DE102007020302A1 - Verbesserte dreidimensionale biokompatible Gerüststruktur, die Nanopartikel beinhaltet - Google Patents

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Zellkultursystem, das eine dreidimensionale biokompatible Gerüststruktur und biokompatible Nanopartikel umfasst, ein Verfahren zur Kultivierung von Zellen, die Bereitstellung von Zellen oder Zellprodukten und Geweben sowie von Zellen oder Zellprodukten und Geweben an sich mittels eines solchen Zellkultursystems.

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Zellkultursystem, das eine dreidimensionale biokompatible Gerüststruktur und Nanopartikel beinhaltet. Weiterhin umfasst die vorliegende Erfindung auch Verfahren zur Herstellung eines solchen Zellkultursystems sowie Verfahren zur Kultivierung von Zellen mittels dieses Zellkultursystems.
  • Zellen werden in vivo von einer komplexen, dynamischen Mikroumwelt umgeben, die insbesondere aus der extrazellulären Matrix (ECM), Wachstumsfaktoren, Cytokinen und benachbarten Zellen besteht. Die extrazelluläre Matrix ist in allen vier Grundgewebetypen, nämlich Epithel-, Muskel-, Nerven- sowie Binde- und Stützgewebe vorhanden. Neben ihrer Funktion als Stützgerüst, die lange Zeit als Hauptaufgabe gesehen wurde, dient die ECM vor allem einem interaktiven Signalaustausch durch Transmembranrezeptoren der Zellen. Durch diese Form der Kommunikation wirkt sie sich auch auf die Regulation der Genexpression aus. Dies spielt eine wichtige Rolle bei essentiellen Zelleigenschaften, wie Adhäsion, Proliferation, Differenzierung, Migration, Apoptose und Umbauprozessen. Die ECM stellt kein statisches System dar, vielmehr befinden sich die Komponenten der ECM in einem „Fließgleichgewicht". Komponenten der ECM werden von Zellen in den Interzellularraum (der Raum zwischen den Zellen) sezerniert und synthetisiert, können aber auch gleichzeitig wieder von den Zellen abgebaut werden. Die extrazelluläre Matrix besteht aus drei Hauptkomponenten: Kollagenfasern, Ankerproteine und raumfüllende Kohlenhydrate. Die Basalmembran ist eine Proteinschicht, die als spezialisierte extrazelluläre Matrix angesehen werden kann. Sie stellt eine stabilisierende Schicht dar und grenzt Oberflächenepithelien gegenüber dem Bindegewebe ab. Da durch wird verhindert, dass die Zellen dieser Schichten auseinander gleiten.
  • Eine Komponente der extrazellulären Matrix stellen faserbildende Proteine dar. Kollagene sind dabei die vorherrschende Proteinfamile der ECM. Sie bilden verschiedene Arten von Fasern und sind in fast jedem Gewebe vorhanden. Große Teile der ECM werden von dem fibrillären Kollagen Typ 1 gebildet, während in der Basalmembran Kollagen vom Typ IV eine wichtige Rolle spielt. Elastische Fasern setzen sich aus den Proteinen Fibrillin und Elastin zusammen. Innerhalb der ECM stellen Kohlenhydrate eine weitere wichtige Komponente dar. Darunter zählen auch Glycosaminoglykane (GAG). Glycosaminoglykane sind Proteine, die mit langkettigen Polysacchariden bestimmter Einzelbausteine assoziiert sind. Lagern sich Glycosaminoglykane zu größeren Makromolekülen zusammen, so entstehen Proteoglykane. Wesentliche Merkmale und Eigenschaften der ECM ergeben sich aus der Vielfalt und den Interaktionen von Proteinen, Glycosaminoglykanen und Proteoglykanen. Weitere Kohlenhydratkomponenten der ECM stellen Hyaluronsäure, Heparansulfat, Dermatansulfat, Chondroitinsulfat und Keratansulfat dar.
  • Eine weitere kennzeichnende Komponente der extrazellulären Matrix sind Adhäsionsproteine. Adhäsionsproteine, Adpaterproteine oder andere adhäsive Proteine können zum einen mit anderen Bestandteilen der Matrix, zum anderen aber auch mit weiteren Zellen durch Anheftung an bestimmte Zellrezeptoren interagieren. Beispiele für Adhäsionsproteine stellen die Proteinfamilie der Laminine, Vitronektin und Fibronektin dar.
  • Die Basalmembran als spezialisierte extrazelluläre Matrix enthält verschiedene wesentliche Komponenten. Als erstes sind hierbei Kollagene vom Typ I bis IV zu nennen, wobei Typ IV eine besondere Bedeutung zukommt. Laminine stellen einen weiteren Bestandteil der Basalmembran dar. Sie besitzen eine schwertähnliche Form. Ihre Enden sind mit Zellrezeptoren besetzt, die hauptsächlich an Integrine binden. Laminin 1 ist die wichtigste Adhäsionskomponente, weiterhin kommt Laminin 5 als entscheidender Bestandteil der Basalmembran besondere Bedeutung zu. Eine besondere Bedeutung kommt Entactin (Nidogen) als weitere Komponente der Basalmembran zu, da es die Kollagenschichten mit den Lamininschichten verbindet. Schließlich werden durch Proteoglykane wie Perlecan die einzelnen Komponenten der Basalmembran verknüpft, da Perlecan in seiner Struktur Bindungsstellen für Kollagen, Laminin, Nidogen und sich selbst aufweist.
  • Zuletzt sind als weitere wichtige Elemente der extrazellulären Matrix Zellrezeptoren zu nennen. Zellmembranproteine wie die Integrinfamilie spielen in diesem Zusammenhang für die Zelladhäsion eine entscheidende Rolle. Integrine sind heterodimere Proteine, die aus verschiedenen alpha- und beta-Untereinheiten aufgebaut sein können. Je nach Zusammensetzung der alpha- beziehungsweise beta-Untereinheiten der Integrine können diese an die extrazelluläre Matrix, so zum Beispiel an Laminin, Vitronektin oder Fibronektin binden.
  • Für die Kultivierung von Zellen ist es ein Ziel, die extrazelluläre Matrix als natürliche Umgebung der Zellen möglichst genau nachzubilden. Neben den Bestandteilen der extrazellulären Matrix ist es auch wünschenswert, weitere biologisch bedeutsame Stoffe wie Wachstumsfaktoren gezielt in diese ECM-Strukturen einbringen zu können.
  • Bisher findet die Kultivierung von primären Zellen, die aus Gewebe isoliert werden, häufig in mit Kunststoff beschichteten Zellkulturgefäßen statt. Diese Umgebung entspricht jedoch nicht den natürlichen, physiologischen Bedingungen der Zellen und führt deshalb sehr oft zum Funktionsverlust, zur Dedifferenzierung der Zellen und schlimmstenfalls zum Zelltod. Bisher bekannte Verbesserungen der Zellkulturgefäße bestehen darin, die Oberfläche mit einzelnen natürlichen Bestandteilen der extrazellulären Matrix wie Kollagenfasern oder Fibronektin zu beschichten. Diese werden jedoch nicht spezifisch an den Zelltyp angepasst und sind zudem undefiniert aufgetragen. Bekannt ist auch die Kultivierung von Zellen in wirkstoffhaltigen gelartigen Strukturen. Als nachteilig erweist sich unter anderem, dass die Wirkstoffe unkontrolliert bei einem gegebenenfalls erforderlich werdendem Mediumwechsel herausgewaschen werden.
  • Des weiteren besteht die Möglichkeit, Zellen in Zellkulturmedien zu kultivieren, in denen die Wirkstoffe bereits in gelöster Form vorliegen. Die Wirkstoffe stehen somit zwar den Zellen unmittelbar zur Verfügung, jedoch besteht ein Nachteil darin, dass diese unter Umständen schnell verbraucht werden und ihre Konzentration den jeweiligen Differenzierungs- und Wachstumsphasen der kultivierten Zellen nicht kontrolliert angepasst werden können.
  • Aus der DE 10144252 A1 und der DE 10031859 A1 sind Nanopartikel und deren Anwendung für Identifizierungs- und Screeningverfahren bekannt. Gemäß dieser Offenbarungen können die Nanopartikel auch bestimmte biologisch aktive Substanzen erkennen oder trägem.
  • Zur Herstellung von Nanopartikeln stellt die Emulsionspolymerisation ein Spezialverfahren der Polymerisation dar, bei dem wasserunlösliche Monomere mit Hilfe von Emulgatoren in Wasser emulgiert und unter Verwendung wasserlöslicher Initiatoren, zum Beispiel Kaliumpersulfat, polymerisiert werden. Die bei der Emulsionspolymerisation anfallenden Polymerdispersionen, zum Beispiel Latex-Dispersionen, können für eine Vielzahl von Anwendungen eingesetzt werden. Die US 4,521,317 und US 4,021,364 zeigen Möglichkeiten und Grenzen der Emulsionspolymerisation auf.
  • Im Rahmen von Emulsionspolymerisationen können grundsätzlich zwei Typen von Emulsionen eingesetzt werden: die Öl-in-Wasser-Emulsion und die Wasser-in-Öl-Emulsion, auch inverse Emulsion genannt. In beiden Fällen wird ein im Reaktionsmedium unlösliches Monomer unter Rühren mittels Emulgatorzugabe dispergiert und die Reaktion durch Zugabe eines Initiators gestartet.
  • Der vorliegenden Erfindung liegt das technische Problem zugrunde, ein Zellkultursystem bereitzustellen, das zum einen der nativen extrazellulären Matrix als natürliche Umgebung der Zellen sehr nahe kommt und zum anderen die kontrollierte Zufuhr von Wachstumsfaktoren und Cytokinen ermöglicht, um das Zellwachstum und die Zelldifferenzierung gezielt steuern und auch gewebespezifisch anpassen zu können. Weiterhin liegt der vorliegenden Erfindung das technische Problem zugrunde, Zellen, insbesondere auch Gewebe und Organe bereitzustellen, die für Transplantationen geeignet sind. Darüber hinaus besteht auch ein Bedarf an speziellen Geweben im Rahmen des sogenannten Tissue engineering sowie für Forschungszwecke.
  • Die vorliegende Erfindung löst das ihr zugrundeliegende technische Problem durch die Bereitstellung eines Zellkultursystems, das eine dreidimensionale biokompatible Gerüststruktur sowie biokompatible Nanopartikel umfasst, sowie durch ein Verfahren zur Kultivierung von Zellen, durch die Bereitstellung von Zellen oder Zellprodukten und Gewebe sowie von Zellen oder Zellprodukten und Gewebe an sich mittels eines solchen Zellkultursystems.
  • Die vorliegende Erfindung stellt demgemäß ein Zellkultursystem bereit, das es ermöglicht, Zellen, insbesondere eukaryotische Zeilen, in besonders bevorzugter Ausführungsform tierische oder menschliche Zellen, unter Bedingungen zu kultivieren, die der in vivo-Situation oder einer erwünschten künstlich ausgerichteten Umgebung entspricht.
