WO2021156443A1 - Dreidimensionale zellkultur - Google Patents

Dreidimensionale zellkultur Download PDF

Info

Publication number
WO2021156443A1
WO2021156443A1 PCT/EP2021/052816 EP2021052816W WO2021156443A1 WO 2021156443 A1 WO2021156443 A1 WO 2021156443A1 EP 2021052816 W EP2021052816 W EP 2021052816W WO 2021156443 A1 WO2021156443 A1 WO 2021156443A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
matrix
cell culture
cell
matrix holder
holder
Prior art date
Application number
PCT/EP2021/052816
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Manfred TASCHNER
Volker LORBER
Original Assignee
Lifetaq-Analytics Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Lifetaq-Analytics Gmbh filed Critical Lifetaq-Analytics Gmbh
Priority to US17/798,013 priority Critical patent/US20230078423A1/en
Priority to EP21703904.9A priority patent/EP4100509A1/de
Priority to CN202180012862.4A priority patent/CN115052966A/zh
Publication of WO2021156443A1 publication Critical patent/WO2021156443A1/de

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/12—Well or multiwell plates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/52—Mobile; Means for transporting the apparatus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
    • C12M25/02—Membranes; Filters
    • C12M25/04—Membranes; Filters in combination with well or multiwell plates, i.e. culture inserts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
    • C12M29/10—Perfusion
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2513/00—3D culture

