WO2021075502A1 - 細胞シート製造装置、および細胞シート - Google Patents

Abstract

培地内の細胞シートの位置が安定した状態で細胞シート両面を容易に観察する。細胞シート製造装置（１００）は、容器（２０）、およびメッシュシート（２）と、メッシュシート（２）を容器（２０）の底面から浮くように保持する土台（３）と、を有し、容器（２０）に離接可能に収容された支持体ユニット（１０）を備え、支持体ユニット（１０）は、培地中で鉛直方向および水平方向の位置が一定となるように容器（２０）に収容されている。

Description

細胞シート製造装置、および細胞シート

　本発明は、細胞シート製造装置、および細胞シートに関する。

　細胞シートは、火傷部位を治療する際の皮膚シートなどとして実際に使用されている。将来的には、細胞シートは、心不全患者へ移植される心筋細胞シートまたは糖尿病患者へ移植される膵島細胞シートとしても使用され得、多くの患者に適用されることが期待されている。

　一方で、複数の細胞層からなる細胞シートによって、生体内に類似した組織構造を再構築する試みがなされている。それゆえ、３次元的に細胞が配置されている細胞シートの作製法の重要性が認識されている。既存の温度応答性培養皿を用いた細胞シート作製法で作製した場合、作製される細胞シートは脆いために取り扱いが難しいことが多い（非特許文献１および２参照）。また、ディッシュの上で複数の細胞層（真皮層や表皮層）からなる細胞シートを作製しようとする場合、成熟した表皮層がタイトジャンクションと呼ばれる一種のバリアを形成するために、細胞シート内部への栄養供給が阻害されることが懸念されている。

　また、非細胞性のシート状の支持体の上で細胞シートを作製する方法が提案されている。しかし、支持体が患部の細胞と馴染まない場合、この方法では支持体が露出している面を患部へ貼付できない。すなわち、細胞シートの患部に対する貼付面が片方の面に限定される。線維芽細胞層（真皮層）の上に角化細胞層（表皮層）が配置されているような細胞シートを患部に貼付する場合、上述のように貼付面が限定されることは極めて都合が悪い。なぜなら、細胞シートを移植する場合は、真皮層側の面を患部へ接着させる必要があるからである。

　また、他の方法として、多孔膜（例えばポリカーボネート製の多孔膜）の上に複数の細胞層からなる細胞シートを作製する方法が知られている（非特許文献３参照）。この方法により作製した細胞シートは、多孔膜の孔を介した細胞への栄養供給が期待されるために、ディッシュの上で複層の細胞シートを作製した時よりも、細胞への栄養供給が優れている。しかし、多孔膜の上で細胞シートを作製した場合においても、作製された細胞シートは、患部に対する貼付面が片方の面であるため、移植に使用することは難しい。それゆえ、上記方法により作製された細胞シートは、主に化合物の透過性試験等で使用されている。

　ゼラチン、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、乳酸グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）等のナノファイバーシートを用いた細胞シート作製方法が提案されている（非特許文献４参照）。この方法では、エレクトロスピニング法によりナノファイバーからなるシートを作り、当該シート上にて細胞を培養する。このような方法に関しては、エレクトロスピニングにより各ナノファイバーの配置を正確に制御することが難しいという問題がある。そして、このナノファイバーの不規則性の問題のため、作製された細胞シートについて、再現性の高い結果を得られ難い可能性がある。

　また、細胞シートを作製するために、マイクロメッシュシートを用いることが提案されている。マイクロメッシュシートを用いた方法として、例えば、（ｉ）マイクロメッシュシートの上で細胞を培養して二次元の細胞シートを作製する方法、（ｉｉ）マイクロメッシュシートの上でｉＰＳ細胞を培養してスフェア状のトロフォブラスト様細胞を作製する方法等が報告されている（特許文献１および２、並びに非特許文献５参照）。このマイクロメッシュシートを用いた細胞培養法の応用として、マイクロメッシュシート上で株化肝細胞ＨｅｐＧ２細胞を培養して３次元細胞シートを作製する技術が開発されている。この３次元細胞シートは、３次元スフェロイドよりも細胞機能の一部が向上しており、また、細胞観察や栄養供給に優れ、流体デバイスとの適合性に優れていることが示唆されている（非特許文献６参照）。

国際公開ＷＯ２０１５／００５３４９号パンフレット（２０１５年　１月１５日公開） 特開２０１９－５０７７３号公報（２０１９年　４月　４日公開）

Ｇｒｅｅｎ　Ｈ，　Ｋｅｈｉｎｄｅ　Ｏ，　Ｔｈｏｍａｓ　Ｊ．　Ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｈｕｍａｎ　ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎｔｏ　ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｅｐｉｔｈｅｌｉａ　ｓｕｉｔａｂｌｅ　ｆｏｒ　ｇｒａｆｔｉｎｇ．　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　Ｕ　Ｓ　Ａ．　１９７９；７６（１１）：５６６５－８． Ｙａｍａｄａ　Ｎ，　Ｏｋａｎｏ　Ｔ，　Ｓａｋａｉ　Ｈ，　Ｋａｒｉｋｕｓａ　Ｆ，　Ｓａｗａｓａｋｉ　Ｙ，　Ｓａｋｕｒａｉ　Ｙ．　Ｔｈｅｒｍｏ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ　ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ　ｓｕｒｆａｃｅｓ；　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ　ａｎｄ　ｄｅｔａｃｈｍｅｎｔ　ｏｆ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｃｅｌｌｓ．　Ｄｉｅ　Ｍａｋｒｏｍｏｌｅｋｕｌａｒｅ　Ｃｈｅｍｉｅ，　Ｒａｐｉｄ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ．　１９９０；１１（１１）：５７１－６． Ｋｏｊｉｍａ　Ｈ，　Ｉｓｈｉｉ　Ｉ，　Ｎａｋａｔａ　Ｓ，　Ｋｏｎｉｓｈｉ　Ｈ．　Ｄｏｓｅ－ｒｅｓｐｏｎｓｅ　Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　Ｕｓｉｎｇ　ａｎ　Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　Ｍｏｄｅｌ，　ａｎ　Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ　ｔｏ　Ｓｋｉｎ　Ｉｒｒｉｔａｔｉｏｎ　Ｔｅｓｔｉｎｇ．　Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｓ　ｔｏ　Ａｎｉｍａｌ　Ｔｅｓｔｉｎｇ　ａｎｄ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ．　２００６；１１（３）：１７７－８４． Ｌｉ　Ｊ，　Ｍｉｎａｍｉ　Ｉ，　Ｓｈｉｏｚａｋｉ　Ｍ，　Ｙｕ　Ｌ，　Ｙａｊｉｍａ　Ｓ，　Ｍｉｙａｇａｗａ　Ｓ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｈｕｍａｎ　Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ－Ｄｅｒｉｖｅｄ　Ｃａｒｄｉａｃ　Ｔｉｓｓｕｅ－ｌｉｋｅ　Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ　ｆｏｒ　Ｒｅｐａｉｒｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｉｎｆａｒｃｔｅｄ　Ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ．　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ．　２０１７；９（５）：１５４６－５９． Ｏｋｅｙｏ　ＫＯ，　Ｋｕｒｏｓａｗａ　Ｏ，　Ｙａｍａｚａｋｉ　Ｓ，　Ｏａｎａ　Ｈ，　Ｋｏｔｅｒａ　Ｈ，　Ｎａｋａｕｃｈｉ　Ｈ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｃｅｌｌ　Ａｄｈｅｓｉｏｎ　Ｍｉｎｉｍｉｚａｔｉｏｎ　ｂｙ　ａ　Ｎｏｖｅｌ　Ｍｅｓｈ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｍｅｔｈｏｄ　Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌｌｙ　Ｄｉｒｅｃｔｓ　Ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｓｅｌｆ－Ａｓｓｅｍｂｌｙ　Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ．　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｅｎｇ　Ｐａｒｔ　Ｃ　Ｍｅｔｈｏｄｓ．　２０１５；２１（１０）：１１０５－１５． Ｈｏｒｉ　Ｔ，　Ｋｕｒｏｓａｗａ　Ｏ．　Ａ　Ｔｈｒｅｅ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ　Ｃｅｌｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｍｅｔｈｏｄ　ｗｉｔｈ　ａ　Ｍｉｃｒｏｍｅｓｈ　Ｓｈｅｅｔ　ａｎｄ　Ｉｔｓ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｔｏ　Ｈｅｐａｔｉｃ　Ｃｅｌｌｓ．　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｅｎｇ　Ｐａｒｔ　Ｃ　Ｍｅｔｈｏｄｓ．　２０１８．

　マイクロメッシュシートを用いた細胞シートの製造方法では、まず、細胞を培養するための培地中に浮かせた状態で、メッシュシートを容器内に設置する。続いて、マイクロメッシュ上に細胞を播種する。そして、マイクロメッシュシート上に播種された細胞を培地中で培養する。このような細胞シートの製造方法においては、細胞シートを構成する細胞の生育状況を確認するため、細胞シートの両面を顕微鏡で確認する必要がある。

　例えば特許文献１に開示された技術では、細胞を播種するためのマイクロメッシュシートは、容器に設置された吊るし用部材に設置されている。このような構成では、（ｉ）細胞シートを反転させて培養すること、（ｉｉ）細胞シートを反転させて顕微鏡観察すること（すなわち両面観察）が難しい。

　また、特許文献２に開示された装置では、培地を収容する容器の内壁に設けられた溝にマイクロメッシュシートが保持されている。このような構成では、マクロメッシュシートを容器から分離し、裏表逆に配置することが困難である。このため、細胞シートの両面を顕微鏡で確認することは困難である。

　上述の細胞観察に関わる困難性は、例えば、複数の細胞層からなる細胞シートを作製する場合に、特に問題となり得る。

　本発明の一態様は、細胞シートを構成する細胞の生育状況を確認するために、培地内の細胞シートの位置が安定した状態で細胞シートの両面を容易に観察できる細胞シート製造装置を実現することを第１の目的としている。

　また、本発明の一態様は、厚さを十分に確保でき、強度を向上させることができる細胞シートを実現することを第２の目的としている。

　上記の課題を解決するために、本発明の一態様に係る細胞シート製造装置は、細胞を培養するための培地を収容する容器と、前記細胞を付着させて培養する基材であるメッシュシートと、当該メッシュシートを前記容器の底面から浮くように保持する保持部材と、を有し、前記容器に離接可能に収容されている支持体ユニットと、を備え、前記支持体ユニットは、前記培地中で鉛直方向および水平方向の位置が一定となるように前記容器に収容されていることを特徴としている。

　本発明の一態様に係る細胞シートは、細胞層を少なくとも２つ有し、前記２つの細胞層の間に、細胞を付着させて培養する基材であるメッシュシートが配されたことを特徴としている。

　本発明の一態様によれば、細胞シート中の細胞の生育状況を確認するために、培地内の細胞シートの位置が安定した状態で細胞シートの両面を容易に観察できる細胞シート製造装置を実現できる。さらに、本発明の一態様によれば、厚さを十分に確保でき、強度を向上させることができる細胞シートを実現できる。

構成例１の細胞シート製造装置の概略構成を示す図である。 図１に示す細胞シート製造装置の効果を説明するための図である。 変形例１の細胞シート製造装置の構成を示す図である。 変形例２の細胞シート製造装置の構成を示す図である。 本発明の一実施形態に係る細胞シート製造装置を用いて作製した皮膚シートの断面構造を示す模式図である。 構成例２の細胞シート製造装置に備えられた支持体ユニットの概略構成を示す図である。 構成例２の細胞シート製造装置の概略構成を示す図である。 構成例３の細胞シート製造装置の概略構成を示す図である。 構成例４の細胞シート製造装置の概略構成を示す図である。 実施例１の結果を示す図である。 実施例１の結果を示す図である。 実施例２の結果を示す図である。 実施例３の結果を示す図である。 実施例４の結果を示す図である。 実施例５の結果を示す図である。 実施例５の結果を示す図である。 実施例５の結果を示す図である。 実施例６の結果を示す図である。 実施例７の結果を示す図である。 変形例３の細胞シート製造装置の構成を示す図である。 変形例３の細胞シート製造装置の効果を説明するための図である。

