KR102521317B1 - 메타크릴레이트가 결합된 알지네이트를 포함하는 하이드로겔 조성물 및 하이드로겔 제조방법 - Google Patents

메타크릴레이트가 결합된 알지네이트를 포함하는 하이드로겔 조성물 및 하이드로겔 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 메타크릴레이트가 결합된 알지네이트를 포함하는 하이드로겔 조성물 및 하이드로겔 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로는 히드록실기에 메타크릴레이트가 결합된 알지네이트를 포함하는 하이드로겔 조성물 및 상기 하이드로겔의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 하이드로겔 조성물은 알지네이트의 나트륨 반대 이온을 친유성을 가지는 테트라알킬암모늄으로 대체하여 유기 용매에서 반응이 가능하여, 더 높은 효울을 가진 다양한 유기 반응이 가능할 뿐만 아니라, 메타크릴레이트를 알지네이트의 히드록실기와 결합시킴으로써 고유한 알지네이트의 기능을 유지할 수 있고, 상기 메타크릴레이트의 치환 정도에 따라서 하이드로겔의 기게적 특성을 제어할 수 있는 장점이 있다.

Description

메타크릴레이트가 결합된 알지네이트를 포함하는 하이드로겔 조성물 및 하이드로겔 제조방법{HYDROGEL COMPOSITION HAVING ALGINATE COUPLED METHACRYLATE AND MANUFACTURING METHOD OF HYDROGEL}
본 발명은 메타크릴레이트가 결합된 알지네이트를 포함하는 하이드로겔 조성물 및 하이드로겔 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로는 히드록실기에 메타크릴레이트가 결합된 알지네이트를 포함하는 하이드로겔 조성물 및 상기 하이드로겔의 제조방법에 관한 것이다.
천연 다당류를 사용하여 만든 하이드로겔은 주로 화학 반응없이 물리적 상호 작용을 통해 하이드로겔을 형성할 수 있기 때문에 약물 전달 시스템 및 조직 공학 스캐 폴드와 같은 생물 의학 공학 응용 분야에 오랫동안 채택되어 왔다. 예를 들어, 아가로스 하이드로겔은 냉각시 아가로스 용액의 열 겔화(thermogelling)에 의해 쉽게 개발되며, 이는 광범위한 수소 결합을 유도한다. 하전된 작용기를 갖는 다당류는 또한 반대 전하를 갖는 다가 이온과의 이온 가교에 의해 하이드로겔로 발전할 수 있다. 예를 들어, 각각 카르복실레이트 및 설포네이트기를 포함하는 음이온성 알지네이트 및 카라기난은 이온 가교 결합되어 Ca2+와 같은 양이온에 의해 하이드로겔을 형성하는 반면, 아민기를 갖는 키토산은 β-글리세로포스페이트와 같은 음이온성 종과 가교 결합될 수 있다.
이러한 물리적으로 가교된 다당류 하이드로겔은 제작에 매우 효율적이고 천연 화학 구조를 유지할 수 있지만 원하는 범위와 방식으로 물리역학 및 생물학적 특성을 제어하는 것은 매우 어렵다.
대부분의 다당류는 점성이 높은 수용액이 되어 작업 농도 범위를 제한한다. 이것은 필연적으로 제한된 범위의 재료 특성을 가진 하이드로겔을 생성한다. 또한 물리적으로 가교된 하이드로겔은 일반적으로 가역적이므로 특정 환경 조건에서 구조적 완전성과 물리적 기계적 특성이 심하게 파괴될 수 있다. 예를 들어, 열-가역성(thermally-reversible) 아가로스 하이드로겔은 더 높은 온도에서 용해되고 이온-가교된 알지네이트 하이드로겔도 킬레이터의 존재하에 용해된다.
이러한 문제를 극복하기 위해 화학적 가교 전략이 종종 사용되어 재료 특성과 제조 및 가공을 추가로 제어할 수 있다. 예를 들어, 아민기를 갖는 키토산은 쉬프 염기 형성(Schiff base formation)을 통해 글루타르알데히드와 반응하거나 친핵성 치환을 통해 지니핀과 반응하여 하이드로겔을 형성할 수 있다. 대안적으로, 다당류는 종종 화학적으로 변형되어 가교 반응을 위한 반응성 부위인 알데히드, 카테콜, 티올 및 (메트)아크릴레이트와 같은 반응성 작용기를 제공한다. 이러한 접근법은 하이드로겔 개발을 위해 성공적으로 구현되었지만, 유기 용매에서 다당류의 용해도가 심각하게 제한되어 있기 때문에 접합 화학을 다양화하고 다당류에 대한 다중 화학 반응을 도입하는 것은 여전히 어려운 일이다.
대한민국 등록특허 제10-1360942호
다당류에 대한 상이한 화학 반응 경로를 수용하는 전략은 상이한 기능적 부분을 제시하기 위해 본원에서 사용되었다. 널리 사용되는 알지네이트 나트륨을 모델 다당류로 사용하여, 소수성을 증가시켜 디메틸설폭사이드와 같은 극성 비양성자성 용매에서 용해를 촉진하기 위해 먼저 알지네이트 나트륨 반대 이온을 테트라부틸암모늄(tetrabutylammonium, TBA) 이온으로 교환했다. 이것은 알지네이트에 더 넓은 범위의 화학 반응을 적용할 수 있게 했다.
더욱이, 알지네이트는 하이드록실기와 카르복실기의 두 가지의 다른 작용기를 가지고 있기 때문에, 이 두 가지 다른 작용기는 서로 다른 반응식을 사용하여 알지네이트에 독립적으로 접합될 수 있다.
다중 접합의 이러한 독립적인 제어를 입증하기 위해, 라디칼 중합을 거쳐 하이드로겔을 형성할 수 있는 메타크릴레이트를 하이드록실기에 고리-열림(ring-opening) 친핵성 첨가를 통해 TBA-alginate에 접합한 반면, RGD 펩티드 및 젤라틴과 같은 세포 접착 분자(CAM)는 카르복실 그룹에 아미드 커플링에 의해 접합된다(도 1a). TBA-alginate는 원래의 알지네이트 나트륨으로 다시 교환되었다.
생성된 CAM-결합 메타크릴 알지네이트(CAM-linked methacrylic alginate)를 가교제로 사용하여 메타크릴레이트 치환의 농도와 정도에 의해 제어되는 다양한 기계적 특성을 가진 하이드로겔을 생성하면서 독립적으로 세포 접착 특성을 부여했다(도 1b).
본 발명의 일 실시예에 따르면, 히드록실기에 메타크릴레이트가 결합된 알지네이트를 포함하는 하이드로겔 조성물을 제공한다. 보다 바람직하게, 상기 메타크릴레이트는 알지네이트 2번 탄소의 히드록실기에 결합될 수 있다.
상기 알지네이트는 하기 [화학식 1]로 표시되는 화합물일 수 있다;
[화학식 1]
Figure 112020109092894-pat00001
여기서, X는 테트라알킬암모늄 또는 Na 이고, m은 정수 ≥ 1 이다.
