CN112533619A - 肝-胆-胰组织和其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本文公开肝‑胆‑胰类器官(“HBPO”或“HBP类器官”)组合物，以及制备和使用肝‑胆‑胰类器官组合物的方法。所述公开的组合物可具有两种或更多种选自以下的功能：肝组织功能、胆组织功能、外分泌胰功能，和内分泌胰组织功能。还公开使用所述肝‑胆‑胰类器官组合物治疗个体的方法。

Description

肝-胆-胰组织和其制备方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年7月26日提交的题为“从在人体内的前肠道-中肠道边界建模肝-胆-胰器官发生”的62/703,559的优先权和权益，其内容出于所有目的以其全文并入。
背景技术
器官发生是一个复杂且互连的过程，由多种边界组织相互作用统筹1-7。然而，迄今为止，尚不清楚各个相邻组分如何协调以建立完整的多器官结构。因此，干细胞培养中的多器官整合已为未解决的关键挑战。具体来说，获得具有多于一种组织类型的结构上和功能上整合的类器官是所属领域中未满足的需求。更特别的是，由于技术复杂性，肝-胆-胰(HBP)系统的模式化和平衡的器官发生尚未在组织培养中成功建模，阻碍详细的机理研究16、17。本公开试图解决在所属领域中的一个或多个前述需要。
发明内容
本文公开肝-胆-胰类器官(“HBPO”或“HBP类器官”)组合物，以及制备和使用肝-胆-胰类器官组合物的方法。公开的组合物可具有两种或更多种选自以下的功能：肝组织功能、胆组织功能、外分泌胰功能，和内分泌胰组织功能。还公开使用肝-胆-胰类器官组合物治疗个体的方法。
附图说明
所属领域的技术人员将理解，下文描述的附图仅用于说明性目的。附图不旨在以任何方式限制本教示内容的范围。
图1A-1G。边界类器官生成多内胚层结构域。1A。用于从iPSC建立肝-胆-胰(HBP)类器官(“HBPO”)的示意性概述。人PSC分化成前部或后部肠道细胞。将细胞解离成单个细胞并重新聚集以形成前部/后部肠道球体，并且在基质胶中生成前部-后部边界类器官。基质胶包埋从边界类器官开始多器官规格和内陷。1B。经由SOX2+前部和CDX2+后部肠道球体的融合的边界类器官的生成。SOX2和CDX2的表达通过呈红色的SOX2、呈绿色的CDX2和呈白色的DAPI进行整体免疫染色，流式细胞术检测每个群的百分比作为进样口数，并通过qPCR证实。数据为平均值±标准差；n＝3个独立实验。未配对的双尾学生t检验。1C。从第8天到第11天人iPSC衍生的前部和后部类器官混合体的示踪。上排：亮场。中排：呈红色的SOX2、呈绿色的PDX1、呈蓝色的CDX2和呈白色的DAPI的整体免疫染色。下排：呈蓝色的CDX2、呈绿色的HHEX、呈红色的PDX1和呈白色的DAPI的整体免疫染色。箭头：PDX1和HHEX阳性区域。1D。在对PDX1染色的边界类器官免疫荧光的每个区中检测到PDX1阳性细胞的频率。1E。PDX1阳性细胞在每个边界类器官中的位置。Y轴示出与DAPI染色的总细胞数相比，在每个区中PDX1阳性细胞的百分比。f。在第11天以各种组合(前部-后部(AP)(n＝4)、前部到前部(AA)(n＝3)和后部-后部(PP)(n＝3))融合的类器官的HHEX和PDX1阳性细胞的百分比。Y轴示出与DAPI染色的总细胞数相比，性细胞的百分比。数据为平均值±标准差*P<0.05，**P<0.01；单向方差分析。g。从第8天(D8)到第12天(D12)，随时间过程的边界类器官的转录组学表征。解剖、分离前部(A)、边界(B)和后部(P)结构域，并将其应用于RNA测序，如左代表性图像指示(前部肠道球体通过GFP标记，并且后部肠道球体通过RFP标记)。前部、边界和后部结构域分别示出报告的前部前肠、肝脏/胆/胰腺原基和中/后肠道标志物的基因集的丰富31,32。比例尺50μm(1B)，100μm(1C)，50μm(1G)。
图2A-2I。在没有诱导因子的情况下，从边界类器官自行出现肝-胆-胰祖细胞。2A。通过CRISPR-Cas9基因编辑系统生成PROX1-tdTomato报告基因系。2B。从第9天到第11天，在建立的PROX1报告基因iPSC中的PROX1-tdTomato表达。2C。每个类器官中的PROX1-tdTomato阳性区。评估AP、AA和PP的组合。在AP组合中，在边界类器官的细胞膜中证实tdTomato表达。2D。小鼠肝脏原基外植体(Prox1::GFP)和人iPSC衍生的边界类器官(PROX1::m-tdTomato)的肝内陷。2E。第13天，在E8.75小鼠胚胎和边界类器官中的PROX1免疫染色。2F。边界类器官的转录组学表征。解剖、分离前部、边界和后部结构域，并且将其应用于RNA测序。热图示出与选自GO术语类别和KEGG途径类别的FGF、BMP、Hedgehog、NOTCH和RA信号途径有关的下游基因表达。热图通过无偏层次聚类分为8个详细的组(C1-C8)。在B中示出高表达基因的独特表达模式的C6指示RA下游基因集比其它丰富。2G。在视黄酸、BMS493、R-75251或WIN18446的三天培养物下第11天，HHEX、PDX1、SOX2和CDX2的基因表达。2H。在来自原始前部或后部肠道球体的上皮或间充质细胞中RA信号途径有关基因的基因表达分析。使用RFP或GFP标记的iPSC分化每个肠道球体，并且在边界形成之后解离成单个细胞。通过RFP或GFP表达执行前部/后部分离，而通过EpCAM表达执行上皮/间质分离。2I。移植的边界类器官的默认发育潜力。中图示出H&E染色和免疫组织化学分析，而右图示出免疫荧光分析。比例尺50μm(2B)，200μm(2D)，100μm(2E)，100μm(2I)。
图3A-3O。建模人类肝-胆-胰器官发生。3A。从HBP类器官解剖PROX1阳性区域的图示以及解剖前后的图像。3B。优化培养系统的方法：1)浮选，2)包埋到基质胶中，3)包埋到基质胶中，并与来自D13的Transwell一起培养，4).将其解剖，包埋到Matrigel中，并与D13的Transwell一起培养。左图示出内陷或支化类器官的分类。3C。从第13天起的2天内，边界类器官的形态发生。3D在30天的空气-液体界面培养系统中，来自边界类器官的PROX1解剖组织的形态发生改变。3E。第37天类器官的立体显微镜图像。3F。边界类器官具有支化出假定的胰结构域的tdTomato表达肝胆组织，类似于培养的小鼠E10.5衍生肝-胆-胰腺。左：在4天期间培养的小鼠胚胎组织，右：第90天的PROX1-tdTomato报告基因iPSC。3G。右：与肠连接的内陷肝脏\胆管和胰腺的图示。左：在D90边界组织中的H&E。3H-3I。CK19\PDX1\PROX1\SOX9和NGN3以及α-SMA和SOX17(3H)以及AFP、EpCAM和α-SMA(3I)的组合的免疫染色。3J、3K。PDX1、NKX6.1和GATA4以及DBA、PDX1和PROX1(3K)的整体染色。3L-3N。NKX6.1和HNF1B(3L)、淀粉酶和GATA4(3M)以及淀粉酶和CCKAR(3N)的免疫染色。3O。在假定胆结构中的CCK治疗响应。3P。激素诱导外分泌胰腺结构域的分泌功能。在3天-CCK之前和之后边界组织中的淀粉酶的酶联免疫吸附测定。比例尺，100μm(a)，100μm(3B)，100μm(3C)，200μm(3D)，1mm(3E)，200μm(3F)，200μm(3G)，200μm(3H)，200μm(3I)，200μm(3J)，100μm(3K')，200μm(3L)，100μm(3M)，500μm(3N)，50μm(3O)。
图4A-4J。在HBP类器官中建模HES1-介导的器官分隔误差。4A。通过CRISPR-Cas9系统对HES1敲除(KO)系的基因靶向策略。4B。确认WT和HES1KO的修饰基因序列(Del#11)。4C。HES1-/-iPSC培养物照片。4D。在第20天，在HES1 KO iPSC衍生的边界类器官中HES1的基因表达。4E。通过SOX2、CDX2、PDX1和HHES的整体免疫染色，确认由HES1-/-iPS系的边界类器官的形成。即使存在HES1突变，也保留肝-胆-胰前体规格。4F。在D11，在由HES1+/+和HES1-/-生成的前部和后部边界球体中的PROX1-tdTomato表达。4G。在第22天的HES1+/+和HES1-/-HBP类器官的胰腺相关标志物的RNAseq。4H。GCG、NEUROG3、INS和NKX2-2在HES1+/+、HES1-/-类器官和人成体胰组织中的基因表达。4I。HES1+/+和HES1-/-的边界组织的宏观观察。4J。DBA和PDX1的整体免疫染色示出在HES1 KO类器官中，PDX1表达增强，DBA染色区减小。比例尺500μm(4C)，200μm(4E)，100μm(4F)，500μm(4I)，500μm(4J)。
图5。前部和后部肠道细胞表征。使用TkDA人iPSC和72_3人iPSC在第7天前部和后部肠道细胞中的EpCAM的流式细胞术。
图6A-6B边界类器官形成的可再现性。6A。D11边界类器官的图像。从H1 ESC或1383D6 iPSC分化前部和后部肠道球体，混合，并且转移到基质胶中。比例尺为200μm。6B。在衍生自H1ESC的边界球体中，CDX2、上皮标志物ECAD和HHEX的免疫荧光染色。6C。在衍生自72_3iPS的边界球体中PDX1、CDX2、FOXF1和HHEX的免疫荧光染色。
图7A-7B细胞-细胞接触依赖性HBP基因诱导。7A。将前部和后部肠道球体在D8混合，第二天在D9融合，培养并在D12收集用于定量RT-PCR。还在D12收集未融合的球体用于比较。7B。在融合、未融合后部肠道球体(第8天)和iPS细胞的情况下，PDX1和HHEX基因表达。
图8不同的前部和后部肠道组合的比较。在D12，在AP，AA和PP球状体组合中CDX2、HHEX和PDX1的免疫荧光染色。比例尺为200μm。
