WO2014058100A1 - 세포가 담지된 생체적합성 고분자-천연생체적합성 재료 하이브리드 구조체 및 그 제조방법 - Google Patents

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WO2014058100A1
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natural
biocompatible polymer
biocompatible material
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김근형
안승현
이형진
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조선대학교산학협력단
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Definitions

  • the present invention relates to a cell-supported biocompatible polymer-natural biocompatible material hybrid structure and a method of manufacturing the same, and the present inventors have a structure in which cells composed of a biocompatible polymer scaffold and a natural biocompatible material support including a cell are printed.
  • the biocompatible polymeric struts and the natural biocompatible struts are stacked in an interdigital manner in each layer to form a three-dimensional shape.
  • the hybrid structure shows a two-phase structure, one of which is a cell-supported natural biocompatible material support, which can support biological activity, and a biocompatible polymer support serves to mechanically support the support on which the cell is supported. .
  • Biomedical constructs have been widely applied to various tissue regeneration. In order to successfully regenerate damaged tissues and organs with transplanted constructs, it is essential to control the pores and microinternal structures of the constructs for cell survival, proliferation and migration [A. Khademhosseini et al. J. Biomater. Sci. Polym. Ed . 2006 , 17 , 1221, SM Lien et al. Acta Biomater . 2009 , 5 , 670, N. Annabi et al. Tissue Eng. Part B. 2010 , 16 , 3711-3]. In particular, pore size, shape, and inter-pore connectivity (permeability) have been major challenges for researchers.
  • the optimal pore size for angiogenesis is 5 ⁇ m
  • the optimal pore size for fibroblast growth is 5-15 ⁇ m
  • 20-125 ⁇ m for adult mammalian skin regeneration 100-400 ⁇ m for bone regeneration, and bone growth.
  • (osteoid ingrowth) suggests 40-100 ⁇ m and hepatocellular internal growth 20 ⁇ m [K. Whang et al., Tissue Eng . 1999 , 5 , 356.
  • Schuurman et al. Proposed a new cell-supporting technique, in which cell-containing alginate was injected between thermoplastic meshes.
  • the manufactured cell support structure is excellent in mechanical flexibility because the mechanical strength can be easily controlled by changing the spatial configuration and orientation of the mesh and / or the thickness of the thermoplastic mesh [W. Schuurman et al., Biofabrication 2011 , 3 , 021001].
  • this technique shows a new paradigm in the manufacture of cell carrier constructs.
  • this technique has a limitation in that internal microporous structure fabrication and cellular activity are limited by a thermoplastic mesh similar to a limited template.
  • Patent No. 1067827 relates to a three-dimensional artificial support and a method of manufacturing the same, and discloses a technique of forming a lattice by alternately stacking a biodegradable synthetic polymer-hydrogel layer.
  • this technique is similar to the schematic diagram of FIG. 5A by stacking synthetic polymers on both sides and injecting hydrogel therebetween. Therefore, the content of the hydrogel in the total artificial support is very limited, since the cells contained in the hydrogel is surrounded by synthetic polymers, there is a problem that the supply of oxygen or nutrients necessary for survival and growth, metabolism of the cells is not smooth. In addition, the mechanical properties of the artificial support are limited.
  • An object of the present invention is to produce a three-dimensional structure on which cells with controllable mechanical properties and microporous structures are carried.
  • the present inventors used a method of combining cell printing and melt-floating methods.
  • a modified cell printing method In order to obtain a pore structure composed of natural biocompatible material struts carrying cells in successive layers, the inventors used a modified cell printing method. This method is complemented by crosslinking methods such as aerosol injection for crosslinking between distributed biocompatible material struts.
  • Biocompatible polymer struts were used to improve the mechanical properties of the structure.
  • the biocompatible polymer struts were interposed between the cells to support the natural biocompatible struts carrying the cells.
  • the spacing between the biocompatible polymer posts or the number of biocompatible polymer posts is adjustable to control the mechanical properties of the structure.
  • the MC3T3-E1 cells which are osteoblast precursor cells, were loaded on the natural biocompatible material struts for the complete state of the cell support construct, and cell viability was measured after constructing the construct. After 25 days of cell culture, cell activity was tested.
  • Hybrid constructs prepared according to the method of the present invention have a 100% pore interconnectivity, which is very advantageous for nutrient, oxygen uptake and growth and waste excretion of cells.
  • the hybrid structure produced according to the method of the present invention can control the mechanical properties of the hybrid structure by controlling the number of biocompatible polymer struts.
  • the cells supported in the hybrid construct prepared according to the method of the present invention proliferated and survived well on the surface of the natural biocompatible material struts, and the metabolic function was increased during the culture period.
  • FIG. 1 is a cell-supported hybrid structure manufacturing process and the prepared cell-supported hybrid structure photograph.
  • (b) a photograph of the surface of the prepared PCL-alginate structure;
  • FIG. 2 shows the effect of manufacturing conditions on structure variables.
  • (a) Graph showing the size of strut when the wt% of CaCl 2 in the injection solution was varied at nozzle outside diameter (310 and 650 ⁇ m), nozzle moving speed 7.5 mm s ⁇ 1 , and constant pressure (210 ⁇ 12 kPa).
  • (b) A graph showing the effect of nozzle size on single column diameter.
  • (c), (d) and (e) are optical images of PCL-only structures, PCL-alginate hybrid structures, and alginate-only structures, respectively, and the upper right photograph is a partial enlarged photograph, and the lower photograph of (d) Is a cross-sectional photograph.
  • 3A is a stress-strain curve for a pure PCL structure and two hybrid structures (PA-1 and PA-2), a pure alginate structure.
  • 3B shows the tensile coefficients for pure PCL structures and two hybrid structures (PA-1 and PA-2), pure alginate structures.
  • 3C is a graph showing the forces (0.2, 0.4, 0.6, 0.8 and 1.0 N) versus strain applied to the pure PCL structure and the two hybrid structures (PA-1 and PA-2).
  • 3D shows von Mises stress versus load (1 N) applied to tensile PCL structures in tensile mode.
  • FIG. 3E shows von Mises stress versus load (1 N) applied to tensile structure in hybrid structure PA-1.
  • FIG. 3F shows von Mises stress versus load (1 N) applied to tensile structure in hybrid structure PA-2.
  • 3G shows the relative tensile modulus for pure PCL structures and two hybrid structures (PA-1 and PA-2).
  • 4A is a surface image of hybrid structure PA-1.
  • (a) is a survival (green) panel
  • (b) is a death (red) panel
  • (c) is an optical image
  • (d) and (e) is a fluorescent image (survival-green, Death-red).
  • (f) and (h) are top, middle and bottom cross sections, respectively.
  • Figure 4b is a comparison of cell viability in different parts of the hybrid construct. (a) surface, (f) top, (g) middle, (h) bottom.
  • Figure 4c is a comparison of cell viability between the PA-1 hybrid structure and the control after 7 days of cell culture.
  • 4D is an optical and fluorescent image of various parts of the hybrid construct PA-1 after cell culture for 25 days.
  • (k) is an optical image
  • (l) and (m) are fluorescence images. In the picture, the nucleus is blue and the F-actin is red. * Indicates P ⁇ 0.05.
  • Figure 5a is a schematic diagram of a natural biocompatible material hybrid structure loaded with a biocompatible polymer-cell prepared according to the prior art. Green indicates biocompatible polymer struts and red indicates natural biocompatible material struts on which cells are supported.
  • Figure 5b is a schematic diagram of a natural biocompatible material hybrid structure loaded with biocompatible polymer-cells prepared by two of various embodiments of the method of the present invention. Green indicates biocompatible polymer struts and red indicates natural biocompatible material struts on which cells are supported.
  • the present invention comprises the steps of (a) dispensing biocompatible polymer struts on a plate to form a strut layer;
  • the present invention relates to a method for preparing a biocompatible polymer-natural biocompatible material hybrid structure in which a cell is supported, wherein the hybrid structure formed after the step (d) is immersed in a crosslinking solution and taken out.
  • the present invention is the biocompatible polymer polyimide (polyimides), polyamix acid (polyamix acid), polycarprolactone (polycarprolactone), polyetherimide (polyetherimide), nylon (nylon), polyaramid (polyaramid), poly Polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone, poly-benzyl-glutamate, polyphenyleneterephthalamide, polyaniline, polyacrylonitrile, Polyethylene oxide, polystyrene, cellulose, cellulose, polyacrylate, polymethylmethacrylate, polylactic acid (PLA), polyglycolic acid (PGA) ), Copolymers of polylactic acid and polyglycolic acid (PLGA), poly ⁇ poly (ethylene oxide) terephthalate-co-butylene terephthalate ⁇ (PEOT / PBT), Polyphosphoester (PPE), polyphosphazene (PPA), polyanhydride (PA), poly (ortho ester; POE ⁇ , poly (propyl
  • the present invention is characterized in that the natural biocompatible material is at least one selected from the group consisting of gelatin, fucoidan, collagen, alginate, chitosan and hyaluronic acid, the cell-supported biocompatible polymer-natural biocompatible material hybrid structure It relates to a manufacturing method.
  • the natural biocompatible material is also referred to as 'hydrogel', which is capable of regulating the growth and function of cells inside the natural biocompatible material strut, converting growth factor- ⁇ (TGF- ⁇ ), bone morphogenetic protein (BMP), Growth factors such as vascular endothelial growth factor (VEGF) or epithelial cell growth factor (EGF) may be embedded and include cells to be regenerated in the natural biocompatible material struts.
  • the cells may include stem cells capable of differentiating into various cells, including various cells such as skin cells, fibroblasts, keratinocytes, bone cells, chondrocytes, blood vessel cells, angiogenic endothelial cells, and neurons.
  • step (c) is to distribute the cell-supported natural biocompatible material struts between one or more biocompatible polymer struts distributed in step (b), A method for producing a polymer-natural biocompatible material hybrid structure.
  • the present invention is characterized in that the cross-linking of the step (c) is carried out using one or more of the cross-linking solution spraying method and the photo-crosslinking method of irradiating UV, cell-supported biocompatible polymer-natural organism A method of making a compliant material hybrid structure.
  • the crosslinking solution is gypsum; Or apatite hydroxide, apatite carbonate, fluoride apatite, chlorine apatite, ⁇ -TCP, ⁇ -TCP, calcium metaphosphate, tetracalcium phosphate, calcium hydrogen phosphate, calcium dihydrogen phosphate, calcium pyrophosphate, calcium carbonate, calcium sulfate, EDC ⁇ 1-ethyl- (3-3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride ⁇ or a solution of at least one mixture selected from salts thereof, wherein the cell-supported biocompatible polymer-natural biocompatible material hybrid structure manufacturing method will be.
