JP2021502091A - 幹細胞からの成長ホルモン産生細胞の誘導およびその使用 - Google Patents

幹細胞からの成長ホルモン産生細胞の誘導およびその使用 Download PDF

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Abstract

本開示の主題は、幹細胞(例えば、ヒト幹細胞)の成長ホルモン産生細胞への分化を誘導するin vitro方法、およびこのような方法によって生成される分化細胞を提供する。本開示の主題は、成長ホルモン欠損症を処置するためのこのような細胞の使用も提供する。本開示は、下垂体前駆体の分化を誘導するためのin vitro方法を提供する。例えば、本開示は、下垂体前駆体の、分化細胞の細胞集団への分化を誘導するためのin vitro方法であって、分化細胞の少なくとも約50%が、成長ホルモンを産生することが可能である成長ホルモン産生細胞(「GH産生成長ホルモン産生細胞」と称される)である、方法を提供する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、その内容がその全体として参照により組み込まれ、それに対して優先権が主張される、2017年11月10日に出願された米国仮出願第62/584,299号の優先権を主張する。
特許付与情報
本発明は、国立衛生研究所(National Institutes of Health)からの助成金番号NCI−1−R21−CA176700のもとで政府の支援によってなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
1.導入
本開示の主題は、幹細胞(例えば、ヒト幹細胞)から生じる成長ホルモン産生細胞、ならびに成長ホルモン(GH)欠損症における細胞ベースの処置および創薬のためのその使用に関する。
2.発明の背景
成長ホルモン(GH)は、脳下垂体前葉において産生され、特に、小児において重大な作用を有する。成長および代謝に対するGHの作用は、直接的なGH作用とインスリン様成長因子1および2(IGF−1およびIGF−2)産生の刺激を介する間接的な作用とによって媒介される。主な標的組織は、骨、脂肪および筋肉である。GHレベルが低いと、骨塩密度、筋肉強度の低下、およびコレステロールの増加がもたらされる。小児では、小人症をもたらす。
成長ホルモン欠損症として、先天性成長ホルモン欠損症および後天性成長ホルモン欠損症が挙げられる。先天性成長ホルモン欠損症は、成長ホルモンの発達に関与する遺伝子の変異に起因する。後天性成長ホルモン欠損症は、視床下部−下垂体領域における腫瘍、外科手術、傷害などによって誘導され得る。先天性成長ホルモン欠損症は、2つのカテゴリーに分けることができる:複合下垂体ホルモン欠損症(CPHD)型と成長ホルモン単独欠損症(IGHD)型。CPHDを引き起こし得る遺伝子変異として、POU1F1変異(CPHD1)、PROP−1変異(CPHD2;最も一般的、12〜55%)、LHX3変異(CPHD3)、およびLHX4変異(CPHD4)が挙げられる。IGHD型を引き起こし得る遺伝子変異として、GH1変異(IAおよびII型)、GH1または成長ホルモン放出ホルモン受容体(GHRHR)変異(IB型)、およびブルトンチロシンキナーゼ(BTK)変異(III型)が挙げられる。成長障害について多くの単一遺伝子の原因が同定されているが、IGHD/CPHDを有する患者のほとんどは、比較的低い変異検出率によって示されるように、病因不明のままである。さらに、成長ホルモンおよび他の下垂体ホルモンの後天性病因は複数であり、多数の患者に影響を及ぼす。
成長ホルモン欠損症に対する再生手法の役割は、状態の蔓延(100,000人当たり45.5人)および多数の患者が下垂体ホルモンの補充を必要とするにもかかわらず、ほとんど注目されてこなかった。成長ホルモン欠損症に関する現在の処置方法として、一生続くホルモン補充療法が挙げられ、これは最適以下の解決策であり、その理由は、これらの分子の静的送達が、概日パターン、フィードバック機構またはストレスの多い状況に応答するホルモンの動的分泌などの正常な下垂体の特徴に対する代わりにほとんどならないためである。処置は、成長ホルモンの補充のみのコストが1年当たり50,000ドルを超え、法外に高価であり得る。よって、成長ホルモン欠損症に対する新たな療法に対する必要性が存在する。
3.発明の概要
本開示の主題は、例えば、in vitroでの分化によって、幹細胞(例えば、ヒト幹細胞)から生じる成長ホルモン産生細胞(例えば、GH産生成長ホルモン産生細胞)に関する。
ある特定の実施形態では、幹細胞の、GH産生成長ホルモン産生細胞への分化は、3つの段階:(a)幹細胞の、下垂体前駆細胞(「下垂体前駆体」とも称される)へのin vitroでの分化、(b)下垂体前駆細胞の、Pit1を発現する細胞(Pit1細胞)へのin vitroでの分化;および(c)Pit1細胞の、GH産生成長ホルモン産生細胞へのin vitroでの分化を含む。
本開示は、下垂体前駆体の分化を誘導するためのin vitro方法を提供する。例えば、本開示は、下垂体前駆体の、分化細胞の細胞集団への分化を誘導するためのin vitro方法であって、分化細胞の少なくとも約50%が、成長ホルモンを産生することが可能である成長ホルモン産生細胞(「GH産生成長ホルモン産生細胞」と称される)である、方法を提供する。ある特定の実施形態では、方法は、1つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する細胞を、1つまたは複数の背方化剤(dorsalizing agent)および1つまたは複数の腹方化剤(ventralizing agent)と接触させるステップと;細胞を、Wingless(Wnt)シグナル伝達の1つまたは複数の活性化剤(「Wnt活性化剤」と称される)および成長ホルモン(GH)の発現を誘導することが可能である1つまたは複数の分子(「GH誘導剤」と称される)と接触させて、分化細胞の細胞集団を得るステップであって、分化細胞のうちの少なくとも約50%は、GH産生成長ホルモン産生細胞であるステップとを含む。
ある特定の実施形態では、GH産生成長ホルモン産生細胞は、低レベルのGHRHR免疫反応性を発現する細胞(GHRHRlow細胞)、高レベルのGHRHR免疫反応性を発現する細胞(GHRHRhigh細胞)、およびその組合せを含む。
ある特定の実施形態では、方法は、1つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する細胞の、1つまたは複数の背方化剤との最初の接触から少なくとも約10日で、少なくとも約50%のGHRHRlow細胞を含む細胞集団を得るステップを含む。ある特定の実施形態では、方法は、1つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する細胞の、1つまたは複数の背方化剤との最初の接触から約2週間または3週間で、少なくとも約50%のGHRHRlow細胞を含む細胞集団を得るステップを含む。ある特定の実施形態では、1つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する細胞の、1つまたは複数の背方化剤との最初の接触から約15日で、少なくとも約50%のGHRHRlow細胞を含む細胞集団を得るステップを含む。
ある特定の実施形態では、方法は、1つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する細胞の、1つまたは複数の背方化剤との最初の接触から少なくとも約10日で、少なくとも約50%のGHRHRhigh細胞を含む細胞集団を得るステップを含む。ある特定の実施形態では、方法は、1つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する細胞の、1つまたは複数の背方化剤との最初の接触から約3週間で、少なくとも約50%のGHRHRhigh細胞を含む細胞集団を得るステップを含む。ある特定の実施形態では、方法は、1つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する細胞の、1つまたは複数の背方化剤との最初の接触から約25日で、少なくとも約50%のGHRHRhigh細胞を含む細胞集団を得るステップを含む。ある特定の実施形態では、方法は、1つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する細胞の、1つまたは複数の背方化剤との最初の接触から約35日で、少なくとも約50%のGHRHRhigh細胞を含む細胞集団を得るステップを含む。
さらに、本開示は、下垂体前駆体の、分化細胞の細胞集団への分化を誘導するためのin vitro方法であって、分化細胞の少なくとも約50%が、Pit1を発現する、方法を提供する。ある特定の実施形態では、方法は、1つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する細胞を、1つまたは複数の背方化剤および1つまたは複数の腹方化剤と接触させるステップと;細胞をWntシグナル伝達の1つまたは複数の活性化剤と接触させて、分化細胞の細胞集団を得るステップであって、分化細胞の少なくとも約50%は、Pit1を発現するステップとを含む。ある特定の実施形態では、方法は、1つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する細胞の、1つまたは複数の背方化剤との最初の接触から少なくとも約5日で、細胞集団を得るステップを含む。ある特定の実施形態では、方法は、1つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する細胞の、1つまたは複数の背方化剤との最初の接触から約7日または約11日で、細胞集団を得るステップを含む。
さらに、本開示は、幹細胞の分化を誘導するためのin vitro方法を提供する。例えば、本開示は、幹細胞の、分化細胞の細胞集団への分化を誘導するためのin vitro方法であって、分化細胞の少なくとも約50%が、GH産生成長ホルモン産生細胞である、方法を提供する。ある特定の実施形態では、方法は、幹細胞を、1つまたは複数のBMP分子およびTGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤と接触させるステップ;細胞を、SHHシグナル伝達の1つまたは複数の活性化剤(「SHH活性化剤」と称される)、FGFシグナル伝達の1つまたは複数の活性化剤(「FGF活性化剤」と称される)、1つまたは複数の背方化剤、1つまたは複数の腹方化剤、1つまたは複数のWnt活性化剤および1つまたは複数のGH誘導剤と接触させて、分化細胞の細胞集団を得るステップであって、分化細胞の少なくとも約50%は、GH産生成長ホルモン産生細胞であるステップを含む。
ある特定の実施形態では、GH産生成長ホルモン産生細胞は、低レベルのGHRHR免疫反応性を発現する細胞(GHRHRlow細胞)、高レベルのGHRHR免疫反応性を発現する細胞(GHRHRhigh細胞)、およびその組合せを含む。ある特定の実施形態では、方法は、幹細胞の、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤との最初の接触から少なくとも約3週間で、少なくとも約50%のGHRHRlow細胞を含む細胞集団を得るステップを含む。ある特定の実施形態では、方法は、幹細胞の、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤との最初の接触から約24日で、少なくとも約50%のGHRHRlow細胞を含む細胞集団を得るステップを含む。ある特定の実施形態では、方法は、幹細胞の、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤との最初の接触から約4週間で、少なくとも約50%のGHRHRlow細胞を含む細胞集団を得るステップを含む。
ある特定の実施形態では、方法は、幹細胞の、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤との最初の接触から少なくとも約4週間で、少なくとも約50%のGHRHRhigh細胞を含む細胞集団を得るステップを含む。ある特定の実施形態では、方法は、幹細胞の、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤との最初の接触から約6週間で、少なくとも約50%のGHRHRhigh細胞を含む細胞集団を得るステップを含む。ある特定の実施形態では、方法は、幹細胞の、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤との最初の接触から約30日で、少なくとも約50%のGHRHRhigh細胞を含む細胞集団を得るステップを含む。ある特定の実施形態では、方法は、幹細胞の、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤との最初の接触から33日で、少なくとも約50%のGHRHRhigh細胞を含む細胞集団を得るステップを含む。
さらに、本開示は、幹細胞の、分化細胞の細胞集団への分化を誘導するためのin vitro方法であって、分化細胞の少なくとも約50%が、Pit1を発現する、方法を提供する。ある特定の実施形態では、方法は、幹細胞を、1つまたは複数のBMP分子およびTGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤と接触させるステップ;細胞を、1つまたは複数のSHH活性化剤、1つまたは複数のFGF活性化剤、1つまたは複数の背方化剤、1つまたは複数の腹方化剤、および1つまたは複数のWnt活性化剤と接触させて、分化細胞の細胞集団を得るステップであって、分化細胞の少なくとも約50%は、Pit1を発現するステップを含む。
ある特定の実施形態では、方法は、幹細胞の、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤との最初の接触から少なくとも約10日で、細胞集団を得るステップを含む。ある特定の実施形態では、方法は、幹細胞の、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤との最初の接触から少なくとも約15日で、細胞集団を得るステップを含む。ある特定の実施形態では、方法は、幹細胞の、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤との最初の接触から約15日で、細胞集団を得るステップを含む。ある特定の実施形態では、方法は、幹細胞の、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤との最初の接触から約20日で、細胞集団を得るステップを含む。
本明細書に開示される様々な方法について、ある特定の実施形態では、細胞の、1つまたは複数のWnt活性化剤との最初の接触は、1つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する細胞の、1つまたは複数の背方化剤との最初の接触から少なくとも約2日および/または約5日以内である。ある特定の実施形態では、細胞の、1つまたは複数のWnt活性化剤との最初の接触は、1つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する細胞の、1つまたは複数の背方化剤との最初の接触と同じ日に起こる。ある特定の実施形態では、細胞の、1つまたは複数のWnt活性化剤との最初の接触は、1つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する細胞の、1つまたは複数の背方化剤との最初の接触から約4日である。
ある特定の実施形態では、方法は、細胞を、少なくとも約5日間および/または最長約15日間、1つまたは複数のWnt活性化剤と接触させるステップを含む。ある特定の実施形態では、方法は、細胞を、少なくとも約7日間、1つまたは複数のWnt活性化剤と接触させるステップを含む。
ある特定の実施形態では、方法は、細胞を、少なくとも約3日間および/または最長約10日間、1つまたは複数の背方化剤と接触させるステップを含む。ある特定の実施形態では、方法は、細胞を、約4日間または約7日間、1つまたは複数の背方化剤と接触させるステップを含む。ある特定の実施形態では、方法は、細胞を、少なくとも約5日間および/または最長約15日間、1つまたは複数の腹方化剤と接触させるステップを含む。ある特定の実施形態では、方法は、細胞を、少なくとも約7日間または約11日間、1つまたは複数の腹方化剤と接触させるステップを含む。
ある特定の実施形態では、方法は、1つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する細胞を、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤と接触させるステップを含む。ある特定の実施形態では、方法は、細胞を、少なくとも約3日間および/または最長約10日間、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤と接触させるステップを含む。ある特定の実施形態では、方法は、細胞を、約4日間または約7日間、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤と接触させるステップを含む。ある特定の実施形態では、方法は、細胞を、1つまたは複数の背方化剤およびTGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤と、同時に接触させるステップを含む。
ある特定の実施形態では、方法は、細胞を、1つまたは複数のエストロゲン受容体(ER)アゴニストと接触させるステップをさらに含む。ある特定の実施形態では、方法は、細胞を、1つまたは複数のERアゴニストおよび1つまたは複数のWnt活性化剤と、同時に接触させるステップを含む。ある特定の実施形態では、細胞の、1つまたは複数のERアゴニスト(the one or ER agonist)との最初の接触は、1つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する細胞の、1つまたは複数の背方化剤との最初の接触から少なくとも約2日および/または約5日以内である。ある特定の実施形態では、細胞の、1つまたは複数のERアゴニストとの最初の接触は、1つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する細胞の、1つまたは複数の背方化剤との最初の接触と同じ日に起こる。ある特定の実施形態では、細胞の、1つまたは複数のERアゴニストとの最初の接触は、1つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する細胞の、1つまたは複数の背方化剤との最初の接触から約4日である。ある特定の実施形態では、方法は、細胞を、少なくとも約5日間および/または最長約15日間、1つまたは複数のERアゴニストと接触させるステップを含む。ある特定の実施形態では、方法は、細胞を、少なくとも約7日間、1つまたは複数のERアゴニストと接触させるステップを含む。
ある特定の実施形態では、1つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する細胞は、幹細胞のin vitroでの分化によって得られる。ある特定の実施形態では、幹細胞のin vitroでの分化は、幹細胞を、1つまたは複数のBMP分子およびTGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤と接触させること、細胞を、1つまたは複数のSHH活性化剤および1つ、2つ、またはそれより多いFGF活性化剤と接触させることを含む。
ある特定の実施形態では、幹細胞を、少なくとも約2日間および/または約4日以内、1つまたは複数のBMP分子と接触させる。ある特定の実施形態では、幹細胞を、少なくとも約5日間、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤と接触させる。ある特定の実施形態では、幹細胞を、約8日間、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤と接触させる。
ある特定の実施形態では、幹細胞を、少なくとも約2日間、1つまたは複数のSHH活性化剤および1つ、2つ、またはそれより多いFGF活性化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、幹細胞を、約5日間、1つまたは複数のSHH活性化剤および1つ、2つ、またはそれより多いFGF活性化剤と接触させる。
ある特定の実施形態では、幹細胞のin vitroでの分化は、細胞を、SMADシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤(「SMAD阻害剤」と称される)と接触させるステップをさらに含む。ある特定の実施形態では、幹細胞を、少なくとも約2日間、1つまたは複数のSMAD阻害剤と接触させる。ある特定の実施形態では、幹細胞を、約5日間、SMADシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤と接触させる。
ある特定の実施形態では、様々な方法は、1つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する細胞を、Pit1を発現する細胞へと分化させるステップと、Pit1を発現する細胞を、GHRHRlow細胞へと分化させるステップと、GHRHRlow細胞を、GHRHRhigh細胞へと分化させるステップとを含む。ある特定の実施形態では、方法は、幹細胞を、1つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する細胞へと分化させるステップと、1つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する細胞を、Pit1を発現する細胞へと分化させるステップと、Pit1を発現する細胞を、GHRHRlow細胞へと分化させるステップと、GHRHRlow細胞を、GHRHRhigh細胞へと分化させるステップとを含む。ある特定の実施形態では、方法は、幹細胞を、1つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する細胞へと分化させるステップと、1つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する細胞を、Pit1を発現する細胞へと分化させるステップとを含む。
ある特定の実施形態では、Pit1を発現する細胞の、GHRHRlow細胞への分化は、Pit1を発現する細胞を、GH誘導剤の第1の組合せと接触させることを含む。ある特定の実施形態では、GH誘導剤の第1の組合せは、レチノイン酸(RA)、コルチコステロイド、甲状腺ホルモン、GHRHシグナル伝達のアゴニスト、ERアゴニスト、およびGhrelinシグナル伝達経路のアゴニストからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、GH誘導剤の第1の組合せは、レチノイン酸(RA)、コルチコステロイド、甲状腺ホルモン、およびGHRHシグナル伝達のアゴニストを含む。ある特定の実施形態では、GH誘導剤の第1の組合せは、RA、デキサメタゾン、T3、およびGHRHを含む。ある特定の実施形態では、GH誘導剤の第1の組合せは、レチノイン酸(RA)、コルチコステロイド、甲状腺ホルモン、2種のGHRHシグナル伝達のアゴニスト、およびERアゴニストを含む。ある特定の実施形態では、GH誘導剤の第1の組合せは、RA、デキサメタゾン、T3、GHRH、cAMP、およびDPNを含む。ある特定の実施形態では、GH誘導剤の第1の組合せは、レチノイン酸(RA)、コルチコステロイド、甲状腺ホルモン、GHRHシグナル伝達のアゴニスト、ERアゴニスト、およびGhrelinシグナル伝達経路のアゴニストを含む。ある特定の実施形態では、GH誘導剤の第1の組合せは、RA、デキサメタゾン、T3、GHRH、DPN、およびGhrelinを含む。
ある特定の実施形態では、方法は、Pit1を発現する細胞を、少なくとも約3日間、GH誘導剤の第1の組合せと接触させて、少なくとも約50%のGHRHRlow細胞を含む細胞集団を得るステップを含む。ある特定の実施形態では、方法は、Pit1を発現する細胞を、約5日間、GH誘導剤の第1の組合せと接触させて、少なくとも約50%のGHRHRlow細胞を含む細胞集団を得るステップを含む。ある特定の実施形態では、方法は、Pit1を発現する細胞を、約2週間、GH誘導剤の第1の組合せと接触させて、少なくとも約50%のGHRHRlow細胞を含む細胞集団を得るステップを含む。
ある特定の実施形態では、GHRHRlow細胞のGHRHRhigh細胞への分化は、GHRHRlow細胞を、GH誘導剤の第2の組合せと接触させることを含む。ある特定の実施形態では、GH誘導剤の第2の組合せは、レチノイン酸(RA)、コルチコステロイド、甲状腺ホルモン、GHRHシグナル伝達のアゴニスト、ERアゴニスト、インターロイキン、およびGhrelinシグナル伝達経路のアゴニストからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、GH誘導剤の第2の組合せは、レチノイン酸(RA)、コルチコステロイド、甲状腺ホルモン、およびGHRHシグナル伝達のアゴニストを含む。ある特定の実施形態では、GH誘導剤の第2の組合せは、RA、デキサメタゾン、T3、およびGHRHを含む。ある特定の実施形態では、GH誘導剤の第2の組合せは、レチノイン酸(RA)、コルチコステロイド、甲状腺ホルモン、2種のGHRHシグナル伝達のアゴニスト、およびERアゴニストを含む。ある特定の実施形態では、GH誘導剤の第2の組合せは、RA、デキサメタゾン、T3、GHRH、cAMP、およびDPNを含む。ある特定の実施形態では、GH誘導剤の第2の組合せは、コルチコステロイド、甲状腺ホルモン、GHRHシグナル伝達のアゴニスト、ERアゴニスト、インターロイキン、およびGhrelinシグナル伝達経路のアゴニストを含む。ある特定の実施形態では、GH誘導剤の第2の組合せは、デキサメタゾン、T3、GHRH、IL−6、Ghrelin、およびDPNを含む。
ある特定の実施形態では、方法は、GHRHRlow細胞を、少なくとも約5日間、GH誘導剤の第2の組合せと接触させて、少なくとも約50%のGHRHRhigh細胞を含む細胞集団を得るステップを含む。ある特定の実施形態では、方法は、GHRHRlow細胞を、約10日間、GH誘導剤の第2の組合せと接触させて、少なくとも約50%のGHRHRhigh細胞を含む細胞集団を得るステップを含む。ある特定の実施形態では、方法は、GHRHRlow細胞を、約4週間、GH誘導剤の第2の組合せと接触させて、少なくとも約50%のGHRHRhigh細胞を含む細胞集団を得るステップを含む。
ある特定の実施形態では、本開示の主題は、幹細胞(例えば、ヒト幹細胞)の分化を誘導するためのin vitro方法を提供する。ある特定の実施形態では、本開示の主題は、幹細胞の、1つまたは複数の下垂体前駆体マーカー(下垂体前駆体)を発現する細胞への分化を誘導するためのin vitro方法を提供する。ある特定の実施形態では、方法は、幹細胞の集団を、有効量の、形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤、有効量の、BMPシグナル伝達の1つまたは複数の活性化剤、有効量の、Sonic Hedgehog(SHH)シグナル伝達の1つまたは複数の活性化剤、および有効量の、FGFシグナル伝達の1つ、2つまたはそれより多い活性化剤と接触させるステップを含む。ある特定の実施形態では、方法は、細胞を、SMADシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤と接触させるステップをさらに含む。ある特定の実施形態では、FGFシグナル伝達の活性化剤は、少なくともFGF8およびFGF10シグナル伝達を活性化する。ある特定の実施形態では、FGFシグナル伝達の活性化剤は、少なくともFGF8、FGF10およびFGF18シグナル伝達を活性化する。ある特定の実施形態では、細胞を、少なくとも約2日間、または少なくとも約3日間BMPシグナル伝達の1つまたは複数の活性化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、最長3日間、最長4日間、または最長5日間BMPシグナル伝達の1つまたは複数の活性化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、SHHシグナル伝達の1つまたは複数の活性化剤およびFGFシグナル伝達の2つまたはそれより多い活性化剤、ならびに必要に応じて1つまたは複数のSMAD阻害剤と、幹細胞の、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤との最初の接触から少なくとも約3日で接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、SHHシグナル伝達の1つまたは複数の活性化剤およびFGFシグナル伝達の2つまたはそれより多い活性化剤、ならびに必要に応じて1つまたは複数のSMAD阻害剤と、幹細胞の、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤との最初の接触から約3日または約4日で接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、少なくとも約5日間かつ最長約10日間、1つまたは複数のSHH活性化剤および2つまたはそれより多いFGF活性化剤、ならびに必要に応じて1つまたは複数のSMAD阻害剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、少なくとも約9日間、1つまたは複数のSHH活性化剤および2つまたはそれより多いFGF活性化剤、ならびに必要に応じて1つまたは複数のSMAD阻害剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、少なくとも約8日間、1つまたは複数のSHH活性化剤および2つまたはそれより多いFGF活性化剤、ならびに必要に応じて1つまたは複数のSMAD阻害剤と接触させる。
下垂体前駆体は、in vitroで、Pit1を発現する細胞へと分化され得る。ある特定の実施形態では、下垂体前駆体を、少なくとも約50%(例えば、少なくとも約70%または約80%)のPit1を発現する細胞を含む細胞集団へと分化させるための方法は、下垂体前駆体の集団を、有効量の、1つまたは複数の背方化剤、有効量の、1つまたは複数の腹方化剤、および有効量の、1つまたは複数のWnt活性化剤と接触させるステップを含む。ある特定の実施形態では、方法は、下垂体前駆体を、有効量の、エストロゲン受容体(ER)の1つまたは複数のアゴニスト(ERアゴニスト)と接触させるステップをさらに含む。ある特定の実施形態では、細胞を、少なくとも約5日間および最長約10日間、1つまたは複数の背方化剤、1つまたは複数の腹方化剤および1つまたは複数のWnt活性化剤、ならびに必要に応じてERアゴニストと接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約7日間、1つまたは複数の背方化剤、1つまたは複数の腹方化剤および1つまたは複数のWnt活性化剤、ならびに必要に応じてERアゴニストと接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約8日間、1つまたは複数の背方化剤、1つまたは複数の腹方化剤および1つまたは複数のWnt活性化剤、ならびに必要に応じてERアゴニストと接触させる。
Pit1を発現する細胞は、in vitroで、成長ホルモン産生細胞へとさらに分化され得る。ある特定の実施形態では、Pit1を発現する細胞を、少なくとも約50%(例えば、少なくとも約70%または約80%)の1つまたは複数の成長ホルモン産生細胞マーカーを発現する細胞を含む細胞集団へと分化させるための方法は、Pit1を発現する細胞を、成長ホルモン(GH)の発現を誘導することが可能である1つまたは複数の分子(GH誘導剤)と接触させるステップを含む。ある特定の実施形態では、Pit1細胞を、1、2、3、4、5、または6種のGH誘導剤と接触させる。
ある特定の実施形態では、本開示の主題は、幹細胞(例えば、ヒト幹細胞)の、1つまたは複数の成長ホルモン産生細胞マーカー(成長ホルモン産生細胞)を発現する細胞への分化を誘導するためのin vitro方法を提供する。ある特定の実施形態では、幹細胞の、1つまたは複数の成長ホルモン産生細胞マーカーを発現する細胞への分化を誘導するためのin vitro方法は、幹細胞の集団を、(a)有効量の、形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤、(b)有効量の、BMPシグナル伝達の1つまたは複数の活性化剤、(c)有効量の、Sonic Hedgehog(SHH)シグナル伝達の1つまたは複数の活性化剤、(d)有効量の、FGFシグナル伝達の2つまたはそれより多い活性化剤、(e)有効量の1つまたは複数の背方化剤、(f)有効量の1つまたは複数の腹方化剤、および(g)有効量の1つまたは複数のWnt活性化剤と接触させるステップを含む。
ある特定の実施形態では、細胞を、少なくとも約2日間、または少なくとも約3日間BMPシグナル伝達の1つまたは複数の活性化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、最長3日間、最長4日間、または最長5日間BMPシグナル伝達の1つまたは複数の活性化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、SHHシグナル伝達の1つまたは複数の活性化剤およびFGFシグナル伝達の2つまたはそれより多い活性化剤と、幹細胞のTGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤との最初の接触から少なくとも約3日で接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、SHHシグナル伝達の1つまたは複数の活性化剤およびFGFシグナル伝達の2つまたはそれより多い活性化剤と、幹細胞のTGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤との最初の接触から約3日または約4日で接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、少なくとも約5日間および最長約10日間、1つまたは複数のSHH活性化剤、および2つまたはそれより多いFGF活性化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、少なくとも約9日間、1つまたは複数のSHH活性化剤、および2つまたはそれより多いFGF活性化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、SHHシグナル伝達の1つまたは複数の活性化剤およびFGFシグナル伝達の2つまたはそれより多い活性化剤を、細胞と、同時に接触させる。