图9A-9C。从后部肠道细胞发育HBP祖细胞。9A。未标记的iPS细胞分化成前部肠道球体，而AAVS1-GFP标记的iPS细胞分化成后部肠道球体。顶栏示出在边界类器官形成期间的亮场和GFP荧光图像。底栏示出在第13天HHEX和PDX1的整体免疫染色。HHEX表达与GFP表达重叠。比例尺为200μm。9B。H2B-GFP标记和未标记的PROX1-tdTomato报告基因iPSC分别分化成前部和后部肠道球体。tdTomato表达仅在未标记的原始后部肠道球体中检测到。比例尺为200μm。9C。使用未标记的iPSC和PROX1-tdTomato报道基因iPSC，分化前部和后部肠道球体。通过tdTomato表达检查两种组合，报告基因细胞衍生的前部和未标记的细胞后部(左栏)，或未标记细胞衍生的前部和报告基因细胞衍生的后部肠道球体(右栏)。顶行：明场图像，底行：tdTomato荧光图像。比例尺为200μm
图10。在后部肠道特异性BMS493中HHEX和PDX1诱导的消除。将BMS493预处理的前部或后部肠道球体融合以诱导HBP原基形成。与未治疗的对照组相比，BMS493预处理的后部肠道球体组在边界处抑制HHEX和PDX1表达，表明在后部侧的视黄酸受体功能对建立HBP边界类器官重要。比例尺：200μm
图11A和11B。BMS493暴露于E9.0PROX1::GFP报告基因小鼠胚胎外植体培养物的PROX1抑制。将胚胎第9.0天Prox1-GFP整个胚胎在旋转器型瓶培养系统中培养24小时。将视黄酸受体拮抗剂BMS493治疗组与对照(添加DMSO)组比较。11A。胚胎在培养之后的亮场图像和GFP荧光图像。11B。GFP表达部分的面积由在(a)中的GFP图像定量。比例尺：1mm
图12体外培养系统的优化。在图3A-3C中，比较各种培养形式以增强PROX1阳性HBP前体区域的形态发生改变，如内陷和支化。在D7，在24小时培养后将前部和后部肠道球体混合并连接。将连接的球体转移到基质胶滴或低结合培养板中，以比较在HBP前体出现期间的非浮选和浮选条件。在基质胶包埋组中的类器官在D11开始表达tdTomato。根据荧光表达在显微镜下手动解剖tdTomato阳性区域，并且再次将其转移到基质胶滴或Transwell中，以比较在培养基中各种激动剂和拮抗剂的作用。
图13。类器官大小、PROX1阳性面积、支化和内陷的比较。仅AP组合增加了类器官和PROX1表达区域的大小。此外，AP组合示出具有支化和内陷的球体，而其它两种组合没有。比例尺：500μm
图14。未能从HBP类器官的后部支化和内陷。虽然HBP类器官形成Prox1表达支化结构，但是含有PDX1表达的HBP的后部区域未形成其结构。比例尺为200μm。
图15A-15C。在HBP类器官中器官结构域特异性标志物的表达。15A。在第30天，AFP、白蛋白和HHEX的免疫荧光染色。AFP和白蛋白在同一区域表达，但HHEX不是。HHEX为肝细胞祖细胞标志物，其在后期导致表达消失。15B。NKX6.1、NKX6.3和PDX1的免疫荧光染色。NKx6.3在胰腺标志物PDX1和NKX6.1表达区中表达。15C。EpCAM、PROX1、SOX9和CLF的免疫荧光染色。比例尺：100μm
图16。胰相关基因在HES-/-类器官中上调。在第22天的HES1+/+和HES1-/-HBP类器官的胰相关标志物的RNAseq。这与图4G有关。
图17。在长期培养的类器官中的连接结构。在HES1-/-和HES1+/+类器官中DBA和SOX9的整体染色。在HES1-/-类器官中，DBA和SOX9消失。比例尺：200μm。
具体实施方式
定义
除非另有指出，否则术语应根据相关领域中普通技术人员的常规用法来理解。在有矛盾的情况下，将以本文档(包括定义)为准。下文描述优选的方法和材料，但与本文所描述的那些类似或等效的方法和材料可用于实施或测试本发明。本文提到的所有公开案、专利申请、专利和其它参考文献都以全文引用的方式并入。本文公开的材料、方法和实例仅为说明性的并且不打算是限制性的。
除非上下文另外明确规定，否则如本文和所附权利要求书中所用，单数形式“一(a/an)”和“所述(the)”包括多个指示物。因此，例如，提及“一种方法”包括多种这类方法，并且提及“一种剂量”包括提及所属领域技术人员已知的一种或多种剂量及其等同物，等等。
术语“约”或“大约”意指在所属领域普通技术人员确定的特定值的可接受误差范围内，这将部分取决于如何测量或确定值，例如，测量系统的限制。举例来说，根据所属领域中的实践，“约”可意指在1或大于1个标准差内。替代地，“约”可意指给定值的最多20％，或最多10％，或最多5％，或最多1％的范围。替代地，特别是对于生物系统或过程，术语可意指在一个数量级内，优选地在值的5倍内，并且更优选地在2倍内。在申请和权利要求中描述特定值的情况下，除非另有说明，否则应当假设术语“约”意指在特定值的可接受误差范围内。
如本文所用，术语“定形内胚层(DE)细胞”意指通过原肠胚形成过程产生的三个原代胚层中的一个。
如本文所使用，术语“wnt信号传导途径”意指wnt/β-连环蛋白途径，并且为通过β-连环蛋白起作用的Wnt配体和卷曲的细胞表面受体介导的信号转导途径。
如本文所用，关于如“wnt途径”的途径的术语“激活剂”意指激活Wnt/β-连环蛋白途径使得Wnt/β-连环蛋白靶标增加的物质。
如本文所用，术语“FGF信号传导途径激活剂”意指激活FGF途径使得FGF靶标增加的物质。
如本文所用，术语“BMP信号传导途径抑制剂”为干扰BMP途径并引起BMP靶标降低的物质。
如本文所用，术语“生长因子”意指能够刺激细胞过程，包括但不限于生长、增殖、形态发生或分化的物质。
如本文所用，术语标志物的“稳定表达”意指在生长环境改变后不改变的表达。
如本文所用，术语“全能(totipotent)干细胞”(也称为全能(omnipotent)干细胞)为可分化成胚胎和胚胎外细胞类型的干细胞。这类细胞可构建完整的、活的生物体。这些细胞由卵子和精子细胞融合产生。由受精卵的前几次分裂产生的细胞也是全能的。
如本文所用，术语“多能干细胞(PSC)”，通常也称为PS细胞，涵盖可分化成几乎所有细胞的任何细胞，即衍生自三个胚层(生殖上皮)中的任何一个的细胞，所述三个胚层包括内胚层(内部胃粘膜、胃肠道、肺)、中胚层(肌肉、骨骼、血液、泌尿生殖器)和外胚层(表皮组织和神经系统)。PSC可为全能细胞的后代，衍生自胚胎(包括胚胎生殖细胞)或通过诱导非多能细胞(如成体体细胞)通过强制某些基因的表达而获得。
如本文所用，术语“诱导多能干细胞(iPSC)”，也通常缩写为iPS细胞，是指通过诱导某些基因的“强制”表达由正常非多能细胞(如成体体细胞)人工衍生的一种类型的多能干细胞。
如本文所用，术语“前体细胞”涵盖可用于本文所描述的方法中的任何细胞，通过所述细胞，一种或多种前体细胞获得自我更新或分化成一种或多种特化细胞类型的能力。在一些方面，前体细胞为多能的或具有变成多能的能力。在一些方面，前体细胞经受外部因子(例如，生长因子)的处理以获得多能性。在一些方面，前体细胞可为全能干细胞；多能干细胞(诱导或非诱导)；多能干细胞；和单能干细胞。在一些方面，前体细胞可来自胚胎、婴儿、儿童或成人。在一些方面，前体细胞可为经受处理的体细胞，使得经由基因操纵或蛋白/肽处理赋予多能性。
在发育生物学中，细胞分化为较不特化的细胞变成较特化的细胞类型的过程。如本文所用，术语“定向分化”描述了一种过程，通过所述过程，较不特化的细胞变成特定的特化靶向细胞类型。特化靶向细胞类型的特殊性可通过可用于定义或改变初始细胞命运的任何适用方法来确定。示例性方法包括但不限于基因操纵、化学处理、蛋白质处理和核酸处理。
本文公开肝-胆-胰类器官(“HBPO”或“HBP类器官”)组合物。在一些方面，公开的组合物可具有两种或更多种选自以下的功能：肝组织功能、胆组织功能、外分泌胰功能，和内分泌胰组织功能。在一方面，本文公开的HBPO可互换地称为“多器官三维类器官”，并且可包含前部区域、后部区域和边界区域。在一个方面，边界区域可表达胰和十二指肠同源盒1(PDX1)和造血表达的同源盒蛋白(HHEX)。在一个方面，HBPO可包含胆管组织和胰组织。在一个方面，在HBPO中胆管组织和胰组织可连接。在一个方面，HBPO可包含肝脏细胞、胰腺细胞、胆管细胞和肠细胞。
在一个方面，HBPO可包含内皮细胞、间充质细胞，或内皮细胞和间充质细胞两者。在某些方面，HBPO可包含内胚层和中胚层。
所公开的HBPO的特征可在于，例如在本文的对应图中所示的支化结构。
在一个方面，本文公开的HBPO的特征可在于功能外分泌标志物的表达。在一个方面标志物可为淀粉酶。在一个方面标志物可为内分泌标志物，例如胰岛素。
在某些方面，本文公开的HBPO的特征可在于外源施用的试剂的功能响应。举例来说，在一个方面，HBPO可响应于与胆囊收缩素(CCK)接触而分泌淀粉酶。
在某些方面，所公开的HBPO的特征可在于HBPO可基本上不含粘膜下腺、过渡区域、血管系统、免疫细胞或粘膜下层中的一种或多种。这类特征将三维类器官的结构与人类或其它哺乳动物内源性发现的天然组织的结构区分开。
在一个方面，通过扩增如上定义的一种或多种前体细胞(例如从个体获得的iPSC)获得HBPO。
本文还公开制备肝-胆-胰类器官(“HBPO”或“HBP类器官”)的方法。在此方面，方法可包含使第一定形内胚层与Wnt信号传导途径激活剂、FGF信号传导途径激活剂和BMP信号传导途径抑制剂接触，以形成前部肠道球体；使第二定形内胚层与Wnt信号传导途径激活剂和FGF信号传导途径激活剂接触，以形成后部肠道球体；使前部肠道球体与后部肠道球体接触，直到前部肠道球体和后部肠道球体融合，以形成具有前肠道-中肠道边界的边界类器官；和培养具有前肠道-中肠道边界的边界类器官，以形成HBPO；其中HBPO包含胆组织和胰组织。(参见例如图12)在一个方面，所公开的方法可允许生产HBPO，其可包含肝脏组织、胰组织、胆管组织和肠组织。
