WO2008128717A1 - Verbesserte dreidimensionale biokompatible gerüststruktur, die nanopartikel beinhaltet - Google Patents

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WO2008128717A1
WO2008128717A1 PCT/EP2008/003130 EP2008003130W WO2008128717A1 WO 2008128717 A1 WO2008128717 A1 WO 2008128717A1 EP 2008003130 W EP2008003130 W EP 2008003130W WO 2008128717 A1 WO2008128717 A1 WO 2008128717A1
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cell culture
culture system
nanoparticles
cells
cell
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Herwig Brunner
Heike Mertsching
Petra Kluger
Michaela Weimer
Achim Weber
Günter Tovar
Kirsten Borchers
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Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V.
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Definitions

  • the present invention relates to a cell culture system that includes a three-dimensional biocompatible scaffold structure and nanoparticles. Furthermore, the present invention also encompasses methods for producing such a cell culture system as well as methods for cultivating cells by means of this cell culture system.
  • ECM extracellular matrix
  • cytokines growth factors
  • neighboring cells The extracellular matrix is present in all four basic tissue types, namely epithelial, muscle, nerve, connective and supporting tissues.
  • ECM serves above all an interactive signal exchange through transmembrane receptors of the cells. This form of communication also affects the regulation of gene expression. This plays an important role in essential cell properties, such as adhesion, proliferation, differentiation, migration, apoptosis and remodeling processes.
  • the ECM is not a static system, but ECM components are in a "steady state.” ECM components are secreted and synthesized by cells in the intercellular space (the space between cells), but can also be broken down by the cells at the same time
  • the extracellular matrix consists of three major components: collagen fibers, anchor proteins, and bulky carbohydrates, which is a protein layer that can be considered a specialized extracellular matrix, providing a stabilizing layer and delimiting surface epithelia from the connective tissue. this prevents the cells of these layers from sliding apart.
  • GAGs glycosaminoglycans
  • ECM carbohydrate components include hyaluronic acid, heparan sulfate, dermatan sulfate, chondroitin sulfate and keratan sulfate.
  • Adhesion proteins Another characteristic component of the extracellular matrix are adhesion proteins.
  • Adhesion proteins, adapter proteins or other adhesive proteins can interact on the one hand with other constituents of the matrix, on the other hand, however, also with other cells by attaching to specific cell receptors.
  • adhesion proteins are the protein family of laminins, vitronetin and fibronectin.
  • the basement membrane as a specialized extracellular matrix contains several essential components.
  • the first to be mentioned here are type I to IV collagens, with type IV being a special one Meaning.
  • Laminins are another component of the basement membrane. They have a sword-like shape. Their ends are occupied by cell receptors that bind mainly to integrins.
  • Laminin 1 is the most important adhesive component, furthermore laminin 5 as a crucial component of the basement membrane is of particular importance.
  • entactin (nidogen) as a further component of the basement membrane, as it binds the collagen layers to the laminin layers.
  • proteoglycans such as Perlecan link the individual components of the basement membrane, since Perlecan has in its structure binding sites for collagen, laminin, nidogen, and itself.
  • Integrins are heterodimeric proteins that can be composed of different alpha and beta subunits. Depending on the composition of the alpha or beta subunits of the integrins, these can bind to the extracellular matrix, for example to laminin, vitronectin or fibronectin.
  • nanoparticles and their use for identification and screening methods are known. According to these disclosures, the nanoparticles may also recognize or be inert to certain biologically active substances.
  • emulsion polymerization is a special method of polymerization in which water-insoluble monomers are emulsified in water with the aid of emulsifiers and polymerized using water-soluble initiators, for example potassium persulfate.
  • water-soluble initiators for example potassium persulfate.
  • the polymer dispersions obtained in the emulsion polymerization for example latex dispersions, can be used for a large number of applications.
  • the US Pat. Nos. 4,521,317 and 4,021,364 show the possibilities and limits of emulsion polymerization.
  • emulsion polymerization two types can basically be used: the oil-in-water emulsion and the water-in-oil emulsion, also called inverse emulsion.
  • a monomer which is insoluble in the reaction medium is dispersed with stirring by means of emulsifier addition, and the reaction is started by addition of an initiator.
  • the present invention is based on the technical problem of providing a cell culture system which, on the one hand, comes very close to the native extracellular matrix as a natural environment of the cells and, on the other hand, enables the controlled supply of growth factors and cytokines in order to specifically control cell growth and differentiation as well to customize tissue-specific. Furthermore, the present invention is based on the technical problem of providing cells, in particular also tissues and organs, which are suitable for transplantations. In addition, there is also a need for special tissues in the context of so-called tissue engineering as well as for research purposes.
  • the present invention solves the underlying technical problem by providing a cell culture system comprising a three-dimensional biocompatible scaffold structure and biocompatible nanoparticles, as well as a method of culturing cells, providing cells or cell products and tissues, and cells or cell products and tissues in itself by means of such a cell culture system.
  • the present invention accordingly provides a cell culture system which makes it possible to cultivate cells, in particular eukaryotic cells, in a particularly preferred embodiment, animal or human cells under conditions corresponding to the in vivo situation or a desired artificially oriented environment.
  • the invention is based on the provision of a cell culture system which has biocompatible nanoparticles present together with a three-dimensional biocompatible scaffold structure.
  • a cell culture system which has biocompatible nanoparticles present together with a three-dimensional biocompatible scaffold structure.
  • Such a system makes it possible to expose the cells cultured in it to influences and conditions which are deliberately set by the presence of the nanoparticles and, depending on the purpose of the cultivation, the cells in their biological behavior, e.g. Influence growth or differentiation behavior.
  • the nanoparticles can comprise active substances, for example by having them enclosed on the surface or in the nanoparticle itself.
  • the active ingredients are present both on the surface and in the interior of the nanoparticles.
  • the active substances associated in this way with the nanoparticles are controlled and / or regulated in the course of the cell culture system carried out cell culture system, in particular released with a time delay, and can be dosed and fed over a longer period of time controlled the cells. Coupling the nanoparticles with, for example, growth factors thus ensures targeted delivery of these growth factors over a defined period of time.
  • nanoparticles for example of polymeric material, as carriers of, for example, growth factors have surprising advantages.
  • nanoparticles in particular polymeric nanoparticles, control the controlled release of active substances, for example cytokines, as a carrier, ie with a certain, generally delayed release kinetics. This effect is also known as controlled release.
  • active substances for example cytokines
  • the release of the active ingredients is predeterminably regulated as a function of time, thus providing a desired and specific drug release kinetics.
  • a desired active ingredient release kinetics is selected by selecting the nanoparticle material such that release of the active ingredient takes place cell-specifically.
  • a constant release rate of the active ingredient based on the total release duration can take place.
  • it can also be provided to provide, for example, in a first phase, an initially initially low drug release rate and an increased release rate starting after a certain time.
  • the invention also provides, in an initial first phase, for a comparatively high release rate of the active ingredient, which is replaced after a certain time point by a lower release rate.
  • the nanoparticles may have such an active ingredient loading that the active ingredient concentration is in a preferred range of 1 ng / ml to 10 ⁇ g / ml after release.
  • the release of active ingredient can take place both by diffusion of the substance from or from the nanoparticles and by degradation of the nanoparticle itself, for example by hydrolysis of the polymer.
  • cell culture system is to be understood as a system for cultivating cells, in particular in the form of the framework structure contained therein, adhesion sites for cells to be cultivated, preferably in a three-dimensionally structured structure, for example as a matrix or hydrogel, Typically, such a cell culture system, when in use, preferably in vitro use, is positioned in artificial containers capable of receiving, via the cell culture system itself, also the cells to be cultured and a culture medium.
  • the cell culture system of the present invention is therefore particularly a system for culturing cells in vitro.
  • the cell culture system according to the invention can be used for cultivating cells in conventional cell culture vessels such as petri dishes or cell culture bottles or in any other form.
  • the cell culture system is used to culture primary cells.
  • the cell culture system according to the invention is used in vivo, e.g. in animal experiments.
  • framework structure means a structure for attaching cells
  • a framework structure in the context of the present invention is in particular a preferred embodiment of a structure that not only allows a superficial adherence or adhesion of cells, but also in particular also ingrowth or integration of cells into the framework structure itself.
  • a matrix preferably with pores or interstices.
  • this matrix contains one or more components of the extracellular matrix, such as components of the basement membrane, adhesion proteins, fiber-forming proteins, carbohydrates, proteoglycans or cell receptors.
  • a "primary cell” is a eukaryotic cell of human or animal origin derived from organs or from an embryo, and more preferably an embryonic stem cell is provided as the primary cell, preferably one derived from umbilical cord blood
  • an embryonic stem cell is provided as the primary cell, preferably one derived from umbilical cord blood
  • the stem cell employed in accordance with the present invention may be a totipotent, omnipotent or pluripotent cell
  • the primary cell is an adult stem cell, eg an animal or human adult stem cell.
  • primary cell thus means a eukaryotic cell of human or animal origin
  • Primary cells can be obtained from organs such as skin, kidney or liver, or from whole embryos
  • An example of a primary cell used according to the invention The primary cell is preferably omnipotent or pluripotent
  • a primary cell can also be an adult stem cell
  • the cells are treated by treatment with trypsin or by another protease and thereby isolated from the tissue and also
  • Primary cell cultures of epithelial cells are one another example of primary cells.
  • epithelia cover external and internal surfaces of tissues and organs.
  • Epithelial cells have a very high degree of differentiation, which is expressed in the polarization of cells with an apical and a basolateral surface. The different surfaces perceive different functions.
  • the apical surface of epithelial cells of the intestine serves to absorb nutrients, while the basolateral surface transfers these nutrients to the blood and forms connections to adjacent cells as well as to the basal membrane.
  • Primary cells from the blood, bone marrow or spleen hardly adhere but can still be cultured in suspension.
  • methods exist for further selection of a desired subtype from the isolated primary cells.
  • a primary cell may also be a, preferably non-human, embryonic stem cell, preferably an embryonic stem cell, which in a particularly preferred embodiment has been obtained from umbilical cord blood.
  • the embryonic stem cell is a cell isolated from an embryo that is in a stage of up to eight cells. This embryonic stem cell from the eight-cell stage is a totipotent cell and can be differentiated into all cell types of the main tissue types endodermal - like wall cells of the digestive tract - mesodermal - like muscles, bones, blood cells - and ectodermal - like skin cells and nerve tissue.
  • the embryonic stem cell is a cell isolated from an embryo that is in the stage of Blastocyst is located.
  • This embryonic stem cell from the blastocyst stage is a pluripotent cell and can be differentiated into all types of body cells of the main tissue types, ie endodermal, and laterally, with the exception of the formation of placental tissue, which can no longer be formed.
  • a special feature of stem cells is that these cells are capable of self-replicating during cell division, thus preserving the pool of stem cells and simultaneously producing a differentiated cell, which then has a lower differentiation potential.
  • Stem cells are distinguished by so-called markers of differentiated cells. Markers can be specific proteins that are amplified or expressed to a lesser extent by stem cells.
  • the markers described are SSEA-1, stage-specific embryonic antigen-1, AP activity, alkaline phosphatase activity and the expression of the transcription factor Oct-3/4.
  • the expression of the marker proteins depends on the origin of the stem cell.
  • an adult stem cell is a cell that arises after the embryonic stage.
  • Adult stem cells can be isolated from organs and tissues such as bone marrow, skin, adipose tissue, umbilical cord, umbilical cord blood, brain, liver or pancreas and are usually predeterminable, ie they have a lower potential for differentiation and are multi- or unipotent.
  • Usually isolated primary cells from an embryo or an adult mammal have only a very limited ability to grow. In human fetal cells, after their isolation and cultivation, first a good cell growth takes place. Furthermore, primary cells can also be isolated from tumors and to be cultivated.
  • tumor stem cells Genetic alterations, oncogenic transformations, override regulatory mechanisms such as apoptosis or potentiate positive growth signals such as overexpression of growth receptors. Therefore, many, especially primary tumor cells, often show unlimited growth. A special subpopulation of primary cells under tumor cells are so-called tumor stem cells. These could be detected as a very small cell fraction within certain tumors. Tumor stem cells have been isolated and cultured from breast cancer tumors. Characteristic marker proteins for these breast cancer stem cells are high CD44 expression, no or low CD24 expression and the absence of so-called line markers.
  • an "adult stem cell” is to be understood as meaning, in particular, a cell which has arisen after the embryonic stage, has an undifferentiated differentiation potential compared to differentiated cells, is predeterminable and, in particular, epithelial cells, endothelial cells, dendritic cells, mesenchymal cells Cells, adipocytes or especially the corresponding progenitor cells from the heart, the musculature, adipose tissue, the skin and the brain are isolated.
  • three-dimensional means a spatial extension into all three space coordinates.
  • the extent can be substantially uniform in these three directions, so that, for example, there is a cylindrical shape, a column, cuboid or cube-shaped matrix structure. But it is also possible, for example, that the expansion is in two directions to a greater extent, in the third direction but only to a small extent, so that the three-dimensional structure acts flat, for example, represents a membrane or layer.
  • biocompatible means that the framework structure and the nanoparticles, with regard to their material composition as well as their structure in the cells, tissues or in an organism, in particular an experimental animal, no toxic, apoptotic, unwanted immunological or other causes unwanted reaction and cellular or molecular processes, even after a possible intemalization of nanoparticles or degradation of the nanoparticles and / or scaffold structure does not or hardly disturbs.
  • the invention preferably provides for the nanoparticles to be biodegradable or bioresorbable, that is to be degraded successively by biological influences, in particular the action of the cultured cells, and to thereby release the active substances preferably contained.
  • nanoparticles are understood as meaning particles having a diameter of from 1 to 1000 nm.
  • Such nanoparticles can be composed of various materials, for example inorganic or organic substances.
  • their surfaces may comprise chemically reactive functional groups which fertilize affine bonds, ie covalent and / or non-covalent binders, with complementary functional groups of active substances to be bound, and in this way can stably fix the active substances to their surfaces.
  • the present invention provides that the nanoparticles can also form bonds with the framework structure. Such bonds are preferably electrostatic interactions.
  • the present invention provides a cell culture system in which the nanoparticles have a diameter of from 50 to 1000 nm, preferably from 50 nm to 900 nm, preferably from 60 to 600 nm. In a further preferred embodiment, the present invention provides a cell culture system in which the nanoparticles have a diameter of 80 to 150 nm, preferably 50 to 150 nm.
  • the cell culture system according to the invention contains nanoparticles composed of inorganic substances, for example gold or other noble metals or metals or metal oxides, calcium phosphate and calcium hydrogen phosphate or other mixed phosphates, silicon-based oxidic materials, such as silicates, silicon oxides , such as silicon dioxide, are built up.
  • the nanoparticles can also be DynaBeads.
  • the cell culture system according to the invention contains nanoparticles which are composed of organic materials, in particular organic polymers.
  • the nanoparticles can preferably be prepared by way of emulsion polymerization.
  • Nanoparticles are preferably used in the cell culture system according to the invention, which are constructed from biodegradable polymers. Also preferred is a use of nanoparticles which have a diameter of 50 nm and a biodegradable matrix.
  • the cell culture system according to the invention contains nanoparticles composed of polylactides (PLA), poly (lactide-co-glycolides) (PLGA), poly (lactic acid) PCL / PGA-di-block systems, polyorthoesters (POE), polyanhydrides, polyhydroxyalkanoates (PHA), polypyrroles (PPy), polypropylenecarbonate, Polyethylene carbonate, polyalkylcyanonitrile or polyethylene glycol are constructed.
  • the nanoparticles have polymers of different molecular weight and variable polarity.
  • the selection of the material to be used for the construction of the nanoparticle can be carried out according to which form and kinetics the active substance is to be released.
  • the invention provides a preferred embodiment, according to which a nanoparticle of different materials, in particular different polymers, constructed in order to achieve a particularly high variability in the control of the release profile of the drug to be released.
  • the cell culture system according to the invention comprises nanoparticles of different materials which, in a further preferred embodiment, in turn have different active substances. In this way too, a temporally and / or spatially specifically defined release of active ingredients can take place.
  • the nanoparticles are carriers of at least one active substance.
  • active ingredients are understood to mean those substances which exert an effect on the cells to be cultivated.
  • Preferred such active substances are substances which can be cultivated in the regulation of growth and differentiation processes.
  • Fourth cells are involved, in particular control, regulate, determine, initiate or finalize these agents growth and differentiation processes.
  • agents may also be involved in migration, invasion, redifferentiation or division processes.
  • the active compounds are those which are to be supplied to the cells to be cultivated in a desired and particular particular application kinetics.