또한 상기 알지네이트는 하기 [화학식 2] 또는 [화학식 3]으로 표시되는 화합물일 수 있다;
[화학식 2]
Figure 112020109092894-pat00002
여기서, X는 테트라알킬암모늄 또는 Na 이고, n과 m은 정수 ≥ 1 이다,
[화학식 3]
Figure 112020109092894-pat00003
여기서, X는 테트라알킬암모늄 또는 Na 이고, n과 m은 정수 ≥ 1 이고, R1은 CONH-(세포 결합 분자)이다.
상기 테트라알킬암모늄은 화학식 [NR1R2R3R4]+(이때 R1, R2, R3 및 R4는 서로 동일하거나 다를 수 있고, 직쇄 C1-C6 알킬, 분지쇄 C1-C6 알킬, 치환 C6-C10 아릴, 비치환 C6-C10 아릴 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택됨)으로 표시될 수 있으며, 보다 바람직하게는 테트라부틸암모늄(tetrabutylammonium)이다.
상기 [화학식 3]에서 n과 m의 합계에 대한 m의 백분율은 1 ~ 50%인 것이 바람직하다. n과 m의 합계에 대한 m의 백분율은 본 명세서에서 메타크릴레이트 치환 정도(DSMA)로 언급된다.
상기 세포 결합 분자는 RGD(Arg-Gly-Asp), RGDS(Arg-Gly-Asp-Ser), RGDC(Arg-Gly-Asp-Cys), RGDV(Arg-Gly-Asp-Val), RGES(Arg-Gly-Glu-Ser), RGDSPASSKP(Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Ala-Ser-Ser-Lys-Pro), GRGDS(Gly-Arg-Gly-Asp-Ser), GRADSP(Gly-Arg-Ala-Asp-Ser-Pro), KGDS(Lys-Gly-Asp-Ser), GRGDSP(Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro), GRGDTP(Gly-Arg-Gly-Asp-Thr-Pro), GRGES(Gly-Arg-Gly-Glu-Ser), GRGDSPC(Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Cys), GRGESP(Gly-Arg-Gly-Glu-Ser-Pro), SDGR(Ser-Asp-Gly-Arg), YRGDS(Tyr-Arg-Gly-Asp-Ser), GQQHHLGGAKQAGDV (Gly-Gln-Gln-His-His-Leu-Gly-Gly-Ala-Lys-Gln-Ala-Gly-Asp-Val), GPR(Gly-Pro-Arg), GHK(Gly-His-Lys), YIGSR(Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg), PDSGR(Pro-Asp-Ser-Gly-Arg), CDPGYIGSR(Cys-Asp-Pro-Gly-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg), LCFR(Leu-Cys-Phe-Arg), EIL(Glu-Ile-Leu), EILDV(Glu-Ile-Leu-Asp-Val),EILDVPST(Glu-Ile-Leu-Asp-Val-Pro-Ser-Thr), EILEVPST(Glu-Ile-Leu-Glu-Val-Pro-Ser-Thr), LDV(Leu-Asp-Val) 및 LDVPS(Leu-Asp-Val-Pro-Ser)로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 펩타이드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 세포 결합 분자의 또 다른 예로 상기 세포 결합 분자는 젤라틴, 콜라겐, 피브로넥틴, 젤라틴, 라미닌, 비트로넥틴, 폴리카프로락톤(PCL), 폴리에틸렌옥사이드(PEO), 폴리비닐알코올(PVA) 및 폴리비닐피롤리돈(PVP)로 이루어진 그룹으부터 선택된 하나 이상의 생체적합성 고분자일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 하이드로겔 조성물은 아크릴 단량체 및 광개시제를 더 포함할 수 있다.
상기 아크릴 단량체는 소듐아크릴레이트(sodium acrylate), 소듐메타크릴레이트(sodium methacrylate), 아크릴아마이드, C1-C15 포화 알킬 아크릴레이트 또는 메타크릴레이트, 하이드록시기가 1 내지 3개 치환된 C1-C15 하이드록시알킬 아크릴레이트 또는 메타크릴레이트; 및 N,N-디(C1-C15 포화 또는 불포화 알킬)아크릴아마이드로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있으며, 보다 구체적으로 메타크릴레이트 젤라틴(methacrylate gelatin), 폴리에틸렌글리콜에틸메타아크릴레이트(polyethylene glycol ethyl methacrylate, PEGMA), 에틸렌글리콜에틸아크릴레이트 (polyethylene glycol ethyl acrylate, PEGA), 폴리에틸렌글리콜에틸디아크릴레이트 (polyethylene glycol ethyl diacrylate, PEGDA), 폴리에틸렌글리콜에틸디메타아크릴레이트 (polyethylene glycol ethyl dimethacrylate, PEGDMA)로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 광개시제는 수용성 광개시제로 2-hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone), 1-hydroxy-cyclohexyl-phenyl-ketone, 2,2-Dimethoxy-1,2-diphenylethan-1-one, 2-benzyl-2-dimethylamino-1-(4-morpholinophenyl)-1-butanone, 2-methyl-4′-(methylthio)-2-morpholinopropiophenone, TPO-Na (sodium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate), TPO-Li (lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate), BAPO-ONa (sodium bis(mesitoyl)phosphinate), BAPO-OLi (lithium bis(mesitoyl)phosphinate)으로 이루어진 군 중에서 선택된 적어도 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
대부분의 광개시제는 지용성이기 때문에 수용액상에서 제작해야 하는 하이드로젤에는 사용할 수 없다. 그래서 특별히 제작된 수용성 광개시제를 사용해야 한다. Ciba사의 Irgacure 패밀리 중에서는 Irgacure 2959 (2-hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone)가 용해도가 제일 높고 생체적합성이 높아 가장 많이 사용된다. 그 이외에 Irgacure 184 (1-hydroxy-cyclohexyl-phenyl-ketone), Irgacure 651 (2,2-Dimethoxy-1,2-diphenylethan-1-one), Irgacure 369 (2-benzyl-2-dimethylamino-1-(4-morpholinophenyl)-1-butanone), Irgacure 907 (2-methyl-4′-(methylthio)-2-morpholinopropiophenone)이 사용될 수 있다.
또한, Phosphine계열 중에는 MAPO (Mono-acylphosphine oxide) 혹은 BAPO (bi-sacylphosphine oxide)를 포함한 화합물이 많이 사용된다.
MAPO 중에서 수용성을 지난 광개시제는 TPO (diphenyl(2,4,6-trimethylbenzoyl)phosphine oxide)의 염(salt)인 TPO-Na (sodium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate), TPO-Li (lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate, LAP)이 주로 사용된다. BAPO 중에서는 마찬가지로 BAPO-ONa (sodium bis(mesitoyl)phosphinate), BAPO-OLi (lithium bis(mesitoyl)phosphinate)가 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 상기 하이드로겔 조성물로 제조된 하이드로겔을 제공한다.
상기 하이드로겔은 메타크릴레이트와 결합된 우론산(uronic acid) 잔기의 수가 증가할수록 하이드로겔의 탄성 계수 또는 세포 증식 속도가 증가할 수 있다. 여기서 메타크릴레이트와 결합된 우론산(uronic acid) 잔기의 수는 메타크릴레이트 치환 정도(DSMA)와 동일한 의미이다.