如本文所用，术语肝-胆-胰类器官(“HBPO”或“HBP类器官”)大体上是指在其中分隔多器官结构域(肝、胆和胰器官结构域)的阶段(通常发生在约D30)的类器官。关于术语“边界类器官”，其可包括在D7之后的类器官，其包括尚不具有组织规格的类器官组合物。
在一个方面，前部肠道球体可包含表达SRY-盒2(SOX2)的细胞。在一个方面，前部肠道球体的特征可在于SRY-盒2(SOX2)表达。在一个方面，前部肠道球体可基本上不含胰和十二指肠同源盒1(PDX1)表达细胞。在一个方面，后部肠道球体包含表达胰和十二指肠同源盒1(PDX1)的细胞。在一个方面，后部肠道球体可表达CDX2。在一个方面，后部肠道球体的特征可在于尾侧型同源盒2(CDX2)表达。在一个方面，后部肠道球体可包含表达尾侧型同源盒2(CDX2)的细胞。在一个方面，HBPO可包含表达胰和十二指肠同源盒1(PDX1)的细胞、表达造血表达的同源盒蛋白(HHEX)的细胞，和表达Prospero有关的同源盒1(PROX1)的细胞。在一个方面，融合的前部肠道球体和后部肠道球体可包含胆-胰原基，其特征在于SOX2、CDX2、HHEX和PDX1的表达，其中PDX1表达局限于融合的前部肠道球体和后部肠道球体的边界区域。
在一个方面，HBPO可包埋到形态发生因子中，优选地基底膜基质，例如基质胶。方法还可包含从HBPO切除PROX1阳性区域，并且培养切除的HBPO，以形成内陷上皮和支化结构。
在一个方面，HBPO可例如使用本文公开的方法在旋转下培养。
在一个方面，所公开的方法可用于获得如本文所描述的HBPO，具体地说，包含内胚层和中胚层的HBPO。
在一个方面，定形内胚层可衍生自选自以下的前体细胞：胚胎干细胞、胚胎生殖细胞、诱导多能干细胞、中胚层细胞、定形内胚层细胞、后部内胚层细胞、后部内胚层细胞和后肠道细胞，优选地定形内胚层衍生自多能干细胞，更优选地定形内胚层衍生自选自以下的多能干细胞：胚胎干细胞、成体干细胞，或诱导多能干细胞
在一个方面，定形内胚层可衍生自使多能干细胞与一种或多种选自以下的分子接触：活化素、生长因子的TGF-β超家族的BMP子群；Nodal、活化素A、活化素B、BMP4、Wnt3a和其组合。
在一个方面，WNT信号传导途径激活剂可选自一种或多种选自由以下组成的组的分子：Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt9a、Wnt9b、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11、Wnt16、GSKβ抑制剂(例如CHIR99021，即“CHIRON”)、BIO、LY2090314、SB-216763、锂、豪猪抑制剂IWP、LGK974、C59、SFRP抑制剂WAY-316606，β-连环蛋白激活剂DCA。
在一个方面，FGF信号传导途径激活剂可选自一种或多种选自由以下组成的组的分子：FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF10、FGF11、FGF12、FGF13、FGF14、FGF15、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF20、FGF21、FGF22、FGF23和其组合，优选地FGF4或FGF10或其组合。
在一个方面，BMP信号传导途径抑制剂选自可诺金(Noggin)、德索莫啡(Dorsomorphin)、LDN189、DMH-1和其组合，优选地其中BMP信号传导途径抑制剂为诺金。
在一个方面，所公开的方法可在体外进行。在某些方面，方法的至少一个步骤可在固体支持物上进行。举例来说，固体支持物可选自胶原蛋白、基底膜基质(基质胶)或其组合。
在一个方面，公开用于制备具有内皮的HBPO的方法。在此方面，方法可包含将根据本文公开的方法的HBPO与衍生自诱导多能干细胞的内皮细胞一起培养的步骤。内皮细胞可形成为内皮细胞(EC)球体，然后HBPO一起进行培养。举例来说，对于内皮细胞(EC)分化，可使用Accutase(美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技公司(Thermo FisherScientific Inc.,Waltham,MA,USA))解离人iPSC，并且在具有Rho相关激酶抑制剂(Y-27632)的
Figure BDA0002909826820000121
(味之素公司(Ajinomoto Co.,Inc.))中在变化的最佳密度(根据细胞系)下在层粘连蛋白511E8片段(iMatrix-511TM，由日本飞机公司(Nippi,Inc.)提供)上铺板。从第二天起，在Wnt激活剂和骨形态生成蛋白4(BMP4)持续三天的情况下，使用具有B27培养基(DMEM:F12(1:1)与1％Glutamax和1％B27(均为生命技术(Life Technologies))的1:1混合物)的起动培养基，它们可首先分化成中胚层。然后可用补充有VEGF和弗斯可林的EC诱导培养基、StemPro-34SFM培养基(生命技术)替换起动培养基。诱导培养基可每天更新。在分化的第七天，将EC解离并进行FACS分析。iPSC衍生的EC应显示出具有CD144和CD31的连接定位的典型的内皮形态。EC可在补充有VEGF-A的由StemPro-34 SFM组成的EC扩增培养基中以50,000细胞cm-2的密度重新铺板在纤连蛋白包被的培养皿上。EC扩增培养基可每隔一天更换一次。可使用如本文所描述的前部肠道球体和后部肠道球体的球体形成协议，将分化的EC解离成单个细胞并形成球体。然后可将EC与融合的前部肠道球体和后部肠道球体在肠道生长培养基中的96孔圆底超低附接板上混合24小时，以形成融合的EC球体、前部肠道球体和后部肠道球体。
在一个方面，公开用于制备具有间充质的HBPO的方法。在此方面，方法可包含将根据如本文公开的方法的HBPO与衍生自诱导多能干细胞的间充质细胞一起培养的步骤。间充质细胞可形成为间充质细胞(MC)球体，然后与HBPO一起进行培养。所公开的多器官三维类器官和间充质细胞或间充质球体可一起培养，以改善多器官三维类器官的生长和成熟。举例来说，对于间充质(MSC)分化，人iPSC可分化成中胚层。中胚层细胞然后可暴露于附加活化素A和PDGFBB 3天。可使用前部肠道球体和后部肠道球体的球体形成协议，将分化的MSC解离成单个细胞并形成球体。然后可将MSC与融合的前部肠道球体和后部肠道球体在肠道生长培养基中的96孔圆底超低附接板上混合24小时，以形成融合的MSC球体、前部肠道球体和后部肠道球体。
在一个方面，公开制备肝-胆-胰类器官(“HBPO”)的方法，其中方法可包含从前部肠道细胞衍生前部肠道球体并且从后部肠道细胞衍生后部肠道球体，以制备边界类器官；和在肠道生长培养基中培养边界类器官，以制备HBPO。在一个方面，制备肝-胆-胰类器官(“HBPO”)的方法可包含在不存在诱导因子的情况下从前部肠道细胞衍生前部肠道球体并且从后部肠道细胞衍生后部肠道球体，以制备HBPO；和在肠道生长培养基中培养边界类器官，以制备HBPO。
通过“诱导因子”意指用于指导分化的因子，例如视黄酸(RA；美国密苏里州的西格玛(Sigma,MO,USA))、肝细胞生长因子(HGF；美国新泽西州派普泰克(PeproTech,NJ,USA))、0.1μM地塞米松(Dex；西格玛)和20ng/mL抑瘤素M(OSM；安迪生物公司(R&D Systems))用于肝细胞分化。胰腺和胆的许多其它诱导因子也是已知的，并且所属领域技术人员将容易理解。
在一个方面，公开制备肝-胆-胰类器官(“HBPO”)的方法，其中方法可包含在肠道生长培养基中培养从多能干细胞(PSC)分化的定形内胚层(DE)，以制备前部肠道细胞和后部肠道细胞，在不存在诱导因子的情况下从前部肠道细胞制备前部肠道球体并且从后部肠道细胞制备后部肠道球体，以制备边界类器官；和(iii)在肠道生长培养基中培养边界类器官，以制备HBPO。在一个方面，肠道生长培养基可为包含ROCK抑制剂的培养基。在一个方面，ROCK抑制剂可为Y-27632。在一个方面，生长培养基为Advanced DMEM/F-12(Dulbecco的改性Eagle培养基/Ham's F-12)，一种广泛使用的基础培养基，其在添加谷氨酰胺、HEPES、N2和B27的情况下允许哺乳动物细胞的培养物具有降低的胎牛血清(FBS)补充，可得自：https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/12634010。在一个方面，培养基可包括将以下细胞因子添加到Advanced DMEM：用于前部肠道细胞的诺金(BMP抑制剂)、CHIR(WNT激活剂)、FGF4，用于后部肠道细胞的CHIR和FGF4(没有诺金)。
在一个方面，本文公开用于生产HBPO的机器。机器可包含在存在或不存在BMP信号传导途径抑制剂的情况下含有Wnt信号传导途径激活剂和FGF信号传导途径激活剂的肠道生长培养基；和含有ROCK抑制剂的肠道生长培养基。
在一个方面，公开用于生产HBPO的多种培养基的用途，其中多种培养基包含含有Wnt信号传导途径激活剂和FGF信号传导途径激活剂，任选地包含BMP信号传导途径抑制剂的肠道生长培养基；和含有ROCK抑制剂的肠生长培养基。
在一个方面，可将HBPO移植到哺乳动物(如非人类哺乳动物)中一段时间，以增加HBPO的生长和成熟。在一个方面，可例如在有需要的个体中移植HBPO以拯救器官功能障碍。在一个实例中，可收集体外生成的HBPO，并且将其移植到非肥胖性糖尿病/严重联合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠的肾脏的肩胛下部位或小肠的隔膜中。在移植后第8周可观察到类器官的生长增加。可基于血液测试(例如人Alb、人C肽水平)监测生存力和生长。
在一个方面，公开治疗个体的方法，其包含移植如本文所描述的HBPO。在此方面，可使用如所属领域已知的标准手术程序将根据本文使用的任何方法生产的类器官移植到有需要的个体中。在一个方面，个体可具有选自以下的疾病状态：肝疾病(如肝脏衰竭和先天性肝脏疾病)、胰疾病(如糖尿病)或胆疾病。