　本発明の一実施形態について説明すると以下の通りであるが、本発明はこれに限定されない。本発明は、以下に説明する各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態及び実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態及び実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された文献の全てが、本明細書中において参考文献として援用される。本明細書中、数値範囲に関して「Ａ～Ｂ」と記載した場合、当該記載は「Ａ以上Ｂ以下」を意図する。

　１．細胞シート製造装置
　本実施形態に係る細胞シート製造装置は、メッシュシートが培地中に設置され、当該メッシュシート上に播種された細胞を培地中で生育させることにより細胞シートを製造することを前提とした装置である。メッシュシートを培地（培養液）中に設置することにより、メッシュシートの形状に沿って細胞を増殖させることができる。

　本実施形態に係る細胞シート製造装置は、細胞を培養するための培地を収容する容器と、支持体ユニットと、を備えた構成である。前記支持体ユニットは、前記容器に離接可能に収容されており、メッシュシートと、保持部材と、を有する。前記メッシュシートは、細胞を付着させて培養するための基材である。また、前記保持部材は、前記メッシュシートを前記容器の底面から浮くように保持する。そして、前記支持体ユニットは、前記培地中で鉛直方向および水平方向の位置が一定となるように前記容器に収容されている。

　ここで、「メッシュシートを前記容器の底面から浮くように保持する」とは、メッシュシートの両面が、容器の底面（好ましくは、容器の内壁および底面）に接触しておらず、メッシュシートの両面が前記培地に十分に接触するように、メッシュシートを保持することをいう。前記保持部材は、メッシュシートを前記容器の底面から浮くように保持する構成であればよく、具体的な構成は限定されない。

　上述のメッシュシートを用いた細胞シート製造において、本実施形態に係る細胞シート製造装置は使用者による細胞観察の利便性を向上させる。より具体的には、上記の構成では、前記支持体ユニットは、容器に離接可能に収容されている。このため、使用者は、前記支持体ユニットを、容器から取り出して裏返した後、再び、容器に収容することによって、前記支持体ユニットを容易に裏返しにすることができる。前記支持体ユニットが裏返ると、支持体ユニットの保持部材に保持されたメッシュシート上に形成された細胞シートも裏返る。それゆえ、上記の構成によれば、前記メッシュシート上に形成された細胞シートの両面を顕微鏡で容易に観察することができる。

　さらに、前記支持体ユニットは、培地中で鉛直方向および水平方向の位置が一定となるように容器に収容されているので、顕微鏡による細胞シートの観察中に、メッシュシートの容器内の位置、換言すれば、メッシュシート上に形成された細胞シートの位置が、変化することがない。それゆえ、上記の構成によれば、細胞シートを精密に観察することができる。

　また、本実施形態に係る細胞シート製造装置において、前記保持部材は、前記メッシュシートを取り外し可能に保持することが好ましい。これにより、前記メッシュシート上に形成された細胞シートを容易に前記支持体ユニットから分離することができる。それゆえ、例えば、細胞シートを移植する際に細胞シートの取り扱いが容易になる。

　また、前記支持体ユニットは、前記培地中で鉛直方向および水平方向の位置が一定になるように前記容器中に収納できる構成であればよく、その具体的な構成は限定されない。例えば、前記支持体ユニットは、前記保持部材が前記培地よりも比重が大きい構成が挙げられる。前記保持部材が前記培地よりも比重が大きいことにより、前記保持部材は前記培地中を浮遊せずに沈み、特に鉛直方向の位置が安定する。前記保持部材の比重は、前記培地の種類に応じて適宜設定可能であり、例えば、培地の比重を１としたときに、前記保持部材の比重は、好ましくは１．１以上、より好ましくは１．５以上、より好ましくは２．０以上、より好ましくは５．０以上、最も好ましくは１０．０以上である。また、前記保持部材を構成する材料としては、例えば、ポリスチレン、ポリエステル、ポリアセタール、ポリカーボネート、ポリ塩化ビニル等が挙げられる。

　また、メッシュシートとしては、細胞を播種できることができ、かつ細胞を増殖することができる構造であれば、特に限定されない。前記メッシュシートは、所定の形状の開口部が規則的又は非規則的に繰り返し並んだ平面状の構造体が好ましい。前記メッシュシートは、平面視において、多角形の開口部を多数有することがより好ましい。メッシュシートの開口部の形状は、典型的には三角形、四角形、六角形などの多角形であるが、円や楕円、その他の多角形であってもよい。

　ここで、前記メッシュシートの開口部以外の部分をフレーム又はフレーム部と呼ぶことにする。なお、開口部がマイクロメートルサイズであるとき、メッシュシートは、マイクロメッシュなどと称することもある。なお、メッシュシートの開口部の形状とは、メッシュシートを構成するフレームに囲まれた領域の形状であるともいえる。

　前記メッシュシートの開口部は、培養する細胞少なくとも１個が通過できる大きさであり得る。開口部が培養する細胞少なくとも１個が通過できる大きさであるとは、開口部の大きさと、細胞の大きさとが、細胞が変形して又は変形しないで、開口部を通過できる関係であることを意味する。開口部は、細胞が開口部に接触しないで通過できる大きさであってもよいし、細胞が接触しながら（換言すれば、細胞が変形しながら）通過できる大きさであってもよい。

　好ましくは、メッシュシートの開口部の形状は、一方向に伸長した形状である。「一方向に伸長した形状」とは、当該形状を規定する複数の軸線のうち、他の軸（短軸）よりも長い軸（長軸）が１つ存在する形状をいう。このような形状として、例えば、長方形、菱形、楕円などが挙げられる。開口部の形状が長方形である場合、長辺が長軸に対応し、短辺が短軸に対応する。また、開口部の形状が菱形である場合、２つの対角線のうちの長い方の対角線が長軸に対応し、短い方の対角線が短軸に対応する。「一方向に伸長した形状」は、例えば、長軸（長辺）が短辺（短軸）よりも遥かに長い長方形、長軸が短軸よりも遥かに長い菱形または楕円が挙げられる。長方形である場合、一方向が伸長した形状は、短辺：長辺が１：２～１：５、好ましくは１：２～１：１０の形状である。また、菱形である場合、一方向が伸長した形状は、短軸：長軸が１：２～１：５、好ましくは１：２～１：１０の形状である。また、楕円である場合、一方向が伸長した形状は、短軸：長軸が１：２～１：５、好ましくは１：２～１：１０である形状である。勿論、本発明は、これらの構成に限定されない。なお、「一方向に伸長した形状」は、長方形、菱形、楕円に限定されず、当該形状を規定する複数の軸線のうち、他の軸よりも遥かに長い軸が１つ存在する形状であればよい。

　上記の構成のように前記メッシュシートの開口部が一方向に伸長した形状である場合、開口部は、一方向へ長く伸びた大きな壁面を有することになる。当該壁面に接着して増殖する細胞の数は多く、かつ、同様の配向性を有して増殖するので、上記の構成によれば、増殖する細胞の配向性を開口部の伸長方向へ制御することができる。

　また、前記メッシュシートの材料は、細胞が付着し増殖できる材料であればよく、例えば、光硬化性樹脂、生体適合性材料、生体分解性材料などを用いることができる。

　光硬化性樹脂を用いれば、フォトリソグラフィ法によって前記メッシュシートを作製することができる。前記光硬化性樹脂としては、例えば、アクリレート化合物、メタクリレート化合物、エポキシ化合物、イソシアネート化合物、チオール化合物、シリコーン系化合物などが挙げられる。これらの２種以上を組み合わせて用いてもよい。光硬化性樹脂の具体例としては、ウレタンアクリレート、ポリエステルアクリレート、エポキシアクリレート、ポリ（メタ）アクリル酸メチル、エトキシ化ビスフェノールＡアクリレート、脂肪族ウレタンアクリレート、ポリエステルアクリレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリスチレン、ポリカーボネート、アクリル変性脂環式エポキシド、２官能アルコールエーテル型エポキシド、アクリルシリコーン、アクリルジメチルシロキサン、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）等が挙げられるがこれらに限定されない。

　また、フォトリソグラフィ法によって前記メッシュシートを作製する場合、露光した部分が除去されるポジ型のレジストを用いてマイクロメッシュシートを作製することができる。例えば、前記ポジ型のレジストとして、ＤＮＱ（ジアゾナフトキノン）ノボラック系樹脂ポジ型レジスト、ｔ－ブトキシカルボニル、テトラヒドロピラン、フエノキシエチル、トリメチルシリル、t－ブトキシカルボニルメチル等の脱保護反応型、ポリフタルアルデヒド、ポリカーボネート、ポリシリエルーテル等の解重合反応型のものが挙げられる。また、現像液にはテトラメチルアンモニウムヒドロキシド（ＴＭＡＨ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ＭＥＫ（メルエチルケトン）、ＧＢＬ（γ－ブチロラクトン）、ＥＬ（乳酸エチル）などが用いられる。

　また、前記メッシュシートの材料が生体適合性材料または生体分解性材料である場合、得られる細胞シートは、そのままメッシュシートと共に生体に移植できるので、再生医療または創薬に好適に用いられる。

　前記生体適合性材料としては、シリコーン、ポリエーテルブロックアミド（ＰＥＢＡＸ）、ポリウレタン、シリコーン－ポリウレタン共重合体、セラミックス、コラーゲン、ヒドロキシアパタイト、ナイロン、ポリエチレンテレフタレート、ゴアテックス（商標）などの超高分子量ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、その他生体由来材料などが挙げられるがこれらに限定されない。また、前記メッシュシートは、生体適合性材料以外の材料で形成し、表面を生体適合性材料で処理したものであってもよい。

　前記生体分解性材料としては、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリグリコリド（ＰＧＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、及びそれらの共重合体、ＰＨＢ－ＰＨＶ系ポリ（アルカン酸）類、ポリエステル類、デンプン、セルロース、キトサンなどの天然高分子やその誘導体などが挙げられるがこれらに限定されない。

　前記メッシュシートの材料としては、上記の中でも、ポリエステル、とりわけポリエチレンテレフタレートが好ましい。ポリエチレンテレフタレートは生体への毒性が低いため、得られた細胞シートを生体内へ移植できる。また、蛍光顕微鏡観察の際に自家蛍光を抑えるため、ポリエチレンテレフタレートは黒色に染色されていることが好ましい。ポリエステル製のメッシュシートの具体例として、天池合繊社製の生地ＡＧ００１Ｎ０、ＡＧ００Ｚ１Ｎ０、ＡＧ００Ｚ３Ｎ０等が挙げられる。また、黒色に染色されたポリエステル製のメッシュシートの具体例として、天池合繊社製の生地ＡＧ００１Ｎ１、ＡＧ００Ｚ１Ｎ９、ＡＧ００Ｚ３Ｎ９等が挙げられる。

　また、前記メッシュシートは、予め細胞接着促進材料でコーティングしてもよい。細胞接着促進材料は、細胞を培養支持体に定着させて伸展や増殖をしやすくするために用いられ、例えば、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニンなどの細胞外マトリックスタンパク質、ポリＬリジンなどの陽性電荷物質などが挙げられる。細胞接着促進材料として、具体的には、マトリゲル（登録商標）が挙げられる。

　また、本実施形態に係る細胞シート製造装置において、前記容器は、細胞を培養するための培地を収容することが可能であればよく、その構成（例えば形状）は特に限定されない。前記容器は、例えば、細胞培養用のディッシュ、複数個のウェルを有するプレート（６穴プレート、１２穴プレート等）、細胞培養用のカラムが挙げられる。

　２．本実施形態に係る細胞シート製造装置の構成例１
　本実施形態に係る細胞シート製造装置の構成例１について、説明する。図１は、構成例１としての細胞シート製造装置１００の構成の概略を示す図である。図１の１０１０は、細胞シート製造装置１００に備えられた支持体ユニット１０の構成を示す斜視図である。図１の１０２０～１０２３は、細胞シート製造装置１００を用いた細胞シートの製造方法の手順を示す図である。図１の１０３０は、細胞シート製造装置１００を用いて作製された細胞シートの構成を示す図である。また、図１の１０４０は、細胞シート製造装置１００の具体的構成の一例を示す像である。

　図１の１０２３に示されるように、細胞シート製造装置１００は、支持体ユニット１０と、容器２０と、を備えている。支持体ユニット１０は、容器２０に離接可能に収容されている。