  • the cell culture system contains nanoparticles which have active substances enclosed in the framework structure and / or applied to their surface.
  • the inclusion of active substances for example growth factors, the water-in-oil-in-water technique as the preferred method for the preparation of active substance-loaded nanoparticles, in particular PLA and PLGA Particles, is used.
  • active substances for example growth factors
  • the water-in-oil-in-water technique as the preferred method for the preparation of active substance-loaded nanoparticles, in particular PLA and PLGA Particles, is used.
  • the present invention furthermore preferably provides a cell culture system in which the active substances enclosed in the nanoparticles are growth factors, cytokines, cell adhesion proteins such as integrins, dyes such as fluoresceneamines, chemokines, vitamins, minerals, fats, proteins, nutrients, fiber-forming proteins, carbohydrates, Adhesion proteins, cell receptors, pharmaceuticals, DNA, RNA, aptamers, angiogenic factors, lectins, antibodies, antibody fragments or inhibitors.
  • growth factors cytokines
  • cell adhesion proteins such as integrins
  • dyes such as fluoresceneamines
  • chemokines chemokines
  • Adhesion proteins cell receptors
  • pharmaceuticals DNA, RNA, aptamers, angiogenic factors, lectins, antibodies, antibody fragments or inhibitors.
  • the cell culture system contains nanoparticles which Have stabilizers.
  • the stabilizers preferably represent carbohydrates, for example trehalose, proteins, polyethylene glycols or detergents.
  • the cell culture system contains nanoparticles which have been functionalized by coupling with functional groups.
  • the nanoparticles themselves have functional groups on their surface.
  • the present invention provides, in particular, for a first functional group 1A to be applied to the surface of the nanoparticles, which can form an affine, preferably covalent bond with a complementary group 2A of an active substance to be immobilized.
  • the first functional group 1A is selected from the group consisting of amino group, carboxy group, epoxy group, maleimido group, alkyl ketone group, aldehyde group, hydrazine group, hydrazide group, thiol group and thioester group.
  • the functional group 2A of the active substance is selected from the group consisting of amino group, carboxy group, epoxy group, maleimido group, alkyl ketone group, aldehyde group, hydrazine group, hydrazide group, thiol group and thioester group.
  • a nanoparticle according to the invention thus has on its surface a first functional group 1A which is covalently linked to a functional group 2A of the active substance to be immobilized, the functional surface group 1A being a group other than the functional protein group 1A. group 2A.
  • the two bonding moieties 1A and 2A must be complementary to each other, that is, able to form a covalent bond with each other.
  • the surface of the nanoparticle according to the invention functional groups 1B and an active substance to be immoblisierende the functional groups 1 B binding complementary groups 2B, wherein the functional groups 1 B and 2B according to the invention in particular a non- Covalent bond can enter.
  • the second functional group 1B of the surface of the nanoparticle is selected from the group consisting of oligohistidine group, Strep-Tag I, Strep-Tag II, Desthiobiotin, Biotin, Chitin, chitin derivatives, Chitinbinddomäne, metal ion chelate complex, streptavidin, streptactin, avidin and Neutravidin.
  • the functional group 2B of an active substance to be immobilized is selected from the group consisting of oligohistidine group, Strep-Tag I, Strep-Tag II, Desthiobiotin, biotin, chitin, chitin derivatives, Chitinbinddomäne, metal ion chelate complex, streptavidin, streptactin, avidin and Neutravidin.
  • a nanoparticle according to the invention has in its surface a functional group 1B which is non-covalently linked to a functional group 2B of a molecule, the functional surface group 1B of the nanoparticle being a group other than the functional molecular group 2B.
  • the two non-covalent bond-forming groups must be complementary to each other, that is, able to form a non-covalent bond with each other.
  • the surface of the nanoparticle according to the invention and the active substances to be immobilized optionally have both functional groups 1A and 1B as well as 2A and 2B.
  • the three-dimensional framework structure contains one or more of the following components, namely fiber-forming proteins such as collagens, elastic fiber-forming fibrillins and / or elastins, carbohydrates such as glucosaminoglycans, long-chain polysaccharides, in particular hyaluronic acid, heparan sulfate, dermatan sulfate, chondroitin sulfate and keratan sulfate, adhesion proteins, for example adapter proteins or other adhesive proteins, for example laminins, vitronectin and fibronectin, components of the basal membrane such as laminins, entactin and proteoglycan and cell receptors for ECM components such as cell membrane proteins.
  • fiber-forming proteins such as collagens, elastic fiber-forming fibrillins and / or elastins
  • carbohydrates such as glucosaminoglycans, long-chain polysaccharides, in particular hyaluronic acid, heparan
  • the three-dimensional framework structure contains or consists of components of the extracellular matrix selected from the group consisting of laminins, glycosaminoglycans (GAG), proteoglycans, elastin, type I collagen, II, III and IV, entactin (nidogen), vitronectin, hyaluronic acid, heparan sulfate, dermatan sulfate, chondroitin sulfate, keratan sulfate, perlecan, adhesion proteins and fibronectin.
  • laminins glycosaminoglycans (GAG), proteoglycans, elastin, type I collagen, II, III and IV, entactin (nidogen), vitronectin, hyaluronic acid, heparan sulfate, dermatan sulfate, chondroitin sulfate, keratan sulfate, perlecan, adhesion proteins and fibro
  • the framework structure can be constructed from a framework structure, for example collagen, in particular collagen fibers, this framework structure being advantageously and optionally designed with further components from the aforementioned group of components forming the framework structure.
  • the Framework basic structure in particular the collagen scaffold structure, for example, be additionally equipped with components that promote cell properties such as adhesion and proliferation, for example anchor proteins and / or carbohydrates.
  • the framework structure in particular of collagen, is in fiber form and / or in net shape.
  • the framework structure in particular of collagen, is present in a three-dimensional network-like branched form.
  • the framework structure may be in a preferred embodiment in hydrogelartiger or sponge-like form.
  • the three-dimensional biocompatible scaffold structure in the cell culture system according to the invention represents an extracellular matrix.
  • the concentration of active ingredients in the nanoparticle is in a range of 1 ng / ml to 10 ug / ml.
  • the cell culture system contains nanoparticles which are distributed in the cell culture system integrally in the framework structure.
  • the nanoparticles can be distributed homogeneously in the framework structure. In a preferred embodiment, however, there may also be a heterogeneous, non-uniform distribution of the nanoparticles.
  • the nanoparticles are present in the form of at least one layer above and / or below the framework structure. In a In a preferred embodiment, the nanoparticles are present in the form of at least one layer above the framework structure.
  • the nanoparticles in the cell culture system according to the invention are arranged in several layers below the framework structure.
  • the nanoparticles in the cell culture system according to the invention are preferably arranged in several layers above the framework structure.
  • the average diameter of the nanoparticles is always less than or equal to the average thickness of the framework structure. In a further preferred embodiment, the average diameter of all nanoparticles is always smaller than the average thickness of the framework structure. In a preferred embodiment, all nanoparticles, preferably predominantly or completely, are preferably embedded in the framework structure.
  • the ratio of the dimensions of nanoparticles to the thickness of the framework structure is preferably 1: 1 or less, preferably 1:10 or less, more preferably 1: 100 or less, more preferably 1: 1000 or less.
  • the nanoparticles in the cell culture system according to the invention are in the form of a gradient within the framework structure.
  • the preferably provided active substance is present in the cell culture system according to the invention in the form of a gradient within the framework structure.
  • the term "gradient" can thus mean the formation of various concentrations of nanoparticles and / or active substance within the cell culture system according to the invention, in particular the framework structure, in particular a spatially graduated, increasing or decreasing concentration of nanoparticles and / or agents.
  • an active ingredient gradient is formed by the use of nanoparticles which have different concentrations of an active substance.
  • the active substance can be enclosed or applied in different concentrations in the nanoparticles.
  • the active compound can also be applied to the nanoparticles in different concentrations by binding via functional groups. Depending on the order of these nanoparticles with different concentrations within the framework structure, for example a homogeneous distribution, an increasing concentration or a concentration gradient of the active substance in the cell culture system is thereby achieved.
  • a drug gradient is formed by having nanoparticles homogeneously distributed within the scaffold structure, wherein the nanoparticles have different drug concentrations and are arranged such that a drug gradient is formed. It is also provided in a preferred embodiment to distribute nanoparticles with different concentrations of active substance in a spatially uneven form, ie heterogeneously, in the framework structure, in particular to introduce such nanoparticles in the form of a nanoparticle gradient into the framework structure.
  • the drug gradient is formed in the cell culture system by forming a nanoparticle gradient, namely by nanoparticles in which a certain and in the nanoparticles used the same concentration of an active ingredient is incorporated or applied to the surface thereof , spatially heterogeneous, that is differently distributed in the framework structure, are present.
  • a lower number of these nanoparticles in, for example, an upper region of the framework structure followed by a higher number of these nanoparticles in an underlying region of the framework structure leads to an increase in concentration within the framework structure towards the bottom.
  • a higher number of these nanoparticles in an upper region of the framework structure and a smaller number of these nanoparticles in an underlying region of the framework structure lead to a decrease in concentration within the framework structure downwards.
  • a controlled and delayed release of active substance takes place in the cell culture system, in particular through the use of biodegradable nanoparticles.
  • the controlled release of active substances which is preferred according to the invention can additionally or alternatively also be ensured by diffusion from the nanoparticles into the surrounding cell culture system, in particular into the fibrous or network-like framework structure.
  • the nanoparticles are connected to the framework structure.
  • the binding is carried out so that a culture medium change does not lead to detachment of the nanoparticles from the framework structure.
  • the bond is stable to washing, ie the nanoparticles are not detached from the framework structure even when changing the culture medium and optionally washing steps with conventional washing media, such as buffers.
  • the nanoparticles are connected via electrostatic interactions with the framework structure, in particular by ionic bonding.
  • the nanoparticles are connected to the framework structure by UV crosslinking.
  • the cell culture system is used for carrying out migration experiments, in particular migration experiments in vivo.
  • the invention also relates to a method for producing a cell culture system comprising a three-dimensional biocompatible scaffold structure and biocompatible nanoparticles, wherein the scaffold structure with the nanoparticles, e.g. in accordance with one of the following methods.
  • the cell culture system is produced by a "contactless printing process".
  • the term "contactless printing process” means a process in which nanoparticles are transferred to the substrate without contact with the surface, and there are various possibilities for achieving this - called drop on demand provided by ink jet method.
  • a method by means of printhead or individual needles is provided.
  • one or more drops of suspension are transferred to the desired location.
  • commercially available machines from Dimatix - FujiFilm- are used for inkjet processes.
  • the delivery of the nanoparticle suspension takes place via a pneumatic method, a vacuum method or a piezoelectric method
  • the penetration depth of the nanoparticles into the substrate, in particular into the framework structure of the cell culture system is controlled by the drop volume or the dropping speed in the respective embodiments of the method according to the invention
  • the contactless printing method preferably leads to a layer-like structure wrestle the nanoparticles within the framework structure.
  • a cell culture system which is produced by impregnation, in particular by using a framework structure with a nanoparticle-containing suspension is penetrated, for example by impregnation with a nanoparticle-containing suspension.
  • a cell culture system which is produced by a laser induced forward transfer - LIFT method.
  • material to be transported in particular one or more components of the extracellular matrix, is cut out by laser energy and applied to a target material.
  • a further preferred embodiment of the present invention provides that the cell culture system is produced by electrospinning (spincoating).
  • electrospinning preferably polymeric structures having preferably a fiber diameter of preferably 2 to 20 ⁇ m, which are very similar to the natural environment of the cells, namely the extracellular matrix, can be produced.
  • the invention thus relates to methods for producing a cell culture system, wherein it is provided in a particularly preferred embodiment to produce the biocompatible nanoparticles, for example, by means of solvent evaporation of the Spontanoues Emulsifaction Solvent Diffusion (SESD) method, salting out, spray drying or phase separation.
  • SESD Emulsifaction Solvent Diffusion
  • this method it is particularly preferably possible according to the invention to incorporate the most diverse hydrophilic active ingredients into the nanoparticles.
  • the active substance in the water The substance is emulsified in a polymer-containing oil phase. This mixture is emulsified in a further water phase and the organic solvent removed, for example by reducing the pressure.
  • the oil phase acts equally as a solvent for the polymer as well as the active ingredient.
  • the novel nanoparticles in particular by the solvent evaporation based on Spontanoues Emulification Sovent Diffusion SESD method.
  • it is provided to dissolve both the polymer and the active ingredient in an organic mixture, preferably in dichloromethane and acetone, and to transfer this solution into an aqueous phase with stabilizer and to emulsify it by stirring.
  • the hydrophilic solvent, preferably acetone diffused into the surrounding water phase and the nanoparticles according to the invention are formed by stirring under reduced pressure.
  • the particle size is reduced by an increase in the proportion of water-miscible solvent.
  • the nanoparticles according to the invention in particular by salting out.
  • the polymer preferably PVA
  • the polymer is added to a saturated solution, in particular of magnesium chloride or magnesium acetate, so as to obtain a viscous gel as an aqueous phase.
  • a biodegradable polymer with an active ingredient preferably in acetone as the organic phase.
  • the organic phase is emulsified in the resulting two-phase system by stirring in the gel.
  • the nanoparticles according to the invention precipitate into the aqueous phase by adding sufficient water and after diffusion of preferably acetone.
  • nanoparticles according to the invention in particular by spray drying. It is preferably provided that nanoparticles according to the invention are produced by sputtering or atomizing solutions and emulsions in which biodegradable polymers and active substances are dissolved, in particular with the aid of a two-substance nozzle in a hot air stream.
  • the nanoparticles according to the invention are produced in particular by phase separation - coacervation.
  • phase separation - coacervation it is provided in particular to dissolve biodegradable polymers in preferably dichloromethane and to disperse or emulsify an active substance therein.
  • silicone oil which does not mix with the organic polymer phase, is added and carries out a phase separation. This mixture is stirred further with the addition of preferably heptane, whereby nanoparticles according to the invention can be obtained.
  • the method for producing a cell culture system according to the present invention relates to a cell culture system manufactured by contactless printing method.
  • the present invention relates to a process for the preparation of a cell culture system prepared by impregnation.
  • the present invention relates to a method for producing a cell culture system produced by an LIFT method.
  • the present invention relates to a method for producing a cell culture system in which the cell culture system is produced by electrospinning (spin coating).
  • the present invention also relates to a method for cultivating cells by introducing the cells into a cell culture vessel containing a cell culture system of the present invention and a suitable nutrient medium and cultured there under suitable conditions allowing cultivation.
  • the cultured cells are preferably eukaryotic cells, in particular of human or animal origin. More preferably, the cultured cells are primary cells.
  • the cell to be cultivated is a tumor cell, in particular a tumor cell line such as MCF-7, HeLa, HepG2, PC3, CT-26, A125, A549, MRC-5, CHO, MelJuso28, Nalm ⁇ or Jurkat.
  • a tumor cell line such as MCF-7, HeLa, HepG2, PC3, CT-26, A125, A549, MRC-5, CHO, MelJuso28, Nalm ⁇ or Jurkat.
  • the cell to be cultivated is an adherent cell, in particular an established cell line such as HUVEC or HaCaT.
  • this relates to a method for cultivating cells by means of the cell culture system according to the invention, wherein the cell to be cultivated is a differentiated cell.
  • the present invention relates to a method, in particular a non-therapeutic method, for producing differentiated cells or cell aggregates from undifferentiated cells, wherein the undifferentiated cells are cultivated in the cell culture method according to the invention and thus differentiated cells or cell aggregates are obtained.
  • the present invention relates to a method, in particular a non-therapeutic method, for maintaining the differentiation stage of predifferentiated or differentiated cells, wherein the predifferentiated or differentiated cells are cultured in the cell culture method according to the invention.
  • the present invention relates to an aforementioned, preferably non-therapeutic method, wherein undifferentiated cells are cultured in the cell culture method according to the invention and kept in this undifferentiated state.
  • the cell aggregates represent transplants or test systems.
  • the cell aggregates can also be organs, organ parts, in particular a trachea or parts thereof.
  • the present invention relates to differentiated cells and cell aggregates, which are obtained according to the invention cultivation of differentiated or undifferentiated cells or cell aggregates, for example, grafts, test systems, organs, organ parts, in particular a trachea, or parts thereof.
  • the present invention in particular the present cell culture method, allows the long-term cultivation of stem and progenitor cells, which can be used for a variety of applications, for example for transplants and test systems, but also in basic research.
  • the present invention particularly the present cell culture method, enables the proliferation of functional cells, especially primary cells.