  • Die Erfindung beruht insbesondere darauf, dass ein Zellkultursystem bereitgestellt, welches gemeinsam mit einer dreidimensionalen biokompatiblen Gerüststruktur vorliegende biokompatible Nanopartikel aufweist. Ein derartiges System erlaubt es, die in ihm kultivierten Zellen Einflüssen und Bedingungen auszusetzen, die gezielt durch die Anwesenheit der Nanopartikel gesetzt werden und, je nach Zielsetzung der Kultivierung, die Zellen in ihrem biologischen Verhalten, z. B. Wachstums- oder Differenzierungsverhalten beeinflussen. In besonders bevorzugter Ausführungsform können die Nanopartikel Wirkstoffe aufweisen, zum Beispiel, indem sie diese auf der Oberfläche oder im Nanopartikel selbst eingeschlossen aufweisen. Selbstverständlich kann auch vorgesehen sein, dass die Wirkstoffe sowohl auf der Oberfläche als auch im Inneren der Nanopartikel vorliegen. Die auf diese Art und Weise mit den Nanopartikeln verbundenen Wirkstoffe werden im Verlauf des mit dem Zellkultursystem durchgeführten Zellkulturverfahrens kontrolliert und/oder reguliert, insbesondere zeitlich verzögert freigesetzt, und können so dosiert und über einen längeren Zeitraum hinweg kontrolliert den Zellen zugeführt werden. Durch die Kopplung der Nanopartikel mit beispielsweise Wachstumsfaktoren wird so eine gezielte Abgabe dieser Wachstumsfaktoren über einen definierten Zeitraum gewährleistet.
  • Es konnte gezeigt werden, dass Nanopartikel, zum Beispiel aus polymeren Material, als Träger von zum Beispiel Wachstumsfaktoren überraschende Vorteile aufweisen. So kontrollieren Nanopartikel, insbesondere polymere Nanopartikel, als Träger die kontrollierte, d. h. mit einer bestimmten, in der Regel verzögerten Freigabekinetik erfolgende Freigabe von Wirkstoffen, beispielsweise Cytokinen. Dieser Effekt wird auch als controlled release bezeichnet. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist vorgesehen, dass die Freigabe der Wirkstoffe vorbestimmbar in Abhängigkeit von der Zeit reguliert wird und so eine erwünschte und bestimmte Wirkstoff-Freigabe-Kinetik bereitgestellt wird. Erfindungsgemäß kann vorgesehen sein, dass eine erwünschte Wirkstoff-Freigabe-Kinetik durch Auswahl des Nanopartikel-Materials derart ausgestaltet ist, dass eine Freigabe des Wirkstoffs zellspezifisch erfolgt. Beispielsweise kann eine auf die gesamte Freigabedauer bezogene konstante Freisetzungsrate des Wirkstoffs erfolgen. Selbstverständlich kann auch vorgesehen sein, beispielsweise in einer ersten Phase eine zunächst initial geringe Wirkstofffreigaberate und eine nach einem bestimmten Zeitpunkt einsetzende erhöhte Freisetzungsrate vorzusehen. Die Erfindung sieht in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform auch vor, in einer initialen ersten Phase eine vergleichsweise hohe Freisetzungsrate des Wirkstoffes vorzusehen, die nach einem bestimmten Zeitpunkt von einer geringeren Freisetzungsrate abgelöst wird. Durch die Verwendung geeigneter Polymermaterialien zur Herstellung des Nanopartikels ist es erfindungsgemäß auch möglich, zu einem bestimmten Zeitpunkt im Rahmen eines Zellkulturverfahrens eine erwünschte hohe Konzentration eines Wirkstoffes aus dem Nanopartikel in Form eines burst-Effektes freizusetzen. Die Nanopartikel können in bevorzugter Ausführungsform eine solche Wirkstoffbeladung aufweisen, dass die Wirkstoffkonzentration in einem bevorzugten Bereich von 1 ng/ml bis 10 μg/ml nach der Freisetzung liegt.
  • Die Wirkstofffreigabe kann dabei sowohl durch Diffusion des Stoffes aus oder von den Nanopartikeln als auch durch Abbau des Nanopartikels selbst, zum Beispiel durch Hydrolyse des Polymeren, erfolgen.
  • Die Kombination von, insbesondere wirkstoffbeladenen, Nanopartikeln mit einer Gerüststruktur, insbesondere aus Komponenten der extrazellulären Matrix, zeigte weitere überraschende Vorteile. So ist es möglich, eine gezielte und gerichtete Differenzierung von Stammzellen zu erreichen durch Kultivierung der Zellen auf einer Gerüststruktur mit Nanopartikeln, insbesondere einer bestimmten Cytokinbeladung.
  • Weiterhin konnte gezeigt werden, dass insbesondere primäre Zellen durch die Kultivierung in einer Matrix, enthaltend Nanopartikel, gekoppelt mit speziellen Wachstumsfaktoren, eine deutlich höhere Überlebensrate aufwiesen und somit auch eine Langzeitkultivierung dieser empfindlichen Zellen möglich wird.
  • Überraschenderweise konnte gezeigt werden, dass durch die Kultivierung in dem erfindungsgemäßen Zellkultursystem eine gezielte und gerichtete Zellmigration induziert werden kann.
  • Untersuchungen zeigten, dass insbesondere primäre Zellen, die in dem erfindungsgemäßen Zellkultursystem kultiviert wurden, überraschenderweise eine deutlich gesteigerte Proliferation aufwiesen. Darüber hinaus konnte eine deutlich verbesserte Adhäsionseigenschaft an den erfindungsgemäß modifizierten Oberflächen, das heißt dem Zellkultursystem festgestellt werden im Vergleich zu herkömmlichen Zellkulturgefäßen. Die Zellen behielten zudem ihre typischen morphologischen Eigenschaften auch nach mehrtägiger Kultivierung bei. Eine unerwünschte Dedifferenzierung der primären Zellen wird somit durch das erfindungsgemäße Zellkultursystem weitgehend verhindert.
  • Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist unter dem Begriff „Zellkultursystem" ein System zur Kultivierung von Zellen zu verstehen, das insbesondere in Form der in ihm enthaltenden Gerüststruktur, Adhäsionsstellen für zu kultivierende Zellen, vorzugsweise in dreidimensional strukturiertem Aufbau, zum Beispiel als Matrix oder Hydrogel, bereitstellt. Üblicherweise ist ein solches Zellkultursystem bei seinem Gebrauch, vorzugsweise in vitro-Gebrauch, in künstlichen Behältern positioniert, die in der Lage sind, über das Zellkultursystem selbst auch die zu kultivierenden Zellen sowie ein Kulturmedium aufzunehmen.
  • Das Zellkultursystem der vorliegenden Erfindung ist daher insbesondere ein System zur Kultivierung von Zellen in vitro. Das erfindungsgemäße Zellkultursystem kann zur Kultivierung von Zellen in herkömmlichen Zellkulturgefäßen wie Petrischalen oder Zellkulturflaschen oder in irgendeiner anderen Form angewendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das Zellkultursystem zur Kultivierung von primären Zellen verwendet. In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass das erfindungsgemäße Zellkultursystem in vivo eingesetzt wird, z. B. in Tierexperimenten.
  • Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet „Gerüststruktur" eine Struktur zum Anheften von Zellen. Eine Gerüststruktur im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist insbesondere in bevorzugter Ausführung eine Struktur, die nicht allein ein oberflächliches Anhaften oder Adhärieren von Zellen gestattet, sondern darüber hinaus insbesondere auch ein Hineinwachsen oder Integrieren von Zellen in die Gerüststruktur selbst. Die Gerüststruktur stellt be vorzugt eine Matrix dar, vorzugsweise mit Poren oder Zwischenräumen. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält diese Matrix eine oder mehrere Komponenten der extrazellulären Matrix wie Bestandteile der Basalmembran, Adhäsionsproteine, faserbildende Proteine, Kohlenhydrate, Proteoglykane oder Zellrezeptoren.
  • Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ist unter einer „primären Zelle" eine eukaryotische Zelle humanen oder tierischen Ursprungs, die aus Organen oder aus einem Embryo gewonnen wird. Insbesondere ist vorzugsweise ein embryonale Stammzelle als primäre Zelle vorgesehen, vorzugsweise eine solche, die aus Nabelschnurblut gewonnen wird. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ist jedoch vorzugsweise nicht die Verwendung von humanen embryonalen Stammzellen vorgesehen. Die erfindungsgemäß eingesetzte Stammzelle kann eine totipotente, omnipotente oder pluripotente Zelle sein. Weiterhin bevorzugt ist die primäre Zelle eine adulte Stammzelle, z. B. eine tierische oder menschliche adulte Stammzelle.
  • Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet „primäre Zelle" also eine eukaryotische Zelle humanen oder tierischen Ursprungs. Primäre Zellen können aus Organen, wie Haut, Niere oder Leber, oder aus ganzen Embryonen gewonnen werden. Ein Beispiel für eine erfindungsgemäß eingesetzte primäre Zelle ist ein Fibroblast. Die primäre Zelle ist bevorzugt omnipotent oder pluripotent. Eine primäre Zelle kann auch eine adulte Stammzelle sein. Die Zellen werden durch Behandlung mit Trypsin oder durch eine andere Protease behandelt und dadurch aus dem Gewebe isoliert und auch – durch Abbau von interzellulären Verbindungen wie Tight Junctions – vereinzelt. Primäre Zellkulturen von epithelialen Zellen sind ein weiteres Beispiel für primäre Zellen. Im Allgemeinen umkleiden Epithelien externe und interne Oberflächen von Geweben und Organen. Epithelzellen besitzen einen sehr hohen Differenzierungsgrad, der in der Polarisierung der Zellen mit einer apikalen und einer basolateralen Oberfläche zum Ausdruck kommt. Die verschiedenen Oberflächen nehmen unterschiedliche Funktionen wahr. So dient die apikale Oberfläche von Epithelzellen des Darms der Aufnahme von Nährstoffen, während die basolaterale Oberfläche diese Nährstoffe an das Blut weiterleitet und Verbindungen zu benachbarten Zellen sowie zur Basalmembran ausbildet. Primäre Zellen aus Blut, Knochenmark oder Milz adhärieren kaum, können jedoch dennoch in Suspension kultiviert werden. Nach der Behandlung mit Trypsin existieren darüber hinaus Methoden, um aus den isolierten primären Zellen einen gewünschten Subtyp weiter zu selektionieren. So besteht die Möglichkeit durch magnetische Zellseparierungsmethoden oder durch fluorescence activated cell sorting FACS beispielsweise aus dem Knochenmark B-Zellen als primäre Zelle zu isolieren.