　図１の１０１０に示されるように、支持体ユニット１０は、環状部材１と、メッシュシート２と、土台３（保持部材）と、を備えている。土台３は、土台本体３ａと、筒状載置部３ｂと、底面当接部３ｃと、側壁当接部３ｄと、を有している。

　土台本体３ａは、円盤形状である。筒状載置部３ｂは、無底円筒形状であり、軸方向の両端部が開口している。筒状載置部３ｂは、土台本体３ａの一方の面からのみ鉛直方向に突出して形成されている。筒状載置部３ｂは、土台本体３ａの内部を貫通する構成になっている。換言すれば、土台本体３ａの上側および下側は、筒状載置部３ｂを介して連通している。筒状載置部３ｂ上には、メッシュシート２が載置される。メッシュシート２は、土台本体３ａに対して筒状載置部３ｂと反対側から、筒状載置部３ｂを通して、顕微鏡などにより観察可能となる。

　土台本体３ａに対して垂直な方向からみた平面視において、側壁当接部３ｄは、土台本体３ａから水平方向に伸長した矩形板形状である。側壁当接部３ｄは、土台本体３ａに対して対称になるように少なくとも２つ形成されている。図１の１０１０に示される構成では、側壁当接部３ｄは、４つ形成されている。側壁当接部３ｄは、水平方向の先端部分が容器２０の側壁に当接する。側壁当接部３ｄは、土台本体３ａと容器２０の側壁との間の水平方向の間隔を一定に維持するスペーサーの役割を果たす。それゆえ、容器２０が水平方向に振動した場合であっても、側壁当接部３ｄの先端部が容器２０の側壁に当接することにより、培地中で、土台本体３ａの水平方向の位置は変動することなく安定に維持される。なお、土台３は、容器２０から離接可能となるように、全ての側壁当接部３ｄが容器２０の側壁と寸法的なクリアランスを形成するように構成されている。

　底面当接部３ｃは、矩形板形状であり、矩形板形状の側壁当接部３ｄそれぞれに対して立設されている。底面当接部３ｃは、側壁当接部３ｄと交差している。図１の１０１０に示された構成では、底面当接部３ｃは、側壁当接部３ｄに対して鉛直方向（重力方向）に交差している。そして、底面当接部３ｃにおける鉛直方向の先端部が容器２０の底面と当接する。底面当接部３ｃは、土台本体３ａと容器２０の底面との間の鉛直方向の間隔を一定に維持するスペーサーの役割を果たす。それゆえ、容器２０に土台３が収納されたとき、底面当接部３ｃが容器２０の底面と当接することにより、培地中で、土台本体３ａの鉛直方向の位置は変動することなく安定に維持される。また、底面当接部３ｃは、側壁当接部３ｄと交差しており、側壁当接部３ｄに対して上下両方向から突出して形成されている。このため、上下逆方向に裏返して土台３が容器２０に収容されても、土台本体３ａの鉛直方向の位置は安定に維持される。

　環状部材１は、筒状載置部３ｂの外周を取り囲む環形状を有し、土台３に対して取り外し可能に設けられている。環状部材１の環形状は、特に限定されず、円環、四角環等の任意の形状であってもよい。図１の１０１０に示された構成では、環状部材１は、円環形状である。

　メッシュシート２は、環状部材１と筒状載置部３ｂとの間に配置される。メッシュシート２は、その周縁が環状部材１の内側面と筒状載置部３ｂの外側面とにより挟持された状態で、土台３に保持されている。環状部材１が円環形状であり、かつ筒状載置部３ｂが円筒形状である場合、メッシュシート２が安定に保持されるとの観点から、環状部材１の内径と筒状載置部３ｂの外径との差は、メッシュシート２の厚さに近ければ近いほどよい。

　次に、細胞シート製造装置１００を用いた細胞シートの製造方法について説明する。まず、図１の１０２０に示されるように、土台３の筒状載置部３ｂにメッシュシート２を載置する。そして、メッシュシート２が筒状載置部３ｂに載置された状態で、筒状載置部３ｂに環状部材１を装着する。

　このとき、環状部材１は、その内側面が筒状載置部３ｂの外側面を取り囲むように装着される。このため、図１の１０２１に示されるように、メッシュシート２の周縁は、環状部材１の内側面と筒状載置部３ｂの外側面とにより挟持される。これにより、メッシュシート２を保持する支持体ユニット１０が作製される。作製された支持体ユニット１０では、筒状載置部３ｂの軸方向の両端部の開口のうち、一方の端部の開口がメッシュシート２によって閉塞され、他方の端部の開口が開放されている。

　次いで、メッシュシート２が筒状載置部３ｂよりも下側に位置するように、支持体ユニット１０を上下逆に裏返す。この結果、支持体ユニット１０には、メッシュシート２と筒状載置部３ｂの内側面とにより、メッシュシート２を底面とする有底筒部１０ａが形成される。図１の１０２２に示されるように、ピペットマン５等を用いて、細胞４を培地６中に懸濁した懸濁液を有底筒部１０ａに注入する。このとき、筒状載置部３ｂの内側面およびメッシュシート２に対する前記懸濁液の表面張力により、前記懸濁液は、メッシュシート２を通過せず、メッシュシート２上に保持される。そして、懸濁液中の細胞４をメッシュシート２に付着させることにより、メッシュシート２上に細胞４を播種する。

　その後、支持体ユニット１０を容器２０に収容する。そして、容器２０を培地６で満たし、メッシュシート２に付着した細胞４の培養を行う。

　図１の１０３０に示されるように、メッシュシート２の開口を埋めるように、開口中心に向かって個々の細胞４同士が自発的に伸展しながら接着する。増殖能を保持した細胞４をメッシュシート２上で培養したとき、細胞４はメッシュシート２に対して水平方向だけでなく鉛直方向へも増殖する。その結果、メッシュシート２の開口を覆うように、細胞４からなる細胞層が単層または複数層形成された細胞シート２００を得ることができる。メッシュシート２に播種する細胞４の量および／または細胞４の増殖速度を制御することにより、細胞シート２００の厚さを制御可能である。細胞シート２００は、メッシュシート２により支持されているため、頑丈であり、取り扱いやすい。

　また、細胞シート２００は、細胞４からなる細胞層を少なくとも２つ有し、前記２つの細胞層の間に、細胞４を付着させて培養する基材であるメッシュシート２が配された構成となっている。すなわち、細胞シート２００の両面が細胞４により構成されている。それゆえ、細胞シート２００は、患部に対する貼付面が片方の面に限定されない。また、ディッシュや多孔膜を足場として利用した従来の細胞シートの製造方法と比較して、細胞シート製造装置１００を用いた細胞シートの製造方法は、細胞４への栄養供給や細胞４の観察の点で優れている。また、メッシュシート２のようにパターン化された開口を有するシートを用いることにより、同様の構造（換言すれば性質）を有する細胞シート２００を再現性高く得ることができる。

　図１の１０４０に示されるように、容器２０は、ウェル２１が複数形成されたプレートであってもよい。より具体的には、容器２０は、１２穴プレートである。この場合、土台３を備えた支持体ユニット１０は、ウェル２１に対し離接可能に収容されるように構成されている。

　図２は、細胞シート製造装置１００の効果を説明するための図である。図２の２０１０および２０１１に示されるように、支持体ユニット１０は、容器２０に対して離接可能に収容されているので、上下逆方向に裏返して土台３を容器２０に収容しても、支持体ユニット１０は使用可能である。それゆえ、支持体ユニット１０を裏返すと、メッシュシート２上に形成された細胞シートも裏返るので、メッシュシート２上に形成された細胞シートの両面を顕微鏡７により容易に観察することができる。

　また、図２の２０２０～２０２２に示されるように、細胞シート製造装置１００を用いれば、複数種類の細胞層を有する細胞シートを作製することができる。より具体的には、細胞４ａからなる第１細胞層と、細胞４ａと種類が異なる細胞４ｂからなる第２細胞層とを有する細胞シートを作製することができる。まず、図２の２０２０に示されるように、メッシュシート２上に細胞４ａが播種された状態で、支持体ユニット１０を培地６中に浸す。次いで、図２の２０２１に示されるように、支持体ユニット１０を上下逆になるように裏返す。このとき、メッシュシート２の細胞４ａとは反対側の面が上側となる。それゆえ、上側からピペットマン５等を用いて細胞４ｂの懸濁液をメッシュシート２上へ滴下すれば、メッシュシート２の細胞４ａと反対側の面にも細胞４ｂを播種することができる（図２の２０２２参照）。このように、細胞シート製造装置１００の構成によれば、細胞シートの表面および裏面のどちらの面に対しても、追加して細胞を播種することが可能である。なお、細胞シートの両面に細胞を容易に播種するという観点から、図２の２０２０～２０２２に示されるように、好ましくは、環状部材１は、筒状載置部３ｂから突出して、土台３に取り付けられている。当該構成によれば、支持体ユニット１０を裏返すと、環状部材１の内側面とメッシュシート２とにより、メッシュシート２を底面とする有底筒部１０ｂが形成される。このため、有底筒部１０ｂに細胞４ｂの懸濁液を注入することで、当該懸濁液がメッシュシート２上で安定して保持される。

　さらに、細胞シート製造装置１００の構成によれば、支持体ユニット１０から細胞シート２００を容易に分離することができる。図２の２０３０に示されるように、容器２０内の培地中で細胞４を培養することにより、細胞４からなる細胞シート２００を作製する。その後、図２の２０３１に示されるように、支持体ユニット１０を容器２０から分離する。次いで、図２の２０３２に示されるように、土台３の筒状載置部３ｂから環状部材１を取り外す。これにより、メッシュシート２に形成された細胞シート２００は、例えばピンセット８等を用いて、土台３の筒状載置部３ｂから取り外すことが可能である。このような細胞シート製造装置１００からの取り外しが容易な細胞シート２００は、例えば、細胞シートを移植する際に便利である。

　（変形例１）
　細胞シート製造装置１００の変形例について、説明する。図３は、変形例１としての細胞シート製造装置１００Ａの構成、および当該細胞シート製造装置１００Ａを用いた細胞シートの製造方法を示す図である。図３の３０１０は、細胞シート製造装置１００Ａに備えられた土台３の構成例を示す斜視図である。また、図３の３０２０～３０２４は、細胞シート製造装置１００Ａを用いた細胞シートの製造方法を示す図である。図３の３０３０は、細胞シート製造装置１００Ａに備えられた蓋体９の構成を示す断面図である。細胞シート製造装置１００Ａは、大面積の細胞シートを製造することが可能である。

　図３の３０１０に示されるように、土台３は、直径３．５ｃｍのディッシュ用（６穴プレート用）、直径６ｃｍのディッシュ用、直径１０ｃｍのディッシュ用に設計することが可能である。すなわち、土台３の筒状載置部３ｂの直径を大きくすることによって、作製される細胞シートを大面積にすることができる。これに伴い、メッシュシート２の面積も大きくすればよい。

　変形例１の細胞シート製造装置１００Ａは、このような大面積のメッシュシート２上に懸濁液を保持し、大面積の細胞シートを製造するのに適した構成となっている。図３の３０２１～３０２４に示されるように、細胞シート製造装置１００Ａの支持体ユニット１０Ａは、蓋体９を備えている。蓋体９は、メッシュシート２の一方の面２ａを覆う構成となっている。蓋体９には、細胞４を含む懸濁液をメッシュシート２と蓋体９との間に注入する注入口９ａが設けられている。より具体的には、蓋体９は、メッシュシート２における筒状載置部３ｂと接触する面２ａを覆うように配置されている。メッシュシート２と蓋体９とは離間している。メッシュシート２と蓋体９との間に筒状載置部３ｂが配置されている。筒状載置部３ｂにより、メッシュシート２と蓋体９との間隔が一定に保持されている。

　ここで、メッシュシート２と蓋体９との間隔は、細胞４の懸濁液がメッシュシート２と蓋体９との両方に接触しながらメッシュシート２と蓋体９との間に注入されるように設定されている。メッシュシート２と蓋体９との間隔は、好ましくは１ｍｍ～３ｍｍ、より好ましくは１ｍｍ～２ｍｍ、特に好ましくは１ｍｍ～１．５ｍｍに設定されている。

