JPWO2007102606A1 - 足場材料 - Google Patents

Abstract

本発明の目的は、機械的強度、細胞増殖性に優れ、細胞培養基材や補綴材として好適な足場材料を提供することにある。本発明は、繊維の集合体からなり、２つの底面および側面から構成される３次元構造を有し、（１）繊維は面方向に配向し、（２）繊維の直径は０．０５〜５０μｍであり、（３）繊維は生体適合性ポリマーから主としてなり、（４）見掛け密度は９５〜３５０ｋｇ／ｍ３である、細胞増殖のための足場材料である。

Description

本発明は細胞増殖に用いる足場材料に関する。本発明は繊維の集合体からなり、補綴材若しくは細胞培養基材に好適な足場材料に関する。

近年、大きく損傷した生体組織の治療法として、細胞の分化、増殖能を利用し元の生体組織に再構築する再生医療の研究が活発になってきている。生体内において細胞が分化・増殖する場合、細胞外マトリックスが足場として機能し、組織の構築を行っている。しかし組織が大きく損傷している場合、細胞自身がマトリックスを産生するまで人工および天然材料で補う必要がある。つまり足場材料（補綴材）は組織構築の上で最適な環境を与える重要なファクターである。この足場材料に求められる特性としては、１）生体吸収性、２）細胞接着性、３）多孔質性、４）力学強度などが挙げられる。これらの特性を満足する材料を創生することを目的として、合成高分子（ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリカプロラクトンなど）、天然高分子（コラーゲン、ゼラチン、エラスチン、ヒアルロン酸、アルギン酸、キトサンなど）、無機材料（ハイドロキシアパタイト、β−リン酸三カルシウム）、これらの複合体などがこれまで検討されている。
前述したように、足場材料（補綴材）に求められる重要な特性の１つとして多孔質性がある。これは組織を再生させるのに必要な細胞への十分な酸素および栄養を補給し、二酸化炭素や老廃物を速やかに排出する意味において重要である。そのため、足場材料の多孔質性を達成するために凍結乾燥法、相分離法、発泡法などが提案されている。凍結乾燥法または相分離法により得られる構造体は、ポアの形状が鱗片状であり、細胞の侵入が難しく足場材料として未充足な課題がある。また発泡法により得られる構造体もポアが単独に存在するため細胞の侵入が困難であるという課題がある。
また、熱可塑性ポリマーからなる繊維の集合体であって、平均繊維径が０．１〜２０μｍであり、かつ該繊維の任意の横断面が異形であり、更に平均見掛け密度が１０〜９５ｋｇ／ｍ^３である不織布が報告されている（特許文献１）。しかし、足場材料としてさらなる厚みと強度を有するものが求められている。
また、サッカロースなどの水溶性物質を含有するポリウレタンポリマーを調製した後、水浴中で含有する水溶性物質を溶解して孔構造を形成した軟骨プラグが提案されている（特許文献２）。しかし、この方法で形成される孔は連続孔ではなく細胞増殖には限度がある。
また、静電紡糸法でナノファイバーが平面状に堆積された足場材料を製造し、これを用いて細胞を培養することが提案されている（非特許文献１）。この方法は、繊維を平面状の捕集電極上に捕集するため、繊維が一定の厚さ以上に堆積すると、電極が堆積物で覆われることになり、一定の電位差を維持することが困難になり、繊維の堆積物の密度が堆積方向で変化するという欠点がある。また、堆積物は、堆積方向に垂直な面方向においても堆積密度に斑が生じる。よって、この堆積物を細胞増殖の足場材料として用いるには、堆積密度を均一にして機械的強度を改良する必要がある。
ＷＯ２００４／８８０２４号公報 特表２００４−５２０８５５号公報 Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ２５ Ｍａｒｃｈ ２００２ ｉｎ Ｗｉｌｅｙ ＩｎｔｅｒＳｃｉｅｎｃｅ（ｗｗｗ．ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ．ｗｉｌｅｙ．ｃｏｍ）