  • Eine primäre Zelle kann auch eine, vorzugsweise nicht humane, embryonale Stammzelle sein, bevorzugt eine embryonale Stammzelle, die in besonders bevorzugter Ausführungsform aus Nabelschnurblut gewonnen wurde. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die embryonale Stammzelle ein Zelle, die aus einem Embryo isoliert wurde, der sich in einem Stadium bis zu acht Zellen befindet. Diese embryonale Stammzelle aus dem Achtzellstadium ist eine totipotente Zelle und lässt sich in alle Zellformen der Hauptgewebetypen also endodermal – wie Wandzellen des Verdauungstraktes –, mesodermal – wie Muskeln, Knochen, Blutzellen – und ektodermal – wie Hautzellen und Nervengewebe – differenzieren. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die embryonale Stammzelle eine Zelle, die aus einem Embryo isoliert wurde, der sich in dem Stadium der Blastozyste befindet. Diese embryonale Stammzelle aus dem Blastozystenstadium ist eine pluripotente Zelle und lässt sich in alle Arten von Körperzellen der Hauptgewebetypen, also endodermal, und ektodermal differenzieren, mit Ausnahme der Bildung von plazentalem Gewebe, das nicht mehr gebildet werden kann. Besonderes Kennzeichen von Stammzellen ist, dass diese Zellen fähig sind zum einen während der Zellteilung sich selbst zu replizieren, und damit den Pool an Stammzellen zu erhalten, und gleichzeitig eine differenzierte Zelle hervorzubringen, die dann ein geringeres Differenzierungspotential besitzt. Stammzellen grenzen sich durch sogenannte Marker von differenzierten Zellen ab. Marker können spezielle Proteine sein, die von Stammzellen verstärkt oder in geringerem Maße exprimiert werden. Für murine embryonale Stammzellen sind als Marker SSEA-1, stage-specific embryonic antigen-1, AP-Aktivität, alkalische Phosphatase-Aktivität sowie die Expression des Transkriptionsfaktors Oct-3/4 beschrieben. Die Expression der Markerproteine ist von der Herkunft der Stammzelle abhängig.
  • Die Erfindung betrifft jedoch auch Zellkulturverfahren und Mittel zu deren Durchführung, die nicht-embryonale Stammzellen betreffen, insbesondere verwenden. Eine adulte Stammzelle ist eine Zelle, die nach dem embryonalen Stadium entsteht. Adulte Stammzellen können aus Organen und Geweben, wie Knochenmark, Haut, Fettgewebe, Nabelschnur, Nabelschnurblut, Gehirn, Leber oder Bauchspeicheldrüse isoliert werden und sind in der Regel prädeterminiert, d. h. sie besitzen ein geringeres Differenzierungspotential und sind multi- oder unipotent. Gewöhnlich besitzen isolierte primäre Zellen aus einem Embryo oder einem adulten Säugetier nur eine sehr begrenzte Wachstumsfähigkeit. Bei humanen fetalen Zellen findet nach ihrer Isolierung und Kultivierung zunächst ein gutes Zellwachstum statt. Weiterhin können auch primäre Zellen aus Tumoren isoliert und kultiviert werden. Durch genetische Veränderungen, oncogene Transformationen, werden Regulationsmechanismen, wie Apoptose, außer Kraft gesetzt beziehungsweise positive Wachstumssignale, wie eine Überexpression von Wachstumsrezeptoren, verstärkt. Daher zeigen viele, insbesondere primäre Tumorzellen häufig ein nicht limitiertes Wachstum. Eine besondere Subpopulation von primären Zellen unter Tumorzellen stellen sogenannte Tumorstammzellen dar. Diese konnten als eine sehr kleine Zellfraktion innerhalb bestimmter Tumoren festgestellt werden. Tumorstammzellen sind aus Brustkrebstumoren isoliert und kultiviert worden. Kennzeichnende Markerproteine für diese Brustkrebsstammzellen sind eine hohe CD44-Expression, keine oder eine geringe CD24-Expression und die Abwesenheit von sogenannten Linienmarkern.
  • Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ist unter einer „adulten Stammzelle" insbesondere eine Zelle zu verstehen, die nach dem embryonalen Stadium entstanden ist, gegenüber ausdifferenzierten Zellen ein noch nicht ausgeschöpftes Differenzierungspotential aufweisen, prädeterminiert sind und insbesondere aus Epithelzellen, Endothelzellen, dendritischen Zellen, mesenchymalen Zellen, Adipocyten beziehungsweise insbesondere den entsprechenden Vorläuferzellen aus dem Herzen, der Muskulatur, des Fettgewebes, der Haut und dem Gehirn isoliert werden.
  • Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet „dreidimensional" eine räumliche Ausdehnung in alle drei Raumkoordinaten. Die Ausdehnung kann im Wesentlichen gleichmäßig in diesen drei Richtungen vorliegen, sodass zum Beispiel eine zylindrische Form, eine säulen-, quader- oder würfelförmige Matrixstruktur vorliegt. Es ist aber zum Beispiel auch möglich, dass die Ausdehnung in zwei Richtungen in größerem Ausmaß vorliegt, in die dritte Richtung jedoch nur in geringem Maße, so dass die dreidimensionale Struktur flächig wirkt, zum Beispiel eine Membran oder Schicht darstellt.
  • Im Rahmen der vorliegenden Erfindung bedeutet der Begriff „biokompatibel", dass die Gerüststruktur und die Nanopartikel sowohl hinsichtlich ihrer Materialzusammensetzung als auch hinsichtlich ihrer Struktur in den Zellen, Geweben oder in einem Organismus, insbesondere eines Versuchstiers, keine toxische, apoptotische, unerwünschte immunologische oder sonstige unerwünschte Reaktion hervorruft und zelluläre und molekulare Prozesse auch nach einer möglichen Internalisierung der Nanopartikel oder einem Abbau der Nanopartikel und/oder Gerüststruktur nicht oder kaum stört.
  • Vorzugsweise sieht die Erfindung in einer besonderen Ausführungsform vor, dass die Nanopartikel bioabbaubar oder bioresorbierbar sind, das heißt durch biologische Einflüsse, insbesondere die Einwirkung der kultivierten Zellen, sukzessive abgebaut werden und dabei die vorzugsweise enthaltenen Wirkstoffe freisetzen können.
  • Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden unter Nanopartikeln Partikel verstanden, die einen Durchmesser von 1 bis 1000 nm aufweisen. Derartige Nanopartikel können aus verschiedenen Materialien aufgebaut sein, beispielsweise anorganischen oder organischen Substanzen. In bevorzugter Ausführungsform können deren Oberflächen chemisch reaktive funktionelle Gruppen umfassen, die mit komplementären funktionellen Gruppen von zu bindenden Wirkstoffen affine Bindungen, also kovalente und/oder nicht-kovalente Bindungen, eingehen und auf diese Weise die Wirkstoffe an ihren Oberflächen stabil fixieren können. Die vorliegende Erfindung sieht in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform vor, dass die Nanopartikel auch Bindungen mit der Gerüststruktur eingehen können. Derartige Bindungen sind bevorzugt elektrostatische Wechselwirkungen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform sieht die vorliegende Erfindung ein Zellkultursystem vor, in dem die Nanopartikel einen Durchmesser von 50 bis 1000 nm, vorzugsweise von 50 nm bis 900 nm, bevorzugt von 60 bis 600 nm, aufweisen. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sieht die vorliegende Erfindung ein Zellkultursystem vor, in dem die Nanopartikel einen Durchmesser von 80 bis 150 nm, bevorzugt von 50 bis 150 nm, aufweisen.
  • In einer weiteren Ausführungsform ist es vorgesehen, dass das erfindungsgemäße Zellkultursystem Nanopartikel enthält, die aus anorganischen Substanzen, zum Beispiel Gold oder anderen Edelmetallen oder Metallen oder Metalloxiden, Calciumphosphat und Calciumhydrogensphosphat oder anderen Mischphosphaten, Siliziumbasierten oxidischen Materialien, wie Silicaten, Siliziumoxiden, wie Siliziumdioxid, aufgebaut sind. In bevorzugter Ausführung können die Nanopartikel auch DynaBeads sein.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, dass das erfindungsgemäße Zellkultursystem Nanopartikel enthält, die aus organischen Materialien, insbesondere organischen Polymeren, aufgebaut sind. Die Nanopartikel können bevorzugt im Wege der Emulsionspolymerisation hergestellt werden.
  • Bevorzugt werden Nanopartikel in dem erfindungsgemäßen Zellkultursystem eingesetzt, die aus bioabbaubaren Polymeren aufgebaut sind. Weiterhin bevorzugt ist auch eine Verwendung von Nanopartikeln, die einen Durchmesser von 50 nm und eine bioabbaubare Matrix aufweisen.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist es vorgesehen, dass das erfindungsgemäße Zellkultursystem Nanopartikel enthält, die aus Polylactiden (PLA), Poly(lactid-co-glycolid)en (PLGA), Poly caprolactonen (PCL), Polyglycoliden, Di- und Tri-Block-Polymeren bspw. PCL/PGA-Di-Block-Systemen, Polyorthoestern (POE), Polyanhydride, Polyhydroxyalkanoaten (PHA), Polypyrrolen (PPy), Polypropylencarbonat, Polyethylencarbonat, Polyalkylcyanonitril oder Polyethylenglycol aufgebaut sind.
  • Bevorzugt ist vorgesehen, dass die Nanopartikel je nach gewünschtem Freisetzungsprofil des Wirkstoffs Polymere mit unterschiedlichem Molekulargewicht und variabler Polarität aufweisen. Die Auswahl des für den Aufbau des Nanopartikels einzusetzenden Materials kann in bevorzugter Ausführungsform danach erfolgen, in welcher Form und Kinetik der Wirkstoff freigesetzt werden soll.
  • Insbesondere sieht die Erfindung eine bevorzugte Ausführungsform vor, gemäß der ein Nanopartikel aus verschiedenen Materialien, insbesondere verschiedenen Polymeren, aufgebaut ist, um so eine besonders hohe Variabilität bei der Steuerung des Freisetzungsprofils des freizusetzenden Wirkstoffs erzielen zu können. In einer weiteren Ausführungsform kann selbstverständlich auch vorgesehen werden, dass das erfindungsgemäße Zellkultursystem Nanopartikel aus verschiedenen Materialien aufweist, die in weiter bevorzugter Ausführung wiederum unterschiedliche Wirkstoffe aufweisen. Auch auf diese Art und Weise kann eine zeitlich und/oder räumlich spezifisch definierte Freisetzung von Wirkstoffen erfolgen.