Definitions

  • the present invention relates to the technical field of cell culture, in particular the three-dimensional cell culture of animal and human cells.
  • Animal and human cells are traditionally cultivated in the second dimension in biomedical and pharmaceutical research. This involves transferring cells to a plastic or glass surface where they can attach and multiply. However, this environment does not correspond to the natural, physiological conditions of the cells and therefore very often leads to a loss of function, to dedifferentiation of the cells and, in the worst case, to cell death. (DE102007020302A1).
  • Cells in the human body behave fundamentally different in their environment than those in culture. The reasons are both complex intercellular and extracellular processes, which are influenced, for example, by neighboring cells, the tissue or also by soluble factors such as growth factors or hormones. 2D cell cultures allow cells to attach and grow outside of an organism, but they do not adequately reflect the natural growth conditions of cells in their natural environment.
  • 3D cultures bring numerous advantages, as the cultivated cells enable a more physiologically authentic model of human tissue. These include, for example, systems with solid supports, such as porous support structures that imitate the extracellular matrix, and support-independent systems, such as spheroid cultures.
  • solid supports such as porous support structures that imitate the extracellular matrix
  • support-independent systems such as spheroid cultures.
  • Examples are hanging-drop multiwell plates that are used to produce spheroids (US 2013/236924 A1), systems for producing three-dimensional matrices that include a magnetic core (US 2017/137766 A1) or a cell culture system that has a three-dimensional biocompatible scaffold structure and Includes nanoparticles. These structures are supposed to simulate the extracellular matrix as the natural environment of the cells (DE102007020302A1).
  • DE10003521A1 describes a device for producing three-dimensional matrix bodies, which consist of a carrier substance and cell cultures stored therein, and their use for cultivating cells in multiwell plates.
  • US 2019/276784 A1 discloses various complex cell culture devices which are intended to imitate the joint of a mammal.
  • the cell culture device comprises a plurality of hollow scaffolds with many openings for receiving a matrix in the cavity of the scaffold.
  • US 2007/237683 A1 discloses a device which is used for better optical imaging of two-dimensional cell cultures.
  • the device comprises a multiwell plate with cylindrical bottomless inlets that hold the corrugated strips.
  • the corrugated strips also comprise cylindrical wells that fit into the inlets of the multiwell plate, but have a transparent bottom on which the cells are cultivated.
  • CA 2579680 A1 discloses a bioreactor with a perfusion unit and a multiwell plate, which comprises a plurality of bioreactor units, in each of which different experiments can be carried out.
  • WO 2004/027016 A1 discloses a perfusion incubator with a peristaltic pump, which can be used in particular for growing embryos.
  • the present invention comprises a cell culture device for a three-dimensional cell culture with one or more cell culture units, characterized in that a cell culture unit comprises the following: i. at least one matrix holder (12) with a central opening (13) for receiving a matrix; ii. a carrier (10) which is fixedly or reversibly connected to the at least one matrix holder (12); and iii. a corrugated strip (11) consisting of a vessel with at least one depression which can comprise at least one matrix holder (12) up to the upper end of the central opening (13) or more, the matrix holder (12) being oriented vertically.
  • the compact structure of the cell culture unit allows easy handling of not just one but also several matrix holders.
  • the central opening (13) of the matrix holder (12) can have a through opening (13a and 13c) or a recess with a wall (13b).
  • the inner walls of the opening (13) can have an angle of 1-30 °, so that the two ends of the opening (13) can have different diameters. In particular, they can have an angle of about 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 , 23, 24, 25, 26, 27, 28 or 29 °.
  • the present invention also includes an inoculating device (30, 33).
  • the opening (13) of the matrix holder has a recess (13c) for sealing and reversible attachment to a colonization device (30, 33).
  • the colonization device (30, 33) comprises sealing elements (31).
  • the colonization device can have elevations (32).
  • the opening (13a) has an upper depression (13d) in order to avoid the inclusion of air bubbles in the matrix during the horizontal colonization.
  • the central opening (13) comprises a matrix which is a solid porous support or a hydrogel, or a combination thereof.
  • the matrix can be a solid, porous carrier to which a hydrogel is applied and / or which is filled with a hydrogel.
  • a cell culture unit can comprise several matrix holders (12).
  • the cell culture unit can comprise 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 or 20 matrix holders (12).
  • the matrix holders (12), which are encompassed by a cell culture unit, can contain the same or different matrices.
  • the matrix holders (12) of a cell culture unit each contain a matrix of hydrogel or a matrix that is a solid, porous carrier.
  • This allows the simultaneous culture of cells in the same three-dimensional environment, whereby the medium in the wells of the corrugated strip (11) can be identical or different.
  • the composition of the medium can be different, for example to investigate the influence of the medium on cell growth.
  • the medium contains a test active ingredient, different active ingredients or different concentrations of an active ingredient can be tested.
  • a cell culture unit comprises matrix holders (12) whose matrix is a hydrogel and matrix holders whose matrix is a solid, porous carrier. If a cell culture unit comprises various matrix holders (12), this enables, for example, rapid screening of different three-dimensional environments.
  • the matrix consists of natural, semi-synthetic or synthetic material or a combination thereof.
  • the matrix can optionally be modified or coated with protein or peptide sequences.
  • the matrix can have antibodies or antibody fragments or RGD sequences.
  • any material compatible with the culture of animal or human cells can be used as the material for the matrix described herein.
  • the natural material is selected from collagen, fibrin, glycosamine glycans and hyaluronic acid
  • the synthetic or semi-synthetic material is selected from polymeric components such as polymethyl methacrylate, polylactic acid, polyglycol, polystyrene and ceramic components such as hydroxyapatite or tricalcium phosphate.
  • the carrier (10) has an element (15) for receiving the matrix holder (12) and the matrix holder (12) has notches (14a, 14b) at its upper end, via which it can be reversibly connected to the element ( 15) of the carrier (10) can be connected.
  • the carrier comprises an opening at at least one end, preferably at both ends, for fastening a magnetizable nut (45), for example by means of a screw.
  • the carrier has several additional openings for matrix holders (46) which can be connected to the carrier, for example by means of fastening pins (47).
  • the device additionally comprises a transport unit (20) which can transport one or more cell culture units (21).
  • the transport unit (20) facilitates the use of the cell culture device in question in an automated environment.
  • One or more cell culture units can be moved and operated by means of the transport unit.
  • this makes it possible to automate certain processes, such as automated media change or automated settlement of the units.
  • the automation can take place by means of a robot.
  • the transport unit comprises: i. a support rail (22) for fastening one or more cell culture units (21) to the transport unit (20), ii. a receiving unit (20a) for a support rail (22), iii. a lid (23), and iv. two spacer elements (24), which are optionally directly connected to one another, for the orderly reception of at least two or more carriers (10) of a matrix holder, v. optionally at least one identification element (26) such as an RFID chip or a barcode, and vi. optionally a centering unit (27).
  • the corrugated strip (11) comprises a position (25) for attachment to the support rail (20).
  • the spacer elements serve to accommodate and orderly arrange the cell culture units that are attached in the spacer above the carrier (10) of the matrix holders.
  • the cell culture units are arranged in parallel in the spacer (24).
  • the spacer elements can be connected to one another in a fixed or reversible manner, or they can also not be connected to one another directly, but only via the carrier of the matrix holders.
  • the transport unit (20) comprises: i) a plate (48) which forms the underside of the transport unit, ii) openings in the plate (48) for centering the transport unit on the plate (49), iii) openings in the plate (48) for screw connections (50), iv) a further plate (51) which is attached approximately at mid-height of the transport unit, v) magnetizable metal rods (52), vi) a centering bracket (54), vii) openings in the plate (51) for the centering bracket (54), viii) and a centering object (55).
  • the magnetizable metal rods (52) are used for reversible connection with a cell culture robot.
  • the magnetizable metal rods (52) serve as a docking point for reversible connection with a robotized unit for transporting the transport unit, for example for reversible connection with magnets of the Oli-MAT (available from LifeTaq-Analytics GmbH, Tulln an der Donau).
  • the Z-axis of the Oli-MAT has two permanent magnets with which the transfer unit can be carried from position to position. A short pulse can briefly demagnetize the magnets, which leads to the transfer unit being switched off.
  • the present invention also encompasses a method of culturing cells using the cell culture device disclosed herein.
  • the method comprises the following steps: i. Suspending the cells to be cultivated in an appropriate amount of a cell culture medium to form a cell suspension, ii. Colonizing the matrix in the opening (13) of the matrix holder (12) with the cell suspension, iii. Transferring the matrix holder into a corrugated strip (11), in particular using the carrier of the matrix holder (10), and iv. Incubate the cell culture device containing the cells under conditions that allow cell growth.
  • the colonization of the matrix with the cell suspension takes place in a horizontal arrangement of the matrix holder (12).
  • the matrix holder (12) of the cell culture device for use in this method has an opening (13) with a depression (13c), the matrix holder being reversibly connected to a colonization device (30) via a complementary sealing element (31), wherein the matrix used is a hydrogel and the cell cultivation method comprises in particular the following steps: i. Suspending the cells to be cultivated in an appropriate amount of a cell culture medium to form a cell suspension, ii. Mixing the cell suspension with one or more ingredients of a hydrogel to produce a cell suspension-hydrogel mixture, iii. Populating the opening (13) of the matrix holder (12), which is horizontally aligned in the inoculating device (30), with the cell suspension-hydrogel mixture, iv.
  • Polymerization of the hydrogel can in particular last approximately 5 minutes and up to 24 hours.
  • the duration of the complete polymerization typically depends on the composition of the hydrogel, in particular its components and their components Concentration dependent, as well as the environment, for example the humidity and the air temperature. The person skilled in the art is able accordingly to determine the time required for the gel to harden.
  • a further layer of a cell suspension-hydrogel mixture can be introduced into the matrix.
  • the further cell suspension-hydrogel mixture can contain cells other than the first mixture, such as, for example, modified variants of the cells of the first mixture.
  • the further cell suspension-hydrogel mixture can contain the same cells as the first mixture, but for example a different hydrogel composition.
  • the colonization device (30) has an inner elevation (32) which ensures that a depression is created in the opening (13) when the cell suspension-hydrogel mixture is fully polymerized, which after removal of the colonization device (30) the further cell suspension-hydrogel mixture can be filled.
  • This enables, for example, the co-culture of different cell types or the culture of one cell type in a different three-dimensional environment in a matrix holder (12).
  • the method comprises the following steps: i. Transferring a solid porous support into the recess (13b), ii. Suspending the cells to be cultivated in an appropriate amount of a cell culture medium to form a cell suspension, iii. Transfer the cell suspension into the opening (13b) of the matrix holder
  • the matrix is populated with the cell suspension in a vertical arrangement of the matrix holder (12).
  • the matrix holder (12) of the cell culture device for use in this method has an upper opening (13d), the matrix holder (12) is reversibly connected to a colonization device (33) and the matrix is a hydrogel.
  • the method has the following steps: i. Suspending the cells to be cultivated in an appropriate amount of a cell culture medium to form a cell suspension, ii. Mixing the cell suspension with a hydrogel to produce a cell suspension-hydrogel mixture, iii. Filling the wells of the colonization device (33) with the cell suspension-hydrogel mixture, iv. Populating the opening (13) of the matrix holder by immersing the matrix holder (12) in the inoculating device (33), v.
  • the volume of the wells of the inoculation device (33) can be reduced in contrast to the corrugated strip (11).
  • the colonization device (33) can additionally have filling elements (40).
  • the wells of the inoculation device (33) can be filled with medium via the filling elements (40).
  • the method has the following steps when a filling device (33) is used which has filling elements (40): i. Suspending the cells to be cultivated in an appropriate amount of a cell culture medium to form a cell suspension, ii. Mixing the cell suspension with a hydrogel to produce a cell suspension-hydrogel mixture, iii. Introducing the matrix holder into the inoculating device (33), iv. Filling the wells of the colonization device (33) with the cell suspension-hydrogel mixture via the filling elements (40), whereby the opening (13) of the matrix holder is colonized with the cell suspension-hydrogel mixture, v. Incubating the cell batch in a suitable cultivation environment, preferably at 37 ° C.
  • the matrix holder is aligned horizontally for colonization.
  • the opening (13) of the matrix holder (12) has a recess with a wall (13b) and the matrix is a solid, porous carrier.
  • the method for colonizing the matrix holder in this embodiment comprises the steps: i. Transferring a solid porous support into the recess (13b), ii. Suspending the cells to be cultivated in an appropriate amount of a cell culture medium to form a cell suspension, iii. Transfer of the cell suspension into the opening (13b) of the matrix holder (12), iv. Incubating the inoculation device, in particular for at least 30 minutes to 24 hours, under conditions which allow the cells to grow on the solid, porous support.
  • the matrix holder can then be transferred into a corrugated strip (11) filled with cell culture medium, in particular using the carrier of the matrix holder (10), and the cells can be incubated in the cell culture device, which contains the cells attached to the porous carrier, under conditions which enable cell growth.
  • the transfer of the matrix holders into a corrugated strip, the transfer of an entire cell culture device and / or the transfer of a corrugated strip can be automated by a robot-supported gripper arm.
  • the corrugated strip is a perfusion device (34), the hose connections (41) to the At the end of a pump.
  • a continuous flow of a cell-compatible liquid, such as, for example, cell culture medium, can be passed through the perfusion device via these hose connections by means of a pump.
  • the cell culture device further comprises a box (44) and an insert (42) for receiving one or more
  • the cell culture device further comprises a box (44) and an insert (43) for receiving one or more
  • FIG. 1 shows components of an embodiment of the cell culture unit (21), in particular matrix holders (12) with various openings (13a, 13b, 13c, 13d), a corrugated strip (11) and a carrier (10).
  • FIG. 2 shows components of an embodiment of the transport unit (20), in particular a receiving unit (20a), several cell culture units (21), a support rail (22), a cover (23), spacer elements (24), a marking element (26) and a centering unit (27).
  • FIG. 3 shows colonization devices.
  • FIG. 3a shows a colonization device (30) with sealing elements (31) which can be reversibly connected to the matrix holder (12) via the recess of the opening (13c).
  • FIG. 3b) shows a colonization device (30) which has elevations (32).
  • FIG. 4 shows components of a cell culture unit and the colonization device
  • FIG. 5 shows components of a cell culture unit and a perfusion device
  • FIG. 6 shows components of a cell culture unit (10, 11, 12) and a box (44) and an insert (42) for receiving one or more cell culture units in the box.
  • FIG. 7 shows components of a cell culture unit (10, 12) with a colonization device (30), as well as a box (44) for receiving one or more colonization devices.
  • FIG. 8 shows a further embodiment of a carrier (10) of the cell culture device with an opening for fastening a magnetizable nut by means of a screw (45), several openings in the carrier for matrix holders (46), fastening pins of a matrix holder (47) and the matrix holder (12).
  • FIG. 9 shows a further embodiment of the transport unit (20) comprising several cell culture devices (21).
  • the figure shows a plate (48) which forms the underside of the transport unit, openings in the plate (48) for centering the transport unit on the plate (49), openings in the plate (48) for screw connections (50), another plate ( 51) which is attached approximately at the middle of the transport unit, magnetizable metal rods (52), a centering bracket (54) and openings in the plate (51) for the centering bracket (54) and a centering object (55).
  • FIG. 10 shows a further embodiment of a colonization device (30) comprising sealing elements (31).
  • the figure shows a carrier (10) with a matrix holder (12) which is introduced into the inoculation device.
  • the cell culture device in question opens up the possibility of using three-dimensional cell cultures with a matrix of hydrogel and / or porous support structures in automated medium to high-throughput applications.
  • toxicology studies can thus be carried out in an automated environment in a three-dimensional cell culture.
  • the invention relates to cell culture devices for the in vitro cultivation of biological cells and tissue and to cultivation methods using these cell culture devices.
  • the cell culture devices in question are robust and easy to handle and enable cells to be cultivated in vitro in a three-dimensional environment.
  • Another particular advantage of the cell culture devices in question is that they are suitable for use in an automation-supported environment, for example in combination with a robot. Due to the compact structure of the cell culture device according to the invention, in particular the cell culture units, the cultivation of different cell types can take place simultaneously in different environments, with variations in the cultivation of the cells, in particular through human interaction with the cell culture device, being reduced. In particular, several replicates of a cell culture system can be cultivated at the same time.
  • the cell culture device in question comprises at least one matrix holder, a carrier for fixing the matrix holder and a vessel with at least one generally trough-shaped depression (well), which is called a corrugated strip.
  • the cell culture device according to the invention is particularly characterized in that the at least one matrix holder is oriented vertically.
  • the matrix holder is particularly characterized in that it consists of an outer basic shape and comprises an inner central opening.
  • This opening can have various modifications and shapes, for example it can be a through opening or a recess with a rear wall which is therefore only open on one side. This enables both hydrogels and solid porous supports to be used.
  • the opening of the matrix holder can be continuous or discontinuous; the matrix holder can, for example, have a rectangular or round opening and be shaped, for example, as a cylinder, cuboid, pyramid, or cube.
  • the interior walls of the opening of the matrix holder can be straight or at an angle of about 1 to 25 degrees.
  • the inner walls of the opening of the matrix holder can form an angle of approximately 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 , 20, 21, 22, 23, 24 or 25 degrees.
  • the outer wall of the opening can also have such an angle.
  • the two ends of the opening can have different diameters.
  • the opening is a recess with a wall
  • the rear wall can thus have a smaller diameter than the front opening. This has the effect that hydrogels adhere less to the rear wall and can be removed more easily from the opening of the matrix holder. This can prevent damage to the hydrogel and the cells when they are removed from the matrix holder.
  • the matrix holder also has modifications around the inner central opening. These modifications can for example, further depressions around the opening, creating a wall around the opening.
  • This wall is in particular a raised curve with an inner trough-shaped opening, which optionally has a wall, for example a rear wall, or is continuous. Modifications of this type are particularly suitable for reversibly connecting the matrix holder to a correspondingly compatible colonizing device, for example via a plug-in system.
  • the matrix holder has a depression or also an indentation on the upper edge of the opening, whereby air bubbles can escape from the well. In this way, for example, the inclusion of air bubbles in the matrix, in particular during colonization, can be avoided.
  • the matrix holder is formed from soft, elastic silicone of different Shore hardness, whereby mechanical forces, such as pulling, stretching or pressing, can act on the matrix holder and thus on the cells in the matrix without a negative effect.
  • the cell culture device in question has at least one carrier which is fixedly or reversibly connected to at least one matrix holder.
  • the carrier is preferably suitable for more than one matrix holder, in particular at least 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 , 25, 30, 35, 40, 45, 50 or more matrix holders fixed or reversible.
  • the matrix holders are preferably arranged in the longitudinal direction, in particular in a line or in parallel lines.
  • the carrier comprises constructions or elements for receiving one matrix holder in each case.
  • These constructions or elements are preferably arranged in the longitudinal direction, in particular in a line or in parallel lines.
  • the matrix holders have elements, such as notches, for example, which are compatible with the constructions or elements of the carrier and can thus be reversibly connected to the carrier.
  • the elements of the carrier and the notches of a matrix holder can be a Represent a plug-in system by inserting or pushing the notches of the matrix holder into the elements of the carrier.
  • the carrier has elements for fixed or reversible connection and attachment to a transport unit.
  • the carrier and the transport unit have compatible elements via which the carrier and the transport unit can be connected to one another in a fixed or reversible manner. For example, they can be connected by pushing or plugging one of the elements into the matching element.
  • the carrier comprises an opening at at least one end, preferably both ends, for fastening a magnetizable nut, for example by means of a screw.
  • the carrier additionally has several openings for matrix holders, which can be connected to the carrier, for example, by means of fastening pins.
  • the nut is preferably made of iron or another magnetizable metal.
  • the nut can be magnetized by permanent magnets, for example in a separate structure such as a robot.
  • the separate construction can for example be a cell culture robot, for example Oli-Mat (available from LifeTaq-Analytics GmbH, Tulln an der Donau).
  • Oli-Mat available from LifeTaq-Analytics GmbH, Tulln an der Donau
  • the carrier can be reversibly connected to the separate construction via the magnetizable nut and thus enable the cell culture unit (for example in fresh nutrient medium) to be moved over the carrier.
  • the carriers can be separated from the magnet by physical force or by a short impulse.
  • the cell culture device in question has at least one corrugated strip, which consists of a vessel with at least one depression. This depression can completely encompass at least one matrix holder, at least up to the upper end of the central opening of the matrix holder.
  • the corrugated strip preferably has depressions, the number of which corresponds to the number of matrix holders on a carrier.
  • the corrugated strip can also have more depressions than matrix holders are contained on a carrier, and / or at least one of the depressions of the corrugated strip can accommodate more than one matrix holder.