ある特定の実施形態では、細胞を、少なくとも約5日間および最長約10日間、1つまたは複数の背方化剤、1つまたは複数の腹方化剤、および1つまたは複数のWnt活性化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約7日間、1つまたは複数の背方化剤、1つまたは複数の腹方化剤、および1つまたは複数のWnt活性化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約8日間、1つまたは複数の背方化剤、1つまたは複数の腹方化剤、および1つまたは複数のWnt活性化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、1つまたは複数の背方化剤、1つまたは複数の腹方化剤、および1つまたは複数のWnt活性化剤と、幹細胞の、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤との最初の接触から少なくとも約5日および最長約15日で接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、1つまたは複数の背方化剤、1つまたは複数の腹方化剤、および1つまたは複数のWnt活性化剤と、幹細胞の、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤との最初の接触から約8日で、接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、1つまたは複数の背方化剤、1つまたは複数の腹方化剤、および1つまたは複数のWnt活性化剤と、幹細胞の、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤との最初の接触から約9日で接触させる。ある特定の実施形態では、1つまたは複数の背方化剤、1つまたは複数の腹方化剤、および1つまたは複数のWnt活性化剤を、細胞と同時に接触させる。
ある特定の実施形態では、方法は、細胞を、(h)有効量の1つまたは複数のSMAD阻害剤と接触させるステップをさらに含む。ある特定の実施形態では、1つまたは複数のSMAD阻害剤は、SHHシグナル伝達の1つまたは複数の活性化剤およびFGFシグナル伝達の2つまたはそれより多い活性化剤と同時に、細胞と接触させる。
ある特定の実施形態では、方法は、細胞を、(i)有効量の1つまたは複数のERアゴニストと接触させるステップをさらに含む。ある特定の実施形態では、1つまたは複数のERアゴニストを、1つまたは複数の背方化剤、1つまたは複数の腹方化剤、および1つまたは複数のWnt活性化剤と同時に、細胞と接触させる。
ある特定の実施形態では、細胞を、1つまたは複数のGH誘導剤と、幹細胞の、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤との最初の接触から少なくとも約10日および最長約25日で接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、1つまたは複数のGH誘導剤と、幹細胞の、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤との最初の接触から約15日で接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、1つまたは複数のGH誘導剤と、幹細胞の、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤との最初の接触から約16日で接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、少なくとも約10日間および最長約10週間、1つまたは複数のGH誘導剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、少なくとも約2週間、少なくとも約4週間、または少なくとも約6週間、1つまたは複数のGH誘導剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約2週間、1つまたは複数のGH誘導剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約4週間、1つまたは複数のGH誘導剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約6週間、1つまたは複数のGH誘導剤と接触させる。
ある特定の実施形態では、細胞集団は、少なくとも約50%(例えば、約70%または約80%)の1つまたは複数の成長ホルモン産生細胞マーカーを発現する細胞を、幹細胞の、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤との最初の接触から少なくとも約30日で含む。
ある特定の実施形態では、細胞を、有効量の前述の作用物質(agent)と、少なくとも50%(例えば、約70%または約80%)の細胞が検出可能なレベルの1つまたは複数の成長ホルモン産生細胞マーカーを発現するように、一定期間接触させる。
ある特定の実施形態では、1つまたは複数の背方化剤は、FGFシグナル伝達の1つまたは複数の活性化剤を含む。ある特定の実施形態では、FGFシグナル伝達の1つまたは複数の活性化剤は、FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF7、FGF8、FGF10、FGF18、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、FGFシグナル伝達の1つまたは複数の活性化剤は、FGF8を含む。ある特定の実施形態では、FGFシグナル伝達の1つまたは複数の活性化剤は、FGF8およびFGF10を含む。ある特定の実施形態では、FGFシグナル伝達の1つまたは複数の活性化剤は、FGF8、FGF10、およびFGF18を含む。
ある特定の実施形態では、1つまたは複数の腹方化剤は、1つまたは複数のBMP分子を含む。ある特定の実施形態では、1つまたは複数のBMP分子は、BMP1、BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8a、BMP8b、BMP10、BMP11、BMP15、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、1つまたは複数のBMP分子は、BMP2を含む。ある特定の実施形態では、1つまたは複数のBMP分子は、BM4を含む。
ある特定の実施形態では、1つまたは複数のWnt活性化剤は、CHIR99021、Wnt−1、WNT3A、Wnt4、Wnt5a、WAY−316606、IQ1、QS11、SB−216763、BIO(6−ブロモインジルビン−3’−オキシム)、LY2090314、DCA、2−アミノ−4−[3,4−(メチレンジオキシ)ベンジル−アミノ]−6−(3−メトキシフェニル)ピリミジン、(ヘテロ)アリールピリミジン、その誘導体、およびそれらの組合せからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、1つまたは複数のWnt活性化剤は、CHIR99021を含む。
ある特定の実施形態では、1つまたは複数のGH誘導剤は、レチノイン酸(RA)、コルチコステロイド、甲状腺ホルモン、ERアゴニスト、GHRHシグナル伝達経路のアゴニスト、Ghrelinシグナル伝達経路のアゴニスト、インターロイキン、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される。
ある特定の実施形態では、コルチコステロイドは、デキサメタゾン、コルチゾン、ヒドロコルチゾン、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、コルチコステロイドは、デキサメタゾンを含む。
ある特定の実施形態では、甲状腺ホルモンは、T3、T4、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、甲状腺ホルモンは、T3を含む。
ある特定の実施形態では、GHRHシグナル伝達経路のアゴニストは、GHRH、c−AMP(例えば、ジブチリル−cAMP)、PKA、CREB、MAPK活性化剤、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、GHRHシグナル伝達経路のアゴニストは、GHRH、c−AMP、およびそれらの組合せからなる群から選択される。
ある特定の実施形態では、Ghrelinシグナル伝達経路のアゴニストは、Ghrelin、GHSRアゴニスト、その誘導体およびそれらの混合物からなる群から選択される。
ある特定の実施形態では、インターロイキンは、IL−1、IL−2、IL−3、IL−4、IL−5、IL−6、IL−7、IL−8、IL−9、IL−10、IL−11、IL−12、IL−13、IL−15、およびそれらの組合せからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、インターロイキンは、IL−1、IL−6、IL−10、およびそれらの組合せからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、インターロイキンは、IL−6である。
ある特定の実施形態では、ERアゴニストは、ジアリールプロピオニトリル(DPN)、エストラジオール(E2)、プロピルピラゾール−トリオール(PPT)、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、ERアゴニストは、DPNを含む。
ある特定の実施形態では、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤は、SB431542、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤は、SB431542を含む。
ある特定の実施形態では、SHHシグナル伝達の1つまたは複数の活性化剤は、SHH、C25IIおよびパルモルファミンなどのスムーズンド(SMO)受容体小分子アゴニスト、SAG(例えば、Stanton et al, Mol Biosyst. 2010 Jan;6(1):44−54に開示されているような)、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、SHHシグナル伝達の1つまたは複数の活性化剤は、SHHを含む。ある特定の実施形態では、SHHシグナル伝達の1つまたは複数の活性化剤は、SAGを含む。
ある特定の実施形態では、SMADシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤は、LDN193189、Noggin、Dorsomorphin、K02288、DMH1、ML347、LDN 212854、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、SMADシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤は、LDN193189を含む。
ある特定の実施形態では、細胞を、約10ng/mLから200ng/mLの間の濃度の1つまたは複数の背方化剤と接触させる。
ある特定の実施形態では、細胞を、約1ng/mLから30ng/mLの間の濃度の1つまたは複数の腹方化剤と接触させる。
ある特定の実施形態では、細胞を、約10ng/mlから200ng/mLの間の濃度のFGFシグナル伝達の1つまたは複数の活性化剤と接触させる。
ある特定の実施形態では、細胞を、約0.1ng/mlから10ng/mlの間の濃度のBMP分子の1つまたは複数の活性化剤と接触させる。
ある特定の実施形態では、細胞を、約1μMから20μMの間の濃度のTGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤と接触させる。
ある特定の実施形態では、細胞を、約50ng/mlから200ng/mlの間または約50nMから200nMの間の濃度のSHHシグナル伝達の1つまたは複数の活性化剤と接触させる。
ある特定の実施形態では、細胞を、約1μMから10μMの濃度の1つまたは複数のWnt活性化剤と接触させる。
ある特定の実施形態では、細胞を、約0.1nMから20nMの間の濃度の1つまたは複数のERアゴニストと接触させる。
ある特定の実施形態では、細胞を、約0.1μMから1μMの濃度のRAと接触させる。
ある特定の実施形態では、細胞を、約1nMから20nMの間の濃度の1つまたは複数の甲状腺ホルモンと接触させる。
ある特定の実施形態では、細胞を、約0.1μMから10μMの濃度の1つまたは複数のコルチコステロイドと接触させる。
ある特定の実施形態では、細胞を、約0.1μMから10μM、約0.1μM未満、または約10nMの濃度の1つまたは複数のGHRHシグナル伝達経路のアゴニストと接触させる。
ある特定の実施形態では、細胞を、約1nMから50nMの間の濃度の1つまたは複数のGhrelinシグナル伝達経路のアゴニストと接触させる。
ある特定の実施形態では、細胞を、約1ng/mlから50ng/mlの間の濃度の1つまたは複数のインターロイキンと接触させる。
ある特定の実施形態では、細胞を、約50nMから200nMの間の濃度のSHHシグナル伝達の1つまたは複数の活性化剤と接触させる。
ある特定の実施形態では、細胞を、約100nMから500nMの間の濃度のSMADシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤と接触させる。
さらに、本開示の主題は、幹細胞の分化を誘導するためのキットを提供する。
ある特定の実施形態では、幹細胞の、1つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する分化細胞の集団への分化を誘導するためのキットは、(a)形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤、(b)BMPシグナル伝達の1つまたは複数の活性化剤、(c)FGFシグナル伝達の1つまたは複数の活性化剤、および(d)SHHシグナル伝達の1つまたは複数の活性化剤を含む。ある特定の実施形態では、キットは、(e)幹細胞の、1つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する分化細胞の集団への分化を誘導するための指示をさらに含む。ある特定の実施形態では、キットは、(f)1つまたは複数のSMAD阻害剤をさらに含む。
ある特定の実施形態では、幹細胞の、Pit1を発現する分化細胞の集団への分化を誘導するためのキットは、(a)形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤、(b)BMPシグナル伝達の1つまたは複数の活性化剤、(c)FGFシグナル伝達の1つまたは複数の活性化剤、(d)SHHシグナル伝達の1つまたは複数の活性化剤、(e)1つまたは複数の背方化剤、(f)1つまたは複数の腹方化剤、および(g)1つまたは複数のWnt活性化剤を含む。ある特定の実施形態では、キットは、(h)幹細胞の、Pit1を発現する分化細胞の集団への分化を誘導するための指示をさらに含む。ある特定の実施形態では、キットは、(i)1つまたは複数のERアゴニストをさらに含む。
ある特定の実施形態では、幹細胞の、GH産生成長ホルモン産生細胞への分化を誘導するためのキットは、(a)形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤、(b)BMPシグナル伝達の1つまたは複数の活性化剤、(c)FGFシグナル伝達の1つまたは複数の活性化剤、(d)SHHシグナル伝達の1つまたは複数の活性化剤、(e)1つまたは複数の背方化剤、(f)1つまたは複数の腹方化剤、(g)1つまたは複数のWnt活性化剤、および(h)1つまたは複数のGH誘導剤を含む。ある特定の実施形態では、キットは、(i)幹細胞の、GH産生成長ホルモン産生細胞の集団への分化を誘導するための指示をさらに含む。
本開示は、下垂体前駆体の、GH産生成長ホルモン産生細胞への分化を誘導するためのキットをさらに提供する。ある特定の実施形態では、キットは、(a)1つまたは複数の背方化剤;(b)1つまたは複数の腹方化剤;(c)Wingless(Wnt)シグナル伝達の1つまたは複数の活性化剤(Wnt活性化剤);および(d)1つまたは複数の成長ホルモン(GH)誘導剤を含む。
さらに、本開示は、幹細胞の、GH産生成長ホルモン産生細胞への分化を誘導するためのキットを提供する。ある特定の実施形態では、キットは、(a)1つまたは複数のBMP分子;(b)TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤;(c)FGFシグナル伝達の1つまたは複数の活性化剤;(d)SHHシグナル伝達の1つまたは複数の活性化剤;(e)1つまたは複数の背方化剤;(f)1つまたは複数の腹方化剤;(g)Wingless(Wnt)シグナル伝達の1つまたは複数の活性化剤(Wnt活性化剤);および(h)1つまたは複数の成長ホルモン(GH)誘導剤を含む。ある特定の実施形態では、キットは、1つまたは複数のERアゴニストをさらに含む。
ある特定の実施形態では、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤は、SB431542、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される小分子である。ある特定の実施形態では、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の阻害剤は、SB431542を含む。
ある特定の実施形態では、SMADシグナル伝達の前記1つまたは複数の阻害剤は、LDN193189、Noggin、Dorsomorphin、K02288、DMH1、ML347、LDN212854、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される小分子である。ある特定の実施形態では、SMADシグナル伝達の阻害剤は、LDN193189を含む。
ある特定の実施形態では、Wntシグナル伝達の前記1つまたは複数の活性化剤は、Wntシグナル伝達の活性化のためのグリコーゲンシンターゼキナーゼ3β(GSK3β)を低下させる。ある特定の実施形態では、Wntシグナル伝達の前記1つまたは複数の活性化剤は、CHIR99021、Wnt−1、WNT3A、Wnt4、Wnt5a、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される小分子である。ある特定の実施形態では、Wntシグナル伝達の活性化剤は、CHIR99021を含む。
ある特定の実施形態では、FGFシグナル伝達の前記活性化剤は、FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF7、FGF8、FGF10、FGF18、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、FGF活性化剤は、FGF8、FGF10、および/またはFGF18を含む。
ある特定の実施形態では、BMPシグナル伝の前記活性化剤は、BMP1、BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8a、BMP8b、BMP10、BMP11、BMP15、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される。
ある特定の実施形態では、SHHシグナル伝達の活性化剤は、Sonic hedgehog(SHH)、C25IIおよびパルモルファミンなどのスムーズンド(SMO)受容体小分子アゴニスト、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される。
ある特定の実施形態では、ERアゴニストは、ジアリールプロピオニトリル(DPN)、エストラジオール(E2)、プロピルピラゾール−トリオール(PPT)、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、ERアゴニストは、DPNを含む。
ある特定の実施形態では、GH誘導剤は、酸(RA)、コルチコステロイド、甲状腺ホルモン、ERアゴニスト、およびGHRHシグナル伝達経路のアゴニスト、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、コルチコステロイドは、デキサメタゾン、コルチゾン、およびヒドロコルチゾン、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、甲状腺ホルモンは、T3、T4、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、GHRHシグナル伝達経路のアゴニストは、GHRH、ジブチリル−cAMP、PKA,CREB、MAPK活性化剤、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される。
加えて、本開示は、in vitroで分化したGH産生成長ホルモン産生細胞の細胞集団、in vitroで分化したPit1細胞の細胞集団を含む、本明細書に開示される方法によって得られる分化細胞の様々な細胞集団を提供する。
本開示は、本明細書に開示される細胞集団を含む組成物をさらに提供する。
本開示は、in vitroで分化した細胞の集団を含む組成物であって、分化細胞の少なくとも約50%が、成長ホルモンを産生することが可能であり(GH産生成長ホルモン産生細胞(somatotroph))、分化細胞の約25%未満が、プロラクチン産生細胞(lactrotroph)マーカー、甲状腺刺激ホルモン産生細胞(thyrotroph)マーカー、下垂体前駆体マーカー、Pit1、幹細胞マーカー、NNEマーカー、神経堤(NC)系統マーカー、および非下垂体プラコードマーカーからなる群から選択される1つまたは複数のマーカーを発現する、組成物をさらに提供する。
ある特定の実施形態では、本開示の主題は、1つまたは複数の成長ホルモン産生細胞マーカーを発現するin vitroで分化した細胞の集団であって、前記分化細胞集団が、幹細胞の集団を、有効量の(a)有効量の、形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤、(b)有効量の、BMPシグナル伝達の1つまたは複数の活性化剤、(c)有効量の、Sonic Hedgehog(SHH)シグナル伝達の1つまたは複数の活性化剤、(d)有効量の、FGFシグナル伝達の2つまたはそれより多い活性化剤、(e)有効量の1つまたは複数の背方化剤、(f)有効量の1つまたは複数の腹方化剤、および(g)有効量の1つまたは複数のWnt活性化剤に曝露するステップを含む方法に従って、幹細胞の集団から生じ、
分化細胞の集団の25%未満が、プロラクチン産生細胞マーカー、甲状腺刺激ホルモン産生細胞マーカー、下垂体前駆体マーカー、Pit1、幹細胞マーカー、NNEマーカー、神経堤(NC)系統マーカー、および非下垂体プラコードマーカー(頭蓋プラコードマーカー、上鰓プラコードマーカー、三叉神経プラコードマーカー、および耳プラコードマーカーを含むがこれらに限定されない)からなる群から選択される、検出可能なレベルの1つまたは複数のマーカーを発現する、集団を提供する。
本開示の主題は、in vitroで分化した細胞の集団を含む組成物であって、少なくとも約50%(例えば、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約99%、または少なくとも約99.5%)の細胞の集団が、1つまたは複数の成長ホルモン産生細胞マーカーを発現し、約25%未満(例えば、約20%未満、約15%未満、約10%未満、約5%未満、約4%未満、約3%未満、約2%未満、約1%未満、約0.5%未満、または約0.1%未満)の細胞の集団が、プロラクチン産生細胞マーカー、甲状腺刺激ホルモン産生細胞マーカー、下垂体前駆体マーカー、Pit1、幹細胞マーカー、NNEマーカー、神経堤(NC)系統マーカー、および非下垂体プラコードマーカー(頭蓋プラコードマーカー、上鰓プラコードマーカー、三叉神経プラコードマーカー、および耳プラコードマーカーを含むがこれらに限定されない)からなる群から選択される1つまたは複数のマーカーを発現する、組成物も提供する。
ある特定の実施形態では、下垂体前駆細胞マーカーは、SIX1、LHX3、LHX4、PITX1、PITX2、HESX1、PROP1、SIX6、TBX19、およびPAX6、GATA2、およびSF1からなる群から選択される。
ある特定の実施形態では、成長ホルモン産生細胞マーカーは、GH1、GHRH受容体(GHRHR)、POU1F1、NeuroD4、およびGHSRからなる群から選択される。
ある特定の実施形態では、NC系統マーカーは、SOX10、FoxD3、ASCL1、Neurogenin、およびSnailからなる群から選択される。
ある特定の実施形態では、NNEマーカーは、TFAP2A、EYA1、DLX3、およびDLX5からなる群から選択される。
ある特定の実施形態では、非下垂体プラコードマーカーは、頭蓋プラコードマーカー、上鰓プラコードマーカー、三叉神経プラコードマーカー、および耳プラコードマーカーからなる群から選択される。
ある特定の実施形態では、頭蓋プラコードマーカーは、SIX1、PAX6、PITX3、クリスタリンアルファA、およびクリスタリンアルファBからなる群から選択される。
ある特定の実施形態では、三叉神経プラコードマーカーは、PAX3である。
ある特定の実施形態では、上鰓プラコードマーカーは、PAX2である。
ある特定の実施形態では、耳プラコードマーカーは、PAX8である。
ある特定の実施形態では、プロラクチン産生細胞マーカーは、PRL、PIT1、およびD2Rからなる群から選択される。
ある特定の実施形態では、甲状腺刺激ホルモン産生細胞マーカーは、TSH、THRH、およびPIT1からなる群から選択される。
ある特定の非限定の実施形態では、組成物は、前記1つまたは複数の成長ホルモン産生細胞マーカーを発現する約1×10から約1×1010個の細胞の集団を含む。
ある特定の実施形態では、幹細胞は、ヒト幹細胞である。ある特定の実施形態では、ヒト幹細胞は、ヒト多能性幹細胞である。ある特定の実施形態では、ヒト多能性幹細胞は、ヒト胚性幹細胞、およびヒト人工多能性幹細胞からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、幹細胞は、非ヒト幹細胞、例えば、これらに限定されないが、哺乳動物幹細胞、霊長類幹細胞、またはげっ歯類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、ブタ、ウシ、ヒツジなど由来の幹細胞である。
本開示の主題は、対象における成長ホルモンの発現および/または分泌を増加させる方法をさらに提供する。ある特定の実施形態では、方法は、対象に、有効量の本明細書に記載の分化細胞集団(例えば、少なくとも約50%(例えば、約70%、または約80%)の1つまたは複数の成長ホルモン産生細胞マーカーを発現する細胞を含む細胞集団)またはそれを含む組成物を投与するステップを含む。
本開示の主題は、対象における成長ホルモンの発現および/または分泌を増加させるための、本明細書に記載の分化細胞集団(例えば、少なくとも約50%(例えば、約70%、または約80%)の1つまたは複数の成長ホルモン産生細胞マーカーを発現する細胞を含む細胞集団)、それを含む組成物をさらに提供する。
本開示の主題は、対象におけるGH、インスリン様成長因子1(IGF−1)、およびIGF−2のうちの1つまたは複数の動的放出を回復させる方法をさらに提供する。ある特定の実施形態では、方法は、対象に、有効量の本明細書に記載の分化細胞集団(例えば、少なくとも約50%(例えば、約70%または約80%)の1つまたは複数の成長ホルモン産生細胞マーカーを発現する細胞を含む細胞集団)またはそれを含む組成物を投与するステップを含む。
本開示の主題は、対象におけるGH、インスリン様成長因子1(IGF−1)、およびIGF−2のうちの1つまたは複数の動的放出を回復させるための、本明細書に記載の分化細胞集団(例えば、少なくとも約50%(例えば、約70%または約80%)の1つまたは複数の成長ホルモン産生細胞マーカーを発現する細胞を含む細胞集団)、それを含む組成物をさらに提供する。
ある特定の実施形態では、対象は、成長ホルモン欠損症を患っている。
本開示の主題は、対象における成長ホルモン欠損症を処置する方法をさらに提供する。ある特定の実施形態では、方法は、対象に、有効量の本明細書に記載の分化細胞集団(例えば、少なくとも約50%(例えば、約70%または約80%)の1つまたは複数の成長ホルモン産生細胞マーカーを発現する細胞を含む細胞集団)またはそれを含む組成物を投与するステップを含む。
本開示は、対象におけるGHの発現および/もしくは分泌を増加させる、GH、インスリン様成長因子1(IGF−1)、およびIGF−2のうちの1つもしくは複数の動的放出を回復させる、ならびに/またはGH欠損症を処置する方法も提供する。ある特定の実施形態では、方法は、対象に、以下の:(a)本明細書に開示される分化細胞の細胞集団(例えば、本明細書に開示されるin vitroで分化したGH産生成長ホルモン産生細胞の細胞集団);および(b)本明細書に開示される組成物のうちの1つを投与するステップを含む。
本開示の主題は、対象における成長ホルモン欠損症を処置するための、本明細書に記載の分化細胞集団(例えば、少なくとも約50%(例えば、約70%または約80%)の1つまたは複数の成長ホルモン産生細胞マーカーを発現する細胞を含む細胞集団)、それを含む組成物をさらに提供する。
本開示の主題は、成長ホルモンの発現および/もしくは分泌を増加させる、GH、インスリン様成長因子1(IGF−1)、およびIGF−2のうちの1つもしくは複数の動的放出を回復させる、ならびに/または成長ホルモン欠損症を処置するための医薬の製造における、本明細書に記載の分化細胞集団(例えば、少なくとも約50%(例えば、約70%または約80%)の1つまたは複数の成長ホルモン産生細胞マーカーを発現する細胞を含む細胞集団)、それを含む組成物の使用をさらに提供する。
さらに、本開示は、GH欠損症に関連する1つまたは複数の細胞表現型を克服することが可能である治療用化合物をスクリーニングする方法を提供する。ある特定の実施形態では、方法は、(a)本明細書に開示されるin vitroで分化したGH産生成長ホルモン産生細胞の細胞集団を、試験化合物と接触させるステップと;(b)GH産生成長ホルモン産生細胞の機能的活性および/または遺伝子発現を測定するステップであって、GH産生成長ホルモン産生細胞が、GH欠損症を有する対象の幹細胞またはGH欠損症を有する対象の1つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する細胞から得られるステップとを含む。
4.図面の簡単な説明
図1は、本開示の主題のある特定の実施形態に従った、幹細胞の、成長ホルモン産生細胞への分化のための方法を示す。
図2は、hPSCから生じる前プラコード外胚葉(pre−placodal ectoderm)および下垂体前葉前駆細胞の遺伝子発現を示す。シングルセルRNA−seq分析により、70%の細胞がPITX1およびLHX3などの下垂体転写物を共発現することが示された。4つの細胞(分析した全細胞の5%)のみが、T(中胚葉)、SOX17、またはMYODを発現し、夾雑細胞の割合が低いことを示唆する。他のプラコードの運命は、PAX2(上鰓)、PAX3(三叉神経)、またはPAX8(耳)を含み、これらは、SIX1集団の約20%において一緒に検出された。
図3は、低用量および高用量のNotchシグナル伝達誘導剤(例えば、FGF8/10)で処置した多能性幹細胞の遺伝子発現を示す。PROP1発現は、Notchシグナル伝達誘導剤によって有意に上方調節された。
図4は、CHIR99021によってさらに処置された細胞におけるPit1遺伝子発現を示す。ほとんどのPit1を発現する細胞は、Ki67標識によって示されるように増殖していなかった。
図5は、PROP1、PIT1およびPOMC発現に対するFGF8の作用を示す。FGF8処置は、PROP1を維持し、PIT1を下方調節し、POMCを上方調節した。BMP2処置は、このような作用を中和した。
図6は、GH1、PRLおよびTSH−β発現に対するBMP2とCHIRの組合せの作用を示す。BMP2とCHIRの組合せは、GH1の発現を有意に促進した。**:対照群と比較して、p値<0.01。
図7A〜7Dは、成長ホルモン産生細胞の選択的誘導に対するRA、GHRH、T3、およびコルチコステロンの作用を示す。図6Aは、RAによる処置によってGH1の発現が有意に増加したことを示す。図6Bは、GHRHによる処置によってGH1の発現が有意に増加したことを示す。図6Cは、T3による処置によってTSH−βの発現が有意に低下したことを示す。図6Dは、コルチコステロンによる処置によってPRLの発現が有意に低下したことを示す。**:対照群と比較して、p値<0.01。
図8は、成長ホルモン誘導後の細胞表現型を示す。細胞集団は、多量のGHおよびGHRHR、および少量のTSH、PRLおよびLHを発現した。右下のパネルは、GHRH刺激によりGH発現が増加したことを示す。
図9は、GHRHR陽性細胞集団におけるKi67およびGHRHRの発現を示す。GHRHR陽性細胞では、ほとんどの細胞が低レベルのGHRHRを発現し、細胞の一部だけが高レベルのGHRHRを発現した。高レベルのGHRHRを発現する細胞は、低い増殖速度を有する多角形形態を示し、これらがより成熟したGH細胞であることが示された。
図10は、成長ホルモンの分泌とGHRHR発現の間の相関を示す。左側のパネルは、高レベルのGHRHRを発現する細胞が、Ki67の低発現によって反映される低い増殖速度を有していたことを示す。真ん中のパネルは、細胞がGHRHRの発現に基づいてスクリーニングされ、ここで、高レベルのGHRHRを発現する細胞が集団の15%を占めたことを示す。右側のパネルは、高レベルのGHRHRを発現する細胞が、低レベルのGHRHRを発現する細胞と比較して、有意に多い量の成長ホルモンを発現したことを示す。***:対照群と比較して、p値<0.001。
図11は、それによって別個の細胞集団を分析することができる、ステージ特異的レポーター系を生成するための例示的なレポーター構築物を示す。
図12A〜12Fは、Ames小人症マウスコロニーの特徴付けを示す。A)11週齢のAmes小人症マウスとヘテロ接合同腹子の比較。Ames小人症マウスは、サイズおよび体重において小型であった。B)ELISAによって検出された循環血漿中GHレベル。C)腓腹筋におけるIGF−1(クラスII)遺伝子発現のRT−qPCR分析。D)Amesマウスと正常な対照から得られた大腿骨は、長さに有意な差を示した。E)大腿骨の皮質骨密度および厚みのMicroCT分析。F)骨梁骨塩密度(TMD)のMicroCT分析。TMDは、2つのマウスの間で類似していたが、Amesマウスは、非常により薄い骨梁骨(より多くの分離とより多数の骨梁を示す)を示した。データは、2から4つの別々の試料の平均±SEMとしてプロットした。野生型群と比較して、p<0.05、**:p値<0.01、***:p値<0.001。
図13A〜13Fは、RAG1−/−/Prop1df/dfマウスに対するGH細胞の作用を示す。A)左の2匹のマウスはRAG1−/−/Prop1df/dfであった。右のマウスはRAG1−/−/Prop1wt/dfであった。マウスは6カ月齢であった。B)IHCは、移植後移植6週以内にヒト核(hNA)で標識したヒト細胞におけるGH細胞の存在を示す。C)ELISAによって検出された基底のおよびGHRHで刺激されたhGHの血漿中レベル。D)IGF−1クラスII(IGF−1の循環形態)のqRT−PCR分析。E)肝臓におけるIGFBP3 mRNA発現のqRT−PCR分析。F)ELISAによって検出された基底の血漿中IGF−1レベルのqRT−PCR分析。n=2〜3。データは、平均±SEMとしてプロットされた。スケールバー=50μm。偽群と比較して、:p値<0.05;**:p値<0.01。
図14は、本開示の主題のある特定の実施形態に従った、幹細胞の、成長ホルモン産生細胞への分化のための方法を示す。
図15は、本開示の主題のある特定の実施形態に従った、幹細胞の、成長ホルモン産生細胞への分化のための方法を示す。
図16は、インターロイキン(「IL」)がGH1の遺伝子発現を促進することを示す。IL6およびIL10は、対照群と比較して、PIT1およびGH1の遺伝子発現を増加させた。対照群と比較して、**:p値<0.001。
5.発明の詳細な説明