또한 상기 하이드로겔은 아크릴 단량체의 농도가 증가할수록 하이드로겔의 탄성 계수가 증가할 수 있다.
상기 하이드로겔은 세포 배양, 분화 또는 증식에 사용될 수 있다.
상기 세포는 부착 의존성 세포로, 심근세포, 혈관내피세포, 지방세포, 상피세포, 섬유아세포, 골아세포, 연골세포, 간세포, 자궁경부세포, 암세포 및 중간엽 줄기세포로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 1) 소듐 알지네이트(sodium alginate)의 양이온 교환을 통하여 테트라알킬암모늄 알지네이트를 생성하는 단계; 및 2) 상기 알지네이트의 히드록실기에 메타크릴레이트를 결합하는 단계를 포함하는 하이드로겔 제조방법을 제공한다.
상기 테트라알킬암모늄은 화학식 [NR1R2R3R4]+(이 때 R1, R2, R3 및 R4는 서로 동일하거나 다를 수 있고, 직쇄 C1-C6 알킬, 분지쇄 C1-C6 알킬, 치환 C6-C10 아릴, 비치환 C6-C10 아릴 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택됨)으로 표시될 수 있으며, 보다 바람직하게는 테트라부틸암모늄(tetrabutylammonium)이다.
상기 2) 단계는 유기 용매 하에서 테트라알킬암모늄 알지네이트 및 글리시딜 메타크릴레이트의 고리-열림(ring-opening) 친핵성 첨가 반응을 통하여 수행될 수 있으며, 상기 유기 용매는 디메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO), 디메틸포름아미드(dimethylformamide, DMF), 디메틸아세트아미드(dimethylacetamide), N-메틸-2-피롤리돈(N-methyl-2-pyrrolidone, NMP), 및 헥사메틸포스포아미드(hexamethylphosphoramide, HMPA)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 제조방법은 2) 단계 이후에, 3) 테트라알킬암모늄을 Na+로 양이온 교환하여 메타크릴릭 알지네이트를 합성하는 단계를 더 포함할 수 있다.
또한 상기 제조방법은 상기 1) 단계 이후에, 1-1) 카르보디이미드 커플링을 통하여 알지네이트의 카르복실기에 세포 결합 분자를 결합하는 단계를 더 포함할 수 있다.
또한 상기 제조방법은 상기 3) 단계 이후에, 4) 메타크릴릭 알지네이트, 아크릴 단량체 및 광개시제를 혼합하는 단계 및 5) UV를 조사하여 광가교시키는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 메타크릴릭 알지네이트는 아크릴 단량체 총 중량 대비 0.1 ~ 10 wt% 첨가될 수 있으며, 상기 아크릴 단량체의 농도는 5 ~ 50%(w/v), 바람직하게는 20 ~ 40%, 가장 바람직하게는 30 ~ 40%일 수 있다.
본 발명에 따른 하이드로겔 조성물은 알지네이트의 나트륨 반대 이온을 친유성을 가지는 테트라알킬암모늄으로 대체하여 유기 용매에서 반응이 가능하여, 더 높은 효울을 가진 다양한 유기 반응이 가능할 뿐만 아니라, 메타크릴레이트를 알지네이트의 히드록실기와 결합시킴으로써 고유한 알지네이트의 기능을 유지할 수 있고, 상기 메타크릴레이트의 치환 정도에 따라서 하이드로겔의 기게적 특성을 제어할 수 있는 장점이 있다.
도 1은 (a) 메타크릴 알지네이트(MAlg) 및 (b) 세포-접착 분자(CAM) 접합된 메타크릴 알지네이트(MAlg)의 합성의 합성 단계를 개략적으로 나타낸 도면이다.
도 2는 메타크릴레이트 치환 정도의 변화에 따른 Malg의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸 도면이다.
도 3은 (a) MAlg, RGD-MAlg 및 gel-MAlg의 대표적인 1H-NMR 스펙트럼 및 (b) 다양한 DSMA에서 RGD-MAlg의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸 도면이다.
도 4는 MAlg의 DSMA에 의해 하이드로겔의 기계적 특성을 나타내는 그래프이다; 다양한 DSMA에서 (b, c) PAAm-MAlg 하이드로겔 및 (d, e) PEGMA-MAlg 하이드로겔의 탄성 계수(E); (b, d) 10 %, (c, e) 20 % PAAm.
도 5는 다양한 DSMA에서 MGel-MAlg 하이드로겔의 탄성 계수(E)를 나타내는 그래프이다; (a) 6 %, (b) 8 %, and (c) 10 % MGel.
도 6은 상이한 반대 이온을 포함하는 (a) PAAm-MAlg 하이드로겔 및 (b) PEGMA-MAlg 하이드로겔의 탄성 계수(E)를 나타내는 도면이다; TBA+ 및 Na+.
도 7은 (a, b) RGD-MAlg 또는 (c, d) gel-MAlg와 가교 결합된 PAAm 하이드로겔의 탄성 계수(E)를 나타내는 도면이다; PAAm의 농도는 (a, c) 10 % 및 (b, d) 20% 이다.
도 8은 (a) 다양한 DSMA로 MGel-MAlg에 캡슐화된 섬유아세포의 광학 및 형광 현미경 이미지(스케일 막대 : 100 um)를 나타내며, 세포는 살아있는(녹색) 및 죽은(적색) 세포를 나타내기 위해 형광 표지되었다. (b) 7일까지 배양하는 동안 다양한 시간에서의 세포 생존력을 나타내는 그래프이다. (c) 정규화된 생존 세포수(N t/N 0)는 시간이 지남에 따라 측정되었다. (d) (c)의 그래프를 Eq.(1)(*p<0.05)로 피팅하여 얻은 증식률(k P )을 나타내는 그래프이다.
도 9는 RGD-MAlg의 세포 접착 특성은 최대 5일까지 다양한 RGD-MAlg의 DSMA로 가교된 PEGMA 하이드로겔의 표면에서 세포 배양 이미지를 나타내는 도면이다.
본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시 예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
<실시예>
1. 테트라부틸암모늄(TBA) 알지네이트 합성
TBA 알지네이트는 양이온 교환을 통해 알지네이트 나트륨으로부터 생성되었다. 소듐 알지네이트(sodium alginate)를 먼저, 에탄올/1M HCl(1:1) 혼합물에 첨가하고 4℃에서 밤새 교반하여 알긴산(alginic acid)을 생성했다. 알긴산(alginic acid)을 탈 이온수(DI)에 분산시키고, 테트라부틸암모늄 하이드록사이드(tetrabutylammonium hydroxide)(물 중 40%)를 알지네이트가 완전히 용해될 때까지 천천히 첨가하였다. pH를 8로 조정한 후 용액을 DI water로 광범위하게 투석하고 동결 건조하여 TBA-alginate를 얻었다.