  • the present invention is a method of spraying the crosslinking solution by applying ultrasonic waves to the crosslinking solution, a method of spraying the crosslinking solution using an electrospray, a method of aerosolizing and spraying by applying air pressure to the crosslinking solution and crosslinking
  • the present invention relates to a method for producing a cell-supported biocompatible polymer-natural biocompatible material hybrid structure, which is carried out by at least one method selected from aerosolization and spraying by applying heat to a solution.
  • the present invention also relates to a cell-supported biocompatible polymer-natural biocompatible material hybrid structure prepared by the above method and having 100% pore interconnectivity.
  • the present invention also relates to a therapeutic agent for cell or tissue regeneration comprising the biocompatible polymer-natural biocompatible material hybrid structure in which the cells are supported.
  • the present invention is prepared for the bone cell or chondrocyte regeneration comprising a biocompatible polymer-natural biocompatible material hybrid structure that is carried by one or more of the bone cells and chondrocytes and 100% pore interconnectivity prepared by the above method It is about a therapeutic agent.
  • the present invention also relates to a therapeutic agent for skin cell regeneration comprising a biocompatible polymer-natural biocompatible material hybrid structure in which the skin cells are supported and having 100% pore interconnectivity prepared by the above method.
  • the present invention also relates to a therapeutic agent for cell regeneration comprising a biocompatible polymer-natural biocompatible material hybrid structure having vascular cells or angiogenic endothelial cells prepared by the above method and having 100% pore interconnectivity.
  • the present invention further relates to a therapeutic agent for cell regeneration comprising a biocompatible polymer-natural biocompatible material hybrid structure in which a neuron is carried and 100% pore interconnectivity prepared by the above method.
  • the present invention also relates to a therapeutic agent for cell regeneration comprising a biocompatible polymer-natural biocompatible material hybrid structure having stem cells and 100% pore interconnectivity prepared by the above method.
  • the three-dimensional structure for cell or tissue regeneration produced by the present invention may be applied to aged skin, burns, wounds, ulcers or wounded skin, or may be used as artificial dermis for skin cosmetic or cosmetic purposes.
  • the present invention can be used as a skin dressing, skin external preparation or cosmetics containing the artificial dermis.
  • the present invention can be used as artificial skin proliferated by including at least one selected from keratinocytes, angiogenic endothelial cells and stem cells in the artificial dermis, the artificial skin is aged skin, burns, wounds, ulcers or It can be applied to supine skin, or used for cosmetic or cosmetic purposes.
  • the present invention can be used as a skin dressing, external skin preparation or cosmetics including the artificial skin.
  • the dressing material including the skin dressing, may be any material used in the art, including bandages, gauze, sterile packaging materials, hydrogels, hydrocolloids, and similar materials.
  • the structure of the present invention can be used impregnated or covalently attached to the dressing material.
  • the present invention can be used as a topical applicable skin external preparation or cosmetic including a structure. It is possible to prepare an external preparation for skin containing a structure suitable for topical application with or without adding a pharmaceutically acceptable carrier, and can be used for wound healing, tissue regeneration, skin care, cosmetic use, and the like.
  • the therapeutic agent for cell regeneration of the present invention may be formulated by a method known in the pharmaceutical art, and may be mixed with the structure itself or a pharmaceutically acceptable carrier, excipient, etc., and a conventional pharmaceutical agent, for example, liquid, ointment, or emulsion. It can be formulated into various formulations such as gels, creams and pastes.
  • a conventional pharmaceutical agent for example, liquid, ointment, or emulsion. It can be formulated into various formulations such as gels, creams and pastes.
  • the preferred dosage varies depending on the condition and weight of the patient, the extent of the disease or condition, the type and duration of the drug, and may be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the therapeutic agent of the present invention is usually administered at 0.01 to 100 mg / kg, preferably at 0.1 to 100 mg / kg.
  • the carrier is not particularly limited so long as it does not adversely affect the structure and function of the structure, for example, polyols such as water, ethanol, glycerol, propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils, non-toxic glyceryl esters, and mixtures thereof. A solvent containing these is preferable.
  • the present invention also provides a cosmetic composition comprising the structure.
  • Cosmetic composition comprising the structure of the present invention can be easily prepared in any form according to a conventional manufacturing method.
  • the artificial dermis and / or artificial skin of the present invention is contained in a cream base of a general oil-in-water type (O / W) or water-in-oil type (W / O), which contains perfumes, chelating agents, and pigments. While antioxidants, preservatives, etc. may be used as necessary, synthetic or natural materials such as proteins, minerals, vitamins, etc. may be used together for the purpose of improving the properties.
  • the cosmetic of the present invention is added to the pH adjuster, fragrance, emulsifiers, preservatives, etc. as necessary to improve the aging skin by formulating the lotion, gel, water-soluble liquid, cream or essence in the usual cosmetic preparation method, etc. Can be used for
  • the present invention may add various bioactive substances to the structure.
  • the bioactive substance is not particularly limited and may be used as long as it does not negatively affect the adhesion and proliferation of cells in the construct.
  • one or more selected from antibiotics, antiviral agents, antibacterial agents, nucleic acids, peptides and proteins may be added.
  • Antibiotics, antiviral agents, antimicrobials, etc. are used to prevent infection of the structure, and proteins include hormones, cytokines, enzymes, antibodies, growth factors, transcriptional regulators, vaccines, structural proteins, ligand proteins, receptors, cell surface antigens and receptors. Characterized in that it is selected from the group consisting of antagonists.
  • MC3T3-E1 cells were provided by Professor Claudia Fischbach-Teschl (Cornell University, Ithaca, NY, USA).
  • Alginate hydrogels for supporting cells were prepared according to the prior art [24].
  • a non-pharmaceutical grade LF10 / 60 alginate (FMC BioPolymer, Drammen, Norway) of low viscosity and high G content was mixed with PBS to prepare a 3.5 wt% alginate solution.
  • 0.5 wt% CaCl 2 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA
  • CaCl 2 solution 7: 3).
  • Cells were mixed with the alginate solution at a density of 2.65 ⁇ 10 5 ml ⁇ 1 using a three-way stopcock.
  • the cell-alginate mixture was loaded into a syringe.
  • Secondary crosslinking was performed with PBS containing 2 wt% CaCl 2 to completely crosslink the cell-alginate struts in the hybrid construct.
  • PCL struts were heated (130 ° C.) and ejected onto plates and floated at a constant pressure (350 ⁇ 28 kPa) and constant nozzle speed (7.5 mm s ⁇ 1 ) with an outside diameter 350 ⁇ m nozzle. Alginate administration was performed using a nozzle.
  • the alginate solution containing the cells was distributed in a interlocking pattern between PCL struts in successive layers. First, right angled PCL struts were floated on the stage and then alginate struts were floated between the PCL struts. This process was repeated several times to prepare a PCL-alginate hybrid structure.
  • the cell-supported hybrid construct was soaked in 2 wt% CaCl 2 solution for 1 minute to cure the alginate struts in the hybrid construct. The construct was then washed twice with PBS solution. This process is summarized in Table 1.
  • the hybrid structure was cut into small pieces (10 ⁇ 20 mm 2).
  • the uniaxial compression test was performed with a tensile tester (Top-tech 2000, Chemilab, South Korea).
  • the construct was exposed to 0.15 mM calcein AM and 2 mM ethidium homodimer-1 for 45 minutes in an incubator. Stained constructs were analyzed with a microscope (TE2000-S, Nikon, Tokyo, Japan) equipped with a fluorescence microscope aid and a SPOT RT digital camera (SPOT Imaging Solutions, Sterling Heights, MI, USA). Images were captured through the Image J program (NIH, Bethesda, MD, USA) to monitor cell viability and the number of green and red spots was measured. Thus, the cell viability of the alginate construct on which the cells were loaded was determined.
  • the ratio of viable cell number to total cell was calculated using Image J software, and the ratios were normalized to the initial cell viability, ie the value prior to cell-alginate ejection.
  • Initial cell viability was determined using Trypan Blue (Mediatech, Herndon, VA, USA).
  • Hybrid constructs (PA-1) were cultured and maintained in ⁇ -minimal essential medium (Life Science, USA) containing 10% fetal calf serum (GEMINI Bio-PRODUCTS, USA) and 1% antibiotic (Antimycotic; Cellgro, USA). . The construct was incubated at 5% CO 2 , 37 ° C., and the medium was changed every two days.
  • the hybrid construct was analyzed by DAPI (diamidino-2-phenylindole) fluorescence staining to detect cell nuclei in the construct.
  • Paloidine Invitrogen Inc., USA was used to visualize actin cytoskeleton of cells proliferated in the construct. Fluorescence images were obtained using a fluorescence microscope (ZEISS observer. Z1, ZEISS, Germany).
  • Alginate hydrogels are widely used as biomedical constructs for a variety of tissue regeneration, including skin, bone and blood vessels, because of their ability to promote epithelial and granular tissue formation [X. Li et al., Biotechnol. Prog. 2006 , 22 , 1683, T. Hashimoto et al., Biomaterials 2004 , 25 , 1407, E. Alsberg et al., J. Dent. Res . 2001 , 80 , 2025].
  • CaCl 2 solution due to the fast solidifying properties in CaCl 2 solution has been widely used in the manufacture of cell-supported structure.
  • 1 (a) shows the administration of alginate solution between PCL struts.
  • the cell-supported alginate struts were sandwiched between PCL struts and the porous structure was well maintained.
  • the characteristics of the alginate structure on which the cells were loaded were studied using single line patterning. Variables tested were CaCl 2 concentration and nozzle diameter in the spray solution under the same nozzle speed (7.5 mm s-1), pressure (210 ⁇ 12 kPa) and spray rate (1.45 mL / min).
  • the alginate struts were maximally stable when immediate ejection of the ejected alginate struts with the sprayed aerosol.
  • the concentration of the spray solution was selected to 2.5 wt%.
  • the stability of the strut volume is an important process variable in structure design because the pore size affecting various cellular activities is affected by the strut volume. Therefore, the correlation between nozzle size and experimental (especially injection) conditions should be considered.
  • the effect of nozzle size on the resulting alginate strut diameter is shown in FIG. 2 (b).
  • the diameter of the resulting struts increased with increasing nozzle size under the same spray conditions (2.5 wt% CaCl 2 solution, constant spray rate 1.45 mL / min).
  • the alginate single posts were not ejected continuously.
  • the present inventors selected the nozzle diameter of the floating system to be 310 mu m.
