WO2020054834A1 - エレクトロスピニングを用いて製造された不織布からなる細胞培養基材、及びその製造方法 - Google Patents

エレクトロスピニングを用いて製造された不織布からなる細胞培養基材、及びその製造方法 Download PDF

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WO2020054834A1
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nonwoven fabric
nozzle
cell culture
resin
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昌士 牧田
直也 大坂
寛之 平良
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Ｏｒｔｈｏｒｅｂｉｒｔｈ株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • D10B2331/04—Fibres made from polymers obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polycondensation products polyesters, e.g. polyethylene terephthalate [PET]
    • D10B2331/041—Fibres made from polymers obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polycondensation products polyesters, e.g. polyethylene terephthalate [PET] derived from hydroxy-carboxylic acids, e.g. lactones

Definitions

  • the present invention relates to a cell culture substrate used for growing mesenchymal stem cells (MSCs) while maintaining their differentiation ability, and a method for producing the same. More specifically, a nonwoven fabric made of fibers having a micro-order diameter manufactured by using electrospinning, a nonwoven fabric made of fibers having a micro-order diameter, and a method of manufacturing the same.
  • the present invention relates to a cell culture substrate composed of fibers having a micro-order diameter.
  • Multicellular organisms including humans are composed of many cells and non-cellular fine components (extracellular matrix) including collagen, and cells and cells, and cells and extracellular matrix bind and adhere, Cells sense their environment and determine their fate (proliferate, commit suicide, or change to another type of cell) accordingly.
  • the scaffolding material in in vitro cell culture, the scaffolding material (cell culture substrate) functions as an extracellular matrix (ECM). It is important that the substrate functions like the ECM in vivo and allows cells to adhere.
  • Non-Patent Document 1 a nonwoven fabric composed of nanofibers spun using an electrospinning method as a cell culture substrate.
  • An excellent three-dimensional cell culture that replaces conventional two-dimensional cell culture plates because the nonwoven fabric made of fibers spun using the electrospinning method forms a three-dimensional structure similar to the extracellular matrix (ECM) It can be used as a substrate.
  • ECM extracellular matrix
  • the nonwoven fabric used as the three-dimensional cell culture substrate needs to have a space where cells can enter between the fibers and supply nutrients and oxygen contained in the medium. Since human MSCs usually have a size of 10 ⁇ m or more (Non-Patent Document 2), it is desirable that the inter-fiber space is equal to or greater than that in order to grow cells on a substrate.
  • Non-Patent Document 3 an attempt to form voids between fibers has been proposed (Non-Patent Document 3).
  • the inter-fiber space can also be increased by increasing the outer diameter of the fibers.
  • the conventional electrospinning method uses the bending-instability phenomenon to make fibers emitted from a nozzle into ultrafine fibers, and thus there is a limit to increasing the fiber diameter.
  • the nonwoven fabric used as a cell culture substrate has a space for allowing cells to enter the interfiber space and proliferate, and at the same time, captures the seeded cells and adheres the cells to the substrate fibers in that state. It is necessary to have a structure.
  • the nonwoven fabric In order for the nonwoven fabric to function as the pseudo ECM, it is necessary that the surface of the fiber constituting the nonwoven fabric is covered with the protein. Unless the cells adhere to the extracellular matrix, they cannot proliferate and die due to apoptosis. Therefore, they cannot directly adhere to the polymer surface of the fiber. When the non-woven fabric is immersed in the cell culture solution, the protein contained in the culture medium is adsorbed on the surface of the fiber to form a protein layer, and as a result, the cells adhere to the substrate surface via the protein layer It becomes possible.
  • Proteins are known to adsorb to polymer surfaces by hydrophobic interactions. Proteins are macromolecules in which an amino acid having a hydrophilic group and an amino acid having a hydrophobic group are bonded, and the surface of the protein molecule has a mosaic structure composed of a hydrophilic part and a hydrophobic part. Tends to be adsorbed on the surface of a polymer material composed of various types of molecules in an attempt to avoid contact with the polymer material. Since PLGA, PLLA, and PCL have a hydrophobic group, they are suitable resins for obtaining adsorption by a hydrophobic interaction with a protein.
  • Non-Patent Document 4 it has been proposed to improve the adhesion of cells by processing a fine structure on the surface of a base material using a photolithography technique. Furthermore, it has been reported that cells preferentially adhere to a polymer surface having a physical uneven structure along the structure (Non-Patent Document 5).
  • MSCs mesenchymal stem cells
  • a cell culture substrate consisting of a nonwoven fabric manufactured by electrospinning.
  • the nonwoven fabric needs to satisfy all the requirements regarding the interfiber space, the protein adsorption performance of the substrate surface, the physical topography, and the like.
  • the inventors of the present invention have conducted extensive experiments and conducted extensive studies. As a result, by setting electrospinning under independently developed conditions, it is possible to stably produce fibers having a diameter of 10 to 50 ⁇ m. Succeeded in spinning. Further, when the fibers spun in such a manner were deposited on a rotating drum, the nonwoven fabric forming a network structure by adhering and connecting at the portions where the fibers were intertwined and in contact with each other could be collected.
  • the inventors of the present invention have found that when a nonwoven fabric made of such a resin fiber is immersed in a cell culture solution, high protein adsorption can be obtained on the fiber surface and good cell adhesion can be obtained.
  • the inventors of the present invention is a cell culture substrate produced using a nonwoven fabric made of resin fibers spun by an electrospinning method,
  • the nonwoven fabric includes a plurality of resin fibers having an outer diameter of 10 to 50 ⁇ m, and the plurality of resin fibers are intertwined in random directions;
  • a network structure is formed by attaching and connecting the plurality of entangled resin fibers at places where they are in contact with each other, and the network structure has a substantially elliptical shape having a diameter of about 100 to 200 ⁇ m surrounded by curved fibers.
  • the fibers constituting the non-woven fabric do not contain an inorganic filler, and numerous pores having a diameter of 0.1 to 3 ⁇ m are formed over the entire surface of the fibers.
  • the present invention has reached the invention of a cell culture substrate produced using a nonwoven fabric having a network structure composed of resin fibers spun by an electrospinning method.
  • said nonwoven has a thickness of 0.1 mm to 0.4 mm. If the thickness is less than 0.1 mm, the inoculated MSC passes through the nonwoven fabric and becomes difficult to be caught, and if the thickness is more than 0.4 mm, the MSC is well captured by the nonwoven fabric, but the adhered MSC is converted to trypsin. It is not easy to peel off.
  • the resin fiber is made of PLGA or PLLA having a molecular weight of 200,000 to 400,000.
  • the resin fibers are biodegradable fibers.
  • the nonwoven fabric produced by the method of one embodiment of the present invention has an outer diameter of the fibers of 10 to 50 ⁇ m, the space between the fibers is large, and the cells easily enter the three-dimensional structure of the nonwoven fabric, and reach the surface of the fibers. Can adhere and proliferate.
  • the nonwoven fabric produced by the method of one embodiment of the present invention forms a substantially elliptical network having a diameter of about 100 to 200 ⁇ m surrounded by curved fibers, the seeded cells can be treated with the fiber structure of the nonwoven fabric. High ability to catch inside.
  • the fibers constituting the nonwoven fabric manufactured using the method of one embodiment of the present invention have a large specific surface area due to the formation of a myriad of pores having a diameter of about 1 ⁇ m over the entire surface of the fibers. And high protein adsorption performance.
  • a physical uneven structure is formed on the surface of the fiber by the myriad of pores of cells, cells captured by the nonwoven fabric can be attached and adhered along the uneven structure.
  • the fibers constituting the nonwoven fabric manufactured by the method of one embodiment of the present invention are made of 100% resin and do not contain inorganic particles such as calcium compounds. Since no inorganic ions are eluted, MSCs are not induced to differentiate and can be grown while maintaining the differentiation ability of MSCs.
  • a nonwoven fabric used as a cell culture substrate can be inexpensively and efficiently manufactured by using an electrospinning method, so that the proliferation of MSC on a commercial basis can be realized.
  • FIG. 1 shows an electrospinning apparatus used in the method of the present invention.
  • FIG. 2A shows an SEM image (300 times) of a sheet manufactured using Experiment 1 of the present invention (28 kV, 200 mm, 18 G, 10 ml / h).
  • FIG. 2B shows an SEM image (magnification: 70) of a sheet manufactured using the same method.
  • FIG. 2 (C) shows a SEM image ( ⁇ 3000) of a sheet manufactured using the same method.
  • FIG. 2 (D) shows an external appearance photograph of a cell culture substrate manufactured using a sheet manufactured using the method of the present invention.
  • FIG. 2E shows the result of measuring the fiber length of the fiber spun by the method of the present invention.
  • FIG. 2A shows an SEM image (300 times) of a sheet manufactured using Experiment 1 of the present invention (28 kV, 200 mm, 18 G, 10 ml / h).
  • FIG. 2B shows an SEM image (magnification: 70
  • FIG. 3A shows an SEM image (magnification: 500) of a sheet manufactured using Experiment 2 of the present invention (21 kV, 150 mm, 18 G, 10 ml / h).
  • FIG. 3B shows an SEM image (100 times) of a sheet manufactured using the same method.
  • FIG. 3 (C) shows a SEM image (magnification: 50) of a sheet manufactured using the same method.
  • FIG. 4A shows a SEM image (magnification: 500) of a sheet manufactured using Experiment 3 (14 kV, 100 mm, 18 G, 10 ml / h) of the present invention.
  • FIG. 4B shows a SEM image (100 ⁇ ) of a sheet manufactured using the same method.
  • FIG. 4C shows a SEM image (22 ⁇ ) of a sheet manufactured using the same method.
  • FIG. 5A shows a SEM image (magnification: 500) of a sheet manufactured using Experiment 4 of the present invention (28 kV, 200 mm, 22 G, 10 ml / h).
  • FIG. 5B shows a SEM image ( ⁇ 200) of the nonwoven fabric manufactured using the same method.
  • FIG. 5C shows a SEM image (magnification: 50) of the sheet manufactured by using the same method.
  • FIG. 6 shows the results of Comparative Experiment 1.
  • FIG. 7 shows the results of Comparative Experiment 2.
  • FIG. 8 shows the results of Comparative Experiment 3.
  • FIG. 9A is a SEM photograph (200) of a sheet manufactured by spinning using the method of the present invention at an applied voltage of 18 kV, a distance between the nozzle and the drum of 200 mm, a nozzle diameter of 18 G, and a spinning solution delivery speed of 10 ml / h. Times).
  • FIG. 9B is an SEM photograph (50) of a sheet manufactured by spinning using the method of the present invention at an applied voltage of 18 kV, a distance between the nozzle and the drum of 200 mm, a nozzle diameter of 18 G, and a spinning solution delivery speed of 10 ml / h. Times).
  • FIG. 9B is an SEM photograph (50) of a sheet manufactured by spinning using the method of the present invention at an applied voltage of 18 kV, a distance between the nozzle and the drum of 200 mm, a nozzle diameter of 18 G, and a spinning solution delivery speed of 10 ml / h. Times).
  • FIG. 9B is an SEM photograph (