在一个方面，公开鉴定选自胆炎性疾病和/或胰炎性疾病(如胰腺炎)中的一种或多种疾病状态的治疗的方法。在此方面，所公开的类器官组合物可与如本文中所公开的类器官组合物的感兴趣的潜在治疗剂接触。然后可在类器官中检测器官活动的量度。基于此检测的输出，可确定感兴趣的潜在治疗剂是否改善疾病状态的度量，并且可由此用于鉴定治疗剂可能用于治疗涉及在HBPO中实施的组织中任一种的功能障碍的疾病状态。
衍生自胚胎细胞的多能干细胞
在一些实施例中，一个步骤可包括获得多能干细胞或可诱导成为多能的干细胞。在一些方面，多能干细胞衍生自胚胎干细胞，胚胎干细胞继而衍生自早期哺乳动物胚胎的全能细胞并且能够在体外无限制、未分化的增殖。胚胎干细胞为衍生自早期胚胎的胚泡的内细胞团的多能干细胞。从胚细胞衍生胚胎干细胞的方法是在所属领域中是众所周知的。人类胚胎干细胞H9(H9-hESC)用于本申请中描述的示例性实施例中，但是所属领域技术人员将理解，本文描述的方法和系统适用于任何干细胞。
可用于根据本发明的实施例中的附加干细胞包括不限于由旧金山加利福尼亚大学(UCSF)的人类胚胎干细胞研究中心的国家干细胞库(NSCB)主办的数据库；Wi细胞研究所的WISC细胞库；威斯康星大学干细胞与再生医学中心(UW-SCRMC)；Novocell公司(加利福尼亚州圣地亚哥)；Cellartis AB(瑞典哥德堡)；胚胎干细胞国际公司(新加坡)；以色列理工学院以色列理工学院(以色列海法)；以及由普林斯顿大学和宾夕法尼亚大学主办的干细胞数据库提供或描述的那些干细胞。可用于根据本发明的实施例中的示例性胚胎干细胞包括不限于SA01(SA001)；SA02(SA002)；ES01(HES-1)；ES02(HES-2)；ES03(HES-3)；ES04(HES-4)；ES05(HES-5)；ES06(HES-6)；BG01(BGN-01)；BG02(BGN-02)；BG03(BGN-03)；TE03(13)；TE04(14)；TE06(16)；UC01(HSF1)；UC06(HSF6)；WA01(H1)；WA07(H7)；WA09(H9)；WA13(H13)；WA14(H14)。关于胚胎干细胞的更多细节可见于：例如Thomson等人,1998,“衍生自人类胚泡的胚胎干细胞系(Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts),”《科学(Science)》282(5391):1145-1147；Andrews等人,2005,“胚胎干(ES)细胞和胚胎癌(EC)细胞：同一枚硬币的两面(Embryonic stem(ES)cells and embryonal carcinoma(EC)cells:opposite sides of the same coin,”《生化学会学报(Biochem Soc Trans)》33:1526-1530；Martin 1980,“《畸胎癌和哺乳动物胚胎发生(Teratocarcinomas andmammalian embryogenesis),”.《科学》209(4458):768-776；Evans和Kaufman,1981,“在小鼠胚胎中培养多能细胞(Establishment in culture of pluripotent cells from mouseembryos),”《自然(Nature)》292(5819):154-156；Klimanskaya等人,2005,“在无饲养细胞的情况下衍生得到的人类胚胎干细胞(Human embryonic stem cells derived withoutfeeder cells),”《柳叶刀(Lancet)》365(9471):1636-1641；其中每个的全文在此由此并入本文中。
诱导多能干细胞(iPSC)
在一些方面，通过将某些干细胞相关基因转染到非多能细胞(如成体成纤维细胞)中来衍生iPSC。转染可通过病毒载体实现，如逆转录病毒。转染的基因包括主转录调节因子Oct-3/4(Pouf51)和Sox2，但有人提出其它基因可提高诱导效率。3-4周后，少量被转染的细胞在形态上和生物化学上开始变得与多能干细胞类似，并且通常通过形态选择、倍增时间或通过报告基因和抗生素选择来分离。如本文所用，iPSC包括不限于小鼠中的第一代iPSC、第二代iPSC和人诱导的多能干细胞。在一些方面，使用四种关键基因：Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc，逆转录病毒系统用于将人类成纤维细胞转化成多能干细胞。在替代的方面，慢病毒系统用于用OCT4、SOX2、NANOG和LIN28转化体细胞。表达在iPSC中诱导的基因包括不限于Oct-3/4(例如，Pou5fl)；Sox基因家族的某些成员(例如，Sox1、Sox2、Sox3和Sox15)；Klf家族的某些成员(例如，Klf1、Klf2、Klf4和Klf5)，Myc家族的某些成员(例如，C-myc、L-myc和N-myc)，Nanog和LIN28。
在一些方面，使用基于非病毒的技术生成iPSC。在一些方面，腺病毒可用于将必需的四种基因转运到小鼠的皮肤和肝细胞的DNA中，产生与胚胎干细胞相同的细胞。由于腺病毒不将其任何自身基因与靶向宿主组合，因此消除了产生肿瘤的危险。在一些方面，重编程可经由质粒完成，而根本不需任何病毒转染系统，但效率非常低。在其它方面，蛋白的直接递送用于生成iPSC，因此消除了对病毒或基因修饰的需要。在一些实施例中，使用类似的方法可生成小鼠iPSC：用经由聚精氨酸锚定导入细胞中的某些蛋白重复处理细胞足以诱导多能性。在一些方面，还可通过在低氧条件下用FGF2处理体细胞来增加多能性诱导基因的表达。
关于胚胎干细胞的更多细节可见于例如，Kaji等人,2009,“病毒自由诱导多能性并随后切除重编程因子(Virus free induction of pluripotency and subsequentexcision of reprogramming factors),”《自然》458:771-775；Woltjen等人,2009,“piggyBac转座将成纤维细胞重新编程为诱导多能干细胞(piggyBac transpositionreprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells),”《自然》458:766-770；Okita等人,2008,“在没有病毒载体的情况下产生小鼠诱导多能干细胞(Generation ofMouse Induced Pluripotent Stem Cells Without Viral Vectors),”《科学》322(5903):949-953；Stadtfeld等人,2008,“在无病毒整合的情况下产生诱导多能干细胞(InducedPluripotent Stem Cells Generated without Viral Integration),”Science 322(5903):945-949；和Zhou等人.,2009,“使用重组蛋白产生诱导多能干细胞(Generation ofInduced Pluripotent Stem Cells Using Recombinant Proteins),”《细胞干细胞(CellStem Cell)》4(5):381-384；其中每个的全文由此并入本文中。
在一些方面，示例性iPS细胞系包括但不限于iPS-DF19-9；iPS DF19-9；iPS DF4-3；iPS DF6-9；的iPS(包皮)；iPS(IMR90)；和iPS(IMR90)。
关于与DE发育有关的信号传导途径的功能的更多细节可见于例如，Zorn和Wells,2009,“脊椎动物内胚层发育和器官的形成(Vertebrate endoderm development andorgan formation),”《细胞发育生物学年鉴(Annu Rev Cell Dev Biol)》25:221-251；Dessimoz等人,2006,“FGF信号传导对于在体内沿前部-后部轴建立肠道管结构域是必要的(FGF signaling is necessary for establishing gut tube domains along theanterior-posterior axis in vivo),”《发育机理(Mech Dev)》123:42-55；McLin等人,2007,“在前内胚层中抑制Wnt/β-连环蛋白信号传导对于肝脏和胰腺的发育至关重要(Repression of Wnt/β-catenin signaling in the anterior endoderm is essentialfor liver and pancreas development).《发育(Development)》,”134:2207-2217；Wells和Melton,2000,《发育》127:1563-1572；de Santa Barbara等人,2003,“肠上皮的发育和分化(Development and differentiation of the intestinal epithelium),”《细胞和分子生命科学(Cell Mol Life Sci)》60(7):1322-1332；其中每个的全文由此并入本文中。
用于从多能细胞(例如，iPSC或ESC)产生定形内胚层的任何方法都适用于本文所述的方法。在一些方面，多能细胞衍生自桑椹胚。在一些方面，多能干细胞为干细胞。在这些方法中使用的干细胞可包括但不限于胚胎干细胞。胚胎干细胞可衍生自胚胎内细胞团或胚胎性腺脊。胚胎干细胞或生殖细胞可源自多种动物物种，包括但不限于包括人类在内的各种哺乳动物物种。在一些方面，人类胚胎干细胞用于产生定形内胚层。在一些方面，人类胚胎生殖细胞用于产生定形内胚层。在一些方面，iPSC用于产生定形内胚层。