  • the construct In order to regenerate bone tissue, the construct must have a proper pore size and 100% pore interconnectivity, resulting in pore structure microvascular induction and bone formation maintained [KS Chan et al., J. Mech. Behav. Biomed. Mater. 2010 , 3 , 584, J. Sanders et al., J. Biomed. Mater. Res. 2002 , 60 , 36]. As previously reported, the optimal pore size in bone tissue regeneration remains a controversial issue. However, we chose a 500 ⁇ m pore size. Pore sizes of 100 to 500 ⁇ m were recommended to allow for cell proliferation and optimal diffusion of nutrients and wastes. Karageorgiou, D. Kaplan, Biomaterials 2005 , 26 , 5474, SM Roosa et al., J. Biomed. Mater. Res. Part A. 2009 , 92 , 359], this pore size was considered appropriate for bone formation.
  • PCL is an aliphatic polyester and one of the most useful synthetic polymers used for bone tissue regeneration due to its high mechanical properties, controllable rate of degradation, minimal toxicity and low immune reactivity.
  • Two different structures (PA-1 and PA-2) were prepared to demonstrate the controllability of the mechanical properties of the structures.
  • 3A shows the stress-strain curves of pure PCL structures, pure alginate structures and hybrid structures at a constant tensile rate of 0.5 mm / s.
  • E P and E A are the coefficients of pure PCL and pure alginate, respectively, and ⁇ P and ⁇ A are the volume fractions of PCL and alginate struts, respectively.
  • PCL and alginate volume fractions were calculated using the number of each post, assuming that each post was a perfect cylinder.
  • the coefficients calculated by simple analysis were 17.1 MPa and 13.1 MPa for PA-1 and PA-2 structures, respectively.
  • the measured coefficient values differed slightly (15.4 MPa and 8.3 MPa for the PA-1 and PA-2 structures, respectively), indicating that (1) the alginate and PCL struts used in the volume fraction calculation were It is derived from the assumption of a perfect cylinder and (2) a perfect bond between the PCL strut and the alginate strut.
  • the hybrid structure was simulated with a linear elastic model with the Young's modulus of single-stranded PCL and alginate in elastic mode, and the Poisson's ratio for each strut was 0.45.
  • Three-charged ANSYS ver. Structure displacements were measured using 11.0 software. In particular, the force applied for Young's modulus was varied from 0.2 to 1N. Structural modeling of the structures was performed with UGX NX 5.0 software.
  • 3C-3F show the force and displacement results of pure PCL structures and hybrid structures (PA-1 and PA-2), respectively (FIG. 3C) and show the distribution of von Mises stress for 1N in elastic mode (FIG. 3C). 3d, 3e, 3f).
  • the coefficient value of the hybrid structure is completely dependent on the PCL strut volume ratio, and the control of the number of struts can control the overall mechanical characteristics of the hybrid structure.
  • Figure 4a shows the micropore structure of the PCL / alginate hybrid structure loaded with MC3T3-E1 cells. To determine the cell viability of the hybrid constructs, the constructs were stained with calcein AM and ethidium homodimer 1, which stained viable and dead cells, respectively.
  • A) and (b) of FIG. 4A show the surface of the hybrid structure, and (c), (d) and (e) show cross-sectional fluorescence images of the hybrid structure. The viable cells were green, and the dead cells were observed in red.
  • FIG. 4A (a) and (d), the bright parts were green, and the bright parts (b) and (e) were red.
  • FIG. 4B cell viability of several regions (parts indicated by white dotted lines in (d) of FIG. 4A) was distinguished (FIG. 4B).
  • the cells in the alginate struts were evenly distributed throughout the entire construct, and the cell viability was similar regardless of the position in the construct.
  • Total average cell viability in alginate struts was 84 ⁇ 7%.
  • FIG. 4a shows that as shown in the point of contact between PCL holding and alginate holding hot PCL landlord may injure heat shock is severe damage to the alginate holding cell when placed on the alginate holding Did.
  • Figure 4d (k) is an optical image after 25 days of cell culture of the hybrid construct (PA-1).
  • the upper right photograph of (k) of FIG. 4D and the upper right photograph of (l) and (m) show stained nuclei (blue: appear as bright spots in black and white) and F-actin (red; in black and white) within the hybrid construct. Light color of the background).
  • the supported cells proliferate well on the surface of the alginate struts, indicating that the printed cells carried in the alginate struts survive well and increase metabolic function during the culture period.
  • cells with extracellular matrix proliferated well and grew between pores, indicating that the microstructure and three-dimensional shape of the hybrid constructs were well maintained during the incubation period. In this way, nutrients and oxygen can be easily transferred through the laminated pore structure.
  • the present inventors have combined the melt-floating method and the modified spraying process to produce cell-supported hybrid structures consisting of PCL struts and cell-supported alginate struts.
  • the resulting hybrid structure has a near pore size and exhibits 100% pore interconnection.
  • This structure has significantly improved mechanical properties compared to pure alginate structures. Improvement in modulus of elasticity can be controlled by the fraction of PCL strut volume in the hybrid structure.
  • MC3T3-E1 cell viability in the hybrid construct was about 84%. After 25 days of cell culture the cells survived and proliferated. Proliferated cells and extracellular matrix occupied the pores of the construct.
  • the present inventors found that the mechanical properties and biological activity can be controlled by appropriately controlling the number of PCL struts and cell-supported alginate struts in the hybrid construct.
  • the cell-supported hybrid construct according to the present invention is expected to extend the application of cell-supported hydrogels used in soft tissue regeneration to the field of hard tissue regeneration.
  • the biocompatible polymer-natural biocompatible material hybrid construct in which the cell of the present invention or the cell produced by the method of the present invention is carried may be a variety of cells such as bone cells, chondrocytes, skin cells, blood vessel cells, nerve cells, stem cells, and the like. It can be formed into a supported structure and used for treating and regenerating tissues of animals and humans.

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Abstract

본 발명자들은 생체적합성 고분자 스캐폴드와 세포를 포함하는천연생체적합성 재료 지주로 이루어진 세포가 프린트된 구조체를 디자인하였다. 생체적합성 고분자 지주와천연생체적합성 재료 지주는 각 층에서 서로 깍지끼우는 방식으로 적층되어 3차원 형상을 이룬다. 제조된 세포 담지 구조체는 잘 제어된 미세구조 (100% 공극 상호연결도)를 나타내는데, 이는 생물학적 기능에 필수적이다. 본 발명의 하이브리드 구조체에 대하여 기계적 성질과 세포생존율을 시험한 결과, 탄성 계수와 최대 강도는 순수 알지네이트 구조체와 비교하여 약 5배 정도 증대되었다. 담지된 세포는 천연생체적합성 재료 지주 전체 및 전 구조체에 골고루 분포하였고, 세포생존율은 약 84%였다. 이러한 결과를 바탕으로 기계적 특성이 개선된 본 발명의 세포 담지 하이브리드 구조체는 연성 조직 및 경성 조직 재생에 매우 유용할 것으로 예상된다.

Description

세포가 담지된 생체적합성 고분자-천연생체적합성 재료 하이브리드 구조체 및 그 제조방법
본 발명은 세포가 담지된 생체적합성 고분자-천연생체적합성 재료 하이브리드 구조체 및 그 제조방법에 관한 것으로서, 본 발명자들은 생체적합성 고분자 스캐폴드와 세포를 포함하는 천연생체적합성 재료 지주로 이루어진 세포가 프린트된 구조체를 디자인하였다. 생체적합성 고분자 지주와 천연생체적합성 재료 지주는 각 층에서 서로 깍지끼우는 방식으로 적층되어 3차원 형상을 이룬다. 이 하이브리드 구조체는 2상 구조를 보이는데, 하나는 세포가 담지된 천연생체적합성 재료 지주로서 이는 생물학적 활성을 지지할 수 있고, 생체적합성 고분자 지주는 세포가 담지된 지주를 기계적으로 지지해주는 역할을 수행한다.
생체의학 구조체들은 다양한 조직재생에 널리 응용되어 왔다. 이식한 구조체로 손상된 조직과 기관을 성공적으로 재생하기 위해서는 세포 생존, 증식 및 이동을 위해 구조체의 공극 및 미세내부구조의 조절이 필수적이다 [A. Khademhosseini et al. J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 2006, 17, 1221, S. M. Lien et al. Acta Biomater. 2009, 5, 670, N. Annabi et al. Tissue Eng. Part B. 2010, 16, 3711-3]. 특히, 공극 크기, 형상 및 공극간 연결성 (투과성)이 연구자들의 주요과제가 되어 왔다. 구조체의 공극 연결성이 낮으면 대량수송 및 영양물질 교환이 잘 이루어지지 않고, 이는 결국 대형 3차원 구조체에서 세포 괴사를 일으키게 된다 [Y. Ling et al., Lab Chip. 2007, 7, 756]. Fidkowski 등에 따르면, 고유한 내부연결 공극이 없으면, 영양분과 산소 전달이 부족하기 때문에 세포침투가 가능한 최대 두께는 150~200 ㎛이라고 한다 [C. Fidkowski et al., Tissue Eng. 2005, 11, 302]. 나아가, 구조체의 적절한 공극 크기와 형태는 구조체의 두께에서 세포의 성장과 침투에 중대한 영향을 미친다. 구조체의 최적 공극 크기는 주요 논쟁분야이다. 몇몇 연구자들은 혈관신생에 최적인 공극 크기는 5 ㎛, 섬유아세포 내부성장에 최적인 공극 크기는 5~15 ㎛, 성인 포유류 피부 재생에는 20~125 ㎛, 뼈 재생에는 100~400 ㎛, 유골 내부성장 (osteoid ingrowth)에는 40~100 ㎛, 그리고 간세포 내부성장에는 20 ㎛라고 제안한다 [K. Whang et al., Tissue Eng. 1999, 5, 356].
구조체의 미세구조와 더불어 기계적 안정성은 구조체 디자인에 있어서 필수적인 변수이다. 특히, 근골격 조직 재생용 구조체의 적절한 기계적 특성은 결정적으로 중요한 요소인데, 이는 낮은 기계적 특성을 갖는 구조체는 주변의 원래 조직 (native tissues)에 의해 쉽게 변형될 수 있기 때문이다. 그 결과로, 구조체 원래의 형상은 장기간의 기능성을 유지할 수 없기 때문이다 [W. Schuurman et al., Biofabrication 2011, 3, 021001]. 이상적인 구조체에 필요한 다양한 요구사항을 만족시키기 위해 염 침출법 (salt-leaching)[X. Huang et al., Tissue Eng. 2007, 13, 2645], 상 분리법 (phase separation)[O. V. Khutoryanskaya et al., Biomacromolecules 2008, 14, 3353], 동결건조법 [M. G. Haugh et al., Tissue Eng. Part C: Meth. 2010, 16, 887], 사진식각법 (photolithography)[M. S. Hahn et al., Biomaterials 2006, 27, 2519], 전기방사법 (electrospinning)[S. A. Sell et al., Tissue Eng. Part A. 2011, 17, 2723, E. Kijenska et al. J. Biomed. Mater. Res. Part B. 2012, 100B, 1093, GH. Kim et al., Macromol. Rapid Commun. 2008, 29, 1577] 및 고형 임의형상 제작법 (solid freeform fabrications; SFFs)[R. Landers et al., J. Mater. Sci. 2002, 37, 3107, S. J. Hollister, Nat. Mater. 2005, 4, 518, L. Moroni et al., Tissue Eng. 2007, 13, 361, G. H. Kim et al., J. Mater. Chem. 2009, 19, 8817]과 같은 미세구조의 구조체를 제조하는 많은 방법들이 있다. 이 방법들 중 고형 임의형상 제작법 (SFFs)은 CAD/CAM 시스템과 적층구조 제조에 있어서 그 역할로 인해 매우 다공성이고 공극 크기를 제어할 수 있는 구조체 제조를 용이하게 한다. 구조체에서 제어된 공극 네트워크는 인비보 이식 동안 적절한 산소 및 양분의 공급을 보장해 준다 [J. Malda et al., Biomaterials 2004, 25, 5773].