本開示の主題は、幹細胞(例えば、ヒト幹細胞)の、1つまたは複数の成長ホルモン産生細胞マーカーを発現する細胞へのまたはGH産生成長ホルモン産生細胞への分化を誘導するためのin vitro方法、および下垂体前駆細胞(または下垂体前駆体)の、1つまたは複数の成長ホルモン産生細胞マーカーを発現する細胞へのまたはGH産生成長ホルモン産生細胞への分化を誘導するためのin vitro方法、およびこのような方法によって生成される細胞、ならびにこのような細胞を含む組成物に関する。成長ホルモンの発現および/分泌を増加させる、成長ホルモンの動的放出を回復させる、ならびに/または成長ホルモン欠損症を処置するためのこのような細胞の使用も提供される。
本開示の明確化のためであって限定としてではなく、詳細な説明は以下の下位項目に分割される。
5.1.定義;
5.2.幹細胞を分化させる方法;
5.3.分化細胞集団を含む組成物;
5.4.成長ホルモンを増加させる方法;
5.5.キット;
5.6.治療用化合物をスクリーニングする方法
5.1 定義
本明細書において使用される用語は、一般的に、本発明の文脈内で、かつ各用語が使用される特定の文脈において、当技術分野における通常の意味を有する。特定の用語について以下に、または本明細書中の他所において議論し、従事者に本発明の組成物および方法を説明する際の追加のガイダンスならびにそれらを作製および使用する方法を提供する。
「約」または「およそ」という用語は、当業者によって決定された特定の値に関する許容可能な誤差範囲内を意味し、これは、値が測定または決定される方法に部分的に依存する(すなわち、測定系の限界)。例えば、「約」は、当技術分野における実践で、3以内または3を超える標準偏差を意味し得る。あるいは、「約」は、所与の値の最大20%、例えば、最大10%、最大5%、または最大1%の範囲を意味し得る。あるいは、特に生物学的システムまたはプロセスに関して、この用語は、値の一桁以内、例えば、5倍以内、または2倍以内を意味し得る。
本明細書で使用される場合、「シグナル伝達タンパク質」に関する「シグナル伝達」という用語は、膜受容体タンパク質へのリガンド結合またはいくつかの他の刺激によって活性化されるかまたはそうでなければ影響を受けるタンパク質を指す。シグナル伝達タンパク質の例として、これらに限定されないが、SMAD、ベータ−カテニンを含むウイングレス(Wnt)複合体タンパク質、NOTCH、形質転換成長因子ベータ(TGFβ)、Activin、Nodal、グリコーゲンシンターゼキナーゼ3β(GSK3β)タンパク質、骨形成タンパク質(BMP)、線維芽細胞成長因子(FGF)、Sonic Hedgehog(SHH)、GHRH、およびGhrelinが挙げられる。多くの細胞表面受容体または細胞内受容体タンパク質では、リガンド−受容体相互作用は、細胞の応答と直接結びついていない。リガンド活性化受容体は、細胞の挙動に対するリガンドの最終的な生理的作用が生じる前に、細胞の内部で他のタンパク質と最初に相互作用し得る。一連のいくつかの相互作用する細胞タンパク質の挙動は、受容体の活性化または阻害後に変化することが多い。受容体の活性化によって誘導される細胞変化の全体のセットは、シグナル伝達機構またはシグナル伝達経路と呼ばれる。
本明細書で使用される場合、「シグナル」という用語は、細胞の構造および機能の変化を制御する内部および外部の因子を指す。これらは、本質的に化学的または物理的であり得る。
本明細書で使用される場合、「リガンド」という用語は、受容体に結合する分子およびタンパク質、例えば、形質転換成長因子ベータ(TFGβ)、Activin、Nodal、骨形成タンパク質(BMP)などを指す。
「阻害剤」は、本明細書で使用される場合、分子または経路のシグナル伝達機能を妨げる(例えば、低減するか、低下させるか、抑制するか、排除するか、またはブロックする)ことが可能である化合物または分子(例えば、小分子、ペプチド、ペプチド模倣体、天然化合物、siRNA、アンチセンス核酸、アプタマー、または抗体)を指す。阻害剤は、指定されるタンパク質(シグナル伝達分子、指定されるシグナル伝達分子に関与する任意の分子、指定される関連分子)の任意の活性を変化させる任意の化合物または分子であり得る。阻害剤は、指定されるシグナル伝達分子から上流の分子に結合して影響を及ぼすこと(次に指定される分子の阻害を引き起こす)によって誘導される阻害に加えて、競合的阻害(別の公知の結合化合物の結合を排除または低減するように活性部位に結合する)およびアロステリック阻害(化合物がそのタンパク質の活性部位に結合するのを妨げるようにタンパク質のコンフォメーションを変化させるようにタンパク質に結合する)の観点から説明される。阻害剤は、実際にシグナル伝達標的と接触することによってシグナル伝達標的またはシグナル伝達標的経路を阻害する「直接的阻害剤」であり得る。
「活性化剤」は、本明細書で使用される場合、分子または経路のシグナル伝達機能、例えば、Wntシグナル伝達、BMPシグナル伝達、SHHシグナル伝達、FGFシグナル伝達、GHRHシグナル伝達、Ghrelinシグナル伝達などの活性化を増加させる、誘導する、刺激する、活性化する、促進する、および/または増強することが可能である化合物を指す。
本明細書で使用される場合、「誘導体」という用語は、類似するコア構造を有する化学的化合物を指す。
本明細書で使用される場合、「細胞の集団」または「細胞集団」という用語は、少なくとも2つの細胞の群を指す。非限定的な例では、細胞集団は、少なくとも約10個、少なくとも約100個、少なくとも約200個、少なくとも約300個、少なくとも約400個、少なくとも約500個、少なくとも約600個、少なくとも約700個、少なくとも約800個、少なくとも約900個、少なくとも約1000個の細胞、少なくとも約5,000個の細胞または少なくとも約10,000個の細胞または少なくとも約100,000個の細胞または少なくとも約1,000,000個の細胞を含み得る。集団は、1つの細胞型を含む純粋集団、例えば、下垂体前駆細胞または下垂体前駆体の集団、Pit1を発現する細胞、GH産生成長ホルモン産生細胞(GHRHRlow細胞、GHRHRhigh細胞)、または未分化幹細胞の集団であってもよい。あるいは、集団は、1種より多い細胞型、例えば、混合細胞集団を含んでもよい。
本明細書で使用される場合、「幹細胞」という用語は、培養下で無期限に分裂し、特殊化した細胞を生じさせる能力を有する細胞を指す。ヒト幹細胞は、ヒトに由来する幹細胞を指す。
本明細書で使用される場合、「胚性幹細胞」および「ESC」という用語は、培養下で長期間分化せずに分裂することが可能である、着床前段階の胚から生じ、3つの一次胚葉の細胞および組織へと発生することが公知である、原始(未分化)細胞を指す。ヒト胚性幹細胞は、ヒトに由来する胚性幹細胞を指す。本明細書で使用される場合、「ヒト胚性幹細胞」または「hESC」という用語は、培養下で長期間分化せずに分裂することが可能であり、3つの一次胚葉の細胞および組織へと発生することが公知である、初期ヒト胚(胚盤胞段階まで、および胚盤胞段階を含む)から生じる多能性幹細胞の一種を指す。
本明細書で使用される場合、「胚性幹細胞系」という用語は、数日間、数カ月間から数年間まで分化せずに増殖することが可能である、in vitro条件下で培養された胚性幹細胞の集団を指す。
本明細書で使用される場合、「全能性」という用語は、身体のすべての細胞型および胎盤などの胚体外組織を構成するすべての細胞型を生じさせる能力を指す。
本明細書で使用される場合、「複能性(multipotent)」という用語は、身体の1つより多くの細胞型へと発生する能力を指す。
本明細書で使用される場合、「多能性」という用語は、内胚葉、中胚葉、および外胚葉を含む生物の3つの発生胚葉へと発生する能力を指す。
本明細書で使用される場合、「人工多能性幹細胞」または「iPSC」という用語は、特定の胚性遺伝子(例えば、OCT4、SOX2、およびKLF4導入遺伝子)(例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Takahashi and Yamanaka Cell 126, 663−676 (2006)を参照されたい)が体細胞、例えば、C14、C72などに導入されることによって形成される、胚性幹細胞に類似する、多能性幹細胞の一種を指す。
本明細書で使用される場合、「体細胞」という用語は、配偶子(卵子または精子)以外の身体中の任意の細胞を指し、「成体」細胞と称される場合もある。
本明細書で使用される場合、「体性(成体)幹細胞」という用語は、自己再生(実験室における)および分化の両方について限られた能力を有する、多くの器官および分化組織において見られる比較的稀な未分化細胞を指す。このような細胞の分化能力は様々であるが、通常は起源の器官における細胞型に限定される。
本明細書で使用される場合、「ニューロン」という用語は、神経系の主要な機能的単位である神経細胞を指す。ニューロンは、細胞体とその突起−軸索および1つまたは複数の樹状突起からなる。ニューロンは、シナプスにおいて神経伝達物質を放出することによって他のニューロンまたは細胞に情報を伝達する。
本明細書で使用される場合、「増殖」という用語は、細胞数の増加を指す。
本明細書で使用される場合、「未分化」という用語は、まだ特殊化した細胞型へと発生していない細胞を指す。
本明細書で使用される場合、「分化」という用語は、特殊化していない胚細胞が、心臓、肝臓、または筋細胞などの特殊化した細胞の特徴を獲得するプロセスを指す。分化は、通常は、細胞表面に埋め込まれたタンパク質を含むシグナル伝達経路を介して、細胞の遺伝子の、細胞の外側の物理的および化学的条件との相互作用によって制御される。
本明細書で使用される場合、「定方向性分化」という用語は、神経、神経堤、頭蓋プラコード、および非神経外胚葉前駆体などの、特定の(例えば、所望する)細胞型への分化を誘導する幹細胞培養条件の操作を指す。
本明細書で使用される場合、幹細胞に関する「定方向性分化」という用語は、幹細胞の、多能性状態からより成熟したまたは特殊化した細胞運命への移行を促進するための小分子、成長因子タンパク質、および他の成長条件の使用を指す。
本明細書で使用される場合、「下垂体前駆細胞」および「下垂体前駆体」という用語は互換的に使用され、1つまたは複数の下垂体前駆細胞マーカーを発現する細胞を指す。
本明細書で使用される場合、「成長ホルモン産生細胞」という用語は、1つまたは複数の成長ホルモン産生細胞マーカーを発現する細胞を指す。ある特定の実施形態では、成長ホルモン産生細胞は、GH産生成長ホルモン産生細胞またはGH分泌成長ホルモン産生細胞である。
本明細書で使用される場合、細胞に関する「分化を誘導する」という用語は、デフォルト細胞型(遺伝子型および/または表現型)を非デフォルト細胞型(遺伝子型および/または表現型)に変化させることを指す。よって、「細胞(例えば、幹細胞)において分化を誘導する」とは、細胞(例えば、幹細胞)を、遺伝子型(例えば、マイクロアレイなどの遺伝子分析によって決定される遺伝子発現の変化)および/または表現型(例えば、下垂体前駆細胞マーカー、PIT1、および成長ホルモン産生細胞マーカーなどのタンパク質の発現の変化)などの、その細胞とは異なる特徴を有する子孫細胞へと分裂するように誘導することを指す。
本明細書で使用される場合、「細胞培養」という用語は、研究または医学的処置のための人工培地におけるin vitroでの細胞の成長を指す。
本明細書で使用される場合、「培養培地」という用語は、例えば、ペトリ皿、マルチウェルプレートなどの培養容器中で細胞を覆う液体を指し、細胞に栄養を与え、支持する栄養分を含有する。培養培地はまた、細胞に所望の変化を生じさせるために添加される成長因子も含み得る。
本明細書で使用される場合、細胞を化合物(例えば、1つまたは複数の阻害剤、活性化剤、および/または誘導剤)と「接触させる」という用語は、細胞を化合物に曝露させること、例えば、化合物を細胞と触れることを可能にする位置に置くことを指す。接触させることは、任意の適切な方法を使用して達成され得る。例えば、接触させることは、化合物を細胞のチューブに添加することによって達成され得る。接触させることはまた、化合物を細胞を含む培養培地に添加することによって達成され得る。化合物(例えば、本明細書に開示される阻害剤および活性化剤)のそれぞれは、溶液(例えば、濃縮溶液)として、細胞を含む培養培地に添加することができる。あるいはまたはさらに、化合物(例えば、本明細書に開示される阻害剤および活性化剤)および細胞は、製剤化された細胞培養培地中に存在し得る。
本明細書で使用される場合、「in vitro」という用語は、人工環境および人工環境内で起こるプロセスまたは反応を指す。in vitro環境は、試験管および細胞培養物に例示されるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「in vivo」という用語は、自然環境(例えば、動物または細胞)および、例えば、胚発生、細胞分化、神経管形成などの自然環境内で起こるプロセスまたは反応を指す。
本明細書で使用される場合、遺伝子またはタンパク質に関連する「発現する」という用語は、例えば、マイクロアレイアッセイ、抗体染色アッセイなどのアッセイを使用して観察することができるmRNAまたはタンパク質が生じることを指す。
本明細書で使用される場合、「マーカー」または「細胞マーカー」という用語は、特定の細胞または細胞型を同定する遺伝子またはタンパク質を指す。細胞に関するマーカーは、1つのマーカーに限定されなくてもよく、マーカーは、指定される群のマーカーが細胞または細胞型を別の細胞または細胞型から識別し得るように、マーカーの「パターン」を指し得る。
本明細書で使用される場合、「から生じた」または「から確立された」または「から分化した」という用語は、本明細書に開示される任意の細胞に関連して述べられる場合、細胞系、組織中の親細胞(例えば、任意の操作、例えば、限定されないが、単一細胞単離、in vitroでの培養、例えば、タンパク質、化学物質、放射線、ウイルスによる感染を使用する処置および/または変異誘発、例えば、モルフォゲンなどのDNA配列でのトランスフェクション、培養親細胞中に含有される任意の細胞の選択(連続培養によるなどの)を使用して分離された胚、または流体)から得られた(例えば、単離された、精製されたなど)細胞を指す。生じた細胞は、成長因子、サイトカイン、サイトカイン処置の選択進行、接着性、接着性の欠如、選別手順などに対する応答によって混合集団から選択することができる。
本明細書における「個体」または「対象」は、脊椎動物、例えば、ヒトまたは非ヒト動物、例えば、哺乳動物である。哺乳動物として、これらに限定されないが、ヒト、霊長類、家畜動物、競技用動物、げっ歯類およびペットが挙げられる。非ヒト動物対象の非限定例として、げっ歯類、例えば、マウス、ラット、ハムスター、およびモルモット;ウサギ;イヌ;ネコ;ヒツジ;ブタ;ヤギ;ウシ;ウマ;ならびに非ヒト霊長類、例えば、類人猿およびサルが挙げられる。
本明細書で使用される場合、「疾患」という用語は、細胞、組織、または器官の正常な機能に損傷を与えるかまたはそれを妨げる任意の状態または障害を指す。
本明細書で使用される場合、「処置すること」または「処置」という用語は、処置されている個体または細胞の疾患の経過を変更することを試みる臨床的介入を指し、予防のためにまたは臨床病理の経過の間のいずれかに実施され得る。処置の治療的効果として、限定されないが、疾患の発症または再発を防止すること、症状の軽減、疾患の任意の直接的または間接的な病理学的転帰の消失、転移を防止すること、疾患の進行速度を低下させること、疾患状態の軽快または緩和、および寛解または予後改善が挙げられる。疾患または障害の進行を防止することによって、処置は、罹患したもしくは診断された対象または障害を有することが疑われる対象において障害による悪化を防止することができるが、処置は、障害のリスクを有する対象または障害を有することが疑われる対象において障害または障害の症状の発症を防止することもできる。
5.2 幹細胞を分化させる方法
本開示の主題は、幹細胞(例えば、ヒト幹細胞)の分化を誘導するためのin vitro方法を提供する。ある特定の実施形態では、幹細胞は、多能性幹細胞である。ある特定の実施形態では、幹細胞は、ヒト幹細胞である。ある特定の実施形態では、幹細胞は、ヒト多能性幹細胞である。ヒト幹細胞の非限定的な例として、ヒト胚性幹細胞(hESC)、ヒト多能性幹細胞(hPSC)、ヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)、ヒト単為生殖幹細胞、始原生殖細胞様多能性幹細胞、胚盤葉上層幹細胞、Fクラス多能性幹細胞、体性幹細胞、がん幹細胞、または系統特異的分化が可能な任意の他の細胞が挙げられる。ある特定の実施形態では、ヒト幹細胞は、ヒト胚性幹細胞(hESC)である。ある特定の実施形態では、ヒト幹細胞は、ヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)である。ある特定の実施形態では、幹細胞は、これらに限定されないが、哺乳動物幹細胞、霊長類幹細胞、またはげっ歯類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、ブタ、ウシ、ヒツジなどに由来する幹細胞を含む非ヒト幹細胞である。
ある特定の実施形態では、本開示の主題は、in vitro幹細胞由来成長ホルモン産生細胞(例えば、GH産生成長ホルモン産生細胞)を作製する方法に関する。ある特定の実施形態では、幹細胞の、成長ホルモン産生細胞へのin vitroでの分化は、3つのフェーズ:(a)幹細胞の、下垂体前駆細胞へのin vitroでの分化、(b)下垂体前駆細胞の、Pit1を発現する細胞(Pit1細胞)へのin vitroでの分化;および(c)Pit1細胞の、GH産生成長ホルモン産生細胞へのin vitroでの分化を含む。
ある特定の実施形態では、本開示の主題は、下垂体前駆細胞の、成長ホルモン産生細胞(例えば、GH産生成長ホルモン産生細胞)への分化を誘導する方法に関する。ある特定の実施形態では、方法は、下垂体前駆細胞の、Pit1を発現する細胞(Pit1細胞)へのin vitroでの分化;およびPit1細胞の、GH産生成長ホルモン産生細胞へのin vitroでの分化を含む。
これらに限定されないが、Zimmer, et al., Stem Cell Report (2016);6:858−872、および2017年9月7日に出願された米国特許仮出願第62/555,629号に開示されたものを含む、幹細胞の、下垂体前駆細胞へのin vitroでの分化のための任意の好適な方法を、本開示の方法の第1のフェーズで使用することができる。
ある特定の実施形態では、幹細胞の集団は、下垂体前駆細胞の集団へとin vitroで分化され、これは、Pit1細胞の集団へとin vitroで分化され、これは、成長ホルモン産生細胞の集団へとさらにin vitroで分化される。
本開示の方法は、Wntシグナル伝達の活性化剤(「Wnt活性化剤」と称される;例えば、CHIR99021)によって、Wnt/β−カテニンシグナル伝達を上方調節することによりPit1誘導が増強され得る;FGFシグナル伝達の活性化剤(「FGF活性化剤」と称される、例えば、FGF8)によって、Prop1が維持され、Pit1が下方調節される一方でPOMCが上方調節され得、この作用が骨形成タンパク質(BMP)分子(例えば、BMP2)によってアンタゴナイズされ得る;ならびにFGF活性化剤、BMP分子およびWnt活性化剤の組合せ(例えば、FGF8、BMP2およびCHIRの組合せ)によってGH1の発現が促進され得るという本発明者らの発見に少なくとも基づく。図4〜6を参照されたい。さらに、Pit1細胞によって、成長ホルモン産生細胞、プロラクチン産生細胞および甲状腺刺激ホルモン産生細胞がもたらされ得る(Tabar et al., Cell Stem Cell. (2011 Dec 2);9(6):490−1)。本発明者らは、Pit1細胞の、成長ホルモン産生細胞への選択的分化を誘導することが可能である以下の分子を発見した:レチノイン酸(副腎皮質刺激ホルモン産生細胞(corticotroph)によって発現されたPOMCを抑制し、GH1の発現を促進する)、コルチコステロイド(例えば、デキサメタゾン)および甲状腺ホルモン(例えば、T3)(PRL(プロラクチン産生細胞(lactotroph)によって発現される)およびTSH(甲状腺刺激ホルモン産生細胞(thyrotroph)によって発現される)を阻害する一方で、GH1の発現を促進する)、ERアゴニスト(例えば、DPN)(GH1の発現を促進する)、GHRHシグナル伝達経路のアゴニスト(例えば、GHRH、c−AMP)(GH1の発現を促進する)、Ghrelinシグナル伝達経路のアゴニスト(例えば、Ghrelin)(GH1の発現を促進する)およびインターロイキン(例えば、IL−6)(GH1の発現を促進する)。
5.2.1.幹細胞を下垂体前駆体へと分化させる方法
ある特定の実施形態では、幹細胞を、下垂体前駆体、下垂体プラコード前駆体または下垂体細胞へと分化させる。ある特定の実施形態では、下垂体前駆体は、下垂体前葉前駆体である。ある特定の実施形態では、幹細胞を、下垂体前駆体、下垂体細胞、または下垂体プラコード前駆体へと分化させ、幹細胞を、有効量の、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤および有効量の、BMPシグナル伝達の1つまたは複数の活性化剤(BMP活性化剤、例えば、BMP分子)と接触させ、細胞を、有効量の、Sonic Hedgehog(SHH)シグナル伝達の1つまたは複数の活性化剤(SHH活性化剤)および有効量の、FGFシグナル伝達の1つ、2つまたはそれより多い活性化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、有効量の、Small Mothers Against Decapentaplegic(SMAD)シグナル伝達を阻害することが可能である1つまたは複数の阻害剤(「SMAD阻害剤」)とさらに接触させる。
ある特定の実施形態では、FGFシグナル伝達の活性化剤は、FGF8およびFGF10シグナル伝達を活性化する。ある特定の実施形態では、FGFシグナル伝達の活性化剤は、FGF18シグナル伝達をさらに活性化する。FGF活性化剤の非限定的な例として、FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF7、FGF8、FGF10、FGF18、その誘導体、およびそれらの混合物が挙げられる。ある特定の実施形態では、分化方法は、細胞を、2種のFGF活性化剤と接触させるステップを含む。ある特定の実施形態では、2種のFGF活性化剤は、FGF8およびFGF10である。ある特定の実施形態では、分化方法は、細胞を、3種のFGF活性化剤と接触させるステップを含む。ある特定の実施形態では、3種のFGF活性化剤は、FGF8、FGF10、およびFGF18である。
ある特定の実施形態では、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤は、TGFβ、BMP、Nodal、およびアクチビンを含むリガンドを中和するか、または受容体および下流のエフェクターをブロックすることによりそれらのシグナル経路をブロックする。TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の阻害剤の非限定的な例は、参照によりその全体が組み込まれる、WO2011/149762、Chambers (2009)、およびChambers (2012)に開示されている。ある特定の実施形態では、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤は、SB431542、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される小分子である。ある特定の実施形態では、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤は、SB431542である。
「SB431542」は、CAS番号 301836−41−9、分子式C2218、および4−[4−(1,3−ベンゾジオキソール−5−イル)−5−(2−ピリジニル)−1H−イミダゾール−2−イル]−ベンズアミドという名称を有する分子を指し、例えば、以下の構造:
を参照されたい。
SMAD阻害剤の非限定的な例は、参照によりその全体が組み込まれている、WO2011/149762、Chambers (2009)、およびChambers (2012)に開示されている。SMAD阻害剤の非限定的な例として、LDN193189、Noggin、Dorsomorphin、K02288、DMH1、ML347、LDN212854、その誘導体、およびそれらの混合物、ならびに他のBMP阻害剤が挙げられる。ある特定の実施形態では、SMADシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤は、LDN193189、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される小分子である。ある特定の実施形態では、1つまたは複数のSMAD阻害剤は、LDN193189である。
「LDN193189」は、以下の式を有する化学式C2522を有する、IUPAC名4−(6−(4−(ピペラジン−1−イル)フェニル)ピラゾロ[1,5−a]ピリミジン−3−イル)キノリンの、小分子DM−3189を指す。
LDN193189は、SMADシグナル伝達阻害剤として機能することが可能である。LDN193189はまた、ALK2、ALK3、およびALK6、プロテインチロシンキナーゼ(PTK)の極めて強力な小分子阻害剤であり、I型TGFβ受容体のALK1およびALK3ファミリーのメンバーのシグナル伝達を阻害し、骨形成タンパク質(BMP)BMP2、BMP4、BMP6、BMP7、およびアクチビンサイトカインシグナルを含む多数の生物学的シグナルの伝達ならびにその後のSmad1、Smad5およびSmad8のSMADリン酸化の阻害を生じさせる(参照により本明細書に組み込まれる、Yu et al. (2008) Nat Med 14:1363−1369;Cuny et al. (2008) Bioorg. Med. Chem. Lett. 18: 4388−4392)。
ある特定の実施形態では、BMP活性化剤は、BMP分子である。BMP活性化剤の非限定的な例として、BMP1、BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8a、BMP8b、BMP10、BMP11、BMP15、その誘導体、およびそれらの混合物が挙げられる。ある特定の実施形態では、1つまたは複数のBMP活性化剤は、BMP4を含む。
ある特定の実施形態では、SHHシグナル伝達の活性化剤は、Sonic hedgehog(SHH)、C25IIおよびスムーズンド(SMO)受容体小分子アゴニスト、例えば、パルモルファミン、スムーズンドアゴニスト(SAG)(例えば、Stanton et al, Mol Biosyst. 2010 Jan;6(1):44−54に開示されているような)、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、SHHシグナル伝達の1つまたは複数の活性化剤は、SHHを含む。ある特定の実施形態では、SHHシグナル伝達の1つまたは複数の活性化剤は、SAGを含む。
ある特定の実施形態では、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤を、少なくとも約3日、少なくとも約4日、少なくとも約5日、少なくとも約6日、少なくとも約7日、少なくとも約8日、少なくとも約9日、少なくとも約10日、少なくとも約11日、少なくとも約12日、少なくとも約13日、少なくとも約14日、少なくとも約15日、少なくとも約16日、少なくとも約17日、少なくとも約18日、少なくとも約19日、または少なくとも約20日間、幹細胞と接触させて(またはそれに曝露させて)、下垂体前駆細胞を得る。ある特定の実施形態では、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤を、最長約3日、最長約4日、最長約5日、最長約6日、最長約7日、最長約8日、最長約9日、最長約10日、最長約11日、最長約12日、最長約13日、最長約14日、最長約15日、最長約16日、最長約17日、最長約18日、最長約19日、または最長約20日間、幹細胞と接触させて(またはそれに曝露させて)、下垂体前駆細胞を得る。ある特定の実施形態では、細胞を、約3日間、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤と接触させて、下垂体前駆細胞を得る。ある特定の実施形態では、細胞を、約4日間、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤と接触させて、下垂体前駆細胞を得る。ある特定の実施形態では、細胞を、少なくとも約5日間、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤と接触させて、下垂体前駆細胞を得る。ある特定の実施形態では、細胞を、約8日間、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の阻害剤と接触させて、下垂体前駆細胞を得る。ある特定の実施形態では、細胞を、9日間、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の阻害剤と接触させて、下垂体前駆細胞を得る。
ある特定の実施形態では、1つまたは複数のBMP活性化剤を、少なくとも約2日、少なくとも約3日、少なくとも約4日、もしくは少なくとも約5日間、および/または最長約3日、最長約4日、最長約5日間幹細胞と接触させて(またはそれに曝露させて)、下垂体前駆細胞を得る。ある特定の実施形態では、1つまたは複数のBMP活性化剤を、少なくとも約2日間および/または最長約4日間幹細胞と接触させて(またはそれに曝露させて)、下垂体前駆細胞を得る。ある特定の実施形態では、1つまたは複数のBMP活性化剤を、約3日間幹細胞と接触させて(またはそれに曝露させて)、下垂体前駆細胞を得る。ある特定の実施形態では、1つまたは複数のBMP活性化剤を、4日間幹細胞と接触させて(またはそれに曝露させて)、下垂体前駆細胞を得る。
ある特定の実施形態では、SHHシグナル伝達の1つまたは複数の活性化剤およびFGFシグナル伝達の1つ、2つ、またはそれより多い活性化剤、ならびに必要に応じて1つまたは複数のSMAD阻害剤を、少なくとも約2日、少なくとも約3日、少なくとも約4日、少なくとも約5日、少なくとも約6日、少なくとも約7日、少なくとも約8日、少なくとも約9日、または少なくとも約10日間、細胞と接触させて、下垂体前駆細胞を得る。ある特定の実施形態では、細胞を、最長約4日、最長約5日、最長約6日、最長約7日、最長約8日、最長約9日、最長約10日、最長約11日、最長約12日、最長約13日、最長約14日、最長約15日、最長約16日、最長約17日、最長約18日、最長約19日、または最長約20日間、SHHシグナル伝達の1つまたは複数の活性化剤およびFGFシグナル伝達の1つ、2つまたはそれより多い活性化剤、ならびに必要に応じて1つまたは複数のSMAD阻害剤と接触させて、下垂体前駆細胞を得る。ある特定の実施形態では、SHHシグナル伝達の1つまたは複数の活性化剤およびFGFシグナル伝達の1つ、2つまたはそれより多い活性化剤、ならびに必要に応じて1つまたは複数のSMAD阻害剤を、少なくとも約2日間、細胞に接触させて、下垂体前駆細胞を得る。ある特定の実施形態では、SHHシグナル伝達の1つまたは複数の活性化剤およびFGFシグナル伝達の1つ、2つまたはそれより多い活性化剤、ならびに必要に応じて1つまたは複数のSMAD阻害剤を、少なくとも約5日間、細胞と接触させて、下垂体前駆細胞を得る。ある特定の実施形態では、SHHシグナル伝達の1つまたは複数の活性化剤およびFGFシグナル伝達の1つ、2つまたはそれより多い活性化剤、ならびに必要に応じて1つまたは複数のSMAD阻害剤を、6日間、細胞と接触させて、下垂体前駆細胞を得る。
ある特定の実施形態では、SHHの1つまたは複数の活性化剤およびFGFの1つ、2つまたはそれより多い活性化剤、ならびに必要に応じて1つまたは複数のSMAD阻害剤を、少なくとも約2日、約3日、約4日、約5日、もしくは約6日間、および/または幹細胞の、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤との最初の接触から約数日以内に、約4日以内に、約5日以内に、約6日以内に、約7日以内に、約8日以内に、約9日以内に、もしくは約10日以内に細胞と最初に接触させて(それに曝露させて)、下垂体前駆細胞を得る。ある特定の実施形態では、SHHの1つまたは複数の活性化剤およびFGFの1つ、2つまたはそれより多い活性化剤、ならびに必要に応じて1つまたは複数のSMAD阻害剤を、少なくとも約2日間および/または幹細胞の、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤との最初の接触から約5日以内に細胞と最初に接触させて(それに曝露させて)、下垂体前駆細胞を得る。ある特定の実施形態では、SHHの1つまたは複数の活性化剤およびFGFの1つ、2つまたはそれより多い活性化剤、ならびに必要に応じて1つまたは複数のSMAD阻害剤を、幹細胞の、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤との最初の接触から約3日間、細胞と最初に接触させて、下垂体前駆細胞を得る。ある特定の実施形態では、SHHの1つまたは複数の活性化剤およびFGFの1つ、2つまたはそれより多い活性化剤、ならびに必要に応じて1つまたは複数のSMAD阻害剤を、幹細胞の、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤との最初の接触から4日間、細胞と最初に接触させて(それに曝露させて)、下垂体前駆細胞を得る。ある特定の実施形態では、SHHの1つまたは複数の活性化剤および1つ、2つまたはそれより多い(例えば、3つの)FGF活性化剤、ならびに1つまたは複数のSMAD阻害剤を、幹細胞の、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤との最初の接触から約3日間、細胞と最初に接触させて、下垂体前駆細胞を得る。
ある特定の実施形態では、細胞を、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤および1つまたは複数のBMP活性化剤と同時に接触させる(それに曝露させる)。ある特定の実施形態では、細胞を、SHHの1つまたは複数の活性化剤およびFGFの1つ、2つまたはそれより多い活性化剤、ならびに必要に応じて1つまたは複数のSMAD阻害剤と同時に接触させる(それに曝露させる)。
ある特定の実施形態では、細胞を、約1μMから20μMの間、約2μMから18μMの間、約4から16μMの間、約6μMから14μMの間、または約8μMから12μMの間の濃度のTGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の阻害剤と接触させる(それに曝露させる)。ある特定の実施形態では、細胞を、約10μMの濃度のTGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の阻害剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約10μMの濃度のSB43152に接触させる。
ある特定の実施形態では、BMPシグナル伝達の活性化剤またはBMP分子を、約0.01ng/mlから10ng/mlの間、約0.1ng/mlから8ng/mLの間、約1ng/mlから10ng/mLの間、約1ng/mlから6ng/mLの間、約1ng/mlから5ng/mLの間、または約2ng/mlから5ng/mLの間の濃度の細胞と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約1ng/mlから10ng/mLの間の濃度のBMPシグナル伝達の活性化剤またはBMP分子と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約5ng/mLの濃度のBMPシグナル伝達の活性化剤またはBMP分子と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約5ng/mLの濃度のBMP4に接触させる。