在一个方面，定形内胚层可衍生自选自以下的前体细胞：胚胎干细胞、胚胎生殖细胞、诱导多能干细胞、中胚层细胞、定形内胚层细胞、后部内胚层细胞、后部内胚层细胞和后肠道细胞。在一个方面，定形内胚层可衍生自多能干细胞。在一个方面，定形内胚层可衍生自选自以下的多能干细胞：胚胎干细胞、成体干细胞或诱导多能干细胞。在一个方面，DE可为DE单层，其中在DE单层中大于90％的细胞共表达FOXA2和SOX17。
在一个方面，定形内胚层可衍生自使多能干细胞与一种或多种选自以下的分子接触：活化素、生长因子的TGF-β超家族的BMP子群；Nodal、活化素A、活化素B、BMP4、Wnt3a和其组合。
在一个方面，BMP信号传导途径抑制剂可选自诺金、德索莫啡、LDN193189、DMH-1和其组合。在一个方面，BMP信号传导途径抑制剂为诺金。BMP抑制剂可以在约50到约1500ng/ml之间的浓度存在。
在一个方面，WNT信号传导途径激活剂可选自一种或多种选自由以下组成的组的分子：Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt9a、Wnt9b、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11、Wnt16、GSKβ抑制剂(例如CHIR99021，即“CHIRON”)、BIO、LY2090314、SB-216763、锂、SFRP抑制剂WAY-316606，β-连环蛋白激活剂DCA。可使用的WNT途径激活剂的浓度为例如在约50到约1500ng/ml之间的浓度。存在许多激活Wnt/β-连环蛋白途径的方式(参见http://web.stanford.edu/group/nusselab/cgi-bin/wnt/)。合适的一些现有wnt信号传导途径激活剂包括不限于基于蛋白的激活剂，其可包括Wnt配体，包括但不限于Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt8等；Wnt配体活性的修饰剂，包括但不限于激活的Wnt卷曲的受体、(LRP)共受体、R-反应素蛋白、Dkk蛋白、Wnt配体分泌和运输的调节因子(Wntless，豪猪)、抑制β-连环蛋白降解APC和GSK3β抑制、激活的β-连环蛋白、组成型活性TCF/Lef蛋白，和化学激活剂，其可包括激活或抑制Wnt/β-连环蛋白信号传导的超过28种已知化学品。一些激活剂包括不限于GSK3-β抑制剂CHIR99021(CHIRON)、BIO、LY2090314、SB-216763、锂、SFRP抑制剂WAY-316606、β-连环蛋白激活剂DCA。
在一个方面，FGF信号传导途径激活剂可选自一种或多种选自由以下组成的组的分子：FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF10、FGF11、FGF12、FGF13、FGF14、FGF15、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF20、FGF21、FGF22、FGF23和其组合，优选地FGF4或FGF10或其组合。在一个方面，可使用FGF途径激活剂的浓度为在约50到约1500ng/ml之间的浓度，但是所属领域的普通技术人员应理解可使用各种浓度。刺激FGF受体和受体下游信号传导组分的蛋白和化学物质包括MAPK、MEK、ERK蛋白和调整其活性的化学物质。FGF信号传导可通过抑制FGF信号传导途径的抑制剂(包括但不限于Sprouty蛋白家族成员)来激活。
实例
提供以下非限制性实施例以进一步说明本文公开的本发明的实施例。所属领域技术人员应了解，在以下实例中公开的技术代表已发现在本发明的实践中很好地起作用的方法，并且因此可被视为构成其实践的模式的实例。然而，根据本公开，所属领域的技术人员应了解，可在不脱离本发明的精神和范围的情况下对所公开的具体实施例作出许多改变并且仍获得相似或类似结果。
器官发生是一个复杂且互连的过程，由多种边界组织相互作用统筹1-7。然而，迄今为止，尚不清楚各个相邻组分如何协调以建立完整的多器官结构。本文公开从人类多能干细胞(PSC)的三维培养物内陷，肝、胆和胰结构的连续模式化和动态形态发生。
申请人已经发现，从人类PSC分化的前部和后部肠道球体之间的边界相互作用，使得在不存在外在因子供应的情况下，自主出现在前肠道-中肠道边界类器官处指定的肝-胆-胰(HBP)器官结构域。然而移植物衍生的组织以中肠道衍生物为主导，微解剖的HBP类器官的长期培养物发展发育成分隔的肝-胰-胆原基，随后再现早期形态发生事件(包括三种不同并且互连的器官结构的内陷和支化)，使人联想到衍生自小鼠外植入前肠道-中肠道培养物的组织。如体内看到，通过在HES1中的基因突变招致的多器官结构域的错误分隔消除在培养物中潜在的胆规格8,9。申请人已经证明，可通过并列定位前肠道和中肠道组织来建立实验多器官整合模型，并且所述模型可用作研究人类复杂内胚层器官发生的易控制、可操纵且易于访问的模型。
肝-胆-胰(HBP)原基(通过HHEX(造血表达的同源盒蛋白)和PDX1(胰和十二指肠同源盒1)表达分界)首先指定在前肠道-中肠道之间的边界处10，并且形成从原始肠道腹侧内陷的上皮囊泡11-13。破坏此区周围的边界限定基因，如BMPR1A(骨形态生成蛋白受体，1A型)1、HLX(H2.0样同源盒)2、CDX2(尾侧型同源盒2)3、NKX3-2(NK3同源盒2)4、HHEX5、PDX1和SOX9(SRY-盒9)6显著体内改变沿胃-HBP-肠的平衡的器官发生1-7。随后的HBP谱系的多样化可能通过间接抑制后部肝脏芽细胞中的SOX9在其边界处相邻的间充质BMP介导14。因此，在复杂环境中发生连续动态器官发生，并且这很可能通过连续邻接组织相互作用驱动5,6,15。然而，由于技术复杂性，HBP系统的模式化和平衡的器官发生尚未在组织培养中成功建模，阻碍详细的机理研究16,17。
这里，申请人使用人类多能干细胞(PSC)使用三维分化方法来指定具有包含内胚层和中胚层两者的不同区域身份的肠道球体。申请人证明，前后部相互作用在体外复制前肠道(通过SOX2、SRY-盒2标志)和中肠道(通过CDX2标志)边界，建模人类肝-胆-胰系统的相互协同规格和内陷。
为了使前肠道-中肠道边界模型发育，申请人首先将定形内胚层细胞(如先前描述模式化18、19)暴露于重组蛋白FGF4，和对于前部肠道为在存在BMP拮抗剂诺金的情况下并且对于后部肠道身份在不存在诺金的情况下小分子CHIR99021(调制WNT途径)(图1A和图5)。在第7天(D7)，前部或后部肠道细胞单独聚集，以形成其中分别优先表达前肠道和中/后肠道转录因子SOX2和CDX2的球体(图1B)。然后申请人转移与前部肠道球体邻的后部肠道球体。在D9，两个球体以94.8％的孔融合，并且将融合的球体包埋到形态发生因子(即基质胶)中(图1A和B)。出人意料地，在不添加任何外源因子的情况下，HBP原基出现在前部和后部肠道球体的界面上，如通过使用标志物SOX2、CDX2、未成熟的肝脏标志物HHEX，以及胃、十二指肠和胰腺祖细胞标志物PDX1通过在D9、D10和D11的球体的整体染色证实(图1C)。在D9，前部和后部肠道球体未显示HHEX和PDX1的任何表达。在D10，出现HHEX和PDX1表达，并且仅可在前部和后部(bAP)类器官的边界处检测到HHEX。在D11，在边界区域中PDX1和HHEX阳性细胞明显增加(图1C)。使用三种附加诱导性多能干细胞(iPSC)和胚胎干细胞(ESC)系证实在bAP类器官的边界处发育HHEX和PDX1表达细胞的再现性(图6A-6C)。HBP祖细胞诱导需要在前部和后部肠道球体之间的细胞间接触(图3A和图3B)。在边界部位处所有检测到的PDX1阳性细胞中(30个染色的类器官中有30个)(图1D)，边界区域中PDX1阳性细胞占总细胞数的百分比为5％，而在前部和后部区域中分别为0和1％(图1E)。以A-P类器官和后部-后部(P-P)肠道球体组合观察PDX1表达细胞。相比之下，仅在AP类器官中检测到HHEX阳性细胞，而在前-前(AA)或PP组合中均未检测到(图1F和图8)，指示HBP祖细胞的平衡诱导涉及A-P融合。
为了追踪HHEX和PDX1表达细胞的来源，使用未标记的前部和GFP标记的后部肠道球体建立bAP类器官。申请人发现HHEX和PDX1表达均与GFP重叠，表明HBP祖细胞源自后部肠道(图9A)。D8、D9、D11和D12微解剖的前部、边界和后部区域的RNA测序示出，在D11和D12的边界组织逐渐表达HBP规格标志物的阵列，而前部或后部区域分别获得前肠道或中/后肠道身份(图1G)。值得注意的是，与AP重组实验一致，后部组织与边界区域具有更接近的身份(图1G)。综上所述，在不存在外源诱导因子的情况下，AP边界策略统筹HHEX和PDX1阳性HBP祖细胞的自主模式化。
申请人进一步建立报告基因人iPSC，以通过使用CRISPR/Cas9基因组编辑在肝脏、胆管和胰腺的共同祖细胞标志物(prospero相关的同源盒1(PROX1))下观测tdTomato来追踪其去向(图2A)。类似于HHEX和PDX1，PROX1表达在D10在边界处开始并且然后增加(图2B)。PROX1的出现对AP类器官具有特异性，但不是以AA和PP组合(图2C)。AP重组测定表明PROX1阳性细胞也源自后部肠道细胞(图9B和9C)。空气-液体界面培养诱导的PROX1阳性区的附加生长，如在E8.75 Prox1::EGFP小鼠胚胎肝脏组织中看到(图2D)。PROX1免疫染色证实，由bAP类器官诱导的形态上内陷组织与在E8.5-8.75的小鼠的边界区域类似(图2E)。
为了描述HBP祖细胞的自诱导机制，申请人评估已知诱导信号传导途径的边界特异性表达谱。在FGF、BMP、HH(hedgehog)、NOTCH和RA(视黄酸)信号中，RNAseq鉴定RA下游的信号在边界区域明显地激活，但在D11的前部或后部区域中没有激活(图2F和表1)。
表1.RNA测序的基因本体分析(与图2E有关)
