DE10315930A1 - Verfahren zur Vaskularisierung von künstlichen Zellkulturträgern - Google Patents

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Vaskularisierung von künstlichen Zellträgermaterialien, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass die Oberfläche des künstlichen Materials DOLLAR A a) mit hydrophoben und hydrophilen funktionellen Gruppen in einem Verhältnis angereichert wird, so dass die überwiegende Hydrophilie der Oberfläche einen Wasserkontaktwinkel von 40 bis 50 DEG aufweist, DOLLAR A b) ein Matrixprotein an dieser modifizierten Oberfläche schwach adsorbiert wird, wonach DOLLAR A c) Endothelzellen am Matrixprotein angesiedelt werden, und dass die schwache Adsorption der Matrixproteine auf dem Copolymer eine dreidimensionale Selbststrukturierung der Endothelzellen mit dem Matrixprotein zulassen.

Description

  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Vaskularisierung von künstlichen Zellkulturträgern.
  • In der regenerativen Medizin werden synthetische Materialien eingesetzt, deren Oberflächeneigenschaften zuvor gezielt modifiziert und an die spezifischen Anforderungen der jeweiligen Anwendung angepasst werden.
  • Die Vaskularisierung und die Angiogenese von synthetischen bzw. künstlichen Materialien ist von grundlegender Bedeutung für eine Vielzahl von Anwendungen in der regenerativen Medizin. Dabei kommt es darauf an, dass künstliche Trägerstrukturen bzw. Template für Zellen sowie künstlich erzeugte Gewebsteile mit einem Netzwerk von Blutgefäßen durchsetzt werden.
  • Dem Bestreben nach Vaskularisierung und Angiogenese liegt zu Grunde, dass bei größeren Gewebsteilen (ab Größenbereich von einem Millimeter) der Austausch von Nährstoffen und Abprodukten nicht mehr ausschließlich diffusiv gewährleistet werden kann, so dass ein Transport über das Blutsystem nötig ist.
  • Im Stand der Technik ist bekannt, dass Endothelzellen unter bestimmten Voraussetzungen zur Bildung von Netzwerken kapillarer Blutgefäße fähig sind. Beispielsweise bilden Endothelzellen in dreidimensionalen Gelen bzw. Netzwerken verschiedener extrazellulärer Matrixproteine, wie Collagen, Fibronektin, Fibrin, Fibrinogen oder in Gemischen von diesen, kapillarähnliche Netzwerke.
  • Äquivalent dazu werden feste künstliche Trägerstrukturen mit einer unspezifischen Primärbeschichtung mit extrazellulären Matrixproteinen überzogen oder diese von fremden Zellen, beispielsweise Tumorzellen, abgelagert, wonach sich Endothelzellen anlagern.
  • Dieser Methode haftet der Nachteil an, dass die Art der Proteinanlagerung meist nicht kontrollierbar und ungeeignet ist, und damit eine gezielte, von der Wechselwirkung der angelagerten Proteine mit künstlichen Oberflächen abhängige Anlagerung der Endothelzellen und eine damit verbundene gezielte Steuerung der Vaskularisierung und Angiogenese, nicht möglich ist.
  • Gleichfalls ist bekannt, dass die Vaskularisierung und die Angiogenese durch bestimmte Wachstumsfaktoren unterstützt werden können. Die Unterstützung der Blutgefäßbildung durch Wachstumsfaktoren, wie Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) und basic Fibroblast Growth Factor (b-FGF, FGF-2), wird im Stand der Technik bereits in künstlichen Hydrogelen mit eingebauten Adhäsionsliganden (z.B. RGD-Peptidsequenzen) für die Generierung kapillarer Netzwerke genutzt.