최근의 연구에서 바이오프린팅[C. Norotte et al., Biomaterials 2009, 30, 5910, J. J. Ballyns et al., Tissue Eng. Part A. 2008, 14, 1195], 레이저 보조 감광기술[A. Ovsianikov et al., Biomacromolecules 2011, 12, 858, L. Koch et al., Biotechnol. Bioeng. 2012, DOI 10.1002/bit.24455]을 포함하여 고형 임의형상 제작법을 이용한 세포가 담지된 구조체가 조직 재생분야에서 연구되고 있는데, 이는 구조체 전체에 균일한 세포분포를 포함하여 두드러진 장점이 있기 때문이다. 이 방법은 세포가 담지된 구조체를 얻기 위해 성공적으로 채택되었지만, 최종적으로 제조된 구조체의 미세공극 구조 균일성, 사실적 3차원 형상 및 제어 가능한 기계적 특성은 최적은 아니었다. 따라서, 하이드로젤에 기반한 구조체의 이용이 연성조직재생에서부터 경성조직 재생으로까지 확대될 수 있다면, 제어 가능한 기계적 특성 및 3차원 공극을 가진 세포-담지 구조체 제조방법이 요구된다.
이러한 문제점들을 극복하기 위해 Schuurman 등은 새로운 세포담지 기술을 제안했는데, 이것은 세포 함유 알지네이트를 열가소성 메쉬 사이에 주사하는 것이었다. 제조된 세포담지 구조체는 기계적 유연성이 우수한데, 이는 메쉬의 공간구성과 방향 및/또는 열가소성 메쉬의 두께를 변화시킴으로써 기계적 강도를 용이하게 제어할 수 있기 때문이다[W. Schuurman et al., Biofabrication 2011, 3, 021001]. 다양한 세포 타입의 주사와 기계적 개선에 관하여 이 기술은 세포담지 구조체 제조에 새로운 패러다임을 보여준다. 그러나, 이 기술은 내부 미세공극구조 제조 및 세포 활성이 한정된 주형과 유사한 열가소성 메쉬에 의해 한정된다는 한계가 있다.
특허 제1067827호는 3차원 인공지지체 및 그 제조방법에 관한 것으로서, 생분해성 합성 고분자-하이드로겔(hydrogel) 층을 교대로 적층하여 격자 형태로 형성하는 기술을 개시한다. 그러나, 이 기술은 합성고분자를 양측에 적층한 후 그 사이에 하이드로겔을 주입하는 방식으로 도 5a의 모식도와 같다. 따라서, 전체 인공지지체 중 하이드로겔의 함량은 매우 제한적이며, 하이드로겔에 함유된 세포는 합성고분자로 둘러싸여 있으므로, 세포의 생존과 성장, 대사에 필요한 산소나 영양성분 공급이 원활하지 않다는 문제점이 있다. 뿐만 아니라, 인공지지체의 기계적 특성 조절도 제한적이다.
본 발명의 목적은 제어 가능한 기계적 성질과 미세공극 구조를 갖는 세포가 담지된 3차원 구조체를 제조하려는 것이다.
이러한 본 발명의 목적을 달성하기 위해 본 발명자들은 세포 프린팅 및 용융플로팅 방법을 조합하는 방법을 이용하였다. 연속되는 층에서 세포가 담지된 천연생체적합성 재료 지주로 구성된 공극구조를 얻기 위해 본 발명자들은 변형된 세포프린팅 방법을 이용하였다. 이 방법은 분배되는 천연생체적합성 재료 지주 간 교차결합을 위해 에어로졸 분사 등의 가교형성방법으로 보완하였다. 구조체의 기계적 특성을 향상시키기 위해 생체적합성 고분자 지주를 이용하였다. 이 생체적합성 고분자 지주들은 세포가 담지된 천연생체적합성 재료 지주를 지지하기 위해 깍지끼듯 사이사이에 위치하였다. 뿐만 아니라, 생체적합성 고분자 지주 사이의 간격 또는 생체적합성 고분자 지주의 수는 구조체의 기계적 특성을 제어하기 위해 조절 가능하다.
구체적인 실시예에서는 세포담지 구조체의 완전한 상태를 위해, 천연생체적합성 재료 지주에는 골아전구세포인 MC3T3-E1 세포를 로딩하였고 구조체 제조후 세포 생존율을 측정하였다. 세포배양 25일 후, 세포활성을 시험하였다.
본 발명의 방법에 따르면, 세포가 담지된 천연생체적합성 재료 지주가 안정적으로 생체적합성 고분자 지주 사이에 위치한 하이브리드 구조체를 제조할 수 있다.
본 발명의 방법에 따라 제조된 하이브리드 구조체는 공극 상호연결성이 100%로 세포의 영양성분, 산소 흡수와 성장 및 노폐물 배설에 매우 유리하다.
또한, 본 발명의 방법에 따라 제조된 하이브리드 구조체는 생체적합성 고분자 지주의 수를 조절함으로써 하이브리드 구조체의 기계적 특성을 조절할 수 있다.
또한, 본 발명의 방법에 따라 제조된 하이브리드 구조체에 담지된 세포들은 천연생체적합성 재료 지주 표면에서 잘 증식하고 생존하며 배양기간 동안 대사 기능이 증대되었다.
도 1은 세포가 담지된 하이브리드 구조체 제조공정 및 제조된 세포 담지 하이브리드 구조체 사진이다. (a) 세포 함유 알지네이트 용액을 노즐 (외경 (OD) = 310 ㎛)을 이용하여 PCL 지주 사이에 분배하는 공정을 촬영한 사진이고; (b) 제조된 PCL-알지네이트 구조체의 표면 사진이고; (c) 27 × 27 × 4.5 ㎣의 PCL-알지네이트 하이브리드 구조체 3차원 형상 및 그 단면 사진이다.
도 2는 구조체 변수에 대해 제조 조건이 미치는 효과를 나타낸다. (a) 노즐 외경 (310 및 650 ㎛), 노즐 이동속도 7.5 mm s-1, 일정 압력 (210 ± 12 kPa)에서 분사용액 내 CaCl2 의 wt%를 달리하였을 때 지주 크기를 나타내는 그래프이다. (b) 단일지주 직경에 미치는 노즐 크기의 효과를 나타내는 그래프이다. (c), (d), (e)는 각각 PCL로만 이루어진 구조체, PCL-알지네이트 하이브리드 구조체, 그리고 알지네이트로만 이루어진 구조체의 광학 이미지이고, 각 우측 상단 사진은 부분확대사진이며, (d)의 하단 사진은 단면 사진이다.
도 3a는 순수 PCL 구조체와 두 개의 하이브리드 구조체 (PA-1과 PA-2), 순수 알지네이트 구조체에 대한 응력-변형 곡선이다.
도 3b는 순수 PCL 구조체와 두 개의 하이브리드 구조체 (PA-1과 PA-2), 순수 알지네이트 구조체에 대한 인장 계수를 나타낸다.
도 3c는 순수 PCL 구조체와 두 개의 하이브리드 구조체 (PA-1과 PA-2)에 대하여 가한 힘 (0.2, 0.4, 0.6, 0.8 및 1.0 N) 대 변형을 나타내는 그래프이다.
도 3d는 순수 PCL 구조체에 인장 모드에서 가한 하중 (1 N)에 대한 폰 미제스 응력 (von Mises stress)을 나타낸다.
도 3e는 하이브리드 구조체 PA-1에 인장 모드에서 가한 하중 (1 N)에 대한 폰 미제스 응력 (von Mises stress)을 나타낸다.
도 3f는 하이브리드 구조체 PA-2에 인장 모드에서 가한 하중 (1 N)에 대한 폰 미제스 응력 (von Mises stress)을 나타낸다.
도 3g는 순수 PCL 구조체와 두 개의 하이브리드 구조체 (PA-1과 PA-2)에 대한 상대적 인장 계수를 나타낸다.
도 4a는 하이브리드 구조체 PA-1의 표면 이미지이다. (a)는 생존 (녹색) 패널, (b)는 사멸 (적색) 패널이고, (c)는 광학 이미지이고, (d)와 (e)는 PA-1 하이브리드 구조체의 형광 이미지 (생존-녹색, 사멸-적색)이다. (f), (g), (h)는 각각 위쪽, 중간, 아래쪽 단면이다.
도 4b는 하이브리드 구조체의 각기 다른 부분에서 세포생존율을 비교한 것이다. (a) 표면, (f) 위쪽, (g) 중간, (h) 아래쪽.
도 4c는 7일간의 세포배양 후 PA-1 하이브리드 구조체와 대조군 간의 세포생존율을 비교한 것이다.
도 4d는 25일간 세포배양한 후 하이브리드 구조체 PA-1의 다양한 부분을 촬영한 광학 및 형광 이미지이다. (k)는 광학 이미지, (l)과 (m)은 형광 이미지이다. 사진이서 핵은 청색이고 F-액틴은 적색이다. *는 P < 0.05를 나타낸다.
도 5a는 종래기술에 의하여 제조된 생체적합성 고분자-세포가 담지된 천연생체적합성 재료 하이브리드 구조체 모식도이다. 녹색은 생체적합성 고분자 지주, 적색은 세포가 담지된 천연생체적합성 재료 지주를 나타낸다.
도 5b는 본 발명 방법의 다양한 실시예 중 두 가지 실시예에 의하여 제조된 생체적합성 고분자-세포가 담지된 천연생체적합성 재료 하이브리드 구조체 모식도이다. 녹색은 생체적합성 고분자 지주, 적색은 세포가 담지된 천연생체적합성 재료 지주를 나타낸다.