ある特定の実施形態では、細胞を、それぞれ約10ng/mlから200ng/mLの間、約20ng/mlから150ng/mLの間、約30ng/mlから100ng/mLの間、または約40ng/mlから75ng/mLの間の濃度のFGFシグナル伝達の2つまたはそれより多い活性化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約50ng/mL、または約100ng/mLの濃度のFGFシグナル伝達の1つまたは複数の活性化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約100ng/mLの濃度のFGF8と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約50ng/mLの濃度のFGF10と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約50ng/mLの濃度のFGF18と接触させる。
ある特定の実施形態では、細胞を、約10ng/mlから400ng/mLの間、約50ng/mlから350ng/mLの間、約50ng/mlから250ng/mLの間、約100ng/mlから300ng/mLの間、約150ng/mlから250ng/mLの間、または約50ng/mlから200ng/mLの間の濃度のSHHシグナル伝達の1つまたは複数の活性化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約50ng/mlから200ng/mLの間の濃度のSHHシグナル伝達の1つまたは複数の活性化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約200ng/mLの濃度のSHHシグナル伝達の1つまたは複数の活性化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約100ng/mLの濃度のSHHシグナル伝達の1つまたは複数の活性化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約100ng/mLの濃度のSHHと接触させる。
ある特定の実施形態では、細胞を、約10nMから400nMの間、約50nMから350nMの間、約50nMから250nMの間、約100nMから300nMの間、約50nMから200nMの間、または約150nMから250nMの間の濃度のSHHシグナル伝達の1つまたは複数の活性化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約50nMから200nMの間の濃度のSHHシグナル伝達の1つまたは複数の活性化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約200nMの濃度のSHHシグナル伝達の1つまたは複数の活性化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約100nMの濃度のSHHシグナル伝達の1つまたは複数の活性化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約100nMの濃度のSAGと接触させる。
ある特定の実施形態では、細胞を、約10nMから300nMの間、約10nMから100nMの間、約10nMから50nMの間、約20nMから50nMの間、約20nMから40nMの間、約10nMから30nMの間、約30nMから50nMの間、約50nMから100nMの間、約50nMから60nMの間、約50nMから80nMの間、約60nMから80nMの間、約100nMから200nMの間、約100nMから150nMの間、約150nMから200nMの間、約200nMから300nMの間、約200nMから250nMの間、または約250nMから300nMの間の濃度の1つまたは複数のSMAD阻害剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約10nMから30nMの間の濃度の1つまたは複数のSMAD阻害剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約25nMの濃度の1つまたは複数のSMAD阻害剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約25nMの濃度のLDN193189と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約200nMから250nMの間の濃度の1つまたは複数のSMAD阻害剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約250nMの濃度の1つまたは複数のSMAD阻害剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約250nMの濃度のLDN193189と接触させる。
ある特定の実施形態では、細胞を、毎日、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤、1つまたは複数のBMP活性化剤、1つまたは複数のSHH活性化剤、2つまたはそれより多いFGF活性化剤、および1つまたは複数のSMAD阻害剤のそれぞれと接触させる(またはそれに曝露させる)。ある特定の実施形態では、細胞を、1日おきに、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤、1つまたは複数のBMP活性化剤、1つまたは複数のSHH活性化剤、2つまたはそれより多いFGF活性化剤、および1つまたは複数のSMAD阻害剤のそれぞれと接触させる(またはそれに曝露させる)。ある特定の実施形態では、細胞を、毎日、1つまたは複数のBMP活性化剤と接触させる(またはそれに曝露させる)。ある特定の実施形態では、細胞を、0日目から2日目まで毎日、かつ3日目以降は1日おきに、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤と接触させる(またはそれに曝露させる)。ある特定の実施形態では、細胞を、1日おきに、1つまたは複数のSHH活性化剤、2つまたはそれより多いFGF活性化剤、および1つまたは複数のSMAD阻害剤と接触させる(またはそれに曝露させる)。
ある特定の実施形態では、分化細胞は、検出可能なレベルの1つまたは複数の下垂体前駆細胞マーカーを発現する。下垂体前駆細胞マーカーの非限定的な例として、SIX1、LHX3、LHX4、PITX1、PITX2、HESX1、PROP1、SIX6、TBX19、およびPAX6、GATA2、およびSF1が挙げられる。ある特定の実施形態では、分化細胞は、細胞の、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤との最初の接触から少なくとも約5日、少なくとも約6日、少なくとも約7日、少なくとも約8日、約9日、約10日、約15日、または約30日後に、検出可能なレベルの1つまたは複数の下垂体前駆細胞マーカー(例えば、下垂体前葉前駆細胞マーカー)を発現する。ある特定の実施形態では、分化細胞は、細胞の、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤との最初の接触から少なくとも約5日で、検出可能なレベルの1つまたは複数の下垂体前駆細胞マーカー(例えば、下垂体前葉前駆細胞マーカー)を発現する。ある特定の実施形態では、分化細胞は、細胞の、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤との最初の接触から約8日で、検出可能なレベルの1つまたは複数の下垂体前駆細胞マーカー(例えば、下垂体前葉前駆細胞マーカー)を発現する。ある特定の実施形態では、約50%、約60%、約70%、約80%、または約90%を超える細胞の集団(例えば、細胞の、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤との最初の接触から約8日、約9日、約10日、約15日、または約30日の)が、検出可能なレベルの、1つまたは複数の下垂体前駆細胞マーカー(例えば、下垂体前葉前駆細胞マーカー)を発現する。ある特定の実施形態では、約70%を超える分化細胞が、検出可能なレベルの1つまたは複数の下垂体前駆細胞マーカー(例えば、下垂体前葉前駆細胞マーカー)を発現する。
ある特定の実施形態では、幹細胞の、下垂体細胞、下垂体前駆体または下垂体プラコード前駆体への分化を誘導する方法は、幹細胞を、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤(例えば、10μMのSB431542)およびBMPシグナル伝達の1つまたは複数の活性化剤(例えば、5ng/mLのBMP4)と接触させるステップ(例えば、約3日間(例えば、3または4日間))と、細胞を、SHHシグナル伝達の1つまたは複数の活性化剤(例えば、100ng/mLのSHHまたは100nMのSAG)、FGFシグナル伝達の2つまたはそれより多い(例えば、3つの)活性化剤(例えば、100ng/mLのFGF8、50ng/mLのFGF10、および50ng/mLのFGF18)、ならびに1つまたは複数のSMAD阻害剤(例えば、250nMのLDN193189)と接触させるステップ(例えば、約5日間(例えば、5または6日間))とを含む。ある特定の実施形態では、SHH活性化剤(複数可)、FGF活性化剤(複数可)およびSMAD阻害剤(複数可)の細胞との最初の接触は、幹細胞の、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤との最初の接触から約3日(例えば、3または4日)であり、細胞を、約5日間(例えば、5または6日間)、SHH活性化剤(複数可)、FGF活性化剤(複数可)およびSMAD阻害剤(複数可)と接触させる(それに曝露させる)。
5.2.2.下垂体前駆体をPit1細胞へと分化させる方法
ある特定の実施形態では、下垂体前駆体(例えば、項目5.2.1に記載の方法から得られた分化細胞)を、Pit1(「POUドメイン、クラス1、転写因子1(「Poulf1」)としても公知)を発現する細胞、すなわち、「Pit1細胞」へと分化させる。Pit1は、哺乳動物における下垂体の発生とホルモンの発現を担う下垂体特異的転写因子であり、哺乳動物の発生を調節する転写因子のPOUファミリーのメンバーである。マウスの下垂体発生中、Pit1は、Prop1の発現が低下した後に出現することが分かっており、Prop1のPit1への遷移は、標的因子Axin2によって示されるFGF8およびBMP2およびWnt/β−カテニングシグナル伝達の存在に付随して起こることが分かっている(Dasen JS et al., Annu Rev Neurosci. (2001);24:327−55;Olson et al., Cell. (2006 May 5);125(3):593−605)。Wnt/β−カテニンシグナル伝達は、Pit1系統の決定に必要とされ、Wnt/β−カテニン/Prop1複合体は、HESX1を抑制し、Pit1を活性化するのに必要とされる(Olson et al., 2006)。
ある特定の実施形態では、本開示の主題は、下垂体前駆体の、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、または少なくとも約90%、および最大約100%のPit1細胞を含む第1の細胞集団への分化を誘導する方法を提供する。ある特定の実施形態では、方法は、下垂体前駆体を、有効量の1つまたは複数の背方化剤および有効量の1つまたは複数の腹方化剤と接触させるステップと;細胞を、有効量の、Wntシグナル伝達の1つまたは複数の活性化剤(「Wnt活性化剤」と称される)と接触させるステップとを含む。ある特定の実施形態では、方法は、下垂体前駆体を、有効量の、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤と接触させるステップをさらに含む。ある特定の実施形態では、方法は、細胞を、有効量の、エストロゲン受容体(ER)の1つまたは複数のアゴニスト(「ERアゴニスト」と称される)と接触させるステップをさらに含む。
ある特定の実施形態では、1つまたは複数の背方化剤は、FGFシグナル伝達の活性化剤(「FGF活性化剤」と称される)を含む。FGF活性化剤の非限定的な例として、FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF7、FGF8、FGF10、FGF18、その誘導体、およびそれらの混合物が挙げられる。ある特定の実施形態では、1つまたは複数のFGF活性化剤は、FGF8を含む。
ある特定の実施形態では、1つまたは複数の腹方化剤は、BMPの活性化剤(「BMP活性化剤」と称される)またはBMP分子、例えば、BMP2を含む。BMP活性化剤の非限定的な例として、BMP1、BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8a、BMP8b、BMP10、BMP11、BMP15、その誘導体、およびそれらの混合物が挙げられる。ある特定の実施形態では、1つまたは複数のBMP活性化剤は、BMP2を含む。
本明細書で使用される場合、リガンドに関連する「WNT」または「ウイングレス」という用語は、WNT受容体、例えば、FrizzledおよびLRPDerailed/RYK受容体ファミリーにおける受容体と相互作用することが可能である分泌タンパク質の群(すなわち、ヒトにおけるInt1(integration1))を指す。本明細書で使用される場合、シグナル伝達経路に関する「WNT」または「ウイングレス」という用語は、β−カテニンで媒介されるかまたはβ−カテニンを含まない、WntファミリーリガンドおよびWntファミリー受容体、例えば、FrizzledおよびLRPDerailed/RYK受容体からなるシグナル経路を指す。ある特定の実施形態では、WNTシグナル伝達経路は、β−カテニンによる媒介、例えば、WNT/−カテニンを含む。
ある特定の実施形態では、1つまたは複数のWnt活性化剤は、Wntシグナル伝達の活性化のためにグリコーゲンシンターゼキナーゼ3β(GSK3β)を低下させる。よって、Wnt活性化剤は、GSK3β阻害剤であり得る。GSK3P阻害剤は、WNTシグナル伝達経路を活性化することが可能である。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Cadigan, et al., J Cell Sci. 2006;119:395−402;Kikuchi, et al., Cell Signaling. 2007;19:659−671を参照されたい。本明細書で使用される場合、「グリコーゲンシンターゼキナーゼ3β阻害剤」という用語は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ3β酵素を阻害する化合物を指す。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Doble, et al., J Cell Sci. 2003;116:1175−1186を参照されたい。
Wnt活性化剤またはGSK3β阻害剤の非限定的な例は、参照によりその全体が組み込まれる、WO2011/149762、Chambers (2012)、およびCalder et al., J Neurosci. 2015 Aug 19;35(33):11462−81に開示されている。Wnt活性化剤の非限定的な例として、CHIR99021、WNT3A、Wnt−1、Wnt4、Wnt5a、その誘導体、およびそれらの混合物が挙げられる。ある特定の実施形態では、1つまたは複数のWnt活性化剤は、CHIR99021、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される小分子である。ある特定の実施形態では、1つまたは複数のWnt活性化剤は、CHIR99021を含む。
「CHIR99021」(「アミノピリミジン」または「3−[3−(2−カルボキシエチル)−4−メチルピロール−2−メチリデニル]−2−インドリノン」としても公知)は、以下の式を有する、IUPAC名6−(2−(4−(2,4−ジクロロフェニル)−5−(4−メチル−1H−イミダゾール−2−イル)ピリミジン−2−イルアミノ)エチルアミノ)ニコチノニトリルを指す。
CHIR99021は、非常に選択的であり、関連するおよび関連しないキナーゼの集団に対してほぼ1000倍の選択性を示し、ヒトGSK3βに対してIC50=6.7nMおよびげっ歯類GSK3βホモログに対してナノモル濃度のIC50値を有する。
ある特定の実施形態では、1つまたは複数のERアゴニストは、ERβのアゴニストを含む。ある特定の実施形態では、1つまたは複数のERアゴニストは、ERαのアゴニストを含む。ERβアゴニストの非限定的な例として、ジアリールプロピオニトリル(DPN)、エストラジオール(E2)、プロピルピラゾール−トリオール(PPT)、その誘導体、およびそれらの混合物が挙げられる。ある特定の実施形態では、1つまたは複数のERアゴニストは、DPNを含む。
ある特定の実施形態では、細胞(例えば、下垂体前駆体、下垂体プラコード前駆体)を、幹細胞の、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤との最初の接触から少なくとも約5日、少なくとも約6日、少なくとも約7日、少なくとも約8日、少なくとも約9日、少なくとも約10日、少なくとも約11日、少なくとも約12日、少なくとも約13日、少なくとも約14日、少なくとも約15日、または少なくとも約20日で、1つまたは複数の背方化剤および1つまたは複数の腹方化剤と最初に接触させる。ある特定の実施形態では、細胞(例えば、下垂体前駆体、下垂体プラコード前駆体)を、幹細胞の、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤との最初の接触から少なくとも約5日で、1つまたは複数の背方化剤および1つまたは複数の腹方化剤と最初に接触させる。ある特定の実施形態では、細胞(例えば、下垂体前駆体、下垂体プラコード前駆体)を、幹細胞の、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤との最初の接触から少なくとも約8日で、1つまたは複数の背方化剤および1つまたは複数の腹方化剤と最初に接触させる。ある特定の実施形態では、細胞(例えば、下垂体前駆体、下垂体プラコード前駆体)を、幹細胞の、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤との最初の接触から約8日で、1つまたは複数の背方化剤および1つまたは複数の腹方化剤と最初に接触させる。ある特定の実施形態では、細胞(例えば、下垂体前駆体、下垂体プラコード前駆体)を、幹細胞の、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤との最初の接触から9日で、1つまたは複数の背方化剤および1つまたは複数の腹方化剤と最初に接触させる。
ある特定の実施形態では、細胞(例えば、下垂体前駆体、下垂体プラコード前駆体)を、少なくとも約3日間、少なくとも約4日間、少なくとも約5日間、少なくとも約6日間、少なくとも約7日間、少なくとも約8日間、少なくとも約9日間、少なくとも約10日間、少なくとも約15日間、または少なくとも約20日間、1つまたは複数の背方化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞(例えば、下垂体前駆体、下垂体プラコード前駆体)を、最長約4日間、最長約5日間、最長約6日間、最長約7日間、最長約8日間、最長約9日間、または最長約10日間、1つまたは複数の背方化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞(例えば、下垂体前駆体、下垂体プラコード前駆体)を、最長約4日間または最長約5日間、1つまたは複数の背方化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞(例えば、下垂体前駆体、下垂体プラコード前駆体)を、最長約10日間、1つまたは複数の背方化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞(例えば、下垂体前駆体、下垂体プラコード前駆体)を、少なくとも約3日間、1つまたは複数の背方化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞(例えば、下垂体前駆体、下垂体プラコード前駆体)を、少なくとも約3日間および/または最長約10日間、1つまたは複数の背方化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞(例えば、下垂体前駆体、下垂体プラコード前駆体)を、約4日間、1つまたは複数の背方化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞(例えば、下垂体前駆体、下垂体プラコード前駆体)を、5日間、1つまたは複数の背方化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞(例えば、下垂体前駆体、下垂体プラコード前駆体)を、少なくとも約5日間、1つまたは複数の背方化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞(例えば、下垂体前駆体、下垂体プラコード前駆体)を、約7日間、1つまたは複数の背方化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞(例えば、下垂体前駆体、下垂体プラコード前駆体)を、8日間、1つまたは複数の背方化剤と接触させる。
ある特定の実施形態では、細胞を、少なくとも約5日間、少なくとも約6日間、少なくとも約7日間、少なくとも約8日間、少なくとも約9日間、少なくとも約10日間、少なくとも約15日間、または少なくとも約20日間、1つまたは複数の腹方化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、最長約7日間、最長約8日間、最長約9日間、最長約10日間、最長約11日間、最長約12日間、最長約13日間、最長約14日間、最長約15日間、最長約16日間、最長約17日間、最長約18日間、最長約19日間、または最長約20日間、1つまたは複数の腹方化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、最長約8日間、1つまたは複数の腹方化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、最長約15日間、1つまたは複数の腹方化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、最長約12日間、1つまたは複数の腹方化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、少なくとも約5日間、1つまたは複数の腹方化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約7日間、1つまたは複数の腹方化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、8日間、1つまたは複数の腹方化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、少なくとも約10日間、1つまたは複数の腹方化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約11日間、1つまたは複数の腹方化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞(例えば、下垂体前駆体、下垂体プラコード前駆体)を、12日間、1つまたは複数の腹方化剤と接触させる。
ある特定の実施形態では、細胞(例えば、下垂体前駆体、下垂体プラコード前駆体)を、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤とさらに接触させるかまたはそれに曝露させる。ある特定の実施形態では、細胞(例えば、下垂体前駆体、下垂体プラコード前駆体)を、1つまたは複数の背方化剤およびTGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤と同時に接触させるかまたはそれに曝露させる。ある特定の実施形態では、細胞(例えば、下垂体前駆体、下垂体プラコード前駆体)を、少なくとも約3日間、少なくとも約4日間、少なくとも約5日間、少なくとも約6日間、少なくとも約7日間、少なくとも約8日間、少なくとも約9日間、少なくとも約10日間、少なくとも約15日間、または少なくとも約20日間、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞(例えば、下垂体前駆体、下垂体プラコード前駆体)を、最長約4日間、最長約5日間、最長約6日間、最長約7日間、最長約8日間、最長約9日間、または最長約10日間、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞(例えば、下垂体前駆体、下垂体プラコード前駆体)を、最長約4日間または最長約5日間、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞(例えば、下垂体前駆体、下垂体プラコード前駆体)を、最長約10日間、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞(例えば、下垂体前駆体、下垂体プラコード前駆体)を、少なくとも約3日間および/または最長約10日間、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞(例えば、下垂体前駆体、下垂体プラコード前駆体)を、約4日間、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞(例えば、下垂体前駆体、下垂体プラコード前駆体)を、少なくとも約5日間、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞(例えば、下垂体前駆体、下垂体プラコード前駆体)を、約7日間、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞(例えば、下垂体前駆体、下垂体プラコード前駆体)を、8日間、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤と接触させる。
ある特定の実施形態では、細胞の、1つまたは複数のWnt活性化剤(および必要に応じて、1つまたは複数のERアゴニスト)との最初の接触は、細胞(例えば、下垂体前駆体、下垂体プラコード前駆体)の、1つまたは複数の背方化剤との最初の接触と同じ日に起こる。ある特定の実施形態では、細胞を、細胞(例えば、下垂体前駆体、下垂体プラコード前駆体)の、1つまたは複数の背方化剤との最初の接触から少なくとも約1日、少なくとも約2日、少なくとも約3日、少なくとも約4日、少なくとも約5日、少なくとも約6日、少なくとも約7日、少なくとも約8日、少なくとも約9日、もしくは少なくとも約10日で、および/または約3日以内、約4日以内、約5日以内、約6日以内、約7日以内、約8日以内、約9日以内、もしくは約10日以内に、1つまたは複数のWnt活性化剤(および必要に応じて、1つまたは複数のERアゴニスト)と最初に接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、細胞(例えば、下垂体前駆体、下垂体プラコード前駆体)の、1つまたは複数の背方化剤との最初の接触から少なくとも約2日で、1つまたは複数のWnt活性化剤(および必要に応じて、1つまたは複数のERアゴニスト)と最初に接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、細胞(例えば、下垂体前駆体、下垂体プラコード前駆体)の1つまたは複数の背方化剤との最初の接触から約5日以内に、1つまたは複数のWnt活性化剤(および必要に応じて、1つまたは複数のERアゴニスト)と最初に接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、細胞(例えば、下垂体前駆体、下垂体プラコード前駆体)の、1つまたは複数の背方化剤との最初の接触から少なくとも約2日でおよび約5日以内に、1つまたは複数のWnt活性化剤(および必要に応じて、1つまたは複数のERアゴニスト)と最初に接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、細胞(例えば、下垂体前駆体、下垂体プラコード前駆体)の、1つまたは複数の背方化剤との最初の接触から約4日で、1つまたは複数のWnt活性化剤(および必要に応じて、1つまたは複数のERアゴニスト)と最初に接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、細胞(例えば、下垂体前駆体、下垂体プラコード前駆体)の、1つまたは複数の背方化剤との最初の接触から5日で、1つまたは複数のWnt活性化剤(および必要に応じて、1つまたは複数のERアゴニスト)と最初に接触させる。
ある特定の実施形態では、細胞を、少なくとも約5日間、少なくとも約6日間、少なくとも約7日間、少なくとも約8日間、少なくとも約9日間、少なくとも約10日間、少なくとも約15日間、または少なくとも約20日間、1つまたは複数のWnt活性化剤(および必要に応じて、1つまたは複数のERアゴニスト)と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、最長約7日間、最長約8日間、最長約9日間、最長約10日間、最長約11日間、最長約12日間、最長約13日間、最長約14日間、最長約15日間、最長約16日間、最長約17日間、最長約18日間、最長約19日間、または最長約20日間、1つまたは複数のWnt活性化剤(および必要に応じて、1つまたは複数のERアゴニスト)と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、最長約10日間、1つまたは複数のWnt活性化剤(および必要に応じて、1つまたは複数のERアゴニスト)と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、最長約8日間、1つまたは複数のWnt活性化剤(および必要に応じて、1つまたは複数のERアゴニスト)と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、少なくとも約5日間、1つまたは複数のWnt活性化剤(および必要に応じて、1つまたは複数のERアゴニスト)と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、少なくとも約5日間および最長約10日間、1つまたは複数のWnt活性化剤(および必要に応じて、1つまたは複数のERアゴニスト)と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、少なくとも約7日間、1つまたは複数のWnt活性化剤(および必要に応じて、1つまたは複数のERアゴニスト)と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約7日間、1つまたは複数のWnt活性化剤(および必要に応じて、1つまたは複数のERアゴニスト)と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、8日間、1つまたは複数のWnt活性化剤(および必要に応じて、1つまたは複数のERアゴニスト)と接触させる。
ある特定の実施形態では、細胞を、1つまたは複数の背方化剤、1つまたは複数の腹方化剤、および1つまたは複数のWnt活性化剤、ならびに必要に応じて、1つまたは複数のERアゴニストと同時に接触させる。
ある特定の実施形態では、細胞(例えば、下垂体前駆体、下垂体プラコード前駆体)を、約10ng/mLから200ng/mLの間、約20ng/mLから150ng/mLの間、約50ng/mLから150ng/mLの間、約150ng/mLから200ng/mLの間、約30ng/mLから100ng/mLの間、約50ng/mLから100ng/mLの間、約40ng/mLから75ng/mLの間または約50ng/mLから75ng/mLの間の濃度の1つまたは複数の背方化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞(例えば、下垂体前駆体、下垂体プラコード前駆体)を、約50ng/mLまたは約100ng/mLの濃度の1つまたは複数の背方化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞(例えば、下垂体前駆体、下垂体プラコード前駆体)を、約50ng/mLの濃度の1つまたは複数の背方化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞(例えば、下垂体前駆体、下垂体プラコード前駆体)を、約50ng/mLの濃度のFGF8と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞(例えば、下垂体前駆体、下垂体プラコード前駆体)を、約100ng/mLの濃度の1つまたは複数の背方化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞(例えば、下垂体前駆体、下垂体プラコード前駆体)を、約100ng/mLの濃度のFGF8と接触させる。
ある特定の実施形態では、細胞(例えば、下垂体前駆体、下垂体プラコード前駆体)を、約1ng/mLから30ng/mLの間、約5ng/mLから25ng/mLの間、または約10ng/mLから20ng/mLの間の濃度の1つまたは複数の腹方化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞(例えば、下垂体前駆体、下垂体プラコード前駆体)を、約10ng/mL、または約20ng/mLの濃度の1つまたは複数の腹方化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞(例えば、下垂体前駆体、下垂体プラコード前駆体)を、約20ng/mLの濃度の1つまたは複数の腹方化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞(例えば、下垂体前駆体、下垂体プラコード前駆体)を、約20ng/mLの濃度のBMP2と接触させる。
ある特定の実施形態では、細胞(例えば、下垂体前駆体、下垂体プラコード前駆体)を、約1μMから20μMの間、約2μMから18μMの間、約4μMから16μMの間、約6μMから14μMの間、または約8μMから12μMの間の濃度のTGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の阻害剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞(例えば、下垂体前駆体、下垂体プラコード前駆体)を、約10μMの濃度のTGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の阻害剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約10μMの濃度のSB43152と接触させる。