本発明の目的は、繊維が高密度に集合した細胞増殖に適した足場材料を提供することにある。本発明の目的は、機械的強度に優れた細胞増殖のための足場材料を提供することにある。本発明の目的は、細胞を良好に増殖させることができる足場材料を提供することにある。また本発明の目的は、該足場材料の製造方法を提供することにある。さらに本発明の目的は、該足場材料を用いた細胞の増殖方法を提供することにある。また本発明の目的は、該足場材料を用いた生体組織を再生させる方法を提供することにある。
本発明者は、静電紡糸法で繊維を製造し、得られた繊維を回転する巻き取り軸に堆積させると、堆積方向に均一な堆積密度を有する繊維堆積物が得られることを見出した。
また、繊維を回転する巻き取り軸に堆積させると巻き取り軸に平行な平面に対しても均一な繊維堆積物が得られることを見出した。
さらに、繊維を回転軸に巻き取る際に、繊維に一定の張力がかかり、高密度の繊維堆積物が得られることを見出した。
また、得られた繊維堆積物は、細胞増殖の足場材料として、適度な強度、繊維密度を有することを見出した。本発明はこれらの知見に基づく。
すなわち本発明は、繊維の集合体からなり、２つの底面および側面から構成される３次元構造を有し、
（１）繊維は面方向に配向し、
（２）繊維の直径は０．０５〜５０μｍであり、
（３）繊維は生体適合性ポリマーから主としてなり、
（４）見掛け密度は９５〜３５０ｋｇ／ｍ^３である、
足場材料である。
また本発明は、（１）電極間で形成された静電場中に、生体適合性ポリマーを含むドープをノズルから吐出し、繊維を形成し、
（２）得られた繊維を、巻き取り軸を中心に巻き取り、繊維が巻き取り軸に平行な面の方向に配向したロールを形成し、
（３）得られたロールから３次元構造体を切り出す、
工程を含む足場材料の製造方法である。
本発明は、該足場材料を用いて細胞を分裂増殖させる方法を包含する。また該足場材料を損傷した患部に埋め込み、生体組織を再生させる方法を包含する。

静電紡糸法で用いる装置の一例である。 静電紡糸法で用いる装置の一例である。 静電防止法で用いる装置の一例である。 静電防止法で用いる装置の一例である。 本発明の製造方法の中で、足場材料を切り出す方法の例である。 実施例２において得られた足場材料の上底面像である。 実施例２において得られた足場材料の下底面像である。 実施例２における足場材料を用いた培養１日目の染色像である。 実施例２における足場材料を用いた培養１２日目の染色像である。 実施例３において得られた足場材料の上底面像である。 実施例３において得られた足場材料の下底面像である。 実施例３において得られた足場材料の断面像の一例である。 実施例３における足場材料を用いた培養１日目の染色像である。 実施例３における足場材料を用いた培養１２日目の染色像である。

符号の説明

１． ノズル
２． ドープ
３． ドープ保持槽
４． 正電極
５． 負電極
６． 高電圧発生器
７． 巻き取り装置
８． 静電除去装置
９． 巻き取り軸方向
１０． 巻き取り軸方向に平行に切り出された足場材料
１１． 巻き取りに対し垂直な方向
１２． 巻き取り軸に対し垂直方向に切り出された足場材料