Figure BDA0002909826820000231
Figure BDA0002909826820000241
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作为支持，申请人将在D9的bAP类器官暴露于各种RA信号传导激动剂或拮抗剂。RA受体拮抗剂BMS493强烈抑制HHEX和PDX1两者的基因表达(图2G)。动物研究表明，RA信号传导在成为肝-胆-胰系统的谱系规格中具有重要作用20,21。在体内规格期间，侧板中胚层群充当RA信号传导的激活剂22-24。为了在模型系统中暗示RA的细胞来源，在分离的上皮和非上皮细胞群中评估RA信号有关基因。FACS分析示出在前部肠道细胞中存在90.3％上皮细胞粘附分子(EpCAM)阳性上皮细胞，然而在后部肠道细胞中存在94.8％EpCAM阳性(图5)。有趣的是，前部非上皮细胞，但不在其它群中，高度表达RA合成基因醛脱氢酶1家族成员A2(ALDH1A2)，类似于先前体内动物模型研究(图2H)。对此进行补充，在融合之前仅将后部肠道球体(并且前部肠道球体不)暴露于BMS493抑制HHEX和PDX1的蛋白水平诱导(图10)。在具有BMS493的整个胚胎培养系统中培养的E9.0 PROX1::GFP报告基因小鼠胚胎，在2天后也显示出对PROX1表达细胞的显著抑制(图11A和11B)。结合在一起，衍生自在边界类器官模型系统中的后部区域的HBP祖细胞自规格受RA信号调节，并可由共分化前部非上皮，最可能间充质谱系支持。
已经注意到，干细胞衍生的胚胎内胚层细胞具有很高的可塑性，并且通常生成肠组织18,25。为了检查在体内是否有从祖细胞形成HBP组织的能力，已执行将人PROX1表达类器官移植到免疫缺陷小鼠中。一个月移植物衍生的组织显示小肠组织标志物角蛋白20(CK20)、CDX2和EpCAM，但是其它HBP标志物的可忽略的表达(图2I)。此外，十二指肠制造者受体辅助蛋白6(REEP6/DP1L1)和SOX9表达模式通知这些人类组织最类似于十二指肠组织(图2I)。这些结果指示，尽管存在HBP祖细胞，但异位移植的类器官倾向于在体内发育肠组织。
因为HBP类器官在体内主要生成十二指肠组织，所以申请人接下来从D13边界类器官切除PROX1阳性区域，并以不同的形式对其进行培养，以有效地建模HBP器官发生(图3A和B)。惊人地，在各种测试的培养条件中(图12)，将切除的组织在没有特异性生长因子的Transwell上的基质胶滴中培养两周；大部分PROX1组织发育成空间组织内陷上皮，并形成支化结构(图3b)。相比之下，仅少量在漂浮条件下培养的PROX1阳性上皮或未解剖的类器官内陷(图3B)。时程成像示出，在培养的2天期间，解剖的PROX1阳性组织从上皮形态变成更旋绕的结构(图3C)。约D25，类器官的PROX1上皮部分开始内陷。随后，PROX1阳性区域开始在多个方向上向外生长，经由逐渐内陷形成支化结构(图3D和D)。在A-A和P-P组合中未观察到支化结构(图13)。此外，仅最初表达PDX1但是从bAP类器官解剖的后部肠道球体不能够生长内陷结构(图14)。
为了确定长期培养是否可产生更成熟的组织，将类器官培养到D90。D90类器官在形态上类似于小鼠E14.5外植入的器官培养物(图3F)。H&E染色示出，长期培养的类器官在形态上含有肝脏、胰腺、胆管和肠组织(图3G)。此外，免疫荧光染色检测到在类器官中胰腺标志物PDX1和NGN3、肝脏标志物PROX1以及胆管标志物CK19和SOX9的表达(图3H)。α-SMA表达间充质细胞包裹在胆管SOX17+细胞周围，类似于发育中的胆囊组织26(图3h)。肝标志物AFP和白蛋白，胰腺标志物PDX1、NKX6.1和GATA4以及胆管标志物DBA和SOX9的免疫荧光和整体染色证实，在培养多于30天之后，每个组织谱系都从相同的边界类器官分离出来(图3I-L和图15A-15B)。NKX6.1、HNF1B和GATA4在PDX1阳性区域上差异表达，并且在PDX1表达细胞旁边观察到胰间充质标志物NKX6.3表达，如在体内发育胰腺中看到(图3I-L和图15A-15C)。值得注意地，胆管和胰腺组织在支化类器官中直接连接，如由DBA、SOX9和PDX1的整体共染色以及通过掺入荧光素标记的胆酸(CLF)的能力证实(图3K和3K'以及图15C)。此外，在90天时，在类器官中鉴定表达外分泌标志物淀粉酶和GATA4的胰区域(图3M)。给定在类器官中的胆囊收缩素A受体(CCKAR)表达(图3N)，将类器官暴露于CCK，并用淀粉酶酶联免疫吸附测定法(ELISA)分析胰的分泌功能。与未处理的对照相比，第二天管结构收缩，并且CCK处理的组织在上清液中的淀粉酶分泌增加(图3O和3P)。这些结果指示边界类器官策略不仅生成多器官(HBP)组织，而且建立胰腺，尤其是外分泌谱系和胆管的功能连接。
HES1(Hes家族bHLH转录因子1)为调节后部前肠道谱系的转录因子15、27。在Hes1基因敲除啮齿动物中，由于胰-胆器官分隔失败，发生胆系统转化成胰组织8、9。为了阐明HBP类器官是否复制HES1介导的发育过程，申请人通过CRISPR/Cas9系统在PROX1报告基因iPSC上建立了HES1 KO(图4A-4C)，并证实在D20在HES1-/-iPSC衍生的类器官中不存在HES1基因表达(图4D)。HES1-/-类器官在D11在bAP处保留PROX1报告基因活性(图4E)和HHEX/PDX1表达(图4F)。第22天的HES1-/-和HES1+/+类器官的RNAseq示出，与HES1+/+类器官(图4G和图16)相比，在HES1-/-类器官中，报告的作为HES1靶标9,28的与胰腺相关的鼠类基因(包括内分泌标志物)显著上调。qRT-PCR示出，与HES1+/+类器官相比，在HES1-/-类器官中，所有GCG、NEUROG3、INS和NKX2-2的胰基因表达水平上调(GCG：264倍；NEUROG3：29.8倍；INS：212倍)，然而在HES1+/+和HES1-/-类器官中，GCG、INS的表达水平仍均比人类胰腺组织更低(图4H)。而且，与体内啮齿类动物研究一致，与HES1+/+类器官相比，HES1-/-人类器官产生较少的DBA和SOX9阳性管组织，和较多的PDX1阳性的胰结构(图4I和J以及图17)，突出与动物模型研究表型关联性。
干细胞培养中的多器官整合是未解决的关键挑战。本公开展示人类三维前-后部边界系统的生成，所述系统产生在前肠道-中肠道边缘处发育的结构和功能上整合的HBP类器官。
方法
PSC的维持
如先前所描述维持人PSC系。将未分化的hPSC维持在mTeSR1培养基(加拿大温哥华市干细胞技术有限公司(StemCell technologies,Vancouver,Canada))或Stem Fit培养基(日本味之素公司)的无饲养层条件下，在37℃下具有5％CO2/95％空气的恒温箱的用以1/30的稀释基质胶生长因子减少(美国纽约州纽约的康宁公司(Corning Inc.,New York,NY,USA))或以0.25ug/cm2的iMatrix-511(日本飞机公司)包被的板上。
PSC分化成前部和后部肠道球体
使用修改的先前描述的方法18、19诱导hPSC分化成定形内胚层。简单来说，在Accutase(美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技公司)中分离hiPSC的菌落，并将150,000个细胞/mL铺板在基质胶包被的组织培养板(宾夕法尼亚州韦斯特切斯特的VWRScientific Products)上。在第1天将培养基变为含有100ng/mL活化素A(明尼苏达州明尼阿波利斯的安迪生物公司)和50ng/mL骨形态发生蛋白4(BMP4；安迪生物公司)的RPMI 1640培养基加利福尼亚州卡尔斯巴德的生命技术)，在第2天将培养基变为含有100ng/mL活化素A和0.2％胎牛血清(FCS；赛默飞世尔科技公司)的培养基，并且在第3天将培养基变为含有100ng/mL活化素A和2％FCS的培养基。第4-7天，将细胞培养在肠道生长培养基(AdvancedDMEM/F12(赛默飞世尔科技公司)中，其具有15mM HEPES、2mML-谷氨酰胺、青霉素-链霉素、B27(生命技术)和N2(马里兰州罗克维尔的吉毕科(Gibco,Rockville,MD)，对于前部肠道细胞诱导，补充有200ng/mL诺金(NOG；安迪生物公司)、500ng/ml成纤维细胞生长因子4(FGF4；安迪生物公司)和2μM CHIR99021(美国马萨诸塞州剑桥的干细胞试剂公司)，并且对于后部肠道细胞诱导，补充有500ng/ml FGF 4和3μM CHIR99021。将细胞分化培养物维持在37℃，5％CO2/95％空气的气氛中，并且每天更换培养基。
前部-后部边界球体形成
在第7天，通过在37℃下与TrypLE Express(生命技术)一起孵育，将前部或后部肠道细胞解离成单个细胞。将细胞在1000rpm下离心3分钟，在去除上清液后，将沉淀再悬浮于含有10uM的Y-27632二盐酸盐的肠道生长培养基(英国布里斯托尔的Tocris Bioscience)中。将前部或后部肠道细胞悬浮液以10,000个细胞/孔的密度铺板在96孔圆底超低附接板(康宁公司)上，并在37℃下孵育24小时以形成球体。在第8天，将生成的单个前部肠道球体和后部肠道球体在96孔圆底超低附接板上于肠道生长培养基中混合24小时，以形成融合的边界球体(A-P球体)。
肝-胆-胰(HBP)类器官培养物和移植
在第9天，将A-P球状体包埋在基质胶液滴中，并在肠道生长培养基中培养以生成多器官HBP类器官。对于长期培养，在第13天将HBP类器官解剖和/或转移到Transwell进行空气-液体界面培养。将用于球体的培养物维持在37℃，5％CO2/95％空气的气氛中，并且每4天更换肠道生长培养基。将在第13天的单个HBP类器官移植到年龄12周龄的雄性免疫缺陷NSG(NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ)小鼠的肾的囊膜下。所有实验均在CCHMC的机构动物护理和使用委员会的批准(协议IACUC2018 0096)下进行。