  • the corrugated strip has only one depression which is large enough to accommodate all of the matrix holders of a carrier or a plurality of carriers. If a recess in the corrugated strip comprises several matrix holders, the matrix holders are in contact with the same medium, whereby, for example, variations in the composition of the medium between different wells can be avoided.
  • the corrugated strip has an element for fixed or reversible attachment to the transport unit.
  • the corrugated strip also has a sanding or wiping construction.
  • An abrasive construction is particularly helpful when using the cell culture device in an automated environment, for example with a robot, since in this way the dripping of cell culture medium when transporting individual units can be avoided.
  • At least one of the depressions has an insert, as a result of which the volume of the depression is reduced.
  • the required volume of cell culture medium or hydrogel can be reduced as a result, as a result of which the costs of the cell culture can be reduced considerably.
  • the volume By reducing the volume, the amount of reagents that are tested or used on the cells in the cell culture system can also be reduced.
  • the components of the subject cell culture device can consist of any material that can be used in a cell culture system.
  • the components of the cell culture device consist of biocompatible and sterilizable material. These include, for example, materials such as silicone, polycarbonate, polystyrene, polyethylene, polysulfone (PSU), polyphenylsulfone (PPSU) and other materials commonly used in cell culture systems.
  • the matrix described herein can be a solid porous support or a hydrogel, or a combination thereof.
  • the matrix can be a solid, porous carrier to which a hydrogel is applied and / or which is filled with a hydrogel.
  • the porous matrix can also be dehydrated.
  • the porous matrix can be a poly (L-lactide) (PLLA) that is processed into microfibers that are very consistent in terms of fiber diameter and pore size.
  • PLLA poly (L-lactide)
  • the matrix can be polystyrene scaffolds that are suitable for 3D cell culture.
  • the matrix consists of natural, semi-synthetic or synthetic material, or a combination thereof.
  • the matrix can optionally be modified or coated with proteins or peptides.
  • the matrix can have antibodies, antibody fragments or RGD sequences. RGD sequences are amino acid sequences containing arginine / glycine / asparagine. This Sequences occur in proteins of the EC matrix, for example
  • Fibronectin / vitronectin Cells can bind to these via integrins.
  • the porous matrix can be transferred into the matrix holder, but alternatively it can also be integrated into the matrix holder by means of lyophilization.
  • any material compatible with the culture of animal cells can be used as the material for the matrix described herein.
  • the natural material is selected from collagen, fibrin, glycosamine glycans and hyaluronic acid
  • the synthetic or semi-synthetic material is selected from polymeric components such as polymethyl methacrylate, polylactic acid, polyglycol, polystyrene and ceramic components such as hydroxyapatite or tricalcium phosphate.
  • the matrix is prepared in the matrix holder with proteins or protein components.
  • the hydrogel or the solid porous support is formed in the matrix holder.
  • the matrix can then be functionalized using traditional cross-linking techniques such as NHS-EDC or click chemistry or other variants with functional proteins such as antibodies, growth factors or extracellular protein as well as with functional peptides, whereby the different liquids are stored in different corrugated strips and the chemical reactions via the manual change from one corrugated strip to the next takes place. After that, cells can be colonized or an animal organism can be operated on.
  • Both adherent cells and suspension cells can be cultivated in the cell culture system in question.
  • the cells to be cultivated are preferably eukaryotic cells, in particular animal cells.
  • the cells are preferably mammalian cells, particularly preferably human but also non-human, such as rodent cells, for example from mouse, hamster, opossum, potorous, or rat, insect, bovine cell lines, dog such as MDCK cell lines, pigs, etc.
  • the cells can be stem cells, for example omnipotent, pluripotent, multipotent or unipotent, or differentiated tissue cells or blood cells or lymphocytes.
  • the cells can be from immortalized cell lines, for example tumor cell lines. It is possible for the cells to be cultivated in such a way that differentiation takes place. Thus, cells can also change the degree of differentiation. This should preferably go through the culture conditions are determined (e.g. growth or differentiation factors).
  • Adherent cells include any animal, in particular human, cells that are typically used in biomedical or pharmaceutical research. These include, for example, stem cells from various sources such as mesenchyme, fat, liver, brain or other sources or differentiated cells such as fibroblasts, chondrocytes, osteoblasts, epithelial cells of different origins, endothelial cells, neuronal cells, hepatocytes as well as induced pluripotent stem cells of embryonic origin and cell lines.
  • stem cells from various sources such as mesenchyme, fat, liver, brain or other sources or differentiated cells such as fibroblasts, chondrocytes, osteoblasts, epithelial cells of different origins, endothelial cells, neuronal cells, hepatocytes as well as induced pluripotent stem cells of embryonic origin and cell lines.
  • Suspension cells can include, for example, blood precursor cells or differentiated blood cells. Suspension cells can either be embedded in a hydrogel matrix or cultivated as a suspension in the context of co-culture studies in the corrugated strip, with an adherent cell culture being embedded in a matrix in the matrix holder in the second case. For example, interaction studies between blood cells as a suspension and mesenchymal stem cells in a hydrogel can be carried out in the matrix holder.
  • a three-dimensional cell culture system describes the cultivation of cells in a microstructured three-dimensional cell culture under in vitro conditions.
  • the culture or its cells should adopt a spatial orientation. This takes place mainly in the form of hydrogels made from structural proteins such as fibrin, collagen, gelatin (poly) methacrylate or matrigel, as well as from solid scaffolds such as polystyrene, polylactic acid or other chemical substances.
  • hydrogels made from structural proteins such as fibrin, collagen, gelatin (poly) methacrylate or matrigel, as well as from solid scaffolds such as polystyrene, polylactic acid or other chemical substances.
  • many cell lines form spheroids, the diameter of which increases over time after the cells are embedded. Even cells that do not form spheroid often show a morphology that differs greatly from 2D cultures.
  • a cell-compatible liquid, in particular cell culture medium, is preferably used in the cell culture device according to the invention and in the method according to the invention.
  • the above-described steps ii) to v) are preferably carried out in this liquid.
  • This fluid is used as part of the complex cellular environment. It can be a medium suitable for the growth of the cells or for the cell supply.
  • cell culture media are based on the component groups amino acids, carbohydrates, inorganic salts and vitamins. Frequently contained salts are, for example, calcium chloride, potassium chloride, Magnesium sulfate, sodium chloride and monosodium phosphate. Frequently contained vitamins are for example folic acid, nicotinamide, riboflavin and B12.
  • the cell culture medium can contain FCS (Fetal Calf Serum) or FBS (Fetal Bovine Serum).
  • Preferred cell culture media are MEM, ⁇ -MEM, DMEM, RPMI and variations or modifications thereof.
  • the cell culture device according to the invention also comprises a cell-compatible liquid, such as cell culture medium, and living cells, it is also referred to as a cell culture system.
  • the cell culture system comprises the container and the culture medium, but not the specific atmospheric composition.
  • the cells can be removed from the incubator in which atmospheric conditions prevail which are intended to promote the best possible growth.
  • the preferred atmospheric conditions for the best possible cell growth for animal cells are 35-38 ° C., particularly preferably approximately 37 ° C., and 0-10% CO2, particularly preferably 3-6% CO2.
  • a transport unit described here for transporting the cell culture units preferably comprises a support rail (22) for fastening one or more cell culture units, a receiving unit (20a) for a support rail (22), a cover (23), and two spacer elements (24), which are optionally connected directly to one another, for the orderly reception of at least two or more carriers (10) of a matrix holder.
  • the transport unit can include one or more identification elements (26) such as an RFID, barcode or QR code, and / or a centering unit (27), especially for automated processes.
  • the transport unit is preferably made of a solid material, for example a plastic, which is preferably temperature-resistant and / or acid-resistant.
  • the individual elements of the transport unit can consist of the same material or of different materials.
  • the transport unit described herein can also have a plate (48) which forms the underside of the transport unit, openings in the plate (48) for centering the transport unit on the plate (49), openings in the plate (48) for screw connections (50), another plate (51) which is attached approximately mid-height of the transport unit, magnetizable metal rods (52), a centering bracket (54), openings in the plate (51) for the centering bracket (54), and / or a centering object (55) include.
  • the magnetizable metal rods (52) enable a reversible connection to an external construction, for example a robot, which is used for the automated manipulation of the cell cultures.
  • the magnetizable metal rods (52) serve as a docking point for reversible connection with a robotized unit for transporting the transport unit, for example for reversible connection with magnets of the Oli-MAT (available from LifeTaq-Analytics GmbH, Tulln an der Donau).
  • the Z-axis of the Oli-MAT has two permanent magnets with which the transfer unit can be carried from position to position. The magnets can be briefly demagnetized with a short pulse, which leads to the transport unit being switched off.
  • system also includes a device for colonization in a horizontal and in a vertical orientation.
  • the cells are mixed, for example, with a hydrogel and transferred into the device for vertical colonization, a corrugated strip, by means of a pipette.
  • the matrix holder with the device for the matrix holder is then dipped into the hydrogel until the latter has polymerized.
  • the matrix holder is then carefully transferred into a corrugated strip filled with medium, only a defined amount being transferred along with the corresponding cells in the inner opening of the fully polymerized hydrogel.
  • the polymerization can take a few minutes to hours. Accordingly, the culture may have to be transferred to an incubator.
  • the matrix holder can in this case have a small opening in the vertical surface above the opening.
  • the matrix holder is first transferred into the device for vertical colonization and then the hydrogel with cells is added. After the polymerisation is complete, it is again transferred to a corrugated strip filled with medium.
  • the colonization can take place in a horizontal arrangement with a horizontal colonization device.
  • the matrix holder with the device for fastening the matrix holder to the inoculation device is fastened beforehand.
  • the cells are then mixed with the hydrogel and this mixture is transferred into the opening of the matrix holder.
  • the device is removed manually from the matrix holder and transferred to a corrugated strip filled with medium.
  • the volume can be reduced by at least a factor of 5 compared to the vertical arrangement.
  • the colonization device can be provided with a plateau. After colonization as described above, the matrix holder is detached from the horizontal colonization device, whereby a depression is created on the rear side of the hydrogel.
  • colonization with a further cell type for example of epithelial origin such as endothelial cells of a blood vessel or epithelial cells of the intestine, is possible on this depression and can form a barrier-like structure.
  • the colonization takes place preferably in a horizontal arrangement.
  • the central opening has a recess with a wall.
  • the porous carrier on which cells can be colonized directly rests on this wall.
  • the construct can be transferred to an incubator for several hours up to a day.
  • the matrix holder can be transferred to a well strip filled with medium.
  • the carrier can be dehydrated in several steps before colonization. This can be done in advance by transferring the device with the matrix holder from one corrugated strip filled with liquid to another corrugated strip filled with liquid.
  • a subsequent change of media can be carried out by transferring the device with the matrix holder and the three-dimensional cell culture from the old corrugated strip with old medium to a new corrugated strip previously filled with fresh medium.
  • the transfer of the corrugated strips with the matrix holders can also take place in an automated manner with the aid of the transport unit or a robot-supported gripper arm.
  • the culture can be decellularized according to a particular embodiment in order to obtain an extracellular matrix cell-free.
  • mesenchymal stem cells can be differentiated into osteoplasts, chondrocytes or adipocytes over several weeks and finally the matrix obtained can be made cell-free using a standard decellularization protocol.
  • a preculture in 2D is completely dispensed with and the passage of the cells in 2D is avoided.
  • it will be Cells in low concentration ( ⁇ 5000-10000 / well) on the matrix holder, colonized either as a hydrogel or as a solid porous carrier and cultured to a high concentration. The matrix is then dissolved or the cells are detached from the carrier by means of an enzymatic reaction and recovered for the next colonization.
  • the matrix holder can be filled with cells and a hydrogel matrix and transferred into a device for perfusion, wherein a continuous or periodic flow can be initiated.
  • the cell culture device according to the invention can be stored or transported in a box, optionally with a special insert for receiving the devices.
  • the box can have further elements for temperature control or cooling or elements for temperature control and / or temperature recording or sensors for CO2 or O2 measurement.
  • the box can also be an isothermal box.
  • the matrix holder for example made of silicone, can alternatively be transferred into a bioreactor system with perfusion.
  • a bioreactor system with perfusion For example, cells can be grown in low concentration, if the number of cells becomes too large for a purely static culture, the matrix holder can be transferred to a larger vessel or bioreactor system with perfusion. This allows initiation of a continuous or periodic flow.
  • the matrix posture can be aligned horizontally or vertically.
  • the elements used for cultivation are sterilized, in particular autoclaved.
  • the cells used can be prepared for cultivation, in particular by washing and contact with proteases that break down those proteins that maintain the cell structure, for example trypsin.
  • the cells can be detached from a carrier, isolated and suspended in the further process.
  • the cells can also be centrifuged to increase the cell density.
  • the number of cells for embedding or colonizing the matrix can be determined by a person skilled in the art; the number of cells can, for example, be around 1000-100000 cells per matrix.
  • the matrix holder can be transferred to a corrugated strip (11), in particular using the carrier of the matrix holder (10).
  • the conditions for the colonization of the matrix in the opening (13) of the matrix holder (12) with the cell suspension can be for the respective Cell types are individually adapted, for example the temperature can be about 30 ° C to 38 ° C, for example about 37 ° C for mammalian cell cultures.
  • the cell culture device can comprise one or more electrodes.
  • the electrodes are arranged in such a way that the cells to be cultivated can be electrically stimulated.
  • the electrodes are preferably located in the corrugated strip, in particular in one or more of the depressions in the corrugated strip.
  • a cell culture unit (21) comprises: i. at least one matrix holder (12) with a central opening (13) for receiving a matrix; ii. a carrier (10) which is fixedly or reversibly connected to the at least one matrix holder (12); and iii. a corrugated strip (11) consisting of a vessel with at least one depression which can comprise at least one matrix holder (12) up to the upper end of the central opening (13) or more, the matrix holder (12) being oriented vertically.
  • the cell culture device according to item 4, wherein the natural material is selected from collagen, fibrin, glycosamine glycans and hyaluronic acid, and the synthetic or semi-synthetic material is selected from polymeric components such as polymethyl methacrylate, polylactic acid, polyglycol, polystyrene and ceramic components such as hydroxyapatite or tricalcium phosphate.
  • the carrier (10) has an element (15) for receiving the matrix holder (12) and the matrix holder has notches (14a, 14b) at its upper end, via which it is reversible can be connected to the element (15) of the carrier (10).
  • the cell culture device according to one of items 1 to 7, wherein the device additionally comprises a transport unit (20) which can transport one or more cell culture units (21).
  • the transport unit (20) comprises i. a support rail (22) for fastening one or more cell culture units (21) to the transport unit (20), ii. a receiving unit (20a) for a support rail (22), iii. a lid (23), and iv. two spacer elements (24), which are optionally directly connected to one another, for the orderly reception of at least two or more carriers (10) of a matrix holder, v. optionally at least one identification element (26) such as an RFID chip or a barcode, and vi. optionally a centering unit (27).
  • the method according to item 12, comprising the steps i. Suspending the cells to be cultivated in an appropriate amount of a cell culture medium to form a cell suspension, ii. Colonization of the matrix in the opening (13) of the matrix holder (12) with the cell suspension, iii. Transferring the matrix holder into a corrugated strip (11), in particular using the carrier of the matrix holder (10), and iv. Incubate the cell culture device containing the cells under conditions that allow cell growth.
  • the opening (13) of the matrix holder (12) has a recess (13c) for attachment and is reversibly connected to a colonization device (30) via a complementary sealing element (31), and the matrix is a Hydrogel, comprising the steps i. Suspending the cells to be cultivated in an appropriate amount of a cell culture medium to form a cell suspension, ii. Mixing the cell suspension with one or more ingredients of a hydrogel to produce a cell suspension-hydrogel mixture, iii. Populating the opening (13) of the matrix holder (12), which is horizontally aligned in the inoculating device (30), with the cell suspension-hydrogel mixture, iv.
  • Corrugated strips (11), preferably using the carrier of the matrix holder (10), vii. Incubate the cell culture device containing the cell suspension matrix
  • Mixture contains, under conditions that allow cell growth.
  • the opening (13) of the matrix holder (12) has an upper opening (13d) and the matrix holder (12) is reversibly connected to a colonization device (33), and the matrix is a hydrogel, comprising the Steps i. Suspending the cells to be cultivated in an appropriate amount of a cell culture medium to form a cell suspension, ii. Mix the cell suspension with a hydrogel to obtain a
  • Mixture contains, under conditions that allow cell growth.
  • the opening (13) of the matrix holder (12) has an upper opening (13d) and the matrix holder (12) is reversibly connected to a colonization device (33) which comprises filling elements (40) and which
  • the matrix is a hydrogel comprising the steps of i. Suspending the cells to be cultivated in an appropriate amount of a cell culture medium to form a cell suspension, ii. Mix the cell suspension with a hydrogel to obtain a
  • Mixture contains, under conditions that allow cell growth.
  • Cell culture device according to one of items 1 to 7, additionally comprising a box (44) and an insert (43) for receiving one or more
  • the carrier with the matrix holders (13c) was connected to the inoculation device (30) and autoclaved together.
  • a 2D culture from mesenchymal stem cells was then washed twice with DPBS without Ca / Mg and trypsinized.
  • the detached cells were then taken up in medium with serum and transferred to 50 ml Falcon. Next, these were centrifuged in an ultracentrifuge at 0.3RPM for 5 minutes and the supernatant was discarded. In the next step, new medium without serum was added and, in addition, a cell count was carried out. The cells were then centrifuged again at 0.3 RPM for 5 minutes and the supernatant was discarded.
  • a 5 ml cell-fibrinogen-thrombin solution was prepared for 50 matrix holders.
  • the cell pellet was taken up in 1.75 ml medium without serum, so that a cell number between 1000-100000 cells per matrix was incorporated. This was followed by the addition of 750 ml of reconstituted fibrinogen, so that a concentration of 5 mg / ml of fibrinogen was achieved.
  • 2 ml of a thrombin stock solution (8000U / ml) was transferred to 250 ml of 40mM CaCh ( ⁇ 64U / ml). 40 ml of this solution were transferred to 2.5 ml of 40 mM CaCh ( ⁇ 1 U / ml).
  • 45 ml of the cell fibrinogen solution were pipetted into a matrix holder (12) using a pipette. Then 45 ml of thrombin solution (target concentration Fibrinogen ⁇ 2.5mg / ml thrombin 0.5U / ml) added to each cell fibrinogen plug without air bubbles and transferred to an incubator at 37 ° C with 5% CO2 for complete polymerization. After the polymerization, the inoculation device (30) was manually detached from the matrix holder (12) and the carrier with the fully polymerized matrix-cell solution was transferred to a new corrugated strip (11) with ⁇ 1 -1.5 ml of fresh medium each and transferred to an incubator (37 ° C / 5% CO 2) transferred.
  • thrombin solution target concentration Fibrinogen ⁇ 2.5mg / ml thrombin 0.5U / ml
  • the inoculation device (33) and a carrier with the matrix holders (13a) were autoclaved together.
  • a 2D culture from mesenchymal stem cells was washed twice with DPBS without Ca / Mg and trypsinized.
  • the detached cells were then taken up in medium with serum and transferred to 50 ml Falcon. This was followed by centrifugation using an ultracentrifuge at 0.3RPM for 5 minutes and the supernatant then discarded. In the next step, new medium without serum was added and a cell count was carried out. The cells were then centrifuged again at 0.3 RPM for 5 minutes and the supernatant was again discarded. 5 ml of cell-fibrinogen-thrombin solution were prepared for 5 matrices.
  • the cell pellet was taken up in 1.75 ml medium without serum, so that a cell number between 50000-250000 cells per matrix could be incorporated. This was followed by the addition of 750 ml of reconstituted fibrinogen, so that a concentration of 5 mg / ml of fibrinogen was achieved. Then 2 ml of a thrombin stock solution (8000U / ml) were transferred to 250 ml of 40 mM CaCh ( ⁇ 64U / ml). 40 ml of this solution were transferred to 2.5 ml of 40 mM CaCh ( ⁇ 1 U / ml).
  • the fibrinogen cell solution was mixed with the thrombin solution and 0.5 ml-1 ml was transferred into the colonization device (33).
  • the carrier was quickly immersed in the matrix holder and the inoculation device was stored in an incubator at 37 ° C. and 5% CO 2 until polymerization was complete. After the polymerization, the carrier was carefully pulled up out of the inoculation device and transferred to a new corrugated strip with fresh medium and transferred to an incubator (37 ° C./5% CO 2 ).
  • Example 3 Example 3:
  • a carrier with the matrix holders without opening (13b) and several corrugated strips (11) were autoclaved together.
  • a porous dehydrated matrix for example “Alvetex” Reprocell or “Mimetix” TheElectroSpinningCompany
  • the matrix could already be integrated in the matrix holder by means of lyphilization steps.
  • the matrix was rehydrated using ethanol and washed.
  • the liquids used were transferred into several parallel corrugated strips so that the carrier could quickly be dipped from one corrugated strip into the other.
  • a 2D culture from mesenchymal stem cells was washed twice with DPBS without Ca / Mg and trypsinized. The detached cells were then taken up in medium with serum and transferred to 50 ml Falcon. This was followed by another centrifugation by means of an ultrafuge, centrifuged at 0.3RPM for 5 minutes and subsequent removal of the supernatant. In the next step, new medium with serum was added and a cell count was carried out. The cells were then centrifuged again at 0.3 RPM for 5 minutes and the supernatant was discarded. A 5 ml cell solution was prepared for 50 matrix holders, the number of cells being between 1000 and 20,000 cells per matrix.
  • the carrier with the matrix holders was placed horizontally and 90 ml of cell suspension was transferred into the opening on the matrix.
  • the construct was then cultivated in an incubator for 12-24 hours at 37 ° C. and 5% CO 2 until the cells had attached to the matrix. After the attachment, the carrier was transferred to a new corrugated strip with fresh medium and its subsequent cultivation in an incubator (37 ° C / 5% CO 2).