  • In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist also vorgesehen, dass die Nanopartikel Träger von mindestens einem Wirkstoff sind. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung werden unter Wirkstoffen solche Stoffe verstanden, die eine Wirkung auf die zu kultivierenden Zellen ausüben. Bevorzugt sind als derartige Wirkstoffe solche Stoffe, die an der Regulation von Wachstums- und Differenzierungsprozessen der zu kulti vierenden Zellen beteiligt sind, insbesondere kontrollieren, regulieren, determinieren, initiieren oder finalisieren diese Wirkstoffe Wachstums- und Differenzierungsprozesse. Derartige Wirkstoffe können auch an Migrations-, Invasions-, Redifferenzierungs- oder Teilungsvorgängen beteiligt sein. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind die Wirkstoffe solche, die in einer gewünschten und bestimmten besonderen Applikationskinetik den zu kultivierenden Zellen zugeführt werden sollen.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist es vorgesehen, dass das Zellkultursystem Nanopartikel enthält, die in der Gerüststruktur eingeschlossene und/oder auf ihrer Oberfläche aufgebrachte Wirkstoffe aufweisen.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist vorgesehen, dass zum Einschluss von Wirkstoffen, beispielsweise Wachstumsfaktoren, die Wasser-in-Öl-in-Wasser-Technik als bevorzugtes Verfahren zur Herstellung von wirkstoffbeladenen Nanopartikeln, insbesondere PLA- und PLGA-Partikeln, eingesetzt wird.
  • Weiterhin bevorzugt sieht die vorliegende Erfindung dabei ein Zellkultursystem vor, in dem die in die Nanopartikel eingeschlossenen Wirkstoffe Wachstumsfaktoren, Cytokine, Zelladhäsionsproteine wie Integrine, Farbstoffe wie Fluorescenamine, Chemokine, Vitamine, Mineralstoffe, Fette, Proteine, Nährstoffe, faserbildende Proteine, Kohlenhydrate, Adhäsionsproteine, Zellrezeptoren, Pharmazeutika, DNA, RNA, Aptamere, angiogene Faktoren, Lektine, Antikörper, Antikörperfragmente oder Inhibitoren sind.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist vorgesehen, dass das Zellkultursystem Nanopartikel enthält, die Stabilisatoren aufweisen. Bevorzugt stellen dabei die Stabilisatoren Kohlenhydrate, zum Beispiel Trehalose, Proteine, Polyethylenglycole oder Detergentien dar.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist es vorgesehen, dass das Zellkultursystem Nanopartikel enthält, die durch Kopplung mit funktionellen Gruppen funktionalisiert worden sind. In besonders bevorzugter Ausführungsform ist vorgesehen, dass die Nanopartikel selbst funktionelle Gruppen auf ihrer Oberfläche aufweisen.
  • Die vorliegende Erfindung sieht insbesondere vor, dass auf der Oberfläche der Nanopartikel eine erste funktionelle Gruppe 1A aufgebracht ist, die mit einer komplementären Gruppe 2A eines zu immobilisierenden Wirkstoffs eine affine, bevorzugt kovalente Bindung eingehen kann.
  • Erfindungsgemäß ist vorgesehen, dass die erste funktionelle Gruppe 1A ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Aminogruppe, Carboxygruppe, Epoxygruppe, Maleinimidogruppe, Alkylketongruppe, Aldehydgruppe, Hydrazingruppe, Hydrazidgruppe, Thiolgruppe und Thioestergruppe.
  • Erfindungsgemäß ist vorgesehen, dass die funktionelle Gruppe 2A des Wirkstoffs ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Aminogruppe, Carboxygruppe, Epoxygruppe, Maleinimidogruppe, Alkylketongruppe, Aldehydgruppe, Hydrazingruppe, Hydrazidgruppe, Thiolgruppe und Thioestergruppe. Ein erfindungsgemäßer Nanopartikel weist also auf seiner Oberfläche eine erste funktionelle Gruppe 1A auf, die kovalent mit einer funktionellen Gruppe 2A des zu immobilisierenden Wirkstoffs verknüpft ist, wobei die funktionelle Oberflächen-Gruppe 1A eine andere Gruppe als die funktionelle Protein gruppe 2A ist. Die beiden miteinander in Bindung tretenden Gruppen 1A und 2A müssen komplementär zueinander sein, das heißt in der Lage sein, eine kovalente Bindung miteinander einzugehen.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass die Oberfläche des erfindungsgemäßen Nanopartikels funktionelle Gruppen 1B und ein zu immoblisierender Wirkstoff die funktionellen Gruppen 1B bindende komplementäre Gruppen 2B aufweist, wobei die funktionellen Gruppen 1B und 2B erfindungsgemäß insbesondere eine nicht-kovalente Bindung eingehen können.
  • In bevorzugter Ausführungsform der Erfindung ist die zweite funktionelle Gruppe 1B der Oberfläche des Nanopartikels ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Oligohistidingruppe, Strep-Tag I, Strep-Tag II, Desthiobiotin, Biotin, Chitin, Chitinderivate, Chitinbindedomäne, Metallionenchelatkomplex, Streptavidin, Streptactin, Avidin und Neutravidin.
  • Erfindungsgemäß ist die funktionelle Gruppe 2B eines zu immobilisierenden Wirkstoffs ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Oligohistidingruppe, Strep-Tag I, Strep-Tag II, Desthiobiotin, Biotin, Chitin, Chitinderivate, Chitinbindedomäne, Metallionenchelatkomplex, Streptavidin, Streptactin, Avidin und Neutravidin. Ein erfindungsgemäßer Nanopartikel weist also in seiner Oberfläche eine funktionelle Gruppe 1B auf, die nicht-kovalent mit einer funktionellen Gruppe 2B eines Moleküls verknüpft ist, wobei die funktionelle Oberflächengruppe 1B des Nanopartikels eine andere Gruppe als die funktionelle Molekülgruppe 2B ist. Die beiden miteinander in nicht-kovalente Bindung tretenden Gruppen müssen komplementär zueinander sein, das heißt in der Lage sein, eine nicht-kovalente Bindung miteinander einzugehen.
  • Selbstverständlich kann auch vorgesehen sein, dass die Oberfläche des erfindungsgemäßen Nanopartikels und die zu immobilisierenden Wirkstoffe gegebenenfalls sowohl funktionelle Gruppen 1A und 1B sowie 2A und 2B aufweisen.
  • In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist vorgesehen, dass die dreidimensionale Gerüststruktur eine oder mehrere der folgenden Komponenten enthält, nämlich faserbildende Proteine wie Kollagene, elastische Fasern bildende Fibrilline und/oder Elastine, Kohlenhydrate wie Glucosaminglykane, langkettige Polysaccharide, insbesondere Hyaluronsäure, Heparansulfat, Dermatansulfat, Chondroitinsulfat und Keratansulfat, Adhäsionsproteine, zum Beispiel Adapterproteine oder andere adhäsive Proteine, zum Beispiel Laminine, Vitronektin und Fibronektin, Bestandteile der Basalmembran wie Laminine, Entaktin und Proteoglycane sowie Zellrezeptoren für ECM-Komponenten wie Zellmembranproteine.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist vorgesehen, dass die dreidimensionale Gerüststruktur Komponenten der extrazellulären Matrix enthält oder aus diesen besteht, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Laminine, Glycosaminoglykane (GAG), Proteoglykane, Elastin, Kollagene vom Typ I, II, III und IV, Entaktin (Nidogen), Vitronektin, Hyaluronsäure, Heparansulfat, Dermatansulfat, Chondroitinsulfat, Keratansulfat, Perlecan, Adhäsionsproteine und Fibronektin. In bevorzugter Ausführungsform der vorgehenden Erfindung kann die Gerüststruktur aus einer Gerüstgrundstruktur, zum Beispiel Kollagen, insbesondere Kollagenfasern, aufgebaut sein, wobei diese Gerüstgrundstruktur in vorteilhafter und optionaler Weise mit weiteren aus der vorgenannten Gruppe der die Gerüststruktur bildenden Komponenten ausgestaltet ist. So kann die Gerüstgrundstruktur, insbesondere die Kollagengerüststruktur, beispielsweise zusätzlich mit Komponenten ausgestattet sein, die Zelleigenschaften wie Adhäsion und Proliferation begünstigen, zum Beispiel Ankerproteine und/oder Kohlenhydrate.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Zellkultursystems liegt die Gerüststruktur, insbesondere aus Kollagen, in Faserform und/oder in Netzform vor.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, dass die Gerüststruktur, insbesondere aus Kollagen, in dreidimensional netzartig verzweigter Form vorliegt. Die Gerüststruktur kann in bevorzugter Ausführung in hydrogelartiger oder schwammartiger Form vorliegen.
  • Bevorzugt stellt die dreidimensionale biokompatible Gerüststruktur in dem erfindungsgemäßen Zellkultursystem eine extrazelluläre Matrix dar.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, dass die Konzentration von Wirkstoffen im Nanopartikel in einem Bereich von 1 ng/ml bis 10 μg/ml liegt.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist es vorgesehen, dass das Zellkultursystem Nanopartikel enthält, die in dem Zellkultursystem integral in der Gerüststruktur verteilt vorliegen. Die Nanopartikel können in bevorzugter Ausführung homogen in der Gerüststruktur verteilt vorliegen. Es kann in bevorzugter Ausführung aber auch eine heterogene, ungleichmäßige Verteilung der Nanopartikel vorliegen. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform liegen die Nanopartikel in Form mindestens einer Schicht ober- und/oder unterhalb der Gerüststruktur vor. In einer wei teren bevorzugten Ausführungsform liegen die Nanopartikel in Form mindestens einer Schicht oberhalb der Gerüststruktur vor.
  • Bevorzugt sind die Nanopartikel in dem erfindungsgemäßen Zellkultursystem in mehreren Schichten unterhalb der Gerüststruktur angeordnet.
  • Bevorzugt sind die Nanopartikel in dem erfindungsgemäßen Zellkultursystem in mehreren Schichten oberhalb der Gerüststruktur angeordnet.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der mittlere Durchmesser der Nanopartikel stets kleiner oder gleich wie die mittlere Dicke der Gerüststruktur. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist der mittlere Durchmesser aller Nanopartikel stets kleiner als die mittlere Dicke der Gerüststruktur. In einer bevorzugten Ausführungsform liegen bevorzugt alle Nanopartikel, bevorzugt überwiegend oder vollständig, in der Gerüststruktur eingebettet vor. Bevorzugt beträgt das Verhältnis der Abmessungen von Nanopartikel zur Dicke der Gerüststruktur 1:1 oder weniger, bevorzugt 1:10 oder weniger, werter bevorzugt 1:100 oder weniger, weiter bevorzugt 1:1000 oder weniger.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist vorgesehen, dass die Nanopartikel in dem erfindungsgemäßen Zellkultursystem in Form eines Gradienten innerhalb der Gerüststruktur vorliegen.
  • In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass der bevorzugt vorgesehene Wirkstoff in dem erfindungsgemäßen Zellkultursystem in Form eines Gradienten innerhalb der Gerüststruktur vorliegt.