2. 메타크릴릭 알지네이트(methacrylic alginate, MAlg)의 합성
상기 양이온 교환(cation exchange)을 통해 소듐 알지네이트로부터 개발된 TBA-알지네이트(0.15g)를 5% 테트라부틸암모늄 플루오라이드(TBAF, tetrabutylammonium fluoride) 및 1% 4-디메틸아미노피리딘(DMAP, 4-dimethylaminopyridine)이 첨가된 10mL 디메틸설폭사이드(DMSO, dimethyl sulfoxide)에 용해시켰다. 글리시딜 메타크릴레이트(glycidyl methacrylate)를 상기 용액에 천천히 첨가하고 건조 N2 가스 하에서 48시간 동안 40℃에서 반응시켰다. 과량의 디에틸 에테르(diethyl ether)에 침전시켜 수득한 조생성물을 탈이온수(DI)에 용해시키고 pH가 11 이상으로 증가할 때까지 1N Na2CO3 용액을 계속 첨가하여 TBA+를 Na+로 교환하였다. 상기 용액을 탈이온수에 대해 광범위하게 투석하고 동결 건조하여 최종 생성물을 얻었다. 글리시딜 메타크릴레이트(glycidyl methacrylate)의 양은 메타크릴레이트와 결합된 우론산(uronic acid) 잔기의 백분율로 정의되는 메타크릴레이트 치환 정도(DSMA)를 제어하기 위해 변화시켰다; 0.15g TBA-알지네이트 당 25('DS1'), 51('DS2'), 102('DS3'), 205('DS4'), 409('DS5') 및 767('DS6') mg. 화학 구조와 DS는 1H-NMR 분광법(400-MR DD2, Agilent)으로 분석되었다.
3. 세포 부착 분자(CAM)-접합된 MAlg의 합성
젤라틴 또는 GRGDS('RGD') 펩티드인 세포 접착 분자(cell adhesion molecule)는 메타크릴레이트를 알지네이트에 접합하기 전에 알지네이트에 접합되었다. 먼저, TBA-알지네이트(0.15g)를 10mL DMSO/TBAF에 용해시켰다. 0.04g 디이소프로필카르보디이미드(diisopropylcarbodiimide), 0.03g N-히드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide) 및 0.3g 젤라틴 (또는 0.053g GRGDS 펩티드)을 첨가하고 실온에서 24시간 동안 반응시켰다. 알지네이트에 대한 메타크릴레이트 접합은 위에서 설명한 절차를 사용하여 즉시 현장(in situ)에서 이어졌다. 간단히 말하면, 0.1g DMAP와 글리시딜메타크릴레이트를 상기 혼합물에 첨가하고 건조 N2 가스 하에서 48시간 동안 40℃에서 반응시킨다. 글리시딜메타크틸레이트의 양을 변화시켜 4개의 다른 DSMA를 제조하였다; 0.15g TBA-알지네이트 당 409 ('DS1'), 614 ('DS2'), 767 ('DS3') 및 1278 ('DS4'), 각각 TBA-우론산 잔기의 8, 12, 15 및 24 몰 당량에 해당함. 더 큰 젤라틴 분자가 메타크릴레이트 접합 및 후속 하이드로겔 형성을 방해하는 것을 방지하기 위해, 여기에 사용된 젤라틴은 트립신을 이용한 효소 가수 분해를 사용하여 시판되는 고분자량 300 bloom 젤라틴에서 1000g mol-1 이하로 짧게 절단되었다. 표준 고체상 펩타이드 합성을 사용하여 GRGDS 펩타이드를 얻었다.
4. Malg-연결 하이드로겔의 제작 및 특성화
모노머, MAlg(또는 CAM-MAlg) 및 0.2% Irgacure®2959를 광개시제로 함유하는 겔 전구체 용액을 제조하였다. 세 가지 다른 모노머가 사용되었다; 아크릴아마이드(AAm), 폴리(에틸렌 글리콜) 메타크릴레이트(PEGMA) 및 메타크릴젤라틴(methacrylic gelatin, MGel). AAm 또는 PEGMA의 경우, 10% 및 20% AAm 또는 PEGMA에 대해 MAlg 농도를 각각 0.1 ~ 1 % 및 1 ~ 4 %로 변화시켰다. MGel의 경우, 6%, 8% 및 10% MGel에 대해 MAlg 농도를 0.1에서 1%까지 변화시켰다. 용액을 두 개의 유리판(1mm 두께 스페이서) 사이에 놓고 UV (2분, 800mW cm-1, 모델 S1500, Omnicure)와 광가교하여 하이드로겔을 제조하였다. 하이드로겔 디스크(직경 5mm)를 천공하고 추가적인 특성화(characterization)가 이루어질 때까지 PBS(pH 7.4)에 24시간 동안 담가 두었다.
기계적 특성화를 위해 하이드로겔에 대해 단축 압축 실험을 수행했다. 간단히 말하면, 하이드로겔 디스크를 1 mm min-1의 속도로 일축 압축하고, 변형률 대 응력(stress) 곡선을 얻었다 (모델 3343, Instron). 탄성계수는 곡선의 직선 영역의 기울기 (처음 10 %)로서 결정되었다. 팽윤 비(swelling ratio)는 완전히 팽윤된 하이드로겔 대 건조된 폴리머 메쉬의 중량비로 측정되었다.
5. 특성화
CAM-Malg-연결 하이드로겔의 세포 접착 특성을 테스트하기 위해 각 하이드로겔 디스크를 24-웰 플레이트의 웰에 배치하고 50μL 세포 용액을 하이드로겔 위에 놓았다. 세포 용액에는 1 x 106 세포 mL-1의 밀도로 10% 소태아 혈청 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 Dulbecco's Modified Eagle 배지인 세포 배양 배지에 분산된 NIH3T3 섬유아세포(ATCC)가 포함되어 있다. 세포 부착을 위해 1시간 후, 하이드로겔을 PBS로 세척하고 5% CO2 하에서 37℃ 세포 배양 배지에서 배양하였다. 시간 경과에 따른 세포 부착 및 후속 증식을 도립 현미경(XDS-3FL, Optika)으로 모니터링했다.
3D 세포 캡슐화를 위해, 세포를 MGel-MAlg 겔 전구체 용액에 1 x 106 세포 mL-1로 분산시키고, 두 개의 유리판(0.4mm 두께 스페이서) 사이에 배치하고 1분 동안 UV로 광가교시켰다. 하이드로겔 디스크(직경 5mm)를 펀칭하고 5% 37℃ CO2 조건하에서 세포 배양 배지에서 배양했다. 세포 생존력을 결정하기 위해, 세포를 calcein-AM 및 ethidium homodimer-1로 처리하여 각각 살아있는(녹색 형광) 및 죽은(적색 형광) 세포(LIVE/DEAD Cell Viability Assay, Thermo Fisher)로 나타내었다. 생존율은 주어진 시간에 살아있는 세포의 백분율로 보고 되었다.
캡슐화된 세포의 증식률(k P)은 다음과 같은 멱 법칙(power-law) 방정식을 사용하여 생존 가능한 세포의 분수 수(fractional number)(N t/N 0) 대 시간(t)의 플롯을 피팅하여 계산했다.