  • the present invention in particular the present cell culture method, allows the directed differentiation to functional cells and tissues, for example in the transplant production or for test systems in drug development.
  • the present invention particularly the present cell culture method, enables the production of grafts for healing chronic / diabetic wounds, for example by cell migration induced by nanoparticles.
  • the present invention also relates to a method for the production of expression products of a cell, wherein the cell are cultured according to the cell culture method according to the invention and the expression product is obtained from this cell culture.
  • the present invention also relates to expression products of a cell which is cultured by the method according to the invention and whose expression products are obtained.
  • FIG. 1 shows an SEM micrograph of biodegradable nanoparticles
  • FIG. 2 shows the release result of the 8% BSA-loaded PLGA particles from Example 1.
  • Figure 3 shows cells on a PAH + carboxy nanoparticle coated slide on day 1; A) gives experiment 1, B) gives experiment 2 again.
  • Figure 4 shows cells cultured for control in a cell culture flask from Experiment 2; A) on day 1 and B) on day 3.
  • FIG. 5 shows cells which have been cultivated on surfaces with nanoparticles with amino functionalization and subsequent coating with carbo xy nanoparticles with a planar and globular surface;
  • FIG. 6 shows cells which have been cultivated on surfaces with nanoparticles with amino functionalization and subsequent coating with carbo-xy nanoparticles with a planar and globular surface;
  • A) PAH, Day 1, Approach 3, B) PAA + Amino Nanoparticles, Day 1, Approach 3, C) PAH, Day 3, Approach 2, D) PAA + Amino Nanoparticles, Day 3, Approach 2 Abbreviations:
  • PCL polycaprolactone
  • PGA polyglycolide
  • PAA polyacrylic acid
  • PAH polyallylamine hydrochloride
  • EGF epidermal growth factor
  • BMP bone morphogenic protein
  • SESD morpholinoethanesulfonic acid
  • the prepared W / O phase is dispersed in a further water phase (100 mL water + 500 mg polyvinyl alcohol) by means of ultrasound, so that a W / O / W emulsion is formed.
  • the organic solvent of the polymer-containing O-phase is removed by evaporation, thereby precipitating the polymer as a nanoparticle.
  • the size of the particles is about 150 to 350 nm.
  • the inclusion of active ingredient is 5-8 wt .-%. By use a larger amount of active ingredient can also be achieved a higher load.
  • This W1 / O phase is dispersed in a second aqueous phase (10 mL of a 0.5% PVA solution) by means of ultrasound.
  • the removal of the dichloromethane / acetone mixture of the W1 / 0 / W2 emulsion is carried out by evaporation under reduced pressure. In this case, nanoparticles with a size of 100-250 nm precipitate.
  • the drug loading is about 10-15 wt .-% (Fig. 1).
  • a 1% by weight aqueous suspension of the silica particles is mixed with 10% by volume of 25% ammonia. Then 20% by weight of aminopropyltriethoxysilane, based on the particles, are added and the mixture is stirred for 1 h at room temperature. The particles are purified by repeated centrifugation and carry functional amino groups on their surface (zeta potential in 0.1 M acetate buffer: + 35 mV).
  • the modified surfaces include, in addition to the nanoparticles, a fibrous framework structure.
  • the inoculated nanoparticles are at a distance of 10 to 1000 nm.
  • Ojekt breed (OT) is first cleaned in a water bath at 40 0 C with a 2% (v / v) Hellmanex Il solution. Subsequent hydroxylation of the surfaces occurs at 70 ° C. in a 3: 1 (v / v) NH 3 (30%) and H 2 O 2 (25%) solution to produce a negative charge. Before or after the hydroxylation is carried out a coating with, for example, a collagen solution, for example, collagen type I 1 in a concentration of 0.1 to 6 mg / ml, in a conventional manner.
  • a collagen solution for example, collagen type I 1 in a concentration of 0.1 to 6 mg / ml
  • the polyelectrolyte coating of the surfaces is produced by the so-called layer-by-layer technique.
  • the freshly purified and negatively charged OT are first added to a cationic poly (allylamine hydrochloride) solution (PAH solution) (0.01 M, based on the monomer) or poly (diallyldimethylammonium chloride).
  • PAH solution cationic poly (allylamine hydrochloride) solution
  • PDADMAC solution 0.02 M, based on the monomer
  • Table 1 shows observations on the morphology of human keratinocytes on the carbonyl and amino nanoparticles.
  • modified surfaces with triplicates with n 3 samples each were carried out. Both the colony density and thus the adherent cell number and proliferation as well as the morphology and thus the differentiation status of the primary cells were evaluated.
  • Fig. 3 On the modified surfaces with a fibrous framework structure, there is a much faster adhesion and spreading (Fig. 3) of the keratinocytes in contrast to the culture flask (Fig. 4).
  • the surfaces modified with nanoparticles induce rapid spreading, which is visible within a few hours.
  • the morphology of the primary epidermal cells was comparable to the cell culture flask on these modified substrates. Furthermore, a faster differentiation of the primary cells on the amino-functionalized surfaces (Fig. 6) was seen, whereas the differentiation of the keratinocytes on the carboxy surface corresponded to that of the controls (Fig. 5). Table 1

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Zellkultursystem, das eine dreidimensionale biokompatible Gerüststruktur und biokompatible Nanopartikel umfasst, ein Verfahren zur Kultivierung von Zellen, die Bereitstellung von Zellen oder Zellprodukten und Geweben sowie von Zellen oder Zellprodukten und Geweben an sich mittels eines solchen Zellkultursystems.

Description

Verbesserte dreidimensionale biokompatible Gerüststruktur, die Nanopartikel beinhaltet
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Zellkultursystem, das eine drei- dimensionale biokompatible Gerüststruktur und Nanopartikel beinhaltet. Weiterhin umfasst die vorliegende Erfindung auch Verfahren zur Herstellung eines solchen Zellkultursystems sowie Verfahren zur Kultivierung von Zellen mittels dieses Zellkultursystems.
Zellen werden in vivo von einer komplexen, dynamischen Mikroum- weit umgeben, die insbesondere aus der extrazellulären Matrix (ECM)1 Wachstumsfaktoren, Cytokinen und benachbarten Zellen besteht. Die extrazelluläre Matrix ist in allen vier Grundgewebetypen, nämlich Epithel-, Muskel-, Nerven- sowie Binde- und Stützgewebe vorhanden. Neben ihrer Funktion als Stützgerüst, die lange Zeit als Hauptaufgabe gesehen wurde, dient die ECM vor allem einem interaktiven Signalaustausch durch Transmembranrezeptoren der Zellen. Durch diese Form der Kommunikation wirkt sie sich auch auf die Regulation der Genexpression aus. Dies spielt eine wichtige Rolle bei essentiellen Zelleigenschaften, wie Adhäsion, Proliferation, Diffe- renzierung, Migration, Apoptose und Umbauprozessen. Die ECM stellt kein statisches System dar, vielmehr befinden sich die Komponenten der ECM in einem „Fließgleichgewicht". Komponenten der ECM werden von Zellen in den Interzellularraum (der Raum zwischen den Zellen) sezerniert und synthetisiert, können aber auch gleichzeitig wieder von den Zellen abgebaut werden. Die extrazelluläre Matrix besteht aus drei Hauptkomponenten: Kollagenfasern, Ankerproteine und raumfüllende Kohlenhydrate. Die Basalmembran ist eine Proteinschicht, die als spezialisierte extrazelluläre Matrix angesehen werden kann. Sie stellt eine stabilisierende Schicht dar und grenzt Oberflächenepithelien gegenüber dem Bindegewebe ab. Da- durch wird verhindert, dass die Zellen dieser Schichten auseinander gleiten.
Eine Komponente der extrazellulären Matrix stellen faserbildende Proteine dar. Kollagene sind dabei die vorherrschende Proteinfamile der ECM. Sie bilden verschiedene Arten von Fasern und sind in fast jedem Gewebe vorhanden. Große Teile der ECM werden von dem fibrillären Kollagen Typ I gebildet, während in der Basalmembran Kollagen vom Typ IV eine wichtige Rolle spielt. Elastische Fasern setzen sich aus den Proteinen Fibrillin und Elastin zusammen. In- nerhalb der ECM stellen Kohlenhydrate eine weitere wichtige Komponente dar. Darunter zählen auch Glycosaminoglykane (GAG). Glycosaminoglykane sind Proteine, die mit langkettigen Polysacchariden bestimmter Einzelbausteine assoziiert sind. Lagern sich Glycosaminoglykane zu größeren Makromolekülen zusammen, so entste- hen Proteoglykane. Wesentliche Merkmale und Eigenschaften der ECM ergeben sich aus der Vielfalt und den Interaktionen von Proteinen, Glycosaminoglykanen und Proteoglykanen. Weitere Kohlenhyd- ratkomponenten der ECM stellen Hyaluronsäure, Heparansulfat, Dermatansulfat, Chondroitinsulfat und Keratansulfat dar.
Eine weitere kennzeichnende Komponente der extrazellulären Matrix sind Adhäsionsproteine. Adhäsionsproteine, Adpaterproteine oder andere adhäsive Proteine können zum einen mit anderen Bestandteilen der Matrix, zum anderen aber auch mit weiteren Zellen durch Anheftung an bestimmte Zellrezeptoren interagieren. Beispiele für Adhäsionsproteine stellen die Proteinfamilie der Laminine, Vitronek- tin und Fibronektin dar.
Die Basalmembran als spezialisierte extrazelluläre Matrix enthält verschiedene wesentliche Komponenten. Als erstes sind hierbei Kollagene vom Typ I bis IV zu nennen, wobei Typ IV eine besondere Bedeutung zukommt. Laminine stellen einen weiteren Bestandteil der Basalmembran dar. Sie besitzen eine schwertähnliche Form. Ihre Enden sind mit Zellrezeptoren besetzt, die hauptsächlich an In- tegrine binden. Laminin 1 ist die wichtigste Adhäsionskomponente, weiterhin kommt Laminin 5 als entscheidender Bestandteil der Basalmembran besondere Bedeutung zu. Eine besondere Bedeutung kommt Entactin (Nidogen) als weitere Komponente der Basalmembran zu, da es die Kollagenschichten mit den Lamininschichten verbindet. Schließlich werden durch Proteoglykane wie Perlecan die einzelnen Komponenten der Basalmembran verknüpft, da Perlecan in seiner Struktur Bindungsstellen für Kollagen, Laminin, Nidogen und sich selbst autweist.
Zuletzt sind als weitere wichtige Elemente der extrazellulären Matrix Zellrezeptoren zu nennen. Zellmembranproteine wie die Integrinfami- lie spielen in diesem Zusammenhang für die Zelladhäsion eine entscheidende Rolle. Integrine sind heterodimere Proteine, die aus verschiedenen alpha- und beta-Untereinheiten aufgebaut sein können. Je nach Zusammensetzung der alpha- beziehungsweise beta- Untereinheiten der Integrine können diese an die extrazelluläre Mat- rix, so zum Beispiel an Laminin, Vitronektin oder Fibronektin binden.
Für die Kultivierung von Zellen ist es ein Ziel, die extrazelluläre Matrix als natürliche Umgebung der Zellen möglichst genau nachzubilden. Neben den Bestandteilen der extrazellulären Matrix ist es auch wünschenswert, weitere biologisch bedeutsame Stoffe wie Wachs- tumsfaktoren gezielt in diese ECM-Strukturen einbringen zu können.
Bisher findet die Kultivierung von primären Zellen, die aus Gewebe isoliert werden, häufig in mit Kunststoff beschichteten Zellkulturgefäßen statt. Diese Umgebung entspricht jedoch nicht den natürlichen, physiologischen Bedingungen der Zellen und führt deshalb sehr oft zum Funktionsverlust, zur Dedifferenzierung der Zellen und schlimmstenfalls zum Zelltod. Bisher bekannte Verbesserungen der Zellkulturgefäße bestehen darin, die Oberfläche mit einzelnen natürlichen Bestandteilen der extrazellulären Matrix wie Kollagenfasern oder Fibronektin zu beschichten. Diese werden jedoch nicht spezifisch an den Zelltyp angepasst und sind zudem Undefiniert aufgetragen. Bekannt ist auch die Kultivierung von Zellen in wirkstoffhaltigen gelartigen Strukturen. Als nachteilig erweist sich unter anderem, dass die Wirkstoffe unkontrolliert bei einem gegebenenfalls erforder- lieh werdendem Mediumwechsel herausgewaschen werden.
Des weiteren besteht die Möglichkeit, Zellen in Zellkulturmedien zu kultivieren, in denen die Wirkstoffe bereits in gelöster Form vorliegen. Die Wirkstoffe stehen somit zwar den Zellen unmittelbar zur Verfügung, jedoch besteht ein Nachteil darin, dass diese unter Um- ständen schnell verbraucht werden und ihre Konzentration den jeweiligen Differenzierungs- und Wachstumsphasen der kultivierten Zellen nicht kontrolliert angepasst werden können.
Aus der DE 10144252 A1 und der DE 10031859 A1 sind Nanoparti- kel und deren Anwendung für Identifizierungs- und Screeningverfah- ren bekannt. Gemäß dieser Offenbarungen können die Nanopartikel auch bestimmte biologisch aktive Substanzen erkennen oder trägem.
Zur Herstellung von Nanopartikeln stellt die Emulsionspolymerisation ein Spezialverfahren der Polymerisation dar, bei dem wasserunlösli- che Monomere mit Hilfe von Emulgatoren in Wasser emulgiert und unter Verwendung wasserlöslicher Initiatoren, zum Beispiel Kaliumpersulfat, polymerisiert werden. Die bei der Emulsionspolymerisation anfallenden Polymerdispersionen, zum Beispiel Latex-Dispersionen, können für eine Vielzahl von Anwendungen eingesetzt werden. Die US 4,521 ,317 und US 4,021 ,364 zeigen Möglichkeiten und Grenzen der Emulsionspolymerisation auf.
Im Rahmen von Emulsionspolymerisationen können grundsätzlich zwei Typen von Emulsionen eingesetzt werden: die Öl-in-Wasser- Emulsion und die Wasser-in-öl-Emulsion, auch inverse Emulsion genannt. In beiden Fällen wird ein im Reaktionsmedium unlösliches Monomer unter Rühren mittels Emulgatorzugabe dispergiert und die Reaktion durch Zugabe eines Initiators gestartet.
Der vorliegenden Erfindung liegt das technische Problem zugrunde, ein Zellkultursystem bereitzustellen, das zum einen der nativen extrazellulären Matrix als natürliche Umgebung der Zellen sehr nahe kommt und zum anderen die kontrollierte Zufuhr von Wachstumsfaktoren und Cytokinen ermöglicht, um das Zellwachstum und die Zelldifferenzierung gezielt steuern und auch gewebespezifisch anpassen zu können. Weiterhin liegt der vorliegenden Erfindung das technische Problem zugrunde, Zellen, insbesondere auch Gewebe und Organe bereitzustellen, die für Transplantationen geeignet sind. Darüber hinaus besteht auch ein Bedarf an speziellen Geweben im Rahmen des sogenannten Tissue engineering sowie für For- schungszwecke.
Die vorliegende Erfindung löst das ihr zugrundeliegende technische Problem durch die Bereitstellung eines Zellkultursystems, das eine dreidimensionale biokompatible Gerüststruktur sowie biokompatible Nanopartikel umfasst, sowie durch ein Verfahren zur Kultivierung von Zellen, durch die Bereitstellung von Zellen oder Zellprodukten und Gewebe sowie von Zellen oder Zellprodukten und Gewebe an sich mittels eines solchen Zellkultursystems. Die vorliegende Erfindung stellt demgemäß ein Zellkultursystem bereit, das es ermöglicht, Zellen, insbesondere eukaryotische Zellen, in besonders bevorzugter Ausführungsform tierische oder menschliche Zellen, unter Bedingungen zu kultivieren, die der in vivo-Situation oder einer erwünschten künstlich ausgerichteten Umgebung entspricht.