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Die Erfindung betrifft eine Zellkulturvorrichtung für eine dreidimensionale Zellkultur mit einer oder mehreren Zellkultureinheiten, dadurch gekennzeichnet, dass eine Zellkultureinheit umfasst: i. mindestens eine Matrixhalterung, mit einer zentralen Öffnung zur Aufnahme einer Matrix; ii. einen Träger, der fix oder reversibel mit der mindestens einen Matrixhalterung verbunden ist; und iii. einen Wellstreifen, bestehend aus einem Gefäß mit mindestens einer Vertiefung, die mindestens eine Matrixhalterung bis zum oberen Ende der zentralen Öffnung oder mehr, umfassen kann, wobei die Matrixhalterung vertikal ausgerichtet ist.

Description

DREIDIMENSIONALE ZELLKULTUR
TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Erfindung betrifft das technische Gebiet der Zellkultur, insbesondere der dreidimensionalen Zellkultur tierischer und menschlicher Zellen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Tierische und menschliche Zellen werden in der biomedizinischen und pharmazeutischen Forschung traditionell in der zweiten Dimension kultiviert. Hierbei transferiert man Zellen auf eine Plastik- oder Glasoberfläche, an der sie sich festsetzen und vermehren können. Diese Umgebung entspricht jedoch nicht den natürlichen, physiologischen Bedingungen der Zellen und führt deshalb sehr oft zum Funktionsverlust, zur Dedifferenzierung der Zellen und schlimmstenfalls zum Zelltod. (DE102007020302A1 ). Zellen im menschlichen Körper verhalten sich in ihrem Milieu grundlegend anders als jene in Kultur. Die Gründe sind sowohl komplexe interzelluläre als auch extrazelluläre Vorgänge, welche beispielsweise durch benachbarte Zellen, dem Gewebe oder auch durch lösliche Faktoren, wie zum Beispiel Wachstumsfaktoren oder Hormone beeinflusst werden. 2D-Zellkulturen ermöglichen zwar das Anheften und Wachsen der Zellen außerhalb eines Organismus, spiegeln aber nur unzureichend die natürlichen Wachstumsbedingungen von Zellen in ihrer natürlichen Umgebung wider.
Um diese Gräben zwischen zwei dimensionaler Zellkultur und dem in vivo Milieu zu reduzieren, wurden im letzten Jahrzehnt zahlreiche dreidimensionale Zellkultursysteme als Alternative entwickelt. 3D-Kulturen bringen zahlreiche Vorteile mit sich, da die kultivierten Zellen ein physiologisch authentischeres Modell des menschlichen Gewebes ermöglichen. Dazu zählen beispielsweise Systeme mit festen Trägern, wie beispielsweise porösen Stützstrukturen, die die extrazelluläre Matrix imitieren, und T räger-unabhängige Systeme, wie beispielsweise Sphäroid-Kulturen. Momentan existieren ca. 150 unterschiedliche 3D Kultursysteme weltweit, von denen 76% ein Gerüst zur Kultivierung (scaffold-basiert) nutzen (BCC Research: “3D Cell Cultures: Technologies and Global Markets”, (BIO140A), Publ. Date: Jan. 2015). Beispiele sind etwa Hanging-Drop Multiwell-Platten, die zur Herstellung von Sphäroiden eingesetzt werden (US 2013/236924 A1), Systeme zur Erzeugung dreidimensionaler Matrizen, die einen magnetischen Kern umfassen (US 2017/137766 A1) oder etwa ein Zellkultursystem, das eine dreidimensionale biokompatible Gerüststruktur und Nanopartikel umfasst. Diese Strukturen sollen die extrazelluläre Matrix als natürliche Umgebung der Zellen nachbilden (DE102007020302A1 ).
DE10003521A1 beschreibt eine Vorrichtung zur Herstellung von dreidimensionalen Matrixkörpern, die aus einer Trägersubstanz und darin eingelagerten Zellkulturen bestehen, und deren Einsatz zur Kultivierung von Zellen in Multiwell-Platten.
US 2019/276784 A1 offenbart verschiedene komplexe Zellkulturvorrichtungen, die das Gelenk eines Säugetiers imitieren sollen. Die Zellkulturvorrichtung umfasst mehrere hohle Gerüste mit vielen Öffnungen, zur Aufnahme einer Matrix in dem Hohlraum des Gerüsts.
US 2007/237683 A1 offenbart eine Vorrichtung, die der besseren optischen Bildgebung von zweidimensionalen Zellkulturen dient. Die Vorrichtung umfasst eine Multiwell-Platte mit zylindrischen Einlässen ohne Boden, die die Wellstreifen halten. Die Wellstreifen umfassen ebenfalls zylindrische Vertiefungen, die in die Einlässe der Multiwell-Platte passen, aber einen durchsichtigen Boden haben, auf dem die Zellen kultiviert werden.
CA 2579680 A1 offenbart einen Bioreaktor mit einer Perfusionseinheit und einer Multiwell-Platte, die eine Vielzahl von Bioreaktor-Einheiten umfasst, in denen jeweils unterschiedliche Experimente durchgeführt werden können.
WO 2004/027016 A1 offenbart einen Perfusions-Inkubator mit einer peristaltischen Pumpe, der insbesondere zur Aufzucht von Embryonen verwendet werden kann.
Die Handhabung von scaffold-basierten Systemen und bereits bestehenden dreidimensionalen Zellkultursystemen gestaltet sich allerdings oftmals schwierig und eine Automatisierung der Zellkultur ist nur sehr schwer bis gar nicht möglich. Es besteht daher ein Bedarf an dreidimensionalen Zellkultursystemen, die robust und leicht zu handhaben sind und bevorzugt auch in einem automatisierten System geführt werden können.
KURZBESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Es ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, verbesserte Vorrichtungen zur in vitro Kultivierung tierischer und menschlicher Zellen zur Verfügung zu stellen. Insbesondere ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Zellkulturvorrichtungen zur Verfügung zu stellen, die eine vereinfachte Handhabung ermöglichen und deren Handhabung optional auch automatisiert werden kann.
Diese Aufgabe wird durch den Gegenstand der Erfindung gelöst. Die Verwendung von Scaffold -basierten Matrizen in automatisierten Zellkulturprozessen gestaltet sich aufgrund der Komplexität im Hinblick auf unterschiedliche Materialien und Techniken als schwierig. Aus diesem Grund wurde ein neues Zellkultursystem entwickelt in dem sowohl Hydrogele als auch poröse Stützstrukturen verwendet werden können. Insbesondere wurde eine Zellkulturvorrichtung in vertikaler Ausrichtung entwickelt, mit der Zellen in dreidimensionaler (3D) Umgebung kultiviert werden können. Das Ziel hierbei ist, den manuellen Aufwand möglichst zu reduzieren und Möglichkeiten für 3D-Kulturen aus Hydrogelen oder porösen Stützstrukturen für Medium- bis High-Throughput Anwendungen zu eröffnen.
Die vorliegende Erfindung umfasst eine Zellkulturvorrichtung für eine dreidimensionale Zellkultur mit einer oder mehreren Zellkultureinheiten, dadurch gekennzeichnet, dass eine Zellkultureinheit folgendes umfasst: i. mindestens eine Matrixhalterung (12), mit einer zentralen Öffnung (13) zur Aufnahme einer Matrix; ii. einen Träger (10), der fix oder reversibel mit der mindestens einen Matrixhalterung (12) verbunden ist; und iii. einen Wellstreifen (11), bestehend aus einem Gefäß mit mindestens einer Vertiefung, die mindestens eine Matrixhalterung (12) bis zum oberen Ende der zentralen Öffnung (13) oder mehr, umfassen kann, wobei die Matrixhalterung (12) vertikal ausgerichtet ist.
Der kompakte Aufbau der Zellkultureinheit erlaubt eine einfache Handhabe nicht nur einer, sondern auch mehrerer Matrixhalterungen.
Die zentrale Öffnung (13) der Matrixhalterung (12) kann eine durchgehende Öffnung (13a und 13c) oder eine Vertiefung mit einer Wand (13b) aufweisen.
Die Innenwände der Öffnung (13) können einen Winkel von 1-30° aufweisen, sodass die beiden Enden der Öffnung (13) einen unterschiedlichen Durchmesser haben können. Insbesondere können sie einen Winkel von etwa 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 oder 29° aufweisen.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch eine Besiedelungsvorrichtung (30, 33).
In einer Ausführungsform der Matrixhalterung (12) weist die Öffnung (13) der Matrixhalterung eine Vertiefung (13c) zur Abdichtung und reversiblen Befestigung an eine Besiedelungsvorrichtung (30, 33) auf. Gemäß einer besonderen Ausführungsform umfasst die Besiedelungsvorrichtung (30, 33) Dichtungselemente (31). Die Besiedelungsvorrichtung kann Erhöhungen (32) aufweisen.
In einer weiteren Ausführungsform weist die Öffnung (13a) eine obere Vertiefung (13d) auf, um den Einschluss von Luftblasen in der Matrix während der horizontalen Besiedelung zu vermeiden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Zellkulturvorrichtung, umfasst die zentrale Öffnung (13) eine Matrix, die ein fester poröser Träger oder ein Hydrogel ist, oder eine Kombination davon. Beispielsweise kann die Matrix ein fester poröser Träger sein, auf den ein Hydrogel aufgebracht wird und/oder der mit einem Hydrogel gefüllt ist.
Eine Zellkultureinheit kann mehrere Matrixhalterungen (12) umfassen. Insbesondere kann die Zellkultureinheit 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 oder 20 Matrixhalterungen (12) umfassen. Die Matrixhalterungen (12), die von einer Zellkultureinheit umfasst sind, können gleiche oder unterschiedliche Matrizen umfassen.
Insbesondere enthalten die Matrixhalterungen (12) einer Zellkultureinheit jeweils eine Matrix aus Hydrogel oder jeweils eine Matrix, die ein fester poröser Träger ist. Dies erlaubt die simultane Kultur von Zellen in derselben drei dimensionalen Umgebung, wobei das Medium in den Wells des Wellstreifens (11) ident oder unterschiedlich sein kann. Einerseits kann die Zusammensetzung des Mediums unterschiedlich sein, um beispielsweise den Einfluss des Mediums auf Zellwachstums zu untersuchen. Andererseits können, falls das Medium einen Testwirkstoff enthält, verschiedene Wirkstoffe oder verschiedene Konzentrationen eines Wirkstoffs, getestet werden.
Insbesondere umfasst eine Zellkultureinheit Matrixhalterungen (12) deren Matrix ein Hydrogel ist und Matrixhalterungen deren Matrix ein fester poröser Träger ist. Umfasst eine Zellkultureinheit verschiedene Matrixhalterungen (12), ermöglicht dies beispielsweise ein rasches Screening unterschiedlicher dreidimensionaler Umgebungen.
Insbesondere besteht die Matrix aus natürlichem, halbsynthetischem oder synthetischem Material oder einer Kombination davon. Optional kann die Matrix mit Protein- oder Peptid Sequenzen modifiziert oder beschichtet sein. Beispielsweise kann die Matrix Antikörper oder Antikörperfragmente oder RGD Sequenzen aufweisen. Insbesondere kann jegliches Material, das mit der Kultur von tierischen oder menschlichen Zellen vereinbar ist, als Material für die hierin beschriebene Matrix verwendet werden. Insbesondere ist das natürliche Material ausgewählt aus Kollagen, Fibrin, Glykosaminglykanen und Hyaluronsäure, und das synthetische oder halbsynthetische Material ausgewählt ist aus polymeren Bestandteilen wie Polymethylmethacrylat, Polymilchsäure, Polyglykol, Polystyrol und keramischen Bestandteilen wie Hydroxylapatit oder Trikalziumphosphat.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform weist der Träger (10) ein Element (15) zur Aufnahme der Matrixhalterung (12) auf und die Matrixhalterung (12) weist an ihrem oberen Ende Einkerbungen (14a, 14b) auf, über die sie reversibel mit dem Element (15) des Trägers (10) verbunden werden kann.
Gemäß einer weiteren besonderen Ausführungsform des Trägers (10) der Zellkulturvorrichtung, umfasst der Träger an mindestens einem Ende, bevorzugt an beiden Enden, eine Öffnung zur Befestigung einer magnetisierbaren Mutter (45), beispielsweise mittels Schraube. Insbesondere weist der Träger zusätzliche mehrere Öffnungen für Matrixhalterungen (46) auf, die beispielsweise mittels Befestigungszapfen (47) mit dem Träger verbunden werden können.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform umfasst die Vorrichtung zusätzlich eine Transporteinheit (20), welche eine oder mehrere Zellkultureinheiten (21) transportieren kann.
Insbesondere erleichtert die Transporteinheit (20) die Verwendung der gegenständlichen Zellkulturvorrichtung in einer automatisierten Umgebung. Mittels der Transporteinheit können eine oder mehrere Zellkultureinheiten bewegt und bedient werden. Insbesondere wird dadurch die Automatisierung bestimmter Prozesse möglich, wie beispielsweise automatisierter Medienwechsel oder automatisierte Besiedelung der Einheiten. Insbesondere kann die Automatisierung mittels eines Roboters erfolgen.
Gemäß einer bestimmten Ausführungsform umfasst die Transporteinheit: i. eine Tragschiene (22) zur Befestigung einer oder mehrerer Zellkultureinheiten (21) an der Transporteinheit (20), ii. eine Aufnahmeeinheit (20a) für eine Tragschiene (22), iii. einen Deckel (23), und iv. zwei Spacer-Elemente (24), die optional direkt miteinander verbunden sind, zur geordneten Aufnahme von mindestens zwei oder mehr Trägern (10) einer Matrixhalterung, v. optional mindestens ein Kennzeichnungselement (26) wie beispielsweise einen RFID-Chip oder einen Barcode, und vi. optional eine Zentriereinheit (27).
Insbesondere umfasst der Wellstreifen (11 ) eine Position (25) zur Befestigung an die Tragschiene (20).
Die Spacer-Elemente dienen der Aufnahme und geordneten Reihung der Zellkultureinheiten, die im Spacer über dem Träger (10) der Matrixhalterungen angebracht sind. Insbesondere sind die Zellkultureinheiten im Spacer (24) parallel angeordnet. Die Spacer-Elemente können fix oder reversibel miteinander verbunden sein oder auch nicht direkt miteinander verbunden sein, sondern nur über die Träger der Matrixhalterungen.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform umfasst die Transporteinheit (20): i) eine Platte (48), welche die Unterseite der Transporteinheit bildet, ii) Öffnungen in der Platte (48) zur Zentrierung der Transporteinheit auf der Platte (49), iii) Öffnungen in der Platte (48) für Verschraubungen (50), iv) eine weitere Platte (51), welche ungefähr auf mittlerer Höhe der Transporteinheit angebracht ist, v) magnetisierbare Metallstäbe (52), vi) eine Zentrierhalterung (54), vii) Öffnungen in der Platte (51) für die Zentrierhalterung (54), viii) und ein Zentrierobjekt (55).
Insbesondere dienen die magnetisierbaren Metallstäbe (52) zur reversiblen Verbindung mit einem Zellkultur-Roboter. Gemäß einem speziellen Beispiel dienen die magnetisierbaren Metallstäbe (52) als Andockpunkt zur reversiblen Verbindung mit einer robotisierten Einheit zum Transport der Transporteinheit, beispielsweise zur reversiblen Verbindung mit Magneten des Oli-MAT (erhältlich von LifeTaq-Analytics GmbH, Tulln an der Donau). Die Z-Achse des Oli-MAT verfügt über zwei Permanentmagneten, mit deren Hilfe die Transfereinheit von Position zu Position getragen werden kann. Durch einen kurzen Impuls können die Magneten kurzzeitig entmagnetisiert werden, was zum Abstellen der Transfereinheit führt.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch ein Verfahren zur Zellkultivierung unter Verwendung der hierin offenbarten Zellkulturvorrichtung.
Insbesondere umfasst das Verfahren die folgenden Schritte: i. Suspendieren der zu kultivierenden Zellen in einer angemessenen Menge eines Zellkulturmediums zur Bildung einer Zellsuspension, ii. Besiedeln der Matrix in der Öffnung (13) der Matrixhalterung (12) mit der Zellsuspension, iii. Übertragen der Matrixhalterung in einen Wellstreifen (11), insbesondere unter Verwendung des Trägers der Matrixhalterung (10), und iv. Inkubieren der Zellkulturvorrichtung, die die Zellen enthält, unter Bedingungen, die ein Zellwachstum ermöglichen.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform des hierin offenbarten Verfahrens, erfolgt die Besiedelung der Matrix mit der Zellsuspension in horizontaler Anordnung der Matrixhalterung (12).
Insbesondere weist die Matrixhalterung (12) der Zellkulturvorrichtung zur Verwendung in diesem Verfahren, eine Öffnung (13) mit einer Vertiefung (13c) auf, wobei die Matrixhalterung über ein komplementäres Dichtungselement (31) an einer Besiedelungsvorrichtung (30) reversibel mit dieser verbunden ist, wobei die verwendete Matrix ein Hydrogel ist und das Zellkultivierungsverfahren insbesondere die folgenden Schritte umfasst: i. Suspendieren der zu kultivierenden Zellen in einer angemessenen Menge eines Zellkulturmediums zur Bildung einer Zellsuspension, ii. Vermischen der Zellsuspension mit einem oder mehreren Bestandteilen eines Hydrogels, um eine Zellsuspension-Hydrogel Mischung herzustellen, iii. Besiedeln der Öffnung (13) der Matrixhalterung (12), die horizontal in der Besiedelungsvorrichtung (30) ausgerichtet ist, mit der Zellsuspension-Hydrogel- Mischung, iv. Inkubieren des Zellansatzes in einer geeigneten Kultivierungsumgebung, vorzugsweise bei 37°C und 5% CÖ2, bis zur Auspolymerisation der Matrix, v. Trennen der Matrixhalterung (12) von der Besiedelungsvorrichtung (30), vi. Übertragen der Matrixhalterung (12) in einen mit Medium befüllten Wellstreifen (11), bevorzugt unter Verwendung des Trägers der Matrixhalterung (10), vii. Inkubieren der Zellkulturvorrichtung, die die Zellsuspension-Matrix Mischung enthält, unter Bedingungen, die ein Zellwachstum ermöglichen.
Die Auspolymerisierung des Hydrogels kann insbesondere ungefähr 5 Minuten und bis zu 24 Stunden dauern. Die Dauer der Auspolymerisation ist typischerweise von der Zusammensetzung des Hydrogels, insbesondere seiner Bestandteile und deren Konzentration abhängig, sowie von der Umgebung, beispielsweise der Luftfeuchtigkeit und der Lufttemperatur. Der Fachmann ist in der Lage, dementsprechend die benötigte Zeit bis zur Aushärtung des Gels zu bestimmen.