　換言すれば、蓋体９は、メッシュシート２と筒状載置部３ｂとにより形成された有底筒部１０ａを閉塞する部材である。蓋体９は、少なくとも第１層９ａおよび第２層９ｂを含む積層構造であり得る。第１層９ａは、メッシュシート２から最も遠い層であり、第２層９ｂは、メッシュシート２から最も近い層である。図３の３０３０に示される構成では、蓋体９は、第１層９ａおよび第２層９ｂからなる２層構造となっている。第１層９ａを構成する材料としては、シリコーン樹脂等が挙げられる。また、第２層９ｂを構成する材料としては、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）等が挙げられる。なお、蓋体９は、第１層９ａおよび第２層９ｂの何れかの単層構造であってもよい。

　細胞シート製造装置１００Ａを用いた細胞シートの製造方法では、まず、支持体ユニットをディッシュ２２内に配置する。この支持体ユニットには、蓋体９が設けられていない。また、前記支持体ユニットは、メッシュシート２が筒状載置部３ｂよりも下側に位置するように上下逆に配置されている。このように支持体ユニット１０を配置することにより、有底筒部１０ａが形成される。この有底筒部１０ａは、メッシュシート２と筒状載置部３ｂの内側面とにより形成され、メッシュシート２を底面とする（図３の３０２０参照）。次いで、有底筒部１０ａの開放した上部を閉塞するように蓋体９を配置することにより、支持体ユニット１０Ａを作製する（図３の３０２１参照）。

　次いで、ピペットマン５等を用いて、注入口９ａから、細胞４を培地６中に懸濁した懸濁液を有底筒部１０ａに注入する（図３の３０２２参照）。このとき、細胞４の懸濁液は、メッシュシート２と蓋体９との両方に接触しながら有底筒部１０ａ内に注入される。このため、蓋体９およびメッシュシート２それぞれに対する前記懸濁液の表面張力により、前記懸濁液が重力によりメッシュシート２を通過して落下するのが防止される。このため、メッシュシート２が大面積であっても、蓋体９に対する前記懸濁液の表面張力により、前記懸濁液がメッシュシート２上に保持される（図３の３０２３参照）。このように懸濁液中の細胞４をメッシュシート２に付着させることにより、メッシュシート２（例えば、第面積のメッシュシート２）に細胞４を均一播種することができる。

　その後、ディッシュ２２全体を培地６で満たし、メッシュシート２に付着した細胞４の培養を行う（図３の３０２４参照）。

　なお、上述した方法では、有底筒部１０ａに蓋体９を配置した後に細胞４の懸濁液を注入していた。しかし、細胞４の懸濁液を有底筒部１０ａに注入した後に、前記懸濁液がメッシュシート２から落下しないように蓋体９を設置してもよい。

　（変形例２）
　細胞シート製造装置１００の他の変形例について、説明する。図４は、変形例２としての細胞シート製造装置１００Ｂの構成、および当該細胞シート製造装置１００Ｂを用いた細胞シートの製造方法を示す図である。図４の４０１０は、細胞シート製造装置１００Ｂに備えられた支持体ユニット１０Ｂの構成を示す分解斜視図である。図４の４０２０～４０２２は、細胞シート製造装置１００Ｂを用いた細胞シートの製造方法を示す図である。

　細胞シート製造装置１００Ｂは、変形例１と同様に、蓋体９を備え、大面積の細胞シートを製造することが可能である。細胞シート製造装置１００Ｂでは、支持体ユニット１０Ｂの構成が変形例１とは異なる。図４の４０１０に示されるように、支持体ユニット１０Ｂの土台３は、筒状載置部３ｂが土台本体３ａから突出した構成ではない。筒状載置部３ｂは、土台本体３ａに形成された開口部として設けられている。底面当接部３ｅは、土台本体３ａに対して下方へ突出して設けられており、上方へは突出していない。また、側壁当接部３ｆは、土台本体３ａから水平方向に伸びて設けられている。

　また、環状部材１は、筒状載置部３ｂの内径とほぼ同じ内径を有する。それゆえ、メッシュシート２は、環状部材１の下面と土台本体３ａの上面とにより挟持される。

　また、蓋体９は、メッシュシート２における環状部材１と接触する面２ｂを覆うように配置されている。メッシュシート２と蓋体９とは離間している。メッシュシート２と蓋体９との間に環状部材１が配置されている。環状部材１により、メッシュシート２と蓋体９との間隔が一定に保持されている。蓋体９は、メッシュシート２と環状部材１とにより形成された有底筒部１０ｂを閉塞する部材である。

　細胞シート製造装置１００Ｂを用いた細胞シートの製造方法では、まず、支持体ユニット１０Ｂをディッシュ２２内に配置する。支持体ユニット１０Ｂは、メッシュシート２が環状部材１よりも下側に位置するように配置されている。このように配置することにより、支持体ユニット１０Ｂに有底筒部１０ｂが形成される。この有底筒部１０ｂは、メッシュシート２と環状部材１の内側面とにより形成され、メッシュシート２を底面とする（図４の４０２０参照）。

　次いで、ピペットマン５等を用いて、注入口９ａから、細胞４を培地６中に懸濁した懸濁液を有底筒部１０ａに注入し、メッシュシート２上に細胞４を播種する（図４の４０２１および４０２２参照）。その後、ディッシュ２２を培地６で満たし、細胞培養を行う。

　細胞シート製造装置１００Ｂは、作製した細胞シートを支持体ユニット１０Ｂから容易に分離できない構造となっている。しかし、ハサミやナイフを用いることにより、支持体ユニット１０Ｂから細胞シートを切り取ることが可能である。

　本実施形態に係る細胞シート製造装置を用いて作製した細胞シートは、培地中で細胞シートの上面と下面との両面からの栄養供給が可能である。ディッシュ上で細胞シートを作製する従来の方法では、細胞シートの下面からの栄養供給が不可能であるため、上面からの栄養供給のみに頼って細胞を培養している。したがって、細胞シートの上面からの栄養供給が制限されるような状況では、細胞シート内部の細胞への栄養供給が不十分になることがある。

　細胞シートの上面からの栄養供給が制限される状況として、例えば、皮膚シートの作製時の状況がある。皮膚シート製造においては、線維芽細胞層（真皮層）の上に角化細胞層（表皮層）を形成させることにより皮膚シートを作製する場合がある。この場合、成熟した表皮細胞はタイトジャンクションを形成するため、皮膚シートの上部からの栄養供給が阻害される。したがって、ディッシュ上で細胞シートを作製する従来の方法では、線維芽細胞層と真皮層とからなる皮膚シートを作製することが困難である。

　図５は、本実施形態に係る細胞シート製造装置を用いて作製した皮膚シートの断面構造を示す模式図である。１１は、死んだ角化細胞を示す。１２は、上述したタイトジャンクションを示す。また、１３は、角化細胞を示す。１４は、皮膚線維芽細胞を示す。図５に示されるように、本実施形態に係る細胞シート製造装置を用いて作製した皮膚シートは、上部の角化細胞１３の層からの栄養供給が減少しても、下部の皮膚線維芽細胞１４の層からの栄養供給が期待できる。このため、皮膚シートを構成している角化細胞１３および皮膚線維芽細胞１４により多くの栄養を供給することができる。

　また、他の従来技術として、多孔膜の上に複数の細胞層からなる皮膚シートを作製する方法が知られている。多孔膜を使用しているため、細胞シートの下面から、ある程度栄養が供給されると考えられる。しかし、この方法により作製した細胞シートは、そのまま移植に使用することは困難である。なぜなら、患部への移植に際し、表皮層の面と患部とを接触させるのではなく、真皮層の面と患部とを接触させながら、皮膚シートを移植する必要があるため、真皮層が多孔膜と表皮層との間に挟まれている細胞シートを移植に使用することはできないからである。一方、本実施形態に係る細胞シート製造装置を用いて作製した皮膚シートは、表皮層面だけでなく真皮層面も細胞が培地側に存在する、すなわち培地に露出している。このため、皮膚シートの真皮層面を患部へ貼付することが可能である。

　また、タイトジャンクション１２は腸管細胞や血管内皮細胞などにも観察される。それゆえ、皮膚シート以外にも、タイトジャンクション１２を形成する腸管細胞や血管内皮細胞などを含む細胞シートを培養および使用する際にも、本実施形態に係る細胞シート製造装置を利用できる。

　（変形例３）
　細胞シート製造装置の変形例について、説明する。図２０および図２１は、変形例３としての細胞シート製造装置の支持体ユニット６０を示す図である。なお、図２０および図２１では、細胞シート製造装置を構成する容器については、記載を省略している。

　本実施の形態の細胞シート製造装置は、土台３（保持部材）および環状部材１の少なくとも一方には、土台３と環状部材１とが分離しないように係止する係止部６７が形成されており、土台３および環状部材１の何れか一方には、他方を押圧する押圧ピン６５を貫通させるための貫通孔６６が形成されており、他方の押圧により係止が解除され、土台３と環状部材１とが離間するように構成されている。なお、本実施の形態の細胞シート製造装置は、押圧ピン６５を備えている構成であってもよいし、押圧ピン６５を備えていない構成であってもよい。本実施の形態の細胞シート製造装置が押圧ピン６５を備えていない構成である場合には、押圧ピン６５を、細胞シート製造装置とは別の構成として準備すればよい。

　係止部６７は、押圧ピン６５によって土台３と環状部材１との係止が解除され得る構成であればよく、具体的な構成は限定されない。係止部６７の具体的な構成としては、例えば、（ｉ）土台３および環状部材１の少なくとも一方の表面に形成された、土台３と環状部材１との間で大きな摩擦力を発生させる摩擦力発生領域、（ｉｉ）土台３の表面に形成された凸部と、環状部材１の表面に形成された、上記凸部の押圧方向への移動を係止する係止凸部と、の組み合わせ、（ｉｉｉ）環状部材１の表面に形成された凸部と、土台３の表面に形成された、上記凸部の押圧方向への移動を係止する係止凸部と、の組み合わせ、および、（ｉｖ）上述した（ｉｉ）と（ｉｉｉ）との組み合わせ、を挙げることができる。摩擦発生領域は、例えば、土台３および環状部材１の少なくとも一方の表面に、所望の摩擦力を発生させ得る材料（例えば、ゴム）を貼付することによって形成することができる。

　貫通孔６６は、土台３および環状部材１の何れか一方に形成されていればよいが、支持体ユニット６０の扱い易さの観点から、土台３に形成されていることが好ましい。

　特定の貫通孔６６に着目すると、土台３に当該貫通孔６６が形成されている場合には、当該貫通孔６６と対向する環状部材１の領域には貫通孔が形成されていない構成であり得、環状部材１に当該貫通孔６６が形成されている場合には、当該貫通孔６６と対向する土台３の領域には貫通孔が形成されていない構成であり得る。当該構成であれば、貫通孔６６に押圧ピン６５を貫通させれば、当該押圧ピン６５によって、貫通孔が形成されていない方の構成（土台３または環状部材１）を効果的に押圧することができる。

　貫通孔６６の形状および数は、限定されない。貫通孔６６の形状としては、例えば、円柱状、および角柱状を挙げることができる。１つの保持部材、または、１つの環状部材あたりに形成される貫通孔６６の数は、偶数個であってもよいし、奇数個であってもよいが、土台３または環状部材１の全体を略均等に押圧するという観点から、偶数個であることが好ましい。貫通孔６６の数としては、例えば、１～１０個、または、１～２０個を挙げることができるが、土台３および環状部材１の大きさに基づいて、貫通孔６６の数を適宜設定すればよい。

　より具体的に、図２０の２００１０および図２０の２００１１において、矢印の左側の図は、支持体ユニット６０の斜視図である。後述する図２１にても詳細に示すように、土台３には、メッシュシート２を載置する筒状載置部３ｂが形成されており、メッシュシート２の周縁は、筒状載置部３ｂと環状部材１とにより挟持されている。なお、支持体ユニット６０は、土台３または環状部材１の上に蓋体（図示せず）を備えていてもよい。