Die Erfindung beruht insbesondere darauf, dass ein Zellkultursystem bereitgestellt wird, welches gemeinsam mit einer dreidimensionalen biokompatiblen Gerüststruktur vorliegende biokompatible Nanoparti- kel aufweist. Ein derartiges System erlaubt es, die in ihm kultivierten Zellen Einflüssen und Bedingungen auszusetzen, die gezielt durch die Anwesenheit der Nanopartikel gesetzt werden und, je nach Zielsetzung der Kultivierung, die Zellen in ihrem biologischen Verhalten, z.B. Wachstums- oder Differenzierungsverhalten beeinflussen. In besonders bevorzugter Ausführungsform können die Nanopartikel Wirkstoffe aufweisen, zum Beispiel, indem sie diese auf der Oberfläche oder im Nanopartikel selbst eingeschlossen aufweisen. Selbstverständlich kann auch vorgesehen sein, dass die Wirkstoffe sowohl auf der Oberfläche als auch im Inneren der Nanopartikel vorliegen. Die auf diese Art und Weise mit den Nanopartikeln verbundenen Wirkstoffe werden im Verlauf des mit dem Zellkultursystem durchgeführten Zellkulturverfahrens kontrolliert und/oder reguliert, insbesondere zeitlich verzögert freigesetzt, und können so dosiert und über einen längeren Zeitraum hinweg kontrolliert den Zellen zugeführt werden. Durch die Kopplung der Nanopartikel mit beispielsweise Wachstumsfaktoren wird so eine gezielte Abgabe dieser Wachstumsfaktoren über einen definierten Zeitraum gewährleistet.
Es konnte gezeigt werden, dass Nanopartikel, zum Beispiel aus po- lymeren Material, als Träger von zum Beispiel Wachstumsfaktoren überraschende Vorteile aufweisen. So kontrollieren Nanopartikel, insbesondere polymere Nanopartikel, als Träger die kontrollierte, d.h. mit einer bestimmten, in der Regel verzögerten Freigabekinetik erfolgende Freigabe von Wirkstoffen, beispielsweise Cytokinen. Die- ser Effekt wird auch als controlled release bezeichnet. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist vorgesehen, dass die Freigabe der Wirkstoffe vorbestimmbar in Abhängigkeit von der Zeit reguliert wird und so eine erwünschte und bestimmte Wirkstoff-Freigabe-Kinetik bereitgestellt wird. Erfindungsgemäß kann vorgesehen sein, dass eine erwünschte Wirkstoff-Freigabe- Kinetik durch Auswahl des Nanopartikel-Materials derart ausgestaltet ist, dass eine Freigabe des Wirkstoffs zellspezifisch erfolgt. Beispielsweise kann eine auf die gesamte Freigabedauer bezogene konstante Freisetzungsrate des Wirkstoffs erfolgen. Selbstverständ- lieh kann auch vorgesehen sein, beispielsweise in einer ersten Phase eine zunächst initial geringe Wirkstofffreigaberate und eine nach einem bestimmten Zeitpunkt einsetzende erhöhte Freisetzungsrate vorzusehen. Die Erfindung sieht in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform auch vor, in einer initialen ersten Phase eine ver- gleichsweise hohe Freisetzungsrate des Wirkstoffes vorzusehen, die nach einem bestimmten Zeitpunkt von einer geringeren Freisetzungsrate abgelöst wird. Durch die Verwendung geeigneter Polymermaterialien zur Herstellung des Nanopartikels ist es erfindungsgemäß auch möglich, zu einem bestimmten Zeitpunkt im Rahmen eines Zellkulturverfahrens eine erwünschte hohe Konzentration eines Wirkstoffes aus dem Nanopartikel in Form eines burst-Effektes freizusetzen. Die Nanopartikel können in bevorzugter Ausführungsform eine solche Wirkstoffbeladung aufweisen, dass die Wirkstoffkonzentration in einem bevorzugten Bereich von 1 ng/ml bis 10 μg/ml nach der Freisetzung liegt. Die Wirkstofffreigabe kann dabei sowohl durch Diffusion des Stoffes aus oder von den Nanopartikeln als auch durch Abbau des Nanopar- tikels selbst, zum Beispiel durch Hydrolyse des Polymeren, erfolgen.
Die Kombination von, insbesondere wirkstoffbeladenen, Nanoparti- kein mit einer Gerüststruktur, insbesondere aus Komponenten der extrazellulären Matrix, zeigte weitere überraschende Vorteile. So ist es möglich, eine gezielte und gerichtete Differenzierung von Stammzellen zu erreichen durch Kultivierung der Zellen auf einer Gerüst- struktur mit Nanopartikeln, insbesondere einer bestimmten Cytokin- beladung.
Weiterhin konnte gezeigt werden, dass insbesondere primäre Zellen durch die Kultivierung in einer Matrix, enthaltend Nanopartikel, gekoppelt mit speziellen Wachstumsfaktoren, eine deutlich höhere Überlebensrate aufwiesen und somit auch eine Langzeitkultivierung dieser empfindlichen Zellen möglich wird.
Überraschenderweise konnte gezeigt werden, dass durch die Kultivierung in dem erfindungsgemäßen Zellkultursystem eine gezielte und gerichtete Zellmigration induziert werden kann.
Untersuchungen zeigten, dass insbesondere primäre Zellen, die in dem erfindungsgemäßen Zellkultursystem kultiviert wurden, überraschenderweise eine deutlich gesteigerte Proliferation aufwiesen. Darüber hinaus konnte eine deutlich verbesserte Adhäsionseigenschaft an den erfindungsgemäß modifizierten Oberflächen, das heißt dem Zellkultursystem festgestellt werden im Vergleich zu herkömmli- chen Zellkulturgefäßen. Die Zellen behielten zudem ihre typischen morphologischen Eigenschaften auch nach mehrtägiger Kultivierung bei. Eine unerwünschte Dedifferenzierung der primären Zellen wird somit durch das erfindungsgemäße Zellkultursystem weitgehend verhindert.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist unter dem Begriff „Zellkultursystem" ein System zur Kultivierung von Zellen zu verstehen, das insbesondere in Form der in ihm enthaltenden Gerüststruktur, Adhäsionsstellen für zu kultivierende Zellen, vorzugsweise in dreidimensional strukturiertem Aufbau, zum Beispiel als Matrix oder Hydrogel, bereitstellt. Üblicherweise ist ein solches Zellkultursystem bei seinem Gebrauch, vorzugsweise in vitro-Gebrauch, in künstlichen Behältern positioniert, die in der Lage sind, über das Zellkultursystem selbst auch die zu kultivierenden Zellen sowie ein Kulturmedium aufzunehmen.
Das Zellkultursystem der vorliegenden Erfindung ist daher insbesondere ein System zur Kultivierung von Zellen in vitro. Das erfindungs- gemäße Zellkultursystem kann zur Kultivierung von Zellen in herkömmlichen Zellkulturgefäßen wie Petrischalen oder Zellkulturflaschen oder in irgendeiner anderen Form angewendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das Zellkultursystem zur Kultivierung von primären Zellen verwendet. In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass das erfindungsgemäße Zellkultursystem in vivo eingesetzt wird, z.B. in Tierexperimenten.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet „Gerüststruktur" eine Struktur zum Anheften von Zellen. Eine Gerüst- struktur im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist insbesondere in bevorzugter Ausführung eine Struktur, die nicht allein ein oberflächliches Anhaften oder Adhärieren von Zellen gestattet, sondern darüber hinaus insbesondere auch ein Hineinwachsen oder Integrieren von Zellen in die Gerüststruktur selbst. Die Gerüststruktur stellt be- vorzugt eine Matrix dar, vorzugsweise mit Poren oder Zwischenräumen. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält diese Matrix eine oder mehrere Komponenten der extrazellulären Matrix wie Bestandteile der Basalmembran, Adhäsions- proteine, faserbildende Proteine, Kohlenhydrate, Proteoglykane oder Zellrezeptoren.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ist unter einer „primären Zelle" eine eukaryotische Zelle humanen oder tierischen Ursprungs, die aus Organen oder aus einem Embryo gewonnen wird. Insbesondere ist vorzugsweise ein embryonale Stammzelle als primäre Zelle vorgesehen, vorzugsweise eine solche, die aus Nabelschnurblut gewonnen wird. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ist jedoch vorzugsweise nicht die Verwendung von humanen embryonalen Stammzellen vorgesehen. Die erfindungsgemäß eingesetzte Stammzelle kann eine totipotente, omnipotente oder pluripotente Zelle sein. Weiterhin bevorzugt ist die primäre Zelle eine adulte Stammzelle, z.B. eine tierische oder menschliche adulte Stammzelle.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet „primä- re Zelle" also eine eukaryotische Zelle humanen oder tierischen Ursprungs. Primäre Zellen können aus Organen, wie Haut, Niere oder Leber, oder aus ganzen Embryonen gewonnen werden. Ein Beispiel für eine erfindungsgemäß eingesetzte primäre Zelle ist ein Fibroblast. Die primäre Zelle ist bevorzugt omnipotent oder pluripo- tent. Eine primäre Zelle kann auch eine adulte Stammzelle sein. Die Zellen werden durch Behandlung mit Trypsin oder durch eine andere Protease behandelt und dadurch aus dem Gewebe isoliert und auch
- durch Abbau von interzellulären Verbindungen wie Tight Junctions
- vereinzelt. Primäre Zellkulturen von epithelialen Zellen sind ein weiteres Beispiel für primäre Zellen. Im Allgemeinen umkleiden Epi- thelien externe und interne Oberflächen von Geweben und Organen. Epithelzellen besitzen einen sehr hohen Differenzierungsgrad, der in der Polarisierung der Zellen mit einer apikalen und einer basolatera- len Oberfläche zum Ausdruck kommt. Die verschiedenen Oberflächen nehmen unterschiedliche Funktionen wahr. So dient die apikale Oberfläche von Epithelzellen des Darms der Aufnahme von Nährstoffen, während die basolaterale Oberfläche diese Nährstoffe an das Blut weiterleitet und Verbindungen zu benachbarten Zellen so- wie zur Basalmembran ausbildet. Primäre Zellen aus Blut, Knochenmark oder Milz adhärieren kaum, können jedoch dennoch in Suspension kultiviert werden. Nach der Behandlung mit Trypsin existieren darüber hinaus Methoden, um aus den isolierten primären Zellen einen gewünschten Subtyp weiter zu selektionieren. So besteht die Möglichkeit durch magnetische Zellseparierungsmethoden oder durch fluorescence activated cell sorting FACS beispielsweise aus dem Knochenmark B-Zellen als primäre Zelle zu isolieren.
Eine primäre Zelle kann auch eine, vorzugsweise nicht humane, embryonale Stammzelle sein, bevorzugt eine embryonale Stammzel- Ie, die in besonders bevorzugter Ausführungsform aus Nabelschnurblut gewonnen wurde. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die embryonale Stammzelle ein Zelle, die aus einem Embryo isoliert wurde, der sich in einem Stadium bis zu acht Zellen befindet. Diese embryonale Stammzelle aus dem Achtzellstadium ist eine totipotente Zelle und lässt sich in alle Zellformen der Hauptgewebetypen also endodermal - wie Wandzellen des Verdauungstraktes - , mesoder- mal - wie Muskeln, Knochen, Blutzellen - und ektodermal - wie Hautzellen und Nervengewebe - differenzieren. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die embryonale Stammzelle eine ZeI- Ie, die aus einem Embryo isoliert wurde, der sich in dem Stadium der Blastozyste befindet. Diese embryonale Stammzelle aus dem Blasto- zystenstadium ist eine pluripotente Zelle und lässt sich in alle Arten von Körperzellen der Hauptgewebetypen, also endodermal, und ek- todermal differenzieren, mit Ausnahme der Bildung von plazentalem Gewebe, das nicht mehr gebildet werden kann. Besonderes Kennzeichen von Stammzellen ist, dass diese Zellen fähig sind zum einen während der Zellteilung sich selbst zu replizieren, und damit den Pool an Stammzellen zu erhalten, und gleichzeitig eine differenzierte Zelle hervorzubringen, die dann ein geringeres Differenzierungspo- tential besitzt. Stammzellen grenzen sich durch sogenannte Marker von differenzierten Zellen ab. Marker können spezielle Proteine sein, die von Stammzellen verstärkt oder in geringerem Maße exprimiert werden. Für murine embryonale Stammzellen sind als Marker SSEA- 1 , stage-specific embryonic antigen-1 , AP-Aktivität, alkalische Phosphatase-Aktivität sowie die Expression des Transkriptionsfaktors Oct-3/4 beschrieben. Die Expression der Markerproteine ist von der Herkunft der Stammzelle abhängig.
Die Erfindung betrifft jedoch auch Zellkulturverfahren und Mittel zu deren Durchführung, die nicht-embryonale Stammzellen betreffen, insbesondere verwenden. Eine adulte Stammzelle ist eine Zelle, die nach dem embryonalen Stadium entsteht. Adulte Stammzellen können aus Organen und Geweben, wie Knochenmark, Haut, Fettgewebe, Nabelschnur, Nabelschnurblut, Gehirn, Leber oder Bauchspeicheldrüse isoliert werden und sind in der Regel prädeterminiert, d.h. sie besitzen ein geringeres Differenzierungspotential und sind multi- oder unipotent. Gewöhnlich besitzen isolierte primäre Zellen aus einem Embryo oder einem adulten Säugetier nur eine sehr begrenzte Wachstumsfähigkeit. Bei humanen fetalen Zellen findet nach ihrer Isolierung und Kultivierung zunächst ein gutes Zellwachstum statt. Weiterhin können auch primäre Zellen aus Tumoren isoliert und kultiviert werden. Durch genetische Veränderungen, oncogene Transformationen, werden Regulationsmechanismen, wie Apoptose, außer Kraft gesetzt beziehungsweise positive Wachstumssignale, wie eine Überexpression von Wachstumsrezeptoren, verstärkt. Da- her zeigen viele, insbesondere primäre Tumorzellen häufig ein nicht limitiertes Wachstum. Eine besondere Subpopulation von primären Zellen unter Tumorzellen stellen sogenannte Tumorstammzellen dar. Diese konnten als eine sehr kleine Zellfraktion innerhalb bestimmter Tumoren festgestellt werden. Tumorstammzellen sind aus Brust- krebstumoren isoliert und kultiviert worden. Kennzeichnende Markerproteine für diese Brustkrebsstammzellen sind eine hohe CD44- Expression, keine oder eine geringe CD24-Expression und die Abwesenheit von sogenannten Linienmarkern.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ist unter einer „adulten Stammzelle" insbesondere eine Zelle zu verstehen, die nach dem embryonalen Stadium entstanden ist, gegenüber ausdifferenzierten Zellen ein noch nicht ausgeschöpftes Differenzierungspotential aufweisen, prädeterminiert sind und insbesondere aus Epithelzellen, Endothelzellen, dendritischen Zellen, mesenchymalen Zellen, Adipocyten beziehungsweise insbesondere den entsprechenden Vorläuferzellen aus dem Herzen, der Muskulatur, des Fettgewebes, der Haut und dem Gehirn isoliert werden.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet „dreidimensional" eine räumliche Ausdehnung in alle drei Raumkoordina- ten. Die Ausdehnung kann im Wesentlichen gleichmäßig in diesen drei Richtungen vorliegen, sodass zum Beispiel eine zylindrische Form, eine Säulen-, quader- oder würfelförmige Matrixstruktur vorliegt. Es ist aber zum Beispiel auch möglich, dass die Ausdehnung in zwei Richtungen in größerem Ausmaß vorliegt, in die dritte Richtung jedoch nur in geringem Maße, so dass die dreidimensionale Struktur flächig wirkt, zum Beispiel eine Membran oder Schicht darstellt.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung bedeutet der Begriff „biokompatibel", dass die Gerüststruktur und die Nanopartikel sowohl hinsichtlich ihrer Materialzusammensetzung als auch hinsichtlich ihrer Struktur in den Zellen, Geweben oder in einem Organismus, insbesondere eines Versuchstiers, keine toxische, apoptotische, unerwünschte immunologische oder sonstige unerwünschte Reaktion hervorruft und zelluläre und molekulare Prozesse auch nach einer möglichen Intemalisierung der Nanopartikel oder einem Abbau der Nanopartikel und/oder Gerüststruktur nicht oder kaum stört.
Vorzugsweise sieht die Erfindung in einer besonderen Ausführungsform vor, dass die Nanopartikel bioabbaubar oder bioresorbierbar sind, das heißt durch biologische Einflüsse, insbesondere die Einwir- kung der kultivierten Zellen, sukzessive abgebaut werden und dabei die vorzugsweise enthaltenen Wirkstoffe freisetzen können.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden unter Nanopartikeln Partikel verstanden, die einen Durchmesser von 1 bis 1000 nm aufweisen. Derartige Nanopartikel können aus verschiedenen Materia- lien aufgebaut sein, beispielsweise anorganischen oder organischen Substanzen. In bevorzugter Ausführungsform können deren Oberflächen chemisch reaktive funktionelle Gruppen umfassen, die mit komplementären funktionellen Gruppen von zu bindenden Wirkstoffen affine Bindungen, also kovalente und/oder nicht-kovalente Bin- düngen, eingehen und auf diese Weise die Wirkstoffe an ihren Oberflächen stabil fixieren können. Die vorliegende Erfindung sieht in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform vor, dass die Nanopartikel auch Bindungen mit der Gerüststruktur eingehen können. Derartige Bindungen sind bevorzugt elektrostatische Wechselwirkungen. In einer bevorzugten Ausführungsform sieht die vorliegende Erfindung ein Zellkultursystem vor, in dem die Nanopartikel einen Durchmesser von 50 bis 1000 nm, vorzugsweise von 50 nm bis 900 nm, bevorzugt von 60 bis 600 nm, aufweisen. In einer weiteren bevorzug- ten Ausführungsform sieht die vorliegende Erfindung ein Zellkultursystem vor, in dem die Nanopartikel einen Durchmesser von 80 bis 150 nm, bevorzugt von 50 bis 150 nm, aufweisen.