  • Nachteilig an der Vaskularisierung von gelartigen Trägerstrukturen ist allerdings, dass wiederum nur unspezifisch Netzwerke entstehen und die Gele an sich ohne Funktion sind. Die Implementierung einer Funktion in diesen Gelen für eine lokale Kontrolle der vaskulären Strukturen oder des umgebenden Gewebes ist im Nachhinein schlecht realisierbar. Darüber hinaus besitzen derartige Gele keine ausreichende Festigkeit, welche in vielen Gewebsimplantaten notwendig ist.
    •
  • Es ist somit Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Vaskularisierung von künstlichen Trägerstrukturen bereitzustellen, welches eine verbesserte Bildung und Entwicklung von kapillaren Strukturen in und auf künstlichen Materialien ermöglicht. Das Verfahren soll geeignet sein, die Vaskularisierung und Angiogenese in vitro und in vivo zu unterstützen.
  • Die Aufgabe der Erfindung wird durch ein Verfahren zur Vaskularisierung von künstlichen Materialien mit Endothelzellen gelöst, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass das künstliche Material
    • a) mit hydrophoben und hydrophilen funktionellen Gruppen in einem Verhältnis angereichert wird, so dass die überwiegende Hydrophilie der Oberfläche einen Wasserkontaktwinkel von 40 bis 50 Grad aufweist,
    • b) ein Matrixprotein an dieser modifizierten Oberfläche schwach adsorbiert wird, wonach
    • c) Endothelzellen am Matrixprotein angesiedelt werden, und dass die schwache Adsorption der Matrixproteine auf dem Copolymer eine drei-dimensionalen Selbststrukturierung der Endothelzellen mit dem Matrixprotein zulassen.
  • Die Konzeption der Erfindung besteht darin, dass die Vaskularisierung von künstlichen Materialien gezielt gesteuert wird. Dabei werden Träger und Gerüst bildende künstliche Materialien, wie Polymere, Metalle, Glas, Keramik oder Ähnliche, als Substrate genutzt und vaskularisiert, um im Rahmen des Tissue Engineering eingesetzt werden zu können.
  • Nach einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung wird zur Einstellung des Verhältnisses von hydrophoben und hydrophilen funktionellen Gruppen die Oberfläche des künstlichen Trägermaterials mit einem Polymer überzogen, wobei das Polymer sowohl hydrophile als auch hydrophobe Gruppen aufweist und die hydrophilen Gruppen überwiegen.
  • Das Verhältnis von hydrophoben und hydrophilen Gruppen auf der Oberfläche der künstlichen Materialien wird beispielsweise durch eine Gas-Plasmabehandlung oder durch nasschemische Verfahren erzeugt.
  • Zur Verbesserung der Vaskularisierung können zusätzlich Wachstumsfaktoren wie Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) oder basic Fibroblast Growth Factor (bFGF, FGF-2), eingesetzt werden.
  • Der Gegenstand der Erfindung besteht jedoch darin, dass die Vaskularisierung unabhängig von den Wachstumsbedingungen durch die physikochemischen Eigenschaften der Substrat- bzw. Trägerstrukturgrenzfläche gesteuert wird.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren beruht darauf, dass die Matrixproteine oder andere Adhäsionsliganden nur in geringer Dichte von bis zu ca. 2 × 1011 cm–2 kovalent angebunden bzw. irreversibel adsorbiert sind und anderweitig die Matrixproteine nur in geringer Stärke bzw. Anbindungsstärke adsorptiv gebunden sind, so dass sie noch aktiv durch die Endothelzellen umgelagert werden können. Dadurch bilden sich dreidimensionale Netzwerke der extrazellulären Matrixproteine, wie Collagen, Fibronektin, Fibrin, Fibrinogen oder Gemische davon, aus, wie sie auch in vivo beobachtet werden. Diese Anbindungscharakteristik betrifft voradsorbierte und von den Zellen in der Kultur sezernierte Matrixproteine gleichermaßen.
  • Die Ausbildung von dreidimensionalen Netzwerken ist die Voraussetzung dafür, dass sich die Endothelzellen in kapillaren Netzwerken anordnen können und damit die Basis für ein Blutgefäßsystem bilden.