Nach der Auspolymerisation der Zellsuspension-Hydrogel Mischung, kann eine weitere Schicht einer Zellsuspension-Hydrogel Mischung in die Matrix eingebracht werden. Die weitere Zellsuspension-Hydrogel Mischung kann andere Zellen als die erste Mischung, wie beispielsweise modifizierte Varianten der Zellen der ersten Mischung, enthalten. Die weitere Zellsuspension-Hydrogel Mischung kann die gleichen Zellen wie die erste Mischung enthalten, aber beispielsweise eine andere Hydrogel- Zusammensetzung.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform weist die Besiedelungsvorrichtung (30) eine innere Erhöhung (32) auf, die dafür sorgt, dass bei der Auspolymerisation der Zellsuspension-Hydrogel Mischung eine Vertiefung in der Öffnung (13) entsteht, welche nach Entfernen der Besiedelungsvorrichtung (30) mit der weiteren Zellsuspension- Hydrogel Mischung befüllt werden kann. Dies ermöglicht beispielsweise die Ko-Kultur unterschiedlicher Zellarten, oder die Kultur einer Zellart in unterschiedlicher dreidimensionaler Umgebung in einer Matrixhalterung (12).
Gemäß einerweiteren Ausführungsform des hierin offenbarten Verfahrens, wobei die Besiedelung der Matrix mit der Zellsuspension in horizontaler Anordnung der Matrixhalterung (12) erfolgt, weist die Öffnung (13) der Matrixhalterung (12) eine Vertiefung mit einer Wand (13b) auf, und die Matrix ist ein fester poröser Träger. Insbesondere umfasst das Verfahren die folgenden Schritte: i. Transfer eines festen porösen Trägers in die Vertiefung (13b), ii. Suspendieren der zu kultivierenden Zellen in einer angemessenen Menge eines Zellkulturmediums zur Bildung einer Zellsuspension, iii. Transferieren der Zellsuspension in die Öffnung (13b) der Matrixhalterung
(12), iv. Inkubieren der Besiedelungsvorrichtung für mindestens 30min bis 24h unter Bedingungen, die das Anwachsen der Zellen an dem festen porösen Träger ermöglichen, v. Übertragung der Matrixhalterung in einen zuvor mit Medium befüllten Wellstreifen (11), insbesondere unter Verwendung des Trägers der Matrixhalterung (10), und vi. Inkubieren der Zellkulturvorrichtung, die die angehefteten Zellen an den porösen Träger enthält, unter Bedingungen, die ein Zellwachstum ermöglichen.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform des hierein offenbarten Verfahrens erfolgt die Besiedelung der Matrix mit der Zellsuspension in vertikaler Anordnung der Matrixhalterung (12).
Insbesondere weist die Matrixhalterung (12) der Zellkulturvorrichtung zur Verwendung in diesem Verfahren, eine obere Öffnung (13d) auf, die Matrixhalterung (12) ist reversibel mit einer Besiedelungsvorrichtung (33) verbunden und die Matrix ist ein Hydrogel. Insbesondere weist das Verfahren die folgenden Schritte auf: i. Suspendieren der zu kultivierenden Zellen in einer angemessenen Menge eines Zellkulturmediums zur Bildung einer Zellsuspension, ii. Vermischen der Zellsuspension mit einem Hydrogel, um eine Zellsuspension-Hydrogel Mischung herzustellen, iii. Befüllen der Vertiefungen (Wells) der Besiedelungsvorrichtung (33) mit der Zellsuspension-Hydrogel-Mischung, iv. Besiedeln der Öffnung (13) der Matrixhalterung durch Eintauchen der Matrixhalterung (12) in die Besiedelungsvorrichtung (33), v. Inkubieren des Zellansatzes in einer geeigneten Kultivierungsumgebung, vorzugsweise bei 37°C und 5% CÖ2, bis zur Auspolymerisation der Matrix, vi. Übertragen der Matrixhalterung (12) von der Besiedelungsvorrichtung (33) in einen mit Nährmedium befüllten Wellstreifen (11), und vii. Inkubieren der Zellkulturvorrichtung, die die Zellsuspension-Matrix Mischung enthält, unter Bedingungen, die das Zellwachstum ermöglichen.
Um das Volumen möglichst gering zu halten, kann das Volumen der Wells der Besiedelungsvorrichtung (33) im Gegensatz zum Wellstreifen (11) reduziert sein. Die Besiedelungsvorrichtung (33) kann zusätzlich Befüllungselemente (40) aufweisen. Über die Befüllungselemente (40) können die Wells der Besiedelungsvorrichtung (33) mit Medium befüllt werden.
Insbesondere weist das Verfahren die folgenden Schritte auf, wenn eine Befüllungsvorrichtung (33) verwendet wird, die Befüllungselemente (40) aufweist: i. Suspendieren der zu kultivierenden Zellen in einer angemessenen Menge eines Zellkulturmediums zur Bildung einer Zellsuspension, ii. Vermischen der Zellsuspension mit einem Hydrogel, um eine Zellsuspension-Hydrogel Mischung herzustellen, iii. Einführen der Matrixhalterung in die Besiedelungsvorrichtung (33), iv. Befüllen der Wells der Besiedelungsvorrichtung (33) mit der Zellsuspension-Hydrogel-Mischung über die Befüllungselemente (40), wodurch die Öffnung (13) der Matrixhalterung mit der Zellsuspension-Hydrogel-Mischung besiedelt wird, v. Inkubieren des Zellansatzes in einer geeigneten Kultivierungsumgebung, vorzugsweise bei 37°C und 5% 5% CO2, bis zur Auspolymerisation der Matrix vi. Übertragen der Matrixhalterung (12) von der Besiedelungsvorrichtung (33) in einen mit Nährmedium befüllten Wellstreifen (11), und vii. Inkubieren der Zellkulturvorrichtung, die die Zellsuspension-Matrix Mischung enthält, unter Bedingungen, die Zellwachstum ermöglichen.
Gemäß einer weiteren besonderen Ausführungsform ist die Matrixhalterung zur Besiedelung horizontal ausgerichtet. In dieser Ausführungsform weist die Öffnung (13) der Matrixhalterung (12) eine Vertiefung mit einer Wand (13b) auf und die Matrix ist ein fester poröser Träger. Das Verfahren zur Besiedelung der Matrixhalterung in dieser Ausführungsform umfasst die Schritte: i. Transfer eines festen porösen Trägers in die Vertiefung (13b), ii. Suspendieren der zu kultivierenden Zellen in einer angemessenen Menge eines Zellkulturmediums zur Bildung einer Zellsuspension, iii. Transfer der Zellsuspension in die Öffnung (13b) der Matrixhalterung (12), iv. Inkubieren der Besiedelungsvorrichtung, insbesondere für mindestens 30min bis 24h, unter Bedingungen, die das Anwachsen der Zellen an dem festen porösen Träger ermöglichen.
Anschließend kann die Matrixhalterung in einen mit Zellkulturmedium befüllten Wellstreifen (11), insbesondere unter Verwendung des Trägers der Matrixhalterung (10), transferiert werden und die Zellen können in der Zellkulturvorrichtung, welche die an den porösen Träger angehefteten Zellen enthält, unter Bedingungen inkubiert werden, die ein Zellwachstum ermöglichen.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren kann der T ransfer der Matrixhalterungen in einen Wellstreifen, der T ransfer einer ganzen Zellkulturvorrichtung und/oder der Transfer eines Wellstreifens durch einen robotergestützten Greifarm automatisiert erfolgen.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform der Zellkulturvorrichtung ist der Wellstreifen eine Perfusionsvorrichtung (34), die Schlauchanschlüsse (41) zum An Schluss an eine Pumpe aufweist. Über diese Schlauchanschlüsse kann mittels einer Pumpe ein kontinuierlicher Fluss einer zellverträglichen Flüssigkeit, wie beispielsweise Zellkulturmedium, durch die Perfusionsvorrichtung geleitet werden.
Gemäß einerweiteren Ausführungsform umfasst die Zellkulturvorrichtung weiters eine Box (44) und einen Einsatz (42) zur Aufnahme einer oder mehrerer
Zellkultureinheiten (21) in der Box (44).
Gemäß einerweiteren Ausführungsform umfasst die Zellkulturvorrichtung weiters eine Box (44) und einen Einsatz (43) zur Aufnahme einer oder mehrerer
Besiedelungsvorrichtungen (33) in der Box (44).
FIGUREN
Figur 1 zeigt Bestandteile einer Ausführungsform der Zellkultureinheit (21), insbesondere Matrixhalterungen (12) mit verschiedenen Öffnungen (13a, 13b, 13c, 13d), einen Wellstreifen (11) und einen Träger (10).
Figur 2 zeigt Bestandteile einer Ausführungsform der Transporteinheit (20), insbesondere eine Aufnahmeeinheit (20a), mehrere Zellkultureinheiten (21), eine Tragschiene (22), einen Deckel (23), Spacer-Elemente (24), ein Kennzeichnungselement (26) und eine Zentriereinheit (27).
Figur 3 zeigt Besiedelungsvorrichtungen. Figur 3a) zeigt eine Besiedelungsvorrichtung (30) mit Dichtungselementen (31), die reversibel mit der Matrixhalterung (12) über die Vertiefung der Öffnung (13c) verbunden werden können. Figur 3b) zeigt eine Besiedelungsvorrichtung (30) die Erhöhungen (32) aufweist.
Figur 4 zeigt Bestandteile einer Zellkultureinheit und die Besiedelungsvorrichtung
(33) mit Befüllungselementen (40).
Figur 5 zeigt Bestandteile einer Zellkultureinheit und eine Perfusionsvorrichtung
(34) mit Schlauchanschlüssen (41).
Figur 6 zeigt Bestandteile einer Zellkultureinheit (10, 11, 12) und eine Box (44) und einen Einsatz (42) zur Aufnahme einer oder mehrerer Zellkultureinheiten in der Box.
Figur 7 zeigt Bestandteile einer Zellkultureinheit (10, 12) mit einer Besiedelungsvorrichtung (30), sowie eine Box (44) zur Aufnahme einer oder mehrerer Besiedelungsvorrichtungen.
Figur 8 zeigt eine weitere Ausführungsform eines Trägers (10) der Zellkulturvorrichtung mit einer Öffnung zur Befestigung einer magnetisierbaren Mutter mittels Schraube (45), mehreren Öffnungen im Träger für Matrixhalterungen (46), Befestigungszapfen einer Matrixhalterung (47) und der Matrixhalterung (12).
Figur 9 zeigt eine weitere Ausführungsform der Transporteinheit (20) umfassend mehrere Zellkulturvorrichtungen (21). Die Figur zeigt eine Platte (48) welche die Unterseite der Transporteinheit bildet, Öffnungen in der Platte (48) zur Zentrierung der Transporteinheit auf der Platte (49), Öffnungen in der Platte (48) für Verschraubungen (50), eine weitere Platte (51) welche ungefähr auf mittlerer Höhe der Transporteinheit angebracht ist, magnetisierbare Metallstäbe (52), eine Zentrierhalterung (54) und Öffnungen in der Platte (51) für die Zentrierhalterung (54) und ein Zentrierobjekt (55).
Figur 10 zeigt eine weitere Ausführungsform einer Besiedelungsvorrichtung (30) umfassend Dichtungselemente (31). Die Figur zeigt einen Träger (10) mit einer Matrixhalterung (12), die in die Besiedelungsvorrichtung eingebracht ist.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Verwendung von unterschiedlichen Matrizen in automatisierten Zellkulturprozessen gestaltet sich aufgrund der Komplexität im Hinblick auf unterschiedliche Materialien und Techniken als schwierig. Aus diesem Grund wurde ein System entwickelt in dem sowohl Hydrogele als auch feste poröse Träger verwendet werden können. Das Ziel bei der Verwendung automatisierter Prozesse ist, den manuellen Auswand möglichst gering zu halten.
Erfindungsgemäß eröffnet die gegenständliche Zellkulturvorrichtung die Möglichkeit dreidimensionale Zellkulturen mit einer Matrix aus Hydrogel und/oder porösen Stützstrukturen in automatisierten Medium- bis High-Throughput Anwendungen zu verwenden. Beispielsweise können somit Toxikologiestudien in einem automatisierten Umfeld in einer dreidimensionalen Zellkultur durchgeführt werden.
Die Erfindung betrifft Zellkulturvorrichtungen zur in vitro Kultivierung biologischer Zellen und von Gewebe sowie Kultivierungsverfahren unter Verwendung dieser Zellkulturvorrichtungen. Insbesondere sind die gegenständlichen Zellkulturvorrichtungen robust und leicht zu handhaben und ermöglichen die in vitro Kultivierung von Zellen in dreidimensionaler Umgebung. Ein weiterer besonderer Vorteil der gegenständlichen Zellkulturvorrichtungen ist, dass sie zur Verwendung in einer automationsgestützten Umgebung, beispielsweise in Kombination mit einem Roboter, geeignet sind. Durch den kompakten Aufbau der erfindungsgemäßen Zellkulturvorrichtung, insbesondere der Zellkultureinheiten, kann die Kultivierung verschiedener Zellarten in verschiedenen Umgebungen simultan ablaufen, wobei Variationen in der Kultivierung der Zellen, insbesondere durch menschliche Interaktion mit der Zellkulturvorrichtung, reduziert werden. Insbesondere können mehrere Replikate eines Zellkultursystems zeitgleich kultiviert werden.
Die gegenständliche Zellkulturvorrichtung umfasst mindestens eine Matrixhalterung, einen Träger zur Fixierung der Matrixhalterung und ein Gefäß mit mindestens einer in der Regel wannenförmigen Vertiefung (Well), das Wellstreifen genannt wird. Die erfindungsgemäße Zellkulturvorrichtung ist besonders dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens eine Matrixhalterung vertikal ausgerichtet ist.
Die Matrixhalterung ist insbesondere dadurch gekennzeichnet, dass sie aus einer äußeren Basisgrundform besteht und eine innere zentrale Öffnung umfasst. Diese Öffnung kann verschiedene Modifikationen und Formen aufweisen, beispielsweise kann sie eine durchgehende Öffnung sein oder eine Vertiefung mit einer rückseitigen Wand, die daher nur zu einer Seite hin offen ist. Dadurch wird ermöglicht, dass sowohl Hydrogele als auch feste poröse Träger verwendet werden können. Die Öffnung der Matrixhalterung kann durchgehend oder nicht-durchgehend sein, die Matrixhalterung kann beispielsweise eine rechteckige oder runde Öffnung aufweisen und beispielsweise als Zylinder, Quader, Pyramide, oder Würfel geformt sein.
Die Innenwände der Öffnung der Matrixhalterung können gerade sein oder einen Winkel von etwa 1 bis 25 Grad. Insbesondere können die inneren Wände der Öffnung der Matrixhalterung einen Winkel von etwa 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 oder 25 Grad aufweisen. Optional kann auch die Außenwand der Öffnung einen solchen Winkel aufweisen.
Dadurch können die beiden Enden der Öffnung einen unterschiedlichen Durchmesser aufweisen. Beispielsweise kann somit, wenn die Öffnung eine Vertiefung mit einer Wand ist, die rückseitige Wand einen kleineren Durchmesser aufweisen, als die vorderseitige Öffnung. Das hat den Effekt, dass Hydrogele geringer an der rückseitigen Wand haften und aus der Öffnung der Matrixhalterung leichter entfernt werden können. Dadurch können Schäden am Hydrogel und an den Zellen beim Entfernen aus der Matrixhalterung vermieden werden.
In einer besonderen Ausführungsform weist die Matrixhalterung auch rund um die innere zentrale Öffnung Modifikationen auf. Diese Modifikationen können beispielsweise weitere Vertiefungen rund um die Öffnung sein, wodurch eine Wand rund um die Öffnung entsteht. Diese Wand stellt insbesondere eine erhabene Rundung dar mit einer inneren wannenförmigen Öffnung, welche optional eine Wand aufweist, beispielsweise eine rückseitige Wand, oder durchgehend ist. Modifikationen dieser Art sind insbesondere dafür geeignet um die Matrixhalterung mit einer entsprechend kompatiblen Besiedelungsvorrichtung reversibel, beispielsweise über ein Stecksystem, zu verbinden.
In einer weiteren besonderen Ausführungsform weist die Matrixhalterung am oberen Rand der Öffnung eine Vertiefung oder auch eine Einbuchtung auf, wodurch Luftblasen aus dem Well entweichen können. Dadurch kann beispielsweise der Einschluss von Luftblasen in der Matrix, insbesondere während der Besiedelung, vermieden werden.
Es ist bekannt, dass mechanische Stimulation die Bildung von extrazellulären Matrixproteinen anregt. Gemäß einer besonderen Ausführungsform ist die Matrixhalterung aus weichem, elastischem Silikon unterschiedlicher Shorehärte geformt, wodurch mechanische Kräfte, wie etwa ziehen, dehnen oder drücken, auf die Matrixhalterung und somit auf die Zellen in der Matrix ohne negativen Effekt wirken können.
Die gegenständliche Zellkulturvorrichtung weist mindestens einen Träger auf, der fix oder reversibel mit mindestens einer Matrixhalterung verbunden ist. Bevorzugt ist der Träger dazu geeignet mehr als eine Matrixhalterung, insbesondere mindestens 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 oder mehr Matrixhalterungen fix oder reversibel aufzunehmen. Bevorzugt sind die Matrixhalterungen dabei in Längsrichtung angeordnet, insbesondere in einer Linie oder in parallelen Linien.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform, in der Matrixhalterungen reversibel mit dem Träger verbunden sind, umfasst der Träger Konstruktionen oder Elemente zur Aufnahme jeweils einer Matrixhalterung. Bevorzugt sind diese Konstruktionen oder Elemente in Längsrichtung angeordnet, insbesondere in einer Linie oder in parallelen Linien. Insbesondere weisen die Matrixhalterungen Elemente auf, wie beispielsweise Einkerbungen, die mit den Konstruktionen oder Elementen des Trägers kompatibel sind und dadurch reversibel mit dem Träger verbunden werden können. Beispielsweise können die Elemente des Trägers und die Einkerbungen einer Matrixhalterung ein Stecksystem darstellen, indem die Einkerbungen der Matrixhalterung in die Elemente des Trägers gesteckt oder geschoben werden.
Gemäß einer weiteren besonderen Ausführungsform weist der Träger Elemente zur fixen oder reversiblen Verbindung und Befestigung an eine Transporteinheit auf. Insbesondere weisen der Träger und die Transporteinheit kompatible Elemente auf über die Träger und Transporteinheit fix oder reversibel miteinander verbunden werden können. Beispielsweise können sie verbunden werden, indem eines der Elemente in das dazu passende Element geschoben oder gesteckt wird.
Gemäß einer weiteren besonderen Ausführungsform des Trägers der Zellkulturvorrichtung, umfasst der Träger an mindestens einem Ende, bevorzugt beiden Enden, eine Öffnung zur Befestigung einer magnetisierbaren Mutter, beispielsweise mittels Schraube. Insbesondere weist der Träger zusätzlich mehrere Öffnungen für Matrixhalterungen auf, die beispielsweise mittels Befestigungszapfen mit dem Träger verbunden werden können.