Figure 112020109092894-pat00004
(1)
여기서 N t 는 시간에 살아있는 세포의 수이고, N 0 은 겔화 직후 측정된 최초의 살아있는 세포의 수이다(t=0).
<실험결과>
1. 메타크릴알지네이트(MAlg) 및 세포 접착 분자(CAM)-접합된 MAlg의 합성 및 특성화
알지네이트는 약물 전달 및 조직 공학, 식품 및 제약 첨가제와 같은 생의학 응용 분야에 가장 널리 사용되는 천연 고분자 중 하나이다. 그러나 극히 친수성 음이온성 다당류인 수성 완충 조건에서만 용해되기 때문에 화학적 변형의 범위는 극히 제한적이다. 알지네이트에 다기능성을 부여하기 위해, 나트륨 반대 이온(Na-alginate)을 친유성(lipophilic)으로 알려진 테트라메틸암모늄(tetramethylammonium) 반대 이온(TBA-alginate)으로 대체하여 알지네이트를 유기 용매에 용해하였다. 그 결과, TBA-alginate는 DMSO(dimethyl sulfoxide)와 같은 극성 비양자성 용매에 쉽게 용해되었다.
하이드로겔 제조를 위한 가교제로 활용하기 위해, 알지네이트는 DMSO에서 알지네이트의 하이드록실기와 글리시딜 메타크릴레이트의 고리-열림(ring-opening) 친핵성 반응을 통해 메타크릴레이트와 먼저 접합되었다(도 1a). 또한 메타크릴레이트 치환 정도(DSMA)를 변화시켜 농도 변화없이도 가교 밀도를 효과적으로 조절하였다.
알지네이트 변형에 대한 이전 연구는 알지네이트의 카르복실기와 아미드 결합 형성을 위하여, 주로 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드(EDC) 커플링 사용을 수반하였다. 그러나 수성 기반 EDC 커플링은 일반적으로 광범위한 치환도를 제어하기에 충분히 효율적이지 않다.
또한 카르복실레이트는 알지네이트의 중요한 특성이며 이온 상호 작용의 중요한 역할을 하기 때문에, 화학 반응을 통해 카르복실기의 상당 부분을 제거하면 고유한 알지네이트 기능(예를 들어 수분 흡수 및 이온 가교)이 변경될 수 있다. 반면에, 카르복실레이트 그룹보다 하이드록실 그룹이 더 많기 때문에 메타크릴레이트를 알지네이트의 하이드록실 그룹에 접합하면 것은 더 큰 치환도를 수용할 수 있다.
다양한 양의 글리시딜 메타크릴레이트를 TBA-alginate와 반응시켰다. MAlg(TBA+)의 DSMA 결과는 1H-NMR 스펙트럼으로 확인되었다. 6개의 서로 다른 DSMA가 개발되었다; 3, 6, 10, 15, 18 및 22%, 이는 DS1 ~ DS6로 표시된다. MAlg의 TBA+는 결국 원래 Na+로 다시 교환되었고, TBA+의 제거와 잔류 DMAP도 1H-NMR 스펙트럼에 의해 확인되었다(도 2).
하이드록실과 카르복실레이트라는 두 가지 다른 유형의 작용기를 가지고 있기 때문에 두 가지 다른 반응 경로가 알지네이트에 적용될 수 있다.
다양한 기능성 모이어티로 변형된 알지네이트의 다양성을 입증하기 위해, 세포 접착 분자(CAM)를 카르보디이미드 커플링을 통해 알지네이트의 카르복실레이트기에 접합시킨 다음, 앞서 언급한 메타크릴레이트를 사용하여 생성된 하이드로겔(CAM-MAlg)에 세포 접착 특성뿐만 아니라 가교 기능을 부여했다. 본 명세서에서는 생의학 응용 분야에서 널리 사용되는 두 가지 다른 CAM, GRGDS 펩티드(RGD-MAlg) 및 젤라틴(gel-MAlg)이 사용되었다. CAM-MAlg에서 CAM 및 메타크릴레이트의 존재는 1H-NMR 스펙트럼으로 확인되었다(도 3a). 알지네이트 나트륨의 특성 변화를 최소화하기 위해 카르복실레이트의 일부만 CAM(3%)으로 대체했다.
또한 CAM-MAlg의 DSMA 제어는 1H-NMR로도 확인되었다(도 3b). RGD-MAlg의 DSMA는 6, 11, 16, 21%로 동일한 반응 조건에서 MAlg보다 낮았다. 반면 gel-MAlg의 DSMA는 24, 28, 37, 72%로 동일한 반응 조건에서 MAlg와 유사하였다. 이러한 불일치는 아마도 더 긴 젤라틴 폴리펩티드가 메타크릴레이트 접합을 위한 추가 반응 부위를 제공하여 접합을 효과적으로 증가시키기 때문일 수 있다. 이 결과는 알지네이트에 대한 메타크릴레이트 접합이 CAM이 있는 경우에도 다양한 정도로 진행될 수 있음을 보여 주어 원팟 이중 합성 방식의 편리함을 보여준다.
2. MAlg-연결 하이드로겔의 기계적 성질
(1) 단량체 유형의 영향
MAlg의 가교 효능을 평가하기 위해, 다양한 DSMA를 갖는 MAlg를 사용하여 세 가지 유형의 하이드로겔을 개발했다. 폴리아크릴아미드(PAAm), 폴리(에틸렌 글리콜) 메타크릴레이트(PEGMA) 및 메타크릴 젤라틴(MGel)(도 4a). 이러한 하이드로겔은 다양한 유형의 단량체 시스템을 사용하여 만들어진다; 단량체(PAAm), 거대 단량체(PEGMA), 다기능성 거대 단량체(MGel). 본 발명자는 물리적 특성의 차이가 MAlg 간의 상호 작용 정도를 다양하게 하여 하이드로겔의 기계적 특성이 달라진다는 가설이 세웠다. 또한 DSMA를 통한 하이드로겔의 이러한 기계적 특성은 CAM이 있더라도 제어할 수 있을 것이다.
PAAm-MAlg 하이드로겔의 경우 아크릴아미드의 농도는 10% 또는 20%로 유지되었다. 10%에서 MAlg 농도는 0.5 ~ 2%로 변화되었고, 20%에서 MGel 농도는 모노머 대 가교제의 질량비를 일정하게 유지하면서 1 ~ 4%로 변화되었다. 예상대로 PAAm-MAlg 하이드로겔의 탄성 계수는 MGel 농도와 DSMA 모두와 함께 증가했다(도 4b 및 4c). 10% 아크릴아미드에서 계수는 다양한 DSMA를 사용하여 2% MAlg로 5 (± 0.3)에서 40.4 (± 2.1) kPa까지 제어되었다. 유사하게, 20% 아크릴아미드에서 계수는 다양한 DSMA와 함께 4% MAlg로 20 (± 0.5)에서 163 (± 2.3) kPa까지 광범위하게 변화하였다. DSMA를 사용한 탄성 계수의 유사한 제어가 낮은 MAlg 농도에서 입증되었지만 그 정도는 크지 않았다. 팽창 비율(swelling ratio)의 경향은 탄성 네트워크의 잘 알려진 특성인 탄성 계수의 경향과 반대였다. 증가된 가교 밀도는 기계적 강성을 증가시키지만 가교 사이의 분자량을 감소시켜 팽창 특성을 감소시키기 때문이다. 이러한 결과는 MAlg가 다양한 기계적 특성을 가진 하이드로겔을 형성하기 위해 PAAm의 가교 밀도를 제어하는데 매우 효과적이라는 것을 입증했다.