　図２０の２００１０、および図２０の２００１１において、矢印の右側の図は、貫通孔６６に押圧ピン６５を貫通させて環状部材１を押圧することによって土台３と環状部材１との係止が解除された後の、支持体ユニット６０の分解斜視図である。これらの図面では、土台３に貫通孔６６が形成されており、かつ、当該貫通孔６６と対向する環状部材１の領域には貫通孔が形成されていない。それ故に、貫通孔６６に押圧ピン６５を貫通させれば、当該押圧ピン６５によって環状部材１が効果的に押圧され、土台３と環状部材１との係止が解除される。これらの図面では、土台３に対して、例示的に４個の貫通孔６６が形成されている。これらの貫通孔６６の各々に押圧ピン６５を貫通させれば、環状部材１の全体を略均等に押圧することができる。

　図２１の２１０１０は、支持体ユニット６０の上面図である。図２１の２１０１１は、当該支持体ユニット６０の「Ａ－Ａ」の位置における断面図であって、貫通孔６６に押圧ピン６５を貫通させた場合の、各構成の経時変化を示す断面図である。まず、図２１の２１０１１の左側に示すように、矢印の方向に沿って、押圧ピン６５を貫通孔６６へ挿入させる。次いで、図２１の２１０１１の中央に示すように、押圧ピン６５が貫通孔６６を貫通すると、押圧ピン６５が環状部材１を下側へ向かって押圧する。最後に、図２１の２１０１１の右側に示すように、押圧ピン６５が環状部材１を下側へ向かって更に押圧することによって、土台３と環状部材１との係止が解除されて土台３と環状部材１とが離間し、その結果、筒状載置部３ｂと環状部材１とにより挟持されているメッシュシート２（具体的には、メッシュシート２の周縁）が取り外される。

　３．本実施形態に係る細胞シート製造装置の構成例２
　本実施形態に係る細胞シート製造装置の構成例２について、説明する。図６は、構成例２の細胞シート製造装置に備えられた支持体ユニット３０の構成の概略を示す図である。図６の６０１０～６０１３は、支持体ユニット３０の組み立て手順を示す斜視図である。図６の６０２０は、支持体ユニット３０の概略構成を示す断面図である。

　図６の６０１０～６０１３、および６０２０に示されるように、支持体ユニット３０は、メッシュシート２と、一対の枠体３１および３２と、クリップ３３（挟持部材）と、保持部材３４と、スペーサー３５と、を備えている。保持部材３４は、支持体ユニット３０の本体を構成している。メッシュシート２と、一対の枠体３１および３２と、クリップ３３とにより、メッシュ集合体Ａが構成される。

　枠体３１および３２は、メッシュシート２を挟持することにより、メッシュシート２を補強する部材である。枠体３１および３２は、メッシュシート２の周縁を挟むように配置されている。また、枠体３１および３２は、保持部材３４に対して取り外し可能に設けられている。

　また、図６の６０１１に示されるように、クリップ３３は、一対の枠体３１および３２を挟持することによって、メッシュシート２と一対の枠体３１および３２とを一体化させる部材である。このクリップ３３による挟持により、枠体３１および枠体３２は、互いに分離せず、密着した状態で固定される。

　メッシュ集合体Ａは、一対の枠体３１および３２の間にメッシュシート２を配置し、クリップ３３により枠体３１および３２を固定することにより構築される（図６の６０１０～６０１２参照）。

　保持部材３４は、無底筒形状を有している。保持部材３４の内径は、一対の枠体３１および３２の外径よりも大きくなっている。保持部材３４の内壁の互いに対向する２つの部分それぞれには、メッシュ集合体Ａを装着するための装着部３４ａが形成されている。装着部３４ａは、平板部３４ｂおよび平板部３４ｃを有する。平板部３４ｂおよび３４ｃは、互いに離間して、保持部材３４の内壁から内側に水平方向へ突出して設けられている。メッシュ集合体Ａの周縁部分が平板部３４ｂおよび平板部３４ｃの間に挿入されることにより、メッシュ集合体Ａは保持部材３４に装着される。また、保持部材３４の上端には、水平方向に突出したつば３４ｄが形成されている。

　メッシュ集合体Ａが保持部材３４に装着された状態では、メッシュ集合体Ａと平板部３４ｂとの間に隙間がある（図６の６０１３参照）。スペーサー３５は、メッシュ集合体Ａと平板部３４ｂとの間を埋める部材である。このスペーサー３５により、メッシュ集合体Ａは、保持部材３４の装着部３４ａ内での移動が係止される。このため、メッシュ集合体Ａは、保持部材３４内にて安定して保持されることになる。

　また、スペーサー３５には、上方に突出して伸びる摘み３５ａが設けられている。保持部材３４からメッシュ集合体Ａを分離するに際し、使用者は、スペーサー３５の摘み３５ａを摘んで、スペーサー３５を保持部材３４から取り外す。次いで、保持部材３４からメッシュ集合体Ａを分離する。

　図７は、構成例２としての細胞シート製造装置１００Ｃの構成などを示した図である。図７の７０１０～７０１２は、細胞シート製造装置１００Ｃを用いた細胞シートの製造方法を示す図である。また、図７の７０２０～７０２２、７０３０および７０３１は、細胞シート製造装置１００Ｃの効果を説明するための図である。

　細胞シート製造装置１００Ｃを用いた細胞シートの製造方法では、まず、容器２３内に支持体ユニット３０を収容する。このとき、メッシュ集合体Ａが容器２３の底面に最も近くなるように、支持体ユニット３０を配置する（図７の７０１０参照）。

　また、保持部材３４のつば３４ｄの下面は、容器２３の上端面全体に当接している。また、保持部材３４の外径は、容器２３の内径に近い寸法になっている。そして、容器２３に対し保持部材３４が取り外し可能な程度に、保持部材３４の外周面と容器２３の内側面との間にクリアランスが形成されている。このような構成により、支持体ユニット３０は、培地中で鉛直方向および水平方向の位置が一定となるように容器２３に収容される。

　次いで、メッシュシート２上に細胞４を播種する（図７の７０１１参照）。細胞４の播種方法は、細胞シート製造装置１００を用いた方法と同様であるので、説明を省略する。

　次いで、容器２３全体を培地６で満たし、メッシュシート２上に付着した細胞４の培養を行う。これにより、細胞シート２００が作製される。

　次に、細胞シート製造装置１００Ｃの効果について、説明する。上述したように、スペーサー３５を保持部材３４から取り外すことにより、メッシュ集合体Ａは保持部材３４から分離される。分離されたメッシュ集合体Ａは、容易に、上下逆にして保持部材３４に装着することができる。それゆえ、図７の７０２０および７０２１に示されるように、メッシュシート２の上面および下面それぞれに種類の異なる細胞４ａおよび４ｂを播種することができる。さらには、細胞シート２００が形成された後、容易に集合体Ａから細胞シート２００を分離することができる。クリップ３３を取り外すだけで枠体３１および３２は互いに分離しやすくなる。それゆえ、枠体３１および３２を分離すれば、細胞シート２００を容易に取り出すことができる。また、図７の７０３０および７０３１に示されるように、メッシュシート２の両面を顕微鏡７により観察することが可能である。

　また、細胞シート製造装置１００Ｃでは、保持部材３４のつば３４ｄと容器２３の上端面との当接により支持体ユニット３０が容器２３内に保持されている。つば３４ｄは、培地６に接触しない部分である。また、スペーサー３５の摘み３５ａも培地６に接触しない部分である。それゆえ、ピンセットを用いて支持体ユニット３０を別の容器に移動するに際し、ピンセットによりスペーサー３５を上方に移動させることで、ピンセットが培地６に触れることなく支持体ユニット３０を移動することができる。さらに、容器２３の比較的底部に近い位置にて細胞４を培養する場合には、支持体ユニット３０を移動しても細胞４が容器２３に接触することがない。

　なお、容器２３の底面にて細胞４とは異なる細胞を培養した場合であっても、この細胞は、支持体ユニット３０に接触することがない。つまり、細胞シート製造装置１００Ｃにおいて、（ｉ）支持体ユニット３０のメッシュシート２上および（ｉｉ）容器２３の底面に互いに異なる細胞を共培養したとき、容器２３の底面に培養された細胞に支持体ユニット３０は接触しない。さらに、支持体ユニット３０が容器２３の上側からインサートする構造であるため、容器２３に対する支持体ユニット３０の位置が安定する。

　４．本実施形態に係る細胞シート製造装置の構成例３
　本実施形態に係る細胞シート製造装置の構成例３について、説明する。図８は、構成例３の細胞シート製造装置１００Ｄの構成を示す図である。図８の８０１０および８０２０は、細胞シート製造装置１００Ｄに備えられた支持体ユニット４０の構成を示す像である。また、図８の８０３０～８０３３は、細胞シート製造装置１００Ｄを用いた細胞シートの製造方法を示す図である。

　支持体ユニット４０は、ウェル２４（容器）に対して離接可能に収容されるカラムの形態となっている。支持体ユニット４０は、メッシュシート２と、カラム本体４１と、を備えている。カラム本体４１の下面がメッシュシート２によって構成されている。また、カラム本体４１のつば部分をウェル２４に乗せることにより、カラム本体４１は、培地６中で鉛直方向および水平方向の位置が一定となるようにウェル２４に収容される（図８の８０３０参照）。なお、支持体ユニット４０は、例えば、市販のＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）のカラムから多孔質膜を除去し、メッシュシート２を貼り付けることにより作製され得る。

　細胞シート製造装置１００Ｄを用いることにより、作製された細胞シートに対して液相－気相培養を行うことが容易になる。例えば、皮膚シートの製造においては、まず、図８の８０３１に示されるように、メッシュシート２に皮膚線維芽細胞１４を播種し、培地６中で培養する。次いで、図８の８０３２に示されるように、生育した皮膚線維芽細胞１４からなる層の上にさらに角化細胞１３を播種し培地６中で培養することにより、皮膚シートが作製される。図８の８０３３に示されるように、作製された皮膚シートは、皮膚線維芽細胞１４が培地に接し、また、角化細胞１３の一部が気体に接した状態での培養、すなわち、液相－気相培養が可能である。

　５．本実施形態に係る細胞シート製造装置の構成例４
　本実施形態に係る細胞シート製造装置の構成例４について、説明する。図９は、構成例３の細胞シート製造装置１００Ｅの構成を示す図である。図９の９０１０は、細胞シート製造装置１００Ｅに備えられた支持体ユニット５０の構成を示す斜視図である。また、図９の９０１１は、細胞シート製造装置１００Ｅの構成を示す像である。

　図９の９０１１に示されるように、細胞シート製造装置１００Ｅでは、容器として、ウェル２５ａが複数形成されたウェルプレート２６が使用される。図９の９０１１に示された構成では、ウェルプレート２６は、１２穴プレートである。支持体ユニット５０は、このようなウェルプレート２６に対して離接可能に収容される。支持体ユニット５０は、メッシュシート２と、カラム本体５１と、を備えている。

　カラム本体５１は、第１円環部５１ａと、足部５１ｂと、第２円環部５１ｃと、を有している。足部５１ｂは、第１円環部５１ａと第２円環部５１ｃとの間を連結する部分である。第１円環部５１ａと第２円環部５１ｃとは、中心軸が一致するように配置されている。

　第１円環部５１ａの外径は、ウェルプレート２５のウェル２５ａの内径よりも大きくなっている。また、第２円環部５１ｃの内径は、第１円環部５１ａの内径よりも小さくなっている。第２円環部５１ｃの底部は、メッシュシート２により閉塞している。

　細胞シート製造装置１００Ｅにおいては、カラム本体５１の第１円環部５１ａをウェル２５ａに乗せることにより、カラム本体５１は、培地６中で鉛直方向および水平方向の位置が一定となるようにウェル２５ａに収容される。また、細胞の懸濁液は、第２円環部５１ｃの内側面および足部５１ｂの内側面とメッシュシート２とにより形成された空間に注入される。