Bevorzugt ist die Mutter aus Eisen oder einem anderen magnetisierbaren Metall. Die Mutter kann durch Permanentmagneten, beispielsweise in einer separaten Konstruktion wie etwa einem Roboter, magnetisiert werden. Die separate Konstruktion kann beispielsweise ein Zellkulturroboter sein, beispielsweise Oli-Mat (erhältlich von LifeTaq-Analytics GmbH, Tulln an der Donau). Über die magnetisierbare Mutter kann der Träger reversibel mit der separaten Konstruktion verbunden werden und somit die Bewegung der Zellkultureinheit (beispielsweise in frisches Nährmedium) über den Träger ermöglichen. Zum Abstellen am Zielort, können die Träger durch physische Krafteinwirkung oder durch einen kurzen Impuls vom Magneten getrennt werden.
Die gegenständliche Zellkulturvorrichtung weist mindestens einen Wellstreifen auf, welcher aus einem Gefäß mit mindestens einer Vertiefung besteht. Diese Vertiefung kann mindestens eine Matrixhalterung, mindestens bis zum oberen Ende der zentralen Öffnung der Matrixhalterung, vollständig umfassen. Bevorzugt weist der Wellstreifen Vertiefungen auf, deren Anzahl mit der Anzahl an Matrixhalterungen auf einem Träger korrespondiert. Alternativ kann der Wellstreifen auch mehr Vertiefungen aufweisen als Matrixhalterungen auf einem Träger enthalten sind, und/oder mindestens eine der Vertiefungen des Wellstreifens kann mehr als eine Matrixhalterung aufnehmen. Optional weist der Wellstreifen nur eine Vertiefung auf, welche groß genug ist um alle Matrixhalterungen eines Trägers oder mehrerer Träger aufzunehmen. Umfasst eine Vertiefung des Wellstreifens mehrere Matrixhalterungen, so sind die Matrixhalterungen in Kontakt mit demselben Medium, wodurch beispielsweise Variationen in der Zusammensetzung des Mediums zwischen verschiedenen Vertiefungen vermieden werden können.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform weist der Wellstreifen ein Element zur fixen oder reversiblen Befestigung an die Transporteinheit auf. Optional weist der Wellstreifen auch eine Abschleif- oder Abstreifkonstruktion auf. Eine Abschleifkonstruktion ist insbesondere bei Verwendung der Zellkulturvorrichtung in einer automatisierten Umgebung, beispielsweise mit einem Roboter, hilfreich, da so das T ropfen von Zellkulturmedium beim Transport einzelner Einheiten vermieden werden kann.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform weist mindestens eine der Vertiefungen ein Insert auf, wodurch das Volumen der Vertiefung verringert wird. Beispielsweise kann hierdurch das benötigte Volumen an Zellkulturmedium oder Hydrogel verringert werden, wodurch die Kosten der Zellkultur erheblich gesenkt werden können. Durch Reduktion des Volumens kann auch die Menge an Reagenzien, die in dem Zellkultursystem an den Zellen getestet oder verwendet werden, reduziert werden.
Die Bestandteile der gegenständlichen Zellkulturvorrichtung können aus jeglichem Material bestehen, das in einem Zellkultursystem verwendet werden kann. Insbesondere bestehen die Komponenten der Zellkulturvorrichtung aus biokompatiblem und sterilisierbarem Material. Dazu zählen beispielsweise Materialien wie Silikon, Polycarbonat, Polystyrol, Polyethylen, Polysulfon (PSU), Polyphenylsulfon (PPSU) und andere üblicherweise in Zellkultursystemen verwendete Materialien.
Die hierin beschriebene Matrix kann ein fester poröser Träger oder ein Hydrogel, oder eine Kombination davon, sein. Beispielsweise kann die Matrix ein fester poröser Träger sein, auf den ein Hydrogel aufgebracht wird und/oder der mit einem Hydrogel gefüllt ist. Beispielsweise kann die poröse Matrix auch dehydriert sein. Im Speziellen kann die poröse Matrix ein Poly(L-Lactid) (PLLA) sein, das zu Mikrofasern verarbeitet ist, die hinsichtlich des Faserdurchmessers und der Porengröße sehr konsistent ist. Alternativ kann es sich um Polystyrene Scaffolds handeln die für die 3D Zellkultur geeignet sind. Insbesondere besteht die Matrix aus natürlichem, halbsynthetischem oder synthetischem Material, oder einer Kombination davon. Optional kann die Matrix mit Proteinen oder Peptiden modifiziert oder beschichtet sein. Beispielsweise kann die Matrix Antikörper, Antikörperfragmente oder RGD Sequenzen aufweisen. RGD- Sequenzen sind Aminosäure-Sequenzen enthaltend Arginin/Glycin/Asparagin. Diese Sequenzen kommen in Proteinen der EC-Matrix vor, beispielsweise
Fibronektin/Vitronektin. Zellen können über Integrine an diese binden.
Die poröse Matrix kann in die Matrixhalterung transferiert werden, sie kann alternativ aber auch mittels Lyophilisierung in der Matrixhalterung integriert sein.
Insbesondere kann jegliches Material, das mit der Kultur von tierischen Zellen vereinbar ist, als Material für die hierin beschriebene Matrix verwendet werden. Insbesondere ist das natürliche Material ausgewählt aus Kollagen, Fibrin, Glykosaminglykanen und Hyaluronsäure, und das synthetische oder halbsynthetische Material ausgewählt aus polymeren Bestandteilen wie Polymethylmethacrylat, Polymilchsäure, Polyglykol, Polystyrol und keramischen Bestandteilen wie Hydroxylapatit oder Trikalziumphosphat.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform wird die Matrix in der Matrixhalterung mit Proteinen oder Proteinbestandteilen aufbereitet. Hierbei wird das Hydrogel oder der feste poröse Träger in der Matrixhalterung gebildet. Nachfolgend kann die Matrix durch traditionelle Quervernetzungstechniken wie NHS-EDC oder Click-Chemie oder anderen Varianten mit funktionellen Proteinen wie Antikörpern, Wachstumsfaktoren oder extrazellulären Protein sowie mit funktionellen Peptiden funktionalisiert werden, wobei die unterschiedlichen Flüssigkeiten in unterschiedlichen Wellstreifen gelagert sind und die chemischen Reaktionen über den manuellen Wechsel von einem Wellstreifen zum nächsten erfolgt. Danach kann eine Besiedelung mit Zellen oder ein operativer Eingriff in einen tierischen Organismus erfolgen.
In dem gegenständlichen Zellkultursystem können sowohl adhärente Zellen als auch Suspensionszellen kultiviert werden.
Die zu kultivierenden Zellen sind bevorzugt eukaryotische Zellen, insbesondere tierische Zellen. Vorzugsweise sind die Zellen Säugerzellen, insbesondere bevorzugt menschliche aber auch nicht-menschliche, wie beispielsweise Nagetierzellen etwa von Maus, Hamster, Opossum, Potorous, oder Ratte, Insekten, bovine Zelllinien, Hund wie MDCK Zelllinien, Schwein etc.
Die Zellen können Stammzellen sein, z.B. omnipotent, pluripotent, multipotent oder unipotent, oder differenzierte Gewebezellen oder Blutzellen bzw. Lymphozyten sein. Die Zellen können von immortalisierten Zelllinien sein, z.B. Tumorzelllinien. Es ist möglich, dass die Zellen so kultiviert werden, dass eine Differenzierung stattfindet. Somit können Zellen den Differenzierungsgrad auch ändern. Dies sollte vorzugsweise durch die Kulturbedingungen festgelegt werden (z.B. Wachstums- oder Differenzierungsfaktoren).
Adhärente Zellen umfassen jegliche tierische, insbesondere menschliche, Zellen, die typischerweise in der biomedizinischen oder pharmazeutischen Forschung verwendet werden. Dazu zählen beispielsweise Stammzellen aus diversen Quellen wie dem Mesenchym, Fett, Leber, Gehirn oder anderen Quellen bzw. differenzierte Zellen wie Fibroblasten, Chondrozyten, Osteoblasten, Epithelzellen unterschiedlichen Ursprungs, Endothelzellen, neuronale Zellen, Hepatozyten sowie induzierte pluripotente Stammzellen embryonalen Ursprungs, und Zelllinien.
Suspensionszellen können beispielsweise Vorläuferzellen des Blutes oder differenzierte Blutzellen umfassen. Dabei können Suspensionszellen entweder in einer Hydrogelmatrix eingebettet werden oder als Suspension im Rahmen von Ko- Kulturstudien im Wellstreifen kultiviert werden, wobei im zweiten Fall eine adhärente Zellkultur in einer Matrix in der Matrixhalterung eingebettet ist. Beispielsweise können Interaktionsstudien zwischen Blutzellen als Suspension und mesenchymalen Stammzellen in einem Hydrogel in der Matrixhalterung durchgeführt werden.
Ein dreidimensionales Zellkultursystem bezeichnet die Kultivierung von Zellen in einer mikrostrukturierten dreidimensionalen Zellkultur unter in vitro Bedingungen. Die Kultur bzw. ihre Zellen sollen eine räumliche Orientierung einnehmen. Dies geschieht hauptsächlich in Form von Hydrogelen aus Gerüstproteinen wie etwa Fibrin, Kollagen, Gelatine-(Poly)Methacrylat oder Matrigel sowie aus festen Scaffolds wie beispielsweise aus Polystyrol Polylactatsäure oder anderen chemischen Substanzen. In einer dreidimensionalen Umgebung bilden viele Zelllinien Sphäroide aus, deren Durchmesser im Laufe der Zeit nach der Einbettung der Zellen anwächst. Auch nicht Sphäroid bildende Zellen zeigen oft eine Morphologie, die sich von 2D Kulturen stark unterscheidet.
Vorzugsweise wird in der erfindungsgemäßen Zellkulturvorrichtung und im erfindungsgemäßen Verfahren eine zellverträgliche Flüssigkeit eingesetzt, insbesondere Zellkulturmedium. In dieser Flüssigkeit werden vorzugsweise die oben beschriebenen Schritte ii) bis v) durchgeführt. Diese Flüssigkeit wird als Teil der komplexen zellulären Umgebung eingesetzt. Sie kann ein zum Wachstum der Zellen oder zur Zellversorgung geeignetes Medium sein. Definierte Zellkulturmedien basieren auf den Komponenten-Gruppen Aminosäuren, Kohlenhydrate, anorganische Salze und Vitamine. Häufig enthaltene Salze sind beispielsweise Calciumchlorid, Kaliumchlorid, Magnesiumsulfat, Natriumchlorid und Mononatriumphosphat. Häufig enthaltene Vitamine sind beispielsweise Folsäure, Nicotinamid, Riboflavin und B12. Zusätzlich kann das Zellkulturmedium FCS (Fetal Calf Serum) oder FBS (Fetal Bovine Serum) enthalten. Bevorzugte Zellkulturmedien sind MEM, a-MEM, DMEM, RPMI und Variationen oder Abwandlungen davon.
Umfasst die erfindungsgemäße Zellkulturvorrichtung auch eine zellverträgliche Flüssigkeit, wie etwa Zellkulturmedium, und lebende Zellen so wird es auch als Zellkultursystem bezeichnet.
Insbesondere umfasst das Zellkultursystem das Behältnis und das Kulturmedium, nicht jedoch die spezielle atmosphärische Zusammensetzung. Somit können die Zellen in Schritt ii) des gegenständlichen Verfahrens aus dem Inkubator, in dem atmosphärische Bedingungen herrschen, die ein möglichst gutes Wachstum begünstigen sollen, herausgenommen werden. Die bevorzugten atmosphärischen Bedingungen für ein möglichst gutes Zellwachstum für tierische Zellen sind 35-38°C, besonders bevorzugt ungefähr 37°C, und 0-10% CO2, besonders bevorzugt 3-6% CO2.
Eine hier beschriebene Transporteinheit zum Transport der Zellkultureinheiten umfasst bevorzugt eine Tragschiene (22) zur Befestigung einer oder mehrerer Zellkultureinheiten, eine Aufnahmeeinheit (20a) für eine Tragschiene (22), einen Deckel (23), und zwei Spacer-Elemente (24), die optional direkt miteinander verbunden sind, zur geordneten Aufnahme von mindestens zwei oder mehr Trägern (10) einer Matrixhalterung. Optional kann die Transporteinheit ein oder mehrere Kennzeichnungselemente (26) wie beispielsweise einen RFID, Barcode oder QR Code umfassen, und/oder eine Zentriereinheit (27), speziell für automatisierte Prozesse. Die Transporteinheit besteht bevorzugt aus einem festen Material, beispielsweise einem Kunststoff, der bevorzugt temperaturbeständig und/oder säureresistent ist. Die einzelnen Elemente der Transporteinheit können aus dem gleichen Material oder aus verschiedenen Materialien bestehen.
Optional kann die hierin beschriebene Transporteinheit weiters eine Platte (48) welche die Unterseite der Transporteinheit bildet, Öffnungen in der Platte (48) zur Zentrierung der Transporteinheit auf der Platte (49), Öffnungen in der Platte (48) für Verschraubungen (50), eine weitere Platte (51) welche ungefähr auf mittlerer Höhe der Transporteinheit angebracht ist, magnetisierbare Metallstäbe (52), eine Zentrierhalterung (54), Öffnungen in der Platte (51) für die Zentrierhalterung (54), und/oder ein Zentrierobjekt (55) umfassen. Die magnetisierbaren Metallstäbe (52) ermöglichen eine reversible Verbindung mit einer externen Konstruktion, beispielsweise einem Roboter, der für die automatisierte Manipulation der Zellkulturen verwendet wird. Beispielsweise dienen die magnetisierbaren Metallstäbe (52) als Andockpunkt zur reversiblen Verbindung mit einer robotisierten Einheit zum Transport der Transporteinheit, beispielsweise zur reversiblen Verbindung mit Magneten des Oli-MAT (erhältlich von LifeTaq-Analytics GmbH, Tulln an der Donau). Die Z-Achse des Oli-MAT verfügt über zwei Permanentmagneten, mit deren Hilfe die Transfereinheit von Position zu Position getragen werden kann. Durch einen kurzen Impuls können die Magneten kurzzeitig entmagnetisiert werden, was zum Abstellen der Transporteinheit führt.
Zusätzlich beinhaltet das System noch je eine Vorrichtung zur Besiedelung in horizontaler und in vertikaler Orientierung.
Bei Besiedelung in vertikaler Anordnung werden die Zellen beispielsweise mit einem Hydrogel vermischt und in die Vorrichtung zur vertikalen Besiedelung, einem Wellstreifen, mittels Pipette transferiert. Nachfolgend wird die Matrixhalterung mit der Vorrichtung für die Matrixhalterung in das Hydrogel getaucht, bis dieses auspolymerisiert. Danach wird die Matrixhalterung vorsichtig in einen mit Medium befüllten Wellstreifen transferiert, wobei nur eine definierte Menge in der inneren Öffnung des auspolymerisierten Hydrogels mit entsprechenden Zellen mittransferiert wird. Je nach Konzentration der Hydrogelkomponenten kann die Polymerisierung wenige Minuten bis Stunden dauern. Dementsprechend muss die Kultur gegebenenfalls in einen Inkubator überführt werden. Um Luftblasen in der Öffnung während der Polymerisation zu vermeiden, kann die Matrixhalterung in diesem Fall eine kleine Öffnung in der vertikalen Oberfläche, oberhalb der Öffnung aufweisen.
In einer anderen Variante der vertikalen Besiedelung wird zuerst die Matrixhalterung in die Vorrichtung zur vertikalen Besiedelung transferiert und nachfolgend das Hydrogel mit Zellen hinzugefügt. Nach der Auspolymerisierung erfolgt wiederum der Transfer in einen mit Medium befüllten Wellstreifen.
Alternativ kann die Besiedelung im Falle von Hydrogelen in horizontaler Anordnung mit einer horizontalen Besiedelungsvorrichtung erfolgen. Hierbei wird die Matrixhalterung mit der Vorrichtung zur Befestigung der Matrixhalterung an der Besiedelungsvorrichtung zuvor befestigt. Danach erfolgt die Vermischung der Zellen mit dem Hydrogel und der Transfer dieser Mischung in die Öffnung der Matrixhalterung. Nach Auspolymerisation wird die Vorrichtung von der Matrixhalterung manuell gelöst und in einen mit Medium befüllten Wellstreifen transferiert. Durch diese Anordnung kann das Volumen im Vergleich zur vertikalen Anordnung um mindestens den Faktor 5 reduziert werden.
Bei der horizontalen Besiedelung kann die Besiedelungsvorrichtung mit einem Plateau versehen sein. Nach Besiedelung wie oben beschrieben wird die Matrixhalterung von der horizontalen Besiedelungsvorrichtung gelöst, wobei eine Vertiefung auf der Rückseite des Hydrogels entsteht. In einer besonderen ausführungsform ist auf dieser Vertiefung dann eine Besiedelung mit einem weiteren Zelltyp, beispielsweise epithelialen Ursprungs wie Endothelzellen eines Blutgefäßes oder Epithelzellen des Darms möglich und kann eine Barriere-artige Struktur bilden.
Im Falle von porösen festen Trägern erfolgt die Besiedelung bevorzugt in horizontaler Anordnung. In diesem Fall weist die zentrale Öffnung eine Vertiefung mit einer Wand auf. Auf dieser Wand liegt der poröse Träger auf, auf dem Zellen direkt besiedelt werden können, wobei in dieser Anordnung das Konstrukt für mehrere Stunden bis zu einem Tag in einen Inkubator transferiert werden kann. Nach erfolgter Besiedelung kann die Matrixhalterung in einen mit Medium befüllten Wellstrip überführt werden. Je nach Träger kann vor der Besiedelung der Träger in mehreren Schritten dehydriert werden. Dies kann im Vorfeld erfolgen, indem die Vorrichtung mit den Matrixhalterung von einem mit Flüssigkeit gefüllten Wellstreifen in einen anderen mit Flüssigkeit gefüllten Wellstreifen transferiert wird. Nach Besiedelung kann ein nachfolgender Medienwechsel durchgeführt werden, indem die Vorrichtung mit den Matrixhalterung und der dreidimensionalen Zellkultur von dem alten Wellstreifen mit altem Medium in einen neuen, zuvor mit frischem Medium befüllten, Wellstreifen transferiert wird. In einer besonderen Ausführungsform kann der Transfer der Wellstreifen mit den Matrixhalterungen auch mit Hilfe der Transporteinheit oder eines robotergestützten Greifarms automatisiert erfolgen.
Für eine langfristige Kultivierung von Zellen in der Matrix als Hydrogel oder porösem abbaubaren Träger kann die Kultur gemäß einer besonderen Ausführungsform dezellularisiert werden, um eine extrazelluläre Matrix zellfrei zu erhalten. Beispielsweise können hierbei mesenchymale Stammzellen in Osteoplasten, Chondrozyten oder Adipozyten über mehrere Wochen differenziert werden und schlussendlich die erhaltene Matrix mit einem Standard-Dezellularisierungsprotokoll zellfrei gemacht werden.
In einer anderen möglichen Variante wird auf eine Vorkultur in 2D komplett verzichtet und das Passagieren der Zellen in 2D vermieden. In diesem Fall werden Zellen in niedriger Konzentration (<5000-10000/Well) auf der Matrixhalterung, entweder als Hydrogel oder als fester poröser Träger besiedelt und bis zu einer hohen Konzentration kultiviert. Nachfolgend wird die Matrix aufgelöst oder die Zellen mittels enzymatischer Reaktion vom Träger gelöst und für eine nächste Besiedelung wiedergewonnen.
In einer anderen Ausführung kann die Matrixhalterung mit Zellen und einer Hydrogel-Matrix gefüllt sein und in eine Vorrichtung zur Perfusion transferiert werden, wobei eine kontinuierliche oder periodische Strömung initiiert werden kann.
