CN116234899A - 筏式培养物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本文公开了更接近地类似原生器官结构的食管筏式培养物组合物。这些食管筏式培养物也可以通过与肠神经嵴细胞组合而受神经支配。这些食管筏式培养物对于诸如研究细胞器功能、发育和组织等目的是有利的。本文还公开了产生所述食管筏式培养物组合物的方法。

Description

筏式培养物及其制备方法
关于联邦资助研发的声明
本发明是根据国立卫生研究院授予的P01 HD093363在政府支持下完成的。政府享有本发明的某些权利。
技术领域
本公开的各方面总体上涉及食管筏式培养物组合物以及制备所述食管筏式培养物组合物的方法。本文公开的筏式培养物更接近地类似原生器官结构。
背景技术
与传统的二维培养系统相比，三维(3D)细胞培养物(如类器官)作为生物功能和发育的模型具有很大的前景。这些3D培养物具有更准确地反映体内存在的器官的特性的潜力，以用于如药理学行为、细胞信号传导、癌症形成和迁移或移植(transplant/grafting)等应用。然而，模拟活生物体中存在的复杂结构的器官组织的体外形成仍然是新兴领域。
发明内容
目前需要更精确的3D器官模型及其例如更有效、更便宜且耗时更少的制作方法。目前还需要任选地避免异种组分的培养制剂，这可能具有重要的安全性和监管意义。本文公开了来自分化的前部前肠细胞的食管筏式培养物及其中间细胞组合物。在一些实施方案中，中间细胞组合物包含背侧前部前肠细胞和/或食管祖细胞。本文还公开了产生所述食管筏式培养物及其中间细胞组合物的方法。在一些实施方案中，该方法包括使前部前肠细胞与EGF通路活化剂、BMP通路抑制剂、FGF通路活化剂或生长补充剂或它们的任何组合中的一者或多者(例如至少1者、2者、3者、4者)接触，以使该前部前肠细胞分化为背侧前部前肠细胞。在一些实施方案中，该方法包括使前部前肠细胞与EGF通路活化剂、BMP通路抑制剂或FGF通路活化剂、任选的神经祖细胞抑制剂或它们的任何组合中的一者或多者(例如至少1者、2者、3者、4者)接触，以使该前部前肠细胞分化为背侧前部前肠细胞。在一些实施方案中，然后将该背侧前部前肠细胞解离成单个细胞并在第一组织培养容器中培养，以扩增该背侧前部前肠细胞并使其分化为食管祖细胞。在一些实施方案中，然后将扩增的食管祖细胞解离成单个细胞并在插入构件(例如，transwell或细胞插入物)中和/或其表面上进行培养，其中该插入构件定位在第二组织培养容器内，并且该插入构件包括能够渗透生长培养基但无法渗透细胞的表面。在一些实施方案中，该插入构件和第二组织培养容器各自包括一定量的生长培养基，使得该食管祖细胞完全浸没在该生长培养基中。在一些实施方案中，然后在该插入构件中培养该食管祖细胞，其中该第二组织培养容器和/或插入构件含有一定量的生长培养基，使得该食管祖细胞仅部分地浸没在该生长培养基中以产生该食管筏式培养物。在一些实施方案中，该第二组织培养容器与该第一组织培养容器相同。在一些实施方案中，部分浸没的食管祖细胞或食管筏式培养物在气-液界面中培养。在一些实施方案中，该前部前肠细胞由定形内胚层细胞分化而来。在一些实施方案中，该前部前肠细胞或定形内胚层细胞由诱导性多能干细胞分化而来。在一些实施方案中，该诱导性多能干细胞是人诱导性多能干细胞。
在本文公开的方法和组合物中，该食管祖细胞也可与肠神经嵴细胞混合以制备受神经支配的食管筏式培养物。
本文提供的本公开的实施方案通过以下编号的替代方案描述：
1.一种体外食管筏式培养物，包括：
复层鳞状上皮层，该复层鳞状上皮层包括基底上层和基底层；以及
间充质层，该间充质层包括肌纤维；
其中该复层鳞状上皮是E-钙粘蛋白+，该基底上层是KRT13+和KRT8+，并且该基底层是SOX2+、P63+和KRT5+；并且
其中该间充质层是FOXF1+、NKX6-1+和波形蛋白+，并且该肌纤维是结蛋白+。
2.根据前述替代方案中任一项所述的食管筏式培养物，其中该食管筏式培养物缺乏固有层，或者与来自和该筏式培养物相同物种的成年动物的食管组织相比具有减少的固有层。
3.根据前述替代方案中任一项所述的食管筏式培养物，还包括生长培养基，如DMEM/F12。
4.根据前述替代方案中任一项所述的食管筏式培养物，还包括组织培养容器和插入构件，
其中该食管筏式培养物定位在该插入构件内，并且该插入构件定位在该组织培养容器内；并且
其中该插入构件包括能够渗透该生长培养基但无法渗透细胞的表面。
5.根据替代方案4所述的食管筏式培养物，其中该插入构件包被有细胞外基质或其组分。
6.根据替代方案5所述的食管筏式培养物，其中该细胞外基质或其组分衍生自人。
7.根据替代方案5或6所述的食管筏式培养物，其中该细胞外基质或其组分包括人IV型胶原。
8.根据替代方案5至7中任一项所述的食管筏式培养物，其中该细胞外基质或其组分不包括大鼠I型胶原基质或基质胶。
9.根据替代方案4至8中任一项所述的食管筏式培养物，其中该插入构件和组织培养容器各自含有一定量的生长培养基，使得该食管筏式培养物完全浸没在该生长培养基中。
10.根据替代方案9所述的食管筏式培养物，其中该插入构件还包括EGF通路活化剂、ROCK抑制剂、SMAD抑制剂或它们的任何组合，并且该组织培养容器包括EGF通路活化剂。
11.根据替代方案4至8中任一项所述的食管筏式培养物，其中该插入构件不含生长培养基，并且该组织培养容器含有一定量的生长培养基，使得该食管筏式培养物部分地浸没在该生长培养基中，
其中该复层鳞状上皮部分地浸没或不浸没在该生长培养基中，并且形成气-液界面。
12.根据替代方案11所述的食管筏式培养物，其中该组织培养容器包括EGF通路活化剂。
13.根据替代方案4至12中任一项所述的食管筏式培养物，其中该插入构件包括为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约0.1μm、0.5μm、1μm、2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm或10μm的孔径，或由前述尺寸中的任何两个所限定的范围内的任何孔径。
14.根据替代方案4至13中任一项所述的食管筏式培养物，其中该插入构件包括3μm的孔径。
15.一种体外细胞培养物，包括：
衍生自背侧前部前肠细胞的食管祖细胞群，该背侧前部前肠细胞已经用EGF通路活化剂、BMP通路抑制剂、FGF通路活化剂或生长补充剂(例如CultureOne补充剂)或它们的任何组合进行处理。
16.根据替代方案15所述的细胞培养物，还包括生长培养基，如角质形成细胞SFM或其他无血清培养基。
17.根据替代方案16所述的细胞培养物，其中该生长培养基包括EGF通路活化剂或牛垂体提取物(BPE)或两者。
18.根据替代方案17所述的细胞培养物，其中：
该EGF通路活化剂的浓度为约1ng/mL、2ng/mL、3ng/mL、4ng/mL、5ng/mL、6ng/mL、7ng/mL、8ng/mL、9ng/mL、10ng/mL、11ng/mL、12ng/mL、13ng/mL、14ng/mL、15ng/mL、16ng/mL、17ng/mL、18ng/mL、19ng/mL或20ng/mL，或由前述浓度中的任何两个所限定的范围内的任何浓度；或者
该BPE的浓度为约5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL、60μg/mL、70μg/mL、80μg/mL、90μg/mL或100μg/mL，或由前述浓度中的任何两个所限定的范围内的任何浓度，或两者。
19.根据替代方案15至18中任一项所述的细胞培养物，还包括组织培养容器。
20.根据替代方案19所述的细胞培养物，其中该组织培养容器包被有细胞外基质或其组分。
21.根据替代方案20所述的细胞培养物，其中该细胞外基质或其组分衍生自人。
22.根据替代方案20或21所述的细胞培养物，其中该细胞外基质或其组分包括人IV型胶原。
23.根据替代方案20至22中任一项所述的细胞培养物，其中该细胞外基质或其组分不包括大鼠I型胶原基质或基质胶。
24.根据替代方案15至23中任一项所述的细胞培养物，还包括ROCK抑制剂。
25.一种体外细胞培养物，包括：
用EGF通路活化剂、BMP通路抑制剂、FGF通路活化剂或生长补充剂或它们的任何组合进行处理的前部前肠细胞群。
26.根据替代方案25所述的细胞培养物，还包括生长培养基，如RPMI，任选地具有FBS，如0％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％或0.5％的FBS，或由前述百分比中的任何两个所限定的范围内的任何百分比的FBS。
27.根据替代方案25或26所述的细胞培养物，还包括组织培养容器。
28.根据替代方案1至14中任一项所述的食管筏式培养物，或根据替代方案15至27中任一项所述的细胞培养物，其中该食管筏式培养物或细胞培养物已经生长了至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或8天。
29.根据替代方案28所述的食管筏式培养物或细胞培养物，其中该食管筏式培养物或细胞培养物衍生自人诱导性多能干细胞。
30.根据替代方案28或29所述的食管筏式培养物或细胞培养物，其中该食管筏式培养物或细胞培养物不衍生自球状体或类器官。
31.一种产生食管筏式培养物的方法，包括：
(a)使前部前肠细胞与EGF通路活化剂、BMP通路抑制剂、FGF通路活化剂或生长补充剂或它们的任何组合接触，以使该前部前肠细胞分化为背侧前部前肠细胞；
(b)将来自步骤(a)的该背侧前部前肠细胞解离成单个细胞；
(c)在第一组织培养容器中培养该背侧前部前肠细胞，以使该背侧前部前肠细胞分化为食管祖细胞；
(d)将来自步骤(c)的食管祖细胞解离成单个细胞；
(e)在插入构件中培养该食管祖细胞，
其中该插入构件定位在第二组织培养容器内；
其中该插入构件包括能够渗透生长培养基但无法渗透细胞的表面；并且
其中该插入构件和第二组织培养容器各自含有一定量的生长培养基，使得该食管祖细胞完全浸没在该生长培养基中；以及
(f)在该插入构件中培养该食管祖细胞，其中该插入构件不含生长培养基，并且该第二组织培养容器含有一定量的生长培养基，使得该食管祖细胞部分地浸没在该生长培养基中。
32.根据替代方案31所述的方法，其中使用如胰蛋白酶、糜蛋白酶、胶原酶、弹性蛋白酶或Accutase等解离酶对该食管祖细胞进行解离。
33.根据替代方案31或32所述的方法，其中该第一组织培养容器和/或该第二组织培养容器包被有细胞外基质或其组分。
34.根据替代方案33所述的方法，其中该细胞外基质或其组分衍生自人。
35.根据替代方案33或34所述的方法，其中该细胞外基质或其组分包括人IV型胶原。
36.根据替代方案33至35中任一项所述的方法，其中该细胞外基质或其组分不包括大鼠I型胶原基质或基质胶。
37.根据替代方案31至36中任一项所述的方法，其中(a)的接触步骤进行至少1天、2天、3天、4天或5天。
38.根据替代方案31至37中任一项所述的方法，其中(c)的培养步骤进行至少1天、2天、3天、4天或5天。
39.根据替代方案31至38中任一项所述的方法，其中(e)的培养步骤进行至少2天、3天、4天、5天、6天、7天或8天。
40.根据替代方案31至39中任一项所述的方法，其中(f)的培养步骤进行至少10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天或20天。
41.根据替代方案31至40中任一项所述的方法，其中将步骤(c)的背侧前部前肠细胞与EGF通路活化剂、BPE、ROCK抑制剂或它们的任何组合一起培养。
42.根据替代方案31至41中任一项所述的方法，其中将步骤(e)的食管祖细胞与EGF通路活化剂、ROCK抑制剂、SMAD抑制剂或它们的任何组合一起在该插入构件的生长培养基中培养，并与EGF一起在该第二组织培养容器的生长培养基中培养。
43.根据替代方案31至42中任一项所述的方法，其中将步骤(f)的食管祖细胞与EGF通路活化剂一起在该第二组织培养容器的生长培养基中培养。
44.根据替代方案31至43中任一项所述的方法，其中该前部前肠细胞衍生自人诱导性多能干细胞。
45.根据替代方案31至44中任一项所述的方法，其中该前部前肠细胞衍生自人定形内胚层细胞，其中该定形内胚层细胞衍生自人诱导性多能干细胞。
46.根据替代方案45所述的方法，其中该定形内胚层细胞已经用Wnt3a、FGF4、Noggin或RA或它们的任何组合进行处理。
47.根据替代方案45或46所述的方法，其中将该定形内胚层细胞处理1天、2天、3天、4天或5天。
48.根据替代方案44至47中任一项所述的方法，其中用BMP4和/或活化素A处理该人诱导性多能干细胞。
49.根据替代方案44至48中任一项所述的方法，其中将该人诱导性多能干细胞处理1天、2天、3天、4天或5天。
50.根据替代方案31至49中任一项所述的方法，还包括：
使人诱导性多能干细胞与BMP4和/或活化素A接触，以使该人诱导性多能干细胞分化为定形内胚层细胞；以及
使该定形内胚层细胞与Wnt、FGF4、Noggin或RA或它们的任何组合接触，以使该定形内胚层细胞分化为步骤(a)的前部前肠细胞。
51.根据替代方案50所述的方法，其中使该人诱导性多能干细胞接触1天、2天、3天、4天或5天。
52.根据替代方案50或51的方法，其中使该定形内胚层细胞接触1天、2天、3天、4天或5天。
53.一种体外食管筏式细胞组合物，包含：
复层鳞状上皮层，该复层鳞状上皮层包括基底上层和基底层；以及
间充质层，该间充质层包括肌纤维；
其中该复层鳞状上皮是E-钙粘蛋白+，该基底上层是KRT13+和KRT8+，并且该基底层是SOX2+、P63+和KRT5+；并且
其中该间充质层是FOXF1+、NKX6-1+和波形蛋白+，并且该肌纤维是结蛋白+。
54.一种体外细胞组合物，包含：
背侧前部前肠细胞群，该背侧前部前肠细胞群衍生自用EGF通路活化剂、BMP通路抑制剂、FGF通路活化剂或生长补充剂或它们的任何组合进行处理的前部前肠细胞。
55.一种体外细胞组合物，包含：
用EGF通路活化剂、BMP通路抑制剂、FGF通路活化剂或生长补充剂或它们的任何组合进行处理的前部前肠细胞群。
56.根据前述替代方案中任一项所述的食管筏式细胞组合物，其中该食管筏式细胞组合物具有约1μm、5μm、10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、200μm、300μm、400μm或500μm的厚度，或由前述厚度中的任何两个所限定的范围内的任何厚度。
57.根据前述替代方案中任一项所述的食管筏式细胞组合物，其中该食管筏式细胞组合物具有约150μm、200μm、250μm、300μm、350μm、400μm、450μm或500μm的厚度，或由前述厚度中的任何两个所限定的范围内的任何厚度。
58.根据前述替代方案中任一项所述的食管筏式细胞组合物，其中该食管筏式组合物具有约0.1cm2、0.5cm2、1cm2、5cm2、10cm2、15cm2、20cm2、25cm2、30cm2、40cm2、50cm2、60cm2、70cm2、80cm2、90cm2或100cm2的表面积，或由前述表面积中的任何两个所限定的范围内的任何表面积。
59.根据前述替代方案中任一项所述的食管筏式细胞组合物，其中该食管筏式组合物具有约0.1cm2、0.5cm2、1cm2、1.5cm2或2cm2的表面积，或由前述表面积中的任何两个所限定的范围内的任何表面积。
60.根据前述替代方案中任一项所述的食管筏式细胞组合物，其中该食管筏式组合物具有约10-5cm3、10-4cm3、10-3cm3、10-2cm3、10-1cm3、1cm3、5cm3或10cm3的体积，或由前述体积中的任何两个所限定的范围内的任何体积。
61.根据前述替代方案中任一项所述的食管筏式细胞组合物，其中该复层鳞状上皮层具有约1μm、5μm、10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、200μm、300μm、400μm或500μm的厚度，或由前述厚度中的任何两个所限定的范围内的任何厚度。
62.根据前述替代方案中任一项所述的食管筏式细胞组合物，其中该复层鳞状上皮层具有约50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、110μm、120μm、130μm、140μm、150μm、160μm、170μm、180μm、190μm、200μm、210μm、220μm、230μm、240μm或250μm的厚度，或由前述厚度中的任何两个所限定的范围内的任何厚度。
63.根据前述替代方案中任一项所述的食管筏式细胞组合物，其中该基底上层具有约1μm、5μm、10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、200μm、300μm、400μm或500μm的厚度，或由前述厚度中的任何两个所限定的范围内的任何厚度。
64.根据前述替代方案中任一项所述的食管筏式细胞组合物，其中该基底上层具有约80μm、90μm、100μm、110μm、120μm、130μm、140μm、150μm、160μm、170μm、180μm、190μm或200μm的厚度，或由前述厚度中的任何两个所限定的范围内的任何厚度。
65.根据前述替代方案中任一项所述的食管筏式细胞组合物，其中该基底层具有约1μm、5μm、10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、200μm、300μm、400μm或500μm的厚度，或由前述厚度中的任何两个所限定的范围内的任何厚度。
66.根据前述替代方案中任一项所述的食管筏式细胞组合物，其中该基底层具有约10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm或100μm的厚度，或由前述厚度中的任何两个所限定的范围内的任何厚度。
67.根据前述替代方案中任一项所述的食管筏式细胞组合物，其中该间充质层具有约1μm、5μm、10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、200μm、300μm、400μm或500μm的厚度，或由前述厚度中的任何两个所限定的范围内的任何厚度。
68.根据前述替代方案中任一项所述的食管筏式细胞组合物，其中该间充质层具有约100μm、150μm、200μm、250μm、300μm、350μm或400μm的厚度，或由前述厚度中的任何两个所限定的范围内的任何厚度。
69.根据前述替代方案中任一项所述的食管筏式培养物、细胞培养物、方法或食管筏式细胞组合物，其中该EGF通路活化剂包括EGF、TGF-α、AR、BTC、HB-EGF、EPR、tomoregulin、NRG-1、NRG-2、NRG-3或NRG-4，或它们的任何组合。
70.根据前述替代方案中任一项所述的食管筏式培养物、细胞培养物、方法或食管筏式细胞组合物，其中该EGF通路活化剂是EGF。
71.根据前述替代方案中任一项所述的食管筏式培养物、细胞培养物、方法或食管筏式细胞组合物，其中该EGF通路活化剂以约10ng/mL、20ng/mL、30ng/mL、40ng/mL、50ng/mL、60ng/mL、70ng/mL、80ng/mL、90ng/mL、100ng/mL、110ng/mL、120ng/mL、130ng/mL、140ng/mL、150ng/mL、160ng/mL、170ng/mL、180ng/mL、190ng/mL或200ng/mL的浓度或由前述浓度中的任何两个所限定的范围内的任何浓度提供。
72.根据前述替代方案中任一项所述的食管筏式培养物、细胞培养物、方法或食管筏式细胞组合物，其中该EGF通路活化剂以100ng/mL或约100ng/mL的浓度提供。
73.根据前述替代方案中任一项所述的食管筏式培养物、细胞培养物、方法或食管筏式细胞组合物，其中该BMP通路抑制剂包括Noggin、RepSox、LY364947、LDN193189、SB431542或它们的任何组合。
74.根据前述替代方案中任一项所述的食管筏式培养物、细胞培养物、方法或食管筏式细胞组合物，其中该BMP通路抑制剂是Noggin
75.根据前述替代方案中任一项所述的食管筏式培养物、细胞培养物、方法或食管筏式细胞组合物，其中该BMP通路抑制剂以约100ng/mL、110ng/mL、120ng/mL、130ng/mL、140ng/mL、150ng/mL、160ng/mL、170ng/mL、180ng/mL、190ng/mL、200ng/mL、210ng/mL、220ng/mL、230ng/mL、240ng/mL、250ng/mL、260ng/mL、270ng/mL、280ng/mL、290ng/mL或300ng/mL的浓度或由前述浓度中的任何两个所限定的范围内的任何浓度提供。
76.根据前述替代方案中任一项所述的食管筏式培养物、细胞培养物、方法或食管筏式细胞组合物，其中该BMP通路抑制剂以200ng/mL或约200ng/mL的浓度提供。
77.根据前述替代方案中任一项所述的食管筏式培养物、细胞培养物、方法或食管筏式细胞组合物，其中该FGF通路活化剂包括FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF8、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF13、FGF14、FGF15、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF20、FGF21、FGF22或FGF23或它们的任何组合。
78.根据前述替代方案中任一项所述的食管筏式培养物、细胞培养物、方法或食管筏式细胞组合物，其中该FGF通路活化剂是FGF10。
79.根据前述替代方案中任一项所述的食管筏式培养物、细胞培养物、方法或食管筏式细胞组合物，其中该FGF通路活化剂以约5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL、20ng/mL、25ng/mL、30ng/mL、35ng/mL、40ng/mL、45ng/mL、50ng/mL、55ng/mL、60ng/mL、65ng/mL、70ng/mL、75ng/mL、80ng/mL、85ng/mL、90ng/mL、95ng/mL或100ng/mL的浓度或由前述浓度中的任何两个所限定的范围内的任何浓度提供。
80.根据前述替代方案中任一项所述的食管筏式培养物、细胞培养物、方法或食管筏式细胞组合物，其中该FGF通路活化剂以50ng/mL或约50ng/mL的浓度提供。
81.根据前述替代方案中任一项所述的食管筏式培养物、细胞培养物、方法或食管筏式细胞组合物，其中该生长补充剂是无血清生长补充剂。
82.根据前述替代方案中任一项所述的食管筏式培养物、细胞培养物、方法或食管筏式细胞组合物，其中该生长补充剂是CultureOne补充剂。
83.根据前述替代方案中任一项所述的食管筏式培养物、细胞培养物、方法或食管筏式细胞组合物，其中该生长补充剂以1x或约1x的浓度提供。
84.根据前述替代方案中任一项所述的食管筏式培养物、细胞培养物、方法或食管筏式细胞组合物，其中该ROCK抑制剂包括Y-27632、Y-30141、Y-39983、Ki-23095、SLx-2119、噻唑维林(thiazovivin)、氮杂吲哚1、法舒地尔(fasudil)、利帕舒地尔(ripasudil)、奈塔舒地尔(netarsudil)、RKI-1447或GSK429286A或它们的任何组合。
85.根据前述替代方案中任一项所述的食管筏式培养物、细胞培养物、方法或食管筏式细胞组合物，其中该ROCK抑制剂是Y-27632。
86.根据前述替代方案中任一项所述的食管筏式培养物、细胞培养物、方法或食管筏式细胞组合物，其中该ROCK抑制剂以约1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、11μM、12μM、13μM、14μM、15μM、16μM、17μM、18μM、19μM或20μM的浓度或由前述浓度中的任何两个所限定的范围内的任何浓度提供。
87.根据前述替代方案中任一项所述的食管筏式培养物、细胞培养物、方法或食管筏式细胞组合物，其中该ROCK抑制剂以10μM或约10μM的浓度提供。
88.根据前述替代方案中任一项所述的食管筏式培养物、细胞培养物、方法或食管筏式细胞组合物，其中该SMAD抑制剂包括A-83-01、DMH1、RepSox、LY365947、LY2109761、LY364947、SB431542、SB525334、SB505125、高伦替布(galunisertib)、GW788388、LDN-193189、LDN-212854、橙皮素或它们的任何组合。
89.根据前述替代方案中任一项所述的食管筏式培养物、细胞培养物、方法或食管筏式细胞组合物，其中该SMAD抑制剂是DMH1和A-83-01。
90.根据前述替代方案中任一项所述的食管筏式培养物、细胞培养物、方法或食管筏式细胞组合物，其中该SMAD抑制剂以约0.1μM、0.5μM、1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM或10μM的浓度或由前述浓度中的任何两个所限定的范围内的任何浓度提供。
91.根据前述替代方案中任一项所述的食管筏式培养物、细胞培养物、方法或食管筏式细胞组合物，其中该SMAD抑制剂以约1μM或约1μM的浓度提供。
本文提供的本公开的另外的实施方案通过以下另选地编号的替代方案来描述：
1.一种体外食管筏式培养物，包括：
复层鳞状上皮层，该复层鳞状上皮层包括基底上层和基底层；以及
间充质层，该间充质层包括肌纤维；
其中该复层鳞状上皮是E-钙粘蛋白+，该基底上层是KRT13+和KRT8+，并且该基底层是SOX2+、P63+和KRT5+；并且
其中该间充质层是FOXF1+、NKX6-1+和波形蛋白+，并且该肌纤维是结蛋白+。
2.根据前述替代方案中任一项所述的食管筏式培养物，其中该食管筏式培养物缺乏固有层，或者与来自和该筏式培养物相同物种的成年动物的食管组织相比具有减少的固有层。
3.根据前述替代方案中任一项所述的食管筏式培养物，还包括生长培养基，任选地DMEM/F12。
4.根据前述替代方案中任一项所述的食管筏式培养物，
其中该食管筏式培养物位于插入构件中和/或其表面上，该插入构件包括能够渗透该生长培养基但无法渗透细胞的表面，并且该插入构件定位在组织培养容器内；并且
任选地其中该食管筏式培养物定位在能够渗透该生长培养基但无法渗透细胞的表面上。
5.根据替代方案4所述的食管筏式培养物，其中该插入构件的至少一部分，任选地能够渗透该生长培养基但无法渗透细胞的表面，包被有细胞外基质或其组分。
6.根据替代方案5所述的食管筏式培养物，其中该细胞外基质或其组分衍生自人。
7.根据替代方案5或6所述的食管筏式培养物，其中该细胞外基质或其组分包括人IV型胶原。