  • FIG. 10A is an SEM photograph (200) of a sheet manufactured by spinning using the method of the present invention at an applied voltage of 22 kV, a distance between the nozzle and the drum of 200 mm, a nozzle diameter of 18 G, and a spinning solution delivery speed of 10 ml / h. Times).
  • FIG. 10B is an SEM photograph (50) of a sheet manufactured by spinning using the method of the present invention at an applied voltage of 22 kV, a distance between the nozzle and the drum of 200 mm, a nozzle diameter of 18 G, and a spinning solution delivery speed of 10 ml / h. Times).
  • FIG. 10A is an SEM photograph (200) of a sheet manufactured by spinning using the method of the present invention at an applied voltage of 22 kV, a distance between the nozzle and the drum of 200 mm, a nozzle diameter of 18 G, and a spinning solution delivery speed of 10 ml / h. Times).
  • FIG. 10A is an SEM photograph (200
  • FIG. 11A is an SEM photograph (200) of a sheet manufactured by spinning using the method of the present invention at an applied voltage of 25 kV, a distance between the nozzle and the drum of 200 mm, a nozzle diameter of 18 G, and a spinning solution delivery speed of 10 ml / h. Times).
  • FIG. 11B is an SEM photograph (50) of a sheet manufactured by spinning using the method of the present invention at an applied voltage of 25 kV, a distance between the nozzle and the drum of 200 mm, a nozzle diameter of 18 G, and a spinning solution delivery speed of 10 ml / h. Times).
  • FIG. 11B is an SEM photograph (50) of a sheet manufactured by spinning using the method of the present invention at an applied voltage of 25 kV, a distance between the nozzle and the drum of 200 mm, a nozzle diameter of 18 G, and a spinning solution delivery speed of 10 ml / h. Times).
  • FIG. 11B is an SEM photograph (50
  • FIG. 12A is a SEM photograph (200) of a sheet manufactured by spinning using the method of the present invention at an applied voltage of 30 kV, a distance between the nozzle and the drum of 200 mm, a nozzle diameter of 18 G, and a spinning solution delivery speed of 10 ml / h. Times).
  • FIG. 12B is an SEM photograph (50) of a sheet manufactured by spinning using the method of the present invention at an applied voltage of 30 kV, a distance between the nozzle and the drum of 200 mm, a nozzle diameter of 18 G, and a spinning solution delivery speed of 10 ml / h. Times).
  • FIG. 12A is a SEM photograph (200) of a sheet manufactured by spinning using the method of the present invention at an applied voltage of 30 kV, a distance between the nozzle and the drum of 200 mm, a nozzle diameter of 18 G, and a spinning solution delivery speed of 10 ml / h. Times).
  • FIG. 12A is a SEM
  • FIG. 13A is a SEM photograph (1000) of a sheet manufactured by spinning using the method of the present invention at an applied voltage of 28 kV, a distance between the nozzle and the drum of 200 mm, a nozzle diameter of 18 G, and a spinning solution delivery speed of 3 ml / h. Times).
  • FIG. 13B is an SEM photograph (50) of a sheet manufactured by spinning using the method of the present invention at an applied voltage of 28 kV, a distance between the nozzle and the drum of 200 mm, a nozzle diameter of 18 G, and a spinning solution delivery speed of 3 ml / h. Times).
  • FIG. 13B is an SEM photograph (50) of a sheet manufactured by spinning using the method of the present invention at an applied voltage of 28 kV, a distance between the nozzle and the drum of 200 mm, a nozzle diameter of 18 G, and a spinning solution delivery speed of 3 ml / h. Times).
  • FIG. 13A is a SEM photograph
  • FIG. 14A is an SEM photograph (1000) of a sheet manufactured by spinning using the method of the present invention at an applied voltage of 28 kV, a distance between the nozzle and the drum of 200 mm, a nozzle diameter of 18 G, and a spinning solution delivery speed of 5 ml / h. Times).
  • FIG. 14B is an SEM photograph (50) of a sheet manufactured by spinning using the method of the present invention at an applied voltage of 28 kV, a distance between the nozzle and the drum of 200 mm, a nozzle diameter of 18 G, and a spinning solution delivery speed of 5 ml / h. Times).
  • FIG. 14A is an SEM photograph (1000) of a sheet manufactured by spinning using the method of the present invention at an applied voltage of 28 kV, a distance between the nozzle and the drum of 200 mm, a nozzle diameter of 18 G, and a spinning solution delivery speed of 5 ml / h. Times).
  • FIG. 14B is an SEM photograph (50
  • FIG. 15A is a SEM photograph (1000) of a sheet manufactured by spinning using the method of the present invention at an applied voltage of 28 kV, a distance between the nozzle and the drum of 200 mm, a nozzle diameter of 18 G, and a spinning solution delivery speed of 10 ml / h. Times).
  • FIG. 15B is an SEM photograph (50) of a sheet manufactured by spinning using the method of the present invention at an applied voltage of 28 kV, a distance between the nozzle and the drum of 200 mm, a nozzle diameter of 18 G, and a spinning solution delivery speed of 10 ml / h. Times).
  • FIG. 15B is an SEM photograph (50) of a sheet manufactured by spinning using the method of the present invention at an applied voltage of 28 kV, a distance between the nozzle and the drum of 200 mm, a nozzle diameter of 18 G, and a spinning solution delivery speed of 10 ml / h. Times).
  • FIG. 15A is a SEM photograph
  • FIG. 16A is an SEM photograph (200) of a sheet manufactured by spinning using the method of the present invention at an applied voltage of 28 kV, a distance between the nozzle and the drum of 200 mm, a nozzle diameter of 18 G, and a spinning solution delivery speed of 12 ml / h. Times).
  • FIG. 16B is an SEM photograph (50) of a sheet manufactured by spinning using the method of the present invention at an applied voltage of 28 kV, a distance between the nozzle and the drum of 200 mm, a nozzle diameter of 18 G, and a spinning solution delivery speed of 12 ml / h. Times).
  • FIG. 16A is an SEM photograph (200) of a sheet manufactured by spinning using the method of the present invention at an applied voltage of 28 kV, a distance between the nozzle and the drum of 200 mm, a nozzle diameter of 18 G, and a spinning solution delivery speed of 12 ml / h. Times).
  • FIG. 17A is an SEM photograph (1000) of a sheet manufactured by spinning using the method of the present invention at an applied voltage of 28 kV, a distance between the nozzle and the drum of 200 mm, a nozzle diameter of 18 G, and a spinning solution delivery speed of 15 ml / h. Times).
  • FIG. 17B is an SEM photograph (50) of a sheet manufactured by spinning using the method of the present invention at an applied voltage of 28 kV, a distance between the nozzle and the drum of 200 mm, a nozzle diameter of 18 G, and a spinning solution delivery speed of 15 ml / h. Times).
  • FIG. 18 shows the configurations of Samples 1 to 7 used in the cell culture experiment.
  • FIG. 19A shows a SEM photograph ( ⁇ 100) of Sample 1 used in the cell culture experiment.
  • FIG. 19B shows a SEM photograph ( ⁇ 1000) of Sample 1 used in the cell culture experiment.
  • FIG. 19C shows an SEM photograph (magnification: 5000) of Sample 1 used in the cell culture experiment.
  • FIG. 20 (A) shows a SEM photograph ( ⁇ 100) of Sample 2 used in the cell culture experiment.
  • FIG. 20B shows a SEM photograph ( ⁇ 1000) of Sample 2 used in the cell culture experiment.
  • FIG. 21 (A) shows a SEM photograph ( ⁇ 100) of Sample 3 used in the cell culture experiment.
  • FIG. 20 (B) shows a SEM photograph ( ⁇ 1000) of Sample 3 used in the cell culture experiment.
  • FIG. 22A shows a SEM photograph ( ⁇ 100) of Sample 4 used in the cell culture experiment.
  • FIG. 22 (B) shows a SEM photograph ( ⁇ 1000) of Sample 4 used in the cell culture experiment.
  • FIG. 23 (A) shows an SEM photograph ( ⁇ 100) of Sample 5 used in the cell culture experiment.
  • FIG. 23 (B) shows an SEM photograph ( ⁇ 1000) of Sample 5 used in the cell culture experiment.
  • FIG. 24 (A) shows an SEM photograph ( ⁇ 100) of Sample 6 used in the cell culture experiment.
  • FIG. 24 (B) shows an SEM photograph ( ⁇ 1000) of Sample 6 used in the cell culture experiment.
  • FIG. 25 (A) shows a SEM photograph ( ⁇ 100) of Sample 7 used in the cell culture experiment.
  • FIG. 25 (A) shows a SEM photograph ( ⁇ 100) of Sample 7 used in the cell culture experiment.
  • FIG. 25 (B) shows an SEM photograph ( ⁇ 1000) of Sample 7 used in the cell culture experiment.
  • FIG. 26 shows the results of an increase in the number of cells 10 days after seeding in a cell culture experiment using Samples 1 to 7.
  • FIG. 27 shows the results of a cell culture experiment using sample 1 in which culturing was continued using an osteoblast differentiation-inducing medium 21 days after seeding and staining was performed with alizarin red after 3 weeks, and differentiation was confirmed.
  • FIG. 28 shows the results of a cell culture experiment using sample 1 in which culturing was continued using an adipocyte differentiation-inducing medium 21 days after seeding and staining was performed with OIL @ Red 3 weeks after culturing for 3 weeks.
  • the electrospinning apparatus 1 of the present invention has a housing 10 that houses a syringe 20, a nozzle 30, and a rotating drum 40.
  • the housing 10 is preferably formed of a conductive material such as steel in order to avoid charging with static electricity.
  • the rotating drum 40 is electrically grounded.
  • the housing 10 can be shielded from the outside air to some extent by closing the front door 11 attached to the front opening so that the front opening can be opened and closed, and the temperature and humidity in the housing can be adjusted according to individual spinning conditions.
  • the housing 10 is provided with an exhaust fan, and can perform ventilation during operation of the apparatus.
  • a rail 31 which is a facility for sliding the nozzle 30 in a horizontal direction is attached near the ceiling of the housing 10.
  • the syringe 20 is fixed near the ceiling of the housing 10.
  • the syringe 20 may be configured to be attached to a rail provided on the housing 10 so that the syringe 20 itself slides on the rail together with the nozzle 30.
  • the spinning start switch When the spinning start switch is pressed after filling the spinning solution into the syringe 20, the spinning solution filled in the syringe 20 is pushed out to the nozzle 30 at a constant pressure / speed through a tube, and electrospinning is started.
  • the amount of spinning solution that can be filled into the syringe is set at 10 ml.
  • the nozzle 30 is connected to the syringe 20 via a tube 21.
  • the nozzle 30 is slidably mounted on a rail provided on the housing 10.
  • the syringe 20 may be fixed to the housing 10 so that the nozzle 30 connected to the syringe 20 by the flexible tube 21 moves horizontally on the rail 31 (within the reach of the tube 21).
  • the nozzle 30 includes a hollow needle made of a conductive material, and the spinning solution extruded from the syringe 20 is introduced into the nozzle and discharged from the tip of the needle.
  • ⁇ Nozzle diameter> The diameter of the nozzle used in the electrospinning apparatus of the present invention is classified into 27G, 22G, and 18G according to its size.
  • the values of the apertures of 27G, 22G and 18G are as shown in the following table.
  • a DC power supply (PW) capable of adjusting the voltage is connected to the nozzle 30.
  • PW DC power supply
  • the DC power supply When the DC power supply is turned on, a positive high voltage is applied to the nozzle 30, the nozzle 30 becomes a positive electrode, and the electrically grounded rotating drum 40 generates electrostatic induction and is negatively charged, so that the negative electrode is connected to the negative electrode.
  • an electric field is formed between the nozzle 30 and the rotating drum 40.
  • the positively charged spinning solution discharged from the nozzle receives electrostatic attraction, causes a Taylor cone phenomenon, and is emitted into the air in a fibrous form.
  • a rotating drum 40 for collecting the fiber spun by electrospinning as a nonwoven fabric is installed at the bottom of the housing 10.
  • the rotating drum 30 is electrically grounded. When a positive voltage is applied to the nozzle 30, electrostatic induction occurs, and the rotating drum 40 is negatively charged and becomes the opposite electrode of the nozzle 30.