  • Im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung kann der Begriff „Gradient" also die Ausbildung verschiedener Konzentrationen an Nanopartikeln und/oder Wirkstoff innerhalb des erfindungsgemäßen Zellkultursystems, insbesondere der Gerüststruktur, bedeuten, insbesondere eine räumlich abgestufte, an- oder absteigende Konzentration an Nanopartikeln und/oder Wirkstoffen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Wirkstoff-Gradient ausgebildet durch die Verwendung von Nanopartikeln, die unterschiedliche Konzentrationen an einem Wirkstoff aufweisen. Der Wirkstoff kann in dieser bevorzugten Ausführungsform in den Nanopartikeln in unterschiedlicher Konzentration eingeschlossen oder aufgebracht sein. Weiterhin kann der Wirkstoff auch in unterschiedlicher Konzentration durch Bindung über funktionelle Gruppen auf den Nanopartikeln aufgebracht sein. Je nach Anordnung dieser Nanopartikel mit unterschiedlicher Konzentration innerhalb der Gerüststruktur, z. B. eine homogene Verteilung, wird dadurch eine ansteigende Konzentration oder ein Konzentrationsgefälle des Wirkstoffs in dem Zellkultursystem erreicht. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist also vorgesehen, dass ein Wirkstoffgradient dadurch ausgebildet ist, dass Nanopartikel homogen verteilt innerhalb der Gerüststruktur vorliegen, wobei die Nanopartikel verschiedene Wirkstoffkonzentrationen aufweisen und so angeordnet sind, dass ein Wirkstoffgradient gebildet wird. Es ist in bevorzugter Ausführungsform auch vorgesehen, Nanopartikel mit unterschiedlichen Wirkstoffkonzentrationen in räumlich ungleichmäßiger Form, also heterogen, in der Gerüststruktur zu verteilen, insbesondere derartige Nanopartikel in Form eines Nanopartikelgradienten in die Gerüststruktur einzubringen.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist vorgesehen, dass der Wirkstoff-Gradient in dem Zellkultursystem durch Ausbildung eines Nanopartikelgradienten ausgebildet wird, nämlich indem Nanopartikel, in denen eine bestimmte und in den verwendeten Nanopartikeln gleiche Konzentration eines Wirkstoffs eingeschlossen oder an deren Oberfläche aufgebracht ist, räumlich heterogen, das heißt unterschiedlich verteilt in der Gerüststruktur, vorliegen. So führt eine geringere Anzahl dieser Nanopartikel in zum Beispiel einem oberen Bereich der Gerüststruktur, gefolgt von einer höheren Anzahl dieser Nanopartikel in einem darunter liegenden Bereich der Gerüststruktur zu einem Konzentrationsanstieg innerhalb der Gerüststruktur nach unten hin. Umgekehrt führt eine höhere Anzahl dieser Nanopartikel in einem oberen Bereich der Gerüststruktur und eine geringere Anzahl dieser Nanopartikel in einem darunter liegenden Bereich der Gerüststruktur zu einer Konzentrationsabnahme innerhalb der Gerüststruktur nach unten hin.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist es vorgesehen, dass in dem Zellkultursystem eine kontrollierte und verzögerte Wirkstofffreisetzung stattfindet, insbesondere durch die Verwendung bioabbaubarer Nanopartikel. Die erfindungsgemäß bevorzugte kontrollierte Freisetzung von Wirkstoffen kann zusätzlich oder alternativ auch durch Diffusion aus den Nanopartikeln in das umgebende Zellkultursystem, insbesondere in die faser- oder netzartige Gerüststruktur, gewährleistet sein.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist vorgesehen, dass die Nanopartikel mit der Gerüststruktur verbunden sind. In bevorzugter Ausführung ist die Bindung so ausgeführt, dass ein Kulturmediumwechsel nicht zum Ablösen der Nanopartikel von der Gerüststruktur führt. In bevorzugter Ausführung ist die Bindung waschstabil, d. h. die Nanopartikel werden auch bei Wechsel des Kulturmediums und gegebenenfalls erfolgenden Waschschritten mit üblichen Waschmedien, wie Puffern, nicht von der Gerüststruktur abgelöst.
  • Bevorzugt ist vorgesehen, dass die Nanopartikel über elektrostatische Wechselwirkungen mit der Gerüststruktur verbunden sind, insbesondere durch ionische Bindung.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist vorgesehen, dass die Nanopartikel durch UV-Crosslinking mit der Gerüststruktur verbunden sind.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist vorgesehen, dass das Zellkultursystem zur Durchführung von Migrationsversuchen, insbesondere Migrationsversuche in vivo, eingesetzt wird.
  • Darüber hinaus betrifft die Erfindung auch ein Verfahren zur Herstellung eines Zellkultursystems, umfassend eine dreidimensionale biokompatible Gerüststruktur und biokompatible Nanopartikel, wobei die Gerüststruktur mit den Nanopartikeln, z. B. gemäß einer der folgenden Verfahren, in Kontakt gebracht wird.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Lehre ist es vorgesehen, dass das Zellkultursystem durch ein „kontaktloses Printverfahren" hergestellt wird.
  • Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet der Begriff „kontaktloses Printverfahren" ein Verfahren, in dem Nanopartikel ohne Kontakt mit der Oberfläche auf das Substrat übertragen werden. Es existieren unterschiedliche Möglichkeiten, um dies zu erreichen. In einer ersten bevorzugten Ausführungsform ist ein so genanntes Drop an demand mittels Ink Jet-Verfahren vorgesehen. In einer zweiten Ausführungsform ist ein Verfahren mittels Druckkopf oder einzelner Nadeln vorgesehen. In beiden Ausführungsformen werden ein oder mehrere Tropfen einer Suspension auf die gewünschte Stelle übertragen. Bevorzugt werden käufliche Maschinen der Firma Dimatix-FujiFilm- für Ink Jet-Verfahren verwendet. Weiterhin bevorzugt sind auch Maschinen der Firmen microdrop technologies, MicroFab TECHNOLOGIES, Scienion AG und GeSIM mbH, welche einzelne Nadeln besitzen und über einen Computer zur Abgabe von Tropfen punktgenau gesteuert werden können. Im Zusammenhang mit dem vorliegenden Verfahren bedeutet „punktgenau", dass eine Positionierungsgenauigkeit bei allen Verfahren von unter +/–25 μm angegeben wird. Im Rahmen der Positionierungsgenauigkeit ist auch das Tropfenvolumen zu berücksichtigen. Dieses kann mit mindestens 1 pL bei dem Gerät Dimatix DMC-11601 und mit mindestens 100 pL bei dem Gerät Nano-Plotter NP1.2 von Ge-SIM eingestellt werden. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist bevorzugt vorgesehen, dass die Abgabe der Nanopartikelsuspension über ein pneumatisches Verfahren, Vakuum-Verfahren oder über ein piezoelektrisches Verfahren erfolgt. Insbesondere ist bevorzugt vorgesehen, dass die Eindringtiefe der Nanopartikel in das Substrat, insbesondere in die Gerüststruktur des Zellkultursystems, durch das Tropfenvolumen oder die Tropfgeschwindigkeit in den jeweiligen Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens gesteuert wird. Das kontaktlose Printverfahren führt vorzugsweise zu einem schichtartigen Aufbringen der Nanopartikel innerhalb der Gerüststruktur.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Anmeldung ist ein Zellkultursystem vorgesehen, das durch Imprägnieren hergestellt wird, insbesondere, indem eine Gerüststruktur mit einer Nanopartikel-haltigen Suspension durchsetzt wird, zum Beispiel durch Tränken mit einer Nanopartikel-haltigen Suspension.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Zellkultursystem vorgesehen, das durch ein Laser Induced Forward Transfer – LIFT-Verfahren hergestellt wird. Hierzu ist insbesondere vorgesehen, dass zu transportierendes Material, insbesondere einen oder mehrere Bestandteile der extrazellulären Matrix, durch Laserenergie ausgeschnitten und auf ein Zielmaterial aufgebracht wird.
  • Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sieht vor, dass das Zellkultursystem durch Elektrospinning (Spincoating) hergestellt wird. Durch Elektrospinning können vorzugsweise polymere Strukturen mit vorzugsweise einem Faserdurchmesser von bevorzugt 2 bis 20 μm, welche der natürlichen Umgebung der Zellen, nämlich der extrazellulären Matrix, sehr ähnlich sind, hergestellt werden.
  • Die Erfindung betrifft also Verfahren zur Herstellung eines Zellkultursystems, wobei in besonders bevorzugter Ausführungsform vorgesehen ist, die biokompatiblen Nanopartikel beispielsweise im Wege der Lösungsmittelverdunstung der Spontanoues Emulsifaction Solvent Diffusion(SESD)-Methode, der Aussalzung, der Sprühtrocknung oder der Phasenseparation herzustellen.
  • In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, die eingesetzten Nanopartikel im Wege der Lösungsmittelverdunstung, insbesondere der Wasser-in-Öl-in-Wasser-Technik, herzustellen. Gemäß dieses Verfahrens ist es erfindungsgemäß besonders bevorzugt möglich, auch die verschiedensten hydrophilen Wirkstoffe in die Nanopartikel einzuarbeiten. Der im Wasser befindliche Wirk stoff wird dabei in einer polymerhaltigen Ölphase emulgiert. Diese Mischung wird in einer weiteren Wasserphase emulgiert und das organische Lösungsmittel beispielsweise durch Reduzieren des Drucks entfernt. Gemäß einer weiteren Ausführungsform ist es auch möglich, eine Öl/Wasseremulsion (O/W) einzusetzen, insbesondere um hydrophobe Wirkstoffe einzuarbeiten. In dieser Ausführungsform wirkt die Ölphase gleichermaßen als Lösungsmittel für das Polymer wie als Wirkstoff.
  • In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, die erfindungsgemäßen Nanopartikel insbesondere durch die auf Lösungsmittelverdunstung basierende Spontanoues Emulification Sovent Diffsion SESD-Methode herzustellen. Hierzu ist vorgesehen sowohl das Polymer als auch den Wirkstoff in einer organischen Mischung, bevorzugt in Dichlormethan und Aceton, zu lösen und diese Lösung in eine wässrige Phase mit Stabilisator zu überführen und durch Rühren zu emulgieren. Insbesondere ist dabei vorgesehen, dass das hydrophile Lösungsmittel, bevorzugt Aceton, in die umgebende Wasserphase diffundiert und die erfindungsgemäßen Nanopartikel durch Rühren unter reduziertem Druck entstehen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, dass die Partikelgröße durch eine Erhöhung des Anteils an in Wasser mischbaren Lösungsmittel verringert wird.
  • In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, die erfindungsgemäßen Nanopartikel insbesondere durch Aussalzung herzustellen. Insbesondere ist vorgesehen, bei dieser Herstellung auf die Verwendung von Lösungsmitteln zu verzichten. Zur Herstellung wird das Polymer, bevorzugt PVA, zu einer gesättigten Lösung, insbesondere von Magnesiumchlorid oder Magnesiumacetat, gegeben, um so ein viskoses Gel als wässrige Phase zu erhalten. Weiterhin ist insbe sondere vorgesehen, ein bioabbaubares Polymer mit einem Wirkstoff bevorzugt in Aceton als organische Phase zu lösen. Durch Mischen von wässriger und organischer Phase ist vorgesehen, dass die organische Phase im entstehenden Zwei-Phasen-System durch Rühren im Gel emulgiert wird. Bevorzugt ist vorgesehen, dass die erfindungsgemäßen Nanopartikel durch Zugabe von ausreichend Wasser und nach Diffusion von vorzugsweise Aceton in die wässrige Phase ausfallen.