8.根据替代方案5至7中任一项所述的食管筏式培养物，其中该细胞外基质或其组分不包括大鼠I型胶原基质或基质胶。
9.根据替代方案4至8中任一项所述的食管筏式培养物，其中该插入构件和/或组织培养容器含有一定量的生长培养基，使得该食管筏式培养物完全浸没在该生长培养基中。
10.根据替代方案9所述的食管筏式培养物，其中包含在该插入构件内的生长培养基还包括EGF通路活化剂、ROCK抑制剂、SMAD抑制剂或它们的任何组合，并且包含在该组织培养容器内的生长培养基包括EGF通路活化剂。
11.根据替代方案4至8中任一项所述的食管筏式培养物，其中该组织培养容器和/或插入构件含有一定量的生长培养基，使得该食管筏式培养物仅部分地浸没在该生长培养基中，
其中该复层鳞状上皮仅部分地浸没或不浸没在该生长培养基中，并且形成气-液界面和/或位于该气-液界面处。
12.根据替代方案11所述的食管筏式培养物，其中包含在该组织培养容器内的生长培养基包括EGF通路活化剂。
13.根据替代方案4至12中任一项所述的食管筏式培养物，其中该插入构件的能够渗透的表面包括为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约0.1μm、0.5μm、1μm、2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm或10μm的孔径，或由前述尺寸中的任何两个所限定的范围内的任何孔径。
14.根据替代方案4至13中任一项所述的食管筏式培养物，其中该插入构件的能够渗透的表面包括3μm的孔径。
15.根据替代方案1至14中任一项所述的食管筏式培养物，其中该食管筏式培养物有效地不含神经元祖细胞和/或βIII-微管蛋白+神经元细胞。
16.根据替代方案1至14中任一项所述的食管筏式培养物，其中该食管筏式培养物还包括肠神经嵴细胞(ENCC)、神经元祖细胞和/或βIII-微管蛋白+神经元细胞，使得该食管筏式培养物是受神经支配的食管筏式培养物，任选地其中该神经元祖细胞是SOX10+。
17.根据替代方案1至16中任一项所述的食管筏式培养物，其中该食管筏式培养物不具有血管形成、血管和/或内皮细胞。
18.一种体外细胞培养物，包括：
衍生自背侧前部前肠细胞的食管祖细胞群，该背侧前部前肠细胞已经用EGF通路活化剂、BMP通路抑制剂、FGF通路活化剂或它们的任何组合进行处理。
19.根据替代方案18所述的细胞培养物，其中该背侧前部前肠细胞还已经用神经元祖细胞抑制剂任选地CultureOne补充剂或阿糖胞苷进行处理。
20.根据替代方案18或19所述的细胞培养物，还包括生长培养基，任选地无血清培养基，任选地角质形成细胞SFM。
21.根据替代方案20所述的细胞培养物，其中该生长培养基包括EGF通路活化剂或牛垂体提取物(BPE)或两者。
22.根据替代方案21所述的细胞培养物，其中：
该EGF通路活化剂的浓度为约1ng/mL、2ng/mL、3ng/mL、4ng/mL、5ng/mL、6ng/mL、7ng/mL、8ng/mL、9ng/mL、10ng/mL、11ng/mL、12ng/mL、13ng/mL、14ng/mL、15ng/mL、16ng/mL、17ng/mL、18ng/mL、19ng/mL或20ng/mL，或由前述浓度中的任何两个所限定的范围内的任何浓度；或者
该BPE的浓度为约5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL、60μg/mL、70μg/mL、80μg/mL、90μg/mL或100μg/mL，或由前述浓度中的任何两个所限定的范围内的任何浓度，或两者。
23.根据替代方案18至22中任一项所述的细胞培养物，其中该细胞培养物位于组织培养容器中和/或其表面上。
24.根据替代方案23所述的细胞培养物，其中该组织培养容器的至少一部分包被有细胞外基质或其组分，并且所述食管祖细胞群位于所述部分上或与所述部分接触。
25.根据替代方案24所述的细胞培养物，其中该细胞外基质或其组分衍生自人。
26.根据替代方案24或25所述的细胞培养物，其中该细胞外基质或其组分包括人IV型胶原。
27.根据替代方案24至27中任一项所述的细胞培养物，其中该细胞外基质或其组分不包括大鼠I型胶原基质或基质胶。
28.根据替代方案18至27中任一项所述的细胞培养物，还包括ROCK抑制剂。
29.根据替代方案18至28中任一项所述的细胞培养物，还包括肠神经嵴细胞。
30.一种体外细胞培养物，包括：
用EGF通路活化剂、BMP通路抑制剂、FGF通路活化剂或它们的任何组合进行处理的前部前肠细胞群。
31.根据替代方案30所述的细胞培养物，其中该前部前肠细胞进一步用神经元祖细胞抑制剂任选地CultureOne补充剂或阿糖胞苷进行处理。
32.根据替代方案30或31所述的细胞培养物，还包括生长培养基，任选地RPMI，任选地具有FBS，任选地0％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2.0％、2.1％、2.2％、2.3％、2.4％或2.5％的FBS，或由前述百分比中的任何两个所限定的范围内的任何百分比的FBS。
33.根据替代方案30至32中任一项所述的细胞培养物，其中所述细胞培养物位于组织培养容器中和/或其表面上。
34.根据替代方案1至17中任一项所述的食管筏式培养物，或根据替代方案18至33中任一项所述的细胞培养物，其中该食管筏式培养物或细胞培养物已经生长了至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或8天。
35.根据替代方案34所述的食管筏式培养物或细胞培养物，其中该食管筏式培养物或细胞培养物已从人诱导性多能干细胞中衍生出。
36.根据替代方案34或35所述的食管筏式培养物或细胞培养物，其中该食管筏式培养物或细胞培养物不衍生自球状体或类器官。
37.一种产生食管筏式培养物的方法，包括：
(a)使前部前肠细胞与EGF通路活化剂、BMP通路抑制剂、FGF通路活化剂或它们的任何组合接触，以使该前部前肠细胞分化为背侧前部前肠细胞；
(b)将来自步骤(a)的该背侧前部前肠细胞解离成单个细胞；
(c)在第一组织培养容器中培养该背侧前部前肠细胞，以使该背侧前部前肠细胞分化为食管祖细胞；
(d)将来自步骤(c)的食管祖细胞解离成单个细胞；
(e)在插入构件中和/或插入构件的表面上培养该食管祖细胞，
其中该插入构件定位在第二组织培养容器内；
其中该插入构件包括能够渗透生长培养基但无法渗透细胞的表面；并且
其中该插入构件和第二组织培养容器各自含有一定量的生长培养基，使得该食管祖细胞完全浸没在该生长培养基中；以及
(f)在该插入构件中培养该食管祖细胞，其中该第二组织培养容器和/或插入构件含有一定量的生长培养基，使得该食管祖细胞仅部分地浸没在该生长培养基中。
38.根据替代方案37所述的方法，其中使该前部前肠细胞进一步与神经元祖细胞抑制剂任选地CultureOne补充剂或阿糖胞苷接触。
39.根据替代方案37或38所述的方法，其中使用解离酶任选地胰蛋白酶、糜蛋白酶、胶原酶、弹性蛋白酶或Accutase对该食管祖细胞进行解离。
40.根据替代方案37至39中任一项所述的方法，其中该第一组织培养容器和/或该第二组织培养容器的至少一部分包被有细胞外基质或其组分。
41.根据替代方案40所述的方法，其中该细胞外基质或其组分衍生自人。
42.根据替代方案40或41所述的方法，其中该细胞外基质或其组分包括人IV型胶原。
43.根据替代方案40至42中任一项所述的方法，其中该细胞外基质或其组分不包括大鼠I型胶原基质或基质胶。
44.根据替代方案37至43中任一项所述的方法，其中(a)的接触步骤进行至少1天、2天、3天、4天或5天。
45.根据替代方案37至44中任一项所述的方法，其中(c)的培养步骤进行至少1天、2天、3天、4天或5天。
46.根据替代方案37至45中任一项所述的方法，其中(e)的培养步骤进行至少2天、3天、4天、5天、6天、7天或8天。
47.根据替代方案37至46中任一项所述的方法，其中(f)的培养步骤进行至少10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天或20天。
48.根据替代方案37至47中任一项所述的方法，其中将步骤(c)的背侧前部前肠细胞与EGF通路活化剂、BPE、ROCK抑制剂或它们的任何组合一起培养。
49.根据替代方案37至48中任一项所述的方法，其中将步骤(e)的食管祖细胞与EGF通路活化剂、ROCK抑制剂、SMAD抑制剂或它们的任何组合一起在该插入构件的生长培养基中培养，并与EGF一起在该第二组织培养容器的生长培养基中培养。
50.根据替代方案37至49中任一项所述的方法，其中将步骤(f)的食管祖细胞与EGF通路活化剂一起在该第二组织培养容器的生长培养基中培养。
51.根据替代方案37至50中任一项所述的方法，其中该前部前肠细胞已从人诱导性多能干细胞中衍生出。
52.根据替代方案37至51中任一项所述的方法，其中该前部前肠细胞已从定形内胚层细胞中衍生出，其中该定形内胚层细胞已从人诱导性多能干细胞中衍生出。
53.根据替代方案52所述的方法，其中该定形内胚层细胞已经用Wnt3a、FGF4、Noggin或RA或它们的任何组合进行处理，以使该定形内胚层细胞分化为前部前肠细胞。
54.根据替代方案53所述的方法，其中已将该定形内胚层细胞进一步用神经元祖细胞抑制剂，任选地CultureOne补充剂或阿糖胞苷进行处理。
55.根据替代方案52至54中任一项所述的方法，其中已将该定形内胚层细胞处理1天、2天、3天、4天或5天。
56.根据替代方案51至55中任一项所述的方法，其中已将该人诱导性多能干细胞用BMP4和/或活化素A处理，以使该人诱导性多能干细胞分化为定形内胚层细胞。
57.根据替代方案56所述的方法，其中已将该人诱导性多能干细胞进一步用神经元祖细胞抑制剂任选地CultureOne补充剂或阿糖胞苷进行处理。
58.根据替代方案51至57中任一项所述的方法，其中已将该人诱导性多能干细胞处理1天、2天、3天、4天或5天。
59.根据替代方案37至58中任一项所述的方法，还包括：
使人诱导性多能干细胞与BMP4和/或活化素A接触，以使该人诱导性多能干细胞分化为定形内胚层细胞；以及
使该定形内胚层细胞与Wnt、FGF4、Noggin或RA或它们的任何组合接触，以使该定形内胚层细胞分化为步骤(a)的前部前肠细胞。
60.根据替代方案59所述的方法，其中使该人诱导性多能干细胞和/或该定形内胚层细胞进一步与神经元祖细胞抑制剂任选地CultureOne补充剂或阿糖胞苷接触。
61.根据替代方案59或60所述的方法，其中使该人诱导性多能干细胞接触1天、2天、3天、4天或5天。
62.根据替代方案59至61中任一项所述的方法，其中使该定形内胚层细胞接触1天、2天、3天、4天或5天。
63.根据替代方案37至62中任一项所述的方法，其中该食管筏式培养物有效地不含神经元祖细胞和/或βIII-微管蛋白+神经元细胞。
64.根据替代方案37至63中任一项所述的方法，还包括将步骤(d)的解离后的食管祖细胞与肠神经嵴细胞(ENCC)组合，并根据步骤(e)和(f)培养组合后的食管祖细胞和ENCC，以产生受神经支配的食管筏式培养物。
65.根据替代方案64所述的方法，其中该受神经支配的食管筏式培养物包括肠神经嵴细胞(ENCC)、神经元祖细胞和/或βIII-微管蛋白+神经元细胞，任选地其中该神经元祖细胞是SOX10+。
66.根据替代方案37至65中任一项所述的方法，其中该食管筏式培养物不包括血管形成、血管和/或内皮细胞。
67.一种体外细胞组合物，包含：
背侧前部前肠细胞群，该背侧前部前肠细胞群衍生自用EGF通路活化剂、BMP通路抑制剂、FGF通路活化剂或它们的任何组合进行处理的前部前肠细胞。
68.一种体外细胞组合物，包含：
用EGF通路活化剂、BMP通路抑制剂、FGF通路活化剂或它们的任何组合进行处理的前部前肠细胞群。
69.根据替代方案68所述的细胞组合物，其中该前部前肠细胞群进一步用神经元祖细胞抑制剂任选地CultureOne补充剂或阿糖胞苷进行处理。
70.一种体外食管筏式细胞组合物，包含：
复层鳞状上皮层，该复层鳞状上皮层包括基底上层和基底层；以及
间充质层，该间充质层包括肌纤维；
其中该复层鳞状上皮是E-钙粘蛋白+，该基底上层是KRT13+和KRT8+，并且该基底层是SOX2+、P63+和KRT5+；并且
其中该间充质层是FOXF1+、NKX6-1+和波形蛋白+，并且该肌纤维是结蛋白+。
71.根据替代方案70所述的食管筏式细胞组合物，其中该食管筏式细胞组合物有效地不含神经元祖细胞和/或βIII-微管蛋白+神经元细胞。
72.根据替代方案70所述的食管筏式细胞组合物，其中该食管筏式细胞组合物还包含肠神经嵴细胞(ENCC)、神经元祖细胞和/或βIII-微管蛋白+神经元细胞，使得该食管筏式培养物是受神经支配的食管筏式培养物，任选地其中该神经元祖细胞是SOX10+。
73.根据替代方案70至72中任一项所述的食管筏式细胞组合物，其中该食管筏式细胞组合物不包含血管形成、血管和/或内皮细胞。
74.根据前述替代方案中任一项所述的食管筏式细胞组合物，其中该食管筏式细胞组合物具有约1μm、5μm、10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、200μm、300μm、400μm或500μm的厚度，或由前述厚度中的任何两个所限定的范围内的任何厚度。
75.根据前述替代方案中任一项所述的食管筏式细胞组合物，其中该食管筏式细胞组合物具有约150μm、200μm、250μm、300μm、350μm、400μm、450μm或500μm的厚度，或由前述厚度中的任何两个所限定的范围内的任何厚度。
76.根据前述替代方案中任一项所述的食管筏式细胞组合物，其中该食管筏式组合物具有约0.1cm2、0.5cm2、1cm2、5cm2、10cm2、15cm2、20cm2、25cm2、30cm2、40cm2、50cm2、60cm2、70cm2、80cm2、90cm2或100cm2的表面积，或由前述表面积中的任何两个所限定的范围内的任何表面积。
77.根据前述替代方案中任一项所述的食管筏式细胞组合物，其中该食管筏式组合物具有约0.1cm2、0.5cm2、1cm2、1.5cm2或2cm2的表面积，或由前述表面积中的任何两个所限定的范围内的任何表面积。
78.根据前述替代方案中任一项所述的食管筏式细胞组合物，其中该食管筏式组合物具有约10-5cm3、10-4cm3、10-3cm3、10-2cm3、10-1cm3、1cm3、5cm3或10cm3的体积，或由前述体积中的任何两个所限定的范围内的任何体积。
79.根据前述替代方案中任一项所述的食管筏式细胞组合物，其中该复层鳞状上皮层具有约1μm、5μm、10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、200μm、300μm、400μm或500μm的厚度，或由前述厚度中的任何两个所限定的范围内的任何厚度。
80.根据前述替代方案中任一项所述的食管筏式细胞组合物，其中该复层鳞状上皮层具有约50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、110μm、120μm、130μm、140μm、150μm、160μm、170μm、180μm、190μm、200μm、210μm、220μm、230μm、240μm或250μm的厚度，或由前述厚度中的任何两个所限定的范围内的任何厚度。
81.根据前述替代方案中任一项所述的食管筏式细胞组合物，其中该基底上层具有约1μm、5μm、10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、200μm、300μm、400μm或500μm的厚度，或由前述厚度中的任何两个所限定的范围内的任何厚度。
82.根据前述替代方案中任一项所述的食管筏式细胞组合物，其中该基底上层具有约80μm、90μm、100μm、110μm、120μm、130μm、140μm、150μm、160μm、170μm、180μm、190μm或
200μm的厚度，或由前述厚度中的任何两个所限定的范围内的任何厚度。
83.根据前述替代方案中任一项所述的食管筏式细胞组合物，其中该基底层具有约1μm、5μm、10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、200μm、300μm、400μm或500μm的厚度，或由前述厚度中的任何两个所限定的范围内的任何厚度。
84.根据前述替代方案中任一项所述的食管筏式细胞组合物，其中该基底层具有约10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm或100μm的厚度，或由前述厚度中的任何两个所限定的范围内的任何厚度。
85.根据前述替代方案中任一项所述的食管筏式细胞组合物，其中该间充质层具有约1μm、5μm、10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、200μm、300μm、400μm或500μm的厚度，或由前述厚度中的任何两个所限定的范围内的任何厚度。
86.根据前述替代方案中任一项所述的食管筏式细胞组合物，其中该间充质层具有约100μm、150μm、200μm、250μm、300μm、350μm或400μm的厚度，或由前述厚度中的任何两个所限定的范围内的任何厚度。
87.根据前述替代方案中任一项所述的食管筏式培养物、细胞培养物、方法或食管筏式细胞组合物，其中该EGF通路活化剂包括EGF、TGF-α、AR、BTC、HB-EGF、EPR、tomoregulin、NRG-1、NRG-2、NRG-3或NRG-4，或它们的任何组合。
88.根据前述替代方案中任一项所述的食管筏式培养物、细胞培养物、方法或食管筏式细胞组合物，其中该EGF通路活化剂是EGF。
89.根据前述替代方案中任一项所述的食管筏式培养物、细胞培养物、方法或食管筏式细胞组合物，其中该EGF通路活化剂以约10ng/mL、20ng/mL、30ng/mL、40ng/mL、50ng/mL、60ng/mL、70ng/mL、80ng/mL、90ng/mL、100ng/mL、110ng/mL、120ng/mL、130ng/mL、140ng/mL、150ng/mL、160ng/mL、170ng/mL、180ng/mL、190ng/mL或200ng/mL的浓度或由前述浓度中的任何两个所限定的范围内的任何浓度提供。
90.根据前述替代方案中任一项所述的食管筏式培养物、细胞培养物、方法或食管筏式细胞组合物，其中该EGF通路活化剂以100ng/mL或约100ng/mL的浓度提供。
91.根据前述替代方案中任一项所述的食管筏式培养物、细胞培养物、方法或食管筏式细胞组合物，其中该BMP通路抑制剂包括Noggin、RepSox、LY364947、LDN193189、SB431542或它们的任何组合。
92.根据前述替代方案中任一项所述的食管筏式培养物、细胞培养物、方法或食管筏式细胞组合物，其中该BMP通路抑制剂是Noggin。
93.根据前述替代方案中任一项所述的食管筏式培养物、细胞培养物、方法或食管筏式细胞组合物，其中该BMP通路抑制剂以约100ng/mL、110ng/mL、120ng/mL、130ng/mL、140ng/mL、150ng/mL、160ng/mL、170ng/mL、180ng/mL、190ng/mL、200ng/mL、210ng/mL、220ng/mL、230ng/mL、240ng/mL、250ng/mL、260ng/mL、270ng/mL、280ng/mL、290ng/mL或
300ng/mL的浓度或由前述浓度中的任何两个所限定的范围内的任何浓度提供。
94.根据前述替代方案中任一项所述的食管筏式培养物、细胞培养物、方法或食管筏式细胞组合物，其中该BMP通路抑制剂以200ng/mL或约200ng/mL的浓度提供。
95.根据前述替代方案中任一项所述的食管筏式培养物、细胞培养物、方法或食管筏式细胞组合物，其中该FGF通路活化剂包括FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF8、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF13、FGF14、FGF15、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF20、FGF21、FGF22或FGF23或它们的任何组合。
96.根据前述替代方案中任一项所述的食管筏式培养物、细胞培养物、方法或食管筏式细胞组合物，其中该FGF通路活化剂是FGF10。
97.根据前述替代方案中任一项所述的食管筏式培养物、细胞培养物、方法或食管筏式细胞组合物，其中该FGF通路活化剂以约5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL、20ng/mL、25ng/mL、30ng/mL、35ng/mL、40ng/mL、45ng/mL、50ng/mL、55ng/mL、60ng/mL、65ng/mL、70ng/mL、75ng/mL、80ng/mL、85ng/mL、90ng/mL、95ng/mL或100ng/mL的浓度或由前述浓度中的任何两个所限定的范围内的任何浓度提供。
98.根据前述替代方案中任一项所述的食管筏式培养物、细胞培养物、方法或食管筏式细胞组合物，其中该FGF通路活化剂以50ng/mL或约50ng/mL的浓度提供。
99.根据前述替代方案中任一项所述的食管筏式培养物、细胞培养物、方法或食管筏式细胞组合物，其中该ROCK抑制剂包括Y-27632、Y-30141、Y-39983、Ki-23095、SLx-2119、噻唑维林、氮杂吲哚1、法舒地尔、利帕舒地尔、奈塔舒地尔、RKI-1447或GSK429286A或它们的任何组合。
100.根据前述替代方案中任一项所述的食管筏式培养物、细胞培养物、方法或食管筏式细胞组合物，其中该ROCK抑制剂是Y-27632。
101.根据前述替代方案中任一项所述的食管筏式培养物、细胞培养物、方法或食管筏式细胞组合物，其中该ROCK抑制剂以约1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、11μM、12μM、13μM、14μM、15μM、16μM、17μM、18μM、19μM或20μM的浓度或由前述浓度中的任何两个所限定的范围内的任何浓度提供。
102.根据前述替代方案中任一项所述的食管筏式培养物、细胞培养物、方法或食管筏式细胞组合物，其中该ROCK抑制剂以10μM或约10μM的浓度提供。
103.根据前述替代方案中任一项所述的食管筏式培养物、细胞培养物、方法或食管筏式细胞组合物，其中该SMAD抑制剂包括A-83-01、DMH1、RepSox、LY365947、LY2109761、LY364947、SB431542、SB525334、SB505125、高伦替布、GW788388、LDN-193189、LDN-212854、橙皮素或它们的任何组合。
104.根据前述替代方案中任一项所述的食管筏式培养物、细胞培养物、方法或食管筏式细胞组合物，其中该SMAD抑制剂是DMH1和A-83-01。
105.根据前述替代方案中任一项所述的食管筏式培养物、细胞培养物、方法或食管筏式细胞组合物，其中该SMAD抑制剂以约0.1μM、0.5μM、1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM或10μM的浓度或由前述浓度中的任何两个所限定的范围内的任何浓度提供。
106.根据前述替代方案中任一项所述的食管筏式培养物、细胞培养物、方法或食管筏式细胞组合物，其中该SMAD抑制剂以约1μM或约1μM的浓度提供。
附图说明
除了本文所描述的特征之外，另外的特征和变化将通过以下对附图和示例性实施方案的描述而变得显而易见。应当理解，这些附图描绘实施方案并且不旨在限制范围。
图1描绘了产生本文所述的食管筏式培养物的示意图的实施方案。
图2描绘了包括上皮和间充质的食管筏式培养物的实施方案。筏式培养物的顶层表达食道上皮标志物SOX2和P63以及上皮通用标志物E-钙粘蛋白(Ecad)(图片A)。上皮是在不同层中表达基底层标志物(KRT5)和基底上层标志物(KRT13和KRT8)的复层鳞状上皮(图片B)。可在苏木精/伊红染色中鉴定这两个不同的层(图片C)。筏式培养物基底层表达间充质标志物FOXF1、NKX6-1(图片D)和波形蛋白(图片E)。间充质表达分化的肌纤维(结蛋白)的标志物(图片F)。将细胞核用DAPI标记作为通用标志物。比例尺为100μm。还示出了食管筏式培养物的示意图，其具有不同的上皮和间充质层以及特征性标志物(图片G)。
图3A描绘了产生本文所述的食管筏式培养物的示意图的实施方案，其中从第0天至第9天添加任选的神经元祖细胞抑制剂(例如CultureOne补充剂[Cult1])。神经元祖细胞抑制剂的添加防止了在食管筏式培养物的分化期间神经元细胞类型的扩增，该扩增对于某些目的来说可能是不期望的。
图3B描绘了免疫荧光图像的实施方案，其示出了从第0天至第9天或第6天至第9天使用神经元祖细胞抑制剂(例如CultureOne补充剂)分化的食管筏式培养物。对食管筏式培养物进行以下染色：1)苏木精和伊红、2)SOX2、3)E-钙粘蛋白(Ecad)、4)SOX、Ecad和DAPI的融合、或5)βIII-微管蛋白和DAPI。虚线表示间充质-上皮边界。箭头表示仅从第6天起用CultureOne处理的筏式培养物的间充质中神经元细胞类型的存在。从第0天至第9天，在用CultureOne生长的培养物中没有发现这些神经元细胞类型。通过间充质层中SOX2和βIII-微管蛋白(箭头)的表达来表示神经元细胞类型。
图4A描绘了产生受神经支配的食管筏式培养物的示意图的实施方案。食管祖细胞和肠神经嵴细胞(ENCC)分别由hPSC分化而来，并在细胞插入物上共培养以产生具有受肠神经元支配的间充质的食管筏式培养物。
图4B描绘了示出受神经支配的食管筏式培养物的免疫荧光图像的实施方案。由1)SOX2、P63、Ecad和DAPI，2)KRT5、KRT13和DAPI，3)GFP(由ENCC表达)、波形蛋白、KRT8和DAPI，或4)GFP(由ENCC表达)、βIII-微管蛋白、KRT8和DAPI对受神经支配的食管筏式培养物进行染色。受ENCC神经支配的食管筏式培养物表达食管上皮标志物SOX2、P63、KRT5、KRT13和KRT8以及通用上皮标志物E-钙粘蛋白(Ecad)。表达GFP的ENCC(箭头)支配食管筏式培养物间充质，其以波形蛋白表达为标志。表达GFP的ENCC与神经标志物βIII-微管蛋白共定位，从而表明它们分化为肠神经元。
具体实施方式