본 발명은 (a) 생체적합성 고분자 지주 (strut)를 플레이트 위에 분배하여 지주층을 형성하는 단계;
(b) 상기 분배된 생체적합성 고분자 지주층 위에 엇갈리는 방향으로 생체적합성 고분자 지주들을 간격을 두어 분배하는 단계;
(c) 세포가 담지된 천연생체적합성 재료 지주를 상기 (b) 단계에서 분배된 생체적합성 고분자 지주 사이에 분배하되, 생체적합성 고분자 지주와 맞닿지 않도록 분배하면서, 분배되는 천연생체적합성 재료에 가교를 형성하는 단계; 및
(d) 상기 (b) 단계와 (c) 단계를 순차적으로 반복하여 하이브리드 구조체를 형성하는 단계;를 포함하는, 세포가 담지된 생체적합성 고분자-천연생체적합성 재료 하이브리드 구조체 제조방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 (d) 단계 이후 형성된 하이브리드 구조체를 가교 용액에 담갔다 꺼내는 단계;가 추가되는 것을 특징으로 하는, 세포가 담지된 생체적합성 고분자-천연생체적합성 재료 하이브리드 구조체 제조방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 생체적합성 고분자가 폴리이미드(polyimides), 폴리아믹스 산(polyamix acid), 폴리카프로락톤(polycarprolactone), 폴리에테르이미드(polyetherimide), 나일론(nylon), 폴리아라미드(polyaramid), 폴리비닐알콜(polyvinyl alcohol), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone), 폴리벤질글루타메이트(poly-benzyl-glutamate), 폴리페닐렌테레프탈아마이드(polyphenyleneterephthalamide), 폴리아닐린(polyaniline), 폴리아크릴로나이트릴(polyacrylonitrile), 폴리에틸렌옥사이드(polyethylene oxide), 폴리스티렌(polystyrene), 셀룰로오스(cellulose), 폴리아크릴레이트(polyacrylate), 폴리메틸메타크릴레이트(polymethylmethacrylate), 폴리락산(polylactic acid; PLA), 폴리글리콜산(polyglycolic acid; PGA), 폴리락산과 폴리글리콜산의 공중합체(PLGA), 폴리{폴리(에틸렌옥사이드)테레프탈레이트-co-부틸렌테레프탈레이트}(PEOT/PBT), 폴리포스포에스터(polyphosphoester; PPE), 폴리포스파젠(PPA), 폴리안하이드라이드(Polyanhydride; PA), 폴리오르쏘에스터{poly(ortho ester; POE}, 폴리(프로필렌푸마레이트)-디아크릴레이트{poly(propylene fumarate)-diacrylate; PPF-DA} 및 폴리에틸렌글라이콜디아크릴레이트{poly(ethylene glycol) diacrylate; PEG-DA}로 이루어진 그룹 중에서 선택된 1종 이상임을 특징으로 하는, 세포가 담지된 생체적합성 고분자-천연생체적합성 재료 하이브리드 구조체 제조방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 천연생체적합성 재료가 젤라틴, 푸코이단, 콜라겐, 알지네이트, 키토산 및 히알루론산으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 1종 이상임을 특징으로 하는, 세포가 담지된 생체적합성 고분자-천연생체적합성 재료 하이브리드 구조체 제조방법에 관한 것이다.
상기 천연생체적합성 재료는 '하이드로젤'이라고 불리기도 하며, 천연생체적합성 재료 지주 내부에 세포의 성장과 기능을 조절할 수 있는, 전환성 성장인자-β(TGF-β), 골형성 단백질(BMP), 혈관 내피 세포 성장인자(VEGF) 또는 상피 세포 성장인자(EGF)와 같은 성장인자가 내재될 수 있으며, 상기 천연생체적합성 재료 지주 내에 재생시키고자 하는 세포를 포함시킨다. 세포로는 피부세포, 섬유아세포, 각질세포, 골세포, 연골세포, 혈관세포, 혈관형성 내피세포, 신경세포 등의 다양한 세포를 비롯하여 여러 가지 세포로 분화가 가능한 줄기세포 등을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 (c) 단계가 세포가 담지된 천연생체적합성 재료 지주를 하나 이상 상기 (b) 단계에서 분배된 생체적합성 고분자 지주 사이에 분배함을 특징으로 하는, 세포가 담지된 생체적합성 고분자-천연생체적합성 재료 하이브리드 구조체 제조방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 (c) 단계의 가교 형성이 가교 용액 분사 방법 및 UV를 조사하는 광가교 방법 중 1종 이상의 방법을 이용하여 수행함을 특징으로 하는, 세포가 담지된 생체적합성 고분자-천연생체적합성 재료 하이브리드 구조체 제조방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 가교 용액이 석고; 또는 수산 아파타이트, 탄산 아파타이트, 불소 아파타이트, 염소 아파타이트, α-TCP, β-TCP, 메타인산칼슘, 인산4칼슘, 인산수소칼슘, 인산2수소칼슘, 피로인산칼슘, 탄산칼슘, 황산칼슘, EDC {1-ethyl-(3-3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride} 또는 이들의 염으로부터 선택되는 1종 이상의 혼합물의 용액임을 특징으로 하는, 세포가 담지된 생체적합성 고분자-천연생체적합성 재료 하이브리드 구조체 제조방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 가교 용액 분사가 가교 용액에 초음파를 가하여 분사하는 방법, 전기 분사장치 (electrospray)를 이용하여 가교 용액을 분사하는 방법, 가교 용액에 공기압을 가하여 에어로졸화하여 분사하는 방법 및 가교 용액에 열을 가하여 에어로졸화하여 분사하는 방법 중 선택된 1종 이상의 방법으로 수행됨을 특징으로 하는, 세포가 담지된 생체적합성 고분자-천연생체적합성 재료 하이브리드 구조체 제조방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조되며, 공극 상호연결성이 100%인, 세포가 담지된 생체적합성 고분자-천연생체적합성 재료 하이브리드 구조체에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 세포가 담지된 생체적합성 고분자-천연생체적합성 재료 하이브리드 구조체를 포함하는 세포 또는 조직 재생용 치료제에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조되는, 골세포 및 연골세포 중 1종 이상이 담지되고 공극 상호연결성이 100%인 생체적합성 고분자-천연생체적합성 재료 하이브리드 구조체를 포함하는 골세포 또는 연골세포 재생용 치료제에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조되는, 피부세포가 담지되고 공극 상호연결성이 100%인 생체적합성 고분자-천연생체적합성 재료 하이브리드 구조체를 포함하는 피부세포 재생용 치료제에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조되는, 혈관세포 또는 혈관형성 내피세포가 담지되고 공극 상호연결성이 100%인 생체적합성 고분자-천연생체적합성 재료 하이브리드 구조체를 포함하는 세포 재생용 치료제에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조되는, 신경세포가 담지되고 공극 상호연결성이 100%인 생체적합성 고분자-천연생체적합성 재료 하이브리드 구조체를 포함하는 세포 재생용 치료제에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조되는, 줄기세포가 담지되고 공극 상호연결성이 100%인 생체적합성 고분자-천연생체적합성 재료 하이브리드 구조체를 포함하는 세포 재생용 치료제에 관한 것이다.
본 발명에 의해 제조되는 상기 세포 또는 조직 재생용 3차원 구조체는 노화된 피부, 화상, 창상, 궤양 또는 좌상 피부에 적용하거나, 피부 미용용 또는 성형용 목적의 인공진피로 이용할 수 있다. 또한, 본 발명은 상기 인공진피를 포함하는 피부 드레싱, 피부 외용제 또는 화장료로 이용할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 인공진피에 각질세포, 혈관 형성 내피세포 및 줄기세포 중 선택된 1종 이상을 포함하여 증식시킨 인공피부로 이용할 수 있으며, 이 인공피부는 노화된 피부, 화상, 창상, 궤양 또는 좌상 피부에 적용하거나, 피부 미용용 또는 성형용 목적으로 사용할 수 있다. 또한, 본 발명은 상기 인공피부를 포함하는 피부 드레싱, 피부외용제 또는 화장료로 이용할 수 있다.
또한, 상기 피부 드레싱을 비롯한 드레싱 재료는 붕대, 거즈, 무균 포장재료, 하이드로젤, 하이드로콜로이드 및 유사재료를 비롯하여 당업계에서 사용되는 임의의 물질일 수 있다. 본 발명의 구조체는 상기 드레싱 재료에 함침되거나 공유 부착되어 사용될 수 있다.
뿐만 아니라, 본 발명은 구조체를 포함하여 국소 적용 가능한 피부 외용제 또는 화장료로 사용할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체를 가하거나 가하지 않고 국소도포에 적합한 구조체를 포함하는 피부 외용제를 제조하여 상처 치료나 조직재생, 피부미용, 성형용도 등으로 사용 가능하다.
본 발명의 세포재생용 치료제는 약제학적 분야에서 공지의 방법에 의해 제제화할 수 있고, 구조체 자체 또는 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 등과 혼합하여 통상의 약학적 제제, 예를 들면 액제, 연고, 에멀젼, 겔, 크림제, 페이스트제 등의 다양한 제형으로 제제화할 수 있다. 본 발명 세포재생용 치료제의 투여량에 특별한 제한은 없으나, 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병이나 상태의 정도, 약물형태 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 바람직한 효과를 위해서 본 발명의 치료제는 통상 1일 0.01~100㎎/㎏으로, 바람직하게는 0.1~100㎎/㎏으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한 번 내지 수회 나누어 투여할 수 있다. 담체로는 구조체의 구조 및 기능에 악영향을 미치지 않는 것이라면 특별한 제한은 없으며, 예컨대 물, 에탄올, 글리세롤, 프로필렌글라이콜, 폴리에틸렌글라이콜 등의 폴리올, 식물성유, 무독성 글리세릴 에스테르 및 이들의 혼합물을 포함하는 용매 등이 바람직하다.
본 발명은 또한, 상기 구조체를 포함하는 화장료 조성물을 제공한다. 본 발명의 구조체를 포함하는 화장료 조성물은 통상적인 제조방법에 따라 어떤 형태로든 용이하게 제조할 수 있다. 일례로서 크림형 제제를 제조함에 있어서는 일반적인 수중유형(O/W) 또는 유중수형(W/O)의 크림 베이스에 본 발명의 인공진피 및/또는 인공피부를 함유시키고 여기에 향료, 킬레이트제, 색소, 산화방지제, 방부제 등을 필요에 따라 사용하는 한편, 물성개선을 목적으로 단백질, 미네랄, 비타민 등 합성 또는 천연소재를 병용할 수 있다. 뿐만 아니라, 본 발명의 화장료에는 pH 조절제, 향료, 유화제, 방부제 등을 필요에 따라 부가하여 통상의 화장료 제조 방법으로 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 크림 또는 에센스 등으로 제형화하여 노화 피부를 개선하는 등의 용도로 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 구조체에 다양한 생리활성물질을 부가할 수 있다. 생리활성물질은 특별한 제한은 없으며, 상기 구조체에서 세포의 부착 및 증식에 부정적인 영향을 미치지 않는 것이면 가능하다. 구체적인 예로는 항생제, 항바이러스제, 항균제, 핵산, 펩타이드 및 단백질 중 선택된 1종 이상을 부가할 수 있다. 항생제, 항바이러스제, 항균제 등은 구조체의 감염을 막기 위한 것이고, 단백질로는 호르몬, 사이토카인, 효소, 항체, 성장인자, 전사조절인자, 백신, 구조단백질, 리간드 단백질, 수용체, 세포표면항원 및 수용체 길항물질로 이루어진 그룹 중 선택된 것임을 특징으로 한다.