以下、本発明について詳述する。
＜足場材料＞
本発明の足場材料は、２つの底面および側面から構成される３次元構造を有する。底面の形状は、円、楕円、四角形など任意の形状である。底面は凹凸のある曲面であっても良い。２つの底面の形状、大きさは異なっていても良い。底面の面積は、好ましくは０．０５〜８ｃｍ^２、より好ましくは０．１〜１ｃｍ^２である。側面は連続した曲面でも、複数の面から形成されていても良い。即ち、本発明の足場材料の形状は、好ましくは、円筒体、多角柱などの３次元構造である。
本発明の足場材料は３次元構造、即ち、横方向（ｘ軸）、縦方向（ｙ軸）および高さ方向（ｚ軸）の広がりを有する。この点において、横方向（ｘ軸）および縦方向（ｙ軸）の広がりを有する平面状の不織布とは相違する。本発明の足場材料において、高さ方向とは一方の底面に対して垂直な方向のことをいう。
足場材料の高さは、好ましくは０．５ｍｍ以上、より好ましくは２ｍｍ以上である。高さの上限は問わず、補綴材として使用する部位に依存するといえる。高さが０．５ｍｍより低いと機械強度が低く、膝関節など負荷の高い組織の補綴材としては好ましくない。本発明の足場材料を、例えば生体の損傷部に埋入し、補綴材表面に細胞を増殖させるために用いることができる。足場材料は所望の形状に合わせて提供できる。
本発明の足場材料は繊維の集合体からなる。本発明において、面方向に配向するとは、繊維が特定の平面に略平行に向いていることを意味する。繊維は、この特定平面に平行な限り、横方向、縦方向、斜め方向のいずれの方向を向いていてもよい。図５の１０または１２に示す円筒体中の破線に示す平面に対して繊維は略平行に向いている。また、図５の１０あるいは１２中に示す点線部は、同心円状の曲面を形成してもよい。但し、該平面上の繊維の向きはランダムである。
繊維は、図５の１０に示すように、高さ方向に平行な面方向に配向していることが好ましい。あるいは図５の１２に示すように、繊維は高さ方向に垂直な面方向に配向していることが好ましい。
繊維の直径は、０．０５〜５０μｍである。繊維の直径が、０．０５μｍよりも小さいと足場材料の強度が保てないため好ましくない。また繊維の直径が５０μｍよりも大きいと繊維の比表面積が小さく生着する細胞数が少なくなる。繊維の直径は、好ましくは０．２〜５０μｍ、さらに好ましくは０．２〜４０μｍである。繊維の直径は、例えば走査型電子顕微鏡（倍率２００倍程度）で足場材料を観察して求めることができる。
また、繊維の任意の横断面は略真円でも異形でも良い。繊維の任意の横断面が異形であると、繊維の比面積は増大するので、細胞の培養時に、細胞が繊維表面に接着する十分な面積をとることができる。
ここで、繊維の任意の横断面が異形であるとは、繊維の任意の横断面が略真円形状をとらないいずれの形状も指し、繊維表面が一様に凹部および／または凸部を有して粗面化されている場合を含む。
異形形状は、繊維表面の微細な凹部、繊維表面の微細な凸部、繊維表面の繊維軸方向に筋状に形成された凹部、繊維表面の繊維軸方向に筋状に形成された凸部および、繊維表面の微細孔部からなる群から選ばれた少なくとも１種によることが好ましく、これらは単独で形成されていても複数が混在していても良い。ここで、上記の「微細な凹部」、「微細な凸部」、とは、繊維表面に０．１〜１μｍの凹部または凸部が形成されていることをいい、「微細孔」とは、０．１〜１μｍの径を有する細孔が繊維表面に存在することをいう。また、上記筋状に形成された凹部および／または凸部は、０．１〜１μｍ幅の畝形状が繊維軸方向に形成されていることをいう。
足場材料の見掛け密度は、９５〜３５０ｋｇ／ｍ^３、好ましくは１００〜３００ｋｇ／ｍ^３、より好ましくは１００〜２５０ｋｇ／ｍ^３である。見掛け密度が９５ｋｇ／ｍ^３より低いと細胞侵入性は良いものの機械強度が低い。また３５０ｋｇ／ｍ^３より高いと細胞が侵入するのが困難となり足場材料としては好ましくない。見掛け密度は、得られた集合体の体積（面積×高さ）と質量とを測定し算出することができる。
足場材料を移植に用いる場合、移植初期における加重圧縮に耐える機械的強度が必要となる。本発明の足場材料の繊維の配向方向を加重圧縮方向に向けることで圧縮に対する形状安定性を付与することができる。本発明の足場材料の圧縮弾性率は、好ましくは０．５ＭＰａ〜５ＭＰａ、より好ましくは１．５ＭＰａ〜５ＭＰａである。
本発明の足場材料の多孔度は、好ましくは７５〜９０％、より好ましくは７８〜８８％である。多孔度は多孔体の容積からポリマーの容積を差し引いた割合により求める。
本発明の足場材料を構成する繊維は生体適合性ポリマーから主としてなる。繊維は、繰り返し単位の好ましくは８０〜１００モル％、より好ましくは９０〜１００モル％は生体適合性のモノマー由来の繰り返し単位からなることが好ましい。生体適合性のモノマーとして、グリコール酸、乳酸、カプロラクトン、ジオキサノンなどが挙げられる。また生体適合性ポリマーのブレンドでもよい。
生体適合性ポリマーは生体吸収性ポリマーであることが好ましい。生体吸収性ポリマーは、好ましくは主として脂肪族ポリエステルからなる。脂肪族ポリエステルとしては、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリカプロラクトン、ポリジオキサノン、ポリトリメチレンカーボネート、ポリブチレンサクシネート、ポリエチレンサクシネート、およびこれらの共重合体などが挙げられる。これらのうち、脂肪族ポリエステルとしては、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリカプロラクトン、およびこれらの共重合体からなる群から選ばれる少なくとも一種であることが好ましい。就中、乳酸とグリコール酸との共重合体が好ましい。共重合比は好ましくは前者／後者（モル）＝２０／８０〜８０／２０、より好ましくは４０／６０〜７５／２５である。