本文公开了iPSC衍生的食管筏式培养物和食管筏式细胞组合物。在一些实施方案中，本文所述的食管筏式培养物和食管筏式细胞组合物由人iPSC产生。在一些实施方案中，食管筏式培养物和食管筏式细胞组合物包含食管上皮和食管间充质。在一些实施方案中，通过与神经元祖细胞的抑制剂(即，抑制神经元祖细胞和神经元细胞类型生长和/或分化的化合物)一起培养，可以使食管筏式培养物和食管筏式细胞组合物生长以排除神经元细胞类型。在一些实施方案中，通过将食管筏式培养物或其祖细胞(如食管祖细胞)与分化为神经元细胞类型的肠神经嵴细胞(ENCC)一起培养，可以使食管筏式培养物和食管筏式细胞组合物生长以受神经支配。本文还公开了制备食管筏式培养物和食管筏式细胞组合物的方法。在一些实施方案中，食管筏式培养物和食管筏式细胞组合物与食管类器官不同。通过操纵控制胚胎器官发生的因子，已经开发了体外方法来指导PSC逐步分化为胚胎生殖层谱系，并随后分化为特定细胞类型，如上皮细胞、间充质细胞、肌细胞、神经细胞和血管细胞。产生食管类器官的方法在PCT公开WO 2019/074793中进行了探讨，该文献特此通过引用整体明确地并入。产生其他类型的类器官和中间细胞类型(例如定形内胚层和前部前肠球状体)的其另外的方法可见于美国专利9719068和10174289以及PCT公开WO 2011/140411、WO 2015/183920、WO 2016/061464、WO 2017/192997、WO 2018/106628、WO 2018/200481、WO 2018/085615、WO 2018/085622、WO 2018/085623、WO 2018/226267、WO 2020/023245中，这些文献中的每个文献特此通过引用整体明确地并入。使用肠神经嵴细胞(ENCC)产生受神经支配的其他类型的类器官的方法在PCT公开WO 2016/061464中进行了探讨，该文献特此通过引用整体明确地并入。
食道积极地促进食物从口腔和咽部传递到胃。其由复层鳞状上皮、间充质、肌肉层以及感知拉伸和控制蠕动的肠道神经系统组成。先天性疾病(如食管闭锁)是由导致腔变窄或不连续的基因突变引起的。其他疾病在生命后期影响食道，如食管癌、嗜酸性食管炎、失弛缓症和其他运动障碍。气管和食管病症在人类中普遍存在，并且难以在小鼠中准确地建模。对改进的食管和其他胃肠道模型的需求是显而易见的。
术语
在以下详细描述中，参考了附图，这些附图构成了本说明书的一部分。在附图中，除非上下文另有说明，否则类似符号通常标识类似组件。在详细描述、附图和权利要求中描述的说明性实施方案并不旨在是限制性的。在不脱离本文提出的主题的精神或范围的情况下，可以利用其他实施方案，并且可做出其他改变。容易理解的是，如本文总体描述的和在附图中示出的，本公开的各方面可以按各种不同的配置来布置、替换、组合、分离和设计，在本文中明确考虑了所有这些配置。
除非另外定义，否则本文中使用的技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员根据本公开阅读时通常理解的含义相同的含义。出于本公开的目的，以下术语解释如下。
本文的公开内容使用肯定性语言描述多个实施方案。本公开还包含其中全部或部分地将主题排除在外的实施方案，该主题如物质或材料、方法步骤和条件、方案或程序。
在本文中使用的冠词“一个和一种(a/an)”指代该冠词的语法宾语中的一个或多于一个(例如，至少一个)。例如，“要素”意指一个/种要素或多于一个/种要素。
“约”意指相对于参考数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度变化多达10％的数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度。
贯穿本说明书，除非上下文另有要求，否则词语“包括(comprise、comprises和comprising)”将被理解为暗示包含所陈述的步骤或要素或步骤或要素组，但不排除任何其他步骤或要素或步骤或要素组。“由...组成”意指包括但不限于，无论在短语“由...组成”之后是什么。因此，短语“由…组成”表示所列要素是必不可少或必需的，并且不能存在其他要素。“基本上由…组成”意指包含在该短语之后列出的任何要素，并且限于不干扰或促进本公开中对所列要素指定的活动或动作的其他要素。因此，短语“基本上由…组成”表示所列要素是必需的或强制性的，但是其他要素是任选的并且可以存在或不存在，这取决于其是否实质上影响所列要素的活动或动作。
如本文所用，术语“个体”、“受试者”或“患者”具有如根据本说明书所理解的其普通而惯用的含义，并且是指人或非人哺乳动物，例如狗、猫、小鼠、大鼠、牛、绵羊、猪、山羊、非人灵长类动物，或鸟，例如鸡，以及任何其他脊椎动物或无脊椎动物。术语“哺乳动物”以其通常的生物学意义使用。因此，哺乳动物具体包括但不限于灵长类动物，包含猿猴(黑猩猩、猿、猴子)和人、牛、马、绵羊、山羊、猪、兔、狗、猫、啮齿类动物、大鼠、小鼠、豚鼠等。
如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”具有如根据本说明书所理解的其普通而惯用的含义，并且是指导致可观察的效果的所述组合物或化合物的量。本发明所公开的主题的活性组合物中活性成分的实际剂量水平可以变化，以便施用有效实现特定受试者和/或应用的期望反应的量的活性组合物或化合物。所选择的剂量水平将取决于多种因素，包括但不限于组合物的活性、调配物、施用途径、与其他药物或治疗的组合、所治疗病状的严重程度，以及所治疗受试者的身体状况和之前病史。在一些实施方案中，施用最小剂量，并且在不存在剂量限制性毒性的情况下将剂量逐步增加至最小有效量。本文考虑了对有效剂量的确定和调整，以及对何时和如何进行这种调整的评估。
如本文所用，术语“功能(function)”和“功能性(functional)”具有如根据本说明书所理解的其普通而惯用的含义，并且是指生物功能、酶促功能或治疗功能。
如本文所用，术语“抑制”具有如根据本说明书所理解的其普通而惯用的含义，并且可以指生物活性的降低或防止。减少可以是为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的百分比，或是由前述值中的任何两个所限定的范围内的量。如本文所用，术语“延迟”具有如根据本说明书所理解的其普通而惯用的含义，并且是指将生物事件减慢、延缓或推迟到比以其他方式所预期的更晚的时间。延迟可以是一定百分比的延迟，该百分比为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约0％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％，或是由前述值中的任何两个所限定的范围内的量。术语抑制和延迟不一定表示100％的抑制或延迟。可以实现部分抑制或延迟。
如本文所用，术语“分离的”具有如根据本说明书所理解的其普通而惯用的含义，并且是指物质和/或实体已经(1)与最初产生时(无论是在自然界和/或在实验环境中)与其相关联的至少一些组分分离，和/或(2)通过人工产生、制备和/或制造。分离的物质和/或实体可以与等于、约、至少、至少约、不超过或不超过约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约98％、约99％、基本上100％或100％的最初与其相关的其他组分分离(或包含和/或跨越前述值的范围)。在一些实施方案中，分离的试剂为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、基本上100％或100％纯(或包含和/或跨越前述值的范围)。如本文所用，“分离的”物质可以是“纯的”(例如，基本上不含其他组分)。如本文所用，术语“分离的细胞”可以指不包含在多细胞生物体或组织中的细胞。
如本文所用，“体内”被赋予如根据本说明书所理解的其普通而惯用的含义，并且是指在活生物体(通常是动物、哺乳动物，包含人和植物)而不是组织提取物或死生物体内部执行方法。
如本文所用，“离体”被赋予如根据本说明书所理解的其普通而惯用的含义，并且是指在自然条件几乎没有改变的情况下在活生物体外部执行方法。
如本文所用，“体外”被赋予如根据本说明书所理解的其普通而惯用的含义，并且是指在生物条件外部例如在培养皿或试管中执行方法。
如本文所用，术语“核酸”或“核酸分子”具有如根据本说明书所理解的其普通而惯用的含义，并且是指多核苷酸，如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)、寡核苷酸、自然出现在细胞中的那些、通过聚合酶链反应(PCR)产生的片段，以及通过任何连接、断裂、核酸内切酶作用和核酸外切酶作用产生的片段。核酸分子可以由是天然存在的核苷酸(如DNA和RNA)的单体或天然存在的核苷酸的类似物(例如，天然存在的核苷酸的对映异构形式)或两者的组合构成。经修饰的核苷酸可以在糖部分中和/或在嘧啶或嘌呤碱基部分中具有改变。糖修饰包含例如用卤素、烷基、胺和叠氮基置换一个或多个羟基，或者糖可以被官能化为醚或酯。此外，整个糖部分可以被空间和电子类似的结构(如氮杂糖和碳环糖类似物)置换。碱基部分中的修饰的示例包括烷基化的嘌呤和嘧啶、酰化的嘌呤或嘧啶或其他熟知的杂环取代物。核酸单体可以通过磷酸二酯键或此类连接的类似物连接。磷酸二酯键的类似物包含硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯胺硫代磷酸酯(phosphoroanilothioate)、苯胺磷酸酯(phosphoranilidate)或氨基磷酸酯(phosphoramidate)。术语“核酸分子”还包含所谓的“肽核酸”，其包括附着到聚酰胺主链的天然存在或经修饰的核酸碱基。核酸可以是单链或双链的。“寡核苷酸”可以与核酸互换使用并且可以指双链或单链DNA或RNA。一种或多种核酸可以包含在可以用于在各种生物系统中扩增和/或表达一种或多种核酸的核酸载体或核酸构建体(例如质粒、病毒、逆转录病毒、慢病毒、噬菌体、粘粒、养粒(fosmid)、噬菌粒、细菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)，或人类人工染色体(HAC))中。通常，载体或构建体还将含有包括但不限于以下的元件：启动子、增强子、终止子、诱导子、核糖体结合位点、翻译起始位点、起始密码子、终止密码子、聚腺苷酸化信号、复制起点、克隆位点、多克隆位点、限制酶位点、表位、报告基因、选择标志物、抗生素选择标志物、靶向序列、肽纯化标签或附属基因，或它们的任何组合。
核酸或核酸分子可以包括一个或多个编码不同的肽、多肽或蛋白质的序列。这一个或多个序列可以相邻地接合在相同的核酸或核酸分子中，或在它们之间具有额外的核酸，例如接头、重复序列或限制酶位点，或长度为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、150个、200个或300个碱基或是由前述长度中的任何两个所限定的范围内的任何长度的任何其他序列。如本文所用，术语核酸上的“下游”具有如根据本说明书所理解的其普通而惯用的含义，并且是指在核酸为双链时，序列在包含编码序列的链(有义链)上处于先前序列的3'端之后。如本文所用，术语核酸上的“上游”具有如根据本说明书所理解的其普通而惯用的含义，并且是指在核酸为双链时，序列在包含编码序列的链(有义链)上处于后续序列的5'端之前。如本文所用，术语“分组”在核酸上具有其根据说明书理解的普通而惯用的含义，并且是指两个或更多个直接在附近发生或在其之间具有额外核酸(例如接头、重复序列或限制酶位点)的序列，或任何其他序列，其长度为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、150个、200个或300个碱基长的序列，或由前述长度中的任何两个所限定的范围内的任何长度，但通常其间不具有可编码功能性或催化性多肽、蛋白质或蛋白质结构域的序列。
本文所描述的核酸包括核碱基。主要的、规范的、天然的或未修饰的碱基是腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶。其他核碱基包括但不限于嘌呤、嘧啶、经修饰的核碱基、5-甲基胞嘧啶、假尿苷、二氢尿苷、肌苷、7-甲基鸟苷、次黄嘌呤、黄嘌呤、5,6-二氢尿嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、异鸟嘌呤、异胞嘧啶、氨基烯丙基碱基、染料标记碱基、荧光碱基或生物素标记碱基。
如本文所用，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”具有其根据本说明书理解的普通而惯用的含义，并且是指包括通过肽键连接的氨基酸的大分子。肽、多肽和蛋白质的许多功能是本领域已知的，并且包括但不限于酶、结构、转运、防御、激素或信号传导。尽管化学合成也是可用的，但是肽、多肽和蛋白质通常(但不总是)由核糖体复合物通过使用核酸模板以生物学方式产生。通过使用核酸模板，可以进行肽、多肽和蛋白质突变，例如一种以上肽、多肽或蛋白质的取代、缺失、截短、添加、复制或融合。多于一种肽、多肽或蛋白质的这些融合可以在同一分子中相邻结合，或者在其间具有额外的氨基酸(例如接头、重复序列、表位或标签)，或者任何其他序列，其长度为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200或300个碱基长，或由前述长度中的任何两个所限定的范围内的任何长度。如本文所用，术语“下游”在多肽上具有其根据说明书理解的普通而惯用的含义，并且是指在先前序列的C末端之后的序列。如本文所用，术语“上游”在多肽上具有其根据说明书理解的普通而惯用的含义，并且是指在后续序列的N末端之前的序列。
如本文所用，任何给定物质、化合物或材料的术语“纯度”具有其根据本说明书理解的普通而惯用的含义，并且指物质、化合物或材料相对于预期丰度的实际丰度。例如，物质、化合物或材料的纯度可以为至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％，包含其间的所有小数。纯度可能会受到多余杂质的影响，包括但不限于核酸、DNA、RNA、核苷酸、蛋白质、多肽、肽、氨基酸、脂质、细胞膜、细胞碎片、小分子、降解产物、溶剂、载体、媒剂或污染物，或它们的任何组合。在一些实施方案中，物质、化合物或材料基本上不含宿主细胞蛋白、宿主细胞核酸、质粒DNA、污染性病毒、蛋白酶体、宿主细胞培养物组分、过程相关组分、支原体、热原、细菌内毒素和外来物质。可以使用包括但不限于以下的技术来测量纯度：电泳、SDS-PAGE、毛细管电泳、PCR、rtPCR、qPCR、色谱法、液相色谱法、气相色谱法、薄层色谱法、酶联免疫吸附测定(ELISA)、光谱法、UV-可见光谱法、红外光谱法、质谱法、核磁共振、重量法或滴定，或它们的任何组合。
如本文所用，任何给定物质、化合物或材料的术语“产量”具有其根据说明书理解的普通而惯用的含义，并且指物质、化合物或材料相对于预期总量的实际总量。例如，物质、化合物或材料的产量占预期总量的比例为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％，包含其间的所有小数。在任何生产步骤中，产率可能会受到以下因素的影响：反应或过程的效率、多余的副反应、降解、输入物质、化合物或材料的质量或所需物质、化合物或材料的损失。
本文所描述的一些实施方案涉及药物组合物，其包括有效量的本文所描述的细胞组合物和药学上可接受的载体、赋形剂或其组合，基本上由其组成或由其组成。本文所描述的药物组合物适用于人类和/或兽医应用。
如本文所用，“药学上可接受的”具有根据本说明书所理解的其普通且惯用的含义，并且是指在所使用的剂量和浓度下对暴露于其中的细胞或哺乳动物无毒或者具有可接受的毒性水平的载体、赋形剂和/或稳定剂。如本文所用，“药学上可接受的”“稀释剂”、“赋形剂”和/或“载体”具有根据本说明书所理解的其普通且惯用的含义，并且旨在包含任何和所有与对人类、猫、狗或其他脊椎动物宿主的施用兼容的溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。通常，药学上可接受的稀释剂、赋形剂和/或载体是由联邦、州政府的监管机构或其他监管机构批准的，或在美国药典或其他公认的用于动物(包含人类以及非人类哺乳动物，如猫和狗)中的药典中列出的稀释剂、赋形剂和/或载体。术语稀释剂、赋形剂和/或“载体”可以指与药物组合物一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒剂。此类药物稀释剂、赋形剂和/或载体可以是无菌液体，如水和油，包含石油、动物油、植物油或合成来源的那些油。水、盐溶液以及葡萄糖和甘油水溶液可以用作液体稀释剂、赋形剂和/或载体，特别是用于可注射溶液。合适的药物稀释剂和/或赋形剂包含淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。生理上可接受的载体的非限制性示例是pH缓冲水溶液。生理学上可接受的载体还可以包括以下中的一种或多种：抗氧化剂，如抗坏血酸；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白；明胶；免疫球蛋白；亲水聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸；碳水化合物，如葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖醇，如甘露醇或山梨醇；成盐抗衡离子，如钠；以及非离子表面活性剂，如
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聚乙二醇(PEG)和
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如果需要，组合物还可以含有少量的润湿剂、膨胀剂、乳化剂或pH缓冲剂。这些组合物可以采取溶液、悬浮液、乳液、缓释调配物等形式。调配物应适合施用方式。/>
冷冻保护剂是细胞组合物添加剂，其通过防止形成大冰晶来提高低温冷冻保存的效率和产量。冷冻保护剂包括但不限于DMSO、乙二醇、甘油、丙二醇、海藻糖、甲酰胺、甲基甲酰胺、二甲基甲酰胺、3-磷酸甘油酯、脯氨酸、山梨糖醇、二甘醇、蔗糖、三甘醇、聚乙烯醇、聚乙二醇或羟乙基淀粉。冷冻保护剂可以用作冷冻保存培养基的一部分，该冷冻保存培养基包含其他组分，如营养物(例如白蛋白、血清、牛血清、胎牛血清[FCS])，以提高细胞的解冻后可存活性。在这些冷冻保存培养基中，可以以以下浓度发现至少一种冷冻保护剂，该浓度为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，或是由前述数字中的任何两个所限定的范围内的任何百分比。
具有期望性质的其他赋形剂包括但不限于防腐剂、佐剂、稳定剂、溶剂、缓冲剂、稀释剂、增溶剂、去污剂、表面活性剂、螯合剂、抗氧化剂、醇、酮、醛、乙二胺四乙酸(EDTA)、柠檬酸、盐、氯化钠、碳酸氢钠、磷酸钠、硼酸钠、柠檬酸钠、氯化钾、磷酸钾、硫酸镁、糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、乳糖、半乳糖、蔗糖、山梨糖醇、纤维素、血清、氨基酸、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、脱氧胆酸钠、牛磺脱氧胆酸钠、硬脂酸镁、辛基苯酚乙氧基化物、苄索氯铵、硫柳汞、明胶、酯、醚、2-苯氧乙醇、尿素或维生素，或它们的任何组合。一些赋形剂可能是制造过程中的残留量或污染物，包括但不限于血清、白蛋白、卵清蛋白、抗生素、灭活剂、甲醛、戊二醛、β-丙内酯、明胶、细胞碎片、核酸、肽、氨基酸、或生长培养基成分或它们的任何组合。赋形剂的量可以以如下百分比存在于组合物中，即为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约0％w/w、0.1％w/w、0.2％w/w、0.3％w/w、0.4％w/w、0.5％w/w、0.6％w/w、0.7％w/w、0.8％w/w、0.9％w/w、1％w/w、2％w/w、3％w/w、4％w/w、5％w/w、6％w/w、7％w/w、8％w/w、9％w/w、10％w/w、20％w/w、30％w/w、40％w/w、50％w/w、60％w/w、70％w/w、80％w/w、90％w/w、95％w/w、100％w/w，或由前述数字中的任何两个所限定的范围内的任何重量百分比。
术语“药学上可接受的盐”具有根据本说明书理解的普通且惯用的含义，并且包含组合物或赋形剂的相对无毒的无机和有机酸或碱加成盐，包括但不限于镇痛剂、治疗剂、其他材料等。药学上可接受的盐的示例包括衍生自无机酸如盐酸和硫酸的那些，以及衍生自有机酸如乙磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸等的那些。用于形成盐的合适无机碱的示例包括氨、钠、锂、钾、钙、镁、铝、锌等的氢氧化物、碳酸盐和碳酸氢盐。盐也可以与合适的有机碱形成，包含无毒且强度足以形成此类盐的那些。例如，该类别的此类有机碱可以包括但不限于单烷基胺、二烷基胺和三烷基胺，包含甲胺、二甲胺和三乙胺；单羟基烷基胺、二羟基烷基胺或三羟基烷基胺，包含单乙醇胺、二乙醇胺和三乙醇胺；氨基酸，包含甘氨酸、精氨酸和赖氨酸；胍；N-甲基葡糖胺；N-甲基葡糖胺；L-谷氨酰胺；N-甲基哌嗪；吗啉；乙二胺；N-苄基苯乙胺；三羟甲基氨基乙烷。
适当的调配物取决于所选择的施用途径。本领域技术人员已知用于调配和施用本文所描述的化合物的技术。本领域存在多种施用化合物的技术，包括但不限于肠内、口服、直肠、局部、舌下、口腔、耳内、硬膜外、皮外、气雾剂、肠胃外递送，包含肌肉内、皮下、动脉内、静脉内、门静脉内、关节内、皮内、腹膜内、髓内注射、鞘内、直接心室内、腹膜内、鼻内或眼内注射。药物组合物通常会根据具体的预期施用途径进行调整。
如本文所用，“载体”具有其根据说明书理解普通而惯用含义，并且是指促进化合物通过、递送和/或掺入至细胞、组织和/或身体器官的化合物、颗粒、固体、半固体、液体或稀释剂。
如本文所用，“稀释剂”具有其根据说明书所理解的普通而惯用的含义，并且是指药物组合物中缺乏药理活性但可能是药学上必需或期望的成分。例如，稀释剂可以用于增加质量太小而无法制造和/或施用的强效药物的体积。稀释剂也可以是用于溶解药物以通过注射、摄入或吸入来施用的液体。本领域中稀释剂的常见形式是缓冲水溶液，例如但不限于模拟人血组成的磷酸盐缓冲盐水。
如本文所用，术语“筏式培养物”具有其根据说明书所理解的普通而惯用的含义，并且是指包括多于一种细胞类型的三维细胞培养物，该细胞类型具有非常类似于原生器官组织的细胞组织和功能。在一些实施方案中，顾名思义，培养物在气-液界面中生长并维持，在该气-液界面中，培养物的一部分暴露于气体或大气环境，而另一部分位于液体生长培养基层上或层内。扩散允许来自生长培养基的营养物进入暴露的细胞。气-液界面促使筏式培养物分化为复层上皮层，这些复层上皮层存在于所有器官中，包含在体内暴露于环境气氛的那些器官，包含肺、食道和皮肤。在本文所述的一些实施方案中，筏式培养物还包括间充质层或间充质。
如本文所用，术语“插入构件”具有其根据说明书所理解的普通而惯用的含义，并且是指至少具有细胞可在其上生长的表面的任何构造或容器，其中该表面或其至少一部分能够渗透水性介质但无法透细胞，并且该表面或其至少一部分可以位于单独的容器或其他构造内，使得细胞暴露于该插入构件和该单独的容器或其他构造两者的环境中(尽管细胞可跨能够渗透水性介质但无法透细胞的该表面或其至少一部分暴露于单独的容器或其他结构的环境中，并且不一定直接接触)。如本文所用，插入构件的常见示例为transwell，其是具有渗透型表面的组织培养容器，并且可以位于单独的、通常体积较大的组织培养容器内，使得水性介质可以包含在transwell的内部体积或单独的组织培养容器的内部体积中的一者或多者内，使得两种水性介质之间的交换可跨越渗透型表面发生，并且细胞可在渗透型表面或其至少一部分上接触，使得细胞暴露于transwell中的水性介质和单独容器中的水性介质。然而，设想了插入构件的替代构造，如其中插入构件被固定到单独的容器并且通道或其他开口可用于进入单独容器的内部体积的那些构造，或其中transwell或单独容器中的任一者或两者不具有传统的内部体积并且插入构件与单独容器中的水性介质之间的接触通过替代手段(如微流体通道)来完成的那些构造。如本文所公开的，细胞可在单独容器内的插入构件的表面或其一部分上生长，使得细胞仅部分地浸没(即，插入构件中具有少量或没有水性介质)在气-液界面内。
如本文所用，术语“％w/w”或“％wt/wt”具有其根据说明书理解的平常且普通的含义，并且指以成分或试剂的重量占组合物总重量的百分比乘以100表示。如本文所用，术语“％v/v”或“％vol/vol”具有其根据说明书理解的普通而惯用的含义，并且是指以化合物、物质、成分或药剂的液体体积占组合物总液体体积的百分比乘以100表示。
干细胞
如本文所用，术语“全能干细胞”(也称为万能干细胞)具有根据说明书所理解的其简单和普通含义，并且是可以分化成胚胎细胞和胚胎外细胞类型的干细胞。这种细胞可以构建完整的、有活力的生物体。这些细胞是由卵子和精子细胞融合而成。由受精卵的前几个分裂产生的细胞也是全能的。
如本文所用，术语“胚胎干细胞(ESC)”，通常也缩写为ES细胞，具有根据说明书所理解的其普通且惯用的含义，并且是指为多能的并且衍生自胚泡(即早期胚胎)的内细胞团的细胞。出于本公开的目的，术语“ESC”有时也广泛用于涵盖胚胎生殖细胞。
如本文所用，术语“多能干细胞(PSC)”具有根据本说明书所理解的其普通且惯用的含义，并且涵盖可以分化成身体的几乎所有细胞类型的任何细胞，即衍生自三个胚层(生发上皮)中的任何一个的细胞，包含内胚层(内部胃壁、胃肠道、肺)、中胚层(肌肉、骨骼、血液、泌尿生殖器)和外胚层(表皮组织和神经系统)。PSC可以是植入前胚泡的内细胞团细胞的后代，或通过诱导非多能细胞，如成体体细胞，通过强迫某些基因表达而获得。多能干细胞可以衍生自任何合适的来源。多能干细胞来源的示例包括哺乳动物来源，包含人、啮齿动物、猪和牛。
如本文所用，术语“诱导的多能干细胞(iPSC)”，通常也缩写为iPS细胞，具有根据说明书所理解的其简单和普通含义，并且是指通过诱导某些基因的“强迫”表达而人工衍生自通常非多能细胞如成体体细胞的多能干细胞类型。hiPSC是指人iPSC。在本领域已知的一些方法中，通过将某些干细胞相关基因转染到非多能细胞如成体成纤维细胞中来获得iPSC。转染可以通过使用病毒(如逆转录病毒或慢病毒)进行病毒转导来实现。经转染的基因可以包含主转录调节因子Oct-3/4(POU5F1)和Sox2，但是其他基因也可以增强诱导效率。3周到4周之后，少量转染细胞开始在形态学和生物化学上类似于多能干细胞，并且通常通过形态学选择、倍增时间或通过报告基因和抗生素选择分离。如本文所用，iPSC包含小鼠中的第一代iPSC、第二代iPSC，以及人类诱导的多能干细胞。在一些方法中，逆转录病毒系统用于使用四种关键基因(Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc)将人成纤维细胞转化为多能干细胞。在其他方法中，慢病毒系统用于用OCT4、SOX2、NANOG和LIN28转化体细胞。表达在iPSC中诱导的基因包括但不限于Oct-3/4(POU5F1)；Sox基因家族的某些成员(例如，Soxl、Sox2、Sox3和Sox15)；Klf家族的某些成员(例如，Klfl、Klf2、Klf4和Klf5)、Myc家族的某些成员(例如，C-myc、L-myc和N-myc)、Nanog、LIN28、Tert、Fbx15、ERas、ECAT15-1、ECAT15-2、Tcl1、β-连环蛋白、ECAT1、Esg1、Dnmt3L、ECAT8、Gdf3、Fth117、Sal14、Rex1、UTF1、Stella、Stat3、Grb2、Prdm14、Nr5a1、Nr5a2、或E-钙粘蛋白，或它们的任何组合。还设想了本领域常规已知的产生诱导性多能干细胞的其他方法。