아래에서는 구체적인 실시예를 통하여 본 발명의 구성을 좀더 자세히 설명한다. 그러나, 본 발명의 범위가 실시예의 기재에 의하여 제한되는 것이 아님은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다. 특히, 아래의 실시예에서는 생체적합성 고분자로서 폴리카프로락톤을 이용하였고, 천연생체적합성 재료로서 알지네이트를 이용하였으나, 이와 같은 선택은 구체적인 예시를 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들 재료에만 한정되는 것이 아님은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명함을 명확히 밝혀둔다.
실시예 1: 세포가 포함된 알지네이트 용액 제조
MC3T3-E1 세포는 Claudia Fischbach-Teschl (Cornell University, Ithaca, NY, USA) 교수가 제공해 주었다. 세포를 담지하기 위한 알지네이트 하이드로젤은 종래기술에 따라 제조하였다 [24]. 점도가 낮고 G 함량이 높은 비의약품 등급의 LF10/60 알지네이트 (FMC BioPolymer, Drammen, Norway)를 PBS와 혼합하여 3.5 wt% 알지네이트 용액을 제조하였다. 세포를 로딩하기 전 알지네이트 용액에 0.5 wt% CaCl2 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 가하여 점도를 높여주었다 (알지네이트 용액 : CaCl2 용액 = 7:3). 3방향 스톱콕을 이용하여 세포를 상기 알지네이트 용액에 2.65 × 105 ㎖-1의 밀도로 혼합하였다. 세포-알지네이트 혼합물은 주사기에 로딩하였다. 하이브리드 구조체 내에서 세포-알지네이트 지주를 완벽하게 교차연결하기 위해 2 wt% CaCl2가 함유된 PBS로 2차 교차연결을 수행하였다.
실시예 2: 세포가 담지된 하이브리드 구조체 제조
PCL/알지네이트 하이브리드 구조체를 제조하기 위해 PCL 수지 (밀도 = 1.135 g cm-3, Mn = 60000~80000; 용융점 = 60℃; Sigma.Aldrich, USA)를 빼내는 3축 로봇 시스템과 연결된 용융 플로팅 장치와 세포가 담지된 알지네이트 지주를 제조하기 위하여 분사장치 (Tess-7400; Paju, South Korea)가 장착된 분배 시스템을 이용하였다. 알지네이트 분배 공정을 수행하는 동안 2.5 wt% CaCl2 용액을 초음파 분사장치 (분사 속도: 1.45 ± 0.2 ml/min)로 제조 스테이지 상에 분사하여 알지네이트 지주를 교차결합하였다. PCL 지주는 가열 (130℃)하여 플레이트 상에 분출시켰고, 외경 350 ㎛ 노즐로 일정 압력 (350 ± 28 kPa) 및 일정한 노즐 속도 (7.5 mm s-1)로 플로팅하였다. 알지네이트 투여는 노즐을 이용하여 수행하였다.
세포가 포함된 알지네이트 용액은 연속되는 층에서 PCL 지주 사이에 깍지끼우는 패턴으로 분배되었다. 먼저, 직각을 이루는 PCL 지주들이 스테이지 상에 플로팅된 후 PCL 지주 사이에 알지네이트 지주들이 플로팅되었다. 이 공정을 수 차례 반복하여 PCL-알지네이트 하이브리드 구조체를 제조하였다.
플로팅 후 세포가 담지된 하이브리드 구조체는 2 wt% CaCl2 용액에 1분간 담가 하이브리드 구조체 내에 알지네이트 지주를 확실히 경화시켰다. 그 후 구조체는 PBS 용액으로 두 번 세척하였다. 이 공정을 표 1에 요약하였다.
실시예 3: 구조체의 기계적 특성
교차연결 후 하이브리드 구조체는 작은 조각 (10 × 20 ㎟)으로 잘랐다. 인장시험기 (Top-tech 2000, Chemilab, South Korea)로 1축 압축시험을 수행하였다. 본 구조체에 대한 응력-변형률 커브를 인장속도 0.5 mm s-1에서 기록하였다. 모든 값은 평균 ± 표준편차 (n = 5)로 나타내었다.
실시예 4: 세포생존율 측정
세포가 담지된 하이브리드 구조체를 제조한 후 구조체를 배양기 내에서 0.15 mM 칼세인 AM 및 2 mM 에티듐 호모다이머-1에 45분간 노출시켰다. 염색된 구조체는 형광현미경 보조장치와 SPOT RT 디지탈 카메라 (SPOT Imaging Solutions, Sterling Heights, MI, USA)가 장착된 현미경 (TE2000-S, Nikon, Tokyo, Japan)으로 분석하였다. 세포생존율을 관찰하기 위해 Image J 프로그램 (NIH, Bethesda, MD, USA)을 통해 영상을 캡쳐하고 녹색 및 적색 반점의 수를 측정하였다. 그리하여 세포가 담지된 알지네이트 구조체의 세포생존율을 결정하였다. 총 세포 (생존세포 및 사멸세포 모두 포함) 수에 대한 생존세포 수의 비는 Image J 소프트웨어를 이용하여 계산하였고, 비율은 최초 세포생존율 즉, 세포-알지네이트 분출 이전의 값으로 표준화하였다. 최초 세포생존율은 트리판 블루 (Mediatech, Herndon, VA, USA)를 이용하여 결정하였다.
10% 우태혈청 (GEMINI Bio-PRODUCTS, USA)과 1% 항생제 (Antimycotic ; Cellgro,USA)를 함유한 α-최소필수배지 (Life Science, USA)에서 하이브리드 구조체 (PA-1)을 배양하고 유지하였다. 구조체는 5% CO2, 37℃에서 배양하였고, 배지는 이틀마다 갈아주었다.
세포배양 25일 후 하이브리드 구조체를 DAPI (diamidino-2-phenylindole) 형광염색으로 분석하여 구조체 내의 세포 핵을 탐지하였다. 팔로이딘 (Invitrogen Inc., USA)을 이용하여 구조체 내에서 증식한 세포의 액틴 세포골격을 시각화하였다. 형광 현미경 (ZEISS observer. z1, ZEISS, Germany)을 이용하여 형광 이미지를 얻었다.
통계 분석
SPSS를 이용하여 통계 분석하였다. 통계 분석은 ANOVAs로 구성되었다. 유의수준은 P < 0.05로 하였다.
결과 1: 하이브리드 구조체 제조
알지네이트 하이드로젤은 피부, 뼈 및 혈관을 포함하여 다양한 조직 재생에 생체의학 구조체로서 널리 이용되고 있는데, 그 이유는 상피 및 입자조직 (granular tissue) 형성을 촉진시키는 능력때문이다 [X. Li et al., Biotechnol. Prog. 2006, 22, 1683, T. Hashimoto et al., Biomaterials 2004, 25, 1407, E. Alsberg et al., J. Dent. Res. 2001, 80, 2025]. 뿐만 아니라, CaCl2 용액 내에서 빨리 고형화되는 특성으로 인해 세포가 담지된 구조체 제조에 널리 이용되어 오고 있었다. 도 1(a)는 PCL 지주 사이에 알지네이트 용액을 투여하는 것을 보여준다. PCL과 알지네이트로 이루어진 세포가 담지된 하이브리드 구조체를 제조하기 위하여 수직 PCL 지주를 플레이트 위에 가열된 주사기 용기 (130 ℃)를 통해 먼저 플로팅하고, 두 번째 PCL 지주층을 간격을 두어 플로팅했다. 세포가 담지된 알지네이트 지주를 PCL 지주 사이에 플로팅했다. 이와 동시에 알지네이트 지주의 침입 (intrusion)을 막기 위해 분사장치로 분사되는 2.5 wt% CaCl2 에어로졸을 작업대에 게속 공급하였다 (분사 속도 = 1.45 ㎖/min). 2.5 wt%보다 낮은 농도의 CaCl2 용액에서는 세포가 담지된 알지네이트 지주의 원통 형상이 PCL 지주 사이에서 잘 유지되지 않았다. 이 공정은 수 차례 반복되어 두꺼운 PCL-알지네이트 하이브리드 구조체를 형성하였다. 하이브리드 구조체에서 알지네이트 지주가 완전히 교차결합하도록 하기 위해 구조체를 실온에서 1분간 2 wt% CaCl2 용액에 담갔다. 교차결합 후 하이브리드 구조체는 PBS로 두 번 세척한 다음 배양기에 즉시 넣었다. 도 1(b)와 (c)는 최종적으로 얻어진 27 × 27 × 4.5 ㎣의 하이브리드 구조체를 나타내며, 구조체의 표면과 단면을 보여준다. 사진과 같이, 세포가 담지된 알지네이트 지주는 PCL 지주 사이에 끼워넣어져 있으며, 다공 구조는 잘 유지되었다. 세포가 담지된 알지네이트 구조의 특성은 단선 패터닝을 이용하여 연구하였다. 시험한 변수는 동일한 노즐 속도 (7.5 mm s-1), 압력 (210 ± 12 kPa) 및 분사속도 (1.45 ㎖/min) 하에서 분사용액 내의 CaCl2 농도와 노즐 직경이었다. 도 2(a)와 같이, 2.5 wt%보다 높은 농도에서 알지네이트 지주는 분출되는 알지네이트 지주와 분사되는 에어로졸이 즉시 접촉할 때 최대로 안정적이었다. 세포에 대한 CaCl2 용액의 효과를 최소화하기 위해 분사용액의 농도를 2.5 wt%로 선택하였다.
일반적으로, 지주 용적의 안정성은 다양한 세포 활성에 영향을 미치는 공극 크기가 지주 용적에 의해 영향을 받기 때문에 구조체 디자인에 있어서 중요한 공정 변수이다. 따라서, 노즐 크기와 실험공정 (특히, 분사) 조건 간의 상관관계를 고찰하여야 한다. 생성된 알지네이트 지주 직경에 미치는 노즐 크기의 영향은 도 2(b)와 같다. 각기 다른 크기의 네 개의 노즐에 대해 시험한 결과, 같은 분사 조건 (2.5 wt% CaCl2 용액, 일정 분사속도 1.45 ㎖/min) 하에서 노즐 크기가 커질수록 생성된 지주의 직경은 커졌다. 그러나, 작은 크기의 노즐 (240 ㎛)에서, 알지네이트 단일 지주는 연속적으로 분출되지 않았다. 그리하여 본 발명자들은 플로팅 시스템의 노즐 직경을 310 ㎛로 선택하였다.