生体吸収性ポリマー以外でも、ポリエステル、ナイロン、ポリスルフォン、ポリウレタン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリメタクリル酸メチル、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリ塩化ビニル、ポリシロキサンなどの生体適合性ポリマーも、多孔体を構成するポリマーとして用いることができる。
生体適合性ポリマーの固有粘度は０．１〜１．４ｄＬ／ｇ、好ましくは０．０．４〜１．３ｄＬ／ｇ、より好ましくは０．６〜１．２ｄＬ／ｇ（３０℃、ヘキサフルオロイソプロパノール）である。
また本発明の足場材料には、生体適合性ポリマー以外の第２成分をさらに含有しても良い。該成分としては、リン脂質類、糖質類、糖脂質類、ステロイド類、ポリアミノ酸類、タンパク質類、およびポリオキシアルキレン類、ＦＧＦ（繊維芽細胞増殖因子）、ＥＧＦ（上皮増殖因子）、ＰＤＧＦ（血小板由来増殖因子）、ＴＧＦ−β（β型形質転換増殖因子）、ＮＧＦ（神経増殖因子）、ＨＧＦ（肝細胞増殖因子）、ＢＭＰ（骨形成因子）などの細胞増殖因子からなる群から選ばれる少なくとも１種であることが好ましい。具体的には、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロールなどのリン脂質類および／またはポリガラクチュロン酸、ヘパリン、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、デルマタン硫酸、コンドロイチン、デキストラン硫酸、硫酸化セルロース、アルギン酸、デキストラン、カルボキシメチルキチン、ガラクトマンナン、アラビアガム、トラガントガム、ジェランガム、硫酸化ジェラン、カラヤガム、カラギーナン、寒天、キサンタンガム、カードラン、プルラン、セルロース、デンプン、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、グルコマンナン、キチン、キトサン、キシログルカン、レンチナンなどの糖質類および／またはガラクトセレブロシド、グルコセレブロシド、グロボシド、ラクトシルセラミド、トリヘキソシルセラミド、パラグロボシド、ガラクトシルジアシルグリセロール、スルホキノボシルジアシルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、グリコシルポリプレノールリン酸などの糖脂質類および／またはコレステロール、コール酸、サポゲニン、ジギトキシンなどのステロイド類および／またはポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸、ポリリジンなどのポリアミノ酸類および／またはコラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、フィブリン、ラミニン、カゼイン、ケラチン、セリシン、トロンビンなどのタンパク質類および／またはポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンプロピレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタンエーテルなどのポリオキシアルキレン類などが挙げられる。第２成分の好ましい含有量としては、生体適合性ポリマー１００重量部に対して０．０１〜５０重量部である。
＜製造方法＞
本発明の足場材料は、第１〜第３工程により製造することができる。
（第１工程）
第１工程は、いわゆる静電紡糸法である。第１工程は、電極間で形成された静電場中に、生体適合性ポリマーを含むドープをノズルから吐出し、繊維を形成する工程である。
静電場は、一対または複数の電極間で形成される。電極は、金属、無機物または有機物のいかなるものでも導電性を示すものであれば良い。また、絶縁物上に導電性を示す金属、無機物または有機物の薄膜を持つものであっても良い。いずれの電極に高電圧を印加しても良い。これは例えば電圧値が異なる高電圧の電極が２つ（例えば１５ｋＶと１０ｋＶ）と、アースに繋がった電極の合計３つの電極を用いる場合も含み、または３本を超える数の電極を使う場合も含む。一方の電極がノズルで、他方の電極が捕集電極であることが好ましい。
電極間の距離は、帯電量、ノズル寸法、紡糸液流量、紡糸液濃度等に依存するが、１０ｋＶ程度のときには５〜２０ｃｍの距離が適当である。印加される静電気電位は、好ましくは３〜１００ｋＶ、より好ましくは５〜５０ｋＶ、さらに好ましくは５〜３０ｋＶである。
ドープは、生体適合性ポリマーおよび溶媒を含有する。生体適合性ポリマーは前述の通りである。ドープ中の生体適合性ポリマーの濃度は、好ましくは１〜３０重量％、より好ましくは２〜２０重量％である。生体適合性ポリマーの濃度が１重量％より低いと、濃度が低すぎるため繊維を形成することが困難となり好ましくない。また３０重量％より高いと得られる繊維の直径が大きくなり好ましくない。