如本文所用，术语“前体细胞”具有根据本说明书所理解的其普通且惯用的含义，并且涵盖可以用于本文所描述的方法中的任何细胞，通过该细胞，一种或多种前体细胞获得自我更新或分化成一种或多种特化细胞类型的能力。在一些实施方案中，前体细胞是多能的或具有变成多能的能力。在一些实施方案中，对前体细胞进行外部因子(例如，生长因子)的处理以获得多能性。在一些实施方案中，前体细胞可以是全能(或全能)干细胞；多能干细胞(诱导或非诱导)；多能干细胞；寡能干细胞和单能干细胞。在一些实施方案中，前体细胞可以来自胚胎、婴儿、儿童或成人。在一些实施方案中，前体细胞可以是经受处理的体细胞，使得通过遗传操作或蛋白质/肽处理赋予多能性。前体细胞包含胚胎干细胞(ESC)、胚胎癌细胞(EC)和外胚层干细胞(EpiSC)以及诱导性多能干细胞。
在一些实施方案中，一个步骤是获得多能性的干细胞或获得可以诱导成为多能性的干细胞。在一些实施方案中，多能干细胞衍生自胚胎干细胞，该胚胎干细胞又衍生自早期哺乳动物胚胎的全能细胞，并且能够在体外无限制的未分化增殖。胚胎干细胞是衍生自早期胚胎的胚泡内细胞团的多能干细胞。从胚细胞衍生胚胎干细胞的方法是本领域熟知的。人胚胎干细胞H9(H9-hESC)用于本申请中描述的示例性实施方案中，但是本领域技术人员将理解，本文描述的方法和系统适用于任何干细胞。
可以用于根据本公开的实施方案中的额外的干细胞包括但不限于由旧金山加利福尼亚大学(UCSF)的人类胚胎干细胞研究中心的国立干细胞库(NSCB)主办的数据库；Wi细胞研究所的WISC细胞库；威斯康星大学干细胞与再生医学中心(UW-SCRMC)；Novocell，Inc.(加利福尼亚州圣地亚哥)；Cellartis AB(瑞典哥德堡)；ES Cell International Pte Ltd(新加坡)；以色列理工学院Technion(以色列海法)；以及由普林斯顿大学和宾夕法尼亚大学主办的干细胞数据库提供或描述的那些干细胞。可以用于根据本公开的实施方案中的示例性胚胎干细胞包括但不限于SA01(SA001)；SA02(SA002)；ES01(HES-1)；ES02(HES-2)；ES03(HES-3)；ES04(HES-4)；ES05(HES-5)；ES06(HES-6)；BG01(BGN-01)；BG02(BGN-02)；BG03(BGN-03)；TE03(13)；TE04(14)；TE06(16)；UCOl(HSF1)；UC06(HSF6)；WA01(HI)；WA07(H7)；WA09(H9)；WA13(H13)；WA14(H14)。示例性人多能细胞系包括但不限于TkDA3-4、1231A3、317-D6、317-A4、CDH1、5-T-3、3-34-1、NAFLD27、NAFLD77、NAFLD150、WD90、WD91、WD92、L20012、C213、1383D6、FF或317-12细胞。
在发育生物学中，细胞分化是较不特化的细胞变成更特化的细胞类型的过程。如本文所用，术语“分化”或“定向分化”描述了一种过程，通过该过程，较不特化的细胞变成特定的特化靶向细胞类型。特化靶细胞类型的特殊性可以通过可以用于定义或改变初始细胞命运的任何适用方法来确定。示例性方法包括但不限于遗传操作、化学处理、蛋白质处理和核酸处理。
在一些实施方案中，腺病毒可以用于运输必需的四种基因，从而产生与胚胎干细胞基本上相同的iPSC。由于腺病毒不将其任何自身基因与靶向宿主组合，因此消除了产生肿瘤的危险。在一些实施方案中，使用基于非病毒的技术生成iPSC。在一些实施方案中，重编程可以通过质粒完成，而根本没有任何病毒转染系统，尽管效率非常低。在其他实施方案中，蛋白质的直接递送用于生成iPSC，因此消除了对病毒或遗传修饰的需要。在一些实施方案中，使用类似的方法生成小鼠iPSC是可能的：用通过聚精氨酸锚导入细胞的某些蛋白来重复处理细胞足以诱导多能性。在一些实施方案中，还可以通过在低氧条件下用FGF2处理体细胞来增加多能性诱导基因的表达。
如本文所用，术语“饲养细胞”具有根据说明书所理解的其简单和普通含义，并且是指支持多能干细胞生长的细胞，如通过将生长因子分泌到培养基中或展示在细胞表面上来支持多能干细胞生长的细胞。饲养细胞通常是贴壁细胞并且可能生长停滞。例如，饲养细胞因辐照(例如γ射线)、丝裂霉素-C处理、电脉冲或温和的化学固定(例如用甲醛或戊二醛)而生长停滞。然而，饲养细胞不一定必须生长停滞。饲养细胞可以用于如分泌生长因子、在细胞表面展示生长因子、使培养基解毒或合成胞外基质蛋白等目的。在一些实施方案中，饲养细胞与所支持的靶干细胞是同种异体的或异种异体的，这可能对下游应用有影响。在一些实施方案中，饲养细胞是小鼠细胞。在一些实施方案中，饲养细胞是人细胞。在一些实施方案中，饲养细胞是小鼠成纤维细胞、小鼠胚胎成纤维细胞、小鼠STO细胞、小鼠3T3细胞、小鼠SNL 76/7细胞、人成纤维细胞、人包皮成纤维细胞、人真皮成纤维细胞、人脂肪间充质细胞、人骨髓间充质细胞、人羊膜间充质细胞、人羊膜上皮细胞、人脐带间充质细胞、人胎儿肌细胞、人胎儿成纤维细胞或人成体输卵管上皮细胞。在一些实施方案中，使用由饲养细胞制备的条件培养基代替饲养细胞共培养物或与饲养细胞共培养物组合。在一些实施方案中，在靶干细胞增殖期间不使用饲养细胞。
PSC和定形内胚层的分化
在一些实施方案中，PSC(如ESC和iPSC)首先以逐步方式定向分化为定形内胚层(DE)，然后分化为前部/前肠谱系，然后分化为食管组织。在一些实施方案中，PSC(如ESC和iPSC)以非逐步方式进行定向分化，其中同时添加用于促进DE形成的分子(例如，生长因子、配体)和用于随后组织形成的分子。
定形内胚层产生肠管。前部DE形成前肠及其相关器官，包含食道、肺、胃、肝脏和胰腺，后部DE形成中肠和后肠，其形成小肠和大肠以及泌尿生殖系统的部分。使用小鼠、鸡和青蛙胚胎的研究表明，在原肠胚阶段建立DE的前后模式是随后前肠和后肠发育的先决条件。Wnt和FGF信号传导通路对于促进后内胚层/后肠或前内胚层/前肠命运至关重要。
指导DE在体外分化为食管组织的方法已经在PCT公开WO 2019/074793中进行了探讨，该文献特此通过引用整体明确地并入。在一些实施方案中，定向分化是通过选择性地活化iPSC和/或DE细胞中的某些信号传导通路来实现的。在一些实施方案中，信号传导通路是在食管或胃肠道发育中活跃的那些信号传导通路，包括但不限于EGF信号传导通路；Wnt信号传导通路；Wnt/APC信号传导通路；FGF信号传导通路；TGF-β信号传导通路；BMP信号传导通路；Notch信号传导通路；刺猬信号传导通路；LKB信号传导通路；以及Par极性信号传导通路。
用于从多能细胞(例如，iPSC或ESC)产生定形内胚层的方法适用于本文所描述的方法。在一些实施方案中，多能细胞衍生自桑椹胚。在一些实施方案中，多能干细胞是干细胞。在这些方法中使用的干细胞可以包括但不限于胚胎干细胞。胚胎干细胞可以衍生自胚胎内细胞团或衍生自胚胎性腺脊。胚胎干细胞或生殖细胞可以源自多种动物物种，包括但不限于包含人的各种哺乳动物物种。在一些实施方案中，人胚胎干细胞用于产生定形内胚层。在一些实施方案中，人胚胎生殖细胞用于产生定形内胚层。在一些实施方案中，iPSC用于产生定形内胚层。在一些实施方案中，人iPSC(hiPSC)用于产生定形内胚层。
在一些实施方案中，胚胎干细胞或生殖细胞或iPSC用一种或多种小分子化合物、活化剂、抑制剂或生长因子处理一段时间，该一段时间为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约6小时、12小时、18小时、24小时、36小时、48小时、60小时、72小时、84小时、96小时、120小时、150小时、180小时、240小时、300小时，或是由前述时间中的任何两个所限定的范围(例如6小时至300小时、24小时至120小时、48小时至96小时、6小时至72小时或24小时至300小时)内的任何时间。在一些实施方案中，添加多于一种小分子化合物、活化剂、抑制剂或生长因子。在这些情况下，可以同时或分别添加多于一种的小分子化合物、活化剂、抑制剂或生长因子。
在一些实施方案中，胚胎干细胞或生殖细胞或iPSC用一种或多种小分子化合物、活化剂、抑制剂或生长因子以如下浓度下进行处理：该浓度为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约10ng/mL、20ng/mL、50ng/rnL、75ng/mL、100ng/mL、120ng/mL、150ng/mL、200ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL、1200ng/mL、1500ng/mL、2000ng/mL、5000ng/mL、7000ng/mL、10000ng/mL或15000ng/mL，或是由前述浓度中的任何两个所限定的范围(例如，10ng/mL至15000ng/mL、100ng/mL至5000ng/mL、500ng/mL至2000ng/mL、10ng/mL至2000ng/mL或1000ng/mL至15000ng/mL)内的任何浓度。在一些实施方案中，一种或多种小分子化合物、活化剂、抑制剂或生长因子的浓度在整个治疗期间保持在恒定水平。在一些实施方案中，一种或多种小分子化合物、活化剂、抑制剂或生长因子的浓度在治疗过程中变化。在一些实施方案中，添加多于一种小分子化合物、活化剂、抑制剂或生长因子。在这些情况下，多于一种小分子化合物、活化剂、抑制剂或生长因子的浓度可以不同。
在一些实施方案中，在支持干细胞生长的生长培养基中培养ESC、生殖细胞或iPSC或任何下游细胞类型。在一些实施方案中，在干细胞生长培养基中培养ESC、生殖细胞或iPSC或任何下游细胞类型。在一些实施方案中，干细胞生长培养基是无血清培养基、RPMI1640、DMEM、DMEM/F12、高级DMEM/F12或角质形成细胞SFM培养基。在一些实施方案中，干细胞生长培养基包括胎牛血清(FBS)。在一些实施方案中，干细胞生长培养基包括FBS，其浓度为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约0％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％，或是由前述浓度中的任何两个所限定的范围(例如0％至20％、0.2％至10％、2％至5％、0％至5％或2％至20％)内的任何百分比。在一些实施方案中，干细胞生长培养基不含有异种异体组分。在一些实施方案中，生长培养基包括一种或多种小分子化合物、活化剂、抑制剂或生长因子。
在一些实施方案中，使用富集定形内胚层细胞的细胞群体。在一些实施方案中，分离或基本上纯化定形内胚层细胞。在一些实施方案中，分离的或基本上纯化的定形内胚层细胞将SOX17、FOXA2或CXRC4标志物中的一者或多者(例如，至少1个、3个)表达至比OCT4、AFP、TM、SPARC或SOX7标志物中的一个或多个(例如至少1个、3个、5个)更大的程度。
在一些实施方案中，定形内胚层细胞和hESC用一种或多种生长因子处理。此类生长因子可以包含来自TGF-β超家族的生长因子。在一些实施方案中，一种或多种生长因子包括TGF-β生长因子超家族的Nodal/活化素和/或BMP亚组。在一些实施方案中，一种或多种生长因子选自由以下组成的组：Nodal、活化素A、激化活素B、BMP4、Wnt3a或这些生长因子中任一者的组合。
在一些实施方案中，活化素诱导的定形内胚层(DE)可进一步经历前内胚层图案化、前肠特化和形态发生，这取决于FGF、Wnt、BMP或视黄酸或它们的任何组合，以及促进食管生长、形态发生和细胞分化的食管培养系统。在一些实施方案中，有效地指导人PSC在体外分化为食管上皮和间充质。应当理解，可以将如生长因子等分子添加到发育的任何阶段以促进特定类型的胃肠组织形成。
在一些实施方案中，定向分化是通过选择性地活化和/或抑制PSC、DE或任何下游细胞类型中的某些信号传导通路来实现的。在一些实施方案中，信号传导通路包括但不限于Wnt通路；FGF通路、BMP通路；视黄酸通路；EGF通路；Rho激酶(ROCK)通路；或SMAD通路，或它们的任何组合。本领域技术人员将理解，改变本文所公开的信号传导通路中的任一种信号传导通路的浓度、表达或功能可以根据本公开驱动分化。在一些实施方案中，与信号传导通路相关的细胞成分，例如，该通路的天然抑制剂、拮抗剂、活化剂或激动剂可以用于导致信号传导通路的抑制或活化。在一些实施方案中，靶向与信号传导通路相关的细胞成分的siRNA和/或shRNA用于抑制或活化这些通路。
在一些实施方案中，使多能干细胞、定形内胚层细胞、前部前肠细胞、背侧前部前肠细胞、食管祖细胞和/或食管筏式细胞与Wnt通路活化剂接触。在一些实施方案中，Wnt通路活化剂包括Wnt蛋白。在一些实施方案中，Wnt蛋白包括重组Wnt蛋白。在一些实施方案中，Wnt通路活化剂包括Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt9a、Wnt9b、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11、Wnt16、BML 284、IQ-1、WAY262611或它们的任何组合。在一些实施方案中，Wnt通路活化剂包括GSK3信号传导通路抑制剂。在一些实施方案中，Wnt通路活化剂包括CHIR99021、CHIR 98014、AZD2858、BIO、AR-A014418、SB 216763、SB 415286、芦荟素(aloisine)、靛玉红(indirubin)、阿特波龙(alsterpaullone)、肯帕罗酮(kenpaullone)、氯化锂、TDZD 8或TWS119或它们的任何组合。在一些实施方案中，细胞没有用Wnt通路活化剂处理。本文所提供的Wnt通路活化剂可以与本文所描述的其他生长因子、通路活化剂或通路抑制剂中的任一种组合使用。
成纤维细胞生长因子(FGF)是参与血管生成、伤口愈合和胚胎发育的生长因子家族。FGF是肝素结合蛋白，并且已经示出与细胞表面相关联的硫酸乙酰肝素蛋白多糖的相互作用对于FGF信号转导是必需的。FGF是多种细胞和组织增殖和分化过程中的关键参与者。在人类中，已鉴定出FGF家族的22个成员，所有这些成员都是结构相关的信号传导分子。成员FGF1到FGF10都与成纤维细胞生长因子受体(FGFR)结合。FGF1又被称为酸性，并且FGF2又被称为碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。已示出成员FGF11、FGF12、FGF13和FGF14，也称为FGF同源因子1-4(FHF1-FHF4)，与FGF相比具有明显的功能差异。尽管这些因子具有非常类似的序列同源性，但是它们不与FGFR结合并且涉及与FGF无关的细胞内过程。该组也被称为“iFGF”。成员FGF15至FGF23是较新的并且不那么好地被表征。FGF15是人FGF19的小鼠直系同源物(因此没有人FGF15)。人FGF20是基于其与非洲爪蟾FGF-20(XFGF-20)的同源性鉴定的。与其他FGF的局部活性相反，FGF15/FGF19、FGF21和FGF23具有更多的全身效应。
在一些实施方案中，使多能干细胞、定形内胚层细胞、前部前肠细胞、背侧前部前肠细胞、食管祖细胞和/或食管筏式细胞与FGF通路活化剂接触。在一些实施方案中，FGF通路活化剂包括FGF蛋白。在一些实施方案中，FGF蛋白包括重组FGF蛋白。在一些实施方案中，FGF通路活化剂包括以下中的一种或多种：FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF8、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF13、FGF14、FGF15(FGF19、FGF15/FGF19)、FGF16、FGF17、FGF18、FGF20、FGF21、FGF22或FGF23。在一些实施方案中，细胞没有用FGF通路活化剂处理。本文所提供的FGF通路活化剂可以与本文所提供的其他生长因子、通路活化剂或通路抑制剂中的任一种组合使用。
在一些实施方案中，使多能干细胞、定形内胚层细胞、前部前肠细胞、背侧前部前肠细胞、食管祖细胞和/或食管筏式细胞与骨形态发生蛋白(BMP)通路活化剂或BMP通路抑制剂接触。在一些实施方案中，BMP通路活化剂包括BMP蛋白。在一些实施方案中，BMP蛋白是重组BMP蛋白。在一些实施方案中，BMP通路活化剂包括BMP1、BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8a、BMP8b、BMP10、BMP11、BMP15、IDE1或IDE2，或它们的任何组合。在一些实施方案中，BMP通路抑制剂包括Noggin、RepSox、LY364947、LDN193189、SB431542或它们的任何组合。在一些实施方案中，细胞没有用BMP通路活化剂或BMP通路抑制剂处理。本文所提供的BMP通路活化剂或BMP通路抑制剂可以与本文所提供的其他生长因子、通路活化剂或通路抑制剂中的任一种组合使用。
在一些实施方案中，使多能干细胞、定形内胚层细胞、前部前肠细胞、背侧前部前肠细胞、食管祖细胞和/或食管筏式细胞与视黄酸通路活化剂接触。在一些实施方案中，视黄酸通路活化剂包括视黄酸、全反式视黄酸、9-顺式视黄酸、CD437、EC23、BS 493、TTNPB或AM580，或它们的任何组合。在一些实施方案中，细胞没有用视黄酸通路活化剂处理。本文所提供的视黄酸通路活化剂可以与本文所提供的其他生长因子、通路活化剂或通路抑制剂中的任一种组合使用。
在一些实施方案中，使多能干细胞、定形内胚层细胞、前部前肠细胞、背侧前部前肠细胞、食管祖细胞和/或食管筏式细胞与表皮生长因子(EGF)通路活化剂接触。在一些实施方案中，EGF通路活化剂包括EGF、TGF-α、AR、BTC、HB-EGF、EPR、tomoregulin、NRG-1、NRG-2、NRG-3或NRG-4，或它们的任何组合。在一些实施方案中，细胞没有用EGF通路活化剂处理。本文所提供的EGF通路活化剂可以与本文所提供的其他生长因子、通路活化剂或通路抑制剂中的任一种组合使用。
在一些实施方案中，使多能干细胞、定形内胚层细胞、前部前肠细胞、背侧前部前肠细胞、食管祖细胞和/或食管筏式细胞与ROCK抑制剂(ROCKi)接触。在一些实施方案中，ROCKi包括Y-27632、Y-30141、Y-39983、Ki-23095、SLx-2119、噻唑维林、氮杂吲哚1、法舒地尔、利帕舒地尔、奈塔舒地尔、RKI-1447或GSK429286A或它们的任何组合。在一些实施方案中，细胞没有用ROCKi处理。本文所提供的ROCKi可以与本文所提供的其他生长因子、通路活化剂或通路抑制剂中的任一种组合使用。
在一些实施方案中，使多能干细胞、定形内胚层细胞、前部前肠细胞、背侧前部前肠细胞、食管祖细胞和/或食管筏式细胞与转化生长因子-β(TGF-β)通路活化剂或TGF-β通路抑制剂接触。在一些实施方案中，TGF-β家族包括骨形态发生蛋白(BMP)、生长和分化因子(GDF)、抗苗勒管激素、活化素和Nodal通路。在一些实施方案中，TGF-β通路活化剂包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、活化素A、活化素B、Nodal、BMP、IDE1、IDE2或它们的任何组合。在一些实施方案中，TGF-β通路抑制剂包括A-83-01、DMH1、RepSox、LY365947、LY2109761、LY364947、SB431542、SB525334、SB505125、高伦替布、GW788388、LDN-193189、LDN-212854、橙皮素或它们的任何组合。在一些实施方案中，细胞没有用TGF-β通路活化剂或TGF-β通路抑制剂处理。本文所提供的TGF-β通路活化剂或TGF-β通路抑制剂可以与本文所提供的其他生长因子、通路活化剂或通路抑制剂中的任一种组合使用。
在一些实施方案中，使多能干细胞、定形内胚层细胞、前部前肠细胞、背侧前部前肠细胞、食管祖细胞和/或食管筏式细胞与SMAD通路抑制剂接触。在一些实施方案中，SMAD通路抑制剂是TGF-β通路抑制剂。在一些实施方案中，SMAD通路抑制剂包括A-83-01、DMH1、RepSox、LY365947、LY2109761、LY364947、SB431542、SB525334、SB505125、高伦替布、GW788388、LDN-193189、LDN-212854、橙皮素或它们的任何组合。在一些实施方案中，细胞没有用SMAD通路抑制剂处理。本文所提供的SMAD通路抑制剂可以与本文所提供的其他生长因子、通路活化剂或通路抑制剂中的任一种组合使用。
在一些实施方案中，细胞通过“一步”法分化。例如，使一种或多种可将多能干细胞分化为DE培养物的分子(例如，活化素A)与可以促进DE培养物定向分化的另外的分子(例如，FGF4、Wnt、Noggin、RA)组合，以直接处理多能干细胞。
在一些实施方案中，多能干细胞由体细胞制备。在一些实施方案中，多能干细胞是由活检获得的生物组织制备的。在一些实施方案中，多能干细胞被冷冻保存。在一些实施方案中，体细胞被冷冻保存。在一些实施方案中，多能干细胞是由PBMC制备的。在一些实施方案中，人PSC是由人PBMC制备的。在一些实施方案中，多能干细胞是由冷冻保存的PBMC制备的。在一些实施方案中，PBMC在饲养细胞基底上生长。在一些实施方案中，PBMC在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)饲养细胞基底上生长。在一些实施方案中，PBMC在经辐照的MEF饲养细胞基底上生长。
在一些实施方案中，在细胞培养物中扩增多能干细胞(例如，胚胎干细胞或诱导性多能干细胞)。在一些实施方案中，在基质胶中扩增多能干细胞(例如，iPSC)。在一些实施方案中，在包括ROCK抑制剂(例如Y-27632)的细胞培养物中扩增多能干细胞。在一些实施方案中，使多能干细胞(例如，iPSC)分化为定形内胚层细胞。通过使多能干细胞(例如，iPSC)与活化素A、BMP4或两者接触，使多能干细胞(例如，iPSC)分化为定形内胚层细胞。在一些实施方案中，使多能干细胞(例如，iPSC)与一定浓度的活化素A接触，该浓度为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约10ng/mL、20ng/mL、30ng/mL、40ng/mL、50ng/mL、60ng/mL、70ng/mL、80ng/mL、90ng/mL、100ng/mL、110ng/mL、120ng/mL、130ng/mL、140ng/mL、150ng/mL、160ng/mL、170ng/mL、180ng/mL、190ng/mL或200ng/mL，或是由前述浓度中的任何两个所限定的范围(例如，10ng/mL至200ng/mL、10ng/mL至100ng/mL、100ng/mL至200ng/mL或50ng/mL至150ng/mL)内的任何浓度。在一些实施方案中，使多能干细胞(例如，iPSC)与浓度为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约1ng/mL、2ng/mL、3ng/mL、4ng/mL、5ng/mL、6ng/mL、7ng/mL、8ng/mL、9ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、30ng/mL、40ng/mL、50ng/mL、60ng/mL、70ng/mL、80ng/mL、90ng/mL、100ng/mL、110ng/mL、120ng/mL、130ng/mL、140ng/mL、150ng/mL、160ng/mL、170ng/mL、180ng/mL、190ng/mL或200ng/mL的BMP4接触，或与由前述浓度中的任何两个所限定的范围(例如，1ng/mL至200ng/mL、1ng/mL至100ng/mL、25ng/mL至200ng/mL、1ng/mL至80ng/mL或25ng/mL至100ng/mL)内的任何浓度的BMP4接触。在一些实施方案中，多能干细胞在含有生长血清的培养基中分化为定形内胚层细胞。在一些实施方案中，培养基含有0％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2.0％、2.1％、2.2％、2.3％、2.4％或2.5％的生长血清，或由前述百分比中的任何两个所限定的范围(例如，0％至2％、1％至2.5％、1.5％至2.5％、1.5％至2％或0.5％至2％)内的任何百分比的生长血清。在一些实施方案中，定形内胚层细胞在含有FBS的培养基中分化为前部前肠细胞。在一些实施方案中，培养基含有0％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2.0％、2.1％、2.2％、2.3％、2.4％或2.5％的FBS，或由前述百分比中的任何两个所限定的范围(例如，0％至2％、1％至2.5％、1.5％至2.5％、1.5％至2％或0.5％至2％)内的任何百分比的FBS。在一些实施方案中，多能干细胞在FBS浓度逐步增加的生长培养基中分化，例如，通过交换含有0％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2.0％、2.1％、2.2％、2.3％、2.4％或2.5％FBS中的多于一者的培养基。在一些实施方案中，用含有0％、0.2％和2％FBS的培养基以逐步方式使多能干细胞分化。除了这些实施方案之外，可根据本领域已知的任何其他方法使多能干细胞(例如，iPSC)分化为定形内胚层细胞。