　また、細胞シート製造装置１００Ｅでは、カラム本体５１の第１円環部５１ａをウェル２５ａに乗せることにより、支持体ユニット５０がウェル２５ａ内に保持されている。第１円環部５１ａは、培地６に接触しない部分である。それゆえ、ピンセットを用いて支持体ユニット５０を別のウェル２５ａに移動するに際し、ピンセットにより第１円環部５１ａを摘まむことで、ピンセットが培地６に触れることなく支持体ユニット５０を移動することができる。さらに、ウェル２５ａの比較的底部に近い位置にて細胞を培養する場合には、支持体ユニット５０を移動しても細胞４がウェル２５ａに接触することがない。なお細胞シート製造装置１００Ｅにおいて、（ｉ）支持体ユニット５０のメッシュシート２上および（ｉｉ）ウェル２５ａの底面に、互いに異なる細胞を共培養したとき、ウェル２５ａの底面に培養された細胞に支持体ユニット５０は接触しない。

　また、細胞シート製造装置１００Ｅでは、メッシュシート２の位置は、第１円環部５１ａおよび足部５１ｂによって安定に保持されている。それゆえ、細胞シート製造装置１００Ｅによれば、ウェル２５ａ内での支持体ユニット５０の鉛直方向および水平方向の位置が、より安定に保持される。

　〔まとめ〕
　上記の課題を解決するために、本発明の一態様に係る細胞シート製造装置は、細胞を培養するための培地を収容する容器と、前記細胞を付着させて培養する基材であるメッシュシートと、当該メッシュシートを前記容器の底面から浮くように保持する保持部材と、を有し、前記容器に離接可能に収容されている支持体ユニットと、を備え、前記支持体ユニットは、前記培地中で鉛直方向および水平方向の位置が一定となるように前記容器に収容されていることを特徴としている。

　上記の構成によれば、前記支持体ユニットは、容器に離接可能に収容されている。このため、使用者は、前記支持体ユニットを、容器から取り出して裏返した後、再び、容器に収容することによって、前記支持体ユニットを容易に裏返しにすることができる。前記支持体ユニットが裏返ると、前記支持体ユニットの保持部材に保持されたメッシュシート上に形成された細胞シートも裏返る。それゆえ、上記の構成によれば、前記メッシュシート上に形成された細胞シートの両面を顕微鏡で容易に観察することができる。

　さらに、支持体ユニットは、培地中で鉛直方向および水平方向の位置が一定となるように容器に収容されているので、顕微鏡による細胞シートの観察中に、メッシュシートの容器内の位置、換言すれば、メッシュシート上に形成された細胞シートの位置が、変化することがない。それゆえ、上記の構成によれば、細胞シートを精密に観察することができる。

　本発明の一態様に係る細胞シート製造装置では、前記保持部材は、前記メッシュシートを取り外し可能に保持することが好ましい。

　上記の構成によれば、前記メッシュシート上に形成された細胞シートを容易に支持体ユニットから分離することができる。

　本発明の一態様に係る細胞シート製造装置では、前記保持部材には、前記メッシュシートを載置する筒状載置部が形成されており、前記支持体ユニットは、前記筒状載置部の外周を取り囲む形状を有し、前記保持部材に対して取り外し可能に設けられた、環状部材を備え、前記メッシュシートの周縁は、前記筒状載置部と前記環状部材とにより挟持されていることが好ましい。

　上記の構成によれば、環状部材を保持部材に取り付けることによって、メッシュシートの周縁を筒状載置部と環状部材とにより挟持させ、これによってメッシュシートを筒状載置部に安定的に載置することができる。一方、環状部材を保持部材から取り外すことによって、筒状載置部と環状部材とにより挟持されているメッシュシートの周縁を解放し、これによって筒状載置部に載置されたメッシュシートを容易に取り外すことができる。

　本発明の一態様に係る細胞シート製造装置では、前記保持部材および前記環状部材の少なくとも一方には、前記保持部材と前記環状部材とが分離しないように係止する係止部が形成されており、前記保持部材および前記環状部材の何れか一方には、他方を押圧する押圧ピンを貫通させるための貫通孔が形成されており、前記他方の押圧により前記係止が解除され、前記保持部材と前記環状部材とが離間することが好ましい。

　上記の構成によれば、貫通孔に押圧ピンを挿入し、前記保持部材または前記環状部材を、押圧ピンにて押圧することにより、保持部材と環状部材との係止が解除され、これによって筒状載置部に載置されたメッシュシートを容易に取り外すことができる。

　本発明の一態様に係る細胞シート製造装置では、前記支持体ユニットは、前記保持部材に対して取り外し可能に設けられ、前記メッシュシートの周縁を挟むように配された一対の枠体と、前記一対の枠体を挟持することによって、前記メッシュシートと前記一対の枠体とを一体化させる挟持部材と、を備えていることが好ましい。

　上記の構成によれば、メッシュシートの周縁を挟むように配された一対の枠体が保持部材に対して取り外し可能に設けられているので、一対の枠体を保持部材から分離することによって、一対の枠体に保持された前記メッシュシートを容易に取り外すことができる。

　本発明の一態様に係る細胞シート製造装置では、前記保持部材は、前記培地よりも比重が大きいことが好ましい。

　上記の構成によれば、保持部材は、培地よりも比重が大きいので、培地中での、保持部材、および、保持部材に保持されたメッシュシート上に形成された細胞シートの鉛直方向および水平方向の位置が安定に維持される。

　本発明の一態様に係る細胞シート製造装置では、前記支持体ユニットは、前記メッシュシートの一方の面を覆う蓋体であって、前記細胞を含む懸濁液を前記メッシュシートと前記蓋体との間に注入する注入口が設けられた蓋体を備え、前記懸濁液が前記メッシュシートと前記蓋体との両方に接触しながら前記メッシュシートと前記蓋体との間に注入されるように、前記蓋体と前記メッシュシートとの間隔が設定されていることが好ましい。

　上記の構成によれば、懸濁液がメッシュシートと蓋体との両方に接触しながらメッシュシートと蓋体との間に注入されるように、蓋体とメッシュシートとの間隔が設定されている。この場合、細胞を含む懸濁液がメッシュシートを通過してメッシュシートの下側へ移動することを抑制しながら、当該懸濁液を横方向へ広げることができる。それゆえ、メッシュシートの面積を大きくしても、細胞を含む懸濁液をメッシュシート上に均一に広げることができ、大面積のメッシュシートを用いた細胞培養を容易に行うことができる。

　本発明の一態様に係る細胞シート製造装置では、前記メッシュシートの開口部は、一方向に伸長した形状であることが好ましい。

　上記の構成のようにメッシュシートの開口部が一方向に伸長した形状である場合、開口部は、一方向へ長く伸びた大きな壁面を有することになる。当該壁面に接着して増殖する細胞の数は多く、かつ、同様の配向性を有して増殖するので、上記の構成によれば、増殖する細胞の配向性を開口部の伸長方向へ制御することができる。

　本発明の一態様に係る細胞シートは、細胞層を少なくとも２つ有し、前記２つの細胞層の間に、細胞を付着させて培養する基材であるメッシュシートが配されたことを特徴としている。

　上記の構成によれば、細胞シートの厚さを十分に確保でき、細胞シートの強度を向上させることができる。また、上記の構成によれば、複数種類の細胞層を有する細胞シートを提供することができる。

　〔実施例１：構成例１の細胞シート製造装置を用いた細胞培養〕
　＜支持体ユニット１０の作製＞
　１２穴プレートに収容される土台３の設計図を作成し、当該設計図を基に、３ＤプリンタＡＧＩＬＩＳＴＡ－３２００（キーエンス）を用いて土台３を作製した。ラボコータ　ＰＤＳ－２０１０（日本パリレン）を用いて、生体適合性に優れたパリレン（ＤＰＸＣ，　ＣＡＳ　Ｎｏ．２８８０４－４６－８）（日本パリレン）で３Ｄプリント造形物（土台３）を被覆した。メッシュシート２は、ポリエステル製マイクロメッシュシート（ＡＧ００Ｚ３Ｎ９）（天池合繊）を使用した。

　また、環状部材１は、ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）（商品名：ＳＩＬＰＯＴ　１８４，東レ・ダウコーニング）からなる２ｍｍの板を用いて作製した。２ｍｍのＰＤＭＳ板の作製方法は、次の通りである。まず、主剤と硬化剤とを１０：１の比率で混合させたＰＤＭＳ溶液を厚さ２ｍｍになるようにディッシュに流し込み、その後、加熱し硬化させた。完成した厚さ２ｍｍのＰＤＭＳ板に対して、直径８ｍｍおよび直径６ｍｍの２つの生検トレパン（カイインダストリーズ）を用いて、リング（外径８ｍｍ、内径６ｍｍ）を作製した。

　上記のように作製した環状部材１、メッシュシート２、および土台３を７０％エタノールで洗浄し風乾した後、クリーンベンチの中で組み立て、支持体ユニット１０を完成させた。完成した支持体ユニット１０に対してＵＶ処理を３０分間行った後、１２穴プレートの各ウェルへ支持体ユニット１０を収容した。

　＜細胞培養条件＞
　ヒト肺由来正常線維芽細胞であるＴｉｇ－１－２０細胞（製品番号　ＪＣＲＢ０５０１）はＪＣＲＢ細胞バンク（大阪）から入手した。１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）（ＧＩＢＣＯ）と１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬペニシリンと１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ）とを含有したＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）（ＧＩＢＣＯ）を用いて、Ｔｉｇ－１－２０細胞を培養した。Ｔｉｇ－１－２０細胞は、３７℃、５％二酸化炭素（ＣＯ_２）条件下のインキュベータ内で培養した。

　ＨｅｐＧ２細胞（製品番号ＲＣＢ１８８６）は、理化学研究所バイオリソースセンター（ＲＩＫＥＮ　ＢＲＣ）から入手した。１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）（ＧＩＢＣＯ）と１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬペニシリンと１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ）とを含有したＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）（ＧＩＢＣＯ）を用いて、ＨｅｐＧ２細胞を培養した。（製品番号ＲＣＢ１８８６）は、理化学研究所バイオリソースセンター（は、３７℃、５％二酸化炭素（ＣＯ_２）条件下のインキュベータ内で培養した。

　ヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞（Ｈｕｍａｎ　Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ　ｆｒｏｍ　Ａｄｉｐｏｓｅ　Ｔｉｓｓｕｅ）は、Ｐｒｏｍｏ　Ｃｅｌｌ社から購入した。間葉系幹細胞増殖培地２（Ｐｒｏｍｏ　Ｃｅｌｌ社）を用いて、ヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞を培養した。ヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞は３７℃、５％二酸化炭素（ＣＯ_２）条件下のインキュベータ内で培養した。

　＜細胞播種と顕微鏡観察＞
　支持体ユニット１０のメッシュシート２（直径４ｍｍ円領域）上に、０．５×１０^５個（１×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬを５０μＬ）のＴｉｇ－１－２０細胞、ＨｅｐＧ２細胞、または間葉系幹細胞を播種した。播種５時間後に、支持体ユニット１０が入ったウェルへ培地３ｍＬを加えた。培地は、３日に１度交換した（３ｍＬ／ｗｅｌｌ）。デジタル顕微鏡もしくは倒立位相差顕微鏡を用いて、細胞の写真を撮った。

　１６日間培養した、Ｔｉｇ－１－２０細胞シート、ＨｅｐＧ２細胞シート、および間葉系幹細胞シートを、光干渉式断層撮像システムＣｅｌｌ３ｉｍａｇｅｒ　Ｅｓｔｉｅｒ（ＳＣＲＥＥＮホールディングス）を用いて解析した。

　Ｔｉｇ－１－２０細胞に関しては、細胞播種の前にメッシュシート２をコラーゲン溶液で被覆した。より具体的には、コラーゲン酸性溶液Ｉ－ＡＣ　５ｍｇ／ｍＬ（高研）を１ｍＭ　ＨＣｌ溶液で１５倍希釈し、その希釈済コラーゲン溶液５０μＬをメッシュシート２の上に乗せた。そして、３７℃で３０分間静置した後、希釈済コラーゲン溶液を除去した。そして、ＰＢＳ（－）で２回洗浄し、細胞播種時まで３７℃インキュベータ内で保管した。

　＜結果＞
　図１０の１０１０は、細胞播種１日後の支持体ユニット１０の顕微鏡画像である。５０μＬの細胞懸濁液はしっかりとメッシュシート２上に保持されていた（左図）。泡が隙間に生じるなどのトラブルが起きることなく、培地をウェルへ加えることができた（中央図）。さらに、支持体ユニット１０を上下逆に裏返すこともできた（右図）。