H&E染色和免疫组织化学
从基质胶收集球体和类器官，在4％多聚甲醛(PFA)中固定并包埋在石蜡中。切片进行H&E和免疫组织化学染色。第一抗体在表1中列出。免疫组织化学染色通过使用ultraView通用DAB检测试剂盒(瑞士巴塞尔的罗氏诊断公司(Roche Diagnostics,Basel,Switzerland))执行。在显微镜下观察标本。
对于整体免疫组织化学染色，从基质胶收集球状和类器官，并通过在4℃下用细胞回收溶液处理30分钟除去残留的基质胶。用PBS洗涤组织，并在4℃下在4％PFA中固定过夜。固定的样品在室温下通过4％PFA和0.5％Triton X100处理15分钟，并在室温下用0.1％吐温20(西格玛)渗透15分钟。样品在室温下用阻断溶液(1％BSA、0.3％Triton X100)处理1小时，并在4℃下与在封闭溶液中稀释的第一抗体一起孵育过夜。在洗涤之后，在室温下将荧光染料缀合的第二抗体施用到样品2小时。第一和第二抗体在表1中列出。在第二抗体反应之后，将样品洗涤三次。细胞核用DAPI封固溶液染色。
在Nikon A1Rsi倒置共聚焦显微镜下观察染色的切片和整体样品。
RNA分离，RT-qPCR
使用RNeasy迷你试剂盒(德国希尔登的凯杰(Qiagen,Hilden,Germany))分离RNA。使用SuperScript IV First-Strand Synthesis System for RT-PCR(美国加利福尼亚州的英杰(Invitrogen,CA,USA))根据制造商的协议进行逆转录。在QuantStudio 3实时PCR系统(赛默)上使用TaqMan基因表达主混合物(应用生物系统公司(Applied Biosystems))进行qPCR。每个靶向基因的所有引物和探针信息均从Universal ProbeLibrary AssayDesign Center(https://qpcr.probefinder.com/organism.jsp)获得，并且在表2中列出。
RNA测序
根据制造商的用户手册，使用SMART-seq v4超低输入RNA测序试剂盒(ClontechLaboratories)执行RNA测序的样品制备。
简单来说，第一链cDNA的合成由3'SMART-seq CDS引物II A起动，并使用SMART-Seq v4寡核苷酸在转录物的5'末端进行模板切换。PCR引物II A由3'SMART-Seq CDS引物IIA和SMART-Seq v4寡核苷酸通过PCR引入的SMART序列扩增cDNA。通过固定在AMPure XP珠粒上纯化PCR扩增的cDNA。然后用80％乙醇洗涤珠粒，并用洗脱缓冲液洗脱cDNA。根据试剂盒用户手册，使用Agilent 2100生物分析仪和安捷伦高灵敏度DNA试剂盒(安捷伦)对扩增的cDNA进行验证。用Nextera XT DNA文库制备试剂盒(依诺米那(Illumina))处理用于测序的SMART-Seq v4超低输入RNA试剂盒的全长cDNA输出。
用Kallisto软件编译RNA谱，并表示为每百万转录本(TPM)。首先通过在至少与1个样品中需要大于0的阈值过滤的数据集进行基于与FGF、BMP、Hedgehog，NOTCH和RA信号传导途径相关基因集的基因功能分类。基因集的列表从分子特征数据库(MolecularSignatures Database)(版本6.2)中获得。通过使用Cluster 3.0软件对过滤的数据集进行无偏聚类分析。在每个聚类中包括的基因集的详情在表3中列出。
流式细胞术。
对于流式细胞术，前部肠道细胞从GFP标签的iPSC分化，并且后部肠道细胞从mCherry标记的iPSC分化。在第13天，通过在37℃下对TrypLE Express处理10分钟，将A-P球体解离为单个细胞。在PBS洗涤后，将单细胞与BV421缀合的EpCAM抗体(BioLegend)一起在室温下孵育30分钟。在PBS洗涤后，通过BD FACS AriaII(碧迪生物科学公司(BDBiosciences))执行细胞分选。通过BD FACS DIVA软件和FlowJo(FlowJo公司)执行分析。
CRISPR编辑
编码Cas9-2A-GFP的质粒获自addgene(#44719，doi：10.1016/j.stem.2013.03.006)。通过集成DNA技术公司(Integrated DNA Technologies)合成靶向PROX1或HES1的N末端的向导RNA，将其克隆到pGL3-U6-sgRNA-PGK-嘌呤霉素载体(addgene#51133，doi：10.1038/nmeth.2857)中，并且使用RV3通用引物测序。为了构建HDR模板，从基因组DNA中独立扩增PROX1起始密码子侧翼的同源臂，并且然后使用高保真taq聚合酶iProof(伯乐(Bio-Rad))经由重叠延伸PCR将其融合到tdTomato。然后将得到的PCR产物克隆到pCR-Blunt II-TOPO克隆载体(英杰)中，并通过Sanger测序证实。
按照制造商的说明，使用Lipofectamine 3000用2μg的每种质粒转染人iPSC。在转染后二十四小时，通过GFP表达对细胞进行分选，以选择阳性转染的细胞。克隆细胞扩增2周，并筛选插入的PROX1-tdTomato或缺失的HES1 exon1序列并进行核型分析。
淀粉酶ELISA。
为了测量类器官的淀粉酶分泌水平，从包埋在基质胶中的类器官中收集200μL的培养物上清液。在培养后48小时的时间点收集培养物上清液，并在-80℃下存储直到使用。将上清液在1,500rpm下离心3分钟，并且使碎片沉淀，并且根据生产商的说明用人淀粉酶ELISA试剂盒测定所得的上清液。
统计和再现性。
使用未配对的双尾学生t检验，Dunn-Holland-Wolfe检验或Welch's t检验执行统计学分析。结果示出平均值±标准差；P值<0.05被视为具有统计学意义。除非另有说明，否则N值是指生物学上独立的重复。为了进行未配对的2组之间的比较，当2个样品独立独立的且样品的方差不相等时，执行非参数Brunner-Munzel检验。为了进行多于2个样品的比较，执行非参数Kruskal-Wallis和事后Dunn-Holland-Wolf检验。
小鼠整个胚胎培养
可使用具有改善的生长的整个胚培养系统(日本东京的池本科学技术(IkemotoScientific Technology,Tokyo,Japan))来进行多器官三维类器官的培养。可将多器官三维类器官转移到含有培养基的无菌玻璃滚瓶中，并用硅塞将烧瓶封闭。转移的类器官的数量取决于它们将被培养多长时间。培养瓶可附接到转鼓上，并在暗处在20rpm和37℃下旋转，同时连续供应有气体混合物(主要20％O2，5％CO2和75％N2，但是O2浓度可用N2平衡修改)。类器官可培养数周(最长的试验为10周)。每5-7天更换一次培养基，并且可基于类器官的长度和培养基成分(如Alb、Amy、C肽水平)监测生存能力和生长。
旋转器型瓶培养系统(池本科学技术有限公司)用于整个胚胎培养。解剖E9.0Prox1-GFP小鼠胚胎，并将其转移到具有补充B27和N2补充剂的Advanced DMEM/F12的培养瓶中。将整个胚胎培养系统内的温度保持在37.0℃。
表2.本研究中使用的抗体
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表3.本研究中使用的qPCR引物
Figure BDA0002909826820000381
Figure BDA0002909826820000391
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除非另外指示，否则所有百分比和比率均按重量计算。
除非另有说明，否则所有百分比和比率均基于总组合物计算。
应理解，在整个说明书中给出的每个最大数值限制包括每个较低的数值限制，如同这类较低的数值限制在本文中明确写出一样。在整个本说明书中给出的每个最小数值限制将包括每个较高数值限制，如同这些较高数值限制在此明确地写出。在整个本说明书中给出的每个数值范围将包括落在这些较宽数值范围内的每个较窄数值范围，如同这些较窄数值范围在此全部明确地写出。
本文所公开的尺寸和值不应理解为严格地限于所叙述的确切数值。实际上，除非另外说明，否则每个这类尺寸旨在意指所叙述的值和围绕所述值的功能上等效的范围两者。举例来说，公开为“20mm”的尺寸旨在意指“约20mm”。
除非明确排除或以其它方式限制，否则本文引用的每个文件，包括任何交叉引用的或相关的专利或申请，均由此以全文引用的方式并入本文中。任何文件的引用均不承认其为本文中所公开或所要求的任何发明的现有技术，或其单独或与任何其它一个参考文献或多个参考文献组合教示、表明或公开任何这类发明。另外，在此文件中的术语的任何意义或定义与以引用方式并入的文件中的相同术语的任何意义或定义冲突的情况下，应以在此文件中赋予所述术语的意义或定义为准。
虽然已经说明并且描述了本发明的特定实施例，但是所属领域中熟习此项技术者将显而易见，可在不脱离本发明的精神和范围的情况下进行多种其它改变和修改。因此，旨在在所附权利要求书中涵盖本发明范围内的所有这类改变和修改。
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Claims (52)

1.一种肝-胆-胰类器官(“HBPO”或“HBP类器官”)，其中所述HBPO具有两种或更多种选自以下的功能：肝组织功能、胆组织功能、外分泌胰功能和内分泌胰组织功能。
2.根据权利要求1所述的HBPO，其中所述多器官三维类器官组合物包含前部区域、后部区域和边界区域，其中所述边界区域表达胰和十二指肠同源盒1(PDX1)和造血表达的同源盒蛋白(HHEX)。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的HBPO，其中所述HBPO包含胆管组织和胰组织。