In einer weiteren Ausführungsform ist es vorgesehen, dass das erfindungsgemäße Zellkultursystem Nanopartikel enthält, die aus an- organischen Substanzen, zum Beispiel Gold oder anderen Edelmetallen oder Metallen oder Metalloxiden, Calciumphosphat und Calci- umhydrogensphosphat oder anderen Mischphosphaten, Siliziumbasierten oxidischen Materialien, wie Silicaten, Siliziumoxiden, wie Siliziumdioxid, aufgebaut sind. In bevorzugter Ausführung können die Nanopartikel auch DynaBeads sein.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, dass das erfindungsgemäße Zellkultursystem Nanopartikel enthält, die aus organischen Materialien, insbesondere organischen Polymeren, aufgebaut sind. Die Nanopartikel können bevorzugt im Wege der Emul- sionspolymerisation hergestellt werden.
Bevorzugt werden Nanopartikel in dem erfindungsgemäßen Zellkultursystem eingesetzt, die aus bioabbaubaren Polymeren aufgebaut sind. Weiterhin bevorzugt ist auch eine Verwendung von Nanoparti- keln, die einen Durchmesser von 50 nm und eine bioabbaubare Mat- rix aufweisen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist es vorgesehen, dass das erfindungsgemäße Zellkultursystem Nanopartikel enthält, die aus Polylactiden (PLA), Poly(lactid-co-glycolid)en (PLGA), PoIy- caprolactonen (PCL), Polyglycoliden, Di- und Tri-Block-Polymeren bspw. PCL/PGA-Di-Block-Systemen, Polyorthoestern (POE), PoIy- anhydride, Polyhydroxyalkanoaten (PHA), Polypyrrolen (PPy), Po- lypropylencarbonat, Polyethylencarbonat, Polyalkylcyanonitril oder Polyethylenglycol aufgebaut sind.
Bevorzugt ist vorgesehen, dass die Nanopartikel je nach gewünschtem Freisetzungsprofil des Wirkstoffs Polymere mit unterschiedlichem Molekulargewicht und variabler Polarität aufweisen. Die Auswahl des für den Aufbau des Nanopartikels einzusetzenden Materi- als kann in bevorzugter Ausführungsform danach erfolgen, in welcher Form und Kinetik der Wirkstoff freigesetzt werden soll.
Insbesondere sieht die Erfindung eine bevorzugte Ausführungsform vor, gemäß der ein Nanopartikel aus verschiedenen Materialien, insbesondere verschiedenen Polymeren, aufgebaut ist, um so eine be- sonders hohe Variabilität bei der Steuerung des Freisetzungsprofils des freizusetzenden Wirkstoffs erzielen zu können. In einer weiteren Ausführungsform kann selbstverständlich auch vorgesehen werden, dass das erfindungsgemäße Zellkultursystem Nanopartikel aus verschiedenen Materialien aufweist, die in weiter bevorzugter Ausfüh- rung wiederum unterschiedliche Wirkstoffe aufweisen. Auch auf diese Art und Weise kann eine zeitlich und/oder räumlich spezifisch definierte Freisetzung von Wirkstoffen erfolgen.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist also vorgesehen, dass die Nanopartikel Träger von mindestens einem Wirkstoff sind. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung werden unter Wirkstoffen solche Stoffe verstanden, die eine Wirkung auf die zu kultivierenden Zellen ausüben. Bevorzugt sind als derartige Wirkstoffe solche Stoffe, die an der Regulation von Wachstums- und Differenzierungsprozessen der zu kulti- vierenden Zellen beteiligt sind, insbesondere kontrollieren, regulieren, determinieren, initiieren oder finalisieren diese Wirkstoffe Wachstums- und Differenzierungsprozesse. Derartige Wirkstoffe können auch an Migrations-, Invasions-, Redifferenzierungs- oder Teilungsvorgängen beteiligt sein. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind die Wirkstoffe solche, die in einer gewünschten und bestimmten besonderen Applikationskinetik den zu kultivierenden Zellen zugeführt werden sollen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist es vorgesehen, dass das Zellkultursystem Nanopartikel enthält, die in der Gerüststruktur eingeschlossene und/oder auf ihrer Oberfläche aufgebrachte Wirkstoffe aufweisen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist vorgesehen, dass zum Einschluss von Wirkstoffen, bei- spielsweise Wachstumsfaktoren, die Wasser-in-ÖI-in-Wasser- Technik als bevorzugtes Verfahren zur Herstellung von wirkstoffbe- ladenen Nanopartikeln, insbesondere PLA- und PLGA-Partikeln, eingesetzt wird.
Weiterhin bevorzugt sieht die vorliegende Erfindung dabei ein ZeII- kultursystem vor, in dem die in die Nanopartikel eingeschlossenen Wirkstoffe Wachstumsfaktoren, Cytokine, Zelladhäsionsproteine wie Integrine, Farbstoffe wie Fluorescenamine, Chemokine, Vitamine, Mineralstoffe, Fette, Proteine, Nährstoffe, faserbildende Proteine, Kohlenhydrate, Adhäsionsproteine, Zellrezeptoren, Pharmazeutika, DNA, RNA, Aptamere, angiogene Faktoren, Lektine, Antikörper, Antikörperfragmente oder Inhibitoren sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist vorgesehen, dass das Zellkultursystem Nanopartikel enthält, die Stabilisatoren aufweisen. Bevorzugt stellen dabei die Stabilisatoren Kohlenhydrate, zum Beispiel Trehalose, Proteine, Polyethylenglycole oder Detergentien dar.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist es vorgesehen, dass das Zellkultursystem Nanopartikel enthält, die durch Kopplung mit funktionellen Gruppen funktionalisiert worden sind. In besonders bevorzugter Ausführungsform ist vorgesehen, dass die Nanopartikel selbst funktionelle Gruppen auf ihrer Oberfläche aufweisen.
Die vorliegende Erfindung sieht insbesondere vor, dass auf der Oberfläche der Nanopartikel eine erste funktionelle Gruppe 1A aufgebracht ist, die mit einer komplementären Gruppe 2A eines zu immobilisierenden Wirkstoffs eine affine, bevorzugt kovalente Bindung eingehen kann.
Erfindungsgemäß ist vorgesehen, dass die erste funktionelle Gruppe 1A ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Aminogruppe, Carboxygruppe, Epoxygruppe, Maleinimidogruppe, Alkylketongrup- pe, Aldehydgruppe, Hydrazingruppe, Hydrazidgruppe, Thiolgruppe und Thioestergruppe.
Erfindungsgemäß ist vorgesehen, dass die funktionelle Gruppe 2A des Wirkstoffs ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Aminogruppe, Carboxygruppe, Epoxygruppe, Maleinimidogruppe, Alkyl- ketongruppe, Aldehydgruppe, Hydrazingruppe, Hydrazidgruppe, Thiolgruppe und Thioestergruppe. Ein erfindungsgemäßer Nanopartikel weist also auf seiner Oberfläche eine erste funktionelle Gruppe 1A auf, die kovalent mit einer funktionellen Gruppe 2A des zu immobilisierenden Wirkstoffs verknüpft ist, wobei die funktionelle Oberflächen-Gruppe 1A eine andere Gruppe als die funktionelle Protein- gruppe 2A ist. Die beiden miteinander in Bindung tretenden Gruppen 1A und 2A müssen komplementär zueinander sein, das heißt in der Lage sein, eine kovalente Bindung miteinander einzugehen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass die Oberfläche des erfindungsgemäßen Nanopar- tikels funktionelle Gruppen 1B und ein zu immoblisierender Wirkstoff die funktionellen Gruppen 1 B bindende komplementäre Gruppen 2B aufweist, wobei die funktionellen Gruppen 1 B und 2B erfindungsgemäß insbesondere eine nicht-kovalente Bindung eingehen können.
In bevorzugter Ausführungsform der Erfindung ist die zweite funktionelle Gruppe 1B der Oberfläche des Nanopartikels ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Oligohistidingruppe, Strep-Tag I, Strep- Tag II, Desthiobiotin, Biotin, Chitin, Chitinderivate, Chitinbindedomäne, Metallionenchelatkomplex, Streptavidin, Streptactin, Avidin und Neutravidin.
Erfindungsgemäß ist die funktionelle Gruppe 2B eines zu immobilisierenden Wirkstoffs ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Oligohistidingruppe, Strep-Tag I, Strep-Tag Ii, Desthiobiotin, Biotin, Chitin, Chitinderivate, Chitinbindedomäne, Metallionenchelatkomplex, Streptavidin, Streptactin, Avidin und Neutravidin. Ein erfindungsgemäßer Nanopartikel weist also in seiner Oberfläche eine funktionelle Gruppe 1 B auf, die nicht-kovalent mit einer funktionellen Gruppe 2B eines Moleküls verknüpft ist, wobei die funktionelle Oberflächengruppe 1 B des Nanopartikels eine andere Gruppe als die funktionelle Molekülgruppe 2B ist. Die beiden miteinander in nicht-kovalente Bindung tretenden Gruppen müssen komplementär zueinander sein, das heißt in der Lage sein, eine nicht-kovalente Bindung miteinander einzugehen. Selbstverständlich kann auch vorgesehen sein, dass die Oberfläche des erfindungsgemäßen Nanopartikels und die zu immobilisierenden Wirkstoffe gegebenenfalls sowohl funktionelle Gruppen 1A und 1 B sowie 2A und 2B aufweisen.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist vorgesehen, dass die dreidimensionale Gerüststruktur eine oder mehrere der folgenden Komponenten enthält, nämlich faserbildende Proteine wie Kollagene, elastische Fasern bildende Fibrilline und/oder Elastine, Kohlenhydrate wie Glucosaminglykane, langkettige Polysaccharide, insbesondere Hyaluronsäure, Heparan- sulfat, Dermatansulfat, Chondroitinsulfat und Keratansulfat, Adhäsionsproteine, zum Beispiel Adapterproteine oder andere adhäsive Proteine, zum Beispiel Laminine, Vitronektin und Fibronektin, Bestandteile der Basalmembran wie Laminine, Entaktin und Proteogly- cane sowie Zellrezeptoren für ECM-Komponenten wie Zellmembranproteine.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist vorgesehen, dass die dreidimensionale Gerüststruktur Komponenten der extrazellulären Matrix enthält oder aus diesen besteht, ausge- wählt aus der Gruppe bestehend aus Laminine, Glycosaminoglykane (GAG), Proteoglykane, Elastin, Kollagene vom Typ I, II, III und IV, Entaktin (Nidogen), Vitronektin, Hyaluronsäure, Heparansulfat, Dermatansulfat, Chondroitinsulfat, Keratansulfat, Perlecan, Adhäsionsproteine und Fibronektin. In bevorzugter Ausführungsform der vor- gehenden Erfindung kann die Gerüststruktur aus einer Gerüstgrundstruktur, zum Beispiel Kollagen, insbesondere Kollagenfasern, aufgebaut sein, wobei diese Gerüstgrundstruktur in vorteilhafter und optionaler Weise mit weiteren aus der vorgenannten Gruppe der die Gerüststruktur bildenden Komponenten ausgestaltet ist. So kann die Gerüstgrundstruktur, insbesondere die Kollagengerüststruktur, beispielsweise zusätzlich mit Komponenten ausgestattet sein, die Zelleigenschaften wie Adhäsion und Proliferation begünstigen, zum Beispiel Ankerproteine und/oder Kohlenhydrate.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Zellkultursystems liegt die Gerüststruktur, insbesondere aus Kollagen, in Faserform und/oder in Netzform vor.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, dass die Gerüststruktur, insbesondere aus Kollagen, in dreidimensional netzartig verzweigter Form vorliegt. Die Gerüststruktur kann in bevorzugter Ausführung in hydrogelartiger oder schwammartiger Form vorliegen.
Bevorzugt stellt die dreidimensionale biokompatible Gerüststruktur in dem erfindungsgemäßen Zellkultursystem eine extrazelluläre Matrix dar.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, dass die Konzentration von Wirkstoffen im Nanopartikel in einem Bereich von 1 ng/ml bis 10 μg/ml liegt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist es vorgesehen, dass das Zellkultursystem Nanopartikel enthält, die in dem Zellkultursystem integral in der Gerüststruktur verteilt vorliegen. Die Nanopartikel können in bevorzugter Ausführung homogen in der Gerüststruktur verteilt vorliegen. Es kann in bevorzugter Ausführung aber auch eine heterogene, ungleichmäßige Verteilung der Nanopartikel vorliegen. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform liegen die Nanopartikel in Form mindestens einer Schicht ober- und/oder unterhalb der Gerüststruktur vor. In einer wei- teren bevorzugten Ausführungsform liegen die Nanopartikel in Form mindestens einer Schicht oberhalb der Gerüststruktur vor.
Bevorzugt sind die Nanopartikel in dem erfindungsgemäßen Zellkultursystem in mehreren Schichten unterhalb der Gerüststruktur ange- ordnet.
Bevorzugt sind die Nanopartikel in dem erfindungsgemäßen Zellkultursystem in mehreren Schichten oberhalb der Gerüststruktur angeordnet.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der mittlere Durchmesser der Nanopartikel stets kleiner oder gleich wie die mittlere Dicke der Gerüststruktur. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist der mittlere Durchmesser aller Nanopartikel stets kleiner als die mittlere Dicke der Gerüststruktur. In einer bevorzugten Ausführungsform liegen bevorzugt alle Nanopartikel, bevor- zugt überwiegend oder vollständig, in der Gerüststruktur eingebettet vor. Bevorzugt beträgt das Verhältnis der Abmessungen von Nanopartikel zur Dicke der Gerüststruktur 1 :1 oder weniger, bevorzugt 1 :10 oder weniger, weiter bevorzugt 1 :100 oder weniger, weiter bevorzugt 1 :1000 oder weniger.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist vorgesehen, dass die Nanopartikel in dem erfindungsgemäßen Zellkultursystem in Form eines Gradienten innerhalb der Gerüststruktur vorliegen.