  • In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, die erfindungsgemäßen Nanopartikel insbesondere durch Sprühtrocknung herzustellen. Bevorzugt ist vorgesehen, dass durch Zerstäuben bzw. Atomisieren von Lösungen und Emulsionen, in denen bioabbaubare Polymere und Wirkstoffe gelöst sind, insbesondere unter Zuhilfenahme einer Zweistoffdüse in einem heißen Luftstrom erfindungsgemäße Nanopartikel hergestellt werden.
  • In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, die erfindungsgemäßen Nanopartikel insbesondere durch Phasenseparation – Koazervation – hergestellt werden. Dazu ist insbesondere vorgesehen, bioabbaubaren Polymere in bevorzugt Dichlormethan zu lösen und einen Wirkstoff darin zu dispergieren bzw. zu emulgieren. Weiterhin ist vorgesehen, dass unter Rühren schrittweise bevorzugt Silikon-Öl, das sich nicht mit der organischen Polymerphase vermischt, zugegeben wird und sich eine Phasentrennung vollzieht. Diese Mischung wird unter Zugabe von bevorzugt Heptan weitergerührt, wobei erfindungsgemäße Nanopartikel gewonnen werden können.
  • Bevorzugt betrifft das Verfahren zur Herstellung eines Zellkultursystems gemäß der vorliegenden Erfindung ein Zellkultursystem, das durch kontaktloses Printverfahren hergestellt wird.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Zellkultursystems, das durch Imprägnieren hergestellt wird.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Zellkultursystems, das durch ein LIFT-Verfahren hergestellt wird.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Zellkultursystems, in dem das Zellkultursystem durch Elektrospinning (Spincoating) hergestellt wird.
  • Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Kultivierung von Zellen, indem die Zellen in ein ein Zellkultursystem der vorliegenden Erfindung und ein geeignetes Nährmedium enthaltendes Zellkulturgefäß eingebracht werden und dort unter geeigneten Bedingungen, die eine Kultivierung ermöglichen, kultiviert werden.
  • Bevorzugt sind die kultivierten Zellen eukaryotische Zellen, insbesondere humanen oder tierischen Ursprungs. Weiter bevorzugt sind die kultivierten Zellen primäre Zellen.
  • In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist vorgesehen, dass die zu kultivierende Zelle eine Tumorzelle ist, insbesondere eine Tumorzelllinie wie MCF-7, HeLa, HepG2, PC3, CT-26, A125, A549, MRC-5, CHO, MelJuso28, Nalm6 oder Jurkat.
  • In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist vorgesehen, dass die zu kultivierende Zelle eine adhärente Zelle, insbesondere ein etablierte Zelllinie wie HUVEC oder HaCaT ist.
  • In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft diese ein Verfahren zur Kultivierung von Zellen mittels des erfindungsgemäßen Zellkultursystems, wobei die zu kultivierende Zelle eine ausdifferenzierte Zelle ist.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren, insbesondere ein nicht-therapeutisches Verfahren, zur Herstellung differenzierter Zellen oder Zellverbände aus undifferenzierten Zellen, wobei die undifferenzierten Zellen in dem erfindungsgemäßen Zellkulturverfahren kultiviert und dadurch differenzierte Zellen oder Zellverbände gewonnen werden.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren, insbesondere ein nicht-therapeutisches Verfahren, zur Aufrechterhaltung des Differenzierungsstadiums prädifferenzierter oder differenzierter Zellen, wobei die prädifferenzierten oder differenzierten Zellen in dem erfindungsgemäßen Zellkulturverfahren kultiviert werden. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein vorgenanntes, vorzugsweise nicht-therapeutisches Verfahren, wobei undifferenzierte Zellen in dem erfindungsgemäßen Zellkulturverfahren kultiviert und in diesem undifferenzierten Zustand gehalten werden.
  • Bevorzugt ist vorgesehen, dass die Zellverbände Transplantate oder Testsysteme darstellen.
  • Weiterhin bevorzugt ist vorgesehen, dass die Zellverbände auch Organe, Organteile, insbesondere eine Trachea oder Teile davon sein können.
  • Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung differenzierte Zellen und Zellverbände, die nach erfindungsgemäßer Kultivierung von differenzierten oder undifferenzierten Zellen oder Zellverbänden gewonnen werden, zum Beispiel Transplantate, Testsysteme, Organe, Organteile, insbesondere eine Trachea, oder Teile davon.
  • Die vorliegende Erfindung, insbesondere das vorliegende Zellkulturverfahren, ermöglicht die Langzeitkultivierung von Stamm- und Vorläuferzellen, die für vielfältige Einsatzgebiete verwendet werden können, beispielsweise für Transplantate und Testsysteme, aber auch in der Grundlagenforschung.
  • Die vorliegende Erfindung, insbesondere das vorliegende Zellkulturverfahren, ermöglicht die Proliferation funktioneller Zellen, insbesondere von primären Zellen.
  • Die vorliegende Erfindung, insbesondere das vorliegende Zellkulturverfahren, ermöglicht die gerichtete Differenzierung zu funktionellen Zellen und Geweben, beispielsweise bei der Transplantatherstellung oder auch für Testsysteme bei der Medikamentenentwicklung.
  • Die vorliegende Erfindung, insbesondere das vorliegende Zellkulturverfahren, ermöglicht die Herstellung von Transplantaten zur Heilung chronischer/diabetischer Wunden, beispielsweise mittels Zellmigration induziert durch Nanopartikel.
  • Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Herstellung von Expressionsprodukten einer Zelle, wobei die Zelle gemäß des erfindungsgemäßen Zellkulturverfahrens kultiviert werden und das Expressionsprodukt aus dieser Zellkultur gewonnen wird.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch Expressionsprodukte einer Zelle, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren kultiviert wird und deren Expressionsprodukte gewonnen werden.
  • Weitere Ausführungsformen ergeben sich aus den Unteransprüchen.
  • Ausführungsbeispiele
  • Die vorliegende Erfindung wird anhand der nachstehenden Beispiele und Figuren näher erläutert. Die Beispiele sind nicht beschränkend zu verstehen.
  • 1 zeigt eine REM-Aufnahme von bioabbaubaren Nanopartikeln
  • 2 zeigt das Freisetzungsergebnis der mit 8% BSA beladenen PLGA-Partikel aus Beispiel 1.
  • 3 zeigt Zellen auf einem mit PAH + Carboxy-Nanopartikel beschichteten Objektträger am Tag 1; A) gibt Versuch 1, B) Versuch 2 wieder.
  • 4 zeigt Zellen, die zur Kontrolle in einer Zellkulturflasche kultivierte wurden, aus Versuch 2; A) am Tag 1 und B) am Tag 3.
  • 5 zeigt Zellen, die auf Oberflächen mit Nanopartikeln mit Aminofunktionalisierung sowie anschließende Beschichtung mit Carboxy-Nanopartikeln mit planarer und globulärer Oberfläche kultiviert wurden; A) PAA, Tag 1, Versuch 1, B) PAH+Carboxy-Nanopartikel, Tag 1, Versuch 1, C) PAA, Tag 3, Versuch 2 D), PAH+Carboxy-Nanopartikel, Tag 3, Versuch 2
  • 6 zeigt Zellen, die auf Oberflächen mit Nanopartikeln mit Aminofunktionalisierung sowie anschließende Beschichtung mit Carboxy-Nanopartikeln mit planarer und globulärer Oberfläche kultiviert wurden; A) PAH, Tag 1, Ansatz 3, B) PAA+Amino-Nanopartikel, Tag 1, Ansatz 3, C) PAH, Tag 3, Ansatz 2, D) PAA+Amino-Nanopartikel, Tag 3, Ansatz 2
  • Abkürzungen:
    • PLGA
      = Poly(Lactid-co-glycolid)
      PLA
      = Polylactid
      PCL
      = Polycaprolacton
      PGA
      = Polyglycolid
      PAA
      = Polyacrylsäure
      PAH
      = Polyallylamin-hydrochlorid
      EGF
      = Epidermal Growth Factor
      BMP
      = Bone Morphogenic Protein
      SESD
      = Spontaneous emulsification solvent diffusion method
      MES
      = Morpholinoethansulfonsäure
  • Beispiel 1:
  • Herstellung von BSA-beladenen bioabbaubaren Nanopartikeln aus PLGA mittels Wasser-in-Öl-in-Wasser-Technik (W/O/W)
  • Zuerst werden 120 mg Poly(Lactid-co-Glycolid) in 3,1 mL Dichlormethan gelöst (O-Phase). In dieser Phase wird eine wässrige Lösung des zu verkapselnden Proteins (Bovin Serum Albumin, BSA) mittels Ultraschallbehandlung emulgiert (W/O), dazu wurden 10 mg BSA in 100 μL PBS-Puffer pH 7,4 gelöst. Zum Schutz des Wirkstoffes können unterschiedliche Stabilisatoren, wie Zucker, Proteine, Polyethylenglycole und andere Detergentien, in die wässrige Lösung eingebaut werden. Die hergestellte W/O-Phase wird in einer weiteren Wasserphase (100 mL Wasser + 500 mg Polyvinylalkohol) mittels Ultraschall dispergiert, so dass eine W/O/W-Emulsion entsteht. Das organische Lösemittel der polymerhaltigen O-Phase wird durch Verdampfung entfernt und dadurch das Polymer als Nanopartikel ausgefällt. Die Größe der Partikel beträgt ca. 150 bis 350 nm. Der Einschluss an Wirkstoff liegt dabei bei 5–8 Gew.-%. Durch Einsatz einer größeren Menge an Wirkstoff kann auch eine höhere Beladung erzielt werden.
  • Beispiel 2:
  • Herstellung von mit BMP-2 beladenen bioabbaubaren Nanopartikeln aus PLA mittels W/O/W-Technik
  • 10 mg Polylactid werden in 300 μL Dichlormethan gelöst. Zu dieser Phase werden 10 μL einer wässrigen Lösung des BMP-2 (bone morphogenic protein-2, c = 200 mg/mL) mit 0,05% Lutrol F 68 zugegeben und darin mittels Ultraschall emulgiert.
  • Diese W1/O-Phase wird in einer zweiten wässrigen Phase (10 mL einer 0,5%igen PVA-Lösung) mittels Ultraschall dispergiert. Die Entfernung des Dichlormethan/Aceton-Gemischs der W1/O/W2-Emulsion erfolgt durch Verdampfung am Vakuum. Dabei fallen Nanopartikel mit einer Größe von 100–250 nm aus. Die Wirkstoffbeladung beträgt ca. 10–15 Gew.-% (1).