  • a non-woven fabric is formed by winding a highly peelable sheet such as a conductive aluminum sheet or a silicone sheet around the rotating drum, and winding the fiber emitted from the nozzle 30 and flying down around the rotating winding shaft around the drum. Can be obtained.
  • the fibers deposited on the drum are charged with the high voltage of the ES and repel each other on the surface of the deposited drum.
  • the drum rotation speed is high, the fibers tend to be aligned and oriented in the winding direction, but when the drum rotation speed is low, the fibers repel each other, and as a result, the fibers are oriented in random directions. Tendency to do so.
  • Resin There is no particular limitation on the type of resin that can be spun by the electrospinning apparatus 1 used in the present invention, and any resin soluble in a solvent that can be dissolved by a solvent can be used.
  • Biodegradable resins such as PLA, PLGA, and PCL as resins have hydrophobic groups and therefore exhibit adsorption performance to hydrophobic portions of proteins, and can be suitably used.
  • the molecular weight of the resin is preferably 150,000 to 400,000 in PLGA. More preferably, it is 200,000 to 400,000. When the molecular weight is lower than 150,000, the entanglement between the molecular chains becomes weak, and the shape may not be maintained as a fiber. Conversely, if the molecular weight is larger than 400,000, the viscosity of the spinning solution becomes too high, and it is necessary to increase the proportion of the solvent in the spinning solution to lower the resin concentration in order to lower the viscosity. The amount of the solvent in the spinning solution is too large, so that after the light is emitted from the nozzle, the solvent is sufficiently volatilized during flight, and it is difficult to form fibers.
  • the solvent used in the method of the present invention is preferably a substance that dissolves a solvent-soluble resin, has a high boiling point at 200 ° C. or less under atmospheric pressure, is highly volatile, and is a liquid at room temperature. Chloroform is preferred as the volatile solvent used in the method of the present invention because it has excellent solubility of the biodegradable resin and high volatility.
  • the resin concentration of the spinning solution needs to be lower than a certain level in order to smoothly send out the spinning solution from the syringe to the nozzle at a high speed. According to experiments conducted by the inventors, if the resin concentration of a spinning solution obtained by dissolving a resin having a molecular weight of 200,000 to 400,000 in chloroform is more than 8% by weight, the spinning solution is hard and cannot be smoothly fed.
  • the resin concentration of the spinning solution needs to be more than a certain level in order to form one continuous fiber after the spinning solution emitted from the nozzle is deposited on the surface of the rotating drum and dried. According to experiments by the inventors, a sheet made of continuous fibers cannot be formed if the resin concentration of a spinning solution obtained by dissolving a PLGA resin having a molecular weight of 200,000 to 400,000 in chloroform is 4% by weight or less. Was.
  • the spinning solution does not contain an inorganic filler such as a calcium compound.
  • an inorganic filler such as a calcium compound.
  • the fiber becomes thicker even under the same conditions, and the fiber is torn off during flight, the fiber length becomes shorter, and the fiber loses flexibility.
  • calcium ions are eluted in the medium as the resin is hydrolyzed, which may induce differentiation of MSC.
  • the spinning solution filled in the syringe is sent out at a high speed. It is considered that the diameter of the fiber emitted from the cone increases.
  • the spinning solution filled in the syringe is sent at a speed of 3 ml / h to 15 ml / h to an outlet having an inner diameter of 0.4 mm to 1.0 mm, the volume flow rate of the spinning solution at the outlet of the nozzle is increased. Is 0.83 mm 3 / sec to 4.2 mm 3 / sec, and the mass flow rate is 1.2 mg / sec to 6.8 mg / sec.
  • the fibrous spinning solution emitted from the nozzle does not become sharply thinned into nanofibers even when subjected to the force of oscillating the flight trajectory in an electric field. Accumulate on drum while maintaining diameter.
  • the inventors have speculated that, in a state where the ejected spinning solution falls and flies under the action of electric force and gravity, even if it receives a repulsive force due to the bias of electric charge.
  • the microfiber formation as in the bending-instability phenomenon in ordinary electrospinning does not occur, and only the evaporation of the solvent and the reduction of the fiber diameter due to the fluctuation of the flight trajectory of the fiber occur.
  • innumerable cell pores having a diameter of about 1 ⁇ m are formed throughout the fiber surface.
  • the mechanism by which such bubble pores are formed is that the fiber emitted from the nozzle contains a large amount of chloroform, and the chloroform contained in the fiber evaporates as a bubble inside and on the surface of the fiber during flight. .
  • the bubbles generated inside go outside, some bubbles are combined to reduce the surface area, and the bubbles become large bubbles and go out of the fiber. It is considered that bubbles generated near the surface are smaller than bubbles generated inside the fiber.
  • the fibers emitted from the nozzle are constantly exposed to new air by flying in the air, and can continue to receive thermal energy, so that vaporization near the surface is promoted. It is considered that a large number of bubbles are generated by receiving a large amount of energy, and some of them are combined to reduce the surface area so that the bubbles become large.
  • the size of the pores formed on the surface of the resin fiber is determined by the relationship with the viscosity of the polymer, in the embodiment of the present invention, the diameter of the pores formed by removing the bubbles is from 0.1 to 0.1. It was 3 ⁇ m (see FIG. 19C).
  • the size of the pores formed on the surface of the fiber spun by electrospinning is usually several nm or less, and the pores formed on the surface of the fiber of the present invention are considerably larger.
  • the cell pores formed in the resin fiber spun by the method of the present invention are so large that cells perceive as physical irregularities on the polymer surface, and the size of the protein molecule (BSA is 8.5 nm, lysodium is 3.8 nm). ), So that proteins contained in the culture medium can enter and be accommodated in the pores of the cells.
  • the spinning solution is preferably made of a resin dissolved in a solvent and contains no inorganic filler.
  • the formation of air bubbles in the fiber emitted from the nozzle is hindered, and thus it is difficult to form air bubble pores on the fiber surface.
  • the amount of the inorganic particles exceeds 30% by weight, the number of pores formed on the fiber surface is significantly reduced, and the diameter of the pores is reduced.
  • pores having a diameter much less than 0.1 ⁇ m are scattered on the surface of a fiber spun at a composition ratio of 50% by weight of PLGA and 50% by weight of HAp particles.
  • each spun fiber has a length of 20 cm or more, and reaches the drum in a wound state by being orbited during the falling flight, so that it is wound into a curved shape. Long fibers are intertwined with each other on the drum to form a nonwoven fabric.
  • Comparative Experiments Comparative experiments 1, 2, 3, and 4 were performed by changing the conditions of Experiment 1 above, and conditions necessary for forming a sheet made of microfibers were confirmed.
  • [Comparative experiment 1] 1) ES conditions A spinning solution was prepared under the same conditions as in Experiment 1, and spun using the same electrospinning apparatus. However, the nozzle used had a diameter of 27G, and the spinning solution delivery speed was 1 ml / h. 2) Results of Comparative Experiment 1-The fiber emitted from the nozzle immediately fluctuated in flight orbit and became invisible. The fiber diameter of the fibers deposited on the drum was 500 nm to 800 nm, and the fiber diameter of several ⁇ m was mixed (see FIG. 6).
  • FIG. 18 shows the structure of Sample 1-6 and Comparative Sample 7, and FIGS. 19 to 25 show SEM photographs of each sample.
  • Adipose-derived mesenchymal stem cells are suspended in a serum-free culture medium (culture medium at the time of cryopreservation) at a cell density of 1 x 10 4 cells / cm 2 at the bottom of the flask to obtain The obtained suspension was put into a T25 flask (Falcon # 353109) with a culture volume of 5 mL and seeded (25 ⁇ 10 4 cells / flask). The cells seeded in the T25 flask were pre-cultured at 37 ° C. and 5% CO 2 , the total amount of the culture solution was changed on the third day of culture, and the pre-culture was continued for 5 days.
  • Step 2 After completion of preculture, remove the culture solution for cryopreservation from the cells, wash with PBS (-) (Cytoscience Laboratory, # 1102P05) and transform the cells grown in preculture into recombinant Using a trypsin / EDTA solution (r-TE (Cytoscience Laboratory Ltd. # 1210)), peel off from the bottom of the T25 flask and further use a synthetic trypsin neutralization solution (s-TI (Cytoscience Laboratories # 1220)) After adding 0.5 ml / flask to mix, the cells were collected with PBS (-) (Cell Science Laboratory # 1102P05) and transferred to a 15-mL centrifuge tube.
  • PBS Cell Science Laboratory # 1102P05
  • Step 3 The cells transferred to the centrifuge tube were centrifuged in a centrifuge (at 1000 rpm for 5 minutes), and the separated cells were suspended in a serum-free culture medium (CiMS) for growth.
  • a serum-free culture medium (CiMS)
  • CiMS-BM trademark of Cell Science Laboratories # A2G00P05C
  • CiMS-sAF Labeloratory of Cell Sciences # A2G20P1CC
  • the culture was started at 37 ° C. and 5% CO 2 , and the culture solution was changed every three days.
  • FIG. 26 shows the proliferation of the number of cells 10 days after the AT-MSC suspension was seeded on the samples 1 to 7.
  • -At 10 days the cell proliferation in Samples 3 and 5 was greater than that in the other samples.
  • -The survival rate of the cells collected on day 10 was good at around 90% in all samples.
  • the culture was continued while changing the culture solution every three days. As a result, accurate cell count was difficult, but cell growth was confirmed even after 20 days. After 30 days, cells of 60 ⁇ 10 4 cells / sheet or more were counted, and the proliferation rate had not yet reached the plateau even at that time.
  • Sample 6 (PLLA 100%) showed the second highest cell proliferation after Samples 3 and 5, despite the large fiber diameter of 23.7 ⁇ m. Further, it was easy to peel off the adhered MSC using trypsin. It is considered that PLLA has particularly excellent physical properties as a resin for a cell culture substrate.
  • the nonwoven fabric increases the cell adhesion area, and effectively captures the mesenchymal stem cells seeded with the nonwoven fabric. It is thought to be the result of cells adhering to the fiber surface covered by the protein.
  • a composition of IMDM, 10% FBS, 0.1 ⁇ M Dexamethasosne, 0.2 mM Ascorbic acid, 10 mM ⁇ -Glycerol-2-phosphate, and 50 ng / mL hEGF was used.
  • a culture medium for inducing differentiation of fat containing serum a composition of IMDM, 10% FBS, 0.1 ⁇ M Dexamethasosne, 0.5 mM IBMX, 2 ⁇ g / mL Inslin, and 0.1 mM indomethacine was used. The culture was continued for 3 weeks in the same culture period as the differentiation induction without differentiation induction, and the comparison was performed by staining.
  • the present invention has been described with reference to the examples of the nonwoven fabric sheet made of fibers spun by the electrospinning method, when the nonwoven fabric of the present invention uses biodegradable fibers, the cell culture medium used for in vitro Not only as a material, it is also possible to implant the proliferated MSCs together with the substrate in vivo.
  • electrospinning device 10 case 11 Front door 20 syringes 21 tubes 30 nozzle 31 rail 40 rotating drum