溶媒は、生体適合性ポリマーを溶解し、常圧で沸点が２００℃以下であり、室温で液体である物質が好ましい。溶媒として例えば、塩化メチレン、クロロホルム、アセトン、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、トルエン、テトラヒドロフラン、１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロイソプロパノール、水、１，４−ジオキサン、四塩化炭素、シクロヘキサン、シクロヘキサノン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、アセトニトリルなどが挙げられる。これらのうち、生体適合性ポリマー特に脂肪族ポリエステルの溶解性等から、塩化メチレン、クロロホルム、アセトンが特に好ましい。これらの溶媒は単独で用いても良く、複数の溶媒を組み合わせても良い。また本発明においては、本目的を損なわない範囲で他の溶媒を併用しても良い。
ノズルの口径は、好ましくは０．６〜１．５ｍｍである。ドープをノズルから静電場中に供給する場合、数個のノズルを用いて繊維状物質の生産速度を上げることもできる。
吐出は、注射器のようなピストンを有するシリンジでドープを押し出すことにより行うことが出来る。また、先端に細孔（ノズル）を有する管でも良い。この場合、ドープは静電気電位差により引っ張られ電極に向かって曳糸される。繊維とは、溶媒が留去された状態のみならず、いまだ溶媒を含んでいる状態も含む。
ノズルと電極の間に静電除去装置を使用することが好ましい。静電除去装置とは、イオンエアーを繊維に当てイオンバランスを均一に保ち、電極に届く前に繊維の帯電状態を緩和することで空気中に分散させる装置である。この装置を用いることによってロールの厚みを増すことが可能である。ロールの厚みを増すことにより、径の大きい足場材料を得ることができる。
（第２工程）
第２工程は、得られた繊維を、回転する巻き取り軸を中心に巻き取り堆積させ、繊維が巻き取り軸に平行な面に配向したロールを得る工程である。
繊維は、ノズルと捕集電極との間にある巻き取り装置の巻き取り軸を中心に堆積させる。巻き取り軸の形状は円柱状でも、角柱状でもよい。
足場材料の平均見掛け密度は巻き取り軸の回転数に依存するため、巻き取り軸の回転数をコントロールすることで、所望の平均見掛け密度を有する足場材料を得ることが可能となる。具体的には、回転数が高い場合においては、得られる足場材料の平均見掛け密度は高い。それに対し、回転数が低い場合においては、得られる足場材料の平均見掛け密度は低い。巻き取り軸の回転速度は、好ましくは１〜１０００回／分、より好ましくは５〜２００回／分である。
得られるロールは、巻き取り軸に平行な面に対し略配向している。ロールの形状は、円柱状、紡錘状など任意の形状である。
第２工程の後、得られたロールについて熱処理を行うことが好ましい。熱処理温度は、好ましくは４０〜９０℃である。熱処理を行うことにより、繊維同士が熱融着し、優れた圧縮強度を有する足場材料を得ることができる。
第１および第２工程を図１〜４により説明する。図１はシリンジ、図２は細管状の吐出器を用いる例である。図１において、ドープ（２）は、ノズル（１）を有するシリンジのドープ保持槽（３）に充填する。ノズル（１）には高電圧発生器（６）により電圧がかけられ、正電極（４）と負電極（５）との間に静電場が形成されている。ドープ（２）をノズル（１）から押し出すと、電荷を帯びたドープが静電場中を負電極（５）に向かって移動し繊維が形成される。
また、図２に示す方法で繊維を形成することもできる。ドープ（２）は、ノズル（１）を有する細管状の吐出器のドープ保持槽（３）に充填する。ドープ保持槽（３）内には正電極（４）が挿入され高電圧発生器（６）により電圧がかけられ、負電極（５）との間に静電場が形成されている。吐出器の先端のノズル（１）と負電極（５）との距離を調節すると、ノズル（１）から電荷を帯びたドープが吐出され、静電場中を負電極（５）に向かって移動し繊維が形成される。繊維は、負電極（５）の手前にある巻き取り装置（７）に巻き取る。
本発明においては、ドープ（２）を負電極（５）に向けて曵糸する間に、溶媒が蒸発して繊維が形成される。通常の室温であれば巻き取り装置（７）に捕集されるまでの間に溶媒は完全に蒸発するが、もし溶媒蒸発が不十分な場合は減圧条件下で曵糸しても良い。また、曵糸する温度は溶媒の蒸発挙動や紡糸液の粘度に依存するが、通常は０〜５０℃である。
図３および図４は、静電除去装置（８）を設置する例である。ノズル（１）と負電極（５）の間に静電除去装置（８）を設置して紡糸を行い、繊維を巻取り装置（７）により捕集することができる。
（第３工程）
第３工程は、得られたロールから３次元構造体を切り出す工程である。３次元構造体は、例えば円筒形の穿孔器を用いて図５に示すように刳り貫くことができる。図５において、３次元構造体の高さ方向と繊維の配向方向とを平行に刳り貫く（１０）ことが好ましい。また、３次元構造体の高さ方向と繊維の配向方向とが垂直になるように刳り貫く（１２）ことが好ましい。足場材料（１０）は、足場材料（１２）に比べ圧縮強度に優れる。
＜細胞の分化増殖＞
本発明の足場材料を用いて細胞を分化増殖させることができる。細胞の分化増殖は生体外、生体内のいずれで行ってもよい。生体外では、細胞を分化増殖するための培養基材として用いることができる。生体内では、本発明の足場材料を補綴材として用いることができる。特に、本発明の足場材料を損傷した患部に埋め込むことによって生体組織を再生させることができる。あるいは、生体外で本発明の足場材料に細胞を培養したものを補綴材として患部に埋め込んでもよい。生体組織としては、例えば骨軟骨組織を挙げることができる。