  • Beispiel 3:
  • Herstellung von BSA-beladenen PLA-Nanopartikeln mittels W/O/W-Methode
  • Zuerst werden 120 mg Polylactid in 3,1 mL Dichlormethan/Aceton (8/2) gelöst (O-Phase). In dieser Phase wird eine wässrige Lösung des zu verkapselnden Proteins (Bovin Serum Albumin, BSA) mittels Ultraschallbehandlung emulgiert (W/O), dazu wurden 10 mg BSA in 100 μL Wasser gelöst. Die hergestellte W/O-Phase wird in einer weiteren Wasserphase (100 mL Wasser mit 0,5% Polyvinylalkohol) mittels Ultraschall dispergiert und eine W/O/W-Emulsion entsteht. Das organische Lösemittel der polymerhaltigen O-Phase wird durch Verdampfung entfernt und dadurch das Polymer als Nanopartikel ausge fällt. Die Größe der Partikel beträgt ca. 150 bis 300 nm. Der Einschluss an Wirkstoff liegt dabei bei 7–8 Gew.-%.
  • Bestimmung der Freisetzungskinetik
  • 50 mg der mit BSA-beladenen Poly(Lactid-co-Glycolid)-Partikel (Resomer® 502 H) werden in 5 mL PBS-Puffer (pH 7,4) suspendiert und bei 37°C im Ölbad gerührt. Es werden pro Probenzug jeweils 300 μL entnommen und zentrifugiert. Das Pellet wurde erneut in PBS-Puffer suspendiert und dem Experiment zurückgeführt.
  • Die quantitative Bestimmung des aus den Partikeln frei werdenden Wirkstoffs erfolgt mittels verschiedener Methoden, wie HPLC, verschiedenen Protein-Assays (Lowry- oder BCA-Assay), Elektronenspinresonanz (ESR) usw. (2).
  • Beispiel 4:
  • Kopplung von Farbstoffen und Proteinen an die Nanopartikel-Oberfläche
  • 10 mg der hergestellten bioabbaubaren PLGA-Nanopartikel (aus Beispiel 1) werden in 0,4 mL 0,1 M MES-Puffer suspendiert. Hierzu werden 300 μL einer Lösung aus Fluoresceinamin (3 mg/mL) gegeben. Es können jedoch auch Proteine wie z. B. Integrine an die Partikeloberfläche gebunden werden. Tropfenweise wird 160 μL EDC-Lösung (c = 110 mg/mL) zugegeben und bei Raumtemperatur über Nacht geschüttelt. Die Suspension wird zentrifugiert und das Pellet in Puffer gewaschen. Es konnte eine Anbindung von 3 μmol Fluoresceinamin pro g Partikel erzielt werden.
  • Beispiel 5:
  • Herstellung von oberflächenmodifizierten Silica-Nanopartikeln für das im Anschluss ausgeführte Beispiel mit Zellen
  • Synthese von Silica-Partikeln:
  • Zu 200 ml Ethanol werden 12 mmol Tetraethoxysilan und 90 mmol NH3 gegeben. Dann wird 24 h bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend werden die Partikel durch mehrfache Zentrifugation gereinigt. Es resultieren 650 mg Silica-Partikel mit einer mittleren Partikelgröße von 125 nm.
  • Aminofunktionalisierung von Silica-Partikeln:
  • Eine 1 Gew.-% wässrige Suspension der Silica-Partikel wird mit 10 Vol.-% 25% Ammoniak versetzt. Dann werden 20 Gew.-% Aminopropyltriethoxysilan, bezogen auf die Partikel, zugegeben und es wird 1 h bei Raumtemperatur gerührt. Die Partikel werden durch mehrfache Zentrifugation gereinigt und tragen funktionelle Aminogruppen auf ihrer Oberfläche (Zeta-Potenzial in 0,1 M Acetat-Puffer: + 35 mV).
  • Carboxyfunktionalisierung von Silica-Partikeln:
  • 10 ml einer 2 Gew.-% Suspension aminofunktionalisierter Nanopartikel werden in Tetrahydrofuran aufgenommen. Dazu werden 260 mg Bernsteinsäureanhydrid gegeben. Nach einer 5-minütigen Behandlung mit Ultraschall wird 1 h bei Raumtemperatur gerührt. Die Partikel werden durch mehrfache Zentrifugation gereinigt und tragen funktionelle Carboxygruppen auf ihrer Oberfläche (Zeta-Potenzial in 0,1 M Acetat-Puffer: – 35 mV). Die mittlere Partikelgröße beträgt 170 nm.
  • Beispiel 6:
  • Optimierte Zellkulturbedingungen durch Nanopartikel-modifizierte Oberflächen
  • Es werden vergleichende Untersuchungen zur Adhäsion, Proliferation, Migration und Differenzierung primärer epidermaler Zellen an den modifizierten Oberflächen durchgeführt. Die modifizierten Oberflächen umfassen neben den Nanopartikeln auch eine faserartige Gerüststruktur. In dieser faserartigen Gerüststruktur liegen die inokulierten Nanopartikel mit einem Abstand von 10 bis 1000 nm vor.
  • Zur Oberflächenmodifikation werden Ojektträger (OT) zunächst mit einer 2% (v/v) Hellmanex II Lösung in einem Wasserbad bei 40°C gereinigt. Eine anschließende Hydroxylierung der Oberflächen erfolgt bei 70°C in einer 3:1 (v/v) NH3 (30%) und H2O2 (25%)-Lösung, um eine negative Ladung zu erzeugen. Vor oder nach der Hydroxylierung erfolgt eine Beschichtung mit beispielsweise einer Kollagenlösung, zum Beispiel Kollagen Typ I, in einer Konzentration von 0,1 bis 6 mg/ml, in an sich bekannter Weise.
  • Die Polyelektrolyt-Beschichtung der Oberflächen entsteht durch die sog. Lager-by-Lager-Technik. Bei der Methode werden die frisch gereinigten und negativ geladenen OT zuerst in eine kationische Poly(allylamin-hydrochlorid)-Lösung (PAH-Lösung) (0,01 M; bezogen auf das Monomer) oder Poly(diallyl-dimethyl-ammoniumchlorid)-Lösung (PDADMAC-Lösung) (0,02 M; bezogen auf das Monomer) gelegt und mindestens 20 min bei Raumtemperatur inkubiert. Für die anschließende Beschichtung mit den Carboxy-Nanopartikeln ist die Ausbildung von nur einer kationischen PE-Schicht ausreichend. Für die Beschichtung mit den Amino-Nanopartikel ist es notwendig, die OT nach PAH-Beschichung 20 min in einer anionischen Polyacrylsäure-Lösung (PAA-Lösung) (0,01 M; bezogen auf das Monomer) zu inkubieren. Die Anbindung der Silica-Nanopartikel erfolgt über elektrostatische Anziehungskräfte. Die Carboxy-Nanopartikel werden von dem kationischen Polyelektrolyt PAH und die Amino-Nanopartikel von dem anionischen Polyelektrolyt PAA angezogen. Anschließend erfolgt die Sterilisation der Oberflächen mit 70% Ethanol.
  • Die Ergebnisse sind für die unterschiedlichen Oberflächenmodifikationen ausführlich in Tabelle 1 dargestellt. Die Tabelle 1 zeigt Beobachtungen zu Morphologie humaner Keratinozyten auf den Carboxy- und Amino-Nanopartikel. Es wurden Versuche zu modifizierten Oberflächen mit Triplikaten mit jeweils n = 3 Proben durchgeführt. Es wurde sowohl die Koloniedichte und damit die adhärente Zellzahl und Proliferation, als auch die Morphologie und damit der Differenzierungszustand der primären Zellen bewertet. Auf den modifizierten Oberflächen mit faserartiger Gerüststruktur findet eine deutlich schnellere Adhäsion und Ausspreizen (3) der Keratinozyten im Gegensatz zur Kulturflasche (4) statt. Besonders die mit Nanopartikeln modifizierten Oberflächen induzieren ein schnelles Ausspreizen, die schon nach wenigen Stunden sichtbar ist.
  • Die Morphologie der primären epidermalen Zellen war auf diesen modifizierten Substraten vergleichbar mit der Zellkulturflasche. Des weiteren war eine schnellere Differenzierung der primären Zellen auf den aminofunktionalisierten Oberflächen (6) zu sehen, wohingegen die Differenzierung der Keratinozyten auf den carboxyoberflächen, denen der Kontrollen entsprach (5). Tabelle 1
    Versuch Nr. Tag 1 Tag 2 Tag 3
    1 2 3 1 2 3 1 2 3
    Glasobjektträger mit PAH K = + M = + K = +(+) M = + K = +(+) M = 0 K = ++ M = (+) K = ++ M = + K = ++ M = 0 K = ++ M = – K = ++(+) M = + -
    Nanopartikel Carboxy-mit PAH und Glasobjektträger K = ++ M = (+) K = + M = + K = +(+) M = 0 Auf einem OT* K = ++(+) M = + Auf anderen OT* M = (0) K = ++ M = + K = ++(+) M = – K = ++(+) M = – K = ++(+) M = 0 -
    mit PAA Glasobjektträger K = ++ M = + K = ++ M = +(+) K = ++ M = 0 K = ++ M = 0 K = ++(+) M = +(+) K = ++ M = 0 K = ++ M = – K = ++(+) -
    Nanopartikel Amino-mit PAA und Glasobjektträger K = ++(+) M = +(+) K = ++ M = + K = ++ M = + K = ++ M = (+) K = +++ M = + K = ++(+) M = + K = ++(+) M = – Auf OT*1 M = – Auf OT*2 K = +++ M = +(+) Auf OT*3 M = – -
    Glasobjektträger K = + M = + K = (+) M = +(+) K = + M = 0 K = ++ M = + K = ++ M = +(+) K = ++ M = – K = ++ M = – K = ++ M = + -
    Zellkulturflasche (Greiner) K = 0 K = + M = ++ K = 0 K = + M = ++ K = + M = ++ K = + M = ++ K = ++ M = ++ K = ++ M = ++ -
    • K = Koloniedichte: 0: keine Kolonien oder weniger als 5 Zellen pro Kolonie, +: Kolonien < 20 Zellen pro Kolonie, ++: Kolonien > 20 Zellen pro Kolonie, +++: Zellrasen M = Morphologie: –: Zellen in sehr später Differenzierungsphase oder tote, nicht adhärente Zellen, 0: differenzierte Zellen, ausgestreckte Form, das Cytoplasma ist im Vergleich zum Kern groß, +: Zellen in früher Differenzierungsphase, einige später differenzierte, ++: alle Zellen in früher Differenzierungsphase, kubische Gestalt, Verhältnis Cytoplasma/Kern ausgewogen *OT = Objektträger
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
  • Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
  • Zitierte Patentliteratur
    • - DE 10144252 A1 [0010]
    • - DE 10031859 A1 [0010]
    • - US 4521317 [0011]
    • - US 4021364 [0011]

Claims (60)

  1. Zellkultursystem, umfassend eine dreidimensionale biokompatible Gerüststruktur und biokompatible Nanopartikel.
  2. Zellkultursystem nach Anspruch 1, wobei die Nanopartikel mindestens einen Wirkstoff aufweisen.
  3. Zellkultursystem nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Nanopartikel einen Durchmesser von 50 bis 1000 nm, vorzugsweise von 60 bis 600 nm aufweisen.