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Abstract

間葉系幹細胞（MSC）をその分化能を維持したまま増殖させるために用いる細胞培養基材を商業ベースで製造して提供する。 エレクトロスピニング法で紡糸された樹脂繊維からなる不織布であって、外径１０～５０μｍの複数の樹脂繊維を含み、前記複数の樹脂繊維がランダムな方向に絡み合っており、前記絡み合った複数の樹脂繊維が互いに接触する箇所において付着して連結することによって網目構造を構成しており、前記網目構造は、曲線状の繊維によって囲まれた直径１００～２００μｍの略楕円形状の網目を形成しており、前記不織布を構成する繊維には、０．１～３μｍの径の気泡細孔が繊維の表面の全域にわたって無数形成されている細胞培養基材。

Description

エレクトロスピニングを用いて製造された不織布からなる細胞培養基材、及びその製造方法
本発明は、間葉系幹細胞（MSC）をその分化能を維持したまま増殖させるために用いる細胞培養基材、及びその製造方法に関する。より具体的には、エレクトロスピニングを用いて製造されたマイクロオ－ダーの径を有する繊維からなる不織布、及びマイクロオーダーの径を有する繊維からなる不織布を製造する方法、並びに、その方法で製造されたマイクロオーダーの径を有する繊維からなる細胞培養基材に関する。
ヒトをはじめとする多細胞生物は、多くの細胞とコラーゲンをはじめとする非細胞細成分(細胞外マトリックス)から成り立っており、細胞と細胞、細胞と細胞外マトリックスが結合、接着することで、細胞は自らの存在している環境を感知し、それに応じて運命（増殖するのか、自殺するのか、別の種類の細胞に変化するのか）を決定する。in vitroの細胞培養においては、足場材料（細胞培養基材）は細胞外マトリクス（ECM）として機能するので、生体内から生きた状態で取出した細胞を体外で培養増殖させるためには、細胞培養基材が生体内のECMと同様に機能して、細胞を接着させることが重要である。
近時、細胞培養基材としてエレクトロスピニング法を用いて紡糸されたナノ繊維からなる不織布が提案されている。エレクトロスピニング法を用いて紡糸された繊維からなる不織布は、細胞外マトリクス（ECM）と近似した３次元構造を形成するので、従来の二次元細胞培養用のプレートに代わる、優れた三次元細胞培養基材として用いることができる（非特許文献１）。
三次元細胞培養基材として用いる不織布には、繊維と繊維の間に細胞が侵入し、培地に含まれる栄養分と酸素を供給できるスペースが存在することが必要である。ヒトMSCは通常１０μｍ以上の大きさを有するので（非特許文献２）、基材上で細胞を増殖させるためには繊維間スペースはそれと同等またはそれ以上であることが望ましい。
しかし、従来のエレクトロスピニング法で製造した不織布は極めて細い繊維同士が密に絡まって、繊維間に十分な間隙を形成することが困難である。繊維間の間隙が細胞のサイズよりも小さいと細胞の侵入が妨げられて、不織布の三次元培養基材としての性能が損なわれる。そこで、この問題を克服するために、繊維間にvoidを形成する試みが提案されている（非特許文献３）。繊維間スペースは繊維の外径を大きくすることによっても拡大することができる。しかし、従来のエレクトロスピニング法はノズルから出射された繊維をbending instability現象を利用して極細繊維化するものであるため、繊維径を太くすることには限界があった。
他方、不織布の繊維間の隙間が大きすぎると、播種された細胞は培地中で不織布を通りぬけてしまい、不織布にとどまることが出来ない。従って、細胞培養基材として用いる不織布は細胞を繊維間スペースに侵入させて増殖するためのスペースを有すると同時に、播種した細胞を捕捉して、その状態で細胞を基材繊維に接着させるための構造を有することが必要である。
不織布が疑似ECMとして機能するためには、不織布を構成する繊維の表面がタンパク質で覆われていることが必要である。細胞は細胞外基質と接着した状態でなければ増殖できずにアポトーシスを起こして死んでしまうので、繊維のポリマー表面に直接接着することはできない。不織布を細胞培養液中に浸漬すると、培地に含まれているタンパク質が繊維の表面に吸着されてタンパク質の層が形成されて、その結果、細胞がタンパク質の層を介して基材表面に接着することが可能になる。
タンパク質はポリマー表面に対して疎水性相互作用によって吸着することが知られている。タンパク質は親水基を持つアミノ酸と疎水基を持つアミノ酸が結合した高分子であり、タンパク質分子の表面は親水部と疎水部とによるモザイク構造を有するので、表面に出ている疎水部は水分子との接触を避けようとして多種類の分子から構成されるポリマー材料表面に吸着する傾向がある。ＰＬＧＡ，ＰＬＬＡ，ＰＣＬは疎水基を有するので、タンパク質との間で疎水性相互作用による吸着を得るには好適な樹脂である。
さらに、細胞の基材に対する接着は、基材表面の地形(photography)によって大きな影響を受ける。そこで、フォトリソグラフィーの技術を用いて基材表面に微細構造を加工することによって細胞の接着を向上させることが提案されている（非特許文献４）。さらに、物理的な凹凸構造をもつ高分子表面に細胞がその構造体に沿って優先的に付着することが報告されている（非特許文献５）。
"Controlling the porosity of fibrous scaffolds by modulating the fiber diameter and packing density" Soliman et al Journal of Biomaterials Research A March 1, 2011 Vol. 96A ISSUE 3. "3D Scaffold of Electrosprayed Fibers with Large Pore Size for Tissue Regeneration" Hong et al. Acta Biomater Dec 1, 2011 "Enhancing cell infiltration of electrospun fibrous scaffolds in tissue regeneration" Jinglei Wu et al. Bioactive Materials Acta Biomater July 26, 2016. "培養基材の３次元表面構造による細胞応答"　伊藤一志　日本素材物性学会誌　第28巻第1/2号　2017年3月 "高分子と細胞との反応"　筏義人　高分子41巻10月号702-705頁（1992年）
足場依存性細胞である間葉系幹細胞（MSC）を，エレクトロスピニング法で製造された不織布からなる細胞培養基材を用いてin vitroで培養して増殖させるためには、細胞培養基材として用いる不織布は、繊維間スペース、基材表面のタンパク質吸着性能、物理的地形等に関する要求を全て満たすものであることが必要である。しかし、これまで細胞培養基材に用いる不織布として、これらの全ての要求を満たして商業ベースで安価に製造して提供できるものはなかった。
上記の課題を解決するために本発明の発明者等は実験を重ねて鋭意検討した結果、エレクトロスピニングを独自に開発した条件に設定して行うことによって１０～５０μｍの径の繊維を安定的に紡糸することに成功した。さらに、そのようにして紡糸された繊維を回転ドラムに堆積させると、繊維が互いに絡み合って接する部分で付着連結して網目構造を形成している不織布を回収することができた。
紡糸された繊維の表面を仔細に観察すると、無数の１μｍ前後の径の気泡細孔が繊維表面の全域にわたって形成されていることを発見した。本発明の発明者等は、そのような樹脂繊維からなる不織布を細胞培養液に浸漬すると、繊維表面に対して高いタンパク質吸着が得られ、良好な細胞接着が得られることを見出した。
上記想到に基づいて、本発明の発明者等は、エレクトロスピニング法で紡糸された樹脂繊維からなる不織布を用いて作製された細胞培養基材であって、
 
前記不織布は、外径１０～５０μｍの複数の樹脂繊維を含み、前記複数の樹脂繊維がランダムな方向に絡み合っており、
 
前記絡み合った複数の樹脂繊維が互いに接触する箇所において付着して連結することによって網目構造を構成しており、前記網目構造は、曲線状の繊維によって囲まれた直径約１００～２００μｍの略楕円形状の網目を形成しており、
 