In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass der bevor- zugt vorgesehene Wirkstoff in dem erfindungsgemäßen Zellkultursystem in Form eines Gradienten innerhalb der Gerüststruktur vorliegt. Im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung kann der Begriff „Gradient" also die Ausbildung verschiedener Konzentrationen an Nanopartikeln und/oder Wirkstoff innerhalb des erfindungsgemäßen Zellkultursystems, insbesondere der Gerüststruktur, bedeuten, ins- besondere eine räumlich abgestufte, an- oder absteigende Konzentration an Nanopartikeln und/oder Wirkstoffen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Wirkstoff-Gradient ausgebildet durch die Verwendung von Nanopartikeln, die unterschiedliche Konzentrationen an einem Wirk- stoff aufweisen. Der Wirkstoff kann in dieser bevorzugten Ausführungsform in den Nanopartikeln in unterschiedlicher Konzentration eingeschlossen oder aufgebracht sein. Weiterhin kann der Wirkstoff auch in unterschiedlicher Konzentration durch Bindung über funktionelle Gruppen auf den Nanopartikeln aufgebracht sein. Je nach An- Ordnung dieser Nanopartikel mit unterschiedlicher Konzentration innerhalb der Gerüststruktur, z.B. eine homogene Verteilung, wird dadurch eine ansteigende Konzentration oder ein Konzentrationsgefälle des Wirkstoffs in dem Zellkultursystem erreicht. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist also vorgese- hen, dass ein Wirkstoffgradient dadurch ausgebildet ist, dass Nanopartikel homogen verteilt innerhalb der Gerüststruktur vorliegen, wobei die Nanopartikel verschiedene Wirkstoffkonzentrationen aufweisen und so angeordnet sind, dass ein Wirkstoffgradient gebildet wird. Es ist in bevorzugter Ausführungsform auch vorgesehen, Na- nopartikel mit unterschiedlichen Wirkstoffkonzentrationen in räumlich ungleichmäßiger Form, also heterogen, in der Gerüststruktur zu verteilen, insbesondere derartige Nanopartikel in Form eines Nanoparti- kelgradienten in die Gerüststruktur einzubringen. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist vorgesehen, dass der Wirkstoff-Gradient in dem Zellkultursystem durch Ausbildung eines Nanopartikelgradienten ausgebildet wird, nämlich indem Nanopartikel, in denen eine bestimmte und in den verwendeten Nanopartikeln gleiche Konzentration eines Wirkstoffs eingeschlossen oder an deren Oberfläche aufgebracht ist, räumlich heterogen, das heißt unterschiedlich verteilt in der Gerüststruktur, vorliegen. So führt eine geringere Anzahl dieser Nanopartikel in zum Beispiel einem oberen Bereich der Gerüststruktur, gefolgt von einer höheren Anzahl dieser Nanopartikel in einem darunter liegenden Bereich der Gerüststruktur zu einem Konzentrationsanstieg innerhalb der Gerüststruktur nach unten hin. Umgekehrt führt eine höhere Anzahl dieser Nanopartikel in einem oberen Bereich der Gerüststruktur und eine geringere Anzahl dieser Nanopartikel in einem darunter liegenden Bereich der Gerüststruktur zu einer Konzentrationsabnahme innerhalb der Gerüststruktur nach unten hin.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist es vorgesehen, dass in dem Zellkultursystem eine kontrollierte und verzögerte Wirkstofffreisetzung stattfindet, insbesonde- re durch die Verwendung bioabbaubarer Nanopartikel. Die erfindungsgemäß bevorzugte kontrollierte Freisetzung von Wirkstoffen kann zusätzlich oder alternativ auch durch Diffusion aus den Nanopartikeln in das umgebende Zellkultursystem, insbesondere in die faser- oder netzartige Gerüststruktur, gewährleistet sein.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist vorgesehen, dass die Nanopartikel mit der Gerüststruktur verbunden sind. In bevorzugter Ausführung ist die Bindung so ausgeführt, dass ein Kulturmediumwechsel nicht zum Ablösen der Nanopartikel von der Gerüststruktur führt. In bevorzugter Ausführung ist die Bindung waschstabil, d.h. die Nanopartikel werden auch bei Wechsel des Kulturmediums und gegebenenfalls erfolgenden Waschschritten mit üblichen Waschmedien, wie Puffern, nicht von der Gerüststruktur abgelöst.
Bevorzugt ist vorgesehen, dass die Nanopartikel über elektrostatische Wechselwirkungen mit der Gerüststruktur verbunden sind, insbesondere durch ionische Bindung.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist vorgesehen, dass die Nanopartikel durch UV- Crosslinking mit der Gerüststruktur verbunden sind.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist vorgesehen, dass das Zellkultursystem zur Durchführung von Migrationsversuchen, insbesondere Migrationsversuche in vivo, eingesetzt wird.
Darüber hinaus betrifft die Erfindung auch ein Verfahren zur Herstellung eines Zellkultursystems, umfassend eine dreidimensionale biokompatible Gerüststruktur und biokompatible Nanopartikel, wobei die Gerüststruktur mit den Nanopartikeln, z.B. gemäß einer der folgenden Verfahren, in Kontakt gebracht wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Lehre ist es vorgesehen, dass das Zellkultursystem durch ein „kontaktloses Printverfahren" hergestellt wird.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet der Begriff „kontaktloses Printverfahren" ein Verfahren, in dem Nanopar- tikel ohne Kontakt mit der Oberfläche auf das Substrat übertragen werden. Es existieren unterschiedliche Möglichkeiten, um dies zu erreichen. In einer ersten bevorzugten Ausführungsform ist ein so- genanntes Drop on demand mittels Ink Jet-Verfahren vorgesehen. In einer zweiten Ausführungsform ist ein Verfahren mittels Druckkopf oder einzelner Nadeln vorgesehen. In beiden Ausführungsformen werden ein oder mehrere Tropfen einer Suspension auf die ge- wünschte Stelle übertragen. Bevorzugt werden käufliche Maschinen der Firma Dimatix - FujiFilm- für Ink Jet-Verfahren verwendet. Weiterhin bevorzugt sind auch Maschinen der Firmen microdrop techno- logies, MicroFab TECHNOLOGIES, Scienion AG und GeSIM mbH, welche einzelne Nadeln besitzen und über einen Computer zur Ab- gäbe von Tropfen punktgenau gesteuert werden können. Im Zusammenhang mit dem vorliegenden Verfahren bedeutet „punktgenau", dass eine Positionierungsgenauigkeit bei allen Verfahren von unter +/- 25 μm angegeben wird. Im Rahmen der Positionierungsgenauigkeit ist auch das Tropfenvolumen zu berücksichtigen. Dieses kann mit mindestens 1 pL bei dem Gerät Dimatix DMC-11601 und mit mindestens 100 pL bei dem Gerät Nano-Plotter NP1.2 von Ge- SIM eingestellt werden. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist bevorzugt vorgesehen, dass die Abgabe der Nanopartikelsuspension über ein pneumatisches Verfahren, Vakuum-Verfahren oder über ein piezoelektrisches Verfahren erfolgt. Insbesondere ist bevorzugt vorgesehen, dass die Eindringtiefe der Nanopartikel in das Substrat, insbesondere in die Gerüststruktur des Zellkultursystems, durch das Tropfenvolumen oder die Tropfgeschwindigkeit in den jeweiligen Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens gesteuert wird. Das kontaktlose Printverfahren führt vorzugsweise zu einem schichtartigen Aufbringen der Nanopartikel innerhalb der Gerüststruktur.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden
Anmeldung ist ein Zellkultursystem vorgesehen, das durch Impräg- nieren hergestellt wird, insbesondere, indem eine Gerüststruktur mit einer Nanopartikel-haltigen Suspension durchsetzt wird, zum Beispiel durch Tränken mit einer Nanopartikel-haltigen Suspension.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Zellkultursystem vorgesehen, das durch ein Laser Induced Forward Transfer - LIFT-Verfahren hergestellt wird. Hierzu ist insbesondere vorgesehen, dass zu transportierendes Material, insbesondere einen oder mehrere Bestandteile der extrazellulären Matrix, durch Laserenergie ausgeschnitten und auf ein Zielmaterial aufgebracht wird.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sieht vor, dass das Zellkultursystem durch Elektrospinning (Spincoating) hergestellt wird. Durch Elektrospinning können vorzugsweise polymere Strukturen mit vorzugsweise einem Faserdurchmesser von bevorzugt 2 bis 20 μm, welche der natürlichen Umgebung der Zellen, nämlich der extrazellulären Matrix, sehr ähnlich sind, hergestellt werden.
Die Erfindung betrifft also Verfahren zur Herstellung eines Zellkultursystems, wobei in besonders bevorzugter Ausführungsform vorgesehen ist, die biokompatiblen Nanopartikel beispielsweise im Wege der Lösungsmittelverdunstung der Spontanoues Emulsifaction Solvent Diffusion (SESD)-Methode, der Aussalzung, der Sprühtrocknung oder der Phasenseparation herzustellen.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, die eingesetzten Nanopartikel im Wege der Lösungsmittelverduns- tung, insbesondere der Wasser-in-ÖI-in-Wasser-Technik, herzustellen. Gemäß dieses Verfahrens ist es erfindungsgemäß besonders bevorzugt möglich, auch die verschiedensten hydrophilen Wirkstoffe in die Nanopartikel einzuarbeiten. Der im Wasser befindliche Wirk- Stoff wird dabei in einer polymerhaltigen ölphase emulgiert. Diese Mischung wird in einer weiteren Wasserphase emulgiert und das organische Lösungsmittel beispielsweise durch Reduzieren des Drucks entfernt. Gemäß einer weiteren Ausführungsform ist es auch möglich, eine Öl/Wasseremulsion (O/W) einzusetzen, insbesondere um hydrophobe Wirkstoffe einzuarbeiten. In dieser Ausführungsform wirkt die ölphase gleichermaßen als Lösungsmittel für das Polymer wie als Wirkstoff.
In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, die erfindungs- gemäßen Nanopartikel insbesondere durch die auf Lösungsmittelverdunstung basierende Spontanoues Emulification Sovent Diffsion SESD-Methode herzustellen. Hierzu ist vorgesehen sowohl das Polymer als auch den Wirkstoff in einer organischen Mischung, bevorzugt in Dichlormethan und Aceton, zu lösen und diese Lösung in ei- ne wässrige Phase mit Stabilisator zu überführen und durch Rühren zu emulgieren. Insbesondere ist dabei vorgesehen, dass das hydrophile Lösungsmittel, bevorzugt Aceton, in die umgebende Wasserphase diffundiert und die erfindungsgemäßen Nanopartikel durch Rühren unter reduziertem Druck entstehen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, dass die Partikelgröße durch eine Erhöhung des Anteils an in Wasser mischbaren Lösungsmittel verringert wird.
In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, die erfindungsgemäßen Nanopartikel insbesondere durch Aussalzung herzustellen. Insbesondere ist vorgesehen, bei dieser Herstellung auf die Verwendung von Lösungsmitteln zu verzichten. Zur Herstellung wird das Polymer, bevorzugt PVA, zu einer gesättigten Lösung, insbesondere von Magnesiumchlorid oder Magnesiumacetat, gegeben, um so ein viskoses Gel als wässrige Phase zu erhalten. Weiterhin ist insbe- sondere vorgesehen, ein bioabbaubares Polymer mit einem Wirkstoff bevorzugt in Aceton als organische Phase zu lösen. Durch Mischen von wässriger und organischer Phase ist vorgesehen, dass die organische Phase im entstehenden Zwei-Phasen-System durch Rühren im Gel emulgiert wird. Bevorzugt ist vorgesehen, dass die erfindungsgemäßen Nanopartikel durch Zugabe von ausreichend Wasser und nach Diffusion von vorzugsweise Aceton in die wässrige Phase ausfallen.
In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, die erfindungs- gemäßen Nanopartikel insbesondere durch Sprühtrocknung herzustellen. Bevorzugt ist vorgesehen, dass durch Zerstäuben bzw. Ato- misieren von Lösungen und Emulsionen, in denen bioabbaubare Polymere und Wirkstoffe gelöst sind, insbesondere unter Zuhilfenahme einer Zweistoffdüse in einem heißen Luftstrom erfindungs- gemäße Nanopartikel hergestellt werden.
In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, die erfindungsgemäßen Nanopartikel insbesondere durch Phasenseparation - Ko- azervation - hergestellt werden. Dazu ist insbesondere vorgesehen, bioabbaubaren Polymere in bevorzugt Dichlormethan zu lösen und einen Wirkstoff darin zu dispergieren bzw. zu emulgieren. Weiterhin ist vorgesehen, dass unter Rühren schrittweise bevorzugt Silikon-Öl, das sich nicht mit der organischen Polymerphase vermischt, zugegeben wird und sich eine Phasentrennung vollzieht. Diese Mischung wird unter Zugabe von bevorzugt Heptan weitergerührt, wobei erfin- dungsgemäße Nanopartikel gewonnen werden können.
Bevorzugt betrifft das Verfahren zur Herstellung eines Zellkultursystems gemäß der vorliegenden Erfindung ein Zellkultursystem, das durch kontaktloses Printverfahren hergestellt wird. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Zellkultursystems, das durch Imprägnieren hergestellt wird.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorlie- gende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Zellkultursystems, das durch ein LIFT-Verfahren hergestellt wird.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Zellkultursystems, in dem das Zellkultursystem durch Elektrospinning (Spincoa- ting) hergestellt wird.
Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Kultivierung von Zellen, indem die Zellen in ein ein Zellkultursystem der vorliegenden Erfindung und ein geeignetes Nährmedium enthaltendes Zellkulturgefäß eingebracht werden und dort unter ge- eigneten Bedingungen, die eine Kultivierung ermöglichen, kultiviert werden.
Bevorzugt sind die kultivierten Zellen eukaryotische Zellen, insbesondere humanen oder tierischen Ursprungs. Weiter bevorzugt sind die kultivierten Zellen primäre Zellen.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist vorgesehen, dass die zu kultivierende Zelle eine Tumorzelle ist, insbesondere eine Tumorzelllinie wie MCF-7, HeLa, HepG2, PC3, CT- 26, A125, A549, MRC-5, CHO, MelJuso28, Nalmθ oder Jurkat.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist vorgesehen, dass die zu kultivierende Zelle eine adhärente Zelle, insbesondere ein etablierte Zelllinie wie HUVEC oder HaCaT ist. In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft diese ein Verfahren zur Kultivierung von Zellen mittels des erfindungsgemäßen Zellkultursystems, wobei die zu kultivierende Zelle eine ausdifferenzierte Zelle ist.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren, insbesondere ein nichttherapeutisches Verfahren, zur Herstellung differenzierter Zellen o- der Zellverbände aus undifferenzierten Zellen, wobei die undifferenzierten Zellen in dem erfindungsgemäßen Zellkulturverfahren kulti- viert und dadurch differenzierte Zellen oder Zellverbände gewonnen werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren, insbesondere ein nichttherapeutisches Verfahren, zur Aufrechterhaltung des Differenzie- rungsstadiums prädifferenzierter oder differenzierter Zellen, wobei die prädifferenzierten oder differenzierten Zellen in dem erfindungsgemäßen Zellkulturverfahren kultiviert werden. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein vorgenanntes, vorzugsweise nicht-therapeutisches Verfahren, wobei undifferenzierte Zellen in dem erfindungsgemäßen Zellkulturverfahren kultiviert und in diesem undifferenzierten Zustand gehalten werden.
Bevorzugt ist vorgesehen, dass die Zellverbände Transplantate oder Testsysteme darstellen.
Weiterhin bevorzugt ist vorgesehen, dass die Zellverbände auch Organe, Organteile, insbesondere eine Trachea oder Teile davon sein können. Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung differenzierte Zellen und Zellverbände, die nach erfindungsgemäßer Kultivierung von differenzierten oder undifferenzierten Zellen oder Zellverbänden gewonnen werden, zum Beispiel Transplantate, Testsysteme, Organe, Organ- teile, insbesondere eine Trachea, oder Teile davon.
Die vorliegende Erfindung, insbesondere das vorliegende Zellkulturverfahren, ermöglicht die Langzeitkultivierung von Stamm- und Vorläuferzellen, die für vielfältige Einsatzgebiete verwendet werden können, beispielsweise für Transplantate und Testsysteme, aber auch in der Grundlagenforschung.
Die vorliegende Erfindung, insbesondere das vorliegende Zellkulturverfahren, ermöglicht die Proliferation funktioneller Zellen, insbesondere von primären Zellen.
Die vorliegende Erfindung, insbesondere das vorliegende Zellkultur- verfahren, ermöglicht die gerichtete Differenzierung zu funktionellen Zellen und Geweben, beispielsweise bei der Transplantatherstellung oder auch für Testsysteme bei der Medikamentenentwicklung.
Die vorliegende Erfindung, insbesondere das vorliegende Zellkulturverfahren, ermöglicht die Herstellung von Transplantaten zur Heilung chronischer/diabetischer Wunden, beispielsweise mittels Zellmigration induziert durch Nanopartikel.
Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Herstellung von Expressionsprodukten einer Zelle, wobei die Zelle gemäß des erfindungsgemäßen Zellkulturverfahrens kultiviert werden und das Expressionsprodukt aus dieser Zellkultur gewonnen wird. Die vorliegende Erfindung betrifft auch Expressionsprodukte einer Zelle, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren kultiviert wird und deren Expressionsprodukte gewonnen werden.
Weitere Ausführungsformen ergeben sich aus den Unteransprüchen.
Ausführunqsbeispiele
Die vorliegende Erfindung wird anhand der nachstehenden Beispiele und Figuren näher erläutert. Die Beispiele sind nicht beschränkend zu verstehen.
Figur 1 zeigt eine REM-Aufnahme von bioabbaubaren Nanopartikeln
Figur 2 zeigt das Freisetzungsergebnis der mit 8% BSA beladenen PLGA-Partikel aus Beispiel 1.
Figur 3 zeigt Zellen auf einem mit PAH + Carboxy-Nanopartikel beschichteten Objektträger am Tag 1; A) gibt Versuch 1 , B) Versuch 2 wieder.
Figur 4 zeigt Zellen, die zur Kontrolle in einer Zellkulturflasche kultivierte wurden, aus Versuch 2; A) am Tag 1 und B) am Tag 3.