在一些实施方案中，定形内胚层细胞分化为前部前肠细胞。在一些实施方案中，前部前肠细胞生长为单层。在一些实施方案中，通过使定形内胚层细胞与Wnt蛋白或通路活化剂、FGF蛋白或通路活化剂、BMP通路抑制剂或视黄酸通路活化剂或它们的任何组合中的一者或多者(例如至少1者、2者、3者、4者)接触，使定形内胚层细胞分化为前部前肠细胞。在一些实施方案中，Wnt蛋白或通路活化剂是Wnt3a。在一些实施方案中，FGF蛋白或通路活化剂是FGF4。在一些实施方案中，BMP通路抑制剂是Noggin。在一些实施方案中，视黄酸通路活化剂是视黄酸。在一些实施方案中，Wnt蛋白或通路活化剂、FGF蛋白或通路活化剂、BMP通路抑制剂或视黄酸通路活化剂或它们的任何组合以一定浓度提供，该浓度为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约0ng/mL、100ng/mL、120ng/mL、140ng/mL、160ng/mL、180ng/mL、200ng/mL、220ng/mL、240ng/mL、260ng/mL、280ng/mL、300ng/mL、320ng/mL、340ng/mL、360ng/mL、380ng/mL、400ng/mL、420ng/mL、440ng/mL、460ng/mL、480ng/mL、500ng/mL、520ng/mL、540ng/mL、560ng/mL、580ng/mL或600ng/mL，或是由前述浓度中的任何两个所限定的范围(例如，0ng/mL至600ng/mL、0ng/mL至200ng/mL、200ng/mL至500ng/mL或200ng/mL至600ng/mL)内的任何浓度。在一些实施方案中，Wnt蛋白或通路活化剂、FGF蛋白或通路活化剂、BMP通路抑制剂或视黄酸通路活化剂或它们的任何组合以一定浓度提供，该浓度为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约0μM、0.1μM、0.2μM、0.3μM、0.4μM、0.5μM、0.6μM、0.7μM、0.8μM、0.9μM、1.0μM、1.1μM、1.2μM、1.3μM、1.4μM、1.5μM、1.6μM、1.7μM、1.8μM、1.9μM、2.0μM、2.1μM、2.2μM、2.3μM、2.4μM、2.5μM、2.6μM、2.7μM、2.8μM、2.9μM或3.0μM，或是由前述浓度中的任何两个所限定的范围(例如，0μM至3.0μM、1.0μM至3.0μM、0μM至2.0μM或1.5μM至3.0μM)内的任何浓度。在一些实施方案中，使定形内胚层细胞与Wnt蛋白或通路活化剂、FGF蛋白或通路活化剂、BMP通路抑制剂或视黄酸通路活化剂或它们的任何组合中的一者或多者(例如至少1者、2者、3者、4者)接触数天，该天数为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或8天。在一些实施方案中，在不使定形内胚层细胞与Wnt蛋白或通路活化剂、FGF蛋白或通路活化剂、BMP通路抑制剂或视黄酸通路活化剂或它们的任何组合中的一者或多者(例如至少1者、2者、3者、4者)接触的情况下，使定形内胚层细胞分化为前部前肠细胞。在一些实施方案中，在不使定形内胚层细胞与Wnt3a、FGF4、Noggin或视黄酸或它们的任何组合中的一者或多者(例如至少1者、2者、3者、4者)接触的情况下，使定形内胚层细胞分化为前部前肠细胞。在一些实施方案中，定形内胚层细胞在含有生长血清的培养基中分化为前部前肠细胞。在一些实施方案中，培养基含有0％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2.0％、2.1％、2.2％、2.3％、2.4％或2.5％的生长血清，或由前述百分比中的任何两个所限定的范围(例如，0％至2％、1％至2.5％、1.5％至2.5％、1.5％至2％或0.5％至2％)内的任何百分比的生长血清。在一些实施方案中，定形内胚层细胞在含有FBS的培养基中分化为前部前肠细胞。在一些实施方案中，培养基含有0％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2.0％、2.1％、2.2％、2.3％、2.4％或2.5％的FBS，或由前述百分比中的任何两个所限定的范围(例如，0％至2％、1％至2.5％、1.5％至2.5％、1.5％至2％或0.5％至2％)内的任何百分比的FBS。
除了这些实施方案之外，可根据本领域已知的任何其他方法使定形内胚层细胞分化为前部前肠细胞。
背侧前部前肠细胞的形成
本文所公开的或本领域以其他方式已知的用于由多能干细胞产生前部前肠细胞的方法适用于本文所描述的方法。在一些实施方案中，本领域已知的产生前部前肠球状体的方法可用于产生前部前肠细胞。在一些实施方案中，通过排除自发产生的前部前肠球状体，在分化期间获得作为细胞单层的前部前肠细胞。在一些实施方案中，通过将自发产生的前部前肠球状体解离成单个细胞并将解离后的单个细胞接种至单层而获得前部前肠细胞。在一些实施方案中，前部前肠细胞作为细胞单层和通过将自发产生的前部前肠球状体解离成单个细胞而获得。
在一些实施方案中，前部前肠细胞分化为背侧前部前肠细胞，其表达SOX2、HNF1β或两者。在一些实施方案中，通过使前部前肠细胞与表皮生长因子(EGF)通路活化剂、BMP通路抑制剂或FGF通路活化剂或它们的任何组合中的一者或多者(例如至少1者、2者、3者)接触，使前部前肠细胞分化为背侧前部前肠细胞。在一些实施方案中，使前部前肠细胞进一步与生长补充剂接触。在一些实施方案中，通过使前部前肠细胞与EGF通路活化剂、BMP通路抑制剂、FGF通路活化剂或生长补充剂或它们的任何组合中的一者或多者(例如至少1者、2者、3者、4者)接触，使前部前肠细胞分化为背侧前部前肠细胞。在一些实施方案中，使前部前肠细胞进一步与神经元祖细胞抑制剂(即抑制神经元祖细胞和神经元细胞类型的生长和/或分化的化合物)接触。在一些实施方案中，通过使前部前肠细胞与EGF通路活化剂、BMP通路抑制剂、FGF通路活化剂或神经元祖细胞抑制剂或它们的任何组合中的一者或多者(例如至少1者、2者、3者、4者)接触，使前部前肠细胞分化为背侧前部前肠细胞。在一些实施方案中，EGF通路活化剂包括EGF、TGF-α、AR、BTC、HB-EGF、EPR、tomoregulin、NRG-1、NRG-2、NRG-3或NRG-4，或它们的任何组合。在一些实施方案中，BMP通路抑制剂包括Noggin、RepSox、LY364947、LDN193189、SB431542或它们的任何组合。在一些实施方案中，FGF通路活化剂包括FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF8、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF13、FGF14、FGF15(FGF19、FGF15/FGF19)、FGF16、FGF17、FGF18、FGF20、FGF21、FGF22或FGF23或它们的任何组合。在一些实施方案中，生长补充剂是无血清生长补充剂，如本领域已知的任何一种补充剂，任选地CultureOne补充剂。在一些实施方案中，神经元祖细胞抑制剂包括CultureOne补充剂或阿糖胞苷。在一些实施方案中，使前部前肠细胞与EGF、Noggin或FGF4或它们的任何组合(包含所有3者)接触，以使前部前肠细胞分化为背侧前部前肠细胞。在一些实施方案中，使前部前肠细胞与EGF、Noggin、FGF4或神经元祖细胞抑制剂或它们的任何组合(包含所有4者)接触，以使前部前肠细胞分化为背侧前部前肠细胞。
在一些实施方案中，使前部前肠细胞与EGF通路活化剂接触。在一些实施方案中，EGF通路活化剂是或包括EGF。在一些实施方案中，使前部前肠细胞与EGF通路活化剂(例如EGF)以一定浓度接触，该浓度为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约10ng/mL、20ng/mL、30ng/mL、40ng/mL、50ng/mL、60ng/mL、70ng/mL、80ng/mL、90ng/mL、100ng/mL、110ng/mL、120ng/mL、130ng/mL、140ng/mL、150ng/mL、160ng/mL、170ng/mL、180ng/mL、190ng/mL或200ng/mL，或是由前述浓度中的任何两个所限定的范围(例如，10ng/mL至200ng/mL、10ng/mL至150ng/mL或50ng/mL至200ng/mL)内的任何浓度。在一些实施方案中，使前部前肠细胞与浓度为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约100ng/mL的EGF通路活化剂(例如EGF)接触。
在一些实施方案中，使前部前肠细胞与BMP通路抑制剂接触。在一些实施方案中，BMP通路抑制剂是或包括Noggin。在一些实施方案中，使前部前肠细胞与BMP通路抑制剂(例如Noggin)以一定浓度接触，该浓度为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约100ng/mL、110ng/mL、120ng/mL、130ng/mL、140ng/mL、150ng/mL、160ng/mL、170ng/mL、180ng/mL、190ng/mL、200ng/mL、210ng/mL、220ng/mL、230ng/mL、240ng/mL、250ng/mL、260ng/mL、270ng/mL、280ng/mL、290ng/mL或300ng/mL，或是由前述浓度中的任何两个所限定的范围(例如，100ng/mL至300ng/mL、100ng/mL至250ng/mL或150ng/mL至300ng/mL)内的任何浓度。在一些实施方案中，使前部前肠细胞与浓度为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约200ng/mL的BMP通路抑制剂(例如Noggin)接触。
在一些实施方案中，使前部前肠细胞与FGF通路活化剂接触。在一些实施方案中，FGF通路活化剂是或包括FGF10。在一些实施方案中，使前部前肠细胞与FGF通路活化剂(例如FGF10)以一定浓度接触，该浓度为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL、20ng/mL、25ng/mL、30ng/mL、35ng/mL、40ng/mL、45ng/mL、50ng/mL、55ng/mL、60ng/mL、65ng/mL、70ng/mL、75ng/mL、80ng/mL、85ng/mL、90ng/mL、95ng/mL或100ng/mL，或是由前述浓度中的任何两个所限定的范围(例如，5ng/mL至100ng/mL、5ng/mL至75ng/mL或25ng/mL至100ng/mL)内的任何浓度。在一些实施方案中，使前部前肠细胞与浓度为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约50ng/mL的FGF通路活化剂(例如FGF10)接触。
在一些实施方案中，使前部前肠细胞与生长补充剂接触。在一些实施方案中，生长补充剂是无血清生长补充剂，如本领域通常已知的那些。在一些实施方案中，生长补充剂是或包括CultureOne补充剂(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德的GIBCO公司)。在一些实施方案中，使前部前肠细胞与生长补充剂(例如CultureOne)以一定浓度接触，据制造商建议的浓度，该浓度为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约0.25×、0.5×、0.75×、1×、1.25×、1.5×、1.75×或2×。在一些实施方案中，使前部前肠细胞与浓度为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约1×的生长补充剂(例如CultureOne)接触。在一些实施方案中，CultureOne补充剂或其他生长补充剂用于在培养前部前肠细胞期间抑制神经元祖细胞的生长。
在一些实施方案中，使前部前肠细胞与神经元祖细胞抑制剂接触。在一些实施方案中，神经元祖细胞抑制剂是或包括CultureOne补充剂或阿糖胞苷。在一些实施方案中，使前部前肠细胞与神经元祖细胞抑制剂(例如CultureOne或阿糖胞苷)以一定浓度接触，据制造商建议的浓度，该浓度为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约0.25×、0.5×、0.75×、1×、1.25×、1.5×、1.75×或2×。在一些实施方案中，使前部前肠细胞与浓度为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约1×的神经元祖细胞抑制剂(例如CultureOne或阿糖胞苷)接触。在一些实施方案中，CultureOne补充剂、阿糖胞苷或其他神经元祖细胞抑制剂用于在培养多能干细胞、定形内胚层和/或前部前肠细胞期间抑制神经元祖细胞的生长。
在一些实施方案中，使前部前肠细胞与EGF通路活化剂、BMP通路抑制剂、FGF通路活化剂或生长补充剂中的一者或多者(例如至少1者、2者、3者、4者)接触数天，该天数为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时或24小时，或1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或8天，或是由前述值中的任何两个所限定的范围，例如12小时至8天、1天至8天或2天至6天。在一些实施方案中，使前部前肠细胞与EGF通路活化剂、BMP通路抑制剂、FGF通路活化剂或神经元祖细胞抑制剂中的一者或多者(例如至少1者、2者、3者、4者)接触数天，该天数为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时或24小时，或1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或8天，或是由前述值中的任何两个所限定的范围，例如12小时至8天、1天至8天或2天至6天。
食管祖细胞的形成
本文所公开的或本领域以其他方式已知的用于产生背侧前部前肠细胞的方法适用于本文所公开的方法。
在一些实施方案中，背侧前部前肠细胞被扩增并分化为食管祖细胞。在一些实施方案中，背侧前部前肠细胞被解离成单细胞悬液。在一些实施方案中，使用解离酶对背侧前部前肠细胞进行解离。在一些实施方案中，解离酶是或包括胰蛋白酶、糜蛋白酶、胶原酶、弹性蛋白酶或Accutase或它们的任何组合中的一者或多者(例如至少1者、2者、3者、4者、5者)。在一些实施方案中，将背侧前部前肠细胞的单细胞悬浮液平板接种到组织培养容器(例如组织培养板)或其一部分上，该部分包被有细胞外基质或其组分或模拟物(特别是细胞接触的表面)。在一些实施方案中，细胞外基质或其组分或模拟物与背侧前部前肠细胞是同种异体的。在一些实施方案中，背侧前部前肠细胞是人的，并且细胞外基质或其组分或模拟物是人来源的。在一些实施方案中，细胞外基质或其组分或模拟物是IV型胶原。在一些实施方案中，IV型胶原是人IV型胶原。在一些实施方案中，IV型胶原衍生自人胎盘。在一些实施方案中，细胞外基质或其组分或模拟物不包括大鼠I型胶原基质或基质胶或两者。
在一些实施方案中，在组织培养容器中的生长培养基中培养背侧前部前肠细胞。在一些实施方案中，生长培养基包括EGF通路活化剂、牛垂体提取物(BPE)或ROCK抑制剂或它们的任何组合，包含所有三者。在一些实施方案中，使背侧前部前肠细胞与EGF通路活化剂、BPE或ROCK抑制剂或它们的任何组合(包含所有三者)接触。在一些实施方案中，生长培养基是无血清培养基。在一些实施方案中，生长培养基是角质形成细胞SFM(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德的GIBCO公司)。在一些实施方案中，生长培养基包括EGF、BPE或ROCK抑制剂或它们的任何组合。在一些实施方案中，EGF通路活化剂包括EGF、TGF-α、AR、BTC、HB-EGF、EPR、tomoregulin、NRG-1、NRG-2、NRG-3或NRG-4，或它们的任何组合。在一些实施方案中，ROCK抑制剂包括Y-27632、Y-30141、Y-39983、Ki-23095、SLx-2119、噻唑维林、氮杂吲哚1、法舒地尔、利帕舒地尔、奈塔舒地尔、RKI-1447或GSK429286A或它们的任何组合。在一些实施方案中，生长培养基包括EGF、BPE或Y-27632或它们的任何组合，包含所有三种。在一些实施方案中，使背侧前部前肠细胞与EGF、BPE或Y-27632或它们的任何组合(包含所有三者)接触。
在一些实施方案中，使背侧前部前肠细胞与EGF通路活化剂接触。在一些实施方案中，EGF通路活化剂是或包括EGF。在一些实施方案中，使背侧前部前肠细胞与EGF通路活化剂(例如EGF)以一定浓度接触，该浓度为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约1ng/mL、2ng/mL、3ng/mL、4ng/mL、5ng/mL、6ng/mL、7ng/mL、8ng/mL、9ng/mL、10ng/mL、11ng/mL、12ng/mL、13ng/mL、14ng/mL、15ng/mL、16ng/mL、17ng/mL、18ng/mL、19ng/mL或20ng/mL，或是由前述浓度中的任何两个所限定的范围(例如，1ng/mL至10ng/mL、10ng/mL至20ng/mL、5ng/mL至15ng/mL或8ng/mL至12ng/mL)内的任何浓度。在一些实施方案中，使背侧前部前肠细胞与浓度为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约10ng/mL的EGF通路活化剂(例如EGF)接触。
在一些实施方案中，使背侧前部前肠细胞与BPE接触。在一些实施方案中，使背侧前部前肠细胞与BPE以一定浓度接触，该浓度为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL、60μg/mL、70μg/mL、80μg/mL、90μg/mL或100μg/mL，或是由前述浓度中的任何两个所限定的范围(例如，5μg/mL至50μg/mL、20μg/mL至100μg/mL、20μg/mL至60μg/mL或10μg/mL至50μg/mL)内的任何浓度。在一些实施方案中，使背侧前部前肠细胞与浓度为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约30μg/mL的BPE接触。
在一些实施方案中，使背侧前部前肠细胞与ROCK抑制剂接触。在一些实施方案中，ROCK抑制剂是或包括Y-27632。在一些实施方案中，使背侧前部前肠细胞与ROCK抑制剂(例如Y-27632)以一定浓度接触，该浓度为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、11μM、12μM、13μM、14μM、15μM、16μM、17μM、18μM、19μM或20μM，或是由前述浓度中的任何两个所限定的范围(例如，1μM至20μM、1μM至15μM或5μM至20μM)内的任何浓度。在一些实施方案中，使背侧前部前肠细胞与浓度为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约10μM的ROCK抑制剂(例如Y-27632)接触。
在一些实施方案中，将背侧前部前肠细胞在经包被的组织培养容器上培养数天，该天数为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或8天，或是由前述值中的任何两个所限定的范围，例如1天至8天、2天至6天、4天至8天或1天至4天，以分化为食管祖细胞。
在一些实施方案中，背侧前部前肠细胞被扩增并分化为食管祖细胞。在一些实施方案中，背侧前部前肠细胞被解离成单细胞悬液。在一些实施方案中，将背侧前部前肠细胞的单细胞悬浮液平板接种到组织培养容器(例如组织培养板)或其一部分上，该部分包被有细胞外基质或其组分或模拟物(特别是细胞接触的表面)。在一些实施方案中，在组织培养容器中的生长培养基中培养背侧前部前肠细胞。在一些实施方案中，生长培养基包括EGF通路活化剂、牛垂体提取物(BPE)或ROCK抑制剂或它们的任何组合，包含一者、两者或所有三者。在一些实施方案中，使背侧前部前肠细胞与EGF通路活化剂、BPE或ROCK抑制剂或它们的任何组合(包含一者、两者或所有三者)接触。在一些实施方案中，生长培养基是无血清培养基。在一些实施方案中，使背侧前部前肠细胞与EGF、BPE或Y-27632或它们的任何组合(包含一者、两者或所有三者)接触。在一些实施方案中，使背侧前部前肠细胞与EGF通路活化剂接触。在一些实施方案中，EGF通路活化剂是或包括EGF。在一些实施方案中，使背侧前部前肠细胞与浓度为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约10ng/mL的EGF通路活化剂(例如EGF)接触。在一些实施方案中，使背侧前部前肠细胞与BPE接触。在一些实施方案中，使背侧前部前肠细胞与浓度为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约30μg/mL的BPE接触。在一些实施方案中，使背侧前部前肠细胞与ROCK抑制剂接触。在一些实施方案中，ROCK抑制剂是或包括Y-27632。在一些实施方案中，使背侧前部前肠细胞与浓度为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约10μM的ROCK抑制剂(例如Y-27632)接触。在一些实施方案中，将背侧前部前肠细胞在经包被的组织培养容器上培养数天，该天数为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或8天，或是由前述值中的任何两个所限定的范围，例如1天至8天、2天至6天、4天至8天或1天至4天，以分化为食管祖细胞。
在一些实施方案中，所得食管祖细胞表达SOX2、P63或HNF1β或它们的任何组合。在一些实施方案中，与背侧前部前肠细胞相比，所得食管祖细胞以更高水平表达SOX2。
食管筏式细胞的形成
在一些实施方案中，从背侧前部前肠细胞分化并在经包被的组织培养容器上扩增的食管祖细胞被解离成单细胞悬液。在一些实施方案中，使用解离酶对扩增后的食管祖细胞进行解离。在一些实施方案中，解离酶是或包括胰蛋白酶、糜蛋白酶、胶原酶、弹性蛋白酶或Accutase或它们的任何组合中的一者或多者(例如至少1者、2者、3者、4者、5者)。在一些实施方案中，将扩增后的食管祖细胞的单细胞悬浮液平板接种到插入构件(例如transwell或细胞插入物)或其一部分上，该部分包被有细胞外基质或其组分或模拟物(特别是细胞接触的部分，或插入构件的能够渗透的表面)。在一些实施方案中，插入构件包括能够渗透生长培养基但无法渗透细胞的表面。在一些实施方案中，插入构件的能够渗透的表面包括为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约0.1μm、0.5μm、1μm、2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm或10μm的孔径，或由前述尺寸中的任何两个所限定的范围(例如，0.1μm至10μm、0.1μm至5μm、1μm至5μm、2μm至8μm)内的任何孔径。在一些实施方案中，插入构件的能够渗透的表面包括3μm或约3μm的孔径。在一些实施方案中，细胞外基质或其组分或模拟物与食管祖细胞是同种异体的。在一些实施方案中，食管祖细胞是人的，并且细胞外基质或其组分或模拟物是人来源的。在一些实施方案中，细胞外基质或其组分或模拟物是IV型胶原。在一些实施方案中，IV型胶原是人IV型胶原。在一些实施方案中，IV型胶原衍生自人胎盘。在一些实施方案中，细胞外基质或其组分或模拟物不包括大鼠I型胶原基质或基质胶或两者。在一些实施方案中，在生长培养基中培养扩增后的食管祖细胞。在一些实施方案中，生长培养基是高级DMEM/F12。在一些实施方案中，插入构件定位在组织培养容器内。
在一些实施方案中，包含在插入构件内的生长培养基包括EGF通路活化剂、ROCK抑制剂和SMAD通路抑制剂中的一者或多者(例如1者、2者、3者)。在一些实施方案中，EGF通路活化剂包括EGF、TGF-α、AR、BTC、HB-EGF、EPR、tomoregulin、NRG-1、NRG-2、NRG-3或NRG-4，或它们的任何组合。在一些实施方案中，ROCK抑制剂包括Y-27632、Y-30141、Y-39983、Ki-23095、SLx-2119、噻唑维林、氮杂吲哚1、法舒地尔、利帕舒地尔、奈塔舒地尔、RKI-1447或GSK429286A或它们的任何组合。在一些实施方案中，SMAD通路抑制剂包括A-83-01、DMH1、RepSox、LY365947、LY2109761、LY364947、SB431542、SB525334、SB505125、高伦替布、GW788388、LDN-193189、LDN-212854、橙皮素或它们的任何组合。在一些实施方案中，包含在插入构件内的生长培养基包括EGF、Y-27632、A-83-01或DMH1或它们的任何组合，包含所有四者。
在一些实施方案中，使食管祖细胞与EGF通路活化剂接触。在一些实施方案中，EGF通路活化剂是或包括EGF。在一些实施方案中，使食管祖细胞与EGF通路活化剂(例如EGF)以一定浓度接触，该浓度为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约10ng/mL、20ng/mL、30ng/mL、40ng/mL、50ng/mL、60ng/mL、70ng/mL、80ng/mL、90ng/mL、100ng/mL、110ng/mL、120ng/mL、130ng/mL、140ng/mL、150ng/mL、160ng/mL、170ng/mL、180ng/mL、190ng/mL或200ng/mL，或是由前述浓度中的任何两个所限定的范围(例如，10ng/mL至200ng/mL、10ng/mL至100ng/mL、100ng/mL至200ng/mL、50ng/mL至150ng/mL或80ng/mL至120ng/mL)内的任何浓度。在一些实施方案中，使食管祖细胞与浓度为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约100ng/mL的EGF通路活化剂(例如EGF)接触。
在一些实施方案中，使食管祖细胞与ROCK抑制剂接触。在一些实施方案中，ROCK抑制剂是或包括Y-27632。在一些实施方案中，使食管祖细胞与ROCK抑制剂(例如Y-27632)以一定浓度接触，该浓度为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、11μM、12μM、13μM、14μM、15μM、16μM、17μM、18μM、19μM或20μM，或是由前述浓度中的任何两个所限定的范围(例如，1μM至20μM、1μM至10μM、10μM至20μM、5μM至15μM或8μM至12μM)内的任何浓度。在一些实施方案中，使食管祖细胞与浓度为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约10μM的ROCK抑制剂(例如Y-27632)接触。