ある特定の実施形態では、細胞を、約1μMから100μMの、約1μMから20μMの、約1μMから15μMの、約1μMから10μMの、約1μMから5μMの、約5μMから10μMの、約5μMから15μMの、約15μMから20μMの、約20μMから30μMの、約30μMから40μMの、約40μMから50μMの、約50μMから60μMの、約60μMから70μMの、約70μMから80μMの、約80μMから90μMの、または約90μMから100μMの濃度の1つまたは複数のWnt活性化剤(Wnt activator agent)と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約1μMから10μMの濃度の1つまたは複数のWnt活性化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約1μMから5μMの濃度の1つまたは複数のWnt活性化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約3μMの濃度の1つまたは複数のWnt活性化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約3μMの濃度のCHIR99021と接触させる。
ある特定の実施形態では、細胞を、約0.1nMから20nMの間、約0.1nMから10nMの間、約0.1nMから1nMの間、または約0.1nMから0.5nMの間の濃度の1つまたは複数のERアゴニストと接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約0.1nMから0.5nMの間の濃度の1つまたは複数のERアゴニストと接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約0.1nMの濃度の1つまたは複数のERアゴニストと接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約0.1nMの濃度のDPNと接触させる。
ある特定の実施形態では、細胞を、毎日、1つまたは複数の背方化剤、1つまたは複数の腹方化剤、1つまたは複数のWnt活性化剤、1つまたは複数のERアゴニスト、およびTGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤のそれぞれと接触させる(またはそれに曝露させる)。ある特定の実施形態では、細胞を、1日おきに、1つまたは複数の背方化剤、1つまたは複数の腹方化剤、1つまたは複数のWnt活性化剤、1つまたは複数のERアゴニスト、およびTGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤のそれぞれと接触させる(またはそれに曝露させる)。ある特定の実施形態では、方法は、細胞を、1つまたは複数の背方化剤、1つまたは複数の腹方化剤、および1つまたは複数のWnt活性化剤、ならびに必要に応じて、1つまたは複数のERアゴニストおよびTGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤と接触させて、分化細胞の第1の細胞集団を得るステップであって、約50%を超える、約60%を超える、約70%を超える、約80%を超える、または約90%を超える分化細胞が、細胞(例えば、下垂体前駆体、下垂体プラコード前駆体)の、1つまたは複数の背方化剤との最初の接触から少なくとも約5日、少なくとも約6日、少なくとも約7日、少なくとも約8日、少なくとも約9日、少なくとも約10日、少なくとも約11日、少なくとも約12日、少なくとも約13日、少なくとも約14日、または約15日で、検出可能なレベルのPit1を発現する、ステップを含む。ある特定の実施形態では、約70%を超える分化細胞は、検出可能なレベルのPit1を発現する。ある特定の実施形態では、方法は、細胞(例えば、下垂体前駆体、下垂体プラコード前駆体)の、1つまたは複数の背方化剤との最初の接触から少なくとも約5日で、第1の細胞集団を得るステップを含む。ある特定の実施形態では、方法は、細胞(例えば、下垂体前駆体、下垂体プラコード前駆体)の、1つまたは複数の背方化剤との最初の接触から約7日(例えば、7日または8日)、約10日(例えば、11日または12日)で、第1の細胞集団を得るステップを含む。
ある特定の実施形態では、方法は、幹細胞の、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤との最初の接触から少なくとも約10日、少なくとも約11日、少なくとも約12日、少なくとも約13日、少なくとも約14日、約15日、少なくとも約16日、少なくとも約17日、少なくとも約18日、少なくとも約19日、または少なくとも約20日で、第1の細胞集団を得るステップを含む。ある特定の実施形態では、方法は、細胞の、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤との最初の接触から少なくとも約10日で、第1の細胞集団を得るステップを含む。ある特定の実施形態では、方法は、細胞の、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤との最初の接触から約15日、約16日、約17日、約18日、約19日または約20日で、第1の細胞集団を得るステップを含む。
ある特定の実施形態では、方法は、細胞(例えば、本明細書に開示される1つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する細胞)を、1つまたは複数の背方化剤および1つまたは複数の腹方化剤、ならびに必要に応じて、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤と接触させて、分化細胞の第2の細胞集団を得るステップであって、約50%を超える、約60%を超える、約70%を超える、約80%を超える、または約90%を超える分化細胞が、細胞の、1つまたは複数の背方化剤との最初の接触から少なくとも約2日、約3日、約4日、または約5日で、検出可能なレベルのProp1を発現する、ステップを含む。ある特定の実施形態では、方法は、細胞(例えば、下垂体前駆体、下垂体プラコード前駆体)の、1つまたは複数の背方化剤との最初の接触から少なくとも約2日(例えば、約4日または約5日)で、第2の細胞集団を得るステップを含む。
ある特定の実施形態では、方法は、幹細胞の、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤との最初の接触から少なくとも約10日、少なくとも約11日、少なくとも約12日、少なくとも約13日、少なくとも約14日、または少なくとも約15日で、第2の細胞集団を得るステップを含む。ある特定の実施形態では、方法は、幹細胞の、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤との最初の接触から少なくとも約8日で、第2の細胞集団を得るステップを含む。ある特定の実施形態では、方法は、幹細胞の、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤との最初の接触から約12日で、第2の細胞集団を得るステップを含む。
ある特定の実施形態では、方法は、第2の細胞集団を、1つまたは複数の腹方化剤および1つまたは複数のWnt活性化剤、ならびに必要に応じて、1つまたは複数のERアゴニストと接触させて、第1の細胞集団を得るステップを含む。ある特定の実施形態では、第1の細胞集団は、第2の細胞集団の存在から少なくとも約5日、少なくとも約6日、少なくとも約7日、少なくとも約8日、少なくとも約9日、少なくとも約10日、少なくとも約11日、少なくとも約12日、少なくとも約13日、少なくとも約14日、または少なくとも約15日で得られる。ある特定の実施形態では、第1の細胞集団は、第2の細胞集団の存在から少なくとも約5日で得られる。ある特定の実施形態では、第1の細胞集団は、第2の細胞集団の存在から約7日で得られる。ある特定の実施形態では、第1の細胞集団は、第2の細胞集団の存在から約8日で得られる。ある特定の実施形態では、方法は、細胞(例えば、本明細書に開示される1つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する細胞)を、例えば、細胞(例えば、本明細書に開示される1つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する細胞)の、1つもしくは複数の背方化剤との最初の接触から約7日もしくは約8日で、および/または幹細胞の、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つもしくは複数の阻害剤との最初の接触から約15日もしくは約16日で、1つまたは複数の背方化剤(例えば、50ng/mLのFGF8)、1つまたは複数の腹方化剤(例えば、20ng/mLのBMP2)、1つまたは複数のWnt活性化剤(例えば、3μMのCHIR99021)、および1つまたは複数のERアゴニスト(例えば、0.1nMのDPN)と接触させて、第1の細胞集団を得るステップを含む。ある特定の実施形態では、細胞(例えば、本明細書に開示される1つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する細胞)の、背方化剤(複数可)、腹方化剤(複数可)、Wnt活性化剤(複数可)およびERアゴニスト(複数可)との最初の接触は、幹細胞の、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤との最初の接触から約8日または約9日である。
ある特定の実施形態では、方法は、1つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する細胞(例えば、本明細書に開示されるもの)を、1つまたは複数の背方化剤(例えば、50ng/mLのFGF8または100ng/mL)、1つまたは複数の腹方化剤(例えば、20ng/mLのBMP2)、およびTGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の(one of more)阻害剤(例えば、10μMのSB43152)と接触させるステップと;細胞を、例えば、1つもしくは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する細胞の、1つもしくは複数の背方化剤との最初の接触から少なくとも約10日(例えば、約10日、約11日、または約12日)で、および/または幹細胞の、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つもしくは複数の阻害剤との最初の接触から少なくとも約15日(例えば、約19日または約20日)で、1つまたは複数のWnt活性化剤(例えば、3μMのCHIR99021)および1つまたは複数のERアゴニスト(例えば、0.1nMのDPN)と接触させて、第1の細胞集団を得るステップとを含む。
ある特定の実施形態では、方法は、1つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する細胞(例えば、本明細書に開示されるもの)を、例えば、1つもしくは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する細胞の、1つもしくは複数の背方化剤との最初の接触から少なくとも約4日(例えば、約4日または約5日)で、および/または幹細胞の、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つもしくは複数の阻害剤との最初の接触から少なくとも約10日(例えば、約10日、約11日、または約12日)で、1つまたは複数の背方化剤(例えば、50ng/mLのFGF8または100ng/mLのFGF8)、1つまたは複数の腹方化剤(例えば、20ng/mLのBMP2)、およびTGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の(one of more)阻害剤(例えば、10μMのSB43152)と接触させて、第2の細胞集団を得るステップを含む。
ある特定の実施形態では、方法は、第2の細胞集団を、例えば、第2の細胞集団の存在から少なくとも約7日(例えば、約7日または約8日)で、1つまたは複数の腹方化剤(例えば、20ng/mLのBMP2)、および1つまたは複数のWnt活性化剤(例えば、3μMのCHIR99021)、および1つまたは複数のERアゴニスト(例えば、0.1nMのDPN)と接触させて、第1の細胞集団を得るステップを含む。
5.2.3.Pit1細胞をGH産生成長ホルモン産生細胞へと分化させる方法
ある特定の実施形態では、Pit1細胞(例えば、項目5.2.2に記載の方法から得られる分化細胞)または項目5.2.2に開示されている第1の細胞集団を、GH産生成長ホルモン産生細胞へと分化させる。ある特定の実施形態では、Pit1細胞を、または第1の細胞集団を、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、または少なくとも約90%、および最大約100%のGH産生成長ホルモン産生細胞を含む細胞集団へと分化させ、Pit1細胞を、または第1の細胞集団を、有効量の、成長ホルモン(GH)の発現を誘導することが可能である1つまたは複数の分子(GH誘導剤)と接触させる(またはそれに曝露させる)。GH誘導剤は、非GH系統細胞、例えば、甲状腺刺激ホルモン産生細胞、およびプロラクチン産生細胞を抑制し得る。
GH誘導剤の非限定的な例として、レチノイン酸(RA)、コルチコステロイド、甲状腺ホルモン、ERアゴニスト、GHRHシグナル伝達経路のアゴニスト、Ghrelinシグナル伝達経路のアゴニスト、およびインターロイキン、ならびにその誘導体、ならびにそれらの混合物が挙げられる。
コルチコステロイドの非限定的な例として、デキサメタゾン、コルチゾン、ヒドロコルチゾン、その誘導体、およびそれらの混合物が挙げられる。ある特定の実施形態では、1つまたは複数のコルチコステロイドは、デキサメタゾンを含む。
甲状腺ホルモンの非限定的な例として、T3、T4、その誘導体、およびそれらの混合物が挙げられる。ある特定の実施形態では、1つまたは複数の甲状腺ホルモンは、T3を含む。
GHRHシグナル伝達経路のアゴニストの非限定的な例として、GHRH、c−AMP(例えば、ジブチリル−cAMP)、PKA、CREB、MAPK活性化剤、その誘導体、およびそれらの混合物が挙げられる。ある特定の実施形態では、1つまたは複数のGHRHシグナル伝達経路のアゴニストは、GHRH、c−AMP、またはそれらの組合せを含む。
Ghrelinシグナル伝達経路のアゴニストの非限定的な例として、Ghrelin、GHSRアゴニスト、その誘導体およびそれらの混合物が挙げられる。ある特定の実施形態では、1つまたは複数のGhrelinシグナル伝達経路のアゴニストは、Ghrelinを含む。
インターロイキンの非限定的な例として、IL−1、IL−2、IL−3、IL−4、IL−5、IL−6、IL−7、IL−8、IL−9、IL−10、IL−11、IL−12、IL−13、IL−15、およびこれらの組合せが挙げられる。ある特定の実施形態では、1つまたは複数のインターロイキンは、IL−1、IL6、IL−10、およびこれらの組合せからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、1つまたは複数のインターロイキンは、IL−6を含む。
RAは、副腎皮質刺激ホルモン産生細胞によって発現されるPOMCを抑制し、成長ホルモン産生細胞によって発現されるGH1の発現を促進し得る。コルチコステロイド(例えば、デキサメタゾン)および甲状腺ホルモン(例えば、T3)は、GH1の発現を促進する一方で、PRL(プロラクチン産生細胞によって発現される)および/またはTSH(甲状腺刺激ホルモン産生細胞によって発現される)を阻害し得る。
ある特定の実施形態では、Pit1細胞を、または第1の細胞集団を、1、2、3、4、5、6、または7つのGH誘導剤と接触させる。ある特定の実施形態では、Pit1細胞を、または第1の細胞集団を、4つのGH誘導剤、例えば、RA、コルチコステロイド、甲状腺ホルモン、および1つのGHRHシグナル伝達経路のアゴニスト(例えば、GHRH)と接触させる。ある特定の実施形態では、Pit1細胞を、または第1の細胞集団を、5つのGH誘導剤、例えば、RA、コルチコステロイド、甲状腺ホルモン、および2つのGHRHシグナル伝達経路のアゴニスト(例えば、GHRHおよびcAMP)と接触させる。ある特定の実施形態では、Pit1細胞を、または第1の細胞集団を、5つのGH誘導剤、例えば、RA、コルチコステロイド、甲状腺ホルモン、1つのGHRHシグナル伝達経路のアゴニスト(例えば、GHRH)、および1つのGhrelinシグナル伝達経路のアゴニスト(例えば、Ghrelin)と接触させる。ある特定の実施形態では、Pit1細胞を、または第1の細胞集団を、6つのGH誘導剤、例えば、RA、コルチコステロイド、甲状腺ホルモン、および2つのGHRHシグナル伝達経路のアゴニスト(例えば、GHRHおよびcAMP)、および1つのERアゴニスト(例えば、DPN)と接触させる。ある特定の実施形態では、Pit1細胞を、または第1の細胞集団を、6つのGH誘導剤、例えば、RA、コルチコステロイド、甲状腺ホルモン、1つのGHRHシグナル伝達経路のアゴニスト(例えば、GHRH)、1つのGhrelinシグナル伝達経路のアゴニスト(例えば、Ghrelin)、および1つのERアゴニスト(例えば、DPN)と接触させる。
ある特定の実施形態では、細胞を、約0.05μMから10μMの、約0.05μMから0.1μMの、約0.1μMから10μMの、約0.1μMから5μMの、約0.1μMから3μMの、約0.1μMから2μMの、約0.1μMから1μMの、または約5μMから10μMの濃度のRAと接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約0.1μMから1μMの濃度のRAと接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約0.05μMから0.1μMの濃度のRAと接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約1μMの濃度のRAと接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約0.1μMの濃度のRAと接触させる。
ある特定の実施形態では、細胞を、約1nMから20nMの間、約2nMから18nMの間、約4nMから16nMの間、約6nMから14nMの間、または約8nMから12nMの間の濃度の1つまたは複数の甲状腺ホルモンと接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約10nMの濃度の1つまたは複数の甲状腺ホルモンと接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約10nMの濃度のT3と接触させる。
ある特定の実施形態では、細胞を、約0.1μMから10μMの、約0.1μMから5μMの、約0.1μMから3μMの、約0.1μMから2μMの、約0.1μMから1μMの、または約5μMから10μMの濃度の1つまたは複数のコルチコステロイドと接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約0.1μMから10μMの濃度の1つまたは複数のコルチコステロイドと接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約0.1μMから1μMの濃度の1つまたは複数のコルチコステロイドと接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約1μMの濃度のコルチコステロイドと接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約1μMの濃度のデキサメタゾンと接触させる。
ある特定の実施形態では、細胞を、約0.01μMから10μMの、約0.01μMから0.05μMの、約0.01μMから0.1μMの、約0.1μMから10μMの、約0.1μMから5μMの、約0.1μMから3μMの、約0.1μMから2μMの、約0.1μMから1μMの、約5μMから10μMの、約10μg/mLから200μg/mLの間、約20μg/mLから150μg/mLの間、約50μg/mLから150μg/mLの間、約50μg/mLから100μg/mLの間、または約100μg/mLから200μg/mLの間の濃度の1つまたは複数のGHRHシグナル伝達経路のアゴニストと接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約1μMの濃度の1つまたは複数のGHRHシグナル伝達経路のアゴニストと接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約1μMの濃度のGHRHと接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約0.01μMの濃度の1つまたは複数のGHRHシグナル伝達経路のアゴニストと接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約0.01μMの濃度のGHRHと接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約100μg/mLの濃度の1つまたは複数のGHRHシグナル伝達経路のアゴニストと接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約100μg/mLの濃度のcAMPと接触させる。
ある特定の実施形態では、細胞を、約0.1nMから20nMの間、約0.1nMから10nMの間、約0.1nMから1nMの間、または約0.1nMから0.5nMの間の濃度の1つまたは複数のERアゴニストと接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約0.1nMから約0.5nMの間の濃度の1つまたは複数のERアゴニストと接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約0.1nMの濃度の1つまたは複数のERアゴニストと接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約0.1nMの濃度のDPNと接触させる。
ある特定の実施形態では、細胞を、約1nMから100nMの間、約1nMから50nMの間、約1nMから30nMの間、約1nMから20nMの間、約1nMから15nMの間、約5nMから20nMの間、約5nMから15nMの間、約20nMから30nMの間、約30nMから40nMの間、約40nMから50nMの間、または約50nMから100nMの間の濃度の1つまたは複数のGhrelinシグナル伝達経路のアゴニストと接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約5nMから15nMの間の濃度の1つまたは複数のGhrelinシグナル伝達経路のアゴニストと接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約10nMの濃度の1つまたは複数のGhrelinシグナル伝達経路のアゴニストと接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約10nMの濃度のGhrelinと接触させる。
ある特定の実施形態では、細胞を、約1ng/mlから100ng/mlの間、約1ng/mlから50ng/mlの間、約1ng/mlから30ng/mlの間、約1ng/mlから25ng/mlの間、約5ng/mlから30ng/mlの間、約10ng/mlから30ng/mlの間、約10ng/mlから25ng/mlの間、約20ng/mlから25ng/mlの間、約30ng/mlから40ng/mlの間、約40ng/mlから50ng/mlの間、または約50ng/mlから100ng/mlの間の濃度の1つまたは複数のインターロイキンと接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約10ng/mlから30ng/mlの間の濃度の1つまたは複数のインターロイキンと接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約25ng/mlの濃度の1つまたは複数のインターロイキンと接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約25ng/mlの濃度のIL−6と接触させる。
ある特定の実施形態では、細胞を、毎日、1つまたは複数のGH誘導剤と接触させる(またはそれに曝露させる)。ある特定の実施形態では、細胞を、1日おきに、1つまたは複数のGH誘導剤と接触させる(またはそれに曝露させる)。
ある特定の実施形態では、細胞(例えば、Pit1細胞)を、少なくとも約3日間、少なくとも約4日間、少なくとも約5日間、少なくとも約6日間、少なくとも約7日間、少なくとも約8日間、少なくとも約9日間、少なくとも約10日間、少なくとも約11日間、少なくとも約12日間、少なくとも約13日間、少なくとも約14日間、少なくとも約15日間、少なくとも約16日間、少なくとも約17日間、少なくとも約18日間、少なくとも約19日間、少なくとも約20日間、少なくとも約1週間、少なくとも約2週間、少なくとも約3週間、少なくとも約4週間、少なくとも約5週間、少なくとも約6週間、または少なくとも約7週間、1つまたは複数のGH誘導剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞(例えば、Pit1細胞)を、少なくとも約5日間、1つまたは複数のGH誘導剤と接触させる。ある特定の実施形態では、Pit1細胞を、少なくとも約6日間、GH誘導剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞(例えば、Pit1細胞)を、少なくとも約14日間、1つまたは複数のGH誘導剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞(例えば、Pit1細胞)を、少なくとも約15日間、1つまたは複数のGH誘導剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞(例えば、Pit1細胞)を、少なくとも約19日間、1つまたは複数のGH誘導剤と接触させる。ある特定の実施形態では、Pit1細胞を、少なくとも約20日間、1つまたは複数のGH誘導剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞(例えば、Pit1細胞)を、少なくとも約2週間、1つまたは複数のGH誘導剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞(例えば、Pit1細胞)を、少なくとも約4週間、1つまたは複数のGH誘導剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞(例えば、Pit1細胞)を、少なくとも約6週間、1つまたは複数のGH誘導剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞(例えば、Pit1細胞)を、最長約5日間、最長約6日間、最長約7日間、最長約8日間、最長約9日間、最長約10日間、最長約11日間、最長約12日間、最長約13日間、最長約14日間、最長約15日間、最長約16日間、最長約17日間、最長約18日間、最長約19日間、最長約20日間、最長約1週間、最長約2週間、最長約3週間、最長約4週間、最長約5週間、最長約6週間、最長約7週間、最長約8週間、最長約9週間、または最長約10週間、1つまたは複数のGH誘導剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞(例えば、Pit1細胞)を、最長約5日間、1つまたは複数のGH誘導剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞(例えば、Pit1細胞)を、最長約6日間、1つまたは複数のGH誘導剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞(例えば、Pit1細胞)を、最長約14日間、1つまたは複数のGH誘導剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞(例えば、Pit1細胞)を、最長約15日間、1つまたは複数のGH誘導剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞(例えば、Pit1細胞)を、最長約19日間、1つまたは複数のGH誘導剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞(例えば、Pit1細胞)を、最長約20日間、1つまたは複数のGH誘導剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞(例えば、Pit1細胞)を、最長約4週間、1つまたは複数のGH誘導剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞(例えば、Pit1細胞)を、最長約6週間、1つまたは複数のGH誘導剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞(例えば、Pit1細胞)を、約5日間、1つまたは複数のGH誘導剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞(例えば、Pit1細胞)を、約6日間、1つまたは複数のGH誘導剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞(例えば、Pit1細胞)を、約14日間、1つまたは複数のGH誘導剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞(例えば、Pit1細胞)を、約15日間、1つまたは複数のGH誘導剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞(例えば、Pit1細胞)を、約19日間、1つまたは複数のGH誘導剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞(例えば、Pit1細胞)を、約20日間、1つまたは複数のGH誘導剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞(例えば、Pit1細胞)を、約2週間、1つまたは複数のGH誘導剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞(例えば、Pit1細胞)を、約4週間、1つまたは複数のGH誘導剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞(例えば、Pit1細胞)を、約6週間、1つまたは複数のGH誘導剤と接触させる。
ある特定の実施形態では、細胞(例えば、Pit1細胞)を、または第1の細胞集団を、幹細胞の、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤との最初の接触から少なくとも約10日、少なくとも約11日、少なくとも約12日、少なくとも約13日、少なくとも約14日、少なくとも約15日、少なくとも約16日、少なくとも約17日、少なくとも約18日、少なくとも約19日、少なくとも約20日、少なくとも約2週間、もしくは少なくとも約3週間、および/または最長約15日、最長約16日、最長約17日、最長約18日、最長約19日、最長約20日、最長約21日、最長約22日、最長約23日、最長約24日、または最長約25日で、1つまたは複数のGH誘導剤と最初に接触させる。ある特定の実施形態では、Pit1細胞を、または第1の細胞集団を、幹細胞の、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤との最初の接触から少なくとも約10日で、1つまたは複数のGH誘導剤と最初に接触させる。ある特定の実施形態では、Pit1細胞を、または第1の細胞集団を、幹細胞の、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤との最初の接触から少なくとも約15日で、1つまたは複数のGH誘導剤と最初に接触させる。ある特定の実施形態では、Pit1細胞を、または第1の細胞集団を、幹細胞の、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤との最初の接触から25日以内で、1つまたは複数のGH誘導剤と最初に接触させる。ある特定の実施形態では、Pit1細胞を、または第1の細胞集団を、幹細胞の、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤との最初の接触から20日以内で、1つまたは複数のGH誘導剤と最初に接触させる。ある特定の実施形態では、Pit1細胞を、または第1の細胞集団を、幹細胞の、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤との最初の接触から少なくとも約15日(例えば、約15日、約16日、約17日、約18日、約19日、または約20日)で、1つまたは複数のGH誘導剤と最初に接触させる。ある特定の実施形態では、Pit1細胞を、または第1の細胞集団を、幹細胞の、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤との最初の接触から少なくとも約2週間(例えば、約2週間、約15日、約16日、約17日、約18日、約19日、または約20日)で、1つまたは複数のGH誘導剤と最初に接触させる。
ある特定の実施形態では、GH産生成長ホルモン産生細胞は、検出可能なレベルの1つまたは複数の成長ホルモン産生細胞マーカーを発現する。成長ホルモン産生細胞マーカーの非限定的な例として、GH1、GHRH受容体(GHRHR)、POU1F1、NeuroD4、およびGHSRが挙げられる。1つまたは複数の成長ホルモン産生細胞マーカーを発現する細胞は、GHを分泌し得る。
ある特定の実施形態では、GH産生成長ホルモン産生細胞は、細胞(例えば、Pit1細胞)または第1の細胞集団の、1つまたは複数のGH誘導剤との最初の接触から少なくとも約3日、少なくとも約4日、少なくとも約5日、少なくとも約6日、少なくとも約7日、少なくとも約8日、少なくとも約9日、少なくとも約10日、少なくとも約10日、少なくとも約11日、少なくとも約12日、少なくとも約13日、少なくとも約14日、少なくとも約15日、少なくとも約16日、少なくとも約17日、少なくとも約18日、少なくとも約19日、少なくとも約20日、少なくとも約1週間、少なくとも約2週間、少なくとも約3週間、または少なくとも約4週間で、検出可能なレベルの1つまたは複数の成長ホルモン産生細胞マーカーを発現する。ある特定の実施形態では、GH産生成長ホルモン産生細胞は、細胞(例えば、Pit1細胞)または第1の細胞集団の、1つまたは複数のGH誘導剤との最初の接触から少なくとも約5日(例えば、約5日または6日)で、検出可能なレベルの1つまたは複数の成長ホルモン産生細胞マーカーを発現する。ある特定の実施形態では、GH産生成長ホルモン産生細胞は、細胞または第1の細胞集団の1つまたは複数のGH誘導剤との最初の接触から少なくとも約15日(例えば、約14日または15日)で、検出可能なレベルの1つまたは複数の成長ホルモン産生細胞マーカーを発現する。ある特定の実施形態では、GH産生成長ホルモン産生細胞は、細胞(例えば、Pit1細胞)または第1の細胞集団の、1つまたは複数のGH誘導剤との最初の接触から少なくとも約2週間で、検出可能なレベルの1つまたは複数の成長ホルモン産生細胞マーカーを発現する。