実施例で使用した材料、測定方法は以下の通りである。
（１）乳酸−グリコール酸共重合体；ＬＡＣＴＥＬ（ＤＬ乳酸／グリコール酸共重合体、モル比＝５０／５０、固有粘度：１．０５ｄＬ／ｇ、３０℃、ヘキサフルオロイソプロパノール、Ａｂｓｏｒｂａｂｌｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）
（２）塩化メチレン、エタノール、ホルムアルデヒド； 和光純薬工業（株）製
（３）ラット間葉系幹細胞； 大日本住友製薬（株）製
（４）ＭＥＭ（Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ）、ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｄ Ｓａｌｉｎｅ）、抗生物質−抗真菌剤（Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ）、０．０５％ Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ溶液； Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製
（５）Ｌ−ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ ２−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｍａｇｎｅｓｉｕｍ ｓａｌｔｓ ｎ−ｈｙｄｒａｔｅ（含水量２６．７％）、β−ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｉｓｏｄｉｕｍ ｎ−ｈｙｄｒａｔｅ、Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎ、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、Ｔｏｌｕｉｄｉｎｅ Ｂｌｕｅ； Ｓｉｇｍａ製
（６）Ｐｉｃｏ Ｇｒｅｅｎ（登録商標）ｄｓ ＤＮＡ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ Ｋｉｔ； Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ製
＜実施例１＞
（ドープの調製）
乳酸−グリコール酸共重合体（モル比＝５０／５０）を、塩化メチレンとエタノールの混合溶媒に溶解し、１５重量％のドープを調製した。
（紡糸）
図４に示す装置を用いて静電紡糸法で繊維の集合体からなる円筒体状のロールを得た。ノズル（１）の内径は１．３ｍｍである。ノズル（１）から巻き取り装置（７）までの距離は２０ｃｍ、ノズル（１）から静電除去装置（８）までの距離は３５ｃｍとした。印加電圧は１５ｋＶとした。ノズル（１）と負電極（５）との間に巻き取り装置（７）および春日電機（株）製の静電除去装置（８）を設置した。ドープ保持槽（３）には正電極（４）を挿入した。巻き取り装置（７）の回転数は１００ｒｐｍに設定した。
ドープ保持槽（３）にドープを入れ、ノズル（１）と負電極（５）との距離を調整し、繊維をノズル（１）から吐出させた。吐出を１２０分間継続し、繊維を回転する巻き取り装置（７）で巻き取り円筒体状のロールを得た。ロールを恒温器に入れ、８０℃で１０分間保持し熱処理を行った。
（切り出し）
得られたロールから図５に示す要領で、生検トレパン（カイインダストリーズ（株）製）を用いて図５中の１０に示すような直径５ｍｍ×高さ５ｍｍの円筒状の足場材料を切り出した。
（特性評価）
得られた足場材料の特性を以下の方法で測定した。その結果を表１に示す。
（１）繊維の直径
繊維の直径は、デジタルマイクロスコープ（株式会社ＫＥＹＥＮＣＥ、ＶＨＸ ＤＩＧＩＴＡＬ ＭＩＣＲＯＳＣＯＰＥ）を用いてあるいは走査型電子顕微鏡（日本電子製、倍率２００倍）で目視観察した。電子顕微鏡観察において１視野につき任意の１０本を選択して計測し、この操作を５視野について実施し、計５０本の平均値を算出した。ただし、繊維形成過程で発生した塊状の異物、繊維同士が融着しバンドル状になっているものは計測対象から除外した。
（２）足場材料の見掛け密度
足場材料の見掛け密度は下記式により算出した。
ρ＝４ｍ／πｄ^２ｈ
（ρ：多孔体の見掛け密度、ｍ：質量、ｄ：直径、ｈ：高さ）
（３）足場材料の多孔度
足場材料の多孔度は下記式により算出した。
ε＝１−ρ／ρ_０
（ε：足場材料の多孔度、ρ：多孔体の見掛け密度、ρ_０：ポリマーの固有密度）
（４）圧縮強度
圧縮強度は、図５の（１０）に対応する足場材料について、ＪＩＳＫ７２２０に準拠して測定した。即ち、繊維が円筒体の高さ方向に平行に配向している足場材料について測定した。試験片を材料試験機の加圧面の間に置き、試験片の中心線を加圧面の中心線に一致させ、かつ、試験片の上面と下面が加圧面と平行であることを確認した。試験速度１０ｍｍ／ｍｉｎにて一定速度で試験片に荷重を加え、圧縮限界まで測定を行った。
＜実施例２＞
（ドープの調製）
実施例１と同じ乳酸−グリコール酸共重合体を用いて１０重量％になるように調製した。
（紡糸）
吐出時間を９０分間とし、熱処理を７０℃で１０分間行う以外は実施例１と同じ方法で繊維の集合体からなる円筒体状のロールを得た。
（切り出し）
得られたロールから実施例１と同じ方法で、図５の１０に対応する直径５ｍｍ×高さ５ｍｍの円筒状の足場材料を切り出した。図５の１０に対応する足場材料の底面に平行な断面の顕微鏡写真（倍率１５倍）を、図６（上底面）および図７（下底面）に示す。繊維が層状に堆積しているのが分かる。（特性評価）
実施例１と同じ方法で特性を測定した。結果を表１に示す。
（足場材料の生物学的評価）
（細胞の調製）
足場材料の生物学的評価を以下の方法により行った。ラット間葉系幹細胞を１５％ＦＢＳおよび１％Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃを含むＭＥＭ中にて、３７℃、５％ＣＯ_２下で３継代まで培養を行った。
（細胞播種、培養）
得られた足場材料に、調製したラット間葉系幹細胞を６．０×１０^６個／ｃｍ^３になるように播種し、１５％ＦＢＳおよび１％Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ、１０μＭ ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ、５０μＭ Ｌ−Ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ ２−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｍａｇｎｅｓｉｕｍ ｓａｌｔｓ ｎ−ｈｙｄｒａｔｅ、１０ｍＭ β−ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｉｓｏｄｉｕｍ ｎ−ｈｙｄｒａｔｅを添加したＭＥＭ中にて、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで１２日間培養した。培地交換は週３回行った。
（評価）
培養１日目、６日目、１２日目に足場材料を取り出し、ＤＮＡ量の測定および組織学的評価を以下の方法で行った。
（１）ＤＮＡ量
ＤＮＡ量は、Ｐｉｃｏ Ｇｒｅｅｎ（登録商標）ｄｓ ＤＮＡ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ Ｋｉｔの測定マニュアルに従って行った。測定試料は０．２％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００で凍結・融解を３回繰り返した後、超音波破砕して細胞懸濁液を得、そこから抽出液を調製した。９６穴マイクロプレートに１００μｌの酵素処理を行った測定試料を入れ、ＴＥ（ｐＨ７．５）で２００倍希釈したＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）ｄｓ ＤＮＡ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔを１００μｌ加え、励起光４８５ｎｍ、蛍光５３５ｎｍの波長にて蛍光の測定を行った。標準ＤＮＡ溶液の値から検量線を作成し、それを基に測定試料のＤＮＡ量を算出した。結果を表２に示す。ＤＮＡ量は、増殖した細胞数に比例する。
（２）組織学的評価
組織学的評価は、あらかじめサンプリング時に足場材料を１０％ホルムアルデヒドに浸漬しておいた。染色する前に、蒸留水で足場材料を洗浄し、１００％エタノールに１時間浸漬を２回、９０％エタノール１時間浸漬、７０％エタノール１時間浸漬と段階的に希釈しながら洗浄した。これを蒸留水に１５分浸漬させることによって洗浄したのち、０．４％トルイジンブルー水溶液に１分浸漬させた。その後、１分間の流水洗浄を行って余分な染色液を落とし、デジタルマイクロスコープにて４５０倍で観察した。
（３）結果
ＤＮＡ量の測定結果を表２に示す。また培養１日目、１２日目の足場材料の染色写真をそれぞれ図８および図９に示す。培養１２日目の足場材料は１日目に比べて染色濃度が高く、また染色範囲が足場材料の深部まで達しており、細胞の増殖と軟骨基質が良好に産生していることが分かる。
＜実施例３＞
（足場材料の製造）
実施例２と同じ操作を繰り返し、図５の１２に対応する直径５ｍｍ×高さ５ｍｍの円筒状の足場材料を得た。その特性を測定した結果を表１に示す。
図５の１２に対応する足場材料の底面に垂直な断面の顕微鏡写真（倍率２００倍）を図１０に示す。繊維が面方向に配向しているのが分かる。また図５の（１２）に対応する足場材料の底面に平行な断面の顕微鏡写真（倍率１５倍）を図１１（上底面）および図１２（下底面）に示す。繊維が網の目のように緻密に堆積しているのが分かる。
（生物学的評価）
得られた足場材料を用いて、実施例２と同様の方法で細胞を培養しＤＮＡ量を測定した。その結果を表２に示す。また培養１日目、１２日目の足場材料の染色写真を図１３および図１４に示す。実施例２と同等に、培養１２日目の足場材料は１日目のそれに比べて染色濃度が高く、また染色範囲が足場材料の表面から深部に広がっており、良好な細胞増殖と基質産生が分かった。