  4. Zellkultursystem nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei die Nanopartikel einen Durchmesser von 80 bis 150 nm, vorzugsweise von 50 bis 150 nm aufweisen.
  5. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Nanopartikel aus anorganischen Polymeren, Gold, Edelmetallen, Metallen, Metalloxiden, Calciumphosphaten, Calciumhydrogenphosphaten, Mischphosphaten, Siliziumbasierten oxidischen Materialen, wie Silicaten, Siliziumoxiden, Siliziumdioxid, aufgebaut sind.
  6. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Nanopartikel aus organischen Polymeren aufgebaut sind.
  7. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Nanopartikel aus bioabbaubaren Polymeren aufgebaut sind.
  8. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Nanopartikel aus Polylactiden (PLA), Poly(lactid-co-glycolid)e (PLGA), Polycaprolactonen, Polyglycoliden (PCL), Di- und Tri-Block-Polymeren bspw. PCL/PGA-Di-Block-Systemen, Polyorthoestern (POE), Polyanhydride, Polyhydroxyalkanoaten (PHA) oder Polypyrrolen (PPy), Polypropylencarbonat, Polyethylencarbonat, Polyalkylcyanonitril oder Polyethylenglycol aufgebaut sind.
  9. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Nanopartikel eingeschlossene oder auf ihrer Oberfläche aufgebrachte Wirkstoffe aufweisen.
  10. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Nanopartikel aus Polymeren mit unterschiedlichem Molekulargewicht und unterschiedlicher Polarität aufgebaut sind, die ein bestimmtes Freisetzungsprofil des in den Nanopartikel eingeschlossenen Wirkstoffs gewährleisten.
  11. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Nanopartikel durch ein Emulsionspolymerisationsverfahren hergestellt sind.
  12. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Einschluss von Wirkstoffen in Nanopartikel durch Wasser-in-Öl-in-Wasser-Technik erfolgt.
  13. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Wirkstoffe Wachstumsfaktoren, Cytokine, Chemokine, Vitamine, Mineralstoffe, Fette, Proteine, Nährstoffe, faserbildende Proteine, Kohlenhydrate, Adhäsionsproteine, Integrine, Zellrezeptoren, Pharmazeutika, DNA, RNA, Aptamere, angiogene Faktoren, Lektine, Antikörper, Antikörperfragmente, Farbstoffe, Fluoresceinamine oder Inhibitoren sind.
  14. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Nanopartikel Stabilisatoren aufweisen.
  15. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Stabilisatoren Kohlenhydrate, Proteine, Polyethylenglycole oder Detergenzien sind.
  16. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Nanopartikel durch Kopplung mit funktionellen Gruppen funktionalisiert sind.
  17. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei auf der Oberfläche der Nanopartikel eine erste funktionelle Gruppe 1A aufgebracht ist, die mit einer komplementären Gruppe 2A auf einem Wirkstoff eine affine Bindung, bevorzugt eine kovalente Bindung eingehen kann.
  18. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die erste funktionelle Gruppe 1A auf der Oberfläche der Nanopartikel und die komplementäre Gruppe 2A eines Wirkstoffs ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Aminogruppe, Carboxygruppe, Epoxygruppe, Maleinimidogruppe, Alkylketongruppe, Aldehydgruppe, Hydrazingruppe, Hydrazidgruppe, Thiolgruppe und Thioestergruppe.
  19. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei auf der Oberfläche der Nanopartikel eine zweite funktionelle Gruppe 1B aufgebracht ist, die mit einer komplementären Gruppe 2B auf einem Wirkstoff eine affine Bindung, bevorzugt eine nicht-kovalente Bindung eingehen kann.
  20. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die zweite funktionelle Gruppe 1B auf der Oberfläche der Nanopartikel und die komplementäre Gruppe 2B eines Wirkstoffs ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Oligohistidingruppe, Strep-Tag I, Strep-Tag II, Desthiobiotin, Biotin, Chitin, Chitinderivate, Chitinbindedomäne, Metallionenchelatkomplex, Streptavidin, Streptactin, Avidin und Neutravidin.
  21. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die dreidimensionale Gerüststruktur ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Laminine, Glycosaminoglykane (GAG), Proteoglykane, Elastin, Kollagene vom Typ I bis IV, Entaktin (Nidogen), Vitronektin, Hyaluronsäure, Heparansulfat, Dermatansulfat, Chondroitinsulfat, Keratansulfat, Perlecan, Adhäsionsproteine und Fibronektin.
  22. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Gerüststruktur in Faserform vorliegt.
  23. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Gerüststruktur in dreidimensional hydrogelartiger oder schwammartiger Form vorliegt.
  24. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die dreidimensionale biokompatible Gerüststruktur eine extrazelluläre Matrix ist.
  25. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Nanopartikel in dem Zellkultursystem integral verteilt oder in Schichtform vorliegen.
  26. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die in Schichtform vorliegenden Nanopartikel unterhalb der Gerüststruktur angeordnet sind.
  27. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Nanopartikel, insbesondere wirkstoffbeladene Nanopartikel, in Form eines Gradienten innerhalb der Gerüststruktur in auf- oder absteigender Menge verteilt vorliegen.
  28. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei sich ein Wirkstoff-Gradient innerhalb der Gerüststruktur dadurch ausbildet, dass Nanopartikel mit jeweils gleicher Konzentration eines eingeschlossenen oder geträgerten Wirkstoffs innerhalb der Gerüststruktur in definierten Bereichen in unterschiedlicher Anzahl vorliegen.
  29. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei sich ein Wirkstoff-Gradient innerhalb der Gerüststruktur dadurch ausbildet, dass Nanopartikel homogen in der Gerüststruktur verteilt vorliegen, die unterschiedliche Konzentrationen eines eingeschlossenen oder geträgerten Wirkstoffs aufweisen.
  30. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei sich ein Wirkstoff-Gradient innerhalb der Gerüststruktur dadurch ausbildet, dass Nanopartikel mit unterschiedlichen Konzentrationen eines eingeschlossenen oder geträgerten Wirkstoffs innerhalb der Gerüststruktur in definierten Bereichen in unterschiedlicher Anzahl vorliegen.
  31. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Zellkultursystem ein System mit kontrollierter, verzögerter Wirkstofffreisetzung ist.
  32. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Nanopartikel mit der Gerüststruktur verbunden sind.
  33. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei Nanopartikel durch elektrostatische Wechselwirkungen mit der Gerüststruktur verbunden sind.
  34. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei Nanopartikel durch ionische Bindung mit der Gerüststruktur verbunden sind.
  35. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei Nanopartikel durch UV-Crosslinking mit der Gerüststruktur verbunden sind.
  36. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Zellkultursystem zur Durchführung von Migrationsversuchen, insbesondere von in vivo Migrationsversuchen eingesetzt wird.
  37. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Zellkultursystem durch ein kontaktloses Printverfahren hergestellt wird.
  38. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Zellkultursystem durch Imprägnieren hergestellt wird.
  39. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Zellkultursystem durch ein LIFT-Verfahren hergestellt wird.
  40. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Zellkultursystem durch Elektro-spinning (Spincoating) hergestellt wird.
  41. Verfahren zur Herstellung eines Zellkultursystems nach einem der Ansprüche 1 bis 40, wobei biokompatible Nanopartikel mit einer dreidimensionalen biokompatiblen Gerüststruktur in Kontakt gebracht werden.
  42. Verfahren zur Herstellung eines Zellkultursystems nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Zellkultursystem durch ein kontaktloses Printverfahren hergestellt wird.
  43. Verfahren zur Herstellung eines Zellkultursystems nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Zellkultursystem durch ein Imprägnieren einer dreidimensionalen Gerüststruktur mit Nanopartikeln hergestellt wird.
  44. Verfahren zur Herstellung eines Zellkultursystems nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Zellkultursystem durch ein LIFT-Verfahren hergestellt wird.
  45. Verfahren zur Herstellung eines Zellkultursystems nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Zellkultursystem durch Elektro-spinning (Spincoating) hergestellt wird.
  46. Verfahren zur Kultivierung von Zellen, wobei Zellen in ein ein Zellkultursystem nach einem der Ansprüche 1 bis 45 enthaltendes Zellkulturgefäß eingebracht und dort in einem Zellkulturmedium unter geeigneten Bedingungen, die eine Kultivierung ermöglichen, kultiviert werden.
  47. Verfahren nach Anspruch 46, wobei die Zellen primäre Zellen sind.
  48. Verfahren nach einem Ansprüche 46 oder 47, wobei die primären Zellen embryonale Stammzellen sind, insbesondere aus dem Nabelschnurblut gewonnene omnipotente oder pluripotente Stammzellen.
  49. Verfahren nach einem der Ansprüche 46 oder 47, wobei die primären Zellen adulte Stammzellen, insbesondere Epithelzellen, dendritischen Zellen, Bindegewebszellen, Adipocyten, mesenchymale Zellen oder Knochenmarkszellen sind.
  50. Verfahren nach einem der Ansprüche 46 oder 47, wobei die Zellen Tumorzellen, insbesondere Tumorzelllinien wie MCF-7, HeLa, HepG2, PC3, CT-26, A125, A549, MRC-5, CHO, MelJuso28, Nalm6 oder Jurkat sind.
  51. Verfahren nach einem der Ansprüche 46 oder 47, wobei die Zellen adhärente Zellen, bevorzugt adhärente Zelllinien wie HUVEC oder HaCaT.
  52. Verfahren nach einem der Ansprüche 46 oder 47, wobei die Zellen ausdifferenzierte Zellen sind.
  53. Verfahren zur Herstellung von Expressionsprodukten einer Zelle, wobei die Zelle in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 46 bis 52 kultiviert und das Expressionsprodukt gewonnen wird.
  54. Verfahren zur Herstellung differenzierter Zellen oder Zellverbände, wobei undifferenzierte Zellen in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 46 bis 52 kultiviert und differenzierte Zellen oder Zellverbände gewonnen werden.
  55. Verfahren nach dem Anspruch 54, wobei die Zellverbände, Transplantate oder Testsysteme sind.
  56. Verfahren nach Anspruch 54, wobei die Zellverbände Organe, Organteile, insbesondere eine Trachea sind.
  57. Expressionsprodukte einer Zelle, hergestellt durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 46 bis 56.
  58. Differenzierte Zellen oder Zellverbände, hergestellt durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 46 bis 56.
  59. Transplantate oder Testsysteme, hergestellt durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 46 bis 56.
  60. Organe, Organteile, insbesondere Trachea, hergestellt durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 46 bis 56.
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