  • Die Bedeutung einer genauen Einstellung der physikochemischen Eigenschaften des Substrates ist somit grundlegend, da einerseits eine gewisse Anbindung der Matrixproteine erfolgen muss, jedoch diese nicht zu stark sein darf, da ansonsten eine Reorganisation durch die Endothelzellen nicht mehr erfolgen kann.
  • Die Anbindung der Matrixproteine an das Substrat darf nicht zu schwach sein, da ansonsten die Endothelzellen nicht an der Substratoberfläche anhaften können. Eine Ausbildung von Adhäsionskontakten ist jedoch für die Proliferation und das Überleben der Endothelzellen entscheidend.
  • Als Substrat wird erfindungsgemäß entweder die direkt modifizierte Oberfläche des künstlichen Materials oder die mit dem Copolymer beschichtete Oberfläche des künstlichen Materials verstanden.
  • Durch die gezielte Einstellung bestimmter physikochemischer Eigenschaften wird die Wechselwirkung des Substrates mit vorher aufgebrachten oder auch von den Endothelzellen sezernierten Proteinen der extrazellulären Matrix beeinflusst.
  • Das Verfahren beinhaltet somit die Nutzung physikochemischer Eigenschaftsprofile von Materialoberflächen zur Beeinflussung von deren Wechselwirkung mit extrazellulären Matrixproteinen für die Steuerung der Vaskularisierung von künstlichen Zellträgerstrukturen sowie von künstlich erzeugten Gewebsteilen in Tissue Engineering Therapien.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren ist für in vivo und in vitro Systeme vorteilhaft einsetzbar.
  • Gemäß einer Ausgestaltung der Erfindung wird die selbstständige Vaskularisierung von künstlichen Materialien bzw. Trägerstrukturen nach Implantation durch die verfahrensgemäß modifizierte Oberfläche mit Endothelzellen in vivo ermöglicht.
  • Nach einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung erfolgt eine Vorkultivierung der modifizierten Trägerstrukturen mit autologen und allogenen Endothelzellen oder aus mesenchymalen Stammzellen gewonnenen Vorläuferzellen von Endothelzellen in vitro.
  • Dazu werden die künstlichen Trägerstrukturen modifiziert um freie Aminogruppen zu erzeugen. Je nach Trägermaterial kann diese Modifizierung z. B. durch einen Plasmaprozess in Ammoniakgas oder eine Umsetzung von freien Silanolgruppen von einem Aminosilan erfolgen. Danach erfolgt eine Beschichtung mit dem Maleinsäureanhydrid-Copolymer aus der Lösung. Dazu werden 0,1%ige Lösungen von Poly(propen-alt-maleinsäureanhydrid) in Tetrahydrofuran oder von Poly(ethylen-alt-maleinsäureanhydrid) in Aceton verwendet.
  • Anschließend erfolgt die kovalente Anbindung des Copolymerfilms an das Substrat über einen Heizschritt bei 120°C. Nachfolgend werden geringe Oberflächendichten von Matrixproteinen oder RGD-Peptiden in wässrigen Lösungen kovalent angebunden.
  • Beispielweise kann eine Beschichtung mit Fibronektin aus einer Phosphat-Puffer-Lösung mit einer Konzentration von 1 μg/ml über eine Stunde erfolgen. Das Fibronektin wird dabei als Matrixprotein in Oberflächendichten von 2 × 1011 cm–2 kovalent gebunden.
  • Äquivalent dazu können nach einen Hydrolysierungsschritt der Anhydridgruppen Matrixproteine nicht-kovalent in größeren Oberflächendichten (1 × 1012 cm–2) aufgebracht werden. Das entspricht einer Beschichtung mit einer Phosphat-Puffer-Lösung von Fibronektin mit einer Konzentration von 50 μg/ml über eine Stunde.