Figur 5 zeigt Zellen, die auf Oberflächen mit Nanopartikeln mit Ami- nofunktionalisierung sowie anschließende Beschichtung mit Carbo- xy-Nanopartikeln mit planarer und globulärer Oberfläche kultiviert wurden; A) PAA, Tag 1 , Versuch 1 , B) PAH+Carboxy-Nanopartikel, Tag 1 , Versuch 1 , C) PAA, Tag 3, Versuch 2 D), PAH+Carboxy- Nanopartikel, Tag 3, Versuch 2
Figur 6 zeigt Zellen, die auf Oberflächen mit Nanopartikeln mit Ami- nofunktionalisierung sowie anschließende Beschichtung mit Carbo- xy-Nanopartikeln mit planarer und globulärer Oberfläche kultiviert wurden; A) PAH, Tag 1 , Ansatz 3, B) PAA+Amino-Nanopartikel, Tag 1 , Ansatz 3, C) PAH, Tag 3, Ansatz 2, D) PAA+Amino-Nanopartikel, Tag 3, Ansatz 2 Abkürzungen:
PLGA= Poly(Lactid-co-glycolid) PLA= Polylactid PCL= Polycaprolacton PGA = Polyglycolid PAA = Polyacrylsäure PAH = Polyallylamin-hydrochlorid EGF = Epidermal Growth Factor BMP= Bone Morphogenic Protein SESD = Spontaneous emulsification solvent diffusion method MES = Morpholinoethansulfonsäure
Beispiel 1:
Herstellung von BSA-beladenen bioabbaubaren Nanopartikeln aus PLGA mittels Wasser-in-ÖI-in-Wasser-Technik (W/O/W) Zuerst werden 120 mg Poly(Lactid-co-Glycolid) in 3,1 mL Dichlor- methan gelöst (O-Phase). In dieser Phase wird eine wässrige Lösung des zu verkapselnden Proteins (Bovin Serum Albumin, BSA) mittels Ultraschallbehandlung emulgiert (W/O), dazu wurden 10 mg BSA in 100 μL PBS-Puffer pH 7,4 gelöst. Zum Schutz des Wirkstoffes können unterschiedliche Stabilisatoren, wie Zucker, Proteine, Polyethylenglycole und andere Detergentien, in die wässrige Lösung eingebaut werden. Die hergestellte W/O-Phase wird in einer weite- ren Wasserphase (100 mL Wasser + 500 mg Polyvinylalkohol) mittels Ultraschall dispergiert, so dass eine W/O/W-Emulsion entsteht. Das organische Lösemittel der polymerhaltigen O-Phase wird durch Verdampfung entfernt und dadurch das Polymer als Nanopartikel ausgefällt. Die Größe der Partikel beträgt ca. 150 bis 350 nm. Der Einschluss an Wirkstoff liegt dabei bei 5-8 Gew.-%. Durch Einsatz einer größeren Menge an Wirkstoff kann auch eine höhere Beladung erzielt werden.
Beispiel 2:
Herstellung von mit BMP-2 beladenen bioabbaubaren Nanopartikeln aus PLA mittels W/OΛ/V-Technik
10 mg Polylactid werden in 300 μl_ Dichlormethan gelöst. Zu dieser Phase werden 10 μL einer wässrigen Lösung des BMP-2 (bone morphogenic protein-2, c=200 mg/mL) mit 0,05% Lutrol F 68 zugegeben und darin mittels Ultraschall emulgiert.
Diese W1/O-Phase wird in einer zweiten wässrigen Phase (10 mL einer 0,5%igen PVA-Lösung) mittels Ultraschall dispergiert. Die Entfernung des Dichlormethan/Aceton-Gemischs der W1/0/W2- Emulsion erfolgt durch Verdampfung am Vakuum. Dabei fallen Na- nopartikel mit einer Größe von 100-250 nm aus. Die Wirkstoffbeladung beträgt ca. 10-15 Gew.-% (Abb. 1).
Beispiel 3:
Herstellung von BSA-beladenen PLA-Nanopartikeln mittels W/O/W-
Methode
Zuerst werden 120 mg Polylactid in 3,1 mL Dichlormethan/Aceton
(8/2) gelöst (O-Phase). In dieser Phase wird eine wässrige Lösung des zu verkapselnden Proteins (Bovin Serum Albumin, BSA) mittels Ultraschallbehandlung emulgiert (W/O), dazu wurden 10 mg BSA in 100 μL Wasser gelöst. Die hergestellte W/O-Phase wird in einer weiteren Wasserphase (100 mL Wasser mit 0,5% Polyvinylalkohol) mittels Ultraschall dispergiert und eine W/O/W-Emulsion entsteht. Das organische Lösemittel der polymerhaltigen O-Phase wird durch Verdampfung entfernt und dadurch das Polymer als Nanopartikel ausge- fällt. Die Größe der Partikel beträgt ca. 150 bis 300 nm. Der Ein- schluss an Wirkstoff liegt dabei bei 7-8 Gew.-%.
Bestimmung der Freisetzungskinetik 50 mg der mit BSA-beladenen Poly(Lactid-co-Glycolid)-Partikel (Re- somer® 502 H) werden in 5 ml_ PBS-Puffer (pH 7,4) suspendiert und bei 37°C im Ölbad gerührt. Es werden pro Probenzug jeweils 300 μl_ entnommen und zentrifugiert. Das Pellet wurde erneut in PBS-Puffer suspendiert und dem Experiment zurückgeführt. Die quantitative Bestimmung des aus den Partikeln frei werdenden Wirkstoffs erfolgt mittels verschiedener Methoden, wie HPLC, verschiedenen Protein-Assays (Lowry- oder BCA-Assay), Elektro- nenspinresonanz (ESR) usw. (Abb. 2).
Beispiel 4:
Kopplung von Farbstoffen und Proteinen an die Nanopartikel-
Oberfläche
10 mg der hergestellten bioabbaubaren PLGA-Nanopartikel (aus Beispiel 1) werden in 0,4 mL 0,1 M MES-Puffer suspendiert. Hierzu werden 300 μl_ einer Lösung aus Fluoresceinamin (3 mg/mL) gegeben. Es können jedoch auch Proteine wie z.B. Integrine an die Partikeloberfläche gebunden werden. Tropfenweise wird 160 μL EDC- Lösung (c=110 mg/mL) zugegeben und bei Raumtemperatur über Nacht geschüttelt. Die Suspension wird zentrifugiert und das Pellet in Puffer gewaschen. Es konnte eine Anbindung von 3 μmol Fluoresceinamin pro g Partikel erzielt werden. Beispiel 5:
Herstellung von oberflächenmodifizierten Silica-Nanopartikeln für das im Anschluss ausgeführte Beispiel mit Zellen
Synthese von Silica-Partikeln:
Zu 200 ml Ethanol werden 12 mmol Tetraethoxysilan und 90 mmol NH3 gegeben. Dann wird 24 h bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend werden die Partikel durch mehrfache Zentrifugation ge- reinigt. Es resultieren 650 mg Silica-Partikel mit einer mittleren Partikelgröße von 125 nm.
Aminofunktionalisierung von Silica-Partikeln:
Eine 1 Gew.-% wässrige Suspension der Silica-Partikel wird mit 10 Vol.-% 25% Ammoniak versetzt. Dann werden 20 Gew.-% Ami- nopropyltriethoxysilan, bezogen auf die Partikel, zugegeben und es wird 1h bei Raumtemperatur gerührt. Die Partikel werden durch mehrfache Zentrifugation gereinigt und tragen funktionelle Ami- nogruppen auf ihrer Oberfläche (Zeta-Potenzial in 0,1 M Acetat- Puffer: + 35 mV).
Carboxyfunktionalisierung von Silica-Partikeln: 10 ml einer 2 Gew.-% Suspension aminofunktionalisierter Nanoparti- kel werden in Tetrahydrofuran aufgenommen. Dazu werden 260 mg Bernsteinsäureanhydrid gegeben. Nach einer 5-minütigen Behandlung mit Ultraschall wird 1h bei Raumtemperatur gerührt. Die Partikel werden durch mehrfache Zentrifugation gereinigt und tragen funktionelle Carboxygruppen auf ihrer Oberfläche (Zeta-Potenzial in 0,1 M Acetat-Puffer: - 35 mV). Die mittlere Partikelgröße beträgt 170 nm. Beispiel 6:
Optimierte Zellkulturbedingungen durch Nanopartikel-modifizierte Oberflächen
Es werden vergleichende Untersuchungen zur Adhäsion, Proliferation, Migration und Differenzierung primärer epidermaler Zellen an den modifizierten Oberflächen durchgeführt. Die modifizierten Oberflächen umfassen neben den Nanopartikeln auch eine faserartige Gerüststruktur. In dieser faserartigen Gerüststruktur liegen die inokulierten Nanopartikel mit einem Abstand von 10 bis 1000 nm vor.
Zur Oberflächenmodifikation werden Ojektträger (OT) zunächst mit einer 2% (v/v) Hellmanex Il Lösung in einem Wasserbad bei 400C gereinigt. Eine anschließende Hydroxylierung der Oberflächen erfolgt bei 700C in einer 3:1 (v/v) NH3 (30%) und H2O2 (25%)-Lösung, um eine negative Ladung zu erzeugen. Vor oder nach der Hydroxylierung erfolgt eine Beschichtung mit beispielsweise einer Kollagenlösung, zum Beispiel Kollagen Typ I1 in einer Konzentration von 0,1 bis 6 mg/ml, in an sich bekannter Weise.
Die Polyelektrolyt-Beschichtung der Oberflächen entsteht durch die sog. Layer-by-Layer-Technik. Bei der Methode werden die frisch gereinigten und negativ geladenen OT zuerst in eine kationische Po- ly(allylamin-hydrochlorid)-Lösung (PAH-Lösung) (0,01 M; bezogen auf das Monomer) oder Poly(diallyl-dimethyl-ammoniumchlorid)- Lösung (PDADMAC-Lösung) (0,02 M; bezogen auf das Monomer) gelegt und mindestens 20 min bei Raumtemperatur inkubiert. Für die anschließende Beschichtung mit den Carboxy-Nanopartikeln ist die Ausbildung von nur einer kationischen PE-Schicht ausreichend. Für die Beschichtung mit den Amino-Nanopartikel ist es notwendig, die OT nach PAH-Beschichung 20 min in einer anionischen Polyacryl- säure-Lösung (PAA-Lösung) (0,01 M; bezogen auf das Monomer) zu inkubieren. Die Anbindung der Silica-Nanopartikel erfolgt über elektrostatische Anziehungskräfte. Die Carboxy-Nanopartikel werden von dem kationischen Polyelektrolyt PAH und die Amino-Nanopartikel von dem anionischen Polyelektrolyt PAA angezogen. Anschließend erfolgt die Sterilisation der Oberflächen mit 70% Ethanol.
Die Ergebnisse sind für die unterschiedlichen Oberflächenmodifikati- onen ausführlich in Tabelle 1 dargestellt. Die Tabelle 1 zeigt Beobachtungen zu Morphologie humaner Keratinozyten auf den Carbo- xy- und Amino-Nanopartikel. Es wurden Versuche zu modifizierten Oberflächen mit Triplikaten mit jeweils n=3 Proben durchgeführt. Es wurde sowohl die Koloniedichte und damit die adhärente Zellzahl und Proliferation, als auch die Morphologie und damit der Differenzierungszustand der primären Zellen bewertet. Auf den modifizierten Oberflächen mit faserartiger Gerüststruktur findet eine deutlich schnellere Adhäsion und Ausspreizen (Abb. 3) der Keratinozyten im Gegensatz zur Kulturflasche (Abb. 4) statt. Besonders die mit Nano- Partikeln modifizierten Oberflächen induzieren ein schnelles Ausspreizen, die schon nach wenigen Stunden sichtbar ist.
Die Morphologie der primären epidermalen Zellen war auf diesen modifizierten Substraten vergleichbar mit der Zellkulturflasche. Des weiteren war eine schnellere Differenzierung der primären Zellen auf den aminofunktionalisierten Oberflächen (Abb. 6) zu sehen, wohingegen die Differenzierung der Keratinozyten auf den carboxyoberflä- chen, denen der Kontrollen entsprach (Abb. 5). Tabelle 1
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K= Koloniedichte: 0: keine Kolonien oder weniger als 5 Zellen pro Kolonie, +: Kolonien < 20 Zellen pro Kolonie, ++: Kolonien > 20 Zellen pro Kolonie, +++: Zellrasen M= Morphologie: -: Zellen in sehr später Differenzierungsphase oder tote, nicht adhärente Zellen, 0: differenzierte Zellen, ausgestreckte Form, das Cytoplasma ist im Vergleich zum Kern groß, +: Zellen in früher Differenzierungsphase, einige später differenzierte, ++: alle Zellen in früher Differenzierungsphase, kubische Gestalt, Verhältnis Cytoplasma/Kern ausgewogen * OT = Objektträger

Claims

Patentansprüche
1. Zellkultursystem, umfassend eine dreidimensionale biokompatible Gerüststruktur und biokompatible Nanopartikel.
2. Zellkultursystem nach Anspruch 1 , wobei die Nanopartikel mindestens einen Wirkstoff aufweisen.
3. Zellkultursystem nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Nanopartikel einen Durchmesser von 50 bis 1000 nm, vorzugsweise von 60 bis 600 nm aufweisen.
4. Zellkultursystem nach Anspruch 1 , 2 oder 3, wobei die Nano- partikel einen Durchmesser von 80 bis 150 nm, vorzugsweise von 50 bis 150 nm aufweisen.
5. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Nanopartikel aus anorganischen Polymeren, Gold, Edelmetallen, Metallen, Metalloxiden, Calciumphosphaten, Calcium- hydrogenphosphaten, Mischphosphaten, Siliziumbasierten oxidischen Materialen, wie Silicaten, Siliziumoxiden, Siliziumdioxid, aufgebaut sind.
6. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Nanopartikel aus organischen Polymeren aufgebaut sind.
7. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Nanopartikel aus bioabbaubaren Polymeren aufgebaut sind.
8. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Nanopartikel aus Polylactiden (PLA), Poly(lactid-co- glycolid)e (PLGA)1 Polycaprolactonen, Polyglycoliden (PCL), Di- und Tri-Block-Polymeren bspw. PCL/PGA-Di-Block-Systemen, Polyor- thoestern (POE), Polyanhydride, Polyhydroxyalkanoaten (PHA) oder Polypyrrolen (PPy), Polypropylencarbonat, Polyethylencarbonat, Po- lyalkylcyanonitril oder Polyethylenglycol aufgebaut sind.
9. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Nanopartikel eingeschlossene oder auf ihrer Oberfläche aufgebrachte Wirkstoffe aufweisen.
10. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Nanopartikel aus Polymeren mit unterschiedlichem Molekulargewicht und unterschiedlicher Polarität aufgebaut sind, die ein bestimmtes Freisetzungsprofil des in den Nanopartikel eingeschlos- senen Wirkstoffs gewährleisten.
11. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Nanopartikel durch ein Emulsionspolymerisationsverfahren hergestellt sind.
12. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Einschluss von Wirkstoffen in Nanopartikel durch Wasser- in-ÖI-in-Wasser-Technik erfolgt.
13. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Wirkstoffe Wachstumsfaktoren, Cytokine, Chemokine, Vitamine, Mineralstoffe, Fette, Proteine, Nährstoffe, faserbildende Pro- teine, Kohlenhydrate, Adhäsionsproteine, Integrine, Zellrezeptoren, Pharmazeutika, DNA, RNA, Aptamere, angiogene Faktoren, Lektine, Antikörper, Antikörperfragmente, Farbstoffe, Fluoresceinamine oder Inhibitoren sind.
14. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Nanopartikel Stabilisatoren aufweisen.
15. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Stabilisatoren Kohlenhydrate, Proteine, Polyethylenglycole oder Detergenzien sind.
16. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Nanopartikel durch Kopplung mit funktionellen Gruppen funktionalisiert sind.
17. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei auf der Oberfläche der Nanopartikel eine erste funktionelle Gruppe 1 A aufgebracht ist, die mit einer komplementären Gruppe 2A auf einem Wirkstoff eine affine Bindung, bevorzugt eine kovalente Bindung eingehen kann.
18. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die erste funktionelle Gruppe 1A auf der Oberfläche der Nanopartikel und die komplementäre Gruppe 2A eines Wirkstoffs ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Aminogruppe, Carbo- xygruppe, Epoxygruppe, Maleinimidogruppe, Alkylketongruppe, Aldehydgruppe, Hydrazingruppe, Hydrazidgruppe, Thiolgruppe und Thioestergruppe.
19. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei auf der Oberfläche der Nanopartikel eine zweite funktionelle Gruppe 1 B aufgebracht ist, die mit einer komplementären Gruppe 2B auf einem Wirkstoff eine affine Bindung, bevorzugt eine nicht- kovalente Bindung eingehen kann.
20. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die zweite funktionelle Gruppe 1 B auf der Oberfläche der Na- nopartikel und die komplementäre Gruppe 2B eines Wirkstoffs ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Oligohistidingruppe, Strep-Tag I, Strep-Tag II, Desthiobiotin, Biotin, Chitin, Chitinderivate, Chitinbindedomäne, Metallionenchelatkomplex, Streptavidin, Strep- tactin, Avidin und Neutravidin.
21. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die dreidimensionale Gerüststruktur ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Laminine, Glycosaminoglykane (GAG), Proteoglykane, Elastin, Kollagene vom Typ I bis IV, Entaktin (Nidogen), Vitronektin, Hyaluronsäure, Heparansulfat, Dermatansulfat, Chondroitinsulfat, Keratansulfat, Perlecan, Adhäsionsproteine und Fibronektin.
22. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Gerüststruktur in Faserform vorliegt.
23. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Gerüststruktur in dreidimensional hydrogelartiger oder schwammartiger Form vorliegt.
24. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die dreidimensionale biokompatible Gerüststruktur eine extrazelluläre Matrix ist.
25. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Nanopartikel in dem Zellkultursystem integral verteilt oder in Schichtform vorliegen.
26. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die in Schichtform vorliegenden Nanopartikel unterhalb der
Gerüststruktur angeordnet sind.
27. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Nanopartikel, insbesondere wirkstoffbeladene Nanopartikel, in Form eines Gradienten innerhalb der Gerüststruktur in auf- oder absteigender Menge verteilt vorliegen.
28. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei sich ein Wirkstoff-Gradient innerhalb der Gerüststruktur dadurch ausbildet, dass Nanopartikel mit jeweils gleicher Konzentration eines eingeschlossenen oder geträgerten Wirkstoffs innerhalb der Gerüststruktur in definierten Bereichen in unterschiedlicher Anzahl vorliegen.
29. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei sich ein Wirkstoff-Gradient innerhalb der Gerüststruktur dadurch ausbildet, dass Nanopartikel homogen in der Gerüststruktur verteilt vorliegen, die unterschiedliche Konzentrationen eines eingeschlossenen oder geträgerten Wirkstoffs aufweisen.
30. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei sich ein Wirkstoff-Gradient innerhalb der Gerüststruktur dadurch ausbildet, dass Nanopartikel mit unterschiedlichen Konzentra- tionen eines eingeschlossenen oder geträgerten Wirkstoffs innerhalb der Gerüststruktur in definierten Bereichen in unterschiedlicher Anzahl vorliegen.
31. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Zellkultursystem ein System mit kontrollierter, verzögerter Wirkstofffreisetzung ist.
32. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Nanopartikel mit der Gerüststruktur verbunden sind.
33. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei Nanopartikel durch elektrostatische Wechselwirkungen mit der Gerüststruktur verbunden sind.
34. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei Nanopartikel durch ionische Bindung mit der Gerüststruktur verbunden sind.
35. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei Nanopartikel durch UV-Crosslinking mit der Gerüststruktur verbunden sind.
36. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Zellkultursystem zur Durchführung von Migrationsversuchen, insbesondere von in vivo Migrationsversuchen eingesetzt wird.
37. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Zellkultursystem durch ein kontaktloses Printverfahren hergestellt wird.
38. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Zellkultursystem durch Imprägnieren hergestellt wird.
39. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Zellkultursystem durch ein LIFT-Verfahren hergestellt wird.
40. Zellkultursystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Zellkultursystem durch Elektro-spinning (Spincoating) hergestellt wird.
41. Verfahren zur Herstellung eines Zellkultursystems nach einem der Ansprüche 1 bis 40, wobei biokompatible Nanopartikel mit einer dreidimensionalen biokompatiblen Gerüststruktur in Kontakt ge- bracht werden.
42. Verfahren zur Herstellung eines Zellkultursystems nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Zellkultursystem durch ein kontaktloses Printverfahren hergestellt wird.
43. Verfahren zur Herstellung eines Zellkultursystems nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Zellkultursystem durch ein Imprägnieren einer dreidimensionalen Gerüststruktur mit Nano- partikeln hergestellt wird.
44. Verfahren zur Herstellung eines Zellkultursystems nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Zellkultursystem durch ein LIFT-Verfahren hergestellt wird.
45. Verfahren zur Herstellung eines Zellkultursystems nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Zellkultursystem durch Elektro-spinning (Spincoating) hergestellt wird.
46. Verfahren zur Kultivierung von Zellen, wobei Zellen in ein ein Zellkultursystem nach einem der Ansprüche 1 bis 45 enthaltendes Zellkulturgefäß eingebracht und dort in einem Zellkulturmedium unter geeigneten Bedingungen, die eine Kultivierung ermöglichen, kultiviert werden.
47. Verfahren nach Anspruch 46, wobei die Zellen primäre Zellen sind.
48. Verfahren nach einem Ansprüche 46 oder 47, wobei die primären Zellen embryonale Stammzellen sind, insbesondere aus dem Nabelschnurblut gewonnene omnipotente oder pluripotente Stammzellen.
49. Verfahren nach einem der Ansprüche 46 oder 47, wobei die primären Zellen adulte Stammzellen, insbesondere Epithelzellen, dendritischen Zellen, Bindegewebszellen, Adipocyten, mesenchyma- Ie Zellen oder Knochenmarkszellen sind.
50. Verfahren nach einem der Ansprüche 46 oder 47, wobei die Zellen Tumorzellen, insbesondere Tumorzelllinien wie MCF-7, HeLa, HepG2, PC3, CT-26, A125, A549, MRC-5, CHO, MeUuso28, Nalm6 oder Jurkat sind.
51. Verfahren nach einem der Ansprüche 46 oder 47, wobei die Zellen adhärente Zellen, bevorzugt adhärente Zelllinien wie HUVEC oder HaCaT.
52. Verfahren nach einem der Ansprüche 46 oder 47, wobei die Zellen ausdifferenzierte Zellen sind.
53. Verfahren zur Herstellung von Expressionsprodukten einer Zelle, wobei die Zelle in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 46 bis 52 kultiviert und das Expressionsprodukt gewonnen wird.
54. Verfahren zur Herstellung differenzierter Zellen oder Zellver- bände, wobei undifferenzierte Zellen in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 46 bis 52 kultiviert und differenzierte Zellen oder Zellverbände gewonnen werden.
55. Verfahren nach dem Anspruch 54, wobei die Zellverbände, Transplantate oder Testsysteme sind.
56. Verfahren nach Anspruch 54, wobei die Zellverbände Organe, Organteile, insbesondere eine Trachea sind.
57. Expressionsprodukte einer Zelle, hergestellt durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 46 bis 56.
58. Differenzierte Zellen oder Zellverbände, hergestellt durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 46 bis 56.
59. Transplantate oder Testsysteme, hergestellt durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 46 bis 56.
60. Organe, Organteile, insbesondere Trachea, hergestellt durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 46 bis 56.
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CA002684544A CA2684544A1 (en) 2007-04-20 2008-04-18 Improved three-dimensional biocompatible skeleton structure containing nanoparticles
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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009046950A1 (de) * 2007-10-05 2009-04-16 Matthias Epple Vorrichtung für den transfer von nukleinsäuren in zellen und verfahren zu ihrer herstellung
WO2011059112A1 (ja) * 2009-11-13 2011-05-19 株式会社日立ハイテクノロジーズ 粒子含有細胞集合体
JP2012509676A (ja) * 2008-11-26 2012-04-26 コーニング インコーポレイテッド ナノ粒子の細胞培養表面
WO2013053502A1 (en) * 2011-10-11 2013-04-18 Closed Stock Company "Institute Of Applied Nanotechnology" Method for cultivation of stem cells
US10413913B2 (en) 2017-02-15 2019-09-17 Tokyo Electron Limited Methods and systems for dielectrophoresis (DEP) separation
US11376640B2 (en) 2018-10-01 2022-07-05 Tokyo Electron Limited Apparatus and method to electrostatically remove foreign matter from substrate surfaces

Families Citing this family (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2006286149B2 (en) 2005-08-29 2012-09-13 Technion Research And Development Foundation Ltd. Media for culturing stem cells
DK2733203T3 (en) 2006-08-02 2019-02-04 Technion Res & Dev Foundation PROCEDURES FOR EXPANSION OF EMBRYONAL STEM CELLS IN A SUSPENSION CULTURE
JP2011024465A (ja) * 2009-07-23 2011-02-10 Univ Of Tokyo 細胞の分化誘導装置、細胞の分化誘導方法、及び未分化細胞からの分化細胞の産生方法
FR2948286B1 (fr) * 2009-07-27 2011-08-26 Jean-Noel Thorel Composition injectable associant un agent de comblement et un milieu de croissance des fibroblastes
EP4166652A1 (de) 2009-11-12 2023-04-19 Technion Research & Development Foundation Ltd. Kulturmedien, zellkulturen und verfahren zur kultivierung pluripotenter stammzellen in undifferenziertem zustand
KR101739330B1 (ko) * 2010-10-29 2017-05-24 (주)아모레퍼시픽 진피 모사체를 이용한 피부 탄력 증진력 평가법
KR20120128440A (ko) * 2011-05-17 2012-11-27 삼성전자주식회사 표적 물질 검출용 키트 및 이를 이용한 표적 물질 검출 방법
JP6114270B2 (ja) * 2011-08-02 2017-04-12 東京エレクトロン株式会社 電界によりパターン及び構造形成を制御する方法及びデバイス
US20140357752A1 (en) 2011-09-18 2014-12-04 Bio Plasmar Ltd. Bio-degradable compositions and use thereof
KR101407605B1 (ko) * 2011-11-24 2014-06-16 포항공과대학교 산학협력단 나노 구조를 갖는 세포 배양용 용기와 그 제조 방법
CN103113627B (zh) * 2013-01-17 2015-03-25 黑龙江省重生生物科技有限公司 一种用于细胞培养的多糖/Matrigel复合凝胶膜及其制备方法和应用
JP2014226097A (ja) * 2013-05-23 2014-12-08 株式会社日立ハイテクノロジーズ 細胞培養方法、粒子状培養担体、及び粒子包含細胞凝集体
DE102014002103B4 (de) * 2014-02-15 2020-10-22 Oxea Gmbh Verfahren zur Regenerierung gebrauchter Hydroformylierungskatalysatoren
DE102014222898A1 (de) * 2014-11-10 2016-05-12 Universität Konstanz Herstellung und Isolierung einer nativen humanen dermalen extrazellulären Matrix
KR101531046B1 (ko) * 2014-11-26 2015-06-24 강원대학교산학협력단 표면개질된 나노섬유, 그 제조방법, 및 그의 용도
CN104818248A (zh) * 2015-03-25 2015-08-05 苏州佰通生物科技有限公司 一种免疫细胞培养基、培养方法及应用
CN105331535B (zh) * 2015-11-05 2017-08-25 中国科学院电子学研究所 用于重建骨细胞微环境的微流控芯片及其使用方法
CN105838666A (zh) * 2016-05-26 2016-08-10 成都远睿生物技术有限公司 一种细胞培养基及细胞培养方法
DE102017101823A1 (de) 2017-01-31 2018-08-02 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Strukturiertes Komposit aus Matrixmaterial und Nanopartikeln
KR102069726B1 (ko) * 2017-02-28 2020-01-23 사회복지법인 삼성생명공익재단 세포 이동성 측정 방법 및 이를 이용한 세포 이동성 저해제의 스크리닝 방법
KR102068665B1 (ko) * 2017-12-21 2020-01-21 주식회사 에스피엘 세포 배양용 지지체, 이의 제조 방법, 및 이를 이용한 세포 배양 방법
KR102147272B1 (ko) * 2018-01-09 2020-08-24 고려대학교 산학협력단 연부조직 질환 치료용 약물이 탑재된 나노입자가 함유된 줄기세포의 3차원 세포 집합체 및 이의 제조방법
WO2020227934A1 (zh) * 2019-05-14 2020-11-19 深圳先进技术研究院 生物制品的制作方法、生物制品和应用
CN110476953B (zh) * 2019-09-09 2021-11-12 广州中鑫基因医学科技有限公司 一种细胞活性保存液以及疾病检测试剂盒
CN110564674B (zh) * 2019-09-29 2021-05-11 广东工业大学 一种干细胞铺底工作液及其应用
DE102019132214B3 (de) * 2019-11-27 2021-04-29 Cellbricks Gmbh Mit biologischen Zellen besiedeltes 3D-Gerüst aus biokompatiblem Polymer und dessen Herstellung
US11279909B2 (en) 2019-12-06 2022-03-22 Diversified Biotech, Inc. Polylactide cell culture containers and use in cell culture
US11788045B2 (en) 2019-12-06 2023-10-17 Diversified Biotech, Inc. Polylactide cell culture containers and use in cell culture
WO2021156443A1 (de) 2020-02-05 2021-08-12 Lifetaq-Analytics Gmbh Dreidimensionale zellkultur

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006099333A2 (en) * 2005-03-11 2006-09-21 Wake Forest University Health Sciences Cell scaffold matrices with incorporated therapeutic agents
WO2007041079A2 (en) * 2005-09-30 2007-04-12 Alza Corporation Banded controlled release nanoparticle active agent formulation dosage forms and methods

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CH594444A5 (de) 1972-12-04 1978-01-13 Gerd Birrenbach
FR2524895A1 (fr) 1982-04-09 1983-10-14 Inst Francais Du Petrole Procede de preparation de microlatex en phase huileuse continue par polymerisation en micro-emulsion du type eau dans l'huile d'un monomere hydrosoluble, microlatex obtenus et leur utilisation en recuperation assistee du petrole
DE10031859B4 (de) 2000-06-30 2007-08-09 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Verbesserte Mikrogele und Filme
DE10144252A1 (de) 2001-08-31 2003-03-27 Fraunhofer Ges Forschung Nanopartikel mit daran immobilisiertem biologisch aktivem TNF
DE10164309A1 (de) * 2001-12-28 2003-07-10 Fraunhofer Ges Forschung Verbesserte strukturiert-funktionale Bindematrices für Biomoleküle
BRPI0612602A2 (pt) * 2005-07-01 2010-11-23 Cinv Ag dispositivos médicos compreendendo um material compósito reticulado

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006099333A2 (en) * 2005-03-11 2006-09-21 Wake Forest University Health Sciences Cell scaffold matrices with incorporated therapeutic agents
WO2007041079A2 (en) * 2005-09-30 2007-04-12 Alza Corporation Banded controlled release nanoparticle active agent formulation dosage forms and methods

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
L-C GERHARDT ET AL: "Titanium dioxide (TiO2) nanoparticles filled poly(d,l lactid acid) (PDLLA) matrix composites for bone tissue engineering", JOURNAL OF MATERIALS SCIENCE: MATERIALS IN MEDICINE, KLUWER ACADEMIC PUBLISHERS, BO, vol. 18, no. 7, 9 January 2007 (2007-01-09), pages 1287 - 1298, XP019503700, ISSN: 1573-4838 *
SHIMIZU KAZUNORI ET AL: "Enhanced cell-seeding into 3D porous scaffolds by use of magnetite nanoparticles.", JOURNAL OF BIOMEDICAL MATERIALS RESEARCH. PART B, APPLIED BIOMATERIALS MAY 2006, vol. 77, no. 2, May 2006 (2006-05-01), pages 265 - 272, XP002491926, ISSN: 1552-4973 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009046950A1 (de) * 2007-10-05 2009-04-16 Matthias Epple Vorrichtung für den transfer von nukleinsäuren in zellen und verfahren zu ihrer herstellung
JP2012509676A (ja) * 2008-11-26 2012-04-26 コーニング インコーポレイテッド ナノ粒子の細胞培養表面
WO2011059112A1 (ja) * 2009-11-13 2011-05-19 株式会社日立ハイテクノロジーズ 粒子含有細胞集合体
CN102597230A (zh) * 2009-11-13 2012-07-18 株式会社日立高新技术 含有粒子的细胞聚集体
WO2013053502A1 (en) * 2011-10-11 2013-04-18 Closed Stock Company "Institute Of Applied Nanotechnology" Method for cultivation of stem cells
US10413913B2 (en) 2017-02-15 2019-09-17 Tokyo Electron Limited Methods and systems for dielectrophoresis (DEP) separation
US11376640B2 (en) 2018-10-01 2022-07-05 Tokyo Electron Limited Apparatus and method to electrostatically remove foreign matter from substrate surfaces

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