前記不織布を構成する繊維は無機フィラーを含まず、０．１～３μｍの径の気泡細孔が繊維の表面の全域にわたって無数形成されている、
 
エレクトロスピニング法で紡糸された樹脂繊維からなる網目構造を有する不織布を用いて作製された細胞培養基材、という発明に到達した。
好ましくは、前記不織布は０．１ｍｍ～０．４ｍｍの厚さを有している。厚さが０．１ｍｍより小さいと播種したMSCが不織布を通り抜けてしまい捕捉されずらくなり、厚さが０．４ｍｍよりも大きいと、MSCは不織布に良く捕捉されるが、接着したMSCをトリプシンで剥がすのが容易でなくなる。
好ましくは、前記樹脂繊維は、分子量が２０万～４０万のＰＬＧＡ又はＰＬＬＡからなる。
好ましくは、前記樹脂繊維は、生分解性繊維である。
本発明の一実施態様の方法で製造された不織布は、繊維の外径が１０～５０μｍあるので、繊維間のスペースが大きく、不織布の立体構造中に細胞が容易に侵入して繊維の表面に接着して増殖することができる。
本発明の一実施態様の方法で製造された不織布は、曲線状の繊維によって囲まれた直径約１００～２００μｍの略楕円形状の網目を形成しているので、播種された細胞を不織布の繊維構造中に捕捉する能力が高い。
本発明の一実施態様の方法を用いて製造した不織布を構成する繊維は、繊維の表面の全域にわたって無数の１μｍ前後の径を有する気泡細孔が形成されていることによって、比表面積が著しく増大してタンパク質吸着性能が高い。また、繊維の表面に無数の気泡細孔によって物理的な凹凸構造が形成されているので、不織布に捕捉された細胞を凹凸構造に沿って付着・接着させることができる。
本発明の一実施態様の方法で製造された不織布を細胞培養基材として用いてＭＳＣを培養すると高い効率の増殖が得られる上、細胞がコンフルになった不織布と未播種の不織布とを接触させると、未播種の不織布に細胞が転移するため、「拡大培養」を行うことができる。そのため、継代作業の必要がなくなるか、又は回数を減らすことができる。
本発明の一実施態様の方法で製造された不織布を構成する繊維は１００％樹脂からなり、カルシウム化合物等の無機粒子を含有していないので、増殖用培地に浸漬したときに、繊維からカルシウム等の無機イオンを溶出することがないので、ＭＳＣに対して分化誘導が働くことがなく、ＭＳＣの分化能を維持したまま増殖させることができる。
本発明によって、細胞培養基材として用いる不織布をエレクトロスピニング法を用いて安価かつ効率的に製造することが可能になるので、商業ベースでのＭＳＣの増殖が実現できる。
図１は本発明の方法に用いるエレクトロスピニング装置を示す。 図２（Ａ）は本発明の実験１（２８ｋＶ，２００ｍｍ、１８Ｇ，１０ｍｌ／ｈ）を用いて製造したシートのＳＥＭ画像（３００倍）を示す。図２（Ｂ）は同じ方法を用いて製造したシートのＳＥＭ画像（７０倍）を示す。図２（Ｃ）は同じ方法を用いて製造したシートのＳＥＭ画像（３０００倍）を示す。図２（Ｄ）は、本発明の方法を用いて製造したシートで作製した細胞培養基材の外観写真を示す。図２（Ｅ）は本発明の方法で紡糸した繊維の繊維長を測定した結果を示す。 図３（Ａ）は本発明の実験２（２１ｋＶ，１５０ｍｍ、１８Ｇ，１０ｍｌ／ｈ）を用いて製造したシートのＳＥＭ画像（５００倍）を示す。図３（Ｂ）は同じ方法を用いて製造したシートのＳＥＭ画像（１００倍）を示す。図３（Ｃ）は同じ方法を用いて製造したシートのＳＥＭ画像（５０倍）を示す。 図４（Ａ）は本発明の実験３（１４ｋＶ，１００ｍｍ、１８Ｇ，１０ｍｌ／ｈ）を用いて製造したシートのＳＥＭ画像（５００倍）を示す。図４（Ｂ）は同じ方法を用いて製造したシートのＳＥＭ画像（１００倍）を示す。図４（Ｃ）は同じ方法を用いて製造したシートのＳＥＭ画像（２２倍）を示す。 図５（Ａ）は本発明の実験４（２８ｋＶ，２００ｍｍ、２２Ｇ，１０ｍｌ／ｈ）を用いて製造したシートのＳＥＭ画像（５００倍）を示す。図５（Ｂ）は同じ方法を用いて製造した不織布のＳＥＭ画像（２００倍）を示す。図５（Ｃ）は同じ方法を用いて製造したシートのＳＥＭ画像（５０倍）を示す。 図６は比較実験１の結果を示す。 図７は比較実験２の結果を示す。 図８は比較実験３の結果を示す。 図９（Ａ）は、本発明の方法を用いて、印加電圧１８ｋＶ，ノズルとドラム間の距離２００ｍｍ、ノズル口径１８Ｇ，紡糸溶液送り出し速度１０ｍｌ／ｈで紡糸して製造したシートのＳＥＭ写真（２００倍）を示す。図９（Ｂ）は、本発明の方法を用いて、印加電圧１８ｋＶ，ノズルとドラム間の距離２００ｍｍ、ノズル口径１８Ｇ，紡糸溶液送り出し速度１０ｍｌ／ｈで紡糸して製造したシートのＳＥＭ写真（５０倍）を示す。 図１０（Ａ）は、本発明の方法を用いて、印加電圧２２ｋＶ，ノズルとドラム間の距離２００ｍｍ、ノズル口径１８Ｇ，紡糸溶液送り出し速度１０ｍｌ／ｈで紡糸して製造したシートのＳＥＭ写真（２００倍）を示す。図１０（Ｂ）は、本発明の方法を用いて、印加電圧２２ｋＶ，ノズルとドラム間の距離２００ｍｍ、ノズル口径１８Ｇ，紡糸溶液送り出し速度１０ｍｌ／ｈで紡糸して製造したシートのＳＥＭ写真（５０倍）を示す。 図１１（Ａ）は、本発明の方法を用いて、印加電圧２５ｋＶ，ノズルとドラム間の距離２００ｍｍ、ノズル口径１８Ｇ，紡糸溶液送り出し速度１０ｍｌ／ｈで紡糸して製造したシートのＳＥＭ写真（２００倍）を示す。図１１（Ｂ）は、本発明の方法を用いて、印加電圧２５ｋＶ，ノズルとドラム間の距離２００ｍｍ、ノズル口径１８Ｇ，紡糸溶液送り出し速度１０ｍｌ／ｈで紡糸して製造したシートのＳＥＭ写真（５０倍）を示す。 図１２（Ａ）は、本発明の方法を用いて、印加電圧３０ｋＶ，ノズルとドラム間の距離２００ｍｍ、ノズル口径１８Ｇ，紡糸溶液送り出し速度１０ｍｌ／ｈで紡糸して製造したシートのＳＥＭ写真（２００倍）を示す。図１２（Ｂ）は、本発明の方法を用いて、印加電圧３０ｋＶ，ノズルとドラム間の距離２００ｍｍ、ノズル口径１８Ｇ，紡糸溶液送り出し速度１０ｍｌ／ｈで紡糸して製造したシートのＳＥＭ写真（５０倍）を示す。 図１３（Ａ）は、本発明の方法を用いて、印加電圧２８ｋＶ，ノズルとドラム間の距離２００ｍｍ、ノズル口径１８Ｇ，紡糸溶液送り出し速度３ｍｌ／ｈで紡糸して製造したシートのＳＥＭ写真（１０００倍）を示す。図１３（Ｂ）は、本発明の方法を用いて、印加電圧２８ｋＶ，ノズルとドラム間の距離２００ｍｍ、ノズル口径１８Ｇ，紡糸溶液送り出し速度３ｍｌ／ｈで紡糸して製造したシートのＳＥＭ写真（５０倍）を示す。 図１４（Ａ）は、本発明の方法を用いて、印加電圧２８ｋＶ，ノズルとドラム間の距離２００ｍｍ、ノズル口径１８Ｇ，紡糸溶液送り出し速度５ｍｌ／ｈで紡糸して製造したシートのＳＥＭ写真（１０００倍）を示す。図１４（Ｂ）は、本発明の方法を用いて、印加電圧２８ｋＶ，ノズルとドラム間の距離２００ｍｍ、ノズル口径１８Ｇ，紡糸溶液送り出し速度５ｍｌ／ｈで紡糸して製造したシートのＳＥＭ写真（５０倍）を示す。 図１５（Ａ）は、本発明の方法を用いて、印加電圧２８ｋＶ，ノズルとドラム間の距離２００ｍｍ、ノズル口径１８Ｇ，紡糸溶液送り出し速度１０ｍｌ／ｈで紡糸して製造したシートのＳＥＭ写真（１０００倍）を示す。図１５（Ｂ）は、本発明の方法を用いて、印加電圧２８ｋＶ，ノズルとドラム間の距離２００ｍｍ、ノズル口径１８Ｇ，紡糸溶液送り出し速度１０ｍｌ／ｈで紡糸して製造したシートのＳＥＭ写真（５０倍）を示す。 図１６（Ａ）は、本発明の方法を用いて、印加電圧２８ｋＶ，ノズルとドラム間の距離２００ｍｍ、ノズル口径１８Ｇ，紡糸溶液送り出し速度１２ｍｌ／ｈで紡糸して製造したシートのＳＥＭ写真（２００倍）を示す。図１６（Ｂ）は、本発明の方法を用いて、印加電圧２８ｋＶ，ノズルとドラム間の距離２００ｍｍ、ノズル口径１８Ｇ，紡糸溶液送り出し速度１２ｍｌ／ｈで紡糸して製造したシートのＳＥＭ写真（５０倍）を示す。 図１７（Ａ）は、本発明の方法を用いて、印加電圧２８ｋＶ，ノズルとドラム間の距離２００ｍｍ、ノズル口径１８Ｇ，紡糸溶液送り出し速度１５ｍｌ／ｈで紡糸して製造したシートのＳＥＭ写真（１０００倍）を示す。図１７（Ｂ）は、本発明の方法を用いて、印加電圧２８ｋＶ，ノズルとドラム間の距離２００ｍｍ、ノズル口径１８Ｇ，紡糸溶液送り出し速度１５ｍｌ／ｈで紡糸して製造したシートのＳＥＭ写真（５０倍）を示す。 図１８は、細胞培養実験に用いたサンプル１～７の構成を示す。 図１９（Ａ）は、細胞培養実験で用いたサンプル１のＳＥＭ写真（１００倍）を示す。図１９（Ｂ）は、細胞培養実験で用いたサンプル１のＳＥＭ写真（１０００倍）を示す。図１９（Ｃ）は、細胞培養実験で用いたサンプル１のＳＥＭ写真（５０００倍）を示す。 図２０（Ａ）は、細胞培養実験で用いたサンプル２のＳＥＭ写真（１００倍）を示す。図２０（Ｂ）は、細胞培養実験で用いたサンプル２のＳＥＭ写真（１０００倍）を示す。 図２１（Ａ）は、細胞培養実験で用いたサンプル３のＳＥＭ写真（１００倍）を示す。図２０（Ｂ）は、細胞培養実験で用いたサンプル３のＳＥＭ写真（１０００倍）を示す。 図２２（Ａ）は、細胞培養実験で用いたサンプル４のＳＥＭ写真（１００倍）を示す。図２２（Ｂ）は、細胞培養実験で用いたサンプル４のＳＥＭ写真（１０００倍）を示す。 図２３（Ａ）は、細胞培養実験で用いたサンプル５のＳＥＭ写真（１００倍）を示す。図２３（Ｂ）は、細胞培養実験で用いたサンプル５のＳＥＭ写真（１０００倍）を示す。 図２４（Ａ）は、細胞培養実験で用いたサンプル６のＳＥＭ写真（１００倍）を示す。図２４（Ｂ）は、細胞培養実験で用いたサンプル６のＳＥＭ写真（１０００倍）を示す。 図２５（Ａ）は、細胞培養実験で用いたサンプル７のＳＥＭ写真（１００倍）を示す。図２５（Ｂ）は、細胞培養実験で用いたサンプル７のＳＥＭ写真（１０００倍）を示す。 図２６は、サンプル１～７を用いた細胞培養実験で、播種後１０日における細胞数の増加の結果を示す。 図２７は、サンプル１を用いた細胞培養実験で播種後２１日経過後に骨芽細胞分化誘導培地を用いて培養を継続して３週間経過後にアリザリンレッドで染色して分化を確認した結果を示す。 図２８は、サンプル１を用いた細胞培養実験で播種後２１日経過後に脂肪細胞分化誘導培地を用いて培養を継続して３週間経過後にOIL　Redで染色して分化を確認した結果を示す。
　以下本発明を実施するための好ましい形態について図面を用いて説明する。
（１）本発明に用いるエレクトロスピニング装置の構成
図１において、本発明のエレクトロスピニング装置１は、シリンジ２０、ノズル３０、回転ドラム４０を収納する筐体１０を有する。筐体１０は、静電気が帯電することを避けるために、スチール等の導電性の材料で形成されていることが好ましい。回転ドラム４０は電気的に接地されている。
＜筐体＞　
筐体１０は、前面開口部を開閉可能に取り付けられた前扉１１を閉じることによって外気からある程度遮断して筐体内の温度と湿度を個々の紡糸条件に応じて調整することができる。筐体１０には、排気ファンが備えられており、装置の稼働中換気可能である。筐体１０の天井付近には、ノズル３０を水平方向にスライド移動させるための設備であるレール３１が取り付けられている。本発明の方法では、ノズルから出射した紡糸溶液が回転ドラムに繊維としての形状を有して堆積するためには、出射された繊維が筐体１０内を落下飛行する間に溶媒が十分に蒸発する必要があるので、筐体内の温度が15℃～30℃、湿度が50％以下に調整されていることが望ましい。
＜シリンジ＞
シリンジ２０は筐体１０の天井付近に固定されている。シリンジ２０は、筐体１０に備えられたレールに取り付けられて、シリンジ２０自体がレール上をノズル３０と共にスライド移動するように構成されていてもよい。
紡糸溶液をシリンジ２０に充填した後、紡糸開始のスイッチを押すと、シリンジ２０に充填された紡糸溶液がチューブを通して一定圧力／速度でノズル３０に押し出されて、エレクトロスピニングが開始される。本発明の一つの実施例では、シリンジに充填できる紡糸溶液の量は１０ｍｌに設定されている。
＜ノズル＞
図１において、ノズル３０はシリンジ２０にチューブ２１を介して接続されている。ノズル３０は、筐体１０に設けられたレール上をスライド移動可能に設置されている。シリンジ２０は筐体１０に固定して、シリンジ２０と柔軟なチューブ２１でつながったノズル３０が（チューブ２１が届く範囲で）レール３１上を水平移動するように構成されていてもよい。ノズル３０は、導電体製の中空のニードルを備え、シリンジ２０から押し出された紡糸溶液はノズル中に導入されて、ニードルの先端から吐出される。
＜ノズル径＞
本発明のエレクトロスピニング装置で用いられるノズルの口径は、その大きさに応じて２７Ｇ，２２Ｇ，１８Ｇに区別される。２７Ｇ，２２Ｇ，１８Ｇの口径の値は次の表に示す通りである。
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＜電源＞