Die erfindungsgemäße Zellkulturvorrichtung kann in einer Box, optional mit einem speziellen Einsatz zur Aufnahme der Vorrichtungen aufbewahrt oder transportiert werden. Im Speziellen, kann die Box weitere Elemente zur Temperierung oder Kühlung bzw. Elemente zur Temperaturkontrolle und/oder Temperaturaufzeichnung oder Sensoren zur CO2 bzw. 02-Messung aufweisen. Des Weiteren kann die Box eine Isotherm-Box sein.
Die Matrixhalterung, beispielsweise aus Silikon, kann alternativ in ein Bioreaktorsystem mit Perfusion transferiert werden. Beispielsweise können Zellen in niedriger Konzentration angezüchtet werden, wenn die Zellzahl zu groß für eine rein statische Kultur wird, kann die Matrixhalterung in ein größeres Gefäß oder Bioreaktorsystem mit Perfusion transferiert werden. Dies erlaubt Initiierung einer kontinuierlichen oder periodischen Strömung.
Verschiedene Verfahren zur Verwendung der erfindungsgemäßen Zellkulturvorrichtung sind hier beschrieben. Dafür kann die Matrixhaltung horizontal oder vertikal ausgerichtet sein. Im Speziellen werden die für die Kultivierung verwendeten Elemente sterilisiert, insbesondere autoklaviert. Die verwendeten Zellen können für die Kultivierung vorbereitet werden, insbesondere durch Waschen und Kontakt mit Proteasen die jene Proteine abbauen, die den Zellverband aufrechterhalten, beispielsweise Trypsin. Dadurch können die Zellen von einem Träger abgelöst, vereinzelt und im weiteren Verfahren suspendiert werden. Zur Erhöhung der Zelldichte können die Zellen auch zentrifugiert werden. Die Zellzahl für das Einbetten oder Besiedeln der Matrix kann von der Fachperson bestimmt werden, die Zellzahl kann beispielsweise bei etwa 1000-100000 Zellen pro Matrix liegen. Die Matrixhalterung kann in einen Wellstreifen (11) übertragen werden, insbesondere unter Verwendung des Trägers der Matrixhalterung (10). Die Bedingungen für das Besiedeln der Matrix in der Öffnung (13) der Matrixhalterung (12) mit der Zellsuspension können für die jeweiligen Zelltypen individuell angepasst werden, beispielsweise kann die Temperatur bei etwa 30°C bis 38°C liegen, beispielsweise bei etwa 37°C für Säugetierzellekulturen.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform kann die Zellkulturvorrichtung eine oder mehrere Elektroden umfassen. Insbesondere, sind die Elektroden derart angeordnet, dass die zu kultivierenden Zellen elektrisch stimuliert werden können. Bevorzugt befinden sich die Elektroden im Wellstreifen, insbesondere in einer oder mehrerer der Vertiefungen des Wellstreifens.
Die Erfindung umfasst weiters folgende Ausführungsformen:
1 . Zellkulturvorrichtung für eine dreidimensionale Zellkultur mit einer oder mehreren Zellkultureinheiten, dadurch gekennzeichnet, dass eine Zellkultureinheit (21) umfasst: i. mindestens eine Matrixhalterung (12), mit einer zentralen Öffnung (13) zur Aufnahme einer Matrix; ii. einen Träger (10), der fix oder reversibel mit der mindestens einen Matrixhalterung (12) verbunden ist; und iii. einen Wellstreifen (11), bestehend aus einem Gefäß mit mindestens einer Vertiefung, die mindestens eine Matrixhalterung (12) bis zum oberen Ende der zentralen Öffnung (13) oder mehr, umfassen kann, wobei die Matrixhalterung (12) vertikal ausgerichtet ist.
2. Die Zellkulturvorrichtung nach Punkt 1 , wobei die zentrale Öffnung (13) der Matrixhalterung (12) eine durchgehende Öffnung (13a und 13c) oder eine Vertiefung mit einer Wand (13b) ist.
3. Die Zellkulturvorrichtung nach Punkt 1 oder 2, wobei die zentrale Öffnung (13) eine Matrix umfasst, die ein fester poröser Träger oder ein Hydrogel ist, oder eine Kombination davon.
4. Die Zellkulturvorrichtung nach einem der Punkte 1 bis 3, wobei die Matrix aus natürlichem, halbsynthetischem oder synthetischem Material besteht, oder einer Kombination davon.
5. Die Zellkulturvorrichtung nach Punkt 4, wobei das natürliche Material ausgewählt ist aus Kollagen, Fibrin, Glykosaminglykanen und Hyaluronsäure, und das synthetische oder halbsynthetische Material ausgewählt ist aus polymeren Bestandteilen wie Polymethylmethacrylat, Polymilchsäure, Polyglykol, Polystyrol und keramischen Bestandteilen wie Hydroxylapatit oder Trikalziumphosphat. 6. Die Zellkulturvorrichtung nach einem der Punkte 1 bis 5, wobei der Träger (10) ein Element (15) zur Aufnahme der Matrixhalterung (12) aufweist und die Matrixhalterung an ihrem oberen Ende Einkerbungen (14a, 14b) aufweist, über die sie reversibel mit dem Element (15) des Trägers (10) verbunden werden kann.
7. Die Zellkulturvorrichtung nach einem der Punkte 1 bis 6, wobei die Vorrichtung mindestens 5, insbesondere mindestens 10 Matrixhalterungen (12) umfasst.
8. Die Zellkulturvorrichtung nach einem der Punkte 1 bis 7, wobei die Vorrichtung zusätzlich eine Transporteinheit (20) umfasst, welche eine oder mehrere Zellkultureinheiten (21) transportieren kann.
9. Die Zellkulturvorrichtung nach Punkt 8, wobei die Transporteinheit (20) umfasst i. eine Tragschiene (22) zur Befestigung einer oder mehrerer Zellkultureinheiten (21) an der Transporteinheit (20), ii. eine Aufnahmeeinheit (20a) für eine Tragschiene (22), iii. einen Deckel (23), und iv. zwei Spacer-Elemente (24), die optional direkt miteinander verbunden sind, zur geordneten Aufnahme von mindestens zwei oder mehr Trägern (10) einer Matrixhalterung, v. optional mindestens ein Kennzeichnungselement (26) wie beispielsweise einen RFID-Chip oder einen Barcode, und vi. optional eine Zentriereinheit (27).
10. Die Zellkulturvorrichtung nach Punkt 8 oder 9, wobei der Wellstreifen (11 ) eine Position (25) zur Befestigung an die Tragschiene (20) umfasst.
11. Die Zellkulturvorrichtung nach Punkt 8 oder 9, wobei die Zellkultureinheiten im Spacer (24) parallel angeordnet sind.
12. Verfahren zur Zellkultivierung unter Verwendung der Zellkulturvorrichtung nach einem der Punkte 1 bis 11.
13. Verfahren nach Punkt 12, umfassend die Schritte i. Suspendieren der zu kultivierenden Zellen in einer angemessenen Menge eines Zellkulturmediums zur Bildung einer Zellsuspension, ii. Besiedeln der Matrix in der Öffnung (13) der Matrixhalterung (12) mit der Zellsuspension, iii. Übertragen der Matrixhalterung in einen Wellstreifen (11), insbesondere unter Verwendung des Trägers der Matrixhalterung (10), und iv. Inkubieren der Zellkulturvorrichtung, die die Zellen enthält, unter Bedingungen, die ein Zellwachstum ermöglichen.
14. Verfahren nach Punkt 13, wobei die Besiedelung der Matrix mit der Zellsuspension in horizontaler Anordnung der Matrixhalterung (12) erfolgt.
15. Verfahren nach Punkt 14, wobei die Öffnung (13) der Matrixhalterung (12) eine Vertiefung (13c) zur Befestigung aufweist und über ein komplementäres Dichtungselement (31) an einer Besiedelungsvorrichtung (30) reversibel mit dieser verbunden ist, und die Matrix ein Hydrogel ist, umfassend die Schritte i. Suspendieren der zu kultivierenden Zellen in einer angemessenen Menge eines Zellkulturmediums zur Bildung einer Zellsuspension, ii. Vermischen der Zellsuspension mit einem oder mehreren Bestandteilen eines Hydrogels, um eine Zellsuspension-Hydrogel Mischung herzustellen, iii. Besiedeln der Öffnung (13) der Matrixhalterung (12), die horizontal in der Besiedelungsvorrichtung (30) ausgerichtet ist, mit der Zellsuspension-Hydrogel- Mischung, iv. Inkubieren des Zellansatzes in einer geeigneten Kultivierungsumgebung, vorzugsweise bei 37°C und 5%CÖ2, bis zur Auspolymerisation der Matrix, v. Trennen der Matrixhalterung (12) von der Besiedelungsvorrichtung (30) vi. Übertragen der Matrixhalterung (12) in einen mit Medium befüllten
Wellstreifen (11), bevorzugt unter Verwendung des Trägers der Matrixhalterung (10), vii. Inkubieren der Zellkulturvorrichtung, die die Zellsuspension-Matrix
Mischung enthält, unter Bedingungen, die Zellwachstum ermöglichen.
16. Verfahren nach Punkt 13, wobei die Besiedelung der Matrix mit der Zellsuspension in vertikaler Anordnung der Matrixhalterung (12) erfolgt.
17. Verfahren nach Punkt 16, wobei die Öffnung (13) der Matrixhalterung (12) eine obere Öffnung (13d) aufweist und die Matrixhalterung (12) reversibel mit einer Besiedelungsvorrichtung (33) verbunden ist, und die Matrix ein Hydrogel ist, umfassend die Schritte i. Suspendieren der zu kultivierenden Zellen in einer angemessenen Menge eines Zellkulturmediums zur Bildung einer Zellsuspension, ii. Vermischen der Zellsuspension mit einem Hydrogel, um eine
Zellsuspension-Hydrogel Mischung herzustellen, iii. Befüllen der Wells der Besiedelungsvorrichtung (33) mit der Zellsuspension-Hydrogel-Mischung, iv. Besiedeln der Öffnung (13) der Matrixhalterung durch Eintauchen der Matrixhalterung (12) in die Besiedelungsvorrichtung (33), v. Inkubieren des Zellansatzes in einer geeigneten Kultivierungsumgebung, vorzugsweise bei 37°C und 5% 5% CÖ2, bis zur Auspolymerisation der Matrix, vi. Übertragen der Matrixhalterung (12) von der Besiedelungsvorrichtung (33) in einen mit Nährmedium befüllten Wellstreifen (11), und vii. Inkubieren der Zellkulturvorrichtung, die die Zellsuspension-Matrix
Mischung enthält, unter Bedingungen, die Zellwachstum ermöglichen.
18. Verfahren nach Punkt 16, wobei die Öffnung (13) der Matrixhalterung (12) eine obere Öffnung (13d) aufweist und die Matrixhalterung (12) reversibel mit einer Besiedelungsvorrichtung (33) verbunden ist, die Befüllungselemente (40) umfasst, und die Matrix ein Hydrogel ist, umfassend die Schritte i. Suspendieren der zu kultivierenden Zellen in einer angemessenen Menge eines Zellkulturmediums zur Bildung einer Zellsuspension, ii. Vermischen der Zellsuspension mit einem Hydrogel, um eine
Zellsuspension-Hydrogel Mischung herzustellen, iii. Einführen der Matrixhalterung in die Besiedelungsvorrichtung (33), iv. Befüllen der Wells der Besiedelungsvorrichtung (33) mit der Zellsuspension-Hydrogel-Mischung über die Befüllungselemente (40), wodurch die Öffnung (13) der Matrixhalterung mit der Zellsuspension-Hydrogel-Mischung besiedelt wird, v. Inkubieren des Zellansatzes in einer geeigneten Kultivierungsumgebung, vorzugsweise bei 37°C und 5% 5% CO2, bis zur Auspolymerisation der Matrix, vi. Übertragen der Matrixhalterung (12) von der Besiedelungsvorrichtung (33) in einen mit Nährmedium befüllten Wellstreifen (11), und vii. Inkubieren der Zellkulturvorrichtung, die die Zellsuspension-Matrix
Mischung enthält, unter Bedingungen, die Zellwachstum ermöglichen.
19. Zellkulturvorrichtung nach einem der Punkte 1 bis 7, wobei der Wellstreifen eine Perfusionsvorrichtung (34) ist, und die Perfusionsvorrichtung Schlauchanschlüsse (41), optional zur Verbindung an eine Pumpe, aufweist. 20. Zellkulturvorrichtung nach einem der Punkte 1 bis 7, zusätzlich umfassend eine Box (44) und einen Einsatz (42) zur Aufnahme einer oder mehrerer
Zellkultureinheiten (21) in der Box (44).
21. Zellkulturvorrichtung nach einem der Punkte 1 bis 7, zusätzlich umfassend eine Box (44) und einen Einsatz (43) zur Aufnahme einer oder mehrerer
Besiedelungsvorrichtungen (30).
BEISPIELE
Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter beschrieben, ohne auf diese konkreten Ausführungsformen der Erfindung notwendigerweise limitiert zu sein.
Beispiel 1:
Besiedeln einer Hydrogel Matrix mit Zellen unter Verwendung der horizontalen Besiedelunqsvorrichtunq (30) und anschließende Kultivierung der Zellen in einer Zellkultureinheit
Der Träger mit den Matrixhalterungen (13c) wurde mit der Besiedelungsvorrichtung (30) verbunden und gemeinsam autoklaviert. Anschließend wurde eine 2D-Kultur aus mesenchymalen Stammzellen 2x mit DPBS ohne Ca/Mg gewaschen und trypsiniert. Die gelösten Zellen wurden danach in Medium mit Serum aufgenommen und in 50ml Falcon überführt. Als nächstes wurden diese mittels Ultrazentrifuge bei 0.3RPM 5min zentrifugiert und der Überstand verworfen. Im nächsten Schritt erfolgte die Zugabe von neuem Medium ohne Serum und darüber hinaus wurde eine Zellzählung durchgeführt. Darauffolgend wurden die Zellen erneut bei 0.3RPM für 5min zentrifugiert und der Überstand verworfen. Für 50 Matrixhalterungen wurde eine 5ml Zell-Fibrinogen-Thrombin-Lösung vorbereitet. Je nach Ausgangskonzentration von Fibrinogen und Thrombin werden unterschiedliche Volumina verwendet. In dem vorliegenden Beispiel wurde das Zellpellet in 1 ,75ml Medium ohne Serum aufgenommen, sodass eine Zellzahl zwischen 1000-100000 Zellen pro Matrix eingearbeitet wurde. Danach erfolgte die Zugabe von 750mI rekonstituiertes Fibrinogen, sodass eine Konzentration von 5mg/ml an Fibrinogen erreicht wurde. Als Nächstes wurde 2mI einer Thrombin Stammlösung (8000U/ml) in 250mI 40mM CaCh (~64U/ml) überführt. Von dieser Lösung wurden 40mI in 2,5ml 40mM CaCh transferiert (~1 U/ml). 45mI der Zell-Fibrinogen-Lösung wurden mittels Pipette in eine Matrixhalterung (12) pipettiert. Anschließend wurden vorsichtig je 45mI Thrombin-Lösung (Zielkonzentration Fibrinogen ~2,5mg/ml Thrombin 0.5U/ml) ohne Luftblasen zu jedem Zell-Fibrinogen- T ropfen hinzugefügt und zur Auspolymerisation in einen Inkubator bei 37°C mit 5% CO2 transferiert. Nach der Polymerisation wurde die Besiedelungsvorrichtung (30) manuell von der Matrixhalterung (12) gelöst und der Träger mit der auspolymerisierten Matrix- Zell-Lösung in einen neuen Wellstreifen (11) mit je ~1 -1 ,5ml frischem Medium transferiert und in einen Inkubator (37°C/5%C02) überführt.
Beispiel 2:
Besiedeln einer Hydrogel Matrix mit Zellen unter Verwendung der vertikalen Besiedelunqsvorrichtunq (33) und anschließende Kultivierung der Zellen in einer Zellkultureinheit
Die Besiedelungsvorrichtung (33) und ein Träger mit den Matrixhalterungen (13a) wurden gemeinsam autoklaviert. Eine 2D-Kultur aus mesenchymalen Stammzellen wurde 2x mit DPBS ohne Ca/Mg gewaschen und trypsiniert. Die gelösten Zellen wurden anschließend in Medium mit Serum aufgenommen und in 50ml Falcon überführt. Danach erfolgte eine Zentrifugation mittels Ultrazentrifuge bei 0.3RPM für 5min und der Überstand danach verworfen. Im nächsten Schritt erfolgte die Zugabe von neuem Medium ohne Serum und eine Zellzählung wurde durchgeführt. Darauffolgend wurden die Zellen nochmals bei 0.3RPM für 5min zentrifugiert und der Überstand erneut verworfen. Für 5 Matrizen wurden 5ml Zell-Fibrinogen-Thrombin-Lösung vorbereitet. Je nach Ausgangskonzentration von Fibrinogen und Thrombin werden unterschiedliche Volumina verwendet. In diesem Fall wurde das Zellpellet in 1 ,75ml Medium ohne Serum aufgenommen, sodass eine Zellzahl zwischen 50000-250000 Zellen pro Matrix eingearbeitet werden konnte. Danach erfolgte die Zugabe von 750mI rekonstituiertes Fibrinogen, sodass eine Konzentration von 5mg/ml an Fibrinogen erreicht wurde. Anschließend wurden 2mI einer Thrombin Stammlösung (8000U/ml) in 250mI 40mM CaCh (~64U/ml) überführt. Von dieser Lösung wurden 40mI in 2,5ml 40mM CaCh transferiert (~1 U/ml). Als nächstes wurde die Fibrinogen-Zell-Lösung mit der Thrombin- Lösung vermischt und 0.5ml-1ml in die Besiedelungsvorrichtung (33) transferiert. Sobald die Lösung in der Besiedelungsvorrichtung war, wurde der Träger schnell in die Matrixhalterung eingetaucht und die Besiedelungsvorrichtung bis zur Auspolymerisation in einem Inkubator bei 37°C und 5%C02 gelagert. Nach erfolgter Polymerisation wurde der T räger vorsichtig aus der Besiedelungsvorrichtung nach oben gezogen und in einen neuen Wellstreifen mit frischem Medium transferiert und in einen Inkubator (37°C/5%C02) überführt. Beispiel 3:
Besiedeln einer festen porösen Matrix und anschließende Kultivierung der Zellen in einer Zellkultureinheit
Ein Träger mit den Matrixhalterungen ohne Öffnung (13b) und mehrere Wellstreifen (11) wurden gemeinsam autoklaviert. In diesem Fall wurde eine poröse dehydrierte Matrix (beispielsweise „Alvetex“ Reprocell oder „Mimetix“ TheElectroSpinningCompany) mittels Pinzette in die Matrixhalterung transferiert. Alternativ könnte die Matrix mittels Lyphilisierungsschritten bereits in der Matrixhalterung integriert sein. Im nächsten Schritt wurde die Matrix nach Angaben der Hersteller mittels Ethanols rehydriert und gewaschen. Für eine effiziente Handhabung wurden hierbei die eingesetzten Flüssigkeiten in mehrere parallele Wellstreifen transferiert, sodass der Träger von einem Wellstreifen schnell in den anderen getaucht werden konnte.
Eine 2D-Kultur aus mesenchymalen Stammzellen wurde 2x mit DPBS ohne Ca/Mg gewaschen und trypsiniert. Die gelösten Zellen wurden anschließend in Medium mit Serum aufgenommen und in 50ml Falcon überführt. Danach erfolgte wiederum eine Zentrifugation mittels Ultrafuge bei 0.3RPM 5min zentrifugiert und anschließender Entfernung des Überstands. Im nächsten Schritt wurde neues Medium mit Serum hinzugefügt und eine Zellzählung durchgeführt. Danach wurden die Zellen wieder bei 0.3RPM für 5min zentrifugiert und der Überstand verworfen. Für 50 Matrixhalterungen wurde eine 5ml Zell-Lösung vorbereitet, wobei die Anzahl der Zellen zwischen 1000- 20000 Zellen pro Matrix betrug. Der Träger mit den Matrixhalterungen wurde horizontal aufgelegt und 90mI Zellsuspension in die Öffnung auf die Matrix transferiert. Nachfolgend wurde das Konstrukt in einen Inkubator für 12-24h bei 37°C und 5%CÖ2 bis zu Anheftung der Zellen an die Matrix kultiviert. Nach der Anheftung erfolgte der Transfer des Trägers in einen neuen Wellstreifen mit frischem Medium und dessen nachfolgender Kultivierung in einen Inkubator (37°C/5%CÖ2).