在一些实施方案中，使食管祖细胞与SMAD通路抑制剂接触。在一些实施方案中，SMAD通路抑制剂是或包括DMH1和A-83-01。在一些实施方案中，使食管祖细胞与SMAD通路抑制剂(例如DMH1和A-83-01)以一定浓度接触，该浓度为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约0.1μM、0.5μM、1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM或10μM，或是由前述浓度中的任何两个所限定的范围(例如，0.1μM至10μM、0.5μM至2μM、0.1μM至2μM或0.5μM至5μM)内的任何浓度。在一些实施方案中，使食管祖细胞与浓度为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约1μM的SMAD通路抑制剂(例如DMH1和A-83-01)接触(例如DMH1和A-83-01各1μM)。
在一些实施方案中，使扩增后的食管祖细胞与插入构件中的EGF通路活化剂、ROCK抑制剂和SMAD通路抑制剂中的一者或多者(例如1者、2者、3者)接触。在一些实施方案中，组织培养容器包括EGF。在一些实施方案中，将扩增后的食管祖细胞在插入构件中培养数天，该天数为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或8天，或是由前述值中的任何两个所限定的范围，例如1天至8天、2天至6天、4天至8天或1天至4天。
在一些实施方案中，使扩增后的食管祖细胞分化为食管筏式培养物。在一些实施方案中，在使扩增后的食管祖细胞与插入构件中的EGF、ROCK抑制剂和SMAD抑制剂中的一者或多者接触后，移除插入构件中的生长培养基，并且组织培养容器含有一定量的生长培养基，使得食管筏式培养物仅部分地浸没在生长培养基中，使得食管筏式培养物处于气-液界面中。在一些实施方案中，食管筏式培养物在气-液界面中培养。在一些实施方案中，组织培养容器包括EGF。在一些实施方案中，将食管筏式培养物在气-液界面中培养数天，该天数为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天或30天，或是由前述值中的任何两个所限定的范围，例如，5天至30天、5天至20天、10天至25天、10天至30天或20天至30天。在一些实施方案中，在气-液界面中培养食管筏式培养物会使食管筏式培养物成熟。
在一些实施方案中，从背侧前部前肠细胞分化并在经包被的组织培养容器上扩增的食管祖细胞被解离成单细胞悬液。在一些实施方案中，将扩增后的食管祖细胞的单细胞悬浮液平板接种到插入构件(例如transwell或细胞插入物)或其一部分上，该部分包被有细胞外基质或其组分或模拟物(特别是细胞接触的部分，或插入构件的能够渗透的表面)。在一些实施方案中，插入构件包括能够渗透生长培养基但无法渗透细胞的表面。在一些实施方案中，插入构件的能够渗透的表面包括为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约0.1μm、0.5μm、1μm、2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm或10μm的孔径，或由前述尺寸中的任何两个所限定的范围(例如，0.1μm至10μm、0.1μm至5μm、1μm至5μm、2μm至8μm)内的任何孔径。在一些实施方案中，插入构件的能够渗透的表面包括3μm或约3μm的孔径。在一些实施方案中，插入构件定位在组织培养容器内。在一些实施方案中，包含在插入构件内的生长培养基包括EGF通路活化剂、ROCK抑制剂和SMAD通路抑制剂中的一者或多者(例如1者、2者、3者)。在一些实施方案中，使食管祖细胞与EGF通路活化剂接触。在一些实施方案中，EGF通路活化剂是或包括EGF。在一些实施方案中，使食管祖细胞与浓度为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约100ng/mL的EGF通路活化剂(例如EGF)接触。在一些实施方案中，使食管祖细胞与ROCK抑制剂接触。在一些实施方案中，ROCK抑制剂是或包括Y-27632。在一些实施方案中，使食管祖细胞与浓度为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约10μM的ROCK抑制剂(例如Y-27632)接触。在一些实施方案中，使食管祖细胞与SMAD通路抑制剂接触。在一些实施方案中，SMAD通路抑制剂是或包括DMH1和A-83-01。在一些实施方案中，使食管祖细胞与浓度为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约1μM的SMAD通路抑制剂(例如DMH1和A-83-01)接触(例如DMH1和A-83-01各1μM)。在一些实施方案中，使扩增后的食管祖细胞与插入构件中的EGF通路活化剂、ROCK抑制剂和SMAD通路抑制剂中的一者或多者(例如1者、2者、3者)接触。在一些实施方案中，组织培养容器包括EGF。在一些实施方案中，将扩增后的食管祖细胞在插入构件中培养数天，该天数为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或8天，或是由前述值中的任何两个所限定的范围，例如1天至8天、2天至6天、4天至8天或1天至4天。在一些实施方案中，使扩增后的食管祖细胞分化为食管筏式培养物。在一些实施方案中，在使扩增后的食管祖细胞与插入构件中的EGF、ROCK抑制剂和SMAD抑制剂中的一者或多者接触后，移除插入构件中的生长培养基，并且组织培养容器含有一定量的生长培养基，使得食管筏式培养物仅部分地浸没在生长培养基中，使得食管筏式培养物处于气-液界面中。在一些实施方案中，食管筏式培养物在气-液界面中培养。在一些实施方案中，组织培养容器包括EGF。在一些实施方案中，将食管筏式培养物在气-液界面中培养数天，该天数为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天或30天，或是由前述值中的任何两个所限定的范围，例如，5天至30天、5天至20天、10天至25天、10天至30天或20天至30天。在一些实施方案中，在气-液界面中培养食管筏式培养物会使食管筏式培养物成熟。
在一些实施方案中，将解离后的食管祖细胞与肠神经嵴细胞(ENCC)组合，并培养组合的食管祖细胞和ENCC，以形成受神经支配的食管筏式培养物。在一些实施方案中，受神经支配的食管筏式培养物包括肠神经嵴细胞(ENCC)、神经元祖细胞和/或βIII-微管蛋白+神经元细胞。在一些实施方案中，神经元祖细胞是SOX10+。在一些实施方案中，食管祖细胞和ENCC通过低速离心或其他不过度破坏细胞的聚集方法进行组合。在一些实施方案中，ENCC作为衍生自神经球的单细胞分离，该神经球可衍生自多能干细胞。用于产生ENCC的方法通常是本领域已知的，并且用于将它们与类器官组合的方法在WO 2016/061464中进行了探讨，该文献特此通过引用整体明确地并入。
用于食管筏式培养物的示例性方法
在一些实施方案中，食管筏式培养物由前部前肠细胞制备。在一些实施方案中，食管筏式培养物和前部前肠细胞最初由iPSC制备。在一些实施方案中，iPSC是hiPSC。在一些实施方案中，前部前肠细胞是根据本文公开的一种或多种方法从iPSC分化而来的。在一些实施方案中，该方法包括在使iPSC分化为定形内胚层细胞的条件下培养iPSC，在使定形内胚层细胞分化为前部前肠细胞的条件下培养定形内胚层细胞。在一些实施方案中，该方法包括将iPSC与TGF-β超家族生长因子一起培养以使iPSC分化为定形内胚层细胞，将定形内胚层细胞与Wnt蛋白或通路活化剂、FGF蛋白或活化剂、BMP通路抑制剂或视黄酸通路活化剂中的一者或多者(例如至少1者、2者、3者、4者)一起培养以使定形内胚层细胞分化为前部前肠细胞。在一些实施方案中，该方法包括将iPSC与活化素A或BMP4或两者一起培养以使iPSC分化为定形内胚层细胞，将定形内胚层细胞与Wnt3a、FGF4、Noggin或视黄酸中的一者或多者(例如至少1者、2者、3者、4者)一起培养以使定形内胚层细胞分化为前部前肠细胞。在一些实施方案中，将iPSC与一定浓度的活化素A一起培养，该浓度为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约10ng/mL、20ng/mL、30ng/mL、40ng/mL、50ng/mL、60ng/mL、70ng/mL、80ng/mL、90ng/mL、100ng/mL、110ng/mL、120ng/mL、130ng/mL、140ng/mL、150ng/mL、160ng/mL、170ng/mL、180ng/mL、190ng/mL或200ng/mL，或是由前述浓度中的任何两个所限定的范围(例如，10ng/mL至200ng/mL、10ng/mL至100ng/mL、100ng/mL至200ng/mL或50ng/mL至150ng/mL)内的任何浓度。在一些实施方案中，将iPSC与100ng/mL活化素A一起培养。在一些实施方案中，将iPSC与浓度为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约1ng/mL、2ng/mL、3ng/mL、4ng/mL、5ng/mL、6ng/mL、7ng/mL、8ng/mL、9ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、30ng/mL、40ng/mL、50ng/mL、60ng/mL、70ng/mL、80ng/mL、90ng/mL、100ng/mL、110ng/mL、120ng/mL、130ng/mL、140ng/mL、150ng/mL、160ng/mL、170ng/mL、180ng/mL、190ng/mL或200ng/mL的BMP4一起培养，或与由前述浓度中的任何两个所限定的范围(例如，1ng/mL至200ng/mL、1ng/mL至100ng/mL、25ng/mL至200ng/mL、1ng/mL至80ng/mL或25ng/mL至100ng/mL)内的任何浓度的BMP4一起培养。在一些实施方案中，将iPSC与50ng/mL BMP4一起培养。在一些实施方案中，将iPSC与活化素A或BMP4或两者一起培养1天、2天、3天、4天或5天。在一些实施方案中，将定形内胚层细胞与Wnt3a、FGF4、Noggin或视黄酸或它们的任何组合中的一者或多者(例如至少1者、2者、3者、4者)以各自足以使定形内胚层细胞分化为前部前肠细胞的浓度一起培养。在一些实施方案中，将定形内胚层细胞与Wnt3a、FGF4、Noggin或视黄酸或它们的任何组合中的一者或多者(例如至少1者、2者、3者、4者)以一定浓度一起培养，该浓度为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约0ng/mL、100ng/mL、120ng/mL、140ng/mL、160ng/mL、180ng/mL、200ng/mL、220ng/mL、240ng/mL、260ng/mL、280ng/mL、300ng/mL、320ng/mL、340ng/mL、360ng/mL、380ng/mL、400ng/mL、420ng/mL、440ng/mL、460ng/mL、480ng/mL、500ng/mL、520ng/mL、540ng/mL、560ng/mL、580ng/mL或600ng/mL，或是由前述浓度中的任何两个所限定的范围(例如，0ng/mL至600ng/mL、0ng/mL至200ng/mL、200ng/mL至500ng/mL或200ng/mL至600ng/mL)内的任何浓度。在一些实施方案中，将定形内胚层细胞与Wnt3a、FGF4、Noggin或视黄酸或它们的任何组合中的一者或多者(例如至少1者、2者、3者、4者)以一定浓度一起培养，该浓度为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约0μM、0.1μM、0.2μM、0.3μM、0.4μM、0.5μM、0.6μM、0.7μM、0.8μM、0.9μM、1.0μM、1.1μM、1.2μM、1.3μM、1.4μM、1.5μM、1.6μM、1.7μM、1.8μM、1.9μM、2.0μM、2.1μM、2.2μM、2.3μM、2.4μM、2.5μM、2.6μM、2.7μM、2.8μM、2.9μM或3.0μM，或是由前述浓度中的任何两个所限定的范围(例如，0μM至3.0μM、1.0μM至3.0μM、0μM至2.0μM或1.5μM至3.0μM)内的任何浓度。在一些实施方案中，将定形内胚层细胞与500ng/mL或约500ng/mL Wnt3a、500ng/mL或约500ng/mL FGF4、200ng/mL或约200ng/mL Noggin以及2μM或约2μM视黄酸一起培养。在一些实施方案中，将定形内胚层细胞与Wnt3a、FGF4、Noggin或视黄酸中的一者或多者(例如至少1者、2者、3者、4者)一起培养1天、2天、3天、4天或5天。
在一些实施方案中，由通过本文所公开的一种或多种方法产生的前部前肠细胞制备食管筏式培养物。在一些实施方案中，通过以下方式制备食管筏式培养物：在使前部前肠细胞分化为背侧前部前肠细胞的条件下培养前部前肠细胞，在使背侧前部前肠细胞分化为食管祖细胞的条件下培养背侧前部前肠细胞，以及在使食管祖细胞分化为食管筏式培养物的条件下培养食管祖细胞。在一些实施方案中，将前部前肠细胞作为单层培养。在一些实施方案中，前部前肠细胞不作为球状体培养。在一些实施方案中，在将食管祖细胞分化为食管筏式培养物的条件下培养食管祖细胞之前，培养食管祖细胞以扩增食管祖细胞。在一些实施方案中，使食管祖细胞分化为食管筏式培养物的条件包括在气-液界面中培养食管祖细胞。
在一些实施方案中，由通过本文所公开的一种或多种方法产生的前部前肠细胞制备食管筏式培养物。在一些实施方案中，通过以下方式制备食管筏式培养物：用EGF通路活化剂、BMP通路抑制剂、FGF通路活化剂或生长补充剂中的一者或多者(例如至少1者、2者、3者、4者)培养前部前肠细胞，或用EGF通路活化剂、BMP通路抑制剂或FGF通路活化剂、任选的神经祖细胞抑制剂或它们的任何组合中的一者或多者(例如至少1者、2者、3者、4者)培养前部前肠细胞，以使前部前肠细胞分化为背侧前部前肠细胞；将背侧前部前肠细胞解离成单个细胞并在包括ROCK抑制剂的第一组织培养容器中培养背侧前部前肠细胞，以将背侧前部前肠细胞分化为食管祖细胞；将食管祖细胞解离成单个细胞并在定位在第二组织培养容器内的插入构件(例如transwell)中和/或其表面上培养食管祖细胞，其中该插入构件包括能够渗透生长培养基但无法渗透细胞的表面，并且其中该插入构件和第二组织培养容器包括一定量的生长培养基，使得食管祖细胞完全浸没在生长培养基中；并且在气-液界面中培养食管祖细胞以将食管祖细胞分化为食管筏式培养物。在一些实施方案中，该第二组织培养容器与该第一组织培养容器相同。在一些实施方案中，使前部前肠细胞与EGF、Noggin和FGF10接触。在一些实施方案中，使前部前肠细胞与EGF、Noggin、FGF10和CultureOne补充剂或一些其他神经元祖细胞抑制剂(例如，阿糖胞苷)接触。在一些实施方案中，使前部前肠细胞与EGF通路活化剂(例如EGF)以一定浓度接触，该浓度为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约10ng/mL、20ng/mL、30ng/mL、40ng/mL、50ng/mL、60ng/mL、70ng/mL、80ng/mL、90ng/mL、100ng/mL、110ng/mL、120ng/mL、130ng/mL、140ng/mL、150ng/mL、160ng/mL、170ng/mL、180ng/mL、190ng/mL或200ng/mL，或是由前述浓度中的任何两个所限定的范围(例如，10ng/mL至200ng/mL、10ng/mL至150ng/mL或50ng/mL至200ng/mL)内的任何浓度。在一些实施方案中，使前部前肠细胞与BMP通路抑制剂(例如Noggin)以一定浓度接触，该浓度为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约100ng/mL、110ng/mL、120ng/mL、130ng/mL、140ng/mL、150ng/mL、160ng/mL、170ng/mL、180ng/mL、190ng/mL、200ng/mL、210ng/mL、220ng/mL、230ng/mL、240ng/mL、250ng/mL、260ng/mL、270ng/mL、280ng/mL、290ng/mL或300ng/mL，或是由前述浓度中的任何两个所限定的范围(例如，100ng/mL至300ng/mL、100ng/mL至250ng/mL或150ng/mL至300ng/mL)内的任何浓度。在一些实施方案中，使前部前肠细胞与FGF通路活化剂(例如FGF10)以一定浓度接触，该浓度为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL、20ng/mL、25ng/mL、30ng/mL、35ng/mL、40ng/mL、45ng/mL、50ng/mL、55ng/mL、60ng/mL、65ng/mL、70ng/mL、75ng/mL、80ng/mL、85ng/mL、90ng/mL、95ng/mL或100ng/mL，或是由前述浓度中的任何两个所限定的范围(例如，5ng/mL至100ng/mL、5ng/mL至75ng/mL或25ng/mL至100ng/mL)内的任何浓度。在一些实施方案中，使前部前肠细胞与生长补充剂(例如CultureOne)或另一种神经元祖细胞抑制剂(例如，阿糖胞苷)以一定浓度接触，据制造商建议的浓度，该浓度为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约0.25×、0.5×、0.75×、1×、1.25×、1.5×、1.75×或2×。在一些实施方案中，以1×提供生长补充剂或神经元祖细胞抑制剂。在一些实施方案中，将前部前肠细胞作为单层培养。在一些实施方案中，前部前肠细胞不作为球状体培养。在一些实施方案中，将背侧前部前肠细胞在第一组织培养容器中在细胞外基质或其组分或模拟物上进行培养。在一些实施方案中，将食管祖细胞在插入构件中和/或其表面上在细胞外基质或其组分或模拟物上进行培养。在一些实施方案中，将食管祖细胞在插入构件中与EGF通路活化剂、ROCK抑制剂或SMAD抑制剂或它们的任何组合中的一者或多者(例如至少1者、2者、3者)一起培养，并在第二组织培养容器中与EGF一起培养。在一些实施方案中，气-液界面包括从插入构件移除生长培养基，使得第二组织培养容器和/或插入构件含有一定量的生长培养基，使得食管祖细胞仅部分地浸没在生长培养基中。在一些实施方案中，使食管祖细胞与EGF、Y-27632、DMH1和A-83-01接触。在一些实施方案中，使食管祖细胞与EGF通路活化剂(例如EGF)以一定浓度接触，该浓度为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约10ng/mL、20ng/mL、30ng/mL、40ng/mL、50ng/mL、60ng/mL、70ng/mL、80ng/mL、90ng/mL、100ng/mL、110ng/mL、120ng/mL、130ng/mL、140ng/mL、150ng/mL、160ng/mL、170ng/mL、180ng/mL、190ng/mL或200ng/mL，或是由前述浓度中的任何两个所限定的范围(例如，10ng/mL至200ng/mL、10ng/mL至100ng/mL、100ng/mL至200ng/mL、50ng/mL至150ng/mL或80ng/mL至120ng/mL)内的任何浓度。在一些实施方案中，使食管祖细胞与ROCK抑制剂(例如Y-27632)以一定浓度接触，该浓度为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、11μM、12μM、13μM、14μM、15μM、16μM、17μM、18μM、19μM或20μM，或是由前述浓度中的任何两个所限定的范围(例如，1μM至20μM、1μM至10μM、10μM至20μM、5μM至15μM或8μM至12μM)内的任何浓度。在一些实施方案中，使食管祖细胞与SMAD抑制剂(例如DMH1和A-83-01)以一定浓度接触，该浓度为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约0.1μM、0.5μM、1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM或10μM，或是由前述浓度中的任何两个所限定的范围(例如，0.1μM至10μM、0.5μM至2μM、0.1μM至2μM或0.5μM至5μM)内的任何浓度(例如对于DMH1和A-83-01中的每一者)。
在一些实施方案中，由通过本文所公开的一种或多种方法产生的前部前肠细胞制备食管筏式培养物。在一些实施方案中，通过以下方式制备食管筏式培养物：用EGF、Noggin、FGF10或CultureOne补充剂中的一者或多者(例如至少1者、2者、3者、4者)培养前部前肠细胞，以使前部前肠细胞分化为背侧前部前肠细胞；将背侧前部前肠细胞解离成单个细胞并在第一组织培养容器中将背侧前部前肠细胞与Y-27632一起培养，以将背侧前部前肠细胞分化为食管祖细胞；将食管祖细胞解离成单个细胞并在定位在第二组织培养容器内的插入构件(例如transwell)中和/或其表面上培养食管祖细胞，其中该插入构件包括能够渗透生长培养基但无法渗透细胞的表面，并且其中该插入构件和第二组织培养容器包括一定量的生长培养基，使得食管祖细胞完全浸没在生长培养基中；并且在气-液界面中培养食管祖细胞以将食管祖细胞分化为食管筏式培养物。在一些实施方案中，该第二组织培养容器与该第一组织培养容器相同。在一些实施方案中，将前部前肠细胞作为单层培养。在一些实施方案中，前部前肠细胞不作为球状体培养。在一些实施方案中，将背侧前部前肠细胞在第一组织培养容器中在IV型胶原上进行培养。在一些实施方案中，将食管祖细胞在插入构件中和/或其表面上在IV型胶原上进行培养。在一些实施方案中，将食管祖细胞在插入构件中和/或其表面上与EGF、Y-27632、DMH1或A-83-01中的一者或多者(例如至少1者、2者、3者、4者)一起培养，并在第二组织培养容器中与EGF一起培养。在一些实施方案中，气-液界面包括从插入构件移除生长培养基，使得第二组织培养容器和/或插入构件含有一定量的生长培养基，使得食管祖细胞仅部分地浸没在生长培养基中。在一些实施方案中，将前部前肠细胞与EGF、Noggin或FGF10中的一者或多者(例如至少1者、2者、3者)以一定浓度一起培养，该浓度为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约10ng/mL、20ng/mL、30ng/mL、40ng/mL、50ng/mL、60ng/mL、70ng/mL、80ng/mL、90ng/mL、100ng/mL、110ng/mL、120ng/mL、130ng/mL、140ng/mL、150ng/mL、160ng/mL、170ng/mL、180ng/mL、190ng/mL、200ng/mL、210ng/mL、220ng/mL、230ng/mL、240ng/mL、250ng/mL、260ng/mL、270ng/mL、280ng/mL、290ng/mL或300ng/mL，或是由前述浓度中的任何两个所限定的范围(例如，10ng/mL至300ng/mL、10ng/mL至200ng/mL、100ng/mL至200ng/mL或50ng/mL至200ng/mL)内的任何浓度。在一些实施方案中，将前部前肠细胞与100ng/mL或约100ng/mL EGF一起培养。在一些实施方案中，将前部前肠细胞与200ng/mL或约200ng/mL Noggin一起培养。在一些实施方案中，将前部前肠细胞与50ng/mL或约50ng/mL FGF10一起培养。在一些实施方案中，将前部前肠细胞与1xCultureOne补充剂一起培养。在一些实施方案中，将前部前肠细胞培养1天、2天、3天、4天或5天。在一些实施方案中，将背侧前部前肠细胞用Accutase解离。在一些实施方案中，将背侧前部前肠细胞在第一组织培养容器中与一定浓度的Y-27632一起培养，该浓度为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、11μM、12μM、13μM、14μM、15μM、16μM、17μM、18μM、19μM或20μM，或是由前述浓度中的任何两个所限定的范围(例如，1μM至20μM、5μM至15μM或8μM至12μM)内的任何浓度。在一些实施方案中，将背侧前部前肠细胞在第一组织培养容器中与10μM或约10μM Y-27632一起培养。在一些实施方案中，将背侧前部前肠细胞在第一组织培养容器中在1.5μg IV型胶原/cm2的培养表面积上进行培养。在一些实施方案中，将食管祖细胞在插入构件中和/或其表面上进行培养，该插入构件包括能够渗透生长培养基但无法渗透细胞的表面。在一些实施方案中，插入构件的能够渗透的表面包括为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约0.1μm、0.5μm、1μm、2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm或10μm的孔径，或由前述尺寸中的任何两个所限定的范围(例如，0.1μm至10μm、0.1μm至5μm、5μm至10μm或1μm至5μm)内的任何孔径。在一些实施方案中，插入构件的能够渗透的表面包括为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约3μm的孔径。在一些实施方案中，将食管祖细胞在插入构件中和/或其表面上与EGF、Y-27632、DMH1或A-83-01中的一者或多者(例如至少1者、2者、3者、4者)以一定浓度一起培养，该浓度为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约10ng/mL、20ng/mL、30ng/mL、40ng/mL、50ng/mL、60ng/mL、70ng/mL、80ng/mL、90ng/mL、100ng/mL、110ng/mL、120ng/mL、130ng/mL、140ng/mL、150ng/mL、160ng/mL、170ng/mL、180ng/mL、190ng/mL、200ng/mL、210ng/mL、220ng/mL、230ng/mL、240ng/mL、250ng/mL、260ng/mL、270ng/mL、280ng/mL、290ng/mL或300ng/mL，或是由前述浓度中的任何两个所限定的范围(例如，10ng/mL至300ng/mL、10ng/mL至200ng/mL、100ng/mL至200ng/mL或50ng/mL至200ng/mL)内的任何浓度。在一些实施方案中，将食管祖细胞在插入构件中和/或其表面上与EGF、Y-27632、DMH1或A-83-01中的一者或多者(例如至少1者、2者、3者、4者)以一定浓度一起培养，该浓度为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约0.1μM、0.5μM、1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、11μM、12μM、13μM、14μM、15μM、16μM、17μM、18μM、19μM或20μM，或是由前述浓度中的任何两个所限定的范围(例如，0.1μM至20μM、5μM至15μM、0.1μM至4μM或8μM至12μM)内的任何浓度。在一些实施方案中，将食管祖细胞在插入构件中和/或其表面上与100ng/mL或约100ng/mL EGF一起培养。在一些实施方案中，将食管祖细胞在插入构件中和/或其表面上与10μM或约10μM Y-27632一起培养。在一些实施方案中，将食管祖细胞在插入构件中和/或其表面上与1μM或约1μM DMH1一起培养。在一些实施方案中，将食管祖细胞在插入构件中和/或其表面上与1μM或约1μM A-83-01一起培养。在一些实施方案中，将食管祖细胞在插入构件中和/或其表面上与EGF、Y-27632、DMH1或A-83-01中的一者或多者(例如至少1者、2者、3者、4者)一起培养1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或8天。在一些实施方案中，将食管祖细胞在插入构件中和/或其表面上在1.5μg IV型胶原/cm2的培养表面积上进行培养。在一些实施方案中，将食管祖细胞在气-液界面中与100ng/mL或约100ng/mL EGF一起在第二组织培养容器中培养。在一些实施方案中，将食管祖细胞在气-液界面中培养5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天或30天。