  • Auf diesen modifizierten Trägerstrukturen können nun Endothelzellen in einer Dichte von 2 × 103 cm–2 ausgesät werden, wobei sie in einem Standard-Zellkulturmedium mit den nötigen Nährstoffen sowie zusätzlich mit 10% fetalen Kälberserum und 3 ng/ml Wachstumsfaktor b-FGF bei 37°C und 5% CO2 wachsen.
  • Alternativ wird als künstliches Material bzw. Trägerstruktur eine Glas- oder Polymeroberfläche mit Poly(propen-alt-maleinsäureanhydrid) oder Poly(ethylen-alt-maleinsäureanhydrid) mit einer Schichtdicke von 4 nm überzogen. Nachfolgend werden die Anhydridgruppen hydrolysiert und anschließend wird Fibronektin als Matrixprotein adsorbiert.
  • Nach einer vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung ist es Merkmal des Verfahrens, dass die für die gewünschte Angiogenese/Vaskularisierung an Materialoberflächen erforderlichen Matrixprotein-Adsorptionsschicht sich beim Kontakt mit herkömmlichen Biofluids (z.B. Zellkulturmedium oder in vivo) spontan ausbildet und auch über längere Zeiträume regeneriert.
  • Die modifizierte Oberfläche der künstlichen Materialien wird dabei durch die Wechselwirkung mit den extrazellulären Matrixproteinen charakterisiert. Diese Wechselwirkung beinhaltet die Oberflächendichte kovalent oder irreversibel adsorbierter extrazellulärer Matrixproteine oder künstlicher Adhäsionsligande (wie RGD-Peptide) sowie die Stärke der nicht-kovalenten Anbindung von voradsorbierten und aus dem Biofluid und den Zellen abgegebenen Matrixproteinen. Die Oberflächendichte der kovalent gebundenen Matrixproteine oder Adhäsionsliganden sollte bei ca. 2 × 1011 cm–2 liegen.
  • Die Anbindungsstärke der schwach gebundenen Matrixproteine kann durch eine Austauschsdynamik von gebundenen und gelösten Proteinen beschrieben werden, die mit
    Figure 00070001
    charakterisiert werden kann, wobei Γ die Menge der aktuell gebundenen Population von Matrixproteine ist und die Konzentration der gelösten Proteine konstant bleibt. Die differentielle Größe t kennzeichnet die Zeit und K eine Zeitkonstante, welche für die geeigneten Oberflächen in einem Bereich von ca. 4 × 10–6 s–1 liegt.
  • Im Falle einer Beschichtung mit Maleinsäureanhydrid-Copolymeren kann die Wechselwirkungsstärke des Matrixproteins Fibronektin über die Hydrophobie der Oberfläche charakterisiert werden. Der fortschreitende Wasserkontaktwinkel muss dafür im Bereich zwischen 40 und 50 Grad liegen.
  • Gemäß einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung wird das künstliche Material bzw. Zellkulturträgermaterial lokal modifiziert, um eine lokale Vaskularisierung oder Angiogenese zu erzeugen Eine weitere vorteilhafte Ausgestaltung der Erfindung besteht in der definierten Vorgabe der Vaskularisierungsstruktur durch eine lateral strukturierte Modifizierung der Zellkulturträgeroberfläche oder die Verwendung oberflächenmodifizierter dreidimensionaler netzwerkartiger textiler Strukturen aus Polymerfasern.
  • Dadurch wird es ermöglicht Vaskularisierung und Angiogenese lokal zu steuern. Außerdem gelingt es dadurch in Komposit-Materialien lokal in bestimmten Strukturen eine Ausbildung von Blutgefäßen zu erreichen.