하이드로겔을 생성하기 위해 거대 단량체인 PEGMA로 동일한 실험을 수행하였다. 탄성 계수는 PAAm과 달리 MAlg의 DSMA에 의해 유사하게 제어될 수 있지만, 기계적 특성은 일반적으로 훨씬 더 낮았고, 팽윤 비율은 PEGMA-MAlg 하이드로겔에 대해 동일한 농도에서 훨씬 더 높았다(도 4d 및 4e). 또한, 하이드로겔은 MAlg의 낮은 DSMA에서 형성되지 않았다. 예를 들어, 10% PEGMA에서, 각각 0.5%, 1% 및 2% MAlg에 대하여, 하이드로겔 형성에 대한 가장 낮은 DSMA는 각각 DS2, DS2 및 DS4 이었다. 이 결과는 PEGMA에 대한 MAlg의 가교 효율이 PAAm에 대한 것보다 현저히 낮았으며, 이는 아마도 가교 반응을 위해 MAlg와의 충분한 상호 작용을 방해하는 PEG 사슬의 입체 장애 때문일 수 있다. 더욱이, 20% PEGMA 및 4% MAlg에서 탄성 계수는 낮은 MAlg 농도에서와 비교해 크게 감소했으며 하이드로겔은 DS2 및 DS3에서만 형성되었고 더 낮은(DS1) 그리고 더 높은(DS4-DS6) DSMA에서는 형성되지 않았다. 이는 상당히 높은 농도에서 MAlg와 PEGMA 사이의 상 분리가 증가했기 때문일 수 있다.
PAAm과 PEGMA 모두 MAlg의 DSMA를 증가시키는 동안, 계수의 전체 추세에서 상당한 편차가 있었고, DS5에서 계수의 갑작스런 감소가 관찰되었다(도 4c 및 4e에서 #로 표시됨). 낮은 10% PAAm 및 PEGMA에서도 DSMA가 증가함에 따라 계수 증가 정도가 감소하였다. 이러한 비정상적인 거동은 DSMA와 함께 MAlg 분자 사이에 사슬 붕괴를 일으키는 소수성이 크게 증가하여 MAlg와 단량체 사이의 상당한 상 분리 및 불충분한 가교 반응 때문일 수 있다. DSMA에서 DS6으로의 추가 증가는 더 조밀하게 접목(graft)된 폴리머 아키텍처를 갖는 DS5에서 DS6으로의 coil-to-rod 전이를 통해 더 확장된 사슬 형태로 상 분리를 극복할 수 있다. 그 결과, 더 광범위한 가교 반응을 위해 이용 가능한 가교 부위의 수가 상당히 증가했다.
다양한 DSMA로 MAlg와 가교 결합된 MGel 하이드로겔의 경우, MGel 농도는 6에서 10%까지 변화시켰고 MAlg의 농도는 0.1에서 1%로 변화시켰다. MGel의 점도가 높기 때문에 MGel 농도 범위는 PAAm 및 PEGMA보다 낮다. 6% MGel에서 계수는 DSMA와 함께 모두 DS4까지 증가했다(도 5a). 0.1%에서 0.5% 사이에서 계수는 0.5%에서 분명히 더 높았지만 1%로 농도를 추가로 증가시키면 특히 DSMA가 높은 경우 0.5%에서보다 낮은 계수가 나타난다. MAlg 대 MGel (1 ~ 6)의 상대적 농도가 PAAm 및 PEGMA (1 ~ 10)보다 높았기 때문에 특히 더 높은 DSMA에서 상 분리를 겪을 가능성이 높아 가교 결합이 불충분했다. 또한 PEG보다 훨씬 더 높은 MW와 더 많은 동적 분자 구조를 가짐으로써 MGel이 MAlg와의 불충분한 물리적 상호 작용에 더 쉽게 영향을 받았다. 유사하게, 전체 계수가 더 높은 MGel 농도에서 증가했음에도 불구하고 계수는 더 높은 DSMA에서 1% MAlg 농도에서 실질적으로 감소했다(도 5b 및 5c).
6% 및 8% MGel의 MGel 하이드로겔은 또한 더 높은 DS6에서 다시 증가하기 전에 높은 DSMA (DS4 또는 DS5)에서 계수의 갑작스런 감소를 나타냈다(도 5에서 #로 표시됨). 이는 도 4c 및 4e에 표시된 PAAm 및 PEGMA 하이드로겔과 유사하지만 훨씬 더 큰 범위이다. 10% MGel에서 계수는 특히 높은 MAlg 농도에서 더 높은 DSMA에서 증가하기보다는 DS4 이후 계속 감소했다. 또한 DSMA를 사용한 계수의 변화는 훨씬 작았다. 이것은 DSMA와의 증가된 소수성이 MGel과 MAlg 사이의 유리한 상호 작용을 방해한다는 것을 나타낸다. 종합하면, MGel과 같은 더 큰 다기능 거대 단량체는 더 작은 단량체에 비해 고분자 가교제의 물리적 특성(즉, 농도 및 DSMA)의 영향을 받을 가능성이 더 높고, 이는 생성된 하이드로겔의 기계적 특성을 더 크게 변화시킨다.
(2) MAlg의 반대 이온의 효과
Na-alginate는 생의학 제품을 포함한 다양한 상업적 용도로 일반적으로 허용되는 형태의 알지네이트다. 따라서 MAlg를 생산하기 위한 화학적 변형에 사용된 TBA-알지네이트는 궁극적으로 Na-MAlg로 다시 전환되었다. 그럼에도 불구하고, 이전의 수많은 연구들은 이온 가교를 포함하여 알지네이트의 물리 역학적 특성에 대한 알지네이트의 다양한 반대 이온의 효과를 연구하였다. 따라서 MAlg의 다른 반대 이온, 특히 TBA+ 및 Na+가 생성된 하이드로겔의 기계적 특성에 미치는 영향을 조사했다. 다양한 DSMA를 갖는 PAAm-MAlg 하이드로겔 및 PEGMA-MAlg 하이드로겔은 이전에 기재된 바와 같이 제조되었다. PAAm (또는 PEGMA) 및 MAlg의 농도는 각각 10% 및 2% 이었다(도 6).