ノズル３０には電圧を調整可能な直流電源（ＰＷ）が接続されている。直流電源をＯＮにすると、ノズル３０にプラスの高電圧が印加され、ノズル３０がプラス電極となり、電気的に接地された回転ドラム４０が静電誘導を生じてマイナスに帯電することによってマイナス電極となって、ノズル３０と回転ドラム４０の間に電場が形成される。ノズル３０の先端では、ノズルから吐出したプラスに帯電した紡糸溶液が、静電引力を受けて、テイラーコーン現象を起こして、空中に繊維状に出射される。
＜回転ドラム＞
筐体１０の底部には、エレクトロスピニングで紡糸された繊維を不織布として回収するための回転ドラム４０が据え付けられている。回転ドラム３０は電気的に接地されており、ノズル３０にプラス電圧を印加すると静電誘導を生じて、回転ドラム４０はマイナスに帯電してノズル３０の反対電極となる。
回転ドラムには導電性のアルミシート又はシリコーンシート等の剥離性の高いシートを巻いて、ノズル３０から出射し落下飛行してきた繊維を、回転する巻き取り軸を中心にドラムに巻き取ることによって不織布を得ることができる。このとき、ドラムに堆積した繊維はＥＳの高電圧を受けて電荷を帯びているので、堆積したドラム表面において互いに反発し合う。ドラムの回転速度が速いと繊維は巻き取り方向に整列して配向する傾向が強いが、ドラムの回転速度が遅いと繊維の互いの反発力が勝って、その結果、繊維はランダムな方向に配向する傾向が強くなる。
（２）樹脂
本発明に用いるエレクトロスピニング装置１によって紡糸できる樹脂の種類には特に制限がなく、溶媒によって溶かすことができる溶媒可溶性の樹脂であれば用いることができる。樹脂としてＰＬＡ，ＰＬＧＡ，ＰＣＬ等の生分解性樹脂は、疎水基を有するのでタンパク質の疎水部分に対して吸着性能を発揮し、好適に用いることができる。
エレクトロスピニング法を用いて樹脂を繊維化するには、ＰＬＧＡでは、樹脂の分子量が１５万～４０万が好ましい。より好ましくは２０万～４０万が好ましい。分子量が１５万よりも低いと分子鎖同士の絡み合いが弱くなり、繊維として形状を維持できなくなる可能性がある。逆に分子量が４０万よりも大きいと、紡糸溶液の粘度が高くなりすぎて、粘度を下げるために紡糸溶液中の溶媒の割合を大きくして樹脂濃度を下げる必要があるが、そうすると、今度は紡糸溶液中の溶媒の量が多くなりすぎて、ノズルから出射された後、飛行中に溶媒が十分に揮発されて繊維化するのが難しくなる。　
（３）揮発性溶媒
本発明の方法に用いる溶媒は、溶媒可溶性樹脂を溶解し、大気圧条件下で沸点が２００℃以下で揮発性が高く、室温で液体である物質が好ましい。クロロホルムは生分解性樹脂の溶解性に優れ、なおかつ揮発性が高いので本発明の方法に用いる揮発性の溶媒として好ましい。　
（４）紡糸溶液
本発明の方法において、紡糸溶液の樹脂濃度は、シリンジからノズルに速い出し速度でスムーズに紡糸溶液を送り出すことができるためには一定以下にする必要がある。発明者等の実験によると、分子量が２０万～４０万の樹脂をクロロホルムに溶解して得た紡糸溶液の樹脂濃度が８重量％を超えると紡糸溶液が固くてスムーズに送り出すことが難しかった。　
他面、紡糸溶液の樹脂濃度は、ノズルから出射された紡糸溶液が回転ドラムの表面に堆積し乾燥した後に一本の連続した繊維を構成するためには一定以上であることが必要である。発明者等の実験によると、分子量が２０万～４０万のＰＬＧＡ樹脂をクロロホルムに溶解して得た紡糸溶液の樹脂濃度が４重量％以下では連続した繊維からなるシートを形成することができなかった。　　
本発明の実施例の方法においては、紡糸溶液にはカルシウム化合物等の無機フィラーを含まない。紡糸溶液に無機フィラーを含むと、同じ条件であっても、繊維は径が太くなり、飛行中に繊維がちぎれて繊維長が短くなり、柔軟性を失う。さらに、そのような繊維からなる不織布を細胞培養基材として用いると、培地中で樹脂の加水分解に伴いカルシウムイオンが溶出されて、ＭＳＣに対して分化誘導が働く可能性がある。
（５）シリンジに充填した紡糸溶液をノズルに送り出す
本発明の方法では、シリンジに充填した紡糸溶液を速い速度で送り出すので、ノズルの吐出口における紡糸溶液の毎秒ごとの流量が大きくなる結果、テイラーコーンで出射される繊維の径が大きくなると考えられる。本発明の実施例では、シリンジに充填した紡糸溶液を３ｍｌ／ｈ～１５ｍｌ／ｈの速度で内径が０．４ｍｍ～１．０ｍｍの吐出口に送り出すと、ノズルの吐出口における紡糸溶液の体積流量は０．８３ｍｍ３／秒～４．２ｍｍ３／秒、質量流量は１．２ｍｇ／秒～６．８ｍｇ／秒である。
（６）ノズルに電圧を印加
紡糸溶液をシリンジに充填した上で直流電源をＯＮにしてノズル３０に電圧を印加する。ノズル３０に電圧を印加することによって、充填された紡糸溶液を帯電させると共に、設置されたドラムコレクターとノズルの間に電位差を生じ、帯電した紡糸溶液がテイラーコーン現象によってドラム方向に引っ張られる。　
本発明の方法では、ノズルから出射された繊維状の紡糸溶液は、電場で飛行軌道を振らせる力を受けても、それによって急激に細くなってナノ繊維化することはなく、マイクロオーダーの繊維径を維持してドラムに堆積する。その理由は必ずしも明らかでないが、発明者等の推測によれば、出射された紡糸溶液が電気力と重力の作用を受けて落下飛行する状態では、電荷の偏りに起因する反発力を受けても、通常のエレクトロスピニングにおけるbending instability現象におけるような極細繊維化は起こらず、溶媒の蒸発と、繊維の飛行軌道が振れることに伴う繊維径の縮小が生じるに留まると考えられる。　
本発明の飛行軌道の振れ現象が生じるためには、ノズルと回転ドラムの間に形成される電場が一定程度以上であることが必要である。電場の強さはＶ＝Ｅｄの公式より、印加する電圧の値とノズル３０と回転ドラム４０の距離によって決まるので、飛行軌道の振れ現象を生じるために必要な印加電圧の値は単独では決まらない。しかし、ノズルから出射された繊維の飛行距離はその間に溶媒を蒸発させる必要があるので、一定以上にする必要があるので、印加する電圧の値は必然的に高く設定される。本発明の一つの実施例では、ノズルとドラム間の距離は２００ｍｍで、ノズルに印加する電圧は２８ｋＶに設定される。
本発明の方法で紡糸された繊維には、繊維表面の全域にわたって無数の１μｍ前後の径の気泡細孔がくまなく形成されている。このような気泡細孔が形成されるメカニズムは、ノズルから出射された繊維はクロロホルムを多量に含んでおり、繊維に含有されたクロロホルムは飛行中に繊維の内部および表面において気泡となって蒸発する。内部で発生した気泡が外に出て行く際にはいくつかの気泡が合わさって表面積を下げ、大きな気泡になって繊維外に出ていく。表面付近で発生した気泡は、繊維内部で発生した気泡よりも小さくなると考えられる。ノズルから出射された繊維は、空気中を飛行することで常に新たな空気にさらされ、熱エネルギーをもらい続けることができるため、表面付近の気化は促進される。多くのエネルギーをもらうことによって多数の気泡が発生し、表面積を下げるべくいくつかは合わさって気泡が大きくなると考えられる。
樹脂繊維の表面に形成される気泡細孔のサイズは、ポリマーの粘性との関係で決まるが、本発明の実施例では、気泡が脱けて形成された気泡細孔の径は０．１～３μｍであった（図１９（Ｃ）参照）。エレクトロスピニングで紡糸された繊維の表面に形成される気泡細孔のサイズは通常数ｎｍ又はそれ以下であり、本発明の繊維表面に形成される気泡細孔はそれと比べてかなり大きい。本発明の方法で紡糸された樹脂繊維に形成される気泡細孔は、細胞がポリマー表面の物理的凹凸として感知するほど大きく、尚且つ、タンパク質分子のサイズ（BSAは8.5 nm、リゾチウムは3.8 nm）よりもかなり大きいので、培地に含まれているタンパク質が気泡細孔の中に入り込んで収容されることが可能である。
エレクトロスピニングで紡糸される樹脂繊維表面に１μｍ前後の径の気泡細孔を形成するためには、紡糸溶液は溶剤に溶かされた樹脂からなり、無機フィラーを含まないことが望ましい。紡糸溶液に無機粒子が含有されていると、ノズルから出射した繊維に気泡の形成が妨げられるので、繊維表面に気泡細孔が形成されづらい。本発明の発明者等の経験では、無機粒子が３０重量％を超えると、繊維表面に形成される気泡細孔は著しく少なくなり、細孔の径は小さくなる。図２５（Ｃ）に示す比較用サンプル７では、ＰＬＧＡ５０重量％、ＨＡｐ粒子５０重量％の組成比で紡糸された繊維の表面には０．１μｍにはるかに満たない径の気泡細孔が散在していた。
（７）不織布を回収
アルミシートやシリコーンシート等の剥離性の高いシートを巻いた回転ドラム上に繊維を不織布として堆積させた後、アルミシートを回転ドラムから取り外すことによって、シートを回収することができる。本発明の方法では、紡糸した一本一本の繊維の長さは２０ｃｍ以上あり、落下飛行中に軌道を振られることで巻回状態でドラムに到達するので、巻回して曲線状となった長い複数の繊維がドラム上で互いに絡み合って不織布を構成する。
I.       不織布の作製実験
ＰＬＧＡ樹脂をクロロホルムで溶解して調製した紡糸溶液を用いてエレクトロスピニング法で紡糸したマイクロオーダーの径の繊維からなる不織布を作製する実験１，２，３，４を実施した。
[実験１]
分子量３４万のPLGA （Evonik社製 LG855S）を純度９９％以上のクロロホルムに溶かして樹脂濃度６重量％の紡糸溶液を調製した。調整した紡糸溶液を用いて、エレクトロスピニング法で紡糸した。
1)  ES条件
ES装置： NANON-03　(株式会社MECC提供)
　溶媒：クロロホルム　純度９９％以上
　溶媒中の樹脂濃度：６wt%
　電圧：２８kV
押し出し速度：１０ml/h
針の太さ：１８Ｇ
ノズルからコレクターまでの飛距離：２００ｍｍ
コレクター：回転式ドラム（回転速度50rpm）。
2)  実験1の結果
・ノズルから出射した繊維は飛行軌道を振らせながら下方向に落下飛行し、回転ドラムに堆積するのが目視できた。
・ドラムに堆積した繊維の繊維径は大体１０～２０μｍであった。
・回転ドラムに堆積した繊維は複数の繊維が絡み合った網目構造を有するシートを形成した（図２（Ａ），（Ｂ）、（Ｃ）参照）。
・実験１で紡糸した繊維の長さを測定するために、コレクターとして回転ドラムに代えてエタノール液を満たした容器に繊維を入射させて綿状に回収し、回収した綿をほぐして綿を構成している繊維の長さを測定したところ５０ｃｍ程度あった（図２（Ｅ）参照）。
[実験２]
1)  ES条件
実験１と同じ条件で、紡糸溶液を調製し、同じエレクトロスピニング装置を用いて紡糸した。但し、電圧２１ｋＶ，ノズルから回転ドラムまでの飛距離を１５０ｍｍとした。
2)     実験２の結果
・ノズルから出射した繊維は途中飛行軌道を振らせながら下方向に落下飛行して回転ドラムに堆積した。繊維の飛行軌道はドラムに堆積する直前で振れていたが実験１よりも振れ具合は少なかった。
・ドラムに堆積した繊維の繊維径は長手方向で必ずしも一定せず細い箇所と太い箇所があったが、大体１０～５０μｍの範囲内であった。
・回転ドラムに堆積した繊維は網目構造を形成したが、実験１よりも繊維と繊維の間の付着傾向が強かった（図３参照）。
[実験３]
1)     ES条件
実験１と同じ条件で、紡糸溶液を調製し、同じエレクトロスピニング装置を用いて紡糸した。但し、電圧は１４ｋＶ，ノズルからコレクターまでの飛距離を１００ｍｍとした。
2)     実験３の結果
・ノズルから出射した繊維は途中飛行軌道を振らせながら下方向に落下飛行して回転ドラムに堆積した。
・ドラムに堆積した繊維の繊維径は１０～５０μｍの繊維と数μｍ～ナノｍの繊維が混在していた。
・回転ドラムに堆積した繊維は網目構造を形成したが、実験２よりもさらに繊維径のばらつきが大きく、また繊維と繊維の間の付着傾向がさらに強かった（図４参照）。
[実験４]
1)     ES条件
実験１と同じ条件で、紡糸溶液を調製し、同じエレクトロスピニング装置を用いて紡糸した。但し、ノズルの口径は２２Ｇのものを用いた。
2)     実験４の結果
・ノズルから出射した繊維は途中で飛行軌道が激しく振れて見えなくなった。
・ドラムに堆積した繊維の繊維径は５μｍ～６０μｍで繊維同士が接触する箇所で互いに付着連結して網目構造を形成していた。
＜＜実験１、２、３、４の評価＞＞
i)       ノズルとドラムの距離