ある特定の実施形態では、方法は、Pit1細胞または第1の細胞集団を、1つまたは複数のGH誘導剤と接触させて、分化細胞の第3の細胞集団を得るステップであって、分化細胞の少なくとも約50%(例えば、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、または少なくとも約99%)は、低レベルのGHRHR免疫反応性を発現する(「GHRHRlow細胞」と称される)ステップを含む。ある特定の実施形態では、第3の細胞集団の細胞の約15%未満(例えば、約10%未満、約9%未満、約8%未満、約7%未満、約6%未満、約5%未満、約3%未満、約2%未満、例えば、約1%)は、高レベルのGHRHR免疫反応性を発現する(「GHRHRhigh細胞」と称される)。
ある特定の実施形態では、Pit1細胞をまたは第1の細胞集団を、少なくとも約5日間(例えば、約5日または約6日間)、1つまたは複数のGH誘導剤と接触させて、第3の細胞集団を得る。ある特定の実施形態では、Pit1細胞をまたは第1の細胞集団を、少なくとも約15日間(例えば、約14日または約15日間)、1つまたは複数のGH誘導剤と接触させて、第3の細胞集団を得る。
ある特定の実施形態では、方法は、Pit1細胞または第1の細胞集団を、少なくとも約15日間(例えば、約14日または約15日間)、RA、コルチコステロイド、甲状腺ホルモン、GHRHシグナル伝達経路のアゴニスト(例えば、GHRH)と接触させて、第3の細胞集団を得るステップを含む。ある特定の実施形態では、方法は、Pit1細胞または第1の細胞集団を、少なくとも約15日間(例えば、約14日または約15日間)、RA、コルチコステロイド、甲状腺ホルモン、2つのGHRHシグナル伝達経路のアゴニスト(例えば、GHRHおよびcAMP)、およびERアゴニスト(例えば、DPN)と接触させて、第3の細胞集団を得るステップを含む。ある特定の実施形態では、方法は、Pit1細胞または第1の細胞集団を、少なくとも約5日間(例えば、約5日または約6日間)、RA、コルチコステロイド、甲状腺ホルモン、GHRHシグナル伝達経路のアゴニスト(例えば、GHRH)、Ghrelinシグナル伝達経路のアゴニスト(例えば、Ghrelin)、およびERアゴニスト(例えば、DPN)と接触させて、第3の細胞集団を得るステップを含む。
細胞の1つまたは複数のGH誘導剤への拡張された曝露/接触により、GH増殖および/またはGH成熟が促進され得る。ある特定の実施形態では、方法は、第3の細胞集団を、1つまたは複数のGH誘導剤と接触させて/それに曝露させて、少なくとも約50%(例えば、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、または少なくとも約99%)のGHRHRhigh細胞を含む第4の細胞集団を得るステップを含む。ある特定の実施形態では、第4の細胞集団は、約15%未満(例えば、約10%未満、約9%未満、約8%未満、約7%未満、約6%未満、約5%未満、約3%未満、約2%未満、例えば、約1%)のGHRHRlow細胞を含む。
ある特定の実施形態では、第4の細胞集団は、Pit1細胞または第1の細胞集団の、1つまたは複数のGH誘導剤との最初の接触から少なくとも約14日(例えば、約14日または15日)で得られる。ある特定の実施形態では、第4の細胞集団は、第3の細胞集団の最初の存在から少なくとも約9日(例えば、約9日または10日)で得られる。ある特定の実施形態では、第4の細胞集団は、Pit1細胞または第1の細胞集団の、1つまたは複数のGH誘導剤との最初の接触から少なくとも約4週間(例えば、約4週間、約5週間、または約6週間)で得られる。ある特定の実施形態では、第4の細胞集団は、第3の細胞集団の最初の存在から少なくとも約2週間(例えば、約2週間、約3週間または約4週間)で得られる。
GHRHRhigh細胞は、より低い増殖速度とともに多角形形態を示し、これは、これらがより成熟したGH細胞(成長ホルモン産生細胞)であることを示す。さらに、GHRHRhigh細胞は、より多量のGH(例えば、GH1)を分泌する。
ある特定の実施形態では、細胞の、1つまたは複数のGH誘導剤との最初の接触から(例えば、約5日、約6日、約15日、約2週間、約19日、約20日、約4週間、または約6週間で)、約50%、約60%、約70%、約80%、または約90%を超える細胞の集団は、検出可能なレベルの1つまたは複数の成長ホルモン産生細胞マーカーを発現する。ある特定の実施形態では、約70%を超える細胞の集団は、検出可能なレベルの1つまたは複数の成長ホルモン産生細胞マーカーを発現する。ある特定の実施形態では、細胞集団は、幹細胞の、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤との最初の接触から少なくとも約30日で、少なくとも約50%(例えば、約70%または80%)の、1つまたは複数の成長ホルモン産生細胞マーカーを発現する細胞を含む。ある特定の実施形態では、細胞集団は、幹細胞の、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤との最初の接触から少なくとも約25日で、少なくとも約50%(例えば、約70%または80%)の、1つまたは複数の成長ホルモン産生細胞マーカーを発現する細胞を含む。
ある特定の実施形態では、方法は、Pit1細胞または第1の細胞集団を、約14日間(例えば、約14または15日間)、1つまたは複数のGH誘導剤(例えば、1μMのRA、10nMのT3、1μMのデキサメタゾン、1μMのGHRH、ならびに必要に応じて、100μMのc−AMP、および0.1nMのDPN)と接触させて、第3の細胞集団を得るステップを含む。ある特定の実施形態では、方法は、Pit1細胞または第1の細胞集団を、約2週間、1つまたは複数のGH誘導剤(例えば、1μMのRA、10nMのT3、1μMのデキサメタゾン、1μMのGHRH、ならびに必要に応じて、100μMのc−AMP、および0.1nMのDPN)と接触させて、第3の細胞集団を得るステップを含む。ある特定の実施形態では、方法は、Pit1細胞または第1の細胞集団を、約4週間、1つまたは複数のGH誘導剤(例えば、1μMのRA、10nMのT3、1μMのデキサメタゾン、1μMのGHRH、ならびに必要に応じて、100μMのc−AMP、および0.1nMのDPN)と接触させて、第4の細胞集団を得るステップを含む。ある特定の実施形態では、方法は、Pit1細胞または第1の細胞集団を、約6週間、1つまたは複数のGH誘導剤(例えば、1μMのRA、10nMのT3、1μMのデキサメタゾン、1μMのGHRH、ならびに必要に応じて、100μMのc−AMP、および0.1nMのDPN)と接触させて、第4の細胞集団を得るステップを含む。
ある特定の実施形態では、方法は、Pit1細胞または第1の細胞集団を、約5日間(例えば、約5または6日間)、1つまたは複数のGH誘導剤(例えば、1μMのRA、10nMのT3、1μMのデキサメタゾン、1μMのGHRH、10nMのGhrelin、および0.1nMのDPN)と接触させるステップを含む。ある特定の実施形態では、細胞(Pit1細胞)を、約5日または約6日間、1つまたは複数のGH誘導剤(例えば、1μMのRA、10nMのT3、1μMのデキサメタゾン、1μMのGHRH、10nMのGhrelin、および0.1nMのDPN)と接触させて、第3の細胞集団を得る。
ある特定の実施形態では、方法は、第3の細胞集団を、約9日間または約10日間、1つまたは複数のGH誘導剤(10nMのT3、1μMのデキサメタゾン、1μMのGHRH、10nMのGhrelin、0.1nMのDPN、および25ng/mlのIL−6)と接触させて、第4の細胞集団を得るステップを含む。
ある特定の実施形態では、方法は、第4の細胞集団を、GH細胞成熟のための条件に供するステップを含む。ある特定の実施形態では、GH細胞成熟のための条件は、第4の細胞集団を、少なくとも約3日間、少なくとも約4日間、または少なくとも約5日間、1つまたは複数のGH誘導剤(10nMのT3、1μMのデキサメタゾン、および0.1nMのDPN)に曝露させることを含む。ある特定の実施形態では、GH細胞成熟のための条件は、第4の細胞集団を、約5または6日間、1つまたは複数のGH誘導剤(10nMのT3、1μMのデキサメタゾン、および0.1nMのDPN)に曝露させることを含む。
ある特定の実施形態では、1つまたは複数のGH誘導剤の、Pit1細胞または第1の細胞集団との最初の接触は、幹細胞の、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤との最初の接触から少なくとも約15日および/または約25日以内(例えば、約15日、約16日、約17日、約18日、約19日または約20日)である。ある特定の実施形態では、Pit1細胞または第1の細胞集団を、少なくとも約14日間または少なくとも約2週間(例えば、約14または15日間)、1つまたは複数のGH誘導剤と接触させて、第3の細胞集団を得、少なくとも約4週間または少なくとも約6週間(例えば、約4週間または約6週間)、1つまたは複数のGH誘導剤と接触させて、第4の細胞集団を得る。ある特定の実施形態では、Pit1細胞をまたは第1の細胞集団を、少なくとも約5日間(例えば、約5日間または6日間)、1つまたは複数のGH誘導剤と接触させて、第3の細胞集団を得、少なくとも約14日間または少なくとも約2週間(例えば、約14または15日間)、1つまたは複数のGH誘導剤と接触させて、第4の細胞集団を得る。
本開示の主題は、幹細胞(例えば、ヒト幹細胞)の、1つまたは複数の成長ホルモン産生細胞マーカーを発現する細胞(成長ホルモン産生細胞)への分化を誘導するためのin vitro方法を提供する。ある特定の実施形態では、方法は、幹細胞の集団を、(a)有効量の、形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤および(b)有効量の、BMPシグナル伝達の1つまたは複数の活性化剤と接触させるステップと;細胞を、(c)有効量の、Sonic Hedgehog(SHH)シグナル伝達の1つまたは複数の活性化剤、(d)有効量の、FGFシグナル伝達の1つ、2つまたはそれより多い活性化剤、(e)有効量の1つまたは複数の背方化剤、(f)有効量の1つまたは複数の腹方化剤、および(g)有効量の1つまたは複数のWnt活性化剤と接触させるステップとを含む。
ある特定の実施形態では、幹細胞を、少なくとも約2日間、または少なくとも約3日間、BMPシグナル伝達の1つまたは複数の活性化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、幹細胞を、最長約3日間、最長約4日間、または最長約5日間、BMPシグナル伝達の1つまたは複数の活性化剤と接触させる。
ある特定の実施形態では、細胞を、幹細胞の、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤との最初の接触から少なくとも約3日で、SHHシグナル伝達の1つまたは複数の活性化剤およびFGFシグナル伝達の2つまたはそれより多い活性化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、幹細胞の、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤との最初の接触から約3日または約4日で、SHHシグナル伝達の1つまたは複数の活性化剤およびFGFシグナル伝達の2つまたはそれより多い活性化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、少なくとも約5日間および最長約10日間、1つまたは複数のSHH活性化剤および2つまたはそれより多いFGF活性化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、少なくとも約5日間、1つまたは複数のSHH活性化剤、および2つまたはそれより多いFGF活性化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約5日間または約6日間、1つまたは複数のSHH活性化剤および2つまたはそれより多いFGF活性化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、少なくとも約9日間、1つまたは複数のSHH活性化剤および2つまたはそれより多いFGF活性化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、SHHシグナル伝達の1つまたは複数の活性化剤およびFGFシグナル伝達の2つまたはそれより多い活性化剤を、細胞と同時に接触させる。
ある特定の実施形態では、細胞を、少なくとも約5日間および最長約10日間、1つまたは複数の背方化剤、1つまたは複数の腹方化剤、および1つまたは複数のWnt活性化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約7日間、1つまたは複数の背方化剤、1つまたは複数の腹方化剤、および1つまたは複数のWnt活性化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約8日間、1つまたは複数の背方化剤、1つまたは複数の腹方化剤、および1つまたは複数のWnt活性化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、幹細胞の、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤との最初の接触から少なくとも約5日および最長約15日で、1つまたは複数の背方化剤、1つまたは複数の腹方化剤、および1つまたは複数のWnt活性化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、幹細胞の、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤との最初の接触から約8日で、1つまたは複数の背方化剤、1つまたは複数の腹方化剤、および1つまたは複数のWnt活性化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、幹細胞の、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤との最初の接触から約9日で、1つまたは複数の背方化剤、1つまたは複数の腹方化剤、および1つまたは複数のWnt活性化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、1つまたは複数の背方化剤、1つまたは複数の腹方化剤、および1つまたは複数のWnt活性化剤を、細胞と同時に接触させる。
ある特定の実施形態では、細胞(例えば、下垂体前駆細胞)を、少なくとも約2日間および最長約10日間、1つまたは複数の背方化剤およびTGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞(例えば、下垂体前駆細胞)を、約4日間、1つまたは複数の背方化剤およびTGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞(例えば、下垂体前駆細胞)を、約5日間、1つまたは複数の背方化剤およびTGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞(例えば、下垂体前駆細胞)を、少なくとも2日間および最長15日間、1つまたは複数の腹方化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞(例えば、下垂体前駆細胞)を、少なくとも約10日間、1つまたは複数の腹方化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞(例えば、下垂体前駆細胞)を、約11日間、1つまたは複数の腹方化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞(例えば、下垂体前駆細胞)を、約12日間、1つまたは複数の腹方化剤と接触させる。
ある特定の実施形態では、細胞(例えば、下垂体前駆細胞)の、1つまたは複数の背方化剤、1つまたは複数の腹方化剤、およびTGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤との最初の接触は、幹細胞の、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤との最初の接触から少なくとも約5日および約15日以内である。ある特定の実施形態では、細胞(例えば、下垂体前駆細胞)の、1つまたは複数の背方化剤、1つまたは複数の腹方化剤、およびTGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤との最初の接触は、幹細胞の、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤との最初の接触から約8日である。ある特定の実施形態では、細胞(例えば、下垂体前駆細胞)の、1つまたは複数の背方化剤、1つまたは複数の腹方化剤、およびTGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤との最初の接触は、幹細胞の、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤との最初の接触から約9日である。ある特定の実施形態では、1つまたは複数の背方化剤およびTGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤を、細胞(例えば、下垂体前駆細胞)と同時に接触させる。
ある特定の実施形態では、細胞を、少なくとも約5日間および最長約10日間、1つまたは複数のWnt活性化剤および1つまたは複数のERアゴニストとさらに接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約7日間、1つまたは複数のWnt活性化剤および1つまたは複数のERアゴニストとさらに接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約8日間、1つまたは複数のWnt活性化剤および1つまたは複数のERアゴニストと接触させる。ある特定の実施形態では、細胞の、1つまたは複数のWnt活性化剤および1つまたは複数のERアゴニストとの最初の接触は、細胞(例えば、下垂体前駆細胞)の、1つもしくは複数の背方化剤との最初の接触から少なくとも約2日および10日以内ならびに/または幹細胞の、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つもしくは複数の阻害剤との最初の接触から少なくとも約5日および25日以内である。ある特定の実施形態では、細胞の、1つまたは複数のWnt活性化剤および1つまたは複数のERアゴニストとの最初の接触は、細胞(例えば、下垂体前駆細胞)の、1つもしくは複数の背方化剤との最初の接触から約4日もしくは5日、および/または幹細胞の、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つもしくは複数の阻害剤との最初の接触から約12日もしくは13日である。ある特定の実施形態では、1つまたは複数のWnt活性化剤および1つまたは複数のERアゴニストを、細胞と同時に接触させる。
ある特定の実施形態では、方法は、細胞を、(h)有効量の1つまたは複数のSMAD阻害剤と接触させるステップをさらに含む。ある特定の実施形態では、1つまたは複数のSMAD阻害剤を、SHHシグナル伝達の1つまたは複数の活性化剤およびFGFシグナル伝達の2つまたはそれより多い活性化剤と同時に、細胞と接触させる。
ある特定の実施形態では、方法は、細胞を、(i)有効量の1つまたは複数のERアゴニストと接触させるステップをさらに含む。ある特定の実施形態では、1つまたは複数のERアゴニストを、1つまたは複数の背方化剤および1つまたは複数のWnt活性化剤と同時に、細胞と接触させる。
ある特定の実施形態では、細胞の、1つまたは複数のGH誘導剤との最初の接触は、幹細胞の、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤との最初の接触から少なくとも約10日および約25日以内である。ある特定の実施形態では、細胞の、1つまたは複数のGH誘導剤との最初の接触は、幹細胞のTGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤との最初の接触から少なくとも約15日である。ある特定の実施形態では、細胞の、1つまたは複数のGH誘導剤との最初の接触は、幹細胞の、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤との最初の接触から約15日である。ある特定の実施形態では、細胞の、1つまたは複数のGH誘導剤との最初の接触は、幹細胞の、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤との最初の接触から約16日である。ある特定の実施形態では、細胞の、1つまたは複数のGH誘導剤との最初の接触は、幹細胞の、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤との最初の接触から約19日である。ある特定の実施形態では、細胞の、1つまたは複数のGH誘導剤との最初の接触は、幹細胞の、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤との最初の接触から約20日である。ある特定の実施形態では、細胞を、少なくとも約10日間および最長約10週間、1つまたは複数のGH誘導剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、少なくとも約2週間、1つまたは複数のGH誘導剤と接触させて、第3の細胞集団を得、少なくとも約4週間または少なくとも約6週間、1つまたは複数のGH誘導剤と接触させて、第4の細胞集団を得る。ある特定の実施形態では、細胞を、約2週間、1つまたは複数のGH誘導剤と接触させて、第3の細胞集団を得る。ある特定の実施形態では、細胞を、約4週間、1つまたは複数のGH誘導剤と接触させて、第4の細胞集団を得る。ある特定の実施形態では、細胞を、約6週間、1つまたは複数のGH誘導剤と接触させて、第4の細胞集団を得る。
ある特定の実施形態では、細胞を、少なくとも約3日間および最長約10週間、1つまたは複数のGH誘導剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、少なくとも約5日間または6日間、1つまたは複数のGH誘導剤と接触させて、第3の細胞集団を得、少なくとも約2週間、1つまたは複数のGH誘導剤と接触させて、第4の細胞集団を得る。
本開示の主題のある特定の実施形態に従って、幹細胞を、成長ホルモン産生細胞へと分化させるための方法は、図1に示される。本開示の主題のある特定の実施形態に従って、幹細胞を、成長ホルモン産生細胞へと分化させるための方法は、図14に示される。本開示の主題のある特定の実施形態に従って、幹細胞を、成長ホルモン産生細胞へと分化させるための方法は、図15に示される。
ある特定の実施形態では、上述の阻害剤、活性化剤および誘導剤は、分化されている細胞を含む細胞培養培地に添加される。好適な細胞培養培地として、これらに限定されないが、Essential 8(登録商標)/Essential 6(登録商標)(「E8/E6」)培地が挙げられる。E8/E6培地は市販されている。
E8/E6培地は、ヒト多能性幹細胞の成長および拡大を支持するフィーダーフリーおよびゼノフリー(xeno free)培地である。E8/E6培地は、体細胞再プログラミングを支持することが判明した。さらに、E8/E6培地は、PSCの培養に対するカスタム培地の配合物のベースとして使用することができる。E8/E6培地の一例は、参照によりその全体が組み込まれる、Chen et al., Nat Methods. 2011 May;8(5):424−9に記載されている。E8/E6培地の一例は、参照によりその全体が組み込まれる、WO15/077648に開示されている。ある特定の実施形態では、E8/E6細胞培養培地は、DMEM/F12、アスコルビン酸、セレン、インスリン、NaHCO、トランスフェリン、FGF2およびTGFβを含む。ある特定の実施形態では、E6培地は、FGF2およびTGFβを含まない。E8/E6培地は、E8/E6培地が、活性BMPまたはWnt成分を含まないという点でKSR培地と異なる。
分化細胞は、1つまたは複数のレポーターをさらに発現し得る。レポーターの非限定的な例として、蛍光タンパク質(緑色蛍光タンパク質(GFP)、青色蛍光タンパク質(EBFP、EBFP2、Azurite、mKalamal)、シアン蛍光タンパク質(ECFP、Cerulean、CyPet、mTurquoise2)、および黄色蛍光タンパク質誘導体(YFP、Citrine、Venus、YPet、EYFP)など)、β−ガラクトシダーゼ(LacZ)、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(cat)、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ(neo)、酵素(オキシダーゼおよびペルオキシダーゼなど)、および抗原分子が挙げられる。本明細書で使用される場合、「レポーター遺伝子」または「レポーター構築物」という用語は、発色タンパク質、GFPなどの蛍光タンパク質またはベータ−ガラクトシダーゼ(lacZ遺伝子)などの酵素のような、容易に検出可能または容易にアッセイ可能であるタンパク質をコードする核酸を含む遺伝的構築物を指す。ある特定の実施形態では、レポーターは、NE系統マーカー遺伝子の組み換えプロモーター、NC系統マーカー遺伝子の組み換えプロモーター、CP系統マーカー遺伝子の組み換えプロモーター、またはNNE系統マーカー遺伝子の組み換えプロモーターによって駆動され得る。
分化細胞は、例えば、細胞培養培地中で、分化後に精製され得る。本明細書で使用される場合、「精製された」、「精製する」、「精製」、「単離された」、「単離する」、および「単離」という用語は、試料由来の少なくとも1種の夾雑物の量の低減を指す。例えば、所望の細胞型は、望ましくない細胞型の量の対応する低減によって、少なくとも約10%、少なくとも約30%、少なくとも約50%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、または少なくとも約90%精製される。「精製する」という用語は、試料からある特定の細胞(例えば、望ましくない細胞)を除去することを指し得る。
本開示の主題は、本明細書に記載の方法によって生成される、1つまたは複数の下垂体前駆体/前駆細胞マーカーを発現するin vitro分化細胞、Pit1を発現する分化細胞、および/または1つもしくは複数の成長ホルモン産生細胞マーカーを発現する分化細胞(GHRHRlow細胞およびGHRHRhigh細胞を含む)の集団、ならびにこのようなin vitro分化細胞を含む組成物も提供する。
5.3 分化細胞集団を含む組成物
本開示の主題は、本明細書に記載のin vitro分化方法によって生成される1つまたは複数の下垂体前駆体/前駆細胞マーカーを発現する細胞の集団を含む組成物を提供する。さらに、本開示の主題は、本明細書に記載のin vitro分化方法によって生成されるPit1を発現する細胞の集団を含む組成物を提供する。さらに、本開示の主題は、本明細書に記載のin vitro分化方法によって生成されるGH産生成長ホルモン産生細胞(GHRHRlow細胞およびGHRHRhigh細胞を含む)の集団を含む組成物を提供する。
さらに、本開示の主題は、in vitro分化細胞の集団を含む組成物であって、分化細胞の集団の少なくとも約50%(例えば、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約99%、または少なくとも約99.5%)が、1つまたは複数の下垂体前駆体/前駆細胞マーカーを発現し、分化細胞の集団の約25%未満(例えば、約20%未満、約15%未満、約10%未満、約5%未満、約4%未満、約3%未満、約2%未満、約1%未満、約0.5%未満、または約0.1%未満)が、幹細胞マーカー、非神経外胚葉(NNC)マーカー、神経堤(NC)系統マーカー、および非下垂体プラコードマーカー(頭蓋プラコードマーカー、上鰓プラコードマーカー、三叉神経プラコードマーカー、および耳プラコードマーカーを含むがこれらに限定されない)からなる群から選択される1つまたは複数のマーカーを発現する、組成物を提供する。
さらに、本開示の主題は、in vitro分化細胞の集団を含む組成物であって、分化細胞の集団の少なくとも約50%(例えば、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約99%、または少なくとも約99.5%)が、Pit1を発現し、分化細胞の集団の約25%未満(例えば、約20%未満、約15%未満、約10%未満、約5%未満、約4%未満、約3%未満、約2%未満、約1%未満、約0.5%未満、または約0.1%未満)が、下垂体前駆体マーカー、幹細胞マーカー、NNEマーカー、神経堤(NC)系統マーカー、および非下垂体プラコードマーカー(頭蓋プラコードマーカー、上鰓プラコードマーカー、三叉神経プラコードマーカー、および耳プラコードマーカーを含むがこれらに限定されない)からなる群から選択される1つまたは複数のマーカーを発現する、組成物を提供する。ある特定の実施形態では、このような細胞集団は、項目5.2.2に開示された第1の細胞集団である。
さらに、本開示の主題は、in vitro分化細胞の集団を含む組成物であって、分化細胞の集団の少なくとも約50%(例えば、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約99%、または少なくとも約99.5%)が、GH産生成長ホルモン産生細胞であり、分化細胞の集団の約25%未満(例えば、約20%未満、約15%未満、約10%未満、約5%未満、約4%未満、約3%未満、約2%未満、約1%未満、約0.5%未満、または約0.1%未満)が、プロラクチン産生細胞マーカー、甲状腺刺激ホルモン産生細胞マーカー、Pit1、下垂体前駆体マーカー、幹細胞マーカー、NNEマーカー、神経堤(NC)系統マーカー、および非下垂体プラコードマーカー(頭蓋プラコードマーカー、上鰓プラコードマーカー、三叉神経プラコードマーカー、および耳プラコードマーカーを含むがこれらに限定されない)からなる群から選択される1つまたは複数のマーカーを発現する、組成物を提供する。ある特定の実施形態では、このような細胞集団は、項目5.2.2で開示された第3の細胞集団、項目5.2.2で開示された第4の細胞集団、およびこれらの組合せを含む。
幹細胞マーカーの非限定的な例として、OCT4、NANOG、SOX2、LIN28、SSEA4、およびSSEA3が挙げられる。
NC系統マーカーの非限定的な例として、SOX10、FoxD3、ASCL1、Neurogenin、およびSnailが挙げられる。
非下垂体プラコードマーカーの非限定的な例として、頭蓋プラコードマーカー(SIX1、PAX6、PITX3、クリスタリンアルファA、およびクリスタリンアルファBを含むがこれらに限定されない)、上鰓プラコードマーカー(PAX2を含むがこれに限定されない)、三叉神経プラコードマーカー(PAX3を含むがこれに限定されない)、耳プラコードマーカー(PAX8を含むがこれに限定されない)が挙げられる。
NNEマーカーの非限定的な例として、TFAP2A、EYA1、DLX3、およびDLX5が挙げられる。
下垂体前駆細胞マーカーの非限定的な例として、SIX1、LHX3、LHX4、PITX1、PITX2、HESX1、PROP1、SIX6、TBX19、PAX6、GATA2、およびSF1が挙げられる。
成長ホルモン産生細胞マーカーの非限定的な例として、GH、GHRHR、POU1F1、NeuroD4、およびGHSRが挙げられる。
プロラクチン産生細胞マーカーの非限定的な例として、PRL、PIT1、およびD2Rが挙げられる。
甲状腺刺激ホルモン産生細胞マーカーの非限定的な例として、TSH、THRH、およびPIT1が挙げられる。
ある特定の実施形態では、組成物は、約1×10から約1×1010、約1×10から約1×10、約1×10から約1×10、約1×10から約1×10、約1×10から約1×10、約1×10から約1×10、約1×10から約1×10、約1×10から約1×10、約1×10から約1×10、約1×10から約1×1010、または約1×10から約1×1010個の、本開示の幹細胞由来細胞の集団を含む。
ある特定の実施形態では、組成物は、約1×10から約1×1010、約1×10から約1×10、約1×10から約1×10、約1×10から約1×10、約1×10から約1×10、約1×10から約1×10、約1×10から約1×10、約1×10から約1×10、約1×10から約1×10、約1×10から約1×1010、または約1×10から約1×1010個の、本開示のin vitro分化成長ホルモン産生細胞の集団を含む。
ある特定の実施形態では、前記組成物は凍結される。ある特定の実施形態では、前記組成物は、1つまたは複数の凍結保護物質、例えば、これらに限定されないが、ジメチルスルホキシド(DMSO)、グリセロール、ポリエチレングリコール、スクロース、トレハロース、デキストロース、またはこれらの組合せをさらに含んでもよい。
ある特定の非限定的な実施形態では、組成物は、生物適合性足場またはマトリックス、例えば、細胞が、対象に対して埋め込まれるまたは移植される場合に、組織の再生を促進する生物適合性三次元足場をさらに含む。ある特定の非限定的な実施形態では、生体適合性足場は、細胞外マトリックス材料、合成ポリマー、サイトカイン、コラーゲン、ポリペプチドもしくはタンパク質、フィブロネクチン、ラミニン、ケラチン、フィブリン、フィブリノゲン、ヒアルロン酸、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、アガロースもしくはゼラチンを含む多糖類、および/またはヒドロゲルを含む。(例えば、それぞれの内容が参照によりその全体が組み込まれる、米国公開第2015/0159135号、同第2011/0296542号、同第2009/0123433号、および同第2008/0268019号を参照されたい)。
ある特定の実施形態では、組成物は、薬学的に許容される担体、賦形剤、希釈剤またはそれらの組合せを含む医薬組成物である。組成物は、本明細書に記載されているように、GH欠損症を予防および/または処置するために使用することができる。
本開示の主題は、本明細書に開示されているように、分化細胞またはそれを含む組成物を含むデバイスも提供する。デバイスの非限定的な例として、シリンジ、微小ガラス管、定位針およびカニューレが挙げられる。
5.4 成長ホルモンを増加させる方法
1つまたは複数の成長ホルモン産生細胞マーカーを発現するin vitro分化細胞(「幹細胞由来成長ホルモン産生細胞」とも称され、例えば、GH産生成長ホルモン産生細胞)は、GHの発現および/もしくは分泌を増加させる、ならびに/またはGH、インスリン様成長因子1(IGF−1)、およびIGF−2のうちの1つもしくは複数の動的放出を回復させる(例えば、生理学的手法で)ために使用することができる。よって、幹細胞由来成長ホルモン産生細胞は、GH欠損症を処置するために使用することができる。
ホルモン欠損症は、現在、処置可能な状態であるが、GHの補充は、若い患者には非常にコストが高く困難であり、彼らは、保険適用が十分でなく、年間50,000ドルを超えることも多い、非常に高価な、毎日の(時には1日に2回の)、週に6〜7回の注射を必要とする。よって、代謝の回復および骨量の維持には、青年期にGHに対する継続的な需要を支持するデータが存在するが、処置は、思春期に中断されることが多い。組換え産物としてGHが製造されて以来、この分野においていかなる刷新も存在していない。
本開示の主題は、対象におけるGHの発現および/もしくは分泌を増加させる、GH、インスリン様成長因子1(IGF−1)、およびIGF−2のうちの1つもしくは複数の動的放出を回復させる、ならびに/またはGH欠損症を処置する方法であって、対象に、有効量の以下の:
(a)本明細書に記載の幹細胞由来成長ホルモン産生細胞の集団;
(b)このような幹細胞由来成長ホルモン産生細胞を含む組成物;および
(c)このような組成物を含むデバイス
のうちの1つまたは複数を投与するステップを含む方法を提供する。