　メッシュシート２の上で、Ｔｉｇ－１－２０細胞、ＨｅｐＧ２細胞、および間葉系幹細胞を培養できることを確認した（図１０の１０１１）。Ｔｉｇ－１－２０細胞は、メッシュシート２への接着が弱いため、メッシュシート２をコーティング溶液で被覆した。コラーゲン溶液でコーティングすることにより、５時間後に培地を添加しても細胞シートがメッシュから離れることが無いことが確認された。

　また、１６日間培養した、Ｔｉｇ－１－２０細胞シート、ＨｅｐＧ２細胞シート、および間葉系幹細胞シートを光干渉式断層撮像システムで解析した結果を図１１に示す。図１１に示されるように、Ｔｉｇ－１－２０細胞シート表面と間葉系幹細胞シート表面とは平たんであったのに対し、ＨｅｐＧ２細胞シートは平たんでないことが分かった。片側からの光干渉式断層撮像システム解析では、ＨｅｐＧ２細胞シートおよび間葉系幹細胞シートは、メッシュシート２平面辺りまでは綺麗に解析できた。Ｔｉｇ－１－２０細胞シートはそれらの細胞シートよりも薄かったため、片側からの観察により細胞シート表面が解析できた（図１１）。

　〔実施例２：構成例１の細胞シート製造装置を用いた３種類の細胞からなる細胞シートの作製〕
　＜細胞培養条件＞
　細胞培養条件は実施例１と同じである。

　＜支持体ユニット１０のメッシュシート２上への細胞播種＞
　支持体ユニット１０（１２穴ウェル用）のメッシュシート２をコラーゲンでコーティングした。その後、このメッシュシート２に対して、ＣｅｌｌＢｒｉｔｅ　Ｇｒｅｅｎ　Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ－Ｌａｂｅｌｉｎｇ　Ｋｉｔ（８０倍希釈；Ｂｉｏｔｉｕｍ，Ｉｎｃ．）で染色したＴｉｇ－１－２０細胞を４×１０^５個（１ｘ１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍＬを４０μＬ）播種した。５時間後、ウェルにＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地を３ｍＬ加えた。２日後、Ｔｉｇ－１－２０細胞の上から、ＣｅｌｌＢｒｉｔｅ　Ｒｅｄ　Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ－Ｌａｂｅｌｉｎｇ１２０倍希釈；Ｂｉｏｔｉｕｍ，Ｉｎｃ．）Ｋｉｔで染色した間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を４×１０^５個（１．６×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍＬを２５μＬ）播種した。そして、培地は、間葉系幹細胞用培地に置換した。翌日、支持体ユニット１０を上下逆に裏返し（逆に設置し）、Ｔｉｇ－１－２０細胞の上から０．０２５ｍｇ／ｍＬ　ＤｉＩ（１，１’－ｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌ－３，３，３’，３’－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｉｎｄｏｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ　ｐｅｒｃｈｌｏｒａｔｅ）で染色したＨｅｐＧ２細胞を４×１０^５個（１．６×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍＬを２５μＬ）播種した。翌日、ＰＢＳ（－）で細胞を洗浄し、４％ＰＦＡに浸し室温で５０分間静置した。ＰＢＳ（－）で洗浄後、封入剤ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ　（ＶＥＣＴＯＲ）と共に細胞シートをカバーガラスとスライドガラスの間に固定した。詳細には、カバーガラスにより細胞シートが潰れるのを防ぐために、約１００ミクロンの厚さのカプトンテープを３枚重ねたものをカバーガラスとスライドガラスの間に置いた。固定した細胞シートを共焦点顕微鏡ＬＳＭ　８００（ＺＥＩＳＳ）で解析した。

　＜結果＞
　図１２の１２１０～１２１２は、本実施例の結果を示す。図１２の１２１０～１２１２に示されるように、Ｔｉｇ－１－２０細胞シートの上に間葉系幹細胞シートを作製することができた。さらに、Ｔｉｇ－１－２０細胞シートの下にＨｅｐＧ２細胞シートを作製することができた。全体的な細胞シートの厚さは、約１４０－１５０μｍほどだった。この結果、（ｉ）支持体ユニット１０の上下の両側から細胞を播種できること、（ｉｉ）複数種類の細胞から成る細胞シートを作製できることが示された。

　〔実施例３：構成例２の細胞シート製造装置を用いたヒト皮膚線維芽細胞の培養〕
　＜支持体ユニット３０の作製＞
　支持体ユニット３０のメッシュシート２以外の各種部材は、３ＤプリンタＡＧＩＬＩＳＴＡ－３２００を用いて作製した。作製した上記各種部材は、パリレン（ＤＰＸＣ，　ＣＡＳ　Ｎｏ．　２８８０４－４６－８）で被覆した。メッシュシート２は、ポリエステル製マイクロメッシュシート（ＡＧ００Ｚ３Ｎ９）（天池合繊）を使用した。対照群として、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）に使用されていた多孔膜（トランズウェルポリカーボネートメンブレン、０．４μｍ　ｐｏｒｅ　ｓｉｚｅ、コーニング社）をメッシュシート２の代わりに装着した支持体ユニット３０も作製した。

　＜細胞培養条件＞
　正常ヒト成人皮膚線維芽細胞（Ｎｏｒｍａｌ　Ｈｕｍａｎ　Ｄｅｒｍａｌ　Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ：ＮＨＤＦ）は、Ｐｒｏｍｏ　Ｃｅｌｌ社から購入し、線維芽細胞増殖培地２（Ｐｒｏｍｏ　Ｃｅｌｌ社）を用いて培養した。正常ヒト成人皮膚線維芽細胞は、３７℃、５％二酸化炭素（ＣＯ２）条件下のインキュベータ内で培養した。

　＜細胞播種と顕微鏡観察＞
　ＮＨＤＦを１．６５×１０^６個（３×０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬを５５０μＬ／シート）で支持体ユニット３０のメッシュシート２に播種した。約１８時間後に培地を加えた。３日に１回培地交換を行い、１４日間培養した（６ｍＬ／ｗｅｌｌ）。細胞の倒立位相差顕微鏡画像（図１１Ａ）を撮った。また、ＨＥ染色切片を作製し（新組織科学）、細胞シートの断面図をＢＺ－Ｘ７１０　Ａｌｌ－ｉｎ－ｏｎｅ（キーエンス）を用いて撮影した（図１３の１３１１）。

　＜結果＞
　結果を図１３の１３１０および１３１１に示す。ＮＨＤＦはメッシュシート２の目開きを埋める形で存在し、メッシュシート２のメッシュ糸を覆うように存在していた。メッシュシート２で作製した細胞シートと多孔膜で作製した細胞シートとの両方とも、細胞シート表面は均一で滑らかであった。メッシュシート２で作製した細胞シートは、多孔膜で作製した細胞シートと異なり細胞シートの下面は細胞が露出している。このため、栄養の供給や細胞観察に優れるとともに、移植医療の際の細胞シートの貼付にも優れていると考えられた。

　〔実施例４：構成例２の細胞シート製造装置を用いたＴｉｇ－１－２０細胞の培養〕
　＜支持体ユニット３０の作製＞
　本実施例の支持体ユニット３０の作製方法は、実施例３と同じである。しかし、本実施例の支持体ユニット３０は、保持部材３４の構造のみが実施例３と一部異なる。本実施例では、保持部材３４には、外側から内側へ培地を流れやすくするための空隙がない（図１４の１４１０参照）。

　また、Ｔｉｇ－１－２０細胞の培養条件（培地の組成）は実施例１と同じである。しかし、本実施例では、メッシュシート２のコーティングはしていない。

　＜Ｔｉｇ－１－２０細胞の播種と顕微鏡観察＞
　ＣｅｌｌＢｒｉｔｅ　Ｇｒｅｅｎ　Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ－Ｌａｂｅｌｉｎｇ　Ｋｉｔ　（１００倍希釈；　Ｂｉｏｔｉｕｍ，　Ｉｎｃ．）で染色した、あるいは染色していない４×１０^６個（８×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬを５００μＬ／ｍｅｓｈ）のＴｉｇ－１－２０細胞を、＜支持体ユニット３０の作製＞にて作製した支持体ユニット３０のメッシュシート２上に播種した。そして、１７時間後に６ｍＬの培地をウェルに加えた。その３日後に１度培地交換を行った。培養開始６日目に、作製した細胞シートを洗浄し、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で細胞を固定し、洗浄後にＤＡＰＩ（４’，６－ｄｉａｍｉｄｉｎｏ－２－ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ）を含む封入剤ＶＥＣＴＡ中に固定した。共焦点顕微鏡ＬＳＭ　８００（ＺＥＩＳＳ）を用いて固定した細胞シートを解析した。一方で、４％ＰＦＡと１％ホルムアルデヒドとにより固定した蛍光染色していない細胞シートのＨＥ染色切片を作製し（新組織科学）、断面図をＢＺ－Ｘ７１０　Ａｌｌ－ｉｎ－ｏｎｅ　（キーエンス）で撮影した。

　＜ヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞の播種と顕微鏡観察＞
　上記の実験にて解析に用いなかったＴｉｇ－１－２０細胞シート（６日間培養）の上からヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞を追加で播種するために、ウェル内の培地を４ｍＬのＭｉｒａＣｅｌｌ　ＣＭ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｍｅｄｉｕｍに置換した。０．０２５　ｍｇ／ｍＬ　ＤｉＩ（１，１’－ｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌ－３，３，３’，３’－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｉｎｄｏｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ　ｐｅｒｃｈｌｏｒａｔｅ）で染色した１．８×１０^５個のヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞を播種した。約１６時間後に２ｍＬの培地を追加した。その後、Ｔｉｇ－１－２０細胞と共に３日間培養し、上記と同様に細胞を固定し、共焦点顕微鏡で解析した。

　＜結果＞
　結果を図１４の１４２０～１４２３に示す。図１４の１４２０に示すように、Ｔｉｇ－１－２０細胞はマイクロメッシュシートの目開きの形に従って配向していた。すなわち長方形の目開きの長辺に対してほぼ平行に配向していた。マイクロメッシュシート平面以外の場所にある細胞、すわなち、マイクロメッシュシート平面の上もしくは下の平面にある細胞も、マイクロメッシュシート平面にある細胞と同じ方向に配向していた。細胞シートの厚さは５０μｍほどだった（図１４の１４２１）。また、ヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞をＴｉｇ－１－２０細胞シートの上から追加で播種した結果、心筋細胞もＴｉｇ－１－２０細胞と同じ方向へ配向した。これらの結果から、マクロメッシュシートを用いた細胞培養を行うことにより３次元細胞シートの配向性を制御できる場合があることが示された（図１４の１４２２および１４２３）。

　〔実施例５：変形例２の細胞シート製造装置を用いたＴｉｇ－１－２０細胞の培養〕
　＜方法＞
　＜支持体ユニット１０Ｂの作製および細胞培養条件＞
　環状部材１および土台３は、３ＤプリンタＡＧＩＬＩＳＴＡ－３２００を用いて作製した。そして、パリレン（ＤＰＸＣ，　ＣＡＳ　Ｎｏ．２８８０４－４６－８　）により、作製した環状部材１および土台３を被覆した。メッシュシート２は、ポリエステル製マイクロメッシュシート（ＡＧ００Ｚ３Ｎ９）（天池合繊）を使用した。メッシュシート２を環状部材１と土台３とにより挟み、ＰＤＭＳ溶液を用いて接着させた。完成した支持体ユニット１０Ｂに対してエタノール処理およびＵＶ処理を行った後、支持体ユニット１０Ｂを１０ｃｍのディッシュ２２に入れた。実験に使用した支持体ユニット１０Ｂにおいて、１ｍｍのＰＤＭＳ板を用いてディッシュ２２の底面からメッシュシート２までの距離を調節し、２．５ｍｍになるようにした（図１５の１５１０）。