発明の効果
本発明の足場材料は、機械的強度に優れ、移植初期における加重圧縮に耐えることができる。よって軟骨損傷部などの機械的特性が必要とされる部位へ使用することができる。本発明の足場材料は、生体適合性ポリマーから構成されているので、生体への悪影響がない。本発明の足場材料は、一定の繊維密度を有し、細胞が容易に侵入することができ、かつ酸素および栄養の補給、二酸化炭素や老廃物の排出を速やかに行うことができる。よって細胞を良好に増殖させることができる。
また本発明の製造方法によれば、該足場材料を簡便な方法で製造することができる。本発明の製造方法によれば、静電紡糸法で得られた繊維を回転する巻き取り軸に堆積させるので、堆積方向に均一な堆積密度を有する繊維堆積物が得られる。また、巻き取り軸に平行な平面に対しても均一な繊維堆積物が得られる。さらに、繊維を回転する巻き取り軸に巻き取ることにより、繊維に一定の張力がかかり、高密度の繊維堆積物が得られる。
本発明の細胞の増殖方法によれば、細胞を良好に増殖させることができる。また本発明の生体組織の再生方法によれば、損傷した生体組織を良好に再生させることができる。

本発明の足場材料は、再生医療分野における細胞培養基材として有用である。また本発明の足場材料は、補綴材、なかでも骨軟骨損傷部などの機械的特性が重要な部位における補綴材として有用である。