さらに、本開示の主題は、GHの発現および/もしくは分泌を増加させる、ならびに/またはGH、インスリン様成長因子1(IGF−1)、およびIGF−2のうちの1つもしくは複数を回復させる、本開示の幹細胞由来成長ホルモン産生細胞またはそれを含む組成物またはそれを含むデバイスの使用を提供する。
成長ホルモン欠損症として、先天性成長ホルモン欠損症および後天性成長ホルモン欠損症が挙げられる。先天性成長ホルモン欠損症は、成長ホルモンの発達に関与する遺伝子の変異に起因する。後天性成長ホルモン欠損症は、視床下部−下垂体領域における腫瘍、外科手術、傷害などによって誘導され得る。先天性成長ホルモン欠損症は、2つのカテゴリーに分けることができる:複合下垂体ホルモン欠損症(CPHD)型と成長ホルモン単独欠損症(IGHD)型。CPHDを引き起こし得る遺伝子変異として、POU1F1変異(CPHD1)、PROP−1変異(CPHD2;最も一般的、12〜55%)、LHX3変異(CPHD3)、およびLHX4変異(CPHD4)が挙げられる。IGHD型を引き起こし得る遺伝子変異として、GH1変異(IAおよびII型)、GH1または成長ホルモン放出ホルモン受容体(GHRHR)変異(IB型)、およびブルトンチロシンキナーゼ(BTK)変異(III型)が挙げられる。
ある特定の実施形態では、対象は、GH欠損症を患っている。GH欠損症は、遺伝的(例えば、小人症)であり、外傷、腫瘍、外科手術、および放射線に関連し、例えば、医学的処置によって引き起こされる下垂体病変および/または下垂体抑制に関連し得る。ある特定の実施形態では、対象は、小人症を患っている。GH欠損症の非限定的な例として、小人症、骨粗鬆症、筋肉量の低下、骨量の低下、鬱もしくは不安症などの精神障害、免疫系の弱化または代謝の変更が挙げられる。ある特定の実施形態では、GH欠損症は、小人症である。
ある特定の実施形態では、本開示の幹細胞由来成長ホルモン産生細胞は、目的の器官(例えば、GH欠損症によって影響を受けた器官、例えば、脳下垂体(例えば、脳下垂体前葉、視床下部または正中隆起、皮下組織))中に直接的に注射される。ある特定の実施形態では、本開示の幹細胞由来成長ホルモン産生細胞、それを含む組成物またはデバイスは、例えば、経鼻的および/または経蝶形骨的(transphenoidal)手法によって、対象の脳下垂体(例えば、脳下垂体前葉、視床下部または正中隆起、皮下組織)に直接的に投与(注射)される。ある特定の実施形態では、本開示の幹細胞由来成長ホルモン産生細胞は、ポリマー内にカプセル化され、皮下注射され得る。
本開示の幹細胞由来成長ホルモン産生細胞は、任意の生理学的に許容されるビヒクル中で投与され得る。本開示の幹細胞由来成長ホルモン産生細胞および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物も提供される。本開示の幹細胞由来成長ホルモン産生細胞およびそれを含む医薬組成物は、局所注射、同所(orthotropic)(OT)注射、全身注射、静脈内投与、皮下投与、または非経口投与によって投与され得る。
本開示の幹細胞由来成長ホルモン産生細胞またはそれを含む組成物は、滅菌液体調製物、例えば、等張水溶液、懸濁液、エマルション、分散液、または粘性組成物として提供するのが好都合であり得、選択されたpHに緩衝されてもよい。液体調製物は、通常、ゲル、他の粘性組成物、および固体組成物よりも調製し易い。加えて、液体組成物は、特に注射によって投与するのに幾分より好都合である。一方、粘性組成物は、適当な粘度範囲内に製剤化され、特定の組織とのより長い接触期間をもたらし得る。液体または粘性組成物は、担体を含むことができ、担体は、例えば、水、食塩水、リン酸緩衝食塩水、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど)およびそれらの好適な混合物を含有する溶媒または分散媒であってもよい。滅菌注射用液剤は、本開示の主題の組成物、例えば、本開示の幹細胞由来成長ホルモン産生細胞を含む組成物を、所望であれば様々な量の他の成分とともに、必要量の適当な溶媒中に加えることによって調製することができる。このような組成物は、例えば、滅菌水、生理食塩水、グルコース、デキストロースなどの好適な担体、希釈剤、または賦形剤と混合してもよい。組成物はまた、凍結乾燥され得る。組成物は、所望の投与経路および調製物に応じて、例えば、湿潤剤、分散剤、または乳化剤(例えば、メチルセルロース)、pH緩衝剤、ゲル化または増粘添加剤、保存剤、着香剤、色素などの補助剤を含有することができる。参照により本明細書に組み込まれる、”REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCE”, 17th edition, 1985などの標準テキストは、過度な実験をせずに好適な調製物を調製するために参照され得る。
抗微生物保存剤、抗酸化剤、キレート剤、および緩衝剤を含む、組成物の安定性および滅菌性を増強する様々な添加剤を添加することができる。微生物の活動の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などによって保証され得る。注射用医薬品形態の長期の吸収は、吸収遅延剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム(alum inurn monostearate)およびゼラチンの使用によってもたらされ得る。しかしながら、本開示の主題によれば、使用される任意のビヒクル、希釈剤、または添加剤は、本開示の幹細胞由来成長ホルモン産生細胞と適合性でなければならない。
所望の場合、組成物の粘度は、薬学的に許容される増粘剤を使用して、選択されるレベルで維持され得る。メチルセルロースは、容易にかつ経済的に入手可能であり、扱い易いことから、使用されてもよい。他の好適な増粘剤として、例えば、キサンタンガム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボマーなどが挙げられる。増粘剤の濃度は、選択される剤(agent)に応じて変わる。重要な点は、選択される粘度を達成する量を使用することである。明らかに、好適な担体および他の添加剤の選択は、正確な投与経路および特定の剤形、例えば、液体剤形(例えば、組成物が、液剤、懸濁剤、ゲル剤または別の液体形態、例えば、徐放形態または液体充填形態中に製剤化されるべきかどうか)の性質に応じて変わる。
当業者は、組成物の構成成分が化学的に不活性であるように、かつ本開示の幹細胞由来腸溶NC前駆体の生存性または有効性に影響を与えないように選択されるべきであることを認識する。これは、化学および薬学の原理に精通した当業者にとって何ら問題を生じさせず、または問題は、本開示および本明細書で引用される文書からの、標準テキストを参照することによってもしくは単純な実験(過度な実験を要しない)によって、容易に回避され得る。
本開示の幹細胞由来成長ホルモン産生細胞の治療用途に関する1つの懸念は、最適な効果を達成するために必要な細胞の量である。最適な効果として、これらに限定されないが、GHの発現の増加、GHの分泌の増加、GH、インスリン様成長因子1(IGF−1)、およびIGF−2のうちの1つもしくは複数の動的放出の回復、ならびに/または成長の回復および代謝の正常化が挙げられる。
「有効量」(または「治療有効量」)は、処置の際に有益なまたは所望の臨床的結果をもたらすのに十分な量である。有効量は、1または複数の用量で対象に投与され得る。処置に関して、有効量は、GHの発現および/もしくは分泌を増加させる;GH、インスリン様成長因子1(IGF−1)、およびIGF−2のうちの1つもしくは複数の動的放出を回復させる、成長の回復および代謝の正常化、ならびに/またはGH欠損症(例えば、小人症)の進行を和らげるか、軽快するか、安定化するか、逆転するかもしくは遅らせるか、またはそうでなければGH欠損症(例えば、小人症)の病理学的転帰を低減するのに十分な量である。有効量は、一般的には、ケースバイケースで医師によって決定され、当業者の技術の範囲内である。典型的には、有効量を達成するために適当な投薬量を決定する場合に、いくつかの要因が考慮される。これらの要因として、対象の年齢、性別および体重、処置されている状態、状態の重症度ならびに投与される細胞の形態および有効濃度が挙げられる。
ある特定の実施形態では、有効量は、最適な効果(これらに限定されないが、GHの発現の増加、GHの分泌の増加、GH、インスリン様成長因子1(IGF−1)、およびIGF−2のうちの1つもしくは複数の動的放出の回復、ならびに/または成長の回復および代謝の正常化を含む)を達成するのに十分な量である。ある特定の実施形態では、有効量は、約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約95%、約98%、約99%または約100%、対象(例えば、GH欠損症を患っているもの)におけるGHの発現を増加させるのに十分な量である。ある特定の実施形態では、有効量は、約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約95%、約98%、約99%または約100%、対象(例えば、GH欠損症を患っているもの)におけるGHの分泌を増加させるのに十分な量である。ある特定の実施形態では、有効量は、約1%、約5%、約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約95%、約98%、約99%または約100%、対象(例えば、GH欠損症を患っているもの)の体のサイズを増加させるのに十分な量である。ある特定の実施形態では、有効量は、約1%、約5%、約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約95%、約98%、約99%または約100%、対象(例えば、GH欠損症を患っているもの)の体重を増加させるのに十分な量である。
投与される細胞の量は、処置されている対象に対して変わる。ある特定の実施形態では、約1×10から約1×1010、約1×10から約1×10、約1×10から約1×10、約1×10から約1×10、約1×10から約1×10、約1×10から約1×10、約1×10から約1×10、約1×10から約1×10、約1×10から約1×10、約1×10から約1×1010の、または約1×10から約1×1010個の本開示の幹細胞由来成長ホルモン産生細胞が、対象に投与される。ある特定の実施形態では、約1×10から約1×10個の本開示の幹細胞由来成長ホルモン産生細胞が、GH欠損症を患っている対象に投与される。
5.5 キット
本開示の主題は、幹細胞の分化を誘導するためのキットを提供する。ある特定の実施形態では、キットは、(a)形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤、(b)BMPシグナル伝達の1つまたは複数の活性化剤、(c)FGFシグナル伝達の1つまたは複数の活性化剤、(d)SHHシグナル伝達の1つまたは複数の活性化剤、および(e)幹細胞の、1つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する分化細胞の集団への分化を誘導するための指示を含む。ある特定の実施形態では、キットは、(f)1つまたは複数のSMAD阻害剤をさらに含む。
ある特定の実施形態では、キットは、(a)形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤、(b)BMPシグナル伝達の1つまたは複数の活性化剤、(c)FGFシグナル伝達の1つまたは複数の活性化剤、(d)SHHシグナル伝達の1つまたは複数の活性化剤、(e)1つまたは複数の背方化剤、(f)1つまたは複数の腹方化剤、(g)1つまたは複数のWnt活性化剤、および(h)幹細胞の、Pit1を発現する分化細胞の集団への分化を誘導するための指示を含む。ある特定の実施形態では、キットは、(i)1つまたは複数のERアゴニストをさらに含む。
ある特定の実施形態では、キットは、(a)形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤、(b)BMPシグナル伝達の1つまたは複数の活性化剤、(c)FGFシグナル伝達の1つまたは複数の活性化剤、(d)SHHシグナル伝達の1つまたは複数の活性化剤、(e)1つまたは複数の背方化剤、(f)1つまたは複数の腹方化剤、(g)1つまたは複数のWnt活性化剤、(h)1つまたは複数のGH誘導剤、および(i)幹細胞の、GH産生成長ホルモン産生細胞の集団への分化を誘導するための指示を含む。
ある特定の実施形態では、指示は、幹細胞を、阻害剤(複数可)、活性化剤(複数可)、作用物質(複数可)、および誘導剤(複数可)と、特定の順序で接触させることを含む。阻害剤(複数可)、作用物質(複数可)、および誘導剤(複数可)を接触させる順序は、幹細胞を培養するために使用される細胞培養培地によって決定され得る。
ある特定の実施形態では、指示は、本開示の方法によって記載されているように、幹細胞を、阻害剤(複数可)、活性化剤(複数可)、作用物質(複数可)、および誘導剤(複数可)と接触させることを含む(上掲、項目5.2を参照されたい)。
ある特定の実施形態では、本開示は、単位剤形中に、有効量の、本開示の幹細胞由来成長ホルモン産生細胞の集団または前記成長ホルモン産生細胞を含む組成物を含むキットを提供する。ある特定の実施形態では、幹細胞由来細胞は、成熟した分化細胞である。ある特定の実施形態では、キットは、治療用組成物を含有する滅菌容器を含み;このような容器は、ボックス、アンプル、ボトル、バイアル、チューブ、バッグ、パウチ、ブリスターパック、または当該分野で公知の他の好適な容器形態であり得る。このような容器は、プラスチック、ガラス、ラミネート紙、金属ホイル、または医薬を保持するのに好適な他の材料から作製され得る。
ある特定の実施形態では、キットは、本開示の幹細胞由来成長ホルモン産生細胞の集団またはそれを含む組成物を、対象(例えば、GH欠損症を患っている対象)に投与するための指示を含む。指示は、GH欠損症を処置するための細胞または組成物の使用についての情報を含み得る。ある特定の実施形態では、指示は、以下の:治療剤の説明;神経変性障害またはその症状の処置もしくは予防のための投与スケジュールおよび投与;予防措置;警告;適応症;禁忌;過剰投与情報;有害反応;動物薬理学;臨床研究;および/または参考文献のうちの少なくとも1つを含む。指示は、容器(存在する場合)に直接印刷されてもよく、または容器に貼付されるラベルとして、または別個のシート、パンフレット、カード、もしくは容器の中にもしくは容器と一緒に供給されるホルダーとして印刷されてもよい。
5.6 治療用化合物をスクリーニングする方法
本開示の幹細胞由来成長ホルモン産生細胞を使用してGH欠損症をモデリングすることができ、GH欠損症に関連する細胞の表現型を克服することができる候補化合物をスクリーニングするためのプラットフォームとして機能することもできる。GH欠損症を軽減する候補化合物の能力は、GH欠損症を引き起こす生理学的または細胞の欠点を救済する候補化合物の能力をアッセイすることによって決定することができる。
ある特定の実施形態では、方法は、(a)(i)幹細胞(例えば、ヒト幹細胞)から生じる本開示の成長ホルモン産生細胞の集団であって、成長ホルモン産生細胞が、GH欠損症を有する対象由来のヒト幹細胞(例えば、ヒト多能性幹細胞、例えば、hESC、またはhiPSC)から調製されるか、または成長ホルモン産生細胞が、GH欠損症の細胞および/もしくは代謝特性を発現する、集団、および(ii)試験化合物を用意するステップと;(b)成長ホルモン産生細胞を、試験化合物と接触させるステップと、(c)成長ホルモン産生細胞の機能的活性、または遺伝子発現を測定するステップとを含む。ある特定の実施形態では、成長ホルモン産生細胞を、少なくとも約24時間(1日)、約2日間、約3日間、約4日間、約5日間、約6日間、約7日間、約8日間、約9日間、または約10日間、試験化合物と接触させる。
6.実施例
本開示の主題は、本開示の主題の例示として提供され、限定のために提供されるのではない、以下の実施例および付属書類を参照してよりよく理解されよう。
(実施例1)
幹細胞からのヒト成長ホルモン産生細胞の選択的誘導
概要
単層培養によってヒト多能性幹細胞からの成長ホルモン産生細胞の誘導方法(method of derivation)が提供される。この方法により、成長ホルモンを放出することができる成長ホルモン産生細胞がもたらされた。手順は、ステップワイズ分化プロセスであり、これは、異なるタイミングで様々な分子に曝露させ、成長ホルモン産生細胞を生じさせる、前駆細胞/前駆体のいくつかの発生段階を誘導する(induce)ことを含んだ。細胞の、GH欠損マウスに関する前臨床モデルへの移植により、血漿中のGHおよびIGF−1レベルが有意に増加した。
方法および材料
ヒトESまたはiPS細胞を、マトリゲル上のE8培地中で拡大させた。
0日目に、細胞を、BMP4(5ng/ml)およびSB43152(10μM)が添加されたE6培地に取り替え、毎日培地と因子を取り替えた。
3日目に、BMP4を除去し、以下の因子を添加した:FGF8(100ng/ml);FGF10(50ng/ml);FGF18(50ng/ml);Sonic hedgehog(SHH)(100ng/ml)またはSAG(スムーズンドアゴニスト)(100nM);LDN193189(250nM)。培地および因子を1日おきに取り替えた。
8日目に、以下の因子を使用した:FGF8(50ng/ml);BMP2(20ng/ml);CHIR99021(3μM);DPN 2,3−ビス(4−ヒドロキシフェニル)プロピオニトリル(0.1nM)。培地および因子を1日おきに取り替えた。
15日目に、以下の因子を使用した:レチノイン酸(1μM);甲状腺ホルモンT3(10nM);デキサメタゾン(1μM);サイクリックAMP(100μg/ml);DPN(0.1nM);成長ホルモン放出ホルモン(GHRH)(1μM)。培地および因子を1日おきに取り替えた。
29日目に、細胞は成熟期に入り、1〜4週間の範囲のさまざまな期間中同じ因子中に維持することができた。この段階の細胞は、GHRH受容体(GHRHR)を発現した。これらを、GHRHに関するFACS選別に供し、成長ホルモン産生細胞の純粋な細胞集団を得ることができた。プロトコールの持続期間中、細胞はマトリゲル上に存在したままであった。
例えば、図1および14に示されているプロトコールを参照されたい。
このプロトコールはGMP適合性であった。これらの条件は、他の下垂体細胞系統、例えば、ACTHを分泌する副腎皮質刺激ホルモン産生細胞、プロラクチンを分泌する細胞、FSH/LHおよびTSHを分泌する細胞などを有効に抑制した。
結果
GH細胞を得るために、戦略は、最初に、ヒト多能性幹細胞を、前プラコード外胚葉および下垂体前葉前駆細胞に分化させることであった。細胞を、PROP1系統へと、次いで、PIT1系統へとさらに分化させた。次いで、細胞を、最終的に、GH細胞へと分化させた。多能性幹細胞を、成長ホルモンを分泌する細胞へと分化させるためのステップワイズプロトコールは、下垂体前葉前駆細胞においてProp1の発現を促進すること、POU1F1(PIT1)を活性化すること、細胞分化を成長ホルモンを発現する細胞へと方向付けることを含んだ。成長ホルモンを発現する細胞をまた、インキュベーションを延長することによってさらに成熟させた。分化のプロセスをモニターするための重要なマーカーは、Prop1、POU1F1(PIT1)、GHおよびGHRHRを含んだ。
例えば、第1のステップは、BMP4およびTGF−β/Activin/NODAL経路の阻害剤(例えば、SB431542)によって、非神経外胚葉を誘導することであった。次いで、細胞を、TGF−β/Activin/NODAL経路の阻害剤(例えば、SB431542)、FGF8/10/18、SHHアゴニスト(例えば、SHH)、およびSMAD阻害剤(例えば、LDN193189)に供し、下垂体前葉前駆細胞を誘導し、これを、PITX1/2、LHX3/4およびPROP1の発現によって特徴付けた。得られた前プラコード外胚葉および下垂体前葉前駆細胞の遺伝子発現を、単一細胞RNA−seqによって分析し、結果を図2に示す。細胞の70%が、PITX1およびLHX3などの下垂体転写物を共発現した。4つの細胞(分析した全細胞の5%)のみが、T(中胚葉)、SOX17、またはMYODを発現し、これは、夾雑細胞の割合が低いことを示唆した。他のプラコードの運命は、PAX2(上鰓)、PAX3(三叉神経)、またはPAX8(耳)を含み、これらは一緒に、SIX1+集団の約20%において検出された。
加えて、Notchシグナル伝達誘導剤(例えば、BMP4、SB431542、FGF8/10およびSHH)は、PROP1の発現を増加させることができた。図3は、Notchシグナル伝達誘導剤で処置した細胞が、PROP1の発現の増加を示したことを示す。
次いで、細胞を、TGF−β/Activin/NODAL経路(例えば、SB431542)、WNT経路の活性化剤(例えば、CHIR99021)、FGF8、BMP2およびエストロゲンERβ受容体選択的アゴニスト(例えば、DPN)で処置し、PIT1(POU1F1)を発現する細胞を誘導し、これは、成長ホルモン産生細胞、プロラクチン産生細胞および甲状腺刺激ホルモン産生細胞を生じさせることができた。CHIR99021は、Wnt/β−カテニンシグナル伝達を上方調節するためのGSK−β阻害剤であり、Pit1の発現を誘導することができた。図4は、CHIR99021によって処置した細胞におけるPIT1遺伝子発現を示す。ほとんどのPIT1細胞は増殖しておらず、Ki67発現の欠如によって示された。図5は、FGF8による処置は、PROP1の発現を維持することができたが、しかしながら、FGF8による処置のみではPIT1が下方調節され、POMCが上方調節されたことを示す。BMP2の添加は、FGF8の作用を相殺することができた。FGF8、BMP2およびCHIRの組合せの効果は、図6に示されている。この組合せは、GH1の発現を有意に促進した。
成長ホルモン産生細胞への選択的分化のために、レチノイン酸を使用して、甲状腺刺激ホルモン産生細胞によって発現されたPOMCを抑制し、成長ホルモン産生細胞によって発現されるGH1の発現を促進した。さらに、コルチコステロイド(例えば、デキサメタゾン)および甲状腺ホルモン(例えば、T3)を培地に添加し、PRL(プロラクチン産生細胞によって発現された)およびTSH(甲状腺刺激ホルモン産生細胞によって発現された)を阻害し、一方、GH1の発現を促進させた。GH1の発現は、エストロゲンERβ受容体選択的アゴニスト(DPN)およびGHRHシグナル伝達経路のアゴニスト(例えば、GHRHおよびデブチル−cAMP)によってさらに促進された。成長ホルモンを分泌する細胞の選択的誘導に対する、RA、GHRH、T3、およびコルチコステロンの作用は、図6に示されている。図6Aは、RAによる処置によって、GH1の発現が有意に増加したことを示す。図6Bは、GHRHによる処置によって、GH1の発現が有意に増加したことを示す。図6Cは、T3による処置によって、TSH−βの発現が有意に減少したことを示す。図6Dは、コルチコステロンによる処置によって、PRLの発現が有意に減少したことを示す。
このステップの後、培養における大部分の集団が成長ホルモン産生細胞であり、これは、上清中で、成長ホルモン産生細胞マーカーであるGH1を発現し、成長ホルモンを分泌した。この集団の表現型が図8に示されている。細胞集団は、多量のGHおよびGHRHR、ならびに少量のTSH、PRLおよびLHを発現した。GHの発現は、GHRH刺激に際してさらに増加した(図8、右下のパネル)。
この方法の最終ステップは、成長ホルモン産生細胞の成熟をさらに可能にし、数週間にわたって、GHRHの発現を増加させることであった。成長ホルモン産生細胞を、抗GHRHRによる細胞選別(例えば、FACS)によって富化した。図9は、GHRHR陽性細胞において、ほとんどの細胞が、低レベルのGHRHRを発現し、一部の細胞だけが、高レベルのGHRHRを発現したことを示す。高レベルのGHRHRを発現する細胞は、より低い増殖速度とともに多角形形態を示し、これらがより成熟したGH細胞であることを示した。図10は、高レベルのGHRHRを発現する細胞が、低いKi67の発現によって反映される低い増殖速度を有し、低レベルを発現する細胞と比較して有意に多量の成長ホルモンを発現したことを示す。これらの細胞は、抗GHRHRによる細胞選別(例えば、FACS)によってさらに富化することができた。
分化の進行をより密接にモニタリングするために、遺伝子編集によって挿入された内因性レポーターを含むことができる。段階特異的レポーター系を生成するための例示的なレポーター構築物を図11に示す。
(実施例2)
GH欠損症を処置するための分化細胞の使用
GH欠損マウス株に関する前臨床モデルとして、ヒトにおける最も一般的なCPHDを表すPROP1変異を有するため、Ames小人症マウスを選択した。Ames小人症マウスは、正常なマウスの半分のサイズを示し、GHおよびIGF−1のレベルは検出不能であった(図12A〜12C)。Micro−CT分析を大腿骨に関して実施し、結果を図12D〜12Fに示す。主な差は、皮質骨におけるものであった。Ames小人症マウスの骨塩密度と平均皮質厚は、正常なマウスより有意に低かった。加えて、Amesマウスは、より多くの分離とより多数の骨梁とともに、非常に薄い骨梁骨を示した。
Rag1−/−およびAmes小人症マウスを異種交配して、ヒト細胞を受容する免疫欠損Ames小人症マウスを得た。異種交配Ames小人症マウスは、依然として、Ames小人症マウスと同様のサイズを示し、正常なマウスの約半分のサイズであった(図13A)。実施例1に記載された方法に従って得たGHRHR陽性細胞を、免疫欠損Ames小人症マウスに皮下注射した。細胞は移植後6週間生存し、GHを発現する(図13Bを参照されたい)。移植片はGHRH注射によって刺激され、ヒトGHの血漿中レベルを上昇させた(図13Cを参照されたい)。循環形態のIGF−1とIGFBP3発現は、肝臓において48%と75%に回復した(図13Dおよび13Cを参照されたい)。血漿中IGF−1レベルは、正常レベルの約31%であった(図13Fを参照されたい)。この実験のために、150,000個の細胞だけを注射した。最適な結果は、移植細胞数を増加させることによって達成することができる。
よって、これらの結果は、ホルモン産生細胞を視床下部−下垂体の境界面に移植することができ、ホルモン産生細胞が内分泌系を機能させ、統合することができ、動的放出およびフィードバック応答性を含む生理学的に適当な機能、ならびに欠損の救済をもたらすという多くの必要とされる前臨床の概念実証を提供し得る。ここで示される結果は、a)概念実証としてのGH欠損症に関する細胞移植の実行可能性、b)移植細胞の視床下部−下垂体軸への統合と生理学的様式でのGHの動的放出の回復、およびc)潜在的な臨床適用に向けた研究を加速させるcGMPを遵守した条件下での貴重な前臨床データの開発への重要な洞察をもたらすことができる。さらに、cGMP条件に十分に適合性のある化合物および方法を優先することによって、細胞分化プロトコールを作成することができる。
(実施例3)
幹細胞からのヒト成長ホルモン産生細胞の選択的誘導
概要
単層培養によるヒト多能性幹細胞からの成長ホルモン産生細胞の誘導方法が提供される。この方法により、成長ホルモンを放出することができる成長ホルモン産生細胞がもたらされた。手順は、ステップワイズ分化プロセスであり、これは、異なるタイミングで様々な分子に曝露させ、成長ホルモン産生細胞を生じさせる、前駆細胞/前駆体のいくつかの発生段階を誘導することを含んだ。細胞の、GH欠損マウスに関する前臨床モデルへの移植により、血漿中のGHおよびIGF−1レベルの有意な増加がもたらされた。
方法および材料
ヒトESまたはiPS細胞を、マトリゲル上のE8培地中で拡大させた。
0日目に、細胞を、BMP4(5ng/ml)およびSB43152(10μM)が添加されたE6培地に取り替え、毎日培地と因子を取り替えた。
3日目に、BMP4を除去し、以下の因子を添加した:FGF8(100ng/ml);FGF10(50ng/ml);FGF18(50ng/ml);Sonic hedgehog(SHH)(100ng/ml)またはSAG(スムーズンドアゴニスト)(100nM);LDN193189(250nM)。培地および因子を1日おきに取り替えた。
8日目に、以下の因子を使用した:FGF8(100ng/ml);BMP2(20ng/ml);SB43152(10μM)。培地および因子を1日おきに取り替える。
12日目に、以下の因子を使用した:BMP2(20ng/ml);CHIR99021(3μM);DPN 2,3−ビス(4−ヒドロキシフェニル)プロピオニトリル(0.1nM)。培地および因子を1日おきに取り替える。
19日目に、以下の因子を使用した:レチノイン酸(0.1μM);甲状腺ホルモンT3(10nM);デキサメタゾン(1μM);DPN(0.1nM);成長ホルモン放出ホルモン(GHRH)(10nM)、Ghrelin(10nM)。培地および因子を1日おきに取り替えた。
24日目に、以下の因子を使用した:甲状腺ホルモンT3(10nM);デキサメタゾン(1μM);DPN(0.1nM);成長ホルモン放出ホルモン(GHRH)(10nM);Ghrelin(10nM);IL−6(25ng/ml)。培地および因子を1日おきに取り替えた。
33日目に、以下の因子を使用した:甲状腺ホルモンT3(10nM);デキサメタゾン(1μM);DPN(0.1nM)。培地および因子を1日おきに取り替えた。
33日目に、細胞は成熟期に入った。この段階の細胞は、GHRH受容体(GHRHR)を発現した。
例えば、図15に示されているプロトコールを参照されたい。
これらを、GHRHに関するFACS選別に供し、成長ホルモン産生細胞の純粋な細胞集団を得ることができた。プロトコールの持続期間中、細胞はマトリゲル上に存在したままであった。このプロトコールはGMP適合性であった。これらの条件は、ACTHを分泌する副腎皮質刺激ホルモン産生細胞、プロラクチンを分泌する細胞、FSH/LHおよびTSHを分泌する細胞などの他の下垂体細胞系統を有効に抑制した。
本開示の主題およびその利点が詳細に記載されてきたが、様々な変更、置換および改変が、添付の特許請求の範囲によって定義されているように、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく本明細書においてなされ得ることが理解されるべきである。さらに、本出願の範囲は、本明細書に記載されているプロセス、機械、製造、および組成物、手段、方法およびステップの特定の実施形態に限定されることを意図されていない。当業者が、本開示の主題の開示から容易に理解するように、既存のまたは後に開発される、本明細書に記載の対応する実施形態と実質的に同じ機能を行うかまたは実質的に同じ結果を達成する、プロセス、機械、製造、組成物、手段、方法またはステップを、本開示の主題に従って利用することができる。したがって、添付の特許請求の範囲は、その範囲内に、このようなプロセス、機械、製造、組成物、手段、方法、またはステップを含むことを意図する。
特許、特許出願、刊行物、製品説明およびプロトコールが本出願全体を通して引用されており、その開示は、すべての目的のために、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

Claims (143)

  1. 下垂体前駆体の分化を誘導するためのin vitro方法であって、1つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する細胞を、1つまたは複数の背方化剤および1つまたは複数の腹方化剤と接触させるステップと;前記細胞を、Wingless(Wnt)シグナル伝達の1つまたは複数の活性化剤(Wnt活性化剤)および成長ホルモンの発現を誘導することが可能である1つまたは複数の分子(GH誘導剤)と接触させて、分化細胞の細胞集団を得るステップであって、分化細胞のうちの少なくとも約50%が、成長ホルモンを産生することが可能である成長ホルモン産生細胞(GH産生成長ホルモン産生細胞)であるステップとを含む、方法。
  2. 前記GH産生成長ホルモン産生細胞が、低レベルのGHRHR免疫反応性を発現する細胞(GHRHRlow細胞)、高レベルのGHRHR免疫反応性を発現する細胞(GHRHRhigh細胞)、およびその組合せを含む、請求項1に記載の方法。
  3. 1つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する前記細胞の、前記1つまたは複数の背方化剤との最初の接触から少なくとも約10日で、少なくとも約50%のGHRHRlow細胞を含む細胞集団を得るステップを含む、請求項2に記載の方法。
  4. 1つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する前記細胞の、前記1つまたは複数の背方化剤との最初の接触から約2週間または3週間で、少なくとも約50%のGHRHRlow細胞を含む細胞集団を得るステップを含む、請求項2または3に記載の方法。
  5. 1つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する前記細胞の、前記1つまたは複数の背方化剤との最初の接触から約15日で、少なくとも約50%のGHRHRlow細胞を含む細胞集団を得るステップを含む、請求項2または3に記載の方法。
  6. 1つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する前記細胞の、前記1つまたは複数の背方化剤との最初の接触から少なくとも約10日で、少なくとも約50%のGHRHRhigh細胞を含む細胞集団を得るステップを含む、請求項2に記載の方法。
  7. 1つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する前記細胞の、前記1つまたは複数の背方化剤との最初の接触から約3週間で、少なくとも約50%のGHRHRhigh細胞を含む細胞集団を得るステップを含む、請求項2から6のいずれか一項に記載の方法。
  8. 1つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する前記細胞の、前記1つまたは複数の背方化剤との最初の接触から約25日で、少なくとも約50%のGHRHRhigh細胞を含む細胞集団を得るステップを含む、請求項2から7のいずれか一項に記載の方法。
  9. 1つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する前記細胞の、前記1つまたは複数の背方化剤との最初の接触から約35日で、少なくとも約50%のGHRHRhigh細胞を含む細胞集団を得るステップを含む請求項2から7のいずれか一項に記載の方法。
  10. 幹細胞の分化を誘導するためのin vitro方法であって、幹細胞を、1つまたは複数のBMP分子およびTGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤と接触させるステップと;前記細胞を、SHHシグナル伝達の1つまたは複数の活性化剤、FGFシグナル伝達の1つまたは複数の活性化剤、1つまたは複数の背方化剤、1つまたは複数の腹方化剤、Wingless(Wnt)シグナル伝達の1つまたは複数の活性化剤(Wnt活性化剤)および1つまたは複数の成長ホルモン(GH)誘導剤と接触させて、分化細胞の細胞集団を得るステップであって、分化細胞の少なくとも約50%が、成長ホルモンを産生することが可能である成長ホルモン産生細胞(GH産生成長ホルモン産生細胞)であるステップとを含む、方法。
  11. 前記GH産生成長ホルモン産生細胞が、低レベルのGHRHR免疫反応性を発現する細胞(GHRHRlow細胞)、高レベルのGHRHR免疫反応性を発現する細胞(GHRHRhigh細胞)、およびその組合せを含む、請求項10に記載の方法。
  12. 前記幹細胞の、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の前記1つまたは複数の阻害剤との最初の接触から少なくとも約3週間で、少なくとも約50%のGHRHRlow細胞を含む細胞集団を得るステップを含む、請求項11に記載の方法。