　Ｔｉｇ－１－２０細胞の培養条件（培地の組成）は、実施例１と同様であるが、メッシュシート２のコーティングはしていない。

　＜Ｔｉｇ－１－２０細胞の播種と顕微鏡観察＞
　最初に、３ｍＬのＴｉｇ－１－２０細胞（６ｘ１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）をメッシュシート２の上に乗せた。その後、上から蓋体９を乗せた。そして、蓋体９の注入口９ａから５ｍＬの細胞懸濁液を加え、蓋体９とメッシュシート２との間隙を細胞懸濁液で充填した。細胞播種の３日後、支持体ユニット１０Ｂが入った１０ｃｍのディッシュ２２に２５ｍＬの培地を加えた後で、蓋体９を除去した。３日に１度培地交換を行い（３５ｍＬ培地／ディッシュ）、細胞播種から１４日後に培養を終了した。

　図１５の１５１１に示されるように、ナイフを用いて支持体ユニット１０Ｂから細胞シートを切り取った。切り取った細胞シートの一部をｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒｅｄ　ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）（－）で洗浄後、４％ＰＦＡで２０分間処理し、ＤｉＩで染色した（３７℃、１時間）。ＰＢＳ（－）で洗浄後、ＤＡＰＩを含んだ封入剤ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ（ＶＥＣＴＯＲ）と共に細胞シートをカバーガラスとスライドガラスとの間に固定した。固定した細胞シートを共焦点顕微鏡ＬＳＭ　８００（ＺＥＩＳＳ）で解析した。

　支持体ユニット１０Ｂにより作製した細胞シートの一部は、ＰＢＳ（－）で洗浄後、４％ＰＦＡで２０分間処理して固定した。次に、５０％，５５％，６０％，６５％，７０％，７５％，８０％，８５％，９０％，９５％，約１００％のエタノールで各５分間処理し、その後風乾した。そして、低真空走査電子顕微鏡Ｍｉｎｉｓｃｏｐｅ　ＴＭ３０３０Ｐｌｕｓ　（日立）を用いて細胞シートを観察した。

　支持体ユニット１０Ｂで培養した細胞シートを構成している細胞の生存率を調べた。支持体ユニット１０Ｂから切り取った細胞シートの約半分をＰＢＳ（－）で洗浄し、０．０５％トリプシン－ＥＤＴＡで７分間処理し（３７℃）、トリプシンを除去後、培地１０ｍＬに懸濁した。細胞の生存率は、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ　ＩＩ　Ａｕｔｏｍａｔｅｄ　Ｃｅｌｌ　Ｃｏｕｎｔｅｒ　（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて計測した。

　＜結果＞
　結果を、図１５の１５１２、図１６の１６１１および１６１２、並びに図１７の１７１１および１７１２に示す。支持体ユニット１０Ｂを用いてＴｉｇ－１－２０細胞を１４日間培養した（図１５の１５１２）。共焦点顕微鏡で細胞シートの断面を解析した結果、厚さはおよそ４０－４５μｍであった（図１６の１６１１および１６１２）。Ｔｉｇ－１－２０細胞は、メッシュシート２の目開きの形に従って配向していた。すなわち、長方形の目開きの長辺に対してほぼ平行に配向していた。メッシュシート２の平面に無い細胞も、同じ方向に配向していた。

　電子顕微鏡で細胞シートを観察するために細胞シートをエタノール処理した。この処理により細胞シートが収縮し薄くなってしまった可能性があるが、メッシュシート２の開口部を細胞が隙間なく埋めていることが確認された（図１７の１７１１）。トリプシン－ＥＤＡＴ溶液とトリパンブルー溶液を用いて、支持体ユニット１０Ｂで作製した３次元細胞シートを構成している細胞の生存率を調べた結果、約９２％の細胞が生存していることが分かった図１７の１７１２。すなわち、３次元培養であっても多くの細胞が生存していた。

　〔実施例６：構成例４の細胞シート製造装置を用いたＨｅｐＧ２細胞の培養〕
　＜方法＞
　＜支持体ユニット５０の作製＞
　支持体ユニット５０のカラム本体５１は、３ＤプリンタＡＧＩＬＩＳＴＡ－３２００を用いて作製した。そして、パリレン（ＤＰＸＣ，　ＣＡＳ　Ｎｏ．２８８０４－４６－８）により、作製したカラム本体５１を被覆した。メッシュシート２は、ポリエステル製マイクロメッシュシート（ＡＧ００Ｚ３Ｎ９）（天池合繊）を使用した。ＰＤＭＳ溶液を用いてメッシュシート２をカラム本体５１に接着させた。完成した支持体ユニット５０をエタノール処理し風乾した後、ウェルプレート２５（１２穴プレート）のウェル２５ａへ入れてＵＶ処理を行った。

　＜細胞培養条件＞
　ＨｅｐＧ２細胞（製品番号ＲＣＢ１８８６）は、理化学研究所バイオリソースセンター（ＲＩＫＥＮ　ＢＲＣ）から入手した。１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）（ＧＩＢＣＯ）と１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬペニシリンと１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ）とを含有したＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）（ＧＩＢＣＯ）を用いて、ＨｅｐＧ２細胞を培養した。細胞は３７℃、５％二酸化炭素（ＣＯ_２）条件下のインキュベータ内で培養した。

　＜細胞播種および細胞観察＞
　１×１０^５個（２×ｘ１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ×５０μＬ／ｍｅｓｈ）のＨｅｐＧ２細胞を支持体ユニット５０のメッシュシート２上（φ４ｍｍの円）に播種した。細胞播種の６時間後に、ウェル２５ａに培地を２ｍＬ加えた。培地は２日に１度交換した（２ｍＬ／ｗｅｌｌ）。コントロールとして、１×１０^５個のＨｅｐＧ２細胞をウェルプレート２５（１２穴プレート）のウェル２５ａへ播種した。

　＜遺伝子発現解析＞
　培養開始から１０日目にＨｅｐＧ２細胞からＲＮＡを抽出した。ＲＮＡの抽出はＴＲＩｚｏｌ　ＲＮＡ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて行い、抽出したＲＮＡとＲｅｖｅｒＴｒａ　Ａｃｅ　ｑＰＣＲ　ＲＴ　Ｋｉｔ（東洋紡）を用いてｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡサンプル、ＤＮＡプライマー、ＰｏｗｅｒＵｐ　ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（ＡＰＰＬＩＥＤ　ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ）、およびＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ　５　Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ（ＡＰＰＬＩＥＤ　ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ）を用いて遺伝子発現解析を行った。ヒト肝臓の成熟マーカーとして知られているアルブミンおよび薬物代謝酵素ＣＹＰ１Ａ２の遺伝子の発現レベルを解析した。各遺伝子の発現レベルは、ハウスキーピング遺伝子として知られている１８ＳｒＲＮＡの発現レベルを用いて標準化した。値は平均±ＳＥ（Ｎ＝３）。

　＜結果＞
　図１８の１８１０にＨｅｐＧ２細胞の顕微鏡画像を示す。ＨｅｐＧ２細胞は６時間以内にメッシュシート２に接着した。図１８の１８１１に遺伝子発現解析の結果を示す。ＨｅｐＧ２細胞を通常のウェル（２Ｄ）上で培養した時と比較して、支持体ユニット５０のメッシュシート２上（Ｍｅｓｈ）で培養をした時の方がアルブミンおよびＣＹＰ１Ａ２の遺伝子の発現量が高かった。

　〔実施例７：構成例４の細胞シート製造装置を用いたヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞の培養〕
　＜方法＞
　＜細胞培養条件＞
　ヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞（ＭｉｒａＣｅｌｌ　Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ　ｆｒｏｍ　ＣｈｉＰＳＣ１２，タカラ）は、製品説明書に従ってＭｉｒａＣｅｌｌ　ＣＭ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｍｅｄｉｕｍを用いて３７℃、５％ＣＯ_２存在下で培養した。ヒトフィブロネクチンがコーティングされたディッシュの上で培養した。

　＜細胞播種および細胞観察＞
　細胞播種の前に、支持体ユニット５０のメッシュシート２をヒトフィブロネクチンでコーティングした。ＰＢＳ（＋）で２０倍希釈したフィブロネクチン溶液（最終濃度０．０５ｍｇ／ｍＬ）を調整した。５０μＬの希釈済フィブロネクチン溶液をメッシュシート２の上に乗せて、３７℃で１時間以上静置した。

　フィブロネクチン溶液を除去し、２×１０^４個（４×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ×５０μＬ／ｍｅｓｈ）の心筋細胞を支持体ユニット５０のメッシュシート２上（φ４ｍｍの円）に播種した。６時間後にウェル２５ａに培地を２ｍＬ入れて心筋細胞を培養した。培地交換は２日に１度行った（２ｍＬ／ｗｅｌｌ）。

　＜結果＞
　結果を図１９に示す。支持体ユニット５０のメッシュシート２上に心筋細胞が接着し増殖することを確認した。心筋細胞は８日間培養しても拍動能を保持していた。

　本発明は、再生医療や移植などに使用される細胞シートの作製に利用することができる。

１　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　環状部材
２　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　メッシュシート
３　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　土台（保持部材）
３ｂ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　筒状載置部
４、４ａ、４ｂ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　細胞
９　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　蓋体
９ａ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　注入口
１０、１０Ａ、１０Ｂ、３０、４０、５０、６０　　　　　　　支持体ユニット
２０、２３　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　容器
２１、２４、２５ａ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ウェル（容器）
２２　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ディッシュ（容器）
２５、２６　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ウェルプレート（容器）３１、３２　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　枠体
３３　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　クリップ（挟持部材）
４１、５１　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　カラム本体（保持部材）６５　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　押圧ピン
６６　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　貫通孔
６７　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　係止部
１００、１００Ａ、１００Ｂ、１００Ｃ、１００Ｄ、１００Ｅ　細胞シート製造装置
２００　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　細胞シート

Claims (9)

1. 　細胞を培養するための培地を収容する容器と、
   　前記細胞を付着させて培養する基材であるメッシュシートと、当該メッシュシートを前記容器の底面から浮くように保持する保持部材と、を有し、前記容器に離接可能に収容されている支持体ユニットと、を備え、
   　前記支持体ユニットは、前記培地中で鉛直方向および水平方向の位置が一定となるように前記容器に収容されていることを特徴とする細胞シート製造装置。
2. 　前記保持部材は、前記メッシュシートを取り外し可能に保持することを特徴とする請求項１に記載の細胞シート製造装置。
3. 　前記保持部材には、前記メッシュシートを載置する筒状載置部が形成されており、
   　前記支持体ユニットは、前記筒状載置部の外周を取り囲む形状を有し、前記保持部材に対して取り外し可能に設けられた、環状部材を備え、
   　前記メッシュシートの周縁は、前記筒状載置部と前記環状部材とにより挟持されていることを特徴とする請求項２に記載の細胞シート製造装置。
4. 　前記保持部材および前記環状部材の少なくとも一方には、前記保持部材と前記環状部材とが分離しないように係止する係止部が形成されており、
   　前記保持部材および前記環状部材の何れか一方には、他方を押圧する押圧ピンを貫通させるための貫通孔が形成されており、
   　前記他方の押圧により前記係止が解除され、前記保持部材と前記環状部材とが離間することを特徴とする請求項３に記載の細胞シート製造装置。
5. 　前記支持体ユニットは、
   　前記保持部材に対して取り外し可能に設けられ、前記メッシュシートの周縁を挟むように配された一対の枠体と、
   　前記一対の枠体を挟持することによって、前記メッシュシートと前記一対の枠体とを一体化させる挟持部材と、を備えたことを特徴とする請求項２に記載の細胞シート製造装置。
6. 　前記保持部材は、前記培地よりも比重が大きいことを特徴とする請求項１～５の何れか１項に記載の細胞シート製造装置。
7. 　前記支持体ユニットは、前記メッシュシートの一方の面を覆う蓋体であって、前記細胞を含む懸濁液を前記メッシュシートと前記蓋体との間に注入する注入口が設けられた蓋体を備え、
   　前記懸濁液が前記メッシュシートと前記蓋体との両方に接触しながら前記メッシュシートと前記蓋体との間に注入されるように、前記蓋体と前記メッシュシートとの間隔が設定されていることを特徴とする請求項１～６の何れか１項に記載の細胞シート製造装置。
8. 　前記メッシュシートの開口部は、一方向に伸長した形状であることを特徴とする請求項１～７の何れか１項に記載の細胞シート製造装置。
9. 　細胞層を少なくとも２つ有し、
   　前記２つの細胞層の間に、細胞を付着させて培養する基材であるメッシュシートが配されたことを特徴とする細胞シート。
   
    

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