JP2020523000A5

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Publication number: JP2020523000A5
Application number: JP2019564915A
Authority: JP
Filing date: 2018-02-19
Publication date: 2021-04-01
Anticipated expiration: 2038-02-19

Description

多能性幹細胞（ＰＳＣ）からのヒト肝細胞分化方法の斬新的進歩にもかかわらず、ヒト幹細胞を用いたディッシュでの臨床試験は依然として「誇大宣伝」である。有効性および／または毒性についての薬物スクリーニングのみならず、例えば、移植用のブリッジとして、また精密（個別化医療）用のブリッジとして、生体人工肝臓装置に使用されるための肝細胞モデルが必要とされている。本開示は、当該技術分野における前述の必要性のうちの１つ以上に対処しようと努めたものである。
この出願の発明に関連する先行技術文献情報としては、以下のものがある（国際出願日以降国際段階で引用された文献及び他国に国内移行した際に引用された文献を含む）。
（先行技術文献）
（特許文献）
（特許文献１）国際公開第２０１４／１５１９２１号
（特許文献２）国際公開第２０１６／１４１１３７号

Claims

胚体内胚葉細胞から肝臓オルガノイドの形成を誘導する方法であって、
ａ）後部前腸スフェロイドを形成するのに十分な期間、胚体内胚葉（ＤＥ）をＦＧＦ経路活性化剤およびＷｎｔシグナル伝達経路活性剤と接触させる工程と；
ｂ）前記肝臓オルガノイドを形成するのに十分な期間、レチノイン酸（ＲＡ）の存在下で工程ａの前記後部前腸スフェロイドをインキュベートする工程と、を含む、方法。
請求項１記載の方法において、前記ＤＥ細胞は、約１〜約３日間の期間接触される、方法。
請求項１または２記載の方法において、前記後部前腸スフェロイドは、約１〜約５日間の期間インキュベートされる、方法。
請求項１〜３いずれか１項記載の方法において、前記ＤＥ細胞は、幹細胞油彩である、方法。
請求項４記載の方法において、前記幹細胞がヒトｉＰＳＣである、方法。
請求項１または２記載の方法において、前記後部前腸スフェロイドが基底膜マトリックス、好ましくはＭａｔｒｉｇｅｌに埋め込まれている、方法。
請求項１〜６いずれか１項記載の方法において、前記肝臓オルガノイドが、アルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、アルブミン（ＡＬＢ）、レチノール結合タンパク質（ＲＢＰ４）、サイトケラチン１９（ＣＫ１９）、肝細胞核因子６（ＨＮＦ６）およびシトクロムＰ４５０３Ａ４（ＣＹＰ３Ａ４）を発現する、方法。
請求項１〜７いずれか１項記載の方法において、前記肝臓オルガノイドが胆汁輸送活性を有する、方法。
請求項１〜８のいずれか１項記載の方法において、前記ＦＧＦ経路活性化剤が、小分子もしくはタンパク質ＦＧＦシグナル伝達経路活性化剤、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ８、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１３、ＦＧＦ１４、ＦＧＦ１５、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２２、ＦＧＦ２３、またはそれらの組み合わせから選択される、方法。
請求項１〜９のいずれか１項記載の方法において、前記Ｗｎｔシグナル伝達経路活性化剤が、小分子もしくはタンパク質Ｗｎｔシグナル伝達経路活性化剤から選択される、方法。
請求項１〜１０のいずれか１項記載の方法において、前記Ｗｎｔシグナル伝達経路活性化剤が、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１、Ｗｎｔ１６、またはそれらの組み合わせである、方法。
請求項１〜１１のいずれか１項記載の方法において、前記Ｗｎｔシグナル伝達経路活性化剤が、塩化リチウム；２−アミノ−４，６−二置換ピリミジン（ヘテロ）アリールピリミジン；ＩＱ１；ＱＳ１１；ＮＳＣ６６８０３６；ＤＣＡベータ−カテニン；および２−アミノ−４−［３，４−（メチレンジオキシ）−ベンジル−アミノ］−６−（３−メトキシフェニル）ピリミジンから選択される小分子である、方法。