  13. 前記幹細胞の、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の前記1つまたは複数の阻害剤との最初の接触から約24日で、少なくとも約50%のGHRHRlow細胞を含む細胞集団を得るステップを含む、請求項11または12に記載の方法。
  14. 前記幹細胞の、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の前記1つまたは複数の阻害剤との最初の接触から約4週間で、少なくとも約50%のGHRHRlow細胞を含む細胞集団を得るステップを含む、請求項11または12に記載の方法。
  15. 前記幹細胞の、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の前記1つまたは複数の阻害剤との最初の接触から少なくとも約4週間で、少なくとも約50%のGHRHRhigh細胞を含む細胞集団を得るステップを含む、請求項11から14のいずれか一項に記載の方法。
  16. 前記幹細胞の、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の前記1つまたは複数の阻害剤との最初の接触から約6週間で、少なくとも約50%のGHRHRhigh細胞を含む細胞集団を得るステップを含む、請求項12から15のいずれか一項に記載の方法。
  17. 前記幹細胞の、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の前記1つまたは複数の阻害剤との最初の接触から約30日で、少なくとも約50%のGHRHRhigh細胞を含む細胞集団を得るステップを含む、請求項12から15のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記幹細胞の、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の前記1つまたは複数の阻害剤との最初の接触から33日で、少なくとも約50%のGHRHRhigh細胞を含む細胞集団を得るステップを含む、請求項12から15のいずれか一項に記載の方法。
  19. 下垂体前駆体の分化を誘導するためのin vitro方法であって、1つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する細胞を、1つまたは複数の背方化剤および1つまたは複数の腹方化剤と接触させるステップと;前記細胞を、Wingless(Wnt)シグナル伝達の1つまたは複数の活性化剤と接触させて、分化細胞の細胞集団を得るステップであって、分化細胞の少なくとも約50%が、Pit1を発現するステップとを含む、方法。
  20. 1つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する前記細胞の、前記1つまたは複数の背方化剤との最初の接触から少なくとも約5日で、前記細胞集団を得るステップを含む、請求項19に記載の方法。
  21. 1つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する前記細胞の、前記1つまたは複数の背方化剤との最初の接触から約7日または約11日で、前記細胞集団を得るステップを含む、請求項19または20に記載の方法。
  22. 幹細胞の分化を誘導するためのin vitro方法であって、幹細胞を、1つまたは複数のBMP分子およびTGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤と接触させるステップと;前記細胞を、SHHシグナル伝達の1つまたは複数の活性化剤、FGFシグナル伝達の1つまたは複数の活性化剤、1つまたは複数の背方化剤、1つまたは複数の腹方化剤、およびWingless(Wnt)シグナル伝達の1つまたは複数の活性化剤(Wnt活性化剤)と接触させて、分化細胞の細胞集団を得るステップであって、分化細胞の少なくとも約50%が、Pit1を発現するステップとを含む、方法。
  23. 前記幹細胞の、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の前記1つまたは複数の阻害剤との最初の接触から少なくとも約10日で、前記細胞集団を得るステップを含む、請求項22に記載の方法。
  24. 前記幹細胞の、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の前記1つまたは複数の阻害剤との最初の接触から少なくとも約15日で、前記細胞集団を得るステップを含む、請求項22または23に記載の方法。
  25. 前記幹細胞の、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の前記1つまたは複数の阻害剤との最初の接触から約15日で、前記細胞集団を得るステップを含む、請求項22から24のいずれか一項に記載の方法。
  26. 前記幹細胞の、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の前記1つまたは複数の阻害剤との最初の接触から約20日で、前記細胞集団を得るステップを含む、請求項22から24のいずれか一項に記載の方法。
  27. 前記細胞の、前記1つまたは複数のWnt活性化剤との最初の接触が、1つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する前記細胞の、前記1つまたは複数の背方化剤との最初の接触から5日以内である、請求項1から26のいずれか一項に記載の方法。
  28. 前記細胞の、前記1つまたは複数のWnt活性化剤との最初の接触が、1つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する前記細胞の、前記1つまたは複数の背方化剤との最初の接触と同じ日に起こる、請求項1から27のいずれか一項に記載の方法。
  29. 前記細胞の、前記1つまたは複数のWnt活性化剤との最初の接触が、1つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する前記細胞の、前記1つまたは複数の背方化剤との最初の接触から約4日である、請求項1から28のいずれか一項に記載の方法。
  30. 前記細胞を、少なくとも約5日間および/または最長約15日間、前記1つまたは複数のWnt活性化剤と接触させるステップを含む、請求項1から29のいずれか一項に記載の方法。
  31. 前記細胞を、少なくとも約7日間、前記1つまたは複数のWnt活性化剤と接触させるステップを含む、請求項1から30のいずれか一項に記載の方法。
  32. 前記細胞を、少なくとも約3日間および/または最長約10日間、前記1つまたは複数の背方化剤と接触させるステップを含む、請求項1から31のいずれか一項に記載の方法。
  33. 前記細胞を、約4日間または約7日間、前記1つまたは複数の背方化剤と接触させるステップを含む、請求項1から32のいずれか一項に記載の方法。
  34. 前記細胞を、少なくとも約5日間および/または最長約15日間、前記1つまたは複数の腹方化剤と接触させるステップを含む、請求項1から33のいずれか一項に記載の方法。
  35. 前記細胞を、少なくとも約7日間または約11日間、前記1つまたは複数の腹方化剤と接触させるステップを含む、請求項1から34のいずれか一項に記載の方法。
  36. 1つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する前記細胞を、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤と接触させるステップをさらに含む、請求項1から35のいずれか一項に記載の方法。
  37. 前記細胞を、少なくとも約3日間および/または最長約10日間、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の前記1つまたは複数の阻害剤と接触させるステップを含む、請求項36に記載の方法。
  38. 前記細胞を、約4日間または約7日間、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の前記1つまたは複数の阻害剤と接触させるステップを含む、請求項36または37に記載の方法。
  39. 前記細胞を、前記1つまたは複数の背方化剤およびTGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の前記1つまたは複数の阻害剤と、同時に接触させるステップを含む、請求項36から38のいずれか一項に記載の方法。
  40. 前記細胞を、1つまたは複数のエストロゲン受容体(ER)アゴニストと接触させるステップをさらに含む、請求項1から39のいずれか一項に記載の方法。
  41. 前記細胞を、1つまたは複数のERアゴニストおよび前記1つまたは複数のWnt活性化剤と、同時に接触させるステップを含む、請求項40に記載の方法。
  42. 前記細胞の、前記1つまたは複数のERアゴニストとの最初の接触が、1つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する前記細胞の、前記1つまたは複数の背方化剤との最初の接触から10日以内である、請求項40または41に記載の方法。
  43. 前記細胞の、前記1つまたは複数のERアゴニストとの最初の接触が、1つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する前記細胞の、前記1つまたは複数の背方化剤との最初の接触と同じ日に起こる、請求項40から42のいずれか一項に記載の方法。
  44. 前記細胞の、前記1つまたは複数のERアゴニストとの最初の接触が、1つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する前記細胞の、前記1つまたは複数の背方化剤との最初の接触から約4日である、請求項40から42のいずれか一項に記載の方法。
  45. 前記細胞を、少なくとも約5日間および/または最長約15日間、前記1つまたは複数のERアゴニストと接触させるステップを含む、請求項40から44のいずれか一項に記載の方法。
  46. 前記細胞を、少なくとも約7日間または約8日間、前記1つまたは複数のERアゴニストと接触させるステップを含む、請求項40から45のいずれか一項に記載の方法。
  47. 1つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する前記細胞が、幹細胞のin vitroでの分化によって得られる、請求項1から9、19から21、および27から45のいずれか一項に記載の方法。
  48. 幹細胞の前記in vitroでの分化が、幹細胞を、1つまたは複数のBMP分子およびTGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤と接触させるステップ、前記細胞を、SHHシグナル伝達の1つまたは複数の活性化剤およびFGFシグナル伝達の1つ、2つ、またはそれより多い活性化剤と接触させるステップを含む、請求項47に記載の方法。
  49. 前記幹細胞を、少なくとも約2日間および/または約4日以内、前記1つまたは複数のBMP分子と接触させる、請求項10から18、22から26、47、および48のいずれか一項に記載の方法。
  50. 前記幹細胞を、少なくとも約5日間、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の前記1つまたは複数の阻害剤と接触させる、請求項10から18、22から26、および47から49のいずれか一項に記載の方法。
  51. 前記幹細胞を、約8日間、TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の前記1つまたは複数の阻害剤と接触させる、請求項10から18、22から26、および47から50のいずれか一項に記載の方法。
  52. 前記幹細胞を、少なくとも約2日間、SHHシグナル伝達の前記1つまたは複数の活性化剤、およびFGFシグナル伝達の1つ、2つ、またはそれより多い活性化剤と接触させる、請求項10から18、22から26、および47から51のいずれか一項に記載の方法。
  53. 前記幹細胞を、約5日間、SHHシグナル伝達の前記1つまたは複数の活性化剤、およびFGFシグナル伝達の1つ、2つ、またはそれより多い活性化剤と接触させる、請求項10から18、22から26、および47から52のいずれか一項に記載の方法。
  54. 幹細胞の前記in vitroでの分化が、前記細胞を、SMADシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤と接触させるステップをさらに含む、請求項10から18、22から26、および47から53のいずれか一項に記載の方法。
  55. 前記幹細胞を、少なくとも約2日間、SMADシグナル伝達の前記1つまたは複数の阻害剤と接触させる、請求項54に記載の方法。
  56. 前記幹細胞を、約5日間、SMADシグナル伝達の前記1つまたは複数の阻害剤と接触させる、請求項54または55に記載の方法。
  57. 1つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する前記細胞を、Pit1を発現する細胞へと分化させるステップと、Pit1を発現する前記細胞を、GHRHRlow細胞へと分化させるステップと、前記GHRHRlow細胞を、GHRHRhigh細胞へと分化させるステップとを含む、請求項1から9および27から56のいずれか一項に記載の方法。
  58. 前記幹細胞を、1つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する細胞へと分化させるステップと、1つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する前記細胞を、Pit1を発現する細胞へと分化させるステップと、Pit1を発現する前記細胞を、GHRHRlow細胞へと分化させるステップと、前記GHRHRlow細胞を、GHRHRhigh細胞へと分化させるステップとを含む、請求項10から18および27から56のいずれか一項に記載の方法。
  59. 前記幹細胞を、1つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する細胞へと分化させるステップと、1つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する前記細胞を、Pit1を発現する細胞へと分化させるステップとを含む、請求項22から56のいずれか一項に記載の方法。
  60. Pit1を発現する前記細胞の、GHRHRlow細胞への分化が、Pit1を発現する細胞を、GH誘導剤の第1の組合せと接触させることを含む、請求項57または58に記載の方法。
  61. GH誘導剤の前記第1の組合せが、レチノイン酸(RA)、コルチコステロイド、甲状腺ホルモン、GHRHシグナル伝達のアゴニスト、ERアゴニスト、およびGhrelinシグナル伝達経路のアゴニストからなる群から選択される、請求項60に記載の方法。
  62. GH誘導剤の前記第1の組合せが、レチノイン酸(RA)、コルチコステロイド、甲状腺ホルモン、およびGHRHシグナル伝達のアゴニストを含む、請求項60または61に記載の方法。
  63. GH誘導剤の前記第1の組合せが、RA、デキサメタゾン、T3、およびGHRHを含む、請求項62に記載の方法。
  64. GH誘導剤の前記第1の組合せが、レチノイン酸(RA)、コルチコステロイド、甲状腺ホルモン、2種のGHRHシグナル伝達のアゴニスト、およびERアゴニストを含む、請求項60または61に記載の方法。
  65. GH誘導剤の前記第1の組合せが、RA、デキサメタゾン、T3、GHRH、cAMP、およびDPNを含む、請求項64に記載の方法。
  66. GH誘導剤の前記第1の組合せが、レチノイン酸(RA)、コルチコステロイド、甲状腺ホルモン、GHRHシグナル伝達のアゴニスト、ERアゴニスト、およびGhrelinシグナル伝達経路のアゴニストを含む、請求項60または61に記載の方法。
  67. GH誘導剤の前記第1の組合せが、RA、デキサメタゾン、T3、GHRH、DPN、およびGhrelinを含む、請求項66に記載の方法。
  68. Pit1を発現する前記細胞を、少なくとも約3日間、GH誘導剤の前記第1の組合せと接触させて、少なくとも約50%のGHRHRlow細胞を含む細胞集団を得るステップを含む、請求項60から67のいずれか一項に記載の方法。
  69. Pit1を発現する前記細胞を、約5日間、GH誘導剤の前記第1の組合せと接触させて、少なくとも約50%のGHRHRlow細胞を含む細胞集団を得るステップを含む、請求項60から68のいずれか一項に記載の方法。
  70. Pit1を発現する前記細胞を、約2週間、GH誘導剤の前記第1の組合せと接触させて、少なくとも約50%のGHRHRlow細胞を含む細胞集団を得るステップを含む、請求項60から69のいずれか一項に記載の方法。
  71. 前記GHRHRlow細胞のGHRHRhigh細胞への分化が、前記GHRHlow細胞を、GH誘導剤の第2の組合せと接触させることを含む、請求項57または58に記載の方法。
  72. GH誘導剤の前記第2の組合せが、レチノイン酸(RA)、コルチコステロイド、甲状腺ホルモン、GHRHシグナル伝達のアゴニスト、ERアゴニスト、インターロイキン、およびGhrelinシグナル伝達経路のアゴニストからなる群から選択される、請求項71に記載の方法。
  73. GH誘導剤の前記第2の組合せが、レチノイン酸(RA)、コルチコステロイド、甲状腺ホルモン、およびGHRHシグナル伝達のアゴニストを含む、請求項71または72に記載の方法。
  74. GH誘導剤の前記第2の組合せが、RA、デキサメタゾン、T3、およびGHRHを含む、請求項73に記載の方法。
  75. GH誘導剤の前記第2の組合せが、レチノイン酸(RA)、コルチコステロイド、甲状腺ホルモン、2種のGHRHシグナル伝達のアゴニスト、およびERアゴニストを含む、請求項71または72に記載の方法。
  76. GH誘導剤の前記第2の組合せが、RA、デキサメタゾン、T3、GHRH、cAMP、およびDPNを含む、請求項75に記載の方法。
  77. GH誘導剤の前記第2の組合せが、コルチコステロイド、甲状腺ホルモン、GHRHシグナル伝達のアゴニスト、ERアゴニスト、インターロイキン、およびGhrelinシグナル伝達経路のアゴニストを含む、請求項71または72に記載の方法。
  78. GH誘導剤の前記第2の組合せが、デキサメタゾン、T3、GHRH、IL−6、Ghrelin、およびDPNを含む、請求項77に記載の方法。
  79. 前記GHRHRlow細胞を、少なくとも約5日間、GH誘導剤の前記第2の組合せと接触させて、少なくとも約50%のGHRHRhigh細胞を含む細胞集団を得るステップを含む、請求項71から78のいずれか一項に記載の方法。
  80. 前記GHRHRlow細胞を、約10日間、GH誘導剤の前記第2の組合せと接触させて、少なくとも約50%のGHRHRhigh細胞を含む細胞集団を得るステップを含む、請求項71から79のいずれか一項に記載の方法。
  81. 前記GHRHRlow細胞を、約4週間、GH誘導剤の前記第2の組合せと接触させて、少なくとも約50%のGHRHRhigh細胞を含む細胞集団を得るステップを含む、請求項71から80のいずれか一項に記載の方法。
  82. 前記1つまたは複数の下垂体前駆体マーカーが、SIX1、LHX3、LHX4、PITX1、PITX2、HESX1、PROP1、SIX6、TBX19、PAX6、GATA2、SF1、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項1から9、19から21、および27から81のいずれか一項に記載の方法。
  83. 前記1つまたは複数の背方化剤が、FGFシグナル伝達の1つまたは複数の活性化剤を含み、請求項1から82のいずれか一項に記載の方法。
  84. FGFシグナル伝達の前記1つまたは複数の活性化剤が、FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF7、FGF8、FGF10、FGF18、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項10から18および22から83のいずれか一項に記載の方法。
  85. FGFシグナル伝達の前記1つまたは複数の活性化剤が、FGF8を含む、請求項10から18および22から84のいずれか一項に記載の方法。
  86. FGFシグナル伝達の前記1つまたは複数の活性化剤が、FGF8およびFGF10を含む、請求項10から18、22から82、84、および85のいずれか一項に記載の方法。
  87. FGFシグナル伝達の前記1つまたは複数の活性化剤が、FGF8、FGF10、およびFGF18を含む、請求項10から18、22から82、84から86のいずれか一項に記載の方法。
  88. 前記1つまたは複数の腹方化剤が、1つまたは複数のBMP分子を含む、請求項1から87のいずれか一項に記載の方法。
  89. 前記1つまたは複数のBMP分子が、BMP1、BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8a、BMP8b、BMP10、BMP11、BMP15、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項10から18および22から88のいずれか一項に記載の方法。
  90. 前記1つまたは複数のBMP分子が、BMP2を含む、請求項10から18および22から89のいずれか一項に記載の方法。
  91. 前記1つまたは複数のBMP分子が、BM4を含む、請求項10から18、22から87、89、および90のいずれか一項に記載の方法。
  92. 前記1つまたは複数のWnt活性化剤が、CHIR99021、Wnt−1、WNT3A、Wnt4、Wnt5a、WAY−316606、IQ1、QS11、SB−216763、BIO(6−ブロモインジルビン−3’−オキシム)、LY2090314、DCA、2−アミノ−4−[3,4−(メチレンジオキシ)ベンジル−アミノ]−6−(3−メトキシフェニル)ピリミジン、(ヘテロ)アリールピリミジン、その誘導体、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項1から91のいずれか一項に記載の方法。
  93. 前記1つまたは複数のWnt活性化剤が、CHIR99021である、請求項1から92のいずれか一項に記載の方法。
  94. 前記1つまたは複数のGH誘導剤が、レチノイン酸(RA)、コルチコステロイド、甲状腺ホルモン、ERアゴニスト、GHRHシグナル伝達経路のアゴニスト、Ghrelinシグナル伝達経路のアゴニスト、インターロイキン、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項1から18および60から93のいずれか一項に記載の方法。
  95. 前記コルチコステロイドが、デキサメタゾン、コルチゾン、ヒドロコルチゾン、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項61から94のいずれか一項に記載の方法。
  96. 前記コルチコステロイドが、デキサメタゾンである、請求項61から95のいずれか一項に記載の方法。
  97. 前記甲状腺ホルモンが、T3、T4、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項61から96のいずれか一項に記載の方法。
  98. 前記甲状腺ホルモンが、T3である、請求項61から97のいずれか一項に記載の方法。
  99. 前記GHRHシグナル伝達経路のアゴニストが、GHRH、c−AMP(例えば、ジブチリル−cAMP)、PKA、CREB、MAPK活性化剤、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項61から98のいずれか一項に記載の方法。
  100. 前記GHRHシグナル伝達経路のアゴニストが、GHRH、c−AMP、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項61から99のいずれか一項に記載の方法。
  101. 前記Ghrelinシグナル伝達経路のアゴニストが、Ghrelin、GHSRアゴニスト、その誘導体およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項61から100のいずれか一項に記載の方法。
  102. 前記インターロイキンが、IL−1、IL−2、IL−3、IL−4、IL−5、IL−6、IL−7、IL−8、IL−9、IL−10、IL−11、IL−12、IL−13、IL−15、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項61から101のいずれか一項に記載の方法。
  103. 前記インターロイキンが、IL−1、IL−6、IL−10、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項61から102のいずれか一項に記載の方法。
  104. 前記インターロイキンが、IL−6である、請求項61から103のいずれか一項に記載の方法。
  105. 前記1つまたは複数のERアゴニストが、ジアリールプロピオニトリル(DPN)、エストラジオール(E2)、プロピルピラゾール−トリオール(PPT)、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項40から104に記載の方法。
  106. 前記1つまたは複数のERアゴニストが、DPNを含む、請求項40から105のいずれか一項に記載の方法。
  107. TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の前記1つまたは複数の阻害剤が、SB431542、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項10から18および22から106のいずれか一項に記載の方法。
  108. SHHシグナル伝達の前記1つまたは複数の活性化剤が、SHH、C25IIおよびパルモルファミンなどのスムーズンド(SMO)受容体小分子アゴニスト、SAG(例えば、Stanton et al, Mol Biosyst. 2010 Jan;6(1):44−54に開示されているような)、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項10から18および22から107のいずれか一項に記載の方法。
  109. SHHシグナル伝達の前記1つまたは複数の活性化剤が、SHHを含む、請求項10から18および22から108のいずれか一項に記載の方法。
  110. SHHシグナル伝達の前記1つまたは複数の活性化剤が、SAGを含む、請求項10から18および22から109のいずれか一項に記載の方法。
  111. SMADシグナル伝達の前記1つまたは複数の阻害剤が、LDN193189、Noggin、Dorsomorphin、K02288、DMH1、ML347、LDN212854、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項54から110のいずれか一項に記載の方法。
  112. SMADシグナル伝達の前記1つまたは複数の阻害剤が、LDN193189を含む、請求項54から111のいずれか一項に記載の方法。
  113. 前記細胞を、約10ng/mLから200ng/mLの間の濃度の前記1つまたは複数の背方化剤と接触させる、請求項1から112のいずれか一項に記載の方法。
  114. 前記細胞を、約1ng/mLから30ng/mLの間の濃度の前記1つまたは複数の腹方化剤と接触させる、請求項1から113のいずれか一項に記載の方法。
  115. 前記細胞を、約10ng/mlから200ng/mLの間の濃度のFGFシグナル伝達の前記1つまたは複数の活性化剤と接触させる、請求項10から18および22から114のいずれか一項に記載の方法。
  116. 前記細胞を、約0.1ng/mlから10ng/mlの間の濃度のBMP分子の前記1つまたは複数の活性化剤と接触させる、請求項10から18および22から115のいずれか一項に記載の方法。
  117. 前記細胞を、約1μMから20μMの間の濃度のTGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の前記1つまたは複数の阻害剤と接触させる、請求項1から116のいずれか一項に記載の方法。
  118. 前記細胞を、約50ng/mlから200ng/mlの間、または約50nMから200nMの間の濃度のSHHシグナル伝達の前記1つまたは複数の活性化剤と接触させる、請求項10から18および22から117のいずれか一項に記載の方法。
  119. 前記細胞を、約1μMから10μMの濃度の前記1つまたは複数のWnt活性化剤と接触させる、請求項1から118のいずれか一項に記載の方法。
  120. 前記細胞を、約0.1nMから20nMの間の濃度の前記1つまたは複数のERアゴニストと接触させる、請求項40から119のいずれか一項に記載の方法。
  121. 前記細胞を、約0.1μMから1μMの濃度のRAと接触させる、請求項61から120のいずれか一項に記載の方法。
  122. 前記細胞を、約1nMから20nMの間の濃度の1つまたは複数の甲状腺ホルモンと接触させる、請求項61から121のいずれか一項に記載の方法。
  123. 前記細胞を、約0.1μMから10μMの濃度の1つまたは複数のコルチコステロイドと接触させる、請求項61から122のいずれか一項に記載の方法。
  124. 前記細胞を、約0.1μMから10μMまたは約0.1μM未満、または10nMの濃度の1つまたは複数のGHRHシグナル伝達経路のアゴニストと接触させる、請求項61から123のいずれか一項に記載の方法。
  125. 前記細胞を、約1nMから50nMの間の濃度の1つまたは複数のGhrelinシグナル伝達経路のアゴニストと接触させる、請求項61から124のいずれか一項に記載の方法。
  126. 前記細胞を、約1ng/mlから50ng/mlの間の濃度の1つまたは複数のインターロイキンと接触させる、請求項61から125のいずれか一項に記載の方法。
  127. 前記細胞を、約100nMから300nMの間の濃度のSMADシグナル伝達の前記1つまたは複数の阻害剤と接触させる、請求項61から126のいずれか一項に記載の方法。
  128. 成長ホルモンを産生することが可能であるin vitro分化細胞(GH産生成長ホルモン産生細胞)の細胞集団であって、前記in vitro分化細胞が、請求項10から18および22から127のいずれか一項に記載の方法に従って、幹細胞から生じる、細胞集団。
  129. 成長ホルモンを産生することが可能であるin vitro分化細胞(GH産生成長ホルモン産生細胞)の細胞集団であって、前記in vitro分化細胞が、請求項1から9、19から21、および27から128のいずれか一項に記載の方法に従って、下垂体前駆体から生じる、細胞集団。
  130. 請求項128または129に記載の細胞集団を含む組成物。
  131. in vitro分化細胞の集団を含む組成物であって、前記分化細胞の少なくとも約50%が、成長ホルモンを産生することが可能(GH産生成長ホルモン産生細胞)であり、前記分化細胞の約25%未満が、プロラクチン産生細胞マーカー、甲状腺刺激ホルモン産生細胞マーカー、下垂体前駆体マーカー、Pit1、幹細胞マーカー、NNEマーカー、神経堤(NC)系統マーカー、および非下垂体プラコードマーカーからなる群から選択される1つまたは複数のマーカーを発現する、組成物。
  132. 前記非下垂体プラコードマーカーが、頭蓋プラコードマーカー、上鰓プラコードマーカー、三叉神経プラコードマーカー、および耳プラコードマーカーからなる群から選択される、請求項131に記載の組成物。
  133. (a)1つまたは複数の背方化剤;
    (b)1つまたは複数の腹方化剤;
    (c)Wingless(Wnt)シグナル伝達の1つまたは複数の活性化剤(Wnt活性化剤);および
    (d)1つまたは複数の成長ホルモン(GH)誘導剤
    を含む、下垂体前駆体のGH産生成長ホルモン産生細胞への分化を誘導するためのキット。
  134. (a)1つまたは複数のBMP分子;
    (b)TGFβ/Activin−Nodalシグナル伝達の1つまたは複数の阻害剤;
    (c)FGFシグナル伝達の1つまたは複数の活性化剤;
    (d)SHHシグナル伝達の1つまたは複数の活性化剤
    (e)1つまたは複数の背方化剤;
    (f)1つまたは複数の腹方化剤;
    (g)Wingless(Wnt)シグナル伝達の1つまたは複数の活性化剤(Wnt活性化剤);および
    (h)1つまたは複数の成長ホルモン(GH)誘導剤
    を含む、幹細胞のGH産生成長ホルモン産生細胞への分化を誘導するためのキット。
  135. 1つまたは複数のERアゴニストをさらに含む、請求項133または134に記載のキット。
  136. 対象におけるGHの発現および/もしくは分泌を増加させる、GH、インスリン様成長因子1(IGF−1)、およびIGF−2のうちの1つもしくは複数の動的放出を回復させる、ならびに/またはGH欠損症を処置する方法であって、前記対象に、以下の:
    (a)請求項128または129に記載の細胞集団;および
    (b)請求項130から132のいずれか一項に記載の組成物
    のうちの1つを投与するステップを含む方法。
  137. 対象におけるGHの発現および/もしくは分泌を増加させる、GH、インスリン様成長因子1(IGF−1)、およびIGF−2のうちの1つもしくは複数の動的放出を回復させる、ならびに/またはGH欠損症を処置するための医薬の製造における、請求項128または129に記載の細胞集団の使用。
  138. 対象におけるGHの発現および/もしくは分泌を増加させる、GH、インスリン様成長因子1(IGF−1)、およびIGF−2のうちの1つもしくは複数の動的放出を回復させる、ならびに/またはGH欠損症を処置するための医薬の製造における、請求項130から132のいずれか一項に記載の組成物の使用。
  139. 療法における使用のための、請求項128または129に記載の細胞集団。
  140. 療法における使用のための、請求項130から132のいずれか一項に記載の組成物。
  141. 対象におけるGHの発現および/もしくは分泌を増加させる、GH、インスリン様成長因子1(IGF−1)、およびIGF−2のうちの1つもしくは複数の動的放出を回復させる、ならびに/またはGH欠損症を処置することにおける使用のための、請求項128または129に記載の細胞集団。
  142. 対象におけるGHの発現および/もしくは分泌を増加させる、GH、インスリン様成長因子1(IGF−1)、およびIGF−2のうちの1つもしくは複数の動的放出を回復させる、ならびに/またはGH欠損症を処置することにおける使用のための、請求項130から132のいずれか一項に記載の組成物。
  143. GH欠損症に関連する1つまたは複数の細胞表現型を克服することが可能である治療用化合物をスクリーニングするための方法であって、
    (a)請求項128または129に記載のin vitroで分化したGH産生成長ホルモン産生細胞の細胞集団を、試験化合物と接触させるステップと;(b)前記GH産生成長ホルモン産生細胞の機能的活性および/または遺伝子発現を測定するステップであって、前記GH産生成長ホルモン産生細胞が、GH欠損症を有する対象の幹細胞またはGH欠損症を有する対象の1つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する細胞から得られるステップとを含む方法。
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