결과 2: 구조체의 공극 구조
골조직을 재생하기 위해 구조체는 절절한 공극 크기와 100% 공극 상호연결성이 있어야 하는데, 그 결과로 공극 구조 미세혈관 유도가 일어날 수 있고 골생성이 유지될 수 있다 [K. S. Chan et al., J. Mech. Behav. Biomed. Mater. 2010, 3, 584, J. Sanders et al., J. Biomed. Mater. Res. 2002, 60, 36]. 앞서 보고된 바와 같이, 골조직 재생에서 최적 공극 크기는 논란의 이슈로 남아 있다. 그렇지만, 본 발명자들은 500 ㎛ 공극 크기를 선택했다. 세포 증식과 영양분과 노폐물의 최적 확산이 가능하도록 하기 위해서 100 ~ 500 ㎛의 공극 크기가 추천되었기 때문에 [V. Karageorgiou, D. Kaplan, Biomaterials 2005, 26, 5474, S. M. Roosa et al., J. Biomed. Mater. Res. Part A. 2009, 92, 359], 이 공극 크기가 골 형성에 적당할 것으로 판단되었다.
도 2의 (c)~(e)는 각각 순수 PCL 구조체, PCL/알지네이트 하이브리드 구조체 및 순수 알지네이트 구조체의 광학 이미지이다. 본 발명에서는 두 종류의 PCL/알지네이트 하이브리드 구조체가 제조되었다. 본 발명의 상세한 설명 및 도면에서는 PCL 지주 사이에 하나의 알지네이트 지주가 있는 것을 "PA-1"으로 (도 1(b) 참조), 그리고 PCL 지주 사이에 두 개의 알지네이트 지주가 자리한 것을 "PA-2"로 명명하였다 (도 2(d) 참조). 하이브리드 구조체의 공극 크기는 PCL 지주와 알지네이트 지주 사이의 거리로 정의하였는데, 이것을 500 ㎛로 정하였다. 그렇지만, 이 크기는 각 구조체마다 달랐는데, 그것은 알지네이트 지주들이 약간씩 다가가는 현상 때문이었다. 도 2(e)는 순수 알지네이트 구조체가 분명히 균일한 지주 (평균 지주 크기= 388 ± 29 ㎛)와 공극 (평균 공극 크기 = 314 ± 22 ㎛)으로 이루어짐을 보여준다. 본 발명 하이브리드 구조체의 좀더 상세한 공극 구조는 표 1에 기재하였다.
결과 3: 구조체의 탄성 특성
일반적으로, 세포가 담지된 하이드로젤의 낮은 기계적 특성은 경질 조직 재생에 이를 활용하는데 주요 한계가 되어 왔다 [W. Schuurman et al., Biofabrication 2011, 3, 021001, D. L. Cohen et al., Tissue Eng. 2006, 12 1325]. 이 문제를 극복하기 위해 본 발명자들은 PCL을 이용한 새로운 세포담지 하이브리드 구조체를 제안한다. PCL은 지방족 폴리에스터이고 높은 기계적 특성, 제어 가능한 분해속도, 최소의 독성 및 낮은 면역 반응성으로 인해 골조직 재생에 이용되는 가장 유용한 합성폴리머 중의 하나이다. 구조체의 기계적 특성 제어가능성을 설명하기 위해 두 개의 다른 구조체 (PA-1과 PA-2)를 제조하였다. 도 3a는 일정한 인장속도 0.5 ㎜/s에서 순수 PCL 구조체, 순수 알지네이트 구조체 및 하이브리드 구조체의 응력-변형 곡선을 보여준다. 고형 임의형상 제작법으로 만든 구조체의 기계적 특성이 공극 구조 (지주 직경, 공극 크기 및 방향성) 그리고 구조체의 다공성과 밀접하게 연관되어 있기 때문에 [L. Moroni et al., Biomaterials 2006, 27, 974], 각 구조체의 공극 구조를 유사하게 제조하였다.
도 3a와 같이, 순수 PCL 구조체의 응력-변형 곡선은 준탄성 (quasi-elastic) 부분 다음에 안정/변동 부분 (plateau/fluctuation region)이 오는데, 이는 PCL 지주 간의 접착 및 고탄성 계수에 기인하는 것이다. 반면, 알지네이트 구조체는 순수 PCL 구조체와 비교하여 차적의 (suboptimal) 기계적 특성 (낮은 계수 및 낮은 최대 강도)을 나타낸다. 하이브리드 구조체 (PA-1과 PA-2)는 깍지낀 구조의 PCL 지주로 인해 파동 부분을 보여준다. 비록 영률(Young’s modulus)과 최대 강도가 순수 PCL 구조체에 비해 낮긴 하지만, 기계적 특성은 순수 알지네이트 구조체와 비교하여 극적으로 개선되었다. 기계적 데이타는 단순 혼합법칙 (ET = EPφP + EAφA)으로 분석되었다. 이 식에서, EP와 EA는 각각 순수 PCL과 순수 알지네이트의 계수이고, φP와 φA는 각각 PCL 지주와 알지네이트 지주의 체적 분율이다. PCL과 알지네이트 체적 분율은 각 지주를 완전한 원통형으로 가정하고 각 지주의 수를 이용하여 계산하였다. 단순분석을 통하여 계산된 계수는 PA-1과 PA-2 구조체에 대해 각각 17.1 MPa와 13.1 MPa였다. 도 3b와 같이, 측정된 계수 값은 약간 차이가 있었는데 (PA-1과 PA-2 구조체에 대해 각각 15.4 MPa와 8.3 MPa), 이는 (1) 체적 분율 계산에 이용된, 알지네이트 지주와 PCL 지주가 완전한 원통형이라는 가정과 (2) PCL 지주와 알지네이트 지주 간의 완전한 접착이라는 가정에서 비롯된 것이다.
응력 분포 (stress-distribution)를 관찰하기 위해 하이브리드 구조체를 탄성 모드에서 단선 지주 PCL과 알지네이트의 영률을 가지고, 각 지주에 대한 쁘아종 비가 0.45인 선형 탄성모델로 시뮬레이션하였다. 3차워 메쉬 구조체의 효과적인 탄성계수를 계산하기 위해 적용하는 힘을 달리 하여 ANSYS ver. 11.0 소프트웨어를 이용하여 구조체 변위를 측정하였다. 특별히, 영률 계산을 위해 가하는 힘은 0.2부터 1N까지 변화시켰다. 구조체의 구조적 모델링은 UGX NX 5.0 소프트웨어로 수행하였다. 도 3c~도 3f는 순수 PCL 구조체와 하이브리드 구조체 (PA-1과 PA-2) 각각의 힘과 변위 결과를 보여주며 (도 3c), 탄성 모드에서 1N에 대한 폰 미제스 응력의 분포를 보여준다 (도 3d, 3e, 3f). 그 결과와 같이, 대부분의 응력은 PCL 지주에 집중되었다. 순수 PCL에 대해 계산된 계수는 100%로 설정하였는데, 하이브리드 구조체 PA-1과 PA-2는 탄성계수 39.7과 53.9%로서 순수 PCL 구조체의 탄성계수보다 작았다 [도 3g]. 실험결과값 (저하율: PA-1은 44%, PA-2는 70%)과 비교하면 약간의 차이가 있다. 그러나, 단순혼합법칙 분석 (PA-1은 38%, PA-2는 53%)과 비교하면 유사하다.
이러한 기계적 특성 분석에 기초하여 하이브리드 구조체의 계수 값이 PCL 지주 용적비에 완전히 의존적임을 알 수 있었고, 지주 수를 제어하면 하이브리드 구조체의 전체 기계적 특성은 조절할 수 있음을 밝혔다.
결과 4: 알지네이트 지주의 세포생존율
도 4a의 (a)는 MC3T3-E1 세포가 담지된 PCL/알지네이트 하이브리드 구조체의 미세공극 구조를 보여준다. 하이브리드 구조체의 세포생존율을 결정하기 위해 각각 생존세포와 사멸세포를 염색하는 칼세인 AM과 에티듐 호모다이머 1으로 구조체를 염색하였다. 도 4a의 (a), (b)는 하이브리드 구조체의 표면을, (c), (d), (e)는 하이브리드 구조체의 단면 형광 이미지를 나타낸다. 생존세포는 녹색, 사멸세포는 적색으로 관찰되었고, 도 4a의 (a)와 (d)에서 밝은 부분은 녹색이고, (b)와 (e)의 밝은 부분은 적색이다. 표면과 두께 방향으로 세포의 분포를 정량적으로 평가하기 위해 몇몇 구역 [도 4a의 (d)에 하얀 점선으로 표시된 부분]의 세포생존율을 구분하였다 (도 4b). 표면과 절단면의 형광 이미지에서 보이는 것과 같이, 알지네이트 지주 내의 세포들은 전체 구조체를 통해 골고루 분포되어 있었고, 구조체 내의 위치에 관계 없이 세포생존율은 유사하였다. 알지네이트 지주 내의 총 평균 세포생존율은 84 ± 7%였다. 또한, PCL 지주와 알지네이트 지주 간의 접점에서와 같이 (도 4a의 (a), (b) 참조), 뜨거운 PCL 지주가 알지네이트 지주 상에 놓일 때의 열 쇼크는 알지네이트 지주의 세포에 심각한 손상을 입히지는 않았다.
본 발명자들은 PA-1 구조체와 대조군 구조체 (이것은 공극 구조가 없이 세포가 담지된 알지네이트 매트로 제조되었음. 10 × 10 × 2.2 ㎣)를 비교하였다. 각 구조체에 같은 밀도 (2.3 ~ 2.8 × 105/㎖)로 세포를 담지하였다. 도 4d와 같이, 알지네이트 지주를 가진 하이브리드 구조체 (PA-1)의 7일째 세포생존율 (단면)은 대조군 구조체와 비교하여 약 58% 증가하였고, 반면 표면의 세포생존율은 유사하였다. 이러한 결과는 미세 크기의 세포를 담지한 알지네이트 지주를 가진 본 발명의 하이브리드 구조체가 종래 기술로 제조된 세포 담지 알지네이트 구조체에 비하여 담지된 세포의 생존에 좀더 효과적임을 말해준다.