Claims

PATENTANSPRÜCHE
1 Zellkulturvorrichtung für eine dreidimensionale Zellkultur mit einer oder mehreren Zellkultureinheiten, dadurch gekennzeichnet, dass eine Zellkultureinheit (21) umfasst: i. mindestens eine Matrixhalterung (12), mit einer zentralen Öffnung oder Vertiefung (13) zur Aufnahme einer Matrix; ii. einen Träger (10), der fix oder reversibel mit der mindestens einen Matrixhalterung (12) verbunden ist; und iii. einen Wellstreifen (11), bestehend aus einem Gefäß mit mindestens einer Vertiefung, die mindestens eine Matrixhalterung (12) bis zum oberen Ende der zentralen Öffnung (13) oder mehr, umfassen kann, wobei die Matrixhalterung (12) vertikal ausgerichtet ist.
2. Die Zellkulturvorrichtung nach Anspruch 1 , wobei die zentrale Öffnung (13) der Matrixhalterung (12) eine durchgehende Öffnung (13a und 13c) oder eine Vertiefung mit einer Wand (13b) ist, insbesondere wobei die zentrale Öffnung (13) eine Matrix umfasst, die ein fester poröser Träger oder ein Hydrogel ist, oder eine Kombination davon.
3. Die Zellkulturvorrichtung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei die Matrix aus natürlichem, halbsynthetischem oder synthetischem Material besteht, oder einer Kombination davon, insbesondere ist das natürliche Material ausgewählt aus Kollagen, Fibrin, Glykosaminglykanen und Hyaluronsäure, und das synthetische oder halbsynthetische Material ausgewählt aus polymeren Bestandteilen wie Polymethylmethacrylat, Polymilchsäure, Polyglykol, Polystyrol und keramischen Bestandteilen wie Hydroxylapatit oder Trikalziumphosphat.
4. Die Zellkulturvorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Träger (10) ein Element (15) zur Verbindung mit der Matrixhalterung (12) aufweist und die Matrixhalterung an ihrem oberen Ende Einkerbungen (14a, 14b) aufweist, über die sie reversibel mit dem Element (15) des Trägers (10) verbunden werden kann.
5. Die Zellkulturvorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Vorrichtung mindestens 5, insbesondere mindestens 10 Matrixhalterungen (12) umfasst.
6. Die Zellkulturvorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Vorrichtung zusätzlich eine Transporteinheit (20) umfasst, welche eine oder mehrere Zellkultureinheiten (21) transportieren kann.
7. Die Zellkulturvorrichtung nach Anspruch 6, wobei die Transporteinheit (20) umfasst i. eine Tragschiene (22) zur Befestigung einer oder mehrerer Zellkultureinheiten (21) an der Transporteinheit (20), ii. eine Aufnahmeeinheit (20a) für eine Tragschiene (22), iii. einen Deckel (23), und iv. zwei Spacer-Elemente (24), die optional direkt miteinander verbunden sind, zur geordneten Aufnahme von mindestens zwei oder mehr Trägern (10) einer Matrixhalterung, v. optional mindestens ein Kennzeichnungselement (26) wie beispielsweise einen RFID-Chip oder einen Barcode, und vi. optional eine Zentriereinheit (27).
8. Die Zellkulturvorrichtung nach Anspruch 6 oder 7 wobei der Wellstreifen (11) eine Position (25) zur Befestigung an die Tragschiene (20) umfasst, und/oder die Zellkultureinheiten im Spacer (24) parallel angeordnet sind.
9. Die Zellkulturvorrichtung nach einem der Ansprüche 6 bis 8, wobei die Transporteinheit (20) umfasst: i. eine Platte (48), welche die Unterseite der Transporteinheit bildet, ii. Öffnungen in der Platte (48) zur Zentrierung der Transporteinheit auf der Platte (49), iii. Öffnungen in der Platte (48) für Verschraubungen (50), iv. eine weitere Platte (51), welche ungefähr auf mittlerer Höhe der Transporteinheit angebracht ist, v. magnetisierbare Metallstäbe (52), vi. eine Zentrierhalterung (54), vii. Öffnungen in der Platte (51) für die Zentrierhalterung (54), viii. und ein Zentrierobjekt (55).
10. Verfahren zur Zellkultivierung unter Verwendung der Zellkulturvorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 9 umfassend die Schritte: i. Suspendieren der zu kultivierenden Zellen in einer angemessenen Menge eines Zellkulturmediums zur Bildung einer Zellsuspension, ii. Einbringen der Zellsuspension in die Zellkulturvorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, iii. Inkubieren der Zellkulturvorrichtung, die die Zellsuspension enthält, unter Bedingungen, die Zellwachstum ermöglichen.
11. Verfahren nach Anspruch 10, umfassend die Schritte i. Suspendieren der zu kultivierenden Zellen in einer angemessenen Menge eines Zellkulturmediums zur Bildung einer Zellsuspension, ii. Besiedeln der Matrix in der Öffnung (13) der Matrixhalterung (12) mit der Zellsuspension durch Einbringen der Zellsuspension in die Zellkulturvorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, iii. Übertragen der Matrixhalterung in einen Wellstreifen (11), insbesondere unter Verwendung des Trägers der Matrixhalterung (10), und iv. Inkubieren der Zellkulturvorrichtung, die die Zellen enthält, unter Bedingungen, die ein Zellwachstum ermöglichen.
12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Öffnung (13) der Matrixhalterung (12) eine Vertiefung (13c) zur Befestigung aufweist und über ein komplementäres Dichtungselement (31) an einer Besiedelungsvorrichtung (30) reversibel mit dieser verbunden ist, und die Matrix ein Hydrogel ist, umfassend die Schritte i. Suspendieren der zu kultivierenden Zellen in einer angemessenen Menge eines Zellkulturmediums zur Bildung einer Zellsuspension, ii. Vermischen der Zellsuspension mit einem oder mehreren Bestandteilen eines Hydrogels, um eine Zellsuspension-Hydrogel Mischung herzustellen, iii. Besiedeln der Öffnung (13) der Matrixhalterung (12), die horizontal in der Besiedelungsvorrichtung (30) ausgerichtet ist, mit der Zellsuspension-Hydrogel- Mischung, iv. Inkubieren des Zellansatzes in einer geeigneten Kultivierungsumgebung, vorzugsweise bei 37°C und 5% CÖ2, bis zur Auspolymerisation der Matrix, v. Trennen der Matrixhalterung (12) von der Besiedelungsvorrichtung (30) vi. Übertragen der Matrixhalterung (12) in einen mit Medium befüllten Wellstreifen (11), bevorzugt unter Verwendung des Trägers der Matrixhalterung (10), vii. Inkubieren der Zellkulturvorrichtung, die die Zellsuspension-Matrix Mischung enthält, unter Bedingungen, die Zellwachstum ermöglichen.
13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Öffnung (13) der Matrixhalterung (12) eine obere Öffnung (13d) aufweist und die Matrixhalterung (12) reversibel mit einer Besiedelungsvorrichtung (33) verbunden ist, und die Matrix ein Hydrogel ist, umfassend die Schritte i. Suspendieren der zu kultivierenden Zellen in einer angemessenen Menge eines Zellkulturmediums zur Bildung einer Zellsuspension, ii. Vermischen der Zellsuspension mit einem Hydrogel, um eine Zellsuspension-Hydrogel Mischung herzustellen, iii. Befüllen der Wells der Besiedelungsvorrichtung (33) mit der Zellsuspension-Hydrogel-Mischung, iv. Besiedeln der Öffnung (13) der Matrixhalterung durch Eintauchen der Matrixhalterung (12) in die Besiedelungsvorrichtung (33), v. Inkubieren des Zellansatzes in einer geeigneten Kultivierungsumgebung, vorzugsweise bei 37°C und 5% CÖ2, bis zur Auspolymerisation der Matrix, vi. Übertragen der Matrixhalterung (12) von der Besiedelungsvorrichtung (33) in einen mit Nährmedium befüllten Wellstreifen (11), und vii. Inkubieren der Zellkulturvorrichtung, die die Zellsuspension-Matrix Mischung enthält, unter Bedingungen, die Zellwachstum ermöglichen.
14. Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Öffnung (13) der Matrixhalterung (12) eine obere Öffnung (13d) aufweist und die Matrixhalterung (12) reversibel mit einer Besiedelungsvorrichtung (33) verbunden ist, die Befüllungselemente (40) umfasst, und die Matrix ein Hydrogel ist, umfassend die Schritte i. Suspendieren der zu kultivierenden Zellen in einer angemessenen Menge eines Zellkulturmediums zur Bildung einer Zellsuspension, ii. Vermischen der Zellsuspension mit einem Hydrogel, um eine Zellsuspension-Hydrogel Mischung herzustellen, iii. Einführen der Matrixhalterung in die Besiedelungsvorrichtung (33), iv. Befüllen der Wells der Besiedelungsvorrichtung (33) mit der Zellsuspension-Hydrogel-Mischung über die Befüllungselemente (40), wodurch die Öffnung (13) der Matrixhalterung mit der Zellsuspension-Hydrogel-Mischung besiedelt wird, v. Inkubieren des Zellansatzes in einer geeigneten Kultivierungsumgebung, vorzugsweise bei 37°C und 5% CO2, bis zur Auspolymerisation der Matrix, vi. Übertragen der Matrixhalterung (12) von der Besiedelungsvorrichtung (33) in einen mit Nährmedium befüllten Wellstreifen (11), und vii. Inkubieren der Zellkulturvorrichtung, die die Zellsuspension-Matrix Mischung enthält, unter Bedingungen, die Zellwachstum ermöglichen.
15. Zellkulturvorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei der Wellstreifen eine Perfusionsvorrichtung (34) ist, und die Perfusionsvorrichtung Schlauchanschlüsse (41), optional zur Verbindung an eine Pumpe, aufweist.
16. Zellkulturvorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, zusätzlich umfassend eine Box (44) und einen Einsatz (42) zur Aufnahme einer oder mehrerer Zellkultureinheiten (21) oder Besiedelungsvorrichtungen (30).
PCT/EP2021/052816 2020-02-05 2021-02-05 Dreidimensionale zellkultur WO2021156443A1 (de)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US17/798,013 US20230078423A1 (en) 2020-02-05 2021-02-05 Three-dimensional cell culture
EP21703904.9A EP4100509A1 (de) 2020-02-05 2021-02-05 Dreidimensionale zellkultur
CN202180012862.4A CN115052966A (zh) 2020-02-05 2021-02-05 三维细胞培养

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP20155628 2020-02-05
EP20155628.9 2020-02-05

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2021156443A1 true WO2021156443A1 (de) 2021-08-12

Family

ID=69500596

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP2021/052816 WO2021156443A1 (de) 2020-02-05 2021-02-05 Dreidimensionale zellkultur

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20230078423A1 (de)
EP (1) EP4100509A1 (de)
CN (1) CN115052966A (de)
WO (1) WO2021156443A1 (de)

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10003521A1 (de) 2000-01-27 2001-08-09 Medigene Ag Vorrichtung zum Herstellen eines dreidimensionalen Matrixkörpers, Multi-Well-Platte, Lösung zum Kultivieren von Säugerkardiomyocyten, Verfahren zum Kultivieren einer Zellkultur, Vorrichtung für die Messung isometrischer Kraftparameter von Zellkulturen sowie Verfahren zum meßbaren Verfolgen von Kontraktionen eines in eine Trägersubstanz eingelagerten Zellgewebes
WO2004027016A1 (en) 2002-09-17 2004-04-01 Cook Urological, Incorporated Improved perfusion incubator
CA2579680A1 (en) 2004-09-16 2006-03-30 Becton, Dickinson And Company Perfusion bioreactor for culturing cells
US20070237683A1 (en) 2006-03-30 2007-10-11 Maxwell Sensors, Inc. Microwell assembly having replaceable well inserts with reduced optical cross-talk
DE102007020302A1 (de) 2007-04-20 2008-10-30 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Verbesserte dreidimensionale biokompatible Gerüststruktur, die Nanopartikel beinhaltet
US20130236924A1 (en) 2010-07-27 2013-09-12 Insphero Ag Compliant multi-well plate
US20170137766A1 (en) 2014-06-30 2017-05-18 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Systems, apparatus, and methods related to magnetically-controlled three-dimensional tissue cultures
US20190276784A1 (en) 2017-11-17 2019-09-12 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education Organ chip to model mammalian joint

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10003521A1 (de) 2000-01-27 2001-08-09 Medigene Ag Vorrichtung zum Herstellen eines dreidimensionalen Matrixkörpers, Multi-Well-Platte, Lösung zum Kultivieren von Säugerkardiomyocyten, Verfahren zum Kultivieren einer Zellkultur, Vorrichtung für die Messung isometrischer Kraftparameter von Zellkulturen sowie Verfahren zum meßbaren Verfolgen von Kontraktionen eines in eine Trägersubstanz eingelagerten Zellgewebes
WO2004027016A1 (en) 2002-09-17 2004-04-01 Cook Urological, Incorporated Improved perfusion incubator
CA2579680A1 (en) 2004-09-16 2006-03-30 Becton, Dickinson And Company Perfusion bioreactor for culturing cells
US20070237683A1 (en) 2006-03-30 2007-10-11 Maxwell Sensors, Inc. Microwell assembly having replaceable well inserts with reduced optical cross-talk
DE102007020302A1 (de) 2007-04-20 2008-10-30 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Verbesserte dreidimensionale biokompatible Gerüststruktur, die Nanopartikel beinhaltet
US20130236924A1 (en) 2010-07-27 2013-09-12 Insphero Ag Compliant multi-well plate
US20170137766A1 (en) 2014-06-30 2017-05-18 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Systems, apparatus, and methods related to magnetically-controlled three-dimensional tissue cultures
US20190276784A1 (en) 2017-11-17 2019-09-12 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education Organ chip to model mammalian joint

Also Published As

Publication number Publication date
EP4100509A1 (de) 2022-12-14
US20230078423A1 (en) 2023-03-16
CN115052966A (zh) 2022-09-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10466232B2 (en) Co-culture bioreactor system
EP1747264B1 (de) Multizelluläre gewebe- und organkultursysteme
JP2019069221A (ja) 細胞ベースの三次元プリンティングのための組成物
EP1675939A2 (de) Verfahren und bioreaktor zum kultivieren und stimulieren von dreidimensionalen, vitalen und mechanisch widerstandsf higen zel ltransplantaten
DE69825002T2 (de) Verfahren zur Verbesserung der Stabilität und/oder Haltbarkeit von verschiedenen Substraten
US10752880B2 (en) Three-dimensional cell culture system and cell culture method using same
EP3795683A1 (de) Zellhaltiger hydrogelkörper und verfahren zur herstellung davon
US9260686B2 (en) Tubular bioreactor system for use in bone and cartilage tissue engineering
WO2005121319A1 (en) Methods for production of mesodermal lineage cells
EP4100509A1 (de) Dreidimensionale zellkultur
Ferronato et al. 3D culture applied to reproduction in females: possibilities and perspectives
WO2005001073A1 (de) Verfahren zur differenzierung von stammzellen in zellen, die ein pankreatisches hormon produzieren
EP0725816B1 (de) Verfahren zum züchten von bipolar adhärierten hepatozyten
EP1749089B1 (de) Verfahren und vorrichtungen zum kultivieren von stammzellen
JPS6225974A (ja) コラ−ゲンよりなるゲル状組成物
JP2023128212A (ja) 細胞構造体の製造方法、培養治具および培養基材
DE102005028899B4 (de) Hautäquivalent und Verfahren zur Erzeugung desselben
EP0869173B1 (de) Träger für Zellkulturen
EP3098304A1 (de) Hybrides zellenablösungsfreies zellenerweiterungssystem für anklebende zellkultivierung und zugehöriges verfahrensprotokoll
DE102004025081B4 (de) Multizelluläre Gewebe- und Organkultursysteme
CN117511876A (zh) 一种利用注射法构建三维培养系统的方法及其应用
CN116286642A (zh) 一种类器官细胞培养体系及方法
Kreß Osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells by the design of a natural microenvironment
Chin MAGNETICALLY SEEDED BIOREACTOR FOR THREE-DIMENSIONAL TISSUE CULTURE
Chin et al. Magnetically Seeded Bioreactor for Three-Dimensional Cell Culture

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 21703904

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2021703904

Country of ref document: EP

Effective date: 20220905