実験１、２、３、４において、ノズルとドラムの間の距離が実験２は１５０ｍｍ、実験３は１００ｍｍと実験１より短いが、Ｅ＝Ｖ／ｄの公式で計算される電場の強さは４つとも同じである。実験１，２，３の結果の比較から、ノズルとドラムの間の距離は長い（２００ｍｍ）方がドラムに堆積した繊維は一定の範囲内の径を有する繊維が繊維としての形状を保って網目構造を有するシートを形成し、反対に、ノズルとドラムの間の距離を短くすると（実験２は１５０ｍｍ、実験３は１００ｍｍ）、ドラムに堆積した繊維の径は一定せず、繊維同士が互いに付着する傾向が強かった。このことから、数十μｍの繊維からなるシートを形成するためには、ノズルから出射された繊維がドラムに堆積するまでの間に溶媒を蒸発するのに十分な距離間隔が存在することが重要であると考えられる。
ii)     ノズルの口径
実験１と実験４で紡糸された繊維と不織布を比べると、１８Ｇの口径のノズルを用いた実験１では数十μｍの繊維が均一に紡糸されており、２２Ｇの口径のノズルを用いた実験４では、径の大きい繊維状のものが互いに付着して不織布を形成した。１０ｍｌ／ｈの送り出し速度では、２２Ｇよりも１８Ｇの方が、繊維の紡糸条件として優れていると考えられる。
比較実験
上記実験１の条件を変えた比較実験１，２，３，４を実施して、マイクロ繊維からなるシートが形成されるために必要な条件を確認した。
[比較実験１]
1)     ES条件
実験１と同じ条件で、紡糸溶液を調製し、同じエレクトロスピニング装置を用いて紡糸した。但し、ノズルは口径を２７Ｇを用い、紡糸溶液の送り出し速度を１ｍｌ／ｈとした。
2)     比較実験１の結果
・ノズルから出射した繊維はすぐに飛行軌道が振れて見えなくなった。
・ドラムに堆積した繊維の繊維径は５００ｎｍ～８００ｎｍのものと数μｍの径のものとが混在していた（図６参照）。
[比較実験２]
1)     ES条件
実験１と同じ条件で、紡糸溶液を調製し、同じエレクトロスピニング装置を用いて紡糸した。但し、ノズルの口径は２７Ｇのものを用いた。
2)     比較実験２の結果
・ノズルから出射した繊維は途中で飛行軌道が激しく触れて見えなくなった。
・シリンジに過負荷がかかり、固定が外れてしまった。原因は早すぎる押出速度によって口径を通りきれなかった溶液の力の逃げ場所がシリンジ固定部品に行ってしまったことによると考えられる。
・ドラムに堆積した繊維の繊維径は細く、０．５ｎｍ～数μｍのものが混在していた（図７参照）。
＜＜比較実験２の評価＞＞
シリンジからノズルへの送り出し速度が１０ｍｌ／ｈでノズル口径が２７Ｇでは安定した紡糸はできず、不織布も形成されなかった。送り出し速度が１０ｍｌ／ｈでは、ノズル口径は１８Ｇが適合していると考えられる。
[比較実験３]
1)     ES条件
実験１と同じ条件で、紡糸溶液を調製し、同じエレクトロスピニング装置を用いて紡糸した。但し、樹脂濃度は４重量％とし、ノズルとドラムの間の距離は３００ｍｍとした。
2)     比較実験３の結果
・ノズルから出射した繊維は飛行軌道が振れることなく、そのまま真下に真直ぐに落下してドラムに堆積した。
・ドラムにはナノ繊維と、太い繊維状のものが混在して堆積しており、繊維の長さは短く、不織布にはなっていなかった（図８参照）。
＜＜比較実験３の評価＞＞
樹脂濃度４重量％では紡糸溶液の溶媒の量が多く樹脂の量が少ないので、ノズルから出射した紡糸溶液は、一本の連続した繊維を形成できていなかった。飛行中に繊維から溶媒が蒸発せずに、樹脂の量に対して相対的に過剰な量の溶媒が残った状態で落下飛行して、ドラムにそのまま堆積し、その結果、溶媒を過剰に含んだ繊維がドラムの表面に衝突して、付着していると考えられる。
実験（印加電圧と飛行軌道）
実験１と同じ条件で、但し、ノズルに印加する電圧を０．５ｋＶ，１０ｋＶ，１４ｋＶ、１８ｋＶ，２２ｋＶ，２５ｋＶ，２８ｋＶ，３０ｋＶとして、出射された飛行軌道の変化と、回転ドラムに堆積された繊維の状態を観察した。
実験結果：
i) 飛行軌道の変化
・ ０．５ｋＶでは紡糸溶液がノズルから押し出されて下方に垂れながら落下し
・ １０ｋＶでは、紡糸溶液は千切れ千切れの短繊維状になって下方に落下した。
・１４ｋＶでは紡糸溶液は一本の線となってドラムに落下した。飛行軌道は若干の振れが認められた。
・１８ｋＶでは、ノズルから出射された繊維は飛行軌道が大きく振れながら回転ドラムに堆積した。
・２２ｋＶ，２５ｋＶ，２８ｋＶ，３０ｋＶでは、ノズルから出射された繊維はより強い力で引っ張られて回転ドラムに堆積した。回転ドラムに堆積する直前に飛行軌道が振れて繊維は肉眼で見えなくなった。
ii)     回転ドラムに堆積した繊維の状態
・印加電圧が１４ｋＶ以下では回転ドラムに堆積した繊維は不織布を形成しなかった。
・印加電圧が１８ｋＶ～３０ｋＶでは、回転ドラムに堆積した繊維は不織布を形成したが、印加電圧が３０ｋＶでは、１８ｋＶ～２８ｋＶにおけるよりも、繊維同士の付着傾向が強く繊維の形状が崩れていた。
実験（紡糸溶液の送り出し速度と不織布の形成）
紡糸溶液をシリンジからノズルに送り出す速度を３ｍｌ／ｈ～１５ｍｌ／ｈに変えることで、不織布の形成に及ぼす影響を観察した。
実験結果
・送り出し速度３ｍｌ／ｈ～１５ｍｌ／ｈで回転ドラムに堆積した繊維は網目構造を有するシートを形成した。しかし、送り出し速度１２ｍｌ／ｈ以上では、繊維同士の付着傾向が強く繊維の形状が崩れて、ドラムに平たく付着する傾向が強かった。
II.　 ＭＳＣ増殖実験
エレクトロスピニング法で製造した樹脂繊維からなる不織布サンプル１－６と比較用サンプル７を用意してＭＳＣを播種し、各サンプルにおける細胞の増殖を観察対比した。図１８はサンプル１－６及び比較用サンプル７の構成を示し、図１９～図２５は各サンプルのSEM写真を示す。
１）実験の手順
Step 1: 脂肪由来間葉系幹細胞（AT-MSC）を フラスコ底面で1 x 104 cells/cm2の細胞密度になるように無血清培養液(凍結保存時の培養液)に懸濁し、得られた懸濁液をT25フラスコ(ファルコン#353109)に培養液量5mLを投入して播種した（25 x 104cell/flask）。T25フラスコに播種した細胞を37℃, 5%CO2で前培養し、培養3日目で培養液を全量交換し、5日間前培養を継続した。
Step 2: 前培養終了後、凍結保存用の培養液を細胞から取り除き、PBS(-)（（株）細胞科学研究所，#1102P05）にて洗浄後、前培養で増殖した細胞を組換え体トリプシン／EDTA溶液(r-TE（（株）細胞科学研究所 #1210）) を用いてT25フラスコの底面から剥離し、さらに合成トリプシン中和溶液（s-TI（（株）細胞科学研究所#1220）） 0.5 mL/ flaskを加えてなじませた後、PBS(-)（（株）細胞科学研究所#1102P05）にて細胞を回収し、15 mL遠沈管へ移した。 
Step 3: 遠沈管へ移した細胞を遠心分離機にかけて遠心分離し（1000 rpmで5分間）、分離した細胞を増殖用の無血清培養液（CiMS　）に懸濁した。増殖用の培養液としてはCiMS-BM登録商標（（株）細胞科学研究所 #A2G00P05C）にCiMS-sAF（（株）細胞科学研究所 #A2G20P1CC） を添加して使用した。
サンプル1-7の各シートを24ウェルの接着プレート (ファルコン#353046, 351147) の底面にそれぞれ固定し、その状態のサンプルシート１～７に5 x 104 cells/sheetの播種密度で細胞を播種した。37℃、5%CO2で培養開始し、3日おきに培養液を交換した。
２）実験結果
・サンプル１～７にAT-MSCの懸濁液を播種後、１０日経過後の細胞数の増殖を図２６に示す。
・１０日経過時点でサンプル3とサンプル5における細胞増殖が他のサンプルにおける細胞増殖よりも多かった。
・１０日目に回収した細胞の生存率はいずれもサンプルにおいても90%前後で良好であった。
・１０日経過後も、3日ごとに培養液を交換しながら培養を続けたところ、正確なcell count は難しかったが、２０日以降も細胞の増殖が確認された。３０日経過時点で６０ｘ１０４cells/sheet以上の細胞がカウントされ、その時点でも未だに増殖率がプラトーに達していなかった。
３）考察
i) サンプル１～６は、播種後１０日経過して良好な細胞増殖が得られたが、その理由は、表面に1μm前後の大きさの気泡細孔が無数形成されていることによって培地中に含まれているタンパク質（通常タンパク質のサイズは２～１０ｎｍ程度）が細孔中に入り込み、効果的に吸着されたことによって初期接着が向上したと考えられる。
ii) １０日経過時点でサンプル３とサンプル５は 細胞増殖が他のサンプルよりも多かった理由は、サンプル３は繊維径が細く（12.6μｍ）、サンプル５は不織布の厚さが大きい（0.24mm）ため、共に不織布全体の表面積が多いので、細胞がより多く接着できたと考えられる。
iii)サンプル６（PLLA１００％）は繊維径が２３．７μｍと太いにもかかわらずサンプル３，５に次いで高い細胞増殖が得られた。また、接着したMSCをトリプシンを用いて引きはがすのが容易であった。PLLAは細胞培養基材に樹脂として特に優れた物性を有していると考えられる。
iv) サンプル１－６に比べて比較用サンプル７（PLGAに対してHAｐ粒子を５０重量％含有）の細胞増殖数が低かった。この理由は、サンプル１－６の繊維表面に比べてＨＡｐ比較用サンプル７の繊維の表面（図２５（Ｃ））は気泡細孔が少なく平坦であり、凹凸に乏しいこと、及び繊維径が太いことによって、細胞が不織布に捕捉されずらかったこと、さらにサンプル１－６に比べてサンプル７の繊維は比表面積がかなり少ないことに起因すると考えられる。
v)サンプル１～６は播種後20日以降も細胞の増殖が確認され、30日経過時点でも未だプラトーに達していなかったことから、３０日経過後もさらに増殖が予想される。このような結果が得られた理由は定かではないが、発明者等の知識経験によると、不織布によって細胞の接着面積が増大し、不織布が播種された間葉系幹細胞を効果的に捕捉し、細胞がタンパク質によって覆われた繊維表面に接着した結果であると考えられる。
vi) サンプル３，５に比べてサンプル４の細胞増殖数が少なかった理由は、サンプル４は繊維の配列が一方方向で網目構造を形成していないため、播種したAT-MSCが培地中で不織布を通り抜けてしまうものが多かったことによると考えられる。
III.   増殖したＭＳＣの分化能の維持の確認実験
１）実験の手順
上記II.のＭＳＣ増殖実験において、AT-MSCを上記サンプル１のシートに播種し、３日ごとに無血清増殖用培養液(CiMS)を交換しながら２０日間培養を継続した。その後分化誘導を行うために、増殖用培養液を取り除き、ＰＢＳで洗浄した後、血清入り分化誘導用培養液を加えて37℃、5％CO2で培養を開始し、３日ごとに培養液を交換しながら培養を継続し、３週間経過後に染色して分化を確認した。
血清入り骨分化誘導用培養液として、IMDM，10% FBS，0.1 μM Dexamethasosne，0.2mM Ascorbic acid，10mM β-Glycerol-2-phosphate，50ng/mL hEGFの組成を用いた。血清入り脂肪分化誘導用培養液として、IMDM，10% FBS，0.1 μM Dexamethasosne， 0.5mM IBMX，2μg/mL Inslin，0.1mM indomethacineの組成を用いた。
分化誘導を行わずに、増殖用培養液による培養を分化誘導と同様の期間として3週間継続したものをコントロールとし、染色による比較確認を行った。
２）実験結果
骨分化誘導用培養液を用いて21日間培養して分化誘導を行った後、細胞培養基材に接着した細胞をアリザリンレッドで染色したところ、細胞が染色され、骨芽細胞に分化しているのが観察された。21日間脂肪分化誘導用培養液を用いて21日間培養して分化誘導を行った後、細胞培養基材に接着した細胞をOil Redで染色したところ、細胞が染色され、脂肪細胞に分化しているのが観察された。コントロールはアリザリンレッド及びOil Redのいずれにおいても染色されなかった。
３）考察
サンプル１の細胞培養シートに接着した細胞は、21日間骨芽細胞及び脂肪細胞への分化誘導を行った後、全て染色によりいずれの細胞にも分化していることを確認できたされていたことから、不織布シートに播種されたＭＳＣ細胞は増殖用培地において、分化能を維持したまま増殖したと考えられる。コントロールはいずれも染色されなかったことから、増殖用培地で増殖させたＭＳＣは、未分化のまま増殖していたと考えられる。
以上本発明をエレクトロスピニング法を用いて紡糸した繊維からなる不織布シートの実施例に即して説明したが、本発明の不織布が生分解性繊維を用いる場合には、in vitroに用いる細胞培養基材としてだけではなく、増殖したMSCを基材ごと生体内に移植することも可能である。
　１　　エレクトロスピニング装置
　１０　筐体　　
　１１　前扉　　
　２０　シリンジ　　
　２１　チューブ　　
　３０　ノズル
　３１　レール
　４０　回転ドラム
 