    •

Claims (17)

  1. Verfahren zur Vaskularisierung von künstlichen Zellträgermaterialien, dadurch gekennzeichnet, dass die Oberfläche des künstlichen Materials a) mit hydrophoben und hydrophilen funktionellen Gruppen in einem Verhältnis angereichert wird, so dass die überwiegende Hydrophilie der Oberfläche einen Wasserkontaktwinkel von 40 bis 50 Grad aufweist, b) ein Matrixprotein an dieser modifizierten Oberfläche schwach adsorbiert wird, wonach c) Endothelzellen am Matrixprotein angesiedelt werden, und dass die schwache Adsorption der Matrixproteine auf dem Copolymer eine drei-dimensionalen Selbststrukturierung der Endothelzellen mit dem Matrixprotein zulassen.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass zur Einstellung des Verhältnisses von hydrophoben und hydrophilen funktionellen Gruppen die Oberfläche des künstlichen Trägermaterials mit einem Polymer überzogen wird, und dass das Polymer sowohl hydrophile als auch hydrophobe Gruppen aufweist, wobei die hydrophilen Gruppen überwiegen.
  3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass als Polymer ein Copolymer Poly(propen-alt-maleinsäureanhydrid) oder Poly(ethylen-alt-maleinsäureanhydrid) eingesetzt wird.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Verhältnis von hydrophoben und hydrophilen Gruppen auf der Oberfläche der künstlichen Materialien durch eine Gas-Plasmabehandlung oder durch nasschemische Verfahren erzeugt wird.
  5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass als künstliche Materialien Glas, Keramik, Metall oder Polymermaterialien eingesetzt werden.
  6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass als Matrixproteine Collagen, Fibronektin, Fibrin, Fibrinogen oder Gemische davon eingesetzt werden.
  7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass eine Glas- oder Polymeroberfläche mit Poly(propen-alt-maleinsäureanhydrid) oder Poly(ethylen-alt-maleinsäureanhydrid) mit einer Schichtdicke von 4 nm überzogen wird und nachfolgend die Anhydridgruppen hydrolysiert werden und dass anschließend Fibronektin als Matrixprotein adsorbiert wird.
  8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass auf einer Metall-, Keramik oder Polymeroberfläche durch einen Plasmaprozess in Ammoniakgas oder eine Umsetzung von freien Silanolgruppen von einem Aminosilan Aminogruppen erzeugt werden und danach eine Beschichtung mit dem Maleinsäureanhydrid-Copolymer aus der Lösung Poly(propen-alt-maleinsäureanhydrid) oder Poly(ethylen-alt-maleinsäureanhydrid) mit einer Schichtdicke von 4 nm erfolgt, wobei die kovalente Anbindung des Copolymerfilms an das Substrat über einen Heizschritt bei 120°C erfolgt und dass die Anhydridgruppen hydrolysiert werden und anschließend Fibronektin als Matrixprotein adsorbiert wird.
  9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Fibronektin als Matrixprotein in Oberflächendichten von 2 × 1011 cm–2 kovalent angebunden wird.
  10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Endothelzellen in einer Dichte von 2 × 103 cm–2 auf dem Matrixprotein ausgesät werden.
  11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich die Wachstumsfaktoren Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) oder basic Fibroblast Growth Factor (bFGF, FGF-2) eingesetzt werden.
  12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11 dadurch gekennzeichnet, dass die nachfolgende Vaskularisierung oder Angiogenese mit Endothelzellen selbstständig in vivo abläuft.
  13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die nachfolgende Vaskularisierung oder Angiogenese mit autologen oder allogenen Endothelzellen in vitro erfolgt.
  14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die nachfolgende Vaskularisierung oder Angiogenese mit autologen oder allogenen, aus mesenchymalen Stammzellen gewonnenen Vorläuferzellen der Endothelzellen in vitro erfolgt.
  15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Zellkulturträgermaterial lokal modifiziert wird, um eine lokale Vaskularisierung oder Angiogenese zu erzeugen.
  16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass als künstliches Material eine textile netzwerkartige Polymerstruktur eingesetzt wird.
  17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass als künstliches Material ein Komposit-Material eingesetzt wird, welches aus verschiedenen Werkstoffen besteht, wovon einer entsprechend modifiziert ist, um eine lokale Vaskularisierung oder Angiogenese zu erreichen.
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