在一些实施方案中，通过本文所述的一种或多种方法产生食管筏式培养物。在一些实施方案中，食管筏式培养物是人食管筏式培养物。在一些实施方案中，食管筏式培养物衍生自人细胞。在一些实施方案中，食管筏式培养物衍生自人iPSC。在一些实施方案中，食管筏式培养物不衍生自球状体或类器官。在一些实施方案中，食管筏式培养物不在细胞外基质或其组分或模拟物上进行培养。在一些实施方案中，食管筏式培养物不在大鼠I型胶原基质或基质胶或两者上进行培养。在一些实施方案中，食管筏式培养物不与异种组分一起培养。在一些实施方案中，食管筏式培养物在人IV型胶原上进行培养。在一些实施方案中，食管筏式培养物不在饲养细胞底物上进行培养。在一些实施方案中，食管筏式培养物不在小鼠成纤维细胞上进行培养。在一些实施方案中，食管筏式培养物不在经辐照的小鼠成纤维细胞上进行培养。
食管筏式培养物的性质
在一些实施方案中，通过本文所述的一种或多种方法产生食管筏式培养物。在一些实施方案中，食管筏式培养物包括复层鳞状上皮层。在一些实施方案中，复层鳞状上皮层包括基底上层和基底层。在一些实施方案中，复层鳞状上皮层对E-钙粘蛋白(Ecad)呈阳性。在一些实施方案中，基底上层对角蛋白13(KRT13)或角蛋白8(KRT8)或两者呈阳性。在一些实施方案中，基底层对性别决定区Y-box 2(SOX2)、肿瘤蛋白p63(P63)或角蛋白5(KRT5)或它们的任何组合中的一者或多者(例如至少1者、2者、3者)呈阳性。在一些实施方案中，食管筏式培养物包括间充质层。在一些实施方案中，间充质层包括肌纤维。在一些实施方案中，间充质层对叉头盒蛋白F1(FOXF1)、同源框蛋白Nkx-6.1(NKX6-1)或波形蛋白或它们的任何组合中的一者或多者(例如至少1者、2者、3者)呈阳性。在一些实施方案中，肌纤维对结蛋白呈阳性。在一些实施方案中，食管筏式培养物缺乏固有层，或者与和筏式培养物相同物种的成年动物的食管组织相比，固有层减少或基本上减少(例如，减少50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多)。在一些实施方案中，食管筏式培养物有效地不含神经元祖细胞和/或βIII-微管蛋白+神经元细胞。在一些实施方案中，食管筏式培养物还包括肠神经嵴细胞(ENCC)。在一些实施方案中，食管筏式培养物还包括ENCC、神经元祖细胞和/或βIII-微管蛋白+神经元细胞，使得该食管筏式培养物是受神经支配的筏式培养物。在一些实施方案中，神经元祖细胞是SOX10+。
在一些实施方案中，通过本文公开的任何方法产生的食管筏式培养物具有为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约1μm、5μm、10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、200μm、300μm、400μm或500μm的厚度，或由前述长度中的任何两个所限定的范围(例如，1μm至500μm、10μm至300μm、50μm至100μm、1μm至100μm或100μm至500μm)内的任何厚度。在一些实施方案中，通过本文公开的任何方法产生的食管筏式培养物具有为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约150μm、200μm、250μm、300μm、350μm、400μm、450μm或500μm的厚度，或由前述厚度中的任何两个所限定的范围(例如，150μm至500μm、150μm至350μm或250μm至500μm)内的任何厚度。
在一些实施方案中，通过本文公开的任何方法产生的食管筏式培养物具有为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约0.1cm2、0.5cm2、1cm2、5cm2、10cm2、15cm2、20cm2、25cm2、30cm2、40cm2、50cm2、60cm2、70cm2、80cm2、90cm2或100cm2的表面积，或由前述表面积中的任何两个所限定的范围(例如，0.1cm2至100cm2、10cm2至80cm2、20cm2至40cm2、0.1cm2至30cm2或50cm2至100cm2)内的任何表面积。在一些实施方案中，通过本文公开的任何方法产生的食管筏式培养物具有为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约0.1cm2、0.5cm2、1cm2、1.5cm2或2cm2的表面积，或由前述表面积中的任何两个所限定的范围(例如，0.1cm2至2cm2、0.1cm2至1cm2或0.5cm2至2cm2)内的任何表面积。
在一些实施方案中，通过本文公开的任何方法产生的食管筏式培养物具有为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约10-5cm3、10-4cm3、10-3cm3、10-2cm3、10-1cm3、1cm3、5cm3或10cm3的体积，或由前述体积中的任何两个所限定的范围(例如，10-5cm3至10cm3、10- 2cm3至1cm3或1cm3至10cm3)内的任何体积。
在一些实施方案中，通过本文公开的任何方法产生的食管筏式培养物的复层鳞状上皮层具有为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约1μm、5μm、10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、200μm、300μm、400μm或500μm的厚度，或由前述长度中的任何两个所限定的范围(例如，1μm至500μm、20μm至200μm、50μm至100μm、1μm至100μm或100μm至500μm)内的任何厚度。在一些实施方案中，通过本文公开的任何方法产生的食管筏式培养物的复层鳞状上皮层具有为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、110μm、120μm、130μm、140μm、150μm、160μm、170μm、180μm、190μm、200μm、210μm、220μm、230μm、240μm或250μm的厚度，或由前述厚度中的任何两个所限定的范围(例如，50μm至250μm、50μm至150μm或100μm至250μm)内的任何厚度。
在一些实施方案中，通过本文公开的任何方法产生的食管筏式培养物的基底上层具有为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约1μm、5μm、10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、200μm、300μm、400μm或500μm的厚度，或由前述长度中的任何两个所限定的范围(例如，1μm至500μm、20μm至200μm、50μm至100μm、1μm至100μm或100μm至500μm)内的任何厚度。在一些实施方案中，通过本文公开的任何方法产生的食管筏式培养物的基底上层具有为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约80μm、90μm、100μm、110μm、120μm、130μm、140μm、150μm、160μm、170μm、190μm、190μm或200μm的厚度，或由前述厚度中的任何两个所限定的范围(例如，80μm至200μm、80μm至150μm或100μm至200μm)内的任何厚度。
在一些实施方案中，通过本文公开的任何方法产生的食管筏式培养物的基底层具有为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约1μm、5μm、10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、200μm、300μm、400μm或500μm的厚度，或由前述长度中的任何两个所限定的范围(例如，1μm至500μm、20μm至200μm、50μm至100μm、1μm至100μm或100μm至500μm)内的任何厚度。在一些实施方案中，通过本文公开的任何方法产生的食管筏式培养物的基底层具有为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm或100μm的厚度，或由前述厚度中的任何两个所限定的范围(例如，10μm至100μm、10μm至50μm或50μm至100μm)内的任何厚度。
在一些实施方案中，通过本文公开的任何方法产生的食管筏式培养物的间充质层具有为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约1μm、5μm、10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、200μm、300μm、400μm或500μm的厚度，或由前述长度中的任何两个所限定的范围(例如，1μm至500μm、20μm至200μm、50μm至100μm、1μm至100μm或100μm至500μm)内的任何厚度。在一些实施方案中，通过本文公开的任何方法产生的食管筏式培养物的间充质层具有为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约100μm、150μm、200μm、250μm、300μm、350μm或400μm的厚度，或由前述厚度中的任何两个所限定的范围(例如，100μm至400μm、100μm至200μm或200μm至400μm)内的任何厚度。
在一些实施方案中，通过本文所述的一种或多种方法产生食管筏式培养物。在一些实施方案中，食管筏式培养物包括神经元结构。在一些实施方案中，食管筏式培养物包括表达神经元标志物(如SOX2或βIII-微管蛋白)的细胞。
在一些实施方案中，食管筏式培养物不包括血管形成、血管和/或内皮细胞。
移植和治疗方法
在一些实施方案中，将本文所述的食管筏式培养物或食管筏式细胞组合物移植(transplant/graft)到宿主生物体中，例如，作为治疗或实验模型。在一些实施方案中，在将筏式培养物培养数天后进行移植，该天数为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、31天、32天、33天、34天、35天、36天、37天、38天、39天、40天、41天、42天、43天、44天、45天、46天、47天、48天、49天或50天，或是由前述天数中的任何两个所限定的范围(例如，1天至50天、10天至40天、20天至30天、1天至30天或20天至50天)内的任何培养天数。在一些实施方案中，在通过本领域已知的其他方法制备的食管类器官达到相同或类似的成熟状态之前数天，筏式培养物已足够成熟以用于移植和/或研究，其中该天数为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、31天、32天、33天、34天、35天、36天、37天、38天、39天或40天，或是由前述天数中的任何两个所限定的范围(例如，5天至40天、10天至40天、20天至30天或5天至30天)内的任何天数。在一些实施方案中，宿主生物体是哺乳动物。在一些实施方案中，宿主生物体是免疫缺陷型哺乳动物。在一些实施方案中，宿主生物体是免疫缺陷型小鼠。在一些实施方案中，宿主生物体是猴、猫、狗、仓鼠或大鼠。在一些实施方案中，宿主生物体是免疫受损的猴、猫、狗、仓鼠或大鼠。在一些实施方案中，宿主生物体是人。在一些实施方案中，宿主生物是具有免疫缺陷的人。在一些实施方案中，宿主生物是具有免疫活性的人。在一些实施方案中，宿主生物体是用免疫抑制剂治疗的具有免疫活性的人。在一些实施方案中，筏式培养物对于宿主生物体是自体的。在一些实施方案中，筏式培养物对于宿主生物体是同种异体的。在一些实施方案中，宿主生物体是需要食管移植(transplant/graft)的哺乳动物。在一些实施方案中，宿主生物体是需要食管移植(transplant/graft)的人。
在一些实施方案中，食管筏式培养物或食管筏式细胞组合物用作临床有益组织，其可用于研究或治疗多种不同的疾病状态，包括但不限于失弛缓症、巴雷斯特食道症(Barrett’s esophagus)、食管癌、胃食管返流病(GERD)、吞咽困难、胃灼热、嗜酸性食管炎、食管旁疝气或食管穿孔。在一些实施方案中，食管筏式培养物或食管筏式细胞组合物用于评估药理学行为、细胞信号传导、蠕动、癌症形成和迁移、或移植(transplant/grafting)、或它们的任何组合。
实施例
在以下实施例中进一步详细地公开了本文讨论的实施方案的一些方面，该实施例不旨在以任何方式限制本公开的范围。本领域技术人员将理解，许多其他实施方案也落入本公开的范围内，如本文和权利要求中所描述的。
实施例1.包括上皮和间充质的食管筏式培养物的产生
根据图1中描绘的示例性示意图产生食管筏式培养物。
将人PSC(hPSC)在符合hESC条件的基质胶包被的10cm板上培养，并分化为食管单层(第9天)。从第0天至第6天，每天更换具有所提供的补充剂的生长培养基。从第0天至第1天，在补充有50ng/mL BMP4(R&D Systems)和100ng/mL活化素A(R&D Systems)的RPMI 1640中培养hPSC。从第1天至第2天，在补充有100ng/mL活化素A和0.2％胎牛血清(FBS)的RPMI1640中培养hPSC。从第2天至第3天，在补充有100ng/mL活化素A和2％FBS的RPMI 1640中培养hPSC。在第3天结束时，将hPSC分化为定形内胚层细胞。
然后按照以下方式将定形内胚层细胞分化为前部前肠单层细胞。从第3天至第5天，在补充有500ng/mL Wnt3a(R&D Systems)、500ng/mL FGF4(R&D Systems)、200ng/mLNoggin(BMP抑制剂，R&D Systems)和2％FBS的RPMI 1640中培养定形内胚层细胞。从第5天至第6天，在补充有500ng/mL FGF4、200ng/mL Noggin、2μM视黄酸(RA，Sigma)和2％FBS的RPMI 1640中培养定形内胚层细胞。在第6天结束时，将定形内胚层细胞分化为前部前肠单层细胞。
然后使前部前肠单层细胞分化为背侧前部前肠细胞和食管祖细胞。从第6天至第9天，将前部前肠单层细胞在补充有100ng/mL EGF(R&D Systems)、200ng/mL Noggin和50ng/mL FGF10的高级DMEM/F12中培养，以模式化为背侧前部前肠细胞。
任选地，除了如本文提供的在每天添加的其他生长因子之外，还可以从第6天至第9天添加1x CultureOne补充剂(Cult1)(GIBCO)(如图1中所示)。另选地，图3A显示从第0天开始直至第9天任选地添加1x CultureOne。从第9天开始，从培养中移除CultureOne。可以添加CultureOne以减少神经元污染，并且较早添加可进一步减少筏式培养物的间充质层中的神经元污染。设想了另选的神经元祖细胞抑制剂，如阿糖胞苷(ara-C)。在其他实施方案中，培养条件中不包含CultureOne补充剂。
在第9天，使用Accutase将分化的背侧前部前肠单层解离成单细胞悬浮液，并在补充有10μM Y-27632(ROCK抑制剂)的角质形成细胞无血清培养基(SFM)(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德的GIBCO公司)中在IV型胶原(来自人胎盘)包被的板(1.5μg胶原/cm2)上以约1.8×104个细胞/cm2进行培养，直至汇合(5天至6天)，每隔一天更换生长培养基，以分化为食管祖细胞。
当食管祖细胞达到汇合时，使用0.05％胰蛋白酶-EDTA将它们解离成单细胞悬浮液，并在IV型胶原包被的(1.5μg胶原/cm2)3μm孔径聚碳酸酯膜细胞插入物(Corning)上进行培养。对于在细胞插入物上培养的前5天，每天在顶部隔室(插入物)和底部(板)隔室中用新鲜培养基培养细胞。向顶部隔室供应补充有100ng/mL EGF、10μM Y-27632、1μM DMH1和1μM A 83-01(SMAD抑制剂)的高级DMEM/F12。向底部隔室供应补充有100ng/mL EGF的高级DMEM/F12。5天后，将细胞移至气-液界面，每天仅在底部隔室中用新鲜培养基培养。通过这种方式，作为更顶端层的筏式培养物的上皮暴露于空气中。
在标准37℃、5％CO2温育条件下培养所有阶段的细胞。
实施例2.食管筏式培养物的观察
通过本文所述方法产生的食管筏式培养物能够在10cm板形式而不是24孔板形式中分化和培养。在分化为筏式培养物之前，没有球状体/类器官阶段。相反，细胞以单层培养，然后在细胞插入物中培养。培养筏式培养物不需要饲养细胞底物(如具有经辐照的小鼠成纤维细胞的大鼠I型胶原基质)。相反，板和插入物，特别是细胞接触的表面或插入物的渗透型表面，包被有人衍生的IV型胶原。也不需要基质胶和其他基底膜基质。这对于扩大到更大的培养物和cGMP生产具有重要的考虑。从食管分化开始约两周后开始气-液界面。相比之下，以前的食管筏式培养物和类器官方案包含在分化开始后约40天启动气-液界面。
重要的是，本文所述的食管筏式培养物包括上皮和间充质两者，而先前的筏式培养物和类器官缺乏间充质。当在第6天至第9天单层中存在少量间充质祖细胞群体时，间充质群体在补充的角质形成细胞SFM培养基中在IV型胶原包被的板上培养期间从第9天至第14天扩增(如实施例1所述)。使用整个单层，而不是如先前方案中那样仅收集自发出现的球状体，允许少量祖细胞群体的扩增，这些少量祖细胞群体会以其他方式丢失。图2示出了食管筏式培养物的形态。由E-钙粘蛋白标记的复层鳞状上皮细分为由角蛋白13(KRT13)和角蛋白8(KRT8)标记的基底上层和由SOX2、P63和角蛋白5(KRT5)标记的基底层。在上皮下，由间充质细胞标志物FOXF1、NKX6-1和波形蛋白标记的间充质含有分化的肌细胞(结蛋白)。
图3B描绘了当在培养的第0天至第9天或第6天至第9天之间使用CultureOne补充剂时比较食管筏式培养物的免疫荧光图像。在Ecad阴性间充质层内SOX2(箭头)或βIII-微管蛋白(箭头)的表达表明存在可能不期望的神经元细胞类型。SOX2通常在Ecad+食管上皮中表达。
实施例3.肠神经嵴细胞(ENCC)分化和共培养成食管筏式培养物
在培养和分化期间，食管筏式培养物可以通过与肠神经嵴细胞(ENCC)组合而受神经支配(图4A)。
将hPSC在符合hESC条件的基质胶包被的板上培养，并在37℃下用在mTeSR1中的胶原酶IV(500U/mL，Gibco)处理60分钟至90分钟，以分离集落。然后将细胞用DMEM/F-12(Gibco)洗涤，并转移到15mL锥形管中。一旦细胞沉淀在管的底部，就除去DMEM/F-12，并将细胞轻轻地磨碎，重悬在神经诱导培养基中。神经诱导培养基由1:1比率的DMEM/F12-GlutaMAX(Gibco)和补充有B27补充物(0.5X，Gibco)、N2补充物(0.5X，Gibco)、青霉素-链霉素(1x，Gibco)、胰岛素(5μg/mL，Sigma-Aldrich)、FGF2(20ng/mL，R&D Systems)和EGF(20ng/mL，R&D Systems)的Neurobasal培养基(Gibco)构成。将细胞在非组织培养物处理的60mm培养皿(Fisherbrand)上培养。每天更换神经诱导培养基，持续5天，在第4天和第5天向培养基中添加2μM视黄酸(RA)以进行后期处理。在第6天，收集自由漂浮的神经球，并在人纤连蛋白(HFN)包被的板(3μg/cm2，稀释在PBS中，Corning)上在神经诱导培养基(不含RA)中再培养4天，每天更换培养基。然后通过简短的2分钟至3分钟的Accutase处理收集汇合的细胞，并在不含RA的神经诱导培养基中在HFN包被的板上再培养4天。在此阶段，通过简单的Accutase处理再次收集细胞，计数，并与食管祖细胞再组合(本文公开的食管筏式培养物分化过程的第13天)，并在细胞插入物上培养。ENCC-食管祖细胞接种比率约为2:1。在与缺乏ENCC的食管培养物相同的条件下维持共培养：向顶部隔室供应补充有100ng/mL EGF、10μMY-27632、1μM DMH1和1μM A 83-01(SMAD抑制剂)的高级DMEM/F12。向底部隔室供应补充有100ng/mL EGF的高级DMEM/F12。5天后，将细胞移至气-液界面，每天仅在底部隔室中用新鲜培养基培养。
图4B示出了受神经支配的食管筏式培养物的代表性标志物。筏式培养物表达典型的食管上皮标志物(SOX2、P63、KRT5、KRT13和KRT8)以及通用上皮标志物E-钙粘蛋白(Ecad)。掺入的表达GFP的ENCC(用箭头标记)支配食管筏式培养物间充质(用波形蛋白和神经元标志物βIII-微管蛋白的表达标记)。βIII-微管蛋白表达与GFP表达共定位，这表明神经支配性神经元源自直接分化为ENCC的hPSC-GFP，而不是源自食管筏分化期间的神经污染。
在至少一些前述实施方案中，一个实施方案中使用的一个或多个要素可以在另一个实施方案中互换使用，除非这种替换在技术上不可行。本领域技术人员将认识到，在不脱离所要求保护的主题的范围的情况下，可以对本文所描述的方法和结构进行各种其他省略、添加和修改。所有这些修改和变化都旨在落入由所附权利要求定义的主题的范围内。
关于本文中基本上任何复数和/或单数术语的使用，本领域技术人员可以在适于上下文和/或应用的情况下将复数转换成单数和/或将单数转换成复数。为了清楚起见，本文可以明确地阐述各种单数/复数排列。
关于“例如(e.g.)”的使用，应理解为意指“例如(for example)”并且因此是非限制性示例。
本领域技术人员将理解，一般来说，本文使用的术语，尤其是在所附权利要求书(例如，所附权利要求书的主体)中使用的术语，通常旨在作为“开放式”术语(例如，术语“包含(including)”应被解释为“包括但不限于”，术语“具有(having)”应被解释为“至少具有”，术语“包括(include)”应被解释为“包括但不限于”等)。本领域内的人员将进一步理解，如果所引入的权利要求叙述的特定数字是有意图的，那么将在权利要求中明确地叙述此意图，并且在不存在此叙述的情况下，不存在此意图。例如，为了帮助理解，以下所附权利要求可以包括使用引入性短语“至少一个”和“一个或多个”来引入权利要求陈述。然而，此类短语的使用不应当解释为暗示由不定冠词“一个”或“一种”引入的权利要求陈述将含有此类引入的权利要求陈述的任何特定权利要求限制为仅含有一个此类陈述的实施方案，即使当相同的权利要求包含引入性短语“一个或多个”或“至少一个”以及不定冠词如“一个”或“一种”时亦是如此(例如，“一个”和/或“一种”应当被解释为意指“至少一个”或“一个或多个”)；对于用于引入权利要求陈述的定冠词的使用也是如此。另外，即使明确地陈述了特定数目的所引入的权利要求陈述，本领域的技术人员也应认识到，此类陈述应被解释为意指至少所陈述的数目(例如，没有其他修饰语的“两个陈述”的无修饰陈述意指至少两个陈述，或者两个或更多个陈述)。此外，在使用类似于“A、B、C等中的至少一个”的惯例的情况下，一般来说，这种结构旨在对本领域技术人员将理解该惯例而言(例如，“具有A、B和C中的至少一个的系统”将包括但不限于单独具有A、单独具有B、单独具有C、具有A和B一起、具有A和C一起、具有B和C一起和/或具有A、B和C一起等的系统)。在使用类似于“A、B或C中的至少一项等等”的惯例的情况中，通常，这种构造旨在本领域技术人员应当理解该惯例的意义上(例如，“一个系统具有A、B或C中的至少一项”将包括但是不限于系统单独具有单独的A、单独的B、单独的C、A与B一起、A与C一起、B与C一起、和/或A、B和C三者一起等)。本领域的技术人员将进一步理解的是，无论是在说明书、权利要求书还是附图中，呈现两个或更多个另选术语的几乎任何分隔性词语和/或短语都应当理解为考虑到了包含这些术语中的一者、这些术语中的任一者或这两个术语的可能性。例如，短语“A或B”将被理解为包含“A”或“B”或“A和B”的可能性。
另外，在按照马库什(Markush)组描述本公开的特征或方面的情况下，本领域技术人员将认识到，本公开也由此按照马库什组中的任何单独成员或成员子组进行描述。
如本领域技术人员将理解的，出于任何和所有目的，如在提供书面描述方面，本文所公开的所有范围还涵盖任何和所有可能的子范围及其子范围的组合。任何列出的范围可以容易地被认为充分描述了并且实现了相同的范围被分解为至少相等的二分之一、三分之一、四分之一、五分之一、十分之一等。作为非限制性示例，本文所讨论的每个范围可以容易地被分解为下三分之一、中三分之一和上三分之一等。如本领域技术人员还将理解的，如“至多”、“至少”、“大于”、“小于”等所有语言包含所叙述的数字并且是指可以被随后分解为如本文所讨论的子范围的范围。最后，如本领域技术人员将理解，范围包含每个单独的成员。因此，例如，具有1个至3个物品的组是指具有1个、2个或3个物品的组。类似地，具有1个至5个物品的组是指具有1个、2个、3个、4个或5个物品的组，依此类推。