請求項１〜１２いずれか１項記載の方法において、前記Ｗｎｔシグナル伝達経路活性化剤が、ＧＳＫ３阻害剤である、方法。
請求項１３項記載の方法において、前記ＧＳＫ３阻害剤が、ＣＨＩＲ９９０２１である、方法。
請求項１〜１４いずれか１項記載の方法によって作成される肝臓オルガノイドにおいて、間葉系細胞を含む内在化微絨毛を含む管腔構造を含み、前記管腔構造が極性肝細胞および基底膜によって囲まれている、肝臓オルガノイド。
請求項１５記載の肝臓オルガノイドにおいて、前記肝臓オルガノイドが、機能的星細胞および機能的クッパー細胞を含む、肝臓オルガノイド。
請求項１５または１６記載の肝臓オルガノイドにおいて、前記肝臓オルガノイドが、以下：胆汁産生能、胆汁輸送活性、少なくとも５０ｎｇ／ｍＬ／１ｘｅ^６細胞／２４時間の補体因子Ｈ発現、少なくとも４０ｎｇ／ｍＬ／１ｘｅ^６細胞／２４時間の補体因子Ｂ、少なくとも１０００ｎｇ／ｍＬ／１ｘｅ^６細胞／２４時間のＣ３発現；少なくとも１０００ｎｇ／ｍＬ／１ｘｅ^６細胞／２４時間のＣ４発現、少なくとも１，０００ｎｇ／ｍＬ／１ｘｅ^６細胞／２４時間のフィブリノゲン産生、および少なくとも１０００ｎｇ／ｍＬ／１ｘｅ^６細胞／２４時間のアルブミン産生、のうちの１またはそれ以上を有することを特徴とする、肝臓オルガノイド。
請求項１５〜１７のいずれかに記載の肝臓オルガノイドにおいて、前記肝臓オルガノイドが、少なくとも１０，０００ｎｇ／ｎｉＬｌｘｅ^６細胞／２４時間の総肝臓タンパク質発現を有することを特徴とする、肝臓オルガノイド。
請求項１５〜１８のいずれかに記載の肝臓オルガノイドにおいて、前記肝臓オルガノイドが、ＰＲＯＸ１、ＲＢＰ４、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ３Ａ４、ＡＢＣＣ１１、ＣＦＨ、Ｃ３、Ｃ５、ＡＬＢ、ＦＢＧ、ＭＲＰ２、ＡＬＣＡＭ、ＣＤ６８、ＣＤ３４、ＣＤ３１から選択される１またはそれ以上の遺伝子を発現する、肝臓オルガノイド。
請求項１５〜１９のいずれかに記載の肝臓オルガノイドにおいて、前記肝臓オルガノイドが、薬物代謝シトクロム変異体、好ましくはＣＹ２Ｃ９^＊２変異体を含む、肝臓オルガノイド。
請求項１５〜２０のいずれかに記載の肝臓オルガノイドにおいて、前記肝臓オルガノイドが炎症細胞または炎症性分泌タンパク質を含まない、肝臓オルガノイド。
重篤な有害事象（ＳＡＥ）、好ましくは肝不全および／または薬物誘発性肝障害（ＤＩＬＩ）についてスクリーニングする方法であって、対象となる薬物を請求項１５〜２１のいずれか１項に記載の肝臓オルガノイドと接触させる工程を含む方法。
請求項２２に記載の方法において、前記方法がフルオレセインジアセテート（ＦＤ）の摂取および／または排出を測定する工程を含み、排出障害が、前記薬物が重篤な有害事象を誘発する可能性があることを示す、方法。
請求項２２または２３に記載の方法において、前記対象となる薬物の毒性が、ミトコンドリア膜電位、ＲＯＳの測定、肝臓ミトコンドリアの膨潤、およびそれらの組み合わせから選択されるパラメータの測定によって決定され、前記ミトコンドリアに対する損傷が、前記薬物が重篤な有害事象を誘発する可能性があることを示す、方法。
請求項２２〜２４のいずれかに記載の方法において、前記方法がオルガノイド生存率を測定する工程を含み、オルガノイド生存率の決定における障害が、前記薬物が重篤な有害事象を誘発する可能性があることを示す、方法。
肝障害を有する個体を治療する際に使用の請求項１５〜２１のいずれか１項に記載の肝臓オルガノイド。
請求項２６記載の使用において、前記肝障害が、代謝性肝疾患、末期肝疾患、またはそれらの組み合わせから選択される、方法。
個体にとって好ましい治療薬を同定する方法であって、請求項１５〜２１のいずれか１項記載の肝臓オルガノイドを、候補化合物と接触させる工程を含み、
前記肝臓オルガノイドは、対象となるｉＰＳＣ由来である、方法。
請求項２８に記載の方法において、前記対象となるｉＰＳＣが、前記個体に見出される１またはそれ以上の変異を含む、方法。
請求項２８または２９記載の方法において、前記対象となるｉＰＳＣが、前記個体と同じ民族的背景に由来する、方法。
請求項２８〜３０のいずれかに記載の方法において、前記対象となるｉＰＳＣが前記個体に由来する、方法。