도 4d의 (k)는 하이브리드 구조체 (PA-1)의 세포배양 25일 후 광학 이미지이다. 도 4d의 (k)의 우측 상단 사진과 (l), (m)의 우측 상단 사진은 하이브리드 구조체 내의 염색된 핵 (청색: 흑백사진에서는 밝은 반점으로 나타남)과 F-액틴 (적색; 흑백사진에서는 바탕의 밝은 색으로 나타남)을 보여준다. 사진과 같이, 담지된 세포들은 알지네이트 지주 표면에서 잘 증식하여, 알지네이트 지주 내에 담지된 프린트된 세포들이 잘 생존하며 배양기간 동안 대사 기능을 증대시킴을 말해준다. 또한, 세포외 기질이 있는 세포들은 잘 증식하여 공극 사이에서도 성장하였는데, 이는 하이브리드 구조체의 미세구조와 3차원 형상이 배양기간 동안 잘 유지되었음을 말해준다. 이 방법으로, 영양성분과 산소가 적층 공극구조를 통하여 용이하게 전달될 수 있다.
결론
본 발명자들은 용융 플로팅 방법과 변형된 분사공정을 조합하여 PCL 지주와 세포담지 알지네이트 지주로 이루어진 세포담지 하이브리드 구조체를 제조하였다. 제조된 하이브리드 구조체는 실제에 가까운 공극 크기를 가지며 100%의 공극 상호연결도를 나타낸다. 이 구조체는 순수 알지네이트 구조체와 비교하여 기계적 특성이 현저히 개선되었다. 탄성계수의 개선은 하이브리드 구조체 내의 PCL 지주 용적 분율로 제어할 수 있다. 생물학적 기능 면에서, 하이브리드 구조체 내의 MC3T3-E1 세포생존율은 약 84%였다. 세포배양 25일 후 세포는 잘 생존하였고 증식하였다. 증식한 세포와 세포외 기질은 구조체의 공극을 차지하였다. 이러한 결과를 바탕으로, 본 발명자들은 하이브리드 구조체 내에서 PCL 지주와 세포담지 알지네이트 지주의 수를 적절히 조절함으로써 기계적 특성과 생물학적 활성을 조절할 수 있음을 밝혔다. 또한, 본 발명에 의한 세포담지 하이브리드 구조체는 연질조직재생에 사용되고 있는 세포담지 하이드로젤의 응용성을 경질조직재생 분야에까지 넓힐 수 있을 것으로 예상된다.
표 1
Hybrid scaffolds PA-1 PA-2
Total processing time(min) 32(overall size: 27×27×4.5㎣) 14(overall size: 27×27×1.8㎣)
Nozzle moving velocity(mm/s) 7.5 7.5
Processing temperature(℃) Alginate:26℃, PCL:130℃ Alginate:26℃,PCL:130℃
Pneumatic pressure(kPa) Alginate:220±10PCL:350±5 Alginate:220±10PCL:350±5
Outer nozzle diameter(㎛) Alginate:310 PCL:350 Alginate:310 PCL:350
Strut size(㎛) Alginate:466±63 PCL:437±11 Alginate:466±63 PCL:437±11
Pore size(㎛) 488±47 338±45
CaCl2 fuming process(wt%) 2.5 2.5
Flow rate of CaCl2 fume(ml/min) 1.45±0.2 1.45±0.2
Laden cells 2.25×105/ml 2.25×105/ml
본 발명의 방법 또는 본 발명의 방법에 의하여 제조되는 세포가 담지된 생체적합성 고분자-천연생체적합성 재료 하이브리드 구조체는 골세포, 연골세포, 피부세포, 혈관세포, 신경세포, 줄기세포 등의 다양한 세포를 담지시킨 구조체로 형성하여 동물 및 인체의 각 조직 치료 및 재생 용도로 이용할 수 있다.

Claims (15)

  1. (a) 생체적합성 고분자 지주 (strut)를 플레이트 위에 분배하여 지주층을 형성하는 단계;
    (b) 상기 분배된 생체적합성 고분자 지주층 위에 엇갈리는 방향으로 생체적합성 고분자 지주들을 간격을 두어 분배하는 단계;
    (c) 세포가 담지된 천연생체적합성 재료 지주를 상기 (b) 단계에서 분배된 생체적합성 고분자 지주 사이에 분배하되, 생체적합성 고분자 지주와 맞닿지 않도록 분배하면서, 분배되는 천연생체적합성 재료에 가교를 형성하는 단계; 및
    (d) 상기 (b) 단계와 (c) 단계를 순차적으로 반복하여 하이브리드 구조체를 형성하는 단계;를 포함하는, 세포가 담지된 생체적합성 고분자-천연생체적합성 재료 하이브리드 구조체 제조방법.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 (d) 단계 이후 형성된 하이브리드 구조체를 가교 용액에 담갔다 꺼내는 단계;가 추가되는 것을 특징으로 하는, 세포가 담지된 생체적합성 고분자-천연생체적합성 재료 하이브리드 구조체 제조방법.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 생체적합성 고분자는 폴리이미드(polyimides), 폴리아믹스 산(polyamix acid), 폴리카프로락톤(polycarprolactone), 폴리에테르이미드(polyetherimide), 나일론(nylon), 폴리아라미드(polyaramid), 폴리비닐알콜(polyvinyl alcohol), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone), 폴리벤질글루타메이트(poly-benzyl-glutamate), 폴리페닐렌테레프탈아마이드(polyphenyleneterephthalamide), 폴리아닐린(polyaniline), 폴리아크릴로나이트릴(polyacrylonitrile), 폴리에틸렌옥사이드(polyethylene oxide), 폴리스티렌(polystyrene), 셀룰로오스(cellulose), 폴리아크릴레이트(polyacrylate), 폴리메틸메타크릴레이트(polymethylmethacrylate), 폴리락산(polylactic acid; PLA), 폴리글리콜산(polyglycolic acid; PGA), 폴리락산과 폴리글리콜산의 공중합체(PLGA), 폴리{폴리(에틸렌옥사이드)테레프탈레이트-co-부틸렌테레프탈레이트}(PEOT/PBT), 폴리포스포에스터(polyphosphoester; PPE), 폴리포스파젠(PPA), 폴리안하이드라이드(Polyanhydride; PA), 폴리오르쏘에스터{poly(ortho ester; POE}, 폴리(프로필렌푸마레이트)-디아크릴레이트{poly(propylene fumarate)-diacrylate; PPF-DA} 및 폴리에틸렌글라이콜디아크릴레이트{poly(ethylene glycol) diacrylate; PEG-DA}로 이루어진 그룹 중에서 선택된 1종 이상임을 특징으로 하는, 세포가 담지된 생체적합성 고분자-천연생체적합성 재료 하이브리드 구조체 제조방법.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 천연생체적합성 재료는 젤라틴, 푸코이단, 콜라겐, 알지네이트, 키토산 및 히알루론산으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 1종 이상임을 특징으로 하는, 세포가 담지된 생체적합성 고분자-천연생체적합성 재료 하이브리드 구조체 제조방법.
  5. 청구항 1에 있어서,
    상기 (c) 단계는 세포가 담지된 천연생체적합성 재료 지주를 하나 이상 상기 (b) 단계에서 분배된 생체적합성 고분자 지주 사이에 분배함을 특징으로 하는, 세포가 담지된 생체적합성 고분자-천연생체적합성 재료 하이브리드 구조체 제조방법.
  6. 청구항 1에 있어서,
    상기 (c) 단계의 가교 형성은 가교 용액 분사 방법 및 UV를 조사하는 광가교 방법 중 1종 이상의 방법을 이용하여 수행함을 특징으로 하는, 세포가 담지된 생체적합성 고분자-천연생체적합성 재료 하이브리드 구조체 제조방법.
  7. 청구항 6에 있어서,
    상기 가교 용액은 석고; 또는 수산 아파타이트, 탄산 아파타이트, 불소 아파타이트, 염소 아파타이트, α-TCP, β-TCP, 메타인산칼슘, 인산4칼슘, 인산수소칼슘, 인산2수소칼슘, 피로인산칼슘, 탄산칼슘, 황산칼슘, EDC {1-ethyl-(3-3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride} 또는 이들의 염으로부터 선택되는 1종 이상의 혼합물의 용액임을 특징으로 하는, 세포가 담지된 생체적합성 고분자-천연생체적합성 재료 하이브리드 구조체 제조방법.
  8. 청구항 6에 있어서,
    상기 가교 용액 분사는 가교 용액에 초음파를 가하여 분사하는 방법, 전기 분사장치 (electrospray)를 이용하여 가교 용액을 분사하는 방법, 가교 용액에 공기압을 가하여 에어로졸화하여 분사하는 방법 및 가교 용액에 열을 가하여 에어로졸화하여 분사하는 방법 중 선택된 1종 이상의 방법으로 수행됨을 특징으로 하는, 세포가 담지된 생체적합성 고분자-천연생체적합성 재료 하이브리드 구조체 제조방법.
  9. 청구항 1 내지 청구항 8 중 어느 한 항의 방법으로 제조되며, 공극 상호연결성이 100%인, 세포가 담지된 생체적합성 고분자-천연생체적합성 재료 하이브리드 구조체.
  10. 청구항 9의 세포가 담지된 생체적합성 고분자-천연생체적합성 재료 하이브리드 구조체를 포함하는 세포 또는 조직 재생용 치료제.
  11. 청구항 1 내지 청구항 8 중 어느 한 항의 방법으로 제조되는, 골세포 및 연골세포 중 1종 이상이 담지되고 공극 상호연결성이 100%인 생체적합성 고분자-천연생체적합성 재료 하이브리드 구조체를 포함하는 골세포 또는 연골세포 재생용 치료제.
  12. 청구항 1 내지 청구항 8 중 어느 한 항의 방법으로 제조되는, 피부세포가 담지되고 공극 상호연결성이 100%인 생체적합성 고분자-천연생체적합성 재료 하이브리드 구조체를 포함하는 피부세포 재생용 치료제.
  13. 청구항 1 내지 청구항 8 중 어느 한 항의 방법으로 제조되는, 혈관세포가 담지되고 공극 상호연결성이 100%인 생체적합성 고분자-천연생체적합성 재료 하이브리드 구조체를 포함하는 세포 재생용 치료제.
  14. 청구항 1 내지 청구항 8 중 어느 한 항의 방법으로 제조되는, 신경세포가 담지되고 공극 상호연결성이 100%인 생체적합성 고분자-천연생체적합성 재료 하이브리드 구조체를 포함하는 세포 재생용 치료제.
  15. 청구항 1 내지 청구항 8 중 어느 한 항의 방법으로 제조되는, 줄기세포가 담지되고 공극 상호연결성이 100%인 생체적합성 고분자-천연생체적합성 재료 하이브리드 구조체를 포함하는 세포 재생용 치료제.
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