4.根据权利要求3所述的HBPO，其中所述胆管组织和所述胰组织连接。
5.根据前述权利要求中任一项所述的HBPO，其中所述HBPO包含肝脏细胞、胰腺细胞、胆管细胞和肠细胞。
6.根据前述权利要求中任一项所述的HBPO，其中所述类器官包含内皮细胞。
7.根据前述权利要求中任一项所述的HBPO，其中所述类器官包含间充质细胞。
8.根据前述权利要求中任一项所述的HBPO，其中所述HBPO包含内胚层和中胚层。
9.根据前述权利要求中任一项所述的HBPO，其中所述HBPO具有支化结构。
10.根据前述权利要求中任一项所述的HBPO，其中所述类器官表达功能外分泌标志物，优选地淀粉酶，和内分泌标志物，优选地胰岛素。
11.根据前述权利要求中任一项所述的HBPO，其中所述类器官响应于激素，优选地响应于胆囊收缩素(CCK)分泌淀粉酶。
12.根据前述权利要求中任一项所述的HBPO，其中所述组合物基本上不含粘膜下腺、过渡区域、血管系统、免疫细胞或粘膜下层中的一种或多种。
13.根据前述权利要求中任一项所述的HBPO，其中所述HBPO通过扩增一个或多个前体细胞获得。
14.一种制备肝-胆-胰类器官(“HBPO”或“HBP类器官”)的方法，其包含
使第一定形内胚层与Wnt信号传导途径激活剂、FGF信号传导途径激活剂和BMP信号传导途径抑制剂接触以形成前部肠道球体；
使第二定形内胚层使Wnt信号传导途径激活剂和FGF信号传导途径激活剂接触以形成后部肠道球体；
使所述前部肠道球体与所述后部肠道球体接触，直到所述前部肠道球体和所述后部肠道球体融合以形成具有前肠道-中肠道边界的边界类器官；和
培养具有所述前肠道-中肠道边界的所述边界类器官以形成所述HBPO；
其中所述HBPO包含胆组织和胰组织。
15.根据权利要求16所述的方法，其中所述HBPO包含肝脏组织、胰组织、胆管组织和肠组织。
16.根据权利要求14或15所述的方法，其中所述前部肠道球体包含表达SRY-盒2(SOX2)的细胞。
17.根据权利要求14到16中任一项所述的方法，其中所述前部肠道球体基本上不含胰和十二指肠同源盒1(PDX1)表达细胞。
18.根据权利要求14到17中任一项所述的方法，其中所述后部肠道球体包含表达胰和十二指肠同源盒1(PDX1)的细胞。
19.根据权利要求14到18中任一项所述的方法，其中所述后部肠道球体包含表达尾侧型同源盒2(CDX2)的细胞。
20.根据权利要求14到19中任一项所述的方法，其中所述边界类器官包含表达胰和十二指肠同源盒1(PDX1)的细胞、表达造血表达的同源盒蛋白(HHEX)的细胞，和表达Prospero有关的同源盒1(PROX1)的细胞。
21.根据权利要求14到20中任一项所述的方法，其中所述后部肠道球体表达CDX2。
22.根据权利要求14到21中任一项所述的方法，其中所述边界类器官包埋到形态发生因子中，优选地基底膜基质，更优选地基质胶。
23.根据权利要求14到22中任一项所述的方法，其还包含从所述边界类器官切除PROX1阳性区域，并且培养所述切除的边界类器官以形成内陷上皮和支化结构。
24.根据权利要求14到23中任一项所述的方法，其中所述HBPO在旋转下培养。
25.根据权利要求14到24中任一项所述的方法，其中将所述HBPO移植到哺乳动物(如非人类哺乳动物)中一段时间，以增加所述HBPO的生长和成熟，优选地其中移植所述HBPO以拯救器官功能障碍。
26.根据权利要求14到25中任一项所述的方法，其中前部肠道球体的特征在于SRY-盒2(SOX2)表达。
27.根据权利要求14到26中任一项所述的方法，其中所述后部肠道球体的特征在于尾侧型同源盒2(CDX2)表达。
28.根据权利要求14到27中任一项所述的方法，其中所述融合的前部肠道球体和所述后部肠道球体包含胆-胰原基，其特征在于SOX2、CDX2、HHEX和PDX1的表达，并且其中PDX1表达局限于所述融合的前部肠道球体和所述后部肠道球体的边界区域。
29.权利要求14到28中的任一项所述的方法，其中所述多器官三维类器官包含内胚层和中胚层。
30.根据权利要求14到29中任一项所述的方法，其中所述定形内胚层衍生自选自以下的前体细胞：胚胎干细胞、胚胎生殖细胞、诱导多能干细胞、中胚层细胞、定形内胚层细胞、后部内胚层细胞、后部内胚层细胞和后肠道细胞，优选地定形内胚层衍生自多能干细胞，更优选地定形内胚层衍生自选自以下的多能干细胞：胚胎干细胞、成体干细胞，或诱导多能干细胞。
31.根据权利要求14到30中任一项所述的方法，其中所述定形内胚层衍生自使多能干细胞与一种或多种选自以下的分子接触：活化素、生长因子的TGF-β超家族的BMP子群；Nodal、活化素A、活化素B、BMP4、Wnt3a和其组合。
32.根据权利要求14到31中任一项所述的方法，其中所述WNT信号传导途径激活剂选自一种或多种选自由以下组成的组的分子：Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt9a、Wnt9b、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11、Wnt16、GSKβ抑制剂(例如CHIR99021，即“CHIRON”)、BIO、LY2090314、SB-216763、锂、豪猪抑制剂IWP、LGK974、C59、SFRP抑制剂WAY-316606，β-连环蛋白激活剂DCA。
33.根据权利要求14到32中任一项所述的方法，其中所述FGF信号传导途径激活剂选自一种或多种选自由以下组成的组的分子：FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF10、FGF11、FGF12、FGF13、FGF14、FGF15、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF20、FGF21、FGF22、FGF23和其组合，优选地FGF4或FGF10或其组合。
34.根据权利要求14到33中任一项所述的方法，其中所述BMP信号传导途径抑制剂选自诺金(Noggin)、德索莫啡(Dorsomorphin)、LDN189、DMH-1和其组合，优选地其中所述BMP信号传导途径抑制剂为诺金。
35.根据权利要求14到34中任一项所述的方法，其中所述方法在体外进行。
36.根据权利要求14到35中任一项所述的方法，其中所述方法中的至少一个步骤在固体支持物上进行。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述固体支持物选自胶原蛋白、基底膜基质(基质胶)或其组合。
38.一种用于制备具有内皮的HBPO的方法，其包含将根据权利要求1所述的HBPO与衍生自诱导多能干细胞的内皮细胞一起培养的步骤。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述内皮细胞形成为内皮细胞(EC)球体，然后与所述HBPO一起进行所述培养。
40.一种用于制备具有间充质的HBPO的方法，其包含将根据权利要求1所述的HBPO与衍生自诱导多能干细胞的间充质细胞一起培养的步骤。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述间充质细胞形成为间充质细胞(MC)球体，然后与所述HBPO一起进行所述培养。
42.一种制备肝-胆-胰类器官(“HBPO”)的方法，其包含
从前部肠道细胞衍生前部肠道球体，并且从后部肠道细胞衍生后部肠道球体，以制备边界类器官；和
在肠道生长培养基中培养所述边界类器官以制备所述HBPO。
43.一种制备肝-胆-胰类器官(“HBPO”)的方法，其包含
在不存在诱导因子的情况下，从前部肠道细胞衍生前部肠道球体并且从后部肠道细胞衍生后部肠道球体，以制备所述HBPO；和
在肠道生长培养基中培养所述边界类器官以制备HBPO。
44.一种制备肝-胆-胰类器官(“HBPO”)的方法，其包含
在肠道生长培养基中培养从多能干细胞(PSC)分化的定形内胚层(DE)，以制备前部肠道细胞和后部肠道细胞，
在不存在诱导因子的情况下，从前部肠道细胞制备前部肠道球体并且从后部肠道细胞制备后部肠道球体，以制备边界类器官；和
(iii)在肠生长培养基中培养边界类器官，以制备HBPO。
45.根据权利要求42到44中任一项所述的方法，其中所述肠道生长培养基为包含ROCK抑制剂的培养基。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述ROCK抑制剂为Y到27632。
47.一种HBPO或边界类器官，通过根据前述权利要求中任一项生产。
48.一种用于生产HBPO或边界类器官的机器，其包含
在存在或不存在BMP信号传导途径抑制剂的情况下含有Wnt信号传导途径激活剂和FGF信号传导途径激活剂的肠道生长培养基；和
含有ROCK抑制剂的肠生长培养基。
49.一种用于生产HBPO或边界类器官的多种培养基的用途，
其中所述多种培养基包含含有Wnt信号传导途径激活剂和FGF信号传导途径激活剂，任选地包含BMP信号传导途径抑制剂的肠道生长培养基；和
含有ROCK抑制剂的肠生长培养基。
50.一种治疗个体的方法，其包含在所述个体中移植根据前述权利要求中任一项所述的HBPO。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述个体具有选自以下的疾病状态：肝疾病(如肝脏衰竭和先天性肝脏疾病)、胰疾病(如糖尿病)或胆疾病。
52.一种鉴定胆炎性疾病和胰炎性疾病(如胰腺炎)中的一种或多种的治疗的方法，其包含使感兴趣的潜在治疗剂与根据前述权利要求中任一项所述的类器官接触，检测器官活动的度量，和确定所述感兴趣的潜在治疗剂是否改善所述疾病状态的所述度量。
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