Claims (18)

1. 繊維の集合体からなり、２つの底面および側面から構成される３次元構造を有し、
   （１）繊維は面方向に配向し、
   （２）繊維の直径は０．０５〜５０μｍであり、
   （３）繊維は生体適合性ポリマーから主としてなり、
   （４）見掛け密度は９５〜３５０ｋｇ／ｍ^３である、
   足場材料。
2. 繊維は、高さ方向に平行な面方向に配向している請求項１記載の足場材料。
3. 繊維は、高さ方向に垂直な面方向に配向している請求項１記載の足場材料。
4. 繊維の直径は、０．２〜４０μｍである請求項１記載の足場材料。
5. 見掛け密度は１００〜２５０ｋｇ／ｍ^３である請求項１記載の足場材料。
6. 多孔度が７５〜９０％である請求項１記載の足場材料。
7. 高さが０．５ｍｍ以上である請求項１記載の足場材料。
8. 底面の面積が０．０５〜８ｃｍ^２である請求項１記載の足場材料。
9. 円筒体若しくは多角柱である請求項１記載の足場材料。
10. 高さ方向の圧縮弾性率が０．５〜５ＭＰａである請求項１記載の足場材料。
11. 生体適合性ポリマーが生体吸収性である請求項１記載の足場材料。
12. 生体適合性ポリマーが脂肪族ポリエステルである請求項１記載の足場材料。
13. 脂肪族ポリエステルが、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリカプロラクトン、およびこれらの共重合体からなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項１記載の足場材料。
14. 補綴材若しくは細胞培養基材である請求項１記載の足場材料。
15. （１）電極間で形成された静電場中に、生体適合性ポリマーを含むドープをノズルから吐出し、繊維を形成し、
    （２）得られた繊維を、巻き取り軸を中心に巻き取り、繊維が巻き取り軸に平行な面の方向に配向したロールを形成し、
    （３）得られたロールから３次元構造体を切り出す、
    工程を含む請求項１〜１２いずれか一項に記載の足場材料の製造方法。
16. 静電除去装置を用いて繊維を形成する請求項１４に記載の製造方法。
17. 請求項１に記載の足場材料を用いて細胞を分化増殖させる方法。
18. 請求項１に記載の足場材料を損傷した患部に埋め込み、生体組織を再生させる方法。

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