대해 양성;
c) 중배엽 마커인 α-SMA에 대해 양성; 및
d) 전분화능 마커인 LIN28에 대해 음성.
제 1 항에 있어서, 상기 근골격계 줄기세포는 하기의 특징을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 배지 조성물:
e) 중간엽줄기세포 마커인 CD90에 대해 음성;
f) 중간엽 줄기세포 마커인 CD271에 대해 음성;
g) 전분화능 마커인 DPPA4에 대해 양성;
h) 중배엽 마커인 T 및 노달(Nodal)에 대해 음성;
i) 신경외배엽(neuroectoderm) 마커인 Pax6에 대해 양성;
j) 장 줄기세포(intestinal stem cell) 마커인 LGR5에 대해 양성;
k) 연골세포(chondrocyte) 마커인 SOX9에 대해 음성; 또는
l) 근육세포(myoblast) 마커인 MyoD에 대해 음성.
제 4 항에 있어서, 상기 근골격계 줄기세포는 하기의 특징을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 배지 조성물:
e) 중간엽줄기세포 마커인 CD90에 대해 음성;
f) 중간엽 줄기세포 마커인 CD271에 대해 음성;
g) 전분화능 마커인 DPPA4에 대해 양성;
h) 중배엽 마커인 T 및 노달(Nodal)에 대해 음성;
i) 신경외배엽(neuroectoderm) 마커인 Pax6에 대해 양성;
j) 장 줄기세포(intestinal stem cell) 마커인 LGR5에 대해 양성;
k) 연골세포(chondrocyte) 마커인 SOX9에 대해 음성; 또는
l) 근육세포(myoblast) 마커인 MyoD에 대해 음성.
제 7 항에 있어서, 상기 근골격계 줄기세포는 하기의 특징을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 배지 조성물:
e) 중간엽줄기세포 마커인 CD90에 대해 음성;
f) 중간엽 줄기세포 마커인 CD271에 대해 음성;
g) 전분화능 마커인 DPPA4에 대해 양성;
h) 중배엽 마커인 T 및 노달(Nodal)에 대해 음성;
i) 신경외배엽(neuroectoderm) 마커인 Pax6에 대해 양성;
j) 장 줄기세포(intestinal stem cell) 마커인 LGR5에 대해 양성;
k) 연골세포(chondrocyte) 마커인 SOX9에 대해 음성; 또는
l) 근육세포(myoblast) 마커인 MyoD에 대해 음성.
제 10 항에 있어서, 상기 근골격계 줄기세포는 하기의 특징을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 배지 조성물:
e) 중간엽줄기세포 마커인 CD90에 대해 음성;
f) 중간엽 줄기세포 마커인 CD271에 대해 음성;
g) 전분화능 마커인 DPPA4에 대해 양성;
h) 중배엽 마커인 T 및 노달(Nodal)에 대해 음성;
i) 신경외배엽(neuroectoderm) 마커인 Pax6에 대해 양성;
j) 장 줄기세포(intestinal stem cell) 마커인 LGR5에 대해 양성;
k) 연골세포(chondrocyte) 마커인 SOX9에 대해 음성; 또는
l) 근육세포(myoblast) 마커인 MyoD에 대해 음성.