PAAm-MAlg 하이드로겔의 경우 TBA+에서 Na+로 전환하면 모든 DSMA에서 계수가 증가하고 팽창 비율이 감소했다(도 6a). 이것은 입체 장애를 일으킬 수 있는 큰 TBA+ 보다 더 작은 Na+를 갖는 아크릴아미드 단량체와 알지네이트 사슬 사이의 더 유리한 물리적 상호 작용 때문일 수 있다. TBA+에 의해 국소 소수성(local hydrophobicity)이 증가했을 가능성도 있다. 반면에 PEGMA-MAlg 하이드로겔에서는 반대 효과가 나타났는데, TBA+ 보다 Na+에 따라 계수가 감소하고 팽창 비율이 증가했다(도 6b). 이 결과는 TBA+의 존재가 저분자 아크릴아미드와는 다르게 고분자 PEGMA와의 물리적 상호 작용을 조절할 수 있음을 더욱 강조했다. 테트라부틸기는 물리적 얽힘(physical entanglement)과 반데르발스 힘의 증가를 통해 PEGMA 사슬과 더 유리하게 상호 작용하여 본질적으로 물리적 가교를 유도할 수 있다. 따라서 TBA+를 Na+로 대체하면 물리적 가교가 효과적으로 제거되어 기계적 물성이 저하된다. 전반적으로, 이러한 결과는 기계적 특성에 영향을 미치는 가교 효율에 대한 알지네이트의 반대 이온의 중요성을 강조한다.
(3) MAlg에 대한 세포 접착 분자(CAM)의 효과
알지네이트 백본에 CAM이 존재하면 MAlg와 모노머 사이의 효율적인 가교 반응을 방해할 수 있다고 추측할 수 있다. CAM이 있는 경우에도 하이드로겔의 가교 밀도를 제어하는 CAM-MAlg의 능력을 확인하기 위해 PAAm 하이드로겔을 CAM-MAlg로 제조하고 기계적 특성을 측정했다(도 7).
10% PAAm에서 1%, 2% 및 4% RGD-MAlg에 의해 제어되는 계수 범위는 각각 1.5 ~ 4.2, 3.7 ~ 13.5 및 5.3 ~ 36.3 kPa 이었다(도 7a). 20%의 더 높은 PAAm 농도에서 계수 범위는 동일한 RGD-MAlg 농도에서 2.0 ~ 7.7, 5.5 ~ 18.4 및 13.7 ~ 50.4 kPa 이었다(도 7b). 유사하게, 1%, 2% 및 4% gel-MAlg에 의해 제어되는 계수의 범위는 10% PAAm에서 각각 0.6 ~ 3.1, 0.8 ~ 12.7 및 2.6 ~ 43.8 kPa 이었다(도 7c). 20% PAAm에서 계수의 범위는 동일한 gel-MAlg 농도에서 0.5 ~ 10.9, 1.8 ~ 35.3 및 5.7 ~ 90.7 kPa로 증가했다(도 7d). CAM-MAlg에 의해 제어되는 하이드로겔의 기계적 특성의 범위는 CAM의 입체 장애 증가로 인해 주어진 DSMA 농도에서 MAlg에 의한 것만큼 넓지 않다는 점에 유의해야 한다. 그럼에도 불구하고, CAM-MAlg는 농도 및 DSMA로 생성된 하이드로겔의 가교 밀도를 성공적으로 제어할 수 있었다. 또한 DS3까지 RGD-MAlg에 의해 제어되는 계수 범위는 gel-MAlg에 의해 제어되는 계수보다 컸으며, 이는 아마도 부피가 더 큰 젤라틴의 입체 장애 때문일 수 있다. 그러나 DS4에 의해 얻은 가장 높은 계수는 gel-MAlg에서 더 컸다.
3. MAlg-결합 하이드로겔의 생체 적합성
MAlg-결합 하이드로겔의 생체 적합성은 먼저 하이드로겔 내에 세포를 캡슐화하고 생존력과 증식을 측정함으로써 평가되었다. DSMA에 의해 제어되는 기계적 특성이 세포에 미치는 영향을 조사했다. 먼저, 도 5에 표시된 대로, 섬유 아세포는 MGel 및 MAlg 농도를 각각 6% 및 1%로 유지하면서 다양한 DSMA를 사용하여 MGel-MAlg 하이드로겔에 캡슐화되었다(도 8). 젤라틴은 세포 활동에 필요한 세포 접착 및 매트릭스 분해 부위(matrix degradation site)를 제공하기 때문에 광가교된 젤라틴 하이드로겔은 생물의학 공학을 위한 세포 배양 플랫폼으로 널리 사용되었다. 1일째에 취한 초기 생존율은 모두 90% 이상이었으며, 이는 하이드로겔이 생체 적합성이 높음을 시사한다(도 8a 및 8b). 후속 세포 증식은 또한 MGel-MAlg 하이드로겔이 캡슐화된 세포에 적합한 미세 환경을 제공했음을 입증했다(도 8a 및 8c). 흥미롭게도, 세포 증식 속도는 DSMA, 특히 DS1에서 DS4로 상당한 증가를 보였는데, 이는 증가된 역학적 전이(mechanotransduction)을 통한 세포 증식을 촉진하는 하이드로겔의 더 큰 기계적 특성의 영향으로 인한 것으로 판단된다. 전반적으로, 이러한 결과는 MAlg-결합 하이드로겔의 생체 적합성을 분명히 강조했다.
기계적 특성을 제어하면서 CAM-MAlg에 의한 세포 접착을 유도하는 능력은 CAM-MAlg와 가교된 PEGMA 하이드로겔에서 세포를 배양하여 추가로 평가되었다(도 9). CAM이 없는 대조군인 PEGMA-MAlg 하이드로겔은 예상대로 유의한 세포 부착 및 후속 증식을 나타내지 않았다. 반면에 RGD-MAlg 또는 gel-MAlg와 가교 결합된 PEGMA 하이드로겔은 안정적인 초기 세포 접착력을 보인 후 시간이 지남에 따라 확산 및 증식을 보였다. 일반적으로, 세포 증식은 gel-MAlg 또는 RGD-MAlg 결합된 하이드로겔 모두에 대해 3일째까지 DSMA와 함께 증가했다. 그러나 증식 정도는 RGD-MAlg에서 더 컸는데, 이는 아마도 gel-MAlg에 비해 RGD-MAlg의 질량 당 세포 접착 펩티드의 밀도가 더 높기 때문일 수 있다. 또한, 더 높은 강성(더 높은 DSMA)에서 스트레스 섬유 형성 및 역학적 전이를 통한 섬유 아세포의 분극화의 특징으로 세포는 더 길어졌다. 종합하면, 이러한 결과는 가교제 및 세포 접착 부위로서 CAM-MAlg의 이중 기능적 특성을 효과적으로 입증하여 세포 배양 플랫폼의 편리한 제작을 가능하게 한다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (23)

  1. 하이드로겔에 있어서,
    상기 하이드로겔은 히드록실기에 메타크릴레이트가 결합된 알지네이트, 아크릴 단량체 및 광개시제를 포함하며,
    상기 알지네이트는 하기 [화학식 1], [화학식2], [화학식3]으로 표시되는 화합물을 1 또는 2이상 포함하며,
    상기 메타크릴레이트와 결합된 우론산(uronic acid) 잔기의 수가 증가할수록 하이드로겔의 탄성 계수가 증가하는
    하이드로겔.