 

Claims (8)

  1. エレクトロスピニング法で紡糸された樹脂繊維からなる不織布を用いて作製された細胞培養基材であって、
     
    前記不織布は、外径１０～５０μｍの複数の樹脂繊維を含み、前記複数の樹脂繊維がランダムな方向に絡み合っており、
     
    前記絡み合った複数の樹脂繊維が互いに接触する箇所において付着して連結することによって網目構造を構成しており、前記網目構造は、曲線状の繊維によって囲まれた直径１００～２００μｍの略楕円形状の網目を形成しており、
     
    前記不織布を構成する樹脂繊維は無機フィラーを含まず、０．１～３μｍの径の気泡細孔が繊維の表面の全域にわたって無数形成されている、
     
    エレクトロスピニング法で紡糸された樹脂繊維からなる不織布を用いて作製された細胞培養基材。
     
  2. 前記不織布の厚さは０．１ｍｍ～０．４ｍｍである、請求項１に記載の細胞培養基材。
     
  3. 前記樹脂繊維は分子量２０万～４０万のＰＬＧＡ樹脂を含む、請求項１又は２に記載の細胞培養基材。
     
  4. 前記不織布を構成する樹脂繊維は無機フィラーを含まない、請求項１～３のいずれか一項に記載の細胞培養基材。
     
  5. エレクトロスピニング法で紡糸された樹脂繊維からなる不織布で構成された細胞培養基材の製造方法であって、
     
    エレクトロスピニング装置のシリンジに分子量5万～７０万の生分解性樹脂をクロロホルムで溶かすことによって調製した樹脂濃度５％～７％の紡糸溶液を充填し、３ｍｌ／ｈ～１５ｍｌ／ｈの送り出し速度で押し出すことによって、前記エレクトロスピニング装置に下方向に設置され、吐出口の内径が０．７ｍｍ～０．９ｍｍであるノズルに前記紡糸溶液を送り出し、
     
    前記ノズルに所定の電圧を印加することによって、前記ノズルと、前記ノズルから１５０ｍｍ～４００ｍｍの距離離れた位置に設置されて電気的に接地されたドラムコレクターとの間に電場を発生させると共に、前記ノズルの吐出口に送り込まれた紡糸溶液を帯電させることによってテイラーコーン現象を生じさせて前記ノズルから前記紡糸溶液を繊維状に出射させ、前記電場はノズルから出射された繊維が飛行中に飛行軌道の振れを生じる強さに調整されており、
     
    前記ノズルから出射された繊維を、所定の速度で回転するドラムコレクターに前記飛行軌道を振りながら落下させて前記ドラムコレクターの表面に堆積させることによって、前記繊維が曲線を描いて前記ドラムコレクターの表面に堆積し、前記堆積した繊維がランダムな方向に配列して絡み合って互いに接触する複数の箇所において付着して連結することによって、繊維径が１０μｍ～１００μｍの繊維が直径１００～２００μｍの略楕円形状の網目を有する網目構造を構成している不織布を形成し、
     
    前記形成された不織布を前記ドラムコレクターから回収し、所望のサイズにカットする、
     
    エレクトロスピニング法で紡糸された樹脂繊維からなる不織布で構成された細胞培養基材の製造方法。
     
  6. 前記不織布の厚さは０．１ｍｍ～０．４ｍｍである、請求項５に記載の細胞培養基材の製造方法。
     
  7. 前記樹脂繊維は分子量２０万～４０万のＰＬＧＡ樹脂を含む、請求項５又は６に記載の細胞培養基材の製造方法。
     
  8. 前記不織布を構成する樹脂繊維は無機フィラーを含まない、請求項５～７のいずれか一項に記載の細胞培養基材の製造方法。
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