尽管本文已经公开了各个方面和实施方案，但是其他方面和实施方案对于本领域技术人员将是显而易见的。本文所公开的各个方面和实施方案是出于说明的目的，而不是旨在进行限制，并且真实的范围和精神由所附权利要求书指示。
本文引用的所有参考文献，包括但不限于已公开和未公开的申请、专利和参考文献，均通过引用整体并入本文中以用于本文的任何特定公开，并且特此成为本说明书的一部分。在通过引用的方式并入的公开和专利或专利申请与本说明书中所包含的公开内容相抵触的情况下，本说明书旨在取代和/或优先于任何这类矛盾材料。

Claims (106)

1.一种体外食管筏式培养物，包括：
复层鳞状上皮层，所述复层鳞状上皮层包括基底上层和基底层；以及
间充质层，所述间充质层包括肌纤维；
其中所述复层鳞状上皮是E-钙粘蛋白+，所述基底上层是KRT13+和KRT8+，并且所述基底层是SOX2+、P63+和KRT5+；并且
其中所述间充质层是FOXF1+、NKX6-1+和波形蛋白+，并且所述肌纤维是结蛋白+。
2.根据前述权利要求中任一项所述的食管筏式培养物，其中所述食管筏式培养物缺乏固有层，或者与来自和所述筏式培养物相同物种的成年动物的食管组织相比具有减少的固有层。
3.根据前述权利要求中任一项所述的食管筏式培养物，还包括生长培养基，任选地DMEM/F12。
4.根据前述权利要求中任一项所述的食管筏式培养物，
其中所述食管筏式培养物位于插入构件中和/或其表面上，所述插入构件包括能够渗透所述生长培养基但无法渗透细胞的表面，并且所述插入构件定位在组织培养容器内；并且
任选地其中所述食管筏式培养物定位在能够渗透所述生长培养基但无法渗透细胞的表面上。
5.根据权利要求4所述的食管筏式培养物，其中所述插入构件的至少一部分，任选地能够渗透所述生长培养基但无法渗透细胞的所述表面，包被有细胞外基质或其组分。
6.根据权利要求5所述的食管筏式培养物，其中所述细胞外基质或其组分衍生自人。
7.根据权利要求5或6所述的食管筏式培养物，其中所述细胞外基质或其组分包括人IV型胶原。
8.根据权利要求5至7中任一项所述的食管筏式培养物，其中所述细胞外基质或其组分不包括大鼠I型胶原基质或基质胶。
9.根据权利要求4至8中任一项所述的食管筏式培养物，其中所述插入构件和/或组织培养容器含有一定量的生长培养基，使得所述食管筏式培养物完全浸没在所述生长培养基中。
10.根据权利要求9所述的食管筏式培养物，其中包含在所述插入构件内的所述生长培养基还包括EGF通路活化剂、ROCK抑制剂、SMAD抑制剂或它们的任何组合，并且包含在所述组织培养容器内的所述生长培养基包括EGF通路活化剂。
11.根据权利要求4至8中任一项所述的食管筏式培养物，其中所述组织培养容器和/或插入构件含有一定量的生长培养基，使得所述食管筏式培养物仅部分地浸没在所述生长培养基中，
其中所述复层鳞状上皮仅部分地浸没或不浸没在所述生长培养基中，并且形成气-液界面和/或位于所述气-液界面处。
12.根据权利要求11所述的食管筏式培养物，其中包含在所述组织培养容器内的所述生长培养基包括EGF通路活化剂。
13.根据权利要求4至12中任一项所述的食管筏式培养物，其中所述插入构件的能够渗透的表面包括为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约0.1μm、0.5μm、1μm、2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm或10μm的孔径，或由前述尺寸中的任何两个所限定的范围内的任何孔径。
14.根据权利要求4至13中任一项所述的食管筏式培养物，其中所述插入构件的能够渗透的表面包括3μm的孔径。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的食管筏式培养物，其中所述食管筏式培养物有效地不含神经元祖细胞和/或βIII-微管蛋白+神经元细胞。
16.根据权利要求1至14中任一项所述的食管筏式培养物，其中所述食管筏式培养物还包括肠神经嵴细胞(ENCC)、神经元祖细胞和/或βIII-微管蛋白+神经元细胞，使得所述食管筏式培养物是受神经支配的食管筏式培养物，任选地其中所述神经元祖细胞是SOX10+。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的食管筏式培养物，其中所述食管筏式培养物不具有血管形成、血管和/或内皮细胞。
18.一种体外细胞培养物，包括：
衍生自背侧前部前肠细胞的食管祖细胞群，所述背侧前部前肠细胞已经用EGF通路活化剂、BMP通路抑制剂、FGF通路活化剂或它们的任何组合进行处理。
19.根据权利要求18所述的细胞培养物，其中所述背侧前部前肠细胞还已经用神经元祖细胞抑制剂任选地CultureOne补充剂或阿糖胞苷进行处理。
20.根据权利要求18或19所述的细胞培养物，还包括生长培养基，任选地无血清培养基，任选地角质形成细胞SFM。
21.根据权利要求20所述的细胞培养物，其中所述生长培养基包括EGF通路活化剂或牛垂体提取物(BPE)或两者。
22.根据权利要求21所述的细胞培养物，其中：
所述EGF通路活化剂的浓度为约1ng/mL、2ng/mL、3ng/mL、4ng/mL、5ng/mL、6ng/mL、7ng/mL、8ng/mL、9ng/mL、10ng/mL、11ng/mL、12ng/mL、13ng/mL、14ng/mL、15ng/mL、16ng/mL、17ng/mL、18ng/mL、19ng/mL或20ng/mL，或由前述浓度中的任何两个所限定的范围内的任何浓度；或者
所述BPE的浓度为约5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL、60μg/mL、70μg/mL、80μg/mL、90μg/mL或100μg/mL，或由前述浓度中的任何两个所限定的范围内的任何浓度，或两者。
23.根据权利要求18至22中任一项所述的细胞培养物，其中所述细胞培养物位于组织培养容器中和/或其表面上。
24.根据权利要求23所述的细胞培养物，其中所述组织培养容器的至少一部分包被有细胞外基质或其组分，并且所述食管祖细胞群位于所述部分上或与所述部分接触。
25.根据权利要求24所述的细胞培养物，其中所述细胞外基质或其组分衍生自人。
26.根据权利要求24或25所述的细胞培养物，其中所述细胞外基质或其组分包括人IV型胶原。
27.根据权利要求24至26中任一项所述的细胞培养物，其中所述细胞外基质或其组分不包括大鼠I型胶原基质或基质胶。
28.根据权利要求18至27中任一项所述的细胞培养物，还包括ROCK抑制剂。
29.根据权利要求18至28中任一项所述的细胞培养物，还包括肠神经嵴细胞。
30.一种体外细胞培养物，包括：
用EGF通路活化剂、BMP通路抑制剂、FGF通路活化剂或它们的任何组合进行处理的前部前肠细胞群。
31.根据权利要求30所述的细胞培养物，其中所述前部前肠细胞进一步用神经元祖细胞抑制剂任选地CultureOne补充剂或阿糖胞苷进行处理。
32.根据权利要求30或31所述的细胞培养物，还包括生长培养基，任选地RPMI，任选地具有FBS，任选地0％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2.0％、2.1％、2.2％、2.3％、2.4％或2.5％的FBS，或由前述百分比中的任何两个所限定的范围内的任何百分比的FBS。
33.根据权利要求30至32中任一项所述的细胞培养物，其中所述细胞培养物位于组织培养容器中和/或其表面上。
34.根据权利要求1至17中任一项所述的食管筏式培养物，或根据权利要求18至33中任一项所述的细胞培养物，其中所述食管筏式培养物或细胞培养物已经生长了至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或8天。
35.根据权利要求34所述的食管筏式培养物或细胞培养物，其中所述食管筏式培养物或所述细胞培养物已从人诱导性多能干细胞中衍生出。
36.根据权利要求34或35所述的食管筏式培养物或细胞培养物，其中所述食管筏式培养物或所述细胞培养物不衍生自球状体或类器官。
37.一种产生食管筏式培养物的方法，包括：
(a)使前部前肠细胞与EGF通路活化剂、BMP通路抑制剂、FGF通路活化剂或它们的任何组合接触，以使所述前部前肠细胞分化为背侧前部前肠细胞；
(b)将来自步骤(a)的所述背侧前部前肠细胞解离成单个细胞；
(c)在第一组织培养容器中培养所述背侧前部前肠细胞，以使所述背侧前部前肠细胞分化为食管祖细胞；
(d)将来自步骤(c)的所述食管祖细胞解离成单个细胞；
(e)在插入构件中和/或插入构件的表面上培养所述食管祖细胞，其中所述插入构件定位在第二组织培养容器内；
其中所述插入构件包括能够渗透生长培养基但无法渗透细胞的表面；并且
其中所述插入构件和第二组织培养容器各自含有一定量的生长培养基，使得所述食管祖细胞完全浸没在所述生长培养基中；以及
(f)在所述插入构件中培养所述食管祖细胞，其中所述第二组织培养容器和/或插入构件含有一定量的生长培养基，使得所述食管祖细胞仅部分地浸没在所述生长培养基中。
38.根据权利要求37所述的方法，其中使所述前部前肠细胞进一步与神经元祖细胞抑制剂任选地CultureOne补充剂或阿糖胞苷接触。
39.根据权利要求37或38所述的方法，其中使用解离酶任选地胰蛋白酶、糜蛋白酶、胶原酶、弹性蛋白酶或Accutase对所述食管祖细胞进行解离。
40.根据权利要求37至39中任一项所述的方法，其中所述第一组织培养容器和/或所述第二组织培养容器的至少一部分包被有细胞外基质或其组分。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述细胞外基质或其组分衍生自人。
42.根据权利要求40或41所述的方法，其中所述细胞外基质或其组分包括人IV型胶原。
43.根据权利要求40至42中任一项所述的方法，其中所述细胞外基质或其组分不包括大鼠I型胶原基质或基质胶。
44.根据权利要求37至43中任一项所述的方法，其中(a)的接触步骤进行至少1天、2天、3天、4天或5天。
45.根据权利要求37至44中任一项所述的方法，其中(c)的培养步骤进行至少1天、2天、3天、4天或5天。
46.根据权利要求37至45中任一项所述的方法，其中(e)的培养步骤进行至少2天、3天、4天、5天、6天、7天或8天。
47.根据权利要求37至46中任一项所述的方法，其中(f)的培养步骤进行至少10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天或20天。
48.根据权利要求37至47中任一项所述的方法，其中将步骤(c)的所述背侧前部前肠细胞与EGF通路活化剂、BPE、ROCK抑制剂或它们的任何组合一起培养。
49.根据权利要求37至48中任一项所述的方法，其中将步骤(e)的所述食管祖细胞与EGF通路活化剂、ROCK抑制剂、SMAD抑制剂或它们的任何组合一起在所述插入构件的所述生长培养基中培养，并与EGF一起在所述第二组织培养容器的所述生长培养基中培养。
50.根据权利要求37至49中任一项所述的方法，其中将步骤(f)的所述食管祖细胞与EGF通路活化剂一起在所述第二组织培养容器的所述生长培养基中培养。
51.根据权利要求37至50中任一项所述的方法，其中所述前部前肠细胞已从人诱导性多能干细胞中衍生出。
52.根据权利要求37至51中任一项所述的方法，其中所述前部前肠细胞已从定形内胚层细胞中衍生出，其中所述定形内胚层细胞已从人诱导性多能干细胞中衍生出。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述定形内胚层细胞已经用Wnt3a、FGF4、Noggin或RA或它们的任何组合进行处理，以使所述定形内胚层细胞分化为前部前肠细胞。
54.根据权利要求53所述的方法，其中已将所述定形内胚层细胞进一步用神经元祖细胞抑制剂，任选地CultureOne补充剂或阿糖胞苷进行处理。
55.根据权利要求52至54中任一项所述的方法，其中已将所述定形内胚层细胞处理1天、2天、3天、4天或5天。
56.根据权利要求51至55中任一项所述的方法，其中已将所述人诱导性多能干细胞用BMP4和/或活化素A处理，以使所述人诱导性多能干细胞分化为定形内胚层细胞。
57.根据权利要求56所述的方法，其中已将所述人诱导性多能干细胞进一步用神经元祖细胞抑制剂，任选地CultureOne补充剂或阿糖胞苷进行处理。
58.根据权利要求51至57中任一项所述的方法，其中已将所述人诱导性多能干细胞处理1天、2天、3天、4天或5天。
59.根据权利要求37至58中任一项所述的方法，还包括：
使人诱导性多能干细胞与BMP4和/或活化素A接触，以使所述人诱导性多能干细胞分化为定形内胚层细胞；以及
使所述定形内胚层细胞与Wnt、FGF4、Noggin或RA或它们的任何组合接触，以使所述定形内胚层细胞分化为步骤(a)的所述前部前肠细胞。
60.根据权利要求59所述的方法，其中使所述人诱导性多能干细胞和/或所述定形内胚层细胞进一步与神经元祖细胞抑制剂，任选地CultureOne补充剂或阿糖胞苷接触。
61.根据权利要求59或60所述的方法，其中使所述人诱导性多能干细胞接触1天、2天、3天、4天或5天。
62.根据权利要求59至61中任一项所述的方法，其中使所述定形内胚层细胞接触1天、2天、3天、4天或5天。
63.根据权利要求37至62中任一项所述的方法，其中所述食管筏式培养物有效地不含神经元祖细胞和/或βIII-微管蛋白+神经元细胞。
64.根据权利要求37至63中任一项所述的方法，还包括将步骤(d)的解离后的食管祖细胞与肠神经嵴细胞(ENCC)组合，并根据步骤(e)和(f)培养组合后的食管祖细胞和ENCC，以产生受神经支配的食管筏式培养物。
65.根据权利要求64所述的方法，其中所述受神经支配的食管筏式培养物包括肠神经嵴细胞(ENCC)、神经元祖细胞和/或βIII-微管蛋白+神经元细胞，任选地其中所述神经元祖细胞是SOX10+。
66.根据权利要求37至65中任一项所述的方法，其中所述食管筏式培养物不包括血管形成、血管和/或内皮细胞。
67.一种体外细胞组合物，包含：
背侧前部前肠细胞群，所述背侧前部前肠细胞群衍生自用EGF通路活化剂、BMP通路抑制剂、FGF通路活化剂或它们的任何组合进行处理的前部前肠细胞。
68.一种体外细胞组合物，包含：
用EGF通路活化剂、BMP通路抑制剂、FGF通路活化剂或它们的任何组合进行处理的前部前肠细胞群。
69.根据权利要求68所述的细胞组合物，其中所述前部前肠细胞群进一步用神经元祖细胞抑制剂，任选地CultureOne补充剂或阿糖胞苷进行处理。
70.一种体外食管筏式细胞组合物，包含：
复层鳞状上皮层，所述复层鳞状上皮层包括基底上层和基底层；以及
间充质层，所述间充质层包括肌纤维；
其中所述复层鳞状上皮是E-钙粘蛋白+，所述基底上层是KRT13+和KRT8+，并且所述基底层是SOX2+、P63+和KRT5+；并且
其中所述间充质层是FOXF1+、NKX6-1+和波形蛋白+，并且所述肌纤维是结蛋白+。
71.根据权利要求70所述的食管筏式细胞组合物，其中所述食管筏式细胞组合物有效地不含神经元祖细胞和/或βIII-微管蛋白+神经元细胞。
72.根据权利要求70所述的食管筏式细胞组合物，其中所述食管筏式细胞组合物还包含肠神经嵴细胞(ENCC)、神经元祖细胞和/或βIII-微管蛋白+神经元细胞，使得所述食管筏式培养物是受神经支配的食管筏式培养物，任选地其中所述神经元祖细胞是SOX10+。
73.根据权利要求70至72中任一项所述的食管筏式细胞组合物，其中所述食管筏式细胞组合物不包含血管形成、血管和/或内皮细胞。
74.根据前述权利要求中任一项所述的食管筏式细胞组合物，其中所述食管筏式细胞组合物具有约1μm、5μm、10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、200μm、300μm、400μm或500μm的厚度，或由前述厚度中的任何两个所限定的范围内的任何厚度。
75.根据前述权利要求中任一项所述的食管筏式细胞组合物，其中所述食管筏式细胞组合物具有约150μm、200μm、250μm、300μm、350μm、400μm、450μm或500μm的厚度，或由前述厚度中的任何两个所限定的范围内的任何厚度。
76.根据前述权利要求中任一项所述的食管筏式细胞组合物，其中所述食管筏式组合物具有约0.1cm2、0.5cm2、1cm2、5cm2、10cm2、15cm2、20cm2、25cm2、30cm2、40cm2、50cm2、60cm2、70cm2、80cm2、90cm2或100cm2的表面积，或由前述表面积中的任何两个所限定的范围内的任何表面积。
77.根据前述权利要求中任一项所述的食管筏式细胞组合物，其中所述食管筏式组合物具有约0.1cm2、0.5cm2、1cm2、1.5cm2或2cm2的表面积，或由前述表面积中的任何两个所限定的范围内的任何表面积。
78.根据前述权利要求中任一项所述的食管筏式细胞组合物，其中所述食管筏式组合物具有约10-5cm3、10-4cm3、10-3cm3、10-2cm3、10-1cm3、1cm3、5cm3或10cm3的体积，或由前述体积中的任何两个所限定的范围内的任何体积。
79.根据前述权利要求中任一项所述的食管筏式细胞组合物，其中所述复层鳞状上皮层具有约1μm、5μm、10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、200μm、300μm、400μm或500μm的厚度，或由前述厚度中的任何两个所限定的范围内的任何厚度。
80.根据前述权利要求中任一项所述的食管筏式细胞组合物，其中所述复层鳞状上皮层具有约50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、110μm、120μm、130μm、140μm、150μm、160μm、170μm、180μm、190μm、200μm、210μm、220μm、230μm、240μm或250μm的厚度，或由前述厚度中的任何两个所限定的范围内的任何厚度。
81.根据前述权利要求中任一项所述的食管筏式细胞组合物，其中所述基底上层具有约1μm、5μm、10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、200μm、300μm、400μm或500μm的厚度，或由前述厚度中的任何两个所限定的范围内的任何厚度。
82.根据前述权利要求中任一项所述的食管筏式细胞组合物，其中所述基底上层具有约80μm、90μm、100μm、110μm、120μm、130μm、140μm、150μm、160μm、170μm、180μm、190μm或200μm的厚度，或由前述厚度中的任何两个所限定的范围内的任何厚度。
83.根据前述权利要求中任一项所述的食管筏式细胞组合物，其中所述基底层具有约1μm、5μm、10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、200μm、300μm、400μm或500μm的厚度，或由前述厚度中的任何两个所限定的范围内的任何厚度。
84.根据前述权利要求中任一项所述的食管筏式细胞组合物，其中所述基底层具有约10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm或100μm的厚度，或由前述厚度中的任何两个所限定的范围内的任何厚度。
85.根据前述权利要求中任一项所述的食管筏式细胞组合物，其中所述间充质层具有约1μm、5μm、10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、200μm、300μm、400μm或500μm的厚度，或由前述厚度中的任何两个所限定的范围内的任何厚度。
86.根据前述权利要求中任一项所述的食管筏式细胞组合物，其中所述间充质层具有约100μm、150μm、200μm、250μm、300μm、350μm或400μm的厚度，或由前述厚度中的任何两个所限定的范围内的任何厚度。
87.根据前述权利要求中任一项所述的食管筏式培养物、细胞培养物、方法或食管筏式细胞组合物，其中所述EGF通路活化剂包括EGF、TGF-α、AR、BTC、HB-EGF、EPR、tomoregulin、NRG-1、NRG-2、NRG-3或NRG-4，或它们的任何组合。
88.根据前述权利要求中任一项所述的食管筏式培养物、细胞培养物、方法或食管筏式细胞组合物，其中所述EGF通路活化剂是EGF。
89.根据前述权利要求中任一项所述的食管筏式培养物、细胞培养物、方法或食管筏式细胞组合物，其中所述EGF通路活化剂以约10ng/mL、20ng/mL、30ng/mL、40ng/mL、50ng/mL、60ng/mL、70ng/mL、80ng/mL、90ng/mL、100ng/mL、110ng/mL、120ng/mL、130ng/mL、140ng/mL、150ng/mL、160ng/mL、170ng/mL、180ng/mL、190ng/mL或200ng/mL的浓度或由前述浓度中的任何两个所限定的范围内的任何浓度提供。
90.根据前述权利要求中任一项所述的食管筏式培养物、细胞培养物、方法或食管筏式细胞组合物，其中所述EGF通路活化剂以100ng/mL或约100ng/mL的浓度提供。
91.根据前述权利要求中任一项所述的食管筏式培养物、细胞培养物、方法或食管筏式细胞组合物，其中所述BMP通路抑制剂包括Noggin、RepSox、LY364947、LDN193189、SB431542或它们的任何组合。
92.根据前述权利要求中任一项所述的食管筏式培养物、细胞培养物、方法或食管筏式细胞组合物，其中所述BMP通路抑制剂是Noggin。
93.根据前述权利要求中任一项所述的食管筏式培养物、细胞培养物、方法或食管筏式细胞组合物，其中所述BMP通路抑制剂以约100ng/mL、110ng/mL、120ng/mL、130ng/mL、140ng/mL、150ng/mL、160ng/mL、170ng/mL、180ng/mL、190ng/mL、200ng/mL、210ng/mL、220ng/mL、230ng/mL、240ng/mL、250ng/mL、260ng/mL、270ng/mL、280ng/mL、290ng/mL或300ng/mL的浓度或由前述浓度中的任何两个所限定的范围内的任何浓度提供。
94.根据前述权利要求中任一项所述的食管筏式培养物、细胞培养物、方法或食管筏式细胞组合物，其中所述BMP通路抑制剂以200ng/mL或约200ng/mL的浓度提供。
95.根据前述权利要求中任一项所述的食管筏式培养物、细胞培养物、方法或食管筏式细胞组合物，其中所述FGF通路活化剂包括FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF8、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF13、FGF14、FGF15、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF20、FGF21、FGF22或FGF23或它们的任何组合。
96.根据前述权利要求中任一项所述的食管筏式培养物、细胞培养物、方法或食管筏式细胞组合物，其中所述FGF通路活化剂是FGF10。
97.根据前述权利要求中任一项所述的食管筏式培养物、细胞培养物、方法或食管筏式细胞组合物，其中所述FGF通路活化剂以约5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL、20ng/mL、25ng/mL、30ng/mL、35ng/mL、40ng/mL、45ng/mL、50ng/mL、55ng/mL、60ng/mL、65ng/mL、70ng/mL、75ng/mL、80ng/mL、85ng/mL、90ng/mL、95ng/mL或100ng/mL的浓度或由前述浓度中的任何两个所限定的范围内的任何浓度提供。
98.根据前述权利要求中任一项所述的食管筏式培养物、细胞培养物、方法或食管筏式细胞组合物，其中所述FGF通路活化剂以50ng/mL或约50ng/mL的浓度提供。
99.根据前述权利要求中任一项所述的食管筏式培养物、细胞培养物、方法或食管筏式细胞组合物，其中所述ROCK抑制剂包括Y-27632、Y-30141、Y-39983、Ki-23095、SLx-2119、噻唑维林、氮杂吲哚1、法舒地尔、利帕舒地尔、奈塔舒地尔、RKI-1447或GSK429286A或它们的任何组合。
100.根据前述权利要求中任一项所述的食管筏式培养物、细胞培养物、方法或食管筏式细胞组合物，其中所述ROCK抑制剂是Y-27632。
101.根据前述权利要求中任一项所述的食管筏式培养物、细胞培养物、方法或食管筏式细胞组合物，其中所述ROCK抑制剂以约1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、11μM、12μM、13μM、14μM、15μM、16μM、17μM、18μM、19μM或20μM的浓度或由前述浓度中的任何两个所限定的范围内的任何浓度提供。
102.根据前述权利要求中任一项所述的食管筏式培养物、细胞培养物、方法或食管筏式细胞组合物，其中所述ROCK抑制剂以10μM或约10μM的浓度提供。
103.根据前述权利要求中任一项所述的食管筏式培养物、细胞培养物、方法或食管筏式细胞组合物，其中所述SMAD抑制剂包括A-83-01、DMH1、RepSox、LY365947、LY2109761、LY364947、SB431542、SB525334、SB505125、高伦替布、GW788388、LDN-193189、LDN-212854、橙皮素或它们的任何组合。
104.根据前述权利要求中任一项所述的食管筏式培养物、细胞培养物、方法或食管筏式细胞组合物，其中所述SMAD抑制剂是DMH1和A-83-01。
105.根据前述权利要求中任一项所述的食管筏式培养物、细胞培养物、方法或食管筏式细胞组合物，其中所述SMAD抑制剂以约0.1μM、0.5μM、1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM或10μM的浓度或由前述浓度中的任何两个所限定的范围内的任何浓度提供。
106.根据前述权利要求中任一项所述的食管筏式培养物、细胞培养物、方法或食管筏式细胞组合物，其中所述SMAD抑制剂以1μM或约1μM的浓度提供。
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