    [화학식 1]
    Figure 112022123861515-pat00017

    [화학식 2]
    Figure 112022123861515-pat00018

    여기서, X는 테트라알킬암모늄 또는 Na 이고, n과 m은 정수 ≥ 1 이다,
    [화학식 3]
    Figure 112022123861515-pat00019

    여기서, X는 테트라알킬암모늄 또는 Na 이고, n과 m은 정수 ≥ 1 이고, R1은 CONH-(세포 결합 분자)이다.
    여기서, X는 테트라알킬암모늄 또는 Na 이고, m은 정수 ≥ 1 이다.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 하이드로겔의 세포 증식속도가 조절되는 하이드로겔.
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서,
    상기 n과 m의 합계에 대한 m의 백분율은 1 ~ 50%인 하이드로겔.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 세포 결합 분자는 RGD(Arg-Gly-Asp), RGDS(Arg-Gly-Asp-Ser), RGDC(Arg-Gly-Asp-Cys), RGDV(Arg-Gly-Asp-Val), RGES(Arg-Gly-Glu-Ser), RGDSPASSKP(Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Ala-Ser-Ser-Lys-Pro), GRGDS(Gly-Arg-Gly-Asp-Ser), GRADSP(Gly-Arg-Ala-Asp-Ser-Pro), KGDS(Lys-Gly-Asp-Ser), GRGDSP(Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro), GRGDTP(Gly-Arg-Gly-Asp-Thr-Pro), GRGES(Gly-Arg-Gly-Glu-Ser), GRGDSPC(Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Cys), GRGESP(Gly-Arg-Gly-Glu-Ser-Pro), SDGR(Ser-Asp-Gly-Arg), YRGDS(Tyr-Arg-Gly-Asp-Ser), GQQHHLGGAKQAGDV (Gly-Gln-Gln-His-His-Leu-Gly-Gly-Ala-Lys-Gln-Ala-Gly-Asp-Val), GPR(Gly-Pro-Arg), GHK(Gly-His-Lys), YIGSR(Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg), PDSGR(Pro-Asp-Ser-Gly-Arg), CDPGYIGSR(Cys-Asp-Pro-Gly-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg), LCFR(Leu-Cys-Phe-Arg), EIL(Glu-Ile-Leu), EILDV(Glu-Ile-Leu-Asp-Val),EILDVPST(Glu-Ile-Leu-Asp-Val-Pro-Ser-Thr), EILEVPST(Glu-Ile-Leu-Glu-Val-Pro-Ser-Thr), LDV(Leu-Asp-Val) 및 LDVPS(Leu-Asp-Val-Pro-Ser)로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 하이드로겔.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 세포 결합 분자는 젤라틴, 콜라겐, 피브로넥틴, 젤라틴, 라미닌, 비트로넥틴, 폴리카프로락톤(PCL), 폴리에틸렌옥사이드(PEO), 폴리비닐알코올(PVA) 및 폴리비닐피롤리돈(PVP)로 이루어진 그룹으부터 선택된 하나 이상의 생체적합성 고분자인 하이드로겔.
  7. 삭제
  8. 제1항에 있어서,
    상기 아크릴 단량체는 소듐아크릴레이트(sodium acrylate), 소듐메타크릴레이트(sodium methacrylate), 아크릴아마이드, C1-C15 포화 알킬 아크릴레이트 또는 메타크릴레이트, 하이드록시기가 1 내지 3개 치환된 C1-C15 하이드록시알킬 아크릴레이트 또는 메타크릴레이트; 및 N,N-디(C1-C15 포화 또는 불포화 알킬)아크릴아마이드로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 하이드로겔.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 아크릴 단량체는 메타크릴레이트 젤라틴(methacrylate gelatin), 폴리에틸렌글리콜에틸메타아크릴레이트(polyethylene glycol ethyl methacrylate, PEGMA), 에틸렌글리콜에틸아크릴레이트 (polyethylene glycol ethyl acrylate, PEGA), 폴리에틸렌글리콜에틸디아크릴레이트 (polyethylene glycol ethyl diacrylate, PEGDA), 폴리에틸렌글리콜에틸디메타아크릴레이트 (polyethylene glycol ethyl dimethacrylate, PEGDMA)로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 하이드로겔.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 광개시제는 수용성 광개시제로 2-hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone), 1-hydroxy-cyclohexyl-phenyl-ketone, 2,2-Dimethoxy-1,2-diphenylethan-1-one, 2-benzyl-2-dimethylamino-1-(4-morpholinophenyl)-1-butanone, 2-methyl-4′-(methylthio)-2-morpholinopropiophenone, TPO-Na (sodium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate), TPO-Li (lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate), BAPO-ONa (sodium bis(mesitoyl)phosphinate), BAPO-OLi (lithium bis(mesitoyl)phosphinate)으로 이루어진 군 중에서 선택된 적어도 하나 이상인 하이드로겔.
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 제1항에 있어서,
    아크릴 단량체의 농도가 증가할수록 하이드로겔의 탄성 계수가 증가하는 하이드로겔.
  14. 삭제
  15. 1) 소듐 알지네이트(sodium alginate)의 양이온 교환을 통하여 테트라알킬암모늄 알지네이트를 생성하는 단계;
    2) 상기 알지네이트의 히드록실기에 메타크릴레이트를 결합하는 단계;
    3) 상기 테트라알킬암모늄을 Na+로 양이온 교환하여 메타크릴릭 알지네이트를 합성하는 단계;
    4) 메타크릴릭 알지네이트, 아크릴 단량체 및 광개시제를 혼합하는 단계; 및
    5) UV를 조사하여 광가교시키는 단계를 더 포함 를 포함하며
    상기 2) 단계는 유기 용매 하에서 테트라알킬암모늄 알지네이트 및 글리시딜 메타크릴레이트의 고리-열림(ring-opening) 친핵성 첨가 반응을 통하여 수행되며,
    상기 메타크릴릭 알지네이트는 아크릴 단량체 총 중량 대비 0.1 ~ 10 wt% 첨가되는
    하이드로겔 제조방법.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 테트라알킬암모늄은 화학식 [NR1R2R3R4]+(이 때 R1, R2, R3 및 R4는 서로 동일하거나 다를 수 있고, 직쇄 C1-C6 알킬, 분지쇄 C1-C6 알킬, 치환 C6-C10 아릴, 비치환 C6-C10 아릴 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택됨)으로 표시되는 하이드로겔 제조방법.
  17. 삭제
  18. 제15항에 있어서,
    상기 유기 용매는 디메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO), 디메틸포름아미드(dimethylformamide, DMF), 디메틸아세트아미드(dimethylacetamide), N-메틸-2-피롤리돈(N-methyl-2-pyrrolidone, NMP), 및 헥사메틸포스포아미드(hexamethylphosphoramide, HMPA)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 하이드로겔 제조방법.
  19. 삭제
  20. 제15항에 있어서,
    상기 1) 단계 이후에
    1-1) 카르보디이미드 커플링을 통하여 알지네이트의 카르복실기에 세포 결합 분자를 결합하는 단계를 더 포함하는 하이드로겔 제조방법.
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 제15항에 있어서,
    상기 아크릴 단량체의 농도는 5 ~ 50%(w/v)인 하이드